JP3426241B2 - 化学発光アッセイ用金属キレート含有組成物 - Google Patents

化学発光アッセイ用金属キレート含有組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、試料中の分析物を測定するための方法、組
成物、およびキットに関するものである。特に、本発明
は、一重項酸素により活性化した場合に、迅速に崩壊
し、かつ長波長で放出する高い量子収率の化学発光を示
す組成物に関するものである。
臨床診断分野は、容易かつ正確に測定し得る物（分析
物）の種類、並びに、測定方法の両方に関して、近年大
きな広がりを見せている。液体中に低濃度で存在する物
質を測定するための好便で信頼でき、かつ有害でない方
法が望まれている。臨床化学において、これらの物質
は、体液中に10-12モル以下の濃度で存在することもあ
る。これら低濃度の物質を検出する困難さは、利用し得
る試料サイズが比較的小さい場合に増大する。
アッセイを開発する際には、多くの考慮すべき問題が
存在する。１つの考慮点は、分析物の濃度変化に対する
シグナル応答である。第２の考慮点は、実施に際しての
アッセイプロトコールの容易さである。第３の考慮点
は、試料間の干渉の多様性である。有用なアッセイを開
発する際の更なる考慮点には、試薬類の製造および精製
の容易さ、設備の利用可能性、自動化の容易さ、および
対象物質との相互作用がある。
広い技術範疇の一つは、分析物存在の関数として、標
識化リガンドの特定の空間的および極性の構成に特異的
に結合できる受容体の使用に関する。受容体が結合する
ことにより観察される効果は、標識によって変わるもの
である。ある場合には、受容体が結合することにより、
単に、結合標識化リガンドと非結合標識化リガンドとの
分子量の相違を生ずる。他の場合には、受容体の結合
が、結合標識化リガンドの遊離標識化リガンドからの分
離を容易ならしめるものであったり、または、標識化リ
ガンドに結合する受容体の量に応じてシグナルが変化す
るように標識から得られたシグナルの性質に影響を及ぼ
すこともある。受容体を標識化し、リガンドを標識化し
ないというような更なるバリエーションもある。別法と
して、受容体およびリガンドの双方を標識化するか、ま
たは異なる受容体を２つの異なる標識で標識化するが、
その際、標識は、極めて近接している場合に相互作用
し、かつ存在するリガンドの量は、受容体の標識が相互
作用し得る度合に影響を与えるものである。
依然として、広範囲の様々なリガンド類に適用できる
か、または他の方法が容易に適用可能でない特定の場合
に使用できる、新規かつ正確な技術に対する要望があ
る。
均一系イムノアッセイは、小分子の場合には、既に報
告されている。これらのアッセイには、シバのFRAT（登
録商標）アッセイ、EMIT（登録商標）アッセイ、酵素チ
ャンネリングイムノアッセイ、および、蛍光エネルギー
転移イムノアッセイ（FETI）；酵素阻害因子イムノアッ
セイ（ホフマン・ラロッシュおよびアボット・ラロラト
リーズ）；蛍光分極化（fluorescence polarization）
イムノアッセイ（ダンドリッカー）、その他がある。こ
れらの方法は全て、感度に限界があり、FETIおよび酵素
チャンネリングを含む２、３の方法のみが、大分子多エ
ピトープ性分析物に適している。蛍光化合物類および化
学発光化合物類などの発光化合物類は、その光放出能力
のため、アッセイ分野において広く応用されている。こ
の理由から、発光物質は、核酸アッセイおよびイムノア
ッセイのようなアッセイにおける標識として利用されて
きた。例えば、特異的結合対の一員を発光物質とコンジ
ュゲートとさせて、様々なプロトコールを採用する。発
光物質コンジュゲートは、分析物を含有する疑いのある
試料中の分析物の量と相関して、固相および液相間に分
配され得る。いずれかの相の発光を測定することによ
り、観察される発光のレベルを試料中の分析物の濃度に
対して関係づけることができる。
リポソーム類および赤血球ゴーストなどの粒子類は、
被包性水溶性物質のキャリアーとして利用されてきた。
例えば、リポソーム類は、薬物をリポソーム製剤中に封
じ込め、次いで、処理すべき患者に投与する薬剤輸送シ
ステムなどの様々な用途のために、生物学的に活性な物
質を封入するのに採用されてきた。
ラテックス・ビーズおよびリポソームなどの粒子類
も、各アッセイに利用されている。例えば、均一系アッ
セイにおいて、酵素を、抗体または抗原で標識したリポ
ソームの水性相に封じ込めることができる。試料および
補体の存在下で、リポソームは、酵素を放出することに
なる。抗体または抗原標識化リポソームで、水性相内に
封入された水溶性蛍光または非蛍光染料、または脂質小
胞の脂質二重層に、またはラテックスビーズに溶解した
脂溶性染料を有するものは、表面結合抗体または抗原と
の免疫化学反応に参入する能力のある分析物をアッセイ
するのにも利用されている。染料をリポソームの水性相
から放出するために合成洗剤が使用されている。
2.関連技術の簡単な説明 ホワイト等（ホワイト）は、ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティー、93巻、6286頁（19
71年）において“ケミカリー・プロデュースド・エキサ
イテッド・ステイツ．エネルギー・トランスファー，フ
ォトケミカル・リアクションズ・アンド・ライト・エミ
ッション”を論じている。
マックカプラ等（マックカプラ）は、テトラヘドロン
・レターズ、23:49、5225−5228頁（1982年）において
“メタル・カタライズド・ライト・エミッション・フロ
ム・ア・ジオキセタン”を開示している。
ウィルド等（ウィルド）は、ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティー、93（23）、6286−
6288頁（1971年）において“ザ・ジオキセタン−センシ
タイズド・ケミルミネセンス・オブ・ランタニド・キレ
ーツ．ア・ケミカル・ソース・オブ・’モノクロマティ
ック’・ライト”を開示している。
ハンドレイ等（ハンドレイ）は、テトラヘドロン・レ
ターズ、26巻、3183頁（1985年）において“エフェクツ
・オブ・ヘテロアトム・サブスティテューエンツ・オン
・プロパティーズ・オブ・1,2−ジオキセタンズ”を開
示している。
ザクリカ等（ザクリカ）は、ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティー、100、4916頁（197
8年）において、“サブスティテューエント・エフェク
ツ・オン・ザ・デコンポジション・オブ・1,2−ジオキ
セタンズ”を論じている。
ヨーロッパ公開特許出願第0,345,776号（マックカプ
ラ）は、標識として感光剤を利用する特異的結合アッセ
イを開示している。感光剤は、１またはそれ以上の波長
の放射による励起、またはその他の化学的または物理的
刺激（例えば、電子転移、電気分解、エレクトロルミネ
センス、またはエネルギー転移）により刺激したとき
に、（ａ）一重項分子酸を産生する分子酸素との相互作
用の際に、または（ｂ）分子酸素と相互作用して過酸化
水素が生じることによりその元の非励起状態に戻され得
る還元型を呈するロイコ染料との相互作用の際に、励起
状態に達する、あらゆる部位を含む。励起した感光剤と
のいずれかの相互作用は、試薬の添加により、検出可能
なシグナルを産生するものである。
ヨーロッパ公開特許出願第0,070,685号（ヘラー等）
は、非放射性エネルギー転移による均一核酸ハイブリダ
イゼーション診断を記載している。
光−放出ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション診
断法は、ヨーロッパ特許出願第0,070,687（へラー等）
に記載されている。
発明の概要 本発明の一態様は、（ａ）ユーロピウム、テルビウ
ム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム、および
ルテニウムからなる群から選択される金属を、少なくと
も六配位結合状態で含んでなる金属キレートと、（ｂ）
２つのアリール基で置換された二重結合、酸素原子、お
よび、酸素、硫黄、および窒素からなる群から選択され
る原子、である構造部分を有する化合物を含む組成物に
関する。これらのアリール基は、一方が他方に対して電
子供与するという特徴を持つ。好ましくはこの組成物
は、ラテックス粒子物質中に組み込まれている。
本発明のその他の態様は、式： 式中、X'はＳまたはNR'、ただし、R'は、アルキルまた
はアリールである、であり、ＤおよびD'は、独立して、
アルキルおよびアルキルラジカルからなる群から選択さ
れる、で示される化合物である。
本発明のその他の態様は、式： 式中、X"はＯ、ＳまたはNR"、ただし、R"は、アルキル
またはアリールである、であり、ｎは１ないし４であ
り、ArおよびAr'は、独立してアリールであるが、Arま
たはAr'の一つがもう一方に対して電子供与するもので
あり、Ｙは水素、またはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＰから
なる群から選択される原子からなる有機基であり、ｍは
０ないし２である、で示される化合物である。
本発明の別の態様は、化合物１を中に組み込んでいる
ラテックスを含む組成物である。
本発明の他の態様は、（ａ）（１）該分析物を含有す
る疑いのある媒質、（２）酸素をその励起状態で活性化
して一重項状態にする能力のある光増感剤、ただし、該
光増感剤は特異的結合対（sbp）構成員と結合している
ものである、および（３）sbp構成員を結合しているラ
テックス粒子物質内に組み込まれた上記組成物の１つを
組み合わせて提供し、（ｂ）該組み合わせを光で処理し
て該光増感剤を励起させ、そして（ｃ）そこから放出さ
れた発光量について該組み合わせを試験することを含ん
でなる、分析物の測定法に関する。この発光量は媒質中
の分析物の量と相関する。
本発明のその他の態様は、パッケージした組み合わせ
物中に、（１）上記化合物の一つを含む懸濁可能なラテ
ックス粒子を含んでなる組成物、および（２）光増感剤
を含んでなるキットである。該粒子には、特異的結合対
（sbp）構成員が結合している。光増感剤は、酸素をそ
の励起状態で活性化して一重項状態にする能力があるも
のである。
発明の詳細な説明 本発明は、一重項酸素による活性化に際し、迅速に衰
退する、一般には、0.5秒ないし30分、好ましくは0.5な
いし30秒、普通は、20秒以下の半減期を有する化学発光
放出を示す化学発光組成物に関する。加えて、本発明の
化学発光組成物は、一重項酸素による活性化に際し、高
い化学発光量子収率、一般には0.1ないし0.9、普通は0.
1ないし0.6、好ましくは0.2ないし0.4を示し得る。本発
明の組成物において、活性化後、金属キレートにより放
出される化学発光の光は、一般に、約550ないし700nm、
普通は600nm以上の波長を有する。本発明の化学発光組
成物は、特に、発光アッセイにおいて有用である。例え
ば、長波長放出により、血液または血清試料のアッセイ
において血清吸収が避けられる。高い量子収率は検出能
を改善するものであり、短い寿命は、放出される全ての
光を長い期間よりもむしろ短いパルスで伝達させること
により、さらに検出能を改善するものである。これによ
り、より低い量子収率でもより高い光強度を提供でき
る。
本化学発光組成物の化学発光の量子収率は、一重項酸
素により活性化した場合、組成物の成分を個別に照射し
て観察されるよりも、一般に10ないし100倍増、好まし
くは10ないし50倍増である。さらに、化学発光の衰退速
度は、本発明の組成物類の幾つかでは顕著に高い。これ
らの特性は、本発明の組成物を分析物の測定アッセイに
おいて非常に有用なものにしている。
更に、本発明の特定の実施態様の記載に進む前に、多
くの用語を詳細に定義および記載する。
金属配位子−−同一分子の２またはそれ以上の原子が
金属と配位して、金属キレートを形成する化合物。本発
明の組成物の部分を形成する金属キレートは、ユーロピ
ウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマリウム、オス
ミウム、およびルテニウムからなる群から選択される金
属を含んでなる。上記金属の１つは、１またはそれ以上
の金属配位子と配位し、これは、例えば、３−（２−チ
エノイル）−1,1,1−トリフルオロアセトン（TTA）、３
−ベンゾイル−1,1,1−トリフルオロアセトン（BFT
A）、３−ナフトイル−1,1,1−トリフルオロアセトン
（NPPTA）、2,2−ジメチル−４−ペルフルオロブチオイ
ル−３−ブタノン（fod）、2,2'−ジピリジル（bpy）、
フェナントロリン（phen）、サリチル酸、フェナントロ
リンカルボン酸、ビピリジルカルボン酸、アザクラウン
エーテル類、トリオクチルホスフィンオキシド、アザク
リプタン類、などであり得る。通常、金属キレート中の
金属は、少なくとも六配位結合しているが、八配位結合
またはより多く配位結合している場合もあり、金属配位
子によって変わる。金属キレートは、非荷電であるの
で、その配位子により与えられる酸性基の数は、金属の
酸化状態に等しい。通常、金属配位子は、非極性溶媒に
おける金属キレートの溶解性を分与するために、相対的
に疎水性である。希土類金属は、普通、酸化状態３を有
し、ルテニウムは、酸化状態２を有し、オスミウムは、
酸化状態２を有する。このような金属キレートの例は、
下記の通りであるが、例示であって、限定ではない： ３（ａ）または３（ｂ）におけるTTAの１つは、下記の
１つにより置換できる： ただし、３（ｂ）におけるDPP（ジフェニルフェナン
トロリン）は、下記の１つにより置換できる： ３（ａ）および３（ｂ）におけるTTAの２つは、独立し
て、下記から選択される化合物により置換できる： TTAの３つは、独立して、下記から選択される化合物に
より置換できる： これらの金属配位子および金属キレートの多くは、当分
野では知られており、多くは商業的に入手出来る。一般
に、金属キレート類は、例えばアセトニトリル、および
放出された塩酸を取り込むのに十分な塩基、例えば、ピ
リジン、などの有機溶媒中、金属クロリドを所望の割合
の金属配位子分子と化合することにより、金属配位子か
ら調製できる。例えば、金属キレート類は、シンハ,A.
