ES2280110T3 - Procedimiento para determinar un analito en una muestra. - Google Patents
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Abstract
Composición que comprende: a) primeras partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un compuesto quimioluminiscente capaz de reaccionar con el oxígeno singlete, en donde dichas primeras partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un primer miembro de un par de unión específica, y b) segundas partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un fotosensibilizador, en donde dicho fotosensibilizador es capaz, en su estado excitado, de activar el oxígeno a su estado singlete, en donde dichas segundas partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un segundo miembro de un par de unión específica.
Description
Procedimiento para determinar un analito en una
muestra.
Esta invención se refiere a procedimientos,
composiciones y equipos para determinar un analito en una muestra.
En concreto, esta invención se refiere a ensayos de unión específica
que no precisan de un paso de separación.
El campo del diagnóstico clínico ha visto una
amplia expansión en años recientes, tanto en la variedad de
materiales (analitos) que pueden determinarse fácil y precisamente,
así como en los procedimientos para la determinación. Se desean
medios apropiados, fidedignos, y no peligrosos para detectar la
presencia de concentraciones bajas de materiales en líquidos. En la
química clínica estos materiales pueden estar presentes en fluidos
corporales en concentraciones inferiores a 10^{-12} molar. La
dificultad para detectar concentraciones bajas de estos materiales
está agravada por los tamaños relativamente pequeños de muestras que
pueden usarse.
En el desarrollo de un ensayo hay múltiples
consideraciones. Una consideración es la respuesta de la señal a
cambios en las concentraciones de analito. Una segunda consideración
es la facilidad con la que puede llevarse a cabo el protocolo para
el ensayo. Una tercera consideración es la variación en la
interferencia de muestra a muestra. La facilidad de preparación y
purificación de los reactivos, la disponibilidad del equipamiento,
la facilidad de automatización e interacción con los materiales de
interés son algunas de las consideraciones adicionales al
desarrollar un ensayo útil.
Una amplia categoría de técnicas implica el uso
de un receptor que puede unirse específicamente a una determinada
organización espacial y polar de un ligando marcado en función de la
presencia de un analito. El efecto de unión por parte del receptor
observado dependerá del marcaje. En algunos casos la unión al
receptor meramente proporciona los medios para diferenciar en el
peso molecular entre ligando marcado unido y no unido. En otros
casos la unión del receptor facilitará la separación del ligando
marcado unido del ligando marcado libre, o puede afectar la
naturaleza de la señal obtenida a partir de la marca de forma que la
señal varíe con la cantidad de receptor unido al ligando marcado.
Aún otra variación es que el receptor se marca y el ligando no se
marca. Alternativamente, tanto el receptor como el ligando se
marcan, o diferentes receptores se marcan con dos marcas
diferentes, en donde las marca interaccionan cuando están en
estrecha proximidad y la cantidad de ligando presente afecta el
nivel al que la marcas del receptor pueden interaccionar.
Hay una continua necesidad de técnicas nuevas y
precisas que puedan adaptarse a un amplio espectro de ligandos
diferentes, o usarse en casos específicos en los que otros métodos
pueden no ser fácilmente adaptables.
Se han descrito previamente inmunoensayos
homogéneos para moléculas pequeñas. Estos ensayos incluyen, entre
otros, el ensayo FRAT® de SYVA, el ensayo EMIT®, el inmunoensayo de
canalización enzimática (enzyme channeling immunoassay), y el
inmunoensayo de transferencia de energía de fluorescencia
(fluorescence energy transfer immunoassay, FETI); los
inmunoensayos de inhibición enzimática (Hoffman La Roche y Abbott
Laboratories); el inmunoensayo de polarización de la fluorescencia
(Dandlicker). Todos estos procedimientos tienen una sensibilidad
limitada, y solamente unos pocos, incluyendo el FETI y la
canalización enzimática, son apropiados para analitos grandes y
multiepitópicos.
Los compuestos luminiscentes, tales como los
compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes, encuentran
múltiples aplicaciones en el campo de los ensayos debido a su
capacidad para emitir luz. Por este motivo, los emisores de luz
(luminiscers) se han utilizado como marcadores en ensayos
tales como ensayos de ácidos nucleicos e inmunoensayos. Por
ejemplo, un miembro de un par de unión específica se conjuga con un
emisor de luz y se emplean varios protocolos. El emisor de luz
conjugado puede repartirse entre una fase sólida y una fase líquida
en proporción con la cantidad de analito en una muestra sospechosa
de contener el analito. Midiendo la luminiscencia de cualquiera de
las fases, se puede relacionar el nivel de luminiscencia observado
con una concentración del analito en la muestra.
Se han usado partículas tales como liposomas y
fantasmas de eritrocitos como portadores de materiales solubles en
agua encapsulados. Por ejemplo, los liposomas se han empleado para
encapsular material biológicamente activo para una diversidad de
usos, tales como sistemas de suministro de drogas en los que se
atrapa un medicamento durante la preparación del liposoma y, a
continuación se administra al paciente a tratar.
También se han usado en ensayos partículas tales
como cuentas de látex y liposomas. Por ejemplo, en ensayos
homogéneos puede atraparse un enzima en la fase acuosa del liposoma
marcado con un anticuerpo o antígeno. Se provoca que los liposomas
liberen el enzima en la presencia de una muestra y complemento.
También se han usado liposomas marcados con anticuerpos o
antígenos, que tienen colorantes fluorescentes o no fluorescentes
solubles en agua encapsulados en una fase acuosa, o colorantes
solubles en lípidos disueltos en la bicapa lipídica de la vesícula
lipídica, para ensayos de analitos capaces de entrar en una reacción
inmunoquímica con el anticuerpo o antígeno unido sobre la
superficie. Se han usado detergentes para liberar los colorantes a
partir de la fase acuosa de los
liposomas.
liposomas.
Los marcadores quimioluminiscentes ofrecen una
sensibilidad excepcional en ensayos de unión a ligandos, pero
normalmente se precisan uno o dos pasos químicos de activación. Los
marcadores fluorescentes no tienen este defecto pero son menos
sensibles.
Se han descrito marcadores quimioluminiscentes
para inmunoensayos y ensayos de ácidos nucleicos en los que un
grupo, que está unido covalentemente a una pareja de unión, emite
luz a partir de su activación química. Genprobe vende un equipo
para el ensayo de ácido nucleico que utiliza un éster de acridina
(Pace2 System®, San Diego, CA), y CIBA-GEIGY
(Basilea, Suiza) vende los equipos para inmunoensayos MagicLite®
basados en este tipo de marcador. La transferencia de energía desde
una sonda de ácido nucleico marcada a un aceptor fluorescente unido
a una segunda sonda ha sido descrito por Heller et al., I y
II, ver más abajo, para un ensayo sandwich de ácido
nucleico. Magio I, ver más abajo, discute un procedimiento similar
para inmunoensayos. La transferencia de energía desde un emisor de
luz, covalentemente unido a un polinucleótido, hasta un fluoróforo
intercalado fue mencionada por Heller et al., IV, ver más
abajo. La transferencia desde un colorante intercalado hasta un
emisor de fluorescencia sobre un polinucleótido fue descrita
recientemente por Cardullo et al., ver más abajo. Más aún,
McCapra, ver más abajo, ha descrito el uso de fotosensibilizadores
como marcadores en donde el fotosensibilizador activa el oxígeno a
su estado de singlete, el cual a su vez reacciona con un compuesto
que, al calentarse, produce luz.
La solicitud de patente europea nº 0.345.776
(McCapra) descubre ensayo de unión específica que utilizan un
sensibilizador como marcador. Los sensibilizadores incluyen una
porción que, cuando se estimula mediante excitación con radiación
de una o más longitudes de onda, u otros estímulos químicos o
físicos (por ejemplo, trasferencia de electrones, electrólisis,
electroluminiscencia, o transferencia de energía) alcanzará un
estado excitado que (a) a partir de la interacción con oxígeno
molecular producirá un oxígeno molecular singlete, o (b) a partir
de la interacción con un leuco-colorante asumirá una
forma reducida que puede devolverse a su estado original no
excitado mediante interacción con oxígeno molecular, causando la
producción de peróxido de hidrógeno. Cualquier interacción con el
sensibilizador excitado producirá, con la adición de reactivos, una
señal detectable.
La solicitud de patente europea nº 0.070.685
(Heller et al., I) describe un diagnóstico de hibridación
homogénea de ácido nucleico mediante transferencia de energía no
radiante.
En la solicitud de patente europea nº 0.070.687
(Heller et al., II) se describe un procedimiento de
diagnóstico de hibridación de polinucleótido que emite luz.
La solicitud de patente europea nº 0.232.967
(Morrison I) discute procedimientos y composiciones para realizar
ensayos para hebras polinucleotídicas diana. Los procedimientos
incluyen poner en contacto una muestra con un reactivo que incluye
una primera y una segunda sonda polinucleotídica. La primera y
segunda sondas son capaces de asumir una primera posición en la que
las sondas están unidas entre ellas, y una segunda posición en la
que las sondas están unidas a una diana. La sondas incluyen
porciones móviles capaces de interaccionar para producir una señal
indicativa de que las sondas están en una de las dos posiciones.
La solicitud de patente europea nº 0.315.364
describe un ensayo inmunoquímico para determinar la presencia o
concentración de antígeno o anticuerpos en un fluido. El ensayo
comprende (a) formar un complejo ternario de un primer anticuerpo o
antígeno marcado, un segundo anticuerpo o antígeno marcado, y el
antígeno o anticuerpo a determinar, y (b) detectar una señal
producida en la presencia de al menos un sustrato, por una
interacción entre la primera marca y la segunda marca, potenciada
por su proximidad entre ellas unidas a la sustancia antigénica.
La solicitud de patente europea nº 0.229.943
(Heller et al., III) describe sondas de desplazamiento
Stokes fluorescentes para ensayos de hibridación de
polinucleótidos.
La patente estadounidense nº 4.226.993 (Buckler
et al.) describe ftalohidrazidas
inmuno-funcionalizadas, las cuales se usan como
intermediarias en la síntesis de conjugados quimioluminiscentes
marcados con ftalohidrazida. Los conjugados son útiles como
reactivos en ensayos de unión específica para determinar ligandos, o
sus parejas de unión específica, en medio líquido.
Las patentes estadounidenses nº 4.380.580 y
4.383.031 (Bogulaski et al., I; y Bogulaski et al.,
II) describen respectivamente ensayos de unión específica
quimioluminiscentes heterogéneos y homogéneos.
La patente estadounidense nº 4.220.450 (Maggio
I) discute inmunoensayos fluorescentes químicamente inducidos.
La patente estadounidense nº 4.652.533 (Jolley)
describe un procedimiento de inmunoensayo sobre fase sólida que
incorpora una marca luminiscente.
La patente estadounidense nº 4.277.437 (Maggio
II) descubre equipos para llevar a cabo inmunoensayos fluorescentes
químicamente inducidos.
Heller et al. (IV) describen sondas
quimioluminiscentes y fluorescentes para sistema de hibridación de
ADN en "Rapid Detection and Identification of Infectious
Agents" (1985), Academic Press, Inc., páginas
245-257.
Hara et al., describen un inmunoensayo
usando un compuesto metal-complejo como catalizador
quimioluminiscente en el Bull. Chem. Soc. Jpn. (1984)
57:3009-3010.
Kuschnir et al., describen la
quimioluminiscencia fotosensible del luminol en
6-aminoftaloazina-1,4-(2H3H)-diona
en Chemical Communications (1969) 193.
La detección de la hibridación de ácido nucleico
mediante transferencia de energía de residencia de fluorescencia no
radiante es descrita por Cardullo et al., en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1988) 85:8790-8794.
Morrison et al. describen una detección
en fase soluble de polinucleótidos usando marcas fluorescentes
interactivas e hibridación competitiva en Analytical
Biochemistry (1989) 183:231-244.
Zomer et al., describen marcas
quimioluminógenas en Analytica Chemica Acta (1989)
227:11-19.
Morrison II discute la detección resuelta en el
tiempo de la transferencia de energía: teoría y aplicación a
inmunoensayos en Analytical Biochemistry (1988)
174:101-120.
La patente estadounidense nº 4.299.916 (Litman
et al., I) describe la producción preferente de señal sobre
una superficie en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.233.402 (Maggio
et al.) describe reactivos y procedimientos que emplean la
canalización.
La patente estadounidense nº 4.261.968 (Ullman
et al., I) describe la atenuación de la fluorescencia con
pares inmunológicos en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.318.707 (Litman
et al., II) discute un partícula macromolecular atenuadora
de la fluorescencia en ensayos de receptor específicos.
La patente estadounidense nº 4.650.770 (Liu
et al.,) discute la atenuación, mediante partículas
absorbentes de energía, en ensayos de unión a proteína competitivos
que emiten luz.
La patente estadounidense nº 4.654.300 (Zuk
et al.) describe un ensayo de atenuación con microcuentas
fluorescentes.
La patente estadounidense nº 4.174.384 (Ullman
et al., I) describe la atenuación de la fluorescencia con
pares inmunológicos en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.193.983 (Ullman
et al., II) descubre composiciones de partículas liposómicas
marcadas, e inmunoensayos con las mismas.
Las patentes estadounidenses nº 4.199.559 y
3.996.345 (Ullman et al., IV y V) describe la atenuación de
la fluorescencia con pares inmunológicos en inmunoensayos.
O'Connell et al., Clin. Chem. (1985)
31(9): 1424-1426 descubre un inmunoensayo
colorimétrico para digoxina utilizando grandes vesículas
fosfolipídicas unilamelares que tienen colorante atrapado en la fase
acuosa del liposoma.
Las patentes nº 3.850.578 (McConnell); 4.483.921
(Yaverbaum); y 4.483.929 (Szoka) descubren reactivos liposomales
inmunoreactivos en los que el antígeno o anticuerpo se une a la
superficie de las vesículas lipídicas.
Las patentes estadounidenses nº 4.529.561 (Hunt
et al.); 4.552.803 (Lenk et al.); y 4.485.054 (Mezei
et al.) descubren una variedad de procedimientos para
preparar vesículas lipídicas.
La patente estadounidense nº 4.311.712 (Evans
et al.) descubre un proceso para preparar un mezcla
liofilizada de liposomas.
La patente estadounidense nº 4.588.578 (Fountain
et al.) descubre un procedimiento para la preparación de
vesículas lipídicas monofásicas, y el uso de dichas vesículas para
sistemas de suministro de drogas.
La patente estadounidense nº 4.576.912 descubre
un procedimiento para potenciar el nivel fluorescente de un
inmunoensayo usando ciertos portadores de cadena larga marcados con
una diversidad de fluoróforos.
La patente estadounidense nº 4.891.324 describe
una partícula con emisores de luz para ensayos.
La destrucción selectiva de linfocitos T
mediante liposomas fototóxicos está descrita por Yemu et al.,
(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
246-250.
Mew et al., en J. of Immunology
130(3): 1473-1477 (1983) descubre la
fotoinmunoterapia: el tratamiento de tumores animales con
conjugados de anticuerpos monoclonales específicos contra el tumor y
hematoporfirina.
La observación mediante microscopía óptica de
moléculas pequeñas solas es discutida por Hirschfeld (1976)
Applied Optics 15(2): 3135-3139.
\newpage
La solicitud de patente europea nº 0.322.926
(McCapra et al.) describe ensayos que utilizan ésteres,
tioésteres y amidas quimioluminiscentes mejorados.
La solicitud de patente europea nº 0.352.713
(Schaap) describe un procedimiento y composiciones que proporcionan
una quimioluminiscencia mejorada a partir de
1,2-dioxetanos.
La patente estadounidense nº 4.978.614
(Bronstein) descubre un procedimiento para detectar una sustancia
usando la descomposición enzimáticamente inducida de dioxetanos.
Bronstein et al. (patente estadounidense
nº 4.956.477) discuten la síntesis de
1,2-dioxetanos.
Schaap et al. describen en WO 90/07511 la
luminiscencia mejorada a partir de 1,2-dioxetanos a
través de la transferencia de energía hacia emisores de
fluorescencia trabados.
La patente estadounidense nº 4.959.182 (Schaap)
descubre un procedimiento y composiciones que proporcionan una
quimioluminiscencia potenciada a partir de
1,2-dioxetanos.
Las patentes estadounidenses nº 4.962.192
(Schaap) y 4.857.652 (Schaap) describen compuestos
quimioluminiscentes de 1,2-dioxetano.
Bronstein et al. describen un
procedimiento usando 1,2-dioxetanos
quimioluminiscentes en la patente estadounidense nº 4.931.223.
La purificación de dioxetanos solubles en agua y
estables se descubre en WO 90/02742 (Edwards et al.).
En WO 90/02742 (Edwards et al.) se
descubren anillos policíclicos fundidos quimioluminiscentes
novedosos que contienen 1,2-dioxetanos, y ensayos
en los que se usan.
WO 89/06226 (Edwards et al.) discute la
síntesis de 1,2-dioxetanos e intermedios de los
mismos.
Neckers et al. describen catalizadores
fotosensibilizadores unidos a polímeros en la patente estadounidense
nº 4.315.998.
En WO 88/00695 (Bronstein et al.) se
discute un procedimiento para detectar una sustancia usando
descomposiciones de dioxetanos inducidas enzimáticamente.
La solicitud de patente europea nº 0.324.202
(Zomer et al.) descubre compuestos de acridina como
marcadores quimioluminógenos.
La solicitud de patente europea nº 0.144.914
(Alberella et al.) describe un ensayo de hibridación que
emplea pares marcados de reactivos unidores híbridos.
La solicitud de patente europea nº 0.401.001
(Urdea et al.) describe 1,2-dioxetanos
quimioluminiscentes doblemente disparados.
La presente invención se dirige a una
composición útil en la determinación de un analito, según la
reivindicación 1.
A continuación se describirán procedimientos en
los cuales puede usarse la composición de la invención. Uno de
tales procedimientos para determinar un analito, es aquél en el que
el procedimiento comprende tratar un medio, sospechoso de contener
un analito, para formar una especie intrínsecamente metaestable,
siendo la especie capaz de difundir en el medio y de reaccionar
selectivamente con una sustancia en el medio, la cual es capaz de
reaccionar con las especies metaestables que han sido llevadas a una
estrecha proximidad con la especie gracias a la presencia del
analito. El procedimiento comprende además determinar si la especie
ha reaccionado con la sustancia, indicando la reacción, por tanto,
la cantidad de analito en el medio.
Otro procedimiento es un ensayo de un analito en
un medio líquido. El ensayo comprende los pasos de tratar un medio,
que se sospecha contiene el analito, para formar un complejo que es
par de unión específica (sbp) en relación con la presencia del
analito, y determinar si se ha formado el complejo. El procedimiento
comprende combinar con el medio (1) una composición de la invención
que tiene un fotosensibilizador asociado con un miembro de un par
de unión específica, y (2) un compuesto quimioluminiscente asociado
con un miembro sbp, en donde la cantidad de luz emitida por el
compuesto quimioluminiscente, a partir de la activación del
fotosensibilizador, está relacionada con la cantidad de analito en
el medio.
Otro procedimiento comprende tratar un medio,
sospechoso de contener un analito, en condiciones tales que el
analito, si está presente, causa que el fotosensibilizador y el
compuesto quimiluminiscente pasen a estar en estrecha proximidad.
Como consecuencia, el oxígeno singlete producido por el
fotosensibilizador puede activar el compuesto quimioluminiscente,
el cual subsiguientemente produce luz o luminiscencia. La cantidad
de luz producida está relacionada con la cantidad de analito en el
medio.
Otro procedimiento de la presente invención para
determinar un analito comprende como primer paso proporcionar una
combinación que comprende un medio sospechoso de contener un
analito, y una composición de la invención en la cual el
fotosensibilizador está asociado con un miembro de un par de unión
específica (sbp), y una partícula que puede suspenderse que
comprende un compuesto quimioluminiscente. La partícula que puede
suspenderse tiene un miembro de un par de unión específica (sbp)
unido a ella. La combinación se trata para excitar el
fotosensibilizador, el cual es capaz, en su estado excitado, de
activar el oxígeno a un estado de singlete. A continuación se
examina la cantidad de luminiscencia emitida por la combinación. La
cantidad de dicha luminiscencia está relacionada con la cantidad de
analito en el medio. Alternativamente, el compuesto
quimioluminiscente está asociado con un miembro de un sbp, y
la
partícula que puede suspenderse comprende un fotosensibilizador, y también tiene un miembro de un sbp unido a él.
partícula que puede suspenderse comprende un fotosensibilizador, y también tiene un miembro de un sbp unido a él.
Otro procedimiento es para determinar un
analito, en donde se proporciona una combinación. La combinación
comprende un medio sospechoso de contener un analito, y una
composición de la invención que tiene un fotosensibilizador
asociado a un primer miembro de un sbp, y un compuesto
quimioluminiscente asociado a un segundo miembro del sbp. A
continuación, se excita el fotosensibilizador, y éste es capaz de
activar el oxígeno a un estado singlete, oxígeno singlete que
activa el compuesto quimioluminiscente cuando está en estrecha
proximidad con el fotosensibilizador. La luminiscencia emitida a
partir de la combinación está relacionada con la cantidad de
analito.
Otro procedimiento para determinar un analito
comprende combinar en un medio acuoso una muestra sospechosa de
contener un analito, una primera partícula que puede suspenderse, la
cual tiene el compuesto quimioluminiscente incorporado en ella y un
miembro de un sbp unido a ella, y una segunda partícula que puede
suspenderse que tiene incorporado en ella un fotosensibilizador
capaz de activar el oxígeno a su estado de singlete, en donde la
segunda partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella. A
continuación, se irradia el medio para producir el estado singlete
del oxígeno y se mide la cantidad de luminiscencia emitida a partir
del medio. La cantidad de dicha luminiscencia está relacionada con
la cantidad de analito en el medio.
Otra realización de la presente invención
implica composiciones que comprenden una partícula que puede
suspenderse que tiene incorporado sobre ella un compuesto
quimioluminiscente, en donde la partícula tiene un miembro de un
sbp unido a ella. La composición puede comprender además una
partícula que puede suspenderse que tiene un fotosensibilizador
incorporado a ella.
Los equipos que comprenden una composición de la
invención pueden contener, en una combinación empaquetada, una
composición que incluye (1) una primera partícula que puede
suspenderse que tiene un compuesto quimioluminiscente, en donde la
partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella, y (2) una segunda
partícula que puede suspenderse que comprende un
fotosensibilizador, en donde la partícula tiene un miembro de un sbp
unido a ella.
Las realizaciones de la invención se describen
más abajo a modo de ejemplo solamente, y con referencia a los
esquemas que acompañan, de los cuales:
La Figura 1 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para Vitamina B_{12}.
La Figura 2 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para digoxina.
La Figura 3 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para HCG.
La Figura 4 es una representación gráfica de los
resultados de una prueba.
La Figura 5 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para TSH.
La Figura 6 es una parte de la representación
gráfica de la Figura 5.
La Figura 7 es una representación gráfica de los
resultados de otro ensayo para HCG según la presente invención.
La Figura 8 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo de detección de ADN híbrido.
La Figura 9 es una representación gráfica de los
resultados de detección de una diana sintética.
La Figura 10 es una representación gráfica de un
ensayo de triodotironina total.
A continuación se describirán los procedimientos
a los cuales puede aplicarse la composición de la invención.
Un procedimiento para determinar un analito
comprende tratar un medio sospechoso de contener un analito para
formar una especie intrínsecamente metaestable. La especie es capaz
de difundir en el medio y de reaccionar selectivamente con una
sustancia en el medio capaz de reaccionar con la especie
metaestable, que ha sido llevada a una estrecha proximidad con las
especies gracias a la presencia del analito. El procedimiento
comprende además determinar si las especies han reaccionado con la
sustancia, indicando la reacción de la misma la cantidad de analito
en el medio.
De forma general, la especie metaestable es un
estado excitado. La especie metaestable tiene una vida media de
menos de un milisegundo, usualmente menos de 100 microsegundos, más
habitualmente menos de 10 microsegundos. La especie metaestable se
difunde en el medio, es decir, se produce en un sitio y migra hacia
otro sitio desde el sitio de formación, en donde puede transferir
energía o reaccionar con una molécula en ese sitio.
La especie metaestable puede ser cualquier
intermediario reactivo tal como un ion radical, nitreno, carbeno,
procedente del grupo trans-ciclohexeno,
\alpha-lactona, trimetilmetano, y similares. Son
de interés particular los estados de singlete excitados tales como
el oxígeno singlete, los estados tripletes, y los dioxetanos,
incluyendo las dioxetanonas y las dioxetanodionas. Los estados
triplete se forman generalmente combinando un sensibilizador
apropiado, tal como el pireno, con un aceptor de energía, tal como
un antraceno. Por ejemplo, dibromoantraceno puede actuar como un
aceptor de energía que asume un estado triplete. El estado triplete
puede proceder a transferir su energía a otra molécula e iniciar un
reacción fotoquímicamente detectable, tal como la producción de
luz. Los dioxetanos, tales como las dioxetanodionas, se forman a
partir de la reacción de moléculas activas con oxígeno singlete o
peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, los oxalatos apropiados y el
peróxido de hidrógeno forman dioxetanodionas. Enzimas tales como la
peroxidasa de rábano silvestre pueden generar cationes radicales o
un oxigeno singlete que, probablemente, son metaestables y pueden
reaccionar con otra molécula para ocasionar una señal
detectable.
La presencia de un complejo de par de unión
específica puede determinarse causando que un miembro del complejo
produzca una especie metaestable, a partir de la cual esta puede
interaccionar selectivamente con otro miembro del complejo, sin
interaccionar con ese miembro cuando no está dentro del
complejo.
En un procedimiento, una composición que
comprende un fotosensibilizador y un ligando, receptor o
polinucleótido, se une en un ensayo a una composición que comprende
un compuesto quimioluminiscente y un ligando, receptor o
polinucleótido. El compuesto quimioluminiscente puede reaccionar con
oxígeno singlete, y el producto formado se descompone con emisión
de luz. El oxígeno singlete es generado por el fotosensibilizador,
habitualmente mediante irradiación del fotosensibilizador. El
oxígeno singlete producido por el fotosensibilizador que no está
unido a la composición que comprende un compuesto quimioluminiscente
es incapaz de alcanzar el compuesto quimioluminiscente antes de
sufrir la atenuación (la t_{1/2} es de aproximadamente dos
microsegundos en agua). La composición que comprende un
fotosensibilizador que pasa a estar unida a la composición que
comprende el compuesto quimioluminiscente produce oxígeno singlete
que reacciona con el compuesto quimioluminiscente, porque dicho
oxígeno singlete puede sobrevivir la corta distancia, conseguida
ahora, entre el fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente. La cortedad de la distancia resulta de la
presencia de un analito en la muestra. Preferiblemente, una parte
de la distancia recorrida por el oxígeno singlete es a través de un
medio orgánico, en donde el oxígeno singlete tiene una vida media
mucho mayor, es decir, superior a aproximadamente cien
microsegundos. El analito debe modular la unión entre la composición
que comprende el fotosensibilizador y la composición que comprende
el compuesto quimioluminiscente. Habitualmente, a menos uno de los
compuestos quimioluminiscentes y el fotosensibilizador están
asociados con una superficie, en particular, allí donde la
superficie comprende partículas que pueden suspenderse.
La estrategia anterior, que implica la
excitación de un compuesto quimioluminiscente mediante oxígeno
singlete en estrecha proximidad con un fotosensibilizador, se debe
distinguir de la de McCapra, ver más arriba. En la página 4, líneas
38-46, de McCapra se describe un ensayo realizado en
un formato de atenuación. El ensayo de McCapra utiliza un reactivo
que es capaz de unirse específicamente a un complejo del analito y
un material de unión específica, al cual se conjuga el
sensibilizador para formar un complejo sensibilizador
conjugado-reactivo. La parte atenuante está unida
al reactivo. Cuando se pone en estrecha proximidad con el
sensibilizador, la porción atenuante reduce o atenúa la señal
producida a resultas de la excitación del sensibilizador unido, o
reduce o atenúa la transferencia de electrones o energía para el
sensibilizador excitado hasta una especie intermedia (es decir,
oxígeno molecular o un leuco-colorante). En este
formato atenuador, la presencia de un analito está relacionada con
la luminiscencia de los dioxetanos que decaen. A continuación,
McCapra se refiere a las patentes estadounidenses nº 4.220.450 y
4.277.437, la cuales se describen más arriba.
Este formato de ensayo de atenuación de McCapra
implica solamente la atenuación del sensibilizador excitado y no
abarca la activación del oxígeno singlete de un compuesto
quimioluminiscente asociado con un miembro de unión específica.
Más aún, en la página 14, líneas
35-36, McCapra describe la transferencia de energía
desde una porción quimioluminiscente para excitar un sensibilizador
en un ensayo de sonda polinucleotídica. Esta descripción de McCapra
es totalmente distinta de la presente invención, la cual implica
poner juntos en estrecha proximidad, gracias a un analito que está
presente, un fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente,
donde el fotosensibilizador excitado produce oxígeno singlete, el
cual, a su vez, activa el compuesto quimioluminiscente.
En otro aspecto, un grupo que puede ser activado
fotoquímicamente hasta un producto luminiscente se usa como una
marca. El grupo está asociado con un miembro de un par de unión
específica, y este reactivo se usa como un reactivo marcado en
ensayos para la detección de un analito. La activación fotoquímica
puede conseguirse irradiando el grupo con luz o mediante reacción
singlete con el grupo. Preferiblemente, se usa un sensibilizador
para ayudar a la fotoactivación cuando la activación es mediante
oxígeno singlete. Usualmente, el sensibilizador absorbe luz, y el
sensibilizador excitado formado de este modo activa el oxígeno, y el
oxígeno singlete reacciona con la marca para rendir un
intermediario metaestable luminiscente. El grupo usado como una
marca puede incluir cualquier compuesto quimioluminiscente que
experimenta fotoactivación con o sin sensibilización, y
preferiblemente es un grupo que es activado por la reacción con
oxígeno singlete. Las marcas pueden usarse tanto en protocolos de
ensayos homogéneos como heterogéneos para determinar un analito. De
forma deseable, no se requiere la adición de reactivos químicos
para activar el compuesto quimioluminiscente con o sin el
sensibilizador y el aceptor de energía. En un protocolo homogéneo
todos los reactivos se combinan y se irradia el medio para activar
el compuesto quimioluminiscente.
En el protocolo de ensayo, los componentes se
proporcionan en combinación, y la luz producida, en función de la
activación del oxígeno por el sensibilizador, estará en función de
la concentración del analito. De forma ventajosa, los
procedimientos pueden realizarse sin calentar el medio para producir
luz. En consecuencia, el ensayo puede realizarse a una temperatura
constante.
Antes de proceder con una descripción de las
realizaciones específicas de la presente invención, se definirán y
describirán con detalle un cierto número de términos.
Analito: el compuesto o composición a detectar.
El analito puede constar de un miembro de par de unión específica
(sbp), y puede ser un ligando, el cual es monovalente
(monoepitópico) o polivalente (poliepitópico), habitualmente
antigénico o hapténico, y es un único compuesto o una pluralidad de
compuestos que comparten, al menos, un sitio epitópico o
determinante común. El analito puede ser parte de una célula, tal
como una bacteria; o una célula portadora de un grupo de antígeno
sanguíneo, tal como A, B, D, etc., o un antígeno HLA; o un
microorganismo, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoos, o
virus.
Los analitos ligandos polivalentes normalmente
serán poli(aminoácidos), es decir, polipéptidos y proteínas,
polisacáridos, ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos.
Dichas combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus,
cromosomas, genes, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, y
similares.
En la mayor parte de los casos, los analitos
ligando poliepitópicos, a los que puede aplicarse la presente
invención, tendrán un peso molecular de al menos aproximadamente
5.000, más habitualmente de al menos aproximadamente 10.000. En la
categoría poli(aminoácidos), los poli(aminoácidos) de
interés tendrán generalmente un peso molecular de, desde
aproximadamente 5.000 hasta 5.000.000, más habitualmente un peso
molecular de desde aproximadamente 20.000 hasta 1.000.000; entre
las hormonas de interés, los pesos moleculares oscilarán
habitualmente desde aproximadamente 5.000 hasta 60.000 de peso
molecular.
Una amplia variedad de proteínas pueden
considerarse como la familia de proteínas que tienen características
estructurales similares; proteínas que tienen determinadas
funciones biológicas, proteínas relacionadas con microorganismos
específicos, particularmente microorganismos causantes de
enfermedades, etc. Dichas proteínas incluyen, por ejemplo, las
inmunoglobulinas, las citoquinas, los enzimas, las hormonas, los
antígenos cancerígenos, los marcadores nutricionales, los antígenos
específicos de tejido, etc.
Las siguientes son clases de proteínas
relacionadas por su estructura:
- protaminas
- histonas
- albúminas
- globulinas
- escleroproteínas
- fosfoproteínas
- mucoproteínas
- cromoproteínas
- lipoproteínas
- nucleoproteínas
- glicoproteínas
- receptores de células T
- proteoglicanos
- HLA
- proteínas no clasificadas, por ejemplo, somatotropina, prolactina, insulina, pepsina.
Un cierto número de proteínas que se encuentran
en el plasma humano son clínicamente importantes, e incluyen:
- Prealbúmina
- Albúmina
- \alpha_{1}-Lipoproteína
- \alpha_{1}-Antitripsina
- \alpha_{1}-Glicoproteína
- Transcortina
- 4,6S-Postalbúmina
- \alpha_{1}-glicoproteína pobre en triptófano
- \alpha_{1}X-Glicoproteína
- Globulina unidora de tiroxina
- Inhibidor de la inter-\alpha-tripsina
- Gc-globulina
- (Gc 1-1)
- (Gc 2-1)
- (Gc 2-2)
- Haptoglobina
- (Hp 1-1)
- (Hp 2-1)
- (Hp 2-2)
- Ceruloplasmina
- Colinesterasa
- \alpha_{2}-Lipoproteína(s)
- Mioglobina
- Proteína C-reactiva
- \alpha_{2}-Macroglobulina
- \alpha_{2}-HS-Glicoproteína
- Zn-\alpha_{2}-Glicoproteína
- \alpha_{2}-Neuramino-Glicoproteína
- Eritropoietina
- \beta-Lipoproteína
- Transferrina
- Hemopexina
- Fibrinógeno
- Plasminógeno
- \beta_{2}-Glicoproteína I
- \beta_{2}-Glicoproteína II
- Inmunoglobulina G (IgG) o \gammaG-Globulina
\vskip1.000000\baselineskip
- Fórmula molecular:
- \gamma_{2}\kappa_{2}
\hskip0.5cm
o\hskip0.5cm
\gamma_{2}\lambda_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
- Inmunoglobulina A (IgA) o \gammaA-Globulina
\vskip1.000000\baselineskip
- Fórmula molecular:
- (\alpha_{2}\kappa_{2})^{n}
\hskip0.5cm
o\hskip0.5cm
(\alpha_{2}\kappa_{2})^{n}
\vskip1.000000\baselineskip
- Inmunoglobulina M (IgM) o \gammaM-Globulina
\vskip1.000000\baselineskip
- Fórmula molecular:
- (\mu_{2}\kappa_{2})^{5}
\hskip0.5cm
o\hskip0.5cm
(\mu_{2}\lambda_{2})^{5}
\vskip1.000000\baselineskip
- Inmunoglobulina D (IgD) o \gammaD-Globulina (\gammaD)
\vskip1.000000\baselineskip
- Fórmula molecular:
- (\delta_{2}\kappa_{2})
\hskip0.5cm
o\hskip0.5cm
(\delta_{2}\lambda_{2})
\vskip1.000000\baselineskip
- Inmunoglobulina E (IgE) o \gammaE-Globulina (\gammaE)
\vskip1.000000\baselineskip
- Fórmula molecular:
- (\varepsilon_{2}\kappa_{2})
\hskip0.5cm
o\hskip0.5cm
(\varepsilon_{2}\lambda_{2})
\vskip1.000000\baselineskip
- Cadenas ligeras \kappa y \lambda sueltas
- Factores de complemento:
- C'1
- C'1q
- C'1r
- C'1s
- C'2
- C'3
- \beta_{1}A
- \alpha_{2}D
\newpage
- C'4
- C'5
- C'6
- C'7
- C'8
- C'9
\vskip1.000000\baselineskip
Los factores de coagulación sanguínea
importantes incluyen:
\vskip1.000000\baselineskip
Las hormonas proteicas importantes incluyen:
Hormonas peptídicas y proteicas
- Hormona paratiroidea (paratromona)
- Tirocalcitonina
- Insulina
- Glucagón
- Relaxina
- Eritropoietina
- Melanotropina
- (hormona estimuladora de los melanocitos: intermedina)
- Somatotropina
- (hormona del crecimiento)
- Corticotropina
- (hormona adrenocorticotrópica)
- Tirotropina
- Hormona estimuladora del folículo
- Hormona luteinizante
- (hormona estimuladora de las células intersticiales)
- Hormona luteomamotrópica
- (luteotropina, prolactina)
- Gonadotropina
- (gonadotropina coriónica)
\vskip1.000000\baselineskip
Hormonas tisulares
- Secretina
- Gastrina
- Angiotensinas I y II
- Bradiquinina
- Lactógeno placentario humano
\vskip1.000000\baselineskip
Citoquinas
- IL I
- IL II
- IL VI
- EGF
- TNF
- NGF
\vskip1.000000\baselineskip
Antígenos del cáncer
- PSA
- CEA
- a-Fetoproteína
- Fosfatasa ácida
- CA19.9
- CA125
\vskip1.000000\baselineskip
Antígenos específicos de tejidos
- Fosfatasa alcalina
- Mioglobina
- CPK-MB
- Calcitonina
- Proteína básica de la mielina
\vskip1.000000\baselineskip
Hormonas peptídicas de la
neurohipófisis
- Oxitocina
- Vasopresina
- Factores liberadores (RF)
- CRF, LRF, TRF, RF de la somatotropina, GRF, RF de la FSH, PIF, MIF
\vskip1.000000\baselineskip
Otros materiales poliméricos de interés son los
mucopolisacáridos y los polisacáridos.
Los microorganismos ilustrativos incluyen:
Los analitos ligandos monoepitópicos
generalmente tendrán un peso molecular desde aproximadamente 100
hasta 2000, más habitualmente un peso molecular desde 125 hasta
1000. Los analitos incluyen drogas, metabolitos, pesticidas,
contaminantes, y similares. Los alcaloides están incluidos entre las
drogas de interés. Entre los alcaloides están los alcaloides de la
morfina, que incluyen la morfina, codeína, heroína, detropetorfano,
sus derivados y metabolitos; los alcaloides de la cocaína, que
incluyen la cocaína y la bencilecgonina, sus derivados y
metabolitos; los alcaloides del cornezuelo, que incluyen la
dietilamida del ácido lisérgico; los alcaloides de esteroides; los
alcaloides de iminazoilo; los alcaloides de quinazolina; los
alcaloides de isoquinolina; los alcaloides de quinolina, que
incluyen la quinina y quinidina; alcaloides de diterpenos, sus
derivados y metabolitos.
El siguiente grupo de drogas incluyen los
esteroides, que incluyen los estrógenos, andrógenos, esteroides
androcorticales; los ácidos biliares; los glicósidos cardiotónicos;
y las agliconas, que incluyen la digoxina y digoxigenina, saponinas
y sapogeninas, sus derivados y metabolitos. También se incluyen las
sustancias imitadoras de esteroides, tales como el
dietilestilbestrol.
El siguiente grupo de drogas son las lactamas
que tienen desde 5 hasta 6 miembros anillados, las cuales incluyen
los barbitúricos, por ejemplo, el fenobarbital y secobarbital, la
difenilhidantonina, la primidona, la etosuximida, y sus
metabolitos.
El siguiente grupo de drogas son los
aminoalquilbencenos, con alquilos de desde 2 hasta 3 átomos de
carbono, que incluyen las anfetaminas; las catecolaminas, que
incluyen la efedrina, la L-dopamina, la epinefrina;
la narceína; la papaverina; y los metabolitos de los anteriores.
El siguiente grupo de drogas son los
benzoheterociclos, que incluyen el oxazepam, la cloroprozamina, el
tegretol, sus derivados y metabolitos, siendo los anillos
heterociclos azepinas, diazepinas y fenotiazinas.
El siguiente grupo de drogas son las purinas,
que incluyen la teofilina, la cafeína, sus metabolitos y
derivados.
El siguiente grupo de drogas incluye aquellas
derivadas de la mariguana, lo que incluye el canabinol y el
tetrahidrocanabinol.
El siguiente grupo de drogas son las hormonas
tales como la tiroxina, el cortisol, la triiodotironina, la
testosterona, el estradiol, la estrona, la progesterona,
polipéptidos tales como la angiotensina, la LHRH, e
inmunosupresores tales como la ciclosporina, FK506, ácido
micofenólico, y demás.
El siguiente grupo de drogas incluye las
vitaminas, tales como la A, B, por ejemplo, B_{12}, C, D, E y K,
ácido fólico, tiamina.
El siguiente grupo de drogas son las
prostaglandinas, las cuales difieren por el grado y sitios de
hidroxilación e insaturación.
El siguiente grupo de drogas son los
antidepresivos tricíclicos, que incluyen las imipramina, la
dismetilimipramina, la amitriptilina, la nortriptilina, la
protriptilina, la trimipramina, la clomipramina, la doxepina, y la
desmetildoxemina.
El siguiente grupo de drogas son los
anti-neoplásicos, que incluyen el metotrexato.
El siguiente grupo de drogas son los
antibióticos, los cuales incluyen la penicilina, cloromicetina,
actinomicetina, tetraciclina, terramicina, los metabolitos y
derivados.
El siguiente grupo de drogas son los nucleótidos
y nucleósidos, los cuales incluyen el ATP, NAD, FMN, adenosina,
guanosina, timidina, y citidina, con sus sustituyentes azúcar y
fosfato apropiados.
El siguiente grupo de drogas son diversas drogas
individuales que incluyen la metadona, meprobamato, serotonina,
meperidina, lidocaína, procainamida, acetilprocainamida,
propranolol, griseofilvina, ácido valproico, butirofenonas,
antihistaminas, cloramfenicol, drogas anticolinérgicas, tales como
la atropina, sus metabolitos y derivados.
Los metabolitos relacionados con estados
morbosos incluyen la espermina, la galactosa, el ácido
fenilpirúvico, y la porfirina de Tipo 1.
El siguiente grupo de drogas son los
aminoglicósidos, tales como la gentamicina, kanamicina, tobramicina,
y amikacina.
Entre los pesticidas de interés están los
bifenilos polihalogenados, ésteres de fosfato, tiofosfatos,
carbamatos, sulfenamidas polihalogenados, sus metabolitos y
derivados.
Para analitos receptores, los pesos moleculares
oscilarán generalmente desde 10.000 hasta 2\times10^{8}, más
habitualmente desde 10.000 hasta 10^{6}. Para las
inmunoglobulinas, IgA, IgG, IgE e IgM, los pesos moleculares
variarán generalmente desde aproximadamente 160.000 hasta
aproximadamente 10^{6}. Los enzimas normalmente oscilarán desde
aproximadamente 10.000 hasta 1.000.000 de peso molecular. Los
receptores naturales varían ampliamente, teniendo generalmente un
peso molecular de aproximadamente 25.000 y, pudiendo tener un peso
molecular de 10^{6} o superior, incluyendo tales materiales como
la avidina, ADN, ARN, globulina unidora de tiroxina, la prealbúmina
unidora de tiroxina, la transcortina, etc.
El término analito incluye además analitos
polinucleotídicos tales como aquellos polinucleótidos definidos más
adelante. Estos incluyen el m-ARN, el
r-ARN, el t-ARN, el ADN, los
dúplexes DNA-ARX, etc. El término analito también
incluye receptores que son agentes unidores de polinucleótidos,
tales como, por ejemplo, enzimas de restricción, activadores,
represores, nucleasas, polimerasas, histonas, enzimas reparadores,
agentes quimioterapéuticos, y similares.
El analito puede ser un molécula que se
encuentra directamente en una muestra tal como un fluido biológico
procedente de un huésped. La muestra puede examinarse directamente,
o puede pre-tratarse para producir un analito más
fácilmente detectable. Más aún, el analito de interés puede
determinarse detectando un agente probador del analito de interés,
tal como un miembro de un par de unión específica complementario del
analito de interés, cuya presencia será detectada solamente cuando
el analito de interés esté presente en la muestra. Por tanto, el
agente probador del analito pasa a ser el analito que se detecta en
el ensayo. El fluido corporal puede ser, por ejemplo, orina,
sangre, plasma, suero, saliva, semen, stool, esputos, fluido
cerebroespinal, lágrimas, mocos, y similares.
Miembro de un par de unión específica
("miembro de un sbp"): una de dos moléculas diferentes, que
tienen un área sobre la superficie o en una cavidad que se une
específicamente a, y se define, por tanto, como complementaria a
una determinada organización espacial o polar sobre la otra
molécula. Los miembros del par de unión específica se denominan
como ligando y receptor (antiligando). Normalmente serán miembros de
un par inmunológico tal como antígeno-anticuerpo,
aunque otros pares de unión específica, tales como la
biotina-avidina, las
hormonas-receptores de hormonas, dúplexes de ácidos
nucleicos, IgG-proteína A, pares polinucleotídicos
tales como ADN-ADN, ADN-ARN, y
similares, no son pares inmunológicos pero se incluyen en la
invención y en la definición de miembro de un sbp.
Polinucleótido: un compuesto o composición que
es un nucleótido polimérico que tiene en el estado natural
aproximadamente de 50 a 500.000 ó más nucleótidos, y que tiene en el
estado aislado aproximadamente de 15 a 50.000 ó más nucleótidos,
habitualmente aproximadamente de 15 a 20.000 nucleótidos, más
frecuentemente de 15 a 10.000 nucleótidos. El polinucleótido
incluye ácidos nucleicos procedentes de cualquier fuente en forma
purificada o no purificada, que ocurren naturalmente o son
producidos sintéticamente, incluyendo el ADN (dsADN y ssADN) y ARN,
habitualmente ADN, o puede ser t-ARN,
m-ARN, r-ARN, ADN y ARN
mitocondrial, ADN y ARN de cloroplastos, híbridos
ADN-ARN, o mezclas de los mismos, genes, cromosomas,
plásmidos, los genomas de materiales biológicos tales como
microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, virus, viroides,
mohos, hongos, plantas, animales, humanos, y fragmentos de los
mismos o similares.
Ligando: cualquier compuesto orgánico para el
que existe de forma natural, o puede prepararse, un receptor.
Análogo de ligando: un ligando modificado, un
radical orgánico o análogo de analito, habitualmente de un peso
molecular superior a 100, el cual puede competir con el ligando
análogo por un receptor, proporcionando la modificación medios para
unir un análogo de ligando a otra molécula. El análogo de ligando
diferirá usualmente del ligando en más que el remplazo de un
hidrógeno con un enlace que une el análogo del ligando a un eje o
marca, pero no es imprescindible. El análogo del ligando puede
unirse al receptor de forma similar al ligando. El análogo puede
ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un
anticuerpo del ligando.
Receptor ("antiligando"): cualquier
compuesto o composición capaz de reconocer una determinada
organización espacial y polar de una molécula, por ejemplo, sitio
epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen
receptores que existen de forma natural, por ejemplo, globulina
unidora de tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab,
lectinas, ácidos nucleicos, proteína A, componente de complemento
C1q, y similares.
Unión específica: el reconocimiento específico
de una de dos moléculas diferentes por parte de la otra en
comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras
moléculas. Generalmente, las moléculas tienen áreas sobre sus
superficies o en cavidades que originan el reconocimiento específico
entre las dos moléculas. Son ejemplo de unión específica las
interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones
enzima-sustrato, interacciones polinucleotídicas, y
demás.
Unión no específica: unión no covalente entre
moléculas que es relativamente independiente de estructuras
específicas sobre la superficie. La unión no específica puede ser el
resultado de varios factores, incluyendo interacciones hidrofóbicas
entre moléculas.
Anticuerpo: una inmunoglobulina que se une
específicamente a, y se define, por tanto, como complementaria de
un determinada organización especial y polar de otra molécula. El
anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse
mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica: tales como
la inmunización de un huésped y la extracción del suero
(policlonal); o preparando líneas celulares híbridas continuas y
recogiendo la proteína secretada (monoclonal); o mediante clonación
y expresión de secuencias nucleotídicas, o versiones mutadas de las
mismas, que codifican al menos las secuencias de aminoácidos
requeridas para la unión específica de los anticuerpos naturales.
Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un
fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las varias
clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e
IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de las mismas incluyen Fab, Fv y
F(ab')_{2}, Fab', y similares. Además, los agregados,
polímeros y conjugados de las inmunoglobulinas o sus fragmentos
pueden usarse donde sea apropiado, con tal que se mantenga la
afinidad de unión por una molécula determinada.
Alquilo: un radical monovalente de ramificada o
no ramificado derivado de un hidrocarburo alifático mediante la
supresión de un átomo de H; incluye tanto alquilos inferiores como
alquilos superiores.
Alquilo inferior: un alquilo que contiene de 1 a
5 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo,
butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, etc.
Alquilo superior: un alquilo que contiene más de
6 átomos de carbono, habitualmente de 6 a 20 átomos de carbono, tal
como, por ejemplo, hexilo, heptilo, octilo, etc.
Alquilideno: un radical orgánico divalente
derivado de un hidrocarburo alifático, tal como, por ejemplo, el
etilideno, en el que 2 átomos de hidrógeno se toman de mismo átomo
de carbono.
Arilo: un radical orgánico derivado de un
hidrocarburo aromático mediante la supresión de un átomo, y que
contiene uno o más anillos aromáticos, habitualmente de uno a cuatro
anillos aromáticos, tal como, por ejemplo, fenilo (a partir del
benceno), naftilo (a partir del naftaleno), etc.
Arilalquilo: un radical orgánico que tiene un
grupo alquilo al cual se une un grupo arilo, por ejemplo, bencilo,
fenetilo, 3-fenilpropilo,
1-naftiletilo, etc.
Alcoxi: un radical alquilo unido al resto de una
molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, metoxi, etoxi,
etc.
Ariloxi: un radical arilo unido al resto de una
molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, fenoxi,
naftoxi, etc.
Arilalcoxi: un radical arilalquilo unido al
resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo,
benzoxi, 1-naftiletoxi, etc.
Sustituido: quiere decir que un átomo de
hidrógeno de una molécula ha sido remplazado por otro átomo, el
cual puede ser un único átomo, tal como un halógeno, etc., o parte
de un grupo de átomos que forman una funcionalidad, tal como un
sustituyente que tiene de 1 a 15 átomos (distintos de los átomos de
hidrógeno necesarios para satisfacer la valencias de dichos
átomos), átomos que se seleccionan independientemente de entre el
grupo formado por: carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo, y
los cuales pueden estar unidos o no a uno o más átomos
metálicos.
Alquiltio: un radical alquilo unido al resto de
una molécula mediante un átomo de azufre, por ejemplo, metiltio,
etiltio, etc.
Ariltio: un radical arilo unido al resto de una
molécula mediante un átomo de azufre, por ejemplo, feniltio,
naftiltio, etc.
Grupo donante de electrones: un sustituyente
que, cuando esta unido a una molécula, es capaz de polarizar la
molécula de tal forma que el grupo donante de electrones se
empobrece en electrones y pasa a estar cargado positivamente en
relación a otras partes de la molécula, es decir, tiene una densidad
electrónica reducida. Tales grupos pueden ser, a modo de
ilustración y no de limitación, las aminas, éteres, tioéteres,
fosfinas, hidroxi, oxianiones, mercaptanos y sus aniones, sulfuros,
etc.
Un sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos
(distintos del requisito de átomos de hidrógenos necesarios para
satisfacer las valencias de dichos átomos), átomos que se
seleccionan independientemente del grupo formado por carbono,
oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo: un radical orgánico; el
radical orgánico tiene de 1 a 50 átomos distintos del requisito de
número de átomos de hidrógeno necesario para satisfacer las
valencias de los átomos del radical. Generalmente, el átomo
predominante es el carbono (C), per también puede serlo el oxígeno
(O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), en donde el O, N, S ó
P, si están presentes, están unidos al carbono, o a uno o más de
entre ellos, o al hidrógeno, o a un átomo metálico, para formar
varios grupos funcionales, tales como, por ejemplo, ácidos
carboxílicos, alcoholes, tioles, carboxamidas, carbamatos, ésteres
de ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ésteres de ácidos
sulfónicos, ácidos fosfóricos, ésteres de ácidos fosfóricos, ureas,
carbamatos, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros, tioéteres,
olefinas, acetilenos, aminas, cetonas, aldehídos, nitrilos, y
similares. Son ilustrativos de dichos radicales o grupos orgánicos,
a modo de ilustración y no de limitación, el alquilo, la
alquilidina, el arilo, el arilalquilo, y el alquilo, arilo, y
arilalquilo sustituidos con una o más de las funcionalidades antes
mencionadas.
Grupo de enlace: el enlace covalente entre
moléculas. El grupo de enlace dependerá ampliamente dependiendo de
la naturaleza de las moléculas, es decir, el fotosensibilizador, el
compuesto quimioluminiscente, el miembro de un sbp, o la molécula
asociada con o parte de una partícula, que está siendo enlazado. Los
grupos funcionales que están normalmente presentes o que se
introducen sobre un fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente se emplearán para el enlace de estos materiales
a un miembro de un sbp, o a una partícula tal como un componente
lipofílico de un liposoma o gota de aceite, partícula de látex,
partícula de silicona, sol de metal, cristalito de colorante.
En la mayor parte, las funcionalidades carbonilo
encontrarán uso, tanto oxocarbonilo, por ejemplo, aldehído, como
no-oxocarbonilo (incluyendo análogos de nitrógeno y
azufre), por ejemplo, carboxi, amidina, amidato, tiocarboxi y
tionocarboxi. Las funcionalidades alternativas a oxo incluyen
halógenos activos, diazo, mercapto, olefina, en particular olefina
activada, amino, fósforo y similares. Una descripción de grupos
enlace puede encontrarse en la patente estadounidense nº 3.817.837,
cuyos descubrimientos se incorporan aquí como referencia.
El enlace de grupo puede variar desde un enlace
hasta una cadena de desde 1 hasta 100 átomos, habitualmente desde
aproximadamente 1 hasta 70 átomos, preferiblemente de 1 a 50 átomos,
más preferiblemente de 1 a 20 átomos, cada uno seleccionado
independientemente de entre el grupo normalmente formado por
carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno, y fósforo. El número de
heteroátomos en los grupos enlace normalmente oscilará desde
aproximadamente 0 hasta 20, habitualmente desde aproximadamente 1
hasta 15, más preferiblemente de 2 a 6. Los átomos en la cadena
pueden sustituirse con otros átomos distintos del hidrógeno de forma
similar a la descrita para el sustituyente que tiene de 1 a 50
átomos. Como regla general, la longitud de un determinado grupo
enlace puede seleccionarse arbitrariamente para proporcionar los
medios convenientes a la síntesis, y la incorporación de cualquier
grupo deseado, tal como un grupo aceptor de energía, un fluoróforo,
un grupo para el análisis del entrecruzado del sistema, tal como un
átomo pesado, y similares. Los grupos enlace pueden ser alifáticos
o aromáticos, aunque con grupos diazo, estarán habitualmente
implicados los grupos aromáticos.
Cuando los heteroátomos están presentes, el
oxígeno estará normalmente presente como oxo y oxi, unido a
carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el nitrógeno estará
normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido
a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre sería análogo al
oxígeno; mientras que el fósforo estará unido a carbono, oxígeno,
azufre o nitrógeno, usualmente como fosfonato y fosfato mono- o
diéster.
Las funcionalidades comunes en la formación de
un enlace covalente entre el grupo enlace y la molécula a conjugar
serán la alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea,
guanidina, azo, tioéter, y ésteres, amidas y tioésteres de
carboxilato, sulfonato y fosfato.
En la mayor parte de los casos, el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente tendrán un
grupo no-oxocarbonilo, incluyendo análogos de
nitrógeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, un agente
alquilante tal como un halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el
análogo de azufre, mercapto), oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o
cetona), u olefina activa, tal como una vinilsulfona o un éster
\alpha,\beta-insaturado. Estas funcionalidades
estarán unidas a grupos amina, grupos carboxílicos, olefinas
activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Allí donde
una amina y ácido carboxílico, o su derivado nitrogenado o ácido
fosfórico, se enlazan, se formarán amidas, amidinas u fosforamidas.
Allí donde se enlazan el mercaptano y una olefina activada, se
formarán tioéteres. Allí donde se enlazan un mercaptano y un agente
alquilante, se formarán tioéteres. Allí donde se enlazan un
aldehído y una amina en condiciones reductoras, se formará una
alquilamina. Allí donde se enlazan un ácido carboxílico o ácido
fosfato y un alcohol, se formarán ésteres.
Un Grupo o Funcionalidad que proporciona
Hidrofobicidad o Solubilidad en Agua: es una funcionalidad
hidrofílica, la cual aumenta la capacidad de empaparse de los
sólidos con agua, y la solubilidad en agua de los compuestos a los
que está unida. Dicha grupo funcional o funcionalidad puede se un
sustituyente que tiene de 1 a 50 ó más átomos, y puede incluir un
sulfonato, sulfato, fosfato, amidina, fosfonato, carboxilato,
hidroxilo, en particular polioles, amina, éter, amida, y similares.
Son grupos funcionales ilustrativos: carboxialquilo,
sulfonoalquilo, CONHOCH_{2}COOH, CO-(glucosamina), azúcares,
dextrano, ciclodextrina, SO_{2}NHCH_{2}COOH, SO_{3}H,
CONHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H_{2}, PO_{3}H_{2},
OPO_{3}H_{2}, hidroxilo, carboxilo, cetona, y combinaciones de
los mismos. La mayoría de la funcionalidades anteriores también
pueden usarse como grupos de anclaje, los cual permite el anclaje
del fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente a un miembro
de un sbp o a un soporte.
Un Grupo o Funcionalidad que Proporciona
Lipofilicidad o Solubilidad en Lípidos: es una funcionalidad
lipofílica, la cual disminuye la capacidad de empaparse de las
superficies por parte del agua, y la solubilidad en agua de los
compuestos a los cuales está unida. Dicho grupo funcional o
funcionalidad puede contener de 1 a 50 ó más átomos, habitualmente
átomos de carbono sustituidos con hidrógeno o halógeno, y puede
incluir alquilo, alquilideno, arilo y arilalquilo. El grupo o
funcionalidad lipofílico normalmente tendrá de uno a seis grupos
alifáticos de cadena simple o ramificada de al menos 6 átomos de
carbono, más habitualmente de al menos 10 átomos de carbono, y
preferiblemente al menos 12 átomos de carbono, habitualmente no más
de 30 átomos de carbono. El grupo alifático puede estar unido a
anillos de desde 5 hasta 6 miembros, los cuales pueden ser
alicíclicos, heterocíclicos, o aromáticos. Fotosensibilizador: un
sensibilizador para la generación de oxígeno singlete,
habitualmente mediante excitación con la luz. El fotosensibilizador
puede ser fotoactivable (por ejemplo, colorantes y compuestos
aromáticos) o activado químicamente (por ejemplo, enzimas y sales
metálicas). Cuando es excitado por la luz, el fotosensibilizador es
habitualmente un compuesto formado por átomos covalentemente
unidos, usualmente con múltiples enlaces dobles y triples
conjugados. El compuesto debería absorber luz en el rango de
longitudes de onda 200-1100 nm, habitualmente
300-1000 nm, preferiblemente 450-950
nm, con un coeficiente de extinción en su máximo de absorbancia
superior a 500 M^{-14} cm^{-1}, preferiblemente al menos 5000
M^{-1} cm^{-1}, más preferiblemente al menos 50.000 M^{-1}
cm^{-1} en la longitud de onda de excitación. La vida media de un
estado excitado producido a partir de la absorción de luz en
ausencia de oxígeno será habitualmente de al menos 100 ns,
preferiblemente al menos 1 ms. En general, la vida media debe ser
lo suficientemente larga como para permitir la transferencia de
energía al oxígeno, el cual estará normalmente presente en
concentraciones en el rango de 10^{-5} hasta 10^{-3},
dependiendo del medio. El estado excitado del sensibilizador
habitualmente tendrá un número cuántico de espín (S) diferente del
de su estado elemental, y será usualmente un triplete (S=1) cuando,
como es habitualmente el caso, el estado elemental sea un singlete
(S=0). Preferiblemente, el sensibilizador tendrá un elevado
rendimiento de entrecruzado del intersistema. Es decir, la
fotoexcitación del sensibilizador producirá un estado vivo largo
(usualmente triplete), con una eficiencia de al menos un 10%,
deseablemente al menos un 40%, preferiblemente superior al 60%. El
fotosensibilizador será habitualmente como mucho débilmente
fluorescente en la condiciones de ensayo (rendimiento cuántico
habitualmente inferior al 0,5, preferiblemente inferior al
0,1).
Los fotosensibilizadores que han de ser
excitados mediante la luz serán relativamente fotoestables, y no
reaccionarán eficientemente con el oxígeno singlete. Varias
características estructurales están presentes en los
sensibilizadores más útiles. Las mayoría de sensibilizadores tienen
al menos uno, y frecuentemente tres o más dobles o triples enlaces
conjugados mantenidos en una estructura rígida, frecuentemente
aromática. Contendrán frecuentemente al menos un grupo que acelera
el cruce del intersistema, tal como un grupo carbamoilo o imina, o
un átomo pesado seleccionado de entre la columnas
3-6 de la tabla periódica, especialmente iodo y
bromo, o pueden tener estructuras aromáticas extendidas. Los
sensibilizadores típicos incluyen la acetona, el benzofenona, el
9-tioxantona, la eosina, el
9,10-dibromoantraceno, el azul de metileno, las
metaloporfirinas, tales como la hematoporfirina, las ftalocianinas,
las clorofilas, el rosa de bengala, el buckminsterfullereno, etc.,
y derivados de estos compuestos que tienen sustituyentes de 1 a 50
átomos para hacer dichos compuestos más lipofílicos o más
hidrofílicos y/o como grupos de anclaje para anclaje, por ejemplo, a
un miembro de un sbp. Son ejemplo de otros fotosensibilizadores que
pueden usarse en la presente invención aquéllos que tienen las
propiedades anteriores y que se enumeran en N. J. Turro,
"Molecular Photochemistry", página 132, W. A. Benjamin Inc.,
N.Y., 1965.
Los fotosensibilizadores son preferiblemente
relativamente no-polares para asegurar su disolución
en un miembro lipofílico cuando el fotosensibilizador es
incorporado a una gota de aceite, liposoma, partícula de látex,
etc.
Se propone que los fotosensibilizadores útiles
en esta invención también incluyan otras sustancias y composiciones
que pueden producir oxígeno singlete con o, menos preferiblemente,
sin activación mediante una fuente externa de luz. Así pues, por
ejemplo, se ha observado que las sales de molibdato
(MoO_{4}^{=}) y la cloroperoxidasa, y la mieloperoxidasa más
ion bromuro o cloruro (Kanofsky, J. Biol. Chem. (1983) 259:
5596) catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno a oxígeno
singlete y agua. Cualquiera de estas composiciones puede, por
ejemplo, incluirse en partículas a las cuales está unido un miembro
de un sbp, y usarse en el procedimiento de ensayo en el que el
peróxido de hidrógeno está incluido como un reactivo secundario, la
cloroperoxidasa está unida a una superficie, y el molibdato se
incorpora en la fase acuosa de un liposoma. También están incluidos
como fotosensibilizadores, dentro del ámbito de los invención, los
compuestos que no son verdaderos sensibilizadores, pero que, al ser
excitados mediante calor, luz o activación química, liberarán una
molécula de oxígeno singlete. Los miembros mejor conocidos de esta
clase de compuestos incluyen los endoperóxidos tales como el
1,4-biscarboxietil-1,4-naftaleno
endoperóxido, el
9,10-difenilantraceno-9,10-endoperóxido,
y el
5,6,11,12-tretrafenilnaftaleno-5,12-endoperóxido.
El calentamiento o la absorción directa de luz por parte de estos
compuestos libera oxígeno singlete.
Soporte o superficie: una superficie formada por
una material poroso o no poroso insoluble en agua. La superficie
puede tener cualquiera de entre un cierto número de formas, tales
como cinta, barra, partícula, incluyendo cuentas, y similares. La
superficie puede ser hidrofílica o capaz de ser convertida en
hidrofílica, e incluye polvos inorgánicos tales como sílice,
sulfato magnésico y alúmina; materiales poliméricos naturales, en
particular materiales celulósicos y materiales derivados de la
celulosa, tales como papeles conteniendo fibra, por ejemplo, papel
de filtro, papel cromatográfico, etc.; polímeros sintéticos o que
ocurren de forma natural modificados, tales como la nitrocelulosa,
el acetato de celulosa, el cloruro de polivinilo, la poliacrilamida,
dextrano entrecruzado, agarosa, poliacrilato, polietileno,
polipropileno, poli(4-metilbuteno),
poliestireno, polimetacrilato, poli(etileno tereftalato),
nilón, polivinilbutirato, etc.; bien usados por sí mismos o
conjuntamente con otros materiales; vidrios disponibles como
Biovidrio; cerámicas; metales; y similares. Los ensamblajes
naturales o sintéticos tales como los liposomas, vesículas
fosfolipídicas, y células también pueden emplearse.
La unión de miembros de un sbp al soporte o
superficie puede conseguirse mediante técnicas bien conocidas,
comúnmente disponibles en la literatura. Ver, por ejemplo,
"Immobilized enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva
York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059
(1970).
La superficie será habitualmente polifuncional,
o será capaz de ser "polifuncionalizada", o será capaz de unir
un oligonucleótido, un miembro de un sbp, un fotosensibilizador, y/o
un compuesto quimioluminiscente, a través de interacciones
covalentes y no covalentes específicas o no específicas. Están
disponibles o pueden incorporarse una amplia variedad de grupos
funcionales. Los grupos funcionales incluyen los ácidos
carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos
etileno, grupos hidroxilo, grupos mercapto, y similares. La manera
de enlazar una amplia variedad de compuestos a superficies es bien
conocida y está ampliamente ilustrada en la literatura. Ver, por
ejemplo, Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970). La
longitud de un grupo de engarce al oligonucleótido o al miembro de
un sbp puede variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del
compuesto que está siendo engarzado, del efecto de la distancia
entre el compuesto que está siendo engarzado y la superficie en las
propiedades de engarce específicas, y similares.
Partículas: partículas de al menos
aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 nm,
habitualmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de
aproximadamente 10 micrómetros, preferiblemente desde
aproximadamente 0,10 hasta 2,0 micrómetros de diámetro, que tienen
normalmente un volumen de menos de 1 picolitro. La partícula puede
ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no
porosa, tener cualquier densidad, pero preferiblemente de una
densidad aproximándose a la del agua, generalmente desde
aproximadamente 0,7 hasta 1,5 g/ml, preferiblemente que puede
suspenderse en agua, y compuesta de material que puede ser
transparente, parcialmente transparente, u opaco. Las partículas
pueden tener o no una carga, y cuando estén cargadas son
preferiblemente negativas. Las partículas pueden ser sólidas (por
ejemplo, de polímeros, metales, vidrio, orgánicas e inorgánicas,
tales como de minerales, sales y diatómicas), gotas de aceite (por
ejemplo, de hidrocarburos, fluorocarburo, fluido de silicona), o
vesículas (por ejemplo, sintéticas tales como de fosfolípido, o
naturales tales como células y orgánulos). Las partículas pueden
ser partículas de látex, u otras partículas compuestas de polímeros
orgánicos e inorgánicos; bicapas lipídicas, por ejemplo, liposomas,
vesículas fosfolipídicas; gotas de aceite; partículas de silicona;
soles de metal; células; y cristalitos de colorante.
Las partículas orgánicas serán normalmente
polímeros, bien polímeros de adición o de condensación, los cuales
pueden dispersarse fácilmente en el medio de ensayo. Las partículas
orgánicas también serán adsortivas, o funcionalizables con objeto
de unir sobre su superficie, bien directa o indirectamente, un
miembro de un sbp, y para unir sobre su superficie o incorporar
dentro de su volumen un fotosensibilizador o un compuesto
quimioluminiscente.
Las partículas pueden derivarse a partir de
materiales que ocurren de forma natural, materiales que ocurren de
forma natural que son modificados sintéticamente, y materiales
sintéticos. Se prefieren los ensamblajes naturales o sintéticos
tales como las bicapas lipídicas, por ejemplo, liposomas y vesículas
no fosfolipídicas. Entre los polímeros orgánicos de especial
interés están los polisacáridos, en particular los polisacáridos
entrecruzados, tales como la agarosa, la cual está disponible como
Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, la
celulosa, el almidón, y similares; los polímeros de adición, tales
como el poliestireno, la poliacrilamida, los homopolímeros y
copolímeros de derivados del acrilato y metacrilato, en particular
ésteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo libres,
incluyendo los hidrogeles y similares. Los polímeros inorgánicos
incluyen las siliconas, vidrios, disponible como Bioglass, y
similares. Los soles incluyen el oro, el selenio, y otros metales.
Las partículas también pueden ser colorantes insolubles tales como
las porfirinas, la ftalocianinas, etc., las cuales pueden actuar
como fotosensibilizadores. Las partículas también pueden incluir
diátomos, células, partículas virales, magnetosomas, núcleos
celulares, y similares.
Cuando las partículas están comercialmente
disponibles, el tamaño de la partícula puede hacerse variar
rompiendo partículas mayores en partículas más pequeñas mediante
medios mecánicos, tales como molienda, sonicación, agitación,
etc.
Las partículas serán habitualmente
polifuncionales, o serán capaces de ser polifuncionalizadas, o
serán capaces de unirse a un miembro de un sbp, fotosensibilizador,
o compuesto quimioluminiscente, a través de interacciones
covalentes o no covalentes, específicas o no específicas. Una amplia
variedad de grupos funcionales están disponibles o pueden ser
incorporados. Los ejemplos de grupos funcionales incluyen los ácidos
carboxílicos, los aldehídos, los grupos amino, los grupos ciano,
los grupos etileno, los grupos hidroxilo, los grupos mercapto, y
similares. Cuando se emplea la unión covalentemente de un miembro de
un sbp, un compuesto quimioluminiscente, o un fotosensibilizador, a
la partícula, la manera de engarzarlos es bien conocida y está
ampliamente ilustrada en la literatura. Ver, por ejemplo,
Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970). La longitud de
un grupo de engarce puede variar ampliamente, dependiendo de la
naturaleza del compuesto que está siendo engarzado, de la
naturaleza de la partícula, y del efecto de la distancia
entre
el compuesto que está siendo engarzado y la partícula, en la unión de miembros de sbp y el analito, y similares.
el compuesto que está siendo engarzado y la partícula, en la unión de miembros de sbp y el analito, y similares.
El fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente pueden escogerse para disolverse en, o para
unirse no covalentemente sobre la superficie de las partículas. En
este caso, estos compuestos serán preferiblemente hidrofóbicos para
reducir su capacidad de disociarse de la partícula, y causar, por
tanto, que ambos compuestos se asocien con la misma partícula. Esta
posibilidad puede reducirse aún más utilizando partículas con tan
sólo una composición, que están asociadas bien con el
fotosensibilizador o con el compuesto quimioluminiscente; o usando
dos tipos de partículas que difieren en su composición, con objeto
de favorecer la asociación del fotosensibilizador con un tipo de
partículas, y la asociación del compuesto quimioluminiscente con el
otro tipo de partículas.
El número de moléculas fotosensibilizadoras o
quimioluminiscentes asociadas con cada partícula, en promedio será
habitualmente de al menos una, y puede ser suficientemente elevado,
de forma que la partícula consistiera enteramente en moléculas
fotosensibilizadoras o quimioluminiscentes. El número de moléculas
preferido se seleccionará empíricamente para proporcionar en el
ensayo la relación señal-ruido de fondo más intensa.
En algunos casos esto se conseguirá mejor asociando una
multiplicidad de diferentes moléculas fotosensibilizadoras a las
partículas. Habitualmente, la proporción de fotosensibilizador o
compuesto quimioluminiscente respecto el miembro de un sbp en las
partículas debería ser de al menos 1, preferiblemente de al menos
100 a 1, y más preferiblemente superior a 1000 a 1.
Gotas de aceite: son partículas fluidas formadas
por un compuesto lipofílico recubierto y estabilizado con un
emulsivo que es una molécula amfifílica, tal como, por ejemplo,
fosfolípidos, esfingomielina, albúmina, y similares.
Los fosfolípidos se basan en ácidos carboxílicos
alifáticos que son ésteres de polioles alifáticos, en donde al
menos un grupo hidrofílico está sustituido con un éster de ácido
carboxílico de desde aproximadamente 8 hasta 36, más habitualmente
de desde aproximadamente 10 hasta 20 átomos de carbono, el cual
puede tener desde 0 hasta 3, más habitualmente desde 0 hasta 1
sitio de insaturación etilénica, y al menos 1, normalmente tan sólo
1, grupo hidroxilo sustituido con fosfato para formar un éster
fosfato. El grupo fosfato puede sustituirse además con pequeños
compuestos alifáticos, los cuales son de dos o más funcionalidades,
teniendo generalmente grupos hidroxilo o amino.
Las gotas de aceite pueden fabricarse según los
procedimientos convencionales, mediante combinación de los
compuestos lipofílicos apropiados con un tensioactivo, aniónico,
catiónico o no iónico, en donde el tensioactivo está presente en
desde aproximadamente 0,1 hasta 5, más habitualmente desde
aproximadamente 0,1 hasta 2 en porcentaje de peso de la mezcla, y
sometiendo la mezcla a agitación en un medio acuoso, tal como
sonicando o agitando en vórtice. Los compuestos lipofílicos
ilustrativos incluyen los aceites hidrocarburos, los halocarburos,
incluyendo el fluorocarburo, los alquilftalatos, trialquilfosfatos,
triglicéridos, etc.
Un miembro de un sbp será generalmente adsorbido
sobre la superficie de la gota lipídica, o unido directa o
indirectamente a un componente de superficie de la gota de aceite.
El miembro de un sbp puede incorporarse dentro de las partículas
líquidas, bien durante o después de la preparación de las partículas
líquidas. El miembro de un sbp normalmente estará presente en un
porcentaje molar de desde 0,5 hasta 100, más habitualmente de 1 a
90, frecuentemente desde aproximadamente 5 hasta 80, y
preferiblemente desde aproximadamente 50 hasta 100, de las
moléculas presentes sobre la superficie de la partícula.
La siguiente es una lista, a modo de ilustración
y no de limitación, de compuestos amfifílicos, los cuales pueden
utilizarse para estabilizar las gotas lipídicas:
fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
dimiristoilfosfatidilcolina, fosfatidil colina de huevo,
dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido fosfatídico, cardiolipina,
lecitina, galactocerebrósido, esfingomielina, dicetilfosfato,
fosfatidilinositol, 2-trihexadecilamoniometilamina,
1,3-bis(octadecilfosfato)-propanol,
fosfato de estearoiloxietileno, fosfolípidos, dialquilfosfatos,
sodio dodecil sulfato, detergentes catiónicos, detergentes
aniónicos, proteínas tales como la albúmina, detergentes no
iónicos, etc.
También pueden usarse otros compuestos que
tienen grupos lipofílicos y que han sido descritos previamente. En
la mayor parte de los casos, estos compuestos serán alquilbencenos,
que tienen grupos alquilo de desde 6 hasta 20 átomos de carbono,
habitualmente mezclas de grupos alquilo, los cuales pueden ser
simples o ramificados, y que tienen un grupo carboxilo, un grupo
hidroxílico, un grupo polioxi alquileno (alquileno de desde 2 hasta
3 átomos de carbono), grupo carboxílico, grupo sulfónico ácido, o
grupo amino. Los ácidos grasos alifáticos pueden usarse,
normalmente tendrán desde 10 hasta 36, más habitualmente desde 12
hasta 20 átomos de carbono. También pueden encontrar un uso los
alcoholes grasos que tienen los límites de carbonos indicados para
los ácidos grasos, las aminas grasas con similares limitaciones de
carbonos, y varios esteroides.
Las gotas lipídicas pueden comprender un aceite
de fluorocarburo o un aceite de silicona (partícula de silicona).
Dichas gotas están descritas por Giaever en las patentes
estadounidenses nº 4.634.681 y 4.619.904 (los descubrimientos de
las cuales se incorporan en ésta en su totalidad). Estas gotas se
forman dispersando un aceite de fluorocarburo o aceite de silicona
en una fase acuosa. Los gotas se preparan colocando una pequeña
cantidad del aceite seleccionado (generalmente, dichos aceites están
disponibles comercialmente) en un contenedor con una mayor cantidad
de fase acuosa. El sistema líquido se somete a agitación para
generar la emulsión, y a continuación se centrifuga. La fase
homogénea se retira y las gotas residuales se resuspenden en un
medio acuoso tamponado. Los pasos anteriores de centrifugación y
decantación pueden repetirse una o más veces antes de que las gotas
sean utilizadas.
Los miembros de un sbp pueden ser unidos a las
gotas en un cierto número de modos. Tal como describe Giaever, el
miembro de un sbp determinado, particularmente un miembro proteico
de un sbp, puede ser recubierto sobre las gotas introduciendo un
exceso del miembro del sbp en el medio acuoso antes del paso de
emulsión. Los pasos de lavado son deseables para retirar el exceso
de medio del sbp. La funcionalización del aceite introduce
funcionalidades descritas más arriba para engarzar a los miembros de
un sbp. Dichas funcionalidades también pueden emplearse para unir
las gotas a un fotosensibilizador o a un compuesto
quimioluminiscente. Por otra parte, el fotosensibilizador o el
compuesto quimioluminiscente se escogerán frecuentemente de forma
que sean solubles en la fase aceite de la gota lipídica, y no serán
unidos covalentemente. Cuando el aceite es un fluorocarburo, un
fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente fluorado serán
a menudo más solubles que el correspondiente derivado no
fluorado.
Otras gotas lipídicas descritas Giaever también
pueden encontrar un uso en la presente invención.
Liposomas: microvesículas de forma
aproximadamente esférica, son uno de los materiales preferidos para
su uso en la presente invención. Los liposomas tienen un diámetro
que es al menos aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente
20 micrómetros, habitualmente al menos aproximadamente 40 nm y menos
de aproximadamente 10 micrómetros. Preferiblemente, el diámetro de
los liposomas será inferior a aproximadamente dos micrómetros, con
objeto de limitar la precipitación o la flotación.
La capa exterior de un liposoma consiste en una
bicapa amfifílica que encierra un volumen de agua o una solución
acuosa. Los liposomas con más de una bicapa se denominan vesículas
multilamelares. Los liposomas con una única bicapa se denominan
vesículas unilamelares. Las vesículas multilamelares son preferidas
en la presente invención cuando se usa a fotosensibilizador o
compuesto quimioluminiscente lipofílicos, debido a su capacidad
para incorporar mayores cantidades de estos materiales que las
vesículas unilamelares. La bicapa amfifílica está frecuentemente
formada por fosfolípidos. Los fosfolípidos empleados en la
preparación de partículas utilizables en la presente invención
pueden ser cualquier fosfolípido o mezcla de fosfolípidos que se
encuentre en membranas naturales, incluyendo la lecitina, o
diésteres sintéticos de glicerolfosfato de ácidos grasos lineales
de 12-carbonos o 24-carbono
saturados o insaturados, en donde el fosfato puede estar presente
como monoéster, o como un éster de un alcohol polar tal como
etanolamina, colina, inositol, serina, glicerol, y similares. Los
fosfolípidos particularmente preferidos incluyen la
L-\alpha-palmitoil
oleoil-fosfatidilcolina (POPC), el palmitoil
oleoil-fosfatidilglicerol (POPG), el
L-\alpha
-dioleoil-fosfatidilglicerol, la
L-\alpha
-dioleoil-fosfatidiletanolamina
(DOPE), y el L-\alpha
-dioleoil-fosfatidil
\beta-(4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxiamido)etanol
(DOPE-MCC).
Los fosfolípidos en la bicapa pueden
suplementarse con colesterol, y pueden remplazarse con otros
compuestos amfifílicos que tienen un grupo cabeza polar,
habitualmente cargado, y una parte hidrofóbica habitualmente
formada por dos cadenas linea de hidrocarburos. Los ejemplos de
dichos sustituyentes incluyen el dialquilfosfato; los
dialcoxipropilfosfatos en los que los grupos alquilo tienen cadenas
lineales de 12-20 átomos de carbono; el cloruro de
N-(2,3-di(9-(Z)-octa-deceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetil-amonio
(DOTMA), tal como se descubre en la patente estadounidense nº
4.897.355 concedida el 30 de enero de 1990, la cual es incorporada
por la presente en ésta por referencia; la esfingomielina; la
cardiolipina; y similares.
Los liposomas utilizados en la presente
invención preferiblemente tienen una elevada densidad de carga
negativa para estabilizar la suspensión, y para prevenir la
agregación espontánea.
Para su uso en la presente invención, los
liposomas deberían ser capaces de unirse a un miembro de un sbp, y
ser capaces de tener un fotosensibilizador o un compuesto
quimioluminiscente asociados con cualquiera, la fase acuosa o la no
acuosa. Los liposoma utilizados en la presente invención
habitualmente tendrán miembros de un sbp unidos a la superficie
exterior de la vesícula lipídica.
Los liposomas pueden producirse mediante una
variedad de procedimientos, incluyendo la hidratación y la
dispersión mecánica de fosfolípidos o sustitutos de fosfolípidos
secos en una solución acuosa. Los liposomas preparados de esta
forma tendrán una variedad de dimensiones, composiciones y
comportamientos, la sonicación es un procedimiento para reducir la
heterogeneidad e inconsistencia de comportamiento de los liposomas
mecánicamente dispersados. Dicho procedimiento disminuye el tamaño
promedio de los liposomas. Alternativamente, la extrusión puede
usarse como un paso final durante la producción de los liposomas. La
patente estadounidense nº 4.529.561 descubre un procedimiento de
extrusión de liposomas bajo presión a través de una membrana de
tamaño de poro uniforme para mejorar la uniformidad de tamaño.
La preparación de liposomas que contengan un
fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente hidrofóbico o
amfifílico disuelto en la bicapa lipídica puede llevarse a cabo en
una variedad de procedimientos, incluyendo un procedimiento
descrito por Olsen et al., Biochemica et Biophisica Acta
557(9), 1979. En resumen, se seca una mezcla de lípidos que
contiene el compuesto apropiado en un solvente orgánico tal como
cloroformo hasta obtener una película delgada sobre las paredes de
un frasco de vidrio. La película lipídica se hidrata en un tampón
apropiado mediante agitación o haciéndola girar (vortexing).
A continuación, la suspensión de lípido se extruye a través de una
serie de membranas de filtro de policarbonato que tienen
sucesivamente poros más pequeños. Por ejemplo, 2,0, 1,0, 0,8, 0,6,
0,4 y 0,2 micrómetros. Es deseable el filtrado repetido a través de
cualquiera de los filtros, y en particular a través de los filtros
más pequeños. Los liposomas pueden purificarse mediante, por
ejemplo, filtración en gel, tal como a través de una columna de
Sephacryl S-1000. La columna puede eluirse con
tampón y recogerse los liposomas. El almacenamiento en frío prolonga
la vida en almacenamiento de los liposomas producidos mediante este
procedimiento. Alternativamente, el fotosensibilizador o el
compuesto quimioluminiscente pueden añadirse a la suspensión
líquida a continuación de la preparación de los liposomas.
El marcaje de gotas y liposomas implicará a
menudo, por ejemplo, inclusión de grupos tiol, o maleimida, o
biotina sobres las moléculas que forma la bicapa lipídica. Los
fotosensibilizadores, moléculas quimioluminiscentes, o miembros de
sbp pueden entonces unirse a la superficie mediante reacción de las
partículas con uno de estos materiales que está unido,
respectivamente, a un compuesto reactivo sulfhidrilo, un grupo
sulfhidrilo, o avidina. Los grupos reactivos sulfhidrilo incluyen
los reactivos alquilantes tales como la bromoacetamida y la
maleimida.
Los miembros de un sbp pueden atraerse hacia la
superficie de las partículas liposómicas mediante interacciones
hidrofóbicas débiles, no obstante, dichas interacciones no bastan
generalmente para soportar la fuerza de rotura que se encuentra
durante la incubación y lavado. Es preferible unir covalentemente
los miembros de un sbp a la partícula liposómica que se ha
funcionalizado, por ejemplo, mediante el uso de
DOPE-MCC, tal como se ha mostrado más arriba,
combinando dicho liposoma con el miembro de un sbp seleccionado y
funcionalizado con un grupo mercaptano. Por ejemplo, si el miembro
de un sbp es un anticuerpo, éste puede hacerse reaccionar con
anhidro S-acetil-mercaptosuccínico
(SAMSA) e hidrolizarse para proporcionar un anticuerpo modificado
con sulfhidrilo.
Partículas de látex: "Látex" significa un
material polimérico desmenuzado insoluble en agua y que puede
suspenderse en agua, que usualmente tiene unas dimensiones de
partícula de 20 nm a 20 mm, más preferiblemente 100 a 1000 nm de
diámetro. El látex es frecuentemente un polietileno sustituido, tal
como: poliestireno-butadieno, poliacrilamida
poliestireno, poliestireno con grupos amino, poli-ácido acrílico,
poli-ácido metacrílico, acrilonitrilo-butadieno,
copolímeros de estireno, polivinil acetato-acrilato,
polivinil pirridina, copolímeros de vinilo-acrilato,
y similares. Se prefieren los polímeros no entrecruzados de
estireno y estireno carboxilado, o estireno funcionalizado con
otros grupos activos tales como amino, hidroxilo, halo, y similares.
Frecuentemente se usarán copolímeros de estirenos sustituidos con
dienos, tales como butadieno.
La asociación del fotosensibilizador o del
compuesto quimioluminiscente con las partículas de látex usadas en
la presente invención puede implicar la incorporación durante la
formación de las partículas mediante polimerización, pero
habitualmente implicará la incorporación dentro de partículas
preformadas, habitualmente mediante disolución no covalente dentro
de las partículas. Habitualmente se empleará una solución del
compuesto quimioluminiscente o sensibilizador. Los solventes que
pueden utilizarse incluyen alcoholes, incluyendo el etanol,
etilenglicol, y alcohol bencílico; amidas tales como la
dimetilformamida, formamida, acetamida, y tetrametilurea, y
similares; sulfóxidos tales como el dimetilsulfóxido y el sulfolano;
y éteres tales como el carbitol, etilcarbitol, dimetoxietano, y
similares; y el agua. El uso de solventes que tienen puntos de
ebullición elevados, en los que las partículas son insolubles,
permite el uso de temperaturas elevadas para facilitar la
disolución de los compuestos en las partículas, y son
particularmente apropiados. Los solventes pueden usarse solos o en
combinación. Los solventes particularmente preferidos para
incorporar el fotosensibilizador son aquéllos que no atenúan el
estado de triplete excitado del fotosensibilizador, bien debido a
sus propiedades intrínsecas o porque pueden retirarse
subsiguientemente de las partículas gracias a su capacidad para ser
disueltos en un solvente, como el agua, que es insoluble en las
partículas. Se prefieren los solventes aromáticos, y, en general,
solventes que son solubles en la partícula. Para incorporar
compuestos quimioluminiscentes en las partículas debería
seleccionarse un solvente que no interfiera con la luminiscencia,
debido a sus propiedades intrínsecas o a su capacidad para ser
retirados de las partículas. Frecuentemente, también se preferirán
los solventes aromáticos. Los solventes aromáticos típicos incluyen
el dibutilftalato, el benzonitrilo, el naftonitrilo, el
dioctiltereftalato, diclorobenceno, difeniléter, dimetoxibenceno,
etc.
Excepto cuando el fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente está covalentemente unido a las partículas, será
habitualmente preferible usar fotosensibilizadores o compuestos
quimioluminiscentes electrónicamente neutros. Es preferible que el
medio líquido seleccionado no reblandezca las cuentas de polímero
hasta el punto de hacerlas pegajosas. Una técnica preferida
comprende suspender las partículas de látex seleccionadas en un
medio líquido en el cual el fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente tienen al menos una solubilidad limitada.
Preferiblemente, las concentraciones de fotosensibilizador y
compuesto quimioluminiscente en el medio líquido se seleccionarán
para proporcionar partículas que tienen la máxima eficiencia de
formación de oxígeno singlete y máximo rendimiento cuántico de
emisión a partir del compuesto quimioluminiscente en el medio, sin
embargo, a veces, se preferirán soluciones menos concentradas. La
distorsión o disolución de las partículas en el solvente puede
evitarse mediante la adición de un cosolvente miscible en el que las
partículas son insolubles.
Generalmente, la temperatura empleada durante el
proceso se escogerá para maximizar la capacidad de formación de
oxígeno singlete de las partículas marcadas con fotosensibilizador,
y el rendimiento cuántico de las partículas de compuesto
quimioluminiscente, con la condición que las partículas no deberían
fundirse o agregarse a la temperatura seleccionada. Normalmente se
emplean temperaturas elevadas. Las temperaturas para el
procedimiento generalmente irán desde 20ºC hasta 200ºC, más
usualmente desde 50ºC hasta 170ºC. Se ha observado que algunos
compuestos que son prácticamente insolubles a temperatura ambiente,
son solubles a elevadas temperaturas en, por ejemplo, alcoholes de
bajo peso molecular, tales como etanol y etilenglicol, y similares.
Se ha observado que las partículas de látex modificadas mediante
carboxilación toleran alcoholes de bajo peso molecular a dichas
temperaturas.
Un miembro de un sbp puede estar físicamente
adsorbido sobre la superficie de la partícula de látex, o puede
estar covalentemente unido a la partícula. En los casos en los que
el miembro de un sbp sólo está débilmente unido a la superficie de
la partícula de látex, la unión puede ser, en ciertos casos, incapaz
de soportar la fuerzas de rotura de
partícula-a-partícula que se
encuentran durante la incubación y lavados. Por tanto, puede ser
preferiblemente unir covalentemente los miembros de un sbp a las
partículas de látex en condiciones que minimizarán la adsorción.
Esto puede conseguirse mediante activación química de la superficie
del látex. Por ejemplo, pueden formarse ésteres de
N-hidroxisuccinimida de los grupos carboxílicos de
la superficie sobre las partículas activadas para reducir la unión
no específica de componentes del ensayo sobre la superficie de la
partícula, y, a continuación, se ponen en contacto con un engarce
que tienen grupos aminos que reaccionarán con los grupos ésteres o
directamente con un miembro de un sbp que tiene un grupo amino. El
engarce usualmente se seleccionará para reducir la unión no
específica de los componentes del ensayo a la superficie de la
partícula, y preferiblemente proporcionará una funcionalidad
apropiada tanto para el anclaje a la partícula de látex y el
anclaje al miembro de un sbp. Los materiales apropiados incluyen el
aminodextrano maleimidato (MAD), la polilisina, los aminosacáridos,
y similares. El MAD puede prepararse tal como describen Hubert et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75(7): 3143, 1978.
En un procedimiento, primero se une el MAD a
partículas de látex que contienen carboxilos usando una
carbodiimida soluble en agua, por ejemplo,
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil
carbodiimida. A continuación, las partículas recubiertas se
equilibran en varios reactivos para prevenir la unión no específica.
Dichos reactivos incluyen proteínas, tales como la gammaglobulina
bovina (BGG), un detergente, tal como el Tween-20,
Triton X-100, y similares. Entonces se añade un
miembro de un sbp que tiene un grupo sulfhidrilo, o convenientemente
modificado para introducirle un grupo sulfhidrilo, a la suspensión
de partículas, a partir de lo cual, se forma un enlace covalente
entre el miembro de un sbp y el MAD sobre las partículas. A
continuación, puede retirarse cualquier exceso de miembro de un sbp
que no haya reaccionado mediante lavado.
Soles de metal: son aquellas partículas formadas
por un metal pesado, es decir, un metal con número atómico superior
a 20, tal como un metal del Grupo IB, por ejemplo, oro o plata, o
chalcogenos tales como selenio o telurio.
Las partículas de sol de metal están descritas,
por ejemplo, por Leuvering en la patente estadounidense nº
4.313.734, cuyo descubrimiento se incorpora aquí en su totalidad por
referencia. Dichos soles incluyen dispersiones acuosas coloidales
de un metal, compuesto metálico, o núcleo polimérico recubierto con
un metal o compuesto metálico.
Los soles de metal pueden ser de metales o
compuestos metálicos, tales como óxidos metálicos, hidróxidos
metálicos, y sales de metales, o un núcleo polimérico recubierto con
metales o compuestos metálicos. Son ejemplo de tales metales el
platino, oro, plata, mercurio, plomo, paladio, y cobre; y de tales
compuestos metálicos el yoduro de plata, el bromuro de plata, el
oxido hidratado de cobre, el óxido de hierro, el hidróxido de
hierro u óxido hidratado, el hidróxido de aluminio o el óxido
hidratado, el hidróxido de cromo o el óxido hidratado, el óxido de
vanadio, el sulfuro de arsénico, el hidróxido de manganeso, el
sulfuro de plomo, el sulfuro de mercurio, el sulfato de bario y el
dióxido de titanio. En general, los metales y compuestos metálicos
útiles pueden ser fácilmente demostrados mediante técnicas
conocidas.
A veces es ventajoso usar soles formados por
partículas dispersas consistentes en un núcleo polimérico
recubierto con los metales o compuestos metálicos anteriormente
mencionados. Estas partículas tienen propiedades similares a las de
la fase dispersa de metales puros o compuestos metálicos, pero el
tamaño, densidad y contacto metálico pueden combinarse
óptimamente.
Las partículas de soles metálicos pueden
prepararse de un gran número de formas que son conocidas en sí
mismas. Por ejemplo, para la preparación de sol de oro Leuvering se
refiere a un artículo de G. Frens en Nature Physical
Sciences 241: 20 (1973).
Las partículas de soles metálicos pueden
modificarse para contener varios grupos funcionales, tal como se
describen más arriba, para unirse a un miembro de un sbp, o a un
fotosensibilizador, o a un compuesto quimioluminiscente. Por
ejemplo, pueden usarse agentes de enlace poliméricos para recubrir
las partículas, tales como polímeros que contienen grupos tiol que
se unen fuertemente a muchos metales pesados, o agente sililantes
que pueden unirse y formar recubrimientos poliméricos como, por
ejemplo, mediante reacción de partículas metálicas con
trialcoxi-aminoalquisilanos, tal como se describe en
la solicitud de patente EPO 84400952.2 de Advanced Magnetics, para
recubrir partículas magnéticas.
Cristalitos de colorante: microcristales de
colorantes sólidos, insolubles en agua, puros o mezclados,
preferiblemente colorantes que pueden servir como los
fotosensibilizadores descritos más arriba. Los cristalitos de
colorantes útiles en la presente invención tienen un rango de
tamaños de 20 nm hasta 20 \mum.
Un procedimiento para preparar cristalitos de
colorante está descrito en la patente estadounidense nº 4.373.932
(Gribnau et al.), el descubrimiento de la cual se incorpora
en su totalidad en ésta por referencia. Gribnau describe partículas
coloidales de colorante y dispersiones acuosas de un colorante o
pigmento hidrofóbico, el cual puede tener un componente
inmunoquímicamente reactivo unido directa o indirectamente. Las
partículas de colorante se preparan en general dispersando un
colorante en agua y centrifugando a continuación. Se obtiene un
precipitado de colorante y se resuspende en agua, a la que se añaden
cuentas de vidrio. Esta suspensión se hace rodar durante varios
días a temperatura ambiente. Se decanta el líquido y se centrifuga,
y se obtienen las partículas de colorante después de aspirar el
líquido.
Otro procedimiento para preparar cristalitos de
colorante es mediante adición lenta al agua de una solución del
colorante en un solvente miscible con agua. Otro procedimiento es
mediante sonicación de una suspensión del colorante sólido en
agua.
La unión de miembros de un sbp a las partículas
de colorante puede conseguirse mediante adsorción directa o
indirecta, o mediante anclaje químico covalente. Este último está
gobernado por la presencia de grupos funcionales apropiados en
cualquier material de recubrimiento y en el colorante. Por ejemplo,
pueden introducirse grupos funcionales sobre la superficie del
cristalito de colorante acoplando un compuesto que contenga un
grupo amino aromático diazotizado, y el grupo funcional deseado a un
grupo fenólico o anilino del colorante.
Cuando el colorante tiene un grupo carboxilo, el
cristalito de colorante puede activarse mediante carbodiimida y
acoplarse a un componente amino primario. Los grupos amino primarios
alifáticos y los grupos hidroxilo pueden activarse, por ejemplo,
con cianuro de bromo o di o tri-azinas
halosustituidas, después de lo cual puede tener lugar el anclaje
con un componente amino primario o con, por ejemplo, un componente
conteniendo un grupo -SH o -OH. También puede hacerse uso de
compuestos reactivos bifuncionales. Por ejemplo, puede usarse
glutaraldehído para el acoplamiento mutuo de componentes amino
primarios del colorante y un miembro de un sbp; y, por ejemplo,
puede usarse un reactivo hetero-bifuncional tal como
el
N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato
para el acoplamiento de un componente amino primario a un
componente que contenga un grupo tiol.
Compuesto quimioluminiscente: una sustancia que
sufre una reacción química con el oxígeno singlete para formar un
intermediario metaestable que puede descomponerse con la emisión
simultánea o subsiguiente de luz dentro del rango de longitudes de
onda de 250 a 1200 nm. La emisión ocurrirá habitualmente sin la
presencia de un aceptor de energía o catalizador para causar la
descomposición y emisión de luz. Preferiblemente, el intermediario
se descompone espontáneamente sin calentamiento o sin la adición de
reactivos secundarios a partir de su formación. No obstante, para
algunos compuestos quimioluminiscentes puede requerirse la adición
de un reactivo después de la formación del intermedio, o el uso de
una temperatura elevada, para acelerar la descomposición. Los
compuestos quimioluminiscentes son habitualmente compuestos ricos en
electrones que reaccionan con el oxígeno singlete, frecuentemente
con la formación de dioxetanos o dioxetanonas. Son ejemplos de
dichos compuestos los éteres de enol, las enaminas, los
9-alquildenexantanos, las
9-alquilideno-N-alquilacridinas,
los aril-vinil-éteres, los dioxenos, los
arilimidazoles, y la lucigenina. Otros compuestos
quimioluminiscentes generan intermedios, a partir de la reacción
con oxígeno singlete, que subsiguientemente reaccionan con otro
reactivo con emisión de luz. Son ejemplo de compuestos las
hidrazidas tales como el luminol y los ésteres de oxalato.
Los compuestos quimioluminiscentes de interés
generalmente emitirán en longitudes de onda superiores a los 300
nanómetros, y usualmente por encima de los 400 nm. Los compuestos
que solos, o junto con una molécula fluorescente, emiten luz con
longitudes de onda más allá de la región en que los compuestos del
suero absorben luz serán de especial uso en la presente invención.
La fluorescencia del suero decae rápidamente por encima de los 500
nm y pasa a ser relativamente insignificante por encima de 550 nm.
Por tanto, cuando el analito es el suero, los compuestos
quimioluminiscentes que emiten luz por encima de 550 nm,
preferiblemente por encima de 600 nm, son de especial interés. Con
objeto de evitar la autosensibilización del compuesto
quimioluminiscente, es preferible que el compuesto
quimioluminiscente no absorba la luz usada para excitar el
fotosensibilizador. Puesto que generalmente será preferible excitar
el sensibilizador con longitudes de onda superiores a 500 nm, será,
por tanto, deseable que la absorción de luz por parte del compuesto
quimioluminiscente esté muy poco por encima de 500 nm.
Cuando se desee la emisión de longitudes de onda
largas a partir del compuesto quimioluminiscente, puede usarse un
emisor de longitudes de onda larga tal como un pireno, unido al
compuesto quimioluminiscente. Alternativamente, puede incluirse una
molécula fluorescente en el medio que contiene el compuesto
quimioluminiscente. Las moléculas fluorescentes preferidas serán
excitadas por el compuesto quimioluminiscente activado, y emitirán
en una longitud de onda superior a la longitud de emisión del
compuesto quimioluminiscente, habitualmente superior a 550 nm.
También es usualmente deseable que las moléculas fluorescentes no
absorban en las longitudes de onda usadas para activar el
fotosensibilizador. Los ejemplos de colorantes útiles incluyen la
rodamina, el etidio, el dansilo, el Eu(fod)_{3}, el
Eu(TTA)_{3}, el Ru(bpy)_{3}^{--}
(en donde el bpy = 2,2-dipiridil), etc. En general,
estos colorantes actúan como aceptores en los procesos de
transferencia de energía, y preferiblemente tienen rendimientos
cuánticos fluorescentes elevados, y no reaccionan rápidamente con el
oxígeno singlete. Pueden incorporarse en partículas simultáneamente
a la incorporación del compuesto quimioluminiscente en las
partículas.
Las olefinas ricas en electrones generalmente
tienen un grupo donador de electrones en conjugación con la
olefina:
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\vskip1.000000\baselineskip
en donde A es un grupo donante de
electrones tal como, por ejemplo, N(D)_{2}, OD,
p-[C_{6}H_{4}N(D)_{2}]_{2}, furanilo,
N-alquilimidazolio,
N-alquilpirrolilo, 2-indolilo, etc.,
donde D puede ser, por ejemplo, alquilo o arilo, y donde A está
unido directamente al carbono olefínico o unido mediante la
intermediación de otros dobles enlaces conjugados. Las otras
valencias de los átomos C en la olefina 1 son sustituyentes de 1 a
50 átomos, los cuales pueden tomarse juntos para formar uno o más
anillos, que están fusionados o no fusionados, por ejemplo,
cicloalquilo, fenilo, 7-norbornilo, naftilo,
antracilo, acridanilo, adamantilo, y
demás.
\newpage
Los enoléteres de uso en esta invención
generalmente tienen la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde las D_{1} se toman
independientemente, y se seleccionan del grupo formado por H y
sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente, arilo,
hidroxiarilo, aminoarilo, t-alquilo, H, alcoxi,
heteroarilo, etc., y puede tomarse junto con uno o ambos de los
átomos de carbono para formar un anillo tal como un cicloalqueno,
adamantilideno, 7-norbornilideno y similar, y
D_{2} es preferiblemente alquilo o arilo. Son ejemplo de
enoléteres, a modo de ilustración y no de limitación, el
2,3-diaril-4,5-dihidrodioxenos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X = O, S ó ND_{2}, y Ar
y Ar' son arilos, incluyendo arilos sustituidos en donde al menos un
sustituyente está presente como grupo amino, éter, o
hidroxilo.
9-(dialcoximetilideno)-xanteno:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Alcoxivinilpireno:
\newpage
9-alcoximetilideno-10-alquilacridina:
y
\vskip1.000000\baselineskip
Los vinilsulfuros de uso en esta invención
generalmente incluyen los enoléteres antes mencionados, en donde el
átomo de oxígeno está remplazado por un átomo de azufre.
La enaminas de uso en la presente invención
generalmente tienen la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde D_{3} puede ser
independientemente alquilo o arilo, y el resto de sustituyentes en
la olefina se seleccionan del grupo formado por H y sustituyentes
de 1 a 50 átomos, preferiblemente arilo, hidroxiarilo, aminoarilo,
t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo,
etc.
Son ejemplo de enaminas, a modo de ilustración y
no de limitación,
dialquilaminovinilpireno:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
dialquilaminovinil-9,10-difenilantraceno
en donde \phi = fenilo, y así
sucesivamente.
Las
9-alquilideno-N-alquilacridinas
generalmente tienen la estructura:
en donde D_{4} es alquilo, y el
resto de sustituyentes en la olefina se seleccionan del grupo
formado por H y sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente
arilo, alcoxiarilo, aminoarilo, t-alquilo, H,
alcoxi, heteroarilo, etc., y pueden tomarse juntos para formar un
anillo tal como, por ejemplo, adamantilo, ciclopentilo,
7-norbornilo, y similares. Son ejemplo de acridinas,
a modo de ilustración y no de limitación, la
9-bencilideno-10-metilacridina
sustituida y
9-difenilmetileno-10-metilacridina
descritas por Singer et al., J. Am. Chem. Soc. 102: 3823
(1983), y McCapra, Chem. Comm. 944 (1977),
9-metilideno-10-metilacridinas
descritas por E. White, Chem. Letters 1491
(1979).
Los dioxetanos formados por la reacción del
oxígeno singlete con la estructura "quimioluneral", donde los
sustituyentes sobre los átomos de carbono (C) son aquellos presentes
en la olefina correspondiente:
algunos de los cuales se
descomponen espontáneamente, otros mediante calor y/o catálisis,
habitualmente mediante un aceptor de electrones ricos en energía,
con la emisión de
luz.
Otra familia de compuestos quimioluminiscentes
son las
2,3-dihidro-1,4-ftaloazinedionas.
El compuesto más popular es el luminol, que es el compuesto
5-amino. Otros miembros de la familia incluyen los
sustituidos 6-amino,
5-amino-6,7,8-trimetoxi,
y el análogo dimetilamino[ca]benzo. Estos compuestos
son oxidados por el oxígeno singlete, en una reacción con varios
pasos que resulta en su descomposición, con formación de un derivado
ftalato y emisión de luz.
Otra familia de compuestos quimioluminiscentes
son las 2,4,5-trifenilimidazolas, con la lofina como
nombre común del compuesto progenitor. Los análogos
quimioluminiscentes incluyen los sustituyentes
para-dimetilamino y -metoxi.
El siguiente grupo de compuestos
quimioluminiscentes incluye los compuestos
bis-arileno, incluyendo el
bis-9,9'-acridilideno y el derivado
10,10'-dimetilo del mismo descritos por Singer,
J. Org. Chem. 41: 2685 (1976), lucigenina, y
bis-9,9'-xantilidina.
Otros compuestos quimioluminiscentes que
satisfacen los requisitos mencionados más arriba pueden encontrarse
en la solicitud de patente europea nº 0.345.776, publicada el 13 de
diciembre de 1989.
Compuesto quimioluminiscente fotoquímicamente
activable (PACC): una sustancia que experimenta una reacción
química, a partir la excitación directa o sensibilizada por luz o a
partir de la reacción con oxígeno singlete, para formar una
producto de reacción metaestable que es capaz de descomponerse con
la emisión simultánea o subsiguiente de luz, habitualmente en el
rango de longitudes de onda de 250 a 1200 nm. El término
"fotoactivable" incluye "fotoquímicamente activable". Los
PACC preferidos en la presente invención son aquéllos que reaccionan
con el oxígeno singlete para formar dioxetanos o dioxetanonas.
Éstas últimas son usualmente olefinas ricas en electrones. Son
ejemplo de dichas olefinas ricas en electrones los enoléteres,
enaminas,
9-alquilideno-N-alquilacridinas,
arilviniléteres, dioxenos, arilimidazoles,
9-alquilideno-xantanos, y
lucigenina. Otros compuestos que se incluyen en el término
"PACC" incluyen el luminol, y otras ftalohidrazidas, y
compuestos quimioluminiscentes que están protegidos de sufrir una
reacción quimioluminiscente gracias a estar protegidos por un grupo
protector fotoquímicamente lábil, incluyendo dichos compuestos, por
ejemplo, la luciferina de luciérnaga, la acuaforina, el luminol,
etc.
Los PACC de interés preferiblemente emitirán con
una longitud de onda superior a los 300 nanómetros, preferiblemente
superior a 500 nanómetros, y más preferiblemente superior a 550 nm.
Los compuestos que absorben y emiten luz con longitudes de onda más
allá de la región donde los componentes de la muestra contribuyen
significativamente a la absorción de luz serán de especial uso en la
presente invención. La absorción del suero decae rápidamente por
encima de los 500 nm, y pasa a ser insignificante por encima de 600
nm; por tanto, los compuestos quimioluminiscentes emiten luz por
encima de 600 nm será de especial interés. No obstante, los
compuestos quimioluminiscentes que absorben en longitudes de onda
más cortas son útiles cuando la interferencia de absorbancia de la
muestra está ausente, o cuando se usa un fotosensibilizador que
absorbe luz con longitud de onda superior, y, acto seguido, activa
el compuesto quimioluminiscente. Los PACC de esta invención se usan
como marcas y están asociados con un miembro de un sbp.
El PACC 1 de más abajo generalmente no contiene
grupos CH o NH alílicos.
Las olefinas ricas en electrones apropiadas como
PACC de la presente invención están dentro del ámbito de los
"Compuestos Quimioluminiscentes" de la presente Sección. Los
PACC usualmente no tienen ningún átomo portador de un átomo de
hidrógeno que esté unido directamente a la olefina, a menos que el
átomo esté en una posición que no pueda acomodar un doble enlace,
tal como en una posición de cabeza de puente en un sistema anular
bicíclico pequeño. Las olefinas más preferidas son aquéllas que
generan un dioxetano que decae rápidamente a temperatura ambiente
(menos de 60 minutos, preferiblemente menos de 5 minutos,
deseablemente menos de 30 s). Los dioxetanos pueden ser
luminiscentes solos o en conjunción con un aceptor de energía
fluorescente.
Los enoléteres apropiados como PACC de la
presente invención están también dentro del ámbito "Compuesto
Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son compuestos de
enoléteres particularmente útiles aquéllos con un arilo en el mismo
carbono es que el éter, en los que el anillo arilo es sustituido por
un grupo donante de electrones en una posición que proporciona
fluorescencia. El grupo donante de electrones puede ser, por
ejemplo, m-hidroxifenil,
m-dimetilaminofenil,
1-(5-aminonaftil). pirilo,
1-(3-hidroxipirilo), antracilo, crisilo, etc. Uno o
ambos grupos en la posición 2 pueden ser arilos, en los que la
cetona formada mediante el remplazo del carbono 1 con oxígeno es
fluorescente, por ejemplo, \beta-naftilo, o
2-antrilo. Son ejemplos de enoléteres, a modo de
ilustración y no de limitación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X_{1} es H,
OC(O)CH_{3}, OCH_{3}, OH, descrito por Bronstein
et al., en la patente estadounidense nº
4.956.477;
descrito por Bronstein et
al., en la patente estadounidense nº
4.956.477;
en donde X_{2} es H, OH,
N(CH_{3})_{2}, u OCH_{3}, descrito por P.
Schaap, J. Am. Chem. Soc. 104: 3504 (1982) y P. Schaap,
Photochem and Photobiology 30: 35
(1979);
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X_{2} es como se ha
definido más arriba, X_{3} es H, OH, o
N(CH_{3})_{2}, descrito por P. Schaap, informe
para la U.S. Army Research Office, 15 de octubre de 1986, y S. D.
Gagnon, tesis doctoral, Wayne State University
(1982);
en donde X_{4} = O, S, CH_{3}N
o PhN, e Y = O, S, o CH_{3}N, y Ph = fenilo, descrito por P.
Schaap, informe para la Office of Naval Research, 17 de marzo de
1987;
descrito por P. Schaap, informe
para la U.S. Army Research, 15 de octubre de
1986.
Las enaminas apropiadas como PACC de la presente
invención también se encuentra en el ámbito "Compuesto
Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son ejemplo de
enaminas particularmente útiles, a modo de ejemplo y no de
limitación, los anteriores enoléteres 3-5 con
N(CH_{3})_{2} en lugar de OCH_{3}. Aún otro
ejemplo es
Las
9-alquilideno-N-alquilacridinas
apropiadas como PACC también se encuentran dentro del ámbito
"Compuesto Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son
particularmente útiles aquéllos de la Fórmula 7 en donde el resto
de sustituyentes sobre la olefina son fenilo, naftilo, fenantrilo,
m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi,
N-morfoleno, y pueden tomarse juntos para formar un
anillo tal como, por ejemplo, adamantilo,
N-metiacridanilida, xantanilidina,
1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno),
y similares. Son ejemplos determinados de
9-alquilideno-N-alquilacridinas
útiles como marcas en la presente invención, a modo de ilustración
y no de limitación:
descrito por Singer, J. Org.
Chem. 41: 2685
(1976);
\vskip1.000000\baselineskip
descrito por E. White, Chem.
Letters 12: 1491
(1979);
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{4} y R_{5} son
independientemente H o fenilo, descrito por Singer et al., J. Am.
Chem. Soc. 102: 3823
(1983);
descrito por McCapra, Chem.
Comm. N24, 944 (1977) y Singer, et al.,
ibid.;
descrito por McCapra,
ibid.;
descrito por McCapra,
ibid.
Las partes relevantes de las referencias
anteriores se incorporan en ésta por referencia.
Los
9-alquilideno-xantanos útiles como
PACC de la presente invención generalmente tienen la estructura:
donde los sustituyentes en la
olefina se seleccionan del grupo formado por H y sustituyentes de 1
a 50 átomos, preferiblemente fenilo, naftilo, fenantrilo,
m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi,
N-morfoleno, y pueden tomarse juntos para formar un
anillo tal como, por ejemplo, adamantilo,
N-metilacridanilido, xantanilidina,
1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno),
y similares, por ejemplo,
9-fenil-metiliden-xanteno.
Otra familia de PACC son las
2,3-dihidro-1,4-ftaloazinedionas.
El compuesto más popular es el luminol, que es el compuesto
5-amino. Otros miembros de la familia incluyen el
5-amino-6,7,8-trimetoxi
y análogo el dimetilamino[ca]benzo. Debería
destacarse que el luminol se ha usado como marca en ensayos; no
obstante, la excitación del luminol debe conseguirse químicamente,
no mediante fotoactivación como es el caso en la presente
invención. Estos compuestos son oxidados hasta las
1,4-ftaloazinidionas por el oxígeno singlete, y bajo
subsiguiente reacción c on superóxido o peróxido de hidrógeno se
descomponen con emisión de luz.
Otra familia de PACC son la
2,4,5-trifenilimidazolas, con lofina como nombre
común para el compuesto progenitor. Los análogos
quimioluminiscentes incluyen los sustituyentes
para-dimetilamino y -metoxi.
Otros PACC que satisfacen los requisitos
detallados más arriba pueden encontrarse en la solicitud de patente
europea nº 0.345.776 publicada en 13 de diciembre de 1989.
Compuesto quimioluminiscente protegido: son
aquellos PACC que tienen un grupo protector fotoremovible. Cuando
se retira el grupo protector mediante fotoactivación, el compuesto
emite luz espontáneamente o a partir de su activación con
componentes que están presentes en el medio de ensayo. Los grupos
protectores fotoremovibles incluyen, a modo de ejemplo y no de
limitación, el o-nitrobencilo, el
o-acilfeniletilo, el alquilbencilo, y similares,
habitualmente unidos a un heteroátomo del PACC. Son ejemplo de PACC
que pueden formar parte de los compuestos quimioluminiscentes
protegidos aquellas olefinas ricas en electrones mencionadas más
arriba. Son ejemplos particulares, a modo de ilustración, de
compuestos quimioluminiscentes protegidos según este aspecto de la
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de compuestos quimioluminiscentes
protegidos, cualquier reactivo necesario estará presente antes de
la fotoactivación o fotolisis. Dichos reactivos pueden incluir
enzimas y sustratos para dichos enzimas. En algunos casos, el
control del pH es lo único que se precisa. Otros agentes son
la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano silvestre, el
peróxido de hidrógeno, etc. Aquéllos especialistas en la técnica
apreciarán reactivos adicionales a partir de la selección de
cualquier compuesto quimioluminiscente protegido apropiado, guiados
por los principios anteriores. Por ejemplo, en el caso del compuesto
1 puede usarse la luciferasa de luciérnaga y su sustrato
luciferina. En el caso del compuesto 2 tan sólo es necesario
mantener un medio básico (pH > 9). En el caso de 2A,
pueden usarse el peróxido de hidrógeno y la peroxidasa de rábano
silvestre.
Materiales auxiliares: frecuentemente se
emplearán varios materiales auxiliares en el ensayo según la
presente invención. Por ejemplo, los tampones estarán normalmente
presentes en el medio de ensayo, así como los estabilizadores para
el medio de ensayo y componentes del ensayo. Frecuentemente, además
de estos aditivos, pueden incluirse proteínas tales como albúminas,
solventes orgánicos tales como formamida, sales de amonio
cuaternarias, por ejemplo, polialquilenglicoles, o similares. Cuando
el fotosensibilizador es activado químicamente en vez de mediante
irradiación, a menudo se incluirá el peróxido de hidrógeno como un
reactivo auxiliar. Cuando sea deseable desplazar la longitud de
emisión del compuesto quimioluminiscente hacia longitudes de onda
más largas, o catalizar la descomposición de su forma activada por
oxígeno, puede emplearse una molécula fluorescente.
Total o parcialmente secuencialmente: cuando la
muestra y diversos agentes utilizados en la presente invención se
combinan de forma distinta a concomitantemente (simultáneamente),
uno o más pueden combinarse con uno o más de los reactivos
restantes para formar una subcombinación. Cada subcombinación puede
entonces someterse a uno o más pasos del presente procedimiento.
Por tanto, cada una de las subcombinaciones puede incubarse en
condiciones para conseguir uno o más de los resultados deseados.
Aceptor de energía: también denominado en ésta
como aceptor de energía fluorescente. Un cromóforo que tiene un
absorción sustancial por encima de los 310 nm, normalmente por
encima de 350 nm, y preferiblemente superior a aproximadamente 400
nm. La elección del aceptor de energía también estará gobernada por
el PACC particular. El aceptor de energía debería ser capaz de
absorber luz emitida por el PACC. Preferiblemente, el máximo de
absorción del aceptor de energía debería estar en longitudes de onda
similares a la del máximo de emisión del compuesto
quimioluminiscente. Es deseable un elevado coeficiente de extinción,
habitualmente en exceso de 10, preferiblemente en exceso de
10^{3}, y particularmente preferido en exceso de 10^{4}.
Diversas moléculas diferentes útiles como
aceptor de energía son descritas por Ullman et al., I, II,
IV y V, en las columnas 8 y 9, las partes relevantes de las cuales
se incorporan en ésta por referencia. Generalmente, el aceptor de
energía es un compuesto fluorescente o emisor de fluorescencia, pero
también son útiles los aceptores de energía que tienen una muy
débil fluorescencia o no tienen.
Un grupo de emisores de fluorescencia que tienen
un cierto número de las propiedades deseables descritas más arriba
son los colorantes de xanteno, lo cual incluye las fluoresceínas
derivadas del
3,6-dihidroxi-9-fenil-xanthidrol,
y las rosaminas y rodaminas derivadas del
3,6-diamino-9-fenil-xanthidrol.
Las rodaminas y fluoresceínas tienen un grupo
9-o-carboxifenilo, y son derivados
del
9-o-carboxifenil-xanthidrol.
Estos compuestos están comercialmente
disponibles con sustituyentes en el grupo fenilo, los cuales pueden
usarse como sitio de unión o como la funcionalidad de unión. Por
ejemplo, están disponibles compuestos de fluoresceína sustituidos
con amino e isotiocianato.
Las naftilaminas son otro grupo de compuestos
fluorescentes que tienen un grupo amino en la posición alfa o beta,
habitualmente en la posición alfa. Entre los compuestos naftilamino
se incluyen el
1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato,
el
1-anilino-8-naftalensulfonato,
y el
2-p-toluidinil-6-naftalensulfonato.
Los precursores de colorantes que son activados
para reaccionar con proteínas incluyen la
3-fenil-7-isocianatocoumarina;
acridinas tales como la 9-isotiocianatoacridina;
N-(p-(2-benzoazolil)fenil)maleimida;
benzoxadiazolas tales como
la
4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola;
estilbenos tales como el
4-dimetilamino-4'-isotiocanatoestilbeno
y
4-dimetilamino-4'-maleimidoestilbeno.
Otros colorantes que pueden ser funcionalizados aún más para
combinar con un miembro de un sbp incluyen el naranja de acridina,
el
7-(p-metoxibenzilamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola;
la N,N'-dioctabeciloxacarbocianina
p-toluensulfonato; pirenos tales como el ácido
8-hidroxi-1,3,6-pirenetrisulfónico,
y el ácido 1-pirenebutírico, la merocianina 540, el
"rose bengal", así como otras moléculas fluorescentes que
pueden conseguirse
fácilmente.
Para ensayos de polinucleótidos pueden usarse
una amplia variedad de aceptores de energía, pero se prefieren
aquéllos que tienen fluorescencia potenciada cuando se unen a ácidos
nucleicos de doble hebra. Los colorantes que se intercalan tales
como bromuro de etidio y naranja de acridina son ejemplos típicos.
Un derivado del rutenio desarrollado por Barton (J. Am. Chem.
Soc. (1990) 112: 4960) es particularmente atractivo debido a
que es activado dramáticamente cuando se intercala.
Alternativamente, el aceptor de energía puede unirse a una segunda
sonda de polinucleótidos que puede unirse cerca de la sonda marcada
con compuesto quimioluminiscente, o el aceptor de energía puede no
estar unido y dispersase libremente en solución.
Los aceptores de energía que no son
fluorescentes pueden incluir cualquiera de una amplia variedad de
colorantes azo, colorantes cianino,
4,5-dimetoxifluoresceína, formazanos, indofenoles, y
similares.
Un procedimiento al cual puede aplicarse la
presente invención es un procedimiento para determinar un analito.
El procedimiento comprende tratar un medio sospechoso de contener un
analito con condiciones tales que el analito, si está presente,
afecta la cantidad de un fotosensibilizador y un compuesto
quimioluminiscente que puede ponerse en estrecha proximidad, en
donde el oxígeno singlete de corta vida generado por el
fotosensibilizador puede reaccionar con el compuesto
quimioluminiscente antes de su decaimiento espontáneo. El
procedimiento comprende además medir la intensidad de luminiscencia
producida por el compuesto quimioluminiscente. La intensidad de
luminiscencia producida está relacionada con la cantidad de analito
en el medio. El compuesto quimioluminiscente es capaz de activación
por parte del oxígeno singlete, y el fotosensibilizador cataliza la
formación de oxígeno singlete, habitualmente en respuesta a la
fotoexcitación seguida por transferencia de energía al oxígeno
molecular. A menudo, la superficie se llevará a una estrecha
proximidad con el fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente, en donde la superficie será preferiblemente la
superficie de partículas que pueden suspenderse. El producto
formado por la activación del compuesto quimioluminiscente se
descompone, preferiblemente de forma espontánea, con emisión de
luz.
El procedimiento se basa en un analito que causa
o inhibe que las moléculas del fotosensibilizador y del compuesto
quimioluminiscente estén más próximas entre ellas que la distancia
promedio en el conjunto de la solución del medio de ensayo. Este
repartición dependerá de la cantidad de analito presente en la
muestra a analizar. Las moléculas de fotosensibilizador que no
pasan a estar asociadas con el compuesto quimioluminiscente
producen oxígeno singlete que es incapaz de alcanzar el compuesto
quimioluminiscente antes de decaer en el medio acuoso. No obstante,
cuando el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pasan
a estar en estrecha proximidad entre ellos en respuesta a la
cantidad de analito, el oxígeno singlete producido a partir de la
irradiación del fotosensibilizador puede activar el compuesto
quimioluminiscente antes de decaer. Debido a que numerosas
moléculas de compuesto quimioluminiscente y/o moléculas de
fotosensibilizador pueden asociarse con una superficie, y debido a
que la difusión está restringida en una superficie, la presencia de
una superficie en conjunción con el fotosensibilizador y el
compuesto quimioluminiscente puede incrementar la eficiencia del, o
la acción del, oxígeno singlete con el compuesto quimioluminiscente
antes de su decaimiento. El uso de una superficie que se lleva a la
proximidad del compuesto quimioluminiscente y del fotosensibilizador
en función de la presencia de analitos es, por tanto, preferida. El
ensayo sujeto proporciona un procedimiento conveniente para
detectar y medir una amplia variedad de analitos de manera simple,
eficiente y reproducible, que puede emplear un equipamiento sencillo
para medir la cantidad de luz producida durante la reacción.
La cantidad de fotosensibilizador que pasa a
estar en estrecha proximidad del compuesto quimioluminiscente se ve
afectada por la presencia de analito en virtud a que el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están cada uno
asociado con un miembro de un sbp. Esto puede conseguirse en un
cierto número de formas, y el término "asociado con" se define
por ello. El fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente
pueden contener funcionalidades para su anclaje covalente al
miembro de un sbp o a los miembros de un sbp, o grupos capaces de
unirse a miembros de un sbp, pueden contener funcionalidades para su
anclaje al fotosensibilizador y/o compuesto quimioluminiscente. El
anclaje puede conseguirse mediante enlace directo entre las dos
moléculas, o puede emplearse un grupo de engarce entre un miembro
de un sbp y el fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente.
En otra realización uno de ellos o ambos, el fotosensibilizador y el
compuesto quimioluminiscente, pueden unirse a superficies o
incorporarse en partículas, a la que también están unidos los
miembros de un sbp. En ambos casos, cada uno de los miembros de un
sbp es capaz de unirse directa o indirectamente al analito o a un
componente del ensayo cuyas concentraciones se ven afectadas por la
presencia del analito. El fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente pueden incorporarse dentro de partículas gracias
a que son solubles en, al menos, una fase de las partículas, en
cuyo caso el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente
estarán en concentraciones mucho más elevadas dentro de la partícula
que en el conjunto del medio de ensayo. Cuando el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están unidos
covalentemente a partículas, el fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente o las partículas, o componentes de las mismas,
son funcionalizados para proporcionar un medio para anclar el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente y las
partículas. Para partículas que son gotas de aceite o liposomas, el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden unirse
a una o más cadenas hidrocarbonadas largas, teniendo generalmente
cada una al menos 10 a 30 átomos de carbono. Si las partículas son
gotas de un fluorocarburo, el fotosensibilizador o el compuesto
quimioluminiscente incorporado en estas partículas puede estar
fluorado para mejorar su solubilidad y reducir el intercambio
dentro de otras partículas unidas con la otra marca, y la cadena de
hidrocarburo usada para el engarce se remplazará preferiblemente
por una cadena de fluorocarburo. Para partículas fluidas de
silicona, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente
pueden unirse a un polisiloxano. Con objeto de maximizar el número
de moléculas de fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente
por partícula, usualmente será deseable minimizar la carga y
polaridad del fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente, de
forma que resida dentro de la parte no acuosa de la partícula.
Cuando la partícula es un liposoma y se desea retener el
fotosensibilizador o el compuesto quimioluminiscente en la fase
acuosa del fotosensibilizador, se preferirá el uso de
fotosensibilizadores o compuestos quimioluminiscentes que son muy
polares o están muy cargados.
No importa como están unidos el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, es crítico que
ningún compuesto sea capaz de disociarse de su miembro de un sbp, y
pase a asociarse con el miembro de un sbp unido al otro miembro del
par fotosensibilizador y compuesto quimioluminiscente durante el
curso del ensayo. Por tanto, la disociación de estos compuestos de
sus respectivos miembros de un sbp será lenta en relación con el
tiempo requerido para el ensayo.
El compuesto quimioluminiscente puede estar
unido a un miembro de un sbp que es capaz de unirse directa o
indirectamente al analito o a un componente del ensayo, y cuya
concentración se ve afectada por la presencia del analito. El
término "capaz de unirse directa o indirectamente" significa
que la entidad designada puede unirse específicamente a la entidad
(directamente), o puede unirse específicamente a un miembro de un
par de unión específica, o a un complejo de dos o más miembros de
un sbp, que son capaces de unirse a la otra entidad
(indirectamente). La superficie tiene generalmente un miembro de un
sbp unido sobre sí. Preferiblemente, el compuesto
quimioluminiscente está asociado con la superficie, habitualmente
dentro de una partícula que puede suspenderse. Este miembro de un
sbp es generalmente capaz de unirse directamente o indirectamente al
analito o a un receptor del analito. Cuando los miembros de un sbp
asociados con el fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente son ambos capaces de unir el analito, resulta un
protocolo de ensayo en "sandwich". Cuando uno de los miembros
de un sbp asociado con el fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente puede unir ambos el analito y un análogo del
analito, resulta un protocolo de ensayo competitivo. El anclaje a
una superficie o la incorporación en una partícula del compuesto
quimioluminiscente es gobernado generalmente por el mismo principio
descrito más arriba para el anclaje del fotosensibilizador a, o su
incorporación dentro de, una partícula.
Habitualmente se causa que el fotosensibilizador
active el compuesto quimioluminiscente mediante la irradiación del
medio que contiene los reactivos anteriores. El medio debe
irradiarse con luz que tenga una longitud de onda con energía
suficiente para convertir el fotosensibilizador a un estado
excitado, y, por tanto, para hacerlo capaz de activar el oxígeno
molecular a oxígeno singlete. El estado excitado para el
fotosensibilizador capaz de excitar el oxígeno molecular es
generalmente un estado triplete, el cual es más de aproximadamente
20, habitualmente al menos 23 kcal/mol más energético que el estado
fundamental del fotosensibilizador. Preferiblemente, el medio se
irradia con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente
450 a 950 nm, aunque pueden usarse longitudes de onda más cortas,
por ejemplo, 230-950 nm. La luminiscencia producida
puede medirse de cualquier forma conveniente, tal como
fotográficamente, visualmente, o fotométricamente, para determinar
la cantidad de la misma, la cual se relaciona con la cantidad de
analito en el medio.
Aunque habitualmente será preferible excitar el
fotosensibilizador mediante irradiación con luz de una longitud de
onda que sea eficientemente absorbida por el fotosensibilizador,
pueden emplearse otros medios de excitación como, por ejemplo,
mediante transferencia de energía desde un estado excitado de un
donante de energía tal como un segundo fotosensibilizador. Cuando
se usa un segundo fotosensibilizador, pueden usarse longitudes de
onda que son absorbidas ineficientemente por el fotosensibilizador
pero absorbida eficientemente por el segundo fotosensibilizador. El
segundo fotosensibilizador puede estar unido a un componente del
ensayo que está asociado, o pasa a estar asociado, con el primer
fotosensibilizador, por ejemplo, unido a una superficie o
incorporarse en la partícula que tiene el primer fotosensibilizador.
Cuando se emplea un segundo fotosensibilizador, éste tendrá
habitualmente un estado triplete de mínima energía a un nivel de
energía superior al estado triplete de mínima energía del primer
fotosensibilizador.
La línea de emisión a 632,6 nm del láser de
helio-neón es una fuente de luz barata para
excitación. Los fotosensibilizadores con un máximo de absorción en
la región de aproximadamente 620 a aproximadamente 650 nm son
compatibles con la línea de emisión de un láser de
helio-neón y son, por tanto, particularmente útiles
en la presente invención.
Otro aspecto es un procedimiento para determinar
un analito, el cual comprende: (a) proporcionar en combinación (1)
un medio sospechoso de contener analito, (2) un fotosensibilizador
capaz, en su estado excitado, de activar oxígeno a un estado
singlete, estando asociado el fotosensibilizador a un miembro de un
sbp, y (3) una partícula que puede suspenderse que comprende un
compuesto quimioluminiscente, en donde la partícula tiene un
miembro de un sbp unido a ella, (b) tratar la combinación con luz
para excitar el fotosensibilizador, y (c) examinar la combinación a
partir de la cantidad de luz emitida a partir de la misma. La
cantidad de luminiscencia emitida está relacionada con la cantidad
de analito en el medio. El compuesto quimioluminiscente se
incorpora en una partícula que puede suspenderse, y el miembro de un
sbp se une a la partícula. El fotosensibilizador se incorpora en
una segunda partícula que puede suspenderse, la cual tiene un
miembro de un sbp unido a ella.
Las composiciones de la invención pueden
adaptarse a la mayoría de análisis que implican miembros de un sbp,
tales como ligando-receptor: por ejemplo, reacciones
antígeno-anticuerpo; ensayos de unión de
polinucleótidos, y demás. Los ensayos pueden ser homogéneos o
heterogéneos, competitivos o no competitivos. Los componentes del
ensayo, compuesto quimioluminiscente y fotosensibilizador, pueden
utilizarse en un cierto número de formas con (1) una superficie,
cuando se emplee, (2) ácido nucleico o receptor, y (3) ácido
nucleico o ligando. La asociación puede implicar enlaces covalentes
o no covalentes. Aquéllos especializados en la técnica serán
capaces de escoger asociaciones apropiadas dependiendo del ensayo
particular deseado, en vista de la discusión ilustrativa precedente
y siguiente.
En una estrategia de ensayo homogéneo, la
muestra sería tratada previamente, si es necesario, para suprimir
materiales no deseados. La reacción para un tipo de ensayo en
"sandwich" no competitivo puede implicar un miembro de un sbp,
(por ejemplo, un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, un
receptor o ligando) complementario al analito y asociado con un
compuesto quimioluminiscente; un fotosensibilizador asociado con un
miembro de un sbp, (por ejemplo, anticuerpo, sonda de ácido
nucleico, receptor o ligando) que es también complementario del
analito; la muestra de interés; y cualquier reactivo auxiliar
requerido. Preferiblemente, uno o ambos, el fotosensibilizador y el
compuesto quimioluminiscente se incorporan en partículas a las
cuales se anclan los otros miembros de un sbp. En un protocolo
competitivo, un miembro del sbp puede derivarse del analito, y el
otro miembro del sbp puede ser complementaria del analito, por
ejemplo, un anticuerpo. En cualquier protocolo los componentes
pueden combinarse bien simultáneamente o total o parcialmente de
forma secuencial. La capacidad del oxígeno singlete producido por
un fotosensibilizador activado para reaccionar con el compuesto
quimioluminiscente está gobernada por la unión de un miembro de un
sbp al analito. Por tanto, la presencia o la cantidad de analito
puede determinarse midiendo la cantidad de luz emitida a partir de
la activación del fotosensibilizador mediante irradiación,
calentamiento, o adición de un reactivo químico, preferiblemente
mediante irradiación. Ambas, la reacción de unión y la detección
del alcance de la misma pueden llevarse a cabo en una solución
homogénea sin separación. Esto es una ventaja de la presente
invención con respecto a procedimientos previos de la técnica que
usaban la quimioluminiscencia.
En una estrategia de ensayo heterogéneo, los
componentes del ensayo incluyen una muestra sospechosa de contener
un analito que es un miembro de un sbp; un miembro de un sbp unido a
un soporte, que puede ser una superficie no dispersable o una
partícula que tiene asociado consigo un miembro de un grupo formado
por un compuesto quimioluminiscente y el fotosensibilizador; y un
miembro de un sbp que tiene el otro miembro del grupo asociado con
él, en donde los miembros del sbp pueden unir independientemente,
bien directa o indirectamente, el analito o un receptor para el
analito. Estos componentes se combinan generalmente bien
simultáneamente, o total o parcialmente de forma secuencial. La
superficie o partículas pueden entonces separarse de la fase
líquida, y bien la fase separada o la fase líquida se somete a
condiciones para activar el fotosensibilizador, usualmente
irradiando la fase determinada en cuestión, y midiendo la cantidad
de luz emitida.
Las reacciones de unión en un ensayo para el
analito normalmente se llevarán a cabo en un medio acuoso a un
pH moderado, generalmente aquél que proporciona una
sensibilidad del ensayo óptima. Preferiblemente, la activación del
fotosensibilizador también se llevará a cabo en medio acuoso. No
obstante, cuando se emplea un paso de separación, pueden usarse
medios no acuosos, tales como, por ejemplo, acetonitrilo, acetona,
tolueno, benzonitrilo, etc., y medios acuosos con valores de
pH que son muy elevados, es decir, superiores de 10,0, o muy
bajos, es decir, inferiores a 4,0, habitualmente muy elevados. Tal
como se ha explicado más arriba, el ensayo puede realizarse bien
sin separación (homogéneo) o con separación (heterogéneo) de
cualquiera de los componentes o productos del ensayo.
El medio acuoso puede ser solamente agua, o
puede incluir desde un 0,01 hasta un 80 por ciento de volumen de un
cosolvente, pero habitualmente incluirá menos del 40% de un
cosolvente cuando se use un miembro de un sbp que sea una proteína.
El pH para el medio de la reacción de unión estará usualmente
en el rango de aproximadamente 4 a 11, más habitualmente en el
rango de aproximadamente 5 a 10, y preferiblemente en el rango de
aproximadamente 6,5 a 9,5. Cuando el pH no se cambia durante
la generación del oxígeno singlete, el pH será habitualmente
un compromiso entre el óptimo de unión de los miembros unidores y el
pH óptimo para la producción de señal y la estabilidad de
los otros reactivos del ensayo. Cuando se precisan pH
elevados para la producción de señal, puede insertarse un paso, que
implique la adición de un reactivo alcalino, entre la reacción de
unión y la generación de oxígeno singlete y/o producción de señal.
Habitualmente, el pH elevado será superior a 10,
habitualmente 10-14. Tal como se menciona más
arriba, para ensayos heterogéneos también pueden usarse solventes
no acuosos, siendo la principal consideración que el solvente no
reaccione eficientemente con el oxígeno singlete.
Pueden usarse varios tampones para conseguir el
pH deseado y mantener el pH durante un ensayo. Los
tampones ilustrativos incluyen el borato, fosfato, carbonato, tris,
barbital, y similares. El tampón concreto empleado no es crítico
para esta invención, pero en un ensayo individual puede preferirse
uno u otro tampón.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas
para llevar a cabo las reacciones de unión de ligandos y receptores
proteicos en el ensayo, y usualmente una temperatura constante,
preferiblemente, 25ºC a 40ºC, durante el período de medición. Las
temperaturas de incubación para la reacción de unión normalmente
oscilarán desde aproximadamente 5ºC hasta 45ºC, usualmente desde
aproximadamente 15ºC hasta 40ºC, más habitualmente 25ºC hasta 40ºC.
Cuando durante el ensayo ocurre la unión de ácidos nucleicos,
frecuentemente se usarán temperaturas más elevadas, habitualmente
20ºC a 90ºC, más habitualmente 35ºC a 75ºC. Las temperaturas durante
las mediciones, es decir, generación del oxígeno singlete y
detección de luz, generalmente oscilarán desde aproximadamente 20ºC
hasta 100ºC, más habitualmente desde 25ºC hasta 50ºC, más usualmente
25ºC hasta 40ºC.
La concentración de analito que puede ensayarse
generalmente variará desde aproximadamente 10^{-4} hasta inferior
a 10^{-16} M, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6}
hasta 10^{-14}. Las consideraciones como si el ensayo es
cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de
detección concreta, la concentración del analito de interés, y los
tiempos de incubación máximos deseados, normalmente determinarán las
concentraciones de los diversos reactivos.
En ensayos competitivos, mientras que las
concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo
estarán generalmente determinadas por el rango de concentraciones de
interés del analito, la concentración final de cada uno de los
reactivos normalmente se determinará empíricamente para optimizar la
sensibilidad del ensayo en el rango. Esto es, una variación en la
concentración del analito que sea significativa debería
proporcionar una diferencia de señal medible con precisión.
La concentración de los miembros de un sbp
dependerá de la concentración de analito, la velocidad de unión
deseada, y el grado con que los miembros del sbp se unen no
específicamente. Habitualmente, los miembros de un sbp estarán
presentes en, al menos, la concentración de analito más baja
esperada, preferiblemente al menos la concentración de analito más
elevada esperada, y para ensayos no competitivos las concentraciones
pueden ser 10 a 10^{6} veces la concentración de analito más
elevada, pero serán habitualmente inferiores a 10^{-4} M,
preferiblemente menos de 10^{-6} M, frecuentemente entre
10^{-11} y 10^{-7} M. La cantidad de fotosensibilizador o
compuesto quimioluminiscente asociado con un miembro de un sbp
generalmente será de al menos una molécula por miembro de sbp, y
puede ser tan elevada como 10^{5}, habitualmente al menos
10-10^{4}, cuando la molécula de
fotosensibilizador o quimioluminiscente se incorpora en una
partícula.
Mientras que el orden de adición puede variar
ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la
naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple es añadir los
materiales simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden
combinarse total o parcialmente de forma secuencial. Cuando el
ensayo es competitivo, a menudo será deseable añadir el análogo del
analito después de combinar la muestra y un miembro de un sbp capaz
de unir el analito. Opcionalmente, puede implicarse un paso de
incubación después de que los reactivos sean combinados,
generalmente oscilando desde aproximadamente 30 segundos hasta 6
horas, más habitualmente desde aproximadamente 2 minutos hasta 1
hora antes de que se provoque que el sensibilizador genere el
oxígeno singlete y se mida la emisión de luz.
En un orden de adición particularmente
preferido, un primer conjunto de miembros de un sbp que son
complementarios de y/o homólogos del analito se combina con el
analito, seguido por la adición de miembros del par de unión
específico complementarios de los primeros miembros del par de unión
específico, cada uno asociado con un miembro diferente del grupo
formado por un fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente.
A continuación, la mezcla de ensayo, o un componente de la misma
separado, es irradiada y se mide la emisión de luz.
En un ensayo homogéneo, después de que todos los
reactivos hayan sido combinados, éstos pueden incubarse, si se
desea. A continuación, se irradia la combinación y se mide la
emisión de luz resultante. La luz emitida está relacionada con la
cantidad de analito en la muestra ensayada. Las cantidades de los
reactivos de la invención empleados en un ensayo homogéneo dependen
de la naturaleza del analito. Generalmente, los ensayos homogéneos
de la presente invención exhiben una sensibilidad incrementada
frente a ensayos conocidos como el ensayo EMIT®. Esta ventaja
resulta primordialmente de la relación señal-ruido
mejorada obtenida con el presente procedimiento.
Los siguientes ensayos se proporcionan a modo de
ilustración y no de limitación, para permitir que un especialista
en la técnica aprecie el alcance de la presente invención, y ponga
en práctica la invención sin experimentación indebida. Se apreciará
que la elección de analitos, fotosensibilizadores, compuestos
quimioluminiscentes, superficies, partículas y condiciones de
reacción será sugerente para aquéllos especialistas en la técnica
en vista de los descubrimientos en ésta, en los ejemplos que
siguen.
En un procedimiento, no incluido en el ámbito de
la invención, el compuesto quimioluminiscente
9-benzal-10-metilacridina
se une covalentemente a un anticuerpo contra la hormona
estimuladora de la tiroides (TSH) (Reactivo 1). La
9-benzal-10-metilacridina,
funcionalizada con un N-hidroxisuccinimidiléster de
un grupo carboxilo anclado al anillo de fenilo, reacciona con los
grupos amino del anticuerpo. El grupo de engarce es un carboxamida.
El fotosensibilizador utilizado es el "rose bengal", el cual
está unido covalentemente a partículas de látex que tienen una
dimensión promedio de 0,5 micrómetros. Las partículas de látex y el
"rose bengal" están unidos covalentemente entre ellos, a
través de grupos clorometilo sobre el látex, para proporcionar un
grupo de engarce éster tal como se describe en J. Am. Chem.
Soc. 97: 3741 (1975). La partícula de látex está además
engarzada a un segundo anticuerpo contra la TSH a través de grupos
N-hidroxisuccinimidiléster sobre el látex (Reactivo
2). Ambos anticuerpos empleados son anticuerpos monoclonales
preparados mediante tecnología estándar de líneas celulares
híbridas. Un anticuerpo reconoce la subunidad \alpha de la TSH, y
el otro reconoce la subunidad \beta de la TSH. Al realizar el
ensayo se obtiene de un paciente una muestra sospechosa de contener
TSH. Quince microlitros de la muestra se combinan con 500 ml de
medio acuoso, tamponado con tampón Tris a pH 8,0, con los
anteriores Reactivo 1 y Reactivo 2. Las cantidades de Reactivo 1 y
Reactivo 2 son suficientes para proporcionar concentraciones de
cada anticuerpo de aproximadamente 10^{-6} molar. A continuación
se incuba la mezcla de reacción durante un período de una hora a
25ºC, y entonces se irradia durante 30 segundos con luz a 560 nm.
Se mide la intensidad de luz emitida a partir de la irradiación, y
la energía luminosa total detectada durante un período de 30
segundos se compara con los valores obtenidos, en un procedimiento
similar, con muestras con concentraciones conocidas de TSH, para
determinar la concentración de TSH en la muestra desconocida.
Alternativamente, a continuación de la incubación, se separan las
partículas de látex del medio y se colocan en un medio acuoso
tamponado a pH 9,5, se irradian de forma similar, y la
cantidad de luz emitida a partir del sistema se mide como
antes.
En un alternativa basada en la anterior, el
Reactivo 2 es "rose bengal" unido covalentemente al segundo
anticuerpo, y no se emplea ninguna partícula de látex.
En aún otra estrategia alternativa basada en la
anterior, el Reactivo 2 es "rose bengal" unido covalentemente
al segundo anticuerpo, y el Reactivo 1 es
9-benzal-10-metilacridina
unida covalentemente a las partículas de látex, a las que está
unido covalentemente el primer anticuerpo. En todavía otra
alternativa basada en la anterior, el Reactivo 1 es tal como se ha
descrito inmediatamente más arriba, el Reactivo 2 es "rose
bengal" unido covalentemente a partículas de látex, a las que
está unida covalentemente la avidina, y se emplea un tercer
reactivo (Reactivo 2A), que es el segundo anticuerpo unido
covalentemente a la biotina. El Reactivo 1 y el tercer reactivo se
combinan con la muestra y se incuban. Entonces se añade un exceso de
Reactivo 2, y el resto de procedimiento es tal como se ha descrito
más arriba.
En otra alternativa basada en la anterior, una
cloroperoxidasa sustituye al "rose bengal". En este ensayo, el
paso de irradiación es remplazado por la adición de bromuro de sodio
y peróxido de hidrógeno para producir oxígeno singlete. La luz
emitida se mide tal como se ha descrito más arriba.
En otra realización según la presente invención,
un primer conjunto de gotas de aceite (Reactivo 3) se prepara a
partir de una solución del fotosensibilizador y clorofila en aceite
mineral, según Giaever et al., ver más arriba. Las gotas de
aceite, que oscilan entre 0,1 y 2 micrómetros de diámetro, se
funcionalizan y engarzan a un anticuerpo monoclonal contra la
gonadotropina crónica humana (HCG). La clorofila es lipofílica y,
por tanto, se disuelve de forma irreversible en la gota de aceite
lipofílica. Se prepara un segundo conjunto de gotas de aceite
(Reactivo 4) de forma similar. En este conjunto de gotas las gotas
de aceite se engarzan covalentemente a un segundo anticuerpo
monoclonal contra la HCG, el cual reconoce una parte de la molécula
de HCG diferente de la reconocida por el primer anticuerpo
monoclonal mencionado más arriba. La
9-(difenilmetilidino)-N-metilacridina
se disuelve irreversiblemente en la gota de aceite lipofílica
mediante la inclusión de un grupo
N,N-didocecilcarboxamida unido a uno de los grupos
fenilo de la acridina. Los anticuerpos monoclonales se preparan
mediante tecnología estándar de línea celular híbrida. Se combina
una muestra de orina sospechosa de contener HCG (50 microlitros)
con un cantidades en exceso de Reactivo 3 y Reactivo 4 en un medio
acuoso tamponado (500 \mul) a pH 7,5. Se incuba el medio a
25ºC durante un período de 20 minutos. El medio, sin separación, se
irradia a 633 nm usando un láser de He/Ne durante un período de un
minuto, y la luz emitida se mide como se ha descrito más arriba. La
cantidad de luz se compara con la cantidad emitida por muestras que
contienen cantidades conocidas de HCG, y la cantidad de HCG en la
muestra se determina comparando los valores. De esta forma se
realiza un inmunoensayo para HCG homogéneo, sensible y
conveniente.
En una estrategia alternativa basada en la
anterior, el Reactivo 3 tiene un anticuerpo contra la fluoresceína
en lugar del anticuerpo contra la HCG, y un reactivo adicional
(Reactivo 3A) tiene el anticuerpo contra la HGC unido
covalentemente a la fluoresceína. El Reactivo 4 tiene avidina en
lugar del segundo anticuerpo contra la HCG, y un cuarto reactivo
(Reactivo 4A) tiene el segundo anticuerpo unido covalentemente a
biotina. En el ensayo se combinan el Reactivo 4A y el Reactivo 3A
con la muestra y se incuban. A continuación, se añaden los
Reactivos 3 y 4 y se incuban. Entonces se lleva a cabo el resto del
anterior procedimiento de ensayo.
En otro procedimiento que no se halla dentro del
ámbito de la presente invención, se forma un conjunto de liposomas
conjunto de liposomas (Reactivo 5) (0,2 micrómetros de diámetro)
mediante extrusión a presión elevada de una suspensión de
fosfolípidos, en un tampón a pH 7,4, a través de una membrana
con poros de 0,2 micrómetros, usando un instrumento diseñado con
éste propósito y comercialmente disponible. Un análogo de la
tiroxina se une covalentemente al liposoma, formando primero grupos
mercaptoacetamida sobre el liposoma mediante reacción de la
fosfatidiletanolamina en el liposoma con un éster activo de
metilcarboximetildisulfuro seguido por reacción con ditioeritritol.
A continuación se deja reaccionar la
bromoacetil-tiroxina con los liposomas
sulfhidrilatados. Se disuelve un colorante de metaloporfirina en la
parte lipofílica del liposoma. Otro conjunto de liposomas (Reactivo
6) se utiliza para unir un anticuerpo monoclonal contra la tiroxina.
El anticuerpo se une covalentemente por medios similares a los
empleados en la unión de la tiroxina. Se une covalentemente una
enamina (2-dimetilaminometilenepirano), a través de
un grupo de engarce carboxamida, a la superficie del liposoma. El
Reactivo 5 y el Reactivo 6 se combinan en un medio de ensayo acuoso
tamponado (500 \mul) a pH 8,0, junto con una muestra de
suero sospechosa de contener tiroxina, la cual contiene ácido
anilinonaftalenosulfónico para desplazar la tiroxina de las
proteínas unidoras (50 microlitros), y aceptar energía procedente
del pirano activado por oxígeno para proporcionar la emisión con
longitud de onda larga. Entonces se incuba el medio de ensayo a
temperatura ambiente durante 1 hora. Se irradia el medio, sin un
paso de separación, a 650 nm durante un período de 1 minuto, y la
luz emitida resultante se mide con un luminómetro. El valor
obtenido se compara con valores obtenidos realizando un ensayo
similar con cantidades conocidas de tiroxina. De esta forma se
cuantifica la cantidad de tiroxina en la muestra de suero.
En una estrategia alternativa basada en la
anterior, el Reactivo 6 tiene avidina en vez del anticuerpo contra
la tiroxina. Un reactivo adicional (Reactivo 6A) tiene un anticuerpo
contra la tiroxina unido covalentemente a la biotina. El Reactivo 5
tiene un anticuerpo contra la fluoresceína en vez de la tiroxina, y
un reactivo adicional (Reactivo 5A) tiene la tiroxina unido
covalentemente a la fluoresceína. En el ensayo se combinan los
Reactivos 5A y 6A con la muestra y se incuban. A continuación, se
añaden los Reactivos 5 y 6, se incuba la mezcla, y se sigue el
resto del procedimiento de ensayo.
En otra alternativa basada en la anterior, el
colorante de metaloporfirina se remplaza con molibdato potásico que
se incorpora en la fase acuosa de los liposomas. En este ensayo, el
paso de irradiación se remplaza por la adición de peróxido de
hidrógeno para producir oxígeno singlete. La luz emitida se mide tal
como se ha descrito más
arriba.
arriba.
En otro procedimiento, tampoco abarcado por la
invención, se forma
2-hidroxietil-9,10-dibromoantraceno
en un cristalito de colorante, de forma similar a la descrita por
Gribnau. Se une un anticuerpo monoclonal, que reconoce el antígeno
de superficie de la hepatitis B, al cristalito de colorante mediante
un grupo de engarce carbamato. Se trata una partícula de látex para
inmovilizar un segundo anticuerpo contra el antígeno de superficie
de la hepatitis B mediante un anclaje covalente. Además, la
partícula de látex se une covalentemente a
9-(benzal-9H-xanteno) a través de un
grupo de engarce amida. El cristalito de colorante tiene un tamaño
de partícula de un promedio de 2 micrómetros, y las partículas de
látex tienen un diámetro promedio de 0,2 micrómetros. Los
anticuerpos monoclonales se preparan mediante tecnología estándar de
línea celular híbrida. Se combina una muestra de suero, de un
paciente sospechoso de padecer la hepatitis (50 \mul), en un medio
de ensayo acuoso (500 \mul) a pH 7,0 con un exceso del
cristalito de colorante y partículas de látex descritas más arriba.
Entonces se incuba el medio de ensayo a temperatura ambiente durante
un período de 30 minutos, y, a continuación, se irradia a 350 nm
con una fuente de luz de xenón durante un período de 1 minuto. La
presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B en la
muestra causa que el cristalito de colorante y las partículas de
látex pasen a estar en estrecha proximidad gracias a la unión inmune
de los respectivos anticuerpos con el antígeno. A partir de la
irradiación del medio, el 9,10-dibromoantraceno se
excita y convierte el oxígeno molecular a oxígeno singlete. El
oxígeno singlete reacciona con el xanteno para rendir dioxetano, el
cual decae espontáneamente a temperatura ambiente para producir
luz. La luz se mide fotométricamente, y la cantidad de luz por
encima de cierto nivel umbral indica la presencia de antígeno de
superficie de la hepatitis B en la muestra. La irradiación del
medio se realiza a temperatura ambiente, y el ensayo se lleva a cabo
de manera homogénea para obtener un ensayo del antígeno de
superficie de la hepatitis B.
Preferiblemente, en este ensayo el
Eu(TTA)_{3} se disuelve en las partículas de látex
para causar que el derivado del xanteno excitado transfiera su
energía al Eu(TTA)_{3}, el cual emite por encima de
600 nm. Esto evita la interferencia del suero que, de otra forma,
sucedería debido a la absorción, por parte de componentes del
suero, de la luz emitida directamente a partir de la luminiscencia
del xanteno.
En otro procedimiento, no abarcado por la
invención, el ensayo sirve para la determinación de un determinado
antígeno de grupo sanguíneo sobre la superficie de hematíes, en
concreto, un antígeno de grupo A. Se utilizan las partículas de
látex, preparadas tal como se ha descrito más arriba, que tienen un
tamaño de partícula de 150-500 nm. Las partículas
de látex tienen un anticuerpo contra el antígeno de grupo A
covalentemente anclado sobre la partícula de látex. Las partículas
también tienen el enoléter
2-p-dimetilaminofenil-3-fenil-5,6-dihidrodioxeno
disuelto en el látex. Este reactivo de partículas de látex se
combina en el medio acuoso (500 \mul) con sangre entera (100
\mul) y 1 \times 10^{4} M de fotosensibilizador, el cual es un
fotosensibilizador hidrofóbico, en concreto, el ácido
fenazina-2-carboxílico. El colorante
hidrofóbico se intercala dentro de los hematíes presentes en la
muestra. El medio se incuba a 25ºC durante un período de 10 minutos,
y a continuación se irradia a 400-450 nm con una
fuente de tungsteno durante un período de 30 segundos. La luz
emitida por el medio se mide y se compara con la cantidad de luz
obtenida en muestras que se sabe carecen de hematíes con el
antígeno del grupo A. Por tanto, la cantidad de luz por encima de un
nivel umbral indica la presencia del antígeno de grupo sanguíneo
A.
En otro procedimiento, que tampoco ilustra la
presente invención, el analito es un antígeno HLA sobre la
superficie de una célula. Una muestra (50 \mul) sospechosa de
contener el antígeno HLA se combina en un medio de ensayo acuoso
(500 \mul) tamponado a pH 7,4. Al medio también se le añade
una cantidad en exceso de un reactivo que es un anticuerpo contra
el antígeno HLA covalentemente unido a eosina a través de un grupo
de engarce tioéter. También se añade un compuesto quimioluminiscente
al medio de ensayo. El compuesto quimioluminiscente se escoge de
forma que se intercale dentro de la célula que contenga el antígeno
HLA. El compuesto quimioluminiscente es una acridina, en concreto
la
9-(dodecilfenilmetilidino-1)-N-(2-sulfonoxietil)acridina.
El medio de ensayo se incuba a temperatura ambiente durante un
período de 1 hora, y a continuación se irradia a
500-550 nm con una fuente de luz de
tungsteno-halógena durante un período de 1 minuto.
La luz emitida por el medio de ensayo se mide, y la cantidad de luz
por encima de un nivel umbral es indicativa de la presencia del
antígeno HLA.
La presente invención abarca además
composiciones que comprenden una partícula que puede suspenderse,
de 0,04 a 4000 nanómetros de diámetro promedio, la cual incluye un
compuesto quimioluminiscente. El compuesto quimioluminiscente puede
estar unido covalentemente a la matriz de la partícula, o puede
estar disuelto en la matriz, o disuelto en un solvente que se
disuelve en la matriz. Las partículas serán preferentemente
poliméricas, o serán gotas de aceite, o vesículas tales como
liposomas. Cuando la partícula es un liposoma, el compuesto
quimioluminiscente estará asociado con la bicapa lipídica, o
disuelto en el interior acuoso del liposoma. La partícula tendrá un
miembro de un sbp unido sobre sí. Preferiblemente, las partículas
unidas a un sbp serán de 100 a 1000 mm de diámetro promedio.
