ES2280110T3 - Procedimiento para determinar un analito en una muestra. - Google Patents

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John S. Pease
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Abstract

Composición que comprende: a) primeras partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un compuesto quimioluminiscente capaz de reaccionar con el oxígeno singlete, en donde dichas primeras partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un primer miembro de un par de unión específica, y b) segundas partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un fotosensibilizador, en donde dicho fotosensibilizador es capaz, en su estado excitado, de activar el oxígeno a su estado singlete, en donde dichas segundas partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un segundo miembro de un par de unión específica.

Description

Procedimiento para determinar un analito en una muestra.
Esta invención se refiere a procedimientos, composiciones y equipos para determinar un analito en una muestra. En concreto, esta invención se refiere a ensayos de unión específica que no precisan de un paso de separación.
El campo del diagnóstico clínico ha visto una amplia expansión en años recientes, tanto en la variedad de materiales (analitos) que pueden determinarse fácil y precisamente, así como en los procedimientos para la determinación. Se desean medios apropiados, fidedignos, y no peligrosos para detectar la presencia de concentraciones bajas de materiales en líquidos. En la química clínica estos materiales pueden estar presentes en fluidos corporales en concentraciones inferiores a 10^{-12} molar. La dificultad para detectar concentraciones bajas de estos materiales está agravada por los tamaños relativamente pequeños de muestras que pueden usarse.
En el desarrollo de un ensayo hay múltiples consideraciones. Una consideración es la respuesta de la señal a cambios en las concentraciones de analito. Una segunda consideración es la facilidad con la que puede llevarse a cabo el protocolo para el ensayo. Una tercera consideración es la variación en la interferencia de muestra a muestra. La facilidad de preparación y purificación de los reactivos, la disponibilidad del equipamiento, la facilidad de automatización e interacción con los materiales de interés son algunas de las consideraciones adicionales al desarrollar un ensayo útil.
Una amplia categoría de técnicas implica el uso de un receptor que puede unirse específicamente a una determinada organización espacial y polar de un ligando marcado en función de la presencia de un analito. El efecto de unión por parte del receptor observado dependerá del marcaje. En algunos casos la unión al receptor meramente proporciona los medios para diferenciar en el peso molecular entre ligando marcado unido y no unido. En otros casos la unión del receptor facilitará la separación del ligando marcado unido del ligando marcado libre, o puede afectar la naturaleza de la señal obtenida a partir de la marca de forma que la señal varíe con la cantidad de receptor unido al ligando marcado. Aún otra variación es que el receptor se marca y el ligando no se marca. Alternativamente, tanto el receptor como el ligando se marcan, o diferentes receptores se marcan con dos marcas diferentes, en donde las marca interaccionan cuando están en estrecha proximidad y la cantidad de ligando presente afecta el nivel al que la marcas del receptor pueden interaccionar.
Hay una continua necesidad de técnicas nuevas y precisas que puedan adaptarse a un amplio espectro de ligandos diferentes, o usarse en casos específicos en los que otros métodos pueden no ser fácilmente adaptables.
Se han descrito previamente inmunoensayos homogéneos para moléculas pequeñas. Estos ensayos incluyen, entre otros, el ensayo FRAT® de SYVA, el ensayo EMIT®, el inmunoensayo de canalización enzimática (enzyme channeling immunoassay), y el inmunoensayo de transferencia de energía de fluorescencia (fluorescence energy transfer immunoassay, FETI); los inmunoensayos de inhibición enzimática (Hoffman La Roche y Abbott Laboratories); el inmunoensayo de polarización de la fluorescencia (Dandlicker). Todos estos procedimientos tienen una sensibilidad limitada, y solamente unos pocos, incluyendo el FETI y la canalización enzimática, son apropiados para analitos grandes y multiepitópicos.
Los compuestos luminiscentes, tales como los compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes, encuentran múltiples aplicaciones en el campo de los ensayos debido a su capacidad para emitir luz. Por este motivo, los emisores de luz (luminiscers) se han utilizado como marcadores en ensayos tales como ensayos de ácidos nucleicos e inmunoensayos. Por ejemplo, un miembro de un par de unión específica se conjuga con un emisor de luz y se emplean varios protocolos. El emisor de luz conjugado puede repartirse entre una fase sólida y una fase líquida en proporción con la cantidad de analito en una muestra sospechosa de contener el analito. Midiendo la luminiscencia de cualquiera de las fases, se puede relacionar el nivel de luminiscencia observado con una concentración del analito en la muestra.
Se han usado partículas tales como liposomas y fantasmas de eritrocitos como portadores de materiales solubles en agua encapsulados. Por ejemplo, los liposomas se han empleado para encapsular material biológicamente activo para una diversidad de usos, tales como sistemas de suministro de drogas en los que se atrapa un medicamento durante la preparación del liposoma y, a continuación se administra al paciente a tratar.
También se han usado en ensayos partículas tales como cuentas de látex y liposomas. Por ejemplo, en ensayos homogéneos puede atraparse un enzima en la fase acuosa del liposoma marcado con un anticuerpo o antígeno. Se provoca que los liposomas liberen el enzima en la presencia de una muestra y complemento. También se han usado liposomas marcados con anticuerpos o antígenos, que tienen colorantes fluorescentes o no fluorescentes solubles en agua encapsulados en una fase acuosa, o colorantes solubles en lípidos disueltos en la bicapa lipídica de la vesícula lipídica, para ensayos de analitos capaces de entrar en una reacción inmunoquímica con el anticuerpo o antígeno unido sobre la superficie. Se han usado detergentes para liberar los colorantes a partir de la fase acuosa de los
liposomas.
Los marcadores quimioluminiscentes ofrecen una sensibilidad excepcional en ensayos de unión a ligandos, pero normalmente se precisan uno o dos pasos químicos de activación. Los marcadores fluorescentes no tienen este defecto pero son menos sensibles.
Se han descrito marcadores quimioluminiscentes para inmunoensayos y ensayos de ácidos nucleicos en los que un grupo, que está unido covalentemente a una pareja de unión, emite luz a partir de su activación química. Genprobe vende un equipo para el ensayo de ácido nucleico que utiliza un éster de acridina (Pace2 System®, San Diego, CA), y CIBA-GEIGY (Basilea, Suiza) vende los equipos para inmunoensayos MagicLite® basados en este tipo de marcador. La transferencia de energía desde una sonda de ácido nucleico marcada a un aceptor fluorescente unido a una segunda sonda ha sido descrito por Heller et al., I y II, ver más abajo, para un ensayo sandwich de ácido nucleico. Magio I, ver más abajo, discute un procedimiento similar para inmunoensayos. La transferencia de energía desde un emisor de luz, covalentemente unido a un polinucleótido, hasta un fluoróforo intercalado fue mencionada por Heller et al., IV, ver más abajo. La transferencia desde un colorante intercalado hasta un emisor de fluorescencia sobre un polinucleótido fue descrita recientemente por Cardullo et al., ver más abajo. Más aún, McCapra, ver más abajo, ha descrito el uso de fotosensibilizadores como marcadores en donde el fotosensibilizador activa el oxígeno a su estado de singlete, el cual a su vez reacciona con un compuesto que, al calentarse, produce luz.
La solicitud de patente europea nº 0.345.776 (McCapra) descubre ensayo de unión específica que utilizan un sensibilizador como marcador. Los sensibilizadores incluyen una porción que, cuando se estimula mediante excitación con radiación de una o más longitudes de onda, u otros estímulos químicos o físicos (por ejemplo, trasferencia de electrones, electrólisis, electroluminiscencia, o transferencia de energía) alcanzará un estado excitado que (a) a partir de la interacción con oxígeno molecular producirá un oxígeno molecular singlete, o (b) a partir de la interacción con un leuco-colorante asumirá una forma reducida que puede devolverse a su estado original no excitado mediante interacción con oxígeno molecular, causando la producción de peróxido de hidrógeno. Cualquier interacción con el sensibilizador excitado producirá, con la adición de reactivos, una señal detectable.
La solicitud de patente europea nº 0.070.685 (Heller et al., I) describe un diagnóstico de hibridación homogénea de ácido nucleico mediante transferencia de energía no radiante.
En la solicitud de patente europea nº 0.070.687 (Heller et al., II) se describe un procedimiento de diagnóstico de hibridación de polinucleótido que emite luz.
La solicitud de patente europea nº 0.232.967 (Morrison I) discute procedimientos y composiciones para realizar ensayos para hebras polinucleotídicas diana. Los procedimientos incluyen poner en contacto una muestra con un reactivo que incluye una primera y una segunda sonda polinucleotídica. La primera y segunda sondas son capaces de asumir una primera posición en la que las sondas están unidas entre ellas, y una segunda posición en la que las sondas están unidas a una diana. La sondas incluyen porciones móviles capaces de interaccionar para producir una señal indicativa de que las sondas están en una de las dos posiciones.
La solicitud de patente europea nº 0.315.364 describe un ensayo inmunoquímico para determinar la presencia o concentración de antígeno o anticuerpos en un fluido. El ensayo comprende (a) formar un complejo ternario de un primer anticuerpo o antígeno marcado, un segundo anticuerpo o antígeno marcado, y el antígeno o anticuerpo a determinar, y (b) detectar una señal producida en la presencia de al menos un sustrato, por una interacción entre la primera marca y la segunda marca, potenciada por su proximidad entre ellas unidas a la sustancia antigénica.
La solicitud de patente europea nº 0.229.943 (Heller et al., III) describe sondas de desplazamiento Stokes fluorescentes para ensayos de hibridación de polinucleótidos.
La patente estadounidense nº 4.226.993 (Buckler et al.) describe ftalohidrazidas inmuno-funcionalizadas, las cuales se usan como intermediarias en la síntesis de conjugados quimioluminiscentes marcados con ftalohidrazida. Los conjugados son útiles como reactivos en ensayos de unión específica para determinar ligandos, o sus parejas de unión específica, en medio líquido.
Las patentes estadounidenses nº 4.380.580 y 4.383.031 (Bogulaski et al., I; y Bogulaski et al., II) describen respectivamente ensayos de unión específica quimioluminiscentes heterogéneos y homogéneos.
La patente estadounidense nº 4.220.450 (Maggio I) discute inmunoensayos fluorescentes químicamente inducidos.
La patente estadounidense nº 4.652.533 (Jolley) describe un procedimiento de inmunoensayo sobre fase sólida que incorpora una marca luminiscente.
La patente estadounidense nº 4.277.437 (Maggio II) descubre equipos para llevar a cabo inmunoensayos fluorescentes químicamente inducidos.
Heller et al. (IV) describen sondas quimioluminiscentes y fluorescentes para sistema de hibridación de ADN en "Rapid Detection and Identification of Infectious Agents" (1985), Academic Press, Inc., páginas 245-257.
Hara et al., describen un inmunoensayo usando un compuesto metal-complejo como catalizador quimioluminiscente en el Bull. Chem. Soc. Jpn. (1984) 57:3009-3010.
Kuschnir et al., describen la quimioluminiscencia fotosensible del luminol en 6-aminoftaloazina-1,4-(2H3H)-diona en Chemical Communications (1969) 193.
La detección de la hibridación de ácido nucleico mediante transferencia de energía de residencia de fluorescencia no radiante es descrita por Cardullo et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:8790-8794.
Morrison et al. describen una detección en fase soluble de polinucleótidos usando marcas fluorescentes interactivas e hibridación competitiva en Analytical Biochemistry (1989) 183:231-244.
Zomer et al., describen marcas quimioluminógenas en Analytica Chemica Acta (1989) 227:11-19.
Morrison II discute la detección resuelta en el tiempo de la transferencia de energía: teoría y aplicación a inmunoensayos en Analytical Biochemistry (1988) 174:101-120.
La patente estadounidense nº 4.299.916 (Litman et al., I) describe la producción preferente de señal sobre una superficie en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.233.402 (Maggio et al.) describe reactivos y procedimientos que emplean la canalización.
La patente estadounidense nº 4.261.968 (Ullman et al., I) describe la atenuación de la fluorescencia con pares inmunológicos en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.318.707 (Litman et al., II) discute un partícula macromolecular atenuadora de la fluorescencia en ensayos de receptor específicos.
La patente estadounidense nº 4.650.770 (Liu et al.,) discute la atenuación, mediante partículas absorbentes de energía, en ensayos de unión a proteína competitivos que emiten luz.
La patente estadounidense nº 4.654.300 (Zuk et al.) describe un ensayo de atenuación con microcuentas fluorescentes.
La patente estadounidense nº 4.174.384 (Ullman et al., I) describe la atenuación de la fluorescencia con pares inmunológicos en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.193.983 (Ullman et al., II) descubre composiciones de partículas liposómicas marcadas, e inmunoensayos con las mismas.
Las patentes estadounidenses nº 4.199.559 y 3.996.345 (Ullman et al., IV y V) describe la atenuación de la fluorescencia con pares inmunológicos en inmunoensayos.
O'Connell et al., Clin. Chem. (1985) 31(9): 1424-1426 descubre un inmunoensayo colorimétrico para digoxina utilizando grandes vesículas fosfolipídicas unilamelares que tienen colorante atrapado en la fase acuosa del liposoma.
Las patentes nº 3.850.578 (McConnell); 4.483.921 (Yaverbaum); y 4.483.929 (Szoka) descubren reactivos liposomales inmunoreactivos en los que el antígeno o anticuerpo se une a la superficie de las vesículas lipídicas.
Las patentes estadounidenses nº 4.529.561 (Hunt et al.); 4.552.803 (Lenk et al.); y 4.485.054 (Mezei et al.) descubren una variedad de procedimientos para preparar vesículas lipídicas.
La patente estadounidense nº 4.311.712 (Evans et al.) descubre un proceso para preparar un mezcla liofilizada de liposomas.
La patente estadounidense nº 4.588.578 (Fountain et al.) descubre un procedimiento para la preparación de vesículas lipídicas monofásicas, y el uso de dichas vesículas para sistemas de suministro de drogas.
La patente estadounidense nº 4.576.912 descubre un procedimiento para potenciar el nivel fluorescente de un inmunoensayo usando ciertos portadores de cadena larga marcados con una diversidad de fluoróforos.
La patente estadounidense nº 4.891.324 describe una partícula con emisores de luz para ensayos.
La destrucción selectiva de linfocitos T mediante liposomas fototóxicos está descrita por Yemu et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 246-250.
Mew et al., en J. of Immunology 130(3): 1473-1477 (1983) descubre la fotoinmunoterapia: el tratamiento de tumores animales con conjugados de anticuerpos monoclonales específicos contra el tumor y hematoporfirina.
La observación mediante microscopía óptica de moléculas pequeñas solas es discutida por Hirschfeld (1976) Applied Optics 15(2): 3135-3139.
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La solicitud de patente europea nº 0.322.926 (McCapra et al.) describe ensayos que utilizan ésteres, tioésteres y amidas quimioluminiscentes mejorados.
La solicitud de patente europea nº 0.352.713 (Schaap) describe un procedimiento y composiciones que proporcionan una quimioluminiscencia mejorada a partir de 1,2-dioxetanos.
La patente estadounidense nº 4.978.614 (Bronstein) descubre un procedimiento para detectar una sustancia usando la descomposición enzimáticamente inducida de dioxetanos.
Bronstein et al. (patente estadounidense nº 4.956.477) discuten la síntesis de 1,2-dioxetanos.
Schaap et al. describen en WO 90/07511 la luminiscencia mejorada a partir de 1,2-dioxetanos a través de la transferencia de energía hacia emisores de fluorescencia trabados.
La patente estadounidense nº 4.959.182 (Schaap) descubre un procedimiento y composiciones que proporcionan una quimioluminiscencia potenciada a partir de 1,2-dioxetanos.
Las patentes estadounidenses nº 4.962.192 (Schaap) y 4.857.652 (Schaap) describen compuestos quimioluminiscentes de 1,2-dioxetano.
Bronstein et al. describen un procedimiento usando 1,2-dioxetanos quimioluminiscentes en la patente estadounidense nº 4.931.223.
La purificación de dioxetanos solubles en agua y estables se descubre en WO 90/02742 (Edwards et al.).
En WO 90/02742 (Edwards et al.) se descubren anillos policíclicos fundidos quimioluminiscentes novedosos que contienen 1,2-dioxetanos, y ensayos en los que se usan.
WO 89/06226 (Edwards et al.) discute la síntesis de 1,2-dioxetanos e intermedios de los mismos.
Neckers et al. describen catalizadores fotosensibilizadores unidos a polímeros en la patente estadounidense nº 4.315.998.
En WO 88/00695 (Bronstein et al.) se discute un procedimiento para detectar una sustancia usando descomposiciones de dioxetanos inducidas enzimáticamente.
La solicitud de patente europea nº 0.324.202 (Zomer et al.) descubre compuestos de acridina como marcadores quimioluminógenos.
La solicitud de patente europea nº 0.144.914 (Alberella et al.) describe un ensayo de hibridación que emplea pares marcados de reactivos unidores híbridos.
La solicitud de patente europea nº 0.401.001 (Urdea et al.) describe 1,2-dioxetanos quimioluminiscentes doblemente disparados.
La presente invención se dirige a una composición útil en la determinación de un analito, según la reivindicación 1.
A continuación se describirán procedimientos en los cuales puede usarse la composición de la invención. Uno de tales procedimientos para determinar un analito, es aquél en el que el procedimiento comprende tratar un medio, sospechoso de contener un analito, para formar una especie intrínsecamente metaestable, siendo la especie capaz de difundir en el medio y de reaccionar selectivamente con una sustancia en el medio, la cual es capaz de reaccionar con las especies metaestables que han sido llevadas a una estrecha proximidad con la especie gracias a la presencia del analito. El procedimiento comprende además determinar si la especie ha reaccionado con la sustancia, indicando la reacción, por tanto, la cantidad de analito en el medio.
Otro procedimiento es un ensayo de un analito en un medio líquido. El ensayo comprende los pasos de tratar un medio, que se sospecha contiene el analito, para formar un complejo que es par de unión específica (sbp) en relación con la presencia del analito, y determinar si se ha formado el complejo. El procedimiento comprende combinar con el medio (1) una composición de la invención que tiene un fotosensibilizador asociado con un miembro de un par de unión específica, y (2) un compuesto quimioluminiscente asociado con un miembro sbp, en donde la cantidad de luz emitida por el compuesto quimioluminiscente, a partir de la activación del fotosensibilizador, está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Otro procedimiento comprende tratar un medio, sospechoso de contener un analito, en condiciones tales que el analito, si está presente, causa que el fotosensibilizador y el compuesto quimiluminiscente pasen a estar en estrecha proximidad. Como consecuencia, el oxígeno singlete producido por el fotosensibilizador puede activar el compuesto quimioluminiscente, el cual subsiguientemente produce luz o luminiscencia. La cantidad de luz producida está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Otro procedimiento de la presente invención para determinar un analito comprende como primer paso proporcionar una combinación que comprende un medio sospechoso de contener un analito, y una composición de la invención en la cual el fotosensibilizador está asociado con un miembro de un par de unión específica (sbp), y una partícula que puede suspenderse que comprende un compuesto quimioluminiscente. La partícula que puede suspenderse tiene un miembro de un par de unión específica (sbp) unido a ella. La combinación se trata para excitar el fotosensibilizador, el cual es capaz, en su estado excitado, de activar el oxígeno a un estado de singlete. A continuación se examina la cantidad de luminiscencia emitida por la combinación. La cantidad de dicha luminiscencia está relacionada con la cantidad de analito en el medio. Alternativamente, el compuesto quimioluminiscente está asociado con un miembro de un sbp, y la
partícula que puede suspenderse comprende un fotosensibilizador, y también tiene un miembro de un sbp unido a él.
Otro procedimiento es para determinar un analito, en donde se proporciona una combinación. La combinación comprende un medio sospechoso de contener un analito, y una composición de la invención que tiene un fotosensibilizador asociado a un primer miembro de un sbp, y un compuesto quimioluminiscente asociado a un segundo miembro del sbp. A continuación, se excita el fotosensibilizador, y éste es capaz de activar el oxígeno a un estado singlete, oxígeno singlete que activa el compuesto quimioluminiscente cuando está en estrecha proximidad con el fotosensibilizador. La luminiscencia emitida a partir de la combinación está relacionada con la cantidad de analito.
Otro procedimiento para determinar un analito comprende combinar en un medio acuoso una muestra sospechosa de contener un analito, una primera partícula que puede suspenderse, la cual tiene el compuesto quimioluminiscente incorporado en ella y un miembro de un sbp unido a ella, y una segunda partícula que puede suspenderse que tiene incorporado en ella un fotosensibilizador capaz de activar el oxígeno a su estado de singlete, en donde la segunda partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella. A continuación, se irradia el medio para producir el estado singlete del oxígeno y se mide la cantidad de luminiscencia emitida a partir del medio. La cantidad de dicha luminiscencia está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Otra realización de la presente invención implica composiciones que comprenden una partícula que puede suspenderse que tiene incorporado sobre ella un compuesto quimioluminiscente, en donde la partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella. La composición puede comprender además una partícula que puede suspenderse que tiene un fotosensibilizador incorporado a ella.
Los equipos que comprenden una composición de la invención pueden contener, en una combinación empaquetada, una composición que incluye (1) una primera partícula que puede suspenderse que tiene un compuesto quimioluminiscente, en donde la partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella, y (2) una segunda partícula que puede suspenderse que comprende un fotosensibilizador, en donde la partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella.
Las realizaciones de la invención se describen más abajo a modo de ejemplo solamente, y con referencia a los esquemas que acompañan, de los cuales:
La Figura 1 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo para Vitamina B_{12}.
La Figura 2 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo para digoxina.
La Figura 3 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo para HCG.
La Figura 4 es una representación gráfica de los resultados de una prueba.
La Figura 5 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo para TSH.
La Figura 6 es una parte de la representación gráfica de la Figura 5.
La Figura 7 es una representación gráfica de los resultados de otro ensayo para HCG según la presente invención.
La Figura 8 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo de detección de ADN híbrido.
La Figura 9 es una representación gráfica de los resultados de detección de una diana sintética.
La Figura 10 es una representación gráfica de un ensayo de triodotironina total.
A continuación se describirán los procedimientos a los cuales puede aplicarse la composición de la invención.
Un procedimiento para determinar un analito comprende tratar un medio sospechoso de contener un analito para formar una especie intrínsecamente metaestable. La especie es capaz de difundir en el medio y de reaccionar selectivamente con una sustancia en el medio capaz de reaccionar con la especie metaestable, que ha sido llevada a una estrecha proximidad con las especies gracias a la presencia del analito. El procedimiento comprende además determinar si las especies han reaccionado con la sustancia, indicando la reacción de la misma la cantidad de analito en el medio.
De forma general, la especie metaestable es un estado excitado. La especie metaestable tiene una vida media de menos de un milisegundo, usualmente menos de 100 microsegundos, más habitualmente menos de 10 microsegundos. La especie metaestable se difunde en el medio, es decir, se produce en un sitio y migra hacia otro sitio desde el sitio de formación, en donde puede transferir energía o reaccionar con una molécula en ese sitio.
La especie metaestable puede ser cualquier intermediario reactivo tal como un ion radical, nitreno, carbeno, procedente del grupo trans-ciclohexeno, \alpha-lactona, trimetilmetano, y similares. Son de interés particular los estados de singlete excitados tales como el oxígeno singlete, los estados tripletes, y los dioxetanos, incluyendo las dioxetanonas y las dioxetanodionas. Los estados triplete se forman generalmente combinando un sensibilizador apropiado, tal como el pireno, con un aceptor de energía, tal como un antraceno. Por ejemplo, dibromoantraceno puede actuar como un aceptor de energía que asume un estado triplete. El estado triplete puede proceder a transferir su energía a otra molécula e iniciar un reacción fotoquímicamente detectable, tal como la producción de luz. Los dioxetanos, tales como las dioxetanodionas, se forman a partir de la reacción de moléculas activas con oxígeno singlete o peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, los oxalatos apropiados y el peróxido de hidrógeno forman dioxetanodionas. Enzimas tales como la peroxidasa de rábano silvestre pueden generar cationes radicales o un oxigeno singlete que, probablemente, son metaestables y pueden reaccionar con otra molécula para ocasionar una señal detectable.
La presencia de un complejo de par de unión específica puede determinarse causando que un miembro del complejo produzca una especie metaestable, a partir de la cual esta puede interaccionar selectivamente con otro miembro del complejo, sin interaccionar con ese miembro cuando no está dentro del complejo.
En un procedimiento, una composición que comprende un fotosensibilizador y un ligando, receptor o polinucleótido, se une en un ensayo a una composición que comprende un compuesto quimioluminiscente y un ligando, receptor o polinucleótido. El compuesto quimioluminiscente puede reaccionar con oxígeno singlete, y el producto formado se descompone con emisión de luz. El oxígeno singlete es generado por el fotosensibilizador, habitualmente mediante irradiación del fotosensibilizador. El oxígeno singlete producido por el fotosensibilizador que no está unido a la composición que comprende un compuesto quimioluminiscente es incapaz de alcanzar el compuesto quimioluminiscente antes de sufrir la atenuación (la t_{1/2} es de aproximadamente dos microsegundos en agua). La composición que comprende un fotosensibilizador que pasa a estar unida a la composición que comprende el compuesto quimioluminiscente produce oxígeno singlete que reacciona con el compuesto quimioluminiscente, porque dicho oxígeno singlete puede sobrevivir la corta distancia, conseguida ahora, entre el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente. La cortedad de la distancia resulta de la presencia de un analito en la muestra. Preferiblemente, una parte de la distancia recorrida por el oxígeno singlete es a través de un medio orgánico, en donde el oxígeno singlete tiene una vida media mucho mayor, es decir, superior a aproximadamente cien microsegundos. El analito debe modular la unión entre la composición que comprende el fotosensibilizador y la composición que comprende el compuesto quimioluminiscente. Habitualmente, a menos uno de los compuestos quimioluminiscentes y el fotosensibilizador están asociados con una superficie, en particular, allí donde la superficie comprende partículas que pueden suspenderse.
La estrategia anterior, que implica la excitación de un compuesto quimioluminiscente mediante oxígeno singlete en estrecha proximidad con un fotosensibilizador, se debe distinguir de la de McCapra, ver más arriba. En la página 4, líneas 38-46, de McCapra se describe un ensayo realizado en un formato de atenuación. El ensayo de McCapra utiliza un reactivo que es capaz de unirse específicamente a un complejo del analito y un material de unión específica, al cual se conjuga el sensibilizador para formar un complejo sensibilizador conjugado-reactivo. La parte atenuante está unida al reactivo. Cuando se pone en estrecha proximidad con el sensibilizador, la porción atenuante reduce o atenúa la señal producida a resultas de la excitación del sensibilizador unido, o reduce o atenúa la transferencia de electrones o energía para el sensibilizador excitado hasta una especie intermedia (es decir, oxígeno molecular o un leuco-colorante). En este formato atenuador, la presencia de un analito está relacionada con la luminiscencia de los dioxetanos que decaen. A continuación, McCapra se refiere a las patentes estadounidenses nº 4.220.450 y 4.277.437, la cuales se describen más arriba.
Este formato de ensayo de atenuación de McCapra implica solamente la atenuación del sensibilizador excitado y no abarca la activación del oxígeno singlete de un compuesto quimioluminiscente asociado con un miembro de unión específica.
Más aún, en la página 14, líneas 35-36, McCapra describe la transferencia de energía desde una porción quimioluminiscente para excitar un sensibilizador en un ensayo de sonda polinucleotídica. Esta descripción de McCapra es totalmente distinta de la presente invención, la cual implica poner juntos en estrecha proximidad, gracias a un analito que está presente, un fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente, donde el fotosensibilizador excitado produce oxígeno singlete, el cual, a su vez, activa el compuesto quimioluminiscente.
En otro aspecto, un grupo que puede ser activado fotoquímicamente hasta un producto luminiscente se usa como una marca. El grupo está asociado con un miembro de un par de unión específica, y este reactivo se usa como un reactivo marcado en ensayos para la detección de un analito. La activación fotoquímica puede conseguirse irradiando el grupo con luz o mediante reacción singlete con el grupo. Preferiblemente, se usa un sensibilizador para ayudar a la fotoactivación cuando la activación es mediante oxígeno singlete. Usualmente, el sensibilizador absorbe luz, y el sensibilizador excitado formado de este modo activa el oxígeno, y el oxígeno singlete reacciona con la marca para rendir un intermediario metaestable luminiscente. El grupo usado como una marca puede incluir cualquier compuesto quimioluminiscente que experimenta fotoactivación con o sin sensibilización, y preferiblemente es un grupo que es activado por la reacción con oxígeno singlete. Las marcas pueden usarse tanto en protocolos de ensayos homogéneos como heterogéneos para determinar un analito. De forma deseable, no se requiere la adición de reactivos químicos para activar el compuesto quimioluminiscente con o sin el sensibilizador y el aceptor de energía. En un protocolo homogéneo todos los reactivos se combinan y se irradia el medio para activar el compuesto quimioluminiscente.
En el protocolo de ensayo, los componentes se proporcionan en combinación, y la luz producida, en función de la activación del oxígeno por el sensibilizador, estará en función de la concentración del analito. De forma ventajosa, los procedimientos pueden realizarse sin calentar el medio para producir luz. En consecuencia, el ensayo puede realizarse a una temperatura constante.
Antes de proceder con una descripción de las realizaciones específicas de la presente invención, se definirán y describirán con detalle un cierto número de términos.
Analito: el compuesto o composición a detectar. El analito puede constar de un miembro de par de unión específica (sbp), y puede ser un ligando, el cual es monovalente (monoepitópico) o polivalente (poliepitópico), habitualmente antigénico o hapténico, y es un único compuesto o una pluralidad de compuestos que comparten, al menos, un sitio epitópico o determinante común. El analito puede ser parte de una célula, tal como una bacteria; o una célula portadora de un grupo de antígeno sanguíneo, tal como A, B, D, etc., o un antígeno HLA; o un microorganismo, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoos, o virus.
Los analitos ligandos polivalentes normalmente serán poli(aminoácidos), es decir, polipéptidos y proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos. Dichas combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus, cromosomas, genes, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, y similares.
En la mayor parte de los casos, los analitos ligando poliepitópicos, a los que puede aplicarse la presente invención, tendrán un peso molecular de al menos aproximadamente 5.000, más habitualmente de al menos aproximadamente 10.000. En la categoría poli(aminoácidos), los poli(aminoácidos) de interés tendrán generalmente un peso molecular de, desde aproximadamente 5.000 hasta 5.000.000, más habitualmente un peso molecular de desde aproximadamente 20.000 hasta 1.000.000; entre las hormonas de interés, los pesos moleculares oscilarán habitualmente desde aproximadamente 5.000 hasta 60.000 de peso molecular.
Una amplia variedad de proteínas pueden considerarse como la familia de proteínas que tienen características estructurales similares; proteínas que tienen determinadas funciones biológicas, proteínas relacionadas con microorganismos específicos, particularmente microorganismos causantes de enfermedades, etc. Dichas proteínas incluyen, por ejemplo, las inmunoglobulinas, las citoquinas, los enzimas, las hormonas, los antígenos cancerígenos, los marcadores nutricionales, los antígenos específicos de tejido, etc.
Las siguientes son clases de proteínas relacionadas por su estructura:
protaminas
histonas
albúminas
globulinas
escleroproteínas
fosfoproteínas
mucoproteínas
cromoproteínas
lipoproteínas
nucleoproteínas
glicoproteínas
receptores de células T
proteoglicanos
HLA
proteínas no clasificadas, por ejemplo, somatotropina, prolactina, insulina, pepsina.
Un cierto número de proteínas que se encuentran en el plasma humano son clínicamente importantes, e incluyen:
Prealbúmina
Albúmina
\alpha_{1}-Lipoproteína
\alpha_{1}-Antitripsina
\alpha_{1}-Glicoproteína
Transcortina
4,6S-Postalbúmina
\alpha_{1}-glicoproteína pobre en triptófano
\alpha_{1}X-Glicoproteína
Globulina unidora de tiroxina
Inhibidor de la inter-\alpha-tripsina
Gc-globulina
(Gc 1-1)
(Gc 2-1)
(Gc 2-2)
Haptoglobina
(Hp 1-1)
(Hp 2-1)
(Hp 2-2)
Ceruloplasmina
Colinesterasa
\alpha_{2}-Lipoproteína(s)
Mioglobina
Proteína C-reactiva
\alpha_{2}-Macroglobulina
\alpha_{2}-HS-Glicoproteína
Zn-\alpha_{2}-Glicoproteína
\alpha_{2}-Neuramino-Glicoproteína
Eritropoietina
\beta-Lipoproteína
Transferrina
Hemopexina
Fibrinógeno
Plasminógeno
\beta_{2}-Glicoproteína I
\beta_{2}-Glicoproteína II
Inmunoglobulina G (IgG) o \gammaG-Globulina
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula molecular:
\gamma_{2}\kappa_{2}
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
\gamma_{2}\lambda_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunoglobulina A (IgA) o \gammaA-Globulina
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula molecular:
(\alpha_{2}\kappa_{2})^{n} 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
(\alpha_{2}\kappa_{2})^{n}
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunoglobulina M (IgM) o \gammaM-Globulina
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula molecular:
(\mu_{2}\kappa_{2})^{5} 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
(\mu_{2}\lambda_{2})^{5}
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunoglobulina D (IgD) o \gammaD-Globulina (\gammaD)
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula molecular:
(\delta_{2}\kappa_{2}) 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
(\delta_{2}\lambda_{2})
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunoglobulina E (IgE) o \gammaE-Globulina (\gammaE)
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula molecular:
(\varepsilon_{2}\kappa_{2}) 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
(\varepsilon_{2}\lambda_{2})
\vskip1.000000\baselineskip
Cadenas ligeras \kappa y \lambda sueltas
Factores de complemento:
C'1
C'1q
C'1r
C'1s
C'2
C'3
\beta_{1}A
\alpha_{2}D
\newpage
C'4
C'5
C'6
C'7
C'8
C'9
\vskip1.000000\baselineskip
Los factores de coagulación sanguínea importantes incluyen:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Las hormonas proteicas importantes incluyen:
Hormonas peptídicas y proteicas
Hormona paratiroidea (paratromona)
Tirocalcitonina
Insulina
Glucagón
Relaxina
Eritropoietina
Melanotropina
(hormona estimuladora de los melanocitos: intermedina)
Somatotropina
(hormona del crecimiento)
Corticotropina
(hormona adrenocorticotrópica)
Tirotropina
Hormona estimuladora del folículo
Hormona luteinizante
(hormona estimuladora de las células intersticiales)
Hormona luteomamotrópica
(luteotropina, prolactina)
Gonadotropina
(gonadotropina coriónica)
\vskip1.000000\baselineskip
Hormonas tisulares
Secretina
Gastrina
Angiotensinas I y II
Bradiquinina
Lactógeno placentario humano
\vskip1.000000\baselineskip
Citoquinas
IL I
IL II
IL VI
EGF
TNF
NGF
\vskip1.000000\baselineskip
Antígenos del cáncer
PSA
CEA
a-Fetoproteína
Fosfatasa ácida
CA19.9
CA125
\vskip1.000000\baselineskip
Antígenos específicos de tejidos
Fosfatasa alcalina
Mioglobina
CPK-MB
Calcitonina
Proteína básica de la mielina
\vskip1.000000\baselineskip
Hormonas peptídicas de la neurohipófisis
Oxitocina
Vasopresina
Factores liberadores (RF)
CRF, LRF, TRF, RF de la somatotropina, GRF, RF de la FSH, PIF, MIF
\vskip1.000000\baselineskip
Otros materiales poliméricos de interés son los mucopolisacáridos y los polisacáridos.
Los microorganismos ilustrativos incluyen:
3
4
5
6
7
Los analitos ligandos monoepitópicos generalmente tendrán un peso molecular desde aproximadamente 100 hasta 2000, más habitualmente un peso molecular desde 125 hasta 1000. Los analitos incluyen drogas, metabolitos, pesticidas, contaminantes, y similares. Los alcaloides están incluidos entre las drogas de interés. Entre los alcaloides están los alcaloides de la morfina, que incluyen la morfina, codeína, heroína, detropetorfano, sus derivados y metabolitos; los alcaloides de la cocaína, que incluyen la cocaína y la bencilecgonina, sus derivados y metabolitos; los alcaloides del cornezuelo, que incluyen la dietilamida del ácido lisérgico; los alcaloides de esteroides; los alcaloides de iminazoilo; los alcaloides de quinazolina; los alcaloides de isoquinolina; los alcaloides de quinolina, que incluyen la quinina y quinidina; alcaloides de diterpenos, sus derivados y metabolitos.
El siguiente grupo de drogas incluyen los esteroides, que incluyen los estrógenos, andrógenos, esteroides androcorticales; los ácidos biliares; los glicósidos cardiotónicos; y las agliconas, que incluyen la digoxina y digoxigenina, saponinas y sapogeninas, sus derivados y metabolitos. También se incluyen las sustancias imitadoras de esteroides, tales como el dietilestilbestrol.
El siguiente grupo de drogas son las lactamas que tienen desde 5 hasta 6 miembros anillados, las cuales incluyen los barbitúricos, por ejemplo, el fenobarbital y secobarbital, la difenilhidantonina, la primidona, la etosuximida, y sus metabolitos.
El siguiente grupo de drogas son los aminoalquilbencenos, con alquilos de desde 2 hasta 3 átomos de carbono, que incluyen las anfetaminas; las catecolaminas, que incluyen la efedrina, la L-dopamina, la epinefrina; la narceína; la papaverina; y los metabolitos de los anteriores.
El siguiente grupo de drogas son los benzoheterociclos, que incluyen el oxazepam, la cloroprozamina, el tegretol, sus derivados y metabolitos, siendo los anillos heterociclos azepinas, diazepinas y fenotiazinas.
El siguiente grupo de drogas son las purinas, que incluyen la teofilina, la cafeína, sus metabolitos y derivados.
El siguiente grupo de drogas incluye aquellas derivadas de la mariguana, lo que incluye el canabinol y el tetrahidrocanabinol.
El siguiente grupo de drogas son las hormonas tales como la tiroxina, el cortisol, la triiodotironina, la testosterona, el estradiol, la estrona, la progesterona, polipéptidos tales como la angiotensina, la LHRH, e inmunosupresores tales como la ciclosporina, FK506, ácido micofenólico, y demás.
El siguiente grupo de drogas incluye las vitaminas, tales como la A, B, por ejemplo, B_{12}, C, D, E y K, ácido fólico, tiamina.
El siguiente grupo de drogas son las prostaglandinas, las cuales difieren por el grado y sitios de hidroxilación e insaturación.
El siguiente grupo de drogas son los antidepresivos tricíclicos, que incluyen las imipramina, la dismetilimipramina, la amitriptilina, la nortriptilina, la protriptilina, la trimipramina, la clomipramina, la doxepina, y la desmetildoxemina.
El siguiente grupo de drogas son los anti-neoplásicos, que incluyen el metotrexato.
El siguiente grupo de drogas son los antibióticos, los cuales incluyen la penicilina, cloromicetina, actinomicetina, tetraciclina, terramicina, los metabolitos y derivados.
El siguiente grupo de drogas son los nucleótidos y nucleósidos, los cuales incluyen el ATP, NAD, FMN, adenosina, guanosina, timidina, y citidina, con sus sustituyentes azúcar y fosfato apropiados.
El siguiente grupo de drogas son diversas drogas individuales que incluyen la metadona, meprobamato, serotonina, meperidina, lidocaína, procainamida, acetilprocainamida, propranolol, griseofilvina, ácido valproico, butirofenonas, antihistaminas, cloramfenicol, drogas anticolinérgicas, tales como la atropina, sus metabolitos y derivados.
Los metabolitos relacionados con estados morbosos incluyen la espermina, la galactosa, el ácido fenilpirúvico, y la porfirina de Tipo 1.
El siguiente grupo de drogas son los aminoglicósidos, tales como la gentamicina, kanamicina, tobramicina, y amikacina.
Entre los pesticidas de interés están los bifenilos polihalogenados, ésteres de fosfato, tiofosfatos, carbamatos, sulfenamidas polihalogenados, sus metabolitos y derivados.
Para analitos receptores, los pesos moleculares oscilarán generalmente desde 10.000 hasta 2\times10^{8}, más habitualmente desde 10.000 hasta 10^{6}. Para las inmunoglobulinas, IgA, IgG, IgE e IgM, los pesos moleculares variarán generalmente desde aproximadamente 160.000 hasta aproximadamente 10^{6}. Los enzimas normalmente oscilarán desde aproximadamente 10.000 hasta 1.000.000 de peso molecular. Los receptores naturales varían ampliamente, teniendo generalmente un peso molecular de aproximadamente 25.000 y, pudiendo tener un peso molecular de 10^{6} o superior, incluyendo tales materiales como la avidina, ADN, ARN, globulina unidora de tiroxina, la prealbúmina unidora de tiroxina, la transcortina, etc.
El término analito incluye además analitos polinucleotídicos tales como aquellos polinucleótidos definidos más adelante. Estos incluyen el m-ARN, el r-ARN, el t-ARN, el ADN, los dúplexes DNA-ARX, etc. El término analito también incluye receptores que son agentes unidores de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, enzimas de restricción, activadores, represores, nucleasas, polimerasas, histonas, enzimas reparadores, agentes quimioterapéuticos, y similares.
El analito puede ser un molécula que se encuentra directamente en una muestra tal como un fluido biológico procedente de un huésped. La muestra puede examinarse directamente, o puede pre-tratarse para producir un analito más fácilmente detectable. Más aún, el analito de interés puede determinarse detectando un agente probador del analito de interés, tal como un miembro de un par de unión específica complementario del analito de interés, cuya presencia será detectada solamente cuando el analito de interés esté presente en la muestra. Por tanto, el agente probador del analito pasa a ser el analito que se detecta en el ensayo. El fluido corporal puede ser, por ejemplo, orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, stool, esputos, fluido cerebroespinal, lágrimas, mocos, y similares.
Miembro de un par de unión específica ("miembro de un sbp"): una de dos moléculas diferentes, que tienen un área sobre la superficie o en una cavidad que se une específicamente a, y se define, por tanto, como complementaria a una determinada organización espacial o polar sobre la otra molécula. Los miembros del par de unión específica se denominan como ligando y receptor (antiligando). Normalmente serán miembros de un par inmunológico tal como antígeno-anticuerpo, aunque otros pares de unión específica, tales como la biotina-avidina, las hormonas-receptores de hormonas, dúplexes de ácidos nucleicos, IgG-proteína A, pares polinucleotídicos tales como ADN-ADN, ADN-ARN, y similares, no son pares inmunológicos pero se incluyen en la invención y en la definición de miembro de un sbp.
Polinucleótido: un compuesto o composición que es un nucleótido polimérico que tiene en el estado natural aproximadamente de 50 a 500.000 ó más nucleótidos, y que tiene en el estado aislado aproximadamente de 15 a 50.000 ó más nucleótidos, habitualmente aproximadamente de 15 a 20.000 nucleótidos, más frecuentemente de 15 a 10.000 nucleótidos. El polinucleótido incluye ácidos nucleicos procedentes de cualquier fuente en forma purificada o no purificada, que ocurren naturalmente o son producidos sintéticamente, incluyendo el ADN (dsADN y ssADN) y ARN, habitualmente ADN, o puede ser t-ARN, m-ARN, r-ARN, ADN y ARN mitocondrial, ADN y ARN de cloroplastos, híbridos ADN-ARN, o mezclas de los mismos, genes, cromosomas, plásmidos, los genomas de materiales biológicos tales como microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, humanos, y fragmentos de los mismos o similares.
Ligando: cualquier compuesto orgánico para el que existe de forma natural, o puede prepararse, un receptor.
Análogo de ligando: un ligando modificado, un radical orgánico o análogo de analito, habitualmente de un peso molecular superior a 100, el cual puede competir con el ligando análogo por un receptor, proporcionando la modificación medios para unir un análogo de ligando a otra molécula. El análogo de ligando diferirá usualmente del ligando en más que el remplazo de un hidrógeno con un enlace que une el análogo del ligando a un eje o marca, pero no es imprescindible. El análogo del ligando puede unirse al receptor de forma similar al ligando. El análogo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo del ligando.
Receptor ("antiligando"): cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una determinada organización espacial y polar de una molécula, por ejemplo, sitio epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen receptores que existen de forma natural, por ejemplo, globulina unidora de tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, ácidos nucleicos, proteína A, componente de complemento C1q, y similares.
Unión específica: el reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes por parte de la otra en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Generalmente, las moléculas tienen áreas sobre sus superficies o en cavidades que originan el reconocimiento específico entre las dos moléculas. Son ejemplo de unión específica las interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-sustrato, interacciones polinucleotídicas, y demás.
Unión no específica: unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de estructuras específicas sobre la superficie. La unión no específica puede ser el resultado de varios factores, incluyendo interacciones hidrofóbicas entre moléculas.
Anticuerpo: una inmunoglobulina que se une específicamente a, y se define, por tanto, como complementaria de un determinada organización especial y polar de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica: tales como la inmunización de un huésped y la extracción del suero (policlonal); o preparando líneas celulares híbridas continuas y recogiendo la proteína secretada (monoclonal); o mediante clonación y expresión de secuencias nucleotídicas, o versiones mutadas de las mismas, que codifican al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de los anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las varias clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de las mismas incluyen Fab, Fv y F(ab')_{2}, Fab', y similares. Además, los agregados, polímeros y conjugados de las inmunoglobulinas o sus fragmentos pueden usarse donde sea apropiado, con tal que se mantenga la afinidad de unión por una molécula determinada.
Alquilo: un radical monovalente de ramificada o no ramificado derivado de un hidrocarburo alifático mediante la supresión de un átomo de H; incluye tanto alquilos inferiores como alquilos superiores.
Alquilo inferior: un alquilo que contiene de 1 a 5 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, etc.
Alquilo superior: un alquilo que contiene más de 6 átomos de carbono, habitualmente de 6 a 20 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, hexilo, heptilo, octilo, etc.
Alquilideno: un radical orgánico divalente derivado de un hidrocarburo alifático, tal como, por ejemplo, el etilideno, en el que 2 átomos de hidrógeno se toman de mismo átomo de carbono.
Arilo: un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático mediante la supresión de un átomo, y que contiene uno o más anillos aromáticos, habitualmente de uno a cuatro anillos aromáticos, tal como, por ejemplo, fenilo (a partir del benceno), naftilo (a partir del naftaleno), etc.
Arilalquilo: un radical orgánico que tiene un grupo alquilo al cual se une un grupo arilo, por ejemplo, bencilo, fenetilo, 3-fenilpropilo, 1-naftiletilo, etc.
Alcoxi: un radical alquilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, metoxi, etoxi, etc.
Ariloxi: un radical arilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, fenoxi, naftoxi, etc.
Arilalcoxi: un radical arilalquilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, benzoxi, 1-naftiletoxi, etc.
Sustituido: quiere decir que un átomo de hidrógeno de una molécula ha sido remplazado por otro átomo, el cual puede ser un único átomo, tal como un halógeno, etc., o parte de un grupo de átomos que forman una funcionalidad, tal como un sustituyente que tiene de 1 a 15 átomos (distintos de los átomos de hidrógeno necesarios para satisfacer la valencias de dichos átomos), átomos que se seleccionan independientemente de entre el grupo formado por: carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo, y los cuales pueden estar unidos o no a uno o más átomos metálicos.
Alquiltio: un radical alquilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de azufre, por ejemplo, metiltio, etiltio, etc.
Ariltio: un radical arilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de azufre, por ejemplo, feniltio, naftiltio, etc.
Grupo donante de electrones: un sustituyente que, cuando esta unido a una molécula, es capaz de polarizar la molécula de tal forma que el grupo donante de electrones se empobrece en electrones y pasa a estar cargado positivamente en relación a otras partes de la molécula, es decir, tiene una densidad electrónica reducida. Tales grupos pueden ser, a modo de ilustración y no de limitación, las aminas, éteres, tioéteres, fosfinas, hidroxi, oxianiones, mercaptanos y sus aniones, sulfuros, etc.
Un sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos (distintos del requisito de átomos de hidrógenos necesarios para satisfacer las valencias de dichos átomos), átomos que se seleccionan independientemente del grupo formado por carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo: un radical orgánico; el radical orgánico tiene de 1 a 50 átomos distintos del requisito de número de átomos de hidrógeno necesario para satisfacer las valencias de los átomos del radical. Generalmente, el átomo predominante es el carbono (C), per también puede serlo el oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), en donde el O, N, S ó P, si están presentes, están unidos al carbono, o a uno o más de entre ellos, o al hidrógeno, o a un átomo metálico, para formar varios grupos funcionales, tales como, por ejemplo, ácidos carboxílicos, alcoholes, tioles, carboxamidas, carbamatos, ésteres de ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ésteres de ácidos sulfónicos, ácidos fosfóricos, ésteres de ácidos fosfóricos, ureas, carbamatos, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros, tioéteres, olefinas, acetilenos, aminas, cetonas, aldehídos, nitrilos, y similares. Son ilustrativos de dichos radicales o grupos orgánicos, a modo de ilustración y no de limitación, el alquilo, la alquilidina, el arilo, el arilalquilo, y el alquilo, arilo, y arilalquilo sustituidos con una o más de las funcionalidades antes mencionadas.
Grupo de enlace: el enlace covalente entre moléculas. El grupo de enlace dependerá ampliamente dependiendo de la naturaleza de las moléculas, es decir, el fotosensibilizador, el compuesto quimioluminiscente, el miembro de un sbp, o la molécula asociada con o parte de una partícula, que está siendo enlazado. Los grupos funcionales que están normalmente presentes o que se introducen sobre un fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente se emplearán para el enlace de estos materiales a un miembro de un sbp, o a una partícula tal como un componente lipofílico de un liposoma o gota de aceite, partícula de látex, partícula de silicona, sol de metal, cristalito de colorante.
En la mayor parte, las funcionalidades carbonilo encontrarán uso, tanto oxocarbonilo, por ejemplo, aldehído, como no-oxocarbonilo (incluyendo análogos de nitrógeno y azufre), por ejemplo, carboxi, amidina, amidato, tiocarboxi y tionocarboxi. Las funcionalidades alternativas a oxo incluyen halógenos activos, diazo, mercapto, olefina, en particular olefina activada, amino, fósforo y similares. Una descripción de grupos enlace puede encontrarse en la patente estadounidense nº 3.817.837, cuyos descubrimientos se incorporan aquí como referencia.
El enlace de grupo puede variar desde un enlace hasta una cadena de desde 1 hasta 100 átomos, habitualmente desde aproximadamente 1 hasta 70 átomos, preferiblemente de 1 a 50 átomos, más preferiblemente de 1 a 20 átomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo normalmente formado por carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno, y fósforo. El número de heteroátomos en los grupos enlace normalmente oscilará desde aproximadamente 0 hasta 20, habitualmente desde aproximadamente 1 hasta 15, más preferiblemente de 2 a 6. Los átomos en la cadena pueden sustituirse con otros átomos distintos del hidrógeno de forma similar a la descrita para el sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos. Como regla general, la longitud de un determinado grupo enlace puede seleccionarse arbitrariamente para proporcionar los medios convenientes a la síntesis, y la incorporación de cualquier grupo deseado, tal como un grupo aceptor de energía, un fluoróforo, un grupo para el análisis del entrecruzado del sistema, tal como un átomo pesado, y similares. Los grupos enlace pueden ser alifáticos o aromáticos, aunque con grupos diazo, estarán habitualmente implicados los grupos aromáticos.
Cuando los heteroátomos están presentes, el oxígeno estará normalmente presente como oxo y oxi, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el nitrógeno estará normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre sería análogo al oxígeno; mientras que el fósforo estará unido a carbono, oxígeno, azufre o nitrógeno, usualmente como fosfonato y fosfato mono- o diéster.
Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el grupo enlace y la molécula a conjugar serán la alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter, y ésteres, amidas y tioésteres de carboxilato, sulfonato y fosfato.
En la mayor parte de los casos, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente tendrán un grupo no-oxocarbonilo, incluyendo análogos de nitrógeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, un agente alquilante tal como un halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el análogo de azufre, mercapto), oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o cetona), u olefina activa, tal como una vinilsulfona o un éster \alpha,\beta-insaturado. Estas funcionalidades estarán unidas a grupos amina, grupos carboxílicos, olefinas activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Allí donde una amina y ácido carboxílico, o su derivado nitrogenado o ácido fosfórico, se enlazan, se formarán amidas, amidinas u fosforamidas. Allí donde se enlazan el mercaptano y una olefina activada, se formarán tioéteres. Allí donde se enlazan un mercaptano y un agente alquilante, se formarán tioéteres. Allí donde se enlazan un aldehído y una amina en condiciones reductoras, se formará una alquilamina. Allí donde se enlazan un ácido carboxílico o ácido fosfato y un alcohol, se formarán ésteres.
Un Grupo o Funcionalidad que proporciona Hidrofobicidad o Solubilidad en Agua: es una funcionalidad hidrofílica, la cual aumenta la capacidad de empaparse de los sólidos con agua, y la solubilidad en agua de los compuestos a los que está unida. Dicha grupo funcional o funcionalidad puede se un sustituyente que tiene de 1 a 50 ó más átomos, y puede incluir un sulfonato, sulfato, fosfato, amidina, fosfonato, carboxilato, hidroxilo, en particular polioles, amina, éter, amida, y similares. Son grupos funcionales ilustrativos: carboxialquilo, sulfonoalquilo, CONHOCH_{2}COOH, CO-(glucosamina), azúcares, dextrano, ciclodextrina, SO_{2}NHCH_{2}COOH, SO_{3}H, CONHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H_{2}, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, hidroxilo, carboxilo, cetona, y combinaciones de los mismos. La mayoría de la funcionalidades anteriores también pueden usarse como grupos de anclaje, los cual permite el anclaje del fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente a un miembro de un sbp o a un soporte.
Un Grupo o Funcionalidad que Proporciona Lipofilicidad o Solubilidad en Lípidos: es una funcionalidad lipofílica, la cual disminuye la capacidad de empaparse de las superficies por parte del agua, y la solubilidad en agua de los compuestos a los cuales está unida. Dicho grupo funcional o funcionalidad puede contener de 1 a 50 ó más átomos, habitualmente átomos de carbono sustituidos con hidrógeno o halógeno, y puede incluir alquilo, alquilideno, arilo y arilalquilo. El grupo o funcionalidad lipofílico normalmente tendrá de uno a seis grupos alifáticos de cadena simple o ramificada de al menos 6 átomos de carbono, más habitualmente de al menos 10 átomos de carbono, y preferiblemente al menos 12 átomos de carbono, habitualmente no más de 30 átomos de carbono. El grupo alifático puede estar unido a anillos de desde 5 hasta 6 miembros, los cuales pueden ser alicíclicos, heterocíclicos, o aromáticos. Fotosensibilizador: un sensibilizador para la generación de oxígeno singlete, habitualmente mediante excitación con la luz. El fotosensibilizador puede ser fotoactivable (por ejemplo, colorantes y compuestos aromáticos) o activado químicamente (por ejemplo, enzimas y sales metálicas). Cuando es excitado por la luz, el fotosensibilizador es habitualmente un compuesto formado por átomos covalentemente unidos, usualmente con múltiples enlaces dobles y triples conjugados. El compuesto debería absorber luz en el rango de longitudes de onda 200-1100 nm, habitualmente 300-1000 nm, preferiblemente 450-950 nm, con un coeficiente de extinción en su máximo de absorbancia superior a 500 M^{-14} cm^{-1}, preferiblemente al menos 5000 M^{-1} cm^{-1}, más preferiblemente al menos 50.000 M^{-1} cm^{-1} en la longitud de onda de excitación. La vida media de un estado excitado producido a partir de la absorción de luz en ausencia de oxígeno será habitualmente de al menos 100 ns, preferiblemente al menos 1 ms. En general, la vida media debe ser lo suficientemente larga como para permitir la transferencia de energía al oxígeno, el cual estará normalmente presente en concentraciones en el rango de 10^{-5} hasta 10^{-3}, dependiendo del medio. El estado excitado del sensibilizador habitualmente tendrá un número cuántico de espín (S) diferente del de su estado elemental, y será usualmente un triplete (S=1) cuando, como es habitualmente el caso, el estado elemental sea un singlete (S=0). Preferiblemente, el sensibilizador tendrá un elevado rendimiento de entrecruzado del intersistema. Es decir, la fotoexcitación del sensibilizador producirá un estado vivo largo (usualmente triplete), con una eficiencia de al menos un 10%, deseablemente al menos un 40%, preferiblemente superior al 60%. El fotosensibilizador será habitualmente como mucho débilmente fluorescente en la condiciones de ensayo (rendimiento cuántico habitualmente inferior al 0,5, preferiblemente inferior al 0,1).
Los fotosensibilizadores que han de ser excitados mediante la luz serán relativamente fotoestables, y no reaccionarán eficientemente con el oxígeno singlete. Varias características estructurales están presentes en los sensibilizadores más útiles. Las mayoría de sensibilizadores tienen al menos uno, y frecuentemente tres o más dobles o triples enlaces conjugados mantenidos en una estructura rígida, frecuentemente aromática. Contendrán frecuentemente al menos un grupo que acelera el cruce del intersistema, tal como un grupo carbamoilo o imina, o un átomo pesado seleccionado de entre la columnas 3-6 de la tabla periódica, especialmente iodo y bromo, o pueden tener estructuras aromáticas extendidas. Los sensibilizadores típicos incluyen la acetona, el benzofenona, el 9-tioxantona, la eosina, el 9,10-dibromoantraceno, el azul de metileno, las metaloporfirinas, tales como la hematoporfirina, las ftalocianinas, las clorofilas, el rosa de bengala, el buckminsterfullereno, etc., y derivados de estos compuestos que tienen sustituyentes de 1 a 50 átomos para hacer dichos compuestos más lipofílicos o más hidrofílicos y/o como grupos de anclaje para anclaje, por ejemplo, a un miembro de un sbp. Son ejemplo de otros fotosensibilizadores que pueden usarse en la presente invención aquéllos que tienen las propiedades anteriores y que se enumeran en N. J. Turro, "Molecular Photochemistry", página 132, W. A. Benjamin Inc., N.Y., 1965.
Los fotosensibilizadores son preferiblemente relativamente no-polares para asegurar su disolución en un miembro lipofílico cuando el fotosensibilizador es incorporado a una gota de aceite, liposoma, partícula de látex, etc.
Se propone que los fotosensibilizadores útiles en esta invención también incluyan otras sustancias y composiciones que pueden producir oxígeno singlete con o, menos preferiblemente, sin activación mediante una fuente externa de luz. Así pues, por ejemplo, se ha observado que las sales de molibdato (MoO_{4}^{=}) y la cloroperoxidasa, y la mieloperoxidasa más ion bromuro o cloruro (Kanofsky, J. Biol. Chem. (1983) 259: 5596) catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno a oxígeno singlete y agua. Cualquiera de estas composiciones puede, por ejemplo, incluirse en partículas a las cuales está unido un miembro de un sbp, y usarse en el procedimiento de ensayo en el que el peróxido de hidrógeno está incluido como un reactivo secundario, la cloroperoxidasa está unida a una superficie, y el molibdato se incorpora en la fase acuosa de un liposoma. También están incluidos como fotosensibilizadores, dentro del ámbito de los invención, los compuestos que no son verdaderos sensibilizadores, pero que, al ser excitados mediante calor, luz o activación química, liberarán una molécula de oxígeno singlete. Los miembros mejor conocidos de esta clase de compuestos incluyen los endoperóxidos tales como el 1,4-biscarboxietil-1,4-naftaleno endoperóxido, el 9,10-difenilantraceno-9,10-endoperóxido, y el 5,6,11,12-tretrafenilnaftaleno-5,12-endoperóxido. El calentamiento o la absorción directa de luz por parte de estos compuestos libera oxígeno singlete.
Soporte o superficie: una superficie formada por una material poroso o no poroso insoluble en agua. La superficie puede tener cualquiera de entre un cierto número de formas, tales como cinta, barra, partícula, incluyendo cuentas, y similares. La superficie puede ser hidrofílica o capaz de ser convertida en hidrofílica, e incluye polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato magnésico y alúmina; materiales poliméricos naturales, en particular materiales celulósicos y materiales derivados de la celulosa, tales como papeles conteniendo fibra, por ejemplo, papel de filtro, papel cromatográfico, etc.; polímeros sintéticos o que ocurren de forma natural modificados, tales como la nitrocelulosa, el acetato de celulosa, el cloruro de polivinilo, la poliacrilamida, dextrano entrecruzado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etileno tereftalato), nilón, polivinilbutirato, etc.; bien usados por sí mismos o conjuntamente con otros materiales; vidrios disponibles como Biovidrio; cerámicas; metales; y similares. Los ensamblajes naturales o sintéticos tales como los liposomas, vesículas fosfolipídicas, y células también pueden emplearse.
La unión de miembros de un sbp al soporte o superficie puede conseguirse mediante técnicas bien conocidas, comúnmente disponibles en la literatura. Ver, por ejemplo, "Immobilized enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970).
La superficie será habitualmente polifuncional, o será capaz de ser "polifuncionalizada", o será capaz de unir un oligonucleótido, un miembro de un sbp, un fotosensibilizador, y/o un compuesto quimioluminiscente, a través de interacciones covalentes y no covalentes específicas o no específicas. Están disponibles o pueden incorporarse una amplia variedad de grupos funcionales. Los grupos funcionales incluyen los ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, grupos mercapto, y similares. La manera de enlazar una amplia variedad de compuestos a superficies es bien conocida y está ampliamente ilustrada en la literatura. Ver, por ejemplo, Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970). La longitud de un grupo de engarce al oligonucleótido o al miembro de un sbp puede variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del compuesto que está siendo engarzado, del efecto de la distancia entre el compuesto que está siendo engarzado y la superficie en las propiedades de engarce específicas, y similares.
Partículas: partículas de al menos aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 nm, habitualmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de aproximadamente 10 micrómetros, preferiblemente desde aproximadamente 0,10 hasta 2,0 micrómetros de diámetro, que tienen normalmente un volumen de menos de 1 picolitro. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, tener cualquier densidad, pero preferiblemente de una densidad aproximándose a la del agua, generalmente desde aproximadamente 0,7 hasta 1,5 g/ml, preferiblemente que puede suspenderse en agua, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente, u opaco. Las partículas pueden tener o no una carga, y cuando estén cargadas son preferiblemente negativas. Las partículas pueden ser sólidas (por ejemplo, de polímeros, metales, vidrio, orgánicas e inorgánicas, tales como de minerales, sales y diatómicas), gotas de aceite (por ejemplo, de hidrocarburos, fluorocarburo, fluido de silicona), o vesículas (por ejemplo, sintéticas tales como de fosfolípido, o naturales tales como células y orgánulos). Las partículas pueden ser partículas de látex, u otras partículas compuestas de polímeros orgánicos e inorgánicos; bicapas lipídicas, por ejemplo, liposomas, vesículas fosfolipídicas; gotas de aceite; partículas de silicona; soles de metal; células; y cristalitos de colorante.
Las partículas orgánicas serán normalmente polímeros, bien polímeros de adición o de condensación, los cuales pueden dispersarse fácilmente en el medio de ensayo. Las partículas orgánicas también serán adsortivas, o funcionalizables con objeto de unir sobre su superficie, bien directa o indirectamente, un miembro de un sbp, y para unir sobre su superficie o incorporar dentro de su volumen un fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente.
Las partículas pueden derivarse a partir de materiales que ocurren de forma natural, materiales que ocurren de forma natural que son modificados sintéticamente, y materiales sintéticos. Se prefieren los ensamblajes naturales o sintéticos tales como las bicapas lipídicas, por ejemplo, liposomas y vesículas no fosfolipídicas. Entre los polímeros orgánicos de especial interés están los polisacáridos, en particular los polisacáridos entrecruzados, tales como la agarosa, la cual está disponible como Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, la celulosa, el almidón, y similares; los polímeros de adición, tales como el poliestireno, la poliacrilamida, los homopolímeros y copolímeros de derivados del acrilato y metacrilato, en particular ésteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo libres, incluyendo los hidrogeles y similares. Los polímeros inorgánicos incluyen las siliconas, vidrios, disponible como Bioglass, y similares. Los soles incluyen el oro, el selenio, y otros metales. Las partículas también pueden ser colorantes insolubles tales como las porfirinas, la ftalocianinas, etc., las cuales pueden actuar como fotosensibilizadores. Las partículas también pueden incluir diátomos, células, partículas virales, magnetosomas, núcleos celulares, y similares.
Cuando las partículas están comercialmente disponibles, el tamaño de la partícula puede hacerse variar rompiendo partículas mayores en partículas más pequeñas mediante medios mecánicos, tales como molienda, sonicación, agitación, etc.
Las partículas serán habitualmente polifuncionales, o serán capaces de ser polifuncionalizadas, o serán capaces de unirse a un miembro de un sbp, fotosensibilizador, o compuesto quimioluminiscente, a través de interacciones covalentes o no covalentes, específicas o no específicas. Una amplia variedad de grupos funcionales están disponibles o pueden ser incorporados. Los ejemplos de grupos funcionales incluyen los ácidos carboxílicos, los aldehídos, los grupos amino, los grupos ciano, los grupos etileno, los grupos hidroxilo, los grupos mercapto, y similares. Cuando se emplea la unión covalentemente de un miembro de un sbp, un compuesto quimioluminiscente, o un fotosensibilizador, a la partícula, la manera de engarzarlos es bien conocida y está ampliamente ilustrada en la literatura. Ver, por ejemplo, Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970). La longitud de un grupo de engarce puede variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del compuesto que está siendo engarzado, de la naturaleza de la partícula, y del efecto de la distancia entre
el compuesto que está siendo engarzado y la partícula, en la unión de miembros de sbp y el analito, y similares.
El fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden escogerse para disolverse en, o para unirse no covalentemente sobre la superficie de las partículas. En este caso, estos compuestos serán preferiblemente hidrofóbicos para reducir su capacidad de disociarse de la partícula, y causar, por tanto, que ambos compuestos se asocien con la misma partícula. Esta posibilidad puede reducirse aún más utilizando partículas con tan sólo una composición, que están asociadas bien con el fotosensibilizador o con el compuesto quimioluminiscente; o usando dos tipos de partículas que difieren en su composición, con objeto de favorecer la asociación del fotosensibilizador con un tipo de partículas, y la asociación del compuesto quimioluminiscente con el otro tipo de partículas.
El número de moléculas fotosensibilizadoras o quimioluminiscentes asociadas con cada partícula, en promedio será habitualmente de al menos una, y puede ser suficientemente elevado, de forma que la partícula consistiera enteramente en moléculas fotosensibilizadoras o quimioluminiscentes. El número de moléculas preferido se seleccionará empíricamente para proporcionar en el ensayo la relación señal-ruido de fondo más intensa. En algunos casos esto se conseguirá mejor asociando una multiplicidad de diferentes moléculas fotosensibilizadoras a las partículas. Habitualmente, la proporción de fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente respecto el miembro de un sbp en las partículas debería ser de al menos 1, preferiblemente de al menos 100 a 1, y más preferiblemente superior a 1000 a 1.
Gotas de aceite: son partículas fluidas formadas por un compuesto lipofílico recubierto y estabilizado con un emulsivo que es una molécula amfifílica, tal como, por ejemplo, fosfolípidos, esfingomielina, albúmina, y similares.
Los fosfolípidos se basan en ácidos carboxílicos alifáticos que son ésteres de polioles alifáticos, en donde al menos un grupo hidrofílico está sustituido con un éster de ácido carboxílico de desde aproximadamente 8 hasta 36, más habitualmente de desde aproximadamente 10 hasta 20 átomos de carbono, el cual puede tener desde 0 hasta 3, más habitualmente desde 0 hasta 1 sitio de insaturación etilénica, y al menos 1, normalmente tan sólo 1, grupo hidroxilo sustituido con fosfato para formar un éster fosfato. El grupo fosfato puede sustituirse además con pequeños compuestos alifáticos, los cuales son de dos o más funcionalidades, teniendo generalmente grupos hidroxilo o amino.
Las gotas de aceite pueden fabricarse según los procedimientos convencionales, mediante combinación de los compuestos lipofílicos apropiados con un tensioactivo, aniónico, catiónico o no iónico, en donde el tensioactivo está presente en desde aproximadamente 0,1 hasta 5, más habitualmente desde aproximadamente 0,1 hasta 2 en porcentaje de peso de la mezcla, y sometiendo la mezcla a agitación en un medio acuoso, tal como sonicando o agitando en vórtice. Los compuestos lipofílicos ilustrativos incluyen los aceites hidrocarburos, los halocarburos, incluyendo el fluorocarburo, los alquilftalatos, trialquilfosfatos, triglicéridos, etc.
Un miembro de un sbp será generalmente adsorbido sobre la superficie de la gota lipídica, o unido directa o indirectamente a un componente de superficie de la gota de aceite. El miembro de un sbp puede incorporarse dentro de las partículas líquidas, bien durante o después de la preparación de las partículas líquidas. El miembro de un sbp normalmente estará presente en un porcentaje molar de desde 0,5 hasta 100, más habitualmente de 1 a 90, frecuentemente desde aproximadamente 5 hasta 80, y preferiblemente desde aproximadamente 50 hasta 100, de las moléculas presentes sobre la superficie de la partícula.
La siguiente es una lista, a modo de ilustración y no de limitación, de compuestos amfifílicos, los cuales pueden utilizarse para estabilizar las gotas lipídicas: fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, dimiristoilfosfatidilcolina, fosfatidil colina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido fosfatídico, cardiolipina, lecitina, galactocerebrósido, esfingomielina, dicetilfosfato, fosfatidilinositol, 2-trihexadecilamoniometilamina, 1,3-bis(octadecilfosfato)-propanol, fosfato de estearoiloxietileno, fosfolípidos, dialquilfosfatos, sodio dodecil sulfato, detergentes catiónicos, detergentes aniónicos, proteínas tales como la albúmina, detergentes no iónicos, etc.
También pueden usarse otros compuestos que tienen grupos lipofílicos y que han sido descritos previamente. En la mayor parte de los casos, estos compuestos serán alquilbencenos, que tienen grupos alquilo de desde 6 hasta 20 átomos de carbono, habitualmente mezclas de grupos alquilo, los cuales pueden ser simples o ramificados, y que tienen un grupo carboxilo, un grupo hidroxílico, un grupo polioxi alquileno (alquileno de desde 2 hasta 3 átomos de carbono), grupo carboxílico, grupo sulfónico ácido, o grupo amino. Los ácidos grasos alifáticos pueden usarse, normalmente tendrán desde 10 hasta 36, más habitualmente desde 12 hasta 20 átomos de carbono. También pueden encontrar un uso los alcoholes grasos que tienen los límites de carbonos indicados para los ácidos grasos, las aminas grasas con similares limitaciones de carbonos, y varios esteroides.
Las gotas lipídicas pueden comprender un aceite de fluorocarburo o un aceite de silicona (partícula de silicona). Dichas gotas están descritas por Giaever en las patentes estadounidenses nº 4.634.681 y 4.619.904 (los descubrimientos de las cuales se incorporan en ésta en su totalidad). Estas gotas se forman dispersando un aceite de fluorocarburo o aceite de silicona en una fase acuosa. Los gotas se preparan colocando una pequeña cantidad del aceite seleccionado (generalmente, dichos aceites están disponibles comercialmente) en un contenedor con una mayor cantidad de fase acuosa. El sistema líquido se somete a agitación para generar la emulsión, y a continuación se centrifuga. La fase homogénea se retira y las gotas residuales se resuspenden en un medio acuoso tamponado. Los pasos anteriores de centrifugación y decantación pueden repetirse una o más veces antes de que las gotas sean utilizadas.
Los miembros de un sbp pueden ser unidos a las gotas en un cierto número de modos. Tal como describe Giaever, el miembro de un sbp determinado, particularmente un miembro proteico de un sbp, puede ser recubierto sobre las gotas introduciendo un exceso del miembro del sbp en el medio acuoso antes del paso de emulsión. Los pasos de lavado son deseables para retirar el exceso de medio del sbp. La funcionalización del aceite introduce funcionalidades descritas más arriba para engarzar a los miembros de un sbp. Dichas funcionalidades también pueden emplearse para unir las gotas a un fotosensibilizador o a un compuesto quimioluminiscente. Por otra parte, el fotosensibilizador o el compuesto quimioluminiscente se escogerán frecuentemente de forma que sean solubles en la fase aceite de la gota lipídica, y no serán unidos covalentemente. Cuando el aceite es un fluorocarburo, un fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente fluorado serán a menudo más solubles que el correspondiente derivado no fluorado.
Otras gotas lipídicas descritas Giaever también pueden encontrar un uso en la presente invención.
Liposomas: microvesículas de forma aproximadamente esférica, son uno de los materiales preferidos para su uso en la presente invención. Los liposomas tienen un diámetro que es al menos aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 micrómetros, habitualmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de aproximadamente 10 micrómetros. Preferiblemente, el diámetro de los liposomas será inferior a aproximadamente dos micrómetros, con objeto de limitar la precipitación o la flotación.
La capa exterior de un liposoma consiste en una bicapa amfifílica que encierra un volumen de agua o una solución acuosa. Los liposomas con más de una bicapa se denominan vesículas multilamelares. Los liposomas con una única bicapa se denominan vesículas unilamelares. Las vesículas multilamelares son preferidas en la presente invención cuando se usa a fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente lipofílicos, debido a su capacidad para incorporar mayores cantidades de estos materiales que las vesículas unilamelares. La bicapa amfifílica está frecuentemente formada por fosfolípidos. Los fosfolípidos empleados en la preparación de partículas utilizables en la presente invención pueden ser cualquier fosfolípido o mezcla de fosfolípidos que se encuentre en membranas naturales, incluyendo la lecitina, o diésteres sintéticos de glicerolfosfato de ácidos grasos lineales de 12-carbonos o 24-carbono saturados o insaturados, en donde el fosfato puede estar presente como monoéster, o como un éster de un alcohol polar tal como etanolamina, colina, inositol, serina, glicerol, y similares. Los fosfolípidos particularmente preferidos incluyen la L-\alpha-palmitoil oleoil-fosfatidilcolina (POPC), el palmitoil oleoil-fosfatidilglicerol (POPG), el L-\alpha -dioleoil-fosfatidilglicerol, la L-\alpha -dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), y el L-\alpha -dioleoil-fosfatidil \beta-(4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxiamido)etanol (DOPE-MCC).
Los fosfolípidos en la bicapa pueden suplementarse con colesterol, y pueden remplazarse con otros compuestos amfifílicos que tienen un grupo cabeza polar, habitualmente cargado, y una parte hidrofóbica habitualmente formada por dos cadenas linea de hidrocarburos. Los ejemplos de dichos sustituyentes incluyen el dialquilfosfato; los dialcoxipropilfosfatos en los que los grupos alquilo tienen cadenas lineales de 12-20 átomos de carbono; el cloruro de N-(2,3-di(9-(Z)-octa-deceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetil-amonio (DOTMA), tal como se descubre en la patente estadounidense nº 4.897.355 concedida el 30 de enero de 1990, la cual es incorporada por la presente en ésta por referencia; la esfingomielina; la cardiolipina; y similares.
Los liposomas utilizados en la presente invención preferiblemente tienen una elevada densidad de carga negativa para estabilizar la suspensión, y para prevenir la agregación espontánea.
Para su uso en la presente invención, los liposomas deberían ser capaces de unirse a un miembro de un sbp, y ser capaces de tener un fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente asociados con cualquiera, la fase acuosa o la no acuosa. Los liposoma utilizados en la presente invención habitualmente tendrán miembros de un sbp unidos a la superficie exterior de la vesícula lipídica.
Los liposomas pueden producirse mediante una variedad de procedimientos, incluyendo la hidratación y la dispersión mecánica de fosfolípidos o sustitutos de fosfolípidos secos en una solución acuosa. Los liposomas preparados de esta forma tendrán una variedad de dimensiones, composiciones y comportamientos, la sonicación es un procedimiento para reducir la heterogeneidad e inconsistencia de comportamiento de los liposomas mecánicamente dispersados. Dicho procedimiento disminuye el tamaño promedio de los liposomas. Alternativamente, la extrusión puede usarse como un paso final durante la producción de los liposomas. La patente estadounidense nº 4.529.561 descubre un procedimiento de extrusión de liposomas bajo presión a través de una membrana de tamaño de poro uniforme para mejorar la uniformidad de tamaño.
La preparación de liposomas que contengan un fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente hidrofóbico o amfifílico disuelto en la bicapa lipídica puede llevarse a cabo en una variedad de procedimientos, incluyendo un procedimiento descrito por Olsen et al., Biochemica et Biophisica Acta 557(9), 1979. En resumen, se seca una mezcla de lípidos que contiene el compuesto apropiado en un solvente orgánico tal como cloroformo hasta obtener una película delgada sobre las paredes de un frasco de vidrio. La película lipídica se hidrata en un tampón apropiado mediante agitación o haciéndola girar (vortexing). A continuación, la suspensión de lípido se extruye a través de una serie de membranas de filtro de policarbonato que tienen sucesivamente poros más pequeños. Por ejemplo, 2,0, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 y 0,2 micrómetros. Es deseable el filtrado repetido a través de cualquiera de los filtros, y en particular a través de los filtros más pequeños. Los liposomas pueden purificarse mediante, por ejemplo, filtración en gel, tal como a través de una columna de Sephacryl S-1000. La columna puede eluirse con tampón y recogerse los liposomas. El almacenamiento en frío prolonga la vida en almacenamiento de los liposomas producidos mediante este procedimiento. Alternativamente, el fotosensibilizador o el compuesto quimioluminiscente pueden añadirse a la suspensión líquida a continuación de la preparación de los liposomas.
El marcaje de gotas y liposomas implicará a menudo, por ejemplo, inclusión de grupos tiol, o maleimida, o biotina sobres las moléculas que forma la bicapa lipídica. Los fotosensibilizadores, moléculas quimioluminiscentes, o miembros de sbp pueden entonces unirse a la superficie mediante reacción de las partículas con uno de estos materiales que está unido, respectivamente, a un compuesto reactivo sulfhidrilo, un grupo sulfhidrilo, o avidina. Los grupos reactivos sulfhidrilo incluyen los reactivos alquilantes tales como la bromoacetamida y la maleimida.
Los miembros de un sbp pueden atraerse hacia la superficie de las partículas liposómicas mediante interacciones hidrofóbicas débiles, no obstante, dichas interacciones no bastan generalmente para soportar la fuerza de rotura que se encuentra durante la incubación y lavado. Es preferible unir covalentemente los miembros de un sbp a la partícula liposómica que se ha funcionalizado, por ejemplo, mediante el uso de DOPE-MCC, tal como se ha mostrado más arriba, combinando dicho liposoma con el miembro de un sbp seleccionado y funcionalizado con un grupo mercaptano. Por ejemplo, si el miembro de un sbp es un anticuerpo, éste puede hacerse reaccionar con anhidro S-acetil-mercaptosuccínico (SAMSA) e hidrolizarse para proporcionar un anticuerpo modificado con sulfhidrilo.
Partículas de látex: "Látex" significa un material polimérico desmenuzado insoluble en agua y que puede suspenderse en agua, que usualmente tiene unas dimensiones de partícula de 20 nm a 20 mm, más preferiblemente 100 a 1000 nm de diámetro. El látex es frecuentemente un polietileno sustituido, tal como: poliestireno-butadieno, poliacrilamida poliestireno, poliestireno con grupos amino, poli-ácido acrílico, poli-ácido metacrílico, acrilonitrilo-butadieno, copolímeros de estireno, polivinil acetato-acrilato, polivinil pirridina, copolímeros de vinilo-acrilato, y similares. Se prefieren los polímeros no entrecruzados de estireno y estireno carboxilado, o estireno funcionalizado con otros grupos activos tales como amino, hidroxilo, halo, y similares. Frecuentemente se usarán copolímeros de estirenos sustituidos con dienos, tales como butadieno.
La asociación del fotosensibilizador o del compuesto quimioluminiscente con las partículas de látex usadas en la presente invención puede implicar la incorporación durante la formación de las partículas mediante polimerización, pero habitualmente implicará la incorporación dentro de partículas preformadas, habitualmente mediante disolución no covalente dentro de las partículas. Habitualmente se empleará una solución del compuesto quimioluminiscente o sensibilizador. Los solventes que pueden utilizarse incluyen alcoholes, incluyendo el etanol, etilenglicol, y alcohol bencílico; amidas tales como la dimetilformamida, formamida, acetamida, y tetrametilurea, y similares; sulfóxidos tales como el dimetilsulfóxido y el sulfolano; y éteres tales como el carbitol, etilcarbitol, dimetoxietano, y similares; y el agua. El uso de solventes que tienen puntos de ebullición elevados, en los que las partículas son insolubles, permite el uso de temperaturas elevadas para facilitar la disolución de los compuestos en las partículas, y son particularmente apropiados. Los solventes pueden usarse solos o en combinación. Los solventes particularmente preferidos para incorporar el fotosensibilizador son aquéllos que no atenúan el estado de triplete excitado del fotosensibilizador, bien debido a sus propiedades intrínsecas o porque pueden retirarse subsiguientemente de las partículas gracias a su capacidad para ser disueltos en un solvente, como el agua, que es insoluble en las partículas. Se prefieren los solventes aromáticos, y, en general, solventes que son solubles en la partícula. Para incorporar compuestos quimioluminiscentes en las partículas debería seleccionarse un solvente que no interfiera con la luminiscencia, debido a sus propiedades intrínsecas o a su capacidad para ser retirados de las partículas. Frecuentemente, también se preferirán los solventes aromáticos. Los solventes aromáticos típicos incluyen el dibutilftalato, el benzonitrilo, el naftonitrilo, el dioctiltereftalato, diclorobenceno, difeniléter, dimetoxibenceno, etc.
Excepto cuando el fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente está covalentemente unido a las partículas, será habitualmente preferible usar fotosensibilizadores o compuestos quimioluminiscentes electrónicamente neutros. Es preferible que el medio líquido seleccionado no reblandezca las cuentas de polímero hasta el punto de hacerlas pegajosas. Una técnica preferida comprende suspender las partículas de látex seleccionadas en un medio líquido en el cual el fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente tienen al menos una solubilidad limitada. Preferiblemente, las concentraciones de fotosensibilizador y compuesto quimioluminiscente en el medio líquido se seleccionarán para proporcionar partículas que tienen la máxima eficiencia de formación de oxígeno singlete y máximo rendimiento cuántico de emisión a partir del compuesto quimioluminiscente en el medio, sin embargo, a veces, se preferirán soluciones menos concentradas. La distorsión o disolución de las partículas en el solvente puede evitarse mediante la adición de un cosolvente miscible en el que las partículas son insolubles.
Generalmente, la temperatura empleada durante el proceso se escogerá para maximizar la capacidad de formación de oxígeno singlete de las partículas marcadas con fotosensibilizador, y el rendimiento cuántico de las partículas de compuesto quimioluminiscente, con la condición que las partículas no deberían fundirse o agregarse a la temperatura seleccionada. Normalmente se emplean temperaturas elevadas. Las temperaturas para el procedimiento generalmente irán desde 20ºC hasta 200ºC, más usualmente desde 50ºC hasta 170ºC. Se ha observado que algunos compuestos que son prácticamente insolubles a temperatura ambiente, son solubles a elevadas temperaturas en, por ejemplo, alcoholes de bajo peso molecular, tales como etanol y etilenglicol, y similares. Se ha observado que las partículas de látex modificadas mediante carboxilación toleran alcoholes de bajo peso molecular a dichas temperaturas.
Un miembro de un sbp puede estar físicamente adsorbido sobre la superficie de la partícula de látex, o puede estar covalentemente unido a la partícula. En los casos en los que el miembro de un sbp sólo está débilmente unido a la superficie de la partícula de látex, la unión puede ser, en ciertos casos, incapaz de soportar la fuerzas de rotura de partícula-a-partícula que se encuentran durante la incubación y lavados. Por tanto, puede ser preferiblemente unir covalentemente los miembros de un sbp a las partículas de látex en condiciones que minimizarán la adsorción. Esto puede conseguirse mediante activación química de la superficie del látex. Por ejemplo, pueden formarse ésteres de N-hidroxisuccinimida de los grupos carboxílicos de la superficie sobre las partículas activadas para reducir la unión no específica de componentes del ensayo sobre la superficie de la partícula, y, a continuación, se ponen en contacto con un engarce que tienen grupos aminos que reaccionarán con los grupos ésteres o directamente con un miembro de un sbp que tiene un grupo amino. El engarce usualmente se seleccionará para reducir la unión no específica de los componentes del ensayo a la superficie de la partícula, y preferiblemente proporcionará una funcionalidad apropiada tanto para el anclaje a la partícula de látex y el anclaje al miembro de un sbp. Los materiales apropiados incluyen el aminodextrano maleimidato (MAD), la polilisina, los aminosacáridos, y similares. El MAD puede prepararse tal como describen Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75(7): 3143, 1978.
En un procedimiento, primero se une el MAD a partículas de látex que contienen carboxilos usando una carbodiimida soluble en agua, por ejemplo, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida. A continuación, las partículas recubiertas se equilibran en varios reactivos para prevenir la unión no específica. Dichos reactivos incluyen proteínas, tales como la gammaglobulina bovina (BGG), un detergente, tal como el Tween-20, Triton X-100, y similares. Entonces se añade un miembro de un sbp que tiene un grupo sulfhidrilo, o convenientemente modificado para introducirle un grupo sulfhidrilo, a la suspensión de partículas, a partir de lo cual, se forma un enlace covalente entre el miembro de un sbp y el MAD sobre las partículas. A continuación, puede retirarse cualquier exceso de miembro de un sbp que no haya reaccionado mediante lavado.
Soles de metal: son aquellas partículas formadas por un metal pesado, es decir, un metal con número atómico superior a 20, tal como un metal del Grupo IB, por ejemplo, oro o plata, o chalcogenos tales como selenio o telurio.
Las partículas de sol de metal están descritas, por ejemplo, por Leuvering en la patente estadounidense nº 4.313.734, cuyo descubrimiento se incorpora aquí en su totalidad por referencia. Dichos soles incluyen dispersiones acuosas coloidales de un metal, compuesto metálico, o núcleo polimérico recubierto con un metal o compuesto metálico.
Los soles de metal pueden ser de metales o compuestos metálicos, tales como óxidos metálicos, hidróxidos metálicos, y sales de metales, o un núcleo polimérico recubierto con metales o compuestos metálicos. Son ejemplo de tales metales el platino, oro, plata, mercurio, plomo, paladio, y cobre; y de tales compuestos metálicos el yoduro de plata, el bromuro de plata, el oxido hidratado de cobre, el óxido de hierro, el hidróxido de hierro u óxido hidratado, el hidróxido de aluminio o el óxido hidratado, el hidróxido de cromo o el óxido hidratado, el óxido de vanadio, el sulfuro de arsénico, el hidróxido de manganeso, el sulfuro de plomo, el sulfuro de mercurio, el sulfato de bario y el dióxido de titanio. En general, los metales y compuestos metálicos útiles pueden ser fácilmente demostrados mediante técnicas conocidas.
A veces es ventajoso usar soles formados por partículas dispersas consistentes en un núcleo polimérico recubierto con los metales o compuestos metálicos anteriormente mencionados. Estas partículas tienen propiedades similares a las de la fase dispersa de metales puros o compuestos metálicos, pero el tamaño, densidad y contacto metálico pueden combinarse óptimamente.
Las partículas de soles metálicos pueden prepararse de un gran número de formas que son conocidas en sí mismas. Por ejemplo, para la preparación de sol de oro Leuvering se refiere a un artículo de G. Frens en Nature Physical Sciences 241: 20 (1973).
Las partículas de soles metálicos pueden modificarse para contener varios grupos funcionales, tal como se describen más arriba, para unirse a un miembro de un sbp, o a un fotosensibilizador, o a un compuesto quimioluminiscente. Por ejemplo, pueden usarse agentes de enlace poliméricos para recubrir las partículas, tales como polímeros que contienen grupos tiol que se unen fuertemente a muchos metales pesados, o agente sililantes que pueden unirse y formar recubrimientos poliméricos como, por ejemplo, mediante reacción de partículas metálicas con trialcoxi-aminoalquisilanos, tal como se describe en la solicitud de patente EPO 84400952.2 de Advanced Magnetics, para recubrir partículas magnéticas.
Cristalitos de colorante: microcristales de colorantes sólidos, insolubles en agua, puros o mezclados, preferiblemente colorantes que pueden servir como los fotosensibilizadores descritos más arriba. Los cristalitos de colorantes útiles en la presente invención tienen un rango de tamaños de 20 nm hasta 20 \mum.
Un procedimiento para preparar cristalitos de colorante está descrito en la patente estadounidense nº 4.373.932 (Gribnau et al.), el descubrimiento de la cual se incorpora en su totalidad en ésta por referencia. Gribnau describe partículas coloidales de colorante y dispersiones acuosas de un colorante o pigmento hidrofóbico, el cual puede tener un componente inmunoquímicamente reactivo unido directa o indirectamente. Las partículas de colorante se preparan en general dispersando un colorante en agua y centrifugando a continuación. Se obtiene un precipitado de colorante y se resuspende en agua, a la que se añaden cuentas de vidrio. Esta suspensión se hace rodar durante varios días a temperatura ambiente. Se decanta el líquido y se centrifuga, y se obtienen las partículas de colorante después de aspirar el líquido.
Otro procedimiento para preparar cristalitos de colorante es mediante adición lenta al agua de una solución del colorante en un solvente miscible con agua. Otro procedimiento es mediante sonicación de una suspensión del colorante sólido en agua.
La unión de miembros de un sbp a las partículas de colorante puede conseguirse mediante adsorción directa o indirecta, o mediante anclaje químico covalente. Este último está gobernado por la presencia de grupos funcionales apropiados en cualquier material de recubrimiento y en el colorante. Por ejemplo, pueden introducirse grupos funcionales sobre la superficie del cristalito de colorante acoplando un compuesto que contenga un grupo amino aromático diazotizado, y el grupo funcional deseado a un grupo fenólico o anilino del colorante.
Cuando el colorante tiene un grupo carboxilo, el cristalito de colorante puede activarse mediante carbodiimida y acoplarse a un componente amino primario. Los grupos amino primarios alifáticos y los grupos hidroxilo pueden activarse, por ejemplo, con cianuro de bromo o di o tri-azinas halosustituidas, después de lo cual puede tener lugar el anclaje con un componente amino primario o con, por ejemplo, un componente conteniendo un grupo -SH o -OH. También puede hacerse uso de compuestos reactivos bifuncionales. Por ejemplo, puede usarse glutaraldehído para el acoplamiento mutuo de componentes amino primarios del colorante y un miembro de un sbp; y, por ejemplo, puede usarse un reactivo hetero-bifuncional tal como el N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato para el acoplamiento de un componente amino primario a un componente que contenga un grupo tiol.
Compuesto quimioluminiscente: una sustancia que sufre una reacción química con el oxígeno singlete para formar un intermediario metaestable que puede descomponerse con la emisión simultánea o subsiguiente de luz dentro del rango de longitudes de onda de 250 a 1200 nm. La emisión ocurrirá habitualmente sin la presencia de un aceptor de energía o catalizador para causar la descomposición y emisión de luz. Preferiblemente, el intermediario se descompone espontáneamente sin calentamiento o sin la adición de reactivos secundarios a partir de su formación. No obstante, para algunos compuestos quimioluminiscentes puede requerirse la adición de un reactivo después de la formación del intermedio, o el uso de una temperatura elevada, para acelerar la descomposición. Los compuestos quimioluminiscentes son habitualmente compuestos ricos en electrones que reaccionan con el oxígeno singlete, frecuentemente con la formación de dioxetanos o dioxetanonas. Son ejemplos de dichos compuestos los éteres de enol, las enaminas, los 9-alquildenexantanos, las 9-alquilideno-N-alquilacridinas, los aril-vinil-éteres, los dioxenos, los arilimidazoles, y la lucigenina. Otros compuestos quimioluminiscentes generan intermedios, a partir de la reacción con oxígeno singlete, que subsiguientemente reaccionan con otro reactivo con emisión de luz. Son ejemplo de compuestos las hidrazidas tales como el luminol y los ésteres de oxalato.
Los compuestos quimioluminiscentes de interés generalmente emitirán en longitudes de onda superiores a los 300 nanómetros, y usualmente por encima de los 400 nm. Los compuestos que solos, o junto con una molécula fluorescente, emiten luz con longitudes de onda más allá de la región en que los compuestos del suero absorben luz serán de especial uso en la presente invención. La fluorescencia del suero decae rápidamente por encima de los 500 nm y pasa a ser relativamente insignificante por encima de 550 nm. Por tanto, cuando el analito es el suero, los compuestos quimioluminiscentes que emiten luz por encima de 550 nm, preferiblemente por encima de 600 nm, son de especial interés. Con objeto de evitar la autosensibilización del compuesto quimioluminiscente, es preferible que el compuesto quimioluminiscente no absorba la luz usada para excitar el fotosensibilizador. Puesto que generalmente será preferible excitar el sensibilizador con longitudes de onda superiores a 500 nm, será, por tanto, deseable que la absorción de luz por parte del compuesto quimioluminiscente esté muy poco por encima de 500 nm.
Cuando se desee la emisión de longitudes de onda largas a partir del compuesto quimioluminiscente, puede usarse un emisor de longitudes de onda larga tal como un pireno, unido al compuesto quimioluminiscente. Alternativamente, puede incluirse una molécula fluorescente en el medio que contiene el compuesto quimioluminiscente. Las moléculas fluorescentes preferidas serán excitadas por el compuesto quimioluminiscente activado, y emitirán en una longitud de onda superior a la longitud de emisión del compuesto quimioluminiscente, habitualmente superior a 550 nm. También es usualmente deseable que las moléculas fluorescentes no absorban en las longitudes de onda usadas para activar el fotosensibilizador. Los ejemplos de colorantes útiles incluyen la rodamina, el etidio, el dansilo, el Eu(fod)_{3}, el Eu(TTA)_{3}, el Ru(bpy)_{3}^{--} (en donde el bpy = 2,2-dipiridil), etc. En general, estos colorantes actúan como aceptores en los procesos de transferencia de energía, y preferiblemente tienen rendimientos cuánticos fluorescentes elevados, y no reaccionan rápidamente con el oxígeno singlete. Pueden incorporarse en partículas simultáneamente a la incorporación del compuesto quimioluminiscente en las partículas.
Las olefinas ricas en electrones generalmente tienen un grupo donador de electrones en conjugación con la olefina:
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en donde A es un grupo donante de electrones tal como, por ejemplo, N(D)_{2}, OD, p-[C_{6}H_{4}N(D)_{2}]_{2}, furanilo, N-alquilimidazolio, N-alquilpirrolilo, 2-indolilo, etc., donde D puede ser, por ejemplo, alquilo o arilo, y donde A está unido directamente al carbono olefínico o unido mediante la intermediación de otros dobles enlaces conjugados. Las otras valencias de los átomos C en la olefina 1 son sustituyentes de 1 a 50 átomos, los cuales pueden tomarse juntos para formar uno o más anillos, que están fusionados o no fusionados, por ejemplo, cicloalquilo, fenilo, 7-norbornilo, naftilo, antracilo, acridanilo, adamantilo, y demás.
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Los enoléteres de uso en esta invención generalmente tienen la estructura:
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en donde las D_{1} se toman independientemente, y se seleccionan del grupo formado por H y sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente, arilo, hidroxiarilo, aminoarilo, t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo, etc., y puede tomarse junto con uno o ambos de los átomos de carbono para formar un anillo tal como un cicloalqueno, adamantilideno, 7-norbornilideno y similar, y D_{2} es preferiblemente alquilo o arilo. Son ejemplo de enoléteres, a modo de ilustración y no de limitación, el 2,3-diaril-4,5-dihidrodioxenos:
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en donde X = O, S ó ND_{2}, y Ar y Ar' son arilos, incluyendo arilos sustituidos en donde al menos un sustituyente está presente como grupo amino, éter, o hidroxilo.
9-(dialcoximetilideno)-xanteno:
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Alcoxivinilpireno:
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9-alcoximetilideno-10-alquilacridina:
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y
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Los vinilsulfuros de uso en esta invención generalmente incluyen los enoléteres antes mencionados, en donde el átomo de oxígeno está remplazado por un átomo de azufre.
La enaminas de uso en la presente invención generalmente tienen la estructura:
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en donde D_{3} puede ser independientemente alquilo o arilo, y el resto de sustituyentes en la olefina se seleccionan del grupo formado por H y sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente arilo, hidroxiarilo, aminoarilo, t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo, etc.
Son ejemplo de enaminas, a modo de ilustración y no de limitación,
dialquilaminovinilpireno:
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dialquilaminovinil-9,10-difenilantraceno
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en donde \phi = fenilo, y así sucesivamente.
Las 9-alquilideno-N-alquilacridinas generalmente tienen la estructura:
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en donde D_{4} es alquilo, y el resto de sustituyentes en la olefina se seleccionan del grupo formado por H y sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente arilo, alcoxiarilo, aminoarilo, t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo, etc., y pueden tomarse juntos para formar un anillo tal como, por ejemplo, adamantilo, ciclopentilo, 7-norbornilo, y similares. Son ejemplo de acridinas, a modo de ilustración y no de limitación, la 9-bencilideno-10-metilacridina sustituida y 9-difenilmetileno-10-metilacridina descritas por Singer et al., J. Am. Chem. Soc. 102: 3823 (1983), y McCapra, Chem. Comm. 944 (1977), 9-metilideno-10-metilacridinas descritas por E. White, Chem. Letters 1491 (1979).
Los dioxetanos formados por la reacción del oxígeno singlete con la estructura "quimioluneral", donde los sustituyentes sobre los átomos de carbono (C) son aquellos presentes en la olefina correspondiente:
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algunos de los cuales se descomponen espontáneamente, otros mediante calor y/o catálisis, habitualmente mediante un aceptor de electrones ricos en energía, con la emisión de luz.
Otra familia de compuestos quimioluminiscentes son las 2,3-dihidro-1,4-ftaloazinedionas. El compuesto más popular es el luminol, que es el compuesto 5-amino. Otros miembros de la familia incluyen los sustituidos 6-amino, 5-amino-6,7,8-trimetoxi, y el análogo dimetilamino[ca]benzo. Estos compuestos son oxidados por el oxígeno singlete, en una reacción con varios pasos que resulta en su descomposición, con formación de un derivado ftalato y emisión de luz.
Otra familia de compuestos quimioluminiscentes son las 2,4,5-trifenilimidazolas, con la lofina como nombre común del compuesto progenitor. Los análogos quimioluminiscentes incluyen los sustituyentes para-dimetilamino y -metoxi.
El siguiente grupo de compuestos quimioluminiscentes incluye los compuestos bis-arileno, incluyendo el bis-9,9'-acridilideno y el derivado 10,10'-dimetilo del mismo descritos por Singer, J. Org. Chem. 41: 2685 (1976), lucigenina, y bis-9,9'-xantilidina.
Otros compuestos quimioluminiscentes que satisfacen los requisitos mencionados más arriba pueden encontrarse en la solicitud de patente europea nº 0.345.776, publicada el 13 de diciembre de 1989.
Compuesto quimioluminiscente fotoquímicamente activable (PACC): una sustancia que experimenta una reacción química, a partir la excitación directa o sensibilizada por luz o a partir de la reacción con oxígeno singlete, para formar una producto de reacción metaestable que es capaz de descomponerse con la emisión simultánea o subsiguiente de luz, habitualmente en el rango de longitudes de onda de 250 a 1200 nm. El término "fotoactivable" incluye "fotoquímicamente activable". Los PACC preferidos en la presente invención son aquéllos que reaccionan con el oxígeno singlete para formar dioxetanos o dioxetanonas. Éstas últimas son usualmente olefinas ricas en electrones. Son ejemplo de dichas olefinas ricas en electrones los enoléteres, enaminas, 9-alquilideno-N-alquilacridinas, arilviniléteres, dioxenos, arilimidazoles, 9-alquilideno-xantanos, y lucigenina. Otros compuestos que se incluyen en el término "PACC" incluyen el luminol, y otras ftalohidrazidas, y compuestos quimioluminiscentes que están protegidos de sufrir una reacción quimioluminiscente gracias a estar protegidos por un grupo protector fotoquímicamente lábil, incluyendo dichos compuestos, por ejemplo, la luciferina de luciérnaga, la acuaforina, el luminol, etc.
Los PACC de interés preferiblemente emitirán con una longitud de onda superior a los 300 nanómetros, preferiblemente superior a 500 nanómetros, y más preferiblemente superior a 550 nm. Los compuestos que absorben y emiten luz con longitudes de onda más allá de la región donde los componentes de la muestra contribuyen significativamente a la absorción de luz serán de especial uso en la presente invención. La absorción del suero decae rápidamente por encima de los 500 nm, y pasa a ser insignificante por encima de 600 nm; por tanto, los compuestos quimioluminiscentes emiten luz por encima de 600 nm será de especial interés. No obstante, los compuestos quimioluminiscentes que absorben en longitudes de onda más cortas son útiles cuando la interferencia de absorbancia de la muestra está ausente, o cuando se usa un fotosensibilizador que absorbe luz con longitud de onda superior, y, acto seguido, activa el compuesto quimioluminiscente. Los PACC de esta invención se usan como marcas y están asociados con un miembro de un sbp.
El PACC 1 de más abajo generalmente no contiene grupos CH o NH alílicos.
Las olefinas ricas en electrones apropiadas como PACC de la presente invención están dentro del ámbito de los "Compuestos Quimioluminiscentes" de la presente Sección. Los PACC usualmente no tienen ningún átomo portador de un átomo de hidrógeno que esté unido directamente a la olefina, a menos que el átomo esté en una posición que no pueda acomodar un doble enlace, tal como en una posición de cabeza de puente en un sistema anular bicíclico pequeño. Las olefinas más preferidas son aquéllas que generan un dioxetano que decae rápidamente a temperatura ambiente (menos de 60 minutos, preferiblemente menos de 5 minutos, deseablemente menos de 30 s). Los dioxetanos pueden ser luminiscentes solos o en conjunción con un aceptor de energía fluorescente.
Los enoléteres apropiados como PACC de la presente invención están también dentro del ámbito "Compuesto Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son compuestos de enoléteres particularmente útiles aquéllos con un arilo en el mismo carbono es que el éter, en los que el anillo arilo es sustituido por un grupo donante de electrones en una posición que proporciona fluorescencia. El grupo donante de electrones puede ser, por ejemplo, m-hidroxifenil, m-dimetilaminofenil, 1-(5-aminonaftil). pirilo, 1-(3-hidroxipirilo), antracilo, crisilo, etc. Uno o ambos grupos en la posición 2 pueden ser arilos, en los que la cetona formada mediante el remplazo del carbono 1 con oxígeno es fluorescente, por ejemplo, \beta-naftilo, o 2-antrilo. Son ejemplos de enoléteres, a modo de ilustración y no de limitación:
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en donde X_{1} es H, OC(O)CH_{3}, OCH_{3}, OH, descrito por Bronstein et al., en la patente estadounidense nº 4.956.477;
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descrito por Bronstein et al., en la patente estadounidense nº 4.956.477;
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en donde X_{2} es H, OH, N(CH_{3})_{2}, u OCH_{3}, descrito por P. Schaap, J. Am. Chem. Soc. 104: 3504 (1982) y P. Schaap, Photochem and Photobiology 30: 35 (1979);
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en donde X_{2} es como se ha definido más arriba, X_{3} es H, OH, o N(CH_{3})_{2}, descrito por P. Schaap, informe para la U.S. Army Research Office, 15 de octubre de 1986, y S. D. Gagnon, tesis doctoral, Wayne State University (1982);
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en donde X_{4} = O, S, CH_{3}N o PhN, e Y = O, S, o CH_{3}N, y Ph = fenilo, descrito por P. Schaap, informe para la Office of Naval Research, 17 de marzo de 1987;
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descrito por P. Schaap, informe para la U.S. Army Research, 15 de octubre de 1986.
Las enaminas apropiadas como PACC de la presente invención también se encuentra en el ámbito "Compuesto Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son ejemplo de enaminas particularmente útiles, a modo de ejemplo y no de limitación, los anteriores enoléteres 3-5 con N(CH_{3})_{2} en lugar de OCH_{3}. Aún otro ejemplo es
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Las 9-alquilideno-N-alquilacridinas apropiadas como PACC también se encuentran dentro del ámbito "Compuesto Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son particularmente útiles aquéllos de la Fórmula 7 en donde el resto de sustituyentes sobre la olefina son fenilo, naftilo, fenantrilo, m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi, N-morfoleno, y pueden tomarse juntos para formar un anillo tal como, por ejemplo, adamantilo, N-metiacridanilida, xantanilidina, 1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno), y similares. Son ejemplos determinados de 9-alquilideno-N-alquilacridinas útiles como marcas en la presente invención, a modo de ilustración y no de limitación:
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descrito por Singer, J. Org. Chem. 41: 2685 (1976);
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descrito por E. White, Chem. Letters 12: 1491 (1979);
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en donde R_{4} y R_{5} son independientemente H o fenilo, descrito por Singer et al., J. Am. Chem. Soc. 102: 3823 (1983);
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descrito por McCapra, Chem. Comm. N24, 944 (1977) y Singer, et al., ibid.;
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descrito por McCapra, ibid.;
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descrito por McCapra, ibid.
Las partes relevantes de las referencias anteriores se incorporan en ésta por referencia.
Los 9-alquilideno-xantanos útiles como PACC de la presente invención generalmente tienen la estructura:
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donde los sustituyentes en la olefina se seleccionan del grupo formado por H y sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente fenilo, naftilo, fenantrilo, m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi, N-morfoleno, y pueden tomarse juntos para formar un anillo tal como, por ejemplo, adamantilo, N-metilacridanilido, xantanilidina, 1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno), y similares, por ejemplo, 9-fenil-metiliden-xanteno.
Otra familia de PACC son las 2,3-dihidro-1,4-ftaloazinedionas. El compuesto más popular es el luminol, que es el compuesto 5-amino. Otros miembros de la familia incluyen el 5-amino-6,7,8-trimetoxi y análogo el dimetilamino[ca]benzo. Debería destacarse que el luminol se ha usado como marca en ensayos; no obstante, la excitación del luminol debe conseguirse químicamente, no mediante fotoactivación como es el caso en la presente invención. Estos compuestos son oxidados hasta las 1,4-ftaloazinidionas por el oxígeno singlete, y bajo subsiguiente reacción c on superóxido o peróxido de hidrógeno se descomponen con emisión de luz.
Otra familia de PACC son la 2,4,5-trifenilimidazolas, con lofina como nombre común para el compuesto progenitor. Los análogos quimioluminiscentes incluyen los sustituyentes para-dimetilamino y -metoxi.
Otros PACC que satisfacen los requisitos detallados más arriba pueden encontrarse en la solicitud de patente europea nº 0.345.776 publicada en 13 de diciembre de 1989.
Compuesto quimioluminiscente protegido: son aquellos PACC que tienen un grupo protector fotoremovible. Cuando se retira el grupo protector mediante fotoactivación, el compuesto emite luz espontáneamente o a partir de su activación con componentes que están presentes en el medio de ensayo. Los grupos protectores fotoremovibles incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, el o-nitrobencilo, el o-acilfeniletilo, el alquilbencilo, y similares, habitualmente unidos a un heteroátomo del PACC. Son ejemplo de PACC que pueden formar parte de los compuestos quimioluminiscentes protegidos aquellas olefinas ricas en electrones mencionadas más arriba. Son ejemplos particulares, a modo de ilustración, de compuestos quimioluminiscentes protegidos según este aspecto de la invención:
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En el caso de compuestos quimioluminiscentes protegidos, cualquier reactivo necesario estará presente antes de la fotoactivación o fotolisis. Dichos reactivos pueden incluir enzimas y sustratos para dichos enzimas. En algunos casos, el control del pH es lo único que se precisa. Otros agentes son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano silvestre, el peróxido de hidrógeno, etc. Aquéllos especialistas en la técnica apreciarán reactivos adicionales a partir de la selección de cualquier compuesto quimioluminiscente protegido apropiado, guiados por los principios anteriores. Por ejemplo, en el caso del compuesto 1 puede usarse la luciferasa de luciérnaga y su sustrato luciferina. En el caso del compuesto 2 tan sólo es necesario mantener un medio básico (pH > 9). En el caso de 2A, pueden usarse el peróxido de hidrógeno y la peroxidasa de rábano silvestre.
Materiales auxiliares: frecuentemente se emplearán varios materiales auxiliares en el ensayo según la presente invención. Por ejemplo, los tampones estarán normalmente presentes en el medio de ensayo, así como los estabilizadores para el medio de ensayo y componentes del ensayo. Frecuentemente, además de estos aditivos, pueden incluirse proteínas tales como albúminas, solventes orgánicos tales como formamida, sales de amonio cuaternarias, por ejemplo, polialquilenglicoles, o similares. Cuando el fotosensibilizador es activado químicamente en vez de mediante irradiación, a menudo se incluirá el peróxido de hidrógeno como un reactivo auxiliar. Cuando sea deseable desplazar la longitud de emisión del compuesto quimioluminiscente hacia longitudes de onda más largas, o catalizar la descomposición de su forma activada por oxígeno, puede emplearse una molécula fluorescente.
Total o parcialmente secuencialmente: cuando la muestra y diversos agentes utilizados en la presente invención se combinan de forma distinta a concomitantemente (simultáneamente), uno o más pueden combinarse con uno o más de los reactivos restantes para formar una subcombinación. Cada subcombinación puede entonces someterse a uno o más pasos del presente procedimiento. Por tanto, cada una de las subcombinaciones puede incubarse en condiciones para conseguir uno o más de los resultados deseados.
Aceptor de energía: también denominado en ésta como aceptor de energía fluorescente. Un cromóforo que tiene un absorción sustancial por encima de los 310 nm, normalmente por encima de 350 nm, y preferiblemente superior a aproximadamente 400 nm. La elección del aceptor de energía también estará gobernada por el PACC particular. El aceptor de energía debería ser capaz de absorber luz emitida por el PACC. Preferiblemente, el máximo de absorción del aceptor de energía debería estar en longitudes de onda similares a la del máximo de emisión del compuesto quimioluminiscente. Es deseable un elevado coeficiente de extinción, habitualmente en exceso de 10, preferiblemente en exceso de 10^{3}, y particularmente preferido en exceso de 10^{4}.
Diversas moléculas diferentes útiles como aceptor de energía son descritas por Ullman et al., I, II, IV y V, en las columnas 8 y 9, las partes relevantes de las cuales se incorporan en ésta por referencia. Generalmente, el aceptor de energía es un compuesto fluorescente o emisor de fluorescencia, pero también son útiles los aceptores de energía que tienen una muy débil fluorescencia o no tienen.
Un grupo de emisores de fluorescencia que tienen un cierto número de las propiedades deseables descritas más arriba son los colorantes de xanteno, lo cual incluye las fluoresceínas derivadas del 3,6-dihidroxi-9-fenil-xanthidrol, y las rosaminas y rodaminas derivadas del 3,6-diamino-9-fenil-xanthidrol. Las rodaminas y fluoresceínas tienen un grupo 9-o-carboxifenilo, y son derivados del 9-o-carboxifenil-xanthidrol.
Estos compuestos están comercialmente disponibles con sustituyentes en el grupo fenilo, los cuales pueden usarse como sitio de unión o como la funcionalidad de unión. Por ejemplo, están disponibles compuestos de fluoresceína sustituidos con amino e isotiocianato.
Las naftilaminas son otro grupo de compuestos fluorescentes que tienen un grupo amino en la posición alfa o beta, habitualmente en la posición alfa. Entre los compuestos naftilamino se incluyen el 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, el 1-anilino-8-naftalensulfonato, y el 2-p-toluidinil-6-naftalensulfonato.
Los precursores de colorantes que son activados para reaccionar con proteínas incluyen la 3-fenil-7-isocianatocoumarina; acridinas tales como la 9-isotiocianatoacridina; N-(p-(2-benzoazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazolas tales como
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la 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola; estilbenos tales como el 4-dimetilamino-4'-isotiocanatoestilbeno y 4-dimetilamino-4'-maleimidoestilbeno. Otros colorantes que pueden ser funcionalizados aún más para combinar con un miembro de un sbp incluyen el naranja de acridina, el 7-(p-metoxibenzilamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola; la N,N'-dioctabeciloxacarbocianina p-toluensulfonato; pirenos tales como el ácido 8-hidroxi-1,3,6-pirenetrisulfónico, y el ácido 1-pirenebutírico, la merocianina 540, el "rose bengal", así como otras moléculas fluorescentes que pueden conseguirse fácilmente.
Para ensayos de polinucleótidos pueden usarse una amplia variedad de aceptores de energía, pero se prefieren aquéllos que tienen fluorescencia potenciada cuando se unen a ácidos nucleicos de doble hebra. Los colorantes que se intercalan tales como bromuro de etidio y naranja de acridina son ejemplos típicos. Un derivado del rutenio desarrollado por Barton (J. Am. Chem. Soc. (1990) 112: 4960) es particularmente atractivo debido a que es activado dramáticamente cuando se intercala. Alternativamente, el aceptor de energía puede unirse a una segunda sonda de polinucleótidos que puede unirse cerca de la sonda marcada con compuesto quimioluminiscente, o el aceptor de energía puede no estar unido y dispersase libremente en solución.
Los aceptores de energía que no son fluorescentes pueden incluir cualquiera de una amplia variedad de colorantes azo, colorantes cianino, 4,5-dimetoxifluoresceína, formazanos, indofenoles, y similares.
Un procedimiento al cual puede aplicarse la presente invención es un procedimiento para determinar un analito. El procedimiento comprende tratar un medio sospechoso de contener un analito con condiciones tales que el analito, si está presente, afecta la cantidad de un fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente que puede ponerse en estrecha proximidad, en donde el oxígeno singlete de corta vida generado por el fotosensibilizador puede reaccionar con el compuesto quimioluminiscente antes de su decaimiento espontáneo. El procedimiento comprende además medir la intensidad de luminiscencia producida por el compuesto quimioluminiscente. La intensidad de luminiscencia producida está relacionada con la cantidad de analito en el medio. El compuesto quimioluminiscente es capaz de activación por parte del oxígeno singlete, y el fotosensibilizador cataliza la formación de oxígeno singlete, habitualmente en respuesta a la fotoexcitación seguida por transferencia de energía al oxígeno molecular. A menudo, la superficie se llevará a una estrecha proximidad con el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, en donde la superficie será preferiblemente la superficie de partículas que pueden suspenderse. El producto formado por la activación del compuesto quimioluminiscente se descompone, preferiblemente de forma espontánea, con emisión de luz.
El procedimiento se basa en un analito que causa o inhibe que las moléculas del fotosensibilizador y del compuesto quimioluminiscente estén más próximas entre ellas que la distancia promedio en el conjunto de la solución del medio de ensayo. Este repartición dependerá de la cantidad de analito presente en la muestra a analizar. Las moléculas de fotosensibilizador que no pasan a estar asociadas con el compuesto quimioluminiscente producen oxígeno singlete que es incapaz de alcanzar el compuesto quimioluminiscente antes de decaer en el medio acuoso. No obstante, cuando el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pasan a estar en estrecha proximidad entre ellos en respuesta a la cantidad de analito, el oxígeno singlete producido a partir de la irradiación del fotosensibilizador puede activar el compuesto quimioluminiscente antes de decaer. Debido a que numerosas moléculas de compuesto quimioluminiscente y/o moléculas de fotosensibilizador pueden asociarse con una superficie, y debido a que la difusión está restringida en una superficie, la presencia de una superficie en conjunción con el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente puede incrementar la eficiencia del, o la acción del, oxígeno singlete con el compuesto quimioluminiscente antes de su decaimiento. El uso de una superficie que se lleva a la proximidad del compuesto quimioluminiscente y del fotosensibilizador en función de la presencia de analitos es, por tanto, preferida. El ensayo sujeto proporciona un procedimiento conveniente para detectar y medir una amplia variedad de analitos de manera simple, eficiente y reproducible, que puede emplear un equipamiento sencillo para medir la cantidad de luz producida durante la reacción.
La cantidad de fotosensibilizador que pasa a estar en estrecha proximidad del compuesto quimioluminiscente se ve afectada por la presencia de analito en virtud a que el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están cada uno asociado con un miembro de un sbp. Esto puede conseguirse en un cierto número de formas, y el término "asociado con" se define por ello. El fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden contener funcionalidades para su anclaje covalente al miembro de un sbp o a los miembros de un sbp, o grupos capaces de unirse a miembros de un sbp, pueden contener funcionalidades para su anclaje al fotosensibilizador y/o compuesto quimioluminiscente. El anclaje puede conseguirse mediante enlace directo entre las dos moléculas, o puede emplearse un grupo de engarce entre un miembro de un sbp y el fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente. En otra realización uno de ellos o ambos, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, pueden unirse a superficies o incorporarse en partículas, a la que también están unidos los miembros de un sbp. En ambos casos, cada uno de los miembros de un sbp es capaz de unirse directa o indirectamente al analito o a un componente del ensayo cuyas concentraciones se ven afectadas por la presencia del analito. El fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden incorporarse dentro de partículas gracias a que son solubles en, al menos, una fase de las partículas, en cuyo caso el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente estarán en concentraciones mucho más elevadas dentro de la partícula que en el conjunto del medio de ensayo. Cuando el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están unidos covalentemente a partículas, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente o las partículas, o componentes de las mismas, son funcionalizados para proporcionar un medio para anclar el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente y las partículas. Para partículas que son gotas de aceite o liposomas, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden unirse a una o más cadenas hidrocarbonadas largas, teniendo generalmente cada una al menos 10 a 30 átomos de carbono. Si las partículas son gotas de un fluorocarburo, el fotosensibilizador o el compuesto quimioluminiscente incorporado en estas partículas puede estar fluorado para mejorar su solubilidad y reducir el intercambio dentro de otras partículas unidas con la otra marca, y la cadena de hidrocarburo usada para el engarce se remplazará preferiblemente por una cadena de fluorocarburo. Para partículas fluidas de silicona, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden unirse a un polisiloxano. Con objeto de maximizar el número de moléculas de fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente por partícula, usualmente será deseable minimizar la carga y polaridad del fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente, de forma que resida dentro de la parte no acuosa de la partícula. Cuando la partícula es un liposoma y se desea retener el fotosensibilizador o el compuesto quimioluminiscente en la fase acuosa del fotosensibilizador, se preferirá el uso de fotosensibilizadores o compuestos quimioluminiscentes que son muy polares o están muy cargados.
No importa como están unidos el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, es crítico que ningún compuesto sea capaz de disociarse de su miembro de un sbp, y pase a asociarse con el miembro de un sbp unido al otro miembro del par fotosensibilizador y compuesto quimioluminiscente durante el curso del ensayo. Por tanto, la disociación de estos compuestos de sus respectivos miembros de un sbp será lenta en relación con el tiempo requerido para el ensayo.
El compuesto quimioluminiscente puede estar unido a un miembro de un sbp que es capaz de unirse directa o indirectamente al analito o a un componente del ensayo, y cuya concentración se ve afectada por la presencia del analito. El término "capaz de unirse directa o indirectamente" significa que la entidad designada puede unirse específicamente a la entidad (directamente), o puede unirse específicamente a un miembro de un par de unión específica, o a un complejo de dos o más miembros de un sbp, que son capaces de unirse a la otra entidad (indirectamente). La superficie tiene generalmente un miembro de un sbp unido sobre sí. Preferiblemente, el compuesto quimioluminiscente está asociado con la superficie, habitualmente dentro de una partícula que puede suspenderse. Este miembro de un sbp es generalmente capaz de unirse directamente o indirectamente al analito o a un receptor del analito. Cuando los miembros de un sbp asociados con el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente son ambos capaces de unir el analito, resulta un protocolo de ensayo en "sandwich". Cuando uno de los miembros de un sbp asociado con el fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente puede unir ambos el analito y un análogo del analito, resulta un protocolo de ensayo competitivo. El anclaje a una superficie o la incorporación en una partícula del compuesto quimioluminiscente es gobernado generalmente por el mismo principio descrito más arriba para el anclaje del fotosensibilizador a, o su incorporación dentro de, una partícula.
Habitualmente se causa que el fotosensibilizador active el compuesto quimioluminiscente mediante la irradiación del medio que contiene los reactivos anteriores. El medio debe irradiarse con luz que tenga una longitud de onda con energía suficiente para convertir el fotosensibilizador a un estado excitado, y, por tanto, para hacerlo capaz de activar el oxígeno molecular a oxígeno singlete. El estado excitado para el fotosensibilizador capaz de excitar el oxígeno molecular es generalmente un estado triplete, el cual es más de aproximadamente 20, habitualmente al menos 23 kcal/mol más energético que el estado fundamental del fotosensibilizador. Preferiblemente, el medio se irradia con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 450 a 950 nm, aunque pueden usarse longitudes de onda más cortas, por ejemplo, 230-950 nm. La luminiscencia producida puede medirse de cualquier forma conveniente, tal como fotográficamente, visualmente, o fotométricamente, para determinar la cantidad de la misma, la cual se relaciona con la cantidad de analito en el medio.
Aunque habitualmente será preferible excitar el fotosensibilizador mediante irradiación con luz de una longitud de onda que sea eficientemente absorbida por el fotosensibilizador, pueden emplearse otros medios de excitación como, por ejemplo, mediante transferencia de energía desde un estado excitado de un donante de energía tal como un segundo fotosensibilizador. Cuando se usa un segundo fotosensibilizador, pueden usarse longitudes de onda que son absorbidas ineficientemente por el fotosensibilizador pero absorbida eficientemente por el segundo fotosensibilizador. El segundo fotosensibilizador puede estar unido a un componente del ensayo que está asociado, o pasa a estar asociado, con el primer fotosensibilizador, por ejemplo, unido a una superficie o incorporarse en la partícula que tiene el primer fotosensibilizador. Cuando se emplea un segundo fotosensibilizador, éste tendrá habitualmente un estado triplete de mínima energía a un nivel de energía superior al estado triplete de mínima energía del primer fotosensibilizador.
La línea de emisión a 632,6 nm del láser de helio-neón es una fuente de luz barata para excitación. Los fotosensibilizadores con un máximo de absorción en la región de aproximadamente 620 a aproximadamente 650 nm son compatibles con la línea de emisión de un láser de helio-neón y son, por tanto, particularmente útiles en la presente invención.
Otro aspecto es un procedimiento para determinar un analito, el cual comprende: (a) proporcionar en combinación (1) un medio sospechoso de contener analito, (2) un fotosensibilizador capaz, en su estado excitado, de activar oxígeno a un estado singlete, estando asociado el fotosensibilizador a un miembro de un sbp, y (3) una partícula que puede suspenderse que comprende un compuesto quimioluminiscente, en donde la partícula tiene un miembro de un sbp unido a ella, (b) tratar la combinación con luz para excitar el fotosensibilizador, y (c) examinar la combinación a partir de la cantidad de luz emitida a partir de la misma. La cantidad de luminiscencia emitida está relacionada con la cantidad de analito en el medio. El compuesto quimioluminiscente se incorpora en una partícula que puede suspenderse, y el miembro de un sbp se une a la partícula. El fotosensibilizador se incorpora en una segunda partícula que puede suspenderse, la cual tiene un miembro de un sbp unido a ella.
Las composiciones de la invención pueden adaptarse a la mayoría de análisis que implican miembros de un sbp, tales como ligando-receptor: por ejemplo, reacciones antígeno-anticuerpo; ensayos de unión de polinucleótidos, y demás. Los ensayos pueden ser homogéneos o heterogéneos, competitivos o no competitivos. Los componentes del ensayo, compuesto quimioluminiscente y fotosensibilizador, pueden utilizarse en un cierto número de formas con (1) una superficie, cuando se emplee, (2) ácido nucleico o receptor, y (3) ácido nucleico o ligando. La asociación puede implicar enlaces covalentes o no covalentes. Aquéllos especializados en la técnica serán capaces de escoger asociaciones apropiadas dependiendo del ensayo particular deseado, en vista de la discusión ilustrativa precedente y siguiente.
En una estrategia de ensayo homogéneo, la muestra sería tratada previamente, si es necesario, para suprimir materiales no deseados. La reacción para un tipo de ensayo en "sandwich" no competitivo puede implicar un miembro de un sbp, (por ejemplo, un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, un receptor o ligando) complementario al analito y asociado con un compuesto quimioluminiscente; un fotosensibilizador asociado con un miembro de un sbp, (por ejemplo, anticuerpo, sonda de ácido nucleico, receptor o ligando) que es también complementario del analito; la muestra de interés; y cualquier reactivo auxiliar requerido. Preferiblemente, uno o ambos, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente se incorporan en partículas a las cuales se anclan los otros miembros de un sbp. En un protocolo competitivo, un miembro del sbp puede derivarse del analito, y el otro miembro del sbp puede ser complementaria del analito, por ejemplo, un anticuerpo. En cualquier protocolo los componentes pueden combinarse bien simultáneamente o total o parcialmente de forma secuencial. La capacidad del oxígeno singlete producido por un fotosensibilizador activado para reaccionar con el compuesto quimioluminiscente está gobernada por la unión de un miembro de un sbp al analito. Por tanto, la presencia o la cantidad de analito puede determinarse midiendo la cantidad de luz emitida a partir de la activación del fotosensibilizador mediante irradiación, calentamiento, o adición de un reactivo químico, preferiblemente mediante irradiación. Ambas, la reacción de unión y la detección del alcance de la misma pueden llevarse a cabo en una solución homogénea sin separación. Esto es una ventaja de la presente invención con respecto a procedimientos previos de la técnica que usaban la quimioluminiscencia.
En una estrategia de ensayo heterogéneo, los componentes del ensayo incluyen una muestra sospechosa de contener un analito que es un miembro de un sbp; un miembro de un sbp unido a un soporte, que puede ser una superficie no dispersable o una partícula que tiene asociado consigo un miembro de un grupo formado por un compuesto quimioluminiscente y el fotosensibilizador; y un miembro de un sbp que tiene el otro miembro del grupo asociado con él, en donde los miembros del sbp pueden unir independientemente, bien directa o indirectamente, el analito o un receptor para el analito. Estos componentes se combinan generalmente bien simultáneamente, o total o parcialmente de forma secuencial. La superficie o partículas pueden entonces separarse de la fase líquida, y bien la fase separada o la fase líquida se somete a condiciones para activar el fotosensibilizador, usualmente irradiando la fase determinada en cuestión, y midiendo la cantidad de luz emitida.
Las reacciones de unión en un ensayo para el analito normalmente se llevarán a cabo en un medio acuoso a un pH moderado, generalmente aquél que proporciona una sensibilidad del ensayo óptima. Preferiblemente, la activación del fotosensibilizador también se llevará a cabo en medio acuoso. No obstante, cuando se emplea un paso de separación, pueden usarse medios no acuosos, tales como, por ejemplo, acetonitrilo, acetona, tolueno, benzonitrilo, etc., y medios acuosos con valores de pH que son muy elevados, es decir, superiores de 10,0, o muy bajos, es decir, inferiores a 4,0, habitualmente muy elevados. Tal como se ha explicado más arriba, el ensayo puede realizarse bien sin separación (homogéneo) o con separación (heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo.
El medio acuoso puede ser solamente agua, o puede incluir desde un 0,01 hasta un 80 por ciento de volumen de un cosolvente, pero habitualmente incluirá menos del 40% de un cosolvente cuando se use un miembro de un sbp que sea una proteína. El pH para el medio de la reacción de unión estará usualmente en el rango de aproximadamente 4 a 11, más habitualmente en el rango de aproximadamente 5 a 10, y preferiblemente en el rango de aproximadamente 6,5 a 9,5. Cuando el pH no se cambia durante la generación del oxígeno singlete, el pH será habitualmente un compromiso entre el óptimo de unión de los miembros unidores y el pH óptimo para la producción de señal y la estabilidad de los otros reactivos del ensayo. Cuando se precisan pH elevados para la producción de señal, puede insertarse un paso, que implique la adición de un reactivo alcalino, entre la reacción de unión y la generación de oxígeno singlete y/o producción de señal. Habitualmente, el pH elevado será superior a 10, habitualmente 10-14. Tal como se menciona más arriba, para ensayos heterogéneos también pueden usarse solventes no acuosos, siendo la principal consideración que el solvente no reaccione eficientemente con el oxígeno singlete.
Pueden usarse varios tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante un ensayo. Los tampones ilustrativos incluyen el borato, fosfato, carbonato, tris, barbital, y similares. El tampón concreto empleado no es crítico para esta invención, pero en un ensayo individual puede preferirse uno u otro tampón.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo las reacciones de unión de ligandos y receptores proteicos en el ensayo, y usualmente una temperatura constante, preferiblemente, 25ºC a 40ºC, durante el período de medición. Las temperaturas de incubación para la reacción de unión normalmente oscilarán desde aproximadamente 5ºC hasta 45ºC, usualmente desde aproximadamente 15ºC hasta 40ºC, más habitualmente 25ºC hasta 40ºC. Cuando durante el ensayo ocurre la unión de ácidos nucleicos, frecuentemente se usarán temperaturas más elevadas, habitualmente 20ºC a 90ºC, más habitualmente 35ºC a 75ºC. Las temperaturas durante las mediciones, es decir, generación del oxígeno singlete y detección de luz, generalmente oscilarán desde aproximadamente 20ºC hasta 100ºC, más habitualmente desde 25ºC hasta 50ºC, más usualmente 25ºC hasta 40ºC.
La concentración de analito que puede ensayarse generalmente variará desde aproximadamente 10^{-4} hasta inferior a 10^{-16} M, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6} hasta 10^{-14}. Las consideraciones como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de detección concreta, la concentración del analito de interés, y los tiempos de incubación máximos deseados, normalmente determinarán las concentraciones de los diversos reactivos.
En ensayos competitivos, mientras que las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo estarán generalmente determinadas por el rango de concentraciones de interés del analito, la concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determinará empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el rango. Esto es, una variación en la concentración del analito que sea significativa debería proporcionar una diferencia de señal medible con precisión.
La concentración de los miembros de un sbp dependerá de la concentración de analito, la velocidad de unión deseada, y el grado con que los miembros del sbp se unen no específicamente. Habitualmente, los miembros de un sbp estarán presentes en, al menos, la concentración de analito más baja esperada, preferiblemente al menos la concentración de analito más elevada esperada, y para ensayos no competitivos las concentraciones pueden ser 10 a 10^{6} veces la concentración de analito más elevada, pero serán habitualmente inferiores a 10^{-4} M, preferiblemente menos de 10^{-6} M, frecuentemente entre 10^{-11} y 10^{-7} M. La cantidad de fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente asociado con un miembro de un sbp generalmente será de al menos una molécula por miembro de sbp, y puede ser tan elevada como 10^{5}, habitualmente al menos 10-10^{4}, cuando la molécula de fotosensibilizador o quimioluminiscente se incorpora en una partícula.
Mientras que el orden de adición puede variar ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple es añadir los materiales simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden combinarse total o parcialmente de forma secuencial. Cuando el ensayo es competitivo, a menudo será deseable añadir el análogo del analito después de combinar la muestra y un miembro de un sbp capaz de unir el analito. Opcionalmente, puede implicarse un paso de incubación después de que los reactivos sean combinados, generalmente oscilando desde aproximadamente 30 segundos hasta 6 horas, más habitualmente desde aproximadamente 2 minutos hasta 1 hora antes de que se provoque que el sensibilizador genere el oxígeno singlete y se mida la emisión de luz.
En un orden de adición particularmente preferido, un primer conjunto de miembros de un sbp que son complementarios de y/o homólogos del analito se combina con el analito, seguido por la adición de miembros del par de unión específico complementarios de los primeros miembros del par de unión específico, cada uno asociado con un miembro diferente del grupo formado por un fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente. A continuación, la mezcla de ensayo, o un componente de la misma separado, es irradiada y se mide la emisión de luz.
En un ensayo homogéneo, después de que todos los reactivos hayan sido combinados, éstos pueden incubarse, si se desea. A continuación, se irradia la combinación y se mide la emisión de luz resultante. La luz emitida está relacionada con la cantidad de analito en la muestra ensayada. Las cantidades de los reactivos de la invención empleados en un ensayo homogéneo dependen de la naturaleza del analito. Generalmente, los ensayos homogéneos de la presente invención exhiben una sensibilidad incrementada frente a ensayos conocidos como el ensayo EMIT®. Esta ventaja resulta primordialmente de la relación señal-ruido mejorada obtenida con el presente procedimiento.
Los siguientes ensayos se proporcionan a modo de ilustración y no de limitación, para permitir que un especialista en la técnica aprecie el alcance de la presente invención, y ponga en práctica la invención sin experimentación indebida. Se apreciará que la elección de analitos, fotosensibilizadores, compuestos quimioluminiscentes, superficies, partículas y condiciones de reacción será sugerente para aquéllos especialistas en la técnica en vista de los descubrimientos en ésta, en los ejemplos que siguen.
En un procedimiento, no incluido en el ámbito de la invención, el compuesto quimioluminiscente 9-benzal-10-metilacridina se une covalentemente a un anticuerpo contra la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) (Reactivo 1). La 9-benzal-10-metilacridina, funcionalizada con un N-hidroxisuccinimidiléster de un grupo carboxilo anclado al anillo de fenilo, reacciona con los grupos amino del anticuerpo. El grupo de engarce es un carboxamida. El fotosensibilizador utilizado es el "rose bengal", el cual está unido covalentemente a partículas de látex que tienen una dimensión promedio de 0,5 micrómetros. Las partículas de látex y el "rose bengal" están unidos covalentemente entre ellos, a través de grupos clorometilo sobre el látex, para proporcionar un grupo de engarce éster tal como se describe en J. Am. Chem. Soc. 97: 3741 (1975). La partícula de látex está además engarzada a un segundo anticuerpo contra la TSH a través de grupos N-hidroxisuccinimidiléster sobre el látex (Reactivo 2). Ambos anticuerpos empleados son anticuerpos monoclonales preparados mediante tecnología estándar de líneas celulares híbridas. Un anticuerpo reconoce la subunidad \alpha de la TSH, y el otro reconoce la subunidad \beta de la TSH. Al realizar el ensayo se obtiene de un paciente una muestra sospechosa de contener TSH. Quince microlitros de la muestra se combinan con 500 ml de medio acuoso, tamponado con tampón Tris a pH 8,0, con los anteriores Reactivo 1 y Reactivo 2. Las cantidades de Reactivo 1 y Reactivo 2 son suficientes para proporcionar concentraciones de cada anticuerpo de aproximadamente 10^{-6} molar. A continuación se incuba la mezcla de reacción durante un período de una hora a 25ºC, y entonces se irradia durante 30 segundos con luz a 560 nm. Se mide la intensidad de luz emitida a partir de la irradiación, y la energía luminosa total detectada durante un período de 30 segundos se compara con los valores obtenidos, en un procedimiento similar, con muestras con concentraciones conocidas de TSH, para determinar la concentración de TSH en la muestra desconocida. Alternativamente, a continuación de la incubación, se separan las partículas de látex del medio y se colocan en un medio acuoso tamponado a pH 9,5, se irradian de forma similar, y la cantidad de luz emitida a partir del sistema se mide como antes.
En un alternativa basada en la anterior, el Reactivo 2 es "rose bengal" unido covalentemente al segundo anticuerpo, y no se emplea ninguna partícula de látex.
En aún otra estrategia alternativa basada en la anterior, el Reactivo 2 es "rose bengal" unido covalentemente al segundo anticuerpo, y el Reactivo 1 es 9-benzal-10-metilacridina unida covalentemente a las partículas de látex, a las que está unido covalentemente el primer anticuerpo. En todavía otra alternativa basada en la anterior, el Reactivo 1 es tal como se ha descrito inmediatamente más arriba, el Reactivo 2 es "rose bengal" unido covalentemente a partículas de látex, a las que está unida covalentemente la avidina, y se emplea un tercer reactivo (Reactivo 2A), que es el segundo anticuerpo unido covalentemente a la biotina. El Reactivo 1 y el tercer reactivo se combinan con la muestra y se incuban. Entonces se añade un exceso de Reactivo 2, y el resto de procedimiento es tal como se ha descrito más arriba.
En otra alternativa basