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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die sich zur Bestimmung
eines Analyten in einer Probe eignen. Insbesondere betrifft die
vorliegende Erfindung spezifische Bindungstests, die keinen Trennschritt
erfordern.
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Das
Gebiet der klinischen Diagnose hat in den letzten Jahren eine große Expansion
erfahren – sowohl, was
die Vielzahl der Materialien (Analyten) betrifft, die leicht und
präzise
bestimmt werden können,
als auch in Hinblick auf die Verfahren zur Bestimmung. Zweckmäßigerweise
sind zuverlässige
und ungefährliche
Mittel zum Detektieren des Vorhandenseins niedriger Konzentrationen
an Materialien in Flüssigkeiten
erwünscht.
In der klinischen Chemie können
diese Materialien in Körperflüssigkeiten
in molaren Konzentrationen von unter 1012 vorhanden
sein. Die Schwierigkeit, niedrige Konzentrationen dieser Materialien
zu detektieren, wird durch die relativ geringen verwendbaren Probengrößen verschärft.
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Bei
der Entwicklung eines Tests gibt es viele Überlegungen. Eine Überlegung
ist die Signalreaktion auf Veränderungen
in der Konzentration des Analyten. Eine zweite Überlegung besteht darin, wie
einfach es ist, die Vorschrift für
den Test in die Praxis umzusetzen. Eine dritte Überlegung ist die Interterenzschwankungen von
Probe zu Probe. Einfache Herstellung und Reinigung der Reagenzien,
Verfügbarkeit
der Ausrüstung,
einfache Automatisierung und Wechselwirkung mit Material von Interesse
sind einige der zusätzlichen Überlegungen
bei der Entwicklung eines nützlichen
Tests.
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Eine
Vielzahl von Techniken einer bestimmten Kategorie sieht die Verwendung
eines Rezeptors vor, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche
und polare Struktur eines markierten Liganden als Funktion der Gegenwart
eines Analyten binden kann. Die beobachtete Wirkung der Bindung
durch den Rezeptor hängt vom
Marker ab. In einigen Fällen
sorgt die Bindung des Rezeptors lediglich für eine Differenzierung des
Molekulargewichts zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem
Liganden. In anderen Fällen
erleichtert die Bindung des Rezeptors die Trennung von gebundenem
markiertem Liganden von freiem markiertem Liganden, oder sie kann
die Beschaffenheit des aus dem Marker erhaltenen Signals beeinflussen,
sodass das Signal je nach Menge des an den markierten Liganden gebundenen
Rezeptors variiert. Eine weitere Variation besteht darin, dass der
Rezeptor markiert ist und der Ligand unmarkiert. Alternativ dazu
sind sowohl der Rezeptor als auch der Ligand markiert, oder es sind
unterschiedliche Rezeptoren mit zwei unterschiedlichen Markern markiert,
woraufhin die Marker miteinander in Wechselwirkung treten, wenn
sie sich in unmittelbarer Nähe befinden,
und die Menge an vorhandenem Liganden das Ausmaß beeinflusst, in dem die Marker
des Rezeptors miteinander wechselwirken.
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Es
besteht nach wie vor die Notwendigkeit, neue und präzise Techniken
zu entwickeln, die auf ein breites Spektrum unterschiedlicher Liganden
abgestimmt oder in konkreten Fällen
verwendet werden können,
wo andere Verfahren nicht ohne Weiteres in Frage kommen.
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Es
wurden bereits homogene Immunassays für kleine Moleküle beschrieben.
Diese Tests sind z.B. der FRAT®-Test von SYVA, der EMIT®-Test,
der Enzymkanalisierungs-Immuntest und der Fluoreszenz-Energietransfer-Immuntest
(FETI); ferner gibt es Enzyminhibitor-Immuntests (Hoffman LaRoche
und Abbott Laboratories), wie z.B. den Fluoreszenz-Polarisations-Immuntests
(Dandlicker) u.a. Alle diese Verfahren besitzen beschränkte Sensitivität; und nur
einige, wie z.B. FETI und Enzymkanalisierung, sind für große Multiepitop-Analyten
geeignet.
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Lumineszierende
Verbindungen, wie z.B. fluoreszierende Verbindungen und chemolumineszierende Verbindungen,
werden für
Tests sehr häufig
eingesetzt, da sie die Fähigkeit
des Lichtaussendens besitzen. Aus diesem Grund wurden Lumineszenzmittel
als Marker in Tests, wie z.B. Nucleinsäureassays und Immunassays,
verwendet. Beispielsweise wird ein Element eines spezifischen Bindungspaars
an ein Lumineszenzmittel gebunden, und es werden verschiedene Arbeitsvorschriften
befolgt. Das Lumineszenzmittel-Konjugat kann im Verhältnis zur
Analytenmenge in einer Probe, von der man vermutet, dass sie den
Analyten enthält,
zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase verteilt werden.
Durch Messen der Lumineszenz einer der beiden Phasen kann der beobachtete
Lumineszenzwert mit der Konzentration des Analyten in der Probe
in Beziehung gesetzt werden.
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Teilchen,
wie z.B. Liposomen und Erythrozyten-Geisterpeaks, wurden als Träger eingekapselter
wasserlöslicher
Materialien verwendet. Beispielsweise dienten Liposomen dazu, biologisch
aktives Material aus unterschiedlichen Gründen einzukapseln, z.B. für ein Arzneimittel-Zufuhrsystem,
in dem ein Medikament während
der Liposomen-Herstellung eingeschlossen und dann dem zu behandelnden
Patienten verabreicht wird.
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Teilchen,
wie z.B. Latexperlen und Liposomen, werden ebenfalls in Tests eingesetzt.
Beispielsweise kann in homogenen Tests ein Enzym in der wässrigen
Phase eines Liposoms eingeschlossen sein, das mit einem Antikörper oder
Antigen markiert ist. Die Liposomen werden dazu veranlasst, das
Enzym in Gegenwart einer Probe oder eines Komplements freizusetzen.
Antikörper-
oder Antigen-markierte Liposomen, bei denen wasserlösliche fluoreszierende
oder nicht fluoreszierende Farbstoffe in einer wässrigen Phase eingekapselt sind
oder Lipid-lösliche
Farbstoffe, die in der Lipid-Doppelschicht
des Lipidvesikels gelöst
sind, werden ebenfalls eingesetzt, um auf Analyten zu testen, die
fähig sind,
in eine immunochemische Reaktion mit dem Oberflächengebundenen Antikörper oder
Antigen einzutreten. Detergenzien werden eingesetzt, um die Farbstoffe aus
der wässrigen
Phase der Liposomen freizusetzen.
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Chemolumineszierende
Markierungen weisen bei Ligandenbindungstests außergewöhnliche Empfindlichkeit auf,
aber üblicherweise
sind ein oder mehrere chemische Aktivierungsschritte erforderlich.
Fluoreszierende Markierungen weisen diesen Nachteil nicht auf, sind
aber weniger empfindlich.
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Chemolumineszierende
Markierungen sind für
Immuntests und Nucleinsäuretests
beschrieben worden, worin eine Gruppe, die kovalent an einen Bindungspartner
gebunden ist, bei chemischer Aktivierung Licht aussendet. Ein Nuclein-
und Testset, bei dem ein Acridiniumester eingesetzt wird, wird von
Genprobe vertrieben (Pace2 System®, San
Diego, CA, USA), und MagicLite®-Immuntestsets, bei denen
dieser Typ von Markierung eingesetzt wird, werden von CIBA-GEIGY
(Basel, Schweiz) verkauft. Energieübertragung von einer markierten
Nucleinsäuresonde
zu einem fluoreszierenden Akzeptor, der an eine zweite Sonde gebunden
ist, wurden von Heller et al., I und II, s. unten, für einen
Sandwich-Nucleinsäuretest
beschrieben. Maggio I, s. unten, erörtert ein ähnliches Verfahren für Immuntests.
Die Energieübertragung
von einem Lumineszenzmittel, das kovalent an ein Polynucleotid gebunden
ist, auf ein eingelagertes Fluorophor wurde von Heller et al., IV,
s. unten, beschrieben. Die Übertragung
von einem eingelagerten Farbstoff auf ein Fluoreszenzmittel auf
einem Polynucleotid wurde vor kurzem von Cardullo et al., s. unten,
beschrieben. Weiters hat McCapra, s. unten, die Verwendung von Photosensibilatoren
als Markierungen beschrieben, worin der Photosensibilisator Sauerstoff in
seinen Singulettzustand aktiviert, der seinerseits mit einer Verbindung
reagiert, die bei Erwärmung
Licht erzeugt.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.345.776 (McCapra) offenbart spezifische Bindungstests,
bei denen ein Sensibilisator als Markierung eingesetzt wird. Zu
den Sensibilisatoren gehört
jede Gruppierung, die, wenn sie durch Anregung mit Strahlung mit
einer oder mehreren Wellenlängen
oder andere chemische oder physikalische Stimuli (z.B. Elektronenübertragung,
Elektrolyse, Elektrolumineszenz oder Energieübertragung) einen angeregten
Zustand erreicht, der (a) bei Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff
molekularen Sauerstoff im Singulettzustand erzeugt oder (b) bei
Wechselwirkung mit einem Leuko-Farbstoff eine reduzierte Form annehmen
kann, die durch Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff in ihren
ursprünglichen,
nicht angeregten Zustand zurückgeführt werden
kann, was zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid führt. Beide Wechselwirkungen
mit dem angeregten Sensibilisator ergibt bei der Zugabe von Reagenzien
ein detektierbares Signal.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.070.685 (Heller et al. I) beschreibt eine
homogene Nucleinsäurehybridisierung,
die durch nicht-strahlende Energieübertragung diagnostisch ist.
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Ein
Diagnoseverfahren durch Lichtaussendungs-Polynucleotid-Hybridisierung
wird in der europäischen
Patentanmeldung Nr. 0.070.687 (Heller et al. II) beschrieben.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.232.967 (Morrison I) erörtert Verfahren und Zusammensetzungen
zur Durchführung
von Tests für
Target-Polynucleotidstränge.
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Die
Verfahren umfassen das Kontaktieren einer Probe mit einem Reagens,
das eine erste und eine zweite Polynucleotidsonde umfasst. Die erste
und die zweite Sonde können
eine erste Position, in der die Sonden aneinander gebunden sind,
sowie eine zweite Position einnehmen, worin die Sonden an ein Target
gebunden sind. Die Sonden umfassen Markierungsgruppierungen, die
zur Wechselwirkung fähig
sind, um ein Signal zu erzeugen, das anzeigt, dass sich die Sonden
in einer der beiden Positionen befinden.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.315.364 beschreibt einen immunochemischen
Test zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von
Antigen oder Antikörpern
in einem Fluid. Der Test umfasst (a) das Bilden eines ternären Komplexes
aus einem ersten markierten Antikörper oder Antigen, einem zweiten
markierten Antikörper
oder Antigen und dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper, und
(b) das Detektieren eines Signals, das in Gegenwart von zumindest
einem Substrat erzeugt wird, durch eine Wechselwirkung zwischen
der ersten Markierung und der zweiten Markierung, verstärkt durch
ihre Nähe
zueinander gebunden an die antigenische Substanz.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr: 0.229.943 (Heller et al. III) beschreibt fluoreszierende Stokes-Verschiebungssonden
für einen
Polynucleotidhybridisierungstest. US-Patent Nr. 4.226.993 (Buckler
et al.) beschreibt immunfunktionalisierte Phthalhydrazide, die als
Zwischenprodukte bei der Synthese von chemolumineszierenden Phthalhydrazid-markierten
Konjugaten nützlich
sind. Die Konjugate sind als Reagenzien in spezifischen Bindungstests
nützlich,
um Liganden oder ihre spezifischen Bindungspartner in flüssigen Medien
zu bestimmen.
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Die
US-Patente Nr. 4.380.580 und 4.383.031 (Boguslaski et al. I und
Boguslaski et al. II) beschreiben heterologe bzw. homologe chemolumineszierende
spezifische Bindungstests.
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US-Patent
Nr. 4.220.450 (Maggio I) erörtert
chemisch induzierte Fluoreszenzimmuntests.
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US-Patent
Nr. 4.652.533 (Jolley) beschreibt ein Verfahren zum Festphasen-Immuntest,
in dem eine lumineszierende Markierung enthalten ist.
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US-Patent
Nr. 4.277.437 (Maggio II) offenbart Sets zur Durchführung chemisch
induzierter Fluoreszenz-Immuntests.
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Heller
et al. (IV) beschreiben in "Rapid
Detection and identification of Infectious Agents" Academic Press,
Inc., S. 245-257 (1985), chemolumineszierende und fluoreszierende
Sonden für
DNA-Hybridisierungssysteme.
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Hara
et al. beschreiben in Bull. Chem. Soc. Jpn. 57, 3.009-3.010 (1984),
einen Immuntest unter Verwendung einer Metallkomplexverbindung als
chemolumineszierender Katalysator.
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Kuschnir
et al. beschreiben in Chemical Communications 193 (1969) die photosensibilisierte
Chemolumineszenz von Luminol in 6-Aminophthalazin-1,4-(2H3H)-dion.
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Die
Detektion von Nucleinsäure-Hybridisierung
durch nicht-radioaktive Fluoreszenzresidenzenergie-Transfer wird
von Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8790-8794 (1988),
beschrieben.
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Morrison
et al. beschreiben in Analytical Biochemistry 183, 231-244 (1989),
die Detektion von Polynucleotiden in Lösungsphase unter Einsatz von
interaktiven fluoreszierenden Markierungen und kompetitiver Hybridisierung.
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Zomer
et al. beschreiben in Analytica Chemica Acta 227, 11-19 (1989),
chemolumineszierende Markierungen.
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Morrison
II erörtert
in Analytical Biochemistry 174, 101-120 (1988), die zeitaufgelöste Detektion
von Energie: Theorie und Anwendung für Immuntests.
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US-Patent
Nr. 4.299.916 (Litman et al. I) beschreibt die bevorzugte Signalerzeugung
auf einer Oberfläche
bei Immuntests.
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US-Patent
Nr. 4.233.402 (Maggio et al.) beschreibt Reagenzien und Verfahren
unter Einsatz von Kanalbildung.
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US-Patent
Nr. 4.261.968 (Ullman et al. I) beschreibt Fluroeszenz-Quenchen
mit immunologischen Paaren in Immuntests.
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US-Patent
Nr. 4.318.707 (Litman et al. II) erörtert ein makromolekulares
Fluoreszenz-Quencher-Teilchen in spezifischen Rezeptortests.
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US-Patent
Nr. 4.650.770 (Liu et al.) erörtert
energieabsorbierendes Teilchen-Quenchen in lichtaussendenden kompetitiven
Proteinbindungstests.
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US-Patent
Nr. 4.654.300 (Zuk et al.) beschreibt einen Quenchtest mit fluoreszierenden
Mikroperlen.
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US-Patent
Nr. 4.174.384 (Ullman et al. II) beschreibt Fluoreszenz-Quenchen
mit immunologischen Paaren in Immuntests.
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US-Patent
Nr. 4.193.983 (Ullman et al. III) offenbart markierte Liposomteilchen-Zusammensetzungen und
Immuntests damit.
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Die
US-Patente Nr. 4.199.559 und 3.996.345 (Ullman et al. IV und V)
beschreiben Fluoreszenz-Quenchen mit immunologischen Paaren in Immuntests.
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O'Connell et al., Clin.
Chem. 31(9), 1424-1426 (1985), offenbaren einen kolorimetrischen
Immuntest auf Digoxin unter Einsatz großer, unilamellarer Phospholipidvesikel,
bei denen Farbstoff in die wässrige
Phase des Liposoms eingeschlossen ist.
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Die
Patente Nr. 3.850.578 (McConnell); 4.483.921 (Yaverbaum); und 4.483.929
(Szoka) offenbaren immunreaktive Liposomreagenzien, in denen Antigen
oder Antikörper
an die Oberfläche
von Lipid-Vesikeln gebunden ist.
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Die
US-Patente Nr. 4.529.561 (Hunt et al.); 4.522.803 (Lenk et al.);
und 4.485.054 (Mezei et al.) offenbaren eine Vielzahl von Verfahren
zur Herstellung von Lipidvesikeln.
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US-Patent
Nr. 4.311.712 (Evans et al.) offenbart ein Verfahren zur Herstellung
eines gefriergetrockneten Liposomgemischs.
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US-Patent
Nr. 4.588.578 (Fountain et al.) offenbart ein Verfahren zur Herstellung
von einphasigen Lipidvesikeln und die Verwendung derartiger Vesikel
für Arzneimittelabgabesysteme.
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US-Patent
Nr. 4.576.912 offenbart ein Verfahren zur Erhöhung des Fluoreszenzausmaßes eines
Immuntests unter Einsatz bestimmter langkettiger Träger, die
mit einer Vielzahl von Fluorophoren markiert sind.
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US-Patent
Nr. 4.891.324 beschreibt ein Teilchen mit Lumineszenzmittel für Tests.
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Das
Selektive Abtöten
von T-Lymphozyten durch phototoxische Liposomen wird von Yemu et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 246-250 (1987), beschrieben.
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Mew
et al., J. of Immunology 130(3), 1473-1477 (1983), offenbaren Photoimmuntherapie:
Behandlung von Tiertumoren mit Tumor-spezifischen monoklonalen Antikörper-Hämatoporphyrin-Konjugaten.
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Die
Beobachtung von einzelnen kleinen Molekülen mit dem Lichtmikroskop
wird von Hirschfeld, Applied Optics 15(12), 3135-3139 (1976), erörtert.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.322.926 (McCapra et al.) beschreibt Tests,
bei denen verbesserte chemolumineszierende Ester, Thioester und
Amide eingesetzt werden.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.352.713 (Schaap) beschreibt ein Verfahren
und Zusammensetzungen, die für
verbesserte Chemolumineszenz von 1,2-Dioxetanen sorgen.
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US-Patent
Nr. 4.978.614 (Bronstein) offenbart ein Verfahren zum Detektieren
einer Substanz unter Einsatz des enzymatisch herbeigeführten Abbaus
von Dioxetanen.
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Bronstein
et al. (US-Patent Nr. 4.956.477) offenbaren die Synthese von 1,2-Dioxetanen.
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Schaap
et al. beschreiben in der WO 90/07511 die verstärkte Lumineszenz von 1,2-Dioxetanen
durch Energietransfer auf gebundene Fluoreszenzmittel.
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US-Patent
Nr. 4.959.182 (Schaap) offenbart ein Verfahren und eine Zusammensetzung,
die für
verstärkte
Chemolumineszenz von 1,2-Dioxetanen sorgen.
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US-Patent
Nr. 4.962.192 (Schaap) und 4.857.652 (Schaap) beschreiben chemolumineszierende 1,2-Dioxetan-Verbindungen.
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Bronstein
et al. beschreiben in US-Patent Nr. 4.931.223 ein Verfahren unter
Einsatz von chemolumineszierenden 1,2-Dioxetanen.
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Die
Reinigung stabiler wasselöslicher
Dioxetane wird in der WO 90/02742 (Edwards et al.) beschrieben.
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Neue
chemolumineszierende fusionierte polyzyklische Ringe enthaltende
1,2-Dioxetane, und Tests, bei denen sie eingesetzt werden, werden
in der WO 90/00164 (Edwards et al.) beschrieben.
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Die
WO 89/06226 (Edwards et al.) erörtert
die Synthese von 1,2-Dioxetanen und Zwischenprodukte dafür.
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Neckers
et al. beschreiben in US-Patent Nr. 4.315.998 Polymer-gebundene
photosensibilisierende Katalysatoren.
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Ein
Verfahren zum Detektieren einer Substanz unter Einsatz des enzymatisch
induzierten Abbaus von Dioxetanen wird in der WO 88/00695 (Bronstein
et al.) beschrieben.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.324.202 (Zomer et al.) offenbart Acridinium-Verbindungen als chemoluminogene
Markierungen.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.144.914 (Alberella et al.) beschreibt einen
Hybridisierungstest, bei dem markierte Paare von Hybridbindungsreagenzien
eingesetzt werden.
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Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0.401.001 (Urdea et al.) beschreibt chemolumineszierende, doppelt
angeregte 1,2-Dioxetane.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die sich zur
Bestimmung eines Analyten eignet, wie sie in Anspruch 1 dargelegt
ist. Im Folgenden werden Verfahren beschrieben, in denen die erfindungsgemäße Zusammensetzung
verwendet werden kann.
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Ein
solches Verfahren zum Bestimmen eines Analyten ist eines, bei dem
das Verfahren das Behandeln eines Mediums umfasst, von dem vermutet
wird, dass es einen Analyten enthält, so dass eine an sich metastabile
Spezies gebildet wird, wobei die Spezies fähig ist, in das Medium zu diffundieren
und selektiv mit einer Substanz im Medium zu reagieren, die fähig ist,
mit der metastabilen Spezies zu reagieren, die aufgrund des Vorhandenseins
des Analyten in große
Nähe mit
der Spezies gebracht wird. Das Verfahren umfasst weiters die Bestimmung,
ob die Spezies mit der Substanz reagiert hat, wobei deren Reaktion
die Menge an Analyt im Medium anzeigt.
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Ein
weiteres Verfahren ist ein Test auf einen Analyten in einem flüssigen Medium.
Der Test umfasst die Schritte des Behandelns eines Mediums, von
dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, um einen spezifischen Bindungspaar-(sbp-)Komplex
zu bilden, in Bezug auf das Vorhandensein des Analyten, und des
Bestimmens, ob der Komplex gebildet wurde. Das Verfahren umfasst
das Kombinieren (1) einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die einen
Photosensibilisator aufweist, der mit einem Element eines spezifischen
Bindungspaares verbunden ist, und (2) einer chemolumineszierenden
Verbindung mit dem Medium, die mit einem sbp-Element assoziiert
ist, worin die Lichtmenge, die bei Aktivierung des Photosensibilisators
von der chemolumineszierenden Verbindung ausgesandt wird, mit der
Menge an Analyt im Medium in Zusammenhang steht.
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Ein
weiteres Verfahrens umfasst das Behandeln eines Mediums, von dem
vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, unter solchen Bedingungen,
dass der Analyt, wenn er vorhanden ist, bewirkt, dass der Photosensibilisator
und die chemolumineszierende Verbindung in große Nähe zueinander kommen. Als Ergebnis
kann vom Photosensibilisator erzeugter Singulettsauerstoff die chemolumineszierende
Verbindung aktivieren, die daraufhin Licht oder Lumineszenz erzeugt.
Die erzeugte Lichtmenge steht mit der Analytmenge im Medium in Zusammenhang.
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Ein
weiteres erfindungsgemäßes Verfahren
zum Bestimmen eines Analyten umfasst als ersten Schritt das Bereitstellen
einer Kombination, die ein Medium, von dem vermutet wird, dass es
einen Analyten enthält, und
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
umfasst, worin der Photosensibilisator mit einem sbp-Element assoziiert
ist, und ein suspendierbares Teilchen umfasst die chemolumineszierende
Verbindung. An das suspendierbare Teilchen ist ein sbp-Element gebunden.
Die Kombination wird so behandelt, dass der Photosensibilisator
angeregt wird, der in seinem angeregten Zustand fähig ist,
Sauerstoff in einen Singulettzustand zu aktivieren. Die Kombination
wird dann bezüglich
der ausgesandten Lumineszenzmenge untersucht. Das Ausmaß dieser
Lumineszenz steht mit der Analytmenge im Medium in Beziehung. Alternativ
dazu wird die chemolumineszierende Verbindung mit einem sbp-Element
assoziiert, und das suspendierbare Teilchen umfasst einen Photosensibilisator
und weist ein daran gebundenes sbp-Element auf.
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Ein
weiteres Verfahren dient zum Bestimmen eines Analyten, worin eine
Kombination bereitgestellt wird. Die Kombination umfasst ein Medium,
von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, und
eine erfindungsgemäße Zusammensetzung,
worin der Photosensibilisator mit einem ersten sbp-Element assoziiert ist,
und die chemolumineszierende Verbindung mit einem zweiten sbp-Element
assoziiert ist. Der Photosensibilisator wird dann angeregt und kann
Sauerstoff in einen Singulettzustand anregen, wobei der Singulettsauerstoff
die chemolumineszierende Verbindung aktiviert, wenn sie in große Nähe mit dem
Photosensibilisator gebracht wird. Die von der Kombination ausgesandte
Lumineszenz wird mit der Analytmenge in Beziehung gesetzt.
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Ein
weiteres Verfahren umfasst das Kombinieren in einem wässrigen
Medium einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Analyten
enthält,
eines ersten suspendierbaren Teilchens, das die darin aufgenommene
chemolumineszierende Verbindung und ein daran gebundenes sbp-Element
aufweist, und eines zweiten suspendierbaren Teilchens, in das der
Photosensibilisator aufgenommen ist, der fähig ist, Sauerstoff in seinen
Singulettzustand anzuregen, worin an das zweite Teilchen ein sbp-Element
gebunden ist. Das Medium wird dann bestrahlt, um den Singulettzustand
von Sauerstoff zu induzieren, und die vom Medium abgegebene Lumineszenzmenge
wird gemessen. Das Ausmaß dieser
Lumineszenz steht mit der Analytmenge im Medium in Beziehung.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein suspendierbares
Teilchen umfassen, in dem eine chemolumineszieren de Verbindung aufgenommen
ist, worin an das Teilchen ein sbp-Element gebunden ist. Die Zusammensetzung
kann weiters ein suspendierbares Teilchen umfassen, in dem ein Photosensibilisator
aufgenommen ist.
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Sets,
die eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
umfassen, können
eine in abgepackter Kombination vorliegende Zusammensetzung enthalten,
die (1) ein erstes suspendierbares Teilchen, das eine chemolumineszierende
Verbindung aufweist, worin an das Teilchen ein sbp-Element gebunden
ist, und (2) ein zweites suspendierbares Teilchen umfasst, das einen
Photosensibilisator aufweist, worin an das Teilchen ein sbp-Element
gebunden ist.
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Ausführungsformen
der Erfindung werden nachstehend nur anhand von Beispielen und unter
Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, von denen:
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1 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf Vitamin B12 ist.
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2 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf Digoxin ist.
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3 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf HCG ist.
-
4 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests ist.
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5 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf TSH ist.
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6 ein
Abschnitt der graphischen Darstellung von 5 ist.
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7 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eines weiteren Tests auf HCG
gemäß vorliegender Erfindung
ist.
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8 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse eine DNA-Hybrid-Detektionstests
ist.
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9 eine
graphische Darstellung der Ergebnisse der Detektion eines synthetischen
Targets ist.
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10 eine graphische Darstellung eines Gesamt-Triiodthyronintests
ist: Im Folgenden werden Verfahren beschrieben, in denen die erfindungsgemäße Zusammensetzung
eingesetzt werden kann.
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Ein
Verfahren zum Bestimmen eines Analyten umfasst das Behandeln eines
Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, um eine
an sich metastabile Spezies zu bilden. Die Spezies kann in das Medium
diffundieren und selektiv mit einer Substanz im Medium reagieren,
die fähig
ist, mit der der metastabilen Spezies zu reagieren, die durch das
Vorhandensein des Analyten in große Nähe zur Spezies gebracht wird.
Das Verfahren umfasst weiters die dahingehende Bestimmung, ob die
Spezies mit der Substanz reagiert hat, wobei ihre Reaktion die Analytmenge
im Medium anzeigt.
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Im
Allgemeinen befindet sich die metastabile Spezies in einem angeregten
Zustand. Die metastabile Spezies hat eine Lebensdauer von weniger
als 1 ms, üblicherweise
weniger als 100 μs,
häufiger
weniger als 10 μs.
Die metastabile Spezies ist im Medium diffundierend, d.h. wird an
einer Stelle erzeugt und wandert von der Stelle der Bildung zu einer
anderen Stelle, wo sie Energie übertragen
oder mit einem Molekül
an dieser Stelle reagieren kann.
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Die
metastabile Spezies kann jedes reaktive Zwischenprodukt sein, wie
z.B. ein Radikalion, Nitren, Carben, aus der Gruppe trans-Cyclohexen, α-Lacton,
Trimethylmethan und dergleichen. Von besonderem Interesse sind angeregte
Singulettzustände,
wie z.B. Singulettsauerstoff, Triplettzustände und Dioxetane, einschließlich Dioxetanone
und Dioxetandione. Triplettzustände
werden im Allgemeinen gebildet, indem ein geeigneter Sensibilisator,
wie z.B. Pyren, mit einem Energieakzeptor, wie z.B. einem Anthracen,
kombiniert wird. Beispielsweise kann Dibromanthracen als Energieakzeptor
fungieren, der einen Triplettzustand einnimmt. Der Triplettzustand kann
seine Energie weiter auf ein anderes Molekül übertragen und eine detektierbare
photochemische Reaktion, wie z.B. die Erzeugung von Licht, in Gang
setzen. Dioxetane, wie z.B. Dioxetandione, werden aufgrund der Reaktion
von aktiven Molekülen
mit Singulettsauerstoff oder Wasserstoffperoxid gebildet. Beispielsweise
bilden geeignete Oxalate und Wasserstoffperoxid Dioxetandione. Enzyme,
wie z.B. Meerrettichperoxidase, können Radikalkationen oder Singulettsauerstoff
erzeugen, die ebenso metastabil sind und mit einem anderen Molekül reagieren
können,
um ein detektierbares Signal zu ergeben.
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Das
Vorhandensein eines spezifischen Bindungspaarkomplexes kann bestimmt
werden, indem bewirkt wird, dass eine metastabile Spezies von einem
Element des Komplexes erzeugt wird, woraufhin sie selektiv mit einem
anderen Element des Komplexes in Wechselwirkung treten kann, ohne
mit diesem Element in Wechselwirkung zu treten, wenn es nicht innerhalb
des Komplexes vorliegt.
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In
einem Verfahren bindet sich eine Zusammensetzung, die einen Photosensibilisator
und einen Liganden, einen Rezeptor oder ein Polynucleotid umfasst,
in einem Test an eine Zusammensetzung, die eine chemolumineszierende
Verbindung und einen Liganden, einen Rezeptor oder ein Polynucleotid
umfasst. Die chemolumineszierende Verbindung kann mit Singulettsauerstoff
reagieren, und das gebildete Produkt wird unter Emission von Licht
abgebaut. Der Singulettsauerstoff wird durch den Photosensibilisator üblicherweise durch
Bestrahlung des Photosensibilisators erzeugt. Singulettsauerstoff,
der vom Photosensibilisator erzeugt wird, der nicht an die Zusammensetzung
gebunden ist, die eine chemolumineszierende Verbindung umfasst, kann
die chemolumineszierende Verbindung nicht erreichen, bevor er zerfällt (die
t1/2 beträgt in Wasser etwa 2 μs). Die Zusammensetzung,
die einen Photosensibilisator umfasst, der an die Zusammensetzung
gebunden wird, die die chemolumineszierende Verbindung umfasst,
erzeugt Singulettsauerstoff, der mit der chemolumineszierenden Verbindung
reagiert, weil ein derartiger Singulettsauerstoff die kurze Distanz überleben
kann, die nun zwischen dem Photosensibilisator und der chemolumineszierenden
Verbindung liegt. Die Kürze
der Distanz resultiert aus dem Vorhandensein eines Analyten in der
Probe. Vorzugsweise verläuft
ein Abschnitt der Dis tanz, die vom Singulettsauerstoff durchlaufen
wird, durch ein organisches Medium, wo der Singulettsauerstoff eine
viel längere
Lebensdauer hat, nämlich
mehr als etwa 100 μs.
Der Analyt muss die Bindung zwischen der Zusammensetzung, die den
Photosensibilisator umfasst, und der Zusammensetzung, die die chemolumineszierende
Verbindung umfasst, modulieren. Üblicherweise
ist zumindest einer) von chemolumineszierender Verbindung und Photosensibilisator
mit der Oberfläche
assoziiert, insbesondere, wenn die Oberfläche suspendierbare Teilchen
umfasst.
-
Der
obige Ansatz unter Beteiligung von Singulettsauerstoff-Anregung
einer chemolumineszierenden Verbindung in großer Nähe zu einem Photosensibilisator
ist von McCapra, s. oben, zu unterscheiden. Auf Seite 4, Zeilen
38-46, von McCapra wird ein Test beschrieben, der in einem Quenching-Format
durchgeführt
wird. Beim Test von McCapra wird ein Reaktand eingesetzt, der sich
spezifisch an einen Komplex des Analyten binden kann und spezifische
Material binden kann, an das der Sensibilisator konjugiert wird,
um einen Sensibilisator-Konjugat-Reaktandenkomplex zu bilden. Eine
Quenching-Gruppierung ist an den Reaktanden gebunden. Wenn sie in
große
Nähe zum
Sensibilisator gebracht wird, verringert oder quencht die Quenching-Gruppierung
das Signal, das als Ergebnis der Anregung von gebundenem Sensibilisator
erzeugt wird, oder verringert oder quencht die Übertragung von Elektronen oder
Energie für
den angeregten Sensibilisator auf eine Zwischenspezies (d.h. molekularen
Sauerstoff oder einen Leukofarbstoff). In diesem Quenching-Format
wird das Vorhandensein von Analyt mit der Lumineszenz der zerfallenden
Dioxetane in Beziehung gesetzt. McCapra bezieht sich dann auf die
US-Patente Nr. 4.220.450 und 4.277.437, die oben beschrieben sind.
-
Dieses
von McCapra beschriebene Quenching-Testformat umfasst nur das Quenchen
von angeregtem Sensibilisator und beinhaltet nicht die Singulettsauerstoff-Anregung
einer chemolumineszierenden Verbindung, die mit einem spezifischen
Bindungselement assoziiert ist.
-
Weiters
beschreibt McCapra auf Seite 14, Zeilen 35-36 die Übertragung
von Energie von einer chemolumineszierenden Gruppierung, um einen
Sensibilisator in einem Polynucleotidsondentest anzuregen. Diese
Beschreibung von McCapra unterscheidet sich völlig von der vorliegenden Erfindung,
die das Zusammenbringen in große
Nähe zueinander
eines Photosensibilisators und einer chemolumineszierenden Verbindung durch
das Vorhandensein eines Analyten umfasst, wobei der angeregte Photosensibilisator
Singulettsauerstoff erzeugt, der wiederum die chemolumineszierende
Verbindung anregt.
-
In
einem weiteren Verfahren wird als Markierung eine Gruppe verwendet,
die photochemisch zu einem lumineszierenden Produkt aktiviert werden
kann. Die Gruppe ist mit einem Element eines spezifischen Bindungspaares
assoziiert, und dieses Reagens wird als markierte Regens in Tests
zur Detektion eines Analyten verwendet. Photochemische Aktivierung
kann durch Bestrahlung der Gruppe mit Licht oder durch Umsetzen von
Singulett mit der Gruppe erreicht werden. Vorzugsweise wird ein
Sensibilisator verwendet, um die Photoaktivierung zu unterstützen, wenn
die Anregung durch Singulettsauerstoff erfolgt. Üblicherweise absorbiert der Sensibilisator
Licht, und der so gebildete angeregte Sensibilisator aktiviert Sauerstoff
und der Singulettsauerstoff reagiert mit der Markierung, was ein
metastabiles lumineszierendes Zwischenprodukt ergibt. Die als Markierung
verwendete Gruppe kann jede chemolumineszierende Verbindung umfassen,
die Photoaktivierung mit oder ohne Sensibilisierung erfährt, und
es handelt sich vorzugsweise um eine Gruppe, die durch Reaktion
mit Singulettsauerstoff angeregt wird. Die Markierungen können sowohl
bei homogenen als auch bei heterogenen Testvorschriften eingesetzt
werden, um einen Analyten zu bestimmen. Wünschenswert ist keine Zugabe
von chemischen Reagenzien erforderlich, um die chemolumineszierende
Verbindung mit oder ohne einen Sensibilisator und Energieakzeptor
zu aktivieren. Bei einer homogenen Vorschrift werden alle Reagenzien
kombiniert, und das Medium wird bestrahlt, um die chemolumineszierende
Verbindung zu aktivieren.
-
In
der Testvorschrift werden die Komponenten in Kombination bereitgestellt,
und das in Abhängigkeit von
der Anregung von Sauerstoff durch Sensibilisator erzeugte Licht
ist von der Analyt-Konzentration abhängig. Vorteilhaft können die
Verfahren durchge führt
werden, ohne das Medium zu erwärmen,
um Licht zu erzeugen. Folglich kann der Test bei einer konstanten
Temperatur durchgeführt
werden.
-
Bevor
mit der Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung fortgefahren wird, werden eine Reihe von Begriffen definiert
und im Detail beschrieben.
-
Analyt:
Die zu detektierende Verbindung oder Zusammensetzung. Der Analyt
kann aus einem Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) bestehen
und kann ein Ligand sein, der einwertig (monoepitopisch) oder mehrwertig
(polyepitopisch), üblicherweise
antigenisch oder haptenisch ist und aus einer einzelnen Verbindung
oder einer Vielzahl von Verbindungen besteht, die zumindest eine
epitopische oder determinante Stelle gemeinsam haben. Der Analyt
kann ein Teil einer Zelle wie eines Bakteriums oder einer Zelle
sein, die die ein Blutgruppenantigen, wie A, B, D usw. trägt, oder
eines HLA-Antigens oder eines Mikroorganismus, z.B. Bakterium, Fungus,
Protozoe oder Virus.
-
Die
mehrwertigen Ligandenanalyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d.h.
Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren sowie
Kombinationen davon. Derartige Kombinationen umfassen Komponenten
von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen,
Zellmembranen und dergleichen.
-
Größtenteils
weisen die polyepitopischen Ligand-Analyten, auf die die vorliegende
Erfindung angewandt werden kann, ein Molekulargewicht von zumindest
etwa 5.000, häufiger
zumindest etwa 60.000, auf. In der Poly(aminosäure)kategorie haben die Poly(aminosäuren) von
Interesse im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis
5.000.000, häufiger
von etwa 20.000 bis 1.000.000; bei den Hormonen von Interesse liegt
das Molekulargewicht üblicherweise
im Bereich von etwa 5.000 bis 60.000.
-
Eine
große
Vielzahl von Proteinen kann als Familie von Proteinen mit ähnlichen
Strukturmerkmalen betrachtet werden, Proteine mit bestimmtem biologischen
Funk tionen, Proteinen, die mit spezifischen Mikroorganismen verbunden
sind, bestimmte Erkrankung verursachende Mikroorganismen usw. Derartige
Proteine sind beispielsweise Immunglobuline, Zytokine, Enzyme, Hormone,
Krebsantigene, Nährstoffmarker,
gewebespezifische Antigene usw.
-
Es
folgen Klassen von Proteinen, die aufgrund der Struktur verwandt
sind:
- Protamine
- Histone
- Albumine
- Globuline
- Skleroproteine
- Phosphoproteine
- Mucoproteine
- Chromoproteine
- Lipoproteine
- Nucleoproteine
- Glykoproteine
- T-Zellen-Rezeptoren
- Proteoglykane
- HLA
- unklassifizierte Proteine, z.B. Somatotropin, Prolactin, Insulin,
Pepsin
-
Eine
Anzahl von Proteinen, die im menschlichen Plasma zu finden sind,
sind von klinischer Bedeutung, und dazu gehören:
- Präalbumin
- Albumin
- α1-Lipoprotein
- α1-Glykoprotein
- Transcortin
- 4.6S-Postalbumin
- Tryptophan-armes α1-Glykoprotein
- α1X-Glykoprotein
- Thyroxin-bindendes Globulin
- Inter-α-trypsin-Inhibitor
- Gc-Globulin
- (Gc 1-1)
- (Gc 2-1)
- (Gc 2-2)
- Haptoglobin
- (Hp 1-1)
- (Hp 2-1)
- (Hp 2-2)
- Ceruloplasmin
- Cholinesterase
- α2-Lipoprotein(e)
- Myoglobin
- C-reaktives Protein
- α2-Macroglobulin
- α2-Hs-Glykoprotein
- Zn-α2-Glykoprotein
- α2-Neuraminoglykoprotein
- Erythropoietin
- β-Lipoprotein
- Transferrin
- Hemopexin
- Fibrinogen
- Plasminogen
- β2-Glykoprotein I
- β2-Glykoprotein II
- Immunglobulin G
- (IgG) oder γG-Globulin
- Molekülformel:
- γ2κ2 oder γ2λ2
- Immunoglobulin A (IgA)
- oder γA-Globulin
- Molekülformel:
- (α2κ2)a oder (α2κ2)a
- Immunglobulin M
- (IgM) oder γM-Globulin
- Molekülformel:
- (μ2κ2)5 oder (μ2λ2)5
- Immunglobulin D (IgD)
- oder γD-Globulin
(γD)
- Molekülformel:
- (δ2κ2) oder δ2λ2)
- Immunglobulin E (IgE)
- oder γE-Globulin
(γE)
- Molekülformel:
- (ε2κ2) oder (ε2λ2)
- Freie κ-
und λ-Leichtketten
- Komplementfaktoren:
- C'1
- C'1q
- C'1r
- C'1s
- C'2
- C'3
- β1 A
- α2D
- C'4
- C'5
- C'6
- C'7
- C'8
- C'9
-
Wichtige
Blutgerinnungsfaktoren sind:
-
Wichtige
Proteinhormone sind:
- Peptid- und Proteinhormone
- Parathyreoidhormon
- (Parathormon)
- Thyrocalcitonin
- Insulin
- Glucagon
- Relaxin
- Erythropoietin
- Melanotropin
- (Melanocyten-stimulierend)
- Hormon; Intermedin)
- Somatotropin
- (Wachstumshormon)
- Corticotropin
- (adrenocorticotropes Hormon)
- Thyrotropin
- Follikel stimulierendes Hormon
- Luteinisierendes Hormon
- (interstitielle Zellen stimulierendes Hormon)
- Luteomammotropes Hormon
- (Luteotropin, Polactin
- Gonadotropin
- (choriones Gonadotropin)
-
Gewebehormone
-
- Secretin
- Gastrin
- Angiotensin I und II
- Bradykinin
- Menschliches Plazenta-Lactogen
-
Cytokine
-
- IL I
- IL II
- IL VI
- EGF
- TNF
- NGF
-
Krebsantigene
-
- PSA
- CEA
- α-Fetoprotein
- Saure Phosphatase
- CA19.9
- CA125
-
Gewebespezifische Antigene
-
- Alkalische Phosphatasen
- Myoglobin
- CPK-MB
- Calcitonin
- Myelin-Basisprotein
-
Peptidhormone von der
Neurohypophyse
-
- Oxytocin
- Vasopressin
- Freisetzungsfaktoren (RF)
- CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF
-
Andere
polymere Materialien von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.
-
Veranschaulichende
Beispiele für
Mikroorganismen sind:
Corynebakterien | |
Löffler-Diphtherie-Bazillus | |
| |
Pneumokokken | |
Diplococcus
pneumoniae | |
| |
Streptokokken | |
Streptococcus
aureus | |
Streptococcus
albus | |
| |
Neisseria | |
Meningokokkus | |
Gonokokkus | |
| |
Enterobacteriaceae | |
Escherichia
coli | |
Aerobacter
aerogenes | Bakterien
der Koligruppe |
Klebsiella
pneumoniae | |
Salmonella
typhosa | |
Salmonella
choleraesuis | Salmonellae |
Salmonella
typhimurium | |
Shigella
dysenteria | |
Shigella
schmitzii | |
Shigella
arabinotarda | Shigellae |
Shigella
flexneri | |
Shigella
boydii | |
Shigella
sonnei | |
| |
Andere
Darmbakterien | |
Proteus
vulgaris | |
Proteus
mirabilis | Proteus-Spezies |
Proteus
morgani | |
Pseudomonas
aeruginosa | |
Alcaligenes
faecalis | |
Vibrio
cholerae | |
Haemophilus-Bordetella-Gruppe | Rhizopus
oryzae |
Haemophilus
influenzae, H. ducryi | Rhizopus
arrhizua |
Phycomycetes | |
Haemophilus
haemophilus | Rhizopus
nigricans |
Haemophilus
aegypticus | Sporotrichum
schenkii |
Haemophilus
parainfluenza | Flonsecaea
pedrosoi |
Bordetella
pertussis | Flonsecaea
compact |
| |
Pasteurellae | Flonsecaea
dermatidis |
Pasteurella
pestis | Cladosporium
carrionii |
Pasteurella
tulareusis | Phialophora
verrucosa |
| |
Brucellae | Aspergillus
nidulans |
Brucella
melitensis | Madurella
mycetomi |
Brucella
abortus | Madurella
grisea |
Brucella
suis | Allescheria
boydii |
| |
Aerobe
sporenbildende Bazillen | Phialophora
jeanselmei |
Bacillus
anthracis | Microsporum
gypseum |
Bacillus
subtilis | Trichophyton
mentagrophytes |
Bacillus
megaterium | Keratinomyces
ajelloi |
Bacillus
cereus | Microsporum
canis |
| |
Anaerobe
sporenbildende Bazillen | Trichophyton
rubrum |
Clostridium
botulinum | Microsporum
adouini |
Clostridium
tetani | Viren |
Clostridium
perfringens | Adenoviren |
Clostridium
novyi | Herpesviren |
Clostridium
septicum | Herpes
simplex |
Clostridium
histolyticum | Varicella
(Windpocken) |
Clostridium
tertium | Herpes
zoster (Gürtelrose) |
Clostridium
bifermentans | Virus
B |
Clostridium
sporogenes | Cytomegalovirus |
| |
Mycobacteria | Pockenviren |
Mycobacterium
tuberculosis hominis | Variola
(Pocken) |
Mycobacterium
bovis | Kuhpocken |
Mycobacterium
avium | Rinderpocken-Virus |
Mycobacterium
leprae | Paravakzine |
Mycobacterium
paratuberculosis | Molluscum
contagiosum |
Actinomyces
(pilzartige Bakterien) | Picornaviren |
Actinomyces
Isaeli | Poliovirus |
Actinomyces
bovis | Coxsackie-Virus |
Actinomyces
naeslundii | ECHO-Viren |
Nocardia
asteroides | Rhinoviren |
Nocardia
brasiliensis | Myxoviren |
| |
Spirochäten | Influenza
(A, B und C) |
Treponema
pallidium Spirillum minus | Parainfluenza
(1-4) |
Treponema
pertenue Streptobacillus | Mumps-Virus |
monoiliformis | Pseudogeflügelpest-Virus |
Treponema
carateum | Masern-Virus |
Borrelia
recurrentis | Rinderpest-Virus |
Leptospira
icterohaemorrhagiae | Hundestaupe-Virus |
Leptospira
canicola | RS-Virus |
| |
Trypanasomes | Röteln-Virus |
| |
Mycoplasmas | ARBO-Viren |
Mycoplasma
pneumoniae | |
| |
Andere
Pathogene | EEE-Virus |
Eucephalitis-Virus | |
Listeria
monocytogenes | WEE-Virus |
Eucephalitis-Virus | |
Erysipelothrix
rhusiopathiae | Sindbis-Virus |
Streptobacillus
monoiliformis | Chikungunya-Virus |
Donvania
granulomatis | Semliki
Forest-Virus |
Bartonella
bacilliformis | Mayora-Virus |
Rickettsiae
(bakterienartige Parasiten) | St.
Louis-Virus |
Encephalitis-Virus | |
Rickettsia
prowazekii | California
Enzephalitis-Virus |
Rickettsia
mooseri | Colorado-Zeckenfieber-Virus |
Rickettsia
rickettsii | Gelbfieber-Virus |
Rickettsia
conori | Dengue-Virus |
Rickettsia
australis | Reoviren |
Rickettsia
sibiricus | Reoviren-Typen
1-3 |
Rickettsia
akari | Retroviren |
Rickettsia
tsutsugamushi | Human-Immunschwäche-Viren
(HIV) |
Rickettsia
burnetti | Human-T-Zellen-Lymphotrophie-Virus |
Rickettsia
quintana | I & II (HTLV) |
Chlamydia
(nicht klassifizierbare | Hepatitis-Viren |
Parasiten – Bakterien/Viren) | Hepatitis
A-Virus |
| |
Chlamydia-Agentien
(Benennung | Hepatitis
B-Virus |
ungewiss) | Hepatitis
NichtA-NichtB-Virus |
| |
Pilze | Tumor-Viren |
Cryptococcus
neoformans | Rauscher-Leukämie-Virus |
Blastomyces
dermatidis | Gross-Virus |
Histoplasma
capsulatum | Maloney-Leukämie-Virus |
Coccidioides
immitis | Human-Papillom-Virus |
Paracoccidioides
brasiliensis | |
Candida
albicans | |
Aspergillus
fumigatus | |
Mucor
corymbifer (Absidia corymbifera) | |
-
Die
monoepitopischen Ligandenanalyten besitzen ein Molekulargewicht
von im Allge meinen etwa 100 bis 2.000, noch häufiger von 125 bis 1.000. Zu
den Analyten zählen
Arzneimittel, Metaboliten, Pestizide, Schmutzstoffe und dergleichen.
Zu den Arzneimitteln von Interesse zählen Alkaloide. Beispiele für Alkaloide sind
Morphinalkaloide, umfassend Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan,
ihre Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, umfassend Kokain
und Benzylecgonin, ihre Derivate und Metaboliten; Ergotalkaloide, umfassend
Lysergsäurediamid;
Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide; Isochinolinalkaloide;
Chinolinalkaloide, umfassend Chinin und Chinidin; Diterpenalkaloide,
ihre Derivate und Metaboliten.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln enthält
Steroide, z.B. Östrogene,
Androgene, andreokortikale Steroide, Gallensäuren, karidotone Glykoside
und Aglykone, z.B.
-
Digoxin
und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, ihre Derivate und Metaboliten.
-
Ferner
sind steroide mimetische Substanzen, wie z.B. Diethylstilbestrol,
enthalten.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Lactame mit Elementen in Form von
5- bis 6-Ringen,
z.B. Barbiturate wie etwa Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin,
Primidon, Ethosuximid und ihre Metaboliten.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2
bis 3 Kohlenstoffatomen, umfassend Amphetamine; Catecholamine wie
etwa Ephedrin, L-Dopa,
Epinephrin; Nacrein; Papaverin; und Metaboliten davon.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Benzoheterozyklen, z.B. Oxazepam,
Chlorpromazin, Tegretol, ihre Derivate und Metaboliten, wobei die
heterozyklischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Purine wie etwa Theophyllin, Coffein,
ihre Metaboliten und Derivate.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind jene, die von Marihuana herrühren, z.B.
Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Hormone, wie z.B. Thyroxin, Cortisol,
Triiodthyronin, Testosteron, Estradiol, Estron, Progestron, Polypeptide
wie z.B. Angiotensin, LHRH und Immunsuppressiva, wie z.B. Cyclosporin,
FK506, Mycophenolsäure
usw.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Vitamine, wie z.B. A, B wie etwa B12, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Prostaglandine, die sich in ihrem
Grad und den Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind die trizyklischen Antidepressiva,
z.B. Imipramin, Dismethylimipramin, Amitriptylin, Nortriptylin,
Protriptylin, Trimipramin, Chlomipramin, Doxepin und Demethyldoxepin.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind die Antineoplastika, zu denen 0Methotrexat
gehört.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Antibiotika, z.B. Penicillin, Chlormycetin,
Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, ihre Metaboliten und Derivate.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Nucleoside und Nucleotide, z.B. ATP,
NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidine mit ihren geeigneten
Zucker- und Phosphatsubstituenten.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind verschiedene individuelle Medikamente,
z.B. Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Lidocain, Procainamid,
Acetylprocainamid, Propanolol, Griseofulvin, Valproinsäure, Butyrophenone,
Antihistamine, Chloramphenicol, Anticholinergika, wie z.B. Atropine,
ihre Metaboliten und Derivate.
-
Mit
Krankheitszuständen
assoziierte Metaboliten sind Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und
Porphyrin Typ 1.
-
Die
nächste
Gruppe von Arzneimitteln sind Aminoglykoside, z.B. Gentamicin, Kanamicin,
Tobramycin und Amikacin.
-
Zu
Pestiziden von Interesse zählen
polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate,
polyhalogenierte Sulfenamide, ihre Metaboliten und Derivate.
-
Für Rezeptoranalyten
reichen die Molekulargewichte im Allgemeinen von 10.000 bis 2 × 108, noch häufiger
von 10.000 bis 106. Für Immunglobuline IgA, IgG,
IgE und IgM variieren die Molekulargewichte im Allgemeinen von etwa
160.000 bis etwa 106. Enzyme reichen hinsichtlich
des Molekulargewichts normalerweise von etwa 10.000 bis 1.000.000.
Natürliche
Rezeptoren variieren stark und besitzen ein Molekulargewicht von im
Allgemeinen zumindest etwa 25.000, möglicherweise 106 oder
mehr; dazu zählen
Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-Bindungsglobulin, Thyroxin-Bindungspräalbumin,
Transcortin usw.
-
Der
Ausdruck Analyt umfasst ferner Polynucleotid-Analyten, wie z.B.
die unten definierten Polynucleotide. Dazu zählen m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA,
DNA-RNA-Duplexe usw. Der Ausdruck Analyt umfasst außerdem Rezeptoren,
die Polynucleotid-Bindemittel sind, z.B. Restriktionsenzyme, Aktivatoren,
Repressoren, Nucleasen, Polymerasen, Histone, Reparaturenzyme, Chemotherapeutika
und dergleichen.
-
Der
Analyt kann ein Molekül
sein, das sich direkt in einer Probe, wie z.B. einer Körperflüssigkeit
aus einem Wirt, befindet. Die Probe kann direkt untersucht oder
vorbehandelt werden, um den Analyten leichter detektierbar zu machen.
Außerdem
kann der Analyt von Interesse bestimmt werden, indem ein Mittel
detektiert wird, das den Analyten von Interesse untersuchen kann,
z.B. ein sbp, das zum Analyten von Interesse komplementär ist, dessen
Gegenwart nur dann detektiert wird, wenn sich der Analyt von Interesse
in einer Probe befindet. Das den Analyten untersuchende Mittel wird
somit zum Analyten, der in einem Test detektiert wird. Die Körperflüssigkeit
kann z.B. Harn, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Stuhl, Sputum,
Zerebrospinalflüssigkeit,
Tränen,
Mukus und dergleichen sein.
-
Element
eines spezifischen Bindungspaars ("sbp-Element"): Eines von zwei unterschiedlichen
Molekülen
mit einem Bereich auf der Oberfläche
oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche
und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist.
Die Elemente des sbp werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand)
bezeichnet. Diese sind üblicherweise die
Elemente eines immunologischen Paars, wie z.B. Antigen-Antikörper, obwohl
andere sbp wie etwa Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nucleinsäure-Duplexe,
IgG-Protein A, Polynucleotidpaare, wie z.B. DNA-DNA, DNA-RNA und
dergleichen, keine immunologischen Paare sind, aber im Schutzbereich
der Erfindung und in der Definition von sbp-Element enthalten sind.
-
Polynucleotid:
Eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nucleotid
ist, das im natürlichen
Zustand etwa 50 bis 500.000 oder mehr Nucleotide aufweist und im
isolierten Zustand etwa 15 bis 50.000 oder mehr Nucleotide, üblicherweise
etwa 15 bis 20.000 Nucleotide, noch häufiger 15 bis 10.000 Nucleotide,
besitzt. Das Polynucleotid enthält
Nucleinsäuren
aus jeder beliebigen Quelle in gereinigter oder nicht gereinigter
Form, natürlich
vorkommend oder synthetisch produziert, z.B. DNA (dsDNA und ssDNA)
und RNA, üblicherweise
DNA, und kann t-RNA, m-RNA,
r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und RNA, DNA-RNA-Hybride oder
Gemische davon, Gene, Chromosome, Plasmide, die Genome von biologischem
Material, wie z.B. Mikroorganismen wie etwa Bakterien, Hefe, Viren,
Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen, Tiere, Menschen, sowie
Fragmente davon und dergleichen sein.
-
Ligand:
Jede beliebige organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt
oder hergestellt werden kann.
-
Ligandanalog:
Ein modifizierter Ligand, ein organischer Rest oder Analytenanalog, üblicherweise
mit einem Molekulargewicht von mehr als 100, der mit dem analogen
Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation
die Möglichkeit
bietet, ein Ligandanalog mit einem anderen Molekül zu verbinden. Das Ligandanalog
unterscheidet sich vom Liganden üblicherweise – aber nicht
notwendigerweise – durch mehr
als eine Ersetzung eines Wasserstoffs durch eine Bindung, die das
Ligandanalog mit einem Hub oder Marker verknüpft. Das Ligandanalog kann
sich in ähnlicher
Weise wie der Ligand an den Rezeptor binden. Das Analog könnte beispielsweise
ein gegen den Idiotyp eines Liganden-Antikörpers gerichteter Antikörper sein.
-
Rezeptor
("Antiligand"): Jede Verbindung
oder Zusammensetzung, die eine bestimmte räumliche und polare Organisation
eines Moleküls
erkennen kann, z.B. eine Epitop- oder Determinantenstelle. Beispiele
für Rezeptoren
sind natürlich
vorkommende Rezeptoren, z.B. Thyroxin-Bindungsglobulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente,
Lectine, Nucleinsäuren,
Protein A, Komplementkomponente C1q und dergleichen.
-
Spezifische
Bindung: Die spezifische Erkennung eines von zwei unterschiedlichen
Molekülen
für das andere
(im Vergleich zur wesentlich weniger stark ausgeprägten Erkennung
anderer Moleküle).
Im Allgemeinen besitzen die Moleküle Bereiche auf ihren Oberflächen oder
Hohlräumen,
die zur spezifischen Erkennung zwischen den zwei Molekülen führen. Beispiele
für spezifische
Bindung sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen,
Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Polynucleotid-Wechselwirkungen
usw.
-
Nichtspezifische
Bindung: Nichtkovalente Bindung zwischen Molekülen, die relativ unabhängig von spezifischen
Oberflächensutrukturen
ist. Nichtspezifische Bindung kann die Folge verschiedener Faktoren sein,
z.B. hydrophober Wechselwirkungen zwischen Molekülen.
-
Antikörper: Ein
Immunglobulin, das sich spezifisch an eine bestimmte räumliche
und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert
ist. Der Antikörper
kann monoklonal oder polyklonal sein und durch auf dem Gebiet bekannte
Techniken erzeugt werden, z.B. durch Immunisierung eines Wirts und
Gewinnung von Seren (polyklonal), durch Herstellung kontinuierlicher
Hybridzelllinien und Gewinnung des sekretierten Proteins (monoklonal)
oder durch Klonieren und Exprimieren von Nucleotidsequenzen oder
mutagenisierten Versionen davon, die zumindest für die Aminosäuresequenzen
kodieren, die für
die spezifische Bindung natürlicher
Antikörper
erforderlich sind. Antikörper
können
ein vollständiges Immunglobulin
oder ein Fragment davon enthalten, welche Immunglobuline die verschiedenen
Klassen und Isotypen, wie z.B. IgA, IgD, IgE, IGG1, IgG2a, IgG2b
und IgG3, IgM usw., umfassen. Fragmente davon sind Fab, Fv und F(ab')2,
Fab' und dergleichen.
Darüber
hinaus können
Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder ihrer
Fragmente in geeigneten Fällen
verwendet werden, sofern die Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül aufrechterhalten
bleibt.
-
Alkyl:
Ein einwertiger, verzweigter oder unverzweigter Rest, der von einem
aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines H-Atoms abgeleitet
ist; dazu zählen
Niederalkyl und langkettiges Alkyl.
-
Niederalkyl:
Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl,
Butyl, Isopropyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl usw.
-
Langkettiges
Alkyl: Alkyl mit mehr als 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, z.B.
Hexyl, Heptyl, Octyl usw.
-
Alkyliden:
Zweiwertiger organischer Rest, abgeleitet von einem aliphatischen
Kohlenwasserstoff, z.B. Ethyliden, bei dem 2 Wasserstoffatome vom
gleichen Kohlenstoffatom entfernt wurden.
-
Aryl:
Organischer Rest, abgeleitet von einem aromatischen Kohlenwasserstoff
durch Entfernung eines Atoms und umfassend einen oder mehrere aromatische
Ringe, üblicherweise
1 bis 4 aromatische Ringe, z.B. Phenyl (von Benzol), Naphthyl (von
Naphthalin) usw.
-
Aralkyl:
Organischer Rest mit einer Alkylgruppe, an die eine Arylgruppe gebunden
ist, z.B. Benzyl, Phenethyl, 3-Phenylpropyl, 1-Naphthylethyl usw.
-
Alkoxy:
Alkylrest, der über
ein Sauerstoffatom am Rest eines Moleküls gebunden ist, z.B. Methoxy, Ethoxy
usw.
-
Aryloxy:
Arylrest, der über
ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z.B. Phenoxy, Naphthoxy
usw.
-
Aralkoxy:
Aralkylrest, der über
ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z.B. Benzoxy,
1-Naphthylethoxy usw.
-
Substituiert:
Bedeutet, dass ein Wasserstoffatom eines Moleküls durch ein anderes Atom ersetzt
wurde, das ein einzelnes Atom, wie etwa Halogen usw., oder Teil
einer Gruppe von Atomen sein kann, die eine Funktionalität bilden,
z.B. als Substituent mit 1 bis 50 Atomen (mit Ausnahme der erforderlichen
Wasserstoffatome, die zur Erfüllung
der Valenz solcher Atome notwendig sind), welche Atome unabhängig vonei nander aus
der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel
und Phosphor ausgewählt
sind und an eines oder mehrere Metallatome gebunden sein können.
-
Alkylthio:
Alkylrest, der über
ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z.B. Phenylthio,
Naphthylthio usw.
-
Arylthio:
Arylrest, der über
ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z.B. Phenylthio,
Naphthylthio usw.
-
Elektronen-spendende
Gruppe: Substituent, der – wenn
er an ein Molekül
gebunden ist – das
Molekül polarisieren
kann, sodass die Elektronen-spendende Gruppe arm an Elektronen und
im Verhältnis
zu einem anderen Teil des Moleküls
positiv geladen wird, d.h. reduzierte Elektronendichte aufweist.
Solche Gruppe können
u.a. Amine, Ether, Thioether, Phosphine, Hydroxy, Oxyanionen, Mercaptane
und ihre Anionen, Sulfide usw. sein.
-
Substituent
mit 1 bis 50 Atomen (mit Ausnahme der erforderlichen Wasserstoffatome,
die zur Erfüllung der
Valenz solcher Atome notwendig sind), welche Atome unabhängig voneinander
aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff,
Schwefel und Phosphor ausgewählt
sind: Organischer Rest, der 1 bis 50 Atome mit Ausnahme der erforderlichen
Anzahl an Wasserstoffatomen besitzt, die zur Erfüllung der Valenz der Atome
im Rest notwendig sind. Im Allgemeinen ist das vorherrschende Atom
Kohlenstoff (C), es kann aber auch Sauerstoff (O), Stickstoff (N),
Schwefel (S) oder Phosphor (P) sein, worin O, N, S oder P – falls
vorhanden – an
Kohlenstoff oder an eines oder mehrere voneinander oder an Wasserstoff
oder ein Metallatom gebunden sind, um verschiedene funktionelle
Gruppen zu bilden, z.B. Carbonsäuren,
Alkohole, Thiole, Carbonsäureamide,
Carbamate, Carbonsäureester,
Sulfonsäuren,
Sulfonsäureester,
Phosphorsäuren,
Phosphorsäureester, Harnstoffe,
Carbamate, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether,
Olefine, Acetylene, Amine, Ketone, Aldehyde, Nitrile und dergleichen.
Beispiele für
solche organi sche Reste oder Gruppen sind u.a. Alkyl, Alkylidin,
Aryl, Aralkyl sowie Alkyl, Aryl und Aralkyl, substituiert mit einer
oder mehreren der obigen Funktionalitäten.
-
Linkergruppe:
Die kovalente Verbindung zwischen Molekülen. Die Linkergruppe variiert
je nach Beschaffenheit der verbundenen Moleküle, d.h. Photosensibilisator,
Chemolumineszenzverbindung, sbp-Element oder Molekül, das mit
einem Teilchen assoziiert ist oder einen Teil davon bildet. Funktionelle
Gruppen, die normalerweise vorhanden sind oder in einen Photosensibilisator
oder eine Chemolumineszenzverbindung eingebaut werden, dienen dazu,
diese Materialien mit einem sbp-Element oder einem Teilchen zu verknüpfen; Beispiele
sind die lipophile Verbindung eines Liposoms oder Öltröpfchens,
Latexteilchens, Silikonteilchens, Metallsols oder Farbstoffkristallits.
-
Zumeist
werden Carbonylfunktionalitäten
verwendet – sowohl
Oxocarbonyl, wie z.B. Aldehyd, als auch Nicht-Oxocarbonyl (einschließlich Stickstoff-
und Schwefelanaloge), z.B. Carboxy, Amidin, Amidat, Thiocarboxy
und Thionocarboxy.
-
Alternative
Funktionalitäten
von Oxo sind aktives Halogen, Diazo, Mercapto, Olefin, insbesondere
aktiviertes Olefin, Amino, Phosphoro und dergleichen. Eine Beschreibung
von Linkergruppen findet sich in der US-A-3.817.837, welche Offenbarung
hierin durch Verweis aufgenommen ist.
-
Die
Linkergruppen können
von einer Bindung bis zu einer Kette mit 1 bis 100 Atomen, üblicherweise mit
1 bis 70 Atomen, vorzugsweise mit 1 bis 50 Atomen, noch bevorzugter
mit 1 bis 20 Atomen, die jeweils unabhängig voneinander aus der normalerweise
aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff und Phosphor bestehenden
Gruppe ausgewählt
sind, reichen. Die Anzahl an Heteroatomen in den Linkergruppen reicht normalerweise
von etwa 0 bis 20, üblicherweise
von etwa 1 bis 15, noch bevorzugter von etwa 2 bis 6. Die Atome
in der Kette können
mit anderen Atomen als Wasserstoff substituiert sein (ählich wie
oben für
den Substituenten mit 1 bis 50 Atomen beschrieben). Allgemein gesprochen
kann die Länge
einer jeweiligen Linkergruppe willkürlich gewählt werden, um die Synthese
zu vereinfachen und jede gewünschte
Gruppe, wie z.B. einen Energie-Akzeptor, ein Fluorophor, eine Gruppe
zur Analyse von Zwischensystemübergängen, wie
z.B. ein schweres Atom und dergleichen, inkorporieren zu können. Die
Linkergruppen können
aliphatisch oder aromatisch sein, obwohl im Falle von Diazogruppen üblicherweise
aromatische Gruppen enthalten sind.
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Wenn
Heteroatome vorhanden sind, ist Sauerstoff normalerweise als Oxo
oder Oxy, gebunden an Kohlenstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor,
vorhanden; Stickstoff ist normalerweise als Nitro, Nitroso oder Amino
vorhanden, normalerweise gebunden an Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel
oder Phosphor; Schwefel ist analog zu Sauerstoff; Phosphor hingegen
ist an Kohlenstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff gebunden, üblicherweise
als Phosphonat und Phosphatmono- und -diester.
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Gemeinsame
Funktionalitäten
bei der Schaffung einer kovalenten Bindung zwischen der Linkergruppe und
dem zu konjugierenden Molekül
sind Alkylamin, Amidin, Thioamid, Ether, Harnstoff, Thioharnstoff,
Guanidin, Azo, Thioether sowie Carboxylat, Sulfonat, Phosphatester,
Amide und Thioester.
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Zumeist
besitzen der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
eine Nicht-Oxocarbonylgruppe mit Stickstoff- und Schwefelanalogen,
eine Phosphatgruppe, eine Aminogruppe, ein Alkylierungsmittel, wie
z.B. Halogen oder Tosylalkyl, Oxy, (Hydroxyl oder das Schwefelanalog
Mercapto), Oxocarbonyl (z.B. Aldehyd oder Keton) oder aktives Olefin,
wie etwa Vinylsulfon oder α,β-ungesättigten
Ester. Diese Funktionalitäten
werden mit Aminogruppen, Carboxylgruppen, aktiven Olefinen, Alkylierungsmitteln,
wie z.B. Bromacetyl, verknüpft.
Wenn ein Amin und Carbonsäure
oder ihr Stickstoffderivat oder Phosphorsäure verbunden werden, entstehen
Amide, Amidine und Phosphoramide. Wenn Mercaptan und aktivertes
Olefin verbunden werden, entstehen Thioether. Wenn ein Mercaptan
und ein Alkylierungsmittel verbunden werden, entstehen Thioether.
Wenn Aldehyd und ein Amin unter reduzierenden Bedingungen verbunden
werden, entsteht ein Alkylamin. Wenn eine Carbonsäure oder
Phosphorsäure
und ein Alkohol verbunden werden, entstehen Ester.
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Hydrophilie
oder Wasserlöslichkeit
verleihende Gruppe oder Funktionalität: Hydrophile Funktionalität, die die
Benetzbarkeit von Feststoffen mit Wasser und die Löslichkeit
von Verbindungen, an die sie gebunden ist, in Wasser erhöht. Eine
derartige funktionelle Gruppe oder Funktionalität kann ein Substituent mit
1 bis 50 oder mehr Kohlenstoffatomen sein; Beispiele sind Sulfonat,
Sulfat, Phosphat, Amidin, Phosphonat, Carboxylat, Hydroxyl, insbesondere
Polyole, Amin, Ether, Amid und dergleichen. Beispiele für funktionelle
Gruppen sind Carboxyalkyl, Sulfonoxyalkyl, CONHOCH2-COOH, CO-(Glucosamin),
Zucker, Dextran, Cyclodextrin, SO2NHCH2COOH, SO3H, CONHCH2CH2SO3H,
PO3H2, OPO3H2, Hydroxyl, Carboxyl,
Keton und Kombinationen davon. Die meisten der obigen Funktionalitäten können auch
als Bindungsgruppen verwendet werden, die die Bindung des Photosensibilisators
oder der Chemolumineszenzverbindung an ein sbp-Element oder einen Träger ermöglichen.
-
Lipophilie
oder Lipidlöslichkeit
verleihende Gruppe oder Funktionalität: Lipophile Funktionalität, die die Benetzbarkeit
von Oberflächen
durch Wasser und die Löslichkeit
von Verbindungen, an die sie gebunden ist, in Wasser senkt. Eine
solche funktionelle Gruppe oder Funktionalität kann 1 bis 50 oder mehr Atome
enthalten, üblicherweise
mit Wasserstoff oder Halogen substituierte Kohlenstoffatome, und
kann Alkyl, Alkyliden, Aryl und Aralkyl umfassen. Die lipophile
Gruppe oder Funktionalität
besitzt normalerweise 1 bis 6 unverzweigte oder verzweigte aliphatische
Gruppen von zumindest 6 Kohlenstoffatomen, noch häufiger von
zumindest 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von zumindest 12 Kohlenstoffatomen, üblicherweise
von nicht mehr als 30 Kohlenstoffatomen. Die aliphatische Gruppe
kann an Ringe von 5 bis 6 Elementen gebunden sein, die alizyklisch, heterozyklisch
oder aromatisch sein können.
-
Photosensibilisator:
Ein Sensibilisator für
die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff, üblicherweise durch Anregung
mit Licht. Der Photosensibilisator kann photoaktivierbar (z.B. Farbstoffe
und aromatische Verbindungen) oder chemisch aktivierbar (z.B. Enzyme
und Metallsalze) sein. Bei Anregung durch Licht ist der Photosensibilisator üblicherweise
eine Verbindung, die aus kovalent gebundenen Atomen besteht, üblicherweise
mit mehreren konjugierten Doppel- oder Dreifachbindungen. Die Verbindung
sollte Licht im Wellenlängenbereich von
200-1100 nm, üblicherweise
300-1000 nm, vorzugsweise 450-950 nm, absorbieren, wobei der Extinktionskoeffizient
an ihrem Absorptionsmaximum bei der Anregungswellenlänge mehr
als 500 M–1cm–1,
vorzugsweise zumindest 5000 M–1cm–1,
noch bevorzugter zumindest 50.000 M–1cm–1,
beträgt.
Die Lebensdauer eines nach Lichtabsorption in Abwesenheit von Sauerstoff
erzeugten angeregten Zustands beträgt üblicherweise zumindest 100
ns, vorzugsweise zumindest 1 ms. Im Allgemeinen muss die Lebensdauer
ausreichend lang sein, um Energietransfer an den Sauerstoff zu ermöglichen,
der in Abhängigkeit
vom Medium normalerweise in Konzentrationen im Bereich von 10–5 bis
10–3 M
vorhanden ist. Der angeregte Zustand des Sensibilisators besitzt üblicherweise
eine andere Spinquantenzahl (S) als sein Grundzustand und ist üblicherweise
ein Triplett (S=1), wenn was üblicherweise
der Fall ist – der
Grundzustand ein Singulett ist (S=0). Vorzugsweise besitzt der Sensibilisator
eine hohe Zwischensystemübergangs-Ausbeute.
Das heißt,
die Photoanregung eines Sensibilisators erzeugt den langen Lebenszustand
(üblicherweise
Triplett) mit einer Wirksamkeit von zumindest 10 %, günstigerweise
zumindest 40 %, vorzugsweise mehr als 80 %. Der Photosensibilisator
ist üblicherweise
höchstens
schwach fluoreszierend unter den Testbedingungen (Quantenausbeute üblicherweise
weniger als 0,5, vorzugsweise weniger als 0,1).
-
Photosensibilisatoren,
die durch Licht anregbar sind, sind relativ photostabil und reagieren
nicht wirkungsvoll mit Singulett-Sauerstoff. In den meisten geeigneten
Sensibilisatoren sind mehrere Strukturmerkmale vorhanden. Die meisten
Sensibilisatoren besitzen zumindest eine und häufig drei oder mehr konjugierte
Doppel- oder Dreifachbindungen, die in einer starren und oft aromatischen
Struktur gehalten werden. Sie enthalten häufig zumindest eine Gruppe,
die den Zwischensystemübergang
beschleunigt, z.B. eine Carbonyl- oder Imingruppe oder ein schweres
Atom, das aus den Reihen 3-6 des Periodensystems ausgewählt ist,
insbesondere Iod oder Brom, oder sie können erweiterte aromatische
Strukturen aufweisen. Typische Sensibilisatoren sind Aceton, Benzophenon,
9-Thioxanthon, Eosin, 9,10-Dibromanthracen, Methylenblau, Metalloporphyrine,
wie z.B. Hämatoporphyrin,
Phthalocyanine, Chlorophylle, Diodeosin, Buckminsterfulleren usw.,
sowie Derivate dieser Verbindungen mit Substituenten mit 1 bis 50
Atomen, damit die Verbindungen lipophiler oder hydrophiler werden,
und/oder als Bindungsgruppen zur Bindung z.B. an ein sbp-Element.
Bei spiele für
andere hierin geeignete Photosensibilisatoren sind jene mit obigen
Eigenschaften, die bei N.J. Turro, "Molecular Photochemistry", S. 132, W.A. Benjamin
Inc., NY, USA, 1965, aufgelistet sind.
-
Die
Photosensibilisatoren sind vorzugsweise relativ apolar, um Auflösung in
einem lipophilen Element sicherzustellen, wenn der Photosensibilisator
in ein Öltröpfchen,
Liposom, Latexteilchen usw. inkorporiert wird.
-
Die
hierin geeigneten Photosensibilisatoren können auch andere Substanzen
und Zusammensetzungen enthalten, die Singulett-Sauerstoff mit oder – weniger
bevorzugt – ohne
Aktivierung durch eine externe Lichtquelle erzeugen können. Es
wurde z.B. aufgezeigt, dass Molybdat-(MoO4 =) Salze und Chlorperoxidase sowie Myeloperoxidase
plus Bromid- oder Chloridion (Kanofsky, J. Biol. Chem. 259, 5596
(1983)) die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Singulett-Sauerstoff
und Wasser katalysiert. Beide dieser Zusammensetzungen können beispielsweise
in Teilchen enthalten sein, an die ein sbp-Element gebunden ist,
und im Test-Verfahren verwendet werden, worin Wasserstoffperoxid
als zusätzliches
Reagens enthalten ist, Chlorperoxidase an eine Oberfläche gebunden
ist und Molybdat in der wässrigen
Phase eines Liposoms inkorporiert ist. Im Schutzumfang der Erfindung
sind als Photosensibilisatoren auch Verbindungen enthalten, die
keine echten Sensibilisatoren sind, die aber bei Anregung durch
Wärme,
Licht oder chemische Aktivierung ein Molekül von Singulett-Sauerstoff
freisetzen. Die bekanntesten Vertreter dieser Kategorie von Verbindungen
sind Endoperoxide wie etwa 1,4-Biscarboxyethyl-1,4-naphthalinendoperoxid,
9,10-Diphenylanthracen-9,10-endoperoxid und 5,6,11,12-Tetraphenylnaphthalin-5,12-endoperoxid.
Erwärmung
oder direkte Absorption von Licht durch diese Verbindungen setzt
Singulett-Sauerstoff frei.
-
Träger oder
Oberfläche:
Oberfläche
aus einem porösen
oder nichtporösen,
wasserunlöslichen
Material. Die Oberfläche
kann eine beliebige Form aufweisen, z.B. als Streifen, Stab, Teilchen,
Perle und dergleichen ausgestaltet sein. Die Oberfläche kann
hydrophil sein oder hydrophiliert werden; Beispiele sind anorganische
Pulver, wie z.B. Kieselsäure,
Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermate rialien,
insbesondere Cellulosematerialien und von Cellulose abgeleitete
Materialien, z.B. faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, chromatographisches
Papier usw; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, z.B.
Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid,
vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen,
Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon,
Poly(vinylbutyrat) usw; entweder alleine oder in Kombination mit
anderen Materialien verwendbar; als Bioglas, Keramik, Metalle und
dergleichen erhältlich;
natürliche
oder synthetische Strukturen, wie z.B. Liposomen, Phospholipidvesikel
und Zellen, sind auch geeignet.
-
Die
Bindung von sbp-Elementen an die Oberfläche oder den Träger kann
durch allgemein bekannte und in der Literatur beschriebene Techniken
erfolgen. Siehe z.B. "Immobilized
Enzymes", Ichiro
Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol.
Chem. 245, 3059 (1970).
-
Die
Oberfläche
ist üblicherweise
polyfunktionell oder kann polyfunktionalisiert werden oder in die
Lage gebracht werden, ein Oligonucleotid, ein sbp-Element, einen
Photosensibilisator und/oder eine Chemolumineszenzverbindung durch
spezifische oder nichtspezifische, kovalente oder nichtkovalente
Wechselwirkungen zu binden. Es steht eine Vielzahl von funktionellen
Gruppen zur Auswahl oder kann inkorporiert werden. Funktionelle
Gruppen sind Carbonsäuren,
Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen,
Mercaptogruppen und dergleichen. Die Art der Bindung einer Vielzahl
von Verbindungen an Oberflächen
ist allgemein bekannt und in der Literatur hinlänglich beschrieben. Siehe z.B.
Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Die Länge einer
Linkergruppe am Oligonucleotid oder sbp-Element kann stark variieren und hängt von
der Beschaffenheit der verknüpften
Verbindung, vom Einfluss des Abstands zwischen der verknüpften Verbindung
und der Oberfläche
sowie von den spezifischen Bindungseigenschaften und dergleichen
ab.
-
Teilchen:
Teilchen von zumindest etwa 20 nm und höchstens etwa 20 μm, üblicherweise
zumindest etwa 40 nm und weniger als etwa 10 μm, vorzugsweise von etwa 0,10
bis 2,0 μm,
im Durchmesser mit einem Volumen von normalerweise weniger als 1
pl. Das Teilchen kann organisch oder anorganisch, quellbar oder nichtquellbar,
porös oder
nichtporös
sein, es kann jede beliebige Dichte aufweisen, vorzugsweise jedoch
eine ähnliche
Dichte wie Wasser, im Allgemeinen von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml,
es ist vorzugsweise suspendierbar in Wasser und besteht aus Material,
das transparent, teilweise transparent oder undurchsichtig ist.
Die Teilchen können
eine Ladung aufweisen, und wenn sie geladen sind, sind sie vorzugsweise
negativ. Die Teilchen können
Feststoffe (z.B. Polymer, Metall, Glas, organische und anorganische
Substanzen, wie z.B. Minerale, Salze und Diatome), Öltröpfchen (z.B.
Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenstoff, flüssiges Silikon) oder Vesikel
sein (z.B. synthetisch wie etwa Phospholipid oder natürlich wie
etwa Zellen und Organellen). Die Teilchen können Latexteilen oder andere
Teilchen sein, umfassend organische oder anorganische Polymere;
Lipiddoppelschichten, z.B. Liposomen, Phospholipidvesikel; Öltröpfchen;
Silikonteilchen; Metallsole; Zellen; und Farbstoffkristallite.
-
Die
organischen Teilen sind normalerweise Polymere, entweder Additions-
oder Kondensationspoylmere, die leicht im Testmedium dispergierbar
sind. Die organischen Teilchen sind auch adsorptiv oder funktionalisierbar,
sodass sie an ihre Oberfläche
entweder direkt oder indirekt ein sbp-Element binden und an ihre Oberfläche einen
Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung binden
bzw. sie in ihr Volumen inkorporieren.
-
Die
Teilchen können
von natürlich
vorkommenden Materialien, natürlich
vorkommenden Materialien, die synthetisch modifiziert sind, und
synthetischen Materialien herrühren.
Natürliche
oder synthetische Strukturen, wie z.B. Lipiddoppelschichten, z.B.
Liposomen und Nicht-Phospholipidvesikel, sind vorzuziehen. Unter den
organischen Polymeren von besonderem Interesse sind Polysaccharide,
insbesondere vernetzte Polysaccharide, z.B. Agarose, die als Sepharose
erhältlich
ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose, Stärke und
dergleichen; Additionspolymere, wie z.B. Polystyrol, Polyacrylamid,
Homopolymere und Copolymere von Derivaten von Acrylat und Methacrylat,
insbesondere Ester und Amide mit freien Hydroxylfunktionalitäten wie
etwa Hydrogele und dergleichen. Anorganische Polymere sind Silikone,
Glase (erhältlich als
Bioglas) und dergleichen. Zu Solen zählen Gold, Selen und andere
Metalle. Teilchen können
auch wasserunlösliche
Farbstoffe, wie z.b. Porphyrine, Phthalocyanine usw. Sein, die auch
als Photosensibilisatoren dienen können. Teilchen können auch
Diatome, Zellen, virale Teilchen, Magnetosome, Zellkerne und dergleichen sein.
-
Wenn
die Teilchen im Handel erhältlich
sind, kann die Teilchengröße variiert
werden, indem größere Teilchen
durch mechanische Mittel, wie z.B. Mahlen, Ultraschallbehandlung,
Schütteln
usw. zu kleineren Teilchen zerkleinert werden.
-
Die
Teilchen sind üblicherweise
polyfunktionell oder können
polyfunktionalisiert werden oder in die Lage gebracht werden, sich
durch spezifische oder nichtspezifische, kovalente oder nichtkovalente
Wechselwirkungen an ein sbp-Element, einen Photosensibilisator oder
eine Chemolumineszenzverbindung zu binden. Es steht eine Vielzahl
von funktionellen Gruppen zur Verfügung, die auch inkorporiert
werden können.
Beispiele für
funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen,
Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und
dergleichen. Bei kovalenter Bindung des sbp-Elements, der Chemolumineszenzverbindung
oder des Photosensibilisators an das Teilchen ist die Art der Verbindung
allgemein bekannt und in der Literatur hinlänglich beschrieben. Siehe z.B.
Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Die Länge der
Linkergruppe kann stark variieren und hängt von der Beschaffenheit
der verknüpften
Verbindung, der Beschaffenheit des Teilchens, dem Einfluss des Abstands
zwischen der verknüpften
Verbindung und dem Teilchen auf die Bindung von sbp-Elementen und
den Analyten und dergleichen ab.
-
Der
Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung kann
so gewählt
werden, dass er/sie sich in der Oberfläche der Teilchen löst oder
sich nichtkovalent an sie bindet. In diesem Fall sind diese Verbindungen
vorzugsweise hydrophob, um ihre Fähigkeit zu verringern, sich
vom Teilchen zu dissoziieren und dadurch zu bewirken, dass beide
Verbindungen mit dem gleichen Teilchen assoziieren. Diese Möglichkeit kann
weiter eingeschränkt
werden, indem Teilchen von nur einer Zusammensetzung verwendet werden,
die entweder mit dem Photosensibilisator oder der Chemolumineszenzverbindung
assoziiert sind, oder indem zwei Arten von Teilchen ver wendet werden,
die sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung unterscheiden, sodass
die Assoziation des Photosensibilisators mit einer Art von Teilchen
und die Assoziation der Chemolumineszenzverbindung mit der anderen
Art von Teilchen begünstigt
wird.
-
Die
Anzahl an Photosensibilisator- oder Chemolumineszenzverbindungs-Molekülen, die
mit jedem Teilchen assoziiert sind, beträgt durchschnittlich zumindest
1 und kann ausreichend hoch sein, sodass das Teilchen zur Gänze aus
Photosensibilisator- oder Chemolumineszenzverbindungs-Molekülen besteht.
Die bevorzugte Zahl an Molekülen
wird empirisch ermittelt, um das stärkste Signal gegenüber dem
Hintergrund im Test zu erzielen. In einigen Fällen wird dies am besten durch
Assoziation einer Vielfalt unterschiedlicher Photosensibilisator-Moleküle an Teilchen
erreicht. Üblicherweise
sollte das Verhältnis
zwischen Photosensibilisator oder Chemolumineszenzverbindung und
dem sbp-Element in den Teilchen zumindest 1, vorzugsweise zumindest 100:1,
noch bevorzugter über
1.000:1, betragen.
-
Öltröpfchen:
Flüssigkeitsteilchen,
bestehend aus einer lipophilen Verbindung, die mit einem Emulgator überzogen
und stabilisiert ist, der ein amphiphiles Molekül ist, z.B. Phospholipide,
Sphingomyelin, Albumin und dergleichen.
-
Die
Phospholipide basieren auf aliphatischen Carbonsäureestern aliphatischer Polyole,
worin zumindest eine Hydroxylgruppe mit einem Carbonsäureester
von etwa 8 bis 365, noch häufiger
etwa 10 bis 20, Kohlenstoffatomen substituiert ist, die 0 bis 3,
noch häufiger
0 bis 1, Stellen ethylenischer Unsättigungen und zumindest 1,
normalerweise nur 1, Hydroxylgruppe, die mit Phosphat substituiert
ist, um einen Phosphatester zu bilden, aufweisen können. Die
Phosphatgruppe kann außerdem
mit kleinen aliphatischen Verbindungen substituiert sein, die Di-
oder höhere
Funktionalität
besitzen, im Allgemeinen mit Hydroxyl- oder Aminogruppen.
-
Die Öltröpfchen können in
Einklang mit herkömmlichen
Verfahren hergestellt werden, indem die geeigneten lipophilen Verbindungen
mit einem anionischen, kationischen oder nichtionogenen Tensid kombiniert werden,
worin das Tensid in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.-%, noch häufiger 0,1
bis 2 Gew.-%, des Gemisches vorhanden ist, und das Gemisch in einem
wässrigen
Medium durchmischt wird, z.B. durch Ultraschallbehandlung oder Rühren. Beispiele
für lipophile
Verbindungen sind Kohlenwasserstofföle, Halogenkohlenstoffe wie
etwa Fluorkohlenstoffe, Alkylphthalate, Trialkylphosphate, Triglyceride.
-
Ein
sbp-Element ist üblicherweise
an die Oberfläche
des Öltröpfchens
adsorbiert oder direkt oder indirekt an eine Oberflächenkomponente
des Öltröpfchens
gebunden. Das sbp-Element kann in die flüssigen Teilchen entweder während oder
nach der Herstellung derselben inkorporiert werden. Das sbp-Element
ist normalerweise in einer Menge von etwa 0,5 bis 100, häufiger 1
bis 90, noch häufiger
etwa 5 bis 80, vorzugsweise etwa 50 bis 100, Mol-% der auf der Teilchenoberfläche vorhandenen
Moleküle
vorhanden.
-
Es
folgt eine lediglich veranschaulichende und keinesfalls einschränkende Liste
amphiphiler Verbindungen, die zur Stabilisierung der Öltröpfchen verwendet
werden können:
Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylchlolin, Phosphatidylserin,
Dimyristoylphosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylcholin, Diapalmitoylphosphatidylcholin,
Phosphatidinsäure,
Cardiolipin, Lecithin, Galactocerebrosid, Sphingomyelin, Dicetylphosphat, Phosphatidylinosit,
2-Trihexadecylammoniumethylamin, 1,3-Bis(octadecylphosphat)propanol,
Stearoyloxyethylenphosphat, Phospholipide, Dialkylphosphate, Natriumdodecylsulfat,
kationische Detergenzien, anionische Detergenzien, Proteine, wie
z.B. Albumin, nicht-ionogene Detergenzien usw.
-
Es
können
auch andere Verbindungen verwendet werden, die lipophile Gruppen
aufweisen und bereits beschrieben wurden. Zumeist sind diese Verbindungen
Alkylbenzole mit Alkylgruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, üblicherweise
Gemische von Alkylgruppen, die unverzweigt oder verzweigt sein können, umfassend
eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Polyoxyalkylengruppe
(Alkylen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen), Carbonsäuregruppe, Sulfonsäuregruppe
oder Aminogruppe. Es können
aliphatische Fettsäuren verwendet
werden, die normalerweise etwa 10 bis 36, noch häufiger etwa 12 bis 20, Kohlenstoffatome
besitzen. Fettalkohole mit den selben Kohlenstoffgrenzen wie für die Fettsäuren, Fettamine
mit ähnlichen
Kohlenstoffgrenzen und verschiedene Steroide kommen ebenfalls in
Frage.
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Die Öltröpfchen können ein
Fluorkohlenstofföl
oder ein Silikonöl
(Silikonteilchen) umfassen. Solche Tröpfchen werden von Giaever in
den US-Patenten 4.634.681 und 4.619.904 beschrieben, deren Offenbarung hierin
zur Gänze
aufgenommen ist. Diese Tröpfchen
werden durch Dispergieren eines Fluorkohlenstofföls oder Silikonöls in einer
wässrigen
Phase gebildet. Die Tröpfchen
werden hergestellt, indem eine geringe Menge des ausgewählten Öls (im Allgemeinen
sind solche Öle
im Handel erhältlich)
in einen Behälter
mit einer größeren Menge
der wässrigen
Phase eingebracht wird. Das flüssige
System wird durchmischt, um Emulgierung zu bewirken, und dann zentrifugiert.
Die homogene Phase wird entfernt, und die restlichen Tröpfchen werden
in einem wässrigen
gepufferten Medium resuspendiert. Die obigen Zentrifugations- und
Dekantierungsschritte können
ein- oder mehrmals wiederholt werden, bevor die Tröpfchen verwendet
werden.
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spb-Elemente
können
in unterschiedlicher Weise an Tröpfchen
gebunden werden. Wie von Giaever beschrieben kann das jeweilige
sbp-Element, insbesondere ein proteinhältiges sbp-Element, auf die
Tröpfchen aufgebracht
werden, indem ein Überschuss
des sbp-Elements vor oder nach dem Emulgationsschritt in das wässrige Medium
eingebracht wird. Waschschritte tragen dazu bei, überschüssiges sbp-Element
zu entfernen. Die Funktionalisierung des Öls führt die oben beschriebenen
Funktionalitäten
ein, um Bindung an sbp-Elemente zu bewirken. Solche Funktionalitäten können auch
dazu dienen, die Tröpfchen
an einen Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung
zu binden. Andernfalls wird der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung
häufig
so gewählt,
dass er/sie der Ölphase
des Öltröpfchens
löslich
ist und nicht kovalent gebunden wird. Wenn das Öl ein Fluorkohlenstoff ist,
sind ein fluorierter Photosensibilisator oder eine fluorierte Chemolumineszenzverbindung
oft besser löslich
als das entsprechende nichtfluorierte Derivat.
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Andere
von Giaever beschriebene Öltröpfchen finden
in der Erfindung ebenfalls Anwendung.
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Liposomen:
Mikrovesikel mit etwa kugelförmiger
Gestalt, die eines der bevorzugten Materialien zur Verwendung in
der Erfindung sind. Die Liposomen besitzen einen Durchmesser, der
zumindest etwa 20 nm und höchstens
etwa 20 μm
beträgt, üblicherweise
zumindest etwa 40 nm und weniger als ewta 10 μm. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser
der Liposomen weniger als etwa 2 μm,
um das Absetzen oder die Flotation zu begrenzen.
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Die äußere Hülle eines
Liposoms besteht aus einer amphiphilen Doppelschicht, die ein Wasservolumen
oder eine wässrige
Lösung
einschließt.
Liposomen mit mehr als einer Doppelschicht werden als multilamellare
Vesikel bezeichnet. Liposomen mit nur einer Doppelschicht werden
als unilamellare Vesikel bezeichnet. Multilamellare Vesikel sind
hierin vorzuziehen, wenn ein lipophiler Photosensibilisator oder
eine Chemolumineszenzverbindung verwendet wird, da sie die Fähigkeit
aufweisen, größere Mengen
dieser Materialien zu inkorporieren als unilamellare Vesikel. Die
amphiphile Doppelschicht besteht häufig aus Phospholipiden. Phospholipide,
die bei der Herstellung hierin geeigneter Teilchen Anwendung finden,
können
jedes beliebige Phospholipid oder Phospholipidgemisch sein, das
sich in natürlichen
Membranen befindet, z.B. Lecithin oder synthetische Glycerylphosphatdiester
gesättiger
oder ungesättigter
linearer Fettsäuren
mit 12 oder 24 Kohlenstoffen, worin das Phosphat als Monoester oder
als ein Ester eines polaren Alkohols vorhanden ist (z.B. Ethanolamin,
Cholin, Inosit, Serin, Glycerin und dergleichen). Besonders bevorzugte
Phospholipide sind L-α-Palmitoyloleoylphosphatidylcholin
(POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin (POPG), L-α-Dioleoylphosphatidylglycerin,
L-α-(Dioleoyl)phosphatidylethanolamin
(DOPE) und L-α-(Dioleoyl)phosphatidyl-β-(4-N-maleiidomethyl)cyclohexan-1-carboxyamido)ethanol
(DOPE-MCC).
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Die
Phospholipide in der Doppelschicht können mit Cholesterin ergänzt und
mit anderen amphiphilen Verbindungen ersetzt sein, die eine polare
Kopfgruppe (üblicher weise
geladen) und einen hydrophoben Abschnitt umfassen, der üblicherweise
aus zwei linearen Kohlenwasserstoffketten bestehen. Beispiele für solche Substituenten
sind Dialkylphosphat, Dialkoxypropylphosphate, worin die Alkylgruppen
lineare Ketten von 12 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen, N-(2,3-Di(9-(Z)-octadecenyloxy))prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid
(DOTMA), wie dies in der US-A-4.897.355
vom 30. Januar 1990 geoffenbart ist, die hierin durch Verweis aufgenommen
ist, Sphingomyelin, Cardiolipin und dergleichen.
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Hierin
verwendete Liposomen besitzen vorzugsweise eine hohe negative Ladungsdichte,
um die Suspension zu stabilisieren und spontane Aggregation zu verhindern.
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Bei
der Verwendung in der Erfindung sollten die Liposomen in der Lage
sein, sich an ein sbp-Element zu binden und einen Photosensibilisator
oder eine Chemolumineszenzverbindung aufzuweisen, die entweder mit
der wässrigen
oder der nichtwässrigen
Phase assoziiert sind. Die in der Erfindung verwendeten Liposomen besitzen üblicherweise
an die Außenfläche des
Lipidvesikels gebundene sbp-Elemente.
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Liposomen
können
durch eine Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, z.B. durch Hydratation
und mechanische Dispersion von getrocknetem Phospholipid oder Phospholipid-Substitut
in einer wässrigen
Lösung. Auf
diese Weise hergestellte Liposomen weisen eine Vielzahl von Dimensionen,
Zusammensetzungen und Verhaltensweisen auf. Ein Verfahren zur Reduktion
der Heterogenität
und Inkonsistenz des Verhaltens mechanisch dispergierter Liposomen
ist Ultraschallbehandlung. Ein solches Verfahren verringert die
mittlere Liposomengröße. Alternativ
dazu eignet sich Extrusion als letzter Schritt während der Produktion der Liposomen. US-A-4.529.561
offenbart ein Verfahren zum Extrudieren von Liposomen unter Druck
durch eine Membran mit gleichmäßiger Porengröße, um die
Größeneinheitlichkeit
zu verbessern.
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Die
Herstellung von Liposomen mit einem hydrophoben oder amphiphilen
Photosensibilisator oder einer Chemolumineszenzverbindung, gelöst in der
Lipiddoppelschicht, kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, z.B.
gemäß dem von
Olsen et al., Bioche mica et Biophysica Acta 557(9), 1979, beschriebenen
Verfahren. Zusammenfassend gesagt wird ein Gemisch von Lipiden,
umfassend die geeignete Verbindung in einem organischen Lösungsmittel,
wie z.B. Chloroform, zu einem dünnen
Film an den Wänden
eines Glasgefäßes getrocknet.
Der Lipidfilm wird durch Durchmischen oder Rühren in einem geeigneten Puffer
hydriert. Anschließend wird
die Lipidsuspension durch eine Reihe von Polycarbonat-Filtermembranen
mit immer kleinere Porengrößen extrudiert,
wie z.B. 2,0, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 und 0,2 μm. Wiederholte Filtration durch
einen beliebigen dieser Filter, insbesondere durch den kleinsten
Filter, ist günstig.
Die Liposomen können
beispielsweise durch Gelfiltration gereinigt werden, z.B. durch
eine Säule
aus Sephacryl S-1000. Die Säule
kann mit Puffer eluiert werden, und die Liposomen können gesammelt
werden. Kalte Lagerung verlängert
die Lagerbeständigkeit
der durch dieses Verfahren erzeugten Liposomen. Alternativ dazu
kann der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung
der Lipidsuspension nach der Produktion der Liposomen zugesetzt
werden.
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Die
Markierung von Tröpfchen
und Liposomen umfasst oft den Einschluss von Thiol- oder Maleimid- oder
Biotingruppen auf den Molekülen,
die die Lipiddoppelschicht enthalten. Photosensibilisatoren, Chemolumineszenzmolekküle oder
sbp-Elemente können
dann durch Reaktion der Teilchen mit einem dieser Materialien, das
an ein Sulfhydryl-Reagens, eine Sulfhydrylgruppe bzw. Avidin gebunden
ist, an die Oberfläche
gebunden werden. Sulfhydryl-reaktive Gruppen sind z.B. Alkylierungsreagenzien,
wie z.B. Bromacetamid und Maleimid.
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sbp-Elemente
können
durch schwache hydrophobe Wechselwirkungen an die Oberfläche der
Liposomteilchen gebunden werden, doch solche Wechselwirkungen sind
im Allgemeinen nicht ausreichend, um der Scherkraft während der
Inkubation und des Waschens standzuhalten. Es ist vorzuziehen, sbp-Elemente kovalent
an ein Liposomteilchen zu binden, das z.B. mittels DOPE-MCC funktionalisiert
wurde (siehe oben), indem das Liposom mit dem mit einer Mercaptangruppe
funktionalisierten ausgewählten
sbp-Element kombiniert wird. Wenn beispielsweise das sbp-Element
ein Antikörper
ist, kann es mit S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMSA) umgesetzt
und hydrolysiert werden, um einen Sulfhydryl-modifizierten Antikörper bereitzustellen.
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Latexteilchen:
Latex bezieht sich auf ein teilchenförmiges, in Wasser suspendierbares,
wasserunlösliches
Polymermaterial, üblicherweise
mit Teilchendimensionen von 20 nm bis 20 mm, noch bevorzugter 100 bis
1000 nm, im Durchmesser. Der Latex ist häufig ein substituiertes Polyethylen,
wie z.B. Poly(styrol-butadien), Polyacrylamid-Polystyrol, Polystyrol mit Aminogruppen,
Polyacrylsäure,
Polymethacrylsäure,
Acrylnitril-Butadien, Syrol-Copolymere, Polyvinylacetat-Acrylat,
Polyvinylpyrridin, Vinylchlorid-Acrylat-Copolymere und dergleichen.
Nichtvernetzte Polymere von Styrol und carboxyliertem Styrol oder
mit anderen aktiven Gruppen, wie z.B. Amino, Hydroxyl, Halogen und
dergleichen, funktionalisiertem Styrol sind vorzuziehen. Häufig werden
Copolymere substituierter Styrole mit Dienen, wie z.B. Butadien,
verwendet.
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Die
Assoziation des Photosensibilisators oder der Chemolumineszenzverbindung
mit hierin verwendeten Latexteilchen kann Inkorporation während der
Bildung der Teilchen durch Polymerisation umfassen, umfasst aber üblicherweise
Inkorporation in vorgeformte Teilchen, üblicherweise durch nichtkovalente
Lösung
in den Teilchen. Üblicherweise
wird eine Lösung
der Chemolumineszenzverbindung oder des Sensibilisators verwendet.
Geeignete Lösungsmittel
sind Alkohole, z.B. Ethanol, Ethylenglykol und Benzylalkohol; Amide,
wie z.B. Dimethylformamid, Formamid, Acetamid. und Tetramethylharnstoff
und dergleichen; Sulfoxide, wie z.B. Dimethylsulfoxid und Sulfolan;
und Ether, wie z.B. Carbitol, Ethylcarbitol, Dimethoxyethan und
dergleichen; sowie Wasser. Die Verwendung von Lösungsmitteln mit hohen Siedepunkten,
in denen die Teilchen unlöslich sind,
erlaubt hohe Temperaturen, um das Auflösen der Verbindungen in den
Teilchen zu erleichtern; diese Anwendung ist besonders wünschenswert.
Die Lösungsmittel
können
einzeln oder in Kombination verwendet werden. Besonders bevorzugte
Lösungsmittel
zum Inkorporieren von Photosensibilisator sind jene, die den angeregten
Triplett-Zustand des Photosensibilisators nicht quenchen – entweder
aufgrund ihrer inhärenten
Eigenschaften, oder weil sie anschließend aus den Teilchen entfernt
werden können
(aufgrund ihrer Fähigkeit, in
einem Lösungsmittel,
wie z.B. Wasser, das in den Teilchen unlöslich ist, gelöst zu werden).
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Aromatische
Lösungsmittel
sind vorzuziehen, im Allgemeinen Lösungsmittel, die im Teilchen
löslich sind.
Für das
Inkorporieren von Chemolumineszenzverbindungen in Teilchen sollte
ein Lösungsmittel
gewählt werden,
das aufgrund seiner inhärenten
Eigenschaften oder seiner Fähigkeit,
aus den Teilchen entfernbar zu sein, die Lumineszenz nicht beeinträchtigt.
Häufig
sind aromatische Lösungsmittel
vorzuziehen. Typische aromatische Lösungsmittel sind Dibutylphthalat,
Benzonitril, Naphthonitril, Dioctylterephthalat, Dichlorbenzol,
Diphenylether, Dimethoxybenzol usw.
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Außer, wenn
der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung kovalent
an die Teilchen zu binden ist, ist es üblicherweise vorzuziehen, elektronisch
neutrale Photosensibilisatoren oder Chemolumineszenzverbindungen
zu verwenden. Es ist vorzuziehen, dass das gewählte flüssige Medium die Polymerperlen
nicht bis zur Klebrigkeit erweicht. Eine bevorzugte Technik umfasst
das Suspendieren der gewählten
Latexteilchen in einem flüssigen
Medium, in dem der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung zumindest
begrenzte Löslichkeit
aufweist. Vorzugsweise werden die Konzentrationen des Photosensibilisators und
der Chemolumineszenzverbindung in flüssigen Medien so gewählt, dass
Teilchen entstehen, die den höchsten
Wirkungsgrad von Singulett-Sauerstoff-Bildung und die höchste Quantenausbeute
der Emission aus der Chemolumineszenzverbindung in Medien aufweisen,
doch es sind weniger konzentrierte Lösungen manchmal vorzuziehen.
Verformung oder Auflösung
der Teilchen im Lösungsmittel
kann durch Zugabe eines. mischbaren Co-Lösungsmittels, in dem die Teilchen
unlöslich
sind, vermieden werden.
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Im
Allgemeinen wird die während
des Verfhrens herrschende Temperatur so gewählt, dass die Fähigkeit
der mit Photosensibilisator markierten Teilchen, Singulett-Sauerstoff zu bilden,
und die Quantenausbeute der Chemolumineszenzverbindungs-Teilchen maximiert
werden, mit der Maßgabe,
dass die Teilchen bei der gewählten
Temperatur nicht schmelzen oder aggregieren sollten. Es herrschen
normalerweise erhöhte
Temperaturen. Die Temperaturen des Verfahrens reichen im Allgemeinen
von 20 °C
bis 200 °C,
noch häufiger
von 50 °C
bis 170 °C.
Es wurde beobachtet, dass einige Verbindungen, die bei Raumtemperatur
fast unlöslich
sind, z.B. in nieder molekularen Alkoholen wie etwa Ethanol und Ethylenglykol
bei erhöhten
Temperaturen und dergleichen löslich
sind. Carboxylierte modifizierte Latexteilchen tolerieren – wie aufgezeigt
wurde – bei
solchen Temperaturen niedermolekulare Alkohole.
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Ein
sbp-element kann physikalisch an die Oberfläche des Latexteilchens adsorbiert
oder kovalent an das Teilchen gebunden werden. In Fällen, wo
das sbp-Element nur schwach an die Oberfläche des Latex-Teilchens gebunden
ist, kann die Bindung in bestimmten Situationen den während der
Inkubation und der Waschungen herrschenden Scherkräften zwischen
den Teilchen möglicherweise
nicht standhalten. Daher kann es vorzuziehen sein, sbp-Elemente
unter Bedingungen, die Adsorption minimieren, kovalent an die Latexteilchen
zu binden. Dies kann durch chemisches Aktivieren der Latexoberfläche erfolgen.
Beispielsweise können N-Hydroxysuccinimidester
von Oberflächen-Carboxylgruppen
gebildet werden, und die aktivierten Teilchen zur Reduktion nichtspezifischer
Bindung von Testkomponenten an die Teilchenoberfläche werden
dann mit einem Linker, der Aminogruppen aufweist, die mit den Estergruppen
reagieren, oder direkt mit einem eine Aminogruppe besitzenden sbp-Element
in Kontakt gebracht. Der Linker wird üblicherweise so gewählt, dass
er nichtspezifische Bindung von Testkomponenten an die Teilchenoberfläche reduziert,
und sorgt vorzugsweise für
geeignete Funktionalität
für die
Bindung des Latexteilchens und des sbp-Elements. Zweckmäßige Materialien
sind maleimidiertes Aminodextran (MAD), Polylysin, Aminosaccharide
und dergleichen. MAD kann gemäß dem Verfahren
von Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75(7), 3143 (1978), gebildet
werden.
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In
einem Verfahren wird MAD unter Einsatz eines wasserlöslichen
Carbodiimids, z.B. von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid,
zunächst
an Carboxyl-enthaltende Latexteilchen gebunden. Die beschichteten
Teilchen werden dann in Reagenzien äquilibriert, um nichtspezifische
Bindung zu verhindern. Solche Reagenzien enthalten Proteine wie
etwa Rinder-Gamma-Globulin (BGG) und Detergens wie etwa Tween 20,
TRITON X-100 und dergleichen. Ein sbp-Element, das eine Sulfhydrylgruppe
aufweist oder in geeigneter Weise modifiziert ist, um eine Sulfhydrylgruppe
einzuführen,
wird dann einer Suspension der Teilchen zugesetzt, woraufhin eine
ko valente Bindung zwischen dem sbp-Element und MAD auf den Teilchen
entsteht. Jedes überschüssige nichtumgesetzte
sbp-Element kann dann durch Waschen entfernt werden.
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Metallsole:
Jene Teilchen, die aus einem Schwermetall bestehen, d.h. ein Metall
mit einer Ordnungszahl von mehr als 20, etwa Metalle der Gruppe
IB, z.B. Gold oder Silber, oder Chalcogene, wie z.B. Selen oder Tellur.
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Metallsolteilchen
werden beispielsweise von Leuvering in der US-A-4.313.734 beschrieben,
deren Offenbarung hierin durch Verweis zur Gänze aufgenommen ist. Zu solchen
Solen zählen
eine kolloidale wässrige Dispersion
eines Metalls, einer Metallverbindung oder von Polymerkernen, die
mit einem Metall oder einer Metallverbindung beschichtet sind.
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Die
Metallsole können
Metalle oder Metallverbindungen sein, z.B. Metalloxide, Metallhydroxide
und Metallsalze, oder aus mit Metallen oder Metallverbindungen beschichteten
Polymerkernen bestehen. Beispiele für derartige Metalle sind Platin,
Gold, Silber, Quecksilber, Blei, Palladium und Kupfer; Beispiele
für solche
Metallverbindungen sind Silberiodid, Silberbromid, wässriges
Kupferoxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid oder -oxid-hydrat, Chromhydroxid
oder -oxid-hydrat, Vanadiumoxid, Arsensulfid, Manganhydroxid, Bleisulfid,
Quecksilbersulfid, Bariumsulfat und Titandioxid. Im Allgemeinen
können
geeignete Metalle oder Metallverbindungen mittels bekannter Techniken
festgestellt werden.
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Es
ist manchmal vorteilhaft, Sole zu verwenden, die aus dispergierten
Teilchen bestehen, die mit den oben erwähnten Metallen oder Metallverbindungen
beschichtete Polymerkerne enthalten. Diese Teilchen besitzen ähnliche
Eigenschaften wie die dispergierte Phase reiner Metalle oder Metallverbindungen,
doch Größe, Dichte
und Metallkontakt können
optimal kombiniert werden.
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Die
Metallsolteilchen können
gemäß unterschiedlicher
an sich bekannter Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise bezieht
sich zur Herstellung eines. Goldsols Leuvering auf einen Artikel
von G. Frens, Nature Physical Science 241, 20 (1973).
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Die
Metallsolteilchen können
modifiziert werden, um verschiedene funktionelle Gruppen (s.o.)
zur Verbindung mit einem sbp-Element, einem Photosensibilisator
oder einer Chemolumineszenzverbindung zu enthalten. Beispielsweise
können
polymere Bindemittel dazu dienen, die Teilchen zu beschichten, z.B.
Polymere, die Thiolgruppen enthalten, die sich fest an viele Schwermetalle
binden, oder Silylierungsmittel, die sich an Polymerbeschichtungen
binden und diese bilden können,
z.B. durch Reaktion von Metallteilchen mit Trialkoxyaminoalkylsilanen;
siehe EPO 84400952.2 von Advanced Magnetics über die Beschichtung magnetischer
Teilchen.
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Farbstoffkristallite:
Mikrokristalle reiner oder vermischter, fester, wasserunlöslicher
Farbstoffe, vorzugsweise von Farbstoffen, die als die oben beschriebenen
Photosensibilisatoren dienen können.
Die hierin geeigneten Farbstoffkristallite weisen eine Größe im Bereich
von 20 nm bis 20 μm
auf.
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Ein
Verfahren zur Herstellung von Farbsfoffkristalliten ist im US-Patent
4.373.932 (Gribnau et al.) beschrieben, dessen Offenbarung hierin
zur Gänze
durch Verweisaufgenommen ist. Gribnau beschreibt kolloidale Farbstoffteilchen
und wässrige
Dispersionen eines hydrophoben Farbstoffs oder Pigments, der/das
eine immunchemisch reaktive sowie direkt oder indirekt gebundene
Komponente aufweisen kann. Die Farbstoffteilchen werden im Allgemeinen
durch Dispergieren eines Farbstoffs in Wasser und anschließendes Zentrifugieren
hergestellt. Ein Farbstoffpellet wird erhalten und in Wasser resuspendiert,
dem Glasperlen zugegeben werden. Diese Suspension wird mehrere Tage
lang bei Raumtemperatur gewalzt. Die Flüssigkeit wird dekantiert und
zentrifugiert, und die Farbstoffteilchen werden nach Absaugen der
Flüssigkeit
erhalten.
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Ein
weiteres Verfahren zur Herstellung von Farbstoffkristalliten umfasst
die langsame Zugabe einer Lösung
des Farbstoffs in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu Wasser. Ein
weiteres Verfahren sieht die Ultraschallbehandlung einer Suspension
des festen Farbstoffs in Wasser vor.
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Die
Bindung von sbp-Elementen an die Farbstoffteilchen kann durch direkte
oder indirekte Adsorption oder kovalente chemische Bindung erzielt
werden. Das letztere Verfahren wird durch die Gegenwart geeigneter
funktioneller Gruppen in jedem beliebigen Beschichtungsmaterial
und im Farbstoff bestimmt. Beispielsweise können funktionelle Gruppen auf
die Oberfläche
des Farbstoffkristallits aufgebracht werden, indem eine Verbindung,
die eine diazotierte aromatische Aminogruppe und die gewünschte funktionelle
Gruppe enthält, an
eine Phenol- oder Anilingruppe des Farbstoffs gekuppelt wird.
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Wenn
der Farbstoff eine Carboxylgruppe besitzt, kann der Farbstoffkristallit
durch ein Carbodiimid aktiviert und an eine primäre Aminokomponente gekoppelt
werden. Aliphatische primäre
Aminogruppen und Hydroxylgruppen können z.B. durch Bromcyan oder
Halogen-substituierte Di- oder Triazine aktiviert werden, woraufhin
die Bindung mit einer primären
Aminokomponente oder mit z.B. einer eine -SH- oder -OH-Gruppe enthaltenden
Komponente stattfinden kann. Es können auch bifunktionelle reaktive
Verbindungen verwendet werden. Beispielsweise kann Glutaralhdeyhd
für die
gegenseitige Kopplung primärer
Aminokomponenten des Farbstoffs und eines sbp-Elements verwendet
werden, und es kann z.B. ein heterobifunktionelles Reagens wie etwa
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat zur Kopplung einer primären Aminokomponente
an eine eine Thiolgruppe enthaltende Komponente verwendet werden.
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Chemolumineszenzverbindung:
Eine Substanz, die eine chemische Reaktion mit Singulett-Sauerstoff erfährt, um
ein metastabiles Zwischenprodukt zu bilden, das sich mit der gleichzeitigen
oder anschließenden Emission
von Licht innerhalb des Wellenlängenbereichs
von 250 bis 1200 nm zersetzen kann. Die Emission tritt üblicherweise
ohne Gegenwart eines Energieakzeptors oder Katalysators ein, um
Zersetzung und Lichtemission zu bewirken. Vorzugsweise zersetzt
sich das Zwischenprodukt spontan ohne Erhitzung oder Zugabe zusätzlicher
Reagenzien nach seiner Bildung. Die Zugabe eines Reagens nach der
Bildung des Zwischenprodukts oder das Vorse hen erhöhter Temperaturen
zwecks Beschleunigung der Zersetzung ist allerdings für einige
Chemolumineszenzverbindungen erforderlich. Die Chemolumineszenzverbindungen
sind üblicherweise elektronenreiche
Verbindungen, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, häufig unter
Bildung von Dioxetanen oder Dioxetanonen. Beispiele für solche
Verbindungen sind Enolether, Enamine, 9-Alkylidenxanthane, 9-Alkyliden-N-alkylacridane,
Arylvinylether, Dioxene, Arylimidazole und Lucigenin. Andere Chemolumineszenzverbindungen
liefertn nach Reaktion mit Singulett-Sauerstoff Zwischenprodukte,
die anschließend
unter Lichtemission mit anderen Reagenzien reagieren. Beispiele
für solche
Verbindungen sind Hydrazide wie etwa Luminol und Oxalatester.
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Die
Chemolumineszenzverbindungen von Interesse zeigen im Allgemeinen
Emission bei Wellenlängen
von über
300 nm, üblicherweise über 400
nm. Verbindungen, die alleine oder gemeinsam mit einem Fluoreszenzmolekül Licht
mit Wellenlängen
außerhalb
jenes Bereichs emittieren, in dem Serumkomponenten Licht absorbieren,
sind hierin besonders geeignet. Die Fluoreszenz von Serum fällt über 500
nm rasch ab und wird über
550 nm relativ insignifikant. Wenn daher der Analyt in Serum vorliegt,
sind Chemolumineszenzverbindungen, die Licht über 550 nm, vorzugsweise über 600
nm, emittieren, von besonderem Interesse. Um Autosensibilisierung
der Chemolumineszenzverbindung zu vermeiden, ist es vorzuziehen,
dass die Chemolumineszenzverbindungen kein Licht absorbieren, das
zum Anregen des Photosensibilisators dient. Da es im Allgemeinen
vorzuziehen ist, den Sensibilisator mit längeren Lichtwellenlängen als
500 nm anzuregen, ist es wünschenswert,
dass die Lichtabsorption durch die Chemolumineszenzverbindung ganz
knapp über
500 nm erfolgt.
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Wenn
langwellige Emission der Chemolumineszenzverbindung gewünscht ist,
kann ein Emitter mit langer Wellenlänge wie etwa Pyren (gebunden
an die Chemolumineszenzverbindung) verwendet werden. Alternativ
dazu kann ein Fluoreszenzmolekül
im die Chemolumineszenzverbindung enthaltenden Medium vorgesehen
sein. Bevorzugte Fluoreszenzmoleküle werden durch die aktivierte
Chemolumineszenzverbindung angeregt und senden eine längere Wellenlänge aus
als die Emissionswellenlänge
der Chemolumineszenzverbindung (üblicherweise
mehr als 550 nm). Es ist üblicherweise
auch vorteilhaft, dass die Fluoreszenzmoleküle bei den Wellenlängen des
zur Aktivierung des Photosensibilisators verwendeten Lichts nicht
absorbieren. Beispiele für
geeignete Farbstoffe sind Rhodamin, Ethidium, Dansyl, Eu(fod)3, Eu(TTA)3, Ru(bpy)3 ++ (worin bpy = 2,2'-Dipyridyl) usw.
Im Allgemeinen dienen diese Farbstoffe als Akzeptoren in Energietransferprozessen,
weisen vorzugsweise hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten auf und reagieren
nicht rasch mit Singulett-Sauerstoff. Sie können gleichzeitig mit der Inkorporation
der Chemolumineszenzverbindung in die Teilchen in diese inkorporiert
werden.
-
Die
elektronenreichen Olefine besitzen im Allgemeinen eine Elektronen-spendende
Gruppe in Konjugation mit dem Olefin:
worin A eine Elektronen-spendende
Gruppe ist, z.B. N(D)
2, OD, p-[C
6H
4N(D)
2]
2, Furanyl, N-Alkylimidazol, N-Alkylpyrrolyl,
2-Indolyl usw., worin D z.B. Alkyl oder Aryl sein kann und A entweder
direkt an den Olefinkohlenstoff oder durch die unmittelbare Nähe anderer
konjugierter Doppelbindungen gebunden ist. Die anderen Valenzen der
C-Atome in Olefin 1 sind Substituenten mit 1 bis 50 Atomen, die
gemeinsam einen oder mehrere Ringe bilden können, die fusioniert oder nichtfusioniert
sind, z.B. Cycloalkyl, Phenyl, 7-Norbonyl, Naphthyl, Anthracyl, Acridanyl,
Adamantyl usw.
-
Hierin
geeignete Enolether weisen im Allgemeinen die folgende Struktur
auf:
worin die Reste D
1 unabhängig
voneinander sind und aus der aus H und Substituenten mit 1 bis 50
Atomen bestehenden Gruppe ausgewählt
sind, vorzugsweise Aryl, Hydroxyaryl, Aminoaryl, t-Alkyl, H, Alkoxy,
Heteroaryl usw.; sie können
auch mit einem oder beiden Kohlenstoffatomen kombiniert werden,
um einen Ring, wie z.B. Cycloalken, Adamantyliden, 7-Norbornyliden
und dergleichen, zu bilden; D
2 ist vorzugsweise
Alkyl oder Aryl. Beispiele für
Enolether sind u.a. 2,3-Diaryl-4,5-dihydrodioxene:
worin X = O, S oder ND
2 ist und Ar und Ar' Aryl sind, z.B. substituiertes Aryl,
worin zumindest ein Substituent als Amino-, Ether- oder Hydroxylgruppe
vorhanden ist. 9-(Dialkoxymethyleiden)xanthen:
Alkoxyvinylpyren:
9-Alkoxymethyliden-10-alkylacridan:
-
Hierin
geeignete Vinylsulfide umfassen im Allgemeinen die oben erwähnten Enolether,
worin das Sauerstoffatom durch ein Schwefelatom ersetzt ist.
-
Hierin
geeignete Enamine besitzen im Allgemeinen folgende Struktur:
worin die Reste D
3 unabhängig
voneinander Alkyl oder Aryl sein können und die übrigen Substituenten
auf dem Olefin aus der Gruppe bestehend aus H und Substituenten
mit 1 bis 50 Atomen, vorzugsweise Aryl, Hydroxyaryl, Aminoaryl,
t-Alkyl, H, Alkoxy, Heteroaryl usw., ausgewählt sind.
-
Beispiele
für Enamine,
die zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung dienen, sind Folgende: Dialkylaminovinylpyren:
Dialkylaminovinyl-9,10-diphenylanthracen
worin φ =
Phenyl ist, usw.
-
9-Alkyliden-N-alkylacridane
besitzen im Allgemeinen folgende Struktur:
worin D
4 Alkyl
ist und die übrigen
Substituenten auf dem Olefin aus der Gruppe bestehend aus H und
Substituenten mit 1 bis 50 Atomen ausgewählt ist, vorzugsweise Aryl,
Alkoxyaryl, Aminoaryl, t-Alkyl, H, Alkoxy, Heteroaryl usw; sie können kombiniert
werden, um einen Ring zu bilden wie etwa Adamantyl, Cyclophentyl, 7-Norbornyl
und dergleichen. Beispiele für
Acridane sind u.a. substituiertes 9-Benzyliden-10-methylacridan und
9-Diphenylmethylen-10-methylacridan (beschrieben bei Singer et al.,
J. Am. Chem. Soc. 102, 3823 (1983); und McCapra, Chem. Comm. 944
(1977)), 9-Methyliden-10-methylacridane (beschrieben bei E. White, Chem.
Letters 1491 (1979)).
-
Dioxetane
werden durch die Reaktion von Singulett-Sauerstoff mit der chemiluneralen
Struktur gebildet, worin die Substituenten auf den C-Atomen jene
sind, die auf dem entsprechenden Olefin vorhanden sind:
von denen sich manche spontan
zersetzen; andere werden durch Erhitzen und/oder Katalyse, üblicherweise durch
einen elektronenreichen Energieakzeptor, unter Lichtemission gebildet.
In einigen Fällen
wird das Dioxetan spontan in ein Hydroperoxid umgewandelt, woraufhin
ein basischer pH-Wert erforderlich ist, um das Dioxetan zu reformieren
und Zersetzung und Lichtemission zu ermöglichen.
-
Eine
weitere Familie von Chemolumineszenzverbindungen sind 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione.
Die beliebteste Verbindung ist Luminol, die 5-Aminoverbindung. Andere
Familienmitglieder sind das substituierte 6-Amino-, 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamino[ca]benz-Analog.
Diese Verbindungen werden durch Singulett-Sauerstoff in einer aus
mehreren Schritten bestehenden Reaktion oxidiert, die zur Zersetzung mit
Bildung eines Phthalatderivats und Lichtemission führt.
-
Eine
weitere Familie von Chemolumineszenzverbindungen sind die 2,4,5-Triphenylimidazole,
wobei Lophin der gängige
Name für
die Stammverbindung ist. Chemolumineszenzanaloge umfassen p-Dimethylamino-
und -Methoxysubstituenten.
-
Die
nächste
Gruppe von Chemolumineszenzverbindungen umfasst Bisarylen-Verbindungen,
z.B. Bis-9,9'-acridyliden
und das 10,10'-Dimethylderivat
davon (beschrieben von Singer, J. Org. Chem. 41, 2685 (1976)), Lucigenin
und Bis-9,9'-xanthylidin.
-
Andere
Chemolumineszenzverbindungen, die die obigen Anforderungen erfüllen, finden
sich in der EP-A-0.345.776 vom 13. Dezember 1989.
-
Photochemisch
aktivierbare Chemolumineszenzverbindung (PACC): Eine Substanz, die
mit Singulett-Sauerstoff reagiert, um ein metastabiles Reaktionsprodukt
zu bilden, das zur Zersetzung unter gleichzeitiger oder anschließender Lichtemission, üblicherweise
in einem Wellenlängenbereich
von 250 bis 1200 nm, fähig
ist. Der Ausdruck "photoaktivierbar" umfasst auch "photochemisch aktivierbar". Hierin bevorzugte PACCs sind
jene, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, um Dioxetane oder
Dioxetanone zu bilden. Die Letzteren sind üblicherweise elektronenreiche
Olefine. Beispiele für
derartige elektronenreiche Olefine sind Enolether, Enamine, 9-Alkyliden-N-alkylacridane,
Arylvinylether, Dioxene, Arylimidazole, 9-Alkylidenxanthane und
Lucigenin: Andere Verbindungen, die auch unter die Kategorie "PACC" fallen, sind Luminol
und andere Phthalhydrazide sowie Chemolumineszenzverbindungen, die
aufgrund einer photochemisch labilen Schutzgruppe davor geschützt sind,
eine Chemolumineszenzreaktion zu erfahren, wobei solche Verbindungen
z.B. Glühwürmchen-Luciferin,
Aquaphorin, Luminol usw. sind.
-
Die
PACCs von Interesse emittieren vorzugsweise bei einer Wellenlänge über 300
nm, noch bevorzugter über
500 nm, am bevorzugtesten über
550 nm. Verbindungen, die Licht bei Wellenlängen über jenem Bereich absorbieren
und emittieren, in dem die Probenkomponenten signifikant zur Lichtabsorption
beitragen, sind hierin besonders gut geeignet. Die Extinktion von
Serum fällt über 500
nm rasch ab und wird über
600 nm insignifikant, weshalb Chemolumineszenzverbindungen, die
Licht über
600 nm emittieren, von besonderem Interesse sind. Chemolumineszenzverbindungen
jedoch, die bei kürzeren
Wellenlängen
absorbieren, sind geeignet, wenn keine Interferenzextinktion der
Probe vorliegt oder wenn ein Photosensibilisator verwendet wird, der
Licht mit längerer
Wellenlänge
absorbiert und daraufhin die Chemolumineszenzverbindung aktiviert.
-
Die
PACCs der Erfindung werden als Marker verwendet und sind mit einem
sbp-Element assoziiert.
-
Die
unten angeführten
PACCs 1 enthalten im Allgemeinen keine allylischen CH- oder NH-Gruppen.
-
Die
als PACCs der Erfindung geeigneten elektronenreichen Olefine fallen
in die Kategorie der hierin definierten "Chemolumineszenzverbindung". Die PACCs besitzen üblicherweise
kein Wasserstoffatom tragendes Atom, das direkt an das Olefin gebunden
ist, es sei denn, dieses Atom befindet sich an einer Position, die keine
Doppel bindung bilden kann, z.B. an einer Brückenkopfposition eines kleinen
bizyklischen Ringsystems. Die bevorzugteren Olefine sind jene, die
ein Dioxetan liefern, das sich bei Raumtemperatur rasch zersetzt
(weniger als 60 Minuten, vorzugsweise weniger als 5 Minuten, noch
bevorzugter weniger als 30 Sekunden). Die Dioxetane können alleine
oder in Kombination mit einem Fluoreszenzenergie-Akzeptor lumineszent
sein.
-
Die
als PACCs der Erfindung geeigneten Enolether fallen ebenfalls unter
die hierin definierte Kategorie der "Chemolumineszenzverbindung". Besonders geeignete
Enoletherverbindungen sind jene mit einem Aryl auf dem gleichen
Kohlenstoff wie der Ether, worin der Arylring mit einer Elektronen-spendenden
Gruppe an einer Position substituiert ist, die Fluoreszenz verleiht.
Die Elektronen-spendende Gruppe kann z.B. m-Hydroxyphenyl, m-Dimethylaminophenyl,
1-(5-Aminonaphthyl), Pyryl, 1-(3-Hydroxypyryl), Anthracyl, Chrysyl
usw. sein. Eine oder beide Gruppen an der 2-Position können Aryl
sein, worin das Keton, das durch Ersetzen des 1-Kohlenstoffs mit
Sauerstoff gebildet wird, fluoreszierend ist, z.B. β-Naphthyl
oder 2-Anthryl. Illustrative und nichteinschränkende Beispiele für Enolether
sind:
worin
X
1 = H, OC(O)CH
3,
OCH
3, OH ist, beschrieben von Bronstein
et al., US-Patent 4.956.477;
beschrieben von Bronstein
et al., US-Patent 4.956.477;
worin X
2 =
H, OH, N(CH
3)
2 oder
OCH
3 ist, beschrieben von P. Schaap, J.
Am. Chem. Soc. 104, 3504 (1982); und P. Schaap, Photochem. and Photobiology
30, 35 (1979);
worin X
2 wie
oben definiert ist, X
3 = H, OCH
3 oder
N(CH
3)
2 ist, beschrieben
von P. Schaap, Report to U.S. Army Research Office, 15. Oktober
1986, und S.D. Gagnon, Doktorarbeit, Wayne State University (1982);
worin X
4 =
O, S, CH
3N oder PhN ist, Y = O, S oder CH
3N ist und Ph = Phenyl ist, beschrieben von
P. Schaap, Report to Office of Naval Research, 17. März 1987;
beschrieben von P. Schaap,
Report to U.S. Army Research, 15. Oktober 1986.
-
Die
als PACCs der Erfindung geeigneten Enamine fallen ebenfalls unter
die hierin definierte Kategorie der "Chemolumineszenzverbindung". Beispiele für besonders
geeignete Enamine sind u.a. die obigen Enolether 3-5 mit N(CH
3)
2 anstelle von
OCH
3. Ein weiteres Beispiel ist
-
Die
als PACCs geeigneten 9-Alkyliden-N-alkylacridane fallen ebenfalls
unter die hierin definierte Kategorie der "Chemolumineszenzverbindung". Besonders bevorzugt sind
jene der Formel (7), worin die übrigen Substituenten
auf dem Olefin Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m-Methoxyphenyl, Dimethylamino,
Trityl, Methoxy und N-Morpholino
sind; sie können
gemeinsam einen Ring bilden, z.B. Adamantyl, N-Methyacridanylid, Xanthanylidin, 1-(3;4-Benzo-5-hydrofuryliden)
und dergleichen. Als Marker geeignete, illustrative und nicht-einschränkende Beispiele
für 9-Alkylidin-N-alkylacridane sind:
beschrieben von Singer, J.
Org. Chem. 41, 2685 (1976);
beschrieben von E. White,
Chem. Letters 12, 1491 (1979);
worin R
4 und
R
5 unabhängig
voneinander H oder Phenyl ist, beschrieben von Singer et al., J.
Am. Chem. Soc. 102, 3823 (1983);
beschrieben von McCapra,
Chem. Comm. N24, 944 (1977) und Singer et al., ebda.;
beschrieben von McCapra,
ebda.:
beschrieben von McCapra,
ebda.;
-
Die
relevanten Abschnitte der obigen Publikationen sind hierin durch
Verweis aufgenommen.
-
Als
PACCs geeignete 9-Alkylidenxanthane besitzen im Allgemeinen die
folgende Struktur:
worin die Substituenten auf
dem Olefin aus der Gruppe bestehend aus H und Substituenten mit
1 bis 50 Atomen ausgewählt
sind, vorzugsweise Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m-Methoxyphenyl,
Dimethylamino, Trityl, Methoxy und N-Morpholino; sie können gemeinsam
einen Ring, wie z.B. Adamantyl, N-Methyacridanylid, Xanthanylidin,
1-(3,4-Benzo-5-hydrofuryliden) und dergleichen, bilden, beispielsweise
9-Phenylmethylidenxanthen.
-
Eine
weitere Familie von PACCs sind 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione.
Die beliebteste Verbindung ist Luminol, die 5-Aminoverbindung. Andere
Familienmitglieder sind das 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamino[ca]benz-Analog.
Man beachte, dass Luminol als Marker in Tests verwendet wurde; die
Anregung von Luminolen erfolgte allerdings chemisch, nicht durch
Photoaktivierung wie in der vorliegenden Erfindung. Diese Verbindungen
werden durch Singulett-Sauerstoff zu 1,4-Phthalazindionen oxidiert
und erfahren durch anschließende
Reaktion mit Superoxid oder Wasserstoffperoxid Zersetzung unter
Lichtemission.
-
Eine
weitere Familie von PACCs sind 2,4,5-Triphenylimidazole, wobei Lophin
der gängige
Name für das
Ausgangsprodukt ist. Chemolumineszenzanaloge sind z.B. p-Dimethylamino-
und -methoxysubstituenten.
-
Andere
PACCs, die die obigen Anforderuingen erfüllen, finden sich in der EP-A-0.345.776 vom 13.
Dezember 1989.
-
Geschützte Chemolumineszenzverbindung:
Jene PACCs, die eine durch Lichteinstrahlung entfernbare Schutzgruppe
aufweisen. Wenn die Schutzgruppe durch Photoaktivierung entfernt
wird, emittiert die Verbindung Licht spontan oder nach Aktivie rung
mit Komponenten, die im Testmedium vorhanden sind. Durch Photoaktivierung
entfernbare Schutzgruppen sind u.a. o-Nitrobenzyl, o-Acylphenylethyl,
Alkoxyybenzyl und dergleichen, üblicherweise
an ein Heteroatom der PACC gebunden. Beispiele für PACC, die einen Teil der
geschützten
Chemolumineszenzverbindungen bilden können, sind die oben erwähnten elektronenreichen
Olefine. Konkrete, veranschaulichende Beispiele für geschützte Chemolumineszenzverbindungen
gemäß diesem Aspekt
der Erfindung sind:
-
Im
Fall geschützter
Chemolumineszenzverbindungen sind allfällig notwendige Reagenzien
vor der Photoaktivierung oder Photolyse vorhanden. Solche Reagenzien
können
Enzyme und Substrate für
solche Enzyme sein. In einigen Fällen
ist lediglich die Steuerung des pH-Werts erforderlich. Andere Mittel
sind alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Wasserstoffperoxid
usw. Es ist für
Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, dass die Verwendung zusätzlicher
Reagenzien nach Auswahl geeigneter geschützter Chemolumineszenzverbindungen
in Einklang mit den obigen Prinzipien möglich ist. Beispielsweise kann
im Fall von Verbindung 1 Glühwürmchen-Luciferase
und ihr Luciferinsubstrat verwendet werden. Im Fall von Verbindung
2 ist es nur notwenig, ein basisches Medium aufrechtzuerhalten (pH > 9). Im Fall von 2A
können
Wasserstoffperoxid und Meerrettich-Peroxidase verwendet werden.
-
Zusatzmaterialien:
Gemäß der Erfindung
werden im Test häufig
verschiedene Zusatzmaterialien verwendet. Beispielsweise sind im
Testmedium normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren für das Testmedium und
die Testkomponenten vorhanden. Häufig
können
neben diesen Additiven auch Proteine wie etwa Albumine, organische
Lösungsmittel
wie etwa Formamid, quaternäre
Ammoniumsalze, Polykatione wie etwa Dextransulfat, Tenside, insbesondere
nicht-ionogene Tenside, Bindungsbeschleuniger wie etwa Polyalkylenglykole oder
dergleichen enthalten sein. Wenn der Photosensibilisator chemisch
und nicht durch Bestrahlung aktiviert wird, ist oft Wasserstoffperoxid
als Zusatzreagens enthalten. Wenn gewünscht wird, die Emissionswellenlänge der
Chemolumineszenzverbindung zu einer längeren Wellenlänge zu verlagern
oder die Zersetzung ihrer Sauerstoff-aktivierten Form zu katalysieren,
kann ein Fluoreszenzmolekül
verwendet werden.
-
Ganz
oder teilweise nacheinander: Wenn die Probe und verschiedene Mittel
hierin auf andere Weise als gleichzeitig kombiniert werden, können eine
oder mehrere Mittel mit einem oder mehreren der übrigen Mittel kombiniert werden,
um eine Subkombination zu bilden. Jede Subkombination kann dann
einen oder mehrere Schritte des vorliegenden Verfahrens durchlaufen.
Jede der Subkombinationen kann demnach unter Bedingungen, die eines
oder mehrere der gewünschten
Ergebnisse liefern, inkubiert werden.
-
Energieakzeptor
(hierin auch als Fluoreszenz-Energieakzeptor bezeichnet): Ein Chromophor
mit starker Absorption bei mehr als 310 nm, normalerweise mehr als
350 nm, vorzugsweise mehr als 400 nm. Die Auswahl des Energieakzeptors
hängt auch
von der jeweiligen PACC ab. Der Energieakzeptor sollte das durch
die PACC emittierte Licht absorbieren können. Vorzugsweise liegt das
Absorptionsmaximum des Energieakzeptors bei einer ähnlichen
Wellenlänge
wie das Emissionsmaximum der Chemolumineszenzverbindung. Ein hoher
Extinktionskoeffizient ist wünschenswert, üblicherweise
von mehr als 10, vorzugsweise von mehr als 103, noch
bevorzugter von mehr als 104.
-
Einige
als Energieakzeptoren geeignete Moleküle werden von Ullman et al.
I, II, IV und V, in den Spalten 8 und 9 beschrieben, wobei die relevanten
Abschnitte dieser Veröffentlichung
hierin durch Verweis aufgenommen sind. Im Allgemeinen ist der Energieakzeptor
eine Fluoreszenzverbindung oder ein Fluoreszenzmittel, doch Energieakzeptoren
mit sehr schwacher oder überhaupt
keiner Fluoreszenz sind auch geeignet.
-
Eine
Gruppe von Fluoreszenzmitteln mit einigen der oben beschriebenen
günstigen
Eigenschaften sind die Xanthenfarbstoffe, die von 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol
abgeleiteten Fluoresceine sowie Rosamine und von 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol
abgeleitete Rhodamine enthalten. Die Rhodamine und Fluoresceine
besitzen eine 9-o-Carboxyphenylgruppe und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.
-
Diese
Verbindungen sind im Handel erhältlich
und besitzen Substituenten auf der Phenylgruppe, die als Bindungsstelle
oder als Bindungsfunktionalität
verwendet werden können.
Beispielsweise sind Amino- und Isothiocyanat-substituierte Fluoresceinverbindungen
erhältlich.
-
Eine
weitere Gruppe von Fluoreszenzverbindungen sind Naphthylamine mit
einer Aminogruppe an der α-
oder β-Position, üblicherweise α-Position.
Naphthylamino-Verbindungen
sind 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat
und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat.
-
Farbstoffvorläufer, die
aktiviert werden, um mit Proteinen zu reagieren, sind 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin;
Acridine, wie z.B. 9-Isothiocyanatoacridin; N-(p-(2-Benzoxazolyl)phenyl)maleimid;
Benzoxadiazole wie etwa:
4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol;
Stilbene, wie etwa 4-Dimethylamino-4'-isothiocyanatostilben und 4-Dimethylamino-4'-maleimidostilben.
Andere Farbstoffe, die weiter funktionalisiert werden können, um
eine Kombination mit einem sbp-Element zu bilden, sind Acridinorange,
7-(p-Methoxybenzylamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol; N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin-p-toluolsulfonat;
Pyrene, wie z.B. 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure und
1-Pyrenbuttersäure,
Merocyanin 540, Diodeosin sowie andere leicht erhältliche
fluoreszierende Moleküle.
-
Für Polynucleotid-Tests
können
viele verschiedene Energieakzeptoren vewendet werden, doch jene, die
verstärkte
Fluoreszenz aufweisen, wenn sie an doppelstrangige Nucleinsäuren gebunden
sind, sind vorzuziehen. Interkalierende Farbstoffe wie etwa Ethidiumbromid
und Acridinorange sind typische Beispiele. Ein von Barton (J. Am.
Chem. Soc. 112, 4960 (1990)) entwickeltes Rutheniumderivat ist besonders
attraktiv, da es im interkalierten Zustand dramatisch aktiviert
wird. Alternativ dazu kann der Energieakzeptor an eine zweite Polynucleotidsonde
gebunden sein, die sich in der Nähe
der mit Chemolumineszenzverbindung markierten Sonde binden kann,
oder der Energieakezeptor kann ungebunden und in Lösung frei
dispergiert sein.
-
Nichtfluoreszierende
Energieakzeptoren können
eine Vielzahl von Azofarbstoffen, Cyaninfarbstoffen, 4,5-Dimethoxyfluorescein,
Formazane, Indophenole und dergleichen sein.
-
Ein
Verfahren, auf das die vorliegende Erfindung angewandt werden kann
ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten. Das Verfahren umfasst
die Behandlung eines Mediums, das vermutlich einen Analyten enthält, unter
Bedingungen, die dafür
sorgen, dass der Analyt – falls
er vorhanden ist – die
Menge eines Photosensibilisators und einer Chemolumineszenzverbindung,
die einander nahe kommen können,
beeinflusst, worin der durch den Photosensibilisator erzeugte kurzlebige
Singulett-Sauerstoff
mit der Chemolumineszenzverbindung vor der spontanen Zersetzung
reagieren kann. Das Verfahren umfasst ferner die Messung der Intensität der durch
die Chemolumineszenzverbindung erzeugten Lumineszenz. Die Intensität der erzeugten Lumineszenz
steht mit der Analytenmenge im Medium in Zusammenhang. Die Chemolumineszenzverbindung
ist zur Aktivierung durch Singulett-Sauerstoff fähig, und der Photosensibilisator
katalysiert die Bildung von Singulett-Sauerstoff üblicherweise
als Reaktion auf Lichtanregung, gefolgt von Energietransfer auf
molekularen Sauerstoff. Oft wird eine Oberfläche in unmittelbare Nähe zum Photosensibilisator
und zur Chemolumineszenzverbindung gebracht, wobei die Oberfläche vorzugsweise
die Oberfläche
der suspendierbaren Teilchen ist. Das durch die Aktivierung der
Chemolumineszenzverbindung gebildete Produkt zersetzt sich vorzugsweise
spontan unter Lichtemission.
-
Das
Verfahren basiert auf einem Analyten, der bewirkt oder verhindert,
dass Moleküle
des Photosensibilisators und der Chemolumineszenzverbindung näher beieinander
liegen als ihr mittlerer Abstand im Körper der Lösung des Testmediums. Diese
Aufteilung hängt
von der Menge des Analyten ab, die in der zu analysierenden Probe
vorhanden ist. Die Photosensibilisatormoleküle, die sich nicht mit der
Chemolumineszenzverbindung assoziieren, produzieren Singulett-Sauerstoff,
der die Chemolumineszenzverbindung nicht erreichen kann, bevor die
Zersetzung im wässrigen
Medium erfolgt. Wenn jedoch der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
einander als Reaktion auf die Analytenmenge näher kommen, kann der durch
Bestrahlung des Photosensibilisators erzeugte Singulett-Sauerstoff
die Chemolumineszenzverbindung vor der Zersetzung aktivieren. Da
zahlreiche Chemolumineszenzverbindungs-Moleküle und/oder Photosensibilisator-Moleküle mit einer
Oberfläche
assoziiert werden können
und da die Diffusion auf einer Oberfläche beschränkt ist, kann die Gegenwart
einer Oberfläche
in Kombination mit dem Photosensibilisator und der Chemolumineszenzverbindung
den Wirkungsgrad oder die Wirkungsweise von Singulett-Sauerstoff
mit der Chemolumineszenzverbindung vor der Zersetzung steigern.
Die Verwendung einer Oberfläche,
die als Funktion der Gegenwart von Analyten in die Nähe der Chemolumineszenzverbindung
und des Photosensibilisators kommt, ist daher vorzuziehen. Der vorliegende
Test bietet daher ein geeignetes Verfahren zum Detektieren und Messen
einer Vielzahl von Analyten in einfacher, effizienter und reproduzierbarer
Weise sowie unter Einsatz einfacher Geräte zur Messung der während der
Reaktion erzeugten Lichtmenge.
-
Die
Menge des Photosensibilisators, der in die Nähe der Chemolumineszenzverbindung
kommt, wird durch die Gegenwart von Analyt beeinflusst, da der Photosensibilisator
und die Chemolumineszenzverbindung jeweils mit einem sbp-Element
assoziiert werden. Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen,
wobei der Ausdruck "assoziiert
mit" dadurch definiert
ist. Der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung können Funktionalitäten für die kovalente
Bindung an sbp-Elementen enthalten, oder es können die sbp-Elemente bzw.
Gruppen, die sich an sbp-Elemente binden können, Funktionalitäten zur
Bindung an den Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung
enthalten. Die Bindung kann durch direkte Bindung zwischen den zwei
Molekülen
erfolgen, oder es kann eine Linkergruppe zwischen einem sbp-Element
und dem Photosensibilisator oder der Chemolumineszenzverbindung
liegen. In einer anderen Ausführungsform
können der
Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung an Oberflächen gebunden
oder in Teilchen inkorporiert sein, an die auch sbp-Elemente gebunden
sind. In beiden Fällen
kann sich jedes der sbp-Elemente direkt oder indirekt an den Analyten
oder eine Testkomponente binden, deren Konzentration durch die Gegenwart
des Analyten beeinflusst wird. Der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
können
in Teilchen inkorporiert werden, da er bzw. sie in zumindest einer
Phase der Teilchen löslich
ist, in welchem Fall der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
in viel höherer
Konzentration innerhalb des Teilchens vorliegt als im übrigen Testmedium.
Wenn der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
kovalent an Teilchen gebunden sind, werden der Photosensibilisator
und die Chemolumineszenzverbindung oder die Teilchen oder Komponenten
davon funktionalisiert, um ein Mittel zur Bindung des Photosensiblisators
und der Chemolumineszenzverbindungen sowie der Teilchen bereitzustellen.
Bei Teilchen, die Öltröpfchen oder
Liposomen sind, kann der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
an einer oder mehreren langen Kohlenwasserstoffketten gebunden sein,
wobei jede im Allgemeinen zumindest 10 bis 30 Kohlenstoffatome aufweist.
Wenn die Teilchen Tröpfchen
eines Fluorkohlenstoffs sind, kann der Photosensibilisator oder
die Chemolumineszenzverbindung (in diese Teilchen inkorporiert)
fluoriert werden, um die Löslichkeit
zu verstärken
und den Austausch zu anderen mit dem anderen Marker gebundenen Teilchen
zu verringern; die zur Verknüpfung
verwendete Kohlenwasser stoffkette wird vorzugsweise durch eine Fluorkohlenstoffkette
ersetzt. Bei flüssigen
Silikonteilchen kann der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
an ein Polysiloxan gebunden sein. Um die Anzahl an Photosensibilisator-
oder Chemolumineszenzverbindungs-Molekülen pro Teilchen zu maximieren,
ist es üblicherweise
wünschenswert,
die Ladung und Polarität
des Photosensibilisators oder der Chemolumineszenzverbindung zu
minimieren, sodass er bzw. sie sich innerhalb des nichtwässrigen
Abschnitts des Teilchens befindet. Wenn das Teilchen ein Liposom
ist und man den Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung
in der wässrigen
Phase des Liposoms halten möchte,
ist es vorzuziehen, Photosensibilisatoren oder Chemolumineszenzverbindungen
zu verwenden, die stark polar oder stark geladen sind.
-
Ungeachtet
dessen, wie der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung
gebunden sind, ist entscheidend, dass sich keine der beiden Verbindungen
von ihrem sbp-Element disoziieren kann, um sich während des
Tests mit dem sbp-Element, das an das andere Element des Photosensiblisator-Chemolumineszenzverbindungs-Paars
gebunden ist, zu assoziieren. Die Dissoziation dieser Verbindungen
von ihren jeweiligen sbp-Elementen muss demnach im Verhältnis zur
für den
Test erforderlichen Zeit langsam sein.
-
Die
Chemolumineszenzverbindung kann an ein sbp-Element gebunden sein,
das sich direkt oder indirekt an den Analyten oder an eine Testkomponente
binden kann, deren Konzentration durch die Gegenwart des Analyten
beeinflusst wird. Der Ausdruck "kann
sich direkt oder indirekt binden" bedeutet,
dass sich die jeweilige Einheit spezifisch (direkt) an die Einheit
binden kann oder sich spezifisch an ein spezifisches Bindungspaarelement
oder an einen Komplex von zwei oder mehr sbp-Elementen binden kann,
der die andere Einheit (indirekt) binden kann. Die Oberfläche besitzt
im Allgemeinen ein daran gebundenes sbp-Element. Vorzugsweise ist
die Chemolumineszenzverbindung mit der Oberfläche assoziiert, üblicherweise
innerhalb eines suspendierbaren Teilchens. Dieses sbp-Element kann
sich im Allgemeinen direkt oder indirekt an den Analyten oder einen
Rezeptor für
den Analyten binden. Wenn die mit dem Photosensibilisator und der
Chemolumineszenzverbindung assoziierten sbp- Elemente beide in der Lage sind, sich
an den Analyten zu binden, ergibt sich eine Sandwichtest-Arbeitsvorschrift.
Wenn eines der mit dem Photosensibilisator oder der Chemolumineszenzverbindung
assoziierten sbp-Elemente sowohl den Analyten als auch einen Analytenanalog
binden kann, ergibt sich möglicherweise
eine kompetitive Test-Arbeitsvorschrift. Die Bindung an eine Oberfläche oder
die Inkorporation in einem Teilchen der Chemolumineszenzverbindung
wird im Allgemeinen durch die gleichen Prinzipien bestimmt, die
oben für
die Bindung an ein oder die Inkorporation in ein Teilchen des Photosensiblisators
beschrieben sind.
-
Üblicherweise
wird bewirkt, dass der Photosensibilisator die Chemolumineszenzverbindung
aktiviert, indem das die obigen Reaktanden enthaltende Medium bestrahlt
wird. Das Medium muss mit Licht bestrahlt werden, das eine Wellenlänge mit
Energie aufweist, die ausreicht, um den Photosensibilisator in einen
angeregten Zustand überzuführen, wodurch
er molekularen Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff aktivieren kann.
Der angeregte Zustand für
den Photosensiblisator, der molekularen Sauerstoff anregen kann,
ist im Allgemeinen ein Triplett-Zustand, der mehr als etwa 20, üblicherweise
zumindest 23, kcal/mol energetischer als der Photosensibilisator-Grundzustand
ist. Vorzugsweise wird das Medium mit Licht mit einer Wellenlänge von
etwa 450 bis 950 nm bestrahlt, obwohl kürzere Wellenlängen auch
in Frage kommen, z.B. 230 bis 950 nm. Die erzeugte Lumineszenz kann
in jeder geeigneten Weise gemessen werden, z.B. photographisch,
visuell oder photometrisch, um ihre Menge zu bestimmen, die mit
der Menge des Analyten im Medium in Zusammenhang steht.
-
Obwohl
es üblicherweise
vorzuziehen ist, den Photosensibilisator durch Bestrahlung mit Licht
einer Wellenlänge,
die wirkungsvoll vom Photosensibilisator absorbiert wird, anzuregen,
sind auch andere Mittel zur Anregung möglich, z.B. durch Energietransfer
aus einem angeregten Zustand eines Energiedonors, wie z.B. eines
zweiten Photosensibilisators. Bei Verwendung eines zweiten Photosensibilisators
können
Wellenlängen von
Licht verwendet werden, die vom Photosensibilisator ineffizient,
aber vom zweiten Photosensibilisator in wirkungsvoller Weise absorbiert
werden. Der zweite Photosensibilisator kann an eine Testkomponente
gebunden sein, die mit dem ersten Photosensibilisator assoziiert
ist oder sich mit diesem assoziiert (beispielsweise ge bunden an
eine Oberfläche
oder in das Teilchen inkorporiert, das den ersten Photosensibilisator
aufweist). Wenn ein zweiter Photosensibilisator verwendet wird,
weist er üblicherweise
einen Triplett-Zustand niedrigster Energie bei höheren Energiewerten auf als
der Triplett-Zustand niedrigster Energie des ersten Photosensibilisators.
Die 632,6-nm-Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers ist eine kostengünstige Lichtquelle
für die
Anregung. Photosensibilisatoren mit Absorptionsmaxima im Bereich
von etwa 620 bis etwa 650 nm sind mit der Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers kompatibel,
weshalb sie sich hierin besonders eignen.
-
Ein
weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten,
umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen in Kombination
(1) eines Mediums, das vermutlich Analyt enthält, (2) eines Photosensibilisators,
der in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in einen Singulett-Zustand
aktivieren kann, wobei der Photosensibilisator mit einem sbp-Element
assoziiert ist, und (3) eines suspendierbaren Teilchens, umfassend eine
Chemolumineszenzverbindung, worin das Teilchen ein daran gebundenes
sbp-Element aufweist, sodass Analyt – sofern er vorhanden ist – die Menge
der Chemolumineszenzverbindung und des Photosensibilisators beeinflusst,
die einander nahe kommen können,
(b) Behändeln
der Kombination mit Licht, um den Photosensibilisator anzuregen,
und (c) Untersuchen der Kombination hinsichtlich der Menge der daraus
emittierten Lumineszenz. Die Menge der emittierten Lumineszenz steht
in Beziehung zur Menge an Analyt im Medium. Die Chemolumineszenzverbindung
ist in ein suspendierbares Teilchen inkorporiert und das sbp-Element
an das Teilchen gebunden. Der Photosensibilisator ist in ein zweites
suspendierbares Teilchen inkorporiert, das ein daran gebundenes
sbp-Element aufweist.
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung können auf die meisten Tests
eingestellt werden, die sbp-Elemente, wie z.B. Ligand-Rezeptor,
umfassen, beispielsweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, Polynucleotid-Bindungstests
usw. Die Tests können
homogen oder heterogen, kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Die Testkomponenten,
Chemolumineszenzverbindung und Photosensibilisator, können in
unterschiedlicher Weise mit (1) einer Oberfläche (falls vorhanden), (2)
Nucleinsäure
oder Rezeptor und (3) Nucleinsäure
oder Ligand verwendet werden. Die Assoziation kann kovalente oder
nichtkovalente Bindungen enthalten. Fachleute auf dem Gebiet können die
jeweiligen Assoziationen je nach dem Test auswählen, der im Lichte der obigen
und folgenden Beschreibung gewünscht
ist.
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In
einem homogenen Test kann die Probe allenfalls vorbehandelt werden,
um unerwünschte
Materialien zu entfernen. Die Reaktion für einen nichtkompetitiven Sandwich-Test
kann Folgendes enthalten: ein sbp-Element (z.B. einen Antikörper, eine
Nucleinsäuresonde,
einen Rezeptor oder Liganden), das komplementär zum Analyten und mit einer
Chemolumineszenzverbindung assoziiert ist; einen mit einem sbp-Element (z.B. Antikörper, Nucleinsäuresonde,
Rezeptor oder Ligand) assoziierten Photosensibilisator, der ebenfalls zum
Analyten komplementär
ist; die Probe von Interesse; und gegebenenfalls erforderliche Zusatzreagenzien. Vorzugsweise
sind der Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung
in Teilchen inkorporiert, an die die sbp-Elemente gebunden sind.
In einer kompetitiven Arbeitsvorschrift kann ein sbp-Element ein Derivat
des Analyten und das andere sbp-Element komplementär zum Analyten
sein (z.B. Antikörper).
In beiden Arbeitsvorschriften können
die Komponenten entweder gleichzeitig oder zur Gänze oder teilweise nacheinander
kombiniert werden. Die Fähigkeit
von durch einen aktivierten Photosensibilisator erzeugtem Singulett-Sauerstoff,
mit der Chemolumineszenzverbindung zu reagieren, wird durch die
Bindung eines sbp-Elements am Analyten bestimmt. Demnach kann die
Gegenwart oder Menge des Analyten durch Messen der Lichtmenge bestimmt
werden, die nach Aktivierung des Photosensibilisator durch Bestrahlung,
Erhitzen oder Zugabe eines chemischen Reagens, vorzugsweise durch
Bestrahlung, emittiert wird. Sowohl die Bindungsreaktion als auch
die Detektion ihres Ausmaßes
können
in einer homogenen Lösung
ohne Trennung erfolgen. Dies ist ein Vorteil der Erfindung gegenüber Verfahren
des Stands der Technik auf der Basis von Chemolumineszenz.
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In
einem heterogenen Test umfassen die Testkomponenten eine Probe,
die vermutlich einen Analyten enthält, der ein sbp-Element ist;
ein sbp-Element, das an einen Träger
gebunden ist, der entweder eine nicht-dispergierbare Oberfläche oder
ein Teilchen ist, mit dem ein Element einer Gruppe assoziiert ist,
die aus der Chemolumineszenzverbindung und dem Photosensibilisator
besteht; und ein sbp-Element, mit dem das andere Element der Gruppe
assoziiert ist, worin die sbp-Elemente unabhängig voneinander entweder direkt oder
indirket den Analyten oder einen Rezeptor für den Analyten binden können. Diese
Komponenten werden im Allgemeinen entweder gleichzeitig oder zur
Gänze oder
teilweise nacheinander kombiniert. Die Oberfläche oder Teilchen werden dann
von der flüssigen
Phase abgetrennt, und es wird entweder die abgetrennte Phase oder
die flüssige
Phase Bedingungen unterzogen, um den Photosensibilisator zu aktivieren, üblicherweise durch
Bestrahlen der jeweiligen Phase, und die Menge des emittierten Lichts
zu messen.
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Die
Bindungsreaktionen in einem Test auf den Analyten erfolgen normalerweise
in einem wässrigen Medium
bei mittlerem pH-Wert, im Allgemeinen bei jenem, der optimale Testsensitivität bietet.
Vorzugsweise erfolgt die Aktivierung der Photosensibilisators auch
in einem wässrigen
Medium. Wenn jedoch ein Trennschritt vorgesehen ist, eignen sich
auch nichtwässrige
Medien, z.B. Acetonitril, Aceton, Toluol, Benzonitril usw., und
wässrige
Medien mit sehr hohen pH-Werten, d.h. von mehr als 10,0, oder sehr
niedrigen pH-Werten, d.h. weniger als 4,0, wobei sehr hohe üblich sind.
Wie oben erwähnt
kann der Test entweder ohne Trennung (homogen) oder mit Trennung
(heterogen) der Testkomponenten oder -produkte erfolgen.
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Das
wässrige
Medium kann nur Wasser sein oder 0,01 bis 80 Vol.-% eines Co-Lösungsmittels
enthalten; üblicherweise
enthält
es weniger als 40 % eines Co-Lösungsmittels,
wenn ein sbp-Element verwendet wird, das ein Protein ist. Der pH-Wert
für das
Medium der Bindungsreaktion liegt üblicherweise im Bereich von etwa
4 bis 11, noch häufiger
im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5
bis 9,5. Wenn der pH-Wert während
der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff nicht verändert wird, ist er üblicherweise
ein Kompromiss zwischen optimaler Bindung der Bindungselemente und
dem pH-Optimum zur Erzeugung eines Signals sowie der Stabilität anderer
Reagenzien des Tests. Wenn erhöhte
pH-Werte für
die Signalerzeugung erforderlich sind, kann ein Schritt, der die
Zugabe eiens alkalischen Reagens vorsieht, zwischen der Bindungsreaktion
und der Erzeugung von Singulett-Sau erstoff und/oder der Signalproduktion
erfolgen. Üblicherweise sind
die erhöhten
pH-Werte höher als
10, noch häufiger
10 bis 14. Für
heterogene Tests können
auch die oben erwähnten
nichtwässrigen
Lösungsmittel
verwendet werden, wobei die wichtigste Überlegung ist, dass das Lösungsmittel
nicht wirkungsvoll mit Singulett-Sauerstoff reagiert.
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Verschiedene
Puffer können
dazu dienen, den gewünschten
pH-Wert zu erzielen und ihn während
des Tests beizubehalten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat,
Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils verwendete
Puffer ist für
die Erfindung nicht entscheidend, doch in einem konkreten Test kann
ein oder oder anderer Puffer jeweils vorzuziehen sein.
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Bei
der Durchführung
der Bindungsreaktionen proteinhaltiger Liganden und Rezeptoren im
Test herrschen moderate Temperaturen und während der Messdauer üblicherweise
konstante Temperaturen, vorzugsweise zwischen 25 °C und 40 °C. Die Inkubationstemperaturen
für die
Bindungsreaktion reichen normalerweise von etwa 5 °C bis 45 °C, noch häufiger von
etwa 15 °C
bis 40 °C,
noch häufiger
von 25 °C
bis 40 °C.
Wenn Bindung von Nucleinsäuren
im Test erfolgt, herrschen oft höhere
Temperaturen, üblicherweise
20 °C bis
90 °C, noch
häufiger
35 °C bis
75 °C. Die
Temperaturen während
der Messungen, d.h. während
der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff und der Lichtdetektion, reichen
im Allgemeinen von etwa 20 °C
bis 100 °C,
noch häufiger von
etwa 25 °C
bis 50 °C,
noch häufiger
von 25 °C
bis 40 °C.
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Die
zu untersuchende Konzentration von Analyten variiert im Allgemeinen
zwischen etwa 10–4 bis unter 10–16 M,
noch häufiger
von etwa 10–6 bis
10–14 M. Überlegungen,
z.B. ob der Test qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ ist,
das jeweilige Detektionsverfahren, die Konzentration des Analyten
von Interesse und die maximalen gewünschten Inkubationszeiten,
sind normalerweise für
die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien ausschlaggebend.
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Während in
kompetitiven Tests die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien
im Testmedium im Allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von
Interesse des Analyten bestimmt wird, wird normalerweise die Endkonzentration
jedes Reagens empirisch ermittelt, um die Sensititivät des Tests
im Bereich zu optimieren. Eine signifikante Variation der Konzentration
des Analyten sollte eine präzise
messbare Signaldifferenz liefern.
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Die
Konzentration der sbp-Elemente hängt
von der Analytenkonzentration, der gewünschten Bindungsrate und dem
Grad, in dem sich die sbp-Element nichtspezifisch binden, ab. Üblicherweise
sind die sbp-Elemente in zumindest der niedrigsten erwarteten Analytenkonzentration
vorhanden, vorzugsweise in zumindest der höchsten erwarteten Analytenkonzentration;
bei nichtkompetitiven Tests können
die Konzentrationen 10 bis 106 Mal so hoch
wie die höchste
Analytenkonzentration sein, üblicherweise
weniger als 10–4 M, vorzugsweise weniger
als 10–6 M,
häufig
zwischen 10–11 und
10–7 M.
Die Menge an Photosensibilisator oder Chemolumineszenzverbindung,
die mit einem sbp-Element assoziiert sind, beträgt üblicherweise zumindest ein
Molekül
pro sbp-Element und kann bis zu 105 betragen, üblicherweise
zumindest 10 bis 104, wenn das Photosensibilisator-
oder Chemolumineszenzmolekül
in ein Teilchen inkorporiert ist.
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Während die
Reihenfolge der Zugabe stark variieren kann, sind je nach Beschaffenheit
des Tests verschiedene Präferenzen
zu beachten. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist die gleichzeitige
Zugabe aller Materialien. Alternativ dazu können die Reagenzien zur Gänze oder
teilweise nacheinander kombiniert werden. Wenn der Test kompetitiv
ist, ist es oft wünschenswert,
den Analytenanalog nach dem Kombinieren der Probe und eines sbp-Elements,
das den Analyten binden kann, zuzugeben. Gegebenenfalls kann der
Inkubationsschritt nach dem Kombinieren der Reagenzien vorgesehen
sein, im Allgemeinen etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, noch häufiger etwa
2 Minuten bis 1 Stunde, vor der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff
durch den Sensibilisator und dem Messen der Lichtemission.
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In
einer besonders bevorzugten Reihenfolge der Zugabe wird eine erste
Gruppe spezifischer Bindungspaarelemente, die komplementär zum und/oder
homolog mit dem Analyten sind, mit dem Analyten kombiniert, gefolgt
von der Zugabe spezifischer Bin dungspaarelemente, die zu den ersten
spezifischen Bindungspaarelementen komplementär sind, wobei jedes mit einem
unterschiedlichen Element der Gruppe assoziiert ist, die aus einem
Photosensibilisator und einer Chemolumineszenzverbindung besteht.
Das Testgemisch oder eine abgetrennte Komponente davon wird dann
bestrahlt und die Lichtemission gemessen.
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In
einem homogenen Test können
nach dem Kombinieren aller Reagenzien diese auf Wunsch inkubiert
werden. Dann wird die Kombination bestrahlt und das resultierende
emittierte Licht gemessen. Das emittierte Licht wird mit der Menge
des in der untersuchten Probe vorhandenen Analyten in Beziehung
gesetzt. Die Mengen der in einem homogenen Test verwendeten Reagenzien
der Erfindung hängen
von der Beschaffenheit des Analyten ab. Im Allgemeinen weist der
homogene Test der Erfindung höhere
Sensitivität
im Vergleich zu bekannten Tests wie dem EMIT®-Test
auf. Dieser Vorteil ergibt sich hauptsächlich aus dem verbesserten
Signal-Rausch-Verhältnis,
das gemäß dem vorliegenden
Verfahren erzielt werden kann.
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Die
folgenden Tests dienen zur Veranschaulichung und sind keinesfalls
einschränkend;
sie sollen es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ermöglichen,
den Umfang der Erfindung abzuschätzen
und diese ohne allzu viele Experimente durchzuführen. Man beachte, dass die
Auswahl von Analyten, Photosensibilisatoren, Chemolumineszenzverbindungen,
Oberflächen,
Teilchen und Reaktionsbedingungen in den folgenden Beispielen den
Fachleuten in Bezug auf die vorliegende Offenbarung nahe gelegt
wird.
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In
einem Verfahren außerhalb
des Schutzumfangs ist die Chemolumineszenzverbindung 9-Benzal-10-methylacridan
kovalent an einen Antikörper
für Thyroid-stimulierendes
Hormon (TSH) gebunden (Reagens 1). Das 9-Benzal-10-methylacridan,
funktionalisiert mit einem N-Hydroxysuccinimdylester einer am Phenylring
gebundenen Carboxylgruppe, reagiert mit den Aminogruppen des Antikörpers. Die
Linkergruppe ist ein Carbamid. Der verwendete Photosensibilisator
ist Diodeosin, das kovalent an Latexteilchen mit einer mittleren
Größe von 0,5 μm gebunden
ist. Die Latexteilchen und Diodeosin sind mittels Chlormethylgruppen auf
dem Latex kovalent aneinander gebunden, um eine Ester-Linkergruppe
zu bilden (siehe J. Am. Chem. Soc. 97, 3741 (1975)). Das Latexteilchen
ist ferner mittels N-Hydroxysuccinimidylester-Gruppen auf dem Latex
an einen zweiten Antikörper
für TSH
gebunden (Reagens 2). Beide verwendeten Antikörper sind monoklonale Antikörper, die
durch herkömmliche
Hybridzelllinien-Technologie produziert werden. Ein Antikörper erkennt
die α-Untereinheit
von TSH und der andere die β-Untereinheit
von TSH. Bei der Durchführung
des Test wird eine Serumprobe, die vermutlich TSH enthält, von
einem Patienten gezogen. 50 μl
der Probe werden in einem wässrigen
500 ml-Medium, gepuffert mit Tris-Puffer bei pH 8,0, mit obigem
Reagens 1 und Reagens 2 kombiniert. Die Mengen an Reagens 1 und
Reagens 2 sind ausreichend, um Konzentrationen jedes Antikörpers von etwa
10–6 M
zu bilden. Das Reaktionsgemisch wird dann 1 h lang bei 25 °C inkubiert
und dann 30 s lang mit 560 nm Licht bestrahlt. Die nach der Bestrahlung
emittierte Lichtintensität
wird gemessen und die gesamte über
den Zeitraum von 30 s detektierte Lichtenergie mit Werten verglichen,
die in einem ähnlichen
Verfahren mit Proben, die bekannte Konzentrationen an TSH aufweisen,
erhalten wurden, um die TSH-Konzentration in unbekannten Proben
zu ermitteln. Alternativ dazu werden nach der Inkubation die Latexteilchen
vom Medium abgetrennt und in ein wässriges gepuffertes Medium
mit pH 9,5 eingebracht, in ähnlicher
Weise bestrahlt und die Menge an aus dem System emittiertem Licht
wie oben gemessen.
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Gemäß einer
Alternative auf der Grundlage des oben Angeführten ist Reagens 2. Diodeosin,
das kovalent mit dem zweiten Antikörper verbunden ist, und es
wird kein Latexteilchen verwendet. In einer weiteren alternativen
Herangehensweise auf der Basis der obigen, jedoch unter Einsatz
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
ist Reagens 2 Diodeosin, das kovalent mit dem zweiten Antikörper verbunden
ist, und Reagens 1 ist 9-Benzal-10-methylacridan, das kovalent an
Latexteilchen gebunden ist, an die der erste Antikörper kovalent
gebunden ist. In einer weiteren alternativen Ausführungsform
auf der Basis der obigen und unter Einsatz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
ist Reagens 1 wie oben beschrieben, Reagens 2 ist Diodoesin, das
kovalent mit Latexteilchen verbunden ist, an die Avidin kovalent
gebunden ist, und es wird außerdem ein
drittes Reagens (Reagens 2A) verwendet, d.h., der zweite kovalent
mit Biotin verbundene Antikörper
wird verwendet. Reagens 1 und das dritte Reagens werden mit Probe
kombiniert und inkubiert. Dann wird ein Überschuss von Reagens 2 zugegeben;
das übrige
Verfahren verläuft
wie oben beschrieben.
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In
einer anderen Alternative auf der Basis der obigen tritt Chlorperoxidase
an die Stelle von Diodeosin. In diesem Test erfolgt statt dem Bestrahlungsschritt
die Zugabe von Natriumbromid und Wasserstoffperoxid, um Singulett-Sauerstoff
zu erzeugen. Das emittierte Licht wird wie oben beschrieben gemessen.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine erste Gruppe von Öltröpfchen (Reagens 3) aus einer
Lösung
des Photosensibilisators (Chlorophyll) in Mineralöl gemäß dem Verfahren
von Giaever, s.o., hergestellt. Die Öltröpfchen, die einen Durchmesser
von 0,1 bis 2 μm
aufweisen, werden funktionalisiert und mit einem monoklonalen Antikörper für choriales
Human-Gonadotropin (HCG) verbunden. Das Chlorophyll ist lipophil
und daher irreversibel im lipophilen Öltröpfchen gelöst. Eine zweite Gruppe von Öltröpfchen (Reagens 4)
wird in ähnlicher
Weise hergestellt. In dieser Gruppe von Tröpfchen wird das Öltröpfchen kovalent
mit einem zweiten monoklonalen Antikörper für HCG verbunden, der einen
anderen Abschnitt des HCG-Moleküls
erkennt als der oben erwähnte
erste monoklonale Antikörper.
9-(Diphenylmethylidin)-N-methylacridan wird irreversibel im lipophilen Öltröpfchen gelöst, indem
eine N,N-Didodecylcarbonsäureamid-Gruppe,
die an eine der Phenylgruppen des Acridan gebunden ist, miteinbezogen
wird. Die monoklonalen Antikörper
werden durch herkömmliche
Hybridzelllinien-Technologie erzeugt. Eine Harnprobe, die vermutlich
HCG (50 μl)
enthält,
wird in Überschussmengen
von Reagens 3 und Reagens 4 in einem wässrigen gepufferten Medium
(500 μl)
bei pH 7,5 kombiniert. Das Medium wird 20 min lang bei 25 °C inkubiert.
Das Medium wird ohne Trennung unter Anwendung eines He/Ne-Lasers
1 min lang mit 633 nm bestrahlt und das emittierte Licht wie oben
beschrieben gemessen. Die Lichtmenge wird mit der aus Proben emittierten
Menge verglichen, die bekannte Mengen an HCG aufweisen, und der
HCG-Gehalt in der unbekannten Probe durch Vergleichen der Werte
ermittelt. Auf diese Weise wird ein geeigneter und sensitiver homogener
Immuntest auf HCG durchgeführt.
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In
einer alternativen Vorgangsweise auf der Basis der obigen besitzt
Reagens 3 Antikörper
für Fluorescein
anstelle des Antikörpers
für HCG,
und ein zusätzliches
Reagens (Reagens 3A) besitzt einen kovalent mit Fluorescein verbundenen
HCG-Antikörper.
Reagens 4 besitzt Avidin anstelle des zweiten HCG-Antikörpers, und
ein viertes Reagens (Reagens 4A) weist einen zweiten Antikörper auf,
der kovalent an Biotin gebunden ist. Im Test werden Reagens 4A und
Reagens 3A mit Probe kombiniert und inkubiert. Anschließend werden die
Reagenzien 3 und 4 zugegeben und inkubiert. Anschließend wird
der Rest des obigen Tests durchgeführt.
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In
einem weiteren Verfahren, das nicht im Schutzumfang liegt, wird
unter Einsatz im Handel erhältlicher
zu diesem Zweck entwickelter Instrumente eine Gruppe von Liposomen
(Reagens 5, Durchmesser 0,2 μm)
durch Hochdruckextrusion einer Phospholipid-Suspension in pH 7,4-Puffer
durch eine 0,2 μm-Porenmembran
geformt. Ein Thyroxin-Analog wird kovalent an das Liposom gebunden,
indem zuerst Mercaptoacetamid-Gruppen auf dem Liposom durch Reaktion
von Phosphatidylethanolamin im Liposom mit einem aktiven Ester von
Methylcarboxymethyldisulfid gebildet werden, gefolgt von der Reaktion
mit Dithioerythrit. Bromacetylthyroxin wird darin mit den sulfhydrylierten
Liposomen umgesetzt. Ein Metalloporphyrin-Farbstoff wird im lipophilen
Abschnitt des Liposoms gelöst.
Eine weitere Gruppe von Liposomen (Reagens 6) dient dazu, einen monoklonalen
Antikörper
für Thyroxin
zu binden. Der Antikörper
wird durch ein ähnliches
Verfahren wie bei der Bindung von Thyroxin kovalent gebunden. Ein
Enamin (2-Dimethylaminomethylenpyran) wird mittels einer Carbamid-Linkergruppe
kovalent an die Oberfläche
des Liposoms gebunden. Reagens 5 und Reagens 6 werden in einem wässrigen
gepufferten Testmedium (500 μl)
von pH 8,0 mit einer Serumprobe kombiniert, die vermutlich Thyroxin
enthält,
das Anilinonaphthalinsulfonsäure
enthält,
um Thyroxin von Bindungsproteinen (50 μl) zu verdrängen und Energie aus dem Sauerstoff-aktivierten
Pyran aufzunehmen, damit langwellige Emission ermöglicht wird.
Das Testmedium wird dann 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Das Medium wird ohne den Trennschritt bei 650 nm 1 min lang bestrahlt
und das resultierende emittierte Licht mittels eines Luminometers
gemessen. Der erhaltene Wert wird mit Werten verglichen, die unter
Einsatz eines ähnlichen
Tests mit bekannten Mengen an Thyroxin erzielt wurden. Auf diese
Weise wird die Menge an Thyroxin in der Serumprobe quantifiziert.
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In
einer alternativen Vorgangsweise auf der Basis der obigen besitzt
Reagens 6 Avidin anstelle des Antikörpers für Thyroxin. Ein zusätzliches
Reagens (Reagens 6A) weist kovalent an Biotin gebundenen Antikörper für Thyroxin
auf. Reagens 5 weist Antikörper
für Fluorescein
anstelle von Thyroxin auf, und ein zusätzliches Reagens (Reagens 5)
besitzt an Fluorscein kovalent gebundenes Thyroxin. Im Test werden
Reagenzien 5A und 6A mit Probe kombiniert und inkubiert. Dann werden
Reagens 5 und 6 zugegeben, das Gemisch wird inkubiert und der Rest
des Testverfahrens durchgeführt.
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In
einer alternativen Vorgangsweise auf der Basis der obigen wird der
Metalloporphyrin-Farbstoff durch Kaliummolybdat ersetzt, das in
die wässrige
Phase der Liposomen inkorporiert ist. In diesem Test ist der Bestrahlungsschritt
durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid ersetzt, um Singulett-Sauerstoff
zu erzeugen. Das emittierte Licht wird wie oben beschrieben gemessen.
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In
einem weiteren Verfahren, das auch nicht im Schutzumfang liegt,
wird 2-Hydroxyethyl-9,10-dibromanthracen, auf ähnliche Weise wie von Gribnau
beschrieben, in einen Farbstoffkristalliten eingebracht. Ein monoklonaler
Antikörper,
der Hepatitis B-Oberflächen-Antigen
erkennt, wird mittels einer Carbamat-Linkergruppe kovalent an den
Farbstoffkristalliten gebunden. Ein Latexteilchen wird behandelt,
um einen zweiten Antikörper
für Hepatitis
B-Oberflächen-Antigen
mittels kovalenter Bindung zu immobilisieren. Das Latexteilchen wird
ferner mittels einer Amid-Linkergruppe kovalent an 9-(Benzal-9H-xanthen)
gebunden. Der Farbstoffkristallit besitzt eine Teilchengröße von durchschnittlich
2 μm und
das Latexteilchen einen mittleren Durchmesser von 0,2 μm. Die monoklonalen
Antikörper
werden durch herkömmliche
Hybridzelllinien-Technologie erzeugt. Eine Serumprobe eines Patienten,
der vermutlich Hepatitis aufweist (50 μl), wird in einem wässrigen
Testmedium (500 μl)
bei pH 7,0 mit einem Überschuss
des Farbstoffkristalliten und der oben beschriebenen Latexteilen
kombiniert. Das Testmedium wird dann bei Raumtemperatur 30 min lang
inkubiert und dann 1 min lang mit einer Xenon-Lichtquelle bei 350
nm bestrahlt. Die Gegenwart von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen
in der Probe bewirkt, dass der Farbstoffkristallit und die Latexteilchen
aufgrund der Immunbindung der jeweiligen Antikörper mit dem Antigen einander
sehr nahe kommen. Nach Bestrahlung des Mediums wird das 9,10-Dibromanthracen
angeregt und wandelt molekularen Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff
um. Der Singulett-Sauerstoff reagiert mit dem Xanthen, um ein Dioxetan
zu ergeben, das bei Raumtemperatur spontan zerfällt, um Licht zu erzeugen.
Das Licht wird photometrisch gemessen, und die Lichtmenge über einem
bestimmten Schwellenwert zeigt die Gegenwart von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen
in der Probe an. Die Bestrahlung des Mediums erfolgt bei Raumtemperatur
und der Test in homogener Weise, um einen Test auf Hepatitis B-Oberflächen-Antigen
bereitzustellen.
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Vorzugsweise
wird in diesem Test Eu(TTA)
3 in den Latexteilchen
gelöst,
um zu bewirken, dass das angeregte Xanthenderivat seine Energie
auf Eu(TTA)
3 überträgt, das bei über 600
nm emittiert. Dies vermeidet Seruminterferenz, die ansonsten aufgrund
der Absorption durch Serumkomponenten von direkt aufgrund der Xanthen-Lumineszenz emittiertem
Licht auftreten würde.