P.による、スペクトロスコーピー・インオーガニック・
ケミストリー、２巻（1971）、255−288頁、“フルオレ
センシィズ・アンド・レーザー・アクション・イン・レ
ア・アース・キレーツ”に記載されているような方法で
調製できる。
アリール基−−芳香族炭化水素から１原子を除くこと
に生じ、１またはそれ以上の芳香環、通常は、１ないし
４の芳香環を含有する有機基であって、一般に、例え
ば、フェニル（ベンゼン由来）、ナフチル（ナフタレン
由来）、ビフェニレニル、アズレニル、アントリル、フ
ェナントレニル、ピリジル、インドリル、ベンゾフラニ
ル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、イソキノリニ
ル、カルバゾリル、アクリジニル、イミダゾリル、チア
ゾリル、ピラジニル、ビリミジニル、プリニル、プテリ
ジニル、等などの、５または６員環。
アラルキル−−アリール基が結合したアルキル基を有
する有機基、例えば、ベンジル、フェネチル、３−フェ
ニルプロピル、１−ナフチルエチル、等。
電子供与基−−分子に結合したとき、電子供与基が電
子貧弱になって、分子のその他の部分と比べて正に荷電
するように分子を分極化する能力がある、即ち、電子密
度を低減する置換基。かかる基は、例示説明であって限
定ではないが、アミン類、エーテル類、チオエーテル
類、ホスフィン類、ヒドロキシ、オキシアニオン類、メ
ルカプタン類、およびそれらのアニオン類、スルフィド
類等であり得る。
アルキル−−脂環式炭化水素から水素原子１つを除去
することにより生じる一価分枝状または非分枝状基；低
級アルキルおよび高級アルキルの両方を含む。
アルキルラジカル−−チオエーテルを含むエーテル、
アミド、エステル、および同種物などの官能基により共
に連結された、独立して低級または高級アルキル基であ
り得る２またはそれ以上のアルキル基、から形成される
置換基。
低級アルキル−−１ないし５の炭素原子を含有するア
ルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチ
ル、等。
高級アルキル−−６以上の炭素原子、通常、６ないし
20の炭素原子を含有するアルキル基、例えば、ヘキシ
ル、ヘプチル、オクチル、等。
アルキリデン−−脂肪族炭化水素から、２つの水素原
子を同一の炭素原子から取って生じる二価有機基、例え
ば、エチリデン。
置換された−−分子の水素原子が、ハロゲン等のよう
な単一原子であり得る他の原子、または、１から50の原
子（かかる原子の原子価を満たすのに必要な必須数の水
素原子以外）、ただし、各原子は、独立して、炭素、酸
素、窒素、硫黄、およびリンからなる群から選択され、
かつ１またはそれ以上の金属原子と結合していてもよ
く、また結合していなくてもよい、を有する置換基など
の官能基を形成する原子群の一部で置き換えられたこと
を意味する。
分析物−−検出すべき化合物または組成物。分析物
は、特異的結合対（sbp）の一員を含んで成ることがで
き、リガンドであっても良く、一価（モノエピトープ
性）または多価（多エピトープ性）であり、普通は、抗
原性またはハプテン性であり、共通のエピトープ部位ま
たは決定因子部位の少なくとも１つを共有する単一化合
物または複数の化合物である。分析物は、バクテリアな
どの細胞、またはＡ、Ｂ、Ｏ等のような血液型抗原、ま
たはHLA抗原を持つ細胞、または微生物、例えば、バク
テリア類、真菌類、原生動物類、またはウイルスなどの
細胞の一部であることができる。
多価リガンド分析物は、普通、ポリ（アミノ酸）、即
ち、ポリペプチド類およびタンパク質類、ポリサッカラ
イド類、核酸類およびそれらの組み合わせである。この
ような組み合わせは、バクテリアの各成分、ウイルス
類、染色体類、遺伝子類、ミトコンドリア、核、細胞
膜、および同種物を含む。
ほとんどの場合、当該発明を適用できる多エピトープ
性リガンド分析物は、少なくとも約5,000、より普通に
は、少なくとも約10,000の分子量を有する。ポリ（アミ
ノ酸）の範疇では、対象となるポリ（アミノ酸）は、一
般に、分子量約5,000から5,000,000、より普通には、分
子量約20,000から1,000,000である；対象となるホルモ
ン類の間では、分子量は、普通、約5,000から60,000の
範囲である。
類似の構造的特徴を有するタンパク質類、特定の生物
学的機能を有するタンパク質類、特定の微生物、特に疾
病を生ぜしめる微生物に関するタンパク質類、等のファ
ミリーについて、タンパク質の多様さを考慮することが
できる。このようなタンパク質には、例えば、免疫グロ
ブリン類、サイトカイン類、酵素類、ホルモン類、癌抗
原、栄養学的マーカー類（nutritional markers）、組
織特異的抗原等がある。
下記は、構造により関連するタンパク質の分類であ
る：プロタミン類、ヒストン類、アルブミン類、スクレ
ロタンパク質類、リンタンパク質類、ムコタンパク質
類、色素タンパク質類、リポタンパク質類、核タンパク
質類、糖タンパク質類、Ｔ細胞受容体、プロテオグリカ
ン類、HLA、非分類タンパク質類、例えば、ソマトトロ
ピン、プロラクチン、インシュリン、ペプシン、血液凝
固因子類などのヒト血漿中に見いだされるタンパク質
類、ムコポリサッカライド類およびポリサッカライド類
などの他のポリマー物質、バクテリア、ウイルス、およ
び真菌などの微生物。
モノエピトープ性リガンド分析物類は、一般に、分子
量約100から2,000であり、より普通には、分子量125か
ら1,000である。分析物には、薬剤類、代謝物類、農
薬、汚染物質、および同等物がある。対象となる薬剤類
の中には、アルカノイド類、ステロイド類、ステロイド
疑似物質、ラクタム類、アミノアルキルベンゼン類、ベ
ンズ複素環類、プリン類、マリファナから誘導されるも
の、ホルモン類、ビタミン類、プロスタグランジン類、
三環状抗うつ薬類、抗新生物薬、抗生物質、ヌクレオシ
ド類およびヌクレオチド類、メタドン、メプロバメー
ト、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカイン
アミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノール、
グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン類、抗
ヒスタミン類、クロラムフェニコール、アトロピンなど
の抗コリン作用薬類を含む種々雑多な個々の薬剤、スペ
ルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸、および１
型ポルフィリンを含む疾患状態に関連する代謝物、アミ
ノグルコシド類、ポリハロゲン化ビフェニル類、リン酸
エステル類、チオホスフェート類、カルバメート類、ポ
リハロゲン化スルフェンアミド類が含まれる。
受容体分析物の場合、分子量は、一般に、10,000から
２×108、より普通には、10,000から106の範囲である。
免疫グロブリン類、IgA、IgG、IgE、およびIgMの場合、
分子量は、一般に、約160,000から約106で変わる。酵素
類は、通常、分子量約10,000から1,000,000の範囲であ
る。天然の受容体は、広範囲に変わるが、一般に、少な
くとも分子量約25,000であり、106、またはそれ以上の
分子量であることもあり、アビジン、DNA、RNA、チロキ
シン結合グロブリン、チロキシン結合プリアルブミン、
トランスコルチン、等などの物質類を含む。
分析物の用語は、更に、下記に定義するポリヌクレオ
チド類のようなポリヌクレオチド分析物を含む。これら
は、ｍ−RNA、ｒ−RNA、ｔ−RNA、DNA、DNA−RNA二本鎖
分子等を含む。また、分析物の用語は、例えば、制限酵
素類、アクチベーター類、レプレッサー類、ヌクレアー
ゼ類、ポリメラーゼ類、ヒストン類、修復酵素類、化学
療法薬、および同種物などのポリヌクレオチド結合成分
類である受容体を含む。
分析物は、宿主由来の体液のような試料中に直接見い
出される分子であり得る。この試料は、直接調べること
ができ、分析物をより容易に検出可能にするために前処
理することもできる。更に、対象となる分析物は、対象
となる分析物に相補的な特異的結合対構成員などの、対
象となる分析物の存在証拠となる成分を検出することに
より測定でき、これらの存在は、対象となる分析物が試
料中に存在する場合のみ、検出される。従って、分析物
の存在証拠となる成分が、アッセイにおいて検出される
分析物となるのである。体液は、例えば、尿、血液、血
漿、血清、唾液、***、糞、たん、脳脊髄液、涙、粘
液、および同種物であることができる。
特異的結合対構成員（“sbp構成員”）−−他の分子
の特定の空間および極性の構成と特異的に結合し、それ
によって、他の分子の特定の空間的および極性の構成と
相補的なものとして定義される領域を表面上または腔内
に有する、２つの異なる分子のうちの１つ。特異的結合
対の一員は、リガンドおよび受容体（アンチリガンド）
として表される。これらは、普通、抗原−抗体などの免
疫学的ペアの一員であり、ビオチン−アビジン、ホルモ
ン類−ホルモン受容体類、核酸二本鎖分子、IgG−プロ
テインＡ、DNA−DNA、DNA−RNAなどのポリヌクレオチド
対、および同等物などの他の特異的結合対は、免疫学的
ペアではないが、本発明、およびsbp構成員の定義に含
まれる。
ポリヌクレオチド−−天然状態で、約50ないし500,00
0またはそれ以上のヌクレオチドを有し、かつ単離状態
で、約15ないし50,000またはそれ以上のヌクレオチド、
普通は、約15ないし20,000ヌクレオチド、より頻繁に
は、15ないし10,000ヌクレオチドを有する、ポリマーヌ
クレオチドである化合物または組成物。ポリヌクレオチ
ドは、天然に生じる、または合成的に生成される、任意
の供給源由来の精製または非精製形態の核酸類を含み、
DNA（dsDNAおよびssDNA）およびRNA、普通はDNA、を含
み、ｔ−RNA、ｍ−RNA、ｒ−RNA、ミトコンドリアDNAお
よびRNA、葉緑体DNAおよびRNA、DNA−RNAハイブリッド
類、またはそれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミ
ド類、微生物類、例えば、バクテリア、酵母類、ウイル
ス類、ウイロイド類、糸状菌、真菌、植物、動物、ヒト
などの生物学的物質のゲノム、それらのフラグメント類
および同種物であり得る。
リガンド−−受容体が天然に存在するか、または調製
できる、あらゆる有機化合物。
リガンド類似体−−通常分子量100以上の修飾リガン
ド類、有機基、または分析物類似体であり、受容体に対
する類似リガンドと拮抗でき、該修飾により、リガンド
類似体を他の分子に結合させる手段を提供する。リガン
ド類似体は、必要ではないが、より多くの水素がリガン
ド類似体をハブまたは標識に連結させる結合で置換され
ている点で、普通、リガンドとは異なる。リガンド類似
体は、リガンドに対するのと同様の方法で受容体に結合
できる。類似体は、例えば、リガンドに対する抗体のイ
ディオタイプを指向する抗体であってもよい。
受容体（“アンチリガンド”）−−分子の特定の空間
的および極性の構成、例えば、エピトープ性部位または
決定因子部位を認識する能力のあらゆる化合物または組
成物。例示的な受容体類には、天然に生じる受容体類、
例えば、チロキシン結合グロブリン、抗体類、酵素類、
Fabフラグメント類、レクチン類、核酸類、プロテイン
Ａ、補体成分C1q、および同種物がある。
特異的結合−−２つの異なる分子のうちの１つが、も
う一方の分子に対し、その他の分子類の場合の実質的に
低い認識と比べて、特異的に認識すること。一般に、こ
の分子は、その表面上、または腔内に、２つの分子間の
特異的認識を生ぜしめる領域を有する。特異的結合の例
は、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌ
クレオチド相互作用、およびその他である。
非特異的結合−−特異的表面構造から比較的独立して
いる分子間の非共有結合。非特異的結合は、分子間の疎
水性相互作用を含む幾つかの要因から生じ得る。
抗体−−もう一方の分子の特定の空間的および極性の
構成に特異的に結合し、それによって、もう一方の分子
の特定の空間的および極性の構成と相補的であると定義
される免疫グロブリン。抗体は、モノクローナルまたは
ポリクローナルであることができ、当業者にはよく知ら
れた技術、例えば、宿主の免疫感作、および血清（ポリ
クローナル）の収集により、または連続的ハイブリッド
細胞ラインを調製し、分泌タンパク質（モノクローナ
ル）を調製することにより、または、クローニングし
て、少なくとも天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列またはその変異バー
ジョンを発現させることにより、調製できる。抗体類
は、完全な免疫グロブリンまたはそれらのフラグメント
を含み、免疫グロブリン類には、様々な分類およびアイ
ソタイプがあり、例えば、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2
a、IgG2bおよびIgG3、IgM、等である。それらのフラグ
メント類は、Fab、FvおよびＦ（ab'）２、Fab'、および
同等物を含み得る。加えて、免疫グロブリン類またはそ
れらのフラグメントの凝集体類、ポリマー類、およびコ
ンジュゲート類は、特定分子に対する結合親和性を維持
するのに十分適切な場合に、使用することができる。
各原子が、独立して、炭素、酸素、窒素、硫黄、およ
びリンからなる群から選択される、１ないし50の原子
（該原子の原子価を満たすのに必要な必須数の水素原子
以外）を有する置換基−−有機基；有機基は、基内の原
子の原子価を満たすのに必要な必須数の水素原子以外の
１ないし50の原子を有する。一般に、主要原子は、炭素
（Ｃ）であるが、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄
（Ｓ）、リン（Ｐ）であっても良く、存在するならば、
Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＰは、炭素またはお互いの１または
それ以上と、または水素または金属原子と結合して、例
えば、カルボン酸類、アルコール類、チオール類、カル
ボキサミド類、カルバメート類、カルボン酸エステル
類、スルホン酸類、スルホン酸エステル類、リン酸類、
リン酸エステル類、尿素類、カルバメート類、ホスホル
アミド類、スルホンアミド類、エーテル類、スルファイ
ド類、チオエーテル類、オレフィン類、アセチレン類、
アミン類、ケトン類、アルデヒド類、ニトリル類、およ
び同等物のような様々な官能基を形成することができ
る。このような有機ラジカルまたは基の例には、アルキ
ル、アルキリジン、アリール、アラルキル、および上記
官能基の１またはそれ以上で置換されたアルキル、アリ
ール、およびアラルキルがあるが、これらは例示であっ
て限定ではない。
連結基−−分子間の共有結合。連結基は、分子、例え
ば、光増感剤、化学発光化合物、sbp構成員、または連
結されている粒子または粒子の一部と結合した分子、の
性質に依存して変わる。光増感剤または化学発光化合物
に普通に存在するか、または導入される官能基類は、こ
れらの分子をsbp構成員に、またはラテックス粒子など
の粒子に連結させるために採用されるものである。
ほとんどの場合、カルボニル官能性が有用であり、オ
キソカルボニル基、例えば、アルデヒド類、および非オ
キソカルボニル基（窒素および硫黄類似体を含む）、例
えば、カルボキシ、アミジン、アミデート、チオカルボ
キシ、およびチオノカルボキシの双方である。
オキソ以外の別の官能性には、活性ハロゲン、ジア
ゾ、メルカプト、オレフィン、特に、活性化オレフィ
ン、アミノ、ホスホロ、および同種物がある。連結基の
説明は、米国特許第3,817,837号に見ることができ、こ
の開示は、本明細書に参照して組み込んである。
連結基とコンジュゲートされた分子との間の共有結合
形成における共通の官能性は、アルキルアミン、アミジ
ン、チオアミド、エーテル、尿素、チオウレア、グアニ
ジン、アゾ、チオエーテル、およびカルボキシレート、
スルホネート、およびリン酸エステル類、アミド類およ
びチオエステル類である。
たいていの場合、光増感剤および化学発光化合物は、
窒素および硫黄類似体、ホスフェート基、アミノ基、ハ
ロまたはトシルアルキルなどアルキル化剤、オキシ（ヒ
ドロキシまたは硫黄類似体、メルカプト）、オキソカル
ボニル基（例えば、アルデヒドまたはケトン）、または
活性オレフィン、例えば、ビニルスルホン、またはα，
β−不飽和エステルを含む、非オキソカルボニル基を有
するものである。これらの官能性は、アミン基、カルボ
キシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えば、ブ
ロモアセチル、に連結させるものである。アミンおよび
カルボン酸、またはその窒素誘導体、またはリン酸を連
結させると、アミド類、アミジン類、およびホスホルア
ミド類が形成される。メルカプタンおよび活性オレフィ
ンを連結させると、チオエーテル類が形成される。メル
カプタンとアルキル化剤を連結させると、チオエーテル
類が形成される。アルデヒドおよびアミンを還元条件下
で連結させると、アルキルアミンが形成される。カルボ
ン酸またはリン酸、およびアルコールを連結させると、
エステルが形成される。
光増感剤−−通常、光を伴う励起により一重項酸素を
産生する増感剤。光増感剤は、光活性可能（例えば、染
料類および芳香族化合物類）であり得るか、または化学
活性化されるもの（例えば、酸素類および金属塩類）で
有り得る。光により励起される場合、光増感剤は、普
通、共有結合した原子から成る化合物であり、通常、多
コンジュゲート化二重結合または三重結合を伴う。該化
合物は、200−1100nm、普通は300−1000nm、好ましくは
450ないし950nmの範囲の波長で光を吸収し、その吸収極
大で、500M-1cm-1以上、好ましくは少なくとも5000M-1c
m-1、より好ましくは励起波長で少なくとも50,000M-1cm
-1の消光係数を伴うべきである。酸素不在下で光の吸収
の後に生じる励起状態の寿命は、普通、少なくとも100n
sec、好ましくは少なくとも1msecである。一般に、寿命
は、酸素へエネルギーを転移させるのに十分に長くなけ
ればならず、普通は媒質によって変わるが、10-5ないし
10-3Mの範囲の濃度で存在するものである。該増感剤の
励起状態は、普通、その基底状態とは異なるスピン量子
数（Ｓ）を有するものであり、普通は、通常の場合のよ
うに基底状態が一重項（Ｓ＝０）であるとき、三重項
（Ｓ＝１）状態である。好ましくは、該増感剤は、高い
項間交差収率を持つものである。即ち、該増感剤の光励
起は、少なくとも10％、望ましくは少なくとも40％、好
ましくは80％以上の効率で長い生存状態（普通は三重
項）を生じるものである。光増感剤は、普通、アッセイ
条件下は最大でも弱蛍光性である（量子収率は、普通0.