También se abarcan composiciones de dos miembros de un sbp
complementarios unidos entre ellos, en donde uno está asociado con
un fotosensibilizador y el otro está asociado con un compuesto
quimioluminiscente.
Otro procedimiento, que no ilustra la presente
invención, proporciona una combinación que comprende (1) un medio
que se sospecha contiene el analito, y (2) una reactivo marcador que
comprende un primer miembro de un par de unión específica (sbp)
asociado con un PACC. Se escogen las condiciones de forma que se
forme un complejo de miembro de sbp en relación con la presencia
del analito. Por ejemplo, el primer miembro de un sbp puede ser
capaz de unir el analito o un segundo miembro de un sbp para formar
un complejo relacionado con la presencia del analito. El
procedimiento comprende además, la activación fotoquímica del PACC y
la detección de la cantidad de luminiscencia generada por el PACC.
La cantidad de luminiscencia está relacionada con la cantidad de
analito en el medio.
Generalmente, el PACC se activa fotoquímicamente
mediante irradiación con luz, la cual puede activar directamente el
PACC o puede activar un fotosensibilizador, el cual, una vez
irradiado, causa la conversión del oxígeno molecular a oxígeno
singlete. Entonces, el oxígeno singlete activa el PACC. El
fotosensibilizador puede estar unido a un ligando, puede estar
suelto en solución, o puede estar unido a una superficie,
dependiendo de la naturaleza del ensayo. El producto formado por la
activación del PACC con el oxígeno singlete puede descomponerse
espontáneamente con emisión de luz, o puede ser tratado
ulteriormente física o químicamente para emitir luz.
Un fotosensibilizador puede emplearse en un
cierto número de estrategias diferentes para producir oxígeno
singlete, el cual activa el PACC. El fotosensibilizador puede
emplearse directamente, no estando unido a un miembro de un sbp. En
esta estrategia se emplea una concentración del fotosensibilizador
relativamente elevada, usualmente al menos 10^{-7} M,
preferiblemente al menos 10^{-6} M, más preferiblemente al menos
10^{-5} M. Generalmente, la cantidad de fotosensibilizador
empleada en esta estrategia es aquélla suficiente para producir una
concentración de oxígeno singlete que resulta en la activación del
PACC. Esta estrategia puede usarse cuando la emisión del PACC se
modifica sustancialmente cuando se forma un complejo, o cuando la
cantidad de PACC en el medio se ve afectada por la presencia del
analito. Esto se onseguirá habitualmente separando la marca unida y
no unida. Cuando no se desea una separación, la emisión del PACC en
el complejo puede modificarse mediante un aceptor de energía, el
cual se lleva a una estrecha proximidad con el PACC uniendo el
aceptor de energía al complejo formado a resultas de la presencia
del analito. Cuando el aceptor de energía es fluorescente, la
longitud de onda de la emisión es habitualmente modificada. Cuando
el receptor de energía no es fluorescente, la quimioluminiscencia
será habitualmente atenuada cuando el PACC pase a estar unido al
complejo.
En un procedimiento adicional, un
fotosensibilizador y el PACC se reparten entre el conjunto de la
solución del medio de ensayo y una superficie, tal como se describe
en la presente invención. Este reparto dependerá de la cantidad de
analito presente en la muestra a analizar, y el fotosensibilizador
habitualmente estará unido a un miembro de un sbp. Las moléculas de
fotosensibilizador que no pasan a estar asociadas con la superficie
producen oxígeno singlete, el cual es incapaz de alcanzar el PACC
antes de decaer en el medio acuoso. No obstante, cuando ambos, el
fotosensibilizador y el PACC se asocian con la superficie gracias a
la formación de un complejo, a resultas de la presencia del analito,
el oxígeno singlete producido a partir de la irradiación del
fotosensibilizador puede activar el PACC antes de decaer. En este
procedimiento, la cantidad de fotosensibilizador empleado puede ser
considerablemente menor que en el uso descrito previamente del
fotosensibilizador que no implica un miembro de un sbp unido al
fotosensibilizador.
Como puede verse, estos ensayos proporcionan un
procedimiento conveniente para detectar y medir una amplia variedad
de analitos de una manera simple, eficiente y reproducible, los
cuales pueden emplear la inspección visual o equipamiento
convencional para medir la cantidad de luz producida durante la
reacción.
Cuando se causa que el fotosensibilizador pase a
estar asociado con la superficie a resultas de la presencia de
analito, habitualmente estará asociado con un miembro de un sbp.
Esto puede conseguirse de diferentes formas. El fotosensibilizador
puede contener una funcionalidad para su anclaje sobre un miembro de
un sbp, o el miembro de un sbp puede contener la funcionalidad para
su anclaje al fotosensibilizador. El anclaje puede conseguirse
mediante un enlace directo entre las dos moléculas, o puede
emplearse un grupo de engarce entre el miembro de un sbp y el
fotosensibilizador. En una realización de la invención, el
fotosensibilizador puede unirse o incorporarse en una partícula, a
la cual también está unido un miembro de un sbp. En ambos casos, el
miembro del sbp es capaz de unirse al analito. El fotosensibilizador
puede incorporarse dentro de la partícula gracias a ser soluble en
al menos una fase de la partícula. El fotosensibilizador puede
unirse a la partícula cuando no se incorpora dentro de la
partícula. Para este propósito el fotosensibilizador, o la
partícula, o un componente de la misma, se funcionaliza para
proporcionar un medio para unir el fotosensibilizador y la
partícula. Para partículas que son gotas de aceite o bicapas
lipídicas, el fotosensibilizador puede unirse a la partícula
mediante anclaje a una cadena hidrocarbonada larga que es compatible
con la composición de la partícula. Frecuentemente, al menos una,
preferiblemente dos, cadenas hidrocarbonadas se emplean, que tienen
de 8 a 20 ó más átomos de carbono.
Si la partícula es una gota de un fluorocarburo,
el fotosensibilizador puede fluorarse para mejorar su solubilidad y
reducir el intercambio, y la cadena hidrocarbonada usada para en
engarce preferiblemente se remplazará con una cadena de
fluorocarburo. Para partículas de silicona, el fotosensibilizador
puede unirse a un polisiloxano. Habitualmente, será deseable
minimizar la carga y polaridad del fotosensibilizador, de forma que
resida dentro de la parte no acuosa de la partícula. Tal como se
menciona más arriba, la estrategia que implica fotosensibilizador
unido a un miembro de un sbp se describe totalmente en la presente
invención.
Tal como se ha mencionado más arriba, el PACC
está "asociado con un miembro de un sbp" y, por tanto,
funciona como una marca. Tal como se usa en ésta, el término
"asociado con un miembro de un sbp" incluye lo siguiente:
habitualmente, la asociación del PACC y el miembro de un sbp es a
través de una unión covalente. No obstante, este reactivo marca
puede además comprender una partícula que se puede suspender, a la
cual el PACC está unido o en la cual el PACC se incorpora de forma
no covalente. La partícula que se puede suspender también tendrá un
miembro de un sbp unido sobre sí. Este miembro de un sbp es
generalmente capaz de unirse al analito o a un miembro de un sbp
capaz de unirse al analito. Cuando se utiliza otro miembro de un sbp
y también es capaz de unirse al analito, resulta un protocolo de
ensayo en "sandwich". El miembro de un sbp unido al PACC
también puede ser análogo al analito, en cuyo caso puede resultar un
protocolo de ensayo competitivo.
El fotosensibilizador sirve para activar el PACC
cuando se irradia el medio que contiene los reactivos anteriores.
El medio se irradia con luz que tiene una longitud de onda de
energía suficiente para convertir el fotosensibilizador a un estado
excitado, y hacerlo capaz de activar el oxígeno molecular a oxígeno
singlete. Cuando está unido a un miembro de un sbp, la
concentración del fotosensibilizador puede ser muy baja,
frecuentemente 10^{-6} a 10^{-12} M o inferior. Cuando el
fotosensibilizador no está unido, estará frecuentemente en una
concentración suficiente para absorber una cantidad apreciable de
luz, habitualmente al menos un 0,1%, preferiblemente entre el 1 y
el 80%.
\newpage
El estado excitado del fotosensibilizador será
habitualmente el estado triplete más bajo, y es al menos 25
kcal/mol, preferiblemente al menos 23 kcal/mol, más energético que
el estado basal. Generalmente, el medio es irradiado con luz que
tiene una longitud de onda de aproximadamente 300 a 1200 nm,
usualmente de 450 a 950 nm, preferiblemente de 550 a 800 nm. El
período de irradiación dependerá del tiempo de vida del PACC
activado, la intensidad de luz, y la intensidad de emisión deseada.
Para PACC activados de vida breve, el período puede ser inferior a
un segundo, habitualmente aproximadamente un milisegundo, pero puede
ser tan corto como un microsegundo cuando se use una lámpara de
flash intensa o láser. Para PACC activados de vida larga, el
período de irradiación puede ser más largo y puede usarse una fuente
de luz continua y menos intensa. En general, la intensidad de luz
integrada durante el período de irradiación debería ser suficiente
para excitar al menos el 0,1% de las moléculas de
fotosensibilizador, preferiblemente al menos el 30%, y más
preferiblemente cada molécula de fotosensibilizador será excitada
al menos una vez.
La luminiscencia o luz producida en cualquiera
de las estrategias anteriores puede medirse visualmente,
fotográficamente, actinométricamente, espectrofotométricamente, o
por cualquier otro medio apropiado para determinar la cantidad de
la misma, que está relacionada con la cantidad de analito en el
medio.
Un láser de helio-neón es una
fuente de luz barata para la excitación a 632,6 nm. Los
fotosensibilizadores que absorben luz en esta longitud de onda son
compatibles con la línea de emisión de un láser
helio-neón y son, por tanto, particularmente útiles
en la presente invención. Otras fuentes de luz incluyen, por
ejemplo, otros láseres tales como de argón, YAG, He/Cd, y rubí;
fotodiodos; lámparas de vapor de mercurio, sodio y xenón; lámparas
incandescentes tales como de tungsteno y tungsteno/halógenas; y
lámparas de flash.
Otro procedimiento para determinar un analito
comprende (a) combinar en un medio de ensayo, bien simultáneamente,
o total o parcialmente de forma secuencial (1) un medio que se
sospecha contiene un analito, (2) un reactivo marcado que comprende
un primer miembro de un par de unión específica (miembro de un sbp)
unido a un compuesto capaz de quimioluminiscencia a partir de la
reacción con oxígeno singlete, y (3) un reactivo insolubilizado que
comprende un aceptor de energía fluorescente unido a, o capaz de
pasar a estar unido a, un segundo miembro de un sbp, en condiciones
en las que se forma un complejo de miembros de un sbp que implica
dicho reactivo marcador, en relación a la presencia de analito en
dicho medio, y la energía de dicho compuesto quimioluminiscente es
capaz de activar dicho aceptor de energía fluorescente, (b) activar
dicho compuesto con luz, y (c) examinar dicho medio de ensayo en
busca de una señal, estando relacionada la presencia o intensidad de
la misma con la cantidad de analito en el medio.
Las composiciones de la invención pueden
adaptarse a la mayoría de los ensayos que implican miembros de un
sbp, tales como un ligando-receptor, por ejemplo,
reacciones antígeno-anticuerpo, ensayos de unión de
polinucleótidos, y demás. Los ensayos pueden ser homogéneos o
heterogéneos, competitivos o de "sandwich". En una estrategia
de ensayo homogéneo, la muestra puede tratarse previamente, si es
necesario, para suprimir materiales no deseados. La reacción
inmunológica de un ensayo de tipo "sandwich" habitualmente
implica un miembro de un sbp, por ejemplo, un anticuerpo, que es
complementario del analito y está unido al PACC, un segundo miembro
de un sbp, por ejemplo, anticuerpo, que también es complementario al
analito, y la muestra de interés. En un protocolo competitivo, el
PACC puede estar asociado a un miembro de un sbp que es análogo a,
habitualmente un derivado de, el analito, o con un miembro de un sbp
complementario del analito, por ejemplo, un anticuerpo.
El PACC puede utilizarse bien por sí mismo o
asociado con un aceptor de energía. La capacidad de luminiscencia
producida por un PACC activado para activar el aceptor de energía
estará gobernada por la unión de los dos miembros de un sbp, o
puede ser la consecuencia de una concentración relativamente elevada
del aceptor de energía en la vecindad del PACC activado, en donde
la concentración habitualmente será al menos micromolar, usualmente
al menos milimolar. Cuando el PACC está unido a un miembro de un
sbp, su concentración, por contra, puede ser bastante baja, a
menudo 10^{-5} a 10^{-15}, usualmente 10^{-8} a 10^{-14}, y
la detección del alcance de la misma puede llevarse a cabo en una
solución homogénea sin separación, sólo a condición de que la
intensidad de la luminiscencia sea modificada cuando el PACC está en
un complejo unidor.
En una estrategia de ensayo heterogéneo, una
muestra sospechosa de contener un analito, el cual es un miembro de
un sbp, se combina con un reactivo que está formado por un miembro
de un sbp complementario unido a un soporte, el cual puede ser una
superficie o una partícula que tienen el PACC. También puede
emplearse un aceptor de energía asociado con otro miembro de un
sbp, en donde el miembro del sbp es bien complementario (sandwich)
o análogo (competitivo) al analito. Estos materiales se combinarán
generalmente bien simultáneamente o total o parcialmente de forma
secuencial. A continuación se separa el soporte de la fase líquida,
y la fase sólida o la fase líquida se examinan en busca de la
presencia de energía luminiscente, habitualmente irradiando la fase
concreta en cuestión, y midiendo la cantidad de luz emitida.
Un ensayo para el analito normalmente se
realizará en un medio acuoso tamponado a un pH moderado,
generalmente aquél que proporciona una sensibilidad de ensayo
óptima. Tal como se ha explicado más arriba, el ensayo puede
realizarse bien sin separación (homogéneo) o con separación
(heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos del
ensayo.
El medio acuoso puede ser solamente agua, o
puede incluir desde un 0,01 hasta un 80 ó más de porcentaje de
volumen de un cosolvente. El pH del medio estará usualmente
en el rango de aproximadamente 4 a 13, más habitualmente en el
rango de aproximadamente 5 a 10, y preferiblemente en el rango de
aproximadamente 6,5 a 9,5. El pH será habitualmente un
compromiso entre el óptimo de unión de los miembros unidores y el
pH óptimo para los otros reactivos del ensayo, tales como
los miembros del sistema de producción de señal. Por ejemplo, el
PACC puede requerir un cierto rango de pH con objeto de
decaer para producir luminiscencia.
Pueden usarse varios tampones para conseguir el
pH deseado y mantener el pH durante la determinación.
Los tampones ilustrativos incluyen el borato, fosfato, carbonato,
tris, barbital, y similares. El tampón concreto empleado no es
crítico para esta invención, pero en un ensayo individual puede
preferirse uno u otro tampón.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas
para llevar a cabo el ensayo, y usualmente una temperatura
constante, preferiblemente, temperatura ambiente, durante el período
de medición. Las temperaturas de incubación normalmente oscilarán
desde aproximadamente 5ºC hasta 99ºC, usualmente desde
aproximadamente 15ºC hasta 70ºC, más habitualmente 20ºC hasta 45ºC.
Las temperaturas durante las mediciones normalmente oscilarán desde
aproximadamente 10ºC hasta 70ºC, más usualmente desde
aproximadamente 20ºC hasta 45ºC, más habitualmente 20ºC a 25ºC. En
algunos casos, el PACC puede precisar de calentamiento hasta 100ºC
con objeto de decaer para producir luminiscencia.
La concentración de analito que puede ensayarse
generalmente variará desde aproximadamente 10^{-5} hasta
10^{-17} M, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6}
hasta 10^{-14}. Las consideraciones como si el ensayo es
cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de
detección concreta, y la concentración del analito de interés,
normalmente determinarán las concentraciones de los diversos
reactivos.
Mientras que las concentraciones de los diversos
reactivos en el medio de ensayo estarán generalmente determinadas
por el rango de concentraciones de interés del analito, la
concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se
determinará empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo
en el rango. Esto es, una variación en la concentración del analito
que sea significativa debería proporcionar una diferencia de señal
medible con precisión.
Mientras que el orden de adición puede variar
ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la
naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple, en particular
para un ensayo homogéneo, es añadir todos los materiales
simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden combinarse
total o parcialmente de forma secuencial. Opcionalmente, puede
implicarse un paso de incubación después de que los reactivos sean
combinados, generalmente oscilando desde aproximadamente 30 segundos
hasta 6 horas, más habitualmente desde aproximadamente 2 minutos
hasta 1 hora.
En un ensayo homogéneo, después de que todos los
reactivos hayan sido combinados, éstos pueden incubarse, si se
desea. A continuación, se irradia la combinación y se mide la
emisión de luz resultante. La luz emitida está relacionada con la
cantidad de analito en la muestra ensayada. Las cantidades de los
reactivos de la invención empleados en un ensayo homogéneo dependen
de la naturaleza del analito.
Los siguientes ensayos se proporcionan a modo de
ilustración y no de limitación.
Los ensayos H e I siguientes ilustran la
presente invención y las formas de usar composiciones de la
invención sin experimentación indebida. Se apreciará que la elección
de analitos, fotosensibilizadores, PACC, superficies, partículas y
condiciones de reacción será evidente para los especialistas en la
técnica a la luz de los descubrimientos en la presente invención y
en los ejemplos que siguen.
En los siguientes ensayos, los componentes se
combinan en un medio predominantemente acuoso de pH 6 a
8,5.
A. En un ensayo para la HCG se combina una
muestra de orina con (1) un anticuerpo contra la HCG, unido a
partículas de látex de 1 micrómetro teñidas con el
fotosensibilizador, ftalocianina de cobre, y (2) un anticuerpo
contra un epítopo separado y no solapado de la HCG, unido al PACC 4.
Después de incubar la suspensión durante 30 minutos, las partículas
se separan del medio mediante centrifugación, se lavan e irradian
con luz de 600 nm. La intensidad de la luz emitida a continuación
de la irradiación está relacionada con la cantidad de HCG en la
muestra. Las partículas separadas pueden irradiarse directamente, o
suspenderse en un solvente acuoso o no acuoso antes de la
irradiación.
B. En un procedimiento para el ensayo de HCG en
suero similar a A, las cuentas de látex que se usan están teñidas
con el fotosensibilizador, ftalocianina de cobre, y, a continuación
de su incubación, se separan del medio y a continuación se irradían
con luz a 600 nm. La intensidad de la luz emitida está relacionada
con la cantidad de HCG en la muestra.
C. En un ensayo para la digoxina en suero, el
PACC, luminol, conjugado con la digoxigenina, se incuba con la
muestra en un pocillo de poliestireno que se ha teñido con
tetradecilftalocianina. La superficie del pocillo está recubierta
con un anticuerpo contra la digoxina. Después de una incubación de
30 minutos y de retirar el medio de ensayo, se irradia el pocillo
con luz de 600 nm. Es preferible añadir una solución alcalina antes
de la irradiación (pH 10-12). La intensidad
de la luz emitida a continuación de la irradiación está inversamente
relacionada con la concentración de digoxina en la muestra.
\newpage
D. En un ensayo para la albúmina en orina, se
combina la muestra con (1) un anticuerpo contra la albúmina marcado
con el PACC, y (2) un anticuerpo contra la albúmina dirigido
contra un epítopo de la albúmina que no se solapa, anticuerpo que
está marcado con un aceptor de energía,
\vskip1.000000\baselineskip
El fotosensibilizador, azul de metileno, está
incluido en el medio de ensayo. Se incuba el medio durante 10
minutos, y entonces se irradia con luz de 600 nm. La intensidad de
la luz emitida por el aceptor de energía (aproximadamente 500 nm) a
continuación del final de la irradiación está directamente
relacionada con la cantidad de albúmina en la muestra.
E. En un ensayo para la tiroxina en suero, se
combina la muestra con tiroxina unida a cuentas de látex, dentro de
las cuales se ha incorporado el PACC 10, en donde X_{2} es
N(CH_{3})_{2}. En el medio de ensayo se incluye
anticuerpo contra la tiroxina, unido a "rose bengal". A
continuación de una incubación de 10 minutos, se irradia el medio
con luz de 550 nm, y se mide la luz emitida a continuación del final
de la irradiación. La intensidad de luz emitida está inversamente
relacionada con la cantidad de tiroxina en la muestra.
F. En un ensayo para una secuencia
polinucleotídica diana en una muestra que contiene ADN, se mezcla
con la muestra un oligonucleótido de 25 bases complementario de la
secuencia diana y conjugado con PACC 23, que es el
9-fenilmetilidenxantano. Entonces se calienta el
medio hasta 75ºC y se enfría a 55ºC para permitir la hibridación
del oligonucleótido con cualquier secuencia diana presente. El
aceptor de energía e intercalador, naranja de acridina, y el
fotosensibilizador, ácido
ftalocianina-tetrasulfónico, están presentes en la
solución de hibridación o pueden añadirse una vez completada la
reacción de hibridación. Entonces se irradia la solución con luz de
600 nm, y se mide la intensidad de luz emitida por el naranja de
acridina (aproximadamente a 500 nm) a partir del final de la
irradiación. La intensidad de luz esta directamente relacionada con
la presencia de la secuencia diana.
G. En un ensayo para una secuencia
polinucleotídica diana en una muestra que contiene ADN, se provoca
la hibridación de un oligonucleótido de 25 bases, complementario de
la secuencia diana y marcado con el fotosensibilizador,
ftalocianina, con la diana, tal como en E, más arriba. Un compuesto
que se une al surco menor del ADN de doble hebra, el colorante
Hoechst 33258, el cual está unido al PACC 20,
N-metil-9-fenilmetilidenacridina,
está presente en el medio, o se añade a continuación de la
hibridación. Entonces se irradia el medio con luz de 600 nm, y se
mide la intensidad de luz emitida a partir del final de la
irradiación. La intensidad de luz esta directamente relacionada con
la cantidad de secuencia diana presente en la muestra.
H. En un ensayo para el antígeno de superficie
de la hepatitis B (HBsAg) en suero, se combina la muestra con (1)
partículas de látex de 150 nm teñidas con el PACC, y recubiertas con
anticuerpos contra el HBsAg, y (2) con cuentas de látex de 150 nm
teñidas con el fotosensibilizador
tetrafenil-porfirina, y recubiertas con anticuerpos
contra el HBsAg. Después de incubar la muestra durante una hora, se
irradia la suspensión con luz de 550 nm. A continuación del final
de la irradiación, se mide la intensidad de la luz emitida y se
relaciona con la cantidad de HBsAg en la muestra.
I. En un ensayo para HBsAg en sangre completa,
se sigue el procedimiento H. excepto que las cuentas de látex que
contienen PACC se remplazan por cuentas de látex teñidas con PACC
23, que el el
9-fenilmetiliden-xanteno, y el
aceptor de energía
Se mide la intensidad de luz emitida a 610 a 620
nm y se relaciona con la concentración de HBsAg en la muestra.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a equipos que contienen la composición de la invención, útiles para
realizar convenientemente el procedimiento de ensayo para determinar
la presencia o cantidad de un analito en una muestra sospechosa de
contener el analito. Para mejorar la versatilidad de la presente
invención, los reactivos pueden proporcionarse en una combinación
empaquetada, en el mismo contenedor o contenedores separados, de
forma que la proporción de los reactivos proporcione una optimación
sustancial del procedimiento y ensayo. Los reactivos pueden estar
cada uno en contenedores separados, o varios reactivos pueden
combinarse en uno o más contenedores dependiendo de la reactividad
cruzada y estabilidad de los reactivos.
Un tipo de equipo comprende (1) una composición
que incluye una partícula que se puede suspender que comprende un
compuestos quimioluminiscente, teniendo la partícula un miembro de
un sbp unido sobre sí, y (2) un fotosensibilizador con una
partícula, a la cual está unido un miembro de un sbp. El equipo
puede incluir además otros reactivos, empaquetados por separado,
para llevar a cabo un ensayo, incluyendo los reactivos auxiliares,
y demás.
El compuesto quimioluminiscente puede contener
un grupo olefina y uno o más sustituyentes donantes de electrones
en conjugación con dicho grupo olefina.
El compuesto quimioluminiscente puede
seleccionarse de entre el grupo consistente en
9-alquiliden-N-metilacridano,
enoléteres y enaminas.
El fotosensibilizador o dicho compuesto
quimioluminiscente puede estar asociado con una partícula que puede
suspenderse que comprende la superficie.
También se puede conseguir que una superfície se
pusiera en estrecha proximidad, y la supercifie está sobre una
partícula suspendida, y la partícula se selecciona de entre el grupo
consistente en partículas de látex, bicapas lipídicas, gotas de
aceite, partículas de sílica, soles metálicos, y cristalitos de
colorante.
El fotosensibilizador puede ser un colorante
seleccionado del grupo consistente en el azul de metileno, el rosa
de bengala, las porfirinas y las ftalocianinas.
Tanto el fotosensibilizador como el compuesto
quimioluminiscente pueden tener un miembro de un par de unión
específica (sbp) asociado consigo, y dicho miembro del spb se
selecciona de forma independiente del grupo consistente en
ligandos, receptores, polinucleótidos, y agentes unidores de
polinucleótido.
La presente solicitud proporciona un equipo que
comprende, en una combinación empaquetada, (1) una composición que
incluye una partícula que se puede suspender que comprende un
compuestos quimioluminiscente, teniendo dicha partícula un miembro
de un sbp unido sobre ella, y (2) una segunda partícula que se puede
suspender que comprende dicho fotosensibilizador, el cual es capaz,
en su estado excitado, de activar oxígeno a su estado excitado,
teniendo dicha segunda partícula unido sobre ella un miembro de un
sbp.
La invención se demuestra además mediante los
siguientes ejemplos ilustrativos. Las partes y porcentajes usados
en ésta son en peso, a menos que se indique lo contrario. Las
temperaturas están en grado centígrados (ºC).
Ab_{F} - Anticuerpo monoclonal contra la
fluoresceína.
Ab_{IF} - Anticuerpo monoclonal contra el
factor intrínseco.
B_{12}-LC_{25}-F
- Vitamina B_{12} unida a carboxifluoresceína (F) a través de un
grupo de engarce con una longitud de cadena de 25 átomos de carbono,
en concreto,
HN(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}-O-CH_{2}CONH(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}NHCO.
BA-C_{18} -
4-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi)benzal-9-metil-acridina.
t-Bu -
ter-butil.
TFA - Ácido trifluoroacético.
Biotina-LC_{21}-F
BSA - Albúmina de suero bovino.
Chl-a -
Clorofila-a.
D-H_{2}O - Agua
desionizada.
DPPC - Dipalmitoilfosfatidilcolina.
DPPG - Dipalmitoilfosfatidilglicerol.
DPPE - Dipalmitoilfosfatidiletanolamina.
EDAC -
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
hidrocloruro.
F - Fluoresceína.
F-NHS - El éster
N-hidroxisuccinimida de la
6-carboxifluoresceína.
F-LC_{21}NH_{2} -
Carboxifluoresceína a la que se ha unido el grupo engarce
HN(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}-O-CH_{2}CONH
(CH_{2})_{6}NH_{2}.
(CH_{2})_{6}NH_{2}.
HCG - Gonadotropina de corion humana.
Lip - Liposoma.
nC_{10} - Complejo cloruro de
tetra-(n-decil)ftalocianina aluminio.
OD - Gota de aceite.
OD/BA-C_{18} - Gotas de aceite
que contienen BA-C_{18}.
PB - Cuentas de poliestireno.
PB/BA-C_{18} - PB que contiene
BA-C_{18}.
PB/nC_{10} - PB que contienen
tetra-(n-decil)ftalocianina aluminio.
PBS - Solución salina tamponada con fosfato,
0,02 M NaP_{i}, 0,14 M NaCl, pH 7,2.
P_{i} - fosfato.
Sulfo-NHS -
Sulfo-N-hidroxisuccinamida.
TSH - Hormona estimuladora de la tiroides u
hormona tirotrópica.
SATA - ácido
S-acetiltioglicólico
N-hidroxisuccinimida éster.
RLU - Unidades de luz relativas.
Ab_{1}(HCG) - Anticuerpo monoclonal
anti-HCG\beta (12A8).
Ab_{2}(HCG) - Anticuerpo monoclonal
anti-HCG\alpha (9D7).
Ab_{1}(TSH) - Anticuerpo monoclonal
anti-TSH\beta_{1} (35).
Ab_{2}(TSH) - Anticuerpo monoclonal
anti-TSH\beta_{2} (9G3). (Nota: para
Ab_{1}(TSH) y Ab_{2}(TSH), Ab_{1} y Ab_{2} son
anticuerpos contra la cadena \beta de la TSH, contra dos epítopos
diferentes).
NHS - N-hidroxisuccinamida.
IF - Factor intrínseco.
DMSO - Dimetilsulfóxido.
avidina-PB/BA-C_{18}
- PB/BA-C18 unido covalentemente a avidina.
Ab_{F}-PB/nC_{10} -
PB/nC_{10} recubiertas con Ab_{F}.
DMF - Dimetilformamida.
DCC - Diciclohexilcarbodiimida.
TEA - Trietilamina.
TLC - Cromatografía en capa fina.
TNBSA - ácido
2,4,6-trinitrobenzensulfónico.
Dig-CMO -
O-carboximetiloxima de
digoxigenina-3-ona.
BGG - Gammaglobulina bovina.
Biotina-LC_{7}-NHS
-
Sulfosuccinimidil-6-(biotinamido)-hexanoato.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los anticuerpos monoclonales se produjeron
mediante tecnología estándar de células híbridas. En resumen, el
inmunogén apropiado se inyectó en un huésped, habitualmente un ratón
u otro animal apropiado, y después de un período de tiempo
apropiado, se obtuvieron células pancreáticas del huésped.
Alternativamente, se aislaron células no sensibilizadas del huésped
y se sensibilizaron directamente con el inmunogén in vitro.
Las células híbridas se formaron fusionando las células anteriores
con una línea celular de mieloma apropiada, y cultivando las
células fusionadas. Los anticuerpos producidos por las células
híbridas cultivadas se examinaron por su capacidad de unión al
antígeno concreto, por ejemplo, TSH o HCG. Se emplearon un cierto
número de técnicas de examen, tales como, por ejemplo, exámenes
ELISA. A continuación, se reclonaron las fusiones seleccionadas.
El conjugado
B_{12}-LC_{25}-F, con un brazo
espaciador con una longitud de 25 átomos de carbono (ver más
abajo), se preparó introduciendo grupos carboxílicos en la molécula
B_{12} haciendo reaccionar la molécula de B_{12} con
metilisocianatoacetato (el cual reacciona con el grupo hidroxilo de
la ribosa en la molécula de B_{12}, formando un enlace carbamato
estable), seguido por hidrólisis básica del metiléster para generar
el grupo carboxílico. El grupo carboxílico introducido en el sitio
5'-OH se convirtió en el éster NHS de B_{12}, y a
continuación se hizo reaccionar con la amina de fluoresceína
F-LC_{21}-NH_{2} para generar
el producto final
B_{12}-LC_{25}-F.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
Se disolvieron 1,2 g (0,0056 moles) de la
diamina monoprotegida 1C1 en 25 ml de diclorometano anhidro, y a
esta solución se añadieron 0,64 g (0,0056 moles) de diglicólico
anhidro 1A1, y se dejó la reacción durante 5 horas a temperatura
ambiente. Se concentró la mezcla de reacción, y se extrajo con 50 ml
de agua, 50 ml de etilacetato. Se lavó la fase orgánica con HCl 0,1
N (50 ml), agua (2 \times 50 ml), y se secó con MgSO_{4}, y se
concentró al vacío para rendir 1,35 g de 1A2.
^{1}H NMR 100 MHz (CD_{3}OD) \delta 4,0,
3,85(2s, 4, O-CH_{2}-CO), w
3,0, 2,82 (2t, 4, NCH_{2}), \delta 1,4 (s, CH_{3}).
Se disolvieron 500 mg (1,33 moles) de
5-carboxifluoresceína, 1A3, (secada a 80ºC sobre
P_{2}O_{5}, al vacío 0,05 mm, 16 horas) en 20 ml de
dimetilformamida anhidra. A la solución en agitación se le añadieron
280 mg (1,46 mmoles) de
1-etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida,
y 168 mg (1,46 mmoles) de N-hidroxisuccinimida.
Después de agitarla durante 16 horas, se añadieron 400 mg (1,85
mmoles) de mono
t-Boc-1,6-diaminohexano,
y se agitó la mezcla durante 4 horas adicionales a temperatura
ambiente. La mezcla resultante se concentró hasta una solución
espesa, y se disolvió en 1:9 metanol:etilacetato (100 ml), y se
extrajo con agua (3 \times 50 ml), HCl 0,1 N (100 ml). La fase
orgánica se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó al vacío. El residuo
se purificó sobre Analtech 1000 \mu, placas GF de gel de sílice
de 20 \times 20 cm, usando 0,5% de ácido acético y 10% de metanol
en dicloro-metano. Las bandas puras se juntaron y se
extrajeron con (1:1) metanol/diclorometano, se concentraron, y el
residuo se disolvió en el mínimo de metanol, y se añadió gota a gota
en agua. A continuación se centrifugó la mezcla y el sólido se secó
al vacío, rindiendo un 83% de 1A4.
Se trataron 3,5 g (0,0064 moles) de
mono-t-Boc
1,6-diaminohexil-5-carbonil
fluoresceína 1A4 (secada a 90ºC, sobre P_{2}O_{5}, en vacío de
0,05 mm, 16 horas) con 40 ml de diclorometano/ácido trifluoroacético
1/1. La solución se arremolinó en un baño de hielo, y transcurridos
5 minutos se evaporó el solvente y se secó el residuo crudo al
vacío durante la noche.
Se combinaron 42 mg de
mono-t-Boc ácido
1,6-diaminohexilglicólico amida 1A2, 22 mg (0,190
mmoles) de N-hidroxisuccinimida, y 36,4 mg (0,190
mmoles) de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
en 4 ml de diclorometano anhidro, y se agitaron a temperatura
ambiente durante 16 horas. La solución del ácido activado se añadió
gota a gota en un solución en agitación de 75 mg (0,127 mmoles) del
anterior derivado
1,6-diaminohexil-5-carboxilfluoresceína,
10 ml de dimetilformamida anhidra, y 66 ml de trietilamina. Después
de 1 hora, se disolvió la reacción en agua y se extrajo con
etilacetato. Se lavó la fase orgánica con agua (3 \times 25 ml),
se secó con MgSO_{4}, se concentró y purificó sobre una placa GF
de gel se sílice 1000 m Analtech de 20 \times 20 cm, 10% de
metanol, 0,5% de ácido acético en diclorometano. La banda pura se
aisló, se extrajo con metanol/diclorometano, se concentró y secó al
vacío. Se disolvió el residuo en 4 ml de metanol y se añadió gota a
gota a HCl 0,1 N (8 ml) arremolinado, se centrifugó y se secó. 84
mg de 1A5, rendimiento del 84%.
^{1}H NMR 500 MHz (CD_{3}OD) \delta 8,4
(d, 1, ArH, J=0,71 Hz) \delta 8,17 (dd, 1, ArH, J=8,0 Hz)
\delta 7,3 (d, 1, ArH, H=8,0 Hz) \delta 4,04 (d, 4,
O-CH_{2}-CO) \delta 1,41 (s, 9,
3CH_{3}).
Anal. Calc. para C_{42}H_{52}N_{4}O_{11}
: C, 63,7; H, 6.8; N, 7,0
Encontrado: C, 63,56; H, 6,64; N, 7,0
A la anterior amina, t-Boc de
cadena larga de 21 átomos, de la
5-carboxifluoresceína (secada a 80ºC sobre
P_{2}O_{5}, al vacío de 0,05 mm) se le añadieron 5 ml de ácido
trifluoroacético a temperatura ambiente. Transcurridos 5 minutos se
evaporó el ácido y se secó a continuación a 80ºC al vacío para
rendir la sal del ácido trifluoroacético 1A6.
FAB-MS C_{37}H_{44}N_{4}O
(M+H)^{+} 689.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Se disolvieron 25 mg (0,0185 mmoles) de vitamina
B_{12} (1B1) (secada durante 48 horas a 80ºC, 10 \mu) en 1,25
ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta solución en agitación se
añadieron 21,2 mg (0,185 mmoles) de metilisocianoacetato y se dejó
progresar la reacción durante durante 24 horas a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se añadió gota a gota dentro de 10
ml de solución de etilacetato en agitación. Se centrifugó el
producto precipitado, se resuspendió a continuación en una cantidad
mínima de metanol, y se precipitó de nuevo. Este material se
purificó sobre una placa preparativa Whatman PLC_{18}F 1000 \mu
de 20 \times 20 cm, eluyente 2:8 isopropanol:agua conteniendo 0,5
ml de ácido acético + 1 g de NaCl por cada 100 ml. Rf = 0.625. El
aislamiento a partir del absorbente rindió el metiléster 1B2.
(+)-FAB-MS
(C_{67}H_{93}CoN_{15}O_{17}P), P.M. 1469,6; (M+H)
1470,(M-CN)^{+} 1444.
Se disolvieron 40 mg (0,0272 mmoles) del
B_{12}O^{5}'-carbonilglicina metiléster 1B2 en
2,5 ml 2/1 metanol/agua, pH ajustado a 9,5 con hidróxido
amónico, y se agitaron durante 16 horas a temperatura ambiente.
análisis de tlc Whatman KC_{18}F
2:8 isopropanol:agua, 0,5% ácido acético, 1%
NaCl
Rf \approx 0,79
La mezcla de reacción se concentró hasta
secarla, y el producto se aisló usando dos placas Whatman
PLC_{18}F 1000 \mu, 20 \times 20 cm, el mismo eluyente que más
arriba. Se extrajo la banda pura con metanol, se concentró el
extracto, se disolvió en 2:7 metanol-diclorometano,
se filtró y concentró. Se disolvió el residuo en 4 ml de metanol, y
se añadió gota a gota a 4 ml de etiléter. Se centrifugó el
precipitado y se secó a 60ºC, sobre P_{2}O_{5}, 0,5 mm, 16
horas, para obtener 28 mg de producto 1B3.
(+)-FAB-MS
(C_{66}H_{91}CoN_{15}O_{17}P), P.M. 1455,7;
(M+H)^{+} 1456,(M-CN)^{+}
1431.
Se combinaron 15 mg (0,013 mmoles) de
B_{12}O^{5}'-carbonilglicina 1B3, 3,66 mg (0,016
mmoles) de N,N-diciclohexilcarbodiimida, y 1,95 mg
(0,017 mmoles) de N-hidroxisuccinimida, con 5 ml de
dimetilformamida anhidra, y se agitaron a temperatura ambiente
durante 16 horas. Se añadió la mezcla de reacción gota a gota a una
solución en agitación de 13,6 mg (0,17 mmoles) amina de cadena larga
de 21 átomos de la 5-carboxifluoresceína 1A6 en
2,02 mg (0,02 mmoles) de trietilamina en 4 ml de dimetilformamida
seca, y se agitaron durante 12 horas a temperatura ambiente.
El crudo de la reacción se concentró al vacío a
40ºC, y el residuo se disolvió en 2 ml de metanol, y se precipitó
con 6 ml de etiléter, y se centrifugó. El sólido se purificó sobre
una placa Whatman PLC_{18}F de 1000 \mu, 20 \times 20 cm,
eluyente 7:3 metanol:agua, 0,5% ácido acético, Rf \sim 0,78, 37%
de rendimiento de 1B4.
(+)-FAB-MS
(C_{103}H_{133}CoN_{19}O_{25}P), (M+H)^{+} 2125,
(M-CN)^{21} UV/max 360 (\varepsilon
26.600), 50 (\varepsilon 57.000), 550 (\varepsilon 9500).
Los anticuerpos monoclonales
anti-factor intrínseco (Ab_{IF}) se prepararon
mediante tecnología estándar de células híbridas basada en la
descrita por Kohler y Milstein en Nature 256 (1975)
495-497.
Usando
biotina-LC_{7}-NHS de Pierce
Chemical Co., Rockford, Ill, se realizaron tres niveles de
biotinilación (Ab_{IF}:
biotina en la mezcla de reacción = 1:10, 1:50, ó 1:200). El Ab_{IF} estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05, pH = 7,8, a [Ig] = 2,5 mg/ml. A esta solución se le añadió DMSO (1% del volumen total) conteniendo la cantidad requerida de biotina-LC_{7}-NHS, y, a continuación, se incubó la solución durante la noche a 4ºC. Finalmente, las mezclas de reacción se purificaron sobre Sephadex® G25, y se dializaron extensivamente frente a NaP_{i} 0,05 M, 0,02% de NaN_{3}, pH = 7,2. Los anticuerpos anti-factor intrínseco biotinilados se almacenaron congelados.
biotina en la mezcla de reacción = 1:10, 1:50, ó 1:200). El Ab_{IF} estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05, pH = 7,8, a [Ig] = 2,5 mg/ml. A esta solución se le añadió DMSO (1% del volumen total) conteniendo la cantidad requerida de biotina-LC_{7}-NHS, y, a continuación, se incubó la solución durante la noche a 4ºC. Finalmente, las mezclas de reacción se purificaron sobre Sephadex® G25, y se dializaron extensivamente frente a NaP_{i} 0,05 M, 0,02% de NaN_{3}, pH = 7,2. Los anticuerpos anti-factor intrínseco biotinilados se almacenaron congelados.
Látex modificado con carboxilato, 175 nm: Bangs
Laboratories, Inc., Carmel, IN 46032.
Látex modificado con carboxilato, 38 nm: Duke
Scientific Corporation, Palo Alto, CA 94303.
Etilenglicol, alcohol bencílico, benzonitrilo:
Aldrich Chemical Co.
Sephadex® G-25: Pharmacia.
nC_{10}: Ultra Diagnostics Corporation,
Seattle, WA 98105.
Se preparó una solución 2,1 M de nC_{10} en
alcohol bencílico. Se colocó etilenglicol (16 ml) en un vial de
vidrio de 20 ml, y se calentó hasta 100ºC sobre una placa caliente
de laboratorio. Se añadió el alcohol bencílico (1,6 ml) y se agitó
la mezcla magnéticamente. Se añadió una solución de reserva de látex
(2 ml, látex de 38 nm, modificado con carboxilato, conteniendo un
10% de sólidos) y se dejó equilibrar la mezcla durante 3 a 4
minutos. La solución de nC_{10} (0,4 ml) se añadió lentamente en
alícuotas de 100 \mul. Se continuó el calentamiento a 100ºC
durante 5 minutos, entonces se dejó enfriar la mezcla hasta la
temperatura ambiente. Después de enfriada, se aplicó la mezcla a
una columna de Sephadex G-25 (2,5 \times 15 cm)
equilibrada con etanol acuoso al 50%. Las fracciones conteniendo
látex se juntaron y se aplicaron a una segundo columna de Sephadex
G-25 (2,5 \times 35 cm) equilibrada con agua. Se
eluyó el látex en un volumen de 30 ml.
Se preparó una solución 2,1 M de nC_{10} en
alcohol bencílico. Se colocó etilenglicol (80 ml) en un frasco
Erlenmeyer de 125 ml, y se calentó hasta 110ºC sobre una placa
caliente de laboratorio. Se añadió el alcohol bencílico (8 ml) y se
agitó la mezcla magnéticamente. La solución de nC_{10} (2 ml) se
añadió inmediatamente mediante suspensión de látex de reserva (10
ml, látex de 175 nm, modificado con carboxilato, conteniendo un 10%
de sólidos). Se continuó el calentamiento a 100ºC hasta 110ºC
durante 10 minutos mientras se agitaba enérgicamente. A
continuación se colocó el frasco en un baño con agua a temperatura
ambiente para enfriarlo. Después de enfriada, se diluyó la mezcla
con un volumen igual de etanol, e inmediatamente se centrifugó a
15.000 rpm (Sorval, rotor SA 600) durante dos horas. Se decantó el
sobrenadante débilmente azul, y se resuspendió el precipitado en
etanol acuoso al 50% (20 ml) usando un sonicador de baño para
dispersar las partículas. La centrifugación se repitió a 15.000 rpm
1 hora. Los sobrenadantes se decantaron y se resuspendió el
precipitado en agua. A continuación de una centrifugación final, se
resuspendieron los precipitados en agua hasta un volumen final de 20
ml.
Se preparó una solución de
BA-C_{18} en benzonitrilo. Se colocó el
etilenglicol (80 ml) en un frasco Erlenmeyer y se calentó hasta
100ºC sobre una placa caliente de laboratorio. Se añadió
benzonitrilo (9 ml) y se agitó la mezcla magnéticamente. La
solución de BA-C_{18} (1 ml) se añadió seguida
inmediatamente por la suspensión de látex de reserva (10 ml, látex
de 175 nm, conteniendo un 10% de sólidos, descrita más arriba). Se
continuó el calentamiento a 100ºC durante 5 minutos mientras se
agitaba enérgicamente. A continuación se colocó el frasco en un
baño de agua a temperatura ambiente para enfriarlo. Después de
enfriada, se diluyó la muestra con un volumen igual de etanol
acuoso al 50%, y se centrifugó inmediatamente a 15.000 rpm (Sorval,
rotor SA 600) durante un total de 4 horas. Se decantó el
sobrenadante, y se resuspendió el sobrenadante en etanol acuoso
usando un sonicador de baño para dispersar las partículas. Se
repitió la centrifugación, 15.000 rpm durante 1 hora. Se decantaron
los sobrenadantes y se resuspendió el precipitado en agua. A
continuación de una centrifugación final, se resuspendieron los
precipitados en agua hasta un volumen final de 20 ml.
La unión de la cuentas a avidina se describe en
el Ejemplo 3, parágrafo VI.
Se realizó el ensayo mezclando 100 \mul de
calibradores B_{12} (diluidos a partir de una solución de reserva
original de 10 \mug/ml de B_{12}, 10 \muM KCN) en tampón de
ensayo (0,05 M KP_{i}, 0,1% de BSA, pH 7,5, el BSA estaba
libre de B_{12} y unidor de B_{12}) con 50 ml de 2,2 ng/ml
B_{12}-LC_{25}-F, y 50 \mul
de 88 ng/ml de factor intrínseco (IF) mezclados previamente con 8,8
\mug/ml Ab_{IF}-biotina. Estas mezclas se
incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad;
a continuación se añadieron 0,75 ml de tampón 0,05
Tris-HCl, 0,05 NaP_{i}, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton
X-100, pH 8,2, conteniendo 10^{10} cuentas
de avidina-PB/BA-C_{18} y 2,5
\times 10^{11} cuentas Ab_{F}-PB/nC_{10}, en
cada tubo y se continuó la incubación durante 30 minutos
adicionales mediante agitación en la oscuridad a temperatura
ambiente. Finalmente, cada tubo se iluminó durante un minuto
usando, como fuente de luz, una lámpara halógena ajustada con un
filtro de corte a 650 nm, y, a continuación se midió la
quimioluminiscencia integrando durante 20 segundos usando un
luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la Figura
1.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales
anti-digoxina (Ab_{Dig}) se prepararon según
tecnología estándar de línea celular híbrida, y los anticuerpos se
purificaron mediante Proteína-A inmovilizada. A
continuación, se preparó la Ab_{Dig}-biotina
mezclando juntos el anticuerpo (aproximadamente
2-2,5 mg/ml en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M,
pH 7,8) y
biotina-LC_{7}-NHS (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL) (solubilizada primero en DMF, y una
pequeña alícuota se usó para la reacción) e incubando durante tres
horas a 4ºC. En la mezcla de reacción, la relación molar de los
reactivos fue
anticuerpo:biotina-LC_{7}-NHS =
1:25. La biotina no acoplada se retiró mediante una columna
Sephadex G-25. El conjugado final se guardó en
NaP_{i} 0,05 M, 0,001% de Thimerosal, pH = 7,4, a 4ºC o
congelado.
Este reactivo se preparó en tres pasos sucesivos
mediante la preparación de (1) F-NHS, (2)
F-LC_{9}-NH_{2}, y (3)
Dig-LC_{9}-F.
- A.
- Preparación de F-NHS. A 2 ml de 100 mg/ml de 6-carboxifluoresceína y 30,6 ml/ml de NHS en DMF se les añadieron 0,4 ml de 275 mg/ml de DCC. Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La diciclohexilurea formada se retiró mediante filtración. La formación del F-NHS se comprobó mediante TLC sobre placas de sílice, usando el sistema solvente CH_{2}Cl_{2}:metanol:ácido acético = 85:15:1. El DMF se retiró mediante un rotavapor, y el producto (F-NHS) se secó más aún bajo presión reducida, y se guardó desecado a 4ºC.
- B.
- Preparación de F-LC_{9}-NH_{2}. A 1,5 ml de una solución de bis-(3-aminopropil)-metilamina (LC_{9}) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) en DMF se les añadieron 1,2 ml de 125 mg/ml F-NHS en DMF, seguidos por incubación a temperatura ambiente durante la noche con agitación en la oscuridad. La proporción molar de F-NHS:LC_{9} fue de 1:40. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó 1/20 con NaP_{i} 0,5 M pH 5,0, y el pH de la mezcla se ajustó a 5,0 mediante adición de ácido fosfórico (1,0 M), y toda la muestra se cargó sobre una columna de BioRex-70® (2,5 \times 10 cm), equilibrada en NaP_{i} 0,5 M/pH = 5,0. Una vez cargada, se lavó la columna con el tampón inicial hasta que se retiró toda la bis-(3-aminopropil)metilamina (seguido con la reacción TNBSA). Se lavó la columna con NaP_{i} 0,001 M/pH = 6,0 para retirar la 6-carboxifluoresceína contaminante. El lavado con tampón de baja fuerza iónica retiró, no tan sólo la 6-carboxifluoresceína, sino también otros contaminantes que contenían fluoresceína, los cuales no se han identificado. Entonces, se lavó la columna con D-H_{2}O para retirar las sales. Finalmente, se vació la columna con NH_{4}OH 0,8 M. El hidróxido amónico se retiró mediante liofilización. Después de comprobar su pureza, se almacenó el producto desecado a -20ºC. La reacción se siguió (y la pureza del producto se verificó) mediante electroforesis sobre papel (NaP_{i} 0,05 M/pH = 5,8, 20 minutos, usando el sistema de electroforesis paragon) y mediante TLC (placas de C_{18}, usando metanol al 50% en D-H_{2}O como solvente).
- C.
- Preparación de Dig-LC_{9}-F. Se preparó una solución que contenía 23,05 mg (0,05 mmoles) de Dig-CMO tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.039.385, Ejemplo 2, el descubrimiento de la cual se incorpora en ésta por referencia. 50,35 mg (0,1 mmoles) de F-LC_{9}-NH_{2} y 19,2 mg (0,1 mmoles) de EDAC en 1,5 ml de solvente DMF/DMSO (5:1) se agitaron durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La Dig-LC_{9}-F y la Dig-CMO (si había quedado algo reaccionar) se precipitaron añadiendo 3 ml de D-H_{2}O, se filtraron, y se descartó el solvente. El material filtrado se resolubilizó en un sistema solvente consistente en CH_{2}Cl_{2}:metanol:ácido acético = 60:40:5, y se cargó sobre una columna de gel de sílice de (1,5 \times 20 cm) en el mismo sistema solvente. En estas condiciones, la Dig-CMO se adelantó al conjugado Dig-LC_{9}-F, y la F-LC_{9}-NH_{2} permaneció unida a la parte superior de la columna. La pureza del material se verificó mediante placas de TLC de gel de sílice, usando el sistema solvente descrito más arriba, y mediante electroforesis sobre papel a pH = 5,8. Los solventes se retiraron del material purificado mediante rotavapor, y se resolubilizó el producto en un volumen mínimo de metanol/DMF (70:30), y se centrifugó a continuación para retirar los materiales insolubles (gel de sílice). El último paso se realizó para suprimir la mayor parte del gel de sílice, el cual podía solubilizarse y co-eluirse con el producto durante la purificación. Se almacenó el producto en un sistema solvente metanol/DMF (70:30) a -10ºC hasta -20ºC. La concentración del producto se determinó mediante A_{490} a partir de una curva estándar construida usando cantidades conocidas de 6-carboxifluoresceína.
El ensayo se llevó a cabo mezclando 50 ml de
calibradores de digoxina en suero (suero humano normal sin TSH) con
50 \mul de 1,74 ng/ml de conjugado
digoxina-LC_{9}-F en tampón de
ensayo (Tris-HCl 0,05 M, NaP_{i} 0,05, NaCl 0,15
M, 2 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml BGG/pH 8,2), y 50 \mul de 160
ng/ml Ab_{Dig}-biotina en el mismo tampón
anterior. Estas mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante
15 minutos, a continuación se añadieron 0,75 ml de tampón
Tris-HCl 0,05, NaP_{i} 0,05, NaCl 0,15 M,
pH 8,2, conteniendo 10^{10} cuentas aceptoras
(avidina-PB/BA-C_{18}) y 2,5
\times 10^{11} cuentas sensibilizadoras
(Ab_{F}-PB/nC_{10}), en cada tubo, y se
continuó la incubación, durante 30 minutos adicionales, mediante
agitación en la oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, se
iluminó cada tubo durante un minuto usando, como fuente de luz, una
lámpara halógena ajustada con un filtro de corte a 650 nm, y a
continuación se midió la luz quimioluminiscente durante 20 segundos
integrando con un luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen
en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los reactivos se obtuvieron de Aldrich
Chemical Co., excepto cuando se indica.
A 100 ml de una solución recién destilada de
tetrahidrofurano (THF) se le añadió ácido
p-formilfenoxiacético (K & K Labs) (P.M. 180,
0.540 g, 3,0 mmoles), trietilamina (P.M. 101,19, 0,333 g, 3,3
mmoles), y trimetilacetilcloruro (P.M. 120,57, 0,398 g, 3,3
mmoles). Después de 30 minutos de calentamiento a reflujo, se añadió
dioctadecilamina (Fluke) (P.M. 522,01, 1,723 g, 3,3 mmoles). La
reacción se hizo refluir durante toda la noche.
Al día siguiente, se diluyó la mezcla de la
reacción, y se extrajo de la solución de la reacción con cloruro de
metilo. Los extractos de cloruro de metilo se secaron sobre sulfato
sódico.
A la
10-dimetoxifosfinil-9-metilacridina
(Monatshi Chem., 114(3) (1988) (P.M. 303,27, 0,100 g, 3,3
mmoles) en THF anhidro se le añadieron 0,413 ml de solución 1,6 M de
n-butil litio en hexano a -78ºC (baño de
acetona/hielo seco) bajo argón. A partir de la adición de la
solución n-butil litio, la solución apareció
amarilla. Se añadió una solución de la anterior amida en THF 20
minutos después de la adición del n-butil litio. Se
dejó que la solución de reacción se calentara hasta temperatura
ambiente durante la noche.
Al día siguiente se aisló el producto mediante
TLC (gel de sílice, 3:7 etilacetato/hexano). El producto aislado se
analizó mediante espectro de masas y RMN, y se almacenó en la
oscuridad.
- B.
- El colorante (nC_{10}) generador de oxígeno singlete procedía de ULTRA Diagnostic Corporation; EDAC, SATA, HCG, y BSA procedían de Sigma Co. El Ab_{1}(TSH)-biotina y el Ab_{2}(HCG)-biotina, y el Ab_{2}(TSH)-F se prepararon mediante procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 1, parágrafo II (ver también [la patente] estadounidense con número de serie 07/389.659 registrada en 4 de agosto de 1989, equivalente a la publicación de patente europea nº 411.945 publicada el 6 de febrero de 1991, cuyas partes relevantes se incorporan en ésta por referencia).
Se usó un luminómetro procedente de Turner
Designs (modelo 20e).
Las gotas de aceite (OD) marcadas con anticuerpo
anti-HCG se prepararon transfiriendo 1 ml de 10
mg/ml anti-HCG-\beta (12A8, IgG)
a un tubo de vidrio conteniendo 50 \mul de
BA-C_{18} en 5 mM, en dibutilftalato. La proteína
estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6. El aceite se
emulsionó mediante sonicación y mezcla mecánica continua
simultánea. Debería destacarse que se precisaron sonicadores de
elevada energía para preparar gotas de aceite más pequeñas. La
sonicación se realizó durante 7 minutos usando un sonicador Bronson
(como refrigerante se usó agua corriente a temperatura ambiente). La
proteína no unida se retiró añadiendo una solución de
Na_{2}SO_{4} al 25% hasta conseguir una concentración final de
8% al 9%, y centrifugando a continuación (microcentrífuga, posición
8, durante 10 minutos). El paso de lavado se realizó tres veces (la
velocidad de centrifugación debería ajustarse de tal forma que las
gotas de aceite se separan pero no coalescen). Después del lavado
final se suspendieron las partículas en 1 ml de NaP_{i} 0,05 M,
NaCl 0,15 M, 4 mg/ml BSA, pH 7,6, y se sonicaron de nuevo
durante tres minutos. El volumen final de la preparación se ajustó
a 5 ml, y se añadió sacarosa hasta una concentración final del 2%.
Estas partículas
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18}
se almacenaron a 4ºC. Las gotas de aceite se prepararon mediante el
procedimiento descrito más arriba, y eran heterogéneas en tamaño
con un diámetro promedio de 1-5 \mu.
Los liposomas se prepararon mediante el
procedimiento de dilución en metanol. Típicamente, una mezcla de
lípidos:colesterol (2,0 mg), DPPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster,
Ala.) (23,8), DPPG ((Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala.) (6,5
mg), maleimida-DPPE (Molecular Probe, Eugene, Ore.)
(0,5 mg), y nC_{10} (se disolvieron 0,5 mg en metanol templado
(200 \mul), y a continuación se añadieron a 2 ml de
tampón-B (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M, EDTA 5 mM,
pH 6,0) agitado en vórtice. A continuación se pasó la
suspensión a través de una columna (1,5 \times 20 cm) de Sephadex
G-25 en tampón B. Las fracciones conteniendo
liposomas juntas se centrifugaron mediante una microcentrífuga para
suprimir cualquier partícula grande, cuando fue necesario.
Finalmente, los liposomas que contenían maleimida se añadieron
lentamente a una solución en agitación de avidina-SH
succinilada en tampón B (preparada tal como se describe más
arriba). Después de hacer fluir argón, se agitó suavemente esta
mezcla (sin barra de agitación) durante toda la noche a 4ºC. Los
grupos maleimida en exceso se bloquearon con ácido
mercaptosuccinico 2 mM (en volumen de reacción) durante 30 minutos a
4ºC, seguido por la adición de ácido iodoacético hasta una
concentración final de 5 mM para bloquear los grupos tiol en exceso
(30 minutos a 4ºC). Entonces se concentró la mezcla de reacción
hasta 2,5-3 ml con un aparato
Centriprep-30®, y las moléculas de avidina no
acopladas se suprimieron mediante filtración en gel en un columna
(1,5 \times 50 cm) de Sepharosa-2B en tampón
B.
Se hizo reaccionar la avidina con SATA (5 moles
por mol de avidina) (10 mg/ml de avidina en NaP_{i} 1M, pH
7,4) durante la noche a 4ºC. A la misma solución se le añadió
anhidro succínico en DMF (50 moles por mol de avidina) (el DMF
total fue inferior al 1% del volumen de reacción), y se incubó la
solución durante 2 horas. El pH de la mezcla de reacción se
mantuvo a 7,4 mediante la adición de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M. Los
grupos tiol protegidos (tioéster) se liberaron con hidroxilamina
(0,1 M a pH 7,0) durante 1 hora a temperatura ambiente.
Finalmente, las moléculas de bajo peso molecular en exceso se
suprimieron mediante el uso de una columna 1,5 \times 30 cm de
G-25 en tampón B (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M,
EDTA 5 mM, pH 6,0, desgasada y saturada con argón). Se
recogió el pico de proteína (avidina-SH) y se hizo
reaccionar la proteína con liposomas conteniendo maleimida.
Se tiñeron cuentas de poliestireno carboxiladas
(38 nm) (ver Ejemplo 1, parágrafo IIIB) con nC_{10}. Se usó la
química de conjugación EDAC/sulfo-NHS para acoplar
el Ab_{F} a estas cuentas de poliestireno. Típicamente, 10 ml de
NaP_{i} 0,02 M, conteniendo 5 mg/ml de cuentas de poliestireno
teñidas con nC_{10} y 11 mg/ml sulfo-NHS
(pH ajustado a 5,5) se mezclaron con 1 ml de una solución
recién preparada de EDAC (200 mg/ml) en D-H_{2}O.
Después de incubar a temperatura ambiente (en la oscuridad) durante
25 minutos, se centrifugaron las cuentas para suprimir el exceso de
EDAC (puesto que la EDAC causa microagregación de estas cuentas, fue
posible apelotonarlas con centrífugas convencionales, por ejemplo,
Sorval usando un rotor SA-600 a 15.000 rpm). Las
cuentas precipitadas se resuspendieron en 3 ml de NaP_{i} 0,005
M/pH 5,8, y entonces se transfirieron dentro de una solución
de proteína agitada (15 ml de Borax 0,02 M, NaCl 0,08 M, 2 mg/ml 3G1
IgG (Ab_{F}), 8 mg/ml BSA, pH 8,9). Se agitó la mezcla
suavemente (sin remover) durante la noche a 4ºC. Los grupos
reactivos que permanecían en las cuentas, si había alguno, se
bloquearon con glicina 0,083 M y 15 mg/ml de BSA, pH 8,9, a
4ºC durante 60 minutos. Las proteínas no acopladas se suprimieron
mediante lavados sucesivos con NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05,
pH 7,6. El precipitado final se resuspendió en el tampón de
lavado, se sonicó, y se almacenó, tal como estaba, a 4ºC. El tamaño
final de las cuentas era de 140 nm.
Se tiñeron cuentas de látex carboxiladas (0,175
\mu) con el BA-C_{18} (ver Ejemplo 1, parágrafo
IIIC). Se usó la química de conjugación
EDAC/sulfo-NHS para conjugar la avidina a estas
partículas. La activación de las cuentas mediante
sulfo-NHS/EDAC se realizó de la misma forma como se
ha descrito más arriba para la preparación de
Ab_{F}-PB/nC_{10}. Se centrifugaron las cuentas
activadas (100 mg) para retirar el exceso de EDAC, a continuación
se resuspendieron en 2,5 ml de NaP_{i} 0,005 M/pH 5,8, y se
transfirieron a una solución de proteína agitada (15 ml de Borax
0,025 M, 1,33 mg/ml de avidina, pH 9,1). A continuación se
agitó la mezcla suavemente a 4ºC durante la noche. Los avidina en
las cuentas se succiniló mediante la adición de 20 \mul de
anhidro succínico en DMF (en exceso molar de 60 veces sobre la
avidina) y se incubaron aún más a 4ºC durante 1 hora. Se bloquearon
las cuentas con 7 mg/ml de BSA (concentración final en la mezcla de
reacción) durante 60 minutos, a 4ºC. Finalmente, se lavaron las
cuentas tres veces con NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6
mediante centrifugación, y se almacenaron en 10 ml de tampón de
lavado. En el último paso, se sonicaron las cuentas para obtener
partículas monodispersas. El tamaño de las cuentas no cambió
significativamente después del marcaje con proteína (\sim190 nm).
La avidina-PB/BA-C_{18} se
almacenó en tampón de
lavado a 4ºC.
lavado a 4ºC.
6-carboxifluoresceína, Kodak;
éster biotina-NHS, Pierce Chemical Co.;
4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina,
Aldrich Chemical Co.; DMF seco destilado sobre óxido cálcico;
resina de intercambio aniónico
Ag-MP-1 (Cl^{-}), BioRad
Laboratories.
Se disolvió la
6-carboxifluoresceína (VII 1) (10 g, 26,6 mmoles) en
DMF seco (25 ml). La N-hidroxisuccinimida (3,22 g,
28 mmoles) se añadió como un sólido a la solución de DMF, y se dejó
disolver. A continuación se enfrió la solución en un baño helado.
La diciclohexilcarbodiimida (5,8 g, 28 mmoles) se disolvió en DMF
seco (10 ml) y se añadió todo a la vez a la solución fría de DMF.
Se revolvió la mezcla a temperatura de un baño de hielo durante 30
minutos, y entonces se dejó volver a temperatura ambiente. El curso
de la reacción se siguió mediante TLC (10%
MeOH-CH_{2}-Cl_{2} conteniendo
un 1% de ácido acético). Transcurridas 3 horas, la formación del
éster fluoresceína-NHS VII2 fue completa.
Se diluyó
4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina
(25,5 g, 125 mmoles) con DMF seco (10 ml). Se enfrió la mezcla de
reacción del éster de fluoresceína-NHS en un baño de
hielo, en atmósfera de argón, y la solución de diamina se añadió
gota a gota a lo largo de un período de 5 minutos. Se retiró el baño
enfriador, y se continuó la agitación a temperatura ambiente. El
curso de la reacción se siguió mediante TLC usando el sistema
anterior. Cuando se juzgo que la reacción se había completado, se
diluyó la mezcla con agua (100 ml), y se enfrió con hielo para
precipitar la diciclohexilurea, la cual se retiró mediante
filtración.
El filtrado se convirtió en una papilla con la
resina de intercambio aniónico
AG-MP-1(Cl^{-}), y se
vertió dentro de una columna de cromatografía. Se lavó la resina con
metanol acuoso al 50% hasta que ya no pudo detectarse la diamina
libre mediante ninhidrina. Entonces se eluyó la resina con ácido
clorhídrico 0,1 N en metanol acuoso al 50%. La fluoresceína amina
hidrocloruro eluyó primero, seguida por la
6-carboxifluoresceína. Las fracciones puras se
juntaron y se secaron en un rotavapor. Después de secado bajo vacío
elevado se recuperaron 3,4 g de fluoresceína amina hidrocloruro
VII3 pura.
La fluoresceína amina hidrocloruro VII3 (350 mg,
0,61 mmoles) se disolvió en DMF seco (15 ml). Se añadió
trietilamina (300 ml) seguida por éster biotina-NHS
(445 mg, 0,8 mmoles). El curso de la reacción se siguió mediante
TLC (MeOH-CH_{2}-Cl_{2}/ácido
acético/agua, 20:78:1:1). Cuando se juzgo que la reacción se había
completado, se retiró el DMF en un rotavapor. Se disolvió el residuo
en metanol (10 ml) y se convirtió en una papilla con gel de sílice
(10 g). Se secó la papilla en un rotavapor hasta obtener un polvo
que fluía libremente, el cual se convirtió en papilla en
diclorometano y se aplicó a la parte superior de una columna de gel
de sílice (2,5 \times 25 cm) equilibrada con diclorometano. Se
eluyó la columna con la anterior mezcla de solventes para TLC. Las
fracciones que contenían producto se juntaron y se suprimió el
solvente en un rotavapor. Se disolvió el residuo en etanol y se
filtró. El filtrado se evaporó lentamente, y el producto se depositó
como una goma. Se secó la goma bajo vacío elevado para obtener 350
mg de fluoresceína-LC_{21}-biotina
VII4 (F-LC_{21}-biotina), la cual
se usó sin más caracterización.
Se realizó un ensayo de HCG mezclando junto
primero HCG (cantidades variables),
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18},
y Ab_{2}(HCG)-biotina. Después de su
incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se añadió una
cantidad en exceso de avidina-Lip/nC_{10}, y se
continuó la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos
adicionales. Finalmente, se iluminaron los tubos durante 1 minuto
cada uno, y se midió la luminiscencia durante 20 segundos.
Combinar:
- 50 \mul de HCG en concentraciones variables en tampón de muestra (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 0,04% BSA, 20% sacarosa, 4 mg/ml sulfato de dextrano (T-500), pH 7,5).
- 50 \mul de 4 \mug/ml Ab_{2}(HCG)-biotina en tampón de ensayo (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 0,04% BSA, pH 7,5), y
- 50 \mul de reactivo Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18} (5 \times 10^{8} OD/tubo).
Incubar 1 hora a temperatura ambiente, con
agitación, y en la oscuridad.
Añadir:
- 50 \mul de 1,5 \times 10^{12} avidina-nC_{10}-Lip (7,3 \times 10^{10} Lip/tubo).
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente, con
agitación, y en la oscuridad.
Iluminar durante 1 minuto, con lámpara halógena
(120 mW de salida de luz cuando se usa un filtro de corte de 650
nm). A continuación, con la fuente de luz apagada, medir la
intensidad de luz emitida durante 20 segundos. Los resultados se
resumen en la Figura 3.
El ensayo se realizó mezclando 50 ml de
avidina-PB/BA-C_{18} (2 \times
10^{10} cuentas/ml), 50 ml de
Ab_{F}-PB/nC_{10} (5 \times 10^{12}
cuentas/ml), y 100 ml de
biotina-LC_{21}-F (cantidades
variables) en NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de
BSA/pH 7,6. Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente
durante 1,5 horas con agitación en la oscuridad. Finalmente, se
iluminó cada tubo con una fuente de lámpara halógena (ajustada con
un filtro de corte de 650 nm) durante 1 minuto, transcurrido el cual
se midió la emisión de luz durante 20 segundos integrando la
intensidad de luz en un luminómetro Turner 20e. Los
resultados se resumen en la Figura 4.
El ensayo de TSH se realizó mezclando 200 \mul
de THS en concentraciones variables en NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15
M, 4 mg/ml de BSA/pH 7,6, con 50 \mul de 4 \mug/ml de
Ab_{1}(TSH)-biotina y 4 \mug/ml de
Ab_{2}(THS)-F. Estas mezclas se incubaron a
temperatura ambiente durante 1,5 horas. A continuación, se
añadieron 100 \mul de PBS, conteniendo 10^{10} cuentas de
avidina-PB/BA-C_{18} y 2,5
\times 10^{11} cuentas de
Ab_{F}-PB/nC_{10}, en cada tubo. Se continuó la
incubación a temperatura ambiente durante otras 1,5 horas.
Finalmente, se iluminó cada tubo con una fuente de lámpara halógena
(ajustada con un filtro de corte de 650 nm), y después se midió la
emisión de luz integrando la intensidad de luz durante 20 segundos
(Figura 5 y Figura 6) en un luminómetro Turner 20e.
\vskip1.000000\baselineskip
(No es un ejemplo de la
invención)
Gotas de aceite teñidas con colorante aceptor =
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18}
(descritas en el Ejemplo 3, parte II).
Ab_{2}(HCG)-biotina -
preparado de forma similar al Ejemplo 2, parte I, a partir del
derivado NHS de la biotina, comprado a Pierce Chemical Co.
Estreptoavidina-T680 - de
Ultralite Diagnostics Co., estreptoavidina marcada con el análogo
soluble en agua del colorante nC_{10} descrito más arriba.
El ensayo se realizó mezcla 50 ml del tampón de
muestra (NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA, 4 mg/ml de
dextrano-SO_{4} (T500), 20% de sacarosa/pH
7,6) conteniendo cantidades variables de HCG con 50 \mul de 4
\mug/ml de anti-HCG-biotina en
tampón de ensayo (NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de
BSA/pH 7,6) y 50 \mul del reactivo
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{19}
conteniendo 5 \times 10^{8} gotas de aceite. Esta mezcla se
incubó durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A
continuación, se añadieron 50 \mul de 2 \mug/ml de
estreptoavidina-T680 en tampón de ensayo en cada
tubo, y la incubación continuó durante otros 30 minutos
adicionales. Finalmente, se iluminó cada tubo durante 1 minuto con
una fuente de luz de lámpara halógena (ajustada con un filtro de
corte de 650 nm), y entonces se midió la emisión de luz durante 20
segundos usando el luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen
en la Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia diana se seleccionó a partir del
ADNJ del gen K12 de Escherichia coli (J. C. A. Bardwell, K.
Tilly, E. Craig, J. King, M. Zylicz, y C. Georgopoulos, J. Biol.
Chem. 261: 1782-1785 (1986)). Se preparó un
50mero con la secuencia mostrada mediante la estrategia del
fosfito-triéster usando un Biosearch 8750,
incluyendo una biotina incorporada en el extremo 5' usando
fosforamidito Biotina-ON^{TM} (Clontech, Palo
Alto, CA).
Secuencia:
- GCGGGCGAAGGTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTA. La sonda fue un 30mero complementario incluyendo una fluoresceína (F) anclada a una C modificada, con la secuencia
La fluoresceína se introdujo mediante la
incorporación del nucleótido modificado
N^{4}-LCA-5-metildesoxicitidina
CEDT-fosforamidito (American Bionetics, Hayward,
CA) y el subsiguiente marcaje con el éster
N-hidroxisuccinimida de la
5-carboxifluoresceína, usando un exceso molar de
éster de 200 veces en pH 9,0 NaHCO_{3} conteniendo 30%
(v/v) de DMF. El producto crudo se purificó mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida. Las cuentas de
avidina-PB/BA-C_{18} y de
Ab_{F}-PB/nC_{10} fueron las mismas descritas en
ejemplos anteriores.
Se preparó una curva estándar para la diana
diluyéndola en serie en NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 600 mM,
pH 7,5, conteniendo 4 g/l de albúmina de suero bovino y 10
mg/l de ADN de timo de ternera como portadores. Se añadieron
alícuotas (5 \mul) a 4,8 pmoles de sonda marcada con fluoresceína
en 5 \mul del mismo tampón en tubos de ensayo de polipropileno de
12 \times 75. Se taparon las mezclas y se calentaron a 72ºC
durante 10 minutos para asegurar la total hibridación. Se añadieron
aproximadamente 10^{10} cuentas donantes (sensibilizador)
(Ab_{F}-PB/nC_{10}) en 50 \mul de
NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5, conteniendo 4
g/l de albúmina de suero bovino, seguidas por 2,5 \times
10^{11} cuentas aceptoras
(avidina-PB/BA-C_{18}) en 50
\mul del mismo [tampón]. Después de 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación en un agitador orbital, se ilumino cada tubo
durante 1 minuto usando un lámpara halógena con un filtro de 650 nm
tal como se ha descrito en ejemplos anteriores. La generación de
luz se determinó durante 20 segundos usando un luminómetro Turner.
La curva estándar resultante se muestra en la Figura 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 50 nmoles del oligonucleótido
5'-amino-modificado y desalado
(30-mero)
- 5'-UAA-TAC-AGG-TTG-TTG-CCT-TCA-CGC-TCG-AAA-3'
en 0,5 ml de tampón carbonato 0,1 M, pH
9,0. Se añadió una solución de
succinimidil-6-(biotinamido)hexanoato
(Pierce, #21336-G): 125 \mul de 120 mg/ml en DMF,
a la solución tampón. Se incubó la mezcla durante la noche, y se
purificó usando electroforesis preparativa (gel de poliacrilamida al
12% y urea 7 M en tampón TBE (ácido tris bórico y EDTA): base tris
89 mM (tri(hidroximetil)-aminometano), ácido
bórico 89 mM, Na_{2} EDTA 2,5 mM (ácido
etilendiaminotetraacético), pH 8,3), a 400 voltios durante 4
horas. El oligonucleótido biotinilado se extrajo del gel y se
diluyó con 3 ml de NH_{4}CO_{3} 0,1 M a 37ºC durante la noche.
El material se purificó de nuevo sobre una Sep-Pak
(una columna C-18, Waters #51910), se secó al vacío,
y se suspendió en agua doblemente destilada.
El rendimiento de la sonda biotinilada fue de
34,8 nmoles (58%).
Se preparó una solución de 50 nmoles del
oligonucleótido (30-mero) con una citosina central
(en la posición 14) amino-modificada
- 5'-CTG-CCG-GTG-CGC-CAT-GUT-CGC-CCG-CCT-CAC-3'
en una mezcla de tampón NaHCO_{3} 0,1 M,
pH 6,9 (190 \mul) y acetonitrilo (120 \mul). Se añadieron
200 \mul de una solución 0,1 M de succinimidil éster de
5/6-carboxifluoresceína (Molecular Probes, #01112)
en DMF a la solución tampón. Se incubó la mezcla durante la noche a
temperatura ambiente. Los pasos restantes son los mismos que los
descritos más arriba para la sonda biotinilada.
La sonda fluoresceinada se obtuvo con un
rendimiento del 41%.
- Tris 10 mM (Tris(hidroximetil)aminometano), KCl 50 mM, pH 8,3, conteniendo 5 mg/ml de sulfato de dextrano, NaCl 0,5 M, 1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino), y 25 \mug/ml de ADN de timo de ternera.
Se añadieron 40 \mul de tampón de ensayo
conteniendo sonda fluoresceinada (1,5 pmoles) y sonda biotinilada
(1,2 pmoles) a 10 \mul de ADN diana sintético
(65-meros) diluido en series en tampón de ensayo. Se
hibridó la mezcla durante 5 minutos a 55ºC. Se añadieron las
cuentas (20 \mug de cuentas de avidina y 40 \mug de cuentas
anti-fluoresceína, cada una en 50 \mul de tampón
de ensayo). La solución conteniendo las cuentas se incubó durante
15 minutos
a 55ºC.
a 55ºC.
Las cuentas de avidina se prepararon cargando
cuentas de poliestireno de 0,175 \mu carboxiladas con
benzalacridina, y las cuentas se decoraron con avidina, usando la
química del EDAC
(1-etil-3-(dimetilaminopropil)-carbodiimida
hidrocloruro. Sigma Chemical Co., #E-6383).
La benzalacridina se preparó añadiendo 0,413 ml
de solución 1,6 M de n-butil-litio
en hexano a
10-dimetoxifosfinil-9-metil-acridina
(Monatsh Chem. 114 3, 1988) en tetrahidrofurano anhidro
(THF) a -78ºC (baño de acetona/hielo seco) bajo argón. A partir de
la adición de la solución de
t-butil-litio, se añadió una
solución de la amida anterior en THF 20 minutos después de la
adición del t-butil-litio. Se dejó
calentar la solución de reacción hasta temperatura ambiente durante
la noche. A continuación se aisló el producto mediante TLC (gel de
sílice - 3:7 etilacetato/hexano). El producto aislado se analizó
mediante análisis del espectro de masas y RMN, y se almacenó en la
oscuridad.
Las cuentas anti-fluoresceína se
prepararon cargando cuentas carboxiladas de poliestireno de 0,04
\mu con
tetra-n-decil-Al-ftalocianina
(Ultra Diagnostics, Lote #GR11-82), y se decoraron
las cuentas con anticuerpo anti-fluoresceína usando
la química del EDAC.
La señal se leyó iluminando durante 60 segundos
la solución que contenía las cuentas con una lámpara halógena
equipada con un filtro de corte de 650 nm. La luminiscencia se midió
durante 20 segundos. Los resultados se resumen en la Tabla 1, y se
muestran en la Figura 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Diana: ADN genómico de E. coli.
Cebadores: 100 nM de cada uno de:
24-mero biotinilado
- 5'-UCA-TGG-TTC-TGG-TCA-GGT-GCA-GAT-3'
y 18-mero no
biotinilado
- 5'-TTT-GAG-CGC-GGG-CTG-TTG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de ciclado:
- Un ciclo:
94ºC | 3 min | |
59ºC | 1 min | |
72ºC | 1,5 min |
\vskip1.000000\baselineskip
- a continuación 35 ciclos:
94ºC | 3 min | |
59ºC | 1,5 min | |
72ºC | 2 min |
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 10 \mul de 1,5 pmoles de sonda
fluoresceinada en tampón de ensayo, preparada según el
procedimiento del Ejemplo 6, a 20 \mul de producto de PCR a varias
concentraciones iniciales de diana. La mezcla se desanturalizó a
95ºC durante 5 minutos, a continuación se hibridó a 55ºC durante 5
minutos. Se añadieron las cuentas (20 \mug de benzalacridina y
30 \mug de cuentas de Al-ftalocianina en 50 \mul
de tampón de ensayo). La solución conteniendo las cuentas se incubó
durante 15 minutos a 55ºC. La señal se leyó siguiendo el
procedimiento tal como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados
se resumen en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
- Látex de 175 nm modificado con carboxilato, procedentes de Bangs Laboratories.
- Etilenglicol, etoxietanol, alcohol bencílico, clorofila-a: Aldrich.
- Europio (III) theonil-trifluoroacetato (EuTTA): Kodak.
- Óxido de trioctilfosfina (TOPO): Aldrich.
- Dioxeno [1-(4-dimetilaminofenil)-6-fenil-1,4-dioxeno]: preparado mediante una modificación de un procedimiento descrito en: K. A. Zaklika, T. Kissel, A. L. Thayer, P. A. Burns y P. Schaap: Photochem. Photobiol. 30:, 35-44 (1979).
Se añadió una solución de
clorofila-a en alcohol bencílico (1,0 ml, 0,6 mM) a
8,0 ml de alcohol bencílico a 105ºC. Se añadió una suspensión de
látex, de 175 nm de tamaño, modificado con carboxilato, en agua
(10%, 1,0 ml) a la solución de alcohol bencílico. Se agitó la
mezcla durante 5 minutos a 105ºC, y se enfrió hasta temperatura
ambiente. Se añadió etanol (10,0 ml) y se centrifugó la muestra. El
precipitado se resuspendió en una mezcla 1:1 de
etanol-agua (10,0 ml), y se centrifugó la
suspensión. El mismo procedimiento de resuspensión y centrifugación
se repitió en agua (10,0 ml), y el precipitado se resuspendió en
agua (1,8 ml).
- A.
- Concentración de colorante: Se encontró que una solución preparada añadiendo 10 \mul de la anterior suspensión de cuentas en dioxano (990 \mul) tenía una absorbancia de 0,11 a 660 nm, correspondiente a 2,6 \mumoles de clorofila-a en un gramo de cuentas.
- B.
- Generación del oxígeno singlete: Se irradió una mezcla de cuentas de clorofila-a (200 \mug) y 2 \times 10^{-4} moles de ácido antraceno-9,10-dipropiónico (ADPA) en dos ml de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5, conteniendo NaCl 100 mM) con una lámpara de tungsteno-halógena, equipada con un filtro de corte de 645 nm, durante 20 minutos. Las cuentas se retiraron mediante filtración, y la concentración del producto de oxigenación se determinó espectrofotométricamente a 400 nm. Se encontró que la velocidad era de 3,0 nmoles de producto de oxigenación por minuto. En las mismas condiciones, 38 pmoles de un sensibilizador soluble, aluminio-ftalocianina-tetrasulfonato, generaron la misma cantidad de producto de oxigenación (la cantidad de sensibilizador en la cuentas era de 200 \times 10^{-6} \times 2,6 \times 10^{-6} = 520 pmoles).
Se centrifugó una suspensión de cuentas de látex
carboxiladas (175 nm de tamaño, 10% de sólidos en agua, 30,0 ml).
Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en
etilenglicol (60,0 ml). Se calentó la suspensión hasta 100ºC. Se
añadieron lentamente 9,0 ml de solución de alcohol bencílico, la
cual es 1,67 M en clorofila-a y 3,33 mM en
tetrabutil-esquarato
[1,3-bis(4-dibutilaminofenil)esquarato]
a lo largo de 3 minutos a la suspensión. El calentamiento se
prolongó durante 7 minutos, a continuación se enfrió la suspensión
a temperatura ambiente en un baño de agua. La suspensión de alcohol
bencílico se añadió a etanol frío (120 ml). Se centrifugó la mezcla
y se descartó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en
etanol al 50% en agua, y se centrifugó la suspensión. El mismo
procedimiento de resuspensión y centrifugación se repitió en etanol
al 5% en agua (30 ml).
- A.
- Concentración de colorante. La concentración del tetrabutil-esquarato en las cuentas se determinó espectrofotométricamente tal como se ha descrito más arriba para las cuentas de clorofila-a. Se encontró que era 44 \muM de colorante en las cuentas.
- B.
- Generación del oxígeno singlete. Veinticinco \mul de una solución 5 mM de ADPA en etanol se añadieron a una suspensión de cuentas (100 \mug) en tampón fosfato, pH 7,0 (20 mM, conteniendo NaCl 50 mM). La mezcla se irradió como más arriba, usando un filtro de paso alto de 610 nm. La velocidad de formación de oxígeno singlete se calculó a partir de la velocidad de disminución en la absorbancia (a 400 nm) del ADPA. Se encontró que las cuentas generaban 7 \times 10^{-2} \mumoles de oxígeno singlete/min.
Se añadieron 20 ml de cuentas de látex
carboxiladas de 175 nm (suspensión al 10% en agua) a etoxietanol
(20,0 ml). La mezcla se calentó hasta 90ºC. Se añadieron a la mezcla
20 ml de una solución que es dioxeno 10 mM, EuTTA 20 mM, y TOPO 60
mM en etoxietanol. Se añadió etanol (40,0 ml) y se centrifugó la
mezcla. El precipitado se resuspendió en etanol al 80%, y se
centrifugó la suspensión. El procedimiento de resuspensión y
centrifugación se repitió en etanol al 10% (36 ml).
- A.
- Concentración de colorante. La concentración de EuTTA en las cuentas se determinó espectrofotométricamente como más arriba, y se encontró que era 0,07 M. Puesto que la concentración de dioxeno no puede determinarse en la presencia de EuTTA, se midió en cuentas que se cargaron tan sólo con dioxeno, en las mismas condiciones. Se encontró que la concentración era 0,016 M.
- B.
- Generación de la señal. Se mezcló una suspensión de cuentas (25 \mug) en tampón fosfato (0,5 ml, fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, 0,1% de Tween 20, pH 7,0) con una solución 2 \muM de aluminio-ftalocianina-tetrasulfonato (0,5 ml) en el mismo tampón. Se iluminó la mezcla durante 1 minuto con una lámpara de tungsteno-halógena de 125 w equipada con un filtro de paso alto de 610 nm. A continuación de la iluminación, se colocó la mezcla en un luminómetro Turner TD-20e, y se midió la luminiscencia durante 20 segundos. Se encontró que la intensidad era de 327 RLU (unidades de luz relativas)/segundo.
La longitud de onda de la luz emitida se midió
usando un espectrofluorímetro de barrido
Perkin-Elmer 650-40. El pico de
emisión principal estaba centrado cerca de los 615 nm.
Se disolvieron 73,6 mg de
sulfo-NHS
(N-hidroxisulfosuccinimida, Pierce Chemical Co.,
#24510 G) en 6 ml de una suspensión de 4 mg/ml de cuentas de
poliestireno de 40 nm, modificadas con carboxilato (teñidas con
clorofila-a y tetrabutil-esquarato),
en agua. Se añadieron 136 \mul de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M. El
pH se ajustó a 5,2. Se añadieron 136 \mul adicionales de
agua. 130,4 mg de EDAC
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
hidrocloruro, Sigma Chemical Co, #E-6383) en 454
\mul se añadieron lentamente a una suspensión de cuentas en
agitación. La suspensión se incubó durante 20 minutos a temperatura
ambiente. Las cuentas se centrifugaron durante 20 minutos a 15.000
rpm en un rotor Sorvall SA-600 a 4ºC. Se descartó el
sobrenadante. A continuación, se resuspendieron las cuentas en 1,2
ml de fosfato sódico 5 mM, pH 5,8, y la suspensión se sonicó
hasta dispersar de nuevo las cuentas. Las cuentas se añadieron
lentamente a 4,8 ml de una solución en agitación que contenía 1,7
mg/ml de IgG (monoclonal anti-fluoresceína) + 6,7
mg/ml de BSA + bórax 17 mM, pH 9,2, y se mezclaron suavemente
durante la noche a 4ºC. Se añadieron 800 \mul de glicina 2 M, que
fue seguida a continuación por 2,8 ml de 50 mg/ml de BSA en 0,1
bórax, a la suspensión de cuentas. Se sonicó la suspensión y se dejó
mezclar suavemente durante 3 horas a 4ºC. Las cuentas se
centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm. El sobrenadante se
descartó. Las cuentas se resuspendieron en 3 ml de fosfato sódico
50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6, y se sonicó la suspensión. Los
pasos de centrifugación, resuspensión y sonicación se repitieron un
total de tres centrifugaciones. Después de la tercera
centrifugación, las cuentas se resuspendieron en 2,4 ml de fosfato
sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. La suspensión resultante
se sonicó y almacenó a 4ºC.
Se disolvieron 4,4 mg de
sulfo-NHS en 0,4 ml de una suspensión de 25 mg/ml de
cuentas de poliestireno de 175 nm, modificadas con carboxilato
(teñidas con dioxeno/EuTTA/TOPO), en agua. Se añadieron 0,0160 ml de
Na_{2}HPO_{4} 0,25 M. 8 mg de EDAC, disueltos en 0,030 ml de
agua, se añadieron lentamente a una suspensión de cuentas girando.
La suspensión se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Las cuentas se centrifugaron durante 20 minutos a 15.000 rpm en un
rotor Sorvall SA-600 a 4ºC. Se descartó el
sobrenadante.
Las cuentas se resupendieron en 0,6 ml de
fosfato sódico 0,005 M, pH 5,8. La suspensión se sonicó para
resuspender las cuentas. Las cuentas se añadieron lentamente de
nuevo a 3 ml de una solución en agitación que contenía 1,33 mg/ml
de avidina-D (Vector) + bórax 17 mM, pH 9,2,
y se mezclaron suavemente durante la noche a 4ºC. Se añadieron
0,004 ml de anhídrido succínico 1 M en DMF. La suspensión de incubó
durante 1 hora a 4ºC con agitación suave. Se añadieron 0,4 ml de
50 mg/ml de BSA en fosfato sódico 10 mM + NaCl 150 mM, pH
7,0. La suspensión se dejó mezclar suavemente durante 3 horas a 4ºC.
Las cuentas se centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm. El
sobrenadante se descartó. Las cuentas se resuspendieron en 3 ml de
fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. Se sonicó la
suspensión. Los pasos de centrifugación, resuspensión y sonicación
se repitieron un total de tres centrifugaciones. Después de la
tercera centrifugación, las cuentas se resuspendieron en 2,25 ml de
fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. La suspensión se
sonicó y almacenó a 4ºC.
Tampón de ensayo: Barbital 0,075 M, NaCl
0,2 M, 0,4% de BSA, 1,25% de IgG de ratón, 10 mg/ml de sulfato de
dextrano (P.M. 500.000), 1,0 mg/ml de dextrano
T-500, 10 \mug/ml de IgG agregado.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuentas de aceptor:
Avidina-EDAC, 175 nm, cargadas con
dioxeno/EuTTA/TOPO.
Cuentas de sensibilizador:
Anti-fluoresceína-EDAC, 40 nm,
cargadas con clorofila-a/esquarato.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 50 \mul de una solución de ácido
8-anilino-1-naftalen-sulfónico,
sal de amonio (Sigma, A-3125) en tampón de ensayo
(0,75 mg/ml) a 50 \mul de estándar de T_{3} o muestra. Se
añadieron 100 \mul de tampón de ensayo. Se añadieron 50 \mul de
anti-T_{3} biotinilado (70 ng/ml) en tampón de
ensayo. Se añadió el trazador,
T_{3}-LC_{21}-F1 (1,8 ng/ml)
\vskip1.000000\baselineskip
en tampón de ensayo (50 \mul). Se incubó la
mezcla durante 15 minutos a 37ºC. Se añadieron 500 \mul de una
suspensión de cuentas de sensibilizador (50 \mug) y cuentas de
aceptor (6,25 \mug) en tampón de ensayo, y se incubó la mezcla
durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió la solución de "detención"
(50 \mul) (fluoresceína 10 \muM, biotina 0,5 mM).
La señal se leyó mediante una lámpara halógena
con un filtro de corte de 610 nm, un minuto de iluminación, y 20
segundos de medición.
Los resultados se resumen en la Figura 10. La
señal de luminiscencia se representó como una función de la
concentración de T_{3}. La modulación de la señal fue del 94% con
8,5 ng/ml de T_{3}. A 0,5 ng/ml, la modulación de la señal fue
del 38%.
Aunque la invención precedente ha sido descrita
en cierto detalle, a modo de ilustración y ejemplo, con los
propósitos de clarificación y entendimiento, será evidente que
pueden practicarse ciertos cambios o modificaciones dentro del
ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Composición que comprende:
- a)
- primeras partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un compuesto quimioluminiscente capaz de reaccionar con el oxígeno singlete, en donde dichas primeras partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un primer miembro de un par de unión específica, y
- b)
- segundas partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un fotosensibilizador, en donde dicho fotosensibilizador es capaz, en su estado excitado, de activar el oxígeno a su estado singlete, en donde dichas segundas partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un segundo miembro de un par de unión específica.
2. Composición según la reivindicación 1, en
donde dichas partículas que pueden suspenderse se seleccionan de
forma independiente del grupo consistente en partículas de látex,
bicapas lipídicas, gotas de aceite, partículas de sílice, y soles
metálicos.
3. Composición de la reivindicación 1 ó 2, en
donde dichas primeras partículas que pueden suspenderse, dichas
segundas partículas que pueden suspenderse, o ambas, son partículas
de látex.
4. Composición de la reivindicación 1, 2 ó 3,
en donde dicho primer y segundo miembro de un par de unión
específica se seleccionan independientemente del grupo consistente
en receptores, ligandos y polinucleótidos.
5. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho primer miembro de un par de
unión específica se selecciona del grupo consistente en receptores,
ligandos y polinucleótidos.
6. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho compuesto quimioluminiscente
contiene un grupo olefina.
7. Composición de la reivindicación 6, en donde
dicho compuesto quimioluminiscente contiene un grupo olefina y uno o
más sustituyentes donantes de electrones conjugados con dicho grupo
olefina.
8. Composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho compuesto quimioluminiscente
se selecciona del grupo consistente en
9-alquiliden-N-alquil
acridanos, enoléteres, enaminas, y
9-alquilidenxantenos.
9. Composición de la reivindicación 8, en donde
dicho compuesto quimioluminiscente es un
2,3-diaril-4,5-dihidrodioxeno
con la fórmula:
en donde X = O,S ó ND_{2}, Ar and
Ar' son arilos, incluyendo los arilos sustituidos en los que al
menos uno de los sustituyentes está presente como grupo amino, éter
o hidroxilo, y D_{2} es alquilo o
arilo.
10. Composición de la reivindicación 9, en donde
X es S.
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