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In
einem weiteren Verfahren, das nicht im Schutzumfang liegt, dient
der Test der Bestimmung eines konkreten Blutgruppen-Antigens an
der Oberfläche
eines roten Blutkörperchens,
d.h. eines A-Gruppen-Antigens. Wie oben beschrieben erzeugte Latex teilchen
mit einer Teilchengröße von 150
bis 500 nm werden verwendet. Die Latexteilchen besitzen einen Antikörper für das A-Gruppen-Antigen,
der kovalent mit dem Latexteilchen verbunden ist. Die Teilchen besitzen
auch den Enolether 2-p-Dimethylaminophenyl-3-phenyl-5,6-dihydrodioxen,
der im Latex gelöst
ist. Dieses Latexteilchenreagens wird im wässrigen Medium (500 μl) mit Vollblut (100 μl) und 1 × 10–4 M
Photosensibilisator kombiniert, der ein hydrophober Photosensibilisator
ist, nämlich Phenazin-2-carbonsäure. Der
hydrophobe Farbstoff lagert sich in der Probe vorhandenen roten
Blutkörperchen
ein. Das Medium wird 10 min lang bei 25 °C inkubiert und dann mit einer
Wolframquelle 30 s lang bei 400 bis 450 nm bestrahlt. Das aus dem
Medium emittierte Licht wird gemessen und mit der Lichtmenge verglichen, die
von Proben erhalten wird, die bekanntermaßen frei von A-Gruppen-Antigen
roter Blutkörperchen
sind. Somit zeigt die Lichtmenge über einem Schwellenwert die
Gegenwart des A-Blutgruppen-Antigens an.
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In
einem weiteren Verfahren, das die vorliegende Erfindung nicht veranschaulicht,
ist der Analyt ein HLA-Antigen auf der Oberfläche einer Zelle. Eine Probe
(50 μl),
die vermutlich das HLA-Antigen enthält, wird in einem auf pH 7,4
gepufferten wässrigen
Testmedium (500 μl)
kombiniert. Dem Medium wird auch eine Überschussmenge eines Reagens
zugegeben, das ein Antikörper
für das
HLA-Antigen ist, der mittels einer Thioether-Linkergruppe kovalent
an Eosin gekoppelt ist. Auch eine Chemolumineszenzverbindung wird
dem Testmedium zugegeben. Die Chemolumineszenzverbindung wird so
gewählt,
dass sie sich in der das HLA-Antigen enthaltenden Zelle einlagert.
Die Chemolumineszenzverbindung ist ein Acridan, nämlich 9-(Dodecylphenylmethylidin-1)-N-(2-sulfonoxyethyl)acridan.
Das Testmedium wird bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert und dann bei
500 bis 550 nm mit einer Wolfram-Halogen-Lichtquelle 1 min lang
bestrahlt. Das vom Testmedium emittierte Licht wird gemessen, und
die Lichtmenge über
einem Schwellenwert ist ein Indikator für die Gegenwart des HLA-Antigens.
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Die
Erfindung umfasst ferner Zusammensetzungen, die ein suspendierbares
Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,04 bis 4000 nm und
einer Chemolumineszenzverbindung enthalten. Die Chemolumineszenzverbindung
kann kovalent an die Teilchenmatrix gebunden oder in der Matrix
oder in einem in der Matrix gelösten
Lösungsmittel
gelöst
sein. Die Teilchen sind vorzugsweise Polymer- oder Öltröpfchen oder
Vesikel wie etwa Liposomen. Wenn das Teilchen ein Liposom ist, ist
die Chemolumineszenzverbindung mit der Lipid-Doppelschicht assoziiert
oder im wässrigen
Inneren des Liposoms gelöst.
Das Teilchen besitzt ein gebundenes sbp-Element. Vorzugsweise besitzen
die gebundenen sbp-Elemente einen mittleren Durchmesser von 100
bis 1000 mm. Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, die
aus zwei komplementären aneinander
gebundenen sbp-Elementen bestehen, worin eines mit einem Photosensibilisator
und das andere mit einer Chemolumineszenzverbindung assoziiert ist.
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Ein
weiteres Verfahren, das die vorliegende Erfindung nicht veranschaulicht,
stellt eine Kombination bereit, die (1) ein Medium, von dem vermutet
wird, dass es den Analyten enthält,
und (2) ein Markierungsreagens umfasst, das ein erstes Element eines
spezifischen Bindungspaares (sbp) mit einer PACC assoziiert umfasst.
Die Bedingungen sind so gewählt,
dass der sbp-Element-Komplex in Bezug auf das Vorhandensein des Analyten
gebildet ist. Beispielsweise kann das erste sbp-Element fähig sein,
sich an den Analyten oder ein zweites sbp-Element zu binden, um
einen Komplex zu bilden, der mit dem Vorhandensein des Analyten
in Beziehung steht. Das Verfahren umfasst weiters das photochemische
Anregen der PACC und das Detektieren des von der PACC erzeugten
Lumineszenz-Ausmaßes.
Das Lumineszenz-Ausmaß steht
mit der Analytmenge im Medium in Beziehung.
-
Im
Allgemeinen wird die PACC durch Bestrahlung mit Licht photochemisch
angeregt, das die PACC direkt anregen kann oder einen Photosensibilisator
anregen kann, der bei Bestrahlung bewirkt, dass molekularer Sauerstoff
in Singulettsauerstoff umgewandelt wird. der Singulettsauerstoff
regt dann die PACC an. Der Photosensibilisator kann je nach der
Art des Tests an einen Liganden gebunden sein, kann frei in Lösung vorliegen
oder kann an eine Oberfläche
gebunden sein. Das durch die Anregung der PACC mit Singulettsauerstoff gebildete
Produkt kann sich unter Lichtemission spontan zersetzen oder kann
weiter physikalisch oder chemisch behandelt werden, um Licht auszusenden.
-
Ein
Photosensibilisator kann bei einer Anzahl verschiedener Ansätze eingesetzt
werden, um Singulett-Sauerstoff zu produzieren, der die PACC aktiviert.
Der Photosensibilisator kann direkt, ohne an ein sbp-Element gebunden
zu sein, eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren wird eine relativ
hohe Konzentration des Photosensibilisators eingesetzt, üblicherweise
zumindest 10–7 M,
vorzugsweise zumindest 10–6 M, am bevorzugtesten
zumindest 10–5 M.
Im Allgemeinen ist die Menge des hierin eingesetzten Photosensibilisators ausreichend,
um eine Konzentration von Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, die
zur Aktivierung der PACC führt. Diese
Vorgangsweise kann dann gewählt
werden, wenn die Emission der PACC substanziell modifiziert wird, wenn
ein Komplex gebildet oder die Menge der PACC im Medium durch die
Gegenwart des Analyten beeinflusst wird. Dies wird üblicherweise
erreicht, indem gebundener und ungebundener Marker voneinander getrennt
werden. Wenn man keine Trennung möchte, kann die Emission der
PACC im Komplex durch einen Energieakzeptor modifiziert werden,
der in unmittelbare Nähe
mit der PACC gebracht wird, indem der Energieakzeptor an den Komplex
gebunden wird, der aufgrund der Gegenwart des Analyten entsteht.
Wenn der Energieakzeptor fluoreszierend ist, ändert sich üblicherweise die Wellenlänge der
Emission. Wenn der Energieakzeptor nicht fluoreszierend ist, wird
die Chemolumineszenz üblicherweise
gequencht, wenn sich die PACC an den Komplex bindet.
-
In
einem weiteren Verfahren werden ein Photosensibilisator und die
PACC zwischen dem Lösungskörper des
Testmediums und einer Oberfläche
aufgeteilt (siehe vorliegende Anmeldung). Diese Aufteilung hängt von
der Menge an Analyt ab, die in der zu analysierenden Probe vorhanden
ist, wobei sich der Photosensibilisator üblicherweise an ein sbp-Element
bindet. Die Photosensibilisator-Moleküle, die sich nicht mit der
Oberfläche
assoziieren, produzieren Singulett-Sauerstoff, der die PACC nicht
erreichen kann, bevor der Zerfall im wässrigen Medium erfolgt. Wenn
sich jedoch sowohl der Photosensibilisator als auch die PACC mit
der Oberfläche
assoziieren, da ein Komplex aufgrund der Gegenwart des Analyten
entsteht, kann der durch Bestrahlung des Photosensibilisators erzeugte
Singulett-Sauerstoff die PACC vor dem Zerfall aktivieren. In diesem Verfahren
kann die Menge des eingesetzten Photosensi bilisators deutlich geringer
sein als in der obigen Verwendung des Photosensibilisators ohne
daran gebundenes sbp-Element.
-
Man
erkennt, dass diese Tests ein geeignetes Verfahren zum Detektieren
und Messen einer Vielzahl von Analyten in einfacher, wirkungsvoller
und reproduzierbarer Weise bereitstellen, wobei visuelle Kontrolle durchgeführt oder
herkömmliche
Geräte
eingesetzt werden können,
um die während
der Reaktion erzeugte Lichtmenge zu messen.
-
Wenn
sich der Photosensibilisator aufgrund der Gegenwart von Analyt mit
der Oberfläche
assoziiert, wird er üblicherweise
mit einem sbp-Element assoziiert. Dies kann in unterschiedlicher
Weise erfolgen. Der Photosensibilisator kann eine Funktionalität zur Bindung
an ein sbp-Element enthalten, oder das sbp-Element kann die Funktionalität zur Bindung
an den Photosensibilisator enthalten. Die Bindung kann durch direkte
Bindung zwischen den zwei Molekülen
erreicht werden, oder es kann eine Linkergruppe zwischen dem sbp-Element
und dem Photosensibilisator vorgesehen sein. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann der Photosensibilisator an ein Teilchen gebunden oder in dieses
inkorporiert sein, an welchem Teilchen auch ein sbp-Element gebunden
ist. In beiden Fällen
kann sich das sbp-Element an den Analyten binden. Der Photosensibilisator
kann in das Teilchen inkorporiert sein, wenn er in zumindest einer
Phase des Teilchens löslich ist.
Der Photosensibilisator kann an das Teilchen gebunden sein, wenn
er nicht darin inkorporiert ist. Zu diesem Zweck wird der Photosensibilisator
oder das Teilchen oder eine Komponente davon funktionalisiert, um
ein Mittel zur Bindung des Photosensibilisator und des Teilchens
bereitzustellen. Für
Teilchen, die Öltröpfchen oder Lipid-Doppelschichten
sind, kann der Photosensibilisator durch Bindung an eine lange Kohlenwasserstofkette an
das Teilchen gebunden werden, welche Kette mit der Teilchenzusammensetzung
verträglich
ist. Häufig
werden zumindest eine, vorzugsweise zwei, Kohlenwasserstoffketten
mit 8 bis 20 oder mehr C-Atomen eingesetzt.
-
Wenn
das Teilchen ein Tröpfchen
eines Fluorkohlenstoffs ist, kann der Photosensibilisator fluoriert werden,
um die Löslichkeit
zu verbessern und Austausch zu verrin gern; die zur Verknüpfung dienende
Kohlenwasserstoffkette wird vorzugsweise durch eine Fluorkohlenstoffkette
ersetzt. Bei Silikonteilchen ist der Photosensibilisator an ein
Polysiloxan gebunden. Üblicherweise
ist es wünschenswert,
die Ladung und Polarität des
Photosensibilisators zu minimieren, sodass er sich innerhalb des
nicht-wässrigen
Abschnitts des Teilchens befindet. Wie oben erwähnt, ist das Verfahren, das
den an ein sbp-Element gebundenen Photosensibilisator vorsieht,
hierin ausführlich
beschrieben.
-
Wie
oben erwähnt,
ist die PACC "mit
einem sbp-Element assoziiert" und
funktioniert somit als Marker. Der Ausdruck "mit einem sbp-Element assoziiert" bedeutet Folgendes: Üblicherweise
erfolgt die Assoziation der PACC und des sbp-Elements durch kovalente
Bindung. Dieses Markerreagens kann jedoch außerdem ein suspendierbares
Teilchen umfassen, an das die PACC gebunden ist oder in das die
PACC nichtkovalent inkorporiert ist. Das suspendierbare Teilchen
besitzt auch ein daran gebundenes sbp-Element. Dieses sbp-Element kann
sich im Allgemeinen an den Analyten oder an ein sbp-Element binden,
das sich an den Analyten binden kann. Wenn ein anderes sbp-Element
eingesetzt wird und sich auch an den Analyten binden kann, ergibt
sich eine Sandwichtest-Arbeitsvorschrift. Das an die PACC gebundene
sbp-Element kann
auch zum Analyten analog sein, in welchem Fall sich eine kompetitive
Test-Arbeitsvorschrift ergibt.
-
Wenn
ein Photosensibilisator eingesetzt wird, dient dieser dazu, die
PACC zu aktivieren, wenn das die obigen Reaktanden enhtaltende Medium
bestrahlt wird. Das Medium wird mit Licht bestrahlt, dessen Wellenlänge ausreichende
Energie aufweist, um den Photosensibilisator in einen angeregten
Zustand überzuführen, in
dem er molekularen Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff aktivieren
kann. Bei der Bindung an ein sbp-Element kann die Photosensibilisator-Konzentration
sehr niedrig sein, häufig
10–6 bis
10–12 M
oder weniger. Wenn der Photosensibilisator ungebunden ist, liegt
er häufig
in einer Konzentration vor, die ausreicht, um eine große Lichtmenge
zu absorbieren, üblicherweise
zumindest 0,1 %, vorzugsweise zwischen 1 und 80 %.
-
Der
angeregte Zustand des Photosensibilisators ist üblicherweise der niedrigste
Triplett-Zustand und liegt bei um zumindest 25 kcal/Mol, vorzugsweise
zumindest 23 kcal/Mol, höherer
Energie als der Grundzustand. Im Allgemeinen wird das Medium mit
Licht mit einer Wellenlänge
von etwa 300 bis 1200 nm, üblicherweise
450 bis 950 nm, vorzugsweise 550 bis 800 nm, bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer
hängt von
der Lebensdauer der aktivierten PACC, der Lichtintensität und der
gewünschten
Emissionsintensität
ab. Für
kurzlebige aktivierte PACCs kann die Dauer weniger als 1 s, üblicherweise
1 ms, unter Umständen
1 μs, sein,
wenn ein starkes Blitzlicht oder ein Laser eingesetzt wird. Bei
langlebigeren aktivierten PACCs kann die Bestrahlungsdauer länger sein
und eine weniger intensive konstante Lichtquelle eingesetzt werden.
Im Allgemeinen sollte die gesamte Lichtintensität während der Bestrahlungsdauer
ausreichen, um zumindest 0,1 %, vorzugsweise zumindest 30 %, am
bevorzugtesten 100 %, der Photosensibilisator-Moleküle zumindest
einmal anzuregen.
-
Die
Lumineszenz oder das Licht, das in jeder der obigen Vorgangsweisen
erzeugt wird, kann visuell, fotografisch, aktinometrisch, spektralphotometrisch
oder auf beliebige andere geeignete Weise gemessen werden, um die
Menge zu bestimmen, die mit der Menge an Analyt im Medium in Beziehung
steht.
-
Ein
Helium-Neon-Laser ist eine kostengünstige Lichtquelle zur Anregung
bei 632,6 nm. Photosensibilisatoren, die Licht bei dieser Wellenlänge absorbieren,
sind mit der Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers kompatibel
und sind daher hierin besonders gut geeignet. Andere Lichtquellen
sind beispielsweise andere Laser, wie z.B. Argon, YAG, He/Cd und
Rubin; Photodioden; Quecksilber-, Natrium- und Xenon-Dampflampen; Glühlampen,
wie z.B. Wolfram und Wolfram/Halogen; und Blitzlicht.
-
Ein
weiteres Verfahren zum Bestimmen eines Analyten umfasst (a) das
gleichzeitige oder vollständig oder
teilweise aufeinander folgende Kombinieren (1) eines Mediums, von
dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) eines Markierungsreagens,
das ein erstes Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element)
gebunden an eine Verbindung umfasst, die bei Umsetzung mit Singulettsauerstoff
zur Chemolumineszenz fähig
ist, und (3) eines insolubilisierten Reagens, das einen fluo reszierenden
Energieakzeptor umfasst, der an ein zweites sbp-Element gebunden
ist oder gebunden werden kann, unter Bedingungen, worin ein sbp-Element-Komplex,
der das Markierungsreagens umfasst, in Bezug auf das Vorhandensein
von Analyt im Medium gebildet wird und Energie von der chemolumineszierenden
Verbindung den Fluoreszenzenergieakzeptor anregen kann, (b) das
Anregen der Verbindung mit Licht, und (c) das Untersuchen des Testmediums auf
ein Signal, wobei dessen Vorhandensein oder Intensität mit der
Analytmenge im Medium in Beziehung steht.
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung können an die meisten Tests mit
sbp-Elementen angepasst werden, beispielsweise Ligand-Rezeptor-,
z.B. Antigen-Antikörper-Reaktionen,
Polynucleotid-Bindungstests usw. Die Tests können homogen oder heterogen,
kompetitiv oder Sandwich-artig sein. In einem homogenen Test kann
die Probe – falls
erforderlich – vorbehandelt
werden, um unerwünschte
Materialien zu entfernen. Die immunologische Reaktion für einen
Sandwich-Test umfasst üblicherweise
ein sbp-Element, z.B. einen Antikörper, der komplementär zum Analyten
und an die PACC gebunden ist; ein zweites sbp-Element, z.B. Antikörper, der
auch komplementär
zum Analyten ist; und die Probe von Interesse. In einer kompetitiven
Arbeitsvorschrift kann die PACC mit einem sbp-Element, das analog
zum und üblicherweise
ein Derivat des Analyten ist, oder mit einem sbp-Element, das komplementär zum Analyten
ist, z.B. Antikörper,
assoziiert werden.
-
Die
PACC kann entweder alleine oder assoziiert mit einem Energieakzeptor
eingesetzt werden. Die Fähigkeit
der durch eine aktivierte PACC hervorgerufenen Lumineszenz, den
Energieakzeptor zu aktivieren, kann durch die Bindung der zwei sbp-Elemente bestimmt
sein oder sich aus der relativ hohen Konzentration des Energieakzeptors
in der Nähe
der aktivierten PACC ergeben, worin die Konzentration üblicherweise
zumindest im Mikromol-, noch häufiger
zumindest im Millimol-Bereich liegt. Wenn die PACC an ein sbp-Element gebunden
ist, kann hingegen ihre Konzentration recht niedrig sein, häufig 10–5 bis
10–15, üblicherweise
10–8 bis 10–14,
und die Detektion ihres Ausmaßes
in homogener Lösung
ohne Trennung erfolgen, mit der Maßgabe, dass die Lumineszenzintensität modifiziert
ist, wenn sich die PACC in einem Bindungskomplex befindet.
-
In
einem heterogenen Test wird eine Probe, die vermutlich einen Analyten
enthält,
der ein sbp-Element ist, mit einem Reagens kombiniert, das aus einem
komplementären
sbp-Element besteht, das an einen Träger gebunden ist, der eine
Oberfläche
oder ein Teilchen mit der PACC sein kann. Ein mit einem weiteren
sbp-Element assoziierter Energieakzeptor kann auch eingesetzt werden,
worin das sbp-Element entweder komplementär (Sandwich) oder analog (kompetitiv)
zum Analyten ist. Diese Materialien werden im Allgemeinen entweder
gleichzeitig oder zur Gänze
oder teilweise nacheinander kombiniert. Der Träger wird dann von der flüssigen Phase
abgetrennt und entweder die feste oder die flüssige Phase auf Gegenwart von
Lumineszenzenergie untersucht, üblicherweise
durch Bestrahlen der jeweiligen Phase und Messen der emittierten
Lichtmenge.
-
Ein
Test auf den Analyten erfolgt normalerweise in wässrigem gepuffertem Medium
bei mittlerem pH-Wert, im Allgemeinen bei jenem, der für optimale
Testsensitivität
sorgt. Wie oben erläutert
kann der Test entweder ohne Trennung (homogen) oder unter Trennung
(heterogen) der Testkomponenten oder -produkte durchgeführt werden.
-
Das
wässrige
Medium kann nur Wasser sein oder 0,01 bis 80 oder mehr Vol.-% eines
Co-Lösungsmittels
enthalten. Der pH-Wert für
das Medium liegt üblicherweise
im Bereich von etwa 4 bis 13, noch häufiger im Bereich von etwa
5 bis 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Der pH-Wert
ist üblicherweise
ein Kompromiss zwischen optimaler Bindung der Bindungselemente und
dem pH-Optimum für
andere Reagenzien des Tests (z.B. Teile des Signal-erzeugenden Systems).
Beispielsweise erfordert unter Umständen die aktiverte PACC einen
bestimmten pH-Bereich, um zwecks Erzeugung von Lumineszenz zu zerfallen.
-
Es
können
verschiedene Puffer eingesetzt werden, um den gewünschten
pH-Wert zu erreichen und ihn während
der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat,
Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils eingesetzte
Puffer ist für
die Erfindung nicht entscheidend, doch es kann in einem bestimmten
Test ein konkreter Puffer vorzuziehen sein.
-
Zur
Durchführung
des Tests herrschen normalerweise moderate Temperaturen und während der Messdauer üblicherweise
konstante Temperaturen, vorzugsweise Raumtemperatur. Die Inkubationstemperaturen
reichen normalerweise von etwa 5 °C
bis 99 °C, üblicherweise
von etwa 15 °C
bis 70 °C,
noch häufiger 20 °C bis 45 °C. Die Temperaturen
während
der Messungen reichen im Allgemeinen von etwa 10 °C bis 70 °C, noch häufiger von
etwa 20 °C
bis 45 °C,
noch häufiger
von 20 °C
bis 25 °C.
In einigen Fällen
erfordern die aktivierten PACC möglicherweise
Erhitzen auf 100 °C,
um zwecks Erzeugung von Lumineszenz zu zerfallen.
-
Die
Konzentration des zu untersuchenden Analyten reicht im Allgemeinen
von etwa 10–5 bis
10–17 M, noch
häufiger
von etwa 10–6 bis
10–14 M. Überlegungen,
z.B. ob der Test qualitiativ, semiquantitativ oder quantitativ ist,
das jeweilige Detektionsverfahren und die Konzentration des Analyten
von Interesse, bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen
Reagenzien.
-
Während die
Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Testmedium im Allgemeinen
durch den Konzentrationsbereich von Interesse des Analyten bestimmt
werden, wird die Endkonzentration für jedes der Reagenzien normalerweise
empirisch bestimmt, um die Sensititivät des Tests im gesamten Bereich
zu optimieren. Eine signifikante Variation der Konzentration des
Analyten sollte für
eine präzise
messbare Signaldifferenz sorgen.
-
Während die
Reihenfolge der Zugabe stark variieren kann, gibt es je nach Beschaffenheit
des Tests verschiedene Präferenzen.
Die einfachste Reihenfolge der Zugabe – insbesondere für einen
homogenen Test – ist
die gleichzeitige Zugabe aller Materialien. Alternativ dazu können die
Reagenzien zur Gänze
oder teilweise nacheinander kombiniert werden. Gegebenenfalls kann
ein Inkubationsschritt nach dem Kombinieren der Reagenzien vorgesehen
sein; er dauert im Allgemeinen etwa 30 s bis 6 h, noch häufiger etwa
2 min bis 1 h.
-
In
einem homogenen Test können
alle Reagenzien nach ihrem Kombinieren auf Wunsch inkubiert werden.
Dann wird die Kombination bestrahlt und das resultierende emittierte
Licht gemessen. Das emittierte Licht steht in Beziehung zur Analytenmenge
in der untersuchten Probe. Die Mengen der hierin in einem homogenen Test
eingesetzten Reagenzien hängen
von der Beschaffenheit des Analyten ab.
-
Die
folgenden Tests dienen zur Veranschaulichung. Die unten angeführte Tests
H und I veranschaulichen die vorliegende Erfindung sowie zwei Möglichkeiten,
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
ohne Durchführung
allzu vieler Experimente einzusetzen. Man beachte, dass die Auswahl
von Analyten, Photosensibilisatoren, PACCs, Oberflächen, Teilchen
und Reaktionsbedingungen in den folgenden Beispielen den Fachleuten
in Bezug auf die vorliegende Offenbarung nahe gelegt wird.
-
In
den folgenden Tests werden Komponenten in einem vorwiegend wässrigen
Medium mit pH 6 bis 8,5 kombiniert.
- A. In einem
Test auf HCG wird eine Harnprobe mit (1) Antikörper gegen HCG, gebunden an
1 μm-Latexteilchen
und eingefärbt
mit dem Photosensibilisator Kupferphthalocyanin, und (2) einem Antikörper gegen
ein getrenntes, nicht-überlappendes
Epitop von HCG, gebunden an die PACC 4, kombiniert. Nach der Inkubation
der Suspension über
30 min werden die Teilchen durch Zentrifugation vom Medium abgetrennt,
gewaschen und mit 300-nm-Licht bestrahlt. Die Intensität des emittierten
Lichts nach der Bestrahlung steht in Beziehung zum HCG-Gehalt in
der Probe. Die abgetrennten Teilchen können direkt bestrahlt oder
vor der Bestrahlung in einem wässrigen
oder nichtwässrigen
Lösungsmittel
suspendiert werden.
- B. Bei einer Durchführungsart
des Tests auf HCG in Serum, der A ähnelt, werden die Latexperlen,
die verwendet werden, mit dem Photosensibilisator Kupferphthalocyanin
gefärbt,
und nach Inkubation werden sie vom Medium abgetrennt und dann mit
Licht mit 600 nm bestrahlt. Die Intensität des ausgesandten Lichts steht
mit der Menge an HCG in der Probe in Beziehung.
- C. In einem Test auf Digoxin in Serum wird die PACC, an Digoxigenin
konjugiertes Luminol, mit der Probe in einem Polystyrolnapf inkubiert,
der mit Tetradecylphthalo cyanin eingefärbt wurde. Die Oberfläche des Napfs
ist mit einem Antikörper
gegen Digoxin bestrichen. Nach der 30-minütigen Inkubation und der Entfernung
des Testmediums wird der Napf mit 600 nm-Licht bestrahlt. Es ist
vorzuziehen, vor der Bestrahlung eine Basenlösung zuzusetzen (pH 10-12).
Die Intensität
des nach Bestrahlung emittierten Lichts ist umgekehrt proportional
zur Konzentration von Digoxin in der Probe.
- D. In einem Test auf Albumin in Harn wird die Probe mit (1)
einem Antikörper
gegen Albumin (mit der PACC markiert) und (2) einem Antikörper gegen
Albumin, der gegen ein nicht-überlappendes
Albuminepitop gerichtet, das mit Energieakzeptor markiert ist, kombiniert: Der Photosensibilisator Methylenblau
ist im Testmedium enthalten. Das Medium wird 10 min lang inkubiert und
dann mit 600 nm-Licht bestrahlt. Die Intensität des durch den Energieakzeptor
nach Abschluss der Bestrahlung emittierten Lichts (etwa 500 nm)
ist direkt proportional zur Menge an Albumin in der Probe.
- E. In einem Test auf Thyroxin in Serum wird die Probe mit an
Latexperlen gebundenem Thyroxin kombiniert, worin die PACC 10 inkorporiert
wurde, worin X2 = N(CH3)2 ist. Antikörper gegen Thyroxin, gebunden
an den Sensibilisator, Diodosin, ist im Testmedium enthalten. Nach
10-minütiger
Inkubation wird das Medium mit 550-nm-Licht bestrahlt und das nach
Abschluss der Bestrahlung emittierte Licht gemessen. Die emittierte Lichtintensität ist umgekehrt
proportional zur Menge an Thyroxin in der Probe.
- F. In einem Test auf eine Target-Polynucleotidsequenz in einer
DNA umfassenden Probe wird ein 25-Basen-Oligonucleotid, das komplementär zur Targetsequenz
und an PACC 23 konjugiert ist, die 9-Phenylmethylidenxanthan ist,
mit der Probe vermischt. Das Medium wird dann auf 75 °C erhitzt
und auf 55 °C
abgekühlt,
um Hybridisierung des Oligonucleotids mit jeder vorhandenen Targetsequenz
zu ermöglichen.
Der Energieakzeptor und Interkalator, Acridinorange, und der Photosensibilisator,
Phthalocyanintetrasulfonsäure,
sind in der Hybridisierungslösung
vorhanden oder können
nach Abschluss der Hybridisierungsreaktion zugegeben werden. Die
Lösung
wird dann mit 600-nm-Licht bestrahlt und die Intensität des von
Acridinorange nach Abschluss der Bestrahlung emittierten Lichts
(etwa 500 nm) gemessen. Die Lichtintensität ist direkt proportional zur
Gegenwart der Targetsequenz.
- G. In einem Test auf eine Target-Polynucleotidsequenz in einer
DNA enthaltenden Probe wird ein 25-Basen-Oligonucleotid, das komplementär zur Targetsequenz
und mit dem Photosensibilisator, Phthalocyanin, markiert ist, dazu
gebracht, an das Target zu hybridisieren (siehe E). Eine Verbindung,
die sich an den kleineren Strang doppelstrangiger DNA bindet, Hoechst
Farbstoff 33258, gebunden an PACC 20, N-Methyl-9-phenylmethylidenacridan, ist
im Medium enthalten oder wird nach Hybridisierung zugesetzt. Das
Medium wird dann mit 600 nm-Licht bestrahlt und das nach Abschluss
der Bestrahlung emittierte Licht gemessen. Die emittierte Lichtintensität ist direkt
proportional zur Menge der in der Probevorhandenen Targetsequenz.
- H. In einem Test auf Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAg) in Serum
wird die Probe mit (1) 150 nm Latexteilchen (gefärbt mit der PACC und beschichtet
mit Antikörpern
gegen HBsAg) und (2) mit 150 nm Latexperlen (gefärbt mit dem Photosensibilisator
Tetraphenylporphyrin und beschichtet mit Antikörpern gegen HBsAg) kombiniert.
Nach einstündiger
Inkubation des Gemisches wird die Suspension mit 550 nm Licht bestrahlt.
Nach Abschluss der Bestrahlung wird die emittierte Lichtintensität gemessen
und zur Menge an HBsAg in der Probe in Beziehung gesetzt.
- I. In einem Test auf HBsAg in Vollblut wird die Vorgangsweise
aus H wiederholt, außer,
dass die PACC enthaltenden Latexperlen durch Latexperlen ersetzt
sind, die mit PACC 23 eingefärbt
sind, die 9-Phenylmethylidenxanthan und der Energieakzeptor ist.
-
-
Die
Intensität
des bei 610 bis 620 nm emittierten Lichts wird gemessen und zur
Konzentration von HBsAg in der Probe in Beziehung gesetzt.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthaltende Sets zur einfachen Durchführung des Testverfahrens, das
die Gegenwart oder Menge eines Analyten in einer Probe bestimmt,
die vermutlich den Analyten enthält.
Um die Vielseitigkeit der Erfindung zu erhöhen, können die Reagenzien in verpackter
Kombination, im gleichen oder in getrennten Behältern, bereitgestellt werden,
sodass das Verhältnis
der Reagenzien die Optimierung des Verfahrens und Tests ermöglicht.
Die Reagenzien können in
getrennten Behältern
vorliegen, oder es können
verschiedene Reagenzien in einem oder mehreren Behältern kombiniert
sein; dies hängt
von der Kreuzreaktivität
und Stabilität
der Reagenzien ab.
-
Ein
Typ von Set umfasst (1) eine Zusammensetzung mit einem suspendierbaren
Teilchen, das eine Chemolumineszenzverbindung enthält, wobei
das Teilchen ein daran gebundenes sbp-Element aufweist, und (2)
einen Photosensibilisator, der mit einem Teilchen assoziiert ist,
an das ein sbp-Element gebunden ist. Das Set kann überdies
andere getrennt verpackte Reagenzien zur Durchführung eines Tests, einschließlich Zusatzreagenzien
usw., enthalten.
-
Die
chemolumineszierende Verbindung kann eine Olefingruppe und einen
oder mehrere Elektronendonor-Substituenten in Konjugation mit der
Olefingruppe enthalten.
-
Die
chemolumineszierende Verbindung kann aus der aus 9-Alkyliden-N-methylacridanen,
Enolethern und Enaminen bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
-
Der
Photosensibilisator oder die chemolumineszierende Verbindung kann
mit einem suspendierbaren Teilchen assoziiert sein, das die Oberfläche umfasst.
-
Eine
Oberfläche
kann auch dazu gebracht werden, in große Nähe zu kommen, und die Oberfläche befindet
sich auf einem suspendierbaren Teilchen, und das Teilchen ist aus
der aus Latexteilchen, Lipid-Doppelschichten, Öltröpfchen, Silicateilchen, Metallsolen
und Farbstoffkristalliten bestehenden Gruppe ausgewählt.
-
Der
Photosensibilisator kann ein aus der aus Methylenblau, Diodeosin,
Porphryrinen und Phthalocyaninen bestehenden Gruppe ausgewählter Farbstoff
sein.
-
Sowohl
mit dem Photosensibilisator als auch mit der chemolumineszierenden
Verbindung kann ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp)
assoziiert sein, und die sbp-Elemente sind unabhängig voneinander aus der aus
Liganden, Rezeptoren, Polynucleotiden und Polynucleotid-Bindungsmitteln
bestehenden Gruppe ausgewählt.
-
Die
vorliegende Anmeldung stellt ein Set bereit, das in abgepackter
Kombination (1) eine Zusammensetzung, die ein suspendierbares Teilchen
umfasst, das eine chemolumineszierende Verbindung umfasst, wobei
an das Teilchen ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp)
gebunden ist, und (2) ein zweites suspendierbares Teilchen umfasst,
das einen Photosensibilisator umfasst, der fähig ist, in seinem angeregten Zustand
Sauerstoff in seinen angeregten Zustand anzuregen, wobei an das
zweite Teilchen ein sbp-Element gebunden ist.
-
BEISPIELE
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden veranschaulichenden
Beispiele näher
erläutert.
Die hierin angeführten
Teile und Prozentsätze
beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht. Die
Temperaturen sind in °C
angegeben.
-
Abkürzungen:
-
- AbF: Monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen
Fluorescein
- AbIF: Monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen Intrinsic Factor
- B12-LC25-F:
Vitamin B12, verbunden mit Carboxyfluorescein
(F) mittels einer Linkergruppe mit einer Länge von 25 Atomen, d.h.: HN(CH2)6NHCOOH2OCH2CONH(CH2)6NHCOOH2NHCO
- BA-C18: 4-(N,N-Dioctadecylcarbamidomethoxy)benzal-9-methylacridan
- t-Bu: t-Butyl
- TFA: Trifluoressigsäure
- Biotin-LC21-F
- BSA: Rinderserumalbumin
- Chl-a: Chlorophyll-a
- D-H2O: Entionisiertes Wasser
- DPPC: Dipalmitoylphosphatidylcholin
- DPPG: Dipalmitoylphosphatidylglycerin
- DPPE: Dipalmitoylphosphatidylethanolamin
- EDAC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
- F: Fluorescein
- F-NHS: N-Hydroxysuccinimidester von 6-Carboxyfluorescein
- F-LC21NH2: Carboxyfluorescein,
an das die Linkergruppe HN(CH2)6NHCOOH2OCH2CONH(CH2)6NH2 gebunden
ist
- HCG: Human-Chorion-Gonadotropin
- Lip: Liposom
- nC10: Tetra(n-decyl)phthalocyaninaluminiumchlorid-Komplex
- OD: Öltröpfchen
- OD/BA-C18: BA-C18 enthaltende Öltröpfchen
- PB: Polystyrol-Perlen
- PB/BA-C18: BA-C18 enthaltende
PB
- PB/nC10: Tetra-(n-decyl)aluminiumphthalocyanin
enthaltende PB
- PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,02 M NaPi, 0,14 M NaCl/pH
7,2
- Pi: Phosphat
- Sulfo-NHS: Sulfo-N-hydroxysuccinamid
- TSH: Thyroid-stimulierendes Hormon oder Thyrotropin-Hormon
- SATA: S-Acetylthioglykolsäure-N-hydroxysuccinimidester
- RLU: Relative Lichteinheiten
- Ab1 (HCG): Monoklonaler Anti-HCGβ-Antikörper (12A8)
- Ab2 (HCG): Monoklonaler Anti-HCGα-Antikörper (9D7)
- Ab1 (TSH): Monoklonaler Anti-TSHβ1-Antikörper (35)
- Ab2 (TSH): Monoklonaler Anti-TSHβ2-Antikörper (9G3)
(Beachte:
Für Ab1 (TSH) und Ab2 (TSH)
sind Ab1 und Ab2 Antikörper gegen
die β-Kette von TSH, für zwei unterschiedliche
Epitope.)