5以下、好ましくは0.1以下）。
光により励起されるものである光増感剤は、比較的光
安定性であり、一重項酸素と効率良く反応しないもので
ある。最も有用な増感剤には、幾つかの構造的特徴が存
在する。多くの増感剤は、堅く固定された、少なくとも
１つ、頻繁には、３つまたはそれ以上のコンジュゲート
化二重結合または三重結合、多くは芳香性構造、を有す
る。それらは、項間交差を加速する少なくとも１つの
基、例えば、カルボニルまたはイミン基、または周期表
の３−６列から選択される重原子、特に、ヨウ素または
臭素、を含有することが多いか、または、それらは多芳
香性構造を有することもある。典型的な増感剤には、ア
セトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシ
ン、9,10−ジブロモアンスラセン、メチレンブルー、ヘ
マトポルフィリンなどのメタロポルフィリン類、フタロ
シアニン類、クロロフィル類、ローズベンガル、ブック
ミンスターフレーレン等、およびこれらの化合物をより
親油性またはより親水性にさせるために、および／また
は、例えば、sbp構成員に付着させるための付着基とし
て、１ないし50原子の置換基を有する、それらの化合物
の誘導体類がある本発明において利用され得るその他の
光増感剤の例は、上記特性を有するもの、およびN.J.ツ
ロ、“モレキュラー・フォトケミストリー”、132頁、
W.A.ベンジャミン社、ニューヨーク、1965年に列挙され
ているものである。
光増感剤は、光増感剤を、油滴、リポソーム、ラテッ
クス粒子、等に組み込む場合に、親油性成分への溶解を
確実にするため、好ましくは、相対的に非極性である。
また、本発明において有用な光増感剤は、外部光源に
よる活性化を伴うか、またはあまり好ましくないが、伴
わずに、一重項酸素を生成できる他の物質類および組成
物類を含むことも意図する。従って、例えば、モリブデ
ート（MoO4 ＝）塩類およびクロロペルオキシダーゼおよ
びミエロペルオキシダーゼに臭化物および塩化物イオン
（カノフスキー、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（1983年）259巻、5596頁）を加えたもの
は、過酸化水素が一重項酸素および水に変換するのを触
媒することが示されている。これらの組成物のいずれ
も、例えば、sbp構成員に結合する粒子中に含むことが
でき、かつ過酸化水素を補助試薬として含み、クロロペ
ルオキシダーゼを表面に結合させ、モリブデートをリポ
ソームの水相に組み込むようなアッセイ法において使用
できる。厳密には増感剤ではないが、熱、光、または化
学活性化の際に一重項酸素分子を放出する化合物もま
た、光増感剤として本発明の範囲内に含まれる。この分
類の化合物類の中で最も知られている成分には、1,4−
ビスカルボキシエチル−1,4−ナフタレンエンドペルオ
キシド、9,10−ジフェニルアントラセン−9,10−エンド
ペルオキシド、および5,6,11,12−テトラフェニルナフ
タレン−5,12−エンドペルオキシドなどのエンドペルオ
キシド類がある。加熱またはこれらの化合物類による光
の直接吸収によって一重項酸素が放出される。
支持体または表面−−多孔性または非多孔性水不溶性
物質を含んでなる表面。この表面は、多くの形、例え
ば、ストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子、および同
等物のいずれか１つを持つことができる。この表面は、
親水性か、または親水性にさせる能力があるものであ
り、シリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナなどの
無機粉末；天然ポリマー物質、特にセルロース物質およ
びセルロースから誘導される物質、例えば、紙、例え
ば、濾紙、クロマトグラフ用ペーパー等を含む繊維；合
成または修飾化天然由来ポリマー類、例えば、ニトロセ
ルロース、セルロース、アセテート、ポリ（ビニルクロ
リド）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガ
ロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリ
メタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナ
イロン、ポリ（ビニルブチレート）、等；これらは、単
独で、または他の物質と併せてのいずれかで使用され
る；バイオガラスとして利用できるガラス、セラミック
類、金属類、および同種物を含む。リポソーム、脂質小
胞、および細胞などの天然または合成アセンブリーも採
用できる。
支持体または表面へのsbp構成員の結合は、一般に文
献から入手できるよく知られた技術により達成され得
る。例えば、“インモビライズド・エンザイムス”、千
畑一郎、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（1978
年）、およびクアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、245巻、3059頁（1970年）
参照。
粒子−−少なくとも約20nmで直径約20ミクロン以下で
あり、普通は、少なくとも約40nmで約10ミクロン未満、
好ましくは、約0.10から2.0ミクロンであり、普通は、
１ピコリットル未満の容量を有する粒子。粒子は、有機
物または無機物、膨張性または非膨張性、多孔性または
非多孔性であることができ、任意の密度を有するが、好
ましくは水近似密度、一般に約0.7から約1.5g/ml、のも
のであって、好ましくは水に懸濁可能であり、透明、部
分的に透明、または不透明であり得る物質から成る。粒
子は、電荷を有していても、有していなくてもよく、荷
電している場合は、好ましくは負である。この粒子は、
固体（例えば、ポリマー、金属、ガラス、有機物および
鉱物、塩類、およびケイソウなどの無機物）、油滴（例
えば、炭化水素、フルオロカーボン、シリコン液）、ま
たは小胞（例えば、リン脂質などの合成物、または細胞
およびオルガネラなどの天然物）であることができる。
粒子は、ラテックス粒子または有機または無機ポリマー
から成る他の粒子；脂質二重層、例えば、リポソーム、
リン脂質小胞；油滴；シリコン粒子；金属ゾル；細胞；
および染料クリスタライトであり得る。
有機粒子は、普通、ポリマー類、付加または縮合ポリ
マーのいずれかであり、アッセイ媒質に容易に分散可能
である。有機粒子は、また、その表面でsbp構成員と直
接的または間接的のいずれかで結合し、かつ光増感剤ま
たは化学発光化合物と、その表面で結合するか、その容
量内で組み込むために、吸着性であるか、または官能性
を与えることができるものである。
該粒子は、天然由来物質、合成的に修飾される天然由
来物質、および合成物質から誘導できる。脂質二重層の
ような天然または合成アセンブリー、例えば、リポソー
ム類、および非リン脂質小胞が好ましい。特に対象とな
る有機ポリマーの中には、ポリサッカライド類、特に、
架橋ポリサッカライド類、例えば、セファロースとして
入手できるアガロース、セファデックスおよびセファク
リルとして入手できるデキストラン、セルロース、スタ
ーチ、および同種物；付加ポリマー類、例えばポリスチ
レン、ポリアクリルアミド、アクリレートおよびメタク
リレートの誘導体類のホモポリマー類およびコポリマー
類、特にエステル類、およびハイドロゲルを含む遊離の
ヒドロキシル官能性を有するアミド類、および同等物が
ある。無機ポリマーには、シリコーン類、バイオガラス
として入手できるガラス類および同種物がある。ゾル
は、金、セレニウム、および他の金属類を含む。粒子
は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、等のような分
散させた水不溶性染料であっても良く、光増感剤として
働くこともできる。粒子は、ケイソウ類、細胞類、ウイ
ルス粒子類、マグネトソーム類、細胞核、および同種物
を含む場合もある。
該粒子が商業的に入手できる場合、この粒子サイズ
は、粉砕、超音波処理、振動などの機械的手段により大
きい粒子を小さい粒子に砕くことによって変わり得る。
該粒子は、普通、多官能性であるか、または多官能性
にさせることができるか、または、特異的、非特異的共
有または非共有相互作用により、sbp構成員、光増感
剤、または化学発光化合物に結合させることができる。
広範囲の官能基が利用でき、また組み込むことが出来
る。官能基の例には、カルボン酸類、アルデヒド類、ア
ミノ基類、シアノ基類、エチレン基類、ヒドロキシル基
類、メルカプト基類、および同種物がある。この粒子と
sbp構成員、化学発光化合物、または光増感剤との共有
結合を採用する場合、連結法は、よく知られており、文
献に十分に例示説明されいる。例えば、クアトレカサ
ス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、245巻、3059頁（1970年）参照。連結基の長さは、
連結される化合物の性質、粒子の性質、連結される化合
物とsbp構成員に結合する粒子との距離の影響、およ
び、分析物、その他に依存して、広範囲に変わる。
光増感剤は、粒子に溶解するか、または粒子の表面に
非共有結合するものを選択できる。この場合、これらの
化合物は、好ましくは、粒子から分離する能力を低減
し、それによって、両方の化合物を同一粒子に結合させ
るために、疎水性である。
各粒子に結合した光増感剤または化学発光分子の数
は、平均して、普通、少なくとも１つであり、粒子が光
増感剤または化学発光物質分子全体からなるために十分
に高い数であることができる。分子の好ましい数は、ア
ッセイにおけるバックグラウンドに対しても最も高いシ
グナルを提供するように経験的に選択される。ある場合
では、これは、多数の異なる光増感剤分子を粒子に結合
させることにより、最も良く達成されるものである。通
常、sbp構成員に対する光増感剤および化学発光化合物
の粒子中の比率は、少なくとも１であり、好ましくは少
なくとも100ないし１であり、最も好ましくは1,000以上
ないし１であるべきである。
ラテックス粒子−−“ラテックス”は、普通、直径20
nmないし20mm、より好ましくは100ないし1000nmの粒子
寸法を有する特定の懸濁可能水不溶性ポリマー物質を意
味する。ラテックスは、以下のような置換ポリエチレン
であることが多い；ポリスチレン−ブタジエン、ポリア
クリルアミドポリスチレン、アミノ基を有するポリスチ
レン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニ
トリルブタジエン、スチレンコポリマー類、ポリビニル
アセテート−アクリレート、ポリビニルピリジン、ビニ
ル−クロリドアクリレートコポリマー類、および同種
物。スチレン、およびカルボキシル化スチレン、または
他の活性基、例えば、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲ
ン、および同種物で官能化したスチレンの非架橋化ポリ
マー類が好ましい。ブタジエンなどのジエンで置換され
たスチレン類のコポリマーを使用することも多い。
本発明において使用される光増感剤または化学発光化
合物とラテックス粒子との結合は、重合により粒子を形
成する間に組み込むことができるが、普通は、予め形成
した粒子中への、普通は、粒子内への非共有溶解（nonc
ovalent dissolution）による組み込みを含む。普通
は、化学発光化合物または増感剤の溶液を採用する。使
用し得る溶媒類には、エタノール、エチレングリコー
ル、およびベンジルアルコールを含むアルコール類；ジ
メチルホルムアミド、ホルムアミド、アセトアミド、お
よびテトラメチル尿素、および同種物などのアミド類；
ジメチルスルホキシドおよびスルホランなどのスルホキ
シド類；およびカルビトール、エチルカルビトール、ジ
メトキシエタン、および同種物などのエーテル類、およ
び水が含まれる。粒子が不溶性である高沸点溶媒を用い
ることは、高めの温度の使用が可能となり粒子中への化
合物類の溶解が容易となるので、特に適している。溶媒
類は、単独で、または組み合わせて使用することができ
る。光増感剤を組み込むために特に好ましい溶媒類は、
光増感剤の三重項励起状態を失活しないようなものであ
り、なぜならば、それらの溶媒の内在特性のため、また
は、それらの溶媒が、粒子中に不溶性である水などの溶
媒に自身が溶解されるという能力によって実質的に粒子
から除去できるためである。芳香族溶媒類、一般に、粒
子に可溶性である溶媒類が好ましい。粒子内に化学発光
化合物を組み込むためには、溶媒は、それらの内在特性
または粒子から除去される能力のため、発光と干渉しな
いようなものを選択するべきである。芳香族溶媒類は、
また頻繁に好まれるものである。代表的な芳香族溶媒類
には、ジブチルフタレート、ベンゾニトリル、ナフトニ
トリル、ジオクチルテレフタレート、ジクロロベンゼ
ン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベンゼン、等があ
る。
光増感剤または化学発光化合物が粒子に共有結合して
いる場合以外は、普通は、電子的に中性な光増感剤また
は化学発光化合物を使用することが好ましい。液体媒質
は、ポリマービーズを粘着性がなくなるまで軟化しない
ものを選択するのが好ましい。好ましい技術は、選択し
たラテックス粒子を、光増感剤または化学発光化合物が
少なくとも限られた溶解性を有するような液体媒質中に
懸濁することを含んで成る。好ましくは、液体媒質中の
光増感剤または化学発光化合物の濃度は、一重項酸素の
最高形成効率、および媒質中の化学発光化合物からの最
高量子放出収率を有する粒子を提供するように選択する
が、よりすくない濃度の溶液が好ましいこともある。溶
媒中の粒子の歪みまたは溶解は、粒子が不溶性である混
