JP3892912B2 - ルミネセンスを利用する分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
１．発明の技術分野
本発明は試料中の被検物質を定量する方法、組成物、およびキットに関する。とりわけ本発明は別個の段階を必要としない特異的結合に基づく検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床診断分野は近年、容易にかつ正確に定量しうる物質（被検物質）の多様性ならびにその定量法の両方に関して幅広い拡張をみた。液体中の低濃度の物質の存在を検出する便利で信頼できる危険のない手段が望まれている。臨床化学においてこれらの物質は体液中に１０-12モル以下の濃度で存在することがある。これら低濃度物質を検出することのむずかしさは利用できる試料の量が比較的小さいことによって一層増大する。
【０００３】
一検定法を開発する際には多くのことを考慮しなければならない。一つの考慮すべきことは、被検物質の濃度変化に対する信号の応答である。第二の考慮すべきことは、検定に対する実験計画案を容易に実施しうることである。考慮すべきことの第三は、試料毎の妨害物質の変動である。試薬の調製および精製の容易なこと、装置の入手性、オートメ化の容易なことおよび対象物質との相互作用も、有用な検定法を開発する上で更に考慮すべき諸問題である。
【０００４】
一つの幅広い技術のカテゴリーは、被検物質の存在の関数として標識されたリガンドの特別な場所の極性組織へ特異的に結合しうる受容体を使用することである。受容体による観察された結合効果は左右される。ある場合には、受容体の結合は単に結合した標識リガンドと非結合標識リガンドとの間の分子量の差を与えるだけである。
【０００５】
他の場合には、受容体の結合は、結合した標識リガンドと遊離標識リガンドとの分離を促進するか、あるいは標識リガンドに結合した受容体の量によって信号が変化するように標識から得られる信号の性質に影響するかもしれない。更に一つの変法は受容体を標識しリガンドを標識しないことである。他方、受容体およびリガンド両方を標識するか、または異なる受容体を二つの異なる標識で標識する。このようにすると、これら標識がごく接近しているときには相互作用が起こり、存在するリガンドの量は受容体の標識が相互作用しうる度合に影響を及ぼす。
【０００６】
広範囲の異なるリガンドに適合しうる正確な新規技術に対し、あるいは他の方法が容易に適合し得ない特別な場合に使用できる正確な新規技術に対し絶えざる要望がある。
【０００７】
均一系免疫検定法が小さい分子を対象として以前から記述されて来た。これら検定法の例として、特にＳＹＶＡ′Ｓ ＦＲＡＴTM検定、ＥＭＩＴTM検定、酵素チャンネリング免疫検定、および蛍光エネルギー移動免疫検定（ＦＥＴＩ）、酵素阻害物質免疫検定（Ｈｏｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ ａｎｄ ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ）：蛍光偏光免疫検定（Ｄａｎｔｌｉｃｋｅｒ）があげられる。
【０００８】
これらの方法はすべて感度が限られていて、ＦＥＴＩおよび酵素チャンネリング法を含む少数だけが大きい多重エピトープ性被検物質に対し適している。
【０００９】
発光性化合物、例えば蛍光性化合物および化学発光性化合物は、光を放出するその能力の故に検定分野で広い応用が見出されている。この理由のため、核酸検定および免疫検定のような検定における標識として発光物質が利用されて来た。例えば、幾つかの特異的結合対を発光物質と抱合させ、種々な実験計画が用いられている。この発光物質抱合体を、被検物質を含むことが予想される試料中の被検物質の量と関連させて固相と液相との間に分配できる。これら相のいずれかのルミネッセンスを測定することにより、観察されたルミネッセンスのレベルと試料中の被検物質の濃度とを関連づけることができる。
【００１０】
リポソームおよび赤血球ゴーストといった粒子がカプセル化した水溶性物質の担体として利用されて来た、例えば、生物活性物質を種々な用途に向けて、例えばある薬剤をリポソーム調製中にトラップし次に処置すべき患者へ投与する薬物投与方式に向けて、カプセル化するためにリポソームが使用された。
【００１１】
ラテックスビーズおよびリポソームといった粒子も検定に利用されて来た。例えば、均一系検定法において、抗体または抗原で標識したリポソームの水相に酵素をトラップすることができる。リポソームは試料および補体の存在下で酵素を遊離させる。
【００１２】
水相中にカプセル化された水溶性蛍光染料または非蛍光染料を有する、あるいは脂質小胞の脂質二重層中に溶解した脂溶性染料を有する抗体−または抗原−標識リポソームも、この表面に結合した抗体または抗原と免疫化学反応に入りうる被検物質に対する検定に利用されて来た。リポソームの水相から染料を解放するために染浄剤が使われた。
【００１３】
化学発光標識は配位子結合検定法で顕著な感度を示すが、一つ以上の化学的活性化工程を必要とするのが普通である。蛍光性標識はこの欠点をもたないが感度が低い。
【００１４】
結合する相手と共有結合でつながる基が化学的活性化によって光を発する免疫検定および核酸検定に対し化学発光標識が記述された。アクリジニウムエステルを利用する核酸検定キットがＧｅｎｐｒｏｂｅ（Ｐａｃｅ２ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商品名）、サン ジェゴ、カリフォルニア州）により販売され、またこの型の標識を使用するＭａｇｉｃＬｉｔｅ（登録商品名）免疫検定キットがＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（バーゼル、スイス）により売り出されている。
【００１５】
標識された核酸プローブから第二のプローブに結合された蛍光性受容体へのエネルギー移動がサンドイッチ核酸検定に対してＨｅｌｌｅｒ等、ＩおよびＩＩ（以下に述べる）により記述された。Ｍａｇｇｉｏ Ｉ（以下に述べる）は免疫検定に対する同様な手順を述べている。ポリヌクレオチドに共有結合した発光物質から、間に挿入された発蛍光団へのエネルギー移動がＨｅｌｌｅｒ等、ＩＶ（以下に述べる）により記述されている。
【００１６】
間に挿入された染料からポリヌクレオチド上の蛍光物質への移動は最近Ｃａｒｄｕｌｌｏ等（後述）により記述された。更にＭｃ Ｃａｐｒａ（後述）は、標識としての光増感剤（フォトセンシタイザー）の使用を記載しており、この場合光増感剤は酸素をその一重項状態に活性化し、次にこの一重項状態の酸素が加熱により光を発する化合物と反応する。
【００１７】
２．関連技術の簡単な説明
欧州特許願第０，３４５，７７６号明細書（Ｍｃ Ｃａｐｒａ）は、標識として増感剤を利用する特異的結合検定を開示している。この増感剤は、一つ以上の波長の放射線で、または他の化学的あるいは物理的刺激（例えば、電子移動、電気分解、エレクトロルミネッセンスまたはエネルギー移動）で励起することによって刺激されたとき励起状態に達し、そしてこの状態は（イ）分子状の酸素との相互作用により一重項分子酸素をつくり出す、あるいは（ロ）ロイコ染料との相互作用によって還元形（これは分子状の酸素との相互作用によりもとの非励起状態に戻り、結果として過酸化水素を生ずる）をとるというどの部分も包含している。
【００１８】
励起された増感剤との相互作用はいずれも試薬の添加により検知可能な信号を発生する。
欧州特許願第０，０７０，６８５号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、Ｉ）は非放射性エネルギー移動による均質核酸ハイブリッド形成診断法を記載している。
【００１９】
光放出ポリヌクレオチドハイブリッド形成診断法は欧州特許願第０，０７０，６８７号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、ＩＩ）に記載されている。
【００２０】
欧州特許願第０，２３２，９６７号明細書（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｉ）は標的のポリヌクレオチドらせんに対する検定を行なうための方法と組成物を記載している。その方法は第一および第二のポリヌクレオチドプローブを含む試薬と試料とを接触させるものである。
【００２１】
これら第一および第二のプローブは、プローブが互に拘束される最初の位置およびプローブが標的に結合される第二の位置をとりうる。これらプローブはそれがこれら二つの位置の一つに存在することを表示する信号を生ずるように相互作用しうる標識部分を含む。
【００２２】
欧州特許願第０，３１５，３６４号明細書は、液体中の抗原または抗体の存在あるいは濃度を決定する免疫化学検定法を記載している。この検定法は、（イ）第一の標識された抗体または抗原、第二の標識抗体または抗原、および測定しようとする抗原または抗体の３成分複合体をつくり、そして（ロ）抗原物質に結合された相互の接近により高められた第一の標識と第二の標識との間の相互作用により、少なくとも一つの基質の存在下で生ずる信号を検知する、ことからなる。
【００２３】
欧州特許願第０，２２９，９４３号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、ＩＩＩ）は、ポリヌクレオチドハイブリッド形成検定法に対する蛍光ストークスシフトプローブを記載している。
【００２４】
米国特許第４，２２６，９９３号明細書（Ｂｕｃｋｌｅｒ等）は、化学発光性フタルヒドラジドで標識した抱合体の合成中間体として有用な免疫機能を与えたフタルヒドラジドを記載している。この抱合体は、液体媒質中で配位子あるいはその特異的な結合相手を測定するための特異的結合検定法における試薬として役立つ。
【００２５】
米国特許第４，３８０，５８０号および第４，３８３，０３１号明細書（Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ等、ＩおよびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ等、ＩＩ）はそれぞれ不均質および均質化学発光特異的結合検定法を記載している。
【００２６】
米国特許第４，２２０，４５０（Ｍａｇｇｉｏ Ｉ）は化学的に誘導される蛍光免疫検定法を記載している。
【００２７】
米国特許第４，６５２，５３３号明細書（Ｊｏｌｌｅｙ）は発光性標識を取り込んだ固相免疫検定法を記載している。
【００２８】
米国特許第４，２７７，４３７号明細書（Ｍａｇｇｉｏ ＩＩ）は化学的に誘導された蛍光免疫検定法を実行するためのキットを記載している。
【００２９】
Ｈｅｌｌｅｒ等（ＩＶ）は、「Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ」（１９８５），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，２４５〜２５７頁で、ＤＮＡハイブリッド形成方式のための化学発光性および蛍光性プローブを記載している。
【００３０】
Ｈａｒａ等は、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．（１９８４）５７：３００９〜３０１０で、化学発光触媒として金属錯体化合物を使用する免疫検定法を述べている。
【００３１】
Ｋｕｓｃｈｎｉｒ等は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９６９）１９３．において、６−アミノフタラジン−１，４−（２Ｈ３Ｈ）−ジオン中ルミノールの光増感化学発光を記載している。
【００３２】
非放射性蛍光滞留エネルギー移動による核酸ハイブリッド形成の検出法がＣａｒｄｕｌｌｏ等によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５：８７９０〜８７９４に記載されている。
【００３３】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）１８３：２３１〜２４４の中で、相互作用のある蛍光標識および競合的ハイブリッド形成を用いるポリヌクレオチドの溶液相検出法を述べている。
【００３４】
Ｚｏｍｅｒ等は、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ（１９８９）２２７：１１〜１９の中で、化学発光標識を述べている。
【００３５】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＩＩは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）１７４：１０１〜１２０の中で、エネルギー移動の時間分割検出法：理論および免疫検定への応用を述べている。
【００３６】
米国特許第４，２９９，９１６号明細書（Ｌｉｔｍａｎ等、Ｉ）は免疫検定法においてある表面上での優先的信号生成を記載している。
米国特許第４，２３３，４０２号明細書（Ｍａｇｇｉｏ等）はチャンネリングを使用する試薬および方法を記載している。
【００３７】
米国特許第４，２６１，９６８号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、Ｉ）は免疫検定法における免疫学的対による蛍光消光を記載している。
【００３８】
米国特許第４，３１８，７０７号明細書（Ｌｉｔｍａｎ等、ＩＩ）は特異的受容体検定法における高分子蛍光消光剤粒子を記載している。
【００３９】
米国特許第４，６５０，７７０号明細書（Ｌｉｕ等）は、発光競合タンパク質結合検定法におけるエネルギー吸収粒子による消光を記載している。
【００４０】
米国特許第４，６５４，３００号明細書（Ｚｕｋ等）は蛍光マイクロビーズ消光検定法を記載している。
米国特許第４，１７４，３８４号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＩ）は免疫検定法における免疫学的対による蛍光消光を記載している。
【００４１】
米国特許第４，１９３，９８３号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＩＩ）は標識したリポソーム粒子組成物およびそれによる免疫検定法を開示している。
【００４２】
米国特許第４，１９９，５５９号および第３，９９６，３４５号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＶおよびＶ）は、免疫検定法における免疫学的対による蛍光消光を記載している。
【００４３】
Ｏ′Ｃｏｎｎｅｌ等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，（１９８５）、３１（９），１４２４−１４２６は、リポソームの水相中にトラップされた染料を有する大きい単層リン脂質小胞を利用するジゴキシンの比色免疫検定法を開示している。
【００４４】
特許第３，８５０，５７８号（Ｍｃ Ｃｏｎｎｅｌｌ）、第４，４８３，９２１号（Ｙａｖｅｒｂａｕｍ）、および第４，４８３，９２９号明細書（Ｓｚｏｋａ）は、抗原または抗体が脂質小胞の表面に結合される免疫反応性リポソーム試薬を開示している。
【００４５】
米国特許第４，５２９，５６１号（Ｈｕｎｔ等）、第４，５２２，８０３号（Ｌｅｎｋ等）および第４，４８５，０５４号明細書（Ｍｅｚｅｉ等）は脂質小胞を調製する種々な方法を記載している。
【００４６】
米国特許第４，３１１，７１２号明細書（Ｅｖａｎｓ等）は凍結乾燥リポソーム混合物の調製法を開示している。
米国特許第４，５８８，５７８号明細書（Ｆｏｕｎｔａｉｎ等）は単相脂質小胞の製造法および薬物投与系におけるこのような小胞の使用を開示している。
【００４７】
米国特許第４，５７６，９１２号明細書は、多数の発蛍光団を付けたある種の長鎖担体を使用する免疫検定の蛍光レベルを高める方法を開示している。
【００４８】
米国特許第４，８９１，３２４号明細書は検定用に発光物質を有する粒子を記載している。
植物に有毒なリポソームによるＴリンパ球の選択的殺細胞がＹｅｍｕ等（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：２４６−２５０により記述されている。
【００４９】
Ｍｅｗ等はＪ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３０（３）：１４７３−１４７７（１９８３）の中で光免疫療法：腫瘍特異的モノクローン抗体−ヘマトポルフィリン抱合体を用いる動物腫瘍の治療を開示している。
【００５０】
小さい単分子の光学顕微鏡による観察がＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄ（１９７６）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ，１５（１２）：３１３５−３１３９により論議されている。
欧州特許願第０，３２２，９２６号明細書（Ｍｃ Ｃａｐｒａ等）は改良化学発光エステル類、チオエステル類、およびアミド類を利用する検定法を記載している。
【００５１】
欧州特許願第０，３５２，７１３号明細書（Ｓｃｈａａｐ）は１，２−ジオキセタン類からの化学発光を高める方法と組成物を記載している。
【００５２】
米国特許第４，９７８，６１４号明細書（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）はジオキセタン類の酵素誘導分解を用いる物質検出法を開示している。
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等（米国特許第４，９５６，４７７号明細書）は１，２−ジオキセタン類の合成法を述べている。
【００５３】
Ｓｃｈａａｐ等はＷＯ第９０／０７５１１号の中で拘束蛍光物質へのエネルギー移動を通して１，２−ジオキセタン類からルミネッセンスの増強を記載している。
【００５４】
米国特許第４，９５９，１８２号明細書（Ｓｃｈａａｐ）は、１，２−ジオキセタン類からの化学発光を増大させる方法ならびに組成物を開示している。
米国特許第４，９６２，１９２号（Ｓｃｈａａｐ）および第４，８５７，６５２号明細書（Ｓｃｈａａｐ）は化学発光を示す１，２−ジオキセタン化合物を記載している。
【００５５】
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等は米国特許第４，９３１，２２３号明細書中で化学発光を示す１，２−ジオキセタン類を使用する方法を述べている。
ＷＯ第９０／０２７４２号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）には安定な水溶性ジオキセタン類の精製法が開示されている。
縮合多環式環を含む新規な化学発光性１，２−ジオキセタン類およびそれを用いる検定法がＷＯ第９０／００１６４号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）に記載されている。
【００５６】
ＷＯ第８９／０６２２６号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）は１，２−ジオキセタン類およびその中間体の合成を記載している。
Ｎｅｃｋｅｒｓ等は米国特許第４，３１５，９９８号明細書中で重合体に結合させた光増感触媒を述べている。
【００５７】
ジオキセタン類の酵素誘導分解を使用する物質検出法がＷＯ第８８／００６９５号（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等）に記載されている。
欧州特許願第０，３２４，２０２号明細書（Ｚｏｍｅｒ等）は化学発光標識物としてアクリジニウム化合物を開示している。
欧州特許願第０，１４４，９１４号明細書（Ａｌｂｅｒｅｌｌａ等）は、ハイブリッド結合試薬の標識対を用いるハイブリッド形成検定法を記載している。
【００５８】
欧州特許願第０，４０１，００１号明細書（Ｕｒｄｅａ等）は、化学発光性二重トリガー１，２−ジオキセタン類を記載している。
【００５９】
【発明の開示】
課題を解決するための手段
本発明は被検物質の定量法に関する。
【００６０】
本発明の一面は被検物質を定量する方法であり、本法は被検物質を含むと思われる媒質を（メジウム）を、本質的に準安定な化学種を生ずるように処理することからなる。この化学種は媒質中に拡散し、そして被検物質存在のために前記化学種にごく接近した準安定化学種と反応することのできる媒質中のある物質と選択的に反応することができる。本法は更に前記化学種が物質と反応したかどうかを決定することからなる（その反応が媒質中の被検物質の量を表示する）。
【００６１】
本発明のもう一つの具体例は、液体媒質中の被検物質に対する検定法の改良である。この検定法は、被検物質を含むと思われる媒質を処理して被検物質の存在と関連した特異的結合対（ｓｂｐ）複合体を形成せしめ、そしてこの複合体が形成されたかどうかを測定する工程からなる。
【００６２】
その改良点は媒質を（１）特異的結合対の構成要素と関連する光増感剤と、そして（２）ｓｂｐ構成要素（ｓｂｐメンバー）と関連する化学発光性化合物とを一緒にすることからなり、この光増感剤の活性化により化学発光性化合物から放出される光の量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６３】
本発明方法のもう一つの具体例は、被検物質が、もし存在するとすれば、光増感剤および化学発光性化合物を非常に接近させるような条件下で、被検物質を含むと思われる媒質を処理することからなる。
【００６４】
結果として、光増感剤によりつくり出された一重項酸素が化学発光性化合物を活性化し、これがその後光あるいはルミネッセンスを発する。発生する光の量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６５】
もう一つの具体例をあげると、被検物質を測定するための本発明方法は、第一段階として被検物質を含むと思われる媒質、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成要素と関連をもつ光増感剤、および化学発光性化合物を含有してなる懸濁性粒子からなるコンビネーションを提供することからなる。
【００６６】
この懸濁性粒子はそれに結合した（ｓｂｐ）構成要素を有する。このコンビネーシヨンを処理して光増感剤を励起させると、その励起状態で光増感剤が酸素を活性化し一重項状態にすることができる。次にコンビネーションを発せられたルミネッセンスの量について調べる。このようなルミネッセンスの量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６７】
別法として、化学発光性化合物をｓｂｐ構成要素と併合し、懸濁性粒子が光増感剤を含有しかつそれに結合したｓｂｐ構成要素を有するようにすることができる。
【００６８】
もう一つの具体例はコンビネーションを与える被検物質の測定法である。このコンビネーションは被検物質を含むと思われる媒質、第一のｓｂｐ構成要素と併合させた光増感剤、および第二のｓｂｐ構成要素と併合させた化学発光性化合物からなる。次に光増感剤を励起させるとこれが酸素を活性化して一重項状態とし、この一重項酸素が光増感剤と接近して存在する化学発光性化合物を活性化する。コンビネーションから発せられたルミネッセンスは被検物質の量と関係づけられる。
【００６９】
もう一つの具体例は被検物質の測定法である。本法は、被検物質を含むと思われる試料、添加された化学発光性物質および結合したｓｂｐ構成要素を有する第一の懸濁性粒子、および粒子がそれに結合されたｓｂｐ構成要素を有する場合に酸素を活性化してその一重項状態にすることのできる光増感剤を添加した第二の懸濁性粒子を水性媒質中で合わせることからなる。
【００７０】
次に、この媒質を照射して酸素の一重項状態をつくり出し、媒質から発せられたルミネッセンスの量を測定する。このようなルミネッセンスの量を媒質中の被検物質の量と関連づける。
【００７１】
本発明のもう一つの具体例は、化学発光性化合物を添加した懸濁性粒子からなる組成物に関し、この場合、前記粒子はそれに結合したｓｂｐ構成要素を含有する。更に本組成物は光増感剤を添加した懸濁性粒子からなることができる。
【００７２】
本発明のもう一つの具体例は（１）化学発光性化合物を有する懸濁性粒子（この場合、粒子はそれに結合されたｓｂｐ構成要素を含有する）および（２）光増感剤を含む組成物を包装されたコンビネーション中に含有してなるキットに関する。このキットは光増感剤を含有してなる第二の懸濁性粒子（この場合、前記粒子はそれに結合されたｓｂｐ構成要素を有する）からなる組成物を更に包含することができる。
【００７３】
もう一つの具体例をあげると、このキットは（１）第一のｓｂｐ構成要素と併合された化学発光性化合物および（２）その励起状態において、第二のｓｂｐ構成要素と併合された酸素をその一重項状態に活性化することのできる光増感剤からなる。
【００７４】
本発明のもう一つの具体例は、（１）被検物質を含むと思われる媒質、（２）光化学的に活性化できる化学発光性化合物と併合させた第一の特異的結合対（ｓｂｐ）構成要素からなる標識試薬を用意し、第一のｓｂｐ構成要素は被検物質または第二のｓｂｐ構成要素に結合して被検物質の存在と関係づけられる複合体を形成しうるものであり、前記化学発光性化合物を光化学的に活性化し、そして化学発光性化合物により発生するルミネッセンスの量を検知することからなり、このルミネッセンスの量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００７５】
もう一つの具体例をあげると、被検物質を測定するための本発明方法は、第一段階として（１）被検物質を含むと思われる媒質、および（２）光化学的に活性化しうる化学発光性化合物に結合された特異的結合対の構成要素（ｓｂｐ構成要素）からなる標識試薬を、前記標識試薬を含むｓｂｐ構成要素複合体が媒質中の被検物質の存在と関係をもって形成される条件下に、検定媒質中で一緒に合わせることからなる。
【００７６】
検定媒質を光照射して光化学的に活性化しうる化学発光性化合物を活性化する。検定媒質を発光について調べる。このような信号発光の存在または強度を前記媒質中の被検物質の量と関係づける。化学発光性化合物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化しうる。媒質中にエネルギー受容体を加えておく。
【００７７】
もう一つの具体例は被検物質の定量法である。この方法は（１）被検物質を含むと思われる媒質、（２）光または一重項酸素と反応したとき化学発光しうる化合物に結合された特異的結合対の第一の構成要素（ｓｂｐ構成要素）、および（３）第二のｓｂｐ構成要素に結合されたエネルギー受容体、あるいは結合するようになる可能性のあるエネルギー受容体からなる不溶化試薬を水性媒質中で同時にあるいは全体的にあるいは部分的に順次に合わせることからなる。
【００７８】
標識試薬が媒質中の被検物質の存在との関係で形成され、化学発光性化合物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化しうる条件を選ぶ。前記化合物は光あるいは一重項酸素によって活性化される。検定媒質をルミネッセンスについて調べ、その存在あるいは強度を媒質中の被検物質の量と関係づける。
【００７９】
本発明のもう一つの具体例は被検物質の定量法である。
【００８０】
本法は（イ）（１）被検物質を含むと思われる媒質、（２）一重項酸素と反応したとき化学発光を起こしうる化合物に結合された特異的結合対の第一の構成要素（ｓｂｐ構成要素）からなる標識試薬、（３）一重項酸素発生剤、および（４）第二のｓｂｐ構成要素に結合された、あるいは結合するようになる可能性のあるエネルギー受容体からなる試薬を、標識試薬を含むｓｂｐ構成要素複合体が媒質中の被検物質の存在との関係で形成されそして化学発光性化合物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化することができる条件下に、検定媒質中で同時にあるいは全体的にあるいは部分的に順次合わせ、（ロ）一重項酸素発生体を活性化し、そして（ハ）検定媒質を信号について調べ、信号の存在あるいは強度を媒質中の被検物質の量と関係つげることからなる。
【００８１】
本発明のもう一つの具体例はポリヌクレオチド被検物質の定量法である。
【００８２】
そして本法は（イ）（１）ポリヌクレオチド被検物質を含むと思われる試料および（２）ポリヌクレオチドに結合された光化学的に活性化しうる化学発光性化合物からなる標識試薬（その少なくとも一部分は前記ポリヌクレオチド被検物質でハイブリッド形成できる）を、標識試薬が、もし存在するとすればポリヌクレオチド被検物質とハイブリッド形成する条件下に、検定媒質中で合わせ、（ロ）検定媒質を照射して光化学的に活性化しうる化学発光性化合物を活性化し、そして（ハ）媒質のルミネッセンスを測定することからなる。このルミネッセンスの量を試料中の被検物質の量と関係づける。
【００８３】
本発明のもう一つの具体例はｓｂｐ構成要素に結合された光化学的に活性化しうる化学発光性化合物からなる組成物である。本発明のもう一つの具体例はこのような組成物を含有してなるキットである。
【００８４】
図面の記述
【００８５】
図１はビタミンＢ12の検定結果のグラフによる描写である。
図２はジゴキシンの検定結果のグラフによる描写である。
【００８６】
図３は本発明によるＨＣＧの検定結果のグラフによる描写である。
図４は本発明による試験結果のグラフによる描写である。
【００８７】
図５は本発明によるＴＳＨに対する検定結果のグラフによる描写である。
図６は図５のグラフによる描写の一部である。
【００８８】
図７は本発明によるＨＣＧに対する別の検定結果のグラフによる描写である。
図８はＤＮＡハイブリッド検出検定の結果のグラフによる描写である。
【００８９】
図９は合成標的の検出結果のグラフによる描写である。
図１０は全トリヨードチロニン検定のグラフによる描写である。
【００９０】
特別な具体例の説明
【００９１】
本発明は被検物質の定量法に向けられている。
本発明の一面は、被検物質を含むと思われる媒質を処理して本質的に準安定化学種をつくることからなる被検物質の定量法である。この化学種は媒質中に拡散することが可能であり、そして被検物質の存在により化学種にごく接近した準安定化学種と反応することのできる媒質中の物質と選択的に反応することが可能である。
【００９２】
本法は更に化学種が該物質と反応したかどうかを決定することからなり、その反応は媒質中の被検物質の量を指示する。
【００９３】
一般にこの準安定化学種は励起状態である。準安定化学種は１ミリ秒未満、通常は１００ミリ秒未満、更に一般的には１０ミリ秒未満の寿命をもつ。この準安定化学種は媒質中に拡散する性質がある、即ちそれがある部位で生成し、その生成部位から他の部位へ移動しそこでエネルギーを移したり、前記部位で分子と反応することができる。
【００９４】
この準安定化学種はｔｒａｎｓ−シクロヘキセン、α−ラクトン、トリメチレンメタンなどの群から生ずるラジカルイオン、ナイトレン、カルベンといった反応性中間体のいずれでもよい。特に関心をもたれているものは励起一重項状態、例えば一重項酸素、三重項状態、およびジオキセタン類、例えばジオキセタノンおよびジオキセタンジオンである。
【００９５】
三重項状態は一般に適当な増感剤、例えばピレン、をエネルギー受容体、例えばアントラセンと結合させることによりつくられる。例えば、ジブロモアントラセンは三重項状態をとるエネルギー受容体として作用しうる。三重項状態はそのエネルギーを他の分子に移動させるように進行し、光の発生といった検知可能な光化学的反応を開始する。ジオキセタン類、例えばジオキセタンジオンは活性な分子と一重項酸素または過酸化水素との反応から生ずる。例えば、適当なオキサレートおよび過酸化水素はオキセタンジオンを生成する。
【００９６】
セイヨウワサビのペルオキシダーゼのような酵素は一般にラジカル陽イオンまたは一重項酸素を発生させることができ、そして後者は同様に準安定であり、他の分子と反応して検知可能な信号を与えることができる。
【００９７】
特異的結合対複合体の存在は、複合体の一構成要素によって準安定化学種をつくり出すことにより定量できる。このようにするとこの化学種は、該要素が複合体内にないとき前記構成要素と相互作用することなく、複合体の別の構成要素と選択的に相互作用しうる。
【００９８】
本発明の一面においては、光増感剤およびリガンド、受容体またはポリヌクレオチドからなる組成物が、検定中化学発光性化合物およびリガンド、受容体またはポリヌクレオチドからなる組成物へ結合する。この化学発光性化合物は一重項酸素と反応することができ、そして生じた生成物は光を発して分解する。一重項酸素は、通常は光増感剤の照射により光増感剤によって発生する。
【００９９】
化学発光性化合物を含有する組成物に結合されない光増感剤によってつくり出された一重項酸素は減衰（ｔ1/2は水中で約２マイクロ秒である）を受ける前に化学発光性化合物に到達できない。化学発光性化合物を含有する組成物に結合するようになる光増感剤を含有する組成物は一重項酸素をつくり出し、これが化学発光性化合物と反応する。それはこのようにすると光増感剤と化学発光性化合物との間に実現された短い距離をこのような一重項酸素が存続できるようになるからである。
【０１００】
距離の短縮は試料中に被検物質が存在する結果起こる。一重項酸素が移動する距離の一部分は有機媒質経由がよく、この媒質中で一重項酸素ははるかに長い寿命、即ち約１００マイクロ秒より長い寿命、をもつ。被検物質は光増感剤を含有する組成物と化学発光性化合物を含有する組成物との間の結合を調節しなければならない。通常は、化学発光性化合物および光増感剤の少なくとも一つは表面、とりわけその表面が懸濁性粒子からなる場合の表面と関わりをもつ。
【０１０１】
光増感剤とごく接近して化学発光性化合物の一重項酸素励起を含む上記方法は、前記Ｍｃ Ｃａｐｒａの方法と区別すべきである。Ｍｃ Ｃａｐｒａの特許出願明細書４頁３８−４６行に失活形式で行なう検定法が記載されている。Ｍｃ
Ｃａｐｒａの検定法は、増感剤を抱合させた特異的結合物質および被検物質の複合体と特異的に結合しうる反応体を利用して増感剤抱合体−反応体複合体を形成させるものである。失活部分は反応体に付けられる。
【０１０２】
増感剤にきわめて接近させたとき、その失活部分は結合した増感剤の励起の結果として生ずる信号を減少あるいは失活させるか、あるいは励起された増感剤に対する電子またはエネルギーの中間体化学種（即ち、分子状酸素またはロイコ染料）への移動を減少あるいは失活させる。この失活形式で被検物質の存在は減衰しつつあるジオキセタンのルミネッセンスと関係づけられる。このようにして、Ｍｃ Ｃａｐｒａは上記米国特許第４，２２０，４５０号および第４，２７７，４３７号明細書を引用している。
【０１０３】
Ｍｃ Ｃａｐｒａにより記述されたこの失活検定法形式は励起された増感剤の失活のみを含み、特異的結合構成要素と関連する化学発光性化合物の一重項酸素による活性化を包含しない。
【０１０４】
更にまたＭｃ Ｃａｐｒａ １４頁３５〜３６行には、化学発光性部分からのエネルギー移動でポリヌクレオチドプローブ検定における増感剤を励起させることが記載されている。Ｍｃ Ｃａｐｒａによるこの記述は完全に本発明から区別される。即ち、本発明は存在する被検物質によって光増感剤と化学発光性化合物とを互にきわめて接近させる方法であり、そこで励起された光増感剤が一重項酸素をつくり出し、次にこれが化学発光性化合物を活性化するのである。
【０１０５】
本発明のもう一つの面においては、光化学的に活性化されて発光性生成物になりうる物質群を標識として使用する。この物質群は特異的結合対の一構成要素と関連し、そしてこの試薬は被検物質の検出のための検定において標識試薬として利用される。光化学的活性化は前記物質群を光で照射するか、あるいは一重項と物質群との反応により達成できる。なるべくは、活性化が一重項酸素による場合増感剤を用いて光活性化を促進するのがよい。通常は増感剤が光を吸収し、このようにして形成された励起増感剤が酸素を活性化し、一重項酸素が標識と反応して準安定発光性中間体を与える。
【０１０６】
標識として用いる物質群は増感によってあるいは増感なしに光活性化を受ける化学発光性化合物のいずれをも包含し、なるべくは一重項酸素との反応により活性化される物質群である。本発明に係る標識は被検物質を定量するための均質および不均質両方の検定実験計画に使用できる。増感剤およびエネルギー受容体があってもなくても化学発光性化合物を活性化するために化学的試薬を添加する必要がないことが望ましい。
【０１０７】
均質実験計画案においては全試薬を合わせ、媒質を照射して化学発光性化合物を活性化する。
【０１０８】
この検定実験計画案においては、成分をコンビネーションとして提供し、増感剤による酸素の活性化の関数として生じた光は被検物質濃度の関数であろう。本発明方法は光を発生させるのに媒質を加熱せずに実施できるのが有利な点である。従って、本発明検定法は一定温度で行なうことができる。
【０１０９】
本発明の特別な具体例についての説明を更に続ける前に、幾つかの用語を定義し、詳細に説明することにする。
【０１１０】
被検物質−−検出すべき化合物または組成物。被検物質は特異的結合対（ｓｂｐ）の一構成要素からなることができ、そしてリガンド（これは一価（モノエピトープ）または多価（ポリエピトープ）で、通常は抗原またはハプテンである）のこともあり、また少なくとも一つの共通したエピトープ部位かデテルミナント部位を共有する単一化合物または複数の化合物である。
【０１１１】
被検物質は細胞、例えば細菌の部分、あるいは血液型抗原、例えばＡ，Ｂ，Ｄなどを有する細胞の部分、あるいはＨＬＡ抗原あるいは微生物、例えば細菌、真菌、原虫、またはウイルスのこともある。
【０１１２】
多価リガンド被検物質は通常はポリ（アミノ酸）、即ちポリぺプチドおよびタンパク質、多糖類、核酸、およびこれらのコンビネーションである。このようなコンビネーションには細菌、ウイルス、クロモソーム、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が含まれる。
【０１１３】
大抵の場合、本発明検定法を適用できるポリエピトープリガンド被検物質は、少なくとも約５，０００、もっと一般的には少なくとも約１０，０００の分子量を有するであろう。ポリ（アミノ酸）のカテゴリー中対象となるポリ（アミノ酸）は一般に分子量約５，０００から５，０００，０００、更に普通には分子量約２０，０００から１，０００，０００であろう。対象となるホルモンのうち、その分子量は約５，０００から６０，０００に及ぶのが普通である。
【０１１４】
多種多様なタンパク質が同様な構造上の特徴をもつタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特定の微生物、とりわけ病原性微生物に関係あるタンパク質の仲間に関して考慮される。このようなタンパク質には、例えば、免疫グロブリン、シトキン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー、組織特異性抗原などが含まれる。
【０１１５】
下記は構造により関係づけられるタンパク質の分類である。
プロタミン
ヒストン
アルブミン
グロブリン
硬タンパク質
リンタンパク質
ムコタンパク質
【０１１６】
色素タンパク質
リポタンパク質
核タンパク質
糖タンパク質
Ｔ−細胞受容体
プロテオグリカン
ＨＬＡ
分類に入らないタンパク質、例えばソマトトロピン、プロラクチン、シンシ
ュリン、ペプシン。
【０１１７】
ヒト血漿中に見出される幾つかのタンパク質は臨床的に重要であり、それらには下記のものが包含される。
【０１１８】
プレアルブミン
アルブミン
α1−リポタンパク質
α1−アンチトリプシン
α1−糖タンパク質
【０１１９】
トランスコルチン
４．６Ｓ−ポストアルブミン
貧トリプトファンα1−糖タンパク質
α1Ｘ−糖タンパク質
チロキシン結合グロブリン
インター−α−トリプシン−阻害物質
【０１２０】
Ｇｃ−グロブリン
（Ｇｃ１−１）
（Ｇｃ２−１）
（Ｇｃ２−２）
【０１２１】
ハプトグロブリン
（Ｈｐ１−１）
（Ｈｐ２−１）
（Ｈｐ２−２）
【０１２２】
セルロプラスミン
コリンエステラーゼ
α2−リポタンパク質（複数）
ミオグロビン
Ｃ−反応性タンパク質
【０１２３】
α2−マクログロブリン
α2−ＨＳ−糖タンパク質
Ｚｎ−α2−糖タンパク質
α2−ニューラミノ−糖タンパク質
エリトロポイエチン
β−リポタンパク質
【０１２４】
トランスフェリン
ヘモペキシン
フィブリノゲン
プラスミノゲン
β2−グリコプロティンＩ
β2−グリコプロティンＩＩ
免疫グロブリンＧ
【０１２５】
（ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン
分子式：
γ2κ2またはγ2λ2
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）
またはγＡ−グロブリン
分子式：
（α2κ2）nまたは（α2κ2）n
免疫グロブリンＭ
（ＩｇＭ）またはγＭ−グロブリン
分子式：
（μ2κ2）5または（μ2λ2）5
免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）
またはγＤ−グロブリン（γＤ）
分子式：
（δ2κ2）または（δ2λ2）
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）
またはγＥ−グロブリン（γＥ）
分子式：
（ε2κ2）または（ε2λ2）
自由κおよびλ軽鎖
補体因子：
Ｃ′１
Ｃ′１ｑ
Ｃ′１ｒ
Ｃ′１ｓ
Ｃ′２
Ｃ′３
β1 A
α2Ｄ
Ｃ′４
Ｃ′５
Ｃ′６
Ｃ′７
Ｃ′８
Ｃ′９
重要な血液凝固因子には下記のものが含まれる：
【表１】
【０１２６】
重要なタンパク質ホルモンには下記のものが含まれる：
ぺプチドおよびタンパク質ホルモン
パラチロイドホルモン
（パラトロモン）
チロカルシトニン
インシュリン
グルカゴン
【０１２７】
リラキシン
エリトロポィエチン
メラノトロピン
（メラニン細胞刺激ホルモン：インターメジン）
ソマトトロピン
（成長ホルモン）
【０１２８】
コルチコトロピン
（副腎皮質刺激ホルモン）
チロトロピン
濾胞刺激ホルモン
黄体形成ホルモン
（間質細胞刺激ホルモン）
ルテオマモトロピックホルモン
（ルテオトロピン、プロラクチン）
ゴナドトロピン
（絨毛性性腺刺激ホルモン）
【０１２９】
組織ホルモン
セクレチン
ガストリン
アンギオテンシンＩおよびＩＩ
ブラジキニン
ヒト胎盤性ラクトゲン
【０１３０】
シトキン
ＩＬ Ｉ
ＩＬ ＩＩ
ＩＬ ＶＩ
ＥＧＦ
ＴＮＦ
ＮＧＦ
【０１３１】
癌抗原
ＰＳＡ
ＣＥＡ
ａ−フェトプロテイン
酸ホスファターゼ
ＣＡ１９．９
ＣＡ１２５
【０１３２】
組織特異的抗原
アルカリ性ホスファターゼ
ミオグロビン
ＣＰＫ−ＭＢ
カルシトニン
ミエリン塩基性タンパク質
【０１３３】
神経下垂体から生ずるぺプチドホルモン
オキシトシン
バソプレッシン
終結因子（ＲＦ）
【０１３４】
ＣＲＦ，ＬＲＦ，ＴＲＦ，ソマトトロピン−ＲＦ，ＧＲＦ，ＦＳＨ−ＲＦ，ＰＩＦ，ＭＩＦ
【０１３５】
対象となる他の重合体物質はムコ多糖類と多糖類である。
【０１３６】
代表的微生物には次のものが包含される：
【表２】
【表３】
【０１３７】
モノエピトープリガンド被検物質は、一般に分子量約１００から２，０００、より普通には分子量１２５から１，０００であろう。これら被検物質の例として薬物、代謝生成物、有害生物防除剤、汚染物質などがあげられる。分析対象となる薬物にアルカロイドが含まれる。アルカロイドの中にはモルヒネ系アルカロイド、例えばモルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、これらの誘導体および代謝生成物；コカイン系アルカロイド、例えばコカインおよびベンジルエクゴニン、それらの誘導体および代謝生成物；麦角アルカロイド、例えばリセルグ酸のジエチルアミド；ステロイドアルカロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリンアルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キノリンアルカロイド；例えばキニーネおよびキニジン；ジテルペンアルカロイド、それらの誘導体および代謝生成物がある。
【０１３８】
薬物の次の群にはステロイド類、例えば、エストロゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカルステロイド、胆汁酸、強心性配糖体およびアグリコン類、例えば、ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニン、それらの誘導体および代謝生成物が包含される。また、擬ステロイド物質、例えばジエチルスチルベストロールも含まれる。
【０１３９】
薬物の次の群は５から６環員を有するラクタム類、例えばバルビツール酸誘導体、例えばフェノバルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれらの代謝生成物である。
【０１４０】
薬物の次の群は２から３炭素原子を有するアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタミン；カテコールアミン、例えばエフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリン、および上記物質の代謝生成物である。
【０１４１】
薬物の次の群はベンズ複素環化合物で、それらにはオキサゼパム、クロロプロマジン、テグレトール、それらの誘導体および代謝生成物が含まれる。上記複素環はアゼピン類、ジアゼピン類およびフエノチアジン類である。
【０１４２】
薬物の次の群はプリン類、例えばテオフィリン、カフェイン、それらの代謝生成物および誘導体である。
薬物の次の群には***から誘導されるもの、例えばカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールが含まれる。
【０１４３】
薬物の次の群はホルモン類、例えばチロキシン、コルチゾル、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジオール、エストロン、プロゲストロン、ポリぺプチド、例えばアンギオテンシン、ＬＨＲＨ、および免疫抑制物質、例えばシクロスポリン、ＦＫ５０６、マイコフェノール酸などである。
【０１４４】
薬物の次の群にはビタミン類、例えばＡ、Ｂ、例えばＢ12、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、サイアミンが含まれる。
薬物の次の群はプロスタグランジン類であり、これらはヒドロキシル化および不飽和の程度と部位によって異なる。
【０１４５】
薬物の次の群は三環式抗うつ剤、例えばイミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン、クロミプラミン、ドキセピン、およびデスメチルドキセピンである。
【０１４６】
薬物の次の群は抗新生物剤、例えばメトトレキセートである。
薬物の次の群は抗生物質、例えばペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、その代謝生成物と誘導体である。
【０１４７】
薬物の次の群はヌクレオシドおよびヌクレオチドで、それらにはＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジン（適当な糖およびリン酸置換基をもつ）が含まれる。
【０１４８】
薬物の次の群は種々雑多な個々の薬物で、それらにはメタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロン酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、クロラムフェニコール、抗コリン作動薬、例えばアトロピン、それらの代謝生成物および誘導体が含まれる。
【０１４９】
罹患状態に関係する代謝生成物にはスペルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸、およびポルフィリン１型が含まれる。
【０１５０】
薬物の次の群はアミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およびアミカシンである。
対象となる有害生物防除剤にはポリハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハロゲン化スルフェンアミド、それらの代謝生成物および誘導体がある。
【０１５１】
受容体被検物質に対する分子量は一般に１０，０００から２×１０8、更に普通には１０，０００から１０6であろう。免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭに対する分子量は一般に約１６０，０００から約１０6を変化するであろう。酵素の分子量は一般に約１０，０００から１，０００，０００にわたるであろう。
【０１５２】
天然の受容体は多種多様であり、例えばアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランスコルチンなどを含めて、分子量は一般に少なくとも約２５，０００であり、分子量１０6以上のこともある。
【０１５３】
被検物質という用語は更にポリヌクレオチド被検物質、例えば下に定義されているポリヌクレオチドを包含する。これらにはｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ｔ−ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ二重らせんなどが含まれる。被検物質という用語はまたポリヌクレオチド結合剤である受容体、例えば制限酵素、活性化物質、抑制因子、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵素、化学療法剤などをも包含する。
【０１５４】
被検物質は宿主から得た体液のような試料中に直接見出される分子のことがある。この試料は直接検査することができるが、あるいは被検物質を一層容易に検出できるようにするため前処理することもある。更にまた、対象とする被検物質の証明となる作用因子、例えば対象被検物質に対して相補的な特異的結合対の構成要素（対象被検物質が試料中に存在するときにのみその存在が検出されるもの）を検出することによって定量することもできる。従って、被検物質の証明となる作用因子は、検定で検出される被検物質となる。
【０１５５】
体液は例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、***、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液などでよい。
【０１５６】
特異的結合対の構成要素（「ｓｂｐメンバー」）−−二つの異なる分子の一方のことで、他の分子の特別な場所の極性組織に特異的に結合し、そのため後者と相補的であると定義される表面上あるいは空洞の中に或る領域を有する分子。特異的結合対の構成要素を指してリガンドおよび受容体（アンチリガンド）という。これらは通常は抗原−抗体のように免疫学的な対の構成要素であるが、他の特異的結合対、例えばビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二重らせん、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、ポリヌクレオチド対、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどは免疫学的対ではないけれども、本発明ならびにｓｂｐ構成要素の定義に包含される。
【０１５７】
ポリヌクレオチド−−自然の状態で約５０から５００，０００個以上のヌクレオチドを有し、また単離された状態で約１５から５０，０００個以上のヌクレオチド、通常は約１５から２０，０００個のヌクレオチド、更にしばしば１５から１０，０００個のヌクレオチドを有する重合体ヌクレオチドである化合物あるいは組成物。
【０１５８】
ポリヌクレオチドには天然に存在するか合成的につくられた精製または未精製の形にあるいずれかの給源から得られる核酸、例えばＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、通常はＤＮＡが包含され、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはその混合物、遺伝子、クロモソーム、プラスミド、生物学的材料、例えば微生物、例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、かび、真菌、植物、動物、ヒトおよびその部分などのゲノムでよい。
【０１５９】
リガンド−−それに対する受容体が天然に存在するか、あるいは調製することのできる有機化合物。
【０１６０】
リガンド類縁体−−修飾されたリガンド、普通１００より大きい分子量を有する有機残基あるいは被検物質類縁体、同様なリガンドと受容体の競合できる。修飾はリガンド類縁体を別の分子の結合する手段を提供する。
【０１６１】
リガンド類縁体は、リガンド類縁体をある中心あるいは標識へつなぐ結合による水素の置き換えにより、リガンドと異なるのが普通であるが、必要ではない。リガンド類縁体はリガンドと同様の仕方で受容体に結合できる。この類縁体は、例えばそのリガンドに対する抗体のイデイオタイプに対して指向する抗体でありうる。
【０１６２】
受容体（「アンチリガンド」）−−ある分子の特別な場所の極性組織、例えばエピトープ部位またはデテルミナント部位、を認識しうる化合物または組成物。代表的受容体には天然に生ずる受容体、例えばチロキシン結合性グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、タンパク質Ａ、相補的成分Ｃ１ｑなどが含まれる。
【０１６３】
特異的結合−−二つの異なる分子のうちの一つが他の分子を特異的に認識することで、これは別の分子の認識が相当に弱いのと比較して特別に強い。一般に、分子はその表面上にあるいは空洞中に二つの分子間の特異的認識を生ずる領域をもつ。特異的結合の例示は抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用などである。
【０１６４】
非特異的結合−特別な表面構造に比較的依存しない分子間の非共有結合。非特異的結合は分子間の疎水的相互作用を含めて幾つかの因子から生じうる。
【０１６５】
抗体−−別の分子の特別な場所の極性組織に対して特異的に結合し、そのため後者と相補的てあると定義される免疫グロブリン。抗体はモノクローンでもポリクローンでもよく、そしてこの分野でよく知られる技術により、例えば宿主の免疫化と血清の収集（ポリクローン）により、あるいは連続したハイブリッド細胞系をつくり分泌されたタンパク質（モノクローン）を収集することにより、あるいは天然抗体の特異的結合に要求されるアミノ酸順序に対して少なくともコード化するヌクレオチド配列あるいはその変異誘発させた変異種をクローン化し、発現させることによりつくりうる。
【０１６６】
抗体は完全な免疫グロブリンあるいはそのフラグメントを包含し、この免疫グロブリンには種々な分類およびイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３、ＩｇＭなどが含まれる。そのフラグメントはＦａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′などを含みうる。更に、ある特定分子に対する結合親和性が保たれる限り、必要に応じ免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの集合体、重合体および抱合体を使用できる。
【０１６７】
アルキル−−脂肪族炭化水素から１個のＨ原子を除去することにより誘導される１価の分枝または非分枝残基で、低級アルキルおよび高級アルキルの両方を含む。
【０１６８】
低級アルキル−−１から５炭素原子を含むアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチルなど。
【０１６９】
高級アルキル−−６炭素原子より多く、通常は６から２０炭素原子を含むアルキル、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチルなど。
【０１７０】
アルキリデン−−同じ炭素原子から２個の水素原子を取り去ることにより脂肪族炭化水素から誘導される２価有機基、例えばエチリデン。
【０１７１】
アリール−−芳香族炭化水素から１個の水素原子を取り除くことにより誘導される１個以上の芳香環、通常は１から４個の芳香環を含む有機基、例えばフェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナフタレンから）など。
【０１７２】
アルアルキル−−アリール基が付いたアルキル基をもつ有機基、例えばベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルエチルなど。
【０１７３】
アルコキシ−−酸素原子によって分子の残りに付くアルキル基、例えばメトキシ、エトキシなど。
【０１７４】
アリールオキシ−−酸素原子によって分子の残りにつくアリール基、例えばフェノキシ、ナフトキシなど。
【０１７５】
アルアルコキシ−−酸素原子によって分子の残りに付くアルアルキル基、例えばベンズオキシ、１−ナフチルエトキシなど。
【０１７６】
置換−−ある分子の水素原子を他の原子により置き換えることを意味し、これは１個の原子、例えばハロゲンなどのこともあれば、または１から５０個の原子（このような原子の原子価を満足するのに必要な要求される水素原子のほか）を有する置換基のような官能基を形成する原子団の一部のこともある。前記原子は炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群から独立して選ばれ、１個以上の金属原子に結合することもあればしないこともある。
【０１７７】
アルキルチオ−−硫黄原子によって分子の残りに付くアルキル基、例えばメチルチオ、エチルチオなど。
アリールチオ−−硫黄原子によって分子の残りに付くアリール基、例えばフェニルチオ、ナフチルチオなど。
【０１７８】
電子供与性基−−ある分子に結合したとき、その電子供与基が電子不足となり、分子の他の部分と比較して正に帯電する、即ち電子密度を低下させるように分子を分極させることのできる置換基。このような基の例示としてアミン、エーテル、チオエーテル、ホスフィン、ヒドロキシ、オキシアニオン、メルカプタンおよびそれらの陰イオン、スルフィドなどがあげられるが、これらに制限するのではない。
【０１７９】
１から５０個の原子（このような原子の原子価を満足させるのに必要な水素原子を除く）を有する置換基（これらの原子は炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群から独立して選ばれる）−−有機残基；この有機残基は残基中の原子の原子価を満足させるのに必要な数の水素原子のほかに１から５０個の原子を有する。一般に主要な原子は炭素（Ｃ）であるが、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）でもよく、そしてこれらＯ、Ｎ、Ｓ、またはＰがもし存在するならばこれらは炭素に結合するか、あるいは相互の１個以上にあるいは水素または金属原子に結合して種々な官能基、例えばカルボン酸、アルコール、チオール、カルボキサミド、カルバメート、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、リン酸、リン酸エステル、尿素、カルバメート、ホスホルアミド、スルホンアミド、エーテル、スルフィド、チオエーテル、オレフィン、アセチレン、アミン、ケトン、アルデヒド、ニトリルなどを形成する。
【０１８０】
このような有機残基または基の代表例としてアルキル、アルキリデン、アリール、アルアルキル、ならびに上記官能基の１個以上で置換されたアルキル、アリールおよびアルアルキルがあるが、これらは例示のためにあげたのであって制限ではない。
【０１８１】
連結基−−分子間の共有結合。連結基は結ばれる分子、即ち光増感剤、化学発光性化合物、ｓｂｐ構成要素あるいは粒子とまたはその一部分と関連する分子の性質によって変化するであろう。通常は存在する官能基あるいは光増感剤や化学発光性化合物に導入される官能基がこれらの物質をｓｂｐ構成要素にあるいは粒子、例えばリポソームの親油性成分または油滴、ラテックス粒子、ケイ素粒子、金属ゾルまたは染料微結晶に結びつけるために使用される。
【０１８２】
大抵の場合、カルボニル官能基、即ちオキソカルボニル、例えばアルデヒドおよび非オキソカルボニル（窒素および硫黄類縁体を含む）、例えばカルボキシ、アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチオノカルボキシ、の両方が使用される。
【０１８３】
オキソの別の官能基には活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、オレフィン、特別に活性化されたオレフィン、アミノ、ホスホロなどが含まれる。連結基の説明は米国特許第３，８１７，８３７号明細書中に見ることができ、参考のためその開示を本明細書中に取り入れている。
【０１８４】
連結基は１本の結合から、１から１００個の原子、通常は約１から７０原子、なるべくは１から５０原子、更に好ましくは１から２０原子の連鎖までを変化し、各々は通常炭素、酸素、硫黄、窒素およびリンからなる群から独立して選ばれる。連結基中のヘテロ原子の数は、普通には約０から２０個、通常は約１から１５個、更に好ましくは２から６個にわたるであろう。
【０１８５】
鎖中の原子は、１から５０原子を有する置換基に対して説明した仕方と同様にして水素以外の原子で置換することができる。一般則として、特定の連結基の長さは合成の便利さおよびエネルギー受容体、発蛍光団、重金属のような項間交差の解析に対する基の導入が得られるよう任意に選ぶことができる。これら連結基は脂肪族でも芳香族でもよいがジアゾ基については芳香族基が通常含まれる。
【０１８６】
へテロ原子が存在する場合、酸素は通常オキソまたはオキシとして炭素、硫黄、窒素またはリンに結合して存在し、窒素は通常はニトロ、ニトロソまたはアミノとして通常は炭素、酸素、硫黄またはリンに結合して存在し、硫黄は酸素と類似しているが、リンは通常はホスホネートおよびホスフェートモノエステルまたはジエステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合するであろう。
【０１８７】
連結基と抱合させるべき分子との間に共有結合をつくる際の共通の官能基はアルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテルおよびカルボキシレート、スルホネート、およびホスフェートエステル、アミドおよびチオエステルである。
【０１８８】
大抵の場合、光増感剤および化学発光性化合物は非オキソカルボニル基、例えば窒素および硫黄類縁体、ホスフェート基、アミノ基、アルキル化剤、例えばハロアルキルまたはトシルアルキル、オキシ（ヒドロキシルまたは硫黄類縁体、メルカプト）、オキソカルボニル（例えばアルデヒドまたはケトン）、または活性オレフィン、例えばビニルスルホンあるいはα，β−不飽和エステルを有するであろう。これら官能基はアミン基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えばブロモアセチルにつながるであろう。アミンおよびカルボン酸あるいはその窒素誘導体またはリン酸がつながると、アミド、アミジンおよびホスホルアミドが形成されるであろう。メルカプタンおよび活性化オレフィンが連結されるとチオエーテルが形成されるであろう。
【０１８９】
メルカプタンおよびアルキル化剤がつながるとチオエーテルが生ずるであろう。還元的条件下でアルデヒドとアミンがつながるとアルキルアミンが生成されるであろう。カルボン酸またはリン酸とアルコールが結合するとエステルを生ずるであろう。
【０１９０】
親水性あるいは水溶性を付与する基または官能基−−これは親水性官能基であり、水による固体の濡れおよび基が結合する化合物の水溶性を増加させる。
【０１９１】
このような官能基あるいは機能性基は１から５０個またはそれ以上の原子を有する置換基でよく、そしてスルホネート、サルフェート、ホスフェート、アミジン、ホスホネート、カルボキシレート、ヒドロキシル、とりわけポリオール、アミン、エーテル、アミドなどを含みうる。代表的な官能基はカルボキシアルキル、スルホンオキシアルキル、ＣＯＮＨＯＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＯ−（グルコサミン）、糖、デキストラン、シクロデキストリン、ＳＯ2ＮＨＣＨ2ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ＯＰＯ3Ｈ2、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトンおよびそのコンビネーションを包含しうる。上記官能基の大抵のものは、光増感剤または化学発光性化合物をｓｂｐ構成要素あるいは支持体に付着させる付着基としても利用できる。
【０１９２】
親油性あるいは脂溶性を付与する基または官能基−−これは親油性官能基で、水による表面の濡れおよび基を結合させる化合物の水溶性を減少させる。このような官能基または機能性基は１から５０個またはそれ以上の原子、通常は水素またはハロゲンで置換された炭素原子を含むことができ、そしてアルキル、アルキリデン、アリールおよびアルアルキルを包含しうる。
【０１９３】
この親油基または機能性基は通常は少なくとも６炭素原子、更に普通には少なくとも１０炭素原子、そしてなるべくは少なくとも１２炭素原子、通常は３０炭素原子以下を有する１から６個の直鎖または分枝鎖脂肪族基を有するであろう。この脂肪族基は５から６員の環に結合することができ、そして後者は脂環式、複素環式、または芳香族のいずれでもよい。
【０１９４】
光増感剤−−通常は光で励起することにより一重項酸素を発生させるための増感剤。光増感剤は光活性化性（例えば染料および芳香族化合物）でも化学活性化性（例えば、酵素および金属塩）でもよい。光で励起したとき光増感剤は通常は共有結合した原子からなる化合物であり、多数の共役二重結合または三重結合を有するのが普通である。この化合物は２００−１１００ｎｍ、普通は３００−１０００ｎｍ、なるべくは４５０−９５０ｎｍの波長範囲の光を吸収すべきであり、吸収極大における吸光係数は励起波長において５００Ｍ-1ｃｍ-1より大、なるべくは少なくとも５０００Ｍ-1ｃｍ-1、更に好ましくは少なくとも５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1であるのがよい。
【０１９５】
酸素の存在しない状態で光吸収後に生ずる励起状態の寿命は少なくとも１００ナノ秒であるのが普通であり、なるべくは少なくとも１ミリ秒がよい。一般にこの寿命は、媒質により１０-5から１０-3Ｍの範囲内の濃度で通常存在する酸素に対して、エネルギーを移動させるのに十分長くなければならない。増感剤の励起状態はその基底状態とは異なるスピン量子数（Ｓ）を有するのが普通であり、通常は、これが普通の場合であるが、基底状態が一重項（Ｓ＝０）であるとき三重項（Ｓ＝１）であろう。
【０１９６】
増感剤は高い項間交差収率を有するのがよい。即ち、増感剤の光励起は少なくとも１０％、望ましくは少なくとも４０％、なるべくは８０％より大きい効率で長寿命状態（通常は三重項）を生ずる。光増感剤は検定条件下でせいぜい弱く蛍光性を示すのが普通である（量子収率は通常は０．５未満、なるべくは０．１未満がよい）。
【０１９７】
光により励起させようとする光増感剤は比較的光安定性があり、一重項酸素と効率よく反応しない。大抵の有用な増感剤には幾つかの構造上の特徴がある。大抵の増感剤は堅固な構造、しばしば芳香族構造、に保持された少なくとも１個、しばしば３個以上の共役二重結合または三重結合を有する。
【０１９８】
それらはしばしば項間交差を促進する少なくとも１個の基、例えばカルボニルまたはイミン基または周期表第３列〜第６列から選ばれる重原子、とりわけヨウ素または臭素を含むか、あるいは拡張された芳香族構造を有しうる。典型的な増感剤にはアセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、９，１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、メタロ−ポルフィリン、例えばヘマトポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフラーレンなど、およびこれら化合物を一層親油性にするかまたは一層親水性にするための、そして（または）例えばｓｂｐ構成要素へ付着させるための付着基として１から５０原子の置換基を有する上記化合物の誘導体が包含される。
【０１９９】
本発明検定法に利用できる他の光増感剤の例は、上記性質を有するもので、Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｒｏ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１３２頁、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ．Ｉｎｃ．，ニューヨーク、１９６５に列挙されているものである。
【０２００】
光増感剤は、それを油滴、リポソーム、ラテックス粒子などに添加するとき、親油性成分中への溶解性を確保するため比較的無極性であることが好ましい。
【０２０１】
本発明に役立つ光増感剤は、外部光源による活性化を用いて、あるいは余り好ましくないが、活性化せずに一重項酸素を生成しうる他の物質および組成物を含めることも企図されている。このようにして、例えばモリブデン酸塩（ＭｏＯ4 =）およびクロロペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼ＋臭化物または塩化物イオン（Ｋａｎｏｂｓｋｙ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５９ ５５９６）は過酸化水素から一重項酸素と水への変換を触媒することが示された。
【０２０２】
これら組成物のいずれかを、例えばｓｂｐ構成要素を結合させる粒子に含めて、過酸化水素を補助試薬として加え、クロロペルオキシダーゼを表面に結合させそしてモリブデン酸塩をリポソームの水相中に添加するという検定法に使用できる。また光増感剤として本当の増感剤ではないが熱、光または化学的活性化により励起させたとき一重項酸素の分子を放出する化合物があることも本発明の範囲内に含められる。
【０２０３】
この部類の化合物のうち最もよく知られたものにはエンドペルオキシド、例えば１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシドおよび５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン−５，１２−エンドペルオキシドが含まれる。これら化合物の加熱あるいはこれらによる直接の光吸収は一重項酸素を放出する。
【０２０４】
支持体あるいは表面−−多孔質または非多孔質の水不溶性材料からなる表面。この表面は幾つかの形状、例えばストリップ、棒、粒子（ビーズを含む）などのいずれか一つをとりうる。この表面は親水性でもよいし、あるいは親水性を与えることもでき、そして無機粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ；天然重合体材料、とりわけセルロース性材料およびセルロースから誘導される材料、例えば繊維含有紙類、例えば濾紙、クロマトグラフィー用紙など；合成または変性した天然産生重合体、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）などが包含される。これらはそれ自身を使用するか、あるいは他の材料、Ｂｉｏｇｌａｓｓとして入手できるガラス、セラミックス、金属などと共に使用される。
【０２０５】
天然または合成の構成体、例えばリポソーム、リン脂質小胞、および細胞体も使用できる。
【０２０６】
支持体あるいは表面へのｓｂｐ構成要素の結合は、文献で普通に入手できるよく知られた技術により達成できる。例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７８）およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。
【０２０７】
表面は通常は多官能性か、多官能性にすることができるか、あるいは特異的または非特異的共有または非共有相互作用を通して、オリゴヌクレオチド、ｓｂｐ構成要素、光増感剤、および（または）化学発光性化合物を結合しうるかであろう。多種多様な官能基を利用でき、あるいは取り入れることができる。官能基の例としてカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などがあげられる。多種多様な化合物を表面に連結させる方法は公知であり、文献に豊富に例示されている。
【０２０８】
例えばＣａｕｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４５，３０５９（１９７０）参照。オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐ構成要素に対する連結基の長さは結合される化合物の性質、結合される化合物と特異的結合性をもつ表面との間の距離の影響などにより広く変化しうる。
【０２０９】
粒子−−少なくとも約２０ｎｍそして約２０ミクロン以下、通常は少なくとも約４０ｎｍそして約１０ミクロン未満、なるべくは直径約０．１０から２．０ミクロン、そして通常は１ピコリットル未満の体積を有する粒子。この粒子は有機または無機性、膨潤可能または非膨潤性、多孔性または非多孔性で、密度はいずれでもよいが、なるべくは水に近似する一般に約０．７から約１．５ｇ／ｍｌの密度がよく、なるべくは水に懸濁可能で、透明、部分的に透明、または不透明な材料から構成できる。
【０２１０】
粒子は電荷をもつことももたないこともあるが、もしそれらが帯電しているときはなるべく負に帯電するのがよい。粒子は固体（例えば、重合体、金属、ガラス、有機および無機物、例えば鉱物質、塩およびけいそう）、油滴（例えば炭化水素、過フッ化炭化水素、液体シリコーン）、または小胞（例えば、合成、例えばリン脂質または天然、例えば細胞およびオルガネル）のいずれでもよい。
【０２１１】
粒子はラテックス粒子または有機または無機重合体から構成された他の粒子；脂質二重層、例えばリポソーム、リン脂質小胞；油滴；ケイ素粒子；金属ゾル；細胞；および染料微結晶のいずれでもよい。
【０２１２】
有機粒子は通常は重合体（付加重合体か縮合重合体のいずれか）であり、検定媒質中に容易に分散しうるものである。有機粒子はまたその表面に直接か間接的にｓｂｐ構成要素を結合するように、また光増感剤あるいは化学発光性化合物をその表面に結合するように、あるいはその体積内に取り込むように吸着性をもつかそのように機能化しうるであろう。
【０２１３】
これら粒子は天然に生ずる材料、合成的に修飾された天然材料、および合成材料から誘導できる。天然または合成集成体、例えば脂質二重層、例えばリポソームおよび非リン脂質小胞が特によい。特に関心をもたれる有機重合体には多糖類、とりわけ架橋多糖類、例えばアガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして入手可能）、デキストラン（ＳｅｐｈａｄｅｘおよびＳｅｐｈａｃｒｙｌとして入手可能）、セルロース、デンプンなど；付加重合体、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリレートおよびメタクリレートの誘導体のホモポリマーおよび共重合体、とりわけヒドロゲルを含めて遊離ヒドロキシル官能基を有するエステル類およびアミド類などがある。無機重合体はシリコーン、ガラス（Ｂｉｏｇｌａｓとして入手可能）などを包含する。ゾルには金、セレン、および他の金属が含まれる。
【０２１４】
粒子はまた光増感剤としても作用しうる分散水不溶性染料、例えばポルフィリン、フタロシアニンなどでもよい。粒子はまたけいそう、細胞、ウィルス粒子、マグネトソーム、細胞核なども包含する。
【０２１５】
粒子が市販されているものである場合、その粒径はより大きい粒子を粉砕、超音波処理、かきまぜなどといった機械的手段によって小さい粒子に破壊することにより変えることができる。
【０２１６】
粒子は多官能性かまたは多官能性化することができ、あるいはｓｂｐ構成要素、光増感剤、または化学発光性化合物に対し特異的または非特異的共有または非共有相互作用を通して結合させることができるのが普通である。多種多様な官能基を利用でき、あるいは取り入れることができる。典型的な官能基にはカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが包含される。
【０２１７】
粒子に対してｓｂｐ構成要素、化学発光性化合物または光増感剤を共有結合によって付ける方法を用いる場合、その連結の仕方は公知であり、文献に詳細に例示されている。例えば、Ｃａｕｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。連結基の長さは連結される化合物の性質、粒子の性質、連結される化合物と粒子との間の距離がｓｂｐ構成要素の結合に及ぼす影響および被検物質などによって広く変化しうる。
【０２１８】
光増感剤および（または）化学発光性化合物は粒子の表面に溶けるかまたは表面に対し非共有結合的に結合するように選ぶことができる。この場合これら化合物は、粒子から解離する能力を減少させそれによって両方の化合物を同じ粒子と関連させるように、なるべくは疎水性であるのがよい。
【０２１９】
これは多分光増感剤か化学発光性化合物のいずれかと関連させる唯一の組成の粒子を利用するか、または光増感剤と一つの型の粒子との会合をまた化学発光性化合物と他の型の粒子との会合を有利にするように組成の異なる二つの型の粒子を用いることにより更に減らすことができるであろう。
【０２２０】
各粒子と関連する光増感剤または化学発光性分子の数は平均して通常は少なくとも１であり、粒子がすっかり光増感剤または化学発光剤分子から成り立つ程十分高くてもよい。特に適当な分子数は検定て信号対バックグランドを最高にするように経験的に選ばれるであろう。
【０２２１】
ある場合には、多数の異なる光増感剤分子を粒子と共同させることによりこれをなし遂げるのが最も良い。通常は粒子中の光増感剤または化学発光性化合物対ｓｂｐ構成要素の比は少なくとも１とすべきであるが、なるべくは少なくとも１００対１、最も好ましくは１，０００対１以上である。
【０２２２】
油滴−−これは乳化剤で被覆され安定化された親油性化合物からなる液体粒子で、前記乳化剤は、例えばリン脂質、スフィンゴミエリン、アルブミンなどといった両親媒性分子である。
【０２２３】
リン脂質は脂肪族ポリオールの脂肪酸カルボン酸エステルを基本とし、少なくとも１個のヒドロキシル基は約８から３６、更に普通には約１０から２０炭素原子のカルボン酸エステルで置換される。前記カルボン酸エステルはエチレン性不飽和部位０から３個、もっと普通な場合は０から１個を有し、そして少なくとも１個、通常はただ１個だけのヒドロキシル基がホスフェートで置換されてリン酸エステルを形成する。このホスフェート基は、一般にヒドロキシルまたはアミノ基を有する二官能性あるいは多官能性の小さい脂肪族化合物で更に置換されることがある。
【０２２４】
油滴は従来の手順に従い適当な親油性化合物を陰イオン性、陽イオン性または非イオン性の界面活性剤と合わせ（この場合、界面活性剤は混合物の約０．１から５、更に普通には約０．１から２重量％の量で存在する）そして混合物を水性媒質中でかきまぜる、例えば超音波処理あるいは渦巻きを起こさせることにより調製できる。代表的な親油性化合物には炭化水素油、過ハロゲン化炭化水素、例えば過フッ化炭化水素、アルキルフタレート、トリアルキルホスフェート、トリグリセリドなどが含まれる。
【０２２５】
ｓｂｐ構成要素は油滴表面に吸着させるか、あるいは油滴表面の成分に直接または間接的に結合させるのが普通である。ｓｂｐ構成要素は液体粒子の調製中または調製後のいずれかで液粒中に添加できる。ｓｂｐ構成要素は、粒子表面上に存在する分子の約０．５から１００、更に普通には１から９０、しばしば約５から８０そしてなるべくは約５０から１００モルパーセントの量で存在するのが普通である。
【０２２６】
油滴を安定化するために使用できる両親媒性化合物の一覧を次に示すが、これは例示のためであってこれらに制限するのではない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、ジアパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、レシチン、ガラクトセレブロシド、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、ホスファチジルイノシトール、２−トリヘキサデシルアンモニウムエチルアミン、１，３−ビス（オクタデシルホスフェート）−プロパノール、ステアロイルオキシエチレンホスフェート、リン脂質、ジアルキルホスフェート、硫酸ドデシルナトリウム、陽イオン性洗浄剤、陰イオン性洗浄剤、タンパク質、例えばアルブミン、非イオン性洗浄剤など。
【０２２７】
親油性基を有しそして以前に記述されたことのある他の化合物も使用できる。大抵の場合これら化合物はアルキルベンゼン類であり、そして直鎖または分枝鎖の６から２０炭素原子を有するアルキル基（通常はアルキル基の混合体）を有し、またカルボキシル基、ヒドロキシル基、ポリオキシアルキレン基（２から３炭素原子のアルキレン）、カルボン酸基、スルホン酸基、またはアミノ基を有する。
【０２２８】
脂肪族脂肪酸を使用でき、そしてこのものは約１０から３６、更に普通には約１２から２０炭素原子のものが普通である。また、脂肪酸に対して示した炭素原子数の制限を有する脂肪アルコール、同様な炭素数制限をもつ脂肪アミンおよび種々なステロイドも使用できる。
【０２２９】
油滴は過フッ化炭化水素またはシリコーン油（シリコーン粒子）からなることができる。このような油滴は米国特許第４，６３４，６８１号および第４，６１９，９０４号明細書中でＧｉａｅｖｅｒにより述べられている（その開示をそっくり本明細書中に取り入れている）。これら油滴は過フッ化炭化水素またはシリコーン油を水相中に分散させることによりつくられる。
【０２３０】
油滴は少量の選ばれた油（一般にこのような油は市販されている）を大量の水相と共に容器に入れることにより調製される。
【０２３１】
この液体系をかきまぜて乳化を起こさせ次に遠心する。均一相を取り除き、残留油滴を緩衝した水性媒質中に再浮遊させる。油滴を使用する前に上記の遠心およびデカンテーション工程を一回以上繰り返すことができる。
【０２３２】
ｓｂｐ構成要素は幾つかの方法で小滴に結合させることができる。Ｇｉａｅｖｅｒにより説明されている通り、特定のｓｂｐ構成要素、とりわけタンパク質性ｓｂｐ構成要素、は乳化工程に先立ち、またはその後で過剰のｓｂｐ構成要素を水性媒質中に導入することにより小滴上に被覆することができる。過剰のｓｂｐ構成要素を除去するため洗浄工程が望ましい。油を官能基化することによりｓｂｐ構成要素をつなぐための前記官能性が導入される。
【０２３３】
このような官能基は油滴を光増感剤または化学発光性化合物に連結させるために使用することもできる。他方、光増感剤または化学発光性化合物は油滴の油相中に可溶であるように選ばれることが多く、その場合には共有結合されない。油滴が過フッ化炭化水素であるとき、フッ素化された光増感剤または化学発光性化合物は、対応する未フッ素化誘導体より溶け易い場合が多い。
【０２３４】
Ｇａｉｅｖｅｒにより記述された他の油滴も本発明に使用できる。
【０２３５】
リポソーム−−ほぼ球形をした微小ベシクル。これは本発明に用いるのに特に適当な材料の一つである。リポソームは少なくとも約２０ｎｍそして約２０ミクロン以下、通常は少なくとも約４０ｎｍで約１０ミクロン未満の直径をもつ。リポソームの直径は沈降あるいは浮上を制限するように約２ミクロン未満であるのがよい。
【０２３６】
リポソームの外殻はある体積の水または水溶液を包囲する両親媒性二重層からなる。一つより多くの二重層をもつリポソームは多重膜小胞と呼ばれる。唯一つの二重層をもつリポソームは単一膜小胞と呼ばれる。親油性光増感剤または化学発光性化合物を使用する場合には、単一膜小胞よりも大量のこれら物質を取り込む能力があるので、多重膜小胞の方が本発明にとって好ましい。両親媒性二重膜はしばしばリン脂質からなる。
【０２３７】
本発明方法に利用できる粒子を調製するのに用いられるリン脂質はレシチンを含めて天然膜に見出されるどのリン脂質でもまたはリン脂質混合物でもよく、あるいは飽和または不飽和１２−炭素または２４−炭素直鎖脂肪酸の合成グリセリルホスフェートジエステルでもよく、後者の場合、ホスフェートはモノエステルとして、あるいは極性アルコール、例えばエタノールアミン、コリン、イノシトール、セリン、グリセリンなどのエステルとして存在しうる。
【０２３８】
特に適当なリン脂質には下記の化合物が含まれる：Ｌ−α−パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジル−グリセリン（ＰＯＰＧ）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルグリセリン、Ｌ−α（ジオレオイル）−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＬ−α（ジオレオイル）−ホスファチジルβ−（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシアミド）エタノール（ＤＯＰＥ−ＭＣＣ）。
【０２３９】
二重層中のリン脂質はコレステロールで補うことができ、また他の両親媒性化合物で置き換えることができる。後者の化合物は通常は帯電した極性ヘッド基と通常は２本の直線炭化水素鎖からなる疎水性の部分を有するものである。
【０２４０】
このような置き換え化合物の例にはジアルキルホスフェート、ジアルコキシプロピルホスフェート（これらアルキル基は１２〜２０炭素原子の直鎖をもつ）、Ｎ−〔２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタ−デセニルオキシ）〕−１−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムクロリド（米国特許第４，８９７，３５５号明細書、１９９０年１月３０日発行、に開示されている。これは参考として本明細書中に取り入れている）、スフィンゴミエリン、カルジオリピンなとが含まれる。
【０２４１】
本発明方法に利用されるリポソームは懸濁系を安定化しかつ自然凝集を防止するため高い負電荷密度をもつ。
【０２４２】
本発明方法に用いるためにはリポソームはｓｂｐ構成要素に結合できねばならず、また水相または非水相いずれかと関連した光増感剤または化学発光性化合物を含むことができなければならない。本発明方法に利用されるリポソームは脂質小胞の外面に結合したｓｂｐ構成要素を有するのが普通である。
【０２４３】
リポソームは乾燥リン脂質あるいはリン脂質に代る物質の水溶液中での水和および機械的分散を含めて種々な方法により調製できる。この方法でつくられたリポソームは種々な大きさと組成と挙動を有する。機械的に分散したリポソームの挙動の不均一性および不一致を減らす一つの方法は超音波処理によるものである。このような方法はリポソームの平均寸法を減少させる。
【０２４４】
別法としてリポソーム製造中の最終工程として押し出しを使用できる。米国特許第４，５２９，５６１号明細書は寸法の均一性を改善するため均一な細孔寸法の膜を通して加圧下にリポソームを押し出す方法を開示している。
【０２４５】
脂質二重層中に溶けた疎水性あるいは両親媒性の光増感剤または化学発光性化合物を含有するリポソームの製造は、Ｏｌｓｅｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５５７（９），１９７９により記述された方法を含めて種々な方法で実施できる。簡単に言えば、有機溶媒、例えばクロロホルム中に適当な化合物を含む脂質の混合物を、ガラス容器壁上に薄膜となるまで乾燥させる。この脂質の膜を適当な緩衝液中で振盪または渦巻きを起こさせることにより水和する。
【０２４６】
その後脂質懸濁系を連続的に小さくした細孔寸法（例えば、２．０、１．０、０．８、０．６、０．４および０．２ミクロン）を有する一連のポリカーボネートフィルター膜を通して押し出す。これらフィルターのいずれか、とりわけ最小のフィルターを通して繰り返し濾過することが望ましい。このリポソームは、例えばゲル濾過により、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００のカラムを通すことにより精製できる。
【０２４７】
カラムを緩衝液で溶離しリポソームを集めることができる。冷所に貯蔵すると、この方法によりつくられたリポソームの保存寿命を延長できる。別法として、リポソーム調製後の懸濁液に光増感剤または化学発光性化合物を添加することができる。
【０２４８】
油滴およびリポソームの標識化はしばしば例えば脂質二重層からなる分子にチオールまたはマレイミドまたはビオチン基の封入を含むであろう。次に光増感剤、化学発光性分子またはｓｂｐ構成要素を粒子とこれら物質の一つとの反応により表面へ結合させることができる。即ち、それぞれスルフヒドリル反応性試薬、スルフヒドリル基、またはアビジンに結合される。スルフヒドリル反応性基にはアルキル化試薬、例えばブロモアセトアミドおよびマレイミドが含まれる。
【０２４９】
ｓｂｐ構成要素は弱い疎水性相互作用によりリポソーム粒子の表面に引かれることがあるが、しかしこのような相互作用はインキュベーションおよび洗浄中に出会うせん断力に耐えるには一般に十分でない。前に示したように、例えばＤＯＰＥ−ＭＣＣを用いて官能基化したリポソーム粒子をメルカプタン基で官能基化した選ばれたｓｂｐ構成要素と合わせることによって、前記リポソームへｓｂｐ構成要素を共有結合させることが好ましい。
【０２５０】
例えば、もしｓｂｐ構成要素が抗体であるならば、それをＳ−アセチル−メルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）と反応させ、そして加水分解するとスルフヒドリルで修飾された抗体が得られる。
【０２５１】
ラテックス粒子−−「ラテックス」とは水に懸濁しうる水に溶けない粒状重合体物質で、通常は直径２０ｎｍから２０ｍｍ、更に好ましくは直径１００から１０００ｎｍの粒径を有するものを意味する。ラテックスはしばしば置換ポリエチレン、例えばポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミド−ポリスチレン、アミノ基をもつポリスチレン、ポリ−アクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニルアクリレート共重合体などの場合が多い。スチレンおよびカルボキシル化スチレンまたは他の活性基、例えばアミノ、ヒドロキシル、ハロなどで官能基化したスチレンの非架橋重合体が特に適当である。置換スチレンとジエン類、例えばブタジエンとの共重合体がしばしば使用される。
【０２５２】
光増感剤または化学発光性化合物と本発明方法に用いられるラテックス粒子との結合は、重合による粒子の形成中に添加するものであるが、普通には粒子中への非共有結合的溶解による既成粒子中への取り込みである。通常は化学発光性化合物または増感剤の溶液が使用される。
【０２５３】
利用しうる溶媒には、アルコール類、例えばエタノール、エチレングリコールおよびベンジルアルコール；アミド類、例えばジメチルホルムアミド、ホルムアミ ド、アセトアミドおよびテトラメチル尿素など；スルホキシド類、例えばジメチルスルホキシドおよびスルホラン；およびエーテル類、例えばカルビトール、エチルカルビトール、ジメトキシエタンなど、および水が包含される。粒子が溶解しない高沸点溶媒の使用は高温度の使用を可能にし、粒子中への化合物の溶解を促進するので特に適当である。溶媒は単独で用いても組み合わせて用いてもよい。
【０２５４】
光増感剤を添加するために特に適した溶媒は、それらが本来備えている性質の故に、あるいは粒子に溶けない水のような溶媒中にそれらが溶解しうる能力のため溶媒を後に粒子から除去できる故に、光増感剤の三重項励起状態を失活させないものである。芳香族溶媒が特によく、一般に粒子に溶ける溶媒がよい。粒子中に化学発光性化合物を添加するための溶媒は、それらが本来備えている性質の故に、あるいは粒子から除去できる能力の故に、ルミネセンスを妨害しない溶媒を選ぶべきである。この場合にもしばしば芳香族溶媒が好ましい。典型的な芳香族溶媒にはジブチルフタレート、ベンゾニトリル、ナフトニトリル、ジオクチルテレフタレート、ジクロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベンゼンなどが含まれる。
【０２５５】
光増感剤または化学発光性化合物を粒子に共有結合しようとする場合は別として、通常は電子的に中性の光増感剤または化学発光性化合物を用いるのがよい。選ばれる液体媒質は重合体ビーズを粘着性の現われる点まで軟化しないことが好ましい。特に適当な技術は、光増感剤または化学発光性化合物が少なくとも限られた溶解度しかもたない液体媒質中に選ばれたラテックス粒子を懸濁させることからなる。
【０２５６】
この液体媒質中の光増感剤および化学発光性化合物の濃度は一重項酸素の生成効率が最高で、また媒質中での化学発光性化合物からの発光の量子収率が最高である粒子が得られるように選ぶのがよいが、濃厚でない溶液も時としては好ましいであろう。溶媒中での粒子のひずみあるいは溶解は粒子が不溶である混和性共溶媒を加えることにより防止できる。
【０２５７】
一般に、この手順の間に用いる温度は、光増感剤標識粒子の一重項酸素形成能力および化学発光性化合物粒子の量子収率を最大にするように選ばれるが、ただし粒子がその選ばれた温度において融解あるいは凝集すべきでないことを条件とする。通常は高温が使用される。この手順に対する温度は一般に２０℃から２００℃、更に普通には５０℃から１７０℃にわたるであろう。室温ではほとんど不溶性の若干の化合物は、高温では低分子量アルコール、例えばエタノールおよびエチレングリコールなどに可溶である。カルボキシル化変性ラテックス粒子はこのような温度で低分子量アルコールに耐えることが示された。
【０２５８】
ｓｂｐ構成要素はラテックス粒子の表面に物理的に吸着させることができ、あるいは粒子に共有結合させることもできる。ｓｂｐ構成要素がラテックス粒子の表面に極めて弱くしか結合しない場合、その結合はある場合には、インキュベーションおよび洗浄中に出会う粒子対粒子せん断力に耐えることができないかもしれない。それ故に、吸着を最小にする条件下でｓｂｐ構成要素をラテックス粒子に共有結合させることが好ましい。これはラテックスの表面を化学的に活性化することにより達成できる。
【０２５９】
例えば表面カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをつくり、粒子表面への検定成分の非特異的結合を減らすようにこの活性化された粒子を次にアミノ基をもつリンカー（エステル基と反応する）と接触させるかあるいはアミノ基をもつｓｂｐ構成要素と直接接触させる。このリンカーは検定成分が粒子表面に非特異的に結合するのを減らすように選ぶのが普通であり、ラテックス粒子への付着およびｓｂｐ構成要素への付着の両方に適した官能基をもつことが好ましい。適当な物質にはマレイミド化したアミノデキストラン（ＭＡＤ）、ポリリジン、アミノ糖類などが含まれる。ＭＡＤはＨｕｂｅｒｔ、等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７５（７），３１４３，１９７８記載のようにして調製できる。
【０２６０】
一つの方法を示すと、先ずＭＡＤは、水溶性カルボジイミド、例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを用いてカルボキシル含有ラテックス粒子に付ける。この被覆粒子を次に試薬中で平衡化させ非特異的結合を防ぐ。このような試薬の例として、タンパク質、例えばウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）、および洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ２０、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００などがあげられる。
【０２６１】
スルフヒドリル基を有するか、またはスルフヒドリル基を導入するように適当に修飾したｓｂｐ構成要素を次に粒子の懸濁系へ添加すると、ｓｂｐ構成要素と粒子上のＭＡＤとの間に共有結合が形成される。次に過剰の未反応ｓｂｐ構成要素を洗浄により除去する。
【０２６２】
金属ゾル−−これは重金属、即ちＩＢ族金属のような２０より大きい原子番号を有する金属、例えば金または銀、あるいはカルコゲン、例えばセレンまたはテルルからなる粒子である。
【０２６３】
金属ゾル粒子は、例えばＬｅｕｖｅｒｉｎｇにより米国特許第４，３１３，７３４号明細書の中で述べられている（その開示をそのまま参考のため本明細書中に取り入れている）。このようなゾルには金属、金属化合物、あるいは金属か金属化合物で被覆した重合体核のコロイド状水性分散系が含まれる。
【０２６４】
金属ゾルは金属または金属化合物、例えば金属酸化物、金属水酸化物および金属塩、のゾルでもよいし、あるいは金属か金属化合物で被覆された重合体核のものでもよい。このような金属の例は白金、金、銀、水銀、鉛、パラジウムおよび銅であり、このような金属化合物の例はヨウ化銀、臭化銀、銅の含水酸化物、酸化鉄、水酸化鉄または鉄の含水酸化物、アルミニウムの水酸化物または含水酸化物、クロムの水酸化物または含水酸化物、酸化バナジウム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、硫化鉛、硫化水銀、硫酸バリウム、および二酸化チタンである。一般に、有用な金属または金属化合物は公知の技術によって容易に実証できる。
【０２６５】
上記金属または金属化合物で被覆された重合体核からなる分散粒子からなるゾルを使用することも時として有利である。これら粒子は純粋な金属または金属化合物の分散相と同様な性質をもっているが、大きさ、密度および金属接触は最適となるように兼有させることができる。
【０２６６】
金属ゾル粒子は公知の多数の方法で調製できる。例えば、金ゾルの調製にＬｅｕｖｅｒｉｎｇはＧ．ＦｒｅｎｓによるＮａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，２０（１９７３）中の記事を引用している。
【０２６７】
金属ゾル粒子はｓｂｐ構成要素または光増感剤または化学発光性化合物への連結のため前述したような種々な官能基を含むように修飾できる。例えば、重合体結合剤を使用することによって例えば多くの重金属に強く結合するチオール基を含む重合体の粒子を被覆することができ、あるいは、例えば磁性粒子を被覆するためＡｄｖａｎｃｅｄ ＭａｇｎｅｔｉｃｓによりＥＰＯ特許願第８４４００９５２．２号明細書中に述べられた金属粒子とトリアルコキシアミノアルキルシランとの反応による重合体被覆物を結合し形成しうるシリル化剤を用いて前記粒子を被覆できる。
【０２６８】
染料微結晶−−純粋または混合の固体水不溶性染料、なるべくは前記光増感剤として役立ちうる染料の微小結晶。本発明方法に有用な染料微結晶は粒径２０ｎｍから２０μｍをもつ。
【０２６９】
染料微結晶をつくる一つの方法が米国特許第４，３７３，９３２号明細書（Ｇｒｉｂｎａｕ等）に記載されており、その開示をそのまま参考のため本明細書中に取り入れている。Ｇｒｉｂｎａｕはコロイド状染料粒子および疎水性染料または顔料の水性分散系を説明しており、これらは免疫学的に反応性のある成分を直接または間接的に付着できる。
【０２７０】
一般に、染料粒子は染料を水に分散し次に遠心することによりつくられる。染料ペレットが得られ、次にガラスビーズを加えた水に再懸濁させる。この懸濁系を室温で数日間回転させる。液体をデカンテーションし、遠心し、液体の吸引後に染料粒子を得る。
【０２７１】
染料微結晶のもう一つの製造法は、水と混和しうる溶媒中に溶かした染料の溶液を水へゆっくり加えることによる。もう一つの方法は固形染料の水懸濁液の超音波処理による方法である。
【０２７２】
染料粒子へのｓｂｐ構成要素の結合は、直接または間接的な吸着あるいは共有化学結合による付着により達成できる。後者は被覆物質および染料いずれかの中に適当な官能基が存在することにより支配される。例えば、官能基は、ジアゾ化した芳香族アミノ基および望む官能基を含む化合物を染料のフェノール性基またはアニリノ基にカップリングすることにより、染料微結晶の表面上に導入できる。
【０２７３】
染料がカルボキシル基を有する場合、染料微結晶をカルボジイミドにより活性化し、第一級アミノ成分にカップリングできる。脂肪族第一級アミノ基およびヒドロキシル基は、例えば臭化シアンあるいはハロゲン置換ジ−またはトリ−アジン類により活性化し、その後、第一級アミノ成分との結合あるいは、例えば−ＳＨ、または−ＯＨまたは基を含む成分との結合を行なうことができる。二官能性反応性化合物を使用することもできる。
【０２７４】
例えば、染料の第一級アミノ成分とｓｂｐ構成要素との相互カップリングにグルタルアルデヒドを使用し、そしてチオール基を含む成分への第一級アミノ成分のカップリングに、例えばヘテロ−二官能性試薬、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを使用することができる。
【０２７５】
化学発光性化合物−−一重項酸素と化学反応を起こして準安定中間体を生成し、これが分解すると同時にあるいは分解後に、２５０から１２００ｎｍの波長範囲内の光を放出する物質。発光は分解および発光を起こさせるエネルギー受容体または触媒が存在しなくても起こるのが普通である。この中間体はその生成後に加熱しなくとも、あるいは補助的試薬を添加しなくとも自然に分解することが好ましい。しかし、中間体生成後の試薬の添加あるいは分解を促進するための高温の使用はある種の化学発光性化合物に対して要求されることがあるであろう。
【０２７６】
化学発光性化合物は、通常は一重項酸素と反応してしばしばジオキセタン類またはジオキセタノン類を生成する電子豊富な化合物である。このような化合物の典型例は、エノールエーテル、エナミン、９−アルキリデンキサンタン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾールおよびルシゲニンである。他の化学発光性化合物は一重項酸素と反応して中間体を生じ、これがその後別の試薬と反応して光を放出するというものである。
【０２７７】
対象となる化学発光性化合物は一般に３００ナノメートル以上、通常は４００ｎｍ以上の波長で発光する。単独か蛍光性分子と一緒に血清成分が光を吸収する領域を越える波長で光を発する化合物は特に本発明に使用されるであろう。血清の蛍光は５００ｎｍ以上で急速に落ち、５５０ｎｍ以上では比較的重要でなくなる。
【０２７８】
それ故に、被検物質が血清中にあるときはには、５５０ｎｍ以上の、なるべくは６００ｎｍ以上の光を発する発光性化合物が特に関心をもたれている。化学発光性化合物の自己増感を避けるためには、その化学発光性化合物が光増感剤を励起するのに用いた光を吸収しないことが好ましい。一般に増感剤を５００ｎｍより長波長の光で励起するのが好ましいので、化学発光性化合物による光の吸収は５００ｎｍ以上で非常に低いことが望ましい。
【０２７９】
化学発光性化合物から長波長発光を望む場合には、化学発光性化合物にピレンのような長波長エミッターを結合して用いることができる。別法として、化学発光性化合物を含む媒質中に蛍光性分子を含めることもできる。特に適当な蛍光性分子は活性化された化学発光性化合物によって励起され、化学発光性化合物の発光波長よりも長波長で、通常は５５０ｎｍより長波長で発光するであろう。また蛍光分子は光増感剤を活性化するために使用した光の波長で吸収しないことも普通望ましい。有用な染料の例にはローダミン、エチジウム、ダンシル、Ｅｕ（ｆｏｄ）3、Ｅｕ（ＴＴＡ）3、Ｒｕ（ｂｐｙ）3 ++（式中、ｂｐｙ＝２，２′−ジピリジル）などが包含される。
【０２８０】
一般に、これら染料はエネルギー移動過程で受容体として作用し、なるべくは高い蛍光量子収率を有しかつ一重項酸素と迅速に反応しないことが好ましい。これらは粒子へ化学発光性化合物を添加するのと同時に粒子に加えることができる。
【０２８１】
電子豊富なオレフィンは一般に式：
【化１】
式中、Ａは電子供与基、例えばＮ（Ｄ）2、ＯＤ、ｐ−〔Ｃ6Ｈ4Ｎ（Ｄ）2〕2、フラニル、Ｎ−アルキルイミダゾール、Ｎ−アルキルピロリル、２−インドリルなどであり、またＤは、例えばアルキルまたはアリールでよく、Ａはオレフィン性炭素に直接結合するか、または他の共役二重結合を介して結合するかのいずれかである、を有するオレフィンと共役した電子供与基をもつ。
【０２８２】
オレフィン１中のＣ原子の他の原子価は１から５０原子の置換基で満されるが、前記基は一緒に結合して縮合または非縮合の１個以上の環、例えばシクロアルキル、フェニル、７−ノルボルニル、ナフチル、アントラシル、アクリダニル、アダマンチルなどを形成することができる。
【０２８３】
本発明に使用されるエノールエーテルは一般に構造：
【化２】
式中、Ｄ1は独立して引用され、そしてＨおよび１から５０原子の置換基、なるべくはアリール、ヒドロキシアリール、アミノアリール、ｔ−アルキル、Ｈ、アルコキシ、ヘテロアリールなどからなる群から選ばれ、そしてその炭素原子の一つまたは両方と一緒に結合して環、例えばシクロアルケン、アダマンチリデン、７−ノルボルニリデンなどを形成することができ、Ｄ2はなるべくはアルキルまたはアリールがよい、
を有する。
【０２８４】
典型的なエノールエーテルは２，３−ジアリール−４，５−ジヒドロジオキセン類：
【化３】
式中、Ｘ＝Ｏ、ＳまたはＮＤ2、ＡｒおよびＡｒ′は置換アリール（少なくとも１個の置換基はアミノ、エーテルまたはヒドロキシル基として存在する）を含めてアリールである、
であるが、これは例示であって制限ではない。
【０２８５】
９−（ジアルコキシメチリデン）−キサンテン：
【化４】
アルコキシビニルピレン：
【化５】
９−アルコキシメチリデン−１０−アルキルアクリダン：
【化６】
【０２８６】
本発明に使用するビニルスルフィド類は一般に酸素原子を硫黄原子により置き換えた上記エノールエーテルを包含する。
【０２８７】
本発明に使用するエナミンは一般に構造：
【化７】
式中、Ｄ3はそれぞれアルキルまたはアリールでよく、オレフィン上の残りの置換基はＨおよび１から５０原子の置換基、なるべくはアリール、ヒドロキシアリール、アミノアリール、ｔ−アルキル、Ｈ、アルコキシ、ヘテロアリールなどから選ばれる、
を有する。
【０２８８】
典型的なエナミンは下記の化合物であるが、これらは例示であって制限ではない：
【０２８９】
ジアルキルアミノビニルピレン：
【化８】
【０２９０】
ジアルキルアミノビニル−９，１０−ジフェニルアントラセン
【化９】
式中、ψ＝フェニル
など。
【０２９１】
９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類は一般に構造：
【化１０】
式中、Ｄ4はアルキルで、オレフィン上の残りの置換基はＨ、および１から５０原子の置換基、なるべくはアリール、アルコキシアリール、アミノアリール、ｔ−アルキル、Ｈ、アルコキシ、ヘテロアリール、などがよく、また一緒に結合して例えばアダマンチル、シクロペンチル、７−ノルボルニルなどを形成できる、
を有する。
【０２９２】
典型的なアクリダン類は置換９−ベンジリデン−１０−メチルアクリダンおよび９−ジフェニルメチレン−１０−メチルアクリダン〔Ｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：３８２３（１９８３）およびＭｃＣａｐｒａ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．９４４（１９７７）によって記述されている〕、９−メチリデン−１０−メチルアクリダン〔Ｅ．Ｗｈｉｔｅ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１４９１（１９７９）により記述されている〕であるが、これらは例示としてあげたのであって制限ではない。
【０２９３】
炭素（Ｃ）原子上の置換基が対応するオレフィン：
【化１１】
上に存在する基である一重項酸素と化学発光性構造物との反応で生ずるジオキセタンのあるものは自然に分解し、またあるものは加熱するかまたは、通常は電子に富むエネルギー受容体による触媒作用によるか、またはその両方により分解して光を放出する。ある場合には、ジオキセタンは自然にヒドロペルオキシドに変換されるが、そのときジオキセタンを再生成し、分解および発光を可能にするために塩基性ｐＨが要求される。
【０２９４】
化学発光性化合物のもう一つの群は２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類である。最もよく知られた化合物はルミノールであり、このものは５−アミノ化合物である。この群中の他の化合物には置換６−アミノ，５−アミノ−６，７，８−トリメトキシおよびそのジメチルアミノ〔ｃａ〕ベンズ類縁体が含まれる。これら化合物は多段階で一重項酸素により酸化され分解を起こしてフタレート誘導体を生成し光を放出する。
【０２９５】
もう一種の一群の化学発光性化合物は、２，４，５−トリフェニルイミダゾール化合物であり、これらの化合物は親化合物と共通の名称としてロフィン（ｌｏｐｈｉｎｅ）の名称を有する。この化学発光性類似化合物には、パラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換化合物が含まれる。
【０２９６】
さらに別の群の化学発光性化合物には、ビス−アリーレン化合物が含まれ、この化合物はＳｉｎｇｅｒによりＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４１：２６８５（１９７６）に記載されているビス−９，９′−アクリジリデンおよびその１０，１０′−ジメチル誘導体、ルシゲニンおよびビス−９，９′−キサンチリデンを包含する。
前記要件を満たすその他の化学発光性化合物は、１９８９年１２月１３日付で公開されたヨーロッパ特許出願０，３４５，７７６に見い出すことができる。
【０２９７】
光化学的に活性化できる化学発光性化合物（ＰＡＣＣ）は、光による直接励起または光吸収励起によって、あるいは一重項（ｓｉｎｇｌｅｔ）酸素との反応によって化学反応を受け、通常２５０〜１２００ｎｍの波長範囲内の光の同時的にまたは引続いて発光を伴ない、分解できる準安定反応生成物を生成する物質である。「光活性化できる」の用語には、「光化学的に活性化できる」ことが含まれる。本発明において好適なＰＡＣＣは一重項酸素と反応して、ジオキセタン化合物またはジオキセタンオン化合物を生成する化合物である。後者の化合物は通常、電子に富むオレフィン類である。このような電子に富むオレフィン類の例には、エノールエーテル類、エナミン類、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類、アリールビニルエーテル類、ジオキセン類、アリールイミダゾール類、９−アルキリデン−キサンタン類およびルシゲニンがある。「ＰＡＣＣ」の用語の中に含まれるその他の化合物は、ルミノールおよび他のフタルヒドラジド化合物、ならびに光化学的に不安定な保護基によって保護されていることから化学発光反応を受けることから保護されている化学発光性化合物、たとえばホタルルシフェリン、アクアホリン、ルミノールなどの化合物を包含する。
【０２９８】
有利なＰＡＣＣは好ましくは、３００ナノメーター以上、好ましくは５００ナノメーター以上、さらに好ましくは５５０ｎｍ以上の波長で発光するものである。試料成分が光吸収に有意に関与する波長域をこえた波長で光を吸収し、かつまた発光する化合物は本発明において特に使用される。血清の吸光は５００ｎｍ以上で急速に減少し、６００ｎｍ以上では無意味になる。従って、６００ｎｍ以上の光を発光する化学発光性化合物は特に有利である。しかしながら、試料の干渉吸収が無い場合には、またはさらに長い波長の光を吸収し、それによって化学発光性化合物が活性化される場合には、さらに短い波長で吸光性の化学発光性化合物が有用である。
【０２９９】
本発明のＰＡＣＣは標識（ラベル）として使用され、ｓｂｐメンバーと会合させる。
下記のＰＡＣＣ１は一般に、アリル系ＣＨまたはＮＨ基を含有していない。
【０３００】
本発明のＰＡＣＣとして適する電子に富むオレフィン類は、本発明における「化学発光性化合物」の範中にある。このようなＰＡＣＣは通常、オレフィンに直接に結合している水素原子を有する原子を有していないが、ただしこの原子が小さい二環状環系の架橋先端位置などのように、二重結合に関与できない位置にある場合は除かれる。さらに好適なオレフィン類は、室温で急速に（６０分より短い時間、好ましくは５分より短い時間、望ましくは３０秒より短い時間で）崩壊するジオキセタンを生成するものである。これらのジオキセタン化合物は単独で、または蛍光エネルギー受容体と共同して、発光することができる。
【０３０１】
本発明のＰＡＣＣとして適するエノールエーテル類はまた本発明における「化学発光性化合物」の範囲内にある。特に有用なエノールエーテル化合物は、そのアリール環が蛍光を付与する位置で電子供与性基により置換されているエーテルと同一炭素上にアリールを有する化合物である。電子供与性基は、たとえばｍ−ヒドロキシフェニル、ｍ−ジメチルアミノ−フェニル、１−（５−アミノナフチル）、ピリル、１−（３−ヒドロキシピリル）、アントラシル、クリシルなどであることができる。２位置に存在する基の一方または両方がアリールであることができ、この場合には、１−炭素の酸素による置き換えによって生成されるケトンが蛍光体であることができ、このアリールはたとえばβ−ナフチルまたは２−アントリルである。
【０３０２】
これらに制限されないが、エノールエーテル化合物の例には、下記の化合物がある：
【化１２】
【化１３】
（式中、Ｘ1は、Ｈ、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＯＨであり、この化合物はＢｒｏｎｓｔｅｉｎ等により米国特許第４，９５６，４７７号に記載されている）
【化１４】
（この化合物は、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等により、米国特許第４，９５６，４７７号に記載されている）
【化１５】
（式中、Ｘ2は、Ｈ、ＯＨ、Ｎ（ＣＨ3）2またはＯＣＨ3であり、この化合物はＰ．Ｓｃｈａａｐにより、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：３５０４（１９８２）に、およびＰ．Ｓｃｈａａｐにより、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ３０：３５（１９７９）に記載されている）
【化１６】
（式中、Ｘ2は上記定義のとおりであり、Ｘ3はＨ、ＯＣＨ3またはＮ（ＣＨ3）2であり、この化合物はＰ．Ｓｃｈａａｐ、Ｒｅｐｏｒｔ ｔｏ Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｏｃｔｏｂｅｒ １５、１９８６ａｎｄ Ｓ．Ｄ．Ｇａｇｎｏｎ、Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９８２）により開示されている）
【化１７】
（式中、Ｘ4＝Ｏ、Ｓ、ＣＨ3ＮまたはＰｈＮであり、そしてＹ＝Ｏ、ＳまたはＣＨ3Ｎであり、そしてＰｈ＝フェニルであり、この化合物はＰ．ＳｃｈａａｐによりＲｅｐｏｒｔ ｔｏ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｎａｖａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８７年３月１７日に開示されている）
【化１８】
（この化合物は、Ｐ．Ｓｃｈａａｐにより、Ｒｅｐｏｒｔ ｔｏ Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８６年１０月１５日に記載されている）。
【０３０３】
本発明のＰＡＣＣとして適するエナミン類はまた、本発明における「化学発光性化合物」の範囲内にある。これらに制限されないが、特に有用なエナミン化合物の例には、上記エノールエーテル化合物３〜５において、ＯＣＨ3がＮ（ＣＨ3）2で置き換えられている化合物がある。別の例には、次式で示される化合物がある：
【化１９】
【０３０４】
ＰＡＣＣとして適する９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン化合物はまた、本発明における「化学発光性化合物」の範囲内にある。特に有用な化合物は、式（７）において、オレフィン上の残りの置換基がフェニル、ナフチル、フェナントリル、ｍ−メトキシフェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−モルホレノであるか、または一緒になって環、たとえばアダマンチル、Ｎ−メチルアクリダニリド、キサンタニリジン、１−（３，４−ベンゾ−５−ヒドロフリリデン）などを形成していてもよい化合物である。本発明において、ラベルとして特に有用な９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン化合物の例には、これらに制限されないが、下記の化合物がある：
【化２０】
（この化合物は、Ｓｉｎｇｅｒにより、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４１、２６８５（１９７６）に記載されている）
【化２１】
（この化合物は、Ｅ．ＷｈｉｔｅによりＣｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２、１４９１（１９７９）に記載されている）
【化２２】
（式中、Ｒ4およびＲ5は独立して、Ｈまたはフェニルであり、この化合物はＳｉｎｇｅｒ等により、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０２；３８２４（１９８３）に記載されている）
【化２３】
（この化合物はＭｃＣａｐｒａにより、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、Ｎ２４、９４４（１９７７）およびＳｉｎｇｅｒ等による上記刊行物に記載されている）
【化２４】
（この化合物は、ＭｃＣａｐｒａによる上記刊行物に記載されている）
【化２５】
（この化合物は、ＭｃＣａｐｒａによる上記刊行物に記載されている）。
【０３０５】
上記刊行物の関連記載をここに引用して組入れる。
本発明のＰＡＣＣとして有用な９−アルキリデン−キサンタン化合物は一般に、次の構造を有する：
【化２６】
この構造式において、オレフィン上の置換基はＨおよび原子数１〜５０の置換基、好ましくはフェニル、ナフチル、フェナントリル、ｍ−メトキシフェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−モルホレノからなる群から選ばれ、そしてまたこれらの置換基は一緒になって、たとえばアダマンチル、Ｎ−メチルアクリダニリド、キサンタニリジン、１−（３，４−ベンゾ−５−ヒドロフリリデン）など、たとえば９−フェニル−メチリデン−キサンテンを形成していてもよい。
【０３０６】
もう一種の一群のＰＡＣＣは、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物である。この種の最も一般的に知られている化合物はルミノールであり、この化合物は５−アミノ化合物である。この一群の中の他の化合物には、５−アミノ−６，７，８−トリメトキシ類似体およびジメチルアミノ〔ｃａ〕ベンズ類似体が含まれる。ルミノールは検定法においてラベルとして使用されているが、ルミノールの励起が、本発明の場合のような光活性化によるものではなく、化学的に行なわれていたことに留意すべきである。これらの化合物は一重項酸素により、およびまた引続く過酸化物または過酸化水素との反応によって、発光をともなう分解を受け、１，４−フタラジニジオン化合物に酸化される。
【０３０７】
他の一群のＰＡＣＣには、２，４，５−トリフェニルイミダゾール化合物があり、この化合物はその親の化合物と共通の名称として、ロフィン（ｌｏｐｈｉｎｅ）と称されている。その化学発光性類似体はパラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換体を包含する。
前記の要件を満たす、他のＰＡＣＣは、１９８９年１２月１３日付で公開されたヨーロッパ特許出願第０，３４５，７７６号に見い出すことができる。
【０３０８】
保護されている化学発光性化合物は、光分離性の保護基を有するＰＡＣＣである。保護基が光活性化によって分離されると、この化合物は自発的に、あるいは検定メジウム中に存在する成分により活性化されて、光を発する。光分離性保護基の例は、これらに制限されないものとして、ｏ−ニトロベンジル、ｏ−アシルフェニルエチル、アルコキシベンジルなどを包含し、この基は通常、ＰＡＣＣのヘテロ原子に結合している。保護されている化学発光性化合物の一部を形成することができるＰＡＣＣの例には、前記の電子に富むオレフィン類がある。本発明のこの態様に係る保護されている化学発光性化合物の例には、下記の化合物がある：
【０３０９】
【化２７】
【０３１０】
保護されている化学発光性化合物の場合には、光活性化または光分解の前に、いずれか必要な助剤を存在させる。このような助剤は酵素および酵素のための基質を包含することができる。いくつかの場合には、いづれもｐＨの制限が必要である。その他の助剤には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、過酸化水素などがある。上記原則によって指示される、いずれか適当な保護されている化学発光性化合物の選択に係る追加の助剤は、当業者にとって明白なことである。たとえば、化合物１の場合には、ホタルルシフェラーゼおよびそのルシフェリン基質を使用することができる。化合物２の場合には、塩基性メジウム（ｐＨ＞９）を維持することだけが必要である。２Ａの場合には、過酸化水素およびホースラディッシュペルオキシダーゼを使用することができる。
【０３１１】
補助物質−−本発明に係る検定法においては、種々の補助物質をしばしば使用する。一例として、検定メジウム中には通常、緩衝剤を存在させ、また検定メジウムおよび検定成分のための安定剤を存在させる。多くの場合には、これらの添加剤に加えて、タンパク質、たとえばアルブミン類、有機溶剤、たとえばホルムアミド、四級アンモニウム塩、ポリカチオン、たとえばデキストランスルフェート、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、結合増強剤、たとえばポリアルキレングリコール類などを含有させることができる。増感剤が照射によるよりも、化学的に活性化されるものである場合には、補助剤として、過酸化水素をしばしば含有させる。化学発光性化合物の発光波長を、より長い波長に移すことが望まれる場合には、またはその酸素活性化形態の分解を触媒させることが望まれる場合には、蛍光分子を使用することができる。
【０３１２】
全体的に、または部分的に引続いて、本発明で使用される試料および各種助剤を、夾雑ではなく、（同時的に）配合する場合には、１種または２種以上の使用剤を残りの使用剤の１種または２種以上と組合せて、準配合物を生成させることができる。この準配合物はそれぞれ、次いで本発明の工程の１つまたは２つ以上に付することができる。すなわち、これらの準配合物はそれぞれ、所望の結果の１つまたは２つ以上が得られる条件の下にインキュベートすることができる。
【０３１３】
エネルギー受容体−本明細書において、この物質はまた、蛍光エネルギー受容体の用語でも表わされている。３１０ｎｍより高い、通常３５０ｎｍより高い、そして好ましくは約４００より高い、実質的吸光値を有する発色団。
エネルギー受容体の選択はまた、特定のＰＡＣＣによって支配される。エネルギー受容体はＰＡＣＣによって発射される光を吸収することができるものでなければならない。好ましくは、エネルギー受容体の最大吸収値は化学発光性化合物の最大発光と同様の波長であるべきである。吸光係数が高いことが望ましく、通常１０より大きく、好ましくは１０3より大きく、特に好ましくは１０4より大きいことが望ましい。
【０３１４】
エネルギー受容体として有用な種々の一連の分子はＵｌｌｍａｎ等により、コラム８および９のＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶに記載されており、これらの関連記載をここに引用して組入れる。一般に、エネルギー受容体は蛍光化合物または蛍光体であるが、非常に弱い蛍光を有するか、または蛍光を有していないエネルギー受容体も有用である。
【０３１５】
多くの上記の望ましい性質を有する一群の蛍光体はキサンテン染料であり、この染料には、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニル−キサントヒドロールから誘導されるフルオレセイン類、３，６−ジアミノ−９−フェニルキサンチドロールから誘導されるローダミン類およびローザミン類が含まれる。ローダミン類およびフルオレセイン類は、９−ｏ−カルボキシフェニル基を有し、９−ｏ−カルボキシフェニル−キサントヒドロールの誘導体である。
これらの化合物は、結合部位として、または結合性官能性基として、フェニル基上に置換基を有するものとして市販されている。たとえば、アミノおよびイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物が市販されている。
【０３１６】
他の一群の蛍光化合物は、アルファまたはベータ位置に、通常アルファ位置に、アミノ基を有するナフチルアミン化合物である。ナフチルアミノ化合物の中には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリン−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが含まれる。
【０３１７】
活性化されると、タンパク質と反応する染料前駆化合物としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；９−イソチオシアナトアクリジンなどのアクリジン化合物；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾイル）フェニル）マレイミド；下記の式で示される化合物などのベンゾキサジアゾール化合物：
【化２８】
４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；４−ジメチルアミノ−４′−イソチオシアナトスチルベンおよび４−ジメチルアミノ−４′−マレイミドスチルベンなどのスチルベン化合物；が包含される。
【０３１８】
さらに官能性にして、ｓｂｐメンバーと組合させることができる、その他の染料には、アクリジンオレンジ、７−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；Ｎ，Ｎ′−ジオクタデシルオキサカルボシアニンｐ−トルエンスルホネート；８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸および１−ピレン酪酸などのピレン化合物；メロシアニン５４０、ローズベンガル；およびその他の容易に使用できる蛍光発光分子が包含される。
【０３１９】
ポリヌクレオチド検定の場合には、多くの種々のエネルギー受容体を使用することができるが、二重鎖核酸に結合すると、蛍光を増すものが好ましい。エピジウムブロマイドおよびアクリジンオレンジなどのように、侵入する染料は代表的例である。Ｂａｒｔｏｎによって開発されたルテニウム誘導体（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０）１１２：４９６０）は、特に重要であり、これはこの化合物が挿入されると劇的に切り換えられるからである。別様には、エネルギー受容体は化学発光性化合物でラベルしたプローブに接して結合することができる第二のポリヌクレオチドプローブに結合させることができ、あるいはエネルギー受容体は結合されずに、溶液中で自由に分散されるものであってもよい。
蛍光を有していないエネルギー受容体も含むことができ、これは広く種々のアゾ染料、シアニン染料、４，５−ジメトキシフルオレセイン、ホルマザン類、インドフェノール類などのいずれでもあることができる。
【０３２０】
本発明の態様の一つは、被検物質の測定方法である。この方法は、増感剤によって発生される短命な一重項酸素がその自発的崩壊の前に、化学発光性化合物を反応することができるほど極めて接近することができる量の化学発光性化合物及び増感剤に対して、被験物質（存在する場合）が影響を及ぼすような条件の下に、被験物質を含有するものと予想されるメジウムを処理することからなる。この方法はまた、化学発光性化合物によって生じるルミネセンスの強度の測定を包含する。生じるルミネセンスの強度はメジウム中の被験物質の量に関連する。化学発光性化合物は一重項酸素によって活性化することができ、そして増感剤は、通常、光励起に応答する一重項酸素の生成および引続く分子状酸素へのエネルギー転移を触媒する。多くの場合に、表面を増感剤および化学発光性化合物と極めて接近させる。この場合の表面は好ましくは懸濁できる粒子の表面である。化学発光性化合物の活性化によって生成される生成物は、光の発射をともない、好ましくは自発的に分解する。
【０３２１】
この方法は増感剤の分子と化学発光性化合物の分子とを、検定メジウムのカサ高の溶液中におけるそれらの間の平均間隔よりも相互に接近させるか、またはこれらの分子を干渉する、被験物質の存在を予想させる。この分離は被分析試料中に存在する被験物質の量に依存する。
【０３２２】
増感剤分子は、化学発光性化合物と会合されていないと、水性メジウム中で崩壊を受ける前に化学発光性化合物に到達することができない一重項酸素を生成する。しかしながら、増感剤と化学発光性化合物とが被験物質の量に応じて、相互に極めて接近すると、増感剤の照射によって生成される一重項酸素は、崩壊を受ける前に、化学発光性化合物を活性化することができる。多数の化学発光性化合物分子および（または）増感剤分子を表面と会合させることができ、かつまた拡散を表面に限定することができることから、増感剤および化学発光性化合物と結合している表面の存在は、化学発光性化合物に対する一重項酸素の崩壊前の効力または作用を増加させる。従って、被験物質の存在の関数として、増感剤と化学発光性化合物とを接近させる表面を使用することは、好ましいことである。本発明の検定法は、広範囲の種々の被験物質を、簡単で、効率良く、再現可能な方法で検出および測定するための方法を提供する。この方法には、反応中に生成される光の量を測定するための簡単な装置を使用することができる。
【０３２３】
化学発光性化合物と極めて接近する増感剤の量は、増感剤と化学発光性化合物とがそれぞれ、ｓｂｐメンバーと会合されていることから、被験物質の存在によって影響を受ける。これは、多くの方法で達成することができ、従って、「会合」（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）の用語で表わすことにする。増感剤および化学発光性化合物は、ｓｂｐメンバーに共有結合するための官能性基を含有でき、あるいはｓｂｐメンバーまたはｓｂｐメンバーに結合できる基は増感剤および（または）化学発光性化合物に結合するための官能性基を含有することができる。
【０３２４】
この結合は２種の分子間の直接結合によって達成することができ、あるいはｓｂｐメンバーと増感剤または化学発光性化合物との間に結合性基を使用することができる。もう一つの態様においては、増感剤および化学発光性化合物の一方または両方を表面に結合させるか、または粒子中に配合することもでき、ここにまた、ｓｂｐメンバーを結合させる。これらの方法の両方において、ｓｂｐメンバーはそれぞれ、被験物質またはその濃度が被験物質の存在によって左右される検定成分に直接的に、または間接的に結合することができる。
【０３２５】
増感剤および化学発光性化合物は、粒子の少なくとも１つの相中に可溶性であることにもとづいて、粒子中に配合することができ、この場合には、増感剤および化学発光性化合物は、一団の検定メジウム中よりも、粒子内に高濃度で存在する。増感剤および化学発光性化合物を粒子に共有結合させる場合には、増感剤および化学発光性化合物、あるいは粒子またはその成分を官能性にして、増感剤および化学発光性化合物と粒子とを結合する手段を得る。粒子が油滴またはリポソームである場合には、増感剤および化学発光性化合物は１個または２個以上の長鎖状炭化水素に結合させることができ、この炭化水素鎖はそれぞれ、少なくとも１０〜３０個の炭素原子を有するものである。粒子が滴状フルオロカーボンである場合には、これらの粒子中に配合する増感剤または化学発光性化合物をフッ素化して、溶解性を増加させ、かつまた別のラベルと結合した別の粒子中への交換を減じることができる。この場合に、結合に使用する炭化水素は好ましくは、フルオロカーボン鎖で置き換えることができる。
【０３２６】
シリコーン液状粒子の場合には、増感剤および化学発光性化合物はポリシロキサンに結合させることができる。粒子１個当りの増感剤または化学発光性化合物の分子の数を最大にするためには、通常、増感剤または化学発光性化合物の電荷および極性度を最少にし、これが粒子の非水性部分に存在するようにすることが望ましい。粒子がリポソームであり、かつまた増感剤または化学発光性化合物をリポソームの水性相に保有したい場合には、極性または電荷が高い増感剤または化学発光性化合物を使用することが好ましい。
【０３２７】
増感剤および化学発光性化合物をどのようにして結合させるかは問題ではない。どちらの化合物も検定期間中に、そのｓｂｐメンバーから脱離することができないものであり、かつまた別の一組の増感剤および化学発光性化合物に結合しているｓｂｐメンバーと結合することができないものであることが必須要件である。すなわち、これらの化合物のそれらの各ｓｂｐメンバーからの脱離は検定に要する時間よりも遅くあるべきである。
【０３２８】
化学発光性化合物は、被験物質あるいはその濃度が被験物質の存在によって左右される検定成分に対し直接的にまたは間接的に結合できるｓｂｐメンバーに結合させることができる。「直接的にまたは間接的に結合できる」の用語は、指定の実体がこの実体に特異的に結合できる（直接的に）か、または特異結合性の一組のメンバーにまたは別の実体を結合できる２種または３種以上のｓｂｐメンバーの複合体に結合できる（間接的に）ことを意味する。
【０３２９】
表面は一般にそこに結合されているｓｂｐメンバーを有する。好ましくは、化学発光性化合物を、通常、懸濁できる粒子内の表面と会合させる。このｓｂｐメンバーは一般に、被験物質または被験物質に対するレセプターに、直接的にまたは間接的に結合することができる。増感剤と会合されたｓｂｐメンバーおよび化学発光性化合物と会合されたｓｂｐメンバーが両方ともに、被験物質に結合できる場合には、サンドイッチ検定法が得られる。増感剤と会合したｓｂｐメンバーまたは化学発光性化合物と会合したｓｂｐメンバーのうちの一方が被験物質および被験物質類縁体の両方と結合できる場合には、競合式検定法が得られる。化学発光性化合物の粒子表面への結合または粒子内への配合は一般に、増感剤の粒子表面への結合または粒子内への配合に係る前記原則と同一の原則によって支配される。
【０３３０】
増感剤は通常、上記反応体を含有するメジウムを照射することによって、化学発光性化合物を活性化させる。このメジウムは増感剤を励起状態に変換するのに充分のエネルギーを有する波長を有する光によって照射しなければならない。これによって、増感剤は分子状酸素を一重項状態の酸素に活性化することができるようにされる。分子状酸素を励起させることができる増感剤の励起状態は一般に、三重項状態（ｔｒｉｐｌｅｔ）であり、この状態は基底状態の増感剤よりも、約２０、一般に少なくとも２３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ高いエネルギーを有する。好ましくは、メジウムを、約４５０〜９５０ｎｍの波長を有する光により照射するが、さらに短い波長、例えば２３０〜９５０ｎｍの波長の光を使用することもできる。生成されるルミネセンスは、写真により、肉視による、または光度測定によるなどいずれか慣用の方法によって測定し、その量を決定することができる。この測定量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３３１】
増感剤は通常、この増感剤によって効果的に吸収される波長の光により照射することによって励起させることが好ましいが、その他の励起手段も使用することができ、たとえば励起状態のエネルギー供給体、たとえば第二の増感剤からのエネルギー転移によることもできる。第二の増感剤を使用する場合には、増感剤によっては充分に吸収されないが、第二の増感剤によっては充分に吸収される波長の光を使用することができる。この第二の増感剤は、たとえば第一の増感剤を有する粒子の表面に結合させるか、またはこの粒子内に配合することによって、第一の増感剤と会合させるか、またはメンバーを有し、化学発光性化合物を含有する懸濁可能な粒子の組合せを用意し；（ｂ）この組合せを光により処理し、その増感剤を励起させ；次いで（ｃ）そこから発射されるルミネセンスの量に関して、この組合せを検査する；ことからなる。
【０３３２】
発射されるルミネセンスの量はメジウム中の被験物質の量に関連する。好ましくは、化学発光性化合物を懸濁可能な粒子内に配合し、かつまたｓｂｐメンバーをこの粒子に結合させる。さらに好ましくは、増感剤を、そこに結合したｓｂｐメンバーを有する、第二の懸濁可能な粒子内に配合する。
【０３３３】
本発明の方法および組成物は、リガンド−レセプターなどのｓｂｐメンバーを包含する検定法の大部分、たとえば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合検定法などに会合するようにすることができる。第二の増感剤を使用する場合には、この第二の増感剤は通常、第一の増感剤の最低エネルギー三重項状態よりも高いエネルギーの、最低エネルギー三重項状態を有する。
【０３３４】
６３２．６ｎｍの放射線を有するヘリウム−ネオンレーザーは励起用の安価な光源である。約６２０〜約６５０ｎｍの領域に最大吸収を有する増感剤はこの放射線のヘリウム−ネオンレーザーに適合し、従って本発明において特に有用である。
【０３３５】
本発明のもう一つの態様は、被験物質の測定方法にあり、この方法は、（ａ）（１）被験物質を含有するものと予想されるメジウム、（２）その励起状態で、酸素と一重項状態に活性化することができる増感剤（この増感剤はｓｂｐメンバーと会合されている）、および（３）そこに結合されているｓｂｐ適応させることができる。これらの検定法は、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）または不均一系（ｈｅｔｒｏｇｅｎｏｕｓ）競合法もしくは非競合法であることができる。検定成分、化学発光性化合物および増感剤は、（１）表面（使用する場合）、（２）核酸またはレセプター、および（３）核酸またはリガンドとともに、多くの方法で使用することができる。会合は、共有結合または非共有結合であることができる。前記および後記の説明から、特定の所望の検定に応じて、当業者は適当な会合を選択することができる。
【０３３６】
均一系検定法においては、試料を必要に応じて予備処理し、望ましくない物質を除去する。非競合的サンドイッチ検定法における反応は、被験物質に対して相補的であり、化学発光性化合物と会合しているｓｂｐメンバー（たとえば、抗体、核酸プローブ、レセプターまたはリガンド）；被験物質に対してまた相補的であり、ｓｂｐメンバー（たとえば、抗体、核酸プローブ、レセプターまたはリガンド）と会合されている増感剤；対象試料；および必要な助剤；を包含する。好ましくは、増感剤および化学発光性化合物の一方または両方を、ｓｂｐメンバーが結合されている粒子内に配合する。
【０３３７】
競合法においては、一つのｓｂｐメンバーが被験物質の誘導体であることができ、そして他の一つのｓｂｐメンバーが被験物質に対して相補的であることができる（たとえば、抗体）。どちらの方法でも、諸成分は同時的に、または順次、全体的にまたは部分的に、配合することができる。活性化した増感剤によって生成される一重項状態酸素の、化学発光性化合物に対する反応能力は、ｓｂｐメンバーの被験物質に対する結合によって支配される。他方、被験物質の存在または量は、照射、加熱または化学剤の添加により、好ましくは照射により、増感剤の活性化によって発射される光の量を測定することにより、決定することができる。この結合反応およびその程度の検出は両方ともに、分離することなく、均一溶液中で行なうことができる。このことは、化学発光性を利用する従来技術の方法に優る本発明の利点である。
【０３３８】
不均一系検定法においては、検定成分は、ｓｂｐメンバーである被験物質を含有するものと予想される試料；化学発光性化合物および増感剤からなる群の一員を会合して有する、非分散性の表面または粒子のどちらかであることができる支持体に結合されているｓｂｐメンバー；およびｓｂｐメンバーが独立して、直接的にまたは間接的に被験物質またはこの被験物質用のレセプターを結合できるように、会合されている、上記群の他の一員を有するｓｂｐメンバーからなる。
【０３３９】
これらの成分は一般に、同時的に、または順次、全体的に、または部分的に、配合することができる。この表面または粒子を次いで、液相から分離し、次いで分離した相または液相のどちらかを、通常、対象相の照射によって、その増感剤を活性化させる条件に付し、次いで発射された光の量を測定する。
【０３４０】
被験物質検定における結合反応は、正常には、一般に最適検定感度を提供する、中程度のｐＨにおいて、水性メジウム中で行なう。好ましくは、増感剤の活性化もまた水性メジウム中で行なう。しかしながら、分離工程を使用する場合には、たとえばアセトニトリル、アセトン、トルエン、ベンゾニトリルなどのような非水性メジウムおよび非常に高いｐＨ、例えば１．０より大きいｐＨ、あるいは非常に低いｐＨ、すなわち４．０より小さいｐＨ、通常では、非常に高いｐＨを有する水性メジウムを使用することもできる。上記で説明したように、この検定法は検定用成分または生成物のいづれかを分離することなく（均一系）、あるいは分離して（不均一系）、行なうことができる。
【０３４１】
水性メジウムは水単独であってもよく、あるいは０．０１〜８０容量パーセントの補助溶剤を含有していてもよいが、通常、ｓｂｐメンバーとして、タンパク質が使用される場合には、水性メジウムは４０％より少ない量の補助溶剤を含有する。結合反応用のメジウムのｐＨは通常、約４〜１１の範囲、さらに一般的には約５〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜９．５の範囲である。このｐＨが、一重項状態酸素の発生期間中に変化しない場合には、このｐＨは通常、結合メンバーの最適結合ｐＨと信号の生成および検定用の他の成分の安定に最適のｐＨとの間にある。
【０３４２】
信号の生成に、高められたｐＨが必要な場合には、アルカリ性試薬の添加を含む工程を、結合反応と一重項酸素の発生および（または）信号生成との間に挿入することができる。一般的に、この高められたｐＨは１０より大きく、通常１０〜１４である。不均一系検定法の場合には、上記したような、非水性溶剤をまた使用することができ、この場合には、この溶剤が一重項状態酸素と有効には反応しないことを考慮する。
【０３４３】
望ましいｐＨを得、検定期間中にこのｐＨを維持するために、種々の緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタールなどが含まれる。使用する特定の緩衝剤には本発明において制限はないが、各検定毎に、１種のまたは他の一種の緩衝剤が好適である。
【０３４４】
検定において、タンパク質リガンドとレセプターとの結合反応を行なうために使用する温度は通常、中程度の温度であり、一般に測定期間中、一定の温度、好ましくは２５°〜４０°を使用する。結合反応のためのインキュベーション温度は一般的に、約５°〜４５℃、通常約１５°〜４０℃、さらに通常的には、２５°〜４０℃である。核酸の結合が検定中に生じる場合には、さらに高い温度、通常２０°〜９０°、さらに通常３５°〜７５℃の温度がしばしば使用される。測定中の温度、すなわち一重項状態酸素の発生および光検出の期間中の温度は一般に、約２０°〜１００℃、さらに通常約２５°〜５０℃、好ましくは２５°〜４０℃の範囲である。
【０３４５】
検定することができる被験物質の濃度は一般に、約１０-4Ｍから１０-16Ｍ以下、さらに通常、約１０-6〜１０-14Ｍで変わる。検定が定量的であるか、半定量的であるか、または定性的であるか、およびまた特定の検出技術、対象被験物質の濃度および最高に望ましいインキュベーション時間を考慮して、各種成分の濃度が通常、決定される。
【０３４６】
競合検定法においては、検定メジウム中の各種成分の濃度は一般に、対象被験物質の濃度範囲によって決定されるが、各成分のそれぞれの最終濃度は通常、この検定の感度がこの範囲全体にわたって最適になるように、実験的に決定される。すなわち、重要な被験物質の濃度の変化が実際に測定できる信号の差違として得られなければならない。
【０３４７】
ｓｂｐメンバーの濃度は、被験物質の濃度、所望の結合速度、およびｓｂｐメンバーが非特異的に結合する程度に依存する。通常、ｓｂｐメンバーは少なくとも最低の予想被験物質濃度で、好ましくは少なくとも予想される最高被験物質濃度で存在させる。非競合検定法の場合には、この濃度は最高被験物質濃度の１０〜１０6倍であることができるが、通常、１０-4Ｍより少なく、好ましくは１０-6Ｍより少なく、多くの場合に１０-11〜１０-7Ｍである。ｓｂｐメンバーと会合させる増感剤または化学発光性化合物の量は一般に、ｓｂｐメンバー当りで少なくとも１分子であり、増感剤分子または化学発光性化合物分子を粒子内に配合する場合には、１０5ほど高くてもよく、通常少なくとも１０〜１０4であることができる。
【０３４８】
添加順序は広く変えることができるが、検定の種類に応じて、或る好ましい順序がある。最も簡単な添加順序は、諸物質を同時的に加える順序である。別法として、諸成分を全体的にまたは部分的に順次、配合することもできる。検定が競合的である場合には、試料と被験物質を結合できるｓｂｐメンバーとを配合した後に、被験物質類縁体を添加することがしばしば望ましい。場合により、これらの諸成分を配合した後に、インキュベーション工程を包含させることができ、このインキュベーション工程は一般に、約３０秒〜６時間、さらに通常、約２分〜１時間の範囲で行ない、その後で増感剤により一重項酸素を発生させ、次いで発光を測定する。
【０３４９】
特に好適な添加順序では、被験物質に対し相補的であり、そして（または）被験物質と同族である、特異結合性の一組のメンバーからなる第一のセットを被験物質と配合し、次いで第一の特異結合性の一組のメンバーに対し相補的である特異結合性の一組のメンバーを添加する。これらのメンバーはそれぞれ、増感剤および化学発光性化合物からなる群の別々の一員と会合している。この検定混合物またはその分離した成分を次いで、照射し、その発光を測定する。
【０３５０】
均一系検定法においては、全成分を配分した後に、所望により、これらをインキュベートすることができる。次いで、この配合物を照射し、生じる発光を測定する。この発光は被験試料中の被験物質の量に関連する。均一系検定法で使用される本発明の諸成分の量は、被験物質の種類に依存する。一般に、本発明の均一系検定法は、ＥＭＩＴ検定法（商品名）のような公知検定法に比較して増大した感度を示す。この利点は、主として、本発明の方法で得られる、改善された信号対ノイズ比の結果である。
【０３５１】
当業者が本発明の範囲を認識し、本発明を不当な実験を行なうことなく実施できるようにするために、制限的意味を有していない例を下記に示す。被験物質、増感剤、化学発光性化合物、表面、粒子および反応条件の選択は、下記の例の記載から当業者に示唆されるであろう。
【０３５２】
本発明の態様の一つにおいて、化学発光性化合物、９−ベンザル−１０−メチルアクリダンをチロイド刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する抗体（試薬１）に共有結合させる。そのフェニル環に結合しているカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルにより官能性にした９−ベンザル−１０−メチルアクリダンを抗体のアミノ基と反応させる。結合基はカルボキシアミドである。使用増感剤はローズベンガルであり、これは０．５ミクロンの平均径を有するラテックス粒子に共有結合させる。ラテックス粒子とローズベンガルとは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９７：３７４１（１９７５）に記載されているように、エステル結合基を得るために、ラテックス上のクロロメチル基によって、相互に共有結合させる。
【０３５３】
このラテックス粒子をＴＳＨに対する第二の抗体にさらに結合させる（試薬２）。このためには、ラテックス上のＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル基を使用する。使用抗体は両方ともに、標準ハイブリッドセルライン技術によって調製されるモノクローナル抗体である。抗体の一つはＴＳＨのα−サブユニットを認識し、そして他の一つはＴＳＨのβ−サブユニットを認識する。
【０３５４】
検定の実施に際しては、ＴＳＨを含有するものと予想される血清試料を患者から得る。５０マイクロリッターの試料を、上記試薬１および試薬２とともに、トリス緩衝剤によってｐＨ８．０に緩衝されている水性メジウム５００ｍＬ中で一緒に配合する。試薬１および試薬２の量は、約１０-6モルの各抗体の濃度が得られるに充分にする。この反応混合物を次いで、２５℃で１時間、インキュベートし、次いで５６０ｎｍの光を３０秒間照射する。照射後に発射された光の強度を測定し、３０秒間の間に検出された総光エネルギーを、既知濃度でＴＳＨを含有する試料により同様の方法で得た数値と比較し、未知のＴＳＨ濃度を決定する。
【０３５５】
別法では、インキュベーションの後に、ラテックス粒子をメジウムから分離し、ｐＨ９．５の水性緩衝メジウム中に入れ、同様に照射し、次いでこの系から発射された光の量を上記のとおりに測定する。
【０３５６】
上記方法にもとづく別法においては、試薬２が第二の抗体に共有結合したローズベンガルであり、ラテックス粒子は使用しない。さらにもう一つの別法においては、試薬２が第二の抗体に共有結合したローズベンガルであり、かつまた試薬１が、第一抗体が共有結合しているラテックス粒子に共有結合した９−ベンザル−１０−メチルアクリダンである。上記方法にもとづくさらにもう一つの別法においては、試薬１がすぐ上に記載されているものであり、試薬２はアビジンが共有結合しているラテックス粒子に共有結合したローズベンガルであり、かつまたビオチンに共有結合した第二の抗体である第三の試薬（試薬２Ａ）を使用する。試薬１と第三の試薬とを、試料に配合し、次いでインキュベートする。次いで、過剰量の試薬２を加え、引続く処理は上記のとおりに行なう。
【０３５７】
上記方法にもとづく、もう一つの別法においては、ローズベンガルの代りにクロロペルオキシダーゼを使用する。この検定法では、照射工程の代りに、臭化ブロマイドおよび過酸化水素を添加し、一重項状態酸素を発生させる。発射された光を上記のとおりに測定する。
【０３５８】
本発明に係るもう一つの態様においては、上記Ｇｉａｅｖｅｒの刊行物に従い鉱油中の増感剤、クロロフィルから油滴の形態の第一セット（試薬３）を調製する。０．１〜２ミクロンのサイズを有する、この油滴を官能性にし、次いでヒト慢性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）に対するモノクローナル抗体に結合させる。クロロフィルは親油性であり、従ってこの親油性油滴中に不可逆的に溶解する。
【０３５９】
同様の方法で、油滴形の第二のセット（試薬４）を調製する。このセットの油状滴では、この油状滴はＨＣＧに対する第二のモノクローナル抗体に共有結合されており、この第二の抗体は上述の第一のモノクローナル抗体によって認識される以外のＨＣＧ分子の異なる部分を認識する。９−（ジフェニルメチリジン）−Ｎ−メチルアクリダンは、そのアクリダンのフェニル基の一つに結合しているＮ，Ｎ−ジドデシルカルボキシアミド基を含むことによって、この親油性油滴に不可逆的に溶解される。これらモノクローナル抗体は、標準的ハイブリッドセルライン技術によって調製される。
【０３６０】
ＨＣＧを含有するものと予想される尿試料（５０マイクロリッター）をｐＨ７．５の水性緩衝メジウム（５００μＬ）中で、それぞれ過剰量の試薬３および試薬４と配合する。このメジウムを２５℃で２０分間インキュベートする。分離しないで、このメジウムを、Ｈｅ／Ｎｅレーザーを用いて６３３ｎｍで、１分間照射し、次いで発射された光を前記のとおりに測定する。この光の量を、既知量のＨＣＧを含有する試料から発射される量と比較し、この数値の比較によって未知試料中のＨＣＧの量を決定する。この方法によって、ＨＣＧの簡便で、敏感な均一系免疫検定を行なうことができる。
【０３６１】
前記方法にもとづくもう一つの別法においては、試薬３がＨＣＧに対する抗体の代りに、フルオレセインを含有し、追加の試薬（試薬３Ａ）がフルオレセインに共有結合したＨＣＧ抗体を有する。試薬４は第二のＨＣＧ抗体の代りに、アビジンを含有し、そして第四の成分（試薬４Ａ）はビオチンに共有結合した第二の抗体を含有する。この検定においては、試薬４Ａおよび試薬３Ａを試料に配合し、インキュベートする。その後、試薬３および試薬４を加え、次いでインキュベートする。次いで、上記検定法の残りの工程を行なう。
【０３６２】
本発明のもう一つの態様においては、ｐＨ７．４の緩衝液中のリン脂質を、当該目的用に設計されている市販の装置を用いて、０．２ミクロン孔径の膜に通す、高圧抽出によって、一組のリポソーム（試薬５）（０．２ミクロン径）を形成する。このリポソームのホスファチジルエタノールアミンとメチルカルボキシメチルジスルフィドの活性エステルとを反応させ、次いでジチオエリスリトールと反応させることによって、先ずリポソーム上にメルカプトアセトアミド基を形成することにより、リポソームにチロキシン類縁体を共有結合させる。次いで、このスルフヒドリル化したリポソームをブロモアセチルチロキシンと反応させる。このリポソームの親油性部分にメタロ−ポルフィリン染料を溶解させる。
【０３６３】
もう一組のリポソーム（試薬６）を使用し、チロキシンに対するモノクローナル抗体を結合させる。この抗体はチロキシン結合と同様の方法により共有結合させる。このリポソームの表面に、カルボキシアミド結合性基によって、エナミン（２−ジメチルアミノメチレンピラン）を共有結合させる。試薬５および試薬６を、ｐＨ８．０の水性緩衝検定メジウム（５００μＬ）中で、チロキシンを含有するものと予想される血清試料と配合する。このメジウムはアニリノナフタレンスルホン酸（５０マイクロリッター）を含有する。この化合物は、結合性タンパク質からチロキシンを分離し、酸素活性化ピランからのエネルギーを受け取り長波長発光を生じさせる。この検定メジウムを次いで、室温で１時間インキュベートする。分離工程を行なわずに、このメジウムを６５０ｎｍで１分間照射し、生じる発光をルミノメーターにより測定する。得られた数値は、既知量のチロキシンを使用する同様の検定を行なうことによって得られた数値と比較する。この方法により、血清試料中のチロキシンの量が定量できる。
【０３６４】
上記方法にもとづく別法においては、試薬６がチロキシンに対する抗体である代りに、アビジンを含有する。追加の試薬（試薬６Ａ）はビオチンに共有結合したチロキシンに対する抗体を含有する。試薬５はチロキシンの代りに、フルオレセインに対する抗体を含有し、そして追加の試薬（試薬５）はフルオレセインに結合したチロキシンを含有する。この検定法においては、試薬５Ａおよび６Ａを、試料と配合し、次いでインキュベートする。次いで、試薬５および６を加え、この混合物をインキュベートし、検定法の残りの部分を行なう。
【０３６５】
前記方法にもとづく、もう一つの別法においては、メタロ−ポルフィリン染料の代りに、モリブデン酸カリウムを使用し、これをリポソームの水性相に配合する。この検定法においては、照射工程の代りに、過酸化水素を加えて、一重項状態酸素を生成させる。発射された光を前記のとおりに測定する。
【０３６６】
もう一つの態様においては、Ｇｒｉｂｎａｕにより開示された方法と同様の方法により、染料結晶中で、２−ヒドロキシエチル−９，１０−ジブロモアントラセンを生成させる。Ｂ型肝炎表面抗原を認識するモノクローナル抗体を、カルバメート結合基によって、染料結晶に共有結合させる。ラテックス粒子を処理し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する第二の抗体を共有結合により不動化する。このラテックス粒子にはさらに、アミド結合基により９−（ベンザル−９Ｈ−キサンテン）を共有結合させる。この染料結晶は平均２ミクロンの粒子サイズを有し、そしてこのラテックス粒子は０．２ミクロンの平均径を有する。モノクローナル抗体は標準ハイブリッドセルライン技術によって調製される。
【０３６７】
肝炎を患らっているものと予想される患者からの血清試料（５０μＬ）を、ｐＨ７．０の水性検定メジウム（５００μＬ）中で、過剰量の上記染料結晶およびラテックス粒子と配合する。この検定メジウムを次いで、室温で３０分間インキュベートし、次いでキセノン光源を用いて、３５０ｎｍで１分間照射する。試料中にＢ型肝炎表面抗原が存在すると、各抗体と抗原との免疫結合によって、染料結晶とラテックス粒子とが極めて接近する。このメジウムを照射すると、９，１０−ジブロモアントラセンが励起され、分子状酸素を一重項状態酸素に変換する。この一重項酸素はキサンテンと反応し、ジオキセタンを生成させ、このジオキセタンは室温で自発的に分解し、光を発する。この光を分光計によって測定する。或るしきい値レベル以上の光量は試料中のＢ型肝炎表面抗原の存在を示す。このメジウムの照射は室温で行ない、そしてまた、この検定は均一系法で行なわれ、Ｂ型肝炎表面抗原用の検定法を提供する。
【０３６８】
好適には、この検定法において、Ｅｕ（ＴＴＡ）3をラテックス粒子に溶解し、励起したキサンテン誘導体のエネルギーをＥｕ（ＴＴＡ）3に移行させる。これは６００ｎｍ以上のエネルギーを発生する。キサンテンルミネセンスから直接に発射される光は血清成分によって吸収されるので、別段に生じる血清の干渉がこれによって回避される。
【化２９】
【０３６９】
もう一つの態様は、赤血球の表面上の特定の血液型抗原、すなわちＡ型抗原を測定する検定法である。１５０〜５００ｎｍの粒子サイズを有し、前記のとおりにして調製されるラテックス粒子を使用する。このラテックス粒子は、このラテックス粒子に共有結合したＡ型抗原に対する抗体を有する。この粒子はまた、このラテックス中に溶解している、エノールエーテル、２−ｐ−ジメチルアミノフェニル−３−フェニル−５，６−ジヒドロジオキセンを含有する。
【０３７０】
このラテックス粒子試薬を水性メジウム（５００μＬ）中で、全血（１００μＬ）および１×１０-4Ｍの増感剤と配合する。この増感剤は疏水性増感剤、すなわちフェナジン−２−カルボン酸である。この疎水性染料は試料中に存在する赤血球中に侵入する。このメジウムを２５℃で１０分間インキュベートし、次いでタングステン光源を用いて、４００〜４５０ｎｍで３０秒間照射する。このメジウムから発射される光を測定し、Ａ型抗原赤血球を含有していないことが判っている試料で得られた光の量と比較する。この場合には、しきい値レベル以上の光の量が血液型Ａ抗原の存在を示す。
【０３７１】
本発明のもう一つの態様においては、被験物質が細胞表面上のＨＬＡ抗原である。ＨＬＡ抗原を含有するものと予想される試料（５０μＬ）を、ｐＨ７．４に緩衝されている水性検定メジウム（５００μＬ）中に装入する。このメジウムにはまた、チオエーテル結合性基によってエモシンに共有結合したＨＬＡ抗原に対する抗体である試薬の過剰量を加える。この検定メジウムに、化学発光性化合物をまた加える。化学発光性化合物は、ＨＬＡ抗原を含有する細胞中に侵入するものであるように選択する。
【０３７２】
この化学発光性化合物は、アクリダン、すなわち９−（ドデシルフェニルメチリジン−１）−Ｎ−（２−スルホンオキシエチル）アクリダンである。この検定メジウムを室温で１時間インキュベートし、次いでタングステン−ハロゲン光源を用いて、５００〜５５０ｎｍで１分間照射する。この検定メジウムから発射される光を測定し、しきい値レベル以上の光の量がＨＬＡ抗原の存在を示す。
【０３７３】
本発明はまた、０．０４〜４０００ナノメーターの平均径を有し、化学発光性化合物を含有する組成物を包含する。この化学発光性化合物は、粒子マトリックスに共有結合されていてもよく、あるいはマトリックス中に溶解されているか、またはマトリックス中に溶解されている溶剤中に溶解されていてもよい。粒子は好ましくは、滴状の重合体または油状物、あるいはリポソームなどの小胞体である。粒子がリポソームである場合には、化学発光性化合物を脂質二重層と会合させるか、またはリポソームの水性内容物中に溶解させる。
【０３７４】
この粒子はそこに結合しているｓｂｐメンバーを含有する。好ましくは、ｓｂｐ結合粒子は１０〜１０００ｍｍの平均径を有する。相互に結合した２種の相補的ｓｂｐメンバーを有し、その一つが増感剤に結合しており、そして他の一つが化学発光性化合物と会合している組成物がまた包含される。
【０３７５】
本発明のもう一つの態様は、組合物を提供する方法にあり、この方法は、（１）被験物質を含有するものと予想されるメジウムおよび（２）ＰＡＣＣと会合した第一の特異結合性の一組の（ｓｂｐ）メンバーを含有するラベル試薬からなる。ｓｂｐメンバー複合体が被験物質の存在に関連して生成される条件を選択する。たとえば、第一のｓｂｐメンバーは被験物質または第二のｓｂｐメンバーに結合して、被験物質の存在に関連する複合体を生成することができるものであることができる。この方法はまた、ＰＡＣＣの光化学的活性化およびＰＡＣＣによって発射されるルミネセンスの量の検出を包含する。このルミネセンスの量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３７６】
一般に、ＰＡＣＣは、光の照射によって、光化学的に活性化される。この光はＰＡＣＣを直接に活性化でき、あるいは増感剤を活性化できるものである。この増感剤は照射されると、分子状酸素を一重項状態の酸素に変換させる。一重項状態の酸素は次いで、ＰＡＣＣを活性化する。増感剤は検定の種類に応じて、リガンドに結合させることができ、あるいは溶液中に自由に存在させることができ、あるいは表面に結合させることができる。一重項状態酸素によるＰＡＣＣの活性化によって生成される生成物は光を発射して、自発的に分解できるか、あるいはさらに物理的または化学的に処理されて、発光することができる。
【０３７７】
ＰＡＣＣを活性化する一重項状態酸素を生成させるために、異なる多くの増感剤を使用することができる。増感剤は直接に、ｓｂｐメンバーに結合させることなく使用することができる。この方法では、比較的大きい濃度、通常少なくとも１０-7Ｍ、好ましくは少なくとも１０-6Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１０-5Ｍの増感剤を使用する。一般に、この方法で使用する増感剤の量は、ＰＡＣＣの活性化をもたらす濃度の一重項状態酸素を生成させるのに充分の量である。この方法は、ＰＡＣＣの発光が実質的に変えられる場合、複合体が生成される場合、あるいはメジウム中のＰＡＣＣの量が通常、結合したラベルと未結合ラベルとの分離によって得られる場合に、使用することができる。
【０３７８】
分離が望まれない場合には、この複合体中のＰＡＣＣの発光はエネルギー受容体によって変えることができ、この場合には、被験物質が存在する結果として生成される複合体にエネルギー受容体が結合することによって、ＰＡＣＣに極めて接近される。このエネルギー受容体が螢光体である場合には、発光の波長が通常、変更される。エネルギー受容体が螢光体ではない場合には、ＰＡＣＣがこの複合体と結合された時点で、その化学ルミネセンスが通常、消失する。
【０３７９】
本発明のもう一つの態様においては、増感剤およびＰＡＣＣを一団の検定メジウム溶液と本明細書に記載の表面とに分配する。この分配は、分析しようとする試料中に存在する被験物質の量に依存し、増感剤は通常、ｓｂｐメンバーに結合させる。表面と会合しない増感剤分子は、一重項状態酸素を生成するが、この一重項酸素は水性メジウム中で崩壊を受ける前にＰＡＣＣに到達することはできない。しかしながら、増感剤およびＰＡＣＣが両方ともに、表面と会合して、被験物質の存在の結果として、複合体を形成する場合には、増感剤の照射によって生成される一重項酸素は、崩壊を受ける前にＰＡＣＣを活性化することができる。この方法において、増感剤の使用量は、増感剤に結合したｓｂｐメンバーを含まない増感剤を用いる前述の方法におけるよりは格別に少ない量であることができる。
【０３８０】
理解できるように、この対象検定法は、試料中の広く種々の被験物質を検出し、測定するための、簡便で、効果的であり、かつまた再現性を有する方法を提供し、この方法には、反応中に生成される光の量の測定に、肉視または慣用の装置を使用することができる。
【０３８１】
被験物質の存在の結果として、増感剤が表面と会合するようになる場合には、増感剤は通常、ｓｂｐメンバーと会合させる。これは、多くの方法で達成することができる。増感剤がｓｂｐメンバーに結合性の官能性基を有していてもよく、あるいはｓｂｐメンバーが増感剤に結合性の官能性基を有していてもよい。この結合は、２個の分子間の直接結合であることができ、あるいはｓｂｐメンバーと増感剤との間に、結合性基を使用することもできる。
【０３８２】
もう一つの態様では、増感剤を粒子に結合させるか、または粒子中に配合することができ、この粒子にはまた、ｓｂｐメンバーを結合させる。両方の場合において、ｓｂｐメンバーは被験物質に結合することができるものである。増感剤は粒子の少なくとも１つの相に可溶性であることから、粒子中に配合することができる。増感剤を粒子中に配合しない場合には、増感剤は粒子に結合させることができる。この目的には、増感剤または粒子、あるいはその成分を官能性にして、増感剤および粒子の結合手段を得る。油状滴の形態または脂質二重層の形態の粒子の場合には、粒子組成に適合しうる長鎖状炭化水素に結合させることによって、増感剤を粒子に結合することができる。多くの場合に、８〜２０個またはそれ以上の炭素原子を有する、少なくとも１種の、好ましくは２種の炭化水素鎖が使用される。
【０３８３】
粒子がフルオロカーボンの滴状物である場合には、増感剤をフッ素化し、その溶解性を増大させ、かつまた交換を減じることができ、好ましくは、結合に使用する炭化水素鎖の代りに、フルオロカーボン鎖を使用する。シリコーン粒子の場合には、増感剤はポリシロキサンに結合させることができる。通常、増感剤の電荷および極性を最少にして、増感剤が粒子の非水性部分内に存在するようにすることが望ましい。前述したように、このｓｂｐメンバーに結合した増感剤を含む方法は、本明細書中に充分に説明されている。
【０３８４】
前述したように、ＰＡＣＣは「ｓｂｐメンバーと会合させる」、すなわち本発明においてＰＡＣＣはラベルとして機能する。本明細書で使用するものとして、「ｓｂｐメンバーと会合」の用語は、次の様相を包含する：通常、ＰＡＣＣとｓｂｐメンバーとの会合は共有結合による。しかしながら、このラベル試薬がまた、懸濁できる粒子からなり、この粒子にＰＡＣＣが結合しているか、またはこの粒子内にＰＡＣＣが非共有的に配合されていることもできる。この懸濁できる粒子はまた、そこに結合したｓｂｐメンバーを有する。
【０３８５】
このｓｂｐメンバーは一般に、被験物質に、または被験物質に結合できるｓｂｐメンバーに、結合することができる。もう一種のｓｂｐメンバーを使用し、これを被験物質に結合させることができる場合には、サンドイッチ検定法が得られる。ＰＡＣＣに結合したｓｂｐメンバーはまた、被験物質に対し類縁体であることができ、この場合には、競合検定法を得ることができる。
【０３８６】
増感剤を使用する場合に、増感剤は、上記諸反応体を含有するメジウムが照射されると、ＰＡＣＣを活性化する作用を果たす。メジウムは増感剤を励起状態に変換し、分子状酸素を一重項状態酸素に活性化できるのに充分のエネルギーの波長を有する光で照射する。ｓｂｐメンバーに結合している場合には、この増感剤の濃度は非常に小さく、しばしば１０-6〜１０-12Ｍまたはそれ以下であることができる。増感剤が結合されていない場合には、増感剤濃度は、明白な量の光を吸収するのに充分の濃度、通常少なくとも０．１％、好ましくは１〜８０％である。
【０３８７】
増感剤の励起状態は通常、最低三重項状態であり、基底状態よりも少なくとも２５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ、好ましくは２３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ多くのエネルギーを有する。一般に、メジウムは、約３００〜１２００ｎｍ、通常４５０〜９５０ｎｍ、好ましくは５５０〜８００ｎｍの波長を有する光により照射する。照射時間は活性化ＰＡＣＣの寿命、光強度および所望の発光強度に依存する。短命の活性化ＰＡＣＣの場合には、この照射時間は、マイクロ秒ほどの短い時間であることができ、この場合には、強いフラッシュランプまたはレーザーを使用する。長命な活性化ＰＡＣＣを使用する場合には、この照射時間はさらに長くてもよく、かつまた強度の低い光源を使用することができる。
【０３８８】
一般に、照射期間にわたる集積光強度は増感剤分子の少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも３０％を励起させるのに充分なものであるべきであり、最も好ましくは、増感剤の分子の全部を少なくとも一度は励起させる強度である。
【０３８９】
上記いずれの場合においても、生成される光またはルミネセンスは肉視により、写真により、日射計により、分光光度計により、あるいはいずれかその他の慣用の測定手段により、その量を測定することができ、この量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３９０】
ヘリウム−ネオンレーザーは、６３２．６ｎｍで励起させるための、安価な光源である。この波長で光を吸収する増感剤は、ヘリウム−ネオンレーザーの発射線と適合でき、従って本発明において特に有用である。その他の光源には、たとえばアルゴン、ＹＡＧ、Ｈｅ／Ｃｄおよびルビイなどの他のレーザー類、ホトダイオード類、水銀、ナトリウムおよびキセノン蒸気ランプ、タングステンおよびタングステン／ハロゲンなどの強烈なランプ、およびフラッシュランプが含まれる。
【０３９１】
本発明のもう一つの態様は、被験物質の測定方法にあり、この方法は、（ａ）（１）被験物質を含有するものと予想されるメジウム、（２）一重項状態酸素との反応によって化学発光することができる化合物に結合した一対の特異結合体（ｓｂｐメンバー）のうちの第一のメンバーを含むラベル試薬および（３）上記ラベル試薬を含むｓｂｐメンバー複合体が上記メジウム中の被験物質の存在に関連して生成され、上記化学発光性化合物からのエネルギーが下記螢光エネルギー受容体を活性化できる条件の下に、第二のｓｂｐメンバーに結合した、または結合できるようになる螢光エネルギー受容体を含有する不溶化した試薬を、同時的に、あるいは順次全体的または部分的に、検定メジウム中で配合し、（ｂ）上記化合物を光により活性化し、次いで（ｃ）その存在または強度が上記メジウム中の被験物質の量に関連する信号に関して、上記検定メジウムを検査する、ことからなる。
【０３９２】
本発明に係るこの方法および組成物は、リガンド−レセプターなどのｓｂｐメンバーを含む検定法の大部分、たとえば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合検定などに適合させることができる。この検定法は、均一系、不均一系、競合式またはサンドイッチ式であることができる。均一系検定法においては、望ましくない物質を分離するために、必要に応じて、試料を予備処理することができる。サンドイッチ式検定法の場合の免疫学的反応は通常、ｓｂｐメンバー、たとえば抗体および対象試料を包含する。この抗体は被験物質に対し相補的であり、ＰＡＣＣ、第二のｓｂｐメンバー、たとえば抗体に結合することができ、この第二の抗体はまた、被験物質に対し相補的である。競合法においては、ＰＡＣＣは被験物質に対する類縁体、通常、被験物質の誘導体と、または被験物質に対し相補的のｓｂｐメンバー、たとえば抗体と、会合させることができる。
【０３９３】
ＰＡＣＣはそれだけで、またはエネルギー受容体と会合させて使用することができる。エネルギー受容体を活性化するために活性化ＰＡＣＣによって発生される発光能は、２種のｓｂｐメンバーの結合によって支配されることがあり、あるいは活性化ＰＡＣＣの近くに比較的高濃度のエネルギー受容体が存在する結果であることもある。後者の場合に、その濃度は通常、少なくともマイクロモル、通常ミリモルである。これとは逆に、ＰＡＣＣがｓｂｐメンバーに結合している場合には、その濃度は全く少なく、しばしば１０-5〜１０-15、通常１０-8 〜１０-14であり、その程度の検出は、均一溶液中で分離することなく行なうことができるが、ただしＰＡＣＣが結合性複合体中に存在する場合には、ルミネセンス強度は変えられる。
【０３９４】
不均一系検定法では、ｓｂｐメンバーである被験物質を含有するものと予想される試料を、支持体に結合した相補的ｓｂｐメンバーからなる試薬と配合する。この支持体はＰＡＣＣを有する表面または粒子であることができる。もう一つのｓｂｐメンバーと会合しているエネルギー受容体をまた使用することができ、この場合には、このｓｂｐメンバーは被験物質に対し相補的であるか（サンドイッチ式）または類縁体であるか（競合式）のどちらかであることができる。これらの材料は一般に、同時的にあるいは順次全体的または部分的に配合する。この支持体を次いで、液相から分離し、固体相または液体相のどちらかを、通常対象の特定の相の照射、および発射光の量の測定によって、ルミネセンスエネルギーの存在に関して検査する。
【０３９５】
被験物質の検定は通常、中程度のｐＨ、一般に最適検定感度を提供するｐＨにおいて、水性緩衝メジウム中で行なう。前記で説明したように、この検定法は、検定成分または生成物のいずれをも分離することなく（均一系）またはこれらのいずれかを分離して（不均一系）、行なうことができる。
【０３９６】
この水性メジウムは水単独であることができ、あるいは０．０１〜８０容量パーセント、またはそれ以上の補助溶剤を含有していてもよい。メジウムのｐＨは通常、約４〜１３の範囲、さらに通常約５〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜９．５の範囲である。ｐＨは通常、結合性メンバーの最適結合ｐＨと検定の他の試薬、たとえば信号発生物質のメンバーに関して最適のｐＨとの間にある。たとえば、活性化ＰＡＣＣは、崩壊してルミネセンスを発生するために、或るｐＨ範囲を必要とすることがある。
【０３９７】
所望のｐＨを達成し、測定中、このｐＨを維持するために、各種緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタールなどが含まれる。使用する特定の緩衝剤には本発明において制限はないが、各検定毎に、１種または他の１種の緩衝剤が好適である。
【０３９８】
検定の実施には通常、中程度の温度が用いられ、一般に測定期間中、一定の温度、好ましくは室温を使用する。インキュベーション温度は一般的に約５°〜９９℃、通常約１５°〜７０℃、さらに通常では、２０°〜４５℃の範囲である。測定期間中の温度は一般に、約１０°〜７０℃の範囲であり、さらに通常、２０°〜４５℃、さらに好ましくは２０°〜２５℃の範囲である。いくつかの場合には、活性化ＰＡＣＣが崩壊して、ルミネセンスを発生するために、１００℃まで加熱することが求められることもある。
【０３９９】
検定することができる被験物質の濃度は一般に、約１０-5〜１０-17Ｍ、さらに特に約１０-6〜１０-14Ｍで変化する。検定が定量的であるか、半定量的であるか、または定性的であるか、また特定の検出技術および対象の被験物質の濃度などを考慮して、各種試薬の濃度を決定する。
【０４００】
検定メジウム中の各種試薬の濃度は一般に、対象の被験物質の濃度範囲によって決定されるが、各試薬の最終濃度は通常、検定の感度をその範囲全体にわたって最適するために、実験により決定される。すなわち、被験物質の濃度の有意の変化は正確に測定できる信号の差異を提示する。
【０４０１】
添加の順序は広く変えることができるが、検定の種類に応じて或る好ましい順序がある。特に均一系に対する最も単純な添加順序は全ての材料を同時に添加するものである。別法として、各種試薬を全部または部分的に順次配合することもできる。場合により、試薬の配合の後に、インキュベーション工程を含ませることができ、この工程は一般に約３０秒〜６時間、さらに通常、約２分〜１時間の範囲である。
【０４０２】
均一系検定法においては、試薬の全部を配合した後に、所望により、これらをインキュベートすることができる。次いで、この組合せ物を照射し、生じる発光を測定する。この発光は被験試料中の被験物質の量に関連する。均一系検定において使用される本発明の試薬の量は被験物質の種類に依存して変わる。
【０４０３】
当業者が本発明の範囲を認識し、本発明を不当な実験を行なうことなく実施できるために、下記に検定の例を示すが、これは制限する意味を有するものではない。被験物質、増感剤、ＰＡＣＣ、表面、粒子および反応条件の選択は本明細書の記載および下記の例から当業者に示唆されることは明らかである。
【０４０４】
次の検定において、諸成分は、ｐＨ６〜８．５の主として水性のメジウム中に配合する。
Ａ． ＨＣＧ検定では、尿試料を、（１）１ミクロンのラテックス粒子に結合したＨＣＧに対する抗体および（２）ＰＡＣＣ４に結合したＨＣＧの分離した、無重複エピトープに対する抗体と配合する。この懸濁液を３０分間インキュベートした後に、粒子を遠心分離によりメジウムから分離し、洗浄し、次いで３００ｎｍの光を照射する。この照射後に発射される光の強度は試料中のＨＣＧの量に関連する。分離した粒子は、直接に照射することができ、あるいは照射の前に、水性または非水性溶剤中に懸濁することもできる。
【０４０５】
Ｂ． Ａに類似している血清中のＨＣＧの検定方法では、使用するラテックスビーズを増感剤の銅フタロシアニンで染色し、次いでインキュベートした後にメジウムから分離し、次いで６００ｎｍの光を照射する。発射された光の強度は試料中のＨＣＧの量に関連する。
【０４０６】
Ｃ． 血清中のジゴキシンの検定では、ジオキシゲニンに共有結合させたＰＡＣＣのルミノールを、テトラデシルフタロシアニンで染色してあるポリスチレンウエル中で試料とともにインキュベートする。このウエルの表面にはジゴキシンに対する抗体を塗布する。３０分間のインキュベーションおよび検定メジウムの除去の後に、このウエルに６００ｎｍの光を照射する。この照射に先立ち、アルカリ溶液（ｐＨ１０〜１２）を添加すると好ましい。照射後に発射された光の強度は試料中のジゴキシンの濃度に逆比例する。
【０４０７】
Ｄ． 尿中のアルブミンの検定では、試料を、（１）ＰＡＣＣでラベルしたアルブミンに対する抗体および（２）次式のエネルギー受容体でラベルした無重複アルブミンエピトープに対して指向するアルブミンに対する抗体、と配合する：
【化３０】
この検定メジウムに、増感剤、メチレンブルーを含ませる。このメジウムを１０分間、インキュベートし、次いで６００ｎｍの光を照射する。照射を止めた後に、エネルギー受容体によって発射される光（約５００ｎｍ）の強度は試料中のアルブミンの量に直接に関連する。
【０４０８】
Ｅ． 血清中のチロキシンの検定では、試料を、ラテックスビーズに結合したチロキシンと配合する。このビーズには、ＰＡＣＣ１０（Ｘ2はＮ（ＣＨ3）2である）を配合してある。この検定メジウム中には、増感剤、ローズベンガルに結合したチロキシンに対する抗体を含有させる。１０分間のインキュベーションの後に、メジウム５５０ｎｍの光を照射し、この照射を止めた後に発射される光を測定する。この発光の強度は試料中のチロキシンの量に逆に関連する。
【０４０９】
Ｆ． ＤＮＡ含有試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検定では、９−フェニルメチリデンキサンタンであるＰＡＣＣ２３に結合されており、標的配列と相補的な２５−塩基オリゴヌクレオチドを試料と混合する。このメジウムを次いで、７５℃に加熱し、次いで５５℃に冷却し、存在する標的配列にこのオリゴヌクレオチドを交雑する。この雑種形成溶液中には、エネルギー受容体で、挿入体であるアクリジン オレンジ、および増感剤であるフタロシアニン テトラスルホン酸を存在させるか、またはハイブリッド形成反応の完了後に、これらの成分を加えてもよい。この溶液を次いで、６００ｎｍの光で照射し、この照射を止めた後に、アクリジン オレンジによって発射される光（約５００ｎｍ）の強度を測定する。この光強度は標的配列の存在に直接に関連する。
【０４１０】
Ｇ． ＤＮＡ含有試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検定では、増感剤であるフタロシアニンによりラベルされており、標的配列に対し相補的な２５−塩基オリゴヌクレオチドを、上記Ｆと同様に標的に交雑させる。二重鎖ＤＮＡの微少グルーブに結合する化合物であるＨｏｅｃｈｓｈ ｄｙｅ ３３２５８をＰＡＣＣ２０のＮ−メチル−９−フェニルメチリデンアクリダンに結合させ、これをメジウム中に加えるか、またはハイブリド形成の後に加える。このメジウムに次いで、６００ｎｍの光を照射し、この照射の停止後に発射される光を測定する。発光の強度は試料中に存在する標的配列の量に直接に関連する。
【０４１１】
Ｈ． 血清中のＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）の検定では、試料を、（１）ＰＡＣＣで染色されており、かつまたＨＢｓＡｇに対する抗体が塗布されている１５０ｎｍラテックス粒子および（２）増感剤テトラフェニルポルフィリンで染色されており、かつまたＨＢｓＡｇに対する抗体が塗布されている１５０ｎｍラテックスビーズと配合する。この混合物を１時間インキュベートした後に、この懸濁液に５５０ｎｍの光を照射する。この照射の停止後に発射される光の強度を測定する。この強度は試料中のＨＢｓＡｇの量に関連する。
【０４１２】
Ｉ． 全血中のＨＢｓＡｇの検定においては、方法Ｈにしたがうが、ＰＡＣＣ含有ラテックスビーズを、９−フェニルメチリデンキサンタンであるＰＡＣＣ２３および次式のエネルギー受容体により染色したラテックスビーズにより置き換える：
【化３１】
６１０〜６２０ｎｍで発射される光の強度を測定する。この強度は試料中のＨＢｓＡｇの濃度に関連する。
【０４１３】
本発明のもう一つの態様は、被験物質を含有するものと予想される試料中の被験物質の存在またはその量を測定するために、本発明の検定法を簡便に行なうのに有用なキットに関する。本発明の多能性を増すために、諸試薬を同一または別別の容器にパッケージした組合せ物として提供することができる。この組合せ物中の諸試薬の割合は、方法および検定を実質的に最適にする割合にする。諸試薬はそれぞれ、別々の容器に入れることができ、あるいは各種試薬を、試薬の交さ反応性および安定性に応じて、１個または２個以上の容器で組合せることもできる。
【０４１４】
このキットの形態の一つは、（１）ｓｂｐメンバーを結合して有しており、かつまた化学発光性化合物を含有する懸濁できる粒子からなる組成物および（２）増感剤、からなる。この増感剤はｓｂｐメンバーに結合させることもでき、あるいはｓｂｐメンバーが結合されている粒子と会合させることもできる。このキットはまた、別にパッケージされたものとして、補助試薬などを含む検定を実施するための他の試薬を包含することもできる。
【０４１５】
本発明に係る、もう一つの形態のキットは、第一のｓｂｐメンバーを会合している化学発光性化合物、および第二のｓｂｐメンバーと会合しており、その励起状態で、酸素をその一重項状態に活性化することができる増感剤のパッケージされた組合せ物からなる。
【０４１６】
もう一つの形態のキットは、（１）ｓｂｐメンバーに結合したＰＡＣＣを含有する組成物を含有する。このキットはまた、１種または２種以上の追加のｓｂｐメンバー試薬および所望により、増感剤を含有することができる。エネルギー受容体をｓｂｐメンバーに結合させ、試薬を形成することもでき、あるいはエネルギー受容体をそれ自体、試薬として提供することもできる。表面に結合したｓｂｐメンバーを包含させることもできる。このキットはさらにまた、補助試薬などを含む、検定を行なうためのその他の試薬を別のパッケージとして包含することもできる。
【０４１７】
例
本発明を、さらに以下の実施例によって説明する。実施例中で使用される部および百分率は、とくに指示のない限り、重量によるものである。温度は摂氏で表示する。
【０４１８】
略号：
ＡｂF：フルオレセインに対するマウスモノクローナル抗体
Ａｂ1F：内因子に対するマウスモノクローナル抗体
Ｂ12−ＬＣ25−Ｆ：鎖長２５原子の連結基、すなわち
ＨＮ（ＣＨ2)6ＮＨＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2)6ＮＨＣＯＣＨ2ＮＨＣＯ
によってカルボキシフルオレセイン（Ｆ）に連結されたビタミンＢ12
ＢＡ−Ｃ18：４−（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルカルボキシアミドメトキシ）ベンザル−９−メチルアクリジン
【化３２】
ｔ−Ｂｕ：三級ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ビオチン−ＬＣ21−Ｆ
【化３３】
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｃｈｌ−ａ−クロロフィル−ａ
【化３４】
Ｄ−Ｈ2Ｏ：脱イオン水
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＧ：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＥＤＡＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
【化３５】
Ｆ：フルオレセイン
Ｆ−ＮＨＳ：６−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミドＦ−ＬＣ21ＮＨ2：連結基ＨＮ（ＣＨ2)6ＮＨＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2)6ＮＨ2 が結合したカルボキシフルオレセイン
ＨＣＧ：ヒト繊毛性ゴナドトロピン
Ｌｉｐ：リポソーム
ｎＣ10：テトラ−（ｎ−デシル）フタロシアニン塩化アルミニウム錯体
【化３６】
ＯＤ：油滴
ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18：ＢＡ−Ｃ18含有油滴
ＰＢ：ポリスチレンビーズ
ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18：ＢＡ−Ｃ18含有ＰＢ
ＰＢ／ｎＣ10：テトラ−（ｎ−デシル）アルミニウムフタロシアニン含有ＰＢ
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩溶液０．０２Ｍ ＮａＰｉ，０．１４Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２
Ｐｉ：リン酸塩
スルホ−ＮＨＳ：スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＴＳＨ：甲状腺刺激ホルモン（チロトロピックホルモン）
ＳＡＴＡ：Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＲＬＵ：相対光量単位
Ａｂ1（ＨＣＧ）：モノクローナル抗−ＨＣＧβ抗体（１２Ａ８）
Ａｂ2（ＨＣＧ）：モノクローナル抗−ＨＣＧα抗体（９Ｄ７）
Ａｂ1（ＴＳＨ）：モノクローナル抗−ＴＳＨβ1抗体（３５）
Ａｂ2（ＴＳＨ）：モノクローナル抗−ＴＳＨβ2抗体（９Ｇ３）
〔注：Ａｂ1（ＴＳＨ）とＡｂ2（ＴＳＨ）において、Ａｂ1およびＡｂ2はＴＳＨのβ鎖の異なる２つのエピトープに対する抗体である〕
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
１Ｆ：内因子
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18：アビジンに共有結合したＢＡ−Ｃ18
ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10：ＡｂFでコートされたＰＢ／ｎＣ10
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＮＢＳＡ：２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸
Ｄｉｇ−ＣＭＯ：ジゴキシゲニン−３−オンのＯ−カルボキシメチルオキシム
ＢＧＧ：ウシγグロブリン
ビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳ：スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）−ヘキサノエート
【０４１９】
モノクローナル抗体はすべて、標準的なハイブリッド細胞法で製造した。略述すれば、適当な免疫原を宿主、通常マウスまたは他の適当な動物に注射し、適当な期間をおいたのちに宿主から脾臓細胞を採取した。別法として、宿主から非感作細胞を単離し、in vitro で免疫原により直接感作した。ハイブリッド細胞は、上記細胞を適当な骨髄腫細胞系と融合し、融合細胞を培養することによって形成させた。培養ハイブリッド細胞を特定の抗原、たとえばＴＳＨまたはＨＣＧに対するその結合親和性についてスクリーニングした。多数のスクリーニング方法、たとえばＥＬＩＳＡスクリーニングが使用された。選択された融合細胞を最クローン化した。
【０４２０】
例 １
ビタミンＢ 12 のアッセイ
Ｂ 12 −ＬＣ 25 −Ｆ接合体の調製
２５原子長の架橋腕をもつＢ12−ＬＣ25−Ｆ接合体（下記参照）は、Ｂ12分子をメチルイソシアネートアセテート（Ｂ12分子中のリボ−スのヒドロキシル基と反応して、安心なカルバメート結合を形成する）と反応させ、ついでメチルエステル塩基加水分解してカルボキシル基を遊離させることによりＢ12分子にカルボキシル基を導入して製造した。５′−ＯＨ位に導入されたカルボキシル基をＢ12のＮＨＳエステルに変換し、ついでフルオレセインアミンＦ−ＬＣ21−ＮＨ2と反応させて最終生成物Ｂ12−ＣＬ25−Ｆを生成させた。
Ａ． ５−カルボキシフルオレセイン上２１原子鎖の合成反応図
【化３７】
【０４２１】
１．２ｇ（０．００５６モル）のモノ保護ジアミン１Ｃ１を２５ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、この溶液を攪拌しながら０．６４ｇ（０．００５６モル）の無水グリコール酸１Ａ１を加え、反応混合物を室温に５時間放置した。反応混合物を濃縮し、５０ｍｌの水、５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相を０．１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍｌ）、水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮すると１．３５ｇの１Ａ２が生成した。
1Ｈ ＮＭＲ １００ＭＨｚ（ＣＤ3ＯＤ） δ４．０，３．８５（２Ｓ，４，Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ） ｗ３．０，２．８２（２ｔ，４，ＮＣＨ2） δ１．４（Ｓ，ＣＨ3）
【０４２２】
５００ｍｇ（１．３３ミリモル）の５−カルボキシフルオレセイン、１Ａ３（５酸化リン上、８０℃、０．０５ｍｍの真空中で１６時間乾燥）を２０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を攪拌しながら、２８０ｍｇ（１．４６ミリモル）の１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドと１６８ｍｇ（１．４６ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加えた。１６時間攪拌したのち、４００ｍｇ（１．８５ミリモル）のモノｔ−Ｂｏｃ １，６−ジアミノヘキサンを加え、この混合物をさらに４時間室温で攪拌した。得られた混合物を濃縮して濃厚な溶液とし、１：９メタノール−酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解し、水（３×５０ｍｌ）、０．１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発させた。残留物を、Ａｎａｌｔｅｃｈ １０００μ、２０×２０ｃｍシリカゲルＧＦプレート上、ジクロロメタン中０．５％酢酸および１０％メタノールを用いて精製した。純粋なバンドをプールし、ジクロロメタン／メタノール（１：１）で抽出し、濃縮し、残留物を最小量のメタノールに溶解し、水中に滴下した。混合物をついで遠心分離し、固体を真空中で乾燥すると８３％の１Ａ４が生成した。
【０４２３】
３．５ｇ（０．００６４モル）のモノｔＢｏｃ １，６−ジアミノヘキシル−５−カルボニルフルオレセイン１Ａ４（０．０５ｍｍ真空中、五酸化リン上、９０℃で１６時間乾燥）を４０ｍｌのジクロロメタン／トリフルオロ酢酸１／１で処理した。この溶液を氷浴中で５分間攪拌したのち、溶媒を蒸発させ、粗製の残留物を一夜真空中で乾燥した。
【０４２４】
４２ｍｇのモノ−ｔ−Ｂｏｃ １，６−ジアミノヘキシルグリコール酸アミド１Ａ２、２２ｍｇ（０．１９０ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、および３６．４ｍｇ（０．１９０ミリモル）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド４ｍｌの無水ジクロロメタン中に混合し、室温で１６時間攪拌した。この活性化酸の溶液を、上述の１，６−ジアミノヘキシル−５−カルボキシルフルオレセイン誘導体７５ｍｇ（０．１２７ミリモル）、１０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドおよび６６ｍｌのトリエチルアミンの溶液に攪拌しながら滴下した。１時間後、反応混合物を水に取り、酢酸エチルで抽出した。有機相を水（３×２５ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、２０×２０ｃｍ １０００ｍ ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦプレート上、ジクロロメタン中１０％メタノール、０．５％酢酸を用いて精製した。純粋なバンドを単離し、メタノール／ジクロロメタンで抽出し、濃縮し、真空中で乾燥した。残留物を４ｍｌのメタノールに取り、攪拌した０．１Ｎ ＨＣｌ（８ｍｌ）中に滴下し、遠心分離し、乾燥し、８４ｍｇの１Ａ５、収率８４％を得た。
1Ｈ ＮＭＲ ５００ ＭＨｚ（ＣＤ3ＯＤ） δ８．４（ｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝．７１Ｈｚ） δ８．１７（ｄｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ） δ７．３（ｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ） δ４．０４（ｄ，４，Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ） δ１．４１（Ｓ，９，３ＣＨ3）
元素分析Ｃ42Ｈ52Ｎ4Ｏ11として：Ｃ，６３．７：Ｈ，６．８；Ｎ，７．０
分析値：Ｃ，６３．５６；Ｈ，６．６４；Ｎ７．０
【０４２５】
上記５−カルボキシフルオレセインのｔＢｏｃ−２１−原子長鎖アミン（０．０５ｍｍ真空中、五酸化リン上、８０℃で乾燥）に、室温でトリフルオロ酢酸５ｍｌを加えた。５分後、酸を蒸発させ、ついで真空中８０℃で乾燥させると、トリフルオロ酢酸塩１Ａ６が得られた。
ＦＡＢ−ＭＳ Ｃ37Ｈ44Ｎ4Ｏ（Ｍ＋Ｈ) +６８９
【０４２６】
Ｂ． Ｂ12のリボース環のＯ5′位の、５−カルボキシフルオレセインに連結した２５原子スペーサーによる修飾の反応様式
【化３８】
【０４２７】
ビタミンＢ１２（１Ｂ１）（４８時間８０℃で乾燥、１０μ）２５ｍｇ（０．０１８５ミリモル）を１．２５ｍｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。この溶液に攪拌しながら、２１．２ｍｇのイソチオシアネート酢酸メチルエステル（０．１８５ミリモル）を加え、反応混合物を室温に２４時間放置した。反応混合物を攪拌した酢酸エチル溶液１０ｍｌ中に滴下した。沈澱した生成物を遠心分離し、ついで最小量のメタノールに再懸濁し、再沈澱させた。この物質を、Ｗｈａｔｍａｎ ＰＬＣ18Ｆ製造用プレート１０００μ ２０×２０ｃｍ上、０．５ｍｌ酢酸＋１ｇＮａＣｌ／１００ｍｌ含有２：８イソプロパノール−水で溶出して精製した。Ｒｆ＝０．６２５。吸着物質から単離するとメチルエステル１Ｂ２が得られた。
（＋）−ＦＡＢＭ５（Ｃ67Ｈ93Ｃ0Ｎ15Ｏ17Ｐ）分子量１４６９．６；（Ｍ＋Ｈ）１４７０，（Ｍ−ＣＮ）+１４４４
【０４２８】
４０ｍｇ（０．０２７２ミリモル）のＢ12Ｏ5′−カルボニルグリシンメチルエステル１Ｂ２を２．５ｍｌの２／１メタノール−水に取り、水酸化アンモニウムでｐＨを９．５に調整し、室温で１６時間攪拌した。
ｔｌｃ分析 Ｗｈａｔｍａｎ ＫＣ18Ｆ
２：８イソプロパノール−水、０．５％酢酸、１％ＮａＣｌ
Ｒｆ≒０．７９
【０４２９】
反応混合物を濃縮乾固し、生成物をＷｈａｔｍａｎ ＰＬＣ18Ｆプレート１０００μ、２０×２０ｃｍ２個を用い、上述と同様に溶出して単離した。純粋なバンドをメタノールで抽出し、抽出液を濃縮し、２：７メタノール−ジクロロメタンに溶解し、濾過し、濃縮した。残留物を４ｍｌのメタノールに溶解し、４ｍｌのエチルエーテルに滴下した。沈殿を遠心分離し、Ｐ2Ｏ5上、０．５ｍｍ、６０℃で１６時間乾燥すると、生成物１Ｂ３ ２８ｍｇが得られた。
（＋）−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ66Ｈ91ＣｏＮ15Ｏ17Ｐ）分子量１４５５．７，（Ｍ＋Ｈ）+１４５６，（Ｍ−ＣＮ）+１４３１
【０４３０】
１５ｍｇ（０．０１３ミリモル）のＢ12Ｏ5′−カルボニルグリシン１Ｂ３、３．６６ｍｇ（０．０１６ミリモル）Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１．９５ｍｇ（０．０１７ミリモル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを５ｍｌの無水ジメチルホルムアミドと混合し、室温で１６時間攪拌した。反応混合物を、１３．６ｍｇ（０．１７ミリモル）の５−カルボキシフルオレセインの２１−原子長鎖アミン１Ａ６と２．０２ｍｇ（０．０２ミリモル）トリエチルアミンの４ｍｌ乾燥ジメチルホルムアミド中溶液に攪拌しながら滴下し、室温で１２時間攪拌した。
【０４３１】
粗製反応混合物を真空下４０℃で濃縮し、残留物を２ｍｌのメタノールに取り、６ｍｌのエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離した。固体をＷｈａｔｍａｎＰＬＣ18Ｆプレート１０００μ ２０×２０ｃｍ上、７：３メタノール−水、０．５％酢酸で溶出して精製した。２Ｒｆ≒０．７８、１Ｂ４ 収率３７％
（＋）−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ103Ｈ133ＣｏＮ19Ｏ25Ｐ），（Ｍ＋Ｈ）+２１２５；（Ｍ−ＣＮ）21 ＵＶ／ｍａｘ ３６０（ε ２６，６００），５０（ε５７，０００），５５０（ε ９５００）
【０４３２】
ＩＩ．抗−内因子（Ａｂ IF ）抗体のビオチン化
モノクローナル抗−内因子抗体（ＡｂIF）は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）４９５−４９７に報告された方法に基づく標準的ハイブリッド細胞法によって製造した。
【０４３３】
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．からのビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳを用い、３種の異なるレベルのビオチン化（反応混合物中のＡｂIF：ビオチン＝１：１０，１：５０，または１：２００）を実施した。ＡｂIFは０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．８中〔ＩｇＧ〕＝２．５ｍｇ／ｍｌとした。この溶液に、所要量のビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳを含有するＤＭＳＯ（総容量の１％）を加え、ついで溶液を４℃で一夜インキュベートした。最後に、反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘTM Ｇ−２５上で精製し、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０２％ ＮａＮ3／ｐＨ＝７．２に対して大規模に透析した。ビオチン化−内因子抗体は凍結して保存した。
【０４３４】
ＩＩＩ．粒子の製造
Ａ．原料
１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｂａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ ４６０３２
３８ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｄｕｋｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０３
エチレングリコール、ベンジルアルコール、ベンゾニトリル：ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
ＳｅｐｈａｄｅｘTM Ｇ−２５：Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ｎＣ10：Ｕｌｔｒａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ ９８１０５
【０４３５】
Ｂ．Ａｂ F −ＰＢ／ｎＣ 10
１．３８ｎｍ直径粒子
ｎＣ10の２．１ｍＭ溶液をベンジルアルコール中に調製した。エチレングリコール（１６ｍｌ）を２０ｍｌのガラスバイアルに取り、実験室用ホットプレート上で１００°に加熱した。ベンジルアルコール（１．６ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。保存ラテックス懸濁液（２ｍｌ，１０％固体含有３８ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス）を加え、混合物を３〜４分間放置して平衡化させた。ｎＣ10溶液（０．４ｍｌ）を徐々に１００μｌ部ずつ添加した。１００°への加熱を５分間続けたのち、混合物を放置して温度を室温まで低下させた。冷却後、混合物を、５０％含水エタノールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２．５×１５ｃｍ）に適用した。ラテックス含有分画をプールし、水で平衡化した第二のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２．５×３５ｃｍ）に適用した。ラテックスは３０ｍｌの容量中に溶出した。
２．１７５ｎｍ直径粒子
ｎＣ10の２．１ｍＭ溶液をベンジルアルコール中に調製した。エチレングリコール（８０ｍｌ）を１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに取り、実験室用ホットプレート上で１１０°に加熱した。ベンジルアルコール（８ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。ｎＣ10溶液（２ｍｌ）を加え、ついで直ちに保存ラテックス懸濁液（１０ｍｌ，１０％固体含有１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス）を添加した。１００°〜１１０°への加熱を激しく攪拌しながら１０分間継続した。ついでフラスコを室温の水浴中に置き冷却した。冷却後、混合物を等容量のエタノールで希釈し、直ちに１５，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ，ＳＡ６００ローター）で２時間遠心分離した。わずかに青色の上清を傾潟し、ペレットを、粒子を分散するために浴ソニケーターを用いて５０％含水エタノール（２０ｍｌ）中に再懸濁した。遠心分離を１５，０００ｒｐｍで１時間反復した。上清を傾潟し、ペレットを水に再懸濁した。最後の遠心分離ののち、ペレットを水に再懸濁し、最終容量を２０ｍｌとした。
【０４３６】
３．ビーズのＡｂFへの結合は例３，Ｖに記載する。
【０４３７】
Ｃ．アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ 18
１７５ｎｍ直径粒子
ＢＡ−Ｃ18の１０ｍＭ溶液をベンゾニトリル中に調製した。エチレングリコール（８０ｍｌ）を１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに取り、実験室用ホットプレート上で１００°に加熱した。ベンゾニトリル（９ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。ＢＡ−Ｃ18溶液（１ｍｌ）を加え、ついで直ちに保存ラテックス懸濁液（１０ｍｌ，上述の１０％固体含有１７５ｎｍラテックス）を添加した。加熱を１００°で、激しく攪拌しながら５分間継続した。ついでフラスコを室温の水浴中に置いて冷却した。冷却後、混合物を等容量の５０％含水エタノールで希釈し、直ちに１５，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ，ＳＡ６００ローター）で計４時間遠心分離した。上清を傾潟し、ペレットを、粒子を分散させるために浴ソニケーターを用いて含水エタノール中に再懸濁した。遠心分離を１５，０００ｒｐｍで１時間反復した。上清を傾潟し、ペレットを水に再懸濁した。最後の遠心分離ののち、ペレットを水に再懸濁して最終容量を２０ｍｌとした。
ビーズのアビジンへの結合は例３，ＶＩに記載する。
【０４３８】
ＩＶ．アッセイプロトコール
アッセイは、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１％ ＢＳＡ，ｐＨ７．５。ＢＳＡはＢ12およびＢ12バインダーを含まなかった）中、Ｂ12カリブレーター（元の１０μｇ／ｍｌ Ｂ12保存溶液から希釈、１０μＭ ＫＣＮ）１００μｌを５０ｍｌの２．２ｎｇ／ｍｌ Ｂ12−ＬＣ25−Ｆおよび５０μｌの予め混合した８８ｎｇ／ｍｌ内因子（ＩＦ）、８．８μｇ／ｍｌ ＡｂＩ F−ビオチンと混合して実施した。これらの混合物を室温、暗所で１５分間インキュベートし、ついで各チューブに１０10ビーズアビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18および２．５×１０11ビーズＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10を含有する０．７５ｍｌの０．０５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ｐＨ８．２緩衝液を加え、インキュベーションをさらに３０分間、室温暗所で振盪しながら継続した。最後に、各チューブを、光源として６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプを用いて１分間照射し、ついで化学ルミネッセンス光を、Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターを用いて２０秒間集積して測定した。結果は図１にまとめる。
【０４３９】
例 ２
ジゴキシンのアッセイ
Ｉ．Ａｂ Dig −ビオチンの製造
抗−ジゴキシンモノクローナル抗体（ＡｂDig）は標準的ハイブリッド細胞系法に従って製造し、抗体は固定化プロテインＡで精製した。ついで、この抗体（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．８中約２〜２．５ｍｇ／ｍｌ）とビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．）（まずＤＭＦ中に可溶化し、その小部分を反応に使用）を互いに混合し、４℃に３時間インキュベートしてＡｂDig−ビオチンを製造した。反応混合物中、反応原料のモル比は抗体：ビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳ＝１．２５であった。カップリングしなかったビオチンはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムによって除去した。最終の接合体は、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．００１％チメロサール／ｐＨ＝７．４中、４℃または凍結して保存した。
【０４４０】
ＩＩ．Ｄｉｇ−ＬＣ 9 −Ｆの製造
この試薬は、（１）Ｆ−ＮＨＳ、（２）Ｆ−ＬＣ9−ＮＨ2、および（３）Ｄｉｇ−ＬＣ9−Ｆを製造することにより３連続工程で調製した。
Ａ．Ｆ−ＮＨＳの製造：ＤＭＦ中１００ｍｇ／ｍｌ ６−カルボキシフルオレセインおよび３０．６ｍｇ／ｍｌ ＮＨＳの溶液２ｍｌに、２７５ｍｇ／ｍｌＤＣＣ ０．４ｍｌを加えた。混合物を室温暗所で一夜攪拌した。生成したジシクロヘキシル尿素を濾去した。Ｆ−ＮＨＳの形成は、シリカプレート上ＣＨ2Ｃｌ2：メタノール：酢酸＝８５：１５：１の溶媒系を用いたＴＬＣによってチェックした。ＤＭＦをロートバップで除去し、生成物（Ｆ−ＮＨＳ）はさらに減圧下で乾燥し、乾燥器中に４℃で保存した。
【０４４１】
Ｂ．Ｆ−ＬＣ 9 −ＮＨ 2 の製造：ＤＭＦ中ビス−（３−アミノプロピル）−メチルアミン（ＬＣ9）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）の溶液１．５ｍｌに、ＤＭＦ中１２５ｍｇ／ｍｌ Ｆ−ＮＨＳ １．２ｍｌを加え、ついで室温暗所で攪拌しながら一夜インキュベートした。Ｆ−ＮＨＳ：ＬＣ9のモル比は１：４０であった。次に反応混合物を０．５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．０で１／２０に希釈し、混合物のｐＨをリン酸（１．０Ｍ）の添加によって５．０に調整し、全混合物を、０．５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝５．０で平衡化したＢｉｏＲｅｘ−７０TMカラム（２．５×１０ｃｍ）上に負荷した。負荷後、カラムを、ビス−（３−アミノプロピル）メチルアミンが除去されるまで（ＴＮＢＳＡ反応でモニタリング）開始緩衝液で洗浄した。カラムを０．００１Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝６．０で洗浄して６−カルボキシフルオレセイン夾雑物を除去した。低イオン強度緩衝液による洗浄で、６−カルボキシフルオレセインのみでなく、同定されていない他のフルオレセイン含有夾雑物も除去された。次に、カラムをＤ−Ｈ2Ｏで洗浄して塩を除去した。最後にカラムを０．８Ｍ ＮＨ4ＯＨで溶出した。水酸化アンモニウムを凍結乾燥で除去した。純度をチェックしたのち、生成物を−２０℃で乾燥器に保存した。反応は濾紙電気泳動（パラゴン電気泳動システムを用い、０．０５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝５．８で２０分間）およびＴＬＣ（溶媒としてＤ−Ｈ2Ｏ中５０％メタノールを用い、Ｃ18プレート上）で追跡した（また、生成物の純度をチェックした）。
【０４４２】
Ｃ．Ｄｉｇ−ＬＣ 9 −Ｆの製造：米国特許第４，０３９，３８５号例２の記載（この開示は参考として本明細書に導入する）に従って製造したＤｉｇ−ＣＭＯ２３．０５ｍｇ（０．０５ミリモル）、５０．３５ｍｇ（０．１ミリモル）のＦ−ＬＣ9−ＮＨ2および１９．２ｍｇ（０．１ミリモル）のＥＤＡＣを１．５ｍｌのＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５：１）溶媒中に含有する溶液を、室温暗所で一夜攪拌した。Ｄｉｇ−ＬＣ9−ＦおよびＤｉｇ−ＣＭＯ（未反応分が残っていれば）を、３ｍｌのＤ−Ｈ2Ｏを添加して沈殿させ、濾過し、溶媒を捨てた。濾過された物質をＣＨ2Ｃｌ2：メタノール：酢酸＝６０：４０：５からなる溶媒系に再溶解し、同じ溶媒系中シリカゲルカラム（１．５×２０ｃｍ）上に負荷した。これらの条件下に、Ｄｉｇ−ＣＭＯはＤｉｇ−ＬＣ9−Ｆ接合体の前を移動し、Ｆ−ＬＣ9−ＮＨ2はカラムの頂部に結合したままであった。この物質の純度は、上述の溶媒系を用いたＴＬＣシリカゲルプレート、および濾紙上ｐＨ＝５．８における電気泳動によってチェックした。精製された物質からロートバップによって溶媒を除去し、生成物を最小容量のメタノール／ＤＭＦ（７０：３０）に再溶解し、ついで遠心分離して不溶性物質（シリカゲル）を除去した。最終工程は、精製時に可溶化されて生成物と共溶出する大部分のシリカゲルの除去のために実施された。生成物はメタノール／ＤＭＦ（７０：３０）溶媒系中に−１０℃〜−２０℃で保存した。生成物の濃度は、既知量の６−カルボキシフルオレセインを用いて作成した標準曲線からＡ490によって測定した。
【０４４３】
ＩＩＩ．アッセイプロトコール
アッセイは、血清（ヒト無ＴＳＨ正常血清）中ジゴキシンカリブレーター５０ｍｌを、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＧＧ／ｐＨ８．２）中１．７４ｎｇ／ｍｌ ジゴキシン−ＬＣ9−Ｆ接合体５０μｌおよび上述の同じ緩衝液中１６０ｎｇ／ｍｌのＡｂDig−ビオチン５０μｌと混合して実施した。これらの混合物を室温で１５分間インキュベートし、ついで各チューブに、１０10アクセプタービーズ（アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）および２．５×１０11感作ビーズ（ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10）を含有する０．７５ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ８．２緩衝液を加えて、インキュベーションを室温暗所でさらに３０分間継続した。最後に、各チューブを、光源として６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプを用いて１分間照射し、ついで化学ルミネッセンス光をＴｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターを用いて２０秒間測定した。結果は図２にまとめる。
【０４４４】
例 ３
ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよび甲状腺
刺激ホルモンのアッセイ
Ｉ．試薬および原料
Ａ． ＢＡ−Ｃ18は以下の操作によって製造した。
試薬は、とくに指示したものを除き、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した。
１．ｐ−ホルミルフェノキシ酢酸ジオクタデシルアミド
新たに蒸留したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍｌ溶液に、ｐ−ホルミルフェノキシ酢酸（Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｓ）（分子量１８０，０．５４０ｇ，３．０ミリモル）、トリエチルアミン（分子量１０１．１９，０．３３３ｇ，３．３ミリモル）およびトリメチルアセチルクロリド（分子量１２０．５７，０．３９８ｇ，３．３ミリモル）を添加した。２０分間還流加熱したのち、ジオクタデシルアミン（Ｆｌｕｋｅ）（分子量５２２．０１，１．７２３ｇ，３．３ミリモル）を加えた。反応混合物を一夜還流した。
翌日、反応混合物を水で希釈し、反応溶液をメチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出液を硫酸ナトリウム上で乾燥した。
【０４４５】
２．ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルカルボキシアミドメトキシベンザル−９−メチルアクリダン
無水ＴＨＦ中１０−ジメトキシホスフィニル−９−メチルアクリダン（Ｍｏｎａｔｓｈｉ Ｃｈｅｍ．１１４，３，１９８８）（分子量３０３．２７，０．１００ｇ，３．３ミリモル）に、ヘキサン中１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウム溶液０．４１３ｍｌを−７８℃で（アセトン／ドライアイス浴）アルゴン下に添加した。ｎ−ブチルリチウム溶液を加えると溶液は黄色を呈した。ｎ−ブチルリチウムの添加２０分後に上記アミドのＴＨＦ溶液を添加した。反応溶液を一夜放置して温度を室温まで上昇させた。
翌日、生成物をＴＬＣ（シリカゲル−３：７酢酸エチル／ヘキサン）によって単離した。単離された生成物はマススペクトル分析およびＮＭＲで分析し、暗所に保存した。
【０４４６】
Ｂ．一重項酸素発生染料（ｎＣ10）はＵＬＴＲＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。ＥＤＡＣ，ＳＡＴＡ，ＨＣＧ，およびＢＳＡはＳｉｇｍａ Ｃｏ．から入手した。Ａｂ1（ＴＳＨ）−ビオチンおよびＡｂ2（ＨＣＧ）−ビオチンならびにＡｂ2（ＴＳＨ）−Ｆは例１のＩＩの記載の操作と同様にして製造した〔また、米国特許出願０７／３８９，６５９号（１９８９年８月４日出願）、欧州特許公告４１１，９４５号（１９９１年２月６日公告）に対応参照。その関連部分を参考として本明細書に導入する〕。
Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓのルミノメーター（２０ｅ型）を用いた。
【０４４７】
ＩＩ．抗−ＨＣＧ抗体で安定化した油滴〔Ａｂ 1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ 18 ）の製造
抗−ＨＣＧ抗体標識油滴（ＯＤ）は、１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ抗−ＨＣＧ−β（１２Ａ８，ＩｇＧ）を、ジブチルフタレート中５ｍＭ ＢＡ−Ｃ18 ５０μｌ含有ガラス管中に移して製造した。蛋白質は０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５ＭＮａＣｌ／ｐＨ７．６中に取った。油分は超音波処理と同時に連続的な機械的攪拌を行い乳化した。小さな油滴の調製には高エネルギーのソニケーターが必要なことに留意すべきである。超音波処理はＢｒｏｎｓｏｎソニケーターを用いて７分間行った（冷却剤として室温の流水を使用した）。２５％ Ｎａ2ＳＯ4溶液を加えて非結合蛋白質を除去すると８％〜９％の最終濃度が得られ、ついで遠心分離した（マイクロフュージ，セット８，１０分間）。洗浄工程は３回実施した（遠心分離速度は、油滴が分離されるが合体はしないように調整しなければならない）。最終の洗浄後、粒子を１ｍｌの０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ
ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６に懸濁し、３分間再び超音波処理した。調製物の最終容量を５ｍｌに調整し、スクロースを最終濃度２％に添加した。これらのＡｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18粒子は４℃で保存した。上述の方法によって製造した油滴のサイズは不均一で、平均直径は１〜５μであった。
【０４４８】
ＩＩＩ．アビジン−Ｌｉｐ／ｎＣ 10 の製造
リポソームはメタノール希釈法で製造した。典型的には、脂質混合物、すなわちコレステロール（２．０ｍｇ）、ＤＰＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）（２３．８）、ＤＰＰＧ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）（６．５ｍｇ）、マレイミド−ＤＰＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅ）（０．５ｍｇ）およびｎＣ10（０．５ｍｇ）を温メタノール（２００μｌ）に溶解し、ついで攪拌した緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５ＭＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ６．０）２ｍｌ中に添加した。次にこの懸濁液を緩衝液Ｂ中Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１．５×２０ｃｍ）に通した。リポソーム含有分画をプールし、必要な場合には大きな粒子を除去するためにマイクロフュージで遠心分離した。最後に、マレイミド含有リポソームを、緩衝液Ｂ中スクシニル化アビジン−ＳＨ（以下に記載のようにして製造）の溶液に攪拌しながら添加した。アルゴンで通気洗浄後、この混合物を一夜４℃で穏やかに混合した（攪拌棒は使用しない）。２ｍＭのメルカプトコハク酸（反応混合物容量）により４℃で３０分間処理して過剰のマレイミド基を遮断し、ついでヨード酢酸を最終濃度５ｍＭになるように加えて過剰のチオール基を遮断した（４℃，３０分）。ついで反応混合物をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０TM装置によって２．５〜３ｍｌに濃縮し、カップリングしなかったアビジン分子は、緩衝液Ｂ中Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−２Ｂカラム（１．５×５０ｃｍ）でゲル濾過して除去した。
【０４４９】
ＩＶ．スクシニル化アビジン−ＳＨの製造
アビジンをＳＡＴＡ（アビジン１モルあたり５モル）と４℃で一夜反応させた（１Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍｌアビジン）。この溶液にＤＭＦ中無水コハク酸（アビジン１モルあたり５０モル）を加え（総ＤＭＦは反応容量の１％未満）、溶液を２時間インキュベートした。反応混合物のｐＨは０．５ＭＮａ2ＨＰＯ4を添加して７．４に維持した。室温で１時間ヒドロキシルアミン（０．１Ｍ，ｐＨ７．０で）によって処理して保護チオール基を遊離させた。最後に、緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ６．０、気体を除去し、アルゴンを飽和）中１．５×３０ｃｍ Ｇ−２５カラムを用いて過剰の小分子量分子を除去した。蛋白質のピーク（アビジン−ＳＨ）を集め、この蛋白質をマレイミド含有リポソームと反応させた。
【０４５０】
Ｖ．抗−フルオレセイン被覆ｎＣ 10 染色ビーズ（Ａｂ F −ＰＢ／ｎＣ 10 ）の製造
カルボキシル化ポリスチレンビーズ（３８ｎｍ）（例１，ＩＩＩＢ参照）をｎＣ10で染色した。ＥＤＡＣ／スルホ−ＮＨＳの接合法を用いて、これらのポリスチレンビーズにＡｂFをカップリングさせた。典型的には、５ｍｇ／ｍｌ ｎＣ10染色カルボキシル化ポリスチレンビーズおよび１１ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳを含む０．０２Ｍ ＮａＰｉ（ｐＨを５．５に調整）１０ｍｌを、新たに調製したＥＤＡＣ（２００ｍｇ／ｍｌ）のＤ−Ｈ2Ｏ中溶液１ｍｌと混合した。室温（暗所）で２５分間インキュベートしたのち、ビーズを遠心分離して過剰のＥＤＡＣを除去した（ＥＤＡＣはこれらのビーズの微小凝集を起こさせるので、たとえばＳｏｒｖａｌのＳＡ−６００ローターを１５０００ｒｐｍで使用する慣用の遠心分離で、それらをペレット化することが可能であった）。ペレット化されたビーズを３ｍｌの０．００５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．８に再懸濁し、攪拌した蛋白質溶液〔１５ｍｌの０．０２Ｍ Ｂｏｒａｘ，０．０８Ｍ ＮａＣｌ，２ｍｇ／ｍｌ ３ＧＩ ＩｇＧ（ＡｂF），８ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ８．９）中に移した。この混合物を一夜４℃で穏やかに振盪した（攪拌はしない）。ビーズ上に反応性の基が残っていれば、０．０８３Ｍグリシンおよび１５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ８．９により４℃で６０分間処理して遮断した。カップリングしなかった蛋白質は、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．６で連続洗浄して除去した。最終ペレットは洗浄緩衝液に再懸濁し、超音波処理し、そのまま４℃に保存した。これらのビーズの最終サイズは１４０ｎｍであった。
【０４５１】
ＶＩ．アビジン被覆、ベンザルアクリジン染色ビーズ（アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ 18 ）の製造
カルボキシル化ラテックスビーズ（０．１７５μ）をＢＡ−Ｃ18で染色した（例１，ＩＩＩＣ参照）。これらの粒子へのアビジンの接合には、ＥＤＡＣ／スルホ−ＮＨＳ接合法を使用した。スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣによるビーズの活性化は、ＡｂFＰＢ／ｎＣ10の製造について上述したのと同じ方法で実施した。活性化されたビーズ（１００ｍｇ）は遠心分離してＥＤＡＣを除去し、ついで２．５ｍｌの０．００５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．８に再懸濁し、攪拌したアビジン溶液（１５ｍｌの０．０２５Ｍ Ｂｏｒａｘ，１．３３ｍｇ／ｍｌ アビジン／ｐＨ９．１）中に移した。ついで混合物を４℃で一夜、穏かに混合した。２０μｌのＤＭＦ中１Ｍ無水コハク酸（アビジンに対して６０倍モル過剰）を加えてビーズ上のアビジンをスクシニル化し、さらに４℃で１時間インキュベートした。ビーズを７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（反応混合物中の最終濃度）により４℃で６０分間遮断した。最後にビーズを０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．６で３回遠心分離によって洗浄し、１０ｍｌの洗浄緩衝液中に保存した。最終工程で、ビーズを超音波処理して、モノ分散粒子を得た。蛋白質の標識後も粒子サイズには有意な変化はなかった（約１９０ｎｍ）。アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18は洗浄緩衝液中４℃で保存した。
【０４５２】
ＶＩＩ．ビオチン−ＬＣ 21 −Ｆの製造
１．反応式
【化３９】
【０４５３】
２．原料
６−カルボキシフルオレセイン、Ｋｏｄａｋ
ビオチン−ＮＨＳエステル、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
酸化カルシウムから蒸留した乾燥ＤＭＦ、
Ａｇ−ＭＰ−１（Ｃｌ-）陰イオン交換樹脂、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
【０４５４】
３．フルオレセインアミン塩酸塩ＶＩＩ３
６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＩ １）（１０ｇ，２６．６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．２２ｇ，２８ミリモル）を固体としてＤＭＦ溶液に加え、溶解させた。ついで混合物を氷浴で冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（５．８ｇ，２８ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、上述の冷ＤＭＦ溶液に一度に加えた。混合物を氷浴の温度で３０分間攪拌し、ついで放置して温度を室温まで上昇させた。反応の経過はｔｌｃ（１％酢酸含有１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2）で追跡した。３時間後にフルオレセインＮＨＳエステルＶＩＩ２の生成は完結した。
【０４５５】
４，９−ジオキサ−１，２−ドデカンジアミン（２５．５ｇ，１２５ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）で希釈した。フルオレセインＮＨＳエステル反応混合物をアルゴン気相下氷中で冷却し、ジアミン溶液を５分間を要して滴加した。冷却浴を取り去り、攪拌を室温で継続した。反応の経過は上記の系を用いたｔｌｃで追跡した。反応が完結したと判断された時点で、反応混合物を水（１００ｍｌ）によって希釈し、氷中で冷却してジシクロヘキシル尿素を沈殿させ、これを濾過して除去した。
【０４５６】
濾液にＡＧ−ＭＰ−１（Ｃｌ-）陰イオン交換樹脂を懸濁させ、クロマトグラフィーカラム中に注いだ。樹脂を、ニンヒドリンで遊離のジアミンがも早検出されなくなるまで５０％含水メタノールで洗浄した。ついで樹脂を５０％含水メタノール中０．１Ｎ塩酸で溶出した。フルオレセインアミン塩酸塩が最初に、ついで６−カルボキシ−フルオレセインが溶出した。純粋な分画をプールし、ロートバップで乾固させた。高真空下に乾燥すると、純粋なフルオレセインアミン塩酸塩（ＶＩＩ３）３．４ｇが回収された。
【０４５７】
４．フルオレセイン−ＬＣ 21 −ビオチン ＶＩＩ４
フルオレセインアミン塩酸塩ＶＩＩ３（３５０ｍｇ，０．６１ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（３００ｍｌ）、ついでビオチンＮＨＳエステル（４４５ｍｇ，０．８ミリモル）を添加した。反応の経過はｔｌｃ（ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2−酢酸−水，２０：７８：１：１）で追跡した。反応が完了したと判断された時点で、ＤＭＦをロートバップで除去した。残留物をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（１０ｇ）を懸濁させた。この懸濁液をロートバップで流動性の粉末に乾燥し、これをジクロロメタンに懸濁し、ジクロロメタンで平衡化したシリカゲルカラム（２．５×２５ｃｍ）の頂部に適用した。カラムを上記ｔｌｃ溶媒混合物で溶出した。生成物を含有する分画をプールし、溶媒をロートバップで除去した。残留物をエタノールに取り、濾過した。濾液をゆっくり蒸発させると、生成物はゴム状物として枕積した。ゴム状物を高真空下に乾燥すると、フルオレセイン−ＬＣ21−ビオチンＶＩＩＩ４（Ｆ−ＬＣ21−ビオチン）３５０ｍｇが得られ、これはさらに精製することなくそのまま使用した。
【０４５８】
ＶＩＩＩ．アッセイ
Ａ．ＨＣＧアッセイ標準曲線（Ｌｉｐ含有ＯＤ）
ＨＣＧアッセイはまず、ＨＣＧ（量を様々に変えて）、Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18およびＡｂ2（ＨＣＧ）−ビオチンを互いに混合することによって実施した。室温で１時間インキュベートしたのち、過剰量のアビジン−Ｌｉｐ／ｎＣ10を加え、インキュベーションを室温でさらに３０分間続けた。最後に、チューブをそれぞれ１分間照射し、ルミネッセンスを２０秒間測定した。
【０４５９】
プロトコール：
サンプル緩衝液〔０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ＢＳＡ，２０％スクロース，４ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（Ｔ−５００）ｐＨ７．５〕中様々な濃度のＨＣＧ５０μｌ、
アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ＢＳＡ，ｐＨ７．５）中４μｇ／ｍｌ Ａｂ2（ＨＣＧ）−ビオチン５０μｌ、および
Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18試薬５０μｌ（５×１０8ＯＤ／チューブ）を混合する。
室温、暗所で振盪しながら１時間インキュベートする。
１．５×１０12アビジン−ｎＣ10 Ｌｉｐ ５０μｌ（７．３×１０10Ｌｉｐ／チューブ）を添加する。
室温、暗所で振盪しながらインキュベートする。
ハロゲンランプ（６５０ｎｍカットオフフィルターを使用した場合の光出力１２０ｍＷ）を１分間照射する。
ついで光源を切り、放射光の強度を２０秒間測定する。
結果は図３にまとめる。
【０４６０】
Ｂ．ビオチン−ＬＣ 21 −Ｆのアッセイ
試験は、５０ｍｌのアビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18（２×１０11ビーズ／ｍｌ）、５０ｍｌのＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10（５×１０12ビーズ／ｍｌ）および１００ｍｌのビオチン−ＬＣ21−Ｆ（様々な量）を、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５ＭＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６中に混合することにより実施した。この混合物を室温、暗所で、振盪しながら１．５時間インキュベートした。最後に、各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフフィルターを添付）で１分間照射したのち、光出力を２０秒間Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターで光強度を集積して測定した。結果は図４にまとめる。
【０４６１】
Ｃ．ＴＳＨアッセイ標準曲線
ＴＳＨアッセイは、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６中様々の濃度のＴＳＨ２００μｌを、５０μｌの４μｇ／ｍｌ Ａｂ1（ＴＳＨ）−ビオチンおよび４μｇ／ｍｌ Ａｂ2（ＴＳＨ）−Ｆと混合することによって実施した。これらの混合物を室温で１．５時間インキュベートした。ついで各チューブに１００μｌの１０10アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18ビーズおよび２．５×１０11 ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10ビーズ含有ＰＢＳを添加した。インキュベーションを室温でさらに１．５時間続けた。最後に各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフフィルターを添付）で照射したのち、光出力を２０秒間Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターで光強度を集積して測定した（図５および図６）。
【０４６２】
例 ４
可溶性フォトセンシターザーおよび
アクセプター油滴を使用したＨＣＧアッセイ
Ｉ．試薬：
アクセプター染色油滴＝Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18（例３，ＩＩに記載）
Ａｂ2（ＨＣＧ）−ビオチン：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入したビオチンのＮＨＳ誘導体から、例２，Ｉと同様にして調製
ストレパビジン−Ｔ６８０：Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ
Ｃｏ．より。上述のｎＣ10染料の可溶性類縁体で標識されたストレパビジン
【０４６３】
ＩＩ．アッセイ
アッセイは、様々な量のＨＣＧを含有するサンプル緩衝液〔０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，４ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（Ｔ５００），２０％スクロース／ｐＨ７．６〕５０μｌを、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６）中４μｇ／ｍｌ抗−ＨＣＧ−ビオチンおよび５×１０8油滴含有Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18試薬５０μｌと混合して実施した。この混合物を、室温、暗所で１時間インキュベートした。ついで、アッセイ緩衝液中２μｇ／ｍｌのストレパビジン５０μｌを各チューブに加え、インキュベーションをさらに３０分間続けた。最後に、各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフフィルター添付）で１分間照射し、Ｔｕｒｎｅｒの２０ｅルミノメーターを用いて２０秒間光出力を測定した。結果は図７にまとめる。
【０４６４】
例 ５
標的オリゴヌクレオチドの均一系アッセイ
標的配列は大腸菌Ｋ１２ ＤＮＡ Ｊ遺伝子（Ｊ．Ｃ．Ａ．Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｋ．Ｔｉｌｌｙ，Ｅ．Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｚｙｌｉｃｚ ＆ Ｃ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１７８２−１７８５，１９８６）から選択した。Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０を用いるホスファイトトリエステル法によって、以下の配列をもつ５０マーを製造し、Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＮTM Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて５′末端にビオチンを導入した。
を有する相補性の３０マーとした。
【０４６５】
フルオレセインは、改変ヌクレオチドＮ4−ＬＣＡ−５−メチルデオキシシチジンＣＥＤＴ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を挿入し、ついで５−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ含有ｐＨ９．０ ＮａＨＣＯ3中２００倍モル過剰使用して、そのエステルで標識した。粗生成物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18およびＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10ビーズは前例の記載と同じであった。
【０４６６】
標的についての標準曲線は、それを、４ｇ／ｌウシ血清アルブミンおよび１０ｍｇ／ｍｌウシ胸腺ＤＮＡを担体として含有する５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，６００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５中に系列希釈して作成した。その一部（５μｌ）を、１２×７５ポリプロピレン試験管中、同一緩衝液５μｌに取った４．８ピコモルのフルオレセイン標識プローブに添加した。混合物を覆って、７２℃に１０分間加熱して、完全なハイブリダイゼーションを保証した。４ｇ／ｌウシ血清アルブミン含有５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，６００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５の５０μｌ中に約１０10のドナー（センシタイザー）（ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10）を加え、ついで同一の緩衝液５０μｌ中２．５×１０11アクセプター（Ａｖｉｄｉｎ−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）ビーズを添加した。旋回振盪機上、室温で３０分間振盪したのち、各チューブを前例に記載した６５０ｎｍフィルター付きハロゲンランプを用いて１分間照射した。Ｔｕｒｎｅｒルミノメーターを用いて２０秒間、光の発生を測定した。得られた標準曲線は図８に示す。
【０４６７】
例 ６
ビオチン化プローブおよびフルオレセイン化
プローブに結合する合成標的の検出
ビオチン化プローブの製造
脱塩した５′−アミノ−修飾オリゴヌクレオチド（３０マー）
５′−ＵＡＡ−ＴＡＣ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＴＴＧ−ＣＣＴ−ＴＣＡ−ＣＧＣ−ＴＣＧ−ＡＡＡ−３′
５０ナノモルを０．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．０に溶解した。この緩衝溶液に、スクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２１３３６−Ｇ）のＤＭＦ中１２０ｍｇ／ｍｌ溶液１２５μｌを加えた。混合物を一夜インキュベートし、製造用電気泳動〔ＴＢＥ（Ｔｒｉｓホウ酸ＥＤＴＡ）緩衝液：８９ｍＭ ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）塩基，８９ｍＭホウ酸，２．５ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸），ｐＨ８．３〕を用い、４００ボルトで４時間精製した。ビオチン化オリゴヌクレオチドをゲルから切り出し、３ｍｌの０．１Ｍ ＮＨ4ＣＯ3により３７℃で一夜溶出した。この物質を再びＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｃ−１８カラム，Ｗａｔｅｒｓ ＃５１９１０）上で精製し、真空乾燥し、二重蒸留水中に懸濁した。
ビオチン化プローブの収量は３４．８ナノモル（５８％）であった。
【０４６８】
フルオレセイン化プローブの製造
中央のシトシン（位置１４）アミノ修飾オリゴヌクレオチド（３０マー）
５′−ＣＴＧ−ＣＣＧ−ＧＴＧ−ＣＧＣ−ＣＡＴ−ＧＵＴ−ＣＧＣ−ＣＣＧ−ＣＣＴ−ＣＡＣ−３′
５０ナノモルの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ９．６（１９０μｌ）およびアセトニトリル（１２０μｌ）の混合物中溶液を調製した。５／６カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃０１１１２）のＤＭＦ中０．１Ｍ溶液２００μｌを上記緩衝液に加えた。混合物を一夜室温でインキュベートした。以後の工程はビオチン化プローブについて上述した工程と同じである。
フルオレセイン化プローブは４１％の収率で得られた。
【０４６９】
アッセイ操作
アッセイ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕，５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ８．３，５ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および
２５μｇ／ｍｌウシ胸腺ＤＮＡ含有
フルオレセイン化プローブ（１．５ピコモル）およびビオチン化プローブ（１．２ピコモル）を含有するアッセイ緩衝液４０ｍｌを、アッセイ緩衝液中に系列希釈した合成標的ＤＮＡ １０μｌに添加した。混合物を５５℃で５分間ハイブリダイズした。ビーズ（それぞれ５０μｌのアッセイ緩衝液中２０μｇのアビジンビーズおよび３０μｇの抗フルオレセインビーズ）を添加した。ビーズを含有する溶液を５５℃で１５分間インキュベートした。
【０４７０】
アビジンビーズは、０．１７５μカルボキシル化ポリスチレンビーズにベンザルアクリダンを負荷して製造し、ＥＤＡＣ〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，＃Ｅ−６３８３）法によってアビジンを付加させた。
【０４７１】
ベンザルアクリダンは、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中１０−ジメトキシホスフィニル−９−メチルアクリダン（Ｍｏｎａｔｓｈ Ｃｈｅｍ．１１４，３，１９８８）に−７８℃（アセトン／ドライアイス浴）においてアルゴン気相下、ヘキサン中１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウム溶液０．４１３ｍｌを添加して製造した。ｔ−ブチルリチウム溶液を添加し、ｔ−ブチルリチウムの添加２０分後にＴＨＦ中上記アミドの溶液を加えた。反応溶液を一夜放置して、温度を室温に上昇させた。ついで、生成物をＴＬＣ（シリカゲル−３：７酢酸エチル／ヘキサン）で単離した。単離された生成物はマススペクトル分析およびＮＭＲによって分析し、暗所に保存した。
【０４７２】
抗フルオレセインビーズは、０．０４μポリスチレンカルボキシル化ビーズにテトラ−ｎ−デシル−Ａｌ−フタロシアニン（Ｕｌｔｒａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ロット番号ＧＲ１１−８２）を負荷して製造し、ビーズにＥＤＡＣ法を用いて抗フルオレセイン抗体を付加させた。
【０４７３】
シグナルは、ビーズを含有する溶液を６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプで６０秒間照射して読み取った。ルミネッセンスは２０秒間測定した。結果は表４にまとめ、図９に示す。
【０４７４】
例 ７
ビオチン化増幅生成物の検出
ビオチン化配列のＰＣＲによる製造
標的：大腸菌ゲノムＤＮＡ
プライマー：５′−ビオチン化２４マー
５′−ＵＣＡ−ＴＧＧ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＴＣＡ−ＧＧＴ−ＧＣＡ−ＧＡＴ−３′
および非ビオチン化１８マー
５′−ＴＴＴ−ＧＡＧ−ＣＧＣ−ＧＧＧ−ＣＴＧ−ＴＴＧ−３′
各１００ｎＭ
循環条件：
単一サイクル：
９４℃：３分
５９℃：１分
７２℃：１．５分
ついで３５サイクル：
９４℃：１分
５９℃：１．５分
７２℃：２分
【０４７５】
フルオレセイン化プローブを用いる検出
アッセイ緩衝液中１．５ピコモルのフルオレセイン化プローブ１０μｌを例６に記載の操作と同様にして調製し、２０μｌのＰＣＲ生成物に、様々な初期標的濃度において添加した。混合物を９５℃で５分間変性し、ついで５５℃で５分間ハイブリダイズさせた。ビーズ（５０μｌのアッセイ緩衝液中、２０μｇのベンザルアクリダンおよび３０μｇのＡｌ−フタロシアニンビーズ）を添加した。ビーズを含有する溶液を５５℃で１５分間インキュベートした。シグナルは例６に記載の操作後に読み取った。結果は表５にまとめる。
【０４７６】
例 ８
総トリヨードサイロニンのアッセイ
Ｉ．ビーズの製造
原料
１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
エチレングリコール、エトキシエタノール、ベンジルアルコール、クロロフィル−ａ：Ａｌｄｒｉｃｈ
ユーロピウム（ＩＩＩ）テオニルトリフルオロアセトネート（ＥｕＴＴＡ）：Ｋｏｄａｋ
オリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）：Ａｌｄｒｉｃｈ
ジオキセン〔１−（４−ジメチルアミノフェニル）−６−フェニル１，４−ジオキセン〕：Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｎｓ ＆ Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３０，３５−４４（１９７９）に記載された操作を改良して製造した。
【０４７７】
操作
１．クロロフィル−ａセンシタイザービーズ
ベンジルアルコール中クロロフィル−ａ溶液（１．０ｍｌ，０．６ｍＭ）を１０５℃で８．０ｍｌのベンジルアルコールに加えた。１７５ｎｍのサイズのカルボキシレート修飾ラテックスの水懸濁液（１０％，１．０ｍｌ）をベンジルアルコール溶液に添加した。この混合物を１０５℃で５分間攪拌し、室温に冷却した。エタノール（１０．０ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離した。ペレットを１：１エタノール−水混合物（１０．０ｍｌ）に再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。同じ再懸濁および遠心分離操作を水（１０．０ｍｌ）で反復し、ペレットを水（１．８ｍｌ）に再懸濁した。
【０４７８】
性質
Ａ．染料濃度：上記ビーズ懸濁液１０μｌをジオキサン（９９０μｌ）に添加して調製した溶液は、６６０ｎｍに０．１１の吸収を有することが明らかにされた。これはビーズ１ｇ中２．６マイクロモルのクロロフィル−ａに相当する。
【０４７９】
一重項酸素の発生：２ｍｌのリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）中、クロロフィル−ａビーズ（２００μｇ）、２×１０-4モルのアントラセン９，１０−ジプロピオン酸（ＡＤＰＡ）の混合物を、６４５ｎｍカットオフフィルターを付したタングステン−ハロゲンランプで２０分間照射した。ビーズを濾過して除き、酸素化生成物の濃度を４００ｎｍにおいて分光測定法により測定した。速度は１分あたり酸素化生成物３．０ナノモルであった。同一の条件下、可溶性センシタイザー、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホン酸アルミニウムは同量の酸素化生成物を生成した（ビーズ中のセンシタイザーの量は２００・１０-6・２．６・１０-6＝５２０ピコモルであった。
【０４８０】
２．クロロフィル−ａ／テトラブチルスクアレートセンシタイザービーズ
カルボキシル化ラテックスビーズ（サイズ１７５ｎｍ、水中１０％固体、３０．０ｍｌ）を遠心分離した。上清を捨て、ペレットはエチレングリコール（６０．０ｍｌ）に再懸濁した。懸濁液を１００℃に加熱した。クロロフィル−ａ１．６７ｍＭ、テトラブチルスクアレート〔１，３−ビス（４−ジブチルアミノフェニル）スクアレート〕３．３３ｍＭのベンジルアルコール溶液９．０ｍｌを徐々に、３分を要して懸濁液に添加した。加熱を７分間継続したのち、懸濁液を水浴中で室温に冷却した。ベンジルアルコール懸濁液を冷エタノール（１２０ｍｌ）に加えた。混合物を遠心分離し、上清は捨てた。ペレットを水中５０％エタノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。同じ再懸濁、遠心分離操作を水中５０％エタノール（３０ｍｌ）を用いて反復した。
【０４８１】
性質
Ａ．染料濃度：ビーズ中のテトラブチルスクアレートの濃度は、クロロフィル−ａビーズについて上述したのと同様にして分光測光法で測定した。ビーズ中４４μＭ染料が認められた。
【０４８２】
Ｂ．一重項酸素の生成：エタノール中ＡＤＰＡの５ｍＭ溶液２５μｌを、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）中ビーズ（１００μｇ）の懸濁液に添加した。混合物を上述のように、６１０ｎｍ長通過フィルターを用いて照射した。一重項酸素の生成速度はＡＤＰＡの吸収（４００ｎｍ）の低下速度から計算した。このビーズは７・１０-2マイクロモル／分の一重項酸素を生成することが明らかにされた。
【０４８３】
３．ジオキセン／ＥｕＴＴＡ／ＴＯＰＯアクセプタービーズ
１７５ｎｍカルボキシル化ラテックスビーズ（水中１０％懸濁液）２０ｍｌをエトキシエタノール（２０．０ｍｌ）に添加した。混合物を９０℃に加熱した。１０ｍＭジオキセン、２０ｍＭ ＥｕＴＴＡおよび６０ｍＭ ＴＯＰＯのエトキシエタノール溶液２０ｍｌを、混合物に添加した。加熱を７分間、９７℃までの温度で継続した。混合物を室温に冷却した。エタノール（４０．０ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離した。ペレットを８０％エタノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。再懸濁および遠心分離の操作を１０％エタノール（３６ｍｌ）を用いて反復した。
【０４８４】
性質
Ａ．染料濃度：ビーズ中のＥｕＴＴＡ濃度は上述のように分光測光法で測定し、０．０７Ｍであることが明らかにされた。
ジオキセンの濃度はＥｕＴＴＡの存在下には測定できないので、ジオキセンのみを負荷したビーズ中で同じ条件下に測定した。濃度は０．０１６Ｍであることが明らかにされた。
【０４８５】
Ｂ．シグナル生成：リン酸緩衝液（０．５ｍｌ，２０ｍＭリン酸塩，５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．０）中ビーズ（２５μｇ）の懸濁液を、同じ緩衝液中２μＭアルミニウムフタロシアニンテトラスルホネートの溶液と混合した。混合物を６１０ｎｍ長通過フィルターを付した１２５Ｗタングステン−ハロゲンランプで１分間照射した。照射後、混合物をＴｕｒｎｅｒＴＤ−２０ｅ ルミノメーター中に置き、ルミネッセンスを２０秒間測定した。強度は３２７ＲＬＵ（相対光量単位）／秒であった。
放射光の波長は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ６５０−４０走査スペクトロフルオリメーターを用いて測定した。主要な放射ピークは６１５ｎｍ付近に集中した。
【０４８６】
ＩＩ．アッセイ操作
４０ｎｍビーズへの抗体のＥＤＡＣ／ＮＨＳカップリング
７３．６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ＃２４５１０Ｇ）を、水中４ｍｇ／ｍｌカルボキシレート修飾４０ｎｍポリスチレンビーズ（クロロフィル−ａおよびテトラブチルスクアレートで染色）の懸濁液６ｍｌに溶解した。０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4１３６μｌを加えた。ｐＨを５．２に調整した。さらに１３６μｌの水を添加した。１３０．４ｍｇのＥＤＣＡ〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．＃Ｅ−６３８３〕を４５４μｌの水に取り、攪拌したビーズ懸濁液に徐々に加えた。この懸濁液を室温で２０分間インキュベートした。ビーズを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローターを用い１５，０００ｒｐｍ，４℃で２０分間遠心分離した。上清は捨てた。ついで、ビーズを１．２ｍｌの５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８中に再懸濁し、懸濁液を超音波処理してビーズを再度分散させた。１．７ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ（モノクローナル抗−フルオレセイン）＋６．７ｍｇ／ｍｌＢＳＡ＋１７ｍＭ ｂｏｒａｘを含有する溶液（ｐＨ９．２）４．８ｍｌを攪拌しながらビーズを徐々に加え、一夜４℃で穏やかに混合した。８００μｌの２Ｍグリシン、ついで０．１Ｍ ｂｏｒａｘ中５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ２．８ｍｌをビーズ懸濁液に加えた。懸濁液を超音波処理し、４℃で３時間穏やかに混合した。ビーズを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清は捨てた。ビーズを３ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁し、懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸濁および超音波処理工程を計３回反復した。３回目の遠心分離後、ビーズを２．４ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。得られた懸濁液を超音波処理して、４℃で保存した。
【０４８７】
１７５ｎｍビーズへのアビジン−ＤのＥＤＡＣ／ＮＨＳカップリング
４．４ｍｇのスルホ−ＮＨＳを、水中２５ｍｇ／ｍｌのカルボキシレート修飾１７５ｎｍポリスチレンビーズ（ジオキセン／ＢｕＴＴＡ／ＴＯＰＯで染色）２５ｍｇ／ｍｌの懸濁液０．４ｍｌに溶解した。０．０１６０ｍｌの０．２５ＭＮａＨ2ＰＯ4を添加した。０．０３０ｍｌの水に溶解した８ｍｇのＥＤＡＣを旋回させたビーズ懸濁液に徐々に加えた。懸濁液を室温で２０分間インキュベートした。ビーズを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローターを用い、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。上清は捨てた。
【０４８８】
ビーズを０．６ｍｌの０．００５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８に再懸濁した。懸濁液を超音波処理してビーズを再び懸濁させた。ビーズを再び、１．３３ｍｇ／ｍｌアビジン−Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）＋１７ｍＭ ｂｏｒａｘ含有ｐＨ９．２の溶液３ｍｌに攪拌しながら、徐々に添加し、一夜４℃で穏やかに混合した。ＤＭＦ中１Ｍ無水コハク酸０．００４ｍｌを加えた。懸濁液を、穏やかに混合しながら４℃で１時間インキュベートした。１０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０中５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ０．４ｍｌを添加した。懸濁液を４℃で３時間穏やかに混合した。ビーズを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を捨てた。ビーズを、３ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸濁および超音波処理工程を計３回反復した。３回目の遠心分離後、ビーズを２．２５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。懸濁液を超音波処理して、４℃で保存した。
【０４８９】
総Ｔ 3 アッセイ
アッセイ緩衝液：０．０７５Ｍ バルビタール，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ ＢＳＡ，１．２５％マウスＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（分子量５００，０００），１．０ｍｇ／ｍｌデキストランＴ−５００，１０μｇ／ｍｌ凝集ＩｇＧ
【０４９０】
ビーズ
アクセプタービーズ：アビジン−ＥＤＡＣ，１７５ｎｍ，ジオキセン／ＥｕＴＴＡ／ＴＯＰＯを負荷
センシタイザービーズ：抗フルオレセイン−ＥＤＡＣ，４０ｎｍ，クロロフィル−ａ／スクアレートを負荷
【０４９１】
アッセイプロトコール
アッセイ緩衝液中８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩（Ｓｉｇｍａ，Ａ−３１２５）溶液（０．７５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌをＴ3標準溶液またはサンプル５０μｌに加えた。アッセイ緩衝液１００μｌを添加した。アッセイ緩衝液中ビオチン化抗−Ｔ3（７０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを添加した。アッセイ緩衝液（５０μｌ）中、トレーサー、Ｔ3−ＬＣ21−Ｆ１
【化４０】
Ｔ3−ＬＣ21−Ｆ１
（１．８ｎｇ／ｍｌ）を添加した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。センシタイザービーズ（５０μｇ）およびアクセプタービーズ（６．２５μｇ）のアッセイ緩衝液中懸濁液５００μｌを添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。「停止溶液」（５０μｌ）（１０μＭフルオレセイン，０．５ｍＭビオチン）を添加した。
シグナルは、６１０ｎｍカットオフフィルター付きハロゲンランプで、照射１分、測定２０秒で読み取った。
【０４９２】
結果
結果は図１０にまとめる。ルミネッセンスシグナルはＴ3濃度の関数としてプロットした。シグナルの変化は８．５ｎｇ／ｍｌ Ｔ3で９４％であった。０．５ｎｇ／ｍｌにおけるシグナルの変化は３８％であった。
【０４９３】
以上、本発明を、明快にし理解しやすくするために、例示および実施例によって詳細に説明したが、ある種の改変または修飾は特許請求の範囲内に包含されることは明白である。
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ビタミンＢ12の検定結果のグラフによる描写である。
【図２】ジゴキシンの検定結果のグラフによる描写である。
【図３】本発明によるＨＣＧの検定結果のグラフによる描写である。
【図４】本発明による試験結果のグラフによる描写である。
【図５】本発明によるＴＳＨに対する検定結果のグラフによる描写である。
【図６】図５のグラフによる描写の一部である。
【図７】本発明によるＨＣＧに対する別の検定結果のグラフによる描写である。
【図８】ＤＮＡハイブリッド検出検定の結果のグラフによる描写である。
【図９】合成標的の検出結果のグラフによる描写である。
【図１０】全トリヨードチロニン検定のグラフによる描写である。
【産業上の利用分野】
１．発明の技術分野
本発明は試料中の被検物質を定量する方法、組成物、およびキットに関する。とりわけ本発明は別個の段階を必要としない特異的結合に基づく検定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床診断分野は近年、容易にかつ正確に定量しうる物質（被検物質）の多様性ならびにその定量法の両方に関して幅広い拡張をみた。液体中の低濃度の物質の存在を検出する便利で信頼できる危険のない手段が望まれている。臨床化学においてこれらの物質は体液中に１０-12モル以下の濃度で存在することがある。これら低濃度物質を検出することのむずかしさは利用できる試料の量が比較的小さいことによって一層増大する。
【０００３】
一検定法を開発する際には多くのことを考慮しなければならない。一つの考慮すべきことは、被検物質の濃度変化に対する信号の応答である。第二の考慮すべきことは、検定に対する実験計画案を容易に実施しうることである。考慮すべきことの第三は、試料毎の妨害物質の変動である。試薬の調製および精製の容易なこと、装置の入手性、オートメ化の容易なことおよび対象物質との相互作用も、有用な検定法を開発する上で更に考慮すべき諸問題である。
【０００４】
一つの幅広い技術のカテゴリーは、被検物質の存在の関数として標識されたリガンドの特別な場所の極性組織へ特異的に結合しうる受容体を使用することである。受容体による観察された結合効果は左右される。ある場合には、受容体の結合は単に結合した標識リガンドと非結合標識リガンドとの間の分子量の差を与えるだけである。
【０００５】
他の場合には、受容体の結合は、結合した標識リガンドと遊離標識リガンドとの分離を促進するか、あるいは標識リガンドに結合した受容体の量によって信号が変化するように標識から得られる信号の性質に影響するかもしれない。更に一つの変法は受容体を標識しリガンドを標識しないことである。他方、受容体およびリガンド両方を標識するか、または異なる受容体を二つの異なる標識で標識する。このようにすると、これら標識がごく接近しているときには相互作用が起こり、存在するリガンドの量は受容体の標識が相互作用しうる度合に影響を及ぼす。
【０００６】
広範囲の異なるリガンドに適合しうる正確な新規技術に対し、あるいは他の方法が容易に適合し得ない特別な場合に使用できる正確な新規技術に対し絶えざる要望がある。
【０００７】
均一系免疫検定法が小さい分子を対象として以前から記述されて来た。これら検定法の例として、特にＳＹＶＡ′Ｓ ＦＲＡＴTM検定、ＥＭＩＴTM検定、酵素チャンネリング免疫検定、および蛍光エネルギー移動免疫検定（ＦＥＴＩ）、酵素阻害物質免疫検定（Ｈｏｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ ａｎｄ ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ）：蛍光偏光免疫検定（Ｄａｎｔｌｉｃｋｅｒ）があげられる。
【０００８】
これらの方法はすべて感度が限られていて、ＦＥＴＩおよび酵素チャンネリング法を含む少数だけが大きい多重エピトープ性被検物質に対し適している。
【０００９】
発光性化合物、例えば蛍光性化合物および化学発光性化合物は、光を放出するその能力の故に検定分野で広い応用が見出されている。この理由のため、核酸検定および免疫検定のような検定における標識として発光物質が利用されて来た。例えば、幾つかの特異的結合対を発光物質と抱合させ、種々な実験計画が用いられている。この発光物質抱合体を、被検物質を含むことが予想される試料中の被検物質の量と関連させて固相と液相との間に分配できる。これら相のいずれかのルミネッセンスを測定することにより、観察されたルミネッセンスのレベルと試料中の被検物質の濃度とを関連づけることができる。
【００１０】
リポソームおよび赤血球ゴーストといった粒子がカプセル化した水溶性物質の担体として利用されて来た、例えば、生物活性物質を種々な用途に向けて、例えばある薬剤をリポソーム調製中にトラップし次に処置すべき患者へ投与する薬物投与方式に向けて、カプセル化するためにリポソームが使用された。
【００１１】
ラテックスビーズおよびリポソームといった粒子も検定に利用されて来た。例えば、均一系検定法において、抗体または抗原で標識したリポソームの水相に酵素をトラップすることができる。リポソームは試料および補体の存在下で酵素を遊離させる。
【００１２】
水相中にカプセル化された水溶性蛍光染料または非蛍光染料を有する、あるいは脂質小胞の脂質二重層中に溶解した脂溶性染料を有する抗体−または抗原−標識リポソームも、この表面に結合した抗体または抗原と免疫化学反応に入りうる被検物質に対する検定に利用されて来た。リポソームの水相から染料を解放するために染浄剤が使われた。
【００１３】
化学発光標識は配位子結合検定法で顕著な感度を示すが、一つ以上の化学的活性化工程を必要とするのが普通である。蛍光性標識はこの欠点をもたないが感度が低い。
【００１４】
結合する相手と共有結合でつながる基が化学的活性化によって光を発する免疫検定および核酸検定に対し化学発光標識が記述された。アクリジニウムエステルを利用する核酸検定キットがＧｅｎｐｒｏｂｅ（Ｐａｃｅ２ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商品名）、サン ジェゴ、カリフォルニア州）により販売され、またこの型の標識を使用するＭａｇｉｃＬｉｔｅ（登録商品名）免疫検定キットがＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（バーゼル、スイス）により売り出されている。
【００１５】
標識された核酸プローブから第二のプローブに結合された蛍光性受容体へのエネルギー移動がサンドイッチ核酸検定に対してＨｅｌｌｅｒ等、ＩおよびＩＩ（以下に述べる）により記述された。Ｍａｇｇｉｏ Ｉ（以下に述べる）は免疫検定に対する同様な手順を述べている。ポリヌクレオチドに共有結合した発光物質から、間に挿入された発蛍光団へのエネルギー移動がＨｅｌｌｅｒ等、ＩＶ（以下に述べる）により記述されている。
【００１６】
間に挿入された染料からポリヌクレオチド上の蛍光物質への移動は最近Ｃａｒｄｕｌｌｏ等（後述）により記述された。更にＭｃ Ｃａｐｒａ（後述）は、標識としての光増感剤（フォトセンシタイザー）の使用を記載しており、この場合光増感剤は酸素をその一重項状態に活性化し、次にこの一重項状態の酸素が加熱により光を発する化合物と反応する。
【００１７】
２．関連技術の簡単な説明
欧州特許願第０，３４５，７７６号明細書（Ｍｃ Ｃａｐｒａ）は、標識として増感剤を利用する特異的結合検定を開示している。この増感剤は、一つ以上の波長の放射線で、または他の化学的あるいは物理的刺激（例えば、電子移動、電気分解、エレクトロルミネッセンスまたはエネルギー移動）で励起することによって刺激されたとき励起状態に達し、そしてこの状態は（イ）分子状の酸素との相互作用により一重項分子酸素をつくり出す、あるいは（ロ）ロイコ染料との相互作用によって還元形（これは分子状の酸素との相互作用によりもとの非励起状態に戻り、結果として過酸化水素を生ずる）をとるというどの部分も包含している。
【００１８】
励起された増感剤との相互作用はいずれも試薬の添加により検知可能な信号を発生する。
欧州特許願第０，０７０，６８５号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、Ｉ）は非放射性エネルギー移動による均質核酸ハイブリッド形成診断法を記載している。
【００１９】
光放出ポリヌクレオチドハイブリッド形成診断法は欧州特許願第０，０７０，６８７号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、ＩＩ）に記載されている。
【００２０】
欧州特許願第０，２３２，９６７号明細書（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｉ）は標的のポリヌクレオチドらせんに対する検定を行なうための方法と組成物を記載している。その方法は第一および第二のポリヌクレオチドプローブを含む試薬と試料とを接触させるものである。
【００２１】
これら第一および第二のプローブは、プローブが互に拘束される最初の位置およびプローブが標的に結合される第二の位置をとりうる。これらプローブはそれがこれら二つの位置の一つに存在することを表示する信号を生ずるように相互作用しうる標識部分を含む。
【００２２】
欧州特許願第０，３１５，３６４号明細書は、液体中の抗原または抗体の存在あるいは濃度を決定する免疫化学検定法を記載している。この検定法は、（イ）第一の標識された抗体または抗原、第二の標識抗体または抗原、および測定しようとする抗原または抗体の３成分複合体をつくり、そして（ロ）抗原物質に結合された相互の接近により高められた第一の標識と第二の標識との間の相互作用により、少なくとも一つの基質の存在下で生ずる信号を検知する、ことからなる。
【００２３】
欧州特許願第０，２２９，９４３号明細書（Ｈｅｌｌｅｒ等、ＩＩＩ）は、ポリヌクレオチドハイブリッド形成検定法に対する蛍光ストークスシフトプローブを記載している。
【００２４】
米国特許第４，２２６，９９３号明細書（Ｂｕｃｋｌｅｒ等）は、化学発光性フタルヒドラジドで標識した抱合体の合成中間体として有用な免疫機能を与えたフタルヒドラジドを記載している。この抱合体は、液体媒質中で配位子あるいはその特異的な結合相手を測定するための特異的結合検定法における試薬として役立つ。
【００２５】
米国特許第４，３８０，５８０号および第４，３８３，０３１号明細書（Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ等、ＩおよびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ等、ＩＩ）はそれぞれ不均質および均質化学発光特異的結合検定法を記載している。
【００２６】
米国特許第４，２２０，４５０（Ｍａｇｇｉｏ Ｉ）は化学的に誘導される蛍光免疫検定法を記載している。
【００２７】
米国特許第４，６５２，５３３号明細書（Ｊｏｌｌｅｙ）は発光性標識を取り込んだ固相免疫検定法を記載している。
【００２８】
米国特許第４，２７７，４３７号明細書（Ｍａｇｇｉｏ ＩＩ）は化学的に誘導された蛍光免疫検定法を実行するためのキットを記載している。
【００２９】
Ｈｅｌｌｅｒ等（ＩＶ）は、「Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ」（１９８５），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，２４５〜２５７頁で、ＤＮＡハイブリッド形成方式のための化学発光性および蛍光性プローブを記載している。
【００３０】
Ｈａｒａ等は、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．（１９８４）５７：３００９〜３０１０で、化学発光触媒として金属錯体化合物を使用する免疫検定法を述べている。
【００３１】
Ｋｕｓｃｈｎｉｒ等は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９６９）１９３．において、６−アミノフタラジン−１，４−（２Ｈ３Ｈ）−ジオン中ルミノールの光増感化学発光を記載している。
【００３２】
非放射性蛍光滞留エネルギー移動による核酸ハイブリッド形成の検出法がＣａｒｄｕｌｌｏ等によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５：８７９０〜８７９４に記載されている。
【００３３】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）１８３：２３１〜２４４の中で、相互作用のある蛍光標識および競合的ハイブリッド形成を用いるポリヌクレオチドの溶液相検出法を述べている。
【００３４】
Ｚｏｍｅｒ等は、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ（１９８９）２２７：１１〜１９の中で、化学発光標識を述べている。
【００３５】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＩＩは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）１７４：１０１〜１２０の中で、エネルギー移動の時間分割検出法：理論および免疫検定への応用を述べている。
【００３６】
米国特許第４，２９９，９１６号明細書（Ｌｉｔｍａｎ等、Ｉ）は免疫検定法においてある表面上での優先的信号生成を記載している。
米国特許第４，２３３，４０２号明細書（Ｍａｇｇｉｏ等）はチャンネリングを使用する試薬および方法を記載している。
【００３７】
米国特許第４，２６１，９６８号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、Ｉ）は免疫検定法における免疫学的対による蛍光消光を記載している。
【００３８】
米国特許第４，３１８，７０７号明細書（Ｌｉｔｍａｎ等、ＩＩ）は特異的受容体検定法における高分子蛍光消光剤粒子を記載している。
【００３９】
米国特許第４，６５０，７７０号明細書（Ｌｉｕ等）は、発光競合タンパク質結合検定法におけるエネルギー吸収粒子による消光を記載している。
【００４０】
米国特許第４，６５４，３００号明細書（Ｚｕｋ等）は蛍光マイクロビーズ消光検定法を記載している。
米国特許第４，１７４，３８４号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＩ）は免疫検定法における免疫学的対による蛍光消光を記載している。
【００４１】
米国特許第４，１９３，９８３号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＩＩ）は標識したリポソーム粒子組成物およびそれによる免疫検定法を開示している。
【００４２】
米国特許第４，１９９，５５９号および第３，９９６，３４５号明細書（Ｕｌｌｍａｎ等、ＩＶおよびＶ）は、免疫検定法における免疫学的対による蛍光消光を記載している。
【００４３】
Ｏ′Ｃｏｎｎｅｌ等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，（１９８５）、３１（９），１４２４−１４２６は、リポソームの水相中にトラップされた染料を有する大きい単層リン脂質小胞を利用するジゴキシンの比色免疫検定法を開示している。
【００４４】
特許第３，８５０，５７８号（Ｍｃ Ｃｏｎｎｅｌｌ）、第４，４８３，９２１号（Ｙａｖｅｒｂａｕｍ）、および第４，４８３，９２９号明細書（Ｓｚｏｋａ）は、抗原または抗体が脂質小胞の表面に結合される免疫反応性リポソーム試薬を開示している。
【００４５】
米国特許第４，５２９，５６１号（Ｈｕｎｔ等）、第４，５２２，８０３号（Ｌｅｎｋ等）および第４，４８５，０５４号明細書（Ｍｅｚｅｉ等）は脂質小胞を調製する種々な方法を記載している。
【００４６】
米国特許第４，３１１，７１２号明細書（Ｅｖａｎｓ等）は凍結乾燥リポソーム混合物の調製法を開示している。
米国特許第４，５８８，５７８号明細書（Ｆｏｕｎｔａｉｎ等）は単相脂質小胞の製造法および薬物投与系におけるこのような小胞の使用を開示している。
【００４７】
米国特許第４，５７６，９１２号明細書は、多数の発蛍光団を付けたある種の長鎖担体を使用する免疫検定の蛍光レベルを高める方法を開示している。
【００４８】
米国特許第４，８９１，３２４号明細書は検定用に発光物質を有する粒子を記載している。
植物に有毒なリポソームによるＴリンパ球の選択的殺細胞がＹｅｍｕ等（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：２４６−２５０により記述されている。
【００４９】
Ｍｅｗ等はＪ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３０（３）：１４７３−１４７７（１９８３）の中で光免疫療法：腫瘍特異的モノクローン抗体−ヘマトポルフィリン抱合体を用いる動物腫瘍の治療を開示している。
【００５０】
小さい単分子の光学顕微鏡による観察がＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄ（１９７６）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ，１５（１２）：３１３５−３１３９により論議されている。
欧州特許願第０，３２２，９２６号明細書（Ｍｃ Ｃａｐｒａ等）は改良化学発光エステル類、チオエステル類、およびアミド類を利用する検定法を記載している。
【００５１】
欧州特許願第０，３５２，７１３号明細書（Ｓｃｈａａｐ）は１，２−ジオキセタン類からの化学発光を高める方法と組成物を記載している。
【００５２】
米国特許第４，９７８，６１４号明細書（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）はジオキセタン類の酵素誘導分解を用いる物質検出法を開示している。
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等（米国特許第４，９５６，４７７号明細書）は１，２−ジオキセタン類の合成法を述べている。
【００５３】
Ｓｃｈａａｐ等はＷＯ第９０／０７５１１号の中で拘束蛍光物質へのエネルギー移動を通して１，２−ジオキセタン類からルミネッセンスの増強を記載している。
【００５４】
米国特許第４，９５９，１８２号明細書（Ｓｃｈａａｐ）は、１，２−ジオキセタン類からの化学発光を増大させる方法ならびに組成物を開示している。
米国特許第４，９６２，１９２号（Ｓｃｈａａｐ）および第４，８５７，６５２号明細書（Ｓｃｈａａｐ）は化学発光を示す１，２−ジオキセタン化合物を記載している。
【００５５】
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等は米国特許第４，９３１，２２３号明細書中で化学発光を示す１，２−ジオキセタン類を使用する方法を述べている。
ＷＯ第９０／０２７４２号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）には安定な水溶性ジオキセタン類の精製法が開示されている。
縮合多環式環を含む新規な化学発光性１，２−ジオキセタン類およびそれを用いる検定法がＷＯ第９０／００１６４号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）に記載されている。
【００５６】
ＷＯ第８９／０６２２６号（Ｅｄｗａｒｄｓ等）は１，２−ジオキセタン類およびその中間体の合成を記載している。
Ｎｅｃｋｅｒｓ等は米国特許第４，３１５，９９８号明細書中で重合体に結合させた光増感触媒を述べている。
【００５７】
ジオキセタン類の酵素誘導分解を使用する物質検出法がＷＯ第８８／００６９５号（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等）に記載されている。
欧州特許願第０，３２４，２０２号明細書（Ｚｏｍｅｒ等）は化学発光標識物としてアクリジニウム化合物を開示している。
欧州特許願第０，１４４，９１４号明細書（Ａｌｂｅｒｅｌｌａ等）は、ハイブリッド結合試薬の標識対を用いるハイブリッド形成検定法を記載している。
【００５８】
欧州特許願第０，４０１，００１号明細書（Ｕｒｄｅａ等）は、化学発光性二重トリガー１，２−ジオキセタン類を記載している。
【００５９】
【発明の開示】
課題を解決するための手段
本発明は被検物質の定量法に関する。
【００６０】
本発明の一面は被検物質を定量する方法であり、本法は被検物質を含むと思われる媒質を（メジウム）を、本質的に準安定な化学種を生ずるように処理することからなる。この化学種は媒質中に拡散し、そして被検物質存在のために前記化学種にごく接近した準安定化学種と反応することのできる媒質中のある物質と選択的に反応することができる。本法は更に前記化学種が物質と反応したかどうかを決定することからなる（その反応が媒質中の被検物質の量を表示する）。
【００６１】
本発明のもう一つの具体例は、液体媒質中の被検物質に対する検定法の改良である。この検定法は、被検物質を含むと思われる媒質を処理して被検物質の存在と関連した特異的結合対（ｓｂｐ）複合体を形成せしめ、そしてこの複合体が形成されたかどうかを測定する工程からなる。
【００６２】
その改良点は媒質を（１）特異的結合対の構成要素と関連する光増感剤と、そして（２）ｓｂｐ構成要素（ｓｂｐメンバー）と関連する化学発光性化合物とを一緒にすることからなり、この光増感剤の活性化により化学発光性化合物から放出される光の量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６３】
本発明方法のもう一つの具体例は、被検物質が、もし存在するとすれば、光増感剤および化学発光性化合物を非常に接近させるような条件下で、被検物質を含むと思われる媒質を処理することからなる。
【００６４】
結果として、光増感剤によりつくり出された一重項酸素が化学発光性化合物を活性化し、これがその後光あるいはルミネッセンスを発する。発生する光の量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６５】
もう一つの具体例をあげると、被検物質を測定するための本発明方法は、第一段階として被検物質を含むと思われる媒質、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成要素と関連をもつ光増感剤、および化学発光性化合物を含有してなる懸濁性粒子からなるコンビネーションを提供することからなる。
【００６６】
この懸濁性粒子はそれに結合した（ｓｂｐ）構成要素を有する。このコンビネーシヨンを処理して光増感剤を励起させると、その励起状態で光増感剤が酸素を活性化し一重項状態にすることができる。次にコンビネーションを発せられたルミネッセンスの量について調べる。このようなルミネッセンスの量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００６７】
別法として、化学発光性化合物をｓｂｐ構成要素と併合し、懸濁性粒子が光増感剤を含有しかつそれに結合したｓｂｐ構成要素を有するようにすることができる。
【００６８】
もう一つの具体例はコンビネーションを与える被検物質の測定法である。このコンビネーションは被検物質を含むと思われる媒質、第一のｓｂｐ構成要素と併合させた光増感剤、および第二のｓｂｐ構成要素と併合させた化学発光性化合物からなる。次に光増感剤を励起させるとこれが酸素を活性化して一重項状態とし、この一重項酸素が光増感剤と接近して存在する化学発光性化合物を活性化する。コンビネーションから発せられたルミネッセンスは被検物質の量と関係づけられる。
【００６９】
もう一つの具体例は被検物質の測定法である。本法は、被検物質を含むと思われる試料、添加された化学発光性物質および結合したｓｂｐ構成要素を有する第一の懸濁性粒子、および粒子がそれに結合されたｓｂｐ構成要素を有する場合に酸素を活性化してその一重項状態にすることのできる光増感剤を添加した第二の懸濁性粒子を水性媒質中で合わせることからなる。
【００７０】
次に、この媒質を照射して酸素の一重項状態をつくり出し、媒質から発せられたルミネッセンスの量を測定する。このようなルミネッセンスの量を媒質中の被検物質の量と関連づける。
【００７１】
本発明のもう一つの具体例は、化学発光性化合物を添加した懸濁性粒子からなる組成物に関し、この場合、前記粒子はそれに結合したｓｂｐ構成要素を含有する。更に本組成物は光増感剤を添加した懸濁性粒子からなることができる。
【００７２】
本発明のもう一つの具体例は（１）化学発光性化合物を有する懸濁性粒子（この場合、粒子はそれに結合されたｓｂｐ構成要素を含有する）および（２）光増感剤を含む組成物を包装されたコンビネーション中に含有してなるキットに関する。このキットは光増感剤を含有してなる第二の懸濁性粒子（この場合、前記粒子はそれに結合されたｓｂｐ構成要素を有する）からなる組成物を更に包含することができる。
【００７３】
もう一つの具体例をあげると、このキットは（１）第一のｓｂｐ構成要素と併合された化学発光性化合物および（２）その励起状態において、第二のｓｂｐ構成要素と併合された酸素をその一重項状態に活性化することのできる光増感剤からなる。
【００７４】
本発明のもう一つの具体例は、（１）被検物質を含むと思われる媒質、（２）光化学的に活性化できる化学発光性化合物と併合させた第一の特異的結合対（ｓｂｐ）構成要素からなる標識試薬を用意し、第一のｓｂｐ構成要素は被検物質または第二のｓｂｐ構成要素に結合して被検物質の存在と関係づけられる複合体を形成しうるものであり、前記化学発光性化合物を光化学的に活性化し、そして化学発光性化合物により発生するルミネッセンスの量を検知することからなり、このルミネッセンスの量は媒質中の被検物質の量と関係づけられる。
【００７５】
もう一つの具体例をあげると、被検物質を測定するための本発明方法は、第一段階として（１）被検物質を含むと思われる媒質、および（２）光化学的に活性化しうる化学発光性化合物に結合された特異的結合対の構成要素（ｓｂｐ構成要素）からなる標識試薬を、前記標識試薬を含むｓｂｐ構成要素複合体が媒質中の被検物質の存在と関係をもって形成される条件下に、検定媒質中で一緒に合わせることからなる。
【００７６】
検定媒質を光照射して光化学的に活性化しうる化学発光性化合物を活性化する。検定媒質を発光について調べる。このような信号発光の存在または強度を前記媒質中の被検物質の量と関係づける。化学発光性化合物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化しうる。媒質中にエネルギー受容体を加えておく。
【００７７】
もう一つの具体例は被検物質の定量法である。この方法は（１）被検物質を含むと思われる媒質、（２）光または一重項酸素と反応したとき化学発光しうる化合物に結合された特異的結合対の第一の構成要素（ｓｂｐ構成要素）、および（３）第二のｓｂｐ構成要素に結合されたエネルギー受容体、あるいは結合するようになる可能性のあるエネルギー受容体からなる不溶化試薬を水性媒質中で同時にあるいは全体的にあるいは部分的に順次に合わせることからなる。
【００７８】
標識試薬が媒質中の被検物質の存在との関係で形成され、化学発光性化合物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化しうる条件を選ぶ。前記化合物は光あるいは一重項酸素によって活性化される。検定媒質をルミネッセンスについて調べ、その存在あるいは強度を媒質中の被検物質の量と関係づける。
【００７９】
本発明のもう一つの具体例は被検物質の定量法である。
【００８０】
本法は（イ）（１）被検物質を含むと思われる媒質、（２）一重項酸素と反応したとき化学発光を起こしうる化合物に結合された特異的結合対の第一の構成要素（ｓｂｐ構成要素）からなる標識試薬、（３）一重項酸素発生剤、および（４）第二のｓｂｐ構成要素に結合された、あるいは結合するようになる可能性のあるエネルギー受容体からなる試薬を、標識試薬を含むｓｂｐ構成要素複合体が媒質中の被検物質の存在との関係で形成されそして化学発光性化合物からのエネルギーがエネルギー受容体を活性化することができる条件下に、検定媒質中で同時にあるいは全体的にあるいは部分的に順次合わせ、（ロ）一重項酸素発生体を活性化し、そして（ハ）検定媒質を信号について調べ、信号の存在あるいは強度を媒質中の被検物質の量と関係つげることからなる。
【００８１】
本発明のもう一つの具体例はポリヌクレオチド被検物質の定量法である。
【００８２】
そして本法は（イ）（１）ポリヌクレオチド被検物質を含むと思われる試料および（２）ポリヌクレオチドに結合された光化学的に活性化しうる化学発光性化合物からなる標識試薬（その少なくとも一部分は前記ポリヌクレオチド被検物質でハイブリッド形成できる）を、標識試薬が、もし存在するとすればポリヌクレオチド被検物質とハイブリッド形成する条件下に、検定媒質中で合わせ、（ロ）検定媒質を照射して光化学的に活性化しうる化学発光性化合物を活性化し、そして（ハ）媒質のルミネッセンスを測定することからなる。このルミネッセンスの量を試料中の被検物質の量と関係づける。
【００８３】
本発明のもう一つの具体例はｓｂｐ構成要素に結合された光化学的に活性化しうる化学発光性化合物からなる組成物である。本発明のもう一つの具体例はこのような組成物を含有してなるキットである。
【００８４】
図面の記述
【００８５】
図１はビタミンＢ12の検定結果のグラフによる描写である。
図２はジゴキシンの検定結果のグラフによる描写である。
【００８６】
図３は本発明によるＨＣＧの検定結果のグラフによる描写である。
図４は本発明による試験結果のグラフによる描写である。
【００８７】
図５は本発明によるＴＳＨに対する検定結果のグラフによる描写である。
図６は図５のグラフによる描写の一部である。
【００８８】
図７は本発明によるＨＣＧに対する別の検定結果のグラフによる描写である。
図８はＤＮＡハイブリッド検出検定の結果のグラフによる描写である。
【００８９】
図９は合成標的の検出結果のグラフによる描写である。
図１０は全トリヨードチロニン検定のグラフによる描写である。
【００９０】
特別な具体例の説明
【００９１】
本発明は被検物質の定量法に向けられている。
本発明の一面は、被検物質を含むと思われる媒質を処理して本質的に準安定化学種をつくることからなる被検物質の定量法である。この化学種は媒質中に拡散することが可能であり、そして被検物質の存在により化学種にごく接近した準安定化学種と反応することのできる媒質中の物質と選択的に反応することが可能である。
【００９２】
本法は更に化学種が該物質と反応したかどうかを決定することからなり、その反応は媒質中の被検物質の量を指示する。
【００９３】
一般にこの準安定化学種は励起状態である。準安定化学種は１ミリ秒未満、通常は１００ミリ秒未満、更に一般的には１０ミリ秒未満の寿命をもつ。この準安定化学種は媒質中に拡散する性質がある、即ちそれがある部位で生成し、その生成部位から他の部位へ移動しそこでエネルギーを移したり、前記部位で分子と反応することができる。
【００９４】
この準安定化学種はｔｒａｎｓ−シクロヘキセン、α−ラクトン、トリメチレンメタンなどの群から生ずるラジカルイオン、ナイトレン、カルベンといった反応性中間体のいずれでもよい。特に関心をもたれているものは励起一重項状態、例えば一重項酸素、三重項状態、およびジオキセタン類、例えばジオキセタノンおよびジオキセタンジオンである。
【００９５】
三重項状態は一般に適当な増感剤、例えばピレン、をエネルギー受容体、例えばアントラセンと結合させることによりつくられる。例えば、ジブロモアントラセンは三重項状態をとるエネルギー受容体として作用しうる。三重項状態はそのエネルギーを他の分子に移動させるように進行し、光の発生といった検知可能な光化学的反応を開始する。ジオキセタン類、例えばジオキセタンジオンは活性な分子と一重項酸素または過酸化水素との反応から生ずる。例えば、適当なオキサレートおよび過酸化水素はオキセタンジオンを生成する。
【００９６】
セイヨウワサビのペルオキシダーゼのような酵素は一般にラジカル陽イオンまたは一重項酸素を発生させることができ、そして後者は同様に準安定であり、他の分子と反応して検知可能な信号を与えることができる。
【００９７】
特異的結合対複合体の存在は、複合体の一構成要素によって準安定化学種をつくり出すことにより定量できる。このようにするとこの化学種は、該要素が複合体内にないとき前記構成要素と相互作用することなく、複合体の別の構成要素と選択的に相互作用しうる。
【００９８】
本発明の一面においては、光増感剤およびリガンド、受容体またはポリヌクレオチドからなる組成物が、検定中化学発光性化合物およびリガンド、受容体またはポリヌクレオチドからなる組成物へ結合する。この化学発光性化合物は一重項酸素と反応することができ、そして生じた生成物は光を発して分解する。一重項酸素は、通常は光増感剤の照射により光増感剤によって発生する。
【００９９】
化学発光性化合物を含有する組成物に結合されない光増感剤によってつくり出された一重項酸素は減衰（ｔ1/2は水中で約２マイクロ秒である）を受ける前に化学発光性化合物に到達できない。化学発光性化合物を含有する組成物に結合するようになる光増感剤を含有する組成物は一重項酸素をつくり出し、これが化学発光性化合物と反応する。それはこのようにすると光増感剤と化学発光性化合物との間に実現された短い距離をこのような一重項酸素が存続できるようになるからである。
【０１００】
距離の短縮は試料中に被検物質が存在する結果起こる。一重項酸素が移動する距離の一部分は有機媒質経由がよく、この媒質中で一重項酸素ははるかに長い寿命、即ち約１００マイクロ秒より長い寿命、をもつ。被検物質は光増感剤を含有する組成物と化学発光性化合物を含有する組成物との間の結合を調節しなければならない。通常は、化学発光性化合物および光増感剤の少なくとも一つは表面、とりわけその表面が懸濁性粒子からなる場合の表面と関わりをもつ。
【０１０１】
光増感剤とごく接近して化学発光性化合物の一重項酸素励起を含む上記方法は、前記Ｍｃ Ｃａｐｒａの方法と区別すべきである。Ｍｃ Ｃａｐｒａの特許出願明細書４頁３８−４６行に失活形式で行なう検定法が記載されている。Ｍｃ
Ｃａｐｒａの検定法は、増感剤を抱合させた特異的結合物質および被検物質の複合体と特異的に結合しうる反応体を利用して増感剤抱合体−反応体複合体を形成させるものである。失活部分は反応体に付けられる。
【０１０２】
増感剤にきわめて接近させたとき、その失活部分は結合した増感剤の励起の結果として生ずる信号を減少あるいは失活させるか、あるいは励起された増感剤に対する電子またはエネルギーの中間体化学種（即ち、分子状酸素またはロイコ染料）への移動を減少あるいは失活させる。この失活形式で被検物質の存在は減衰しつつあるジオキセタンのルミネッセンスと関係づけられる。このようにして、Ｍｃ Ｃａｐｒａは上記米国特許第４，２２０，４５０号および第４，２７７，４３７号明細書を引用している。
【０１０３】
Ｍｃ Ｃａｐｒａにより記述されたこの失活検定法形式は励起された増感剤の失活のみを含み、特異的結合構成要素と関連する化学発光性化合物の一重項酸素による活性化を包含しない。
【０１０４】
更にまたＭｃ Ｃａｐｒａ １４頁３５〜３６行には、化学発光性部分からのエネルギー移動でポリヌクレオチドプローブ検定における増感剤を励起させることが記載されている。Ｍｃ Ｃａｐｒａによるこの記述は完全に本発明から区別される。即ち、本発明は存在する被検物質によって光増感剤と化学発光性化合物とを互にきわめて接近させる方法であり、そこで励起された光増感剤が一重項酸素をつくり出し、次にこれが化学発光性化合物を活性化するのである。
【０１０５】
本発明のもう一つの面においては、光化学的に活性化されて発光性生成物になりうる物質群を標識として使用する。この物質群は特異的結合対の一構成要素と関連し、そしてこの試薬は被検物質の検出のための検定において標識試薬として利用される。光化学的活性化は前記物質群を光で照射するか、あるいは一重項と物質群との反応により達成できる。なるべくは、活性化が一重項酸素による場合増感剤を用いて光活性化を促進するのがよい。通常は増感剤が光を吸収し、このようにして形成された励起増感剤が酸素を活性化し、一重項酸素が標識と反応して準安定発光性中間体を与える。
【０１０６】
標識として用いる物質群は増感によってあるいは増感なしに光活性化を受ける化学発光性化合物のいずれをも包含し、なるべくは一重項酸素との反応により活性化される物質群である。本発明に係る標識は被検物質を定量するための均質および不均質両方の検定実験計画に使用できる。増感剤およびエネルギー受容体があってもなくても化学発光性化合物を活性化するために化学的試薬を添加する必要がないことが望ましい。
【０１０７】
均質実験計画案においては全試薬を合わせ、媒質を照射して化学発光性化合物を活性化する。
【０１０８】
この検定実験計画案においては、成分をコンビネーションとして提供し、増感剤による酸素の活性化の関数として生じた光は被検物質濃度の関数であろう。本発明方法は光を発生させるのに媒質を加熱せずに実施できるのが有利な点である。従って、本発明検定法は一定温度で行なうことができる。
【０１０９】
本発明の特別な具体例についての説明を更に続ける前に、幾つかの用語を定義し、詳細に説明することにする。
【０１１０】
被検物質−−検出すべき化合物または組成物。被検物質は特異的結合対（ｓｂｐ）の一構成要素からなることができ、そしてリガンド（これは一価（モノエピトープ）または多価（ポリエピトープ）で、通常は抗原またはハプテンである）のこともあり、また少なくとも一つの共通したエピトープ部位かデテルミナント部位を共有する単一化合物または複数の化合物である。
【０１１１】
被検物質は細胞、例えば細菌の部分、あるいは血液型抗原、例えばＡ，Ｂ，Ｄなどを有する細胞の部分、あるいはＨＬＡ抗原あるいは微生物、例えば細菌、真菌、原虫、またはウイルスのこともある。
【０１１２】
多価リガンド被検物質は通常はポリ（アミノ酸）、即ちポリぺプチドおよびタンパク質、多糖類、核酸、およびこれらのコンビネーションである。このようなコンビネーションには細菌、ウイルス、クロモソーム、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの成分が含まれる。
【０１１３】
大抵の場合、本発明検定法を適用できるポリエピトープリガンド被検物質は、少なくとも約５，０００、もっと一般的には少なくとも約１０，０００の分子量を有するであろう。ポリ（アミノ酸）のカテゴリー中対象となるポリ（アミノ酸）は一般に分子量約５，０００から５，０００，０００、更に普通には分子量約２０，０００から１，０００，０００であろう。対象となるホルモンのうち、その分子量は約５，０００から６０，０００に及ぶのが普通である。
【０１１４】
多種多様なタンパク質が同様な構造上の特徴をもつタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特定の微生物、とりわけ病原性微生物に関係あるタンパク質の仲間に関して考慮される。このようなタンパク質には、例えば、免疫グロブリン、シトキン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー、組織特異性抗原などが含まれる。
【０１１５】
下記は構造により関係づけられるタンパク質の分類である。
プロタミン
ヒストン
アルブミン
グロブリン
硬タンパク質
リンタンパク質
ムコタンパク質
【０１１６】
色素タンパク質
リポタンパク質
核タンパク質
糖タンパク質
Ｔ−細胞受容体
プロテオグリカン
ＨＬＡ
分類に入らないタンパク質、例えばソマトトロピン、プロラクチン、シンシ
ュリン、ペプシン。
【０１１７】
ヒト血漿中に見出される幾つかのタンパク質は臨床的に重要であり、それらには下記のものが包含される。
【０１１８】
プレアルブミン
アルブミン
α1−リポタンパク質
α1−アンチトリプシン
α1−糖タンパク質
【０１１９】
トランスコルチン
４．６Ｓ−ポストアルブミン
貧トリプトファンα1−糖タンパク質
α1Ｘ−糖タンパク質
チロキシン結合グロブリン
インター−α−トリプシン−阻害物質
【０１２０】
Ｇｃ−グロブリン
（Ｇｃ１−１）
（Ｇｃ２−１）
（Ｇｃ２−２）
【０１２１】
ハプトグロブリン
（Ｈｐ１−１）
（Ｈｐ２−１）
（Ｈｐ２−２）
【０１２２】
セルロプラスミン
コリンエステラーゼ
α2−リポタンパク質（複数）
ミオグロビン
Ｃ−反応性タンパク質
【０１２３】
α2−マクログロブリン
α2−ＨＳ−糖タンパク質
Ｚｎ−α2−糖タンパク質
α2−ニューラミノ−糖タンパク質
エリトロポイエチン
β−リポタンパク質
【０１２４】
トランスフェリン
ヘモペキシン
フィブリノゲン
プラスミノゲン
β2−グリコプロティンＩ
β2−グリコプロティンＩＩ
免疫グロブリンＧ
【０１２５】
（ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン
分子式：
γ2κ2またはγ2λ2
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）
またはγＡ−グロブリン
分子式：
（α2κ2）nまたは（α2κ2）n
免疫グロブリンＭ
（ＩｇＭ）またはγＭ−グロブリン
分子式：
（μ2κ2）5または（μ2λ2）5
免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）
またはγＤ−グロブリン（γＤ）
分子式：
（δ2κ2）または（δ2λ2）
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）
またはγＥ−グロブリン（γＥ）
分子式：
（ε2κ2）または（ε2λ2）
自由κおよびλ軽鎖
補体因子：
Ｃ′１
Ｃ′１ｑ
Ｃ′１ｒ
Ｃ′１ｓ
Ｃ′２
Ｃ′３
β1 A
α2Ｄ
Ｃ′４
Ｃ′５
Ｃ′６
Ｃ′７
Ｃ′８
Ｃ′９
重要な血液凝固因子には下記のものが含まれる：
【表１】
重要なタンパク質ホルモンには下記のものが含まれる：
ぺプチドおよびタンパク質ホルモン
パラチロイドホルモン
（パラトロモン）
チロカルシトニン
インシュリン
グルカゴン
【０１２７】
リラキシン
エリトロポィエチン
メラノトロピン
（メラニン細胞刺激ホルモン：インターメジン）
ソマトトロピン
（成長ホルモン）
【０１２８】
コルチコトロピン
（副腎皮質刺激ホルモン）
チロトロピン
濾胞刺激ホルモン
黄体形成ホルモン
（間質細胞刺激ホルモン）
ルテオマモトロピックホルモン
（ルテオトロピン、プロラクチン）
ゴナドトロピン
（絨毛性性腺刺激ホルモン）
【０１２９】
組織ホルモン
セクレチン
ガストリン
アンギオテンシンＩおよびＩＩ
ブラジキニン
ヒト胎盤性ラクトゲン
【０１３０】
シトキン
ＩＬ Ｉ
ＩＬ ＩＩ
ＩＬ ＶＩ
ＥＧＦ
ＴＮＦ
ＮＧＦ
【０１３１】
癌抗原
ＰＳＡ
ＣＥＡ
ａ−フェトプロテイン
酸ホスファターゼ
ＣＡ１９．９
ＣＡ１２５
【０１３２】
組織特異的抗原
アルカリ性ホスファターゼ
ミオグロビン
ＣＰＫ−ＭＢ
カルシトニン
ミエリン塩基性タンパク質
【０１３３】
神経下垂体から生ずるぺプチドホルモン
オキシトシン
バソプレッシン
終結因子（ＲＦ）
【０１３４】
ＣＲＦ，ＬＲＦ，ＴＲＦ，ソマトトロピン−ＲＦ，ＧＲＦ，ＦＳＨ−ＲＦ，ＰＩＦ，ＭＩＦ
【０１３５】
対象となる他の重合体物質はムコ多糖類と多糖類である。
【０１３６】
代表的微生物には次のものが包含される：
【表２】
モノエピトープリガンド被検物質は、一般に分子量約１００から２，０００、より普通には分子量１２５から１，０００であろう。これら被検物質の例として薬物、代謝生成物、有害生物防除剤、汚染物質などがあげられる。分析対象となる薬物にアルカロイドが含まれる。アルカロイドの中にはモルヒネ系アルカロイド、例えばモルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、これらの誘導体および代謝生成物；コカイン系アルカロイド、例えばコカインおよびベンジルエクゴニン、それらの誘導体および代謝生成物；麦角アルカロイド、例えばリセルグ酸のジエチルアミド；ステロイドアルカロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリンアルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キノリンアルカロイド；例えばキニーネおよびキニジン；ジテルペンアルカロイド、それらの誘導体および代謝生成物がある。
【０１３８】
薬物の次の群にはステロイド類、例えば、エストロゲン、アンドロゲン、アンドレオコルチカルステロイド、胆汁酸、強心性配糖体およびアグリコン類、例えば、ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニン、それらの誘導体および代謝生成物が包含される。また、擬ステロイド物質、例えばジエチルスチルベストロールも含まれる。
【０１３９】
薬物の次の群は５から６環員を有するラクタム類、例えばバルビツール酸誘導体、例えばフェノバルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれらの代謝生成物である。
【０１４０】
薬物の次の群は２から３炭素原子を有するアミノアルキルベンゼン類、例えばアンフェタミン；カテコールアミン、例えばエフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリン、および上記物質の代謝生成物である。
【０１４１】
薬物の次の群はベンズ複素環化合物で、それらにはオキサゼパム、クロロプロマジン、テグレトール、それらの誘導体および代謝生成物が含まれる。上記複素環はアゼピン類、ジアゼピン類およびフエノチアジン類である。
【０１４２】
薬物の次の群はプリン類、例えばテオフィリン、カフェイン、それらの代謝生成物および誘導体である。
薬物の次の群には***から誘導されるもの、例えばカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールが含まれる。
【０１４３】
薬物の次の群はホルモン類、例えばチロキシン、コルチゾル、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジオール、エストロン、プロゲストロン、ポリぺプチド、例えばアンギオテンシン、ＬＨＲＨ、および免疫抑制物質、例えばシクロスポリン、ＦＫ５０６、マイコフェノール酸などである。
【０１４４】
薬物の次の群にはビタミン類、例えばＡ、Ｂ、例えばＢ12、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、サイアミンが含まれる。
薬物の次の群はプロスタグランジン類であり、これらはヒドロキシル化および不飽和の程度と部位によって異なる。
【０１４５】
薬物の次の群は三環式抗うつ剤、例えばイミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン、クロミプラミン、ドキセピン、およびデスメチルドキセピンである。
【０１４６】
薬物の次の群は抗新生物剤、例えばメトトレキセートである。
薬物の次の群は抗生物質、例えばペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、その代謝生成物と誘導体である。
【０１４７】
薬物の次の群はヌクレオシドおよびヌクレオチドで、それらにはＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジン（適当な糖およびリン酸置換基をもつ）が含まれる。
【０１４８】
薬物の次の群は種々雑多な個々の薬物で、それらにはメタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロン酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、クロラムフェニコール、抗コリン作動薬、例えばアトロピン、それらの代謝生成物および誘導体が含まれる。
【０１４９】
罹患状態に関係する代謝生成物にはスペルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸、およびポルフィリン１型が含まれる。
【０１５０】
薬物の次の群はアミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およびアミカシンである。
対象となる有害生物防除剤にはポリハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハロゲン化スルフェンアミド、それらの代謝生成物および誘導体がある。
【０１５１】
受容体被検物質に対する分子量は一般に１０，０００から２×１０8、更に普通には１０，０００から１０6であろう。免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭに対する分子量は一般に約１６０，０００から約１０6を変化するであろう。酵素の分子量は一般に約１０，０００から１，０００，０００にわたるであろう。
【０１５２】
天然の受容体は多種多様であり、例えばアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランスコルチンなどを含めて、分子量は一般に少なくとも約２５，０００であり、分子量１０6以上のこともある。
【０１５３】
被検物質という用語は更にポリヌクレオチド被検物質、例えば下に定義されているポリヌクレオチドを包含する。これらにはｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ｔ−ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ二重らせんなどが含まれる。被検物質という用語はまたポリヌクレオチド結合剤である受容体、例えば制限酵素、活性化物質、抑制因子、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵素、化学療法剤などをも包含する。
【０１５４】
被検物質は宿主から得た体液のような試料中に直接見出される分子のことがある。この試料は直接検査することができるが、あるいは被検物質を一層容易に検出できるようにするため前処理することもある。更にまた、対象とする被検物質の証明となる作用因子、例えば対象被検物質に対して相補的な特異的結合対の構成要素（対象被検物質が試料中に存在するときにのみその存在が検出されるもの）を検出することによって定量することもできる。従って、被検物質の証明となる作用因子は、検定で検出される被検物質となる。
【０１５５】
体液は例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、***、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液などでよい。
【０１５６】
特異的結合対の構成要素（「ｓｂｐメンバー」）−−二つの異なる分子の一方のことで、他の分子の特別な場所の極性組織に特異的に結合し、そのため後者と相補的であると定義される表面上あるいは空洞の中に或る領域を有する分子。特異的結合対の構成要素を指してリガンドおよび受容体（アンチリガンド）という。これらは通常は抗原−抗体のように免疫学的な対の構成要素であるが、他の特異的結合対、例えばビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二重らせん、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、ポリヌクレオチド対、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどは免疫学的対ではないけれども、本発明ならびにｓｂｐ構成要素の定義に包含される。
【０１５７】
ポリヌクレオチド−−自然の状態で約５０から５００，０００個以上のヌクレオチドを有し、また単離された状態で約１５から５０，０００個以上のヌクレオチド、通常は約１５から２０，０００個のヌクレオチド、更にしばしば１５から１０，０００個のヌクレオチドを有する重合体ヌクレオチドである化合物あるいは組成物。
【０１５８】
ポリヌクレオチドには天然に存在するか合成的につくられた精製または未精製の形にあるいずれかの給源から得られる核酸、例えばＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、通常はＤＮＡが包含され、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはその混合物、遺伝子、クロモソーム、プラスミド、生物学的材料、例えば微生物、例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、かび、真菌、植物、動物、ヒトおよびその部分などのゲノムでよい。
【０１５９】
リガンド−−それに対する受容体が天然に存在するか、あるいは調製することのできる有機化合物。
【０１６０】
リガンド類縁体−−修飾されたリガンド、普通１００より大きい分子量を有する有機残基あるいは被検物質類縁体、同様なリガンドと受容体の競合できる。修飾はリガンド類縁体を別の分子の結合する手段を提供する。
【０１６１】
リガンド類縁体は、リガンド類縁体をある中心あるいは標識へつなぐ結合による水素の置き換えにより、リガンドと異なるのが普通であるが、必要ではない。リガンド類縁体はリガンドと同様の仕方で受容体に結合できる。この類縁体は、例えばそのリガンドに対する抗体のイデイオタイプに対して指向する抗体でありうる。
【０１６２】
受容体（「アンチリガンド」）−−ある分子の特別な場所の極性組織、例えばエピトープ部位またはデテルミナント部位、を認識しうる化合物または組成物。代表的受容体には天然に生ずる受容体、例えばチロキシン結合性グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、タンパク質Ａ、相補的成分Ｃ１ｑなどが含まれる。
【０１６３】
特異的結合−−二つの異なる分子のうちの一つが他の分子を特異的に認識することで、これは別の分子の認識が相当に弱いのと比較して特別に強い。一般に、分子はその表面上にあるいは空洞中に二つの分子間の特異的認識を生ずる領域をもつ。特異的結合の例示は抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用などである。
【０１６４】
非特異的結合−特別な表面構造に比較的依存しない分子間の非共有結合。非特異的結合は分子間の疎水的相互作用を含めて幾つかの因子から生じうる。
【０１６５】
抗体−−別の分子の特別な場所の極性組織に対して特異的に結合し、そのため後者と相補的てあると定義される免疫グロブリン。抗体はモノクローンでもポリクローンでもよく、そしてこの分野でよく知られる技術により、例えば宿主の免疫化と血清の収集（ポリクローン）により、あるいは連続したハイブリッド細胞系をつくり分泌されたタンパク質（モノクローン）を収集することにより、あるいは天然抗体の特異的結合に要求されるアミノ酸順序に対して少なくともコード化するヌクレオチド配列あるいはその変異誘発させた変異種をクローン化し、発現させることによりつくりうる。
【０１６６】
抗体は完全な免疫グロブリンあるいはそのフラグメントを包含し、この免疫グロブリンには種々な分類およびイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３、ＩｇＭなどが含まれる。そのフラグメントはＦａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′などを含みうる。更に、ある特定分子に対する結合親和性が保たれる限り、必要に応じ免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの集合体、重合体および抱合体を使用できる。
【０１６７】
アルキル−−脂肪族炭化水素から１個のＨ原子を除去することにより誘導される１価の分枝または非分枝残基で、低級アルキルおよび高級アルキルの両方を含む。
【０１６８】
低級アルキル−−１から５炭素原子を含むアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチルなど。
【０１６９】
高級アルキル−−６炭素原子より多く、通常は６から２０炭素原子を含むアルキル、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチルなど。
【０１７０】
アルキリデン−−同じ炭素原子から２個の水素原子を取り去ることにより脂肪族炭化水素から誘導される２価有機基、例えばエチリデン。
【０１７１】
アリール−−芳香族炭化水素から１個の水素原子を取り除くことにより誘導される１個以上の芳香環、通常は１から４個の芳香環を含む有機基、例えばフェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナフタレンから）など。
【０１７２】
アルアルキル−−アリール基が付いたアルキル基をもつ有機基、例えばベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルエチルなど。
【０１７３】
アルコキシ−−酸素原子によって分子の残りに付くアルキル基、例えばメトキシ、エトキシなど。
【０１７４】
アリールオキシ−−酸素原子によって分子の残りにつくアリール基、例えばフェノキシ、ナフトキシなど。
【０１７５】
アルアルコキシ−−酸素原子によって分子の残りに付くアルアルキル基、例えばベンズオキシ、１−ナフチルエトキシなど。
【０１７６】
置換−−ある分子の水素原子を他の原子により置き換えることを意味し、これは１個の原子、例えばハロゲンなどのこともあれば、または１から５０個の原子（このような原子の原子価を満足するのに必要な要求される水素原子のほか）を有する置換基のような官能基を形成する原子団の一部のこともある。前記原子は炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群から独立して選ばれ、１個以上の金属原子に結合することもあればしないこともある。
【０１７７】
アルキルチオ−−硫黄原子によって分子の残りに付くアルキル基、例えばメチルチオ、エチルチオなど。
アリールチオ−−硫黄原子によって分子の残りに付くアリール基、例えばフェニルチオ、ナフチルチオなど。
【０１７８】
電子供与性基−−ある分子に結合したとき、その電子供与基が電子不足となり、分子の他の部分と比較して正に帯電する、即ち電子密度を低下させるように分子を分極させることのできる置換基。このような基の例示としてアミン、エーテル、チオエーテル、ホスフィン、ヒドロキシ、オキシアニオン、メルカプタンおよびそれらの陰イオン、スルフィドなどがあげられるが、これらに制限するのではない。
【０１７９】
１から５０個の原子（このような原子の原子価を満足させるのに必要な水素原子を除く）を有する置換基（これらの原子は炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群から独立して選ばれる）−−有機残基；この有機残基は残基中の原子の原子価を満足させるのに必要な数の水素原子のほかに１から５０個の原子を有する。一般に主要な原子は炭素（Ｃ）であるが、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）でもよく、そしてこれらＯ、Ｎ、Ｓ、またはＰがもし存在するならばこれらは炭素に結合するか、あるいは相互の１個以上にあるいは水素または金属原子に結合して種々な官能基、例えばカルボン酸、アルコール、チオール、カルボキサミド、カルバメート、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、リン酸、リン酸エステル、尿素、カルバメート、ホスホルアミド、スルホンアミド、エーテル、スルフィド、チオエーテル、オレフィン、アセチレン、アミン、ケトン、アルデヒド、ニトリルなどを形成する。
【０１８０】
このような有機残基または基の代表例としてアルキル、アルキリデン、アリール、アルアルキル、ならびに上記官能基の１個以上で置換されたアルキル、アリールおよびアルアルキルがあるが、これらは例示のためにあげたのであって制限ではない。
【０１８１】
連結基−−分子間の共有結合。連結基は結ばれる分子、即ち光増感剤、化学発光性化合物、ｓｂｐ構成要素あるいは粒子とまたはその一部分と関連する分子の性質によって変化するであろう。通常は存在する官能基あるいは光増感剤や化学発光性化合物に導入される官能基がこれらの物質をｓｂｐ構成要素にあるいは粒子、例えばリポソームの親油性成分または油滴、ラテックス粒子、ケイ素粒子、金属ゾルまたは染料微結晶に結びつけるために使用される。
【０１８２】
大抵の場合、カルボニル官能基、即ちオキソカルボニル、例えばアルデヒドおよび非オキソカルボニル（窒素および硫黄類縁体を含む）、例えばカルボキシ、アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチオノカルボキシ、の両方が使用される。
【０１８３】
オキソの別の官能基には活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、オレフィン、特別に活性化されたオレフィン、アミノ、ホスホロなどが含まれる。連結基の説明は米国特許第３，８１７，８３７号明細書中に見ることができ、参考のためその開示を本明細書中に取り入れている。
【０１８４】
連結基は１本の結合から、１から１００個の原子、通常は約１から７０原子、なるべくは１から５０原子、更に好ましくは１から２０原子の連鎖までを変化し、各々は通常炭素、酸素、硫黄、窒素およびリンからなる群から独立して選ばれる。連結基中のヘテロ原子の数は、普通には約０から２０個、通常は約１から１５個、更に好ましくは２から６個にわたるであろう。
【０１８５】
鎖中の原子は、１から５０原子を有する置換基に対して説明した仕方と同様にして水素以外の原子で置換することができる。一般則として、特定の連結基の長さは合成の便利さおよびエネルギー受容体、発蛍光団、重金属のような項間交差の解析に対する基の導入が得られるよう任意に選ぶことができる。これら連結基は脂肪族でも芳香族でもよいがジアゾ基については芳香族基が通常含まれる。
【０１８６】
へテロ原子が存在する場合、酸素は通常オキソまたはオキシとして炭素、硫黄、窒素またはリンに結合して存在し、窒素は通常はニトロ、ニトロソまたはアミノとして通常は炭素、酸素、硫黄またはリンに結合して存在し、硫黄は酸素と類似しているが、リンは通常はホスホネートおよびホスフェートモノエステルまたはジエステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合するであろう。
【０１８７】
連結基と抱合させるべき分子との間に共有結合をつくる際の共通の官能基はアルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテルおよびカルボキシレート、スルホネート、およびホスフェートエステル、アミドおよびチオエステルである。
【０１８８】
大抵の場合、光増感剤および化学発光性化合物は非オキソカルボニル基、例えば窒素および硫黄類縁体、ホスフェート基、アミノ基、アルキル化剤、例えばハロアルキルまたはトシルアルキル、オキシ（ヒドロキシルまたは硫黄類縁体、メルカプト）、オキソカルボニル（例えばアルデヒドまたはケトン）、または活性オレフィン、例えばビニルスルホンあるいはα，β−不飽和エステルを有するであろう。これら官能基はアミン基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えばブロモアセチルにつながるであろう。アミンおよびカルボン酸あるいはその窒素誘導体またはリン酸がつながると、アミド、アミジンおよびホスホルアミドが形成されるであろう。メルカプタンおよび活性化オレフィンが連結されるとチオエーテルが形成されるであろう。
【０１８９】
メルカプタンおよびアルキル化剤がつながるとチオエーテルが生ずるであろう。還元的条件下でアルデヒドとアミンがつながるとアルキルアミンが生成されるであろう。カルボン酸またはリン酸とアルコールが結合するとエステルを生ずるであろう。
【０１９０】
親水性あるいは水溶性を付与する基または官能基−−これは親水性官能基であり、水による固体の濡れおよび基が結合する化合物の水溶性を増加させる。
【０１９１】
このような官能基あるいは機能性基は１から５０個またはそれ以上の原子を有する置換基でよく、そしてスルホネート、サルフェート、ホスフェート、アミジン、ホスホネート、カルボキシレート、ヒドロキシル、とりわけポリオール、アミン、エーテル、アミドなどを含みうる。代表的な官能基はカルボキシアルキル、スルホンオキシアルキル、ＣＯＮＨＯＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＯ−（グルコサミン）、糖、デキストラン、シクロデキストリン、ＳＯ2ＮＨＣＨ2ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ＯＰＯ3Ｈ2、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトンおよびそのコンビネーションを包含しうる。上記官能基の大抵のものは、光増感剤または化学発光性化合物をｓｂｐ構成要素あるいは支持体に付着させる付着基としても利用できる。
【０１９２】
親油性あるいは脂溶性を付与する基または官能基−−これは親油性官能基で、水による表面の濡れおよび基を結合させる化合物の水溶性を減少させる。このような官能基または機能性基は１から５０個またはそれ以上の原子、通常は水素またはハロゲンで置換された炭素原子を含むことができ、そしてアルキル、アルキリデン、アリールおよびアルアルキルを包含しうる。
【０１９３】
この親油基または機能性基は通常は少なくとも６炭素原子、更に普通には少なくとも１０炭素原子、そしてなるべくは少なくとも１２炭素原子、通常は３０炭素原子以下を有する１から６個の直鎖または分枝鎖脂肪族基を有するであろう。この脂肪族基は５から６員の環に結合することができ、そして後者は脂環式、複素環式、または芳香族のいずれでもよい。
【０１９４】
光増感剤−−通常は光で励起することにより一重項酸素を発生させるための増感剤。光増感剤は光活性化性（例えば染料および芳香族化合物）でも化学活性化性（例えば、酵素および金属塩）でもよい。光で励起したとき光増感剤は通常は共有結合した原子からなる化合物であり、多数の共役二重結合または三重結合を有するのが普通である。この化合物は２００−１１００ｎｍ、普通は３００−１０００ｎｍ、なるべくは４５０−９５０ｎｍの波長範囲の光を吸収すべきであり、吸収極大における吸光係数は励起波長において５００Ｍ-1ｃｍ-1より大、なるべくは少なくとも５０００Ｍ-1ｃｍ-1、更に好ましくは少なくとも５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1であるのがよい。
【０１９５】
酸素の存在しない状態で光吸収後に生ずる励起状態の寿命は少なくとも１００ナノ秒であるのが普通であり、なるべくは少なくとも１ミリ秒がよい。一般にこの寿命は、媒質により１０-5から１０-3Ｍの範囲内の濃度で通常存在する酸素に対して、エネルギーを移動させるのに十分長くなければならない。増感剤の励起状態はその基底状態とは異なるスピン量子数（Ｓ）を有するのが普通であり、通常は、これが普通の場合であるが、基底状態が一重項（Ｓ＝０）であるとき三重項（Ｓ＝１）であろう。
【０１９６】
増感剤は高い項間交差収率を有するのがよい。即ち、増感剤の光励起は少なくとも１０％、望ましくは少なくとも４０％、なるべくは８０％より大きい効率で長寿命状態（通常は三重項）を生ずる。光増感剤は検定条件下でせいぜい弱く蛍光性を示すのが普通である（量子収率は通常は０．５未満、なるべくは０．１未満がよい）。
【０１９７】
光により励起させようとする光増感剤は比較的光安定性があり、一重項酸素と効率よく反応しない。大抵の有用な増感剤には幾つかの構造上の特徴がある。大抵の増感剤は堅固な構造、しばしば芳香族構造、に保持された少なくとも１個、しばしば３個以上の共役二重結合または三重結合を有する。
【０１９８】
それらはしばしば項間交差を促進する少なくとも１個の基、例えばカルボニルまたはイミン基または周期表第３列〜第６列から選ばれる重原子、とりわけヨウ素または臭素を含むか、あるいは拡張された芳香族構造を有しうる。典型的な増感剤にはアセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、９，１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、メタロ−ポルフィリン、例えばヘマトポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフラーレンなど、およびこれら化合物を一層親油性にするかまたは一層親水性にするための、そして（または）例えばｓｂｐ構成要素へ付着させるための付着基として１から５０原子の置換基を有する上記化合物の誘導体が包含される。
【０１９９】
本発明検定法に利用できる他の光増感剤の例は、上記性質を有するもので、Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｒｏ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１３２頁、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ．Ｉｎｃ．，ニューヨーク、１９６５に列挙されているものである。
【０２００】
光増感剤は、それを油滴、リポソーム、ラテックス粒子などに添加するとき、親油性成分中への溶解性を確保するため比較的無極性であることが好ましい。
【０２０１】
本発明に役立つ光増感剤は、外部光源による活性化を用いて、あるいは余り好ましくないが、活性化せずに一重項酸素を生成しうる他の物質および組成物を含めることも企図されている。このようにして、例えばモリブデン酸塩（ＭｏＯ4 =）およびクロロペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼ＋臭化物または塩化物イオン（Ｋａｎｏｂｓｋｙ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５９ ５５９６）は過酸化水素から一重項酸素と水への変換を触媒することが示された。
【０２０２】
これら組成物のいずれかを、例えばｓｂｐ構成要素を結合させる粒子に含めて、過酸化水素を補助試薬として加え、クロロペルオキシダーゼを表面に結合させそしてモリブデン酸塩をリポソームの水相中に添加するという検定法に使用できる。また光増感剤として本当の増感剤ではないが熱、光または化学的活性化により励起させたとき一重項酸素の分子を放出する化合物があることも本発明の範囲内に含められる。
【０２０３】
この部類の化合物のうち最もよく知られたものにはエンドペルオキシド、例えば１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシドおよび５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン−５，１２−エンドペルオキシドが含まれる。これら化合物の加熱あるいはこれらによる直接の光吸収は一重項酸素を放出する。
【０２０４】
支持体あるいは表面−−多孔質または非多孔質の水不溶性材料からなる表面。この表面は幾つかの形状、例えばストリップ、棒、粒子（ビーズを含む）などのいずれか一つをとりうる。この表面は親水性でもよいし、あるいは親水性を与えることもでき、そして無機粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ；天然重合体材料、とりわけセルロース性材料およびセルロースから誘導される材料、例えば繊維含有紙類、例えば濾紙、クロマトグラフィー用紙など；合成または変性した天然産生重合体、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）などが包含される。これらはそれ自身を使用するか、あるいは他の材料、Ｂｉｏｇｌａｓｓとして入手できるガラス、セラミックス、金属などと共に使用される。
【０２０５】
天然または合成の構成体、例えばリポソーム、リン脂質小胞、および細胞体も使用できる。
【０２０６】
支持体あるいは表面へのｓｂｐ構成要素の結合は、文献で普通に入手できるよく知られた技術により達成できる。例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７８）およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。
【０２０７】
表面は通常は多官能性か、多官能性にすることができるか、あるいは特異的または非特異的共有または非共有相互作用を通して、オリゴヌクレオチド、ｓｂｐ構成要素、光増感剤、および（または）化学発光性化合物を結合しうるかであろう。多種多様な官能基を利用でき、あるいは取り入れることができる。官能基の例としてカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などがあげられる。多種多様な化合物を表面に連結させる方法は公知であり、文献に豊富に例示されている。
【０２０８】
例えばＣａｕｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４５，３０５９（１９７０）参照。オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐ構成要素に対する連結基の長さは結合される化合物の性質、結合される化合物と特異的結合性をもつ表面との間の距離の影響などにより広く変化しうる。
【０２０９】
粒子−−少なくとも約２０ｎｍそして約２０ミクロン以下、通常は少なくとも約４０ｎｍそして約１０ミクロン未満、なるべくは直径約０．１０から２．０ミクロン、そして通常は１ピコリットル未満の体積を有する粒子。この粒子は有機または無機性、膨潤可能または非膨潤性、多孔性または非多孔性で、密度はいずれでもよいが、なるべくは水に近似する一般に約０．７から約１．５ｇ／ｍｌの密度がよく、なるべくは水に懸濁可能で、透明、部分的に透明、または不透明な材料から構成できる。
【０２１０】
粒子は電荷をもつことももたないこともあるが、もしそれらが帯電しているときはなるべく負に帯電するのがよい。粒子は固体（例えば、重合体、金属、ガラス、有機および無機物、例えば鉱物質、塩およびけいそう）、油滴（例えば炭化水素、過フッ化炭化水素、液体シリコーン）、または小胞（例えば、合成、例えばリン脂質または天然、例えば細胞およびオルガネル）のいずれでもよい。
【０２１１】
粒子はラテックス粒子または有機または無機重合体から構成された他の粒子；脂質二重層、例えばリポソーム、リン脂質小胞；油滴；ケイ素粒子；金属ゾル；細胞；および染料微結晶のいずれでもよい。
【０２１２】
有機粒子は通常は重合体（付加重合体か縮合重合体のいずれか）であり、検定媒質中に容易に分散しうるものである。有機粒子はまたその表面に直接か間接的にｓｂｐ構成要素を結合するように、また光増感剤あるいは化学発光性化合物をその表面に結合するように、あるいはその体積内に取り込むように吸着性をもつかそのように機能化しうるであろう。
【０２１３】
これら粒子は天然に生ずる材料、合成的に修飾された天然材料、および合成材料から誘導できる。天然または合成集成体、例えば脂質二重層、例えばリポソームおよび非リン脂質小胞が特によい。特に関心をもたれる有機重合体には多糖類、とりわけ架橋多糖類、例えばアガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして入手可能）、デキストラン（ＳｅｐｈａｄｅｘおよびＳｅｐｈａｃｒｙｌとして入手可能）、セルロース、デンプンなど；付加重合体、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリレートおよびメタクリレートの誘導体のホモポリマーおよび共重合体、とりわけヒドロゲルを含めて遊離ヒドロキシル官能基を有するエステル類およびアミド類などがある。無機重合体はシリコーン、ガラス（Ｂｉｏｇｌａｓとして入手可能）などを包含する。ゾルには金、セレン、および他の金属が含まれる。
【０２１４】
粒子はまた光増感剤としても作用しうる分散水不溶性染料、例えばポルフィリン、フタロシアニンなどでもよい。粒子はまたけいそう、細胞、ウィルス粒子、マグネトソーム、細胞核なども包含する。
【０２１５】
粒子が市販されているものである場合、その粒径はより大きい粒子を粉砕、超音波処理、かきまぜなどといった機械的手段によって小さい粒子に破壊することにより変えることができる。
【０２１６】
粒子は多官能性かまたは多官能性化することができ、あるいはｓｂｐ構成要素、光増感剤、または化学発光性化合物に対し特異的または非特異的共有または非共有相互作用を通して結合させることができるのが普通である。多種多様な官能基を利用でき、あるいは取り入れることができる。典型的な官能基にはカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが包含される。
【０２１７】
粒子に対してｓｂｐ構成要素、化学発光性化合物または光増感剤を共有結合によって付ける方法を用いる場合、その連結の仕方は公知であり、文献に詳細に例示されている。例えば、Ｃａｕｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）参照。連結基の長さは連結される化合物の性質、粒子の性質、連結される化合物と粒子との間の距離がｓｂｐ構成要素の結合に及ぼす影響および被検物質などによって広く変化しうる。
【０２１８】
光増感剤および（または）化学発光性化合物は粒子の表面に溶けるかまたは表面に対し非共有結合的に結合するように選ぶことができる。この場合これら化合物は、粒子から解離する能力を減少させそれによって両方の化合物を同じ粒子と関連させるように、なるべくは疎水性であるのがよい。
【０２１９】
これは多分光増感剤か化学発光性化合物のいずれかと関連させる唯一の組成の粒子を利用するか、または光増感剤と一つの型の粒子との会合をまた化学発光性化合物と他の型の粒子との会合を有利にするように組成の異なる二つの型の粒子を用いることにより更に減らすことができるであろう。
【０２２０】
各粒子と関連する光増感剤または化学発光性分子の数は平均して通常は少なくとも１であり、粒子がすっかり光増感剤または化学発光剤分子から成り立つ程十分高くてもよい。特に適当な分子数は検定て信号対バックグランドを最高にするように経験的に選ばれるであろう。
【０２２１】
ある場合には、多数の異なる光増感剤分子を粒子と共同させることによりこれをなし遂げるのが最も良い。通常は粒子中の光増感剤または化学発光性化合物対ｓｂｐ構成要素の比は少なくとも１とすべきであるが、なるべくは少なくとも１００対１、最も好ましくは１，０００対１以上である。
【０２２２】
油滴−−これは乳化剤で被覆され安定化された親油性化合物からなる液体粒子で、前記乳化剤は、例えばリン脂質、スフィンゴミエリン、アルブミンなどといった両親媒性分子である。
【０２２３】
リン脂質は脂肪族ポリオールの脂肪酸カルボン酸エステルを基本とし、少なくとも１個のヒドロキシル基は約８から３６、更に普通には約１０から２０炭素原子のカルボン酸エステルで置換される。前記カルボン酸エステルはエチレン性不飽和部位０から３個、もっと普通な場合は０から１個を有し、そして少なくとも１個、通常はただ１個だけのヒドロキシル基がホスフェートで置換されてリン酸エステルを形成する。このホスフェート基は、一般にヒドロキシルまたはアミノ基を有する二官能性あるいは多官能性の小さい脂肪族化合物で更に置換されることがある。
【０２２４】
油滴は従来の手順に従い適当な親油性化合物を陰イオン性、陽イオン性または非イオン性の界面活性剤と合わせ（この場合、界面活性剤は混合物の約０．１から５、更に普通には約０．１から２重量％の量で存在する）そして混合物を水性媒質中でかきまぜる、例えば超音波処理あるいは渦巻きを起こさせることにより調製できる。代表的な親油性化合物には炭化水素油、過ハロゲン化炭化水素、例えば過フッ化炭化水素、アルキルフタレート、トリアルキルホスフェート、トリグリセリドなどが含まれる。
【０２２５】
ｓｂｐ構成要素は油滴表面に吸着させるか、あるいは油滴表面の成分に直接または間接的に結合させるのが普通である。ｓｂｐ構成要素は液体粒子の調製中または調製後のいずれかで液粒中に添加できる。ｓｂｐ構成要素は、粒子表面上に存在する分子の約０．５から１００、更に普通には１から９０、しばしば約５から８０そしてなるべくは約５０から１００モルパーセントの量で存在するのが普通である。
【０２２６】
油滴を安定化するために使用できる両親媒性化合物の一覧を次に示すが、これは例示のためであってこれらに制限するのではない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、ジアパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、レシチン、ガラクトセレブロシド、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、ホスファチジルイノシトール、２−トリヘキサデシルアンモニウムエチルアミン、１，３−ビス（オクタデシルホスフェート）−プロパノール、ステアロイルオキシエチレンホスフェート、リン脂質、ジアルキルホスフェート、硫酸ドデシルナトリウム、陽イオン性洗浄剤、陰イオン性洗浄剤、タンパク質、例えばアルブミン、非イオン性洗浄剤など。
【０２２７】
親油性基を有しそして以前に記述されたことのある他の化合物も使用できる。大抵の場合これら化合物はアルキルベンゼン類であり、そして直鎖または分枝鎖の６から２０炭素原子を有するアルキル基（通常はアルキル基の混合体）を有し、またカルボキシル基、ヒドロキシル基、ポリオキシアルキレン基（２から３炭素原子のアルキレン）、カルボン酸基、スルホン酸基、またはアミノ基を有する。
【０２２８】
脂肪族脂肪酸を使用でき、そしてこのものは約１０から３６、更に普通には約１２から２０炭素原子のものが普通である。また、脂肪酸に対して示した炭素原子数の制限を有する脂肪アルコール、同様な炭素数制限をもつ脂肪アミンおよび種々なステロイドも使用できる。
【０２２９】
油滴は過フッ化炭化水素またはシリコーン油（シリコーン粒子）からなることができる。このような油滴は米国特許第４，６３４，６８１号および第４，６１９，９０４号明細書中でＧｉａｅｖｅｒにより述べられている（その開示をそっくり本明細書中に取り入れている）。これら油滴は過フッ化炭化水素またはシリコーン油を水相中に分散させることによりつくられる。
【０２３０】
油滴は少量の選ばれた油（一般にこのような油は市販されている）を大量の水相と共に容器に入れることにより調製される。
【０２３１】
この液体系をかきまぜて乳化を起こさせ次に遠心する。均一相を取り除き、残留油滴を緩衝した水性媒質中に再浮遊させる。油滴を使用する前に上記の遠心およびデカンテーション工程を一回以上繰り返すことができる。
【０２３２】
ｓｂｐ構成要素は幾つかの方法で小滴に結合させることができる。Ｇｉａｅｖｅｒにより説明されている通り、特定のｓｂｐ構成要素、とりわけタンパク質性ｓｂｐ構成要素、は乳化工程に先立ち、またはその後で過剰のｓｂｐ構成要素を水性媒質中に導入することにより小滴上に被覆することができる。過剰のｓｂｐ構成要素を除去するため洗浄工程が望ましい。油を官能基化することによりｓｂｐ構成要素をつなぐための前記官能性が導入される。
【０２３３】
このような官能基は油滴を光増感剤または化学発光性化合物に連結させるために使用することもできる。他方、光増感剤または化学発光性化合物は油滴の油相中に可溶であるように選ばれることが多く、その場合には共有結合されない。油滴が過フッ化炭化水素であるとき、フッ素化された光増感剤または化学発光性化合物は、対応する未フッ素化誘導体より溶け易い場合が多い。
【０２３４】
Ｇａｉｅｖｅｒにより記述された他の油滴も本発明に使用できる。
【０２３５】
リポソーム−−ほぼ球形をした微小ベシクル。これは本発明に用いるのに特に適当な材料の一つである。リポソームは少なくとも約２０ｎｍそして約２０ミクロン以下、通常は少なくとも約４０ｎｍで約１０ミクロン未満の直径をもつ。リポソームの直径は沈降あるいは浮上を制限するように約２ミクロン未満であるのがよい。
【０２３６】
リポソームの外殻はある体積の水または水溶液を包囲する両親媒性二重層からなる。一つより多くの二重層をもつリポソームは多重膜小胞と呼ばれる。唯一つの二重層をもつリポソームは単一膜小胞と呼ばれる。親油性光増感剤または化学発光性化合物を使用する場合には、単一膜小胞よりも大量のこれら物質を取り込む能力があるので、多重膜小胞の方が本発明にとって好ましい。両親媒性二重膜はしばしばリン脂質からなる。
【０２３７】
本発明方法に利用できる粒子を調製するのに用いられるリン脂質はレシチンを含めて天然膜に見出されるどのリン脂質でもまたはリン脂質混合物でもよく、あるいは飽和または不飽和１２−炭素または２４−炭素直鎖脂肪酸の合成グリセリルホスフェートジエステルでもよく、後者の場合、ホスフェートはモノエステルとして、あるいは極性アルコール、例えばエタノールアミン、コリン、イノシトール、セリン、グリセリンなどのエステルとして存在しうる。
【０２３８】
特に適当なリン脂質には下記の化合物が含まれる：Ｌ−α−パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジル−グリセリン（ＰＯＰＧ）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルグリセリン、Ｌ−α（ジオレオイル）−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびＬ−α（ジオレオイル）−ホスファチジルβ−（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシアミド）エタノール（ＤＯＰＥ−ＭＣＣ）。
【０２３９】
二重層中のリン脂質はコレステロールで補うことができ、また他の両親媒性化合物で置き換えることができる。後者の化合物は通常は帯電した極性ヘッド基と通常は２本の直線炭化水素鎖からなる疎水性の部分を有するものである。
【０２４０】
このような置き換え化合物の例にはジアルキルホスフェート、ジアルコキシプロピルホスフェート（これらアルキル基は１２〜２０炭素原子の直鎖をもつ）、Ｎ−〔２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタ−デセニルオキシ）〕−１−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムクロリド（米国特許第４，８９７，３５５号明細書、１９９０年１月３０日発行、に開示されている。これは参考として本明細書中に取り入れている）、スフィンゴミエリン、カルジオリピンなとが含まれる。
【０２４１】
本発明方法に利用されるリポソームは懸濁系を安定化しかつ自然凝集を防止するため高い負電荷密度をもつ。
【０２４２】
本発明方法に用いるためにはリポソームはｓｂｐ構成要素に結合できねばならず、また水相または非水相いずれかと関連した光増感剤または化学発光性化合物を含むことができなければならない。本発明方法に利用されるリポソームは脂質小胞の外面に結合したｓｂｐ構成要素を有するのが普通である。
【０２４３】
リポソームは乾燥リン脂質あるいはリン脂質に代る物質の水溶液中での水和および機械的分散を含めて種々な方法により調製できる。この方法でつくられたリポソームは種々な大きさと組成と挙動を有する。機械的に分散したリポソームの挙動の不均一性および不一致を減らす一つの方法は超音波処理によるものである。このような方法はリポソームの平均寸法を減少させる。
【０２４４】
別法としてリポソーム製造中の最終工程として押し出しを使用できる。米国特許第４，５２９，５６１号明細書は寸法の均一性を改善するため均一な細孔寸法の膜を通して加圧下にリポソームを押し出す方法を開示している。
【０２４５】
脂質二重層中に溶けた疎水性あるいは両親媒性の光増感剤または化学発光性化合物を含有するリポソームの製造は、Ｏｌｓｅｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５５７（９），１９７９により記述された方法を含めて種々な方法で実施できる。簡単に言えば、有機溶媒、例えばクロロホルム中に適当な化合物を含む脂質の混合物を、ガラス容器壁上に薄膜となるまで乾燥させる。この脂質の膜を適当な緩衝液中で振盪または渦巻きを起こさせることにより水和する。
【０２４６】
その後脂質懸濁系を連続的に小さくした細孔寸法（例えば、２．０、１．０、０．８、０．６、０．４および０．２ミクロン）を有する一連のポリカーボネートフィルター膜を通して押し出す。これらフィルターのいずれか、とりわけ最小のフィルターを通して繰り返し濾過することが望ましい。このリポソームは、例えばゲル濾過により、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００のカラムを通すことにより精製できる。
【０２４７】
カラムを緩衝液で溶離しリポソームを集めることができる。冷所に貯蔵すると、この方法によりつくられたリポソームの保存寿命を延長できる。別法として、リポソーム調製後の懸濁液に光増感剤または化学発光性化合物を添加することができる。
【０２４８】
油滴およびリポソームの標識化はしばしば例えば脂質二重層からなる分子にチオールまたはマレイミドまたはビオチン基の封入を含むであろう。次に光増感剤、化学発光性分子またはｓｂｐ構成要素を粒子とこれら物質の一つとの反応により表面へ結合させることができる。即ち、それぞれスルフヒドリル反応性試薬、スルフヒドリル基、またはアビジンに結合される。スルフヒドリル反応性基にはアルキル化試薬、例えばブロモアセトアミドおよびマレイミドが含まれる。
【０２４９】
ｓｂｐ構成要素は弱い疎水性相互作用によりリポソーム粒子の表面に引かれることがあるが、しかしこのような相互作用はインキュベーションおよび洗浄中に出会うせん断力に耐えるには一般に十分でない。前に示したように、例えばＤＯＰＥ−ＭＣＣを用いて官能基化したリポソーム粒子をメルカプタン基で官能基化した選ばれたｓｂｐ構成要素と合わせることによって、前記リポソームへｓｂｐ構成要素を共有結合させることが好ましい。
【０２５０】
例えば、もしｓｂｐ構成要素が抗体であるならば、それをＳ−アセチル−メルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）と反応させ、そして加水分解するとスルフヒドリルで修飾された抗体が得られる。
【０２５１】
ラテックス粒子−−「ラテックス」とは水に懸濁しうる水に溶けない粒状重合体物質で、通常は直径２０ｎｍから２０ｍｍ、更に好ましくは直径１００から１０００ｎｍの粒径を有するものを意味する。ラテックスはしばしば置換ポリエチレン、例えばポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミド−ポリスチレン、アミノ基をもつポリスチレン、ポリ−アクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニルアクリレート共重合体などの場合が多い。スチレンおよびカルボキシル化スチレンまたは他の活性基、例えばアミノ、ヒドロキシル、ハロなどで官能基化したスチレンの非架橋重合体が特に適当である。置換スチレンとジエン類、例えばブタジエンとの共重合体がしばしば使用される。
【０２５２】
光増感剤または化学発光性化合物と本発明方法に用いられるラテックス粒子との結合は、重合による粒子の形成中に添加するものであるが、普通には粒子中への非共有結合的溶解による既成粒子中への取り込みである。通常は化学発光性化合物または増感剤の溶液が使用される。
【０２５３】
利用しうる溶媒には、アルコール類、例えばエタノール、エチレングリコールおよびベンジルアルコール；アミド類、例えばジメチルホルムアミド、ホルムアミ ド、アセトアミドおよびテトラメチル尿素など；スルホキシド類、例えばジメチルスルホキシドおよびスルホラン；およびエーテル類、例えばカルビトール、エチルカルビトール、ジメトキシエタンなど、および水が包含される。粒子が溶解しない高沸点溶媒の使用は高温度の使用を可能にし、粒子中への化合物の溶解を促進するので特に適当である。溶媒は単独で用いても組み合わせて用いてもよい。
【０２５４】
光増感剤を添加するために特に適した溶媒は、それらが本来備えている性質の故に、あるいは粒子に溶けない水のような溶媒中にそれらが溶解しうる能力のため溶媒を後に粒子から除去できる故に、光増感剤の三重項励起状態を失活させないものである。芳香族溶媒が特によく、一般に粒子に溶ける溶媒がよい。粒子中に化学発光性化合物を添加するための溶媒は、それらが本来備えている性質の故に、あるいは粒子から除去できる能力の故に、ルミネセンスを妨害しない溶媒を選ぶべきである。この場合にもしばしば芳香族溶媒が好ましい。典型的な芳香族溶媒にはジブチルフタレート、ベンゾニトリル、ナフトニトリル、ジオクチルテレフタレート、ジクロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベンゼンなどが含まれる。
【０２５５】
光増感剤または化学発光性化合物を粒子に共有結合しようとする場合は別として、通常は電子的に中性の光増感剤または化学発光性化合物を用いるのがよい。選ばれる液体媒質は重合体ビーズを粘着性の現われる点まで軟化しないことが好ましい。特に適当な技術は、光増感剤または化学発光性化合物が少なくとも限られた溶解度しかもたない液体媒質中に選ばれたラテックス粒子を懸濁させることからなる。
【０２５６】
この液体媒質中の光増感剤および化学発光性化合物の濃度は一重項酸素の生成効率が最高で、また媒質中での化学発光性化合物からの発光の量子収率が最高である粒子が得られるように選ぶのがよいが、濃厚でない溶液も時としては好ましいであろう。溶媒中での粒子のひずみあるいは溶解は粒子が不溶である混和性共溶媒を加えることにより防止できる。
【０２５７】
一般に、この手順の間に用いる温度は、光増感剤標識粒子の一重項酸素形成能力および化学発光性化合物粒子の量子収率を最大にするように選ばれるが、ただし粒子がその選ばれた温度において融解あるいは凝集すべきでないことを条件とする。通常は高温が使用される。この手順に対する温度は一般に２０℃から２００℃、更に普通には５０℃から１７０℃にわたるであろう。室温ではほとんど不溶性の若干の化合物は、高温では低分子量アルコール、例えばエタノールおよびエチレングリコールなどに可溶である。カルボキシル化変性ラテックス粒子はこのような温度で低分子量アルコールに耐えることが示された。
【０２５８】
ｓｂｐ構成要素はラテックス粒子の表面に物理的に吸着させることができ、あるいは粒子に共有結合させることもできる。ｓｂｐ構成要素がラテックス粒子の表面に極めて弱くしか結合しない場合、その結合はある場合には、インキュベーションおよび洗浄中に出会う粒子対粒子せん断力に耐えることができないかもしれない。それ故に、吸着を最小にする条件下でｓｂｐ構成要素をラテックス粒子に共有結合させることが好ましい。これはラテックスの表面を化学的に活性化することにより達成できる。
【０２５９】
例えば表面カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをつくり、粒子表面への検定成分の非特異的結合を減らすようにこの活性化された粒子を次にアミノ基をもつリンカー（エステル基と反応する）と接触させるかあるいはアミノ基をもつｓｂｐ構成要素と直接接触させる。このリンカーは検定成分が粒子表面に非特異的に結合するのを減らすように選ぶのが普通であり、ラテックス粒子への付着およびｓｂｐ構成要素への付着の両方に適した官能基をもつことが好ましい。適当な物質にはマレイミド化したアミノデキストラン（ＭＡＤ）、ポリリジン、アミノ糖類などが含まれる。ＭＡＤはＨｕｂｅｒｔ、等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７５（７），３１４３，１９７８記載のようにして調製できる。
【０２６０】
一つの方法を示すと、先ずＭＡＤは、水溶性カルボジイミド、例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを用いてカルボキシル含有ラテックス粒子に付ける。この被覆粒子を次に試薬中で平衡化させ非特異的結合を防ぐ。このような試薬の例として、タンパク質、例えばウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）、および洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ２０、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００などがあげられる。
【０２６１】
スルフヒドリル基を有するか、またはスルフヒドリル基を導入するように適当に修飾したｓｂｐ構成要素を次に粒子の懸濁系へ添加すると、ｓｂｐ構成要素と粒子上のＭＡＤとの間に共有結合が形成される。次に過剰の未反応ｓｂｐ構成要素を洗浄により除去する。
【０２６２】
金属ゾル−−これは重金属、即ちＩＢ族金属のような２０より大きい原子番号を有する金属、例えば金または銀、あるいはカルコゲン、例えばセレンまたはテルルからなる粒子である。
【０２６３】
金属ゾル粒子は、例えばＬｅｕｖｅｒｉｎｇにより米国特許第４，３１３，７３４号明細書の中で述べられている（その開示をそのまま参考のため本明細書中に取り入れている）。このようなゾルには金属、金属化合物、あるいは金属か金属化合物で被覆した重合体核のコロイド状水性分散系が含まれる。
【０２６４】
金属ゾルは金属または金属化合物、例えば金属酸化物、金属水酸化物および金属塩、のゾルでもよいし、あるいは金属か金属化合物で被覆された重合体核のものでもよい。このような金属の例は白金、金、銀、水銀、鉛、パラジウムおよび銅であり、このような金属化合物の例はヨウ化銀、臭化銀、銅の含水酸化物、酸化鉄、水酸化鉄または鉄の含水酸化物、アルミニウムの水酸化物または含水酸化物、クロムの水酸化物または含水酸化物、酸化バナジウム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、硫化鉛、硫化水銀、硫酸バリウム、および二酸化チタンである。一般に、有用な金属または金属化合物は公知の技術によって容易に実証できる。
【０２６５】
上記金属または金属化合物で被覆された重合体核からなる分散粒子からなるゾルを使用することも時として有利である。これら粒子は純粋な金属または金属化合物の分散相と同様な性質をもっているが、大きさ、密度および金属接触は最適となるように兼有させることができる。
【０２６６】
金属ゾル粒子は公知の多数の方法で調製できる。例えば、金ゾルの調製にＬｅｕｖｅｒｉｎｇはＧ．ＦｒｅｎｓによるＮａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，２０（１９７３）中の記事を引用している。
【０２６７】
金属ゾル粒子はｓｂｐ構成要素または光増感剤または化学発光性化合物への連結のため前述したような種々な官能基を含むように修飾できる。例えば、重合体結合剤を使用することによって例えば多くの重金属に強く結合するチオール基を含む重合体の粒子を被覆することができ、あるいは、例えば磁性粒子を被覆するためＡｄｖａｎｃｅｄ ＭａｇｎｅｔｉｃｓによりＥＰＯ特許願第８４４００９５２．２号明細書中に述べられた金属粒子とトリアルコキシアミノアルキルシランとの反応による重合体被覆物を結合し形成しうるシリル化剤を用いて前記粒子を被覆できる。
【０２６８】
染料微結晶−−純粋または混合の固体水不溶性染料、なるべくは前記光増感剤として役立ちうる染料の微小結晶。本発明方法に有用な染料微結晶は粒径２０ｎｍから２０μｍをもつ。
【０２６９】
染料微結晶をつくる一つの方法が米国特許第４，３７３，９３２号明細書（Ｇｒｉｂｎａｕ等）に記載されており、その開示をそのまま参考のため本明細書中に取り入れている。Ｇｒｉｂｎａｕはコロイド状染料粒子および疎水性染料または顔料の水性分散系を説明しており、これらは免疫学的に反応性のある成分を直接または間接的に付着できる。
【０２７０】
一般に、染料粒子は染料を水に分散し次に遠心することによりつくられる。染料ペレットが得られ、次にガラスビーズを加えた水に再懸濁させる。この懸濁系を室温で数日間回転させる。液体をデカンテーションし、遠心し、液体の吸引後に染料粒子を得る。
【０２７１】
染料微結晶のもう一つの製造法は、水と混和しうる溶媒中に溶かした染料の溶液を水へゆっくり加えることによる。もう一つの方法は固形染料の水懸濁液の超音波処理による方法である。
【０２７２】
染料粒子へのｓｂｐ構成要素の結合は、直接または間接的な吸着あるいは共有化学結合による付着により達成できる。後者は被覆物質および染料いずれかの中に適当な官能基が存在することにより支配される。例えば、官能基は、ジアゾ化した芳香族アミノ基および望む官能基を含む化合物を染料のフェノール性基またはアニリノ基にカップリングすることにより、染料微結晶の表面上に導入できる。
【０２７３】
染料がカルボキシル基を有する場合、染料微結晶をカルボジイミドにより活性化し、第一級アミノ成分にカップリングできる。脂肪族第一級アミノ基およびヒドロキシル基は、例えば臭化シアンあるいはハロゲン置換ジ−またはトリ−アジン類により活性化し、その後、第一級アミノ成分との結合あるいは、例えば−ＳＨ、または−ＯＨまたは基を含む成分との結合を行なうことができる。二官能性反応性化合物を使用することもできる。
【０２７４】
例えば、染料の第一級アミノ成分とｓｂｐ構成要素との相互カップリングにグルタルアルデヒドを使用し、そしてチオール基を含む成分への第一級アミノ成分のカップリングに、例えばヘテロ−二官能性試薬、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを使用することができる。
【０２７５】
化学発光性化合物−−一重項酸素と化学反応を起こして準安定中間体を生成し、これが分解すると同時にあるいは分解後に、２５０から１２００ｎｍの波長範囲内の光を放出する物質。発光は分解および発光を起こさせるエネルギー受容体または触媒が存在しなくても起こるのが普通である。この中間体はその生成後に加熱しなくとも、あるいは補助的試薬を添加しなくとも自然に分解することが好ましい。しかし、中間体生成後の試薬の添加あるいは分解を促進するための高温の使用はある種の化学発光性化合物に対して要求されることがあるであろう。
【０２７６】
化学発光性化合物は、通常は一重項酸素と反応してしばしばジオキセタン類またはジオキセタノン類を生成する電子豊富な化合物である。このような化合物の典型例は、エノールエーテル、エナミン、９−アルキリデンキサンタン、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾールおよびルシゲニンである。他の化学発光性化合物は一重項酸素と反応して中間体を生じ、これがその後別の試薬と反応して光を放出するというものである。
【０２７７】
対象となる化学発光性化合物は一般に３００ナノメートル以上、通常は４００ｎｍ以上の波長で発光する。単独か蛍光性分子と一緒に血清成分が光を吸収する領域を越える波長で光を発する化合物は特に本発明に使用されるであろう。血清の蛍光は５００ｎｍ以上で急速に落ち、５５０ｎｍ以上では比較的重要でなくなる。
【０２７８】
それ故に、被検物質が血清中にあるときはには、５５０ｎｍ以上の、なるべくは６００ｎｍ以上の光を発する発光性化合物が特に関心をもたれている。化学発光性化合物の自己増感を避けるためには、その化学発光性化合物が光増感剤を励起するのに用いた光を吸収しないことが好ましい。一般に増感剤を５００ｎｍより長波長の光で励起するのが好ましいので、化学発光性化合物による光の吸収は５００ｎｍ以上で非常に低いことが望ましい。
【０２７９】
化学発光性化合物から長波長発光を望む場合には、化学発光性化合物にピレンのような長波長エミッターを結合して用いることができる。別法として、化学発光性化合物を含む媒質中に蛍光性分子を含めることもできる。特に適当な蛍光性分子は活性化された化学発光性化合物によって励起され、化学発光性化合物の発光波長よりも長波長で、通常は５５０ｎｍより長波長で発光するであろう。また蛍光分子は光増感剤を活性化するために使用した光の波長で吸収しないことも普通望ましい。有用な染料の例にはローダミン、エチジウム、ダンシル、Ｅｕ（ｆｏｄ）3、Ｅｕ（ＴＴＡ）3、Ｒｕ（ｂｐｙ）3 ++（式中、ｂｐｙ＝２，２′−ジピリジル）などが包含される。
【０２８０】
一般に、これら染料はエネルギー移動過程で受容体として作用し、なるべくは高い蛍光量子収率を有しかつ一重項酸素と迅速に反応しないことが好ましい。これらは粒子へ化学発光性化合物を添加するのと同時に粒子に加えることができる。
【０２８１】
電子豊富なオレフィンは一般に式：
【化１】
【０２８２】
オレフィン１中のＣ原子の他の原子価は１から５０原子の置換基で満されるが、前記基は一緒に結合して縮合または非縮合の１個以上の環、例えばシクロアルキル、フェニル、７−ノルボルニル、ナフチル、アントラシル、アクリダニル、アダマンチルなどを形成することができる。
【０２８３】
本発明に使用されるエノールエーテルは一般に構造：
【化２】
を有する。
【０２８４】
典型的なエノールエーテルは２，３−ジアリール−４，５−ジヒドロジオキセン類：
【化３】
であるが、これは例示であって制限ではない。
【０２８５】
９−（ジアルコキシメチリデン）−キサンテン：
【化４】
【化５】
【化６】
本発明に使用するビニルスルフィド類は一般に酸素原子を硫黄原子により置き換えた上記エノールエーテルを包含する。
【０２８７】
本発明に使用するエナミンは一般に構造：
【化７】
を有する。
【０２８８】
典型的なエナミンは下記の化合物であるが、これらは例示であって制限ではない：
【０２８９】
ジアルキルアミノビニルピレン：
【化８】
ジアルキルアミノビニル−９，１０−ジフェニルアントラセン
【化９】
など。
【０２９１】
９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類は一般に構造：
【化１０】
を有する。
【０２９２】
典型的なアクリダン類は置換９−ベンジリデン−１０−メチルアクリダンおよび９−ジフェニルメチレン−１０−メチルアクリダン〔Ｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：３８２３（１９８３）およびＭｃＣａｐｒａ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．９４４（１９７７）によって記述されている〕、９−メチリデン−１０−メチルアクリダン〔Ｅ．Ｗｈｉｔｅ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１４９１（１９７９）により記述されている〕であるが、これらは例示としてあげたのであって制限ではない。
【０２９３】
炭素（Ｃ）原子上の置換基が対応するオレフィン：
【化１１】
【０２９４】
化学発光性化合物のもう一つの群は２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類である。最もよく知られた化合物はルミノールであり、このものは５−アミノ化合物である。この群中の他の化合物には置換６−アミノ，５−アミノ−６，７，８−トリメトキシおよびそのジメチルアミノ〔ｃａ〕ベンズ類縁体が含まれる。これら化合物は多段階で一重項酸素により酸化され分解を起こしてフタレート誘導体を生成し光を放出する。
【０２９５】
もう一種の一群の化学発光性化合物は、２，４，５−トリフェニルイミダゾール化合物であり、これらの化合物は親化合物と共通の名称としてロフィン（ｌｏｐｈｉｎｅ）の名称を有する。この化学発光性類似化合物には、パラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換化合物が含まれる。
【０２９６】
さらに別の群の化学発光性化合物には、ビス−アリーレン化合物が含まれ、この化合物はＳｉｎｇｅｒによりＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４１：２６８５（１９７６）に記載されているビス−９，９′−アクリジリデンおよびその１０，１０′−ジメチル誘導体、ルシゲニンおよびビス−９，９′−キサンチリデンを包含する。
前記要件を満たすその他の化学発光性化合物は、１９８９年１２月１３日付で公開されたヨーロッパ特許出願０，３４５，７７６に見い出すことができる。
【０２９７】
光化学的に活性化できる化学発光性化合物（ＰＡＣＣ）は、光による直接励起または光吸収励起によって、あるいは一重項（ｓｉｎｇｌｅｔ）酸素との反応によって化学反応を受け、通常２５０〜１２００ｎｍの波長範囲内の光の同時的にまたは引続いて発光を伴ない、分解できる準安定反応生成物を生成する物質である。「光活性化できる」の用語には、「光化学的に活性化できる」ことが含まれる。本発明において好適なＰＡＣＣは一重項酸素と反応して、ジオキセタン化合物またはジオキセタンオン化合物を生成する化合物である。後者の化合物は通常、電子に富むオレフィン類である。このような電子に富むオレフィン類の例には、エノールエーテル類、エナミン類、９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類、アリールビニルエーテル類、ジオキセン類、アリールイミダゾール類、９−アルキリデン−キサンタン類およびルシゲニンがある。「ＰＡＣＣ」の用語の中に含まれるその他の化合物は、ルミノールおよび他のフタルヒドラジド化合物、ならびに光化学的に不安定な保護基によって保護されていることから化学発光反応を受けることから保護されている化学発光性化合物、たとえばホタルルシフェリン、アクアホリン、ルミノールなどの化合物を包含する。
【０２９８】
有利なＰＡＣＣは好ましくは、３００ナノメーター以上、好ましくは５００ナノメーター以上、さらに好ましくは５５０ｎｍ以上の波長で発光するものである。試料成分が光吸収に有意に関与する波長域をこえた波長で光を吸収し、かつまた発光する化合物は本発明において特に使用される。血清の吸光は５００ｎｍ以上で急速に減少し、６００ｎｍ以上では無意味になる。従って、６００ｎｍ以上の光を発光する化学発光性化合物は特に有利である。しかしながら、試料の干渉吸収が無い場合には、またはさらに長い波長の光を吸収し、それによって化学発光性化合物が活性化される場合には、さらに短い波長で吸光性の化学発光性化合物が有用である。
【０２９９】
本発明のＰＡＣＣは標識（ラベル）として使用され、ｓｂｐメンバーと会合させる。
下記のＰＡＣＣ１は一般に、アリル系ＣＨまたはＮＨ基を含有していない。
【０３００】
本発明のＰＡＣＣとして適する電子に富むオレフィン類は、本発明における「化学発光性化合物」の範中にある。このようなＰＡＣＣは通常、オレフィンに直接に結合している水素原子を有する原子を有していないが、ただしこの原子が小さい二環状環系の架橋先端位置などのように、二重結合に関与できない位置にある場合は除かれる。さらに好適なオレフィン類は、室温で急速に（６０分より短い時間、好ましくは５分より短い時間、望ましくは３０秒より短い時間で）崩壊するジオキセタンを生成するものである。これらのジオキセタン化合物は単独で、または蛍光エネルギー受容体と共同して、発光することができる。
【０３０１】
本発明のＰＡＣＣとして適するエノールエーテル類はまた本発明における「化学発光性化合物」の範囲内にある。特に有用なエノールエーテル化合物は、そのアリール環が蛍光を付与する位置で電子供与性基により置換されているエーテルと同一炭素上にアリールを有する化合物である。電子供与性基は、たとえばｍ−ヒドロキシフェニル、ｍ−ジメチルアミノ−フェニル、１−（５−アミノナフチル）、ピリル、１−（３−ヒドロキシピリル）、アントラシル、クリシルなどであることができる。２位置に存在する基の一方または両方がアリールであることができ、この場合には、１−炭素の酸素による置き換えによって生成されるケトンが蛍光体であることができ、このアリールはたとえばβ−ナフチルまたは２−アントリルである。
【０３０２】
これらに制限されないが、エノールエーテル化合物の例には、下記の化合物がある：
【化１２】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【０３０３】
本発明のＰＡＣＣとして適するエナミン類はまた、本発明における「化学発光性化合物」の範囲内にある。これらに制限されないが、特に有用なエナミン化合物の例には、上記エノールエーテル化合物３〜５において、ＯＣＨ3がＮ（ＣＨ3）2で置き換えられている化合物がある。別の例には、次式で示される化合物がある：
【化１９】
ＰＡＣＣとして適する９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン化合物はまた、本発明における「化学発光性化合物」の範囲内にある。特に有用な化合物は、式（７）において、オレフィン上の残りの置換基がフェニル、ナフチル、フェナントリル、ｍ−メトキシフェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−モルホレノであるか、または一緒になって環、たとえばアダマンチル、Ｎ−メチルアクリダニリド、キサンタニリジン、１−（３，４−ベンゾ−５−ヒドロフリリデン）などを形成していてもよい化合物である。本発明において、ラベルとして特に有用な９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン化合物の例には、これらに制限されないが、下記の化合物がある：
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【０３０５】
上記刊行物の関連記載をここに引用して組入れる。
本発明のＰＡＣＣとして有用な９−アルキリデン−キサンタン化合物は一般に、次の構造を有する：
【化２６】
【０３０６】
もう一種の一群のＰＡＣＣは、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物である。この種の最も一般的に知られている化合物はルミノールであり、この化合物は５−アミノ化合物である。この一群の中の他の化合物には、５−アミノ−６，７，８−トリメトキシ類似体およびジメチルアミノ〔ｃａ〕ベンズ類似体が含まれる。ルミノールは検定法においてラベルとして使用されているが、ルミノールの励起が、本発明の場合のような光活性化によるものではなく、化学的に行なわれていたことに留意すべきである。これらの化合物は一重項酸素により、およびまた引続く過酸化物または過酸化水素との反応によって、発光をともなう分解を受け、１，４−フタラジニジオン化合物に酸化される。
【０３０７】
他の一群のＰＡＣＣには、２，４，５−トリフェニルイミダゾール化合物があり、この化合物はその親の化合物と共通の名称として、ロフィン（ｌｏｐｈｉｎｅ）と称されている。その化学発光性類似体はパラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換体を包含する。
前記の要件を満たす、他のＰＡＣＣは、１９８９年１２月１３日付で公開されたヨーロッパ特許出願第０，３４５，７７６号に見い出すことができる。
【０３０８】
保護されている化学発光性化合物は、光分離性の保護基を有するＰＡＣＣである。保護基が光活性化によって分離されると、この化合物は自発的に、あるいは検定メジウム中に存在する成分により活性化されて、光を発する。光分離性保護基の例は、これらに制限されないものとして、ｏ−ニトロベンジル、ｏ−アシルフェニルエチル、アルコキシベンジルなどを包含し、この基は通常、ＰＡＣＣのヘテロ原子に結合している。保護されている化学発光性化合物の一部を形成することができるＰＡＣＣの例には、前記の電子に富むオレフィン類がある。本発明のこの態様に係る保護されている化学発光性化合物の例には、下記の化合物がある：
【０３０９】
【化２７】
保護されている化学発光性化合物の場合には、光活性化または光分解の前に、いずれか必要な助剤を存在させる。このような助剤は酵素および酵素のための基質を包含することができる。いくつかの場合には、いづれもｐＨの制限が必要である。その他の助剤には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、過酸化水素などがある。上記原則によって指示される、いずれか適当な保護されている化学発光性化合物の選択に係る追加の助剤は、当業者にとって明白なことである。たとえば、化合物１の場合には、ホタルルシフェラーゼおよびそのルシフェリン基質を使用することができる。化合物２の場合には、塩基性メジウム（ｐＨ＞９）を維持することだけが必要である。２Ａの場合には、過酸化水素およびホースラディッシュペルオキシダーゼを使用することができる。
【０３１１】
補助物質−−本発明に係る検定法においては、種々の補助物質をしばしば使用する。一例として、検定メジウム中には通常、緩衝剤を存在させ、また検定メジウムおよび検定成分のための安定剤を存在させる。多くの場合には、これらの添加剤に加えて、タンパク質、たとえばアルブミン類、有機溶剤、たとえばホルムアミド、四級アンモニウム塩、ポリカチオン、たとえばデキストランスルフェート、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、結合増強剤、たとえばポリアルキレングリコール類などを含有させることができる。増感剤が照射によるよりも、化学的に活性化されるものである場合には、補助剤として、過酸化水素をしばしば含有させる。化学発光性化合物の発光波長を、より長い波長に移すことが望まれる場合には、またはその酸素活性化形態の分解を触媒させることが望まれる場合には、蛍光分子を使用することができる。
【０３１２】
全体的に、または部分的に引続いて、本発明で使用される試料および各種助剤を、夾雑ではなく、（同時的に）配合する場合には、１種または２種以上の使用剤を残りの使用剤の１種または２種以上と組合せて、準配合物を生成させることができる。この準配合物はそれぞれ、次いで本発明の工程の１つまたは２つ以上に付することができる。すなわち、これらの準配合物はそれぞれ、所望の結果の１つまたは２つ以上が得られる条件の下にインキュベートすることができる。
【０３１３】
エネルギー受容体−本明細書において、この物質はまた、蛍光エネルギー受容体の用語でも表わされている。３１０ｎｍより高い、通常３５０ｎｍより高い、そして好ましくは約４００より高い、実質的吸光値を有する発色団。
エネルギー受容体の選択はまた、特定のＰＡＣＣによって支配される。エネルギー受容体はＰＡＣＣによって発射される光を吸収することができるものでなければならない。好ましくは、エネルギー受容体の最大吸収値は化学発光性化合物の最大発光と同様の波長であるべきである。吸光係数が高いことが望ましく、通常１０より大きく、好ましくは１０3より大きく、特に好ましくは１０4より大きいことが望ましい。
【０３１４】
エネルギー受容体として有用な種々の一連の分子はＵｌｌｍａｎ等により、コラム８および９のＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶに記載されており、これらの関連記載をここに引用して組入れる。一般に、エネルギー受容体は蛍光化合物または蛍光体であるが、非常に弱い蛍光を有するか、または蛍光を有していないエネルギー受容体も有用である。
【０３１５】
多くの上記の望ましい性質を有する一群の蛍光体はキサンテン染料であり、この染料には、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニル−キサントヒドロールから誘導されるフルオレセイン類、３，６−ジアミノ−９−フェニルキサンチドロールから誘導されるローダミン類およびローザミン類が含まれる。ローダミン類およびフルオレセイン類は、９−ｏ−カルボキシフェニル基を有し、９−ｏ−カルボキシフェニル−キサントヒドロールの誘導体である。
これらの化合物は、結合部位として、または結合性官能性基として、フェニル基上に置換基を有するものとして市販されている。たとえば、アミノおよびイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物が市販されている。
【０３１６】
他の一群の蛍光化合物は、アルファまたはベータ位置に、通常アルファ位置に、アミノ基を有するナフチルアミン化合物である。ナフチルアミノ化合物の中には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリン−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが含まれる。
【０３１７】
活性化されると、タンパク質と反応する染料前駆化合物としては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；９−イソチオシアナトアクリジンなどのアクリジン化合物；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾイル）フェニル）マレイミド；下記の式で示される化合物などのベンゾキサジアゾール化合物：
【化２８】
【０３１８】
さらに官能性にして、ｓｂｐメンバーと組合させることができる、その他の染料には、アクリジンオレンジ、７−（ｐ−メトキシベンジルアミノ）−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール；Ｎ，Ｎ′−ジオクタデシルオキサカルボシアニンｐ−トルエンスルホネート；８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸および１−ピレン酪酸などのピレン化合物；メロシアニン５４０、ローズベンガル；およびその他の容易に使用できる蛍光発光分子が包含される。
【０３１９】
ポリヌクレオチド検定の場合には、多くの種々のエネルギー受容体を使用することができるが、二重鎖核酸に結合すると、蛍光を増すものが好ましい。エピジウムブロマイドおよびアクリジンオレンジなどのように、侵入する染料は代表的例である。Ｂａｒｔｏｎによって開発されたルテニウム誘導体（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０）１１２：４９６０）は、特に重要であり、これはこの化合物が挿入されると劇的に切り換えられるからである。別様には、エネルギー受容体は化学発光性化合物でラベルしたプローブに接して結合することができる第二のポリヌクレオチドプローブに結合させることができ、あるいはエネルギー受容体は結合されずに、溶液中で自由に分散されるものであってもよい。
蛍光を有していないエネルギー受容体も含むことができ、これは広く種々のアゾ染料、シアニン染料、４，５−ジメトキシフルオレセイン、ホルマザン類、インドフェノール類などのいずれでもあることができる。
【０３２０】
本発明の態様の一つは、被検物質の測定方法である。この方法は、増感剤によって発生される短命な一重項酸素がその自発的崩壊の前に、化学発光性化合物を反応することができるほど極めて接近することができる量の化学発光性化合物及び増感剤に対して、被験物質（存在する場合）が影響を及ぼすような条件の下に、被験物質を含有するものと予想されるメジウムを処理することからなる。この方法はまた、化学発光性化合物によって生じるルミネセンスの強度の測定を包含する。生じるルミネセンスの強度はメジウム中の被験物質の量に関連する。化学発光性化合物は一重項酸素によって活性化することができ、そして増感剤は、通常、光励起に応答する一重項酸素の生成および引続く分子状酸素へのエネルギー転移を触媒する。多くの場合に、表面を増感剤および化学発光性化合物と極めて接近させる。この場合の表面は好ましくは懸濁できる粒子の表面である。化学発光性化合物の活性化によって生成される生成物は、光の発射をともない、好ましくは自発的に分解する。
【０３２１】
この方法は増感剤の分子と化学発光性化合物の分子とを、検定メジウムのカサ高の溶液中におけるそれらの間の平均間隔よりも相互に接近させるか、またはこれらの分子を干渉する、被験物質の存在を予想させる。この分離は被分析試料中に存在する被験物質の量に依存する。
【０３２２】
増感剤分子は、化学発光性化合物と会合されていないと、水性メジウム中で崩壊を受ける前に化学発光性化合物に到達することができない一重項酸素を生成する。しかしながら、増感剤と化学発光性化合物とが被験物質の量に応じて、相互に極めて接近すると、増感剤の照射によって生成される一重項酸素は、崩壊を受ける前に、化学発光性化合物を活性化することができる。多数の化学発光性化合物分子および（または）増感剤分子を表面と会合させることができ、かつまた拡散を表面に限定することができることから、増感剤および化学発光性化合物と結合している表面の存在は、化学発光性化合物に対する一重項酸素の崩壊前の効力または作用を増加させる。従って、被験物質の存在の関数として、増感剤と化学発光性化合物とを接近させる表面を使用することは、好ましいことである。本発明の検定法は、広範囲の種々の被験物質を、簡単で、効率良く、再現可能な方法で検出および測定するための方法を提供する。この方法には、反応中に生成される光の量を測定するための簡単な装置を使用することができる。
【０３２３】
化学発光性化合物と極めて接近する増感剤の量は、増感剤と化学発光性化合物とがそれぞれ、ｓｂｐメンバーと会合されていることから、被験物質の存在によって影響を受ける。これは、多くの方法で達成することができ、従って、「会合」（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）の用語で表わすことにする。増感剤および化学発光性化合物は、ｓｂｐメンバーに共有結合するための官能性基を含有でき、あるいはｓｂｐメンバーまたはｓｂｐメンバーに結合できる基は増感剤および（または）化学発光性化合物に結合するための官能性基を含有することができる。
【０３２４】
この結合は２種の分子間の直接結合によって達成することができ、あるいはｓｂｐメンバーと増感剤または化学発光性化合物との間に結合性基を使用することができる。もう一つの態様においては、増感剤および化学発光性化合物の一方または両方を表面に結合させるか、または粒子中に配合することもでき、ここにまた、ｓｂｐメンバーを結合させる。これらの方法の両方において、ｓｂｐメンバーはそれぞれ、被験物質またはその濃度が被験物質の存在によって左右される検定成分に直接的に、または間接的に結合することができる。
【０３２５】
増感剤および化学発光性化合物は、粒子の少なくとも１つの相中に可溶性であることにもとづいて、粒子中に配合することができ、この場合には、増感剤および化学発光性化合物は、一団の検定メジウム中よりも、粒子内に高濃度で存在する。増感剤および化学発光性化合物を粒子に共有結合させる場合には、増感剤および化学発光性化合物、あるいは粒子またはその成分を官能性にして、増感剤および化学発光性化合物と粒子とを結合する手段を得る。粒子が油滴またはリポソームである場合には、増感剤および化学発光性化合物は１個または２個以上の長鎖状炭化水素に結合させることができ、この炭化水素鎖はそれぞれ、少なくとも１０〜３０個の炭素原子を有するものである。粒子が滴状フルオロカーボンである場合には、これらの粒子中に配合する増感剤または化学発光性化合物をフッ素化して、溶解性を増加させ、かつまた別のラベルと結合した別の粒子中への交換を減じることができる。この場合に、結合に使用する炭化水素は好ましくは、フルオロカーボン鎖で置き換えることができる。
【０３２６】
シリコーン液状粒子の場合には、増感剤および化学発光性化合物はポリシロキサンに結合させることができる。粒子１個当りの増感剤または化学発光性化合物の分子の数を最大にするためには、通常、増感剤または化学発光性化合物の電荷および極性度を最少にし、これが粒子の非水性部分に存在するようにすることが望ましい。粒子がリポソームであり、かつまた増感剤または化学発光性化合物をリポソームの水性相に保有したい場合には、極性または電荷が高い増感剤または化学発光性化合物を使用することが好ましい。
【０３２７】
増感剤および化学発光性化合物をどのようにして結合させるかは問題ではない。どちらの化合物も検定期間中に、そのｓｂｐメンバーから脱離することができないものであり、かつまた別の一組の増感剤および化学発光性化合物に結合しているｓｂｐメンバーと結合することができないものであることが必須要件である。すなわち、これらの化合物のそれらの各ｓｂｐメンバーからの脱離は検定に要する時間よりも遅くあるべきである。
【０３２８】
化学発光性化合物は、被験物質あるいはその濃度が被験物質の存在によって左右される検定成分に対し直接的にまたは間接的に結合できるｓｂｐメンバーに結合させることができる。「直接的にまたは間接的に結合できる」の用語は、指定の実体がこの実体に特異的に結合できる（直接的に）か、または特異結合性の一組のメンバーにまたは別の実体を結合できる２種または３種以上のｓｂｐメンバーの複合体に結合できる（間接的に）ことを意味する。
【０３２９】
表面は一般にそこに結合されているｓｂｐメンバーを有する。好ましくは、化学発光性化合物を、通常、懸濁できる粒子内の表面と会合させる。このｓｂｐメンバーは一般に、被験物質または被験物質に対するレセプターに、直接的にまたは間接的に結合することができる。増感剤と会合されたｓｂｐメンバーおよび化学発光性化合物と会合されたｓｂｐメンバーが両方ともに、被験物質に結合できる場合には、サンドイッチ検定法が得られる。増感剤と会合したｓｂｐメンバーまたは化学発光性化合物と会合したｓｂｐメンバーのうちの一方が被験物質および被験物質類縁体の両方と結合できる場合には、競合式検定法が得られる。化学発光性化合物の粒子表面への結合または粒子内への配合は一般に、増感剤の粒子表面への結合または粒子内への配合に係る前記原則と同一の原則によって支配される。
【０３３０】
増感剤は通常、上記反応体を含有するメジウムを照射することによって、化学発光性化合物を活性化させる。このメジウムは増感剤を励起状態に変換するのに充分のエネルギーを有する波長を有する光によって照射しなければならない。これによって、増感剤は分子状酸素を一重項状態の酸素に活性化することができるようにされる。分子状酸素を励起させることができる増感剤の励起状態は一般に、三重項状態（ｔｒｉｐｌｅｔ）であり、この状態は基底状態の増感剤よりも、約２０、一般に少なくとも２３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ高いエネルギーを有する。好ましくは、メジウムを、約４５０〜９５０ｎｍの波長を有する光により照射するが、さらに短い波長、例えば２３０〜９５０ｎｍの波長の光を使用することもできる。生成されるルミネセンスは、写真により、肉視による、または光度測定によるなどいずれか慣用の方法によって測定し、その量を決定することができる。この測定量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３３１】
増感剤は通常、この増感剤によって効果的に吸収される波長の光により照射することによって励起させることが好ましいが、その他の励起手段も使用することができ、たとえば励起状態のエネルギー供給体、たとえば第二の増感剤からのエネルギー転移によることもできる。第二の増感剤を使用する場合には、増感剤によっては充分に吸収されないが、第二の増感剤によっては充分に吸収される波長の光を使用することができる。この第二の増感剤は、たとえば第一の増感剤を有する粒子の表面に結合させるか、またはこの粒子内に配合することによって、第一の増感剤と会合させるか、またはメンバーを有し、化学発光性化合物を含有する懸濁可能な粒子の組合せを用意し；（ｂ）この組合せを光により処理し、その増感剤を励起させ；次いで（ｃ）そこから発射されるルミネセンスの量に関して、この組合せを検査する；ことからなる。
【０３３２】
発射されるルミネセンスの量はメジウム中の被験物質の量に関連する。好ましくは、化学発光性化合物を懸濁可能な粒子内に配合し、かつまたｓｂｐメンバーをこの粒子に結合させる。さらに好ましくは、増感剤を、そこに結合したｓｂｐメンバーを有する、第二の懸濁可能な粒子内に配合する。
【０３３３】
本発明の方法および組成物は、リガンド−レセプターなどのｓｂｐメンバーを包含する検定法の大部分、たとえば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合検定法などに会合するようにすることができる。第二の増感剤を使用する場合には、この第二の増感剤は通常、第一の増感剤の最低エネルギー三重項状態よりも高いエネルギーの、最低エネルギー三重項状態を有する。
【０３３４】
６３２．６ｎｍの放射線を有するヘリウム−ネオンレーザーは励起用の安価な光源である。約６２０〜約６５０ｎｍの領域に最大吸収を有する増感剤はこの放射線のヘリウム−ネオンレーザーに適合し、従って本発明において特に有用である。
【０３３５】
本発明のもう一つの態様は、被験物質の測定方法にあり、この方法は、（ａ）（１）被験物質を含有するものと予想されるメジウム、（２）その励起状態で、酸素と一重項状態に活性化することができる増感剤（この増感剤はｓｂｐメンバーと会合されている）、および（３）そこに結合されているｓｂｐ適応させることができる。これらの検定法は、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）または不均一系（ｈｅｔｒｏｇｅｎｏｕｓ）競合法もしくは非競合法であることができる。検定成分、化学発光性化合物および増感剤は、（１）表面（使用する場合）、（２）核酸またはレセプター、および（３）核酸またはリガンドとともに、多くの方法で使用することができる。会合は、共有結合または非共有結合であることができる。前記および後記の説明から、特定の所望の検定に応じて、当業者は適当な会合を選択することができる。
【０３３６】
均一系検定法においては、試料を必要に応じて予備処理し、望ましくない物質を除去する。非競合的サンドイッチ検定法における反応は、被験物質に対して相補的であり、化学発光性化合物と会合しているｓｂｐメンバー（たとえば、抗体、核酸プローブ、レセプターまたはリガンド）；被験物質に対してまた相補的であり、ｓｂｐメンバー（たとえば、抗体、核酸プローブ、レセプターまたはリガンド）と会合されている増感剤；対象試料；および必要な助剤；を包含する。好ましくは、増感剤および化学発光性化合物の一方または両方を、ｓｂｐメンバーが結合されている粒子内に配合する。
【０３３７】
競合法においては、一つのｓｂｐメンバーが被験物質の誘導体であることができ、そして他の一つのｓｂｐメンバーが被験物質に対して相補的であることができる（たとえば、抗体）。どちらの方法でも、諸成分は同時的に、または順次、全体的にまたは部分的に、配合することができる。活性化した増感剤によって生成される一重項状態酸素の、化学発光性化合物に対する反応能力は、ｓｂｐメンバーの被験物質に対する結合によって支配される。他方、被験物質の存在または量は、照射、加熱または化学剤の添加により、好ましくは照射により、増感剤の活性化によって発射される光の量を測定することにより、決定することができる。この結合反応およびその程度の検出は両方ともに、分離することなく、均一溶液中で行なうことができる。このことは、化学発光性を利用する従来技術の方法に優る本発明の利点である。
【０３３８】
不均一系検定法においては、検定成分は、ｓｂｐメンバーである被験物質を含有するものと予想される試料；化学発光性化合物および増感剤からなる群の一員を会合して有する、非分散性の表面または粒子のどちらかであることができる支持体に結合されているｓｂｐメンバー；およびｓｂｐメンバーが独立して、直接的にまたは間接的に被験物質またはこの被験物質用のレセプターを結合できるように、会合されている、上記群の他の一員を有するｓｂｐメンバーからなる。
【０３３９】
これらの成分は一般に、同時的に、または順次、全体的に、または部分的に、配合することができる。この表面または粒子を次いで、液相から分離し、次いで分離した相または液相のどちらかを、通常、対象相の照射によって、その増感剤を活性化させる条件に付し、次いで発射された光の量を測定する。
【０３４０】
被験物質検定における結合反応は、正常には、一般に最適検定感度を提供する、中程度のｐＨにおいて、水性メジウム中で行なう。好ましくは、増感剤の活性化もまた水性メジウム中で行なう。しかしながら、分離工程を使用する場合には、たとえばアセトニトリル、アセトン、トルエン、ベンゾニトリルなどのような非水性メジウムおよび非常に高いｐＨ、例えば１．０より大きいｐＨ、あるいは非常に低いｐＨ、すなわち４．０より小さいｐＨ、通常では、非常に高いｐＨを有する水性メジウムを使用することもできる。上記で説明したように、この検定法は検定用成分または生成物のいづれかを分離することなく（均一系）、あるいは分離して（不均一系）、行なうことができる。
【０３４１】
水性メジウムは水単独であってもよく、あるいは０．０１〜８０容量パーセントの補助溶剤を含有していてもよいが、通常、ｓｂｐメンバーとして、タンパク質が使用される場合には、水性メジウムは４０％より少ない量の補助溶剤を含有する。結合反応用のメジウムのｐＨは通常、約４〜１１の範囲、さらに一般的には約５〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜９．５の範囲である。このｐＨが、一重項状態酸素の発生期間中に変化しない場合には、このｐＨは通常、結合メンバーの最適結合ｐＨと信号の生成および検定用の他の成分の安定に最適のｐＨとの間にある。
【０３４２】
信号の生成に、高められたｐＨが必要な場合には、アルカリ性試薬の添加を含む工程を、結合反応と一重項酸素の発生および（または）信号生成との間に挿入することができる。一般的に、この高められたｐＨは１０より大きく、通常１０〜１４である。不均一系検定法の場合には、上記したような、非水性溶剤をまた使用することができ、この場合には、この溶剤が一重項状態酸素と有効には反応しないことを考慮する。
【０３４３】
望ましいｐＨを得、検定期間中にこのｐＨを維持するために、種々の緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタールなどが含まれる。使用する特定の緩衝剤には本発明において制限はないが、各検定毎に、１種のまたは他の一種の緩衝剤が好適である。
【０３４４】
検定において、タンパク質リガンドとレセプターとの結合反応を行なうために使用する温度は通常、中程度の温度であり、一般に測定期間中、一定の温度、好ましくは２５°〜４０°を使用する。結合反応のためのインキュベーション温度は一般的に、約５°〜４５℃、通常約１５°〜４０℃、さらに通常的には、２５°〜４０℃である。核酸の結合が検定中に生じる場合には、さらに高い温度、通常２０°〜９０°、さらに通常３５°〜７５℃の温度がしばしば使用される。測定中の温度、すなわち一重項状態酸素の発生および光検出の期間中の温度は一般に、約２０°〜１００℃、さらに通常約２５°〜５０℃、好ましくは２５°〜４０℃の範囲である。
【０３４５】
検定することができる被験物質の濃度は一般に、約１０-4Ｍから１０-16Ｍ以下、さらに通常、約１０-6〜１０-14Ｍで変わる。検定が定量的であるか、半定量的であるか、または定性的であるか、およびまた特定の検出技術、対象被験物質の濃度および最高に望ましいインキュベーション時間を考慮して、各種成分の濃度が通常、決定される。
【０３４６】
競合検定法においては、検定メジウム中の各種成分の濃度は一般に、対象被験物質の濃度範囲によって決定されるが、各成分のそれぞれの最終濃度は通常、この検定の感度がこの範囲全体にわたって最適になるように、実験的に決定される。すなわち、重要な被験物質の濃度の変化が実際に測定できる信号の差違として得られなければならない。
【０３４７】
ｓｂｐメンバーの濃度は、被験物質の濃度、所望の結合速度、およびｓｂｐメンバーが非特異的に結合する程度に依存する。通常、ｓｂｐメンバーは少なくとも最低の予想被験物質濃度で、好ましくは少なくとも予想される最高被験物質濃度で存在させる。非競合検定法の場合には、この濃度は最高被験物質濃度の１０〜１０6倍であることができるが、通常、１０-4Ｍより少なく、好ましくは１０-6Ｍより少なく、多くの場合に１０-11〜１０-7Ｍである。ｓｂｐメンバーと会合させる増感剤または化学発光性化合物の量は一般に、ｓｂｐメンバー当りで少なくとも１分子であり、増感剤分子または化学発光性化合物分子を粒子内に配合する場合には、１０5ほど高くてもよく、通常少なくとも１０〜１０4であることができる。
【０３４８】
添加順序は広く変えることができるが、検定の種類に応じて、或る好ましい順序がある。最も簡単な添加順序は、諸物質を同時的に加える順序である。別法として、諸成分を全体的にまたは部分的に順次、配合することもできる。検定が競合的である場合には、試料と被験物質を結合できるｓｂｐメンバーとを配合した後に、被験物質類縁体を添加することがしばしば望ましい。場合により、これらの諸成分を配合した後に、インキュベーション工程を包含させることができ、このインキュベーション工程は一般に、約３０秒〜６時間、さらに通常、約２分〜１時間の範囲で行ない、その後で増感剤により一重項酸素を発生させ、次いで発光を測定する。
【０３４９】
特に好適な添加順序では、被験物質に対し相補的であり、そして（または）被験物質と同族である、特異結合性の一組のメンバーからなる第一のセットを被験物質と配合し、次いで第一の特異結合性の一組のメンバーに対し相補的である特異結合性の一組のメンバーを添加する。これらのメンバーはそれぞれ、増感剤および化学発光性化合物からなる群の別々の一員と会合している。この検定混合物またはその分離した成分を次いで、照射し、その発光を測定する。
【０３５０】
均一系検定法においては、全成分を配分した後に、所望により、これらをインキュベートすることができる。次いで、この配合物を照射し、生じる発光を測定する。この発光は被験試料中の被験物質の量に関連する。均一系検定法で使用される本発明の諸成分の量は、被験物質の種類に依存する。一般に、本発明の均一系検定法は、ＥＭＩＴ検定法（商品名）のような公知検定法に比較して増大した感度を示す。この利点は、主として、本発明の方法で得られる、改善された信号対ノイズ比の結果である。
【０３５１】
当業者が本発明の範囲を認識し、本発明を不当な実験を行なうことなく実施できるようにするために、制限的意味を有していない例を下記に示す。被験物質、増感剤、化学発光性化合物、表面、粒子および反応条件の選択は、下記の例の記載から当業者に示唆されるであろう。
【０３５２】
本発明の態様の一つにおいて、化学発光性化合物、９−ベンザル−１０−メチルアクリダンをチロイド刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する抗体（試薬１）に共有結合させる。そのフェニル環に結合しているカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルにより官能性にした９−ベンザル−１０−メチルアクリダンを抗体のアミノ基と反応させる。結合基はカルボキシアミドである。使用増感剤はローズベンガルであり、これは０．５ミクロンの平均径を有するラテックス粒子に共有結合させる。ラテックス粒子とローズベンガルとは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９７：３７４１（１９７５）に記載されているように、エステル結合基を得るために、ラテックス上のクロロメチル基によって、相互に共有結合させる。
【０３５３】
このラテックス粒子をＴＳＨに対する第二の抗体にさらに結合させる（試薬２）。このためには、ラテックス上のＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル基を使用する。使用抗体は両方ともに、標準ハイブリッドセルライン技術によって調製されるモノクローナル抗体である。抗体の一つはＴＳＨのα−サブユニットを認識し、そして他の一つはＴＳＨのβ−サブユニットを認識する。
【０３５４】
検定の実施に際しては、ＴＳＨを含有するものと予想される血清試料を患者から得る。５０マイクロリッターの試料を、上記試薬１および試薬２とともに、トリス緩衝剤によってｐＨ８．０に緩衝されている水性メジウム５００ｍＬ中で一緒に配合する。試薬１および試薬２の量は、約１０-6モルの各抗体の濃度が得られるに充分にする。この反応混合物を次いで、２５℃で１時間、インキュベートし、次いで５６０ｎｍの光を３０秒間照射する。照射後に発射された光の強度を測定し、３０秒間の間に検出された総光エネルギーを、既知濃度でＴＳＨを含有する試料により同様の方法で得た数値と比較し、未知のＴＳＨ濃度を決定する。
【０３５５】
別法では、インキュベーションの後に、ラテックス粒子をメジウムから分離し、ｐＨ９．５の水性緩衝メジウム中に入れ、同様に照射し、次いでこの系から発射された光の量を上記のとおりに測定する。
【０３５６】
上記方法にもとづく別法においては、試薬２が第二の抗体に共有結合したローズベンガルであり、ラテックス粒子は使用しない。さらにもう一つの別法においては、試薬２が第二の抗体に共有結合したローズベンガルであり、かつまた試薬１が、第一抗体が共有結合しているラテックス粒子に共有結合した９−ベンザル−１０−メチルアクリダンである。上記方法にもとづくさらにもう一つの別法においては、試薬１がすぐ上に記載されているものであり、試薬２はアビジンが共有結合しているラテックス粒子に共有結合したローズベンガルであり、かつまたビオチンに共有結合した第二の抗体である第三の試薬（試薬２Ａ）を使用する。試薬１と第三の試薬とを、試料に配合し、次いでインキュベートする。次いで、過剰量の試薬２を加え、引続く処理は上記のとおりに行なう。
【０３５７】
上記方法にもとづく、もう一つの別法においては、ローズベンガルの代りにクロロペルオキシダーゼを使用する。この検定法では、照射工程の代りに、臭化ブロマイドおよび過酸化水素を添加し、一重項状態酸素を発生させる。発射された光を上記のとおりに測定する。
【０３５８】
本発明に係るもう一つの態様においては、上記Ｇｉａｅｖｅｒの刊行物に従い鉱油中の増感剤、クロロフィルから油滴の形態の第一セット（試薬３）を調製する。０．１〜２ミクロンのサイズを有する、この油滴を官能性にし、次いでヒト慢性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）に対するモノクローナル抗体に結合させる。クロロフィルは親油性であり、従ってこの親油性油滴中に不可逆的に溶解する。
【０３５９】
同様の方法で、油滴形の第二のセット（試薬４）を調製する。このセットの油状滴では、この油状滴はＨＣＧに対する第二のモノクローナル抗体に共有結合されており、この第二の抗体は上述の第一のモノクローナル抗体によって認識される以外のＨＣＧ分子の異なる部分を認識する。９−（ジフェニルメチリジン）−Ｎ−メチルアクリダンは、そのアクリダンのフェニル基の一つに結合しているＮ，Ｎ−ジドデシルカルボキシアミド基を含むことによって、この親油性油滴に不可逆的に溶解される。これらモノクローナル抗体は、標準的ハイブリッドセルライン技術によって調製される。
【０３６０】
ＨＣＧを含有するものと予想される尿試料（５０マイクロリッター）をｐＨ７．５の水性緩衝メジウム（５００μＬ）中で、それぞれ過剰量の試薬３および試薬４と配合する。このメジウムを２５℃で２０分間インキュベートする。分離しないで、このメジウムを、Ｈｅ／Ｎｅレーザーを用いて６３３ｎｍで、１分間照射し、次いで発射された光を前記のとおりに測定する。この光の量を、既知量のＨＣＧを含有する試料から発射される量と比較し、この数値の比較によって未知試料中のＨＣＧの量を決定する。この方法によって、ＨＣＧの簡便で、敏感な均一系免疫検定を行なうことができる。
【０３６１】
前記方法にもとづくもう一つの別法においては、試薬３がＨＣＧに対する抗体の代りに、フルオレセインを含有し、追加の試薬（試薬３Ａ）がフルオレセインに共有結合したＨＣＧ抗体を有する。試薬４は第二のＨＣＧ抗体の代りに、アビジンを含有し、そして第四の成分（試薬４Ａ）はビオチンに共有結合した第二の抗体を含有する。この検定においては、試薬４Ａおよび試薬３Ａを試料に配合し、インキュベートする。その後、試薬３および試薬４を加え、次いでインキュベートする。次いで、上記検定法の残りの工程を行なう。
【０３６２】
本発明のもう一つの態様においては、ｐＨ７．４の緩衝液中のリン脂質を、当該目的用に設計されている市販の装置を用いて、０．２ミクロン孔径の膜に通す、高圧抽出によって、一組のリポソーム（試薬５）（０．２ミクロン径）を形成する。このリポソームのホスファチジルエタノールアミンとメチルカルボキシメチルジスルフィドの活性エステルとを反応させ、次いでジチオエリスリトールと反応させることによって、先ずリポソーム上にメルカプトアセトアミド基を形成することにより、リポソームにチロキシン類縁体を共有結合させる。次いで、このスルフヒドリル化したリポソームをブロモアセチルチロキシンと反応させる。このリポソームの親油性部分にメタロ−ポルフィリン染料を溶解させる。
【０３６３】
もう一組のリポソーム（試薬６）を使用し、チロキシンに対するモノクローナル抗体を結合させる。この抗体はチロキシン結合と同様の方法により共有結合させる。このリポソームの表面に、カルボキシアミド結合性基によって、エナミン（２−ジメチルアミノメチレンピラン）を共有結合させる。試薬５および試薬６を、ｐＨ８．０の水性緩衝検定メジウム（５００μＬ）中で、チロキシンを含有するものと予想される血清試料と配合する。このメジウムはアニリノナフタレンスルホン酸（５０マイクロリッター）を含有する。この化合物は、結合性タンパク質からチロキシンを分離し、酸素活性化ピランからのエネルギーを受け取り長波長発光を生じさせる。この検定メジウムを次いで、室温で１時間インキュベートする。分離工程を行なわずに、このメジウムを６５０ｎｍで１分間照射し、生じる発光をルミノメーターにより測定する。得られた数値は、既知量のチロキシンを使用する同様の検定を行なうことによって得られた数値と比較する。この方法により、血清試料中のチロキシンの量が定量できる。
【０３６４】
上記方法にもとづく別法においては、試薬６がチロキシンに対する抗体である代りに、アビジンを含有する。追加の試薬（試薬６Ａ）はビオチンに共有結合したチロキシンに対する抗体を含有する。試薬５はチロキシンの代りに、フルオレセインに対する抗体を含有し、そして追加の試薬（試薬５）はフルオレセインに結合したチロキシンを含有する。この検定法においては、試薬５Ａおよび６Ａを、試料と配合し、次いでインキュベートする。次いで、試薬５および６を加え、この混合物をインキュベートし、検定法の残りの部分を行なう。
【０３６５】
前記方法にもとづく、もう一つの別法においては、メタロ−ポルフィリン染料の代りに、モリブデン酸カリウムを使用し、これをリポソームの水性相に配合する。この検定法においては、照射工程の代りに、過酸化水素を加えて、一重項状態酸素を生成させる。発射された光を前記のとおりに測定する。
【０３６６】
もう一つの態様においては、Ｇｒｉｂｎａｕにより開示された方法と同様の方法により、染料結晶中で、２−ヒドロキシエチル−９，１０−ジブロモアントラセンを生成させる。Ｂ型肝炎表面抗原を認識するモノクローナル抗体を、カルバメート結合基によって、染料結晶に共有結合させる。ラテックス粒子を処理し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する第二の抗体を共有結合により不動化する。このラテックス粒子にはさらに、アミド結合基により９−（ベンザル−９Ｈ−キサンテン）を共有結合させる。この染料結晶は平均２ミクロンの粒子サイズを有し、そしてこのラテックス粒子は０．２ミクロンの平均径を有する。モノクローナル抗体は標準ハイブリッドセルライン技術によって調製される。
【０３６７】
肝炎を患らっているものと予想される患者からの血清試料（５０μＬ）を、ｐＨ７．０の水性検定メジウム（５００μＬ）中で、過剰量の上記染料結晶およびラテックス粒子と配合する。この検定メジウムを次いで、室温で３０分間インキュベートし、次いでキセノン光源を用いて、３５０ｎｍで１分間照射する。試料中にＢ型肝炎表面抗原が存在すると、各抗体と抗原との免疫結合によって、染料結晶とラテックス粒子とが極めて接近する。このメジウムを照射すると、９，１０−ジブロモアントラセンが励起され、分子状酸素を一重項状態酸素に変換する。この一重項酸素はキサンテンと反応し、ジオキセタンを生成させ、このジオキセタンは室温で自発的に分解し、光を発する。この光を分光計によって測定する。或るしきい値レベル以上の光量は試料中のＢ型肝炎表面抗原の存在を示す。このメジウムの照射は室温で行ない、そしてまた、この検定は均一系法で行なわれ、Ｂ型肝炎表面抗原用の検定法を提供する。
【０３６８】
好適には、この検定法において、Ｅｕ（ＴＴＡ）3をラテックス粒子に溶解し、励起したキサンテン誘導体のエネルギーをＥｕ（ＴＴＡ）3に移行させる。これは６００ｎｍ以上のエネルギーを発生する。キサンテンルミネセンスから直接に発射される光は血清成分によって吸収されるので、別段に生じる血清の干渉がこれによって回避される。
【化２９】
もう一つの態様は、赤血球の表面上の特定の血液型抗原、すなわちＡ型抗原を測定する検定法である。１５０〜５００ｎｍの粒子サイズを有し、前記のとおりにして調製されるラテックス粒子を使用する。このラテックス粒子は、このラテックス粒子に共有結合したＡ型抗原に対する抗体を有する。この粒子はまた、このラテックス中に溶解している、エノールエーテル、２−ｐ−ジメチルアミノフェニル−３−フェニル−５，６−ジヒドロジオキセンを含有する。
【０３７０】
このラテックス粒子試薬を水性メジウム（５００μＬ）中で、全血（１００μＬ）および１×１０-4Ｍの増感剤と配合する。この増感剤は疏水性増感剤、すなわちフェナジン−２−カルボン酸である。この疎水性染料は試料中に存在する赤血球中に侵入する。このメジウムを２５℃で１０分間インキュベートし、次いでタングステン光源を用いて、４００〜４５０ｎｍで３０秒間照射する。このメジウムから発射される光を測定し、Ａ型抗原赤血球を含有していないことが判っている試料で得られた光の量と比較する。この場合には、しきい値レベル以上の光の量が血液型Ａ抗原の存在を示す。
【０３７１】
本発明のもう一つの態様においては、被験物質が細胞表面上のＨＬＡ抗原である。ＨＬＡ抗原を含有するものと予想される試料（５０μＬ）を、ｐＨ７．４に緩衝されている水性検定メジウム（５００μＬ）中に装入する。このメジウムにはまた、チオエーテル結合性基によってエモシンに共有結合したＨＬＡ抗原に対する抗体である試薬の過剰量を加える。この検定メジウムに、化学発光性化合物をまた加える。化学発光性化合物は、ＨＬＡ抗原を含有する細胞中に侵入するものであるように選択する。
【０３７２】
この化学発光性化合物は、アクリダン、すなわち９−（ドデシルフェニルメチリジン−１）−Ｎ−（２−スルホンオキシエチル）アクリダンである。この検定メジウムを室温で１時間インキュベートし、次いでタングステン−ハロゲン光源を用いて、５００〜５５０ｎｍで１分間照射する。この検定メジウムから発射される光を測定し、しきい値レベル以上の光の量がＨＬＡ抗原の存在を示す。
【０３７３】
本発明はまた、０．０４〜４０００ナノメーターの平均径を有し、化学発光性化合物を含有する組成物を包含する。この化学発光性化合物は、粒子マトリックスに共有結合されていてもよく、あるいはマトリックス中に溶解されているか、またはマトリックス中に溶解されている溶剤中に溶解されていてもよい。粒子は好ましくは、滴状の重合体または油状物、あるいはリポソームなどの小胞体である。粒子がリポソームである場合には、化学発光性化合物を脂質二重層と会合させるか、またはリポソームの水性内容物中に溶解させる。
【０３７４】
この粒子はそこに結合しているｓｂｐメンバーを含有する。好ましくは、ｓｂｐ結合粒子は１０〜１０００ｍｍの平均径を有する。相互に結合した２種の相補的ｓｂｐメンバーを有し、その一つが増感剤に結合しており、そして他の一つが化学発光性化合物と会合している組成物がまた包含される。
【０３７５】
本発明のもう一つの態様は、組合物を提供する方法にあり、この方法は、（１）被験物質を含有するものと予想されるメジウムおよび（２）ＰＡＣＣと会合した第一の特異結合性の一組の（ｓｂｐ）メンバーを含有するラベル試薬からなる。ｓｂｐメンバー複合体が被験物質の存在に関連して生成される条件を選択する。たとえば、第一のｓｂｐメンバーは被験物質または第二のｓｂｐメンバーに結合して、被験物質の存在に関連する複合体を生成することができるものであることができる。この方法はまた、ＰＡＣＣの光化学的活性化およびＰＡＣＣによって発射されるルミネセンスの量の検出を包含する。このルミネセンスの量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３７６】
一般に、ＰＡＣＣは、光の照射によって、光化学的に活性化される。この光はＰＡＣＣを直接に活性化でき、あるいは増感剤を活性化できるものである。この増感剤は照射されると、分子状酸素を一重項状態の酸素に変換させる。一重項状態の酸素は次いで、ＰＡＣＣを活性化する。増感剤は検定の種類に応じて、リガンドに結合させることができ、あるいは溶液中に自由に存在させることができ、あるいは表面に結合させることができる。一重項状態酸素によるＰＡＣＣの活性化によって生成される生成物は光を発射して、自発的に分解できるか、あるいはさらに物理的または化学的に処理されて、発光することができる。
【０３７７】
ＰＡＣＣを活性化する一重項状態酸素を生成させるために、異なる多くの増感剤を使用することができる。増感剤は直接に、ｓｂｐメンバーに結合させることなく使用することができる。この方法では、比較的大きい濃度、通常少なくとも１０-7Ｍ、好ましくは少なくとも１０-6Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１０-5Ｍの増感剤を使用する。一般に、この方法で使用する増感剤の量は、ＰＡＣＣの活性化をもたらす濃度の一重項状態酸素を生成させるのに充分の量である。この方法は、ＰＡＣＣの発光が実質的に変えられる場合、複合体が生成される場合、あるいはメジウム中のＰＡＣＣの量が通常、結合したラベルと未結合ラベルとの分離によって得られる場合に、使用することができる。
【０３７８】
分離が望まれない場合には、この複合体中のＰＡＣＣの発光はエネルギー受容体によって変えることができ、この場合には、被験物質が存在する結果として生成される複合体にエネルギー受容体が結合することによって、ＰＡＣＣに極めて接近される。このエネルギー受容体が螢光体である場合には、発光の波長が通常、変更される。エネルギー受容体が螢光体ではない場合には、ＰＡＣＣがこの複合体と結合された時点で、その化学ルミネセンスが通常、消失する。
【０３７９】
本発明のもう一つの態様においては、増感剤およびＰＡＣＣを一団の検定メジウム溶液と本明細書に記載の表面とに分配する。この分配は、分析しようとする試料中に存在する被験物質の量に依存し、増感剤は通常、ｓｂｐメンバーに結合させる。表面と会合しない増感剤分子は、一重項状態酸素を生成するが、この一重項酸素は水性メジウム中で崩壊を受ける前にＰＡＣＣに到達することはできない。しかしながら、増感剤およびＰＡＣＣが両方ともに、表面と会合して、被験物質の存在の結果として、複合体を形成する場合には、増感剤の照射によって生成される一重項酸素は、崩壊を受ける前にＰＡＣＣを活性化することができる。この方法において、増感剤の使用量は、増感剤に結合したｓｂｐメンバーを含まない増感剤を用いる前述の方法におけるよりは格別に少ない量であることができる。
【０３８０】
理解できるように、この対象検定法は、試料中の広く種々の被験物質を検出し、測定するための、簡便で、効果的であり、かつまた再現性を有する方法を提供し、この方法には、反応中に生成される光の量の測定に、肉視または慣用の装置を使用することができる。
【０３８１】
被験物質の存在の結果として、増感剤が表面と会合するようになる場合には、増感剤は通常、ｓｂｐメンバーと会合させる。これは、多くの方法で達成することができる。増感剤がｓｂｐメンバーに結合性の官能性基を有していてもよく、あるいはｓｂｐメンバーが増感剤に結合性の官能性基を有していてもよい。この結合は、２個の分子間の直接結合であることができ、あるいはｓｂｐメンバーと増感剤との間に、結合性基を使用することもできる。
【０３８２】
もう一つの態様では、増感剤を粒子に結合させるか、または粒子中に配合することができ、この粒子にはまた、ｓｂｐメンバーを結合させる。両方の場合において、ｓｂｐメンバーは被験物質に結合することができるものである。増感剤は粒子の少なくとも１つの相に可溶性であることから、粒子中に配合することができる。増感剤を粒子中に配合しない場合には、増感剤は粒子に結合させることができる。この目的には、増感剤または粒子、あるいはその成分を官能性にして、増感剤および粒子の結合手段を得る。油状滴の形態または脂質二重層の形態の粒子の場合には、粒子組成に適合しうる長鎖状炭化水素に結合させることによって、増感剤を粒子に結合することができる。多くの場合に、８〜２０個またはそれ以上の炭素原子を有する、少なくとも１種の、好ましくは２種の炭化水素鎖が使用される。
【０３８３】
粒子がフルオロカーボンの滴状物である場合には、増感剤をフッ素化し、その溶解性を増大させ、かつまた交換を減じることができ、好ましくは、結合に使用する炭化水素鎖の代りに、フルオロカーボン鎖を使用する。シリコーン粒子の場合には、増感剤はポリシロキサンに結合させることができる。通常、増感剤の電荷および極性を最少にして、増感剤が粒子の非水性部分内に存在するようにすることが望ましい。前述したように、このｓｂｐメンバーに結合した増感剤を含む方法は、本明細書中に充分に説明されている。
【０３８４】
前述したように、ＰＡＣＣは「ｓｂｐメンバーと会合させる」、すなわち本発明においてＰＡＣＣはラベルとして機能する。本明細書で使用するものとして、「ｓｂｐメンバーと会合」の用語は、次の様相を包含する：通常、ＰＡＣＣとｓｂｐメンバーとの会合は共有結合による。しかしながら、このラベル試薬がまた、懸濁できる粒子からなり、この粒子にＰＡＣＣが結合しているか、またはこの粒子内にＰＡＣＣが非共有的に配合されていることもできる。この懸濁できる粒子はまた、そこに結合したｓｂｐメンバーを有する。
【０３８５】
このｓｂｐメンバーは一般に、被験物質に、または被験物質に結合できるｓｂｐメンバーに、結合することができる。もう一種のｓｂｐメンバーを使用し、これを被験物質に結合させることができる場合には、サンドイッチ検定法が得られる。ＰＡＣＣに結合したｓｂｐメンバーはまた、被験物質に対し類縁体であることができ、この場合には、競合検定法を得ることができる。
【０３８６】
増感剤を使用する場合に、増感剤は、上記諸反応体を含有するメジウムが照射されると、ＰＡＣＣを活性化する作用を果たす。メジウムは増感剤を励起状態に変換し、分子状酸素を一重項状態酸素に活性化できるのに充分のエネルギーの波長を有する光で照射する。ｓｂｐメンバーに結合している場合には、この増感剤の濃度は非常に小さく、しばしば１０-6〜１０-12Ｍまたはそれ以下であることができる。増感剤が結合されていない場合には、増感剤濃度は、明白な量の光を吸収するのに充分の濃度、通常少なくとも０．１％、好ましくは１〜８０％である。
【０３８７】
増感剤の励起状態は通常、最低三重項状態であり、基底状態よりも少なくとも２５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ、好ましくは２３Ｋｃａｌ／ｍｏｌ多くのエネルギーを有する。一般に、メジウムは、約３００〜１２００ｎｍ、通常４５０〜９５０ｎｍ、好ましくは５５０〜８００ｎｍの波長を有する光により照射する。照射時間は活性化ＰＡＣＣの寿命、光強度および所望の発光強度に依存する。短命の活性化ＰＡＣＣの場合には、この照射時間は、マイクロ秒ほどの短い時間であることができ、この場合には、強いフラッシュランプまたはレーザーを使用する。長命な活性化ＰＡＣＣを使用する場合には、この照射時間はさらに長くてもよく、かつまた強度の低い光源を使用することができる。
【０３８８】
一般に、照射期間にわたる集積光強度は増感剤分子の少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも３０％を励起させるのに充分なものであるべきであり、最も好ましくは、増感剤の分子の全部を少なくとも一度は励起させる強度である。
【０３８９】
上記いずれの場合においても、生成される光またはルミネセンスは肉視により、写真により、日射計により、分光光度計により、あるいはいずれかその他の慣用の測定手段により、その量を測定することができ、この量はメジウム中の被験物質の量に関連する。
【０３９０】
ヘリウム−ネオンレーザーは、６３２．６ｎｍで励起させるための、安価な光源である。この波長で光を吸収する増感剤は、ヘリウム−ネオンレーザーの発射線と適合でき、従って本発明において特に有用である。その他の光源には、たとえばアルゴン、ＹＡＧ、Ｈｅ／Ｃｄおよびルビイなどの他のレーザー類、ホトダイオード類、水銀、ナトリウムおよびキセノン蒸気ランプ、タングステンおよびタングステン／ハロゲンなどの強烈なランプ、およびフラッシュランプが含まれる。
【０３９１】
本発明のもう一つの態様は、被験物質の測定方法にあり、この方法は、（ａ）（１）被験物質を含有するものと予想されるメジウム、（２）一重項状態酸素との反応によって化学発光することができる化合物に結合した一対の特異結合体（ｓｂｐメンバー）のうちの第一のメンバーを含むラベル試薬および（３）上記ラベル試薬を含むｓｂｐメンバー複合体が上記メジウム中の被験物質の存在に関連して生成され、上記化学発光性化合物からのエネルギーが下記螢光エネルギー受容体を活性化できる条件の下に、第二のｓｂｐメンバーに結合した、または結合できるようになる螢光エネルギー受容体を含有する不溶化した試薬を、同時的に、あるいは順次全体的または部分的に、検定メジウム中で配合し、（ｂ）上記化合物を光により活性化し、次いで（ｃ）その存在または強度が上記メジウム中の被験物質の量に関連する信号に関して、上記検定メジウムを検査する、ことからなる。
【０３９２】
本発明に係るこの方法および組成物は、リガンド−レセプターなどのｓｂｐメンバーを含む検定法の大部分、たとえば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合検定などに適合させることができる。この検定法は、均一系、不均一系、競合式またはサンドイッチ式であることができる。均一系検定法においては、望ましくない物質を分離するために、必要に応じて、試料を予備処理することができる。サンドイッチ式検定法の場合の免疫学的反応は通常、ｓｂｐメンバー、たとえば抗体および対象試料を包含する。この抗体は被験物質に対し相補的であり、ＰＡＣＣ、第二のｓｂｐメンバー、たとえば抗体に結合することができ、この第二の抗体はまた、被験物質に対し相補的である。競合法においては、ＰＡＣＣは被験物質に対する類縁体、通常、被験物質の誘導体と、または被験物質に対し相補的のｓｂｐメンバー、たとえば抗体と、会合させることができる。
【０３９３】
ＰＡＣＣはそれだけで、またはエネルギー受容体と会合させて使用することができる。エネルギー受容体を活性化するために活性化ＰＡＣＣによって発生される発光能は、２種のｓｂｐメンバーの結合によって支配されることがあり、あるいは活性化ＰＡＣＣの近くに比較的高濃度のエネルギー受容体が存在する結果であることもある。後者の場合に、その濃度は通常、少なくともマイクロモル、通常ミリモルである。これとは逆に、ＰＡＣＣがｓｂｐメンバーに結合している場合には、その濃度は全く少なく、しばしば１０-5〜１０-15、通常１０-8 〜１０-14であり、その程度の検出は、均一溶液中で分離することなく行なうことができるが、ただしＰＡＣＣが結合性複合体中に存在する場合には、ルミネセンス強度は変えられる。
【０３９４】
不均一系検定法では、ｓｂｐメンバーである被験物質を含有するものと予想される試料を、支持体に結合した相補的ｓｂｐメンバーからなる試薬と配合する。この支持体はＰＡＣＣを有する表面または粒子であることができる。もう一つのｓｂｐメンバーと会合しているエネルギー受容体をまた使用することができ、この場合には、このｓｂｐメンバーは被験物質に対し相補的であるか（サンドイッチ式）または類縁体であるか（競合式）のどちらかであることができる。これらの材料は一般に、同時的にあるいは順次全体的または部分的に配合する。この支持体を次いで、液相から分離し、固体相または液体相のどちらかを、通常対象の特定の相の照射、および発射光の量の測定によって、ルミネセンスエネルギーの存在に関して検査する。
【０３９５】
被験物質の検定は通常、中程度のｐＨ、一般に最適検定感度を提供するｐＨにおいて、水性緩衝メジウム中で行なう。前記で説明したように、この検定法は、検定成分または生成物のいずれをも分離することなく（均一系）またはこれらのいずれかを分離して（不均一系）、行なうことができる。
【０３９６】
この水性メジウムは水単独であることができ、あるいは０．０１〜８０容量パーセント、またはそれ以上の補助溶剤を含有していてもよい。メジウムのｐＨは通常、約４〜１３の範囲、さらに通常約５〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜９．５の範囲である。ｐＨは通常、結合性メンバーの最適結合ｐＨと検定の他の試薬、たとえば信号発生物質のメンバーに関して最適のｐＨとの間にある。たとえば、活性化ＰＡＣＣは、崩壊してルミネセンスを発生するために、或るｐＨ範囲を必要とすることがある。
【０３９７】
所望のｐＨを達成し、測定中、このｐＨを維持するために、各種緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタールなどが含まれる。使用する特定の緩衝剤には本発明において制限はないが、各検定毎に、１種または他の１種の緩衝剤が好適である。
【０３９８】
検定の実施には通常、中程度の温度が用いられ、一般に測定期間中、一定の温度、好ましくは室温を使用する。インキュベーション温度は一般的に約５°〜９９℃、通常約１５°〜７０℃、さらに通常では、２０°〜４５℃の範囲である。測定期間中の温度は一般に、約１０°〜７０℃の範囲であり、さらに通常、２０°〜４５℃、さらに好ましくは２０°〜２５℃の範囲である。いくつかの場合には、活性化ＰＡＣＣが崩壊して、ルミネセンスを発生するために、１００℃まで加熱することが求められることもある。
【０３９９】
検定することができる被験物質の濃度は一般に、約１０-5〜１０-17Ｍ、さらに特に約１０-6〜１０-14Ｍで変化する。検定が定量的であるか、半定量的であるか、または定性的であるか、また特定の検出技術および対象の被験物質の濃度などを考慮して、各種試薬の濃度を決定する。
【０４００】
検定メジウム中の各種試薬の濃度は一般に、対象の被験物質の濃度範囲によって決定されるが、各試薬の最終濃度は通常、検定の感度をその範囲全体にわたって最適するために、実験により決定される。すなわち、被験物質の濃度の有意の変化は正確に測定できる信号の差異を提示する。
【０４０１】
添加の順序は広く変えることができるが、検定の種類に応じて或る好ましい順序がある。特に均一系に対する最も単純な添加順序は全ての材料を同時に添加するものである。別法として、各種試薬を全部または部分的に順次配合することもできる。場合により、試薬の配合の後に、インキュベーション工程を含ませることができ、この工程は一般に約３０秒〜６時間、さらに通常、約２分〜１時間の範囲である。
【０４０２】
均一系検定法においては、試薬の全部を配合した後に、所望により、これらをインキュベートすることができる。次いで、この組合せ物を照射し、生じる発光を測定する。この発光は被験試料中の被験物質の量に関連する。均一系検定において使用される本発明の試薬の量は被験物質の種類に依存して変わる。
【０４０３】
当業者が本発明の範囲を認識し、本発明を不当な実験を行なうことなく実施できるために、下記に検定の例を示すが、これは制限する意味を有するものではない。被験物質、増感剤、ＰＡＣＣ、表面、粒子および反応条件の選択は本明細書の記載および下記の例から当業者に示唆されることは明らかである。
【０４０４】
次の検定において、諸成分は、ｐＨ６〜８．５の主として水性のメジウム中に配合する。
Ａ． ＨＣＧ検定では、尿試料を、（１）１ミクロンのラテックス粒子に結合したＨＣＧに対する抗体および（２）ＰＡＣＣ４に結合したＨＣＧの分離した、無重複エピトープに対する抗体と配合する。この懸濁液を３０分間インキュベートした後に、粒子を遠心分離によりメジウムから分離し、洗浄し、次いで３００ｎｍの光を照射する。この照射後に発射される光の強度は試料中のＨＣＧの量に関連する。分離した粒子は、直接に照射することができ、あるいは照射の前に、水性または非水性溶剤中に懸濁することもできる。
【０４０５】
Ｂ． Ａに類似している血清中のＨＣＧの検定方法では、使用するラテックスビーズを増感剤の銅フタロシアニンで染色し、次いでインキュベートした後にメジウムから分離し、次いで６００ｎｍの光を照射する。発射された光の強度は試料中のＨＣＧの量に関連する。
【０４０６】
Ｃ． 血清中のジゴキシンの検定では、ジオキシゲニンに共有結合させたＰＡＣＣのルミノールを、テトラデシルフタロシアニンで染色してあるポリスチレンウエル中で試料とともにインキュベートする。このウエルの表面にはジゴキシンに対する抗体を塗布する。３０分間のインキュベーションおよび検定メジウムの除去の後に、このウエルに６００ｎｍの光を照射する。この照射に先立ち、アルカリ溶液（ｐＨ１０〜１２）を添加すると好ましい。照射後に発射された光の強度は試料中のジゴキシンの濃度に逆比例する。
【０４０７】
Ｄ． 尿中のアルブミンの検定では、試料を、（１）ＰＡＣＣでラベルしたアルブミンに対する抗体および（２）次式のエネルギー受容体でラベルした無重複アルブミンエピトープに対して指向するアルブミンに対する抗体、と配合する：
【化３０】
【０４０８】
Ｅ． 血清中のチロキシンの検定では、試料を、ラテックスビーズに結合したチロキシンと配合する。このビーズには、ＰＡＣＣ１０（Ｘ2はＮ（ＣＨ3）2である）を配合してある。この検定メジウム中には、増感剤、ローズベンガルに結合したチロキシンに対する抗体を含有させる。１０分間のインキュベーションの後に、メジウム５５０ｎｍの光を照射し、この照射を止めた後に発射される光を測定する。この発光の強度は試料中のチロキシンの量に逆に関連する。
【０４０９】
Ｆ． ＤＮＡ含有試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検定では、９−フェニルメチリデンキサンタンであるＰＡＣＣ２３に結合されており、標的配列と相補的な２５−塩基オリゴヌクレオチドを試料と混合する。このメジウムを次いで、７５℃に加熱し、次いで５５℃に冷却し、存在する標的配列にこのオリゴヌクレオチドを交雑する。この雑種形成溶液中には、エネルギー受容体で、挿入体であるアクリジン オレンジ、および増感剤であるフタロシアニン テトラスルホン酸を存在させるか、またはハイブリッド形成反応の完了後に、これらの成分を加えてもよい。この溶液を次いで、６００ｎｍの光で照射し、この照射を止めた後に、アクリジン オレンジによって発射される光（約５００ｎｍ）の強度を測定する。この光強度は標的配列の存在に直接に関連する。
【０４１０】
Ｇ． ＤＮＡ含有試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検定では、増感剤であるフタロシアニンによりラベルされており、標的配列に対し相補的な２５−塩基オリゴヌクレオチドを、上記Ｆと同様に標的に交雑させる。二重鎖ＤＮＡの微少グルーブに結合する化合物であるＨｏｅｃｈｓｈ ｄｙｅ ３３２５８をＰＡＣＣ２０のＮ−メチル−９−フェニルメチリデンアクリダンに結合させ、これをメジウム中に加えるか、またはハイブリド形成の後に加える。このメジウムに次いで、６００ｎｍの光を照射し、この照射の停止後に発射される光を測定する。発光の強度は試料中に存在する標的配列の量に直接に関連する。
【０４１１】
Ｈ． 血清中のＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）の検定では、試料を、（１）ＰＡＣＣで染色されており、かつまたＨＢｓＡｇに対する抗体が塗布されている１５０ｎｍラテックス粒子および（２）増感剤テトラフェニルポルフィリンで染色されており、かつまたＨＢｓＡｇに対する抗体が塗布されている１５０ｎｍラテックスビーズと配合する。この混合物を１時間インキュベートした後に、この懸濁液に５５０ｎｍの光を照射する。この照射の停止後に発射される光の強度を測定する。この強度は試料中のＨＢｓＡｇの量に関連する。
【０４１２】
Ｉ． 全血中のＨＢｓＡｇの検定においては、方法Ｈにしたがうが、ＰＡＣＣ含有ラテックスビーズを、９−フェニルメチリデンキサンタンであるＰＡＣＣ２３および次式のエネルギー受容体により染色したラテックスビーズにより置き換える：
【化３１】
【０４１３】
本発明のもう一つの態様は、被験物質を含有するものと予想される試料中の被験物質の存在またはその量を測定するために、本発明の検定法を簡便に行なうのに有用なキットに関する。本発明の多能性を増すために、諸試薬を同一または別別の容器にパッケージした組合せ物として提供することができる。この組合せ物中の諸試薬の割合は、方法および検定を実質的に最適にする割合にする。諸試薬はそれぞれ、別々の容器に入れることができ、あるいは各種試薬を、試薬の交さ反応性および安定性に応じて、１個または２個以上の容器で組合せることもできる。
【０４１４】
このキットの形態の一つは、（１）ｓｂｐメンバーを結合して有しており、かつまた化学発光性化合物を含有する懸濁できる粒子からなる組成物および（２）増感剤、からなる。この増感剤はｓｂｐメンバーに結合させることもでき、あるいはｓｂｐメンバーが結合されている粒子と会合させることもできる。このキットはまた、別にパッケージされたものとして、補助試薬などを含む検定を実施するための他の試薬を包含することもできる。
【０４１５】
本発明に係る、もう一つの形態のキットは、第一のｓｂｐメンバーを会合している化学発光性化合物、および第二のｓｂｐメンバーと会合しており、その励起状態で、酸素をその一重項状態に活性化することができる増感剤のパッケージされた組合せ物からなる。
【０４１６】
もう一つの形態のキットは、（１）ｓｂｐメンバーに結合したＰＡＣＣを含有する組成物を含有する。このキットはまた、１種または２種以上の追加のｓｂｐメンバー試薬および所望により、増感剤を含有することができる。エネルギー受容体をｓｂｐメンバーに結合させ、試薬を形成することもでき、あるいはエネルギー受容体をそれ自体、試薬として提供することもできる。表面に結合したｓｂｐメンバーを包含させることもできる。このキットはさらにまた、補助試薬などを含む、検定を行なうためのその他の試薬を別のパッケージとして包含することもできる。
【０４１７】
例
本発明を、さらに以下の実施例によって説明する。実施例中で使用される部および百分率は、とくに指示のない限り、重量によるものである。温度は摂氏で表示する。
【０４１８】
略号：
ＡｂF：フルオレセインに対するマウスモノクローナル抗体
Ａｂ1F：内因子に対するマウスモノクローナル抗体
Ｂ12−ＬＣ25−Ｆ：鎖長２５原子の連結基、すなわち
ＨＮ（ＣＨ2)6ＮＨＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2)6ＮＨＣＯＣＨ2ＮＨＣＯ
によってカルボキシフルオレセイン（Ｆ）に連結されたビタミンＢ12
ＢＡ−Ｃ18：４−（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルカルボキシアミドメトキシ）ベンザル−９−メチルアクリジン
【化３２】
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ビオチン−ＬＣ21−Ｆ
【化３３】
Ｃｈｌ−ａ−クロロフィル−ａ
【化３４】
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＧ：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＥＤＡＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
【化３５】
Ｆ−ＮＨＳ：６−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミドＦ−ＬＣ21ＮＨ2：連結基ＨＮ（ＣＨ2)6ＮＨＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2)6ＮＨ2 が結合したカルボキシフルオレセイン
ＨＣＧ：ヒト繊毛性ゴナドトロピン
Ｌｉｐ：リポソーム
ｎＣ10：テトラ−（ｎ−デシル）フタロシアニン塩化アルミニウム錯体
【化３６】
ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18：ＢＡ−Ｃ18含有油滴
ＰＢ：ポリスチレンビーズ
ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18：ＢＡ−Ｃ18含有ＰＢ
ＰＢ／ｎＣ10：テトラ−（ｎ−デシル）アルミニウムフタロシアニン含有ＰＢ
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝食塩溶液０．０２Ｍ ＮａＰｉ，０．１４Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．２
Ｐｉ：リン酸塩
スルホ−ＮＨＳ：スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＴＳＨ：甲状腺刺激ホルモン（チロトロピックホルモン）
ＳＡＴＡ：Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＲＬＵ：相対光量単位
Ａｂ1（ＨＣＧ）：モノクローナル抗−ＨＣＧβ抗体（１２Ａ８）
Ａｂ2（ＨＣＧ）：モノクローナル抗−ＨＣＧα抗体（９Ｄ７）
Ａｂ1（ＴＳＨ）：モノクローナル抗−ＴＳＨβ1抗体（３５）
Ａｂ2（ＴＳＨ）：モノクローナル抗−ＴＳＨβ2抗体（９Ｇ３）
〔注：Ａｂ1（ＴＳＨ）とＡｂ2（ＴＳＨ）において、Ａｂ1およびＡｂ2はＴＳＨのβ鎖の異なる２つのエピトープに対する抗体である〕
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
１Ｆ：内因子
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18：アビジンに共有結合したＢＡ−Ｃ18
ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10：ＡｂFでコートされたＰＢ／ｎＣ10
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＮＢＳＡ：２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸
Ｄｉｇ−ＣＭＯ：ジゴキシゲニン−３−オンのＯ−カルボキシメチルオキシム
ＢＧＧ：ウシγグロブリン
ビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳ：スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）−ヘキサノエート
【０４１９】
モノクローナル抗体はすべて、標準的なハイブリッド細胞法で製造した。略述すれば、適当な免疫原を宿主、通常マウスまたは他の適当な動物に注射し、適当な期間をおいたのちに宿主から脾臓細胞を採取した。別法として、宿主から非感作細胞を単離し、in vitro で免疫原により直接感作した。ハイブリッド細胞は、上記細胞を適当な骨髄腫細胞系と融合し、融合細胞を培養することによって形成させた。培養ハイブリッド細胞を特定の抗原、たとえばＴＳＨまたはＨＣＧに対するその結合親和性についてスクリーニングした。多数のスクリーニング方法、たとえばＥＬＩＳＡスクリーニングが使用された。選択された融合細胞を最クローン化した。
【０４２０】
例 １
ビタミンＢ 12 のアッセイ
Ｂ 12 −ＬＣ 25 −Ｆ接合体の調製
２５原子長の架橋腕をもつＢ12−ＬＣ25−Ｆ接合体（下記参照）は、Ｂ12分子をメチルイソシアネートアセテート（Ｂ12分子中のリボ−スのヒドロキシル基と反応して、安心なカルバメート結合を形成する）と反応させ、ついでメチルエステル塩基加水分解してカルボキシル基を遊離させることによりＢ12分子にカルボキシル基を導入して製造した。５′−ＯＨ位に導入されたカルボキシル基をＢ12のＮＨＳエステルに変換し、ついでフルオレセインアミンＦ−ＬＣ21−ＮＨ2と反応させて最終生成物Ｂ12−ＣＬ25−Ｆを生成させた。
Ａ． ５−カルボキシフルオレセイン上２１原子鎖の合成反応図
【化３７】
１．２ｇ（０．００５６モル）のモノ保護ジアミン１Ｃ１を２５ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、この溶液を攪拌しながら０．６４ｇ（０．００５６モル）の無水グリコール酸１Ａ１を加え、反応混合物を室温に５時間放置した。反応混合物を濃縮し、５０ｍｌの水、５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機相を０．１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍｌ）、水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で濃縮すると１．３５ｇの１Ａ２が生成した。
1Ｈ ＮＭＲ １００ＭＨｚ（ＣＤ3ＯＤ） δ４．０，３．８５（２Ｓ，４，Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ） ｗ３．０，２．８２（２ｔ，４，ＮＣＨ2） δ１．４（Ｓ，ＣＨ3）
【０４２２】
５００ｍｇ（１．３３ミリモル）の５−カルボキシフルオレセイン、１Ａ３（５酸化リン上、８０℃、０．０５ｍｍの真空中で１６時間乾燥）を２０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を攪拌しながら、２８０ｍｇ（１．４６ミリモル）の１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドと１６８ｍｇ（１．４６ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加えた。１６時間攪拌したのち、４００ｍｇ（１．８５ミリモル）のモノｔ−Ｂｏｃ １，６−ジアミノヘキサンを加え、この混合物をさらに４時間室温で攪拌した。得られた混合物を濃縮して濃厚な溶液とし、１：９メタノール−酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解し、水（３×５０ｍｌ）、０．１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発させた。残留物を、Ａｎａｌｔｅｃｈ １０００μ、２０×２０ｃｍシリカゲルＧＦプレート上、ジクロロメタン中０．５％酢酸および１０％メタノールを用いて精製した。純粋なバンドをプールし、ジクロロメタン／メタノール（１：１）で抽出し、濃縮し、残留物を最小量のメタノールに溶解し、水中に滴下した。混合物をついで遠心分離し、固体を真空中で乾燥すると８３％の１Ａ４が生成した。
【０４２３】
３．５ｇ（０．００６４モル）のモノｔＢｏｃ １，６−ジアミノヘキシル−５−カルボニルフルオレセイン１Ａ４（０．０５ｍｍ真空中、五酸化リン上、９０℃で１６時間乾燥）を４０ｍｌのジクロロメタン／トリフルオロ酢酸１／１で処理した。この溶液を氷浴中で５分間攪拌したのち、溶媒を蒸発させ、粗製の残留物を一夜真空中で乾燥した。
【０４２４】
４２ｍｇのモノ−ｔ−Ｂｏｃ １，６−ジアミノヘキシルグリコール酸アミド１Ａ２、２２ｍｇ（０．１９０ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、および３６．４ｍｇ（０．１９０ミリモル）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド４ｍｌの無水ジクロロメタン中に混合し、室温で１６時間攪拌した。この活性化酸の溶液を、上述の１，６−ジアミノヘキシル−５−カルボキシルフルオレセイン誘導体７５ｍｇ（０．１２７ミリモル）、１０ｍｌの無水ジメチルホルムアミドおよび６６ｍｌのトリエチルアミンの溶液に攪拌しながら滴下した。１時間後、反応混合物を水に取り、酢酸エチルで抽出した。有機相を水（３×２５ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、２０×２０ｃｍ １０００ｍ ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦプレート上、ジクロロメタン中１０％メタノール、０．５％酢酸を用いて精製した。純粋なバンドを単離し、メタノール／ジクロロメタンで抽出し、濃縮し、真空中で乾燥した。残留物を４ｍｌのメタノールに取り、攪拌した０．１Ｎ ＨＣｌ（８ｍｌ）中に滴下し、遠心分離し、乾燥し、８４ｍｇの１Ａ５、収率８４％を得た。
1Ｈ ＮＭＲ ５００ ＭＨｚ（ＣＤ3ＯＤ） δ８．４（ｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝．７１Ｈｚ） δ８．１７（ｄｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ） δ７．３（ｄ，１，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ） δ４．０４（ｄ，４，Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ） δ１．４１（Ｓ，９，３ＣＨ3）
元素分析Ｃ42Ｈ52Ｎ4Ｏ11として：Ｃ，６３．７：Ｈ，６．８；Ｎ，７．０
分析値：Ｃ，６３．５６；Ｈ，６．６４；Ｎ７．０
【０４２５】
上記５−カルボキシフルオレセインのｔＢｏｃ−２１−原子長鎖アミン（０．０５ｍｍ真空中、五酸化リン上、８０℃で乾燥）に、室温でトリフルオロ酢酸５ｍｌを加えた。５分後、酸を蒸発させ、ついで真空中８０℃で乾燥させると、トリフルオロ酢酸塩１Ａ６が得られた。
ＦＡＢ−ＭＳ Ｃ37Ｈ44Ｎ4Ｏ（Ｍ＋Ｈ) +６８９
【０４２６】
Ｂ． Ｂ12のリボース環のＯ5′位の、５−カルボキシフルオレセインに連結した２５原子スペーサーによる修飾の反応様式
【化３８】
ビタミンＢ１２（１Ｂ１）（４８時間８０℃で乾燥、１０μ）２５ｍｇ（０．０１８５ミリモル）を１．２５ｍｌの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。この溶液に攪拌しながら、２１．２ｍｇのイソチオシアネート酢酸メチルエステル（０．１８５ミリモル）を加え、反応混合物を室温に２４時間放置した。反応混合物を攪拌した酢酸エチル溶液１０ｍｌ中に滴下した。沈澱した生成物を遠心分離し、ついで最小量のメタノールに再懸濁し、再沈澱させた。この物質を、Ｗｈａｔｍａｎ ＰＬＣ18Ｆ製造用プレート１０００μ ２０×２０ｃｍ上、０．５ｍｌ酢酸＋１ｇＮａＣｌ／１００ｍｌ含有２：８イソプロパノール−水で溶出して精製した。Ｒｆ＝０．６２５。吸着物質から単離するとメチルエステル１Ｂ２が得られた。
（＋）−ＦＡＢＭ５（Ｃ67Ｈ93Ｃ0Ｎ15Ｏ17Ｐ）分子量１４６９．６；（Ｍ＋Ｈ）１４７０，（Ｍ−ＣＮ）+１４４４
【０４２８】
４０ｍｇ（０．０２７２ミリモル）のＢ12Ｏ5′−カルボニルグリシンメチルエステル１Ｂ２を２．５ｍｌの２／１メタノール−水に取り、水酸化アンモニウムでｐＨを９．５に調整し、室温で１６時間攪拌した。
ｔｌｃ分析 Ｗｈａｔｍａｎ ＫＣ18Ｆ
２：８イソプロパノール−水、０．５％酢酸、１％ＮａＣｌ
Ｒｆ≒０．７９
【０４２９】
反応混合物を濃縮乾固し、生成物をＷｈａｔｍａｎ ＰＬＣ18Ｆプレート１０００μ、２０×２０ｃｍ２個を用い、上述と同様に溶出して単離した。純粋なバンドをメタノールで抽出し、抽出液を濃縮し、２：７メタノール−ジクロロメタンに溶解し、濾過し、濃縮した。残留物を４ｍｌのメタノールに溶解し、４ｍｌのエチルエーテルに滴下した。沈殿を遠心分離し、Ｐ2Ｏ5上、０．５ｍｍ、６０℃で１６時間乾燥すると、生成物１Ｂ３ ２８ｍｇが得られた。
（＋）−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ66Ｈ91ＣｏＮ15Ｏ17Ｐ）分子量１４５５．７，（Ｍ＋Ｈ）+１４５６，（Ｍ−ＣＮ）+１４３１
【０４３０】
１５ｍｇ（０．０１３ミリモル）のＢ12Ｏ5′−カルボニルグリシン１Ｂ３、３．６６ｍｇ（０．０１６ミリモル）Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１．９５ｍｇ（０．０１７ミリモル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを５ｍｌの無水ジメチルホルムアミドと混合し、室温で１６時間攪拌した。反応混合物を、１３．６ｍｇ（０．１７ミリモル）の５−カルボキシフルオレセインの２１−原子長鎖アミン１Ａ６と２．０２ｍｇ（０．０２ミリモル）トリエチルアミンの４ｍｌ乾燥ジメチルホルムアミド中溶液に攪拌しながら滴下し、室温で１２時間攪拌した。
【０４３１】
粗製反応混合物を真空下４０℃で濃縮し、残留物を２ｍｌのメタノールに取り、６ｍｌのエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離した。固体をＷｈａｔｍａｎＰＬＣ18Ｆプレート１０００μ ２０×２０ｃｍ上、７：３メタノール−水、０．５％酢酸で溶出して精製した。２Ｒｆ≒０．７８、１Ｂ４ 収率３７％
（＋）−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｃ103Ｈ133ＣｏＮ19Ｏ25Ｐ），（Ｍ＋Ｈ）+２１２５；（Ｍ−ＣＮ）21 ＵＶ／ｍａｘ ３６０（ε ２６，６００），５０（ε５７，０００），５５０（ε ９５００）
【０４３２】
ＩＩ．抗−内因子（Ａｂ IF ）抗体のビオチン化
モノクローナル抗−内因子抗体（ＡｂIF）は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）４９５−４９７に報告された方法に基づく標準的ハイブリッド細胞法によって製造した。
【０４３３】
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．からのビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳを用い、３種の異なるレベルのビオチン化（反応混合物中のＡｂIF：ビオチン＝１：１０，１：５０，または１：２００）を実施した。ＡｂIFは０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．８中〔ＩｇＧ〕＝２．５ｍｇ／ｍｌとした。この溶液に、所要量のビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳを含有するＤＭＳＯ（総容量の１％）を加え、ついで溶液を４℃で一夜インキュベートした。最後に、反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘTM Ｇ−２５上で精製し、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０２％ ＮａＮ3／ｐＨ＝７．２に対して大規模に透析した。ビオチン化−内因子抗体は凍結して保存した。
【０４３４】
ＩＩＩ．粒子の製造
Ａ．原料
１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｂａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ ４６０３２
３８ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｄｕｋｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０３
エチレングリコール、ベンジルアルコール、ベンゾニトリル：ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
ＳｅｐｈａｄｅｘTM Ｇ−２５：Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ｎＣ10：Ｕｌｔｒａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ ９８１０５
【０４３５】
Ｂ．Ａｂ F −ＰＢ／ｎＣ 10
１．３８ｎｍ直径粒子
ｎＣ10の２．１ｍＭ溶液をベンジルアルコール中に調製した。エチレングリコール（１６ｍｌ）を２０ｍｌのガラスバイアルに取り、実験室用ホットプレート上で１００°に加熱した。ベンジルアルコール（１．６ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。保存ラテックス懸濁液（２ｍｌ，１０％固体含有３８ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス）を加え、混合物を３〜４分間放置して平衡化させた。ｎＣ10溶液（０．４ｍｌ）を徐々に１００μｌ部ずつ添加した。１００°への加熱を５分間続けたのち、混合物を放置して温度を室温まで低下させた。冷却後、混合物を、５０％含水エタノールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２．５×１５ｃｍ）に適用した。ラテックス含有分画をプールし、水で平衡化した第二のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（２．５×３５ｃｍ）に適用した。ラテックスは３０ｍｌの容量中に溶出した。
２．１７５ｎｍ直径粒子
ｎＣ10の２．１ｍＭ溶液をベンジルアルコール中に調製した。エチレングリコール（８０ｍｌ）を１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに取り、実験室用ホットプレート上で１１０°に加熱した。ベンジルアルコール（８ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。ｎＣ10溶液（２ｍｌ）を加え、ついで直ちに保存ラテックス懸濁液（１０ｍｌ，１０％固体含有１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス）を添加した。１００°〜１１０°への加熱を激しく攪拌しながら１０分間継続した。ついでフラスコを室温の水浴中に置き冷却した。冷却後、混合物を等容量のエタノールで希釈し、直ちに１５，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ，ＳＡ６００ローター）で２時間遠心分離した。わずかに青色の上清を傾潟し、ペレットを、粒子を分散するために浴ソニケーターを用いて５０％含水エタノール（２０ｍｌ）中に再懸濁した。遠心分離を１５，０００ｒｐｍで１時間反復した。上清を傾潟し、ペレットを水に再懸濁した。最後の遠心分離ののち、ペレットを水に再懸濁し、最終容量を２０ｍｌとした。
【０４３６】
３．ビーズのＡｂFへの結合は例３，Ｖに記載する。
【０４３７】
Ｃ．アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ 18
１７５ｎｍ直径粒子
ＢＡ−Ｃ18の１０ｍＭ溶液をベンゾニトリル中に調製した。エチレングリコール（８０ｍｌ）を１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに取り、実験室用ホットプレート上で１００°に加熱した。ベンゾニトリル（９ｍｌ）を加え、混合物を電磁攪拌器で攪拌した。ＢＡ−Ｃ18溶液（１ｍｌ）を加え、ついで直ちに保存ラテックス懸濁液（１０ｍｌ，上述の１０％固体含有１７５ｎｍラテックス）を添加した。加熱を１００°で、激しく攪拌しながら５分間継続した。ついでフラスコを室温の水浴中に置いて冷却した。冷却後、混合物を等容量の５０％含水エタノールで希釈し、直ちに１５，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌ，ＳＡ６００ローター）で計４時間遠心分離した。上清を傾潟し、ペレットを、粒子を分散させるために浴ソニケーターを用いて含水エタノール中に再懸濁した。遠心分離を１５，０００ｒｐｍで１時間反復した。上清を傾潟し、ペレットを水に再懸濁した。最後の遠心分離ののち、ペレットを水に再懸濁して最終容量を２０ｍｌとした。
ビーズのアビジンへの結合は例３，ＶＩに記載する。
【０４３８】
ＩＶ．アッセイプロトコール
アッセイは、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１％ ＢＳＡ，ｐＨ７．５。ＢＳＡはＢ12およびＢ12バインダーを含まなかった）中、Ｂ12カリブレーター（元の１０μｇ／ｍｌ Ｂ12保存溶液から希釈、１０μＭ ＫＣＮ）１００μｌを５０ｍｌの２．２ｎｇ／ｍｌ Ｂ12−ＬＣ25−Ｆおよび５０μｌの予め混合した８８ｎｇ／ｍｌ内因子（ＩＦ）、８．８μｇ／ｍｌ ＡｂＩ F−ビオチンと混合して実施した。これらの混合物を室温、暗所で１５分間インキュベートし、ついで各チューブに１０10ビーズアビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18および２．５×１０11ビーズＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10を含有する０．７５ｍｌの０．０５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ｐＨ８．２緩衝液を加え、インキュベーションをさらに３０分間、室温暗所で振盪しながら継続した。最後に、各チューブを、光源として６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプを用いて１分間照射し、ついで化学ルミネッセンス光を、Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターを用いて２０秒間集積して測定した。結果は図１にまとめる。
【０４３９】
例 ２
ジゴキシンのアッセイ
Ｉ．Ａｂ Dig −ビオチンの製造
抗−ジゴキシンモノクローナル抗体（ＡｂDig）は標準的ハイブリッド細胞系法に従って製造し、抗体は固定化プロテインＡで精製した。ついで、この抗体（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．８中約２〜２．５ｍｇ／ｍｌ）とビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．）（まずＤＭＦ中に可溶化し、その小部分を反応に使用）を互いに混合し、４℃に３時間インキュベートしてＡｂDig−ビオチンを製造した。反応混合物中、反応原料のモル比は抗体：ビオチン−ＬＣ7−ＮＨＳ＝１．２５であった。カップリングしなかったビオチンはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムによって除去した。最終の接合体は、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．００１％チメロサール／ｐＨ＝７．４中、４℃または凍結して保存した。
【０４４０】
ＩＩ．Ｄｉｇ−ＬＣ 9 −Ｆの製造
この試薬は、（１）Ｆ−ＮＨＳ、（２）Ｆ−ＬＣ9−ＮＨ2、および（３）Ｄｉｇ−ＬＣ9−Ｆを製造することにより３連続工程で調製した。
Ａ．Ｆ−ＮＨＳの製造：ＤＭＦ中１００ｍｇ／ｍｌ ６−カルボキシフルオレセインおよび３０．６ｍｇ／ｍｌ ＮＨＳの溶液２ｍｌに、２７５ｍｇ／ｍｌＤＣＣ ０．４ｍｌを加えた。混合物を室温暗所で一夜攪拌した。生成したジシクロヘキシル尿素を濾去した。Ｆ−ＮＨＳの形成は、シリカプレート上ＣＨ2Ｃｌ2：メタノール：酢酸＝８５：１５：１の溶媒系を用いたＴＬＣによってチェックした。ＤＭＦをロートバップで除去し、生成物（Ｆ−ＮＨＳ）はさらに減圧下で乾燥し、乾燥器中に４℃で保存した。
【０４４１】
Ｂ．Ｆ−ＬＣ 9 −ＮＨ 2 の製造：ＤＭＦ中ビス−（３−アミノプロピル）−メチルアミン（ＬＣ9）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）の溶液１．５ｍｌに、ＤＭＦ中１２５ｍｇ／ｍｌ Ｆ−ＮＨＳ １．２ｍｌを加え、ついで室温暗所で攪拌しながら一夜インキュベートした。Ｆ−ＮＨＳ：ＬＣ9のモル比は１：４０であった。次に反応混合物を０．５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．０で１／２０に希釈し、混合物のｐＨをリン酸（１．０Ｍ）の添加によって５．０に調整し、全混合物を、０．５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝５．０で平衡化したＢｉｏＲｅｘ−７０TMカラム（２．５×１０ｃｍ）上に負荷した。負荷後、カラムを、ビス−（３−アミノプロピル）メチルアミンが除去されるまで（ＴＮＢＳＡ反応でモニタリング）開始緩衝液で洗浄した。カラムを０．００１Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝６．０で洗浄して６−カルボキシフルオレセイン夾雑物を除去した。低イオン強度緩衝液による洗浄で、６−カルボキシフルオレセインのみでなく、同定されていない他のフルオレセイン含有夾雑物も除去された。次に、カラムをＤ−Ｈ2Ｏで洗浄して塩を除去した。最後にカラムを０．８Ｍ ＮＨ4ＯＨで溶出した。水酸化アンモニウムを凍結乾燥で除去した。純度をチェックしたのち、生成物を−２０℃で乾燥器に保存した。反応は濾紙電気泳動（パラゴン電気泳動システムを用い、０．０５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ＝５．８で２０分間）およびＴＬＣ（溶媒としてＤ−Ｈ2Ｏ中５０％メタノールを用い、Ｃ18プレート上）で追跡した（また、生成物の純度をチェックした）。
【０４４２】
Ｃ．Ｄｉｇ−ＬＣ 9 −Ｆの製造：米国特許第４，０３９，３８５号例２の記載（この開示は参考として本明細書に導入する）に従って製造したＤｉｇ−ＣＭＯ２３．０５ｍｇ（０．０５ミリモル）、５０．３５ｍｇ（０．１ミリモル）のＦ−ＬＣ9−ＮＨ2および１９．２ｍｇ（０．１ミリモル）のＥＤＡＣを１．５ｍｌのＤＭＦ／ＤＭＳＯ（５：１）溶媒中に含有する溶液を、室温暗所で一夜攪拌した。Ｄｉｇ−ＬＣ9−ＦおよびＤｉｇ−ＣＭＯ（未反応分が残っていれば）を、３ｍｌのＤ−Ｈ2Ｏを添加して沈殿させ、濾過し、溶媒を捨てた。濾過された物質をＣＨ2Ｃｌ2：メタノール：酢酸＝６０：４０：５からなる溶媒系に再溶解し、同じ溶媒系中シリカゲルカラム（１．５×２０ｃｍ）上に負荷した。これらの条件下に、Ｄｉｇ−ＣＭＯはＤｉｇ−ＬＣ9−Ｆ接合体の前を移動し、Ｆ−ＬＣ9−ＮＨ2はカラムの頂部に結合したままであった。この物質の純度は、上述の溶媒系を用いたＴＬＣシリカゲルプレート、および濾紙上ｐＨ＝５．８における電気泳動によってチェックした。精製された物質からロートバップによって溶媒を除去し、生成物を最小容量のメタノール／ＤＭＦ（７０：３０）に再溶解し、ついで遠心分離して不溶性物質（シリカゲル）を除去した。最終工程は、精製時に可溶化されて生成物と共溶出する大部分のシリカゲルの除去のために実施された。生成物はメタノール／ＤＭＦ（７０：３０）溶媒系中に−１０℃〜−２０℃で保存した。生成物の濃度は、既知量の６−カルボキシフルオレセインを用いて作成した標準曲線からＡ490によって測定した。
【０４４３】
ＩＩＩ．アッセイプロトコール
アッセイは、血清（ヒト無ＴＳＨ正常血清）中ジゴキシンカリブレーター５０ｍｌを、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＧＧ／ｐＨ８．２）中１．７４ｎｇ／ｍｌ ジゴキシン−ＬＣ9−Ｆ接合体５０μｌおよび上述の同じ緩衝液中１６０ｎｇ／ｍｌのＡｂDig−ビオチン５０μｌと混合して実施した。これらの混合物を室温で１５分間インキュベートし、ついで各チューブに、１０10アクセプタービーズ（アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）および２．５×１０11感作ビーズ（ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10）を含有する０．７５ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ８．２緩衝液を加えて、インキュベーションを室温暗所でさらに３０分間継続した。最後に、各チューブを、光源として６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプを用いて１分間照射し、ついで化学ルミネッセンス光をＴｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターを用いて２０秒間測定した。結果は図２にまとめる。
【０４４４】
例 ３
ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよび甲状腺
刺激ホルモンのアッセイ
Ｉ．試薬および原料
Ａ． ＢＡ−Ｃ18は以下の操作によって製造した。
試薬は、とくに指示したものを除き、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した。
１．ｐ−ホルミルフェノキシ酢酸ジオクタデシルアミド
新たに蒸留したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍｌ溶液に、ｐ−ホルミルフェノキシ酢酸（Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｓ）（分子量１８０，０．５４０ｇ，３．０ミリモル）、トリエチルアミン（分子量１０１．１９，０．３３３ｇ，３．３ミリモル）およびトリメチルアセチルクロリド（分子量１２０．５７，０．３９８ｇ，３．３ミリモル）を添加した。２０分間還流加熱したのち、ジオクタデシルアミン（Ｆｌｕｋｅ）（分子量５２２．０１，１．７２３ｇ，３．３ミリモル）を加えた。反応混合物を一夜還流した。
翌日、反応混合物を水で希釈し、反応溶液をメチレンクロリドで抽出した。メチレンクロリド抽出液を硫酸ナトリウム上で乾燥した。
【０４４５】
２．ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルカルボキシアミドメトキシベンザル−９−メチルアクリダン
無水ＴＨＦ中１０−ジメトキシホスフィニル−９−メチルアクリダン（Ｍｏｎａｔｓｈｉ Ｃｈｅｍ．１１４，３，１９８８）（分子量３０３．２７，０．１００ｇ，３．３ミリモル）に、ヘキサン中１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウム溶液０．４１３ｍｌを−７８℃で（アセトン／ドライアイス浴）アルゴン下に添加した。ｎ−ブチルリチウム溶液を加えると溶液は黄色を呈した。ｎ−ブチルリチウムの添加２０分後に上記アミドのＴＨＦ溶液を添加した。反応溶液を一夜放置して温度を室温まで上昇させた。
翌日、生成物をＴＬＣ（シリカゲル−３：７酢酸エチル／ヘキサン）によって単離した。単離された生成物はマススペクトル分析およびＮＭＲで分析し、暗所に保存した。
【０４４６】
Ｂ．一重項酸素発生染料（ｎＣ10）はＵＬＴＲＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。ＥＤＡＣ，ＳＡＴＡ，ＨＣＧ，およびＢＳＡはＳｉｇｍａ Ｃｏ．から入手した。Ａｂ1（ＴＳＨ）−ビオチンおよびＡｂ2（ＨＣＧ）−ビオチンならびにＡｂ2（ＴＳＨ）−Ｆは例１のＩＩの記載の操作と同様にして製造した〔また、米国特許出願０７／３８９，６５９号（１９８９年８月４日出願）、欧州特許公告４１１，９４５号（１９９１年２月６日公告）に対応参照。その関連部分を参考として本明細書に導入する〕。
Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓのルミノメーター（２０ｅ型）を用いた。
【０４４７】
ＩＩ．抗−ＨＣＧ抗体で安定化した油滴〔Ａｂ 1 （ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ 18 ）の製造
抗−ＨＣＧ抗体標識油滴（ＯＤ）は、１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ抗−ＨＣＧ−β（１２Ａ８，ＩｇＧ）を、ジブチルフタレート中５ｍＭ ＢＡ−Ｃ18 ５０μｌ含有ガラス管中に移して製造した。蛋白質は０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５ＭＮａＣｌ／ｐＨ７．６中に取った。油分は超音波処理と同時に連続的な機械的攪拌を行い乳化した。小さな油滴の調製には高エネルギーのソニケーターが必要なことに留意すべきである。超音波処理はＢｒｏｎｓｏｎソニケーターを用いて７分間行った（冷却剤として室温の流水を使用した）。２５％ Ｎａ2ＳＯ4溶液を加えて非結合蛋白質を除去すると８％〜９％の最終濃度が得られ、ついで遠心分離した（マイクロフュージ，セット８，１０分間）。洗浄工程は３回実施した（遠心分離速度は、油滴が分離されるが合体はしないように調整しなければならない）。最終の洗浄後、粒子を１ｍｌの０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ
ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６に懸濁し、３分間再び超音波処理した。調製物の最終容量を５ｍｌに調整し、スクロースを最終濃度２％に添加した。これらのＡｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18粒子は４℃で保存した。上述の方法によって製造した油滴のサイズは不均一で、平均直径は１〜５μであった。
【０４４８】
ＩＩＩ．アビジン−Ｌｉｐ／ｎＣ 10 の製造
リポソームはメタノール希釈法で製造した。典型的には、脂質混合物、すなわちコレステロール（２．０ｍｇ）、ＤＰＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）（２３．８）、ＤＰＰＧ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）（６．５ｍｇ）、マレイミド−ＤＰＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅ）（０．５ｍｇ）およびｎＣ10（０．５ｍｇ）を温メタノール（２００μｌ）に溶解し、ついで攪拌した緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５ＭＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ６．０）２ｍｌ中に添加した。次にこの懸濁液を緩衝液Ｂ中Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１．５×２０ｃｍ）に通した。リポソーム含有分画をプールし、必要な場合には大きな粒子を除去するためにマイクロフュージで遠心分離した。最後に、マレイミド含有リポソームを、緩衝液Ｂ中スクシニル化アビジン−ＳＨ（以下に記載のようにして製造）の溶液に攪拌しながら添加した。アルゴンで通気洗浄後、この混合物を一夜４℃で穏やかに混合した（攪拌棒は使用しない）。２ｍＭのメルカプトコハク酸（反応混合物容量）により４℃で３０分間処理して過剰のマレイミド基を遮断し、ついでヨード酢酸を最終濃度５ｍＭになるように加えて過剰のチオール基を遮断した（４℃，３０分）。ついで反応混合物をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０TM装置によって２．５〜３ｍｌに濃縮し、カップリングしなかったアビジン分子は、緩衝液Ｂ中Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−２Ｂカラム（１．５×５０ｃｍ）でゲル濾過して除去した。
【０４４９】
ＩＶ．スクシニル化アビジン−ＳＨの製造
アビジンをＳＡＴＡ（アビジン１モルあたり５モル）と４℃で一夜反応させた（１Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍｌアビジン）。この溶液にＤＭＦ中無水コハク酸（アビジン１モルあたり５０モル）を加え（総ＤＭＦは反応容量の１％未満）、溶液を２時間インキュベートした。反応混合物のｐＨは０．５ＭＮａ2ＨＰＯ4を添加して７．４に維持した。室温で１時間ヒドロキシルアミン（０．１Ｍ，ｐＨ７．０で）によって処理して保護チオール基を遊離させた。最後に、緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．０５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ６．０、気体を除去し、アルゴンを飽和）中１．５×３０ｃｍ Ｇ−２５カラムを用いて過剰の小分子量分子を除去した。蛋白質のピーク（アビジン−ＳＨ）を集め、この蛋白質をマレイミド含有リポソームと反応させた。
【０４５０】
Ｖ．抗−フルオレセイン被覆ｎＣ 10 染色ビーズ（Ａｂ F −ＰＢ／ｎＣ 10 ）の製造
カルボキシル化ポリスチレンビーズ（３８ｎｍ）（例１，ＩＩＩＢ参照）をｎＣ10で染色した。ＥＤＡＣ／スルホ−ＮＨＳの接合法を用いて、これらのポリスチレンビーズにＡｂFをカップリングさせた。典型的には、５ｍｇ／ｍｌ ｎＣ10染色カルボキシル化ポリスチレンビーズおよび１１ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳを含む０．０２Ｍ ＮａＰｉ（ｐＨを５．５に調整）１０ｍｌを、新たに調製したＥＤＡＣ（２００ｍｇ／ｍｌ）のＤ−Ｈ2Ｏ中溶液１ｍｌと混合した。室温（暗所）で２５分間インキュベートしたのち、ビーズを遠心分離して過剰のＥＤＡＣを除去した（ＥＤＡＣはこれらのビーズの微小凝集を起こさせるので、たとえばＳｏｒｖａｌのＳＡ−６００ローターを１５０００ｒｐｍで使用する慣用の遠心分離で、それらをペレット化することが可能であった）。ペレット化されたビーズを３ｍｌの０．００５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．８に再懸濁し、攪拌した蛋白質溶液〔１５ｍｌの０．０２Ｍ Ｂｏｒａｘ，０．０８Ｍ ＮａＣｌ，２ｍｇ／ｍｌ ３ＧＩ ＩｇＧ（ＡｂF），８ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ８．９）中に移した。この混合物を一夜４℃で穏やかに振盪した（攪拌はしない）。ビーズ上に反応性の基が残っていれば、０．０８３Ｍグリシンおよび１５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ８．９により４℃で６０分間処理して遮断した。カップリングしなかった蛋白質は、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．６で連続洗浄して除去した。最終ペレットは洗浄緩衝液に再懸濁し、超音波処理し、そのまま４℃に保存した。これらのビーズの最終サイズは１４０ｎｍであった。
【０４５１】
ＶＩ．アビジン被覆、ベンザルアクリジン染色ビーズ（アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ 18 ）の製造
カルボキシル化ラテックスビーズ（０．１７５μ）をＢＡ−Ｃ18で染色した（例１，ＩＩＩＣ参照）。これらの粒子へのアビジンの接合には、ＥＤＡＣ／スルホ−ＮＨＳ接合法を使用した。スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣによるビーズの活性化は、ＡｂFＰＢ／ｎＣ10の製造について上述したのと同じ方法で実施した。活性化されたビーズ（１００ｍｇ）は遠心分離してＥＤＡＣを除去し、ついで２．５ｍｌの０．００５Ｍ ＮａＰｉ／ｐＨ５．８に再懸濁し、攪拌したアビジン溶液（１５ｍｌの０．０２５Ｍ Ｂｏｒａｘ，１．３３ｍｇ／ｍｌ アビジン／ｐＨ９．１）中に移した。ついで混合物を４℃で一夜、穏かに混合した。２０μｌのＤＭＦ中１Ｍ無水コハク酸（アビジンに対して６０倍モル過剰）を加えてビーズ上のアビジンをスクシニル化し、さらに４℃で１時間インキュベートした。ビーズを７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（反応混合物中の最終濃度）により４℃で６０分間遮断した。最後にビーズを０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．６で３回遠心分離によって洗浄し、１０ｍｌの洗浄緩衝液中に保存した。最終工程で、ビーズを超音波処理して、モノ分散粒子を得た。蛋白質の標識後も粒子サイズには有意な変化はなかった（約１９０ｎｍ）。アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18は洗浄緩衝液中４℃で保存した。
【０４５２】
ＶＩＩ．ビオチン−ＬＣ 21 −Ｆの製造
１．反応式
【化３９】
２．原料
６−カルボキシフルオレセイン、Ｋｏｄａｋ
ビオチン−ＮＨＳエステル、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
酸化カルシウムから蒸留した乾燥ＤＭＦ、
Ａｇ−ＭＰ−１（Ｃｌ-）陰イオン交換樹脂、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
【０４５４】
３．フルオレセインアミン塩酸塩ＶＩＩ３
６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＩ １）（１０ｇ，２６．６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．２２ｇ，２８ミリモル）を固体としてＤＭＦ溶液に加え、溶解させた。ついで混合物を氷浴で冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（５．８ｇ，２８ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、上述の冷ＤＭＦ溶液に一度に加えた。混合物を氷浴の温度で３０分間攪拌し、ついで放置して温度を室温まで上昇させた。反応の経過はｔｌｃ（１％酢酸含有１０％ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2）で追跡した。３時間後にフルオレセインＮＨＳエステルＶＩＩ２の生成は完結した。
【０４５５】
４，９−ジオキサ−１，２−ドデカンジアミン（２５．５ｇ，１２５ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）で希釈した。フルオレセインＮＨＳエステル反応混合物をアルゴン気相下氷中で冷却し、ジアミン溶液を５分間を要して滴加した。冷却浴を取り去り、攪拌を室温で継続した。反応の経過は上記の系を用いたｔｌｃで追跡した。反応が完結したと判断された時点で、反応混合物を水（１００ｍｌ）によって希釈し、氷中で冷却してジシクロヘキシル尿素を沈殿させ、これを濾過して除去した。
【０４５６】
濾液にＡＧ−ＭＰ−１（Ｃｌ-）陰イオン交換樹脂を懸濁させ、クロマトグラフィーカラム中に注いだ。樹脂を、ニンヒドリンで遊離のジアミンがも早検出されなくなるまで５０％含水メタノールで洗浄した。ついで樹脂を５０％含水メタノール中０．１Ｎ塩酸で溶出した。フルオレセインアミン塩酸塩が最初に、ついで６−カルボキシ−フルオレセインが溶出した。純粋な分画をプールし、ロートバップで乾固させた。高真空下に乾燥すると、純粋なフルオレセインアミン塩酸塩（ＶＩＩ３）３．４ｇが回収された。
【０４５７】
４．フルオレセイン−ＬＣ 21 −ビオチン ＶＩＩ４
フルオレセインアミン塩酸塩ＶＩＩ３（３５０ｍｇ，０．６１ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（３００ｍｌ）、ついでビオチンＮＨＳエステル（４４５ｍｇ，０．８ミリモル）を添加した。反応の経過はｔｌｃ（ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2−酢酸−水，２０：７８：１：１）で追跡した。反応が完了したと判断された時点で、ＤＭＦをロートバップで除去した。残留物をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（１０ｇ）を懸濁させた。この懸濁液をロートバップで流動性の粉末に乾燥し、これをジクロロメタンに懸濁し、ジクロロメタンで平衡化したシリカゲルカラム（２．５×２５ｃｍ）の頂部に適用した。カラムを上記ｔｌｃ溶媒混合物で溶出した。生成物を含有する分画をプールし、溶媒をロートバップで除去した。残留物をエタノールに取り、濾過した。濾液をゆっくり蒸発させると、生成物はゴム状物として枕積した。ゴム状物を高真空下に乾燥すると、フルオレセイン−ＬＣ21−ビオチンＶＩＩＩ４（Ｆ−ＬＣ21−ビオチン）３５０ｍｇが得られ、これはさらに精製することなくそのまま使用した。
【０４５８】
ＶＩＩＩ．アッセイ
Ａ．ＨＣＧアッセイ標準曲線（Ｌｉｐ含有ＯＤ）
ＨＣＧアッセイはまず、ＨＣＧ（量を様々に変えて）、Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18およびＡｂ2（ＨＣＧ）−ビオチンを互いに混合することによって実施した。室温で１時間インキュベートしたのち、過剰量のアビジン−Ｌｉｐ／ｎＣ10を加え、インキュベーションを室温でさらに３０分間続けた。最後に、チューブをそれぞれ１分間照射し、ルミネッセンスを２０秒間測定した。
【０４５９】
プロトコール：
サンプル緩衝液〔０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ＢＳＡ，２０％スクロース，４ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（Ｔ−５００）ｐＨ７．５〕中様々な濃度のＨＣＧ５０μｌ、
アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ＢＳＡ，ｐＨ７．５）中４μｇ／ｍｌ Ａｂ2（ＨＣＧ）−ビオチン５０μｌ、および
Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18試薬５０μｌ（５×１０8ＯＤ／チューブ）を混合する。
室温、暗所で振盪しながら１時間インキュベートする。
１．５×１０12アビジン−ｎＣ10 Ｌｉｐ ５０μｌ（７．３×１０10Ｌｉｐ／チューブ）を添加する。
室温、暗所で振盪しながらインキュベートする。
ハロゲンランプ（６５０ｎｍカットオフフィルターを使用した場合の光出力１２０ｍＷ）を１分間照射する。
ついで光源を切り、放射光の強度を２０秒間測定する。
結果は図３にまとめる。
【０４６０】
Ｂ．ビオチン−ＬＣ 21 −Ｆのアッセイ
試験は、５０ｍｌのアビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18（２×１０11ビーズ／ｍｌ）、５０ｍｌのＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10（５×１０12ビーズ／ｍｌ）および１００ｍｌのビオチン−ＬＣ21−Ｆ（様々な量）を、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５ＭＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６中に混合することにより実施した。この混合物を室温、暗所で、振盪しながら１．５時間インキュベートした。最後に、各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフフィルターを添付）で１分間照射したのち、光出力を２０秒間Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターで光強度を集積して測定した。結果は図４にまとめる。
【０４６１】
Ｃ．ＴＳＨアッセイ標準曲線
ＴＳＨアッセイは、０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６中様々の濃度のＴＳＨ２００μｌを、５０μｌの４μｇ／ｍｌ Ａｂ1（ＴＳＨ）−ビオチンおよび４μｇ／ｍｌ Ａｂ2（ＴＳＨ）−Ｆと混合することによって実施した。これらの混合物を室温で１．５時間インキュベートした。ついで各チューブに１００μｌの１０10アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18ビーズおよび２．５×１０11 ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10ビーズ含有ＰＢＳを添加した。インキュベーションを室温でさらに１．５時間続けた。最後に各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフフィルターを添付）で照射したのち、光出力を２０秒間Ｔｕｒｎｅｒ ２０ｅ ルミノメーターで光強度を集積して測定した（図５および図６）。
【０４６２】
例 ４
可溶性フォトセンシターザーおよび
アクセプター油滴を使用したＨＣＧアッセイ
Ｉ．試薬：
アクセプター染色油滴＝Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18（例３，ＩＩに記載）
Ａｂ2（ＨＣＧ）−ビオチン：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入したビオチンのＮＨＳ誘導体から、例２，Ｉと同様にして調製
ストレパビジン−Ｔ６８０：Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ
Ｃｏ．より。上述のｎＣ10染料の可溶性類縁体で標識されたストレパビジン
【０４６３】
ＩＩ．アッセイ
アッセイは、様々な量のＨＣＧを含有するサンプル緩衝液〔０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，４ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（Ｔ５００），２０％スクロース／ｐＨ７．６〕５０μｌを、アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＰｉ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ｐＨ７．６）中４μｇ／ｍｌ抗−ＨＣＧ−ビオチンおよび５×１０8油滴含有Ａｂ1（ＨＣＧ）−ＯＤ／ＢＡ−Ｃ18試薬５０μｌと混合して実施した。この混合物を、室温、暗所で１時間インキュベートした。ついで、アッセイ緩衝液中２μｇ／ｍｌのストレパビジン５０μｌを各チューブに加え、インキュベーションをさらに３０分間続けた。最後に、各チューブをハロゲンランプ光源（６５０ｎｍカットオフフィルター添付）で１分間照射し、Ｔｕｒｎｅｒの２０ｅルミノメーターを用いて２０秒間光出力を測定した。結果は図７にまとめる。
【０４６４】
例 ５
標的オリゴヌクレオチドの均一系アッセイ
標的配列は大腸菌Ｋ１２ ＤＮＡ Ｊ遺伝子（Ｊ．Ｃ．Ａ．Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｋ．Ｔｉｌｌｙ，Ｅ．Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｚｙｌｉｃｚ ＆ Ｃ．Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１７８２−１７８５，１９８６）から選択した。Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０を用いるホスファイトトリエステル法によって、以下の配列をもつ５０マーを製造し、Ｂｉｏｔｉｎ−ＯＮTM Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて５′末端にビオチンを導入した。
【０４６５】
フルオレセインは、改変ヌクレオチドＮ4−ＬＣＡ−５−メチルデオキシシチジンＣＥＤＴ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を挿入し、ついで５−カルボキシフルオレセインのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ含有ｐＨ９．０ ＮａＨＣＯ3中２００倍モル過剰使用して、そのエステルで標識した。粗生成物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。アビジン−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18およびＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10ビーズは前例の記載と同じであった。
【０４６６】
標的についての標準曲線は、それを、４ｇ／ｌウシ血清アルブミンおよび１０ｍｇ／ｍｌウシ胸腺ＤＮＡを担体として含有する５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，６００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５中に系列希釈して作成した。その一部（５μｌ）を、１２×７５ポリプロピレン試験管中、同一緩衝液５μｌに取った４．８ピコモルのフルオレセイン標識プローブに添加した。混合物を覆って、７２℃に１０分間加熱して、完全なハイブリダイゼーションを保証した。４ｇ／ｌウシ血清アルブミン含有５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，６００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５の５０μｌ中に約１０10のドナー（センシタイザー）（ＡｂF−ＰＢ／ｎＣ10）を加え、ついで同一の緩衝液５０μｌ中２．５×１０11アクセプター（Ａｖｉｄｉｎ−ＰＢ／ＢＡ−Ｃ18）ビーズを添加した。旋回振盪機上、室温で３０分間振盪したのち、各チューブを前例に記載した６５０ｎｍフィルター付きハロゲンランプを用いて１分間照射した。Ｔｕｒｎｅｒルミノメーターを用いて２０秒間、光の発生を測定した。得られた標準曲線は図８に示す。
【０４６７】
例 ６
ビオチン化プローブおよびフルオレセイン化
プローブに結合する合成標的の検出
ビオチン化プローブの製造
脱塩した５′−アミノ−修飾オリゴヌクレオチド（３０マー）
５′−ＵＡＡ−ＴＡＣ−ＡＧＧ−ＴＴＧ−ＴＴＧ−ＣＣＴ−ＴＣＡ−ＣＧＣ−ＴＣＧ−ＡＡＡ−３′
５０ナノモルを０．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．０に溶解した。この緩衝溶液に、スクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２１３３６−Ｇ）のＤＭＦ中１２０ｍｇ／ｍｌ溶液１２５μｌを加えた。混合物を一夜インキュベートし、製造用電気泳動〔ＴＢＥ（Ｔｒｉｓホウ酸ＥＤＴＡ）緩衝液：８９ｍＭ ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）塩基，８９ｍＭホウ酸，２．５ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸），ｐＨ８．３〕を用い、４００ボルトで４時間精製した。ビオチン化オリゴヌクレオチドをゲルから切り出し、３ｍｌの０．１Ｍ ＮＨ4ＣＯ3により３７℃で一夜溶出した。この物質を再びＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｃ−１８カラム，Ｗａｔｅｒｓ ＃５１９１０）上で精製し、真空乾燥し、二重蒸留水中に懸濁した。
ビオチン化プローブの収量は３４．８ナノモル（５８％）であった。
【０４６８】
フルオレセイン化プローブの製造
中央のシトシン（位置１４）アミノ修飾オリゴヌクレオチド（３０マー）
５′−ＣＴＧ−ＣＣＧ−ＧＴＧ−ＣＧＣ−ＣＡＴ−ＧＵＴ−ＣＧＣ−ＣＣＧ−ＣＣＴ−ＣＡＣ−３′
５０ナノモルの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ９．６（１９０μｌ）およびアセトニトリル（１２０μｌ）の混合物中溶液を調製した。５／６カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，＃０１１１２）のＤＭＦ中０．１Ｍ溶液２００μｌを上記緩衝液に加えた。混合物を一夜室温でインキュベートした。以後の工程はビオチン化プローブについて上述した工程と同じである。
フルオレセイン化プローブは４１％の収率で得られた。
【０４６９】
アッセイ操作
アッセイ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕，５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ８．３，５ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および
２５μｇ／ｍｌウシ胸腺ＤＮＡ含有
フルオレセイン化プローブ（１．５ピコモル）およびビオチン化プローブ（１．２ピコモル）を含有するアッセイ緩衝液４０ｍｌを、アッセイ緩衝液中に系列希釈した合成標的ＤＮＡ １０μｌに添加した。混合物を５５℃で５分間ハイブリダイズした。ビーズ（それぞれ５０μｌのアッセイ緩衝液中２０μｇのアビジンビーズおよび３０μｇの抗フルオレセインビーズ）を添加した。ビーズを含有する溶液を５５℃で１５分間インキュベートした。
【０４７０】
アビジンビーズは、０．１７５μカルボキシル化ポリスチレンビーズにベンザルアクリダンを負荷して製造し、ＥＤＡＣ〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，＃Ｅ−６３８３）法によってアビジンを付加させた。
【０４７１】
ベンザルアクリダンは、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中１０−ジメトキシホスフィニル−９−メチルアクリダン（Ｍｏｎａｔｓｈ Ｃｈｅｍ．１１４，３，１９８８）に−７８℃（アセトン／ドライアイス浴）においてアルゴン気相下、ヘキサン中１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウム溶液０．４１３ｍｌを添加して製造した。ｔ−ブチルリチウム溶液を添加し、ｔ−ブチルリチウムの添加２０分後にＴＨＦ中上記アミドの溶液を加えた。反応溶液を一夜放置して、温度を室温に上昇させた。ついで、生成物をＴＬＣ（シリカゲル−３：７酢酸エチル／ヘキサン）で単離した。単離された生成物はマススペクトル分析およびＮＭＲによって分析し、暗所に保存した。
【０４７２】
抗フルオレセインビーズは、０．０４μポリスチレンカルボキシル化ビーズにテトラ−ｎ−デシル−Ａｌ−フタロシアニン（Ｕｌｔｒａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ロット番号ＧＲ１１−８２）を負荷して製造し、ビーズにＥＤＡＣ法を用いて抗フルオレセイン抗体を付加させた。
【０４７３】
シグナルは、ビーズを含有する溶液を６５０ｎｍカットオフフィルターを付したハロゲンランプで６０秒間照射して読み取った。ルミネッセンスは２０秒間測定した。結果は表４にまとめ、図９に示す。
【０４７４】
例 ７
ビオチン化増幅生成物の検出
ビオチン化配列のＰＣＲによる製造
標的：大腸菌ゲノムＤＮＡ
プライマー：５′−ビオチン化２４マー
５′−ＵＣＡ−ＴＧＧ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＴＣＡ−ＧＧＴ−ＧＣＡ−ＧＡＴ−３′
および非ビオチン化１８マー
５′−ＴＴＴ−ＧＡＧ−ＣＧＣ−ＧＧＧ−ＣＴＧ−ＴＴＧ−３′
各１００ｎＭ
循環条件：
単一サイクル：
９４℃：３分
５９℃：１分
７２℃：１．５分
ついで３５サイクル：
９４℃：１分
５９℃：１．５分
７２℃：２分
【０４７５】
フルオレセイン化プローブを用いる検出
アッセイ緩衝液中１．５ピコモルのフルオレセイン化プローブ１０μｌを例６に記載の操作と同様にして調製し、２０μｌのＰＣＲ生成物に、様々な初期標的濃度において添加した。混合物を９５℃で５分間変性し、ついで５５℃で５分間ハイブリダイズさせた。ビーズ（５０μｌのアッセイ緩衝液中、２０μｇのベンザルアクリダンおよび３０μｇのＡｌ−フタロシアニンビーズ）を添加した。ビーズを含有する溶液を５５℃で１５分間インキュベートした。シグナルは例６に記載の操作後に読み取った。結果は表５にまとめる。
【０４７６】
例 ８
総トリヨードサイロニンのアッセイ
Ｉ．ビーズの製造
原料
１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックス：Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
エチレングリコール、エトキシエタノール、ベンジルアルコール、クロロフィル−ａ：Ａｌｄｒｉｃｈ
ユーロピウム（ＩＩＩ）テオニルトリフルオロアセトネート（ＥｕＴＴＡ）：Ｋｏｄａｋ
オリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）：Ａｌｄｒｉｃｈ
ジオキセン〔１−（４−ジメチルアミノフェニル）−６−フェニル１，４−ジオキセン〕：Ｋ．Ａ．Ｚａｋｌｉｋａ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ，Ａ．Ｌ．Ｔｈａｙｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｎｓ ＆ Ｐ．Ｓｃｈａａｐ：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３０，３５−４４（１９７９）に記載された操作を改良して製造した。
【０４７７】
操作
１．クロロフィル−ａセンシタイザービーズ
ベンジルアルコール中クロロフィル−ａ溶液（１．０ｍｌ，０．６ｍＭ）を１０５℃で８．０ｍｌのベンジルアルコールに加えた。１７５ｎｍのサイズのカルボキシレート修飾ラテックスの水懸濁液（１０％，１．０ｍｌ）をベンジルアルコール溶液に添加した。この混合物を１０５℃で５分間攪拌し、室温に冷却した。エタノール（１０．０ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離した。ペレットを１：１エタノール−水混合物（１０．０ｍｌ）に再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。同じ再懸濁および遠心分離操作を水（１０．０ｍｌ）で反復し、ペレットを水（１．８ｍｌ）に再懸濁した。
【０４７８】
性質
Ａ．染料濃度：上記ビーズ懸濁液１０μｌをジオキサン（９９０μｌ）に添加して調製した溶液は、６６０ｎｍに０．１１の吸収を有することが明らかにされた。これはビーズ１ｇ中２．６マイクロモルのクロロフィル−ａに相当する。
【０４７９】
一重項酸素の発生：２ｍｌのリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）中、クロロフィル−ａビーズ（２００μｇ）、２×１０-4モルのアントラセン９，１０−ジプロピオン酸（ＡＤＰＡ）の混合物を、６４５ｎｍカットオフフィルターを付したタングステン−ハロゲンランプで２０分間照射した。ビーズを濾過して除き、酸素化生成物の濃度を４００ｎｍにおいて分光測定法により測定した。速度は１分あたり酸素化生成物３．０ナノモルであった。同一の条件下、可溶性センシタイザー、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホン酸アルミニウムは同量の酸素化生成物を生成した（ビーズ中のセンシタイザーの量は２００・１０-6・２．６・１０-6＝５２０ピコモルであった。
【０４８０】
２．クロロフィル−ａ／テトラブチルスクアレートセンシタイザービーズ
カルボキシル化ラテックスビーズ（サイズ１７５ｎｍ、水中１０％固体、３０．０ｍｌ）を遠心分離した。上清を捨て、ペレットはエチレングリコール（６０．０ｍｌ）に再懸濁した。懸濁液を１００℃に加熱した。クロロフィル−ａ１．６７ｍＭ、テトラブチルスクアレート〔１，３−ビス（４−ジブチルアミノフェニル）スクアレート〕３．３３ｍＭのベンジルアルコール溶液９．０ｍｌを徐々に、３分を要して懸濁液に添加した。加熱を７分間継続したのち、懸濁液を水浴中で室温に冷却した。ベンジルアルコール懸濁液を冷エタノール（１２０ｍｌ）に加えた。混合物を遠心分離し、上清は捨てた。ペレットを水中５０％エタノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。同じ再懸濁、遠心分離操作を水中５０％エタノール（３０ｍｌ）を用いて反復した。
【０４８１】
性質
Ａ．染料濃度：ビーズ中のテトラブチルスクアレートの濃度は、クロロフィル−ａビーズについて上述したのと同様にして分光測光法で測定した。ビーズ中４４μＭ染料が認められた。
【０４８２】
Ｂ．一重項酸素の生成：エタノール中ＡＤＰＡの５ｍＭ溶液２５μｌを、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ，５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）中ビーズ（１００μｇ）の懸濁液に添加した。混合物を上述のように、６１０ｎｍ長通過フィルターを用いて照射した。一重項酸素の生成速度はＡＤＰＡの吸収（４００ｎｍ）の低下速度から計算した。このビーズは７・１０-2マイクロモル／分の一重項酸素を生成することが明らかにされた。
【０４８３】
３．ジオキセン／ＥｕＴＴＡ／ＴＯＰＯアクセプタービーズ
１７５ｎｍカルボキシル化ラテックスビーズ（水中１０％懸濁液）２０ｍｌをエトキシエタノール（２０．０ｍｌ）に添加した。混合物を９０℃に加熱した。１０ｍＭジオキセン、２０ｍＭ ＥｕＴＴＡおよび６０ｍＭ ＴＯＰＯのエトキシエタノール溶液２０ｍｌを、混合物に添加した。加熱を７分間、９７℃までの温度で継続した。混合物を室温に冷却した。エタノール（４０．０ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離した。ペレットを８０％エタノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。再懸濁および遠心分離の操作を１０％エタノール（３６ｍｌ）を用いて反復した。
【０４８４】
性質
Ａ．染料濃度：ビーズ中のＥｕＴＴＡ濃度は上述のように分光測光法で測定し、０．０７Ｍであることが明らかにされた。
ジオキセンの濃度はＥｕＴＴＡの存在下には測定できないので、ジオキセンのみを負荷したビーズ中で同じ条件下に測定した。濃度は０．０１６Ｍであることが明らかにされた。
【０４８５】
Ｂ．シグナル生成：リン酸緩衝液（０．５ｍｌ，２０ｍＭリン酸塩，５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．０）中ビーズ（２５μｇ）の懸濁液を、同じ緩衝液中２μＭアルミニウムフタロシアニンテトラスルホネートの溶液と混合した。混合物を６１０ｎｍ長通過フィルターを付した１２５Ｗタングステン−ハロゲンランプで１分間照射した。照射後、混合物をＴｕｒｎｅｒＴＤ−２０ｅ ルミノメーター中に置き、ルミネッセンスを２０秒間測定した。強度は３２７ＲＬＵ（相対光量単位）／秒であった。
放射光の波長は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ６５０−４０走査スペクトロフルオリメーターを用いて測定した。主要な放射ピークは６１５ｎｍ付近に集中した。
【０４８６】
ＩＩ．アッセイ操作
４０ｎｍビーズへの抗体のＥＤＡＣ／ＮＨＳカップリング
７３．６ｍｇのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ＃２４５１０Ｇ）を、水中４ｍｇ／ｍｌカルボキシレート修飾４０ｎｍポリスチレンビーズ（クロロフィル−ａおよびテトラブチルスクアレートで染色）の懸濁液６ｍｌに溶解した。０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4１３６μｌを加えた。ｐＨを５．２に調整した。さらに１３６μｌの水を添加した。１３０．４ｍｇのＥＤＣＡ〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．＃Ｅ−６３８３〕を４５４μｌの水に取り、攪拌したビーズ懸濁液に徐々に加えた。この懸濁液を室温で２０分間インキュベートした。ビーズを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローターを用い１５，０００ｒｐｍ，４℃で２０分間遠心分離した。上清は捨てた。ついで、ビーズを１．２ｍｌの５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８中に再懸濁し、懸濁液を超音波処理してビーズを再度分散させた。１．７ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ（モノクローナル抗−フルオレセイン）＋６．７ｍｇ／ｍｌＢＳＡ＋１７ｍＭ ｂｏｒａｘを含有する溶液（ｐＨ９．２）４．８ｍｌを攪拌しながらビーズを徐々に加え、一夜４℃で穏やかに混合した。８００μｌの２Ｍグリシン、ついで０．１Ｍ ｂｏｒａｘ中５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ２．８ｍｌをビーズ懸濁液に加えた。懸濁液を超音波処理し、４℃で３時間穏やかに混合した。ビーズを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清は捨てた。ビーズを３ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁し、懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸濁および超音波処理工程を計３回反復した。３回目の遠心分離後、ビーズを２．４ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。得られた懸濁液を超音波処理して、４℃で保存した。
【０４８７】
１７５ｎｍビーズへのアビジン−ＤのＥＤＡＣ／ＮＨＳカップリング
４．４ｍｇのスルホ−ＮＨＳを、水中２５ｍｇ／ｍｌのカルボキシレート修飾１７５ｎｍポリスチレンビーズ（ジオキセン／ＢｕＴＴＡ／ＴＯＰＯで染色）２５ｍｇ／ｍｌの懸濁液０．４ｍｌに溶解した。０．０１６０ｍｌの０．２５ＭＮａＨ2ＰＯ4を添加した。０．０３０ｍｌの水に溶解した８ｍｇのＥＤＡＣを旋回させたビーズ懸濁液に徐々に加えた。懸濁液を室温で２０分間インキュベートした。ビーズを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローターを用い、１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。上清は捨てた。
【０４８８】
ビーズを０．６ｍｌの０．００５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８に再懸濁した。懸濁液を超音波処理してビーズを再び懸濁させた。ビーズを再び、１．３３ｍｇ／ｍｌアビジン−Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）＋１７ｍＭ ｂｏｒａｘ含有ｐＨ９．２の溶液３ｍｌに攪拌しながら、徐々に添加し、一夜４℃で穏やかに混合した。ＤＭＦ中１Ｍ無水コハク酸０．００４ｍｌを加えた。懸濁液を、穏やかに混合しながら４℃で１時間インキュベートした。１０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０中５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ０．４ｍｌを添加した。懸濁液を４℃で３時間穏やかに混合した。ビーズを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を捨てた。ビーズを、３ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸濁および超音波処理工程を計３回反復した。３回目の遠心分離後、ビーズを２．２５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に再懸濁した。懸濁液を超音波処理して、４℃で保存した。
【０４８９】
総Ｔ 3 アッセイ
アッセイ緩衝液：０．０７５Ｍ バルビタール，０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．４％ ＢＳＡ，１．２５％マウスＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌデキストラン硫酸（分子量５００，０００），１．０ｍｇ／ｍｌデキストランＴ−５００，１０μｇ／ｍｌ凝集ＩｇＧ
【０４９０】
ビーズ
アクセプタービーズ：アビジン−ＥＤＡＣ，１７５ｎｍ，ジオキセン／ＥｕＴＴＡ／ＴＯＰＯを負荷
センシタイザービーズ：抗フルオレセイン−ＥＤＡＣ，４０ｎｍ，クロロフィル−ａ／スクアレートを負荷
【０４９１】
アッセイプロトコール
アッセイ緩衝液中８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩（Ｓｉｇｍａ，Ａ−３１２５）溶液（０．７５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌをＴ3標準溶液またはサンプル５０μｌに加えた。アッセイ緩衝液１００μｌを添加した。アッセイ緩衝液中ビオチン化抗−Ｔ3（７０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを添加した。アッセイ緩衝液（５０μｌ）中、トレーサー、Ｔ3−ＬＣ21−Ｆ１
【化４０】
（１．８ｎｇ／ｍｌ）を添加した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。センシタイザービーズ（５０μｇ）およびアクセプタービーズ（６．２５μｇ）のアッセイ緩衝液中懸濁液５００μｌを添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。「停止溶液」（５０μｌ）（１０μＭフルオレセイン，０．５ｍＭビオチン）を添加した。
シグナルは、６１０ｎｍカットオフフィルター付きハロゲンランプで、照射１分、測定２０秒で読み取った。
【０４９２】
結果
結果は図１０にまとめる。ルミネッセンスシグナルはＴ3濃度の関数としてプロットした。シグナルの変化は８．５ｎｇ／ｍｌ Ｔ3で９４％であった。０．５ｎｇ／ｍｌにおけるシグナルの変化は３８％であった。
【０４９３】
以上、本発明を、明快にし理解しやすくするために、例示および実施例によって詳細に説明したが、ある種の改変または修飾は特許請求の範囲内に包含されることは明白である。
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】ビタミンＢ12の検定結果のグラフによる描写である。
【図２】ジゴキシンの検定結果のグラフによる描写である。
【図３】本発明によるＨＣＧの検定結果のグラフによる描写である。
【図４】本発明による試験結果のグラフによる描写である。
【図５】本発明によるＴＳＨに対する検定結果のグラフによる描写である。
【図６】図５のグラフによる描写の一部である。
【図７】本発明によるＨＣＧに対する別の検定結果のグラフによる描写である。
【図８】ＤＮＡハイブリッド検出検定の結果のグラフによる描写である。
【図９】合成標的の検出結果のグラフによる描写である。
【図１０】全トリヨードチロニン検定のグラフによる描写である。
Claims (58)
- 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）サンプル、本質的に準安定な種を産生することができる第一の物質、および本質的に準安定な種と反応して検出可能なシグナルを産生することができる第二の物質からなり、少なくともサンプル並びに第一および第二の物質を組み合せることによって混合物を形成し、
第一の物質は、i)懸濁可能な粒子およびii)被検物質と特異的に結合することができる特異的結合対メンバーと会合して複合体を形成しており、
第二の物質は、i)懸濁可能な粒子およびii)被検物質と特異的に結合することができる特異的結合対メンバーと会合して複合体を形成しており、および、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第二の物質を本質的に準安定な種の形成部位に近接させ；
ｂ）混合物をエネルギーまたは反応性化合物と処理して、混合物中に拡散する、第二の物質と反応する本質的に準安定な種を第一の物質に形成させ；
ｃ）本質的に準安定な種が第二の物質と反応したかどうかを、本質的に準安定な種による第二の物質の活性化の結果として第二の物質によって産生されるシグナルを検出することによって測定し、シグナルの存在または量がサンプル中の被検物質の存在または濃度を示す、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）1)サンプル、
2)本質的に準安定な種を産生することができる第一の物質、懸濁可能な粒子、特異的結合対メンバーおよび被検物質からなる第一の複合体であって、特異的結合対メンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、並びに、
3)本質的に準安定な種と反応して検出可能なシグナルを産生することができる第二の物質、懸濁可能な粒子、および被検物質と特異的に結合することができる特異的結合対メンバーからなる第二の複合体、
からなり、少なくともサンプル並びに第一および第二の複合体を、第一の複合体および第二の複合体からなる第三の複合体が形成される条件下で組み合せることによって混合物を形成し、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第三の複合体の形成を妨害する、即ち、第二の複合体が本質的に準安定な種の形成部位に近接することを妨害し；
ｂ）混合物をエネルギーまたは反応性化合物と処理して、本質的に準安定な種を第一の物質に形成させ；
ｃ）本質的に準安定な種が第二の物質と反応したかどうかを、本質的に準安定な種による第二の物質の活性化の結果として第二の物質によって産生されるシグナルを検出することによって測定し、
シグナルの存在または量が被検物質の存在または濃度を示す、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）1)サンプル、
2)本質的に準安定な種を産生することができる第一の物質、懸濁可能な粒子、および、被検物質と特異的に結合することができる特異的結合対メンバーからなる第一の複合体、並びに、
3)本質的に準安定な種と反応して検出可能なシグナルを産生することができる第二の物質、懸濁可能な粒子、特異的結合対メンバーおよび被検物質からなる第二の複合体であって、特異的結合対メンバーは被検物質に特異的に結合している状態にある、
からなり、少なくともサンプル並びに第一の複合体および第二の複合体を、第一の複合体および第二の複合体からなる第三の複合体が形成される条件下で組み合せることによって混合物を形成し、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第三の複合体の形成を妨害する、即ち、第二の複合体が本質的に準安定な種の形成部位に近接することを妨害し；
ｂ）混合物をエネルギーまたは反応性化合物と処理して、本質的に準安定な種を第一の物質に形成させ；
ｃ）本質的に準安定な種が第二の物質と反応したかどうかを、本質的に準安定な種による第二の物質の活性化の結果として第二の物質によって産生されるシグナルを検出することによって測定し、
シグナルの存在または量が被検物質の存在または濃度を示す、
ことからなる上記方法。 - 第一の物質がフォトセンシタイザーであり、第二の物質が化学ルミネッセンス化合物である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）同時に、または、全てもしくは部分的に連続して、
1)被検物質の含有が疑われるサンプル、
2)懸濁可能な粒子、フォトセンシタイザーおよび特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーからなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、および、
3)懸濁可能な粒子、化学ルミネッセンス化合物およびｓｂｐメンバーからなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、
を組み合せて、サンプル、第一の複合体および第二の複合体からなる混合物を作成し；
ｂ）第一の複合体、第二の複合体および被検物質からなる第三の複合体を形成し、
被検物質は第三の複合体中でフォトセンシタイザーおよび化学ルミネッセンス化合物を近接させ；
ｃ）フォトセンシタイザーをエネルギーまたは反応性化合物で活性化して一重項酸素を発生させ；
ｄ）化学ルミネッセンス化合物を一重項酸素で活性化して検出可能なシグナルを産生し；および、
ｅ）一重項酸素による活性化で化学ルミネッセンス化合物によって産生されるシグナルを検出し、シグナルの存在またはシグナルの強度がサンプル中の被検物質の存在または濃度に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプルの被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）同時に、または、全てもしくは部分的に連続して、
1)被検物質の含有が疑われるサンプル、
2)懸濁可能な粒子、フォトセンシタイザー、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーおよび被検物質からなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、並びに
3)懸濁可能な粒子、化学ルミネッセンス化合物およびｓｂｐメンバーからなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、
を、第一の複合体および第二の複合体からなる第三の複合体が形成される条件下で組み合せ、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第三の複合体の形成を妨害する、即ち、化学ルミネッセンス化合物がフォトセンシタイザーに近接することを妨害し；
ｂ）フォトセンシタイザーをエネルギーまたは反応性化合物で活性化して一重項酸素を発生させ；
ｃ）化学ルミネッセンス化合物を一重項酸素で活性化して検出可能なシグナルを産生させ；および
ｄ）一重項酸素による活性化で化学ルミネッセンス化合物によって産生されるシグナルを検出し、シグナルの存在またはシグナルの強度がサンプル中の被検物質の存在または濃度に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）同時に、または、全てもしくは部分的に連続して、
1)被検物質の含有が疑われるサンプル
2)懸濁可能な粒子、フォトセンシタイザーおよび特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーからなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、並びに
3)懸濁可能な粒子、化学ルミネッセンス化合物、ｓｂｐメンバーおよび被検物質からなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、
を、第一の複合体および第二の複合体からなる第三の複合体が形成される条件下で組み合せ、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第三の複合体の形成を妨害する、即ち、化学ルミネッセンス化合物がフォトセンシタイザーに近接することを妨害し；
ｂ）フォトセンシタイザーをエネルギーまたは反応性化合物で活性化して一重項酸素を発生させ；
ｃ）化学ルミネッセンス化合物を一重項酸素で活性化して検出可能なシグナルを産生させ；および、
ｄ）一重項酸素による活性化で化学ルミネッセンス化合物によって産生されるシグナルを検出し、シグナルの存在またはシグナルの強度がサンプル中の被検物質の存在または濃度に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）少なくとも、
1)サンプル、
2)フォトセンシタイザー、懸濁可能な粒子および特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーからなる複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
3)化学ルミネッセンス化合物、懸濁可能な粒子および特異的結合対のメンバーからなる複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、
を組み合せて混合物を形成し、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、混合物中でフォトセンシタイザーおよび化学ルミネッセンスを近接させ；
ｂ）一重項酸素がフォトセンシタイザーによって発生するように、混合物をエネルギーまたは反応性化合物で処理し；
ｃ）一重項酸素が化学ルミネッセンス化合物と接触したかどうかを、化学ルミネッセンス化合物によって産生される光を測定することによって決定し、光の存在または量がサンプル中の被検物質の存在または量に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）少なくとも、
1)サンプル、
2)フォトセンシタイザー、懸濁可能な粒子、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーおよび被検物質からなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、並びに、
3)化学ルミネッセンス化合物、懸濁可能な粒子および特異的結合対のメンバーからなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、
を組み合せて混合物を形成し、混合物中で、第一の複合体および第二の複合体からなる第三の複合体が形成され、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第三の複合体の形成を妨害する、即ち、化学ルミネッセンス化合物がフォトセンシタイザーに近接することを妨害し；
ｂ）一重項酸素がフォトセンシタイザーによって発生するように、混合物をエネルギーまたは反応性化合物で処理し；
ｃ）一重項酸素が化学ルミネッセンス化合物と接触したかどうかを、化学ルミネッセンス化合物によって産生される光を測定することによって決定し、光の存在または量がサンプル中の被検物質の存在または量に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の含有が疑われるサンプル中の被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）少なくとも、
1)サンプル、
2)フォトセンシタイザー、懸濁可能な粒子および特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーからなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
3)化学ルミネッセンス化合物、懸濁可能な粒子、特異的結合対のメンバーおよび被検物質からなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、
を組み合せて混合物を形成し、混合物中で、第一の複合体および第二の複合体からなる第三の複合体が形成され、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、第三の複合体の形成を妨害する、即ち、化学ルミネッセンス化合物がフォトセンシタイザーに近接することを妨害し；
ｂ）一重項酸素がフォトセンシタイザーによって発生するように、混合物をエネルギーまたは反応性化合物で処理し；
ｃ）一重項酸素が化学ルミネッセンス化合物と接触したかどうかを、化学ルミネッセンス化合物によって産生される光を測定することによって決定し、光の存在または量がサンプル中の被検物質の存在または量に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）1)被検物質の含有が疑われるサンプル、
2)励起状態において酸素を一重項酸素に活性化できるフォトセンシタイザー、および、被検物質と特異的に結合することができる特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーを結合する懸濁可能な粒子材からなる複合体、並びに、
3)フォトセンシタイザーの励起によって産生される一重項酸素との相互作用で光を発することができる化学ルミネッセンス化合物からなる懸濁可能な粒子材であって、粒子材はそれに結合した、被検物質と特異的に結合することができるｓｂｐメンバーを有する、
を組み合わせて提供し、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、フォトセンシタイザーおよび化学ルミネッセンスを近接させ；
ｂ）光でフォトセンシタイザーを励起させて一重項酸素を産生させ；および、
ｃ）化学ルミネッセンス化合物から発せられるルミネッセンスの存在または量を測定し、ルミネッセンスの存在または量は、一重項酸素による化学ルミネッセンス化合物の励起、即ち、サンプル中の被検物質の量に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）1)被検物質の含有が疑われるサンプル、
2)励起状態において酸素を一重項酸素に活性化できるフォトセンシタイザーからなる懸濁可能な第一の粒子材であって、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーが結合している第一の粒子材、および被検物質であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、並びに、
3)フォトセンシタイザーの励起によって産生される一重項酸素との相互作用で光を発することができる化学ルミネッセンス化合物からなる懸濁可能な第二の粒子材であって、第二の粒子材はそれに結合した、被検物質と特異的に結合することができるｓｂｐメンバーを有する、
を組み合わせて提供し、混合物を形成させ、混合物中で第一の粒子材および第二の粒子材からなる複合体が形成され、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、複合体の形成を妨害する、即ち、化学ルミネッセンス化合物がフォトセンシタイザーに近接するのを妨害し；
ｂ）光でフォトセンシタイザーを励起させて一重項酸素を産生させ；および、
ｃ）化学ルミネッセンス化合物から発せられるルミネッセンスの存在または量を測定し、ルミネッセンスの存在または量は、一重項酸素による化学ルミネッセンス化合物の励起、即ち、サンプル中の被検物質の量に関連する、
ことからなる上記方法。 - 被検物質の存在または濃度を測定する方法であって、
ａ）1)被検物質の含有が疑われるサンプル、
2)励起状態において酸素を一重項酸素に活性化できるフォトセンシタイザーからなる懸濁可能な第一の粒子材であって、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーが結合している第一の粒子材であり、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
3)フォトセンシタイザーの励起によって産生される一重項酸素との相互作用で光を発することができる化学ルミネッセンス化合物からなる懸濁可能な第二の粒子材であって、第二の粒子材はそれに結合したｓｂｐメンバーを有し、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、
を組み合わせて提供し、混合物を形成させ、混合物中で第一の粒子材と第二の粒子材からなる複合体が形成され、
被検物質は、それがサンプル中に存在すれば、複合体の形成を妨害する、即ち、化学ルミネッセンス化合物がフォトセンシタイザーに近接するのを妨害し；
ｂ）光でフォトセンシタイザーを励起させて一重項酸素を産生させ；および
ｃ）化学ルミネッセンス化合物から発せられるルミネッセンスの存在または量を測定し、ルミネッセンスの存在または量は、一重項酸素による化学ルミネッセンス化合物の励起、即ち、サンプル中の被検物質の量に関連する、
ことからなる上記方法。 - 化学ルミネッセンス化合物はオレフィン基およびそのオレフィン基と共役する１個または２個以上の電子供与置換基を含有する請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 化学ルミネッセンス化合物は９−アルキリデン−Ｎ−メチルアクリダン類、エノールエーテル類およびエナミン類からなる群より選択される請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 懸濁可能な粒子はそれぞれ表面を含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 懸濁可能な粒子は、ラテックス粒子、脂質二重層、油滴、シリカ粒子、金属ゾルおよび染料微結晶からなる群より選択される請求項１６記載の方法。
- フォトセンシタイザーはメチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン類およびフタロシアニン類からなる群より選択される染料である請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- フォトセンシタイザーおよび化学ルミネッセンス化合物はそれぞれ、それに結合した特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーを有し、ｓｂｐメンバーは、リガンド、受容体、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド結合剤からなる群よりそれぞれ独立に選択される請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 化学ルミネッセンス化合物は、光化学的に活性化が可能な化学ルミネッセンス化合物（ＰＡＣＣ）である請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 光化学的な活性化はＰＡＣＣと一重項酸素との反応による請求項２０記載の方法。
- 一重項酸素はフォトセンシタイザーの活性化によって生成される請求項２１記載の方法。
- 被検物質とｓｂｐメンバーは、リガンド、受容体およびポリヌクレオチドからなる群よりそれぞれ独立に選択される請求項２０記載の方法。
- ＰＡＣＣはオレフィン基およびそのオレフィン基と共役する１個または２個以上の電子供与置換基を含有する請求項２０記載の方法。
- ＰＡＣＣは９−アルキリデンアクリダン類、エノールエーテル類、９−アルキリデンキサンタン類およびエナミン類からなる群より選択される請求項２０記載の方法。
- 請求項１、５、８および１１のいずれか一項に記載の方法に使用するための組成物であって、
ａ）一重項酸素と反応することができる化学ルミネッセンス化合物、および被検物質と特異的に結合することができる第一の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる第一の懸濁可能な粒子、並びに、
ｂ）励起状態において、酸素をその一重項状態に活性化することができるフォトセンシタイザー、および被検物質に結合することができる第二の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる第二の懸濁可能な粒子、
からなる上記組成物。 - 競合的アッセイにおいて被検物質を検出するための組成物であって、
ａ）一重項酸素と反応することができる化学ルミネッセンス化合物、および被検物質と特異的に結合している状態にある第一の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる第一の懸濁可能な粒子、並びに、
ｂ）励起状態において、酸素をその一重項状態に活性化することができるフォトセンシタイザー、および被検物質と結合することができる第二の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる第二の懸濁可能な粒子、
からなる上記組成物。 - 請求項２、６、９および１２のいずれか一項に記載の方法に使用するための組成物であって、
ａ）一重項酸素と反応することができる化学ルミネッセンス化合物、および被検物質と特異的に結合することができる第一の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる第一の懸濁可能な粒子、並びに、
ｂ）励起状態において、酸素をその一重項状態に活性化することができるフォトセンシタイザー、および被検物質と特異的に結合している状態にある第二の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーからなる第二の懸濁可能な粒子、
からなる上記組成物。 - 第一のｓｂｐメンバーは、第一の懸濁可能な粒子の表面に結合する請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 第一の懸濁可能な粒子は、ラテックス粒子、脂質二重層、油滴、シリカ粒子および金属ゾルからなる群より選択される請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 化学ルミネッセンス化合物はオレフィン基を含有する請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 化学ルミネッセンス化合物は、オレフィン基およびそのオレフィン基と共役する１個または２個以上の電子供与置換基を含有する請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 化学ルミネッセンス化合物は、９−アルキリデンアクリダン類、エノールエーテル類、エナミン類および９−アルキリデンキサンタン類からなる群より選択される請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 特異的結合対メンバーは、受容体、リガンドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される請求項２９記載の組成物。
- 第二の懸濁可能な粒子は、ラテックス、脂質二重層、油滴、シリカ粒子および金属ゾルからなる群より選択される請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 第二のｓｂｐメンバーは、第二の懸濁可能な粒子の表面に結合する請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 特異的結合対メンバーは、受容体、リガンドおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される請求項３６記載の組成物。
- 第一の懸濁可能な粒子、第二の懸濁可能な粒子またはその両方がラテックス粒子である請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項１、５、８および１１のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)励起状態において酸素をその一重項状態に活性化することができるフォトセンシタイザー、およびii)懸濁可能な粒子と会合している特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーからなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
ｂ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)一重項酸素との反応で化学ルミネッセンスを発することができる化学ルミネッセンス化合物、およびii)懸濁可能な粒子と会合しているｓｂｐメンバーからなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、
からなる上記キット。 - 請求項２、６、９および１２のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)励起状態において酸素をその一重項状態に活性化することができるフォトセンシタイザー、およびii)懸濁可能な粒子と会合している特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーであって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、
からなる第一の複合体、並びに、
ｂ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)一重項酸素との反応で化学ルミネッセンスを発することができる化学ルミネッセンス化合物、およびii)懸濁可能な粒子と会合しているｓｂｐメンバーからなる第二の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、
からなる上記キット。 - 競合的アッセイにおいて被検物質を検出するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)励起状態において酸素をその一重項状態に活性化することができるフォトセンシタイザー、およびii)懸濁可能な粒子と会合している特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーからなる第一の複合体であって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
ｂ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)一重項酸素との反応で化学ルミネッセンスを発することができる化学ルミネッセンス化合物、およびii)懸濁可能な粒子と会合しているｓｂｐメンバーであって、ｓｂｐメンバーは被検物質と特異的に結合している状態にある、
からなる第二の複合体、
からなる上記キット。 - 第一の複合体中の懸濁可能な粒子、第二の複合体中の懸濁可能な粒子またはその両方がラテックス粒子である請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 第二の複合体がさらに蛍光エネルギーアクセプターを含む請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- ｓｂｐメンバーは、受容体、リガンド、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド結合剤からなる群よりそれぞれ独立に選択される請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- ｓｂｐメンバーが両方とも同じである請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 第一の粒子および第二の粒子は、それぞれ別個に、ラテックス粒子、脂質二重層、油滴、シリカ粒子、金属ゾルからなる群から選択される請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- フォトセンシタイザーが染料である請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 染料がメチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリンまたはフタロシアニンである請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 化学ルミネッセンス化合物がオレフィン基を含有する請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 化学ルミネッセンス化合物がオレフィン基およびそのオレフィン基と共役する１個または２個以上の電子供与置換基を含有する請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 化学ルミネッセンス化合物が９−アルキリデンアクリダン類、エノールエーテル類およびエナミン類から選択される請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 化学ルミネッセンス化合物は、光化学的に活性化可能である請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
- 請求項１、５、８および１１のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)励起状態において酸素をその一重項状態に活性化することができるフタロシアニンフォトセンシタイザー、およびii)懸濁可能なラテックス粒子と会合している、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーとしての第一の抗体であって、第一の抗体は被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
ｂ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)一重項酸素との反応で化学ルミネッセンスを発することができるエノールエーテル化学ルミネッセンス化合物、およびii)懸濁可能なラテックス粒子と会合している、ｓｂｐメンバーとしての第二の抗体であって、第二の抗体は被検物質と特異的に結合することができる、
からなる上記キット。 - 請求項２、６、９および１２のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)励起状態において酸素をその一重項状態に活性化することができるフタロシアニンフォトセンシタイザー、およびii)懸濁可能なラテックス粒子と会合している、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーとしての第一の抗体であって、第一の抗体は被検物質と特異的に結合している状態にある、並びに、
ｂ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)一重項酸素との反応で化学ルミネッセンスを発することができるエノールエーテル化学ルミネッセンス化合物、およびii)懸濁可能なラテックス粒子と会合している、ｓｂｐメンバーとしての第二の抗体であって、第二の抗体は被検物質と特異的に結合することができる、
からなる上記キット。 - 競合的アッセイにおいて被検物質を検出するためのキットであって、
ａ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)励起状態において酸素をその一重項状態に活性化することができるフタロシアニンフォトセンシタイザー、およびii)懸濁可能なラテックス粒子と会合している、特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーとしての第一の抗体であって、第一の抗体は被検物質と特異的に結合することができる、並びに、
ｂ）少なくとも１つの共有結合または非共有結合によって、i)一重項酸素との反応で化学ルミネッセンスを発することができるエノールエーテル化学ルミネッセンス化合物、およびii)懸濁可能なラテックス粒子と会合している、ｓｂｐメンバーとしての第二の抗体であって、第二の抗体は被検物質と特異的に結合している状態にある、
からなる上記キット。 - ラテックス粒子は、直径０．１〜２．０ミクロンであって、０．７〜１．５ｇ／ｍｌの密度を有する請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のキット。
- 第二の抗体がさらに蛍光エネルギーアクセプターを含む請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のキット。
- ｓｂｐメンバーが特異的にポリエピトープ性リガンド被検物質に結合し、各ｓｂｐメンバーがポリエピトープ性リガンド被検物質上の１つのエピトープに結合する請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のキット。
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