- NHS: N-Hydroxysuccinimid
- IF: Intrinsic Factor
- DMSO: Dimethylsulfoxid
- Avidin-PB/BA-C18: Kovalent an Avidin
gebundene PB/BA-C18
- AbF-PB/nC10:
mit AbF beschichtete PB/nC10
- DMF: Dimethylformamid
- DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
- TEA: Triethylamin
- DC: Dünnschichtchromatographie
- TNBSA: 2,4,6-Trinitrobenzolsufonsäure
- Dig-CMO: O-Carboxymethyloxim von Digoxigenin-3-on
- BGG: Rinder-β-Globulin
- Biotin-LC7-NHS: Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanat
-
Alle
monoklonalen Antikörper
wurden durch Standard-Hybridzelltechnologie erzeugt. Das geeignete Immunogen
wurde in einen Wirt, üblicherweise
eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier, injiziert, und nach einem
ausreichenden Zeitraum wurden die Milzzellen aus dem Wirt erhalten.
Alternativ dazu wurden unsensibilisierte Zellen aus dem Wirt isoliert
und direkt in vitro mit dem Immunogen sensibilisiert. Hybridzellen
wurden durch Fusionieren der obigen Zellen mit der geeigneten Myelom-Zelllinie
und Kultivieren der fusionierten Zellen gebildet. Die durch die
kultivierten Hybridzellen produzierten Antikörper wurden hinsichtlich ihrer
Bindungsaffinität
an das jeweilige Antigen, z.B. TSH oder HSG, gescreent. Einige Screening-Techniken
kamen dabei zum Einsatz, z.B. ELISA-Screens. Es wurden ausgewählte Fusionen
anschließend
rekloniert.
-
Beispiel 1
-
Test auf Vitamin B12
-
Herstellung von B12-LC25-F-Konjugat
-
B12-LC25-F-Konjugat
mit einem Spacerarm mit einer Länge
von 25 Atomen (siehe unten) wurde hergestellt, indem durch Umsetzen
des B12-Moleküls mit Methylisocyanatoacetat
(reagiert mit der Hydroxylgruppe von Ribose im B12-Molekül, wodurch
eine stabile Carbamat-Bindung entsteht) Carboxylgruppen in das B12-Molekül
eingeführt
wurden, gefolgt von Basenhydrolyse des Methylesters, um die Carboxylgruppe
zu erzeugen. Die eingearbeitete Carboxylgruppe an der 5'-OH-Stelle wurde
in den NHS-Ester
von B12 umgewandelt und dann mit dem Fluoresceinamin
F-LC21-NH2 umgesetzt,
um das Endprodukt B12-LC25-F
zu ergeben.
-
A.
Syntheseschema für
die 21-atomige Kette auf 5-Carboxyfluorescein
-
1,2
g (0,0056 Mol) des monogeschützten
Diamins 1C1 wurden in 25 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und dieser
gerührten
Lösung
0,64 g (0,0056 Mol) Diglykolsäureanhydrid
1A1 zugesetzt; die Reaktion wurde 5 h lang bei Umgebungstemperatur
stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und mit 50
ml Wasser, 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde
mit 0,1 N HCl (50 ml), Wasser (2 × 50 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt, um
1,35 g 1A2 zu erhalten.
- 1H 100 MHz
(CD3OD) δ 4.0,
3.85 (2S, 4, O-CH2-CO) w 3.0, 2.82 (2t,
4, NCH2), δ 1.4 (S, CH3)
-
500
mg (1,33 mmol) 5-Carboxyfluorescein, 1A3, (getrocknet bei 80 °C über P2O5 in einem Vakuum
von 0,05 mm, 16 h) wurden in 20 ml wasserfreiem Dimethylformamid
gelöst.
Der gerührten
Lösung
wurden 280 mg (1,46 mmol) 1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid
und 168 mg (1,46 Mol) N-Hydroxysuccinimid zugesetzt. Nach 16-stündigem Rühren wurden
400 mg (1,85 mmol) Mono-t-Boc-1,6-diaminohexan zugesetzt und das
Gemisch weitere 4 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das
resultierende Gemisch wurde zu einer dicken Lösung eingeengt und in 1:9 Methanol-Ethylacetat (100
ml) gelöst
sowie mit Wasser (3 × 50
ml), 0,1 N HCl (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der
Rückstand
wurde auf Analtech 1000 μm,
20 × 20
cm Kieselgel GF-Platten unter Verwendung von 0,5 % Essigsäure und
10 % Methanol in Dichlormethan gereinigt. Die reinen Banden wurden
vereinigt und mit 1:1 Methanol/Dichlormethan extrahiert, eingeengt
und der Rückstand
in der minimalen Menge an Methanol gelöst und in Wasser eingetropft.
Das Gemisch wurde anschließend
zentrifugiert und der Feststoff im Vakuum getrocknet, wobei 83 %
1A4 erhalten wurden.
-
3,5
g (0,0064 Mol) Mono-t-Boc-1,6-diaminohexyl-5-carbonylfluorescein
1A4 (getrocknet bei 90 °C über P2O5 in einem Vakuum
von 0,05 mm, 16 h) wurden mit 40 ml Dichlormethan/Trifluoressigsäure = 1:1
behandelt. Die Lösung
wurde in einem Eisbad durchmischt und nach 5 min das Lösungsmittel
abgedampft und der rohe Rückstand über Nacht
im Vakuum getrocknet.
-
42
mg Mono-t-Boc-1,6-diaminohexylglykolsäureamid 1A2, 22 mg (0,190 mmol)
N-Hydroxysuccinimid und
36,4 mg (0,190 mmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
wurden in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan kombiniert und 16 h lang
bei Umgebungstemperatur gerührt.
Die Lösung
der aktivierten Säure
wurde zu einer gerührten
Lösung
von 75 mg (0,127 mmol) des obigen 1,6-Diaminohexyl-5-carboxylfluorescein-Derivats,
10 ml wasserfreiem Dimethylformamid und 66 ml Triethylamin zugetropft.
Nach 1 h wurde die Reaktion in Wasser aufgenommen und mit Ethylacetat
extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (3 × 25 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet, eingeengt und auf einer 20 × 20 cm
1000 μm
Analtech Kieselgel GF-Platte unter Verwendung von 10 % Methanol,
0,5 % Essigsäure
in Dichlormethan gereinigt. Die reine Bande wurde isoliert, mit
Methanol/Dichlormethan extrahiert, eingeengt und im Vakuum getrocknet.
Der Rückstand
wurde in 4 ml Methanol aufgenommen und zu gerührter 0,1 N HCl (8 ml) zugetropft,
zentrifugiert und getrocknet, um 84 mg 1A5 mit einer Ausbeute von
84 % zu erhalten.
- 1H 500 MHz (CD3OD) δ 8.4
(d, 1, ArH, J =. 71 Hz) δ 8.17
(dd, 1, ArH, J = 8.0 Hz) δ 7.3
(d, 1, ArH, J = 8.0 Hz) δ 4.04
(d, 4.O-CH2-CO) δ 1.41 (S, 9, 3CH3)
- Analyse: ber. für
C42H52N4O11: C, 63.7; H, 6.6; N, 7.0 gef.: C, 63.56;
H, 6.64; N, 7.0
-
Dem
obigen, 21 Atome langen t-Boc-Amin von 5-Carboxyfluorescein (getrocknet
bei 80 °C über P2O5 in einem Vakuum
von 0,05 mm) wurden bei Umgebungstemperatur 5 ml Trifluoressigsäure zugesetzt.
Nach 5 min wurde die Säure
abgedampft und anschließend
im Vakuum bei 80 °C
getrocknet, um das Trifluoressigsäuresalz 1A6 zu erhalten.
- FAB-MS
C37H44N4O(M+H)+ 689
-
B.
Syntheseschema für
die Modifikation von S
12 an der O
5'-Position
des Riboserings mit einem mit 5-Carboxylfluorescein verbundenen
25-Atom-Spacer
-
25
mg (0,0185 mmol) Vitamin B12 (1B1) (48 h
lang bei 80 °C
getrocknet, 10 μl)
wurden in 1,25 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst. Dieser
Ausgangslösung
wurden 21,2 mg (0,185 mmol) Methylisocyanatacetat zugesetzt und
das Reaktionsgemisch 24 h lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen.
Das Reaktionsgemisch wurde in 10 ml einer gerührten Ethylacetat-Lösung eingetropft.
Das gefällte
Produkt wurde abzentrifugiert, dann in der minimalen Menge an Methanol
resuspendiert und erneut gefällt.
Dieses Material wurde auf einer präparativen Whatman PLC18F-Platte mit 1000 μm und 20 × 20 cm mittels Isopropanol:Wasser
= 2:8 als Eluent, umfassend 0,5 ml Essigsäure + 1 g NaCl pro 100 ml,
gereinigt. Rf = 625. Die Isolierung vom Absorptionsmittel ergab
den Methylester 1B2.
- (+)-FABM5(C67H93CON15O17P)
MG 1469,6; (M+H) 1470, (M-CN)+ 1444
-
40
mg (0,0272 mmol) des B12-O5'-Carbonylglycinmethylesters
1B2 wurden in 2,5 ml 2:1 Methanol:Wasser aufgenommen, mit Ammoniumhydroxid
auf pH 9,5 eingestellt und 16 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
- DC-Analyse
Whatman KC18F
- 2:8 = Isopropanol:Wasser, 0,5 % Essigsäure, 1 % NaCl, Rf = 0,79.
-
Das
Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockene eingeengt und das Produkt
unter Verwendung von zwei Whatman PLC18F-Platten
mit 1000 μm
und 20 × 20
cm mit demselben Eluenten wie oben isoliert. Die reine Bande wurde
mit Methanol extrahiert, der Extrakt eingeengt, in 2:7 = Methanol:Dichlormethan
gelöst,
filtriert und eingeengt. Der Rückstand
wurde in 4 ml Methanol gelöst
und zu 4 ml Ethylether zugetropft. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert
und bei 60 °C über P2O5, 0,5 mm, 16 h
lang getrocknet, um 28 mg von Produkt 1B3 zu ergeben.
- (+)-FAB-MS(C66H91CON15O17P) MG 1455,7; (M+H)+ 1456,
(M-CN)+ 1431
-
15
mg (0,013 mmol) B12O5'-Carbonylglycin
1B3, 3,66 mg (0,016 mmol) N,N-Dicyclohexylcarbodiimid, 1,95 mg (0,017
mmol) N-Hydroxysuccinimid wurden mit 5 ml was serfreiem Dimethylformamid
kombiniert und 16 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde zu einer gerührten Lösung von 13,6 mg (0,17 mmol)
21-atomigem Amin von 5-Carboxyfluorescein 1A6 in 2,02 mg (0,02 mmol)
Triethylamin in 4 ml trockenem Dimethylformamid zugetropft und 12
h lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
-
Das
rohe Reaktionsgemisch wurde im Vakuum bei 40 °C eingeengt und der Rückstand
in 2 ml Methanol aufgenommen, mit 6 ml Ethylether gefällt und
abzentrifugiert. Der Feststoff wurde auf einer Whatman PLC18F-Platte mit 1000 μm und 20 × 20 cm mittels Methanol:Wasser
= 7:3 als Eluent, umfassend 0,5 % Essigsäure gereinigt. Rf = 0,78. 37
% Ausbeute an 1B4.
- (+)-FAB-MS(C103H133CON19O25P), (M+H)+ 2125;
(M-CN)21 UV/max 360 (∊ 26.600),
50 (∊ 57.000), 550 (∊ 9.500).
-
II. Biotinylierung von
Anti-Intrinsic Factor-(AbIF-)Antikörpern
-
Die
monoklonalen Anti-Intrinsic Factor-Antikörper (AbIF)
wurden durch Standard-Hybridzelltechnologie gemäß dem Verfahren von Kohler
und Milstein, Nature 256, 495-497
(1975), hergestellt.
-
Unter
Verwendung von Biotin-LC7-NHS von Pierce
Chemical Co., Rockford, III, USA, wurden drei unterschiedliche Biotinylierungs-Niveaus
(AbIF:Biotin im Reaktionsgemisch = 1:10,
1:50 oder 1:200) durchgeführt.
AbIF lag in 0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl/pH
= 7,8 bei [IgG] = 2,5 mg/ml vor. Dieser Lösung wurde DMSO (1 % des Gesamtvolumens)
mit der erforderlichen Menge an Biotin-LC7-NHS
zugegeben und die Lösung
dann über
Nacht bei 4 °C
inkubiert. Schließlich
wurden die Reaktionsgemische auf Sephadex® G25
gereinigt und gründlich
gegen 0,05 M NaPi, 0,02 NaN3/pH 7,2 dialysiert.
Die biotinylierten Anti-Intrinsic Factor-Antikörper wurden tiefgefroren gelagert.
-
III. Herstellung von Teilchen
-
A. Materialien
-
- 175 nm Carboxylat-modifizierter Latex: Bangs Laboratories,
Inc., Carmel, IN 46032 USA;
- 38 nm Carboxylat-modofizierter Latex: Duke Scientific Corporation,
Palo Alto, CA 94303 USA;
- Ethylenglykol, Benzylalkohol, Benzonitril: Aldrich Chemical
Co.;
- Sephadex® G-25:
Pharmacia;
- nC10: Ultra Diagnostics Corporation,
Seattle, WA 98105, USA.
-
B. AbF-PB/nC10 1. 38 nm-Durchmesser-Teilchen
-
Eine
2,1 mM Lösung
von nC10 wurde in Benzylalkohol gebildet.
Ethylenglykol (16 ml) wurde in ein 20 ml-Glasfläschchen gefüllt und auf einer Laborheizplatte
erhitzt. Benzylalkohol (1,6 ml) wurde zugegeben und das Gemisch
magnetisch gerührt.
Die Stamm-Latexsuspension (2 ml, 38 nm Carboxylat-modifizierter
Latex mit 10 % Feststoffen) wurde zugegeben und das Gemisch 3 bis
4 min lang äquilibriert.
Die nC10-Lösung (0,4
ml) wurde in 100 μl-Aliquoten
langsam zugegeben. Das Erhitzen auf 100 °C wurde 5 min lang fortgesetzt;
anschließend
wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde
das Gemisch auf eine Säule
von Sephadex G-25 (2,5 × 15
cm), äquilibriert
mit 50 % wässrigem
Ethanol, aufgebracht. Die Latex enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt
und auf eine zweite, mit Wasser äquilibrierte
Sephadex G-25-Säule (2,5 × 35 cm)
aufgebracht. Der Latex wurde in einem Volumen von 30 ml eluiert.
-
2. 175 nm-Durchmesser-Teilchen
-
Eine
2,1 mM Lösung
von nC10 wurde in Benzylalkohol hergestellt.
Ethylenglykol (80 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt und
auf einer Laborheizplatte auf 110 °C erhitzt. Benzylalkohol (8
ml) wurde zugegeben und das Gemisch magnetisch gerührt. Die
nC10-Lösung
(2 ml) wurde zugegeben und unmittelbar danach Stamm-Latexsuspension
(10 ml, 175 nM Carboxylat-modifizierter Latex mit 10 % Feststoffen)
zugesetzt. Das Erhitzen wurde 10 min lang unter kräftigem Rühren bei
100 °C bis
110 °C fortgesetzt.
Der Kolben wurde dann in ein bei Raumtemperatur gehaltenes Bad gelegt,
um abzukühlen.
Nach dem Abkühlen
wurde das Gemisch mit demselben Volumen an Ethanol verdünnt und
sofort bei 15.000 U/min (Sorval, SA 600 Rotor) 2 h lang zentrifugiert.
Der blassblaue Überstand
wurde dekantiert und das Pellet unter Verwendung eines Badbeschallers
in 50 % wässrigem
Ethanol (20 ml) resuspendiert, um die Teilchen zu dispergieren.
Die Zentrifugation wurde 1 h lang bei 15.000 U/min wiederholt. Die Überstände wurden
dekantiert und das Pellet in Wasser resuspendiert. Nach einer letzten
Zentrifugation wurden die Pellets in Wasser bis zu einem Endvolumen
von 20 ml resuspendiert.
-
3. Die Bindung der Perlen
an AbF ist in Beispiel 3, Abschnitt V beschrieben.
-
C. Avidin – PB/BA-C18
-
175 nm-Durchmesser-Teilchen
-
Eine
10 mM Lösung
von BA-C18 wurde in Benzonitril gebildet.
Ethylenglykol (80 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt und
auf einer Laborheizplatte auf 100 °C erhitzt. Benzonitril (9 ml)
wurde zugegeben und das Gemisch magnetisch gerührt. Die Ba-C18-Lösung (1
ml) wurde zugegeben und unmittelbar danach Stamm-Latexsuspension (10 ml, 175 nM Latex
mit 10 % Feststoffen, s.o.) zugesetzt. Das Erhitzen wurde 5 min
lang unter kräftigem
Rühren
bei 100 °C
bis 110 °C
fortgesetzt. Der Kolben wurde dann in ein bei Raumtemperatur gehaltenes
Bad gehängt,
um abzukühlen.
Nach dem Abkühlen
wurde das Gemisch mit demselben Volumen an 50 % Ethanol verdünnt und
sofort bei 15.000 U/min (Sorval, SA 600 Rotor) 4 h lang zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert und das Pellet unter Verwendung eines Badbeschallers
in 50 % wässrigem Ethanol
(20 ml) resuspendiert, um die Teilchen zu dispergieren. Die Zentrifugation
wurde 1 h lang bei 15.000 U/min wiederholt. Die Überstände wurden dekantiert und das
Pellet in Wasser resuspendiert. Nach einer letzten Zentrifugation
wurden die Pellets in Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 ml resuspendiert.
-
Die
Bindung der Perlen an Avidin ist in Beispiel 3, Abschnitt VI beschrieben.
-
IV. Test-Arbeitsvorschrift
-
Der
Test erfolgte durch Vermischen von 100 μl B12-Kalibratoren
(ausgehend von einer ursprünglichen 10 μg/ml B12-Stammlösung
verdünnt,
10 μM KCN)
in Testpuffer (0,05 KPi, 0,1 % BSA, pH 7,5; das BSA war frei von
B12 und B12-Bindemittel)
mit 50 ml 2,2 ng/ml B12-LC25-F
und 50 μl
vorgemischtem 88 ng/ml Intrinsic Factor (IF), 8,8 μg/ml AbIF-Biotin. Diese Gemische wurden bei Raumtemperatur
15 min lang im Dunkeln inkubiert; dann wurden 0,75 ml 0,05 Tris-HCl,
0,05 NaPi, 0,15 M NaCl, 0,1 % Triton X-100/pH 8,2 Puffer, umfassend
1010 Perlen Avidin-PB/BA-C18 und
2,5 × 1011 Perlen AbF-PB/nC10, in jedes Röhrchen eingefüllt und
die Inkubation weitere 30 min lang durch Schütteln im Dunkeln bei Raumtemperatur
fortgesetzt. Schließlich
wurde jedes Röhrchen
1 min lang mit einer Halogenlampe als Lichtquelle beleuchtet, die
mit einem 650 nm-Cutoff-Filter ausgestattet war, und danach das
Chemolumineszenzlicht durch Integration 20 s lang mittels eines
Turner 20e-Luminometers gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst.
-
Beispiel 2
-
Test auf Digoxin
-
I. Herstellung von AbDig-Biotin
-
Monoklonale
Anti-Digoxin-Antikörper
(AbDig) wurden gemäß herkömmlicher Hybridzelllinien-Technologie
erzeugt und Antikörper
durch immobilisiertes Protein A gereinigt. Dann wurde das AbDig-Protein durch Vermischen des Antikörpers (etwa
2 – 2,5
mg/ml in 0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl/pH 7,8) und Biotin-LC7-NHS
(Pierce Chemical Co., Rockford, III, USA) (zuerst in DMF und einer
kleinen für
die Reaktion eingesetzten Aliquote solubilisiert) sowie dreistündiges Inkubieren
bei 4 °C
hergestellt. Im Reaktionsgemisch betrug das Molverhältnis der
Reaktanden Antikörper:Biotin-LC7-NHS
= 1:25. Das ungekoppelte Biotin wurde mittels Sephadex G-25-Säule entfernt.
Das fertige Konjugat wurde in 0,05 M NaPi, 0,001 % Thimerosal/pH
= 7,4 bei 4 °C
gelagert oder tiefgefroren.
-
II. Herstellung von Dig-LC9-F
-
Dieses
Reagens wurde in drei aufeinander folgenden Schritten hergestellt,
indem (1) F-NHS, (2) F-LC9-NH2 und
(3) Dig-LC9-F erzeugt wurden.
- A. Herstellung von F-NHS: 2 ml 100 mg/ml 6-Carboxyfluorescein
und 30,6 mg/ml NHS in DMF wurden 0,4 ml 275 mg/ml DCC zugegeben.
Das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Der entstehende Dicyclohexylharnstoff
wurde durch Filtration entfernt. Die Bildung von F-NHS wurde durch DC
auf Silicaplatten unter Verwendung von CH2Cl2:Methanol:Essigsäure = 85:15:1 als Lösungsmittelsystem überprüft. DMF
wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt (F-NHS)
unter reduziertem Druck weiter getrocknet und getrocknet bei 4 °C gelagert.
- B. Herstellung von F-LC9-NH2:
Zu 1,5 ml einer Lösung
von Bis-(3-aminopropyl)methylamin (LC9;
Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) in DMF wurden 1,2 ml 125
mg/ml F-NHS in DMF zugegeben, gefolgt durch Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht
unter Schütteln
im Dunkeln. Das Molverhältnis
von F-NHS:LC9 betrug 1:40. Anschließend wurde
das Reaktionsgemisch 1:20 mit 0,5 M NaPi/pH 5,0 verdünnt, der
pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von Phosphorsäure (1,0 M) auf 5,0 eingestellt
und das gesamte Gemisch auf eine BioRex-70®-Säule (2,5 × 10 cm; äquilibriert
in 0,5 M NaPi/pH 5,0) geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit
dem Ausgangspuffer gewaschen, bis das gesamte Bis-(3-aminopropyl)methylamin
entfernt war (überwacht
mittels TNBSA-Reaktion). Die Säule
wurde mit 0,001 M NaPi/pH 6,0 gewaschen, um die Verunreinigung 6-Carboxyfluorescein
zu entfernen. Das Waschen mit Puffer mit geringer Ionenstärke entfernte
nicht nur das 6-Carboxyfluorescein, sondern auch ein weiteres, nicht
identifiziertes Fluorescein, das Verunreinigungen enthält. Dann
wurde die Säule
mit D-H2O gewaschen, um die Salze zu entfernen.
Schließlich
wurde die Säule
mit 0,8 M NH4OH gestrippt. Ammoniumhydroxid
wurde durch Lyophilisierung entfernt. Nach Überprüfen der Reinheit wurde das
Produkt in getrocknetem Zustand bei –20 °C gelagert. An die Reaktion
schloss sich Papier-Elektrophorese, die auch die Reinheit des Produkts
kontrollierte (0,05 M NaPi/pH 5,8, 20 min lang unter Verwendung
des Paragon-Elektrophoresesystems), und DC (C18-Platten
unter Einsatz von 50 % Methanol in D-H2O
als Lösungsmittel).
- C. Herstellung von Dig-LC9-F: Eine Lösung mit
23,05 mg (0,05 mmol) Dig-CMO (hergestellt gemäß US-Patent 4.039.385, Beispiel
2, dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist), 50,35
mg (0,1 mmol) F-LC9-NH2 und
19,2 mg (0,1 mmol) ' EDAC
in 1,5 ml EMF/DMSO (5:1) als Lösungsmittel
wurde über Nacht
bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Dig-LC9-F
und Dig-CMO (wenn nicht umgesetzt) wurden durch Zugabe von 3 ml
D-H2O gefällt, abfiltriert und das Lösungsmittel
verworfen. Das abfiltrierte Material wurde in einem Lösungsmittelsystem,
bestehend aus CH2Cl2:Methanol:Essigsäure = 60:40:5,
resolubilisiert und auf eine 1,5 × 20 cm große Kieselgelsäule im gleichen
Lösungsmittelsystem
geladen. Unter diesen Bedingungen bewegte sich Dig-CMO weiter als
Dig-LC9-F-Konjugat, und F-LC9-NH2 blieb am Säulenkopf gebunden. Die Reinheit
des Materials wurde durch DC-Kieselgelplatten unter Verwendung des
oben beschriebenen Lösungsmittelsystems
und durch Elektrophorese auf Papier bei pH 5,8 überprüft. Die Lösungsmittel wurden aus dem
gereinigten Material mittels Rotationsverdampfung entfernt und das
Produkt im Volumen an Methanol/DMF (70:30) resolubilisiert und anschließend zentrifugiert,
um die unlöslichen
Materialien (Kieselgel) zu entfernen. Der letzte Schritt erfolgte,
um den Großteil
des Kieselgels zu entfernen, das während der Reinigung solubilisiert
und mit dem Produkt co-eluiert werden kann. Das Produkt wurde im
Lösungsmittelsystem
Methanol/DMF (70:30) bei –10 °C bis –20 °C gelagert.
Die Konzentration des Produkts wurde durch A490 anhand
einer Standardkurve ermittelt, die unter Verwendung bekannter Mengen
von 6-Carboxyfluorescein erstellt wurde.
-
III. Test-Arbeitsvorschrift
-
Der
Test wurde durchgeführt,
indem 50 ml Digoxin-Kalibratoren in Serum (normales Humanserum ohne
TSH) mit 50 μl
1,74 ng/ml Digoxin-LC9-F-Konjugat in Testpuffer
(0,05 M Tris-HCl, 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 2 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml
BGG/pH 8,2) und 50 μl
160 ng/ml AbDig-Biotin im gleichen Puffer
wie oben vermischt wurden. Diese Gemische wurden bei Raumtemperatur
15 min lang inkubiert; anschließend
wurde 0,75 ml 0,05 M Tris HCl, 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 8,2 Puffer,
umfassend 1010 Akzeptorperlen (Avidin-PB/BA-C18) und 2,5 × 1011 Sensibilisierungsperlen
(AbF-PB/nC10)), jedem Röhrchen zugegeben und die Inkubation
weitere 30 min lang durch Schütteln
im Dunkeln bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurde jedes
Röhrchen
1 min lang mittels einer Halogenlampe, die mit einem 650 nm-Cutoff-Filter
ausgestattet war, als Lichtquelle beleuchtet und dann das Chemolumineszenzlicht
durch Integration 20 s lang mit einem Turner 20e-Luminometer gemessen.
Die Ergebnisse sind in 2 zusammengefasst.
-
Beispiel 3
-
Test auf Human-Chorion-Gonadotropin
und Test auf Thyroid-stimulierendes Hormon
-
I. Reagenzien und Materialien
-
- A. BA-C18 wurde durch
das nachstehend beschriebene Verfahren synthetisiert. Alle Reagenzien
stammten – sofern
nicht anders angegeben – von
Aldrich Chemical Co.
-
1. p-Formylphenoxyessigsäuredioctadecylamid
-
Einer
100 ml-Lösung
von frisch destilliertem Tetrahydrofuran (THF) wurden p-Formylphenoxyessigsäure (K & K Labs, Molekulargewicht
180, 0,540 g, 3,0 mmol), Triethylamin (Molekulargewicht 101,19,
0,333 g, 3,3 mmol) und Trimethylacetylchlorid (Molekulargewicht
120,57, 0,398 g, 3,3 mmol) zugegeben. Nachdem das Gemisch 20 min
lang rückflusserhitzt
worden war, wurde Dioctadecylamin (Fluke; Molekulargewicht 522,01,
1,723 g, 3,3 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht
am Rückfluss
gehalten.
-
Am
nächsten
Tag wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid
aus der Reaktionslösung
extrahiert. Die Methylenchlrorid-Extrakte wurden über Natriumsulfat
getrocknet.
-
2. p-(N,N-Dioctadecylcarbamidomethoxy)benzal-9-methylacridan
-
10-Dimethoxyphosphinyl-9-methylacridan
(Monatshi Chem. 114, 3 (1988); Molekulargewicht 303,27, 0,100 g,
3,3 mmol) in wasserfreiem THF wurden 0,413 ml 1,6 M n-Butyllithium-Lösung in
Hexan bei –78 °C (Aceton/trockenes
Eisbad) unter Argon zugegeben. Nach Zugabe der n-Butyllithium-Lösung schien
die Lösung gelb.
Eine Lösung
des obigen Amids in THF wurde 20 min nach der Zugabe von n-Butyllithium
zugegeben. Die Reaktionslösung
wurde über
Nacht auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen.
-
Am
nächsten
Tag wurde das Produkt mittels DC (Kieselgel; 3:7 = Ethylacetat:Hexan)
isoliert. Das isolierte Produkt wurde durch Massenspektralanalyse
und NMR analysiert und im Dunkeln gelagert.
- B.
Singulett-Sauerstoff-Erzeugerfarbstoff (nC10)
stammte von ULTRA Diagnostic Corporation. EDAC, SATA, HCG und BSA
stammten von Sigma Co. Ab1(TSH)-Biotin und
Ab2(HCG)-Biotin sowie Ab2(TSH)-F
wurden gemäß einem ähnlichen
Verfahren wie in Beispiel 1, Abschnitt II (siehe auch US 07/389.659,
eingereicht am 4. August 1989, d.h. EP-A-411.945, veröffentlicht
am 6. Februar 1991, dessen relevante Abschnitte hierin durch Verweis
aufgenommen sind) hergestellt.
-
Es
wurde ein Luminometer von Turner Designs (Modell 20e) eingesetzt.
-
II. Herstellung von mit
Anti-HCG-Antikörper
stabilisierten Öltröpfchen
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(Ab1(HCG)-OD/BA-C18)
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Die
mit Anti-HCG-Antikörper
markierten Öltröpfchen (OD)
wurden durch Übertragen
von 1 ml 10 mg/ml Anti-HCG-β (12A8,
IgG) in ein Glasröhrchen,
das 50 μl
5 mM BA-C18 in Dibutylphthalat enthielt, hergestellt. Das
Protein befand sich in 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 7,6. Das Öl wurde
durch Beschallung und gleichzeitiges kontinuierliches mechanisches
Rühren
emulgiert. Man beachte, dass energiereiche Beschaller erforderlich
waren, um kleinere Öltröpfchen zu
erzeugen. Die Beschallung erfolgte 7 min lang unter Verwendung des Bronson-Beschallers
(als Kühlmittel
wurde Leitungswasser mit Raumtemperatur eingesetzt). Ungebundenes Protein
wurde durch Zugabe von 25 % Na2SO4-Lösung,
um eine Endkonzentration von 8 % bis 9 % zu erhalten, und anschließendes Zentrifugieren
(Mikrozentrifuge, Einstellung 8, 10 min lang) entfernt. Der Waschschritt erfolgte
drei Mal (die Zentrifugationsgeschwindigkeit sollte solcherart eingestellt
sein, dass die Öltröpfchen abgetrennt
werden, aber nicht koaleszieren). Nach dem letzten Waschgang wurden
die Teilchen in 1 ml 0,05 M NaPi, 0,15 NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6
suspendiert und 3 min lang erneut beschallt. Das Endvolumen des
Präparats
wurde auf 5 ml eingestellt und Saccharose in einer Endkonzentration
von 2 % zugegeben. Diese Ab1(HCG)-OD/BA-C18-Teilchen wurden bei 4 °C gelagert. Die durch das oben
beschriebene Verfahren gebildeten Öltröpfchen waren größenmäßig heterogen
und wiesen einen mittleren Durchmesser von 1 – 5 μm auf.
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III. Herstellung von Avidin-Lip/nC10
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Die
Liposomen wurden durch das Methanol-Verdünnungsverfahren hergestellt.
Typischerweise wurde ein Gemisch von Lipiden – Cholesterin (2,0 mg), DPPC
(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA; 23,8 mg), DPPG (Avanti
Polar Lipids, Alabaster, AL, USA; 6,5 mg), Maleimid-DPPE (Molecular
Probe, Eugene, OR, USA; 0,5 mg) und nC10 (0,5
mg waren in warmem Methanol gelöst;
200 μl) – zu 2 ml
Wirbelpuffer-B (0,05 m NaPi, 0,05 M NaCl, 5 mM EDTA/pH 6,0) zugegeben.
Die Suspension wurde dann durch eine 1,5 × 20 cm große Sephadex G-25-Säule in Puffer-B
geschickt. Die gesammelten Liposomen enthaltenden Fraktionen wurden mittels
Mikrozentrifuge zentrifugiert, um allenfalls große Teilchen zu entfernen. Schließlich wurden
Maleimid enthaltende Liposomen langsam der gerührten succinylierten Avidin-SH-Lösung (wie
oben gebildet) in Puffer-B zugegeben. Nach dem Spülen mit
Argon wurde dieses Gemisch langsam (ohne Rührstäbchen) über Nacht bei 4 °C vermischt.
Die überschüssigen Maleimidgruppen
wurden mit 2 mM Mercaptobernsteinsäure (im Reaktionsvolumen) 30
min lang bei 4 °C
blockiert, gefolgt von der Zugabe von Iodessigsäure bis zu einer Endkonzentration
von 5 mM, um die überschüssigen Thiolgruppen
zu blockieren (30 min lang bei 4 °C).
Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels einer Centriprep-30®-Vorrichtung
auf 2,5 – 3
ml eingeengt, und es wurden die ungebundenen Avidinmoleküle durch
Gelfiltration auf einer 1,5 × 50
cm großen
Sepharose-2B-Säule in Puffer-B
entfernt.
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IV. Herstellung von succinyliertem
Avidin-SH
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Avidin
wurde mit SATA (5 mol pro mol Avidin; 10 mg/ml Avidin in 1 M NaPi/pH
7,4) über
Nacht bei 4 °C
umgesetzt. Der gleichen Lösung
wurde Bernsteinsäureanhydrid
in DMF (50 mol pro mol Avidin) zugegeben (das gesamte DMF machte
weniger als 1 % des Reaktionsvolumens aus) und die Lösung 2 h
lang inkubiert. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch Zugabe
von 0,5 M Na2HPO4 auf
7,4 gehalten. Die geschützten
Thiolgruppen (Thioester) wurden mit Nydroxylamin (0,1 M, pH 7,0)
1 h lang bei Raumtemperatur von Schutzgruppe befreit. Schließlich wurden überschüssige niedermolekulare
Moleküle
mittels einer 1,5 × 30
cm großen
G-25-Säule
in Puffer-B (0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl, 5 mM EDTA/pH 6,0; entgast
und mit Argon gesättigt)
entfernt. Der Proteinpeak (Avidin-SH) wurde gesammelt und das Protein
dann mit Maleimid enthaltenden Liposomen umgesetzt.
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V Herstellung von mit
Anti-Fluorescein beschichteten und mit nC10 eingefärbten Perlen
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(AbF-PB/nC10)
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Carboxylierte
Polystyrolperlen (38 nm; siehe Beispiel 1, Abschnitt IIIB) wurden
mit nC10 eingefärbt. EDAC/Sulfo-NHS-Konjugationschemie
diente zur Bindung des AbF an diese Polystyrolperlen.
Typischerweise wurden 10 ml 0,02 M NaPi, umfassend 5 mg/ml mit nC10 eingefärbte
carboxylierte Polystyrolperlen und 11 mg/ml Sulfo-NHS (pH-eingestellt
auf 5,5), mit 1 ml frisch hergestellter Lösung von EDAC (200 mg/ml) in
D-H2O vermischt. Nach dem Inkubieren bei
Raumtemperatur im Dunkeln über
den Zeitraum von 25 min wurden die Perlen zentrifugiert, um überschüssiges EDAC
zu entfernen (da EDAC Mikroaggregation dieser Perlen bewirkt, war
es möglich,
sie mit herkömmlichen
Zentrifugen zu pelletieren, z.B. Sorval unter Verwendung von SA-600-Rotor bei 15.000
U/min). Die pelletierten Perlen wurden in 3 ml 0,005 M NaPi/pH 5,8
resuspendiert und dann in eine gerührte Proteinlösung eingebracht
(15 mg 0,02 M Borax, 0,08 M NaCl, 2 mg/ml 3Gl IgG (AbF),
8 mg/ml BSA/pH 8,9). Das Gemisch wurde vorsichtig ohne Rühren über Nacht
bei 4 °C
geschüttelt.
Die übrigen
reaktiven Gruppen auf den Perlen wurden – falls vorhanden – mit 0,083
M Glycin und 15 mg/ml BSA/pH 8,9 bei 4 °C 60 min lang blockiert. Die
ungebundenen Proteine wurden durch aufeinander folgende Waschungen
mit 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 7,6 entfernt. Das fertige Pellet
wurde in Waschpuffer resuspendiert, beschallt und in diesem Zustand
bei 4 °C
gelagert. Die endgültige
Größe dieser
Perlen betrug 140 nm.
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VI. Herstellung von mit
Avidin beschichteten und mit Benzalacridan gefärbten Perlen
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(Avidin-PB/BA-C18)
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Carboxylierte
Latexperlen (0,175 μ)
wurden mit BA-C18 eingefärbt (siehe Beispiel 1, Abschnitt
IIIC). EDAC/Sulfo-NHS-Konjugationschemie diente zum Konjugieren
des Avidins an diese Teilchen. Die Aktivierung der Perlen durch
Sulfo-NHS/EDAC erfolgte in gleicher Weise wie für das obige Präparat AbF-PB/nC10 beschrieben.
Die aktivierten Perlen (100 mg) wurden zentrifugiert, um überschüssiges EDAC
zu entfernen, anschließend
in 2,5 ml 0,005 M NaPi/pH 5,8 resuspendiert und in eine gerührte Avidinlösung übertragen
(15 ml 0,025 M Borax, 1,33 mg/ml Avidin/pH 9,1). Das Gemisch wurde
vorsichtig bei 4 °C über Nacht
vermischt. Avidin auf den Perlen wurde durch Zugabe von 20 μl 1 M Bernsteinsäureanhydrid
in DMF (60facher Molüberschuss
gegenüber
Avidin) und einstündige
Inkubation bei 4 °C
succinyliert. Die Perlen wurden mit 7 mg/ml BSA (Endkonzentration
im Reaktionsgemisch) 60 min lang bei 4 °C blockiert. Schließlich wurden
die Perlen drei Mal mit 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 7,6 durch Zentrifugation
gewaschen und in 10 ml Waschpuffer gelagert. Im letzten Schritt
wurden die Perlen beschallt, um monodisperse Teilchen zu erhalten.
Die Größe der Perlen änderte sich
nach der Proteinmarkierung (ca. 190 nm) nicht signifikant. Avidi-PB/BA-C18 würde
in Waschpuffer bei 4 °C gelagert.
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VII. Herstellung von Biotin-LC21-F
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2. Materialien
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6-Carboxyfluorescein,
Kodak; Biotin-NHS-Ester, Pierce Chemical Co.; 4,9-Dioxa-1,12-dodecandiamin,
Aldrich Chemical, Co.; trockenes DMF, destilliert über Calciumoxid;
Ag-MP-1 (C1–)
Anionenaustauschharz, BioRad Laboratories.
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3. Fluoresceinaminhydrochlorid
VII3
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6-Carboxyfluorescein
(VII 1; 10 g, 26,6 mmol) wurde in trockenem DMF (25 ml) gelöst. N-Hydroxysuccinimid
(3,22 g, 28 mmol) wurde als Feststoff der DMF-Lösung zugegeben und gelöst. Das
Gemisch wurde dann in einem Eisbad gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid
(5,8 g, 28 mmol) wurde in trockenem DMF (10 ml) gelöst und auf
einmal der kalten DMF-Lösung
zugegeben. Das Gemisch wurde bei Eisbadtemperatur 30 min lang gerührt und
dann auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen. Der Reaktionsverlauf wurde mittels DC verfolgt (10 % MeOH-CH2Cl2, umfassend 1
% Essigsäure).
Nach 3 Stunden war die Bildung des Fluorescein-NHS-Esters VII2 abgeschlossen.
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4,9-Dioxa-1,12-dodecandiamin
(25,5 g, 125 mmol) wurde mit trockenem DMF (10 ml) verdünnt. Das Fluorescein-NHS-Ester-Reaktionsgemisch
wurde in Eis unter Argonatmosphäre
gekühlt
und die Diaminlösung 5
min lang zugetropft. Das Kühlbad
wurde entfernt und Rühren
bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels
des obigen Systems durch DC verfolgt. Als die Reaktion als abgeschlossen
eingestuft wurde, wurde das Gemisch mit Wasser (100 ml) verdünnt und
in Eis gekühlt,
um Dicyclohexylharnstoff zu fällen,
der durch Filtration entfernt wurde.
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Das
Filtrat wurde mit AG-MP-1 (C1–) Anionenaustauschharz
aufgeschlämmt
und in eine Chromatographiesäule
gegossen. Das Harz wurde mit 50 % wässrigem Methanol gewaschen,
bis freies Diamin nicht mehr mittels Ninhydrin detektierbar war.
Das Harz wurde dann mit 0,1 N Salzsäure in 50% wässrigem
Methanol eluiert. Fluoresceinaminhydrochlorid eluierte zuerst, gefolgt
von 6-Carboxyfluorescein. Reinfraktionen wurden gesammelt und auf
einem Rotationsverdampfer getrocknet. Nach dem Trocknen im Hochvakuum
wurden 3,4 g reines Fluoresceinaminhydrochlorid VII3 gewonnen.
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4. Fluorescein-LC21-Biotin VII4
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Fluoresceinaminhydrochlorid
VII3 (350 mg, 0,61 mmol) wurde in trockenem DMF (15 ml) gelöst. Triethylamin
(300 ml) wurde zugegeben, gefolgt von NHS-Ester (445 mg, 0,8 mmol).
Der Reaktionsverlauf wurde durch DC (MeOH-CH2Cl2-Essigsäure-Wasser,
10:78:1:1) verfolgt. Als die Reaktion als abgeschlossen eingestuft
wurde, wurde DMF auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand
wurde in Methanol (10 ml) gelöst
und mit Kieselgel (10 g) aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde
auf dem Rotationsverdampfer zu einem frei fließenden Pulver getrocknet, das
in Dichlormethan aufgeschlämmt
und auf den Kopf einer mit Dichlormethan äquilibrierten Kieselgelsäule (2,5 × 25 cm)
aufgebracht wurde. Die Säule
wurde mit dem obigen DC-Lösungsmittelgemisch
eluiert. Produkt enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und Lösungsmittel
auf dem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in Ethanol aufgenommen
und filtriert. Das Filtrat wurde langsam eingedampft und das Produkt
als Gummi abgelagert. Der Gummi wurde im Hochvakuum getrocknet,
um 350 mg Fluorescein-LC21-Biotin VII4 (F-LC21-Biotin) zu ergeben, das ohne weitere Charakterisierung eingesetzt
wurde.
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VIII. Tests
-
A. HCG-Test-Standardkurve
(OD mit Lip)
-
Ein
HCG-Test erfolgte, indem zuerst NCG (variierende Mengen), Ab1(HCG)-OD/BA-C18 und Ab2(HCG)-Biotin miteinander vermischt wurden.
Nach einstündiger
Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine überschüssige Menge an Avidin-Lip/nC10 zugegeben und die Inkubation weitere 30
min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurden die Röhrchen jeweils
1 min lang bestrahlt und die Lumineszenz 20 s lang gemessen.
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Arbeitsvorschrift:
-
- Kombinieren von:
- 50 μl
HCG in variierender Konzentration in Probenpuffer (0,05 MNaPi, 0,15
MNaCl, 0,4 % BSA, 20 % Saccharose, 4 mg/ml Dextransulfat (T-500),
pH 7,5); 50 μl
4 μg/ml
Ab2(HCG)-Biotin in Testpuffer (0,05 MNaPi,
0,15 M NaCl, 0,4 % BSA, pH 7,5); und 50 μl Ab1(HCG)-OD/BA-C18-Reagens (5 × 108 OD/Röhrchen)
-
- Inkubieren über
1 h bei Raumtemperatur mit Schütteln
im Dunkeln
-
- Zugabe von:
- 50 μl
1,5 × 1012 Avidin-nC10 Lip
(7,3 × 1010 lip/Röhrchen);
- 30-minütiges
Inkubieren bei Raumtemperatur mit Schütteln im Dunkeln
- 1-minütiges
Bestrahlen mit Halogenlampe (120 mW Lichtleistung bei Verwendung
eines 650 nm-Cutoff-Filters). Dann bei abgeschalteter Lichtquelle
Messen der Lichtintensität über 20 s.
Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst.
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B. Test auf Biotin-LC21-F
-
Der
Test wurde durch Vermischen von 50 ml Avidin-PB/BA-C18 (2 × 1011 Perlen/ml), 50 ml AbF-PB/nC10 (5 × 1012 Perlen/ml) und 100 ml Biotin-LC21-F (variierende Mengen) in 0,05 NaPi, 0,15
M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6 durchgeführt.
-
Dieses
Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1,5 h lang mit Schütteln im
Dunkeln inkubiert. Schließlich wurde
jedes Röhrchen
mit einer Halogenlampe (ausgestattet mit 650 nm-Cutoff-Filter) 1
min lang bestrahlt, woraufhin die Lichtleistung 20 s lang durch
Integration der Lichtintensität
in einem Turner 20e-Luminometer gemessen wurde. Die Ergebnisse sind
in 4 zusammengefasst.
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C. TSH-Test-Standardkurve
-
Der
TSH-Test wurde durch Vermischen von 200 μl TSH in variierenden Konzentrationen
in 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6 mit 50 μl 4 μg/ml Ab1(TSH)-Biotin
und 4 μg/ml
Ab2(TSH)-F durchgeführt. Diese Gemische wurden
bei Raumtemperatur 1,5 h lang inkubiert. Danach wurden 100 μl PBS mit
1010 Avidin-PB/BA-C18-Perlen und 2,5 × 1011 AbF-PB/nC10-Perlen jedem Röhrchen zugegeben. Die Inkubation
wurde weitere 1,5 h lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurde
jedes Röhrchen
mit einer Halogenlampe (ausgestattet mit einem 650 nm-Cutoff-Filter) bestrahlt,
woraufhin die Lichtleistung durch Integrieren der Lichtintensität über den
Zeitraum von 20 s (5 und 6) in
einem Turner 20e-Luminometer
gemessen wurde.
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Beispiel 4 (kein Beispiel
der Erfindung)
-
Test auf HCG unter Verwendung
von löslichem
Photosensibilisator und Akzeptor-Öltröpfchen
-
I. Reagenzien
-
Mit
Akzeptor-Farbstoff eingefärbte Öltröpfchen =
Ab1(HCG)-OD/BA-C18 (beschrieben
in Beispiel 3, Teil II).
-
Ab2(HCG)-Biotin – ähnlich hergestellt wie in Beispiel
2, Teil I, aus NHS-Derivat von Biotin von Pierce Chemical Co.
-
Strepavidin-T680 – von Ultralite
Diagnostics Co., Strepavidin, markiert mit einem wasserlöslichem Analog
des oben beschriebenen nC10-Farbstoffs.
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II. Test
-
Der
Test wurde durch Vermischen von 50 μl Probenpuffer (0,05 M NaPi,
0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA, 4 mg/ml Dextran-SO4 (T500),
20 % Saccharose/pH 7,6), umfas send variierende Mengen an HCG mit
50 μl 4 μg/ml Anti-HCG-Biotin
in Testpuffer (0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6) und
50 μl Ab1(HCG)-OD/BA-C18-Reagens mit 5 × 108 Öltröpfchen)
durchgeführt.
Dieses Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
Danach wurden 50 μl
2 μg/ml
Strepavidin-T680
in Testpuffer jedem Röhrchen
zugegeben und die Inkubation weitere 30 min lang fortgesetzt. Schließlich wurde
jedes Röhrchen
1 min lang mit einer Halogenlampe (ausgestattet mit 650 nm-Cutoff-Filter)
bestrahlt und dann die Lichtleistung 20 s lang mit dem Turner 20e-Luminometer
gemessen. Die Ergebnisse sind in 7 zusammengefasst.
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Beispiel 5
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Homogener
Test auf Target-Oligonucleotid
-
Die
Targetsequenz wurde aus Escherichia coli K12 DNAJ-Gen (J.C.A. Bardwell,
K. Tilly, E. Craig, J. King, M. Zylicz und C. Georgopoulos, J. Biol.
Chem. 261, 1782-1785
(1986)) ausgewählt.
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Ein
50mer mit der dargestellten Sequenz wurde durch das Phosphittriester-Verfahren
unter Anwendung von Biosearch 8750 hergestellt, umfassend ein Biotin,
das am 5'-Ende mittels Biotin-ONTM Phophoramidit (Clontech, Palo Alto, CA,
USA) inkorporiert, war.
-
Sequenz:
-
- GCGGGCGAAGGTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTA.
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Die
Sonde war ein komplementäres
30mer mit einem Fluorescein (F), das an einem modifizierten C gebunden
war; die Sequenz sieht folgendermaßen aus:
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Das
Fluorescein wurde durch Inkorporieren von modifiziertem Nucleotid
N4-LCA-5-Methyldesoxycytidin
CEDT Phosphoramidit (American Bionetics, Hayward, CA, USA) und anschließendes Markieren
mit dem N-Hydroxysuccinimidester von 5-Carboxyfluorescein unter
Verwendung eines 200fachen Molüberschusses von
Ester in pH 9,0 NaHCO3 mit 30 % (Vol./Vol.)
DMF eingeführt.
Das Rohprodukt wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.
Avidin-PB/BA-C18- und AbF-PB/nC10-Perlen waren die gleichen wie in den obigen
Beispielen.
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Eine
Standardkurve für
das Target wurde durch Reihenverdünnung in 50 mM NaH2PO4, 600 mMNaCl, pH 7,5, umfassend 4 g/l Rinderserumalbumin
und 10 mg/l Kalbsthymus-DNA als Träger, erstellt. Aliquoten (5 μl) wurden
zu 4,8 pmol Fluorescein-markierter Sonde in 5 μl des gleichen Puffers in einem
12 × 75
Polypropylen-Reagensglas
zugegeben. Die Gemische wurden abgedeckt und 10 min lang auf 72 °C erhitzt,
um vollständige
Hybridisierung sicherzustellen. Etwa 1010 Donor
(Sensibilisator) (AbF-PB/nC10)-Perlen
wurden 50 μl
50 mM NaH2PO4, 600
mM NaCl, pH 7,5, umfassend 4 g/l Rinderserumalbumin, zugegeben,
gefolgt von 2,5 × 1011 Akzeptor-(Avidin-PB/BA-C18)-Perlen
in 50 μl
der gleichen Substanz. Nach 30 min bei Raumtemperatur und Schütteln auf
einer Orbitalschüttelvorrichtung
wurde jedes Röhrchen
1 min lang mit einer mit einem 650 nm-Filter ausgestatteten Halogenlampe
(s.o.) bestrahlt. Die Lichterzeugung im Zeitraum von 20 s wurde
von einem Turner-Luminometer
bestimmt. Die resultierende Standardkurve ist aus 8 ersichtlich.
-
Beispiel 6
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Detektion von synthetischem
Target, das sich an die biotinylierte Sonde und die fluoresceinierte
Sonde bindet
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Herstellung
von biotinylierter Sonde
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50
nmol von entsalztem 5'-Amino-modifiziertem
Oligonucleotid (30-Mer)
5'-UAA-TAC-AGG-TTG-TTG-CCT-TCA-CGC-TCG-AAA-3'
wurden in 0,5
ml 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,0, gelöst. Eine Lösung von Succinimidyl-6-(biotinamido)hexanat (Pierce
#21336-G), 125 μl
120 mg/ml in DMF wurde der Pufferlösung zugesetzt. Das Gemisch
wurde über Nacht
inkubiert und mittels präparativer
Elektrophorese (12 % Polyacrylamidgel und 7 M Harnstoff in TBE-Puffer
(Tris-Borsäure-EDTA))
gereinigt: 89 mM Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)-Base, 89
mM Borsäure, 2,5
mM Na2 EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH
8,3) bei 400 V, 4 h lang. Das biotinylierte Oligonucleotid wurde
aus dem Gel geschnitten und mit 3 ml 0,1 M NH4CO3 bei 37 °C über Nacht
eluiert. Das Material wurde aus einer Sep-Pak (einer C-18-Säule von Waters #51910) gereinigt,
vakuumgetrocknet und in doppelt destilliertem Wasser suspendiert.
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Die
Ausbeute der biotinylierten Sonde betrug 34,8 nmol (58 %).
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Herstellung
einer fluoresceinierten Sonde
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Es
wurde eine Lösung
von 50 nmol an mittleren Cytosin (an Position 14) aminomodifiziertem
Oligonucleotid (30-Mer)
5'-CTG-CCG-GTG-CGC-CAT-GUT-CGC-CCG-CCT-3'
in einem Gemisch
aus 0,1 M NaHCO3-Puffer, pH 9,6 (190 μl) und Acetonitril
gebildet. 200 μl
0,1 M Lösung
von 5/6 Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (Molecular Probes, #01112)
im DMF wurder der Pufferlösung
zugegeben. Das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die übrigen Schritte sind die gleichen wie
oben in Zusammenhang mit der biotinylierten Sonde beschrieben.
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Die
fluoresceinierte Sonde wurde in einer Ausbeute von 41 % erhalten.
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Testverfahren
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Testpuffer:
10 mM Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), 50 mM KCl, pH 8,3,
umfassend 5 mg/ml Dextransulfat, 0,5 M NaCl, 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin)
und 25 μg/ml
Kalbsthymus-DNA
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40 μl Testpuffer
mit fluoreszeinierter Sonde (1,5 pmol) und biotinylierter Sonde
(1,2 pmol) wurde 10 μl reihenverdünnter synthetischer
Target-DNA (65-Mer) in Testpuffer zugegeben. Das Gemisch wurde 5
min lang bei 55 °C
hybridisiert. Perlen (20 μg
Avidinperlen und 30 μg
Anti-Fluorescein-Perlen, jeweils in 50 μl Testpuffer) wurden zugegeben.
Die Lösung
mit den Perlen wurde 15 min lang bei 55 °C inkubiert.
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Die
Avidinperlen wurden hergestellt, indem 0,175 μ carboxylierte Polystyrolperlen
mit Benzalacridan beladen wurden. Die Perlen wurden unter Anwendung
von EDAC-Chemie
(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, Sigma
Chemical Co. #E-6383), mit Avidin versehen.
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Benzalacridan
wurde gebildet, indem 0,413 ml 1,6 M n-Butyllithium-Lösung in
Hexan zu 10-Dimethoxyphosphinyl-9-methylacridan (Monatsh Chem. 114:
3, 1988) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) bei –78 °C (Aceton/Trockeneis-Bad)
unter Argan zugegeben wurden. 20 min nach Zugabe der t-Butyllithium-Lösung wurde
eine Lösung
des obigen Amids in THF zugegeben. Die Reaktionslösung wurde über Nacht
auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen. Das Produkt wurde anschließend mittels DC (Kieselgel;
3:7 = Ethylacetat/Hexan) isoliert. Das isolierte Produkt wurde durch
Massenspektrometrieanalyse und NMR analysiert und im Dunkeln gelagert.
-
Die
Anti-Fluorescein-Perlen wurden durch Beladen von 0,04 μ carboxylierten
Polystyrolperlen mit Tetra-n-decyl-Al-Phthalocyanin (Ultra Diagonistics,
Lot #GR11-82) hergestellt und mit Anti-Fluorescein-Antikörper mittels
EDAC-Chemie versehen.
-
Signal
wurde durch Bestrahlen der die Perlen enthaltenden Lösung über 60 s
mit einer mit einem 650 nm-Cutoff-Filter ausgestatteten Lampe abgelesen.
Die Lumines zenz wurde 20 s lang gemessen. Die Ergebnise sind in
Tabelle 1 zusammengefasst und in 9 dargestellt.
-
Beispiel 7
-
Detektion
von biotinyliertem Amplifikationsprodukt
-
PCR-Produktion
biotinylierter Sequenz
-
- Target: genomische E. coli-DNA
- Primer: jeweils 100 nM 5'-biotinyliertes
24-mer
- 5'-UCA-TGG-TTC-TGG-TCA-GGT-GCA-GAT-3'
- und nicht-biotinyliertes 18-mer
- 5'-TTT-GAG-CGC-GGG-CTG-TTG-3'
-
Zyklusbedingungen:
-
Ein
Zyklus:
94 °C | 3
min |
59 °C | 1
min |
72 °C | 1,5
min |
Dann
35 Zyklen:
94 °C | 1
min |
59 °C | 1,5
min |
72 °C | 2
min |
-
Detektion
mittels fluoresceinierter Sonde
-
10 μl 1,5 pmol
fluoresceinierter Sonde in Testpuffer, hergestellt gemäß der Vorgangsweise
aus Beispiel 6, wurden zu 20 μl-PCR-Produkt
in verschiedenen Anfänglichen
Targetkonzentrationen zugegeben. Das Gemisch wurde 5 min lang bei
95 °C denaturiert
und dann 5 min lang bei 55 °C
hybridisiert. Perlen (20 μg
Benzalacridan und 30 μg
Al-Phthalocyanin-Perlen in 50 μl
Testpuffer) wurden zugegeben. Die Perlen enthaltende Lösung wurde
15 min lang bei 55 °C
inkubiert. Signal wurde gemäß dem gleichen
Verfahren wie in Beispiel 6 abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
2 zusammengefasst.
-
Beispiel 8
-
Test mit Voll-Triiodthyronin
-
I. Perlenherstellung
-
Materialien
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- 175 nm Carboxylat-modifizierter Latex von Bangs Laboratories;
- Ethylenglykol, Ethoxyethanol, Benzylalkohol, Chlorophyll-1:
Aldrich;
- Europium(III)-theonyltrifluoracetonat (EuTTA): Kodak;
- Trioctylphosphinoxid (TOPO): Aldrich;
- Dioxen[1-(4-dimethylaminophenyl)-6-pohenyl-1,4-dioxen]: hergestellt
in einer Modifikation des Verfahrens von K.A. Zaklika, T. Kissel,
A.L. Thayer, P.A. Burns und P. Schaap: Photochem. Photobiol. 30,
30-35 (1979).
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Verfahren
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1. Chlorophyll-a-Sensibilisatorperlen
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Eine
Lösung
von Chlorophyll-a in Benzylalkohol (1,0 ml, 0,6 mM) wurde 8,0 ml
Benzylalkohol bei 105 °C
zugegeben. Eine Suspension von Carboxylat-modifiziertem Latex mit
einer Größe von 175
nm in Wasser (10 %, 1,0 ml) wurde der Benzylalkohol-Lösung zugesetzt. Das Gemisch
wurde 5 min lang bei 105 °C
gerührt und
auf Raumtemperatur gekühlt.
Ethanol (10,0 ml) wurde zugegeben und das Gemisch zentrifugiert.
Das Pellet wurde in einem 1:1-Ethanol-Wasser-Gemisch (10,0 ml) resuspendiert
und die Suspension zentrifugiert. Die gleiche Vorgangsweise mit
Resuspension und Zentrifugation wurde in Wasser (10,0 ml) wiederholt
und das Pellet in Wasser resuspendiert (1,8 ml).
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Charakterisierung
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- A. Farbstoffkonzentration: Eine Lösung, gebildet
durch Zugabe von 10 μl
der obigen Perlensuspension zu Dioxan (990 μl), wies eine Extinktion von
0,11 bei 660 nm auf, was 2,6 μmol
Chlorophyll-a in 1 g Perlen entsprach.
- B. Erzeugung von Singulett-Sauerstoff: Ein Gemisch aus Chlorophyll-a-Perlen
(200 μg),
2 × 10–4 mol
Anthracen-9,10-dipropionsäure
(ADPA) in 2 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5, umfassend 100 mM NaCl)
wurde mit einer Wolfram-Halogen-Lampe, ausgestattet mit einem 645
nm-Cutoff-Filter, 20 min lang bestrahlt. Die Perlen wurden durch
Filtration entfernt und die Konzentration des Oxidationsprodukts
spektralphotometrisch bei 400 nm bestimmt. Die ermittelte Rate betrug
3,0 nmol Oxidationsprodukt pro min. Unter den gleichen Bedingungen
erzeugten 38 pmol eines löslichen
Sensibilisators, Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat, die gleiche
Menge an Oxidationsprodukt (die Menge des Sensibilisators in den
Perlen betrug 200·10–6·2,6·10–6 =
520 pmol).
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2. Chlorophyll-a/Tetrabutylsguarat-Sensibilisatorperlen
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Eine
Suspension von carboxylierten Latexperlen (Größe 175 nm, 10 % Feststoffe
in Wasser, 30,0 ml) wurde zentrifugiert: Der Überstand wurde verworfen und
das Pellet in Ethylenglykol (60,0 ml) resuspendiert. Die Suspension
wurde auf 100 °C
erhitzt. 9,0 ml einer Benzylalkohol-Lösung, die 1,67 mM in Chlorophyll-a
und 3,33 mM in Tetra-t-butylsquarat [1,3-Bis(4-dibutylaminophenyl)squarat]
ist, wurde 3 min lang der Suspension langsam zugegeben. Das Erhitzen
wurde 7 min lang fortgesetzt und die Suspension dann in einem Wasserbad auf
Raumtemperatur gekühlt.
Die Benzylalkohol-Lösung
wurde kaltem Ethanol (120 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde zentrifugiert
und der Überstand
verworfen. Das Pellet wurde in 50 % Ethanol in Wasser resuspendiert
und die Suspension zentrifugiert. Die gleiche Vorgangsweise mit
Resuspension und Zentrifugation wurde in 5 % Ethanol in Wasser (30
ml) wiederholt.
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Charakterisierung
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- A. Farbstoffkonzentration: Die Konzentration
des Tetrabutylsquarats in den Perlen wurde spektralphotometrisch
bestimmt (wie oben in Zusammenhang mit den Chlorophyll-a-Perlen).
Sie betrug 44 μM
Farbstoff in den Perlen.
- B. Erzeugung von Singulett-Sauerstoff: 25 μl einer 5 mM Lösung ADPA
in Ethanol wurden der Suspension von Perlen (100 μg) in Phosphatpuffer,
pH 7,0 (20 mM, umfassend 50 mMNaCl) zugegeben. Das Gemisch wurde
wie oben mit einem 610-nm-Langpassfilter
bestrahlt. Die Rate der Singulett-Sauerstoff-Erzeugung wurde anhand
der Reduktionsrate der Extinktion (bei 400 nm) des ADPA errechnet.
Es stellte sich heraus, dass die Perlen 7·10–2 μmol Singulett-Sauerstoff/min
erzeugen.
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3. Dioxen/EuTTA/TOPO-Akzeptorperlen
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20
ml 175 nm carboxylierte Latexperlen (10 % Suspension in Wasser)
wurden zu Ethoxyethanol (20,0 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde auf
90 °C erhitzt.
20 ml einer Lösung,
die aus 10 mM Dioxen, 20 mM EuTTA und 60 mM TOPO in Ethoxy ethanol
bestand, wurden dem Gemisch zugegeben. Das Erhitzen erfolgte 7 min
lang bei einer Temperatur von bis zu 97 °C. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur
abgekühlt.
Ethanol (40,0 ml) wurde zugegeben und das Gemisch zentrifugiert.
Das Pellet wurde in 80 % Ethanol resuspendiert und die Suspension
zentrifugiert. Die Resuspension und Zentrifugation wurden in 10
% Ethanol (36 ml) wiederholt.
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Charakterisierung
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- A. Farbstoffkonzentration: Die Konzentration
von EuTTA in den Perlen wurde wie oben spektralphotometrisch bestimmt
und betrug 0,07 M.
Da die Konzentration von Dioxen nicht in
Gegenwart von EuTTA bestimmbar ist, wurde sie unter den gleichen
Bedingungen in Perlen gemessen, die nur mit Dioxen beladen waren.
Die Konzentration betrug 0,016 M.
- B. Signalerzeugung: Eine Suspension von Perlen (25 μg) in Phosphatpuffer
(0,5 ml, 20 mM Phosphat, 50 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, pH 7,0) wurde
mit einer Lösung
von 2 μM
Aluminium-Phthalocyanintetrasulfonat (0,5 ml) im gleichen Puffer
vermischt. Das Gemisch wurde 1 min lang mit einer 125 W-Wolfram-Halogen-Lampe,
die mit einem 610 nm-Langpassfilter ausgestattet war, beleuchtet.
Nach der Beleuchtung wurde das Gemisch in ein Turner TD-20e-Luminometer
eingebracht und die Lumineszenz 20 s lang gemessen. Die Intensität betrug
327 RLU (relative Lichteinheiten)/s.
Die Wellenlänge des
emittierten Lichts wurde mit einem Perkin-Elmer 650-40-Scanning-Spektralfluorimeter gemessen.
Der Haupt-Emissionspeak lag bei etwa 615 nm.
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II. Testverfahren
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EDAC/NHS-Kupplung von
Antikörper
an 40 nm-Perlen
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73,6
mg Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid, Pierce Chemical Co. #24510
G) wurden in 6 ml einer Suspension von 4 mg/ml Carboxylat-modifizierten
40 nm großen
Polystyrolperlen (gefärbt
mit Chlorophyll-a und Tetrabutylsquarat) in Wasser gelöst. 136 μl 0,5 M Na2HPO4 wurden zugegeben.
Der pH-Wert wurde auf 5,2 eingestellt. 136 μl zusätzliches Wasser wurden zugegeben.
130,4 mg EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid,
Sigma Chemical Co. #E-6383) in 454 μl Wasser wurden der gerührten Perlen-Suspension
langsam zugegeben. Die Suspension wurde 20 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Perlen wurden 20 min lang bei 15.000 U/min in Sorvall
SA-600 Rotor bei 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen. Die Perlen wurden in 1,2 ml 5 mM Natriumphosphat,
pH 5,8, resuspendiert und die Suspension beschallt, um Perlen zu
redispersieren. Die Perlen wurden langsam 4,8 ml zu einer gerührten Lösung von
1,7 mg/ml IgG (monoklonales Anti-Fluorescein) + 6,7 mg/ml BSA +
17 mM Borax, pH 9,2, zugegeben und vorsichtig über Nacht bei 4 °C vermischt.
800 μl 2
M Glycin wurden der Perlensuspension zugegeben, gefolgt von 2,8 ml
50 mg/ml BSA in 0,1 M Borax. Die Suspension wurde beschallt und
3 h lang bei 4 °C
vorsichtig vermischt. Die Perlen wurden 30 min lang bei 15.000 U/min
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen. Die Perlen wurden in 3 ml 50 mM Natriumphosphat
+ 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert und die Suspension beschallt.
Die Zentrifugations-, Resuspensions- und Beschallungsschritte wurden
für insgesamt
drei Zentrifugationen wiederholt. Nach der dritten Zentrifugation
wurden die Perlen in 2,4 ml 50 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH
7,6, resuspendiert. Die resultierende Suspension wurde beschallt
und bei 4 °C
gelagert.
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EDAC/NHS-Kopplung von
Avidin-D an 175 nm-Perlen
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4,4
mg Sulfo-NHS wurden in 0,4 ml einer Suspension von 25 mg/ml Carboxylat-modifizierten
175 nm-Polystyrolperlen (gefärbt
mit Dioxen/EuTTA/TOPO) in Wasser gelöst. 0,0160 ml 0,25 M Na2HPO4 wurden zugegeben.
8 mg EDAC, gelöst
in 0,030 ml Wasser, wurde langsam der gerührten Perlensuspension zugegeben.
Die Suspension wurde 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Perlen wurden 20 min lang bei 15.000 U/min in Sorvall SA-600 Rotor
bei 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen.
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Die
Perlen wurden in 0,6 ml 0,005 M Natriumphosphat, pH 5,8, resuspendiert.
Die Suspension wurde beschallt, um Perlen zu resuspendieren. Die
Perlen wurden wiederum langsam zu 3 ml einer gerührten Lösung zugegeben, umfassend 1,33
mg/ml Avidin-D (Vector) + 17 mM Borax, pH 9,2, und vorsichtig über Nacht
bei 4 °C
vermischt. 0,004 ml 1 M Bernsteinsäureanhydrid in DMF wurde zugegeben.
Die Suspension wurde 1 h lang bei 4 °C unter vorsichtigem Mischen
inkubiert. 0,4 ml 50 mg/ml BSA in 10 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl,
pH 7,0, wurden zugegeben. Die Suspension wurde vorsichtig 3 h lang
bei 4 °C
vermischt. Die Perlen wurden 30 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert.
Der Überstand
wurde verworfen. Die Perlen wurden in 3 ml 50 mM Natriumphosphat
+ 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde beschallt.
Die Zentrifugations-, Resuspensions- und Beschallungsschritte wurden über insgesamt
drei Zentrifugationen wiederholt. Nach der dritten Zentrifugation
wurden die Perlen in 2,25 ml 50 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl,
pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde beschallt und bei 4 °C gelagert.
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Voll-T3-Test
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- Testpuffer: 0,075 M Barbital, 0,2 M NaCl, 0,4 % BSA, 1,25
% Mäuse-IgG,
10 mg/ml Dextransulfat (Molekulargewicht 500.000), 1,0 mg/ml Dextran
T-500, 10 μg/ml
aggregiertes IgG.
- Perlen
- Akzeptorperlen: Avidin-EDAC, 175 nm, beladen mit Dioxen/EuTTA/TOPO.
- Sensibilisatorperlen: Anti-Fluorescein-EDAC, 40 nm, beladen
mit Chlorophyll-a/Squarat
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Test-Arbeitsvorschrift
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50 μl einer Lösung von
8-Anilino-1-napthalinsulfonsäure,
Ammoniumsalz (Sigma, A-3125)
in Testpuffer (0,75 mg/ml) wurden 50 μl T
3-Standard
oder Probe zugegeben. 100 μl
Testpuffer wurden zugegeben. 50 μl biotinyliertes
Anti-T
3 (70 ng/ml) in Testpuffer wurden
zugegeben. Der Tracer, T
3-LC
21-Fl
(1,8 ng/ml) T
3-LC
21-Fl
in Testpuffer
(50 μl)
wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 15 min lang bei 37 °C inkubiert.
500 μl einer
Suspension von Sensibilisatorperlen (50 μg) und Akzeptorperlen (6,25 μg) in Testpuffer
wurden zugegeben und das Gemisch 15 min lang bei 37 °C inkubiert.
Es wurde dann die "Stopperlösung" (50 μl; 10 μM Fluorescein, 0,5
mM Biotin) zugegeben.
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Signal
wurde durch eine mit einem 610 nm-Cutoff-Filter ausgestattete Halogenlampe
abgelesen (Bestrahlung 1 min, Messung 20 s).
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Ergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in 10 zusammengefasst. Das Lumineszenzsignal
ist als Funktion der T3-Konzentration aufgetragen.
Die Signalmodulation betrug 94 % mit 8,5 ng/ml T3.
Bei 0,5 ng/ml betrug die Signalmodulation 38 %.
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Obwohl
die dargelegte Erfindung zum besseren Verständnis und zur klareren Verdeutlichung
anhand von Beispielen detailliert beschrieben wurde, sollte klar
sein, dass bestimmte Veränderungen
oder Modifizierungen, ohne vom Schutzumfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen,
vorgenommen werden können. Tabelle
1 Detektion
von synthetischem Target, das sich an die Bio-Sonde und Fl-Sonde
bindet
Tabelle
2 Detektion
von biotinyliertem Amplifikationsprodukt
Produkt | RLU |
1.
20 % (108)a | 79 |
2.
20 % (106)a | 45 |
3.
20 % (104)a | 25 |
4.
20 % (0)a | 9 |
a 20 % Amplifikationsreaktions-Volumen
mit anfänglicher
Anzahl an Targetmolekülen
im Reaktionsgemisch ( ).