和性共溶媒を加えることにより、防ぐことができる。
一般に、この操作中に採用する温度は、光増感剤標識
化粒子の一重項酸素形成能力および化学発光化合物粒子
の量子収率を最大にするように選択されるが、ただし、
粒子は、選択した温度で融解したり、凝集してはならな
い。通常は、昇温温度を採用する。この操作のための温
度は、一般に、20℃から200℃、より普通には、50℃か
ら170℃の範囲である。室温でほぼ不溶性である、ある
化合物類が、昇温温度で、例えば、エタノール、および
エチレングレコール、および同等物などの低分子量アル
コールに可溶性であることが観察されている。カルボキ
シル化修飾ラテックス粒子は、かかる温度で低分子量ア
ルコールを許容することが示されている。
sbp構成員は、ラテックス粒子の表面に物理的に吸着
することができ、また、粒子に共有結合することもでき
る。sbp構成員がラテックス粒子の表面に弱く結合して
いるだけの場合、その結合は、ある場合には、インキュ
ベーションおよび洗浄中に遭遇する粒子対粒子剪断力に
耐えることができないこともある。従って、sbp構成員
をラテックス粒子に、吸着を最小限にするような条件下
で共有結合させるのが好ましい。これは、ラテックスの
表面を化学的に活性化することにより達成できる。例え
ば、表面カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを形成することができ、次いで、アッセイ成
分の粒子表面に対する非特異的結合を低減するように活
性化した粒子を、エステル基と反応するアミノ基を有す
るリンカーと、またはアミノ基を有するsbp構成員と直
接的に、接触させる。リンカーは、普通、アッセイ成分
の粒子表面に対する非特異的結合を低減するようなもの
を選択し、好ましくは、ラテックス粒子への結合とsbp
構成員への結合の両方に対して適切な官能性を与えるも
のである。適切な物質には、マレイミド化アミノデキス
トラン（MAD）、ポリスチレン、アミノサッカライド、
および同等物がある。MADは、フバート等、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシィズ、75（７）、3143頁、1978年に記載のようにし
て調製できる。
ある方法では、MADを、水溶性カルボジイミド、例え
ば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル
カルボジイミドを用いて、まずカルボキシル含有ラテッ
クス粒子に結合させる。次いで、被覆粒子を試薬類中で
平衡化して、非特異的結合を妨げる。このような試薬類
には、ウシγグロブリン（BGG）などのタンパク質、ト
ゥイーン20、トリトンＸ−100、および同等物などの洗
浄剤がある。その後、スルフヒドリル基を有する、また
はスルフヒドリル基を誘導するように適切に修飾したsb
p構成員を粒子の懸濁液に加えると、sbp構成員とMADの
間の共有結合が、粒子上で形成される。次いで、過剰の
未反応sbp構成員を洗浄により除去できる。
化学発光化合物−−本発明の組成物の一部を形成する
化合物類であって、一般に： 式中、ArおよびAr'は、独立してアリールであり、Arま
たはAr'の一方、好ましくはArは、もう一方に対して電
子供与するものである、 からなる群から選択される構造部を有するエノールエー
テル類である。これは、例えば、ArまたはAr'の一方に
おける１またはそれ以上の電子供与基の存在により達成
できる。上記破線で表した構造部分は、本発明にとって
重要ではなく、ジオキセタン形成およびエネルギー転移
を妨害しない置換基であれば、どのような置換基であっ
てもよい。一般に、この化合物類は、化合物２で、好ま
しくはｍが０であり、ｎが１ないし３であるようなもの
である。
ほとんどの場合、本組成物の部分を形成する化合物類
は、構造部分： 式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮであり、Ｎの原子価は、水
素またはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＰからなる群から選択
される原子から成る有機ラジカルで満たされており、Ar
およびAr'は、独立してアリールであり、ArまたはAr'の
一方は、もう一方に対して電子供与するものである、を
有する。
上記構造中の波線は、環が、独立して、非置換である
か、または１から50原子を有する置換基により置換され
得ることを意味する。加えて、この置換基は、一緒にな
って、例えば、アリールなどの環を形成することがで
き、これもまた１から50原子を有する置換基で置換され
ていてもよい。
エノールエーテル類の例を、下記構造を参照して下記
のチャートに記載するが、単に例示説明であって限定で
はない： 式中、化合物９−17は、Ｘ、Ar、およびAr'に対して下
記部分を有する。
この化学発光化合物類は、一重項酸素との化学反応を
受けて、250ないし1200nmの範囲の波長内の光の同時ま
たは連続放出を伴って分解できる準安定中間体を形成す
る。好ましくは、該中間体は、その形成後に加熱または
補助試薬類を添加せずとも自発的に分解する。しかしな
がら、分解を加速させるための、中間体形成後の試薬の
添加、または高めの温度の使用は、ある化学発光化合物
類の場合には必要である。化学発光化合物類は、通常、
一重項酸素と反応し、多くの場合、ジオキセタン類また
はジオキセタノン類の形成を伴う、電子豊富な化合物で
あり、例えば、炭素（Ｃ）原子上の置換基が対応するオ
レフィン上に存在するものである、下記構造により示さ
れるものである： これらの幾つかは、自発的に、その他は、加熱によりお
よび／または触媒反応により通常、電子豊富はエネルギ
ー受容体により、光の放出を伴って分解する。ある場合
では、ジオキセタンは、自発的にヒドロペルオキシに変
換されるが、その際、ジオキセタンを再生成し、分解お
よび光放出を可能にするために塩基性pHが必要である。
対象となる化学発光化合物類は、一般に、300ナノメ
ーター以上、普通は、400nm以上の波長で放出するもの
である。単独で、または蛍光分子と一緒に、血清成分が
光を吸収する領域以外の波長で光を放出する化合物類
が、本発明においては特に好ましいものである。血清の
蛍光は、500nm以上で急速に低下するので、550nm以上で
は比較的重要ではなくなる。従って、分析物が血清中に
ある場合、550nm以上、好ましくは600nm以上で光を放出
する化学発光化合物が特定の対象である。化学発光化合
物の自己増感を避けるためには、化学発光化合物類が、
光増感剤を励起するのに使用される光を吸収しないこと
が好ましい。一般に、500nmより長い光波長で増感剤を
励起するのが好ましいため、化学発光化合物による光吸
収が500nm以上では非常に低いことが望ましい。
本発明の化学発光化合物類は、様々な多くの方法で調
製できる。ある方法では、２−チオエタノール誘導体
を、一方のアリールがケトン炭素上で置換されており、
もう一方がアルファ−ヒドロキシ基を含む炭素上で置換
されている適切なジアリール置換アルファ−ヒドロキシ
ケトン（置換ベンゾイル）と縮合させる。縮合反応によ
り、適切なエノールエーテルを直接得る。上記縮合は、
トルエンなどの不活性溶媒中で実施できる。通常、反応
温度は、約90−130℃であり、反応を５−50時間続けさ
せる。一般に、反応は、合わせた試薬の還流温度で実施
される。縮合は、ルイス酸、例えば、塩化アクリル、塩
化シリル、塩化スズ等の存在下で実施する。下記反応式
は、上記、本発明の化学発光化合物類の調製法の例示説
明である： 本発明に従う化合物類、特に、アルキルラジカルを含
むもの、を調製するためのその他の反応式は、化合物13
を合成するための下記略式にて示す： Ｃ−26チオキセン（化合物13）の合成 上記合成において、５−ブロモ吉草酸エチルをＮ−メ
チルアニリンと縮合させて、22を得、これをキルスメイ
アー−ハーク（Kilsmeier−Haak）合成（DMF/POCl3）に
より、アルデヒド23に変換させる。23とベンズアルデヒ
ドとのベンゾイン縮合により、24を得、これを水酸化カ
リウムを用いて加水分解し、ジデシルアミンおよびジフ
ェニルホスホリルアジド（DPPA）を用いてアミド25に変
換させる。化合物13への変換は、メルカプロエタノール
およびトリメチルシリルクロリドとの縮合により実施し
た。
本発明に従う化合物類の、特に立体選択的合成を含む
その他の調製法は、化合物14を合成するための下記略式
にて示す： 上記合成において、Pd/炭素および水素ガス100psiの
存在下、ｐ−ニトロフェニル酢酸（27）とデカナールと
の反応により、ジデシルアミン28を得、これをｐ−ヘプ
チルベンゼンと縮合させて、ケトン29を得る。臭素およ
びフルオロ酢酸を用いて、29を臭素処理し、ビカーボネ
ートにより生成物をベンゾイン30に変換する。化合物14
への変換は、メルカプトエタノールとトリメチルシリル
クロリドとの縮合により実施する。
補助物質−−本発明に従うアッセイでは、様々な補助
物質が採用されることが多い。例えば、緩衝液は、通
常、アッセイ媒質の安定剤およびアッセイ成分と同様
に、アッセイ媒質中に存在するものである。しばしば、
これらの助補物質に加えて、アルブミンなどのタンパク
質類、ホルムアミドなどの有機溶媒類、第４級アンモニ
ウム塩類、硫酸デキストランなどのポリカチオン類、界
面活性剤類、特定の非イオン性界面活性剤類、結合増強
剤、例えば、ポリアルキレングリコール、または同等物
が、含まれることもある。光増感剤を照射よりもむしろ
化学的に活性化する場合、過酸化水素がしばしば補助試
薬として含まれる。化学発光化合物の放出波長をより長
い波長へと移動させるか、またはその酸素活性化形態の
分解を触媒反応させることが望まれる場合は、蛍光分子
を採用できる。
全体にまたは部分的に連続して−−本発明に利用する
試料および様々な成分をを付随的に（同時に）合わせる
のではないときに、１またはそれ以上を残りの１または
それ以上の成分と合わせて、副組み合わせを作ることが
できる。その後、それぞれの副組み合わせを、本発明方
法の１またはそれ以上の工程に付すことができる。従っ
て、それぞれの副組み合わせを、１またはそれ以上の所
望の結果を達するような条件下でインキュベートでき
る。
本発明のある態様は、（ａ）ユーロピウム、テルビウ
ム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウム、および
ルテニウムから成る群から選択される金属を、少なくと
も六配位結合状態で含む金属キレート、および（ｂ）２
つのアリール基で置換された二重結合、酸素原子、およ
び、酸素、硫黄、および窒素からなる群から選択される
原子である構造部分とを有する化合物を含んで成る、組
成物類に関する。このアリール基は、一方が他方に対し
て電子供与することを特徴とする。金属キレートおよび
オレフィン化合物を含んでなる本発明の組成物は、一般
に、液体または固体、通常は固体粒子、であり得る媒質
中にある。液体媒質は、普通、高沸点の水不混和性液
体、例えば、トルエン、脂質類、フルオロカーボン類、
ジフェニルエーテル、クロロベンゼン、ジオクチルフタ
レート、ジメトキシベンゼン、鉱物油、およびトリアシ
ルグリセライド類を含む群の中の１つであり、固体粒子
媒質は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリメ
チルアクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルア
ミド、ポリビニルクロリド、およびそれらのコポリマー
類、ナイロン、および他のポリアミド類等であり得る。
好ましくは、組成物は、ラテックス粒子物質内に組み込
まれている。
金属キレートは、化学発光量子収率を最大にし、かつ
化学発光の衰退時間を最小にする量で存在する。通常、
金属キレートは、0.2−500mM、好ましくは２−100mMで
存在する。ある環境では、普通、金属キレートが六配位
結合している場合、衰退時間の低減は、量子収率の低減
に付随し、これら２つの作用の間に均衡が保たれなけれ
ばならない。従って、このような均衡に達するように組
成物中の金属キレート濃度を調整すべきである。組成物
中の化学発光化合物濃度は、普通、0.1−500mM、好まし
くは、２−100mMである。
本発明の好ましい化合物は、化合物１の式を有するも
のである。このような化合物の代表は、化合物10−16で
ある。特に好ましい化合物は、化合物１の式で、X'がＳ
またはNR'であり、R'が低級アルキルまたはアリールで
あり、ＤおよびD'が独立して低級アルキルであり、好ま
しくはX'がＳであるようなものである。その中でも特に
好ましい化合物は、ＤおよびD'がメチルであり、R'がメ
チルまたはフェニルであるようなものであり、最も好ま
しい化合物は、X'がＳであり、ＤおよびD'がメチルであ
るものである。化合物13は、上記化合物類の中でより好
ましいものの１つである。
本発明のある態様は、その中に化合物２を組み込んで
いるラテックスを含んで成る組成物である。好ましい組
成物は、R'がメチルまたはフェニルであり、ｎが１また
は２であり、ｍが０であるようなものである。好ましく
は、Arは、５員および６員の芳香環およびヘテロ芳香環
からなる群から選択される。好ましい実施態様では、Ar
は、二重結合に結合している炭素に対してメタまたはパ
ラであるフェニルの位置で、電子供与基により置換され
たフェニルであり、Ar'は、フェニルである。組成物類
の例は、化合物９−16から成る群から選択される化合物
を含むようなものである。ラテックス粒子類は、普通、
懸濁可能であり、平均直径0.04ないし4000ナノメーター
を有する。アッセイの場合、粒子は、それに結合してい
るsbp構成員を有し、平均直径100ないし1000ミクロメー
ターを有するものである。
本発明のその他の実施態様は、分析物の測定法であ
る。該方法は、（ａ）（１）分析物を含有する疑いのあ
る媒質、（２）その励起状態で、酸素を一重項状態へと
活性化する能力のある光増感剤であって、特異的結合対
（sbp）構成員と結合（アソシエート）している光増感
剤、および（３）化合物２を含んでなる懸濁可能なラテ
ックス粒子物質、の組み合わせを提供することを含んで
なる。この粒子物質には、sbp構成員が結合している。
該組み合わせを光で、普通は、照射により処理し、光増
感剤を励起させ、次いで、放出された発光量について試
験する。かかる発光の量は、媒質中の分析物量に相関す
る。光増感剤は、第２懸濁可能粒子物質に組み込むこと
もできる。本発明に従う、分析物を測定するための特に
有用な組成物は、化合物１を含有するものである。
アッセイプロトコールにおいては、組成物を組み合わ
せで提供し、増感剤による酸素の活性化の関数として産
生される光が、分析物濃度の関数である。有利なこと
に、本発明の方法は、光を産生させるために媒質を加熱
することなく実施できる。その結果、本発明のアッセイ
は、一定温度で行うことができる。
化学発光化合物を、分析物に、またはその濃度が分析
物の存在によって影響されるアッセイ成分に、直接的ま
たは間接的に結合する能力があるsbp構成員に結合させ
る場合もある。“直接的または間接的に、結合する能力
がある”という用語は、所定のものが、そのものに特異
的に結合できる（直接的に）か、または他のものに結合
できる特異的結合対構成員または２またはそれ以上のsb
p構成員の複合体に特定的に結合できる（間接的に）こ
とを意味する。好ましくは、本発明に従い実施されるア
ッセイは、ラテックス粒子中の上記組成物の内の１つを
利用する。このラテックス粒子は、一般に、分析物また
は分析物の受容体に直接的または間接的に結合する能力
があるsbp構成員を有する。光増感剤に結合しているsbp
構成員および化学発光化合物の双方が、分析物に結合す
る能力があるような場合は、サンドイッチアッセイプロ
トコールを採用する。光増感剤または化学発光化合物に
結合しているsbp構成員の１つが分析物および分析物類
似体の双方に結合できるような場合は、競合アッセイプ
ロトコールが採用できる。
光増感剤は、普通、化学発光化合物を、上記反応物を
含有する媒質に光を照射することにより、活性化させ
る。この媒質には、光増感剤を励起状態に転換させ、そ
れによって分子酸素を一重項酸素へと活性化できるよう
にさせるに十分なエネルギーを伴う波長を有する光を照
射しなければならない。分子酸素を励起させることがで
きる光増感剤の励起状態は、一般に、光増感剤の基底状
態よりもエネルギーの高い約20Kcal/mol以上、普通は、
少なくとも23Kcal/molである三重項状態である。好まし
くは、媒質に、約450ないし950nmの波長を有する光を照
射するが、より短い波長、例えば、230−950nmを使用す
ることもできる。生じた化学発光は、媒質中の分析物量
に相関するその量を測定するための、写真による、目視
による、または光度計による任意の常法により測定でき
る。
普通は、光増感剤に能率良く吸収される波長の光を照
射することにより、光増感剤を励起させるのが好ましい
が、他の励起手段、例えば、第２光増感剤などのエネル
ギー供与体の励起状態からのエネルギー転移などを用い
ることもできる。第２光増感剤を用いる場合、光の波長
は、光増感剤には能率良く吸収されないが、第２光増感
剤には能率良く吸収されるようなものを使用できる。第
２光増感剤は、第１光増感剤と結合するかまたは結合す
るようになるアッセイ成分に結合させることができ、例
えば、表面に結合させるか、第１光増感剤を有する粒子
に組み込まれる。第２光増感剤を用いる場合、それは、
普通、第１光増感剤の最低エネルギー一重項状態よりも
高いエネルギーで、最低エネルギー一重項状態を持つも
のである。
ヘリウム−ネオンレーザーの632.6nm放出線は、費用
のかからない励起用光源である。約620ないし約650nmの
領域に吸収極大を有する光増感剤は、ヘリウム−ネオン
レーザーの放出線と互換性であり、従って、本発明にお
いては特に有用である。
本発明の方法および組成物は、リガンド−受容体など
のsbp構成員に関係する殆どのアッセイ；例えば、抗原
−抗体反応；ポリヌクレオチド結合アッセイ、およびそ
の他、に適用できる。これらのアッセイは、均一系また
は不均一系、競合型または非競合型であってよい。アッ
セイ成分、化学発光化合物、および光増感剤は、多くの
方法で、（１）採用するならば、表面、（２）核酸また
は受容体、および（３）核酸またはリガンドと共に利用
できる。結合（アソシエーション）は、共有結合であっ
てもよいし、非共有結合であってもよい。当業者なら
ば、上記、および下記に例示の説明から望ましい特定の
アッセイによって変わる適切な結合を選択できるであろ
う。
均一系アッセイのやり方では、必要ならば、不要物質
を除去するために試料を前処理してもよい。非競合的サ
ンドイッチ型アッセイの反応は、分析物に相補的でかつ
化学発光化合物に結合しているsbp構成員（例えば、抗
体、核酸プローブ、受容体、またはリガンド）；これも
また分析物に相補的であるsbp構成員（例えば、抗体、
核酸プローブ、受容体、またはリガンド）に結合する光
増感剤；対象となる試料；および必要な補助試薬を含む
ことができる。好ましくは、少なくとも化学発光化合物
は、sbp構成員が結合している粒子内に組み込まれてい
る。光増感剤は、直接的にsbp構成員に結合していても
よく、また、粒子内に組み込まれていてもよい。競合的
プロトコールでは、一方のsbp構成員は、分析物の誘導
体であることができ、他方のsbp構成員は、分析物と相
補的、例えば、抗体、であることができる。いずれのプ
ロトコールにおいても、その成分は、同時に、または全
体にまたは部分的に連続して、合わせることができる。
活性化した光増感剤により産生された一重項酸素が、化
学発光化合物と反応する能力は、sbp構成員が分析物に
結合することによって左右される。よって、分析物の存
在または量は、照射、加熱、または化学試薬の添加、好
ましくは照射、により光増感剤を活性化させると放出さ
れる光の量を測定することにより、測定できる。結合反
応、およびその度合いの検出の両方を、分離することな
く均一溶液中で実施することができる。これが、化学発
光を利用する従来技術法を越える本発明の利点である。
不均一系アッセイのやり方では、アッセイの成分は、
sbp構成員である分析物を含有する疑いのある試料；自
身と結合している化学発光化合物および光増感剤から成
る群の一構成員を有する、非分散性表面、または粒子の
いずれかであり得る、支持体に結合したsbp構成員；お
よび、自身に結合した、群の他の一構成員を有するsbp
構成員を含んでなり、そのsbp構成員は、独立して、直
接的または間接的に、分析物または分析物の受容体に結
合できる。一般に、これらの成分を、同時に、または全
体にまたは部分的に連続して、合わせる。次いで、粒子
の表面を液相から分離し、分離した相または液相のいず
れかを、普通は当該特定相を照射することにより、光増
感剤を活性化する条件にかけ、放出された光量を測定す
る。
分析物のアッセイにおける結合反応は、通常、一般に
最適アッセイ感度を与える穏やかなpHで水性媒質中で行
うものである。好ましくは、光増感剤の活性化も水性媒
質中で行う。しかしながら、分離工程を採用する場合、
例えば、アセトニトリル、アセトン、トルエン、ベンゾ
ニトリル、等のような非水性媒質、および非常に高い、
即ち10.0以上のpH値、または非常に低い、即ち4.0以下
のpH値を持つ、普通は非常に高いpH値を持つ水性媒質を
使用できる。上記に説明した通り、このアッセイは、ア
ッセイ成分または生成物の幾分かを分離しない（均一
系）か、または分離する（不均一系）かのいずれかで実
施できる。
水性媒質は、水だけであってもよく、または、0.01か
ら80容量パーセントの共溶媒を含んでもよいが、タンパ
ク質であるsbp構成員を使用する場合は、普通40％以下
の共溶媒を含む。結合反応の媒質のpHは、普通、約４な
いし11の範囲であり、より普通には、約５ないし10の範
囲、好ましくは約6.5ないし9.5の範囲である。一重項酸
素産生中にpHを変えない場合、このpHは、普通、結合構
成員が最適に結合するpHとシグナル産生およびアッセイ
のその他の試薬の安定性に最適なpHとの中間である。シ
グナル産生のためにpHを上げる必要がある場合には、ア
ルカリ試薬の添加を含む工程を結合反応と一重項酸素の
産生および／またはシグナル生成の間に挿入できる。普
通、上げたpHは10以上であり、普通は、10−14である。
不均一系アッセイの場合、上記のとおり、非水性溶媒を
使用することもでき、主に溶媒が一重項酸素と効率良く
反応しないことを考慮すればよい。
所望のpHを達成し、そのpHをアッセイ中維持するため
に、様々な緩衝液を使用できる。緩衝液の例には、ボレ
ート、ホスフェート、カーボネート、トリス、バルビタ
ール、および同種物がある。採用した特定の緩衝液が本
発明に対して絶対的なのではなく、個々のアッセイにお
いて１つまたはもう１つの緩衝液が好まれ得る。
アッセイにおいてタンパク質性リガンド類や受容体類
の結合反応を実施する場合、通常は、穏やかな温度が採
用され、普通、測定期間中一定温度、好ましくは25℃な
いし40℃である。結合反応のためのインキュベーション
温度は、通常、約５℃から45℃、普通は、約15℃から40
℃、より普通には、25℃ないし40℃の範囲である。アッ
セイ中に核酸の結合が起こる場合は、より高い温度、普
通は、20℃ないし90℃、より普通には、35℃ないし75℃
を使用することが多い。測定中、即ち、一重項酸素の産
生および光検出中の温度は、一般に、約20℃から100
℃、より普通には、約25℃から50℃、より普通には、25
℃ないし40℃の範囲である。
アッセイすることができる分析物の濃度は、一般に、
約10-4から10-16M未満、より普通には、約10-6から10
-14Mの範囲で変わる。アッセイが定性的、半定量的、ま
たは定量的である場合、普通、特定の検出技術、対象と
なる分析物の濃度、および最大所望インキュベーション
時間などを考察することによって様々な試薬の濃度を決
定する。
競合型アッセイでは、アッセイ媒質中の様々な試薬の
濃度は、一般に、対象となる分析物の濃度範囲により決
定され、各試薬の最終濃度は、通常、その範囲でアッセ
イ感度が最大になるように経験的に決定される。即ち、
問題となる分析物の濃度のバリエーションが、正確に測
定可能なシグナル差を与えるべきである。
sbp構成員の濃度は、分析物濃度、所望の結合速度、
およびsbp構成員が非特定的に結合する度合によって変
わるものである。普通、sbp構成員は、少なくとも予想
される最低分析物濃度、好ましくは、少なくとも予想さ
れる最高分析物濃度で存在するものであり、非競合型ア
ッセイの場合、その濃度は、最高分析濃度の10ないし10
6倍であることができるが、普通は、10-4M以下、好まし
くは10-6M以下、頻繁には、10-11と10-7Mの間である。s
bp構成員と結合している光増感剤または化学発光化合物
の量は、普通、少なくとも1sbp構成員当たり１モルであ
り、光増感剤または化学発光分子が粒子に組み込まれて
いる場合は、105と高いこともあり、普通は、少なくと
も10ないし104である。
添加順序は、広範囲に変わり得るが、アッセイの性質
に依存するある優先順位がある。最も簡易な添加順序
は、材料全てを同時に加えることである。別法として、
試薬類を、全体にまたは部分的に連続して、合わせるこ
とができる。アッセイが競合型である場合、しばしば、
試料と、分析物に結合する能力のあるsbp構成員とを合
わせた後に、分析物類似体を加えることが望まれる。所
望により、インキュベーション工程を、試薬を合わせた
後、一般には、約30秒から６時間の範囲、より普通に
は、約２分から１時間後に行う場合もあり、その後、光
増感剤に一重項酸素を産生させ、光放出を測定する。
特に好ましい添加順序においては、分析物と相補的お
よび／または同族的である特異的結合対構成員の第１セ
ットを分析物と合わせ、ついで第１特異的結合対構成員
と相補的な特異的結合構成員を添加するが、それぞれは
光増感剤および本発明の組成物よりなる群の異なる構成
員と結合しているものである。次いで、このアッセイ混
合物またはその分離された成分を照射して、光放出を測
定する。
均一系アッセイでは、すべての試薬を合わせた後、必
要ならインキュベートできる。それから、組み合わせ物
を照射し、生成する放出光を測定する。放出された光は
試験した試料中の分析物の量と相関する。均一系アッセ
イで採用される本発明の試薬類の量は、分析物の性質に
よって変わる。一般に、本発明の均一系アッセイは、既
知のアッセイ、例えばEMIT（登録商標）アッセイより高
い感度を示す。この利点は、第一に本発明の方法におい
て得られる、ノイズ比率に対して改善されたシグナルに
よるものである。
本発明の他の態様は、分析物を含有する疑いのある試
料中の分析物の存在または量を測定する本発明のアッセ
イ法を適宜実施するのに有用なキット類に関する。この
キット類は、パッケージした組み合わせ物の中に：
（１）化合物２、好ましくは化合物１の式で示される化
合物を含む懸濁可能なラテックス粒子を含んで成る組成
物で、該粒子が特異的結合対（sbp）構成員に結合でき
るもの、および（２）その励起状態で、酸素をその一重
項状態へと活性化する能力のある光増感剤、を含んでな
る。光増感剤は、光増感剤を含む第２懸濁可能粒子を含
む組成物の一部であることができ、ここで、第２粒子は
自身に結合したsbp構成員を有するか、またはsbp構成員
に直接結合し得るものである。キットは、更に、本発明
に従う方法について記載した説明、およびかかる方法に
おけるキットの試薬類の使用説明書を含むことができ
る。
本発明の融通性を高めるために、パッケージした組み
合わせ物中に、同じかまたは別個の容器に入れた試薬類
を準備して、試薬の割合が実質的に最適な方法およびア
ッセイを提供するようにできる。試薬類は、それぞれ、
別個の容器内にあってもよく、また、様々な試薬類を１
またはそれ以上の容器に合わせて入れることもでき、試
薬類の交差反応性および安定性によって変わる。キット
は、更に、別個にパッケージしたその他のアッセイ実施
用試薬類、例えば、補助試薬類などを含む。
実施例 本発明を更に下記に例示の実施例により示す。本明細
書において使用した、部およびパーセントは、特記しな
いかぎり重量によるものである。温度は、セ氏温度
（℃）である。
略号： AbF（抗フルオロセイン） − フルオロセインに対す
るマウスモノクローナル抗体 AbT3（抗T3） − T3に対するマウスモノクローナル抗
体 ｔ−Bu − tert−ブチル TFA − トリフルオロ酢酸 T3 − Ф −化学発光量子収率 PMT − EtoAc − 酢酸エチル BSA − ウシ血清アルブミン Chl−ａ − クロロフィルａ Ｄ−H2O − 脱イオン水 DPPA − 4,7−ジフェニルフェナントロリン DPPC − ジパルミトイルホスファチジルコリン DPPG − ジパルミトイルホスファチジルグリセロール DPPE − ジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン EDAC − １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩 nC10 − テトラ−（ｎ−デシル）フタロシアニンアル
ミニウムクロリド複合体 PB − ポリスチレンビーズ PB/nC10 − nC10含有PB PBS − ホスフェート緩衝化塩水0.02M NaPi、0.14M N
aCl/pH7.2 Pi − ホスフェート スルホ−NHS − スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド SATA − Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル RLU − 相対光単位 NHS − Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド DMSO − ジメチルスルホキシド DMF − ジメチルホルムアミド DCC − ジシクロヘキシルカルボジイミド TEA − トリエチルアミン TLC − 薄層クロマトグラフィー TNBSA − 2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸 BGG − ウシガンマグロブリン TMSCl − トリメチルシリルクロリド MeOH − メタノール ビオチン−LC7−NHS − スルホスクシンイミジル−６
−（ビオチンアミド）−ヘキサノエート λmaxABS − 吸収のラムダ極大 λmaxEMI − 蛍光放出のラムダ極大 λmaxCH.EM. − 化学発光放出のラムダ極大 モノクローナル抗体は、全て標準ハイブリッド細胞技
術により産生した。要約すると、適切な免疫源を、宿
主、普通は、マウスまたはその他の適切な動物に注入
し、適当な期間後、宿主から脾臓細胞を取り出した。こ
れとは別に、非感作細胞を宿主から単離し、イン・ビト
ロで免疫源に直接感作させた。上記細胞を適切なミエロ
ーマ細胞系と融合させ、融合した細胞を培養することに
より、ハイブリッド細胞を形成した。培養ハイブリッド
細胞により産生された抗体を、特定の抗原、例えば、TS
HまたはHCGに対する、その結合親和性についてスクリー
ンした。多くのスクリーニング技術、例えば、ELISAス
クリーンなどを採用した。次いで、選択した融合体を再
度クローン化した。
実施例１ 総合トリヨードチロニンアッセイ I.ビーズ製造 材料 バングス・ラボラトリーズ社の、175nmカルボキシレ
ート修飾ラテックス（CMLビーズ）。
アルドリッチ社の、エチレングリコール、エトキシエ
タノール、ベンジルアルコール、クロロフィルａ。
コダック社の、ユーロピウム（III）チエノイルトリ
フルオロアセトネート（EuTTA）。
アルドリッチ社の、トリオクチルホスフィンオキシド
（TOPO）。
ジオキセン［１−（４−ジメチルアミノフェニル）−
６−フェニル−1,4−ジオキセン］：ギャノン,S.D.（19
82年）、ユニバーシティー・ミクロフィルムス・インタ
ーナショナル（アン・アーバー、ミシガン）に記載され
た方法の修飾法により調製される。
操作 1.クロロフィルａ増感剤ビーズ ベンジルアルコール（1.0ml、0.6mM）中、クロロフィ
ルａの溶液を、ベンジルアルコール8.0mlに105℃で加え
た。水（10％、1.0ml）中、カルボキシル化修飾ラテッ
クス、175nmサイズの懸濁液をベンジルアルコール溶液
に加えた。混合物を105℃で５分間撹拌し、室温まで冷
ました。エタノール（10.0ml）を加え、混合物を遠心分
離した。ペレットを1:1エタノール−水混合物（10.0m
l）に再懸濁し、懸濁液を遠心分子した。同じ再懸濁お
よび遠心分離操作を水（10ml）中で繰り返し、ペレット
を水（1.8ml）に再懸濁した。
特性化 A.染料濃度：上記ビーズ懸濁液10μｌをジオキサン（99
0μｌ）に加えることにより調製した溶液は、ビーズ１
グラム中2.6μモルのクロロフィルａに対応して、660nm
で0.11の吸光度をもつことが分かった。
B.一重項酸素産生：ホスフェート緩衝液（50mM、pH7.
5、100mMNaClを含有する）2ml中、クロロフィルａビー
ズ（200μｇ）、２×10-4モルのアントラセン9,10−ジ
プロピオン酸（ADPA）の混合物に、645nmカット−オフ
フィルターを備えたタングステン−ハロゲンランプを用
いて20分間照射した。ビーズを濾過により除去し、酸素
化生成物の濃度を分光計により、400nmで測定した。そ
の速度は、１分当たり酸素化生成物3.0ナノモルである
ことが分かった。同一条件下、可溶性増感剤、アルミニ
ウムフタロシアニンテトラスルホネート38ピコモルは、
同量の酸素化生成物を産生した（ビーズ中の増感剤の量
は、200×10-6×2.6×10-6＝520ピコモル）。
2.クロロフィルa/テトラブチルスクアレート増感剤ビー
ズ カルボキシル化ラテックスビーズ（175nmサイズ、水
中10％固体、30.0ml）の懸濁液を遠心分離した。上清を
捨て、ペレットをエチレングリコール（60.0ml）中に再
懸濁した。懸濁液を100℃まで加熱した。クロロフィル
ａ中1.67mMであり、テトラブチルスクアレート［1,3−
ビス（４−ジブチルアミノフェニル）スクレアート］中
3.33mMであるベンジルアルコール溶液9.0mlを、懸濁液
に３分間かけてゆっくりと加えた。７分間加熱を続け、
次いで、懸濁液を水浴で室温まで冷ました。ベンジルア
ルコール懸濁液を冷エタノール（120ml）に加えた。混
合物を遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを水中50％
エタノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。同じ再
懸濁および遠心分離操作を、水中５％エタノール（30m
l）中で繰り返した。
特性化 A.染料濃縮：ビーズ中のテトラブチルスクアレートの濃
度を、上記クロロフィルａビーズの場合に記載したよう
にして分光計により、測定した。ビーズ中、44μＭ染料
であることが分かった。
B.一重項酸素産生：エタノール中ADPAの5mM溶液25μｌ
をホスフェート緩衝液、pH7.0（20mM、50mMNaClを含有
する）中、ビーズ（100μｇ）の懸濁液に加えた。混合
物に、610nmロングパスフィルターを用いて上記のよう
に照射した。一重項酸素形成速度は、ADPAの（400nmで
の）吸光度における減少速度から計算した。ビーズは、
７×10-2μモル一重項酸素／分を産生することが分かっ
た。
3.ジオキセン/EuTTA/TOPOアクセプタービーズ 175nmカルボキシル化ラテックスビーズ（水中10％懸
濁液）20mlをエトキシエタノールに加えた（20.0ml）。
混合物を90℃まで加熱した。エトキシエタノール中、10
mM2−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−３−フェニル
ジオキセン、20mMEuTTA、および60mMTOPOである溶液20m
lを混合物に加えた。97℃までの温度で７分間加熱を続
けた。混合物を室温まで冷ました。エタノール（40.0m
l）を加え、混合物を遠心分離した。ペレットを80％エ
タノールに再懸濁し、懸濁液を遠心分離した。再懸濁お
よび遠心分離操作を10％エタノール（36ml）中で繰り返
した。
特性化 A.染料濃縮：ビーズ中のEuTTAの濃度を、分光計によ
り、測定し、0.07Mであることが分かった。ジオキセン
の濃度は、EuTTA存在下では測定できないので、同一条
件下、ジオキセンのみ、２−（ｐ−ジメチルアミノフェ
ニル）−３−フェニルジオキセンで染色した各ビーズ中
で測定した。その濃度は、0.016Mであることが分かっ
た。
B.一重項酸素産生：ホスフェート緩衝液（0.5ml、20mM
ホスフェート、50mMNaCl、0.1％トゥイーン20、pH7.0）
中、ビーズ（25μｇ）の懸濁液を、同一緩衝液中２μＭ
アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネート（0.5m
l）の溶液と混合した。混合物に、610nmロングパスフィ
ルターを備えた125wタングステン−ハロゲンランプで１
分間照射した。照射後、混合物をターナーTD−20eルミ
ノメーターに置き、発光を20秒間測定した。強度は、32
7RUL（相対光単位）／秒であることが分かった。放出さ
れた光の波長を、パーキン−エルマー650−40スキャン
ニングスペクトロフルオリメーターを用いて測定した。
主要な放出ピークは、615nm辺りに集中した。
II.アッセイ操作 抗体の40nmビーズに対するEDAC/NHSカップリング スルホ−NHS（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミ
ド、ピアス・ケミカル・カンパニー、＃24510G）73.6mg
を、水中4mg/mlカルボキシレート修飾40nmポリスチレン
ビーズ（クロロフィルａおよびテトラブチルスクアレー
トで染色）の懸濁液6mlに溶解した。0.5M Na2HPO4136ul
を加えた。pHを5.2に調整した。更に水136ulを加えた。
水454μｌ中EDAC（１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド、シグマ
・ケミカル・カンパニー、＃Ｅ−6383）130.4mgを撹拌
しているビーズ懸濁液にゆっくりと加えた。懸濁液を室
温で20分間インキュベートした。ビーズをソーバルSA−
600ローター中15,000rpmで４℃で20分間遠心分離した。
上清を捨てた。次いで、ビーズを、5mMリン酸ナトリウ
ム、pH5.8の1.2mlに再懸濁し、懸濁液を超音波処理して
ビーズを再分散させた。1.7mg/ml IgG（マウスモノクロ
ーナル抗フルオロセイン）および6.7mg/ml BSAおよび17
mMボラックス、pH9.2を含有する撹拌溶液4.8mlに、ビー
ズをゆっくりと加え、４℃で一晩穏やかに混合した。2M
グリシン800uLをビーズ懸濁液に加え、次いで、0.1Mボ
ラックス中50mg/ml BSA2.8mlを加えた。懸濁液を超音波
処理し、４℃で３時間穏やかに混合させた。ビーズを1
5,000rpmで30分間遠心分離した。上清を捨てた。ビーズ
を50mMリン酸ナトリウムおよび150mMNaCl、pH7.6の3ml
に再懸濁し、懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸
濁、および超音波処理工程を合計３回繰り返した。３回
終了後、ビーズを50mMリン酸ナトリウムおよび150mMNaC
l、pH7.6の2.4mlに再懸濁した。得られた懸濁液を超音
波処理し、４℃で貯蔵した。
III.175nmビーズに対するアビジン−ＤのEDAC/NHSカッ
プリング スルホ−NHS4.4mgを、水中、25mg/mlカルボキシレー
ト修飾175nmポリスチレンビーズ（２−（ｐ−ジメチル
アミノフェニル）−３−フェニルジオキセン/Eu（TTA）
/TOPOで染色した）の懸濁液0.4mlに溶解した。0.25M Na
2HPO40.0160mlを加えた。水0.030mlに溶解したEDAC8mg
を旋回しているビーズ懸濁液にゆっくりと加えた。懸濁
液を室温で20分間インキュベートした。ビーズをソルボ
ールSA−600ローター中、15,000rpmで４℃で20分間遠心
分離した。上清を捨てた。ビーズを0.005Mリン酸ナトリ
ム、pH5.8の0.6mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理し
て、ビーズを再懸濁した。ビーズを再度、1.33mg/mlア
ビジン−Ｄ（ベクター）および17mMボラックス、pH9.2
を含有する撹拌溶液3mlにゆっくりと加え、４℃で一晩
穏やかに混合した。DMF中1M無水コハク酸0.004mlを加え
た。懸濁液を穏やかに混合しながら４℃で１時間インキ
ュベートした。10mMリン酸ナトリウムおよび150mMNaC
l、pH7.0中、50mg/ml BSA0.4mlを加えた。懸濁液を４℃
で３時間穏やかに混合させた。ビーズを15,000rpmで30
分間遠心分離した。上清を捨てた。ビーズを50mMリン酸
ナトリウムおよび150mMNaCl、pH7.6、3mlに再懸濁し
た。懸濁液を超音波処理した。遠心分離、再懸濁、およ
び超音波処理を合計３回繰り返した。３回終了後、ビー
ズを50mMリン酸ナトリウムおよび150mMNaCl、pH7.6の2.
25mlに再懸濁した。懸濁液を超音波処理し、４℃で貯蔵
した。
IV.総T3アッセイ アッセイ緩衝液:0.075Mバルビタール、0.2MNaCl、0.4
％BSA、1.25％マウスIgG、10mg/ml硫酸デキストラン
（分子量500,000）、1.0mg/mlデキストランＴ−500、10
μg/ml集塊IgG ビーズ アクセプタービーズ:2−（ｐ−ジメチルアミノフェニ
ル）−３−フェニルジオキセン/Eu（TTA）3/TOPOで染色
したアビジン−EDAC、175nm 増感剤ビーズ：クロロフィルa/スクレートで染色した
抗フルオロセイン−EDAC、40nm アッセイプロトコール アッセイ緩衝液（0.75mg/ml）中、８−アニリノ−１
−ナフタレンスルホン酸、アンモニウム塩（シグマ、Ａ
−3125）溶液50μｌをT3標準または試料50μｌに加え
た。アッセイ緩衝液100μｌを加えた。ビオチニル化抗
−T3を標準手法に従って、ビオチン−LC7NHS（ピアス・
ケミカル・カンパニー）をモノクローナル抗−T3と反応
させ、次いで、セファデックス・カラムでのクロマトグ
ラフィーにより精製することにより、調製した。アッセ
イ緩衝液中ビオチニル化抗−T3（70ng/ml）50μｌを加
えた。アッセイ緩衝液（50μｌ）中トレーサー、T3−LC
21Fl（1.8ng/ml） を加えた。混合物を37℃で15分間インキュベートした。
アッセイ緩衝液中増感剤ビーズ（50μｇ）およびアクセ
プタービーズ（6.25μｇ）の懸濁液500μｌを加え、混
合物を37℃で15分間インキュベートした。“停止溶液”
（50μｌ）（10μＭフルオレセイン、0.5mMビオチン）
を加えた。
シグナルは、610nmカット−オフフィルターを備えた
ハロゲンランプにより、照射１分、測定20秒で読んだ。
結果 発光シグナルをT3濃度の関数としてプロットした。シ
グナル変調は、8.5ng/ml T3で94％であった。0.5ng/ml
ではシグナル変調は38％であった。
実施例２ 化学発光量子収率および減衰速度測定 化合物11の調製 乾燥トルエン50ml中４−ジメチルアミノベンゾイン
（10ミリモル）2.55gの撹拌溶液に、２−メルカプトエ
タノール（15ミリモル）1.2mlを加え、次いで、TMSCl2.
5mlを加えた。反応混合物をアルゴン下18時間還流さ
せ、室温にして、飽和重炭酸溶液150ml中に注いだ。二
相混合物を分離した。有機相は、再度、飽和重炭酸溶液
100mlで洗浄した。集め合わせた水相をCH2Cl275mlで抽
出した。集め合わせた有機相を硫酸ナトリム（20g）で
乾燥させ、蒸発濃縮した。得られた残渣をフラッシュク
ロマトグラフィー（CH2Cl2）にかけ、化合物11および20
（２−位置異性体の4:1混合物）2.6gを得た。灰色の固
体をCH2Cl2−MeOH（10:90）混合物から再結晶化し、化
合物11の単一位置異性体の針状結晶1.8gを得た。
融点108−110℃ 1HNMR（CDCl3,250MHz）：δ2.85（s,6H）,3.22（t,2
H）,4.5（t,2H）,6.55（d,2H）,7.1−7.3（m,7H） マススペクトル（CI:m/e、相対強度）主要ピーク:297
（M+,40）、165（100） 吸収スペクトル（トルエン）:330nm（ε13,000） 光酸素化操作 化合物11（上記の主たる位置異性体）25ミリグラムを
光酸素化管中でCH2Cl210mlに溶解した。ポリスチレン結
合ローズベンガル約50mgを加え、酸素バブラーを接続し
た。500nmカット−オフフィルターを備えたドーラン−
ジェンナーランプで試料を照射しながら、酸素をゆっく
りと溶液に通した。反応の進行は、TLCで追跡した。チ
オエステル生成物のスポットが検出でき、化合物11より
も低いRf（CH2Cl2）を有した。化合物13が完全に消費さ
れたら、反応完了と判断した。増感剤を濾去し、溶液を
ロータリー音エバポレーターで蒸発濃縮して、チオエス
テル32を唯一の生成物として26mg得た。
1HNMR:（CD2Cl2）：δ3.05（s,6H）,3.4（t,2H）,4.5
（t,2H）,6.72（d,2H）,7.5（m,3H）,7.85（d,2H）,8.0
5（d,2H） マススペクトル（CI、相対強度）主要ピーク:329
（M+,25）、148（100） 吸収スペクトル（CH2Cl2）:342nm（〜30,000） 蛍光スペクトル（トルエン）:370nm 蛍光測定 チオエステル32の溶液を４つの異なる溶媒（トルエン
−乾燥;CH2Cl2;ヘキサン；およびアセトニトリル）に取
り、パーキン−エルマー650−40蛍光光度計の試料区間
の1cm角石英キュベットに入れた。試料をそれぞれの溶
媒の吸収極大（スリット幅2nm）で励起させ、放出スペ
クトル（スリット幅3nm）を350nmから470nmまで走査す
ることにより記録した。蛍光効率を測定し、表１に作表
した。
化学発光の量子収率の測定 Eu（TTA）3Phenの調製： 乾燥トルエン中、Eu（TTA）３・3H2O（10ミリモル、
コダック）8.69gおよび1,10−フェナントロリン（10ミ
リモル、アルドリッチ）1.8gを油浴中１時間95℃まで加
熱した。トルエンを減圧下で除去した。灰色固体をトル
エン10mlから結晶化して、Eu（TTA）3Phen10グラムを得
た。
吸収スペクトル:270nm（20,000）,340nm（60,000）
（トルエン） IR（KBr）:cm-1:340（ｓ）,1600（ｓ）,1540（ｓ）,1
40（ｓ）,1300（ｓ） Eu（TTA）3Phenへのエネルギー転移 乾燥トルエン中、化合物11（上記の位置異性体）（0.
1mM）（8:2混合物）、アルミニウムフタロシアニン（0.
1μＭ）、および上記のEu（TTA）3Phen（０〜4.0mM）の
溶液を、スペックス・フルオロログ分光光度計の試料区
画の1cm角石英キュベット（銀メッキした２側面を有す
る）に入れた。試料ホルダーの温度は、外側の水浴を循
環させることにより25℃に維持した。640nmカットオフ
フィルターを励起ビームの前部に設置した。試料溶液
を、熱平衡に達するまで少なくとも３分間試料区画に置
いた。放出は、時間の流れに沿って記録した。試料を、
613nm（スリット幅8nm）での放出定常状態に達するまで
680nm（スリット幅24nm）で照射した。様々な濃度のEu
（TTA）3Phenでの定常状態光強度を記録し、表２にまと
めた。定常状態光強度から量子収率を測定した。Eu（TT
A）3Phen濃度に対する化学発光強度の二重逆数プロット
（double reciprocal plots）は直線であった。
ジオキセン９からの化学発光 実験1:乾燥トルエン中、ジオキセン９（0.1mM）およ
びアルミニウムフタロシアニン（0.1μＭ）の溶液を上
記のとおり680nmで照射した。400nm（スリット幅8nm）
の光強度における放出を、放射時間の関数として記録し
た。光強度は、180秒の照射に対して8793RLUであった
（実験３回の平均値）。
実験2:ジオキセン９ジオキセタン分解速度を、乾燥ト
ルエン中25℃で曝気した溶液の化学発光の衰退により追
跡した。分解速度は、1.0μＭアルミニウムフタロシア
ニンおよびジオキセン（ジオキセン0.1μＭ以下）の存
在下に追跡した。化学発光衰退は、前記した条件下、ス
ペックス・フルオロログ分光光度計で追跡した。25℃で
の衰退の速度定数は、2.88×10-4S-1であった。
アクセプタービーズの調製 洗浄した175nmカルボキシレート修飾ラテックスの20
％懸濁液（400mg）4mlを、撹拌棒を入れた25ml丸底（R.
B.）フラスコ中、エトキシエタノール3mlで希釈した。
次いで、丸底フラスコを105℃で油浴中に入れ、10分間
撹拌した。その後、3.3mMチオキセン11と15.5mMEu（TT
A）3DPPを加え、ビーズを５分間以上撹拌した。この時
点で、0.1NNaOH 1.0mlをゆっくりと５分間かけて加え
た。全てを加える間、油浴温度は、105℃に維持した。
油浴温度を２時間かけて室温までゆっくりと下げた。
冷ました後、混合物をエタノール20mlで希釈し、遠心
分離（12,500rpm、30分間）した。上清を捨て、ペレッ
トを超音波処理により、エタノールに再懸濁した。遠心
分離を繰り返し、ペレットを水に再懸濁し、さらに、遠
心分離を繰り返した。ペレットを水性エタノール5mlに
再懸濁し、最終容量40mlにした。ビーズの最終濃度は、
10mg/mlであった。
Eu（TTA）3DPPの濃度を分光光度計で測定した。ビー
ズ懸濁液の一部を乾燥アルゴン流下で還元乾固させ、残
渣をジオキサンに溶解した。ポリスチレンに対して、Eu
（TTA）３に対して（ε340nm＝6.7×104）、およびDPP
に対して（ε270nm＝4.0×104）1.06g/ccの密度を用い
て、Eu（TTA）3DPPの濃度が100nmであることを測定し
た。ビーズ中の化合物11の濃度は、その吸光度がEu（TT
A）3DPPにより遮蔽されていたので、測定できなかっ
た。
ビーズの化学発光を水溶性アルミニウムフタロシアニ
ン増感剤を用いて、ORIELルミノメーターで測定した。
ビーズの一部を、0.1％トゥイーン−20を含有するリン
酸緩衝液pH8.0中で、100μg/mlまで希釈した。アルミニ
ウムフタロシアニンテトラスルホン酸1.0μＭを加え、
化学発光シグナルを照射時間の関数として測定した。ま
た同一の試料をスペックス・フルオロログ蛍光計に設置
し、680nm（スリット幅20nm;640カットオフフィルタ
ー）で照射した。化学発光放出スペクトルは、570nmか
ら620nmまで走査することにより、記録した。化学発光
衰退および量子収率は、表３にまとめた。
ビーズにおける量子収率の測定 ジオキセン９ビーズ リン酸緩衝液（pH8.2;50mM0.1％トゥイーン−20）
中、ジオキセン９ビーズ（0.2mg）およびアルミニウム
フタロシアニンテトラスルホン酸（2.5μＭ）の溶液
を、スペックス・フルオロログ分光光度計の試料区画の
1cm角キュベット（銀メッキされた２側面を有する）に
入れた。試料ホルダーの温度は、25℃に維持した。640
カットオフフィルターを励起ビームの前部に設置した。
試料溶液を、熱平衡に到達するまで少なくとも３分間試
料区画に置いた。360nmでの光放出は、時間経過に沿っ
て追跡した。試料を680nm（スリット幅24nm）で60秒間
照射した。360nm（スリット幅16nm）での放出を5000秒
間記録した。放出された光の総計をカット−ウェイ（cu
t−weigh）法により測定した。ピーク形の補正もまた、
カット・アンド・ウエイ（cut and weigh）法により行
った。360nmで放出された光の総計は、8.87±0.2×104R
UL/4500秒であった（ピーク形補正後；実験２回の平均
値）。
ジオキセン9:Eu（TTA）3TOPOビーズ リン酸緩衝液（pH8.2、50mM0.1％トゥイーン−20）中
ジオキセン9Eu（TTA）3TOPOビーズ（0.2g）およびアル
ミニウムフタロシアニンテトラスルホン酸（2.5μＭ）
の溶液を、スペックス・フルオロログ分光光度計の試料
区画の1cm角キュベット（銀メッキされた２側面を有す
る）に入れた。残りの実験は、ジオキセン９ビーズのと
ころで記載したようにして実施した。ビーズからの光放
出は、613nm（スリット幅16nm）で追跡した。
放出された光の総計は、カット・アンド・ウェイ法に
より測定した。PMT補正は、前記の溶液実験のとおりに
行った。613nmで放出された光の総計は、25.0±0.3×10
5RUL/4500秒であった。（PMT補正後；実験２回の平
均）。
定常状態法 ジオキセン9:Eu（TTA）3TOPOビーズ。リン酸緩衝液
（pH8.2;50mM0.1％トゥイーン−20）中、ジオキセン9:E
u（TTA）3TOPOビーズ（0.5mg）およびアルミニウムフタ
ロシアニンテトラスルホン酸（0.05μＭ）の溶液を、オ
リエル・ケミルミノメーターの試料区画の12〜75mM試験
管に入れた。試料ホルダーの温度は37℃である。610カ
ット−オフフィルターを励起ビームの前部に置いた。試
料溶液を熱平衡に到達するまで少なくとも５分間試料区
画に置いた。定常状態の放出に到達するまで、試料を、
30秒間隔で、次いで読み取り５秒で照射した。定常状態
放出での平均強度は、21,000±1000RLU（実験３回）で
ある。
化合物11:Eu（TTA）3DPPビーズ。リン酸緩衝液（pH8.
2;50mM0.1％トゥイーン−20）中、ジオキセン11:Eu（TT
A）3DPPビーズ（0.5mg）およびアルミニウムフタロシア
ニンテトラスルホン酸（0.05μＭ）の溶液を、オリエル
・ケミルミノメーターの試料区画の12〜75mM試験管に入
れた。試料ホルダーの温度は37℃である。610カット−
オフフィルターを励起ビームの前部に置いた。試料溶液
を熱平衡に到達するまで少なくとも５分間試料区画に置
いた。定常状態の放出に到達するまで、試料を、６秒間
隔で、次いで読み取り３秒で照射した。定常状態放出で
の平均強度は、32,000±1000（実験３回）である。
実施例３ Ｃ−26チオキセン（化合物13）の調製： A. N−メチルアニリン62g（0.5モル）および５−ブロモ
葉酸エチル62g（0.3モル）を封止した管中で16時間100
℃まで加熱した。反応混合物を室温まで冷まし、酢酸エ
チル100mlに注いた。酢酸エチル溶液を20％水酸化ナト
リウム（３×100ml）で洗浄した。水層を酢酸エチル50m
lで抽出した。集め合わせた酢酸エチル溶液を硫酸ナト
リウム（50g）で乾燥させ、減圧下で除去した。残渣を
高真空下（130−137℃）で蒸留させ、Ｎ−メチル−Ｎ−
エチル葉酸アニリン60gを得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ1.3（t,3H）,1.65（m,4
H）,2.3（t,2H）,2.8（s,3H）,3.3（t,2H）,4.2（q,2
H）,6.65（d,2H）,7.2（m,3H） B. 氷浴中DMF（8.8g）の撹拌溶液に、POCl3（5.06g）を
ゆっくりと加えた。添加完了後、反応物を４℃で10分間
撹拌する。上記Ａで得られたＮ−メチル−Ｎ−エチルバ
レロイルアニリン（3.76g）を加え、反応物を１時間100
℃まで加熱した。反応混合物を氷に注ぎ、20％水酸化ナ
トリウムで中和した。混合物を酢酸エチル（３×50ml）
で抽出した。集め合わせた酢酸エチル溶液を硫酸ナトリ
ウム（50g）で乾燥させ、減圧下で除去した。残渣をシ
リカゲルに通した（CH2Cl2→CH2Cl2:EtOAc9:2）。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ1.2（t,2H）,1.6（m,4
H）,2.3（t,2H）,2.9（s,3H）,3.3（t,2H）,4.1（q,2
H）,6.6（d,2H）,7.6（m,3H）,9.7（s,1H） C. 60％エタノール中、アルゴン下、上記Ｂで得られた
Ｎ−メチル−Ｎ−エチル−ω−バレロイル−ｐ−ホルミ
ルアニリン5.0g（20ミリモル）およびシアン化カリウム
2gの還流溶液に、エタノール20ml中ベンズアルデヒド2.
15g（20ミリモル）を90分加えた。反応混合物を15分以
上還流し、酢酸エチル（３×50ml）で抽出した。集め合
わせた酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウム（50g）で乾燥
させ、減圧下で除去した。生成物を分取TLC（ヘキサ
ン：酢酸エチル5:1）で精製して、置換ベンゾイン2.2g
を得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ1.3（t,3H）,1.6（m,4
H）,2.4（t,2H）,2.9（s,3H）,3.3（t,2H）,4.1（q,2
H）,4.8（d,1H）,5.8（d,1H）,6.5（d,2H）,7.3（m,5
H）,7.8（d,2H） D. エタノール15ml中上記Ｃで得られたベンゾイン（1.1
g）の撹拌溶液に水7mlおよびKOH100mgを加えた。反応物
を室温で３時間撹拌させた。TLC（シリカゲル、CH2Cl2:
EtOAc9:1）により、出発物質が残っていないことが分か
った。溶媒を中和し、カルボン酸生成物を酢酸エチル
（５×50ml）で抽出した。集め合わせた酢酸エチル溶液
を硫酸ナトリウム（50g）で乾燥させ、減圧下で除去し
た。カルボン酸生成物を、次の工程に使用した。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ1.6（m,4H）,2.4（t,2
H）,2.9（s,3H）,3.3（t,2H）,5.8（s,1H）,6.5（d,2
H）,7.3（m,5H）,7.8（d,2H） E. DMF80ml中、４℃で上記Ｄで得られたカルボン酸（1.
7g、５ミリモル）およびジデシルアミン（1.9g、6.3ミ
リモル）の撹拌溶液に、DPPA（1.8g、８ミリモル）を加
え、次いで、トリエチルアミン（1.25ml）を加えた。反
応混合物を４℃で撹拌し、次いで、室温で16時間撹拌し
た。溶媒を中和し、生成物を酢酸エチル（５×50ml）で
抽出した。集め合わせた酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウ
ム（50g）で乾燥させ、減圧下で除去した。生成物を分
取TLC（CH2Cl2:酢酸エチル9:1）で精製して、置換アミ
ドベンゾイン2.6gを得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ0.8（t,6H）,1.3（m,36
H）,1.6（m,12H）,2.3（t,2H）,2.7（m,4H）,3.0（s,3
H）,3.3（m,6H）,4.8（d,1H）,5.8（d,1H）,6.5（d,2
H）,7.3（m,5H）,7.8（d,2H） F. 乾燥トルエン50ml中、置換ベンゾイン1.5g（2.5ミリ
モル）の撹拌溶液に、２−チオエタノール1.2ml（15ミ
リモル）を加え、次いで、TMSCl 2.5mlを加えた。反応
混合物をアルゴン下油浴で30分間還流した。反応混合物
を室温にして、飽和重炭酸溶液150mlに注いだ。有機層
を分離し、飽和重炭酸溶液100mlで洗浄した。集め合わ
せた水相をCH2Cl275mlで抽出した。集め合わせた有機溶
液を硫酸ナトリウム（50g）で乾燥させ、減圧下で除去
した。生成物をシリカゲル（CH2Cl2:酢酸エチル9:1）で
精製し、Ｃ−26チオキセン1.2gを淡黄色油状物として得
た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ0.8（t,6H）,1.3（m,36
H）,1.6（m,12H）,2.3（t,2H）,2.8（s,3H）,3.3（m,9
H）,4.5（t,2H）,6.5（d,2H）,7.1（d,2H）,7.3（m,5
H） マススペクトル（CI:m/e）M+662 吸収スペクトル（トルエン）:330nm（ε13,000） 実施例４ Ｃ−８チオキセン（化合物15）の調製： A. 60％エタノール中、アルゴン下、ｐ−ジメエチルア
ミノ−ベンズアルデヒド3.0g（20ミリモル）およびシア
ン化カリウム2gの還流溶液に、エタノール20ml中ｐ−オ
クチルベンズアルデヒド（20ミリモル、コダック）4.4g
を90分加えた。反応混合物を15分以上還流させ、酢酸エ
チル（３×50ml）で抽出した。集め合わせた酢酸エチル
溶液を硫酸ナトリウム（50g）で乾燥させ、減圧下で除
去した。生成物を分取TLC（ヘキサン：酢酸エチル5:1）
で精製して、置換ベンゾイン1.2gを得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ0.85（t,3H）,1.3（m,12
H）,1.5（m,2H）,2.5（t,2H）,2.9（s,6H）,4.8（d,1
H）,5.8（d,1H）,6.5（d,2H）,7.3（q,4H）,7.8（d,2
H） B. 乾燥トルエン50ml中、上記Ａで得られた置換ベンゾ
イン0.94g（2.5ミリモル）の撹拌溶液に、２−チオエタ
ノール1.2ml（15ミリモル）を加え、次いでTMSCl2.5ml
を加えた。反応混合物をアルゴン下油浴で30時間還流さ
せた。反応混合物を室温にし、飽和重炭酸溶液150mlに
注いだ。有機層を分離し、飽和重炭酸溶液100mlで洗浄
した。集め合わせた水層をCH2Cl275mlで抽出した。集め
合わせた有機溶液を硫酸ナトリウム（50g）で乾燥さ
せ、減圧下で除去した。生成物をシリカゲル（CH2Cl2:
酢酸エチル9:1）で精製し、Ｃ−８チオキセン化合物15
を淡黄色固体として0.75g得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ0.8（t,3H）,1.3（m,10
H）,1.6（m,2H）,2.5（t,2H）,2.9（s,6H）,3.3（t,2
H）,4.5（t,2H）,6.5（d,2H）,7.1（d,2H）,7.3（m,5
H） マススペクトル（CI:m/e、相対強度）409（M+100）,1
65（40） 吸収スペクトル（トルエン）:330nm（ε13,000） 実施例５ Ｎ−フェニルオキサジン（化合物16）の調製： A. p−ジメエチルアミノベンゾイン5gをCH2Cl25mlに溶
解し、氷浴中で撹拌した。SOCl210mlを加え、反応混合
物を１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、生成物を
MeOHから結晶化した。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ3.0（s,6H）,6.3（s,1
H）,6.5（d,2H）,7.4（m,5H）,7.8（d,2H） B. p−（２−フェニル−２−クロロアセチル）ジメチル
アミノ−ベンゼン0.271g（１ミリモル）およびＮ−（２
−ヒドロキシエチル）アニリン0.274g（2.0ミリモル）
を乾燥エタノール3mlに溶解し、封止管中80℃で８時間
加熱した。冷却すると、生成物が淡黄色針状物として晶
出し、これを濾過および乾燥させて、Ｎ−フェニルオキ
サジン0.2gを得た。
化合物15 1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ3.0（bs,6H）,3.7（bt,2
H）,4.4（bt,2H）,6.5（bd,2H）,7.4（m,12H） マススペクトル（CI:m/e、相対強度）356（M+,100）,
180（70） 実施例６ Ｎ−フェニルインドールオキサジン（化合物17）の調
製： ３−（２−フェニル−２−クロロアセチル）−Ｎ−メチ
ルインドール0.283g（１ミリモル）（H.ナカムラおよび
T.ゴトー、ヘテロサイクルズ、10巻、167〜170頁（1978
年）、および２−アニリノエタノール0.274g（2.0ミリ
モル）を乾燥エタノール3mlに溶解し、封止管中80℃で
８時間加熱した。冷却すると、生成物が、淡黄色針状物
として晶出し、これを濾過および乾燥させて、Ｎ−フェ
ニルインドールオキサジン化合物17を0.21g得た。
1H NMR（CDCl3,250MHz）：δ3.7（bs,3H）,3.8（bt,2
H）,4.4（bt,2H）,7.2（m,15H） マススペクトル（CI:m/e、相対強度）366（M+100）,1
80（70） 実施例７ 表４は、実施例２に記載と同様の方法で測定した化合
物11、16、および17の特性をまとめたものである。
上記考察は、本発明に関連する機構について、ある理
論を包含するものである。これらの理論は、本発明が上
記結果に到達することが示されているので、いずれにし
ても本発明を制限するものと解釈すべきではない。
上記説明および実施例は、本発明のある種の好ましい
実施態様に関して、本発明を開示するものである。そこ
に記載した方法を修飾することは、当業者には、自明で
あるが、添付の請求の範囲に記載の範囲内にあることを
意図しており、かつ本発明の境界内に含まれるものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−180773（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 G01N 21/78

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記式で表される化学発光化合物： 式中、X'はＳ、ＤおよびD'はメチルである。
  2. 【請求項２】（ａ）請求項１記載の化学発光化合物；お
    よび （ｂ）ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サ
    マリウム、オスミウムおよびルテニウムからなる群から
    選択される金属を少なくとも六配位結合状態で含む金属
    キレート； を含む組成物。
  3. 【請求項３】請求項１項記載の化学発光化合物を中に組
    み込んでいるラテックスを含む組成物。
  4. 【請求項４】ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウ
    ム、サマリウム、オスミウムおよびルテニウムからなる
    群から選択される六配位結合状態の金属キレートを更に
    含む請求項３記載の組成物。
  5. 【請求項５】請求項１記載の化学発光化合物をパッケー
    ジに含むキット。
  6. 【請求項６】該化学発光化合物がラテックス粒子中に存
    在する請求項５記載のキット。
  7. 【請求項７】パッケージした組み合わせ中に、 （ａ）化学発光化合物；および （ｂ）酸素をその励起状態で活性化して一重項状態にす
    る能力のある光増感剤； を含む請求項５または６記載のキット。
  8. 【請求項８】化学発光化合物が組成物中に存在し、該組
    成物において懸濁可能なラテックッス粒子が該化学発光
    化合物を含み、該ラテックス粒子には特異的結合対（sb
    p）構成員が結合している、請求項７記載のキット。
  9. 【請求項９】光増感剤が組成物中に存在し、該組成物に
    おいて懸濁可能なラテックッス粒子が該光増感剤を含
    み、該ラテックス粒子には特異的結合対（sbp）構成員
    が結合している、請求項７または８記載のキット。
  10. 【請求項１０】該懸濁可能な粒子の両者またはいずれか
    が、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、サマ
    リウム、オスミウムおよびルテニウムからなる群から選
    択される金属を含む金属キレートを含む請求項７から９
    のいずれかに記載のキット。
  11. 【請求項１１】（ａ）（１）分析物を含有する疑いのあ
    る媒質、（２）その励起状態で酸素を一重項状態へと活
    性化する能力のある光増感剤であって特異的結合対（sb
    p）構成員と結合（アソシエート）している光増感剤、
    および（３）請求項１項記載の化学発光化合物を含む懸
    濁可能な粒子物質であって特異的結合対（sbp）構成員
    を結合している粒子物質の組み合わせを提供し、 （ｂ）該組み合わせを光で処理して該光増感剤を励起さ
    せ、そして、 （ｃ）該組み合わせを、そこから放出させる発光量であ
    って該媒質中の分析物の量と相関する発光量について試
    験すること、 を含んでなる、分析物の測定法。
  12. 【請求項１２】光増感剤が第２の懸濁可能な粒子物質中
    に組み込まれている、請求項11項記載の測定法。
  13. 【請求項１３】光増感剤が、励起状態で分子酸素を一重
    項状態へと活性化する能力のある染料である、請求項11
    または12項記載の測定法。
  14. 【請求項１４】染料が、メチレンブルー、ローズベンガ
    ル、ポルフィリン類およびフタロシアニン類からなる群
    から選択される、請求項13項記載の測定法。
  15. 【請求項１５】sbp構成員が、独立して、受容体類、リ
    ガンド類およびポリヌクレオチド類からなる群から選択
    される、請求項11から14のいずれかに記載の測定法。
  16. 【請求項１６】分析物が、薬剤類、タンパク質類、核酸
    類および微生物類からなる群から選択される、請求項11
    から15のいずれかに記載の測定法。
  17. 【請求項１７】測定法が均一系イムノアッセイである、
    請求項11から16のいずれかに記載の測定法。
  18. 【請求項１８】組み合わせ物を照射により処理して、該
    光増感剤を励起させる、請求項11から17のいずれかに記
    載の測定法。
  19. 【請求項１９】組み合わせ物に波長450−950nmの光を照
    射する、請求項11から18のいずれかに記載の測定法。
  20. 【請求項２０】光増感剤と結合しているsbp構成員が、
    アビジンまたは抗体であり、該化学発光化合物のsbp構
    成員が、アビジンまたは抗体である、請求項11から19の
    いずれかに記載の測定法。
  21. 【請求項２１】粒子物質が、ユーロピウム、テルビウ
    ム、ジスプロシウム、サマリウム、オスミウムおよびル
    テニウムから成る群から選択される金属を含む金属キレ
    ートを含む、請求項11から20のいずれかに記載の測定
    法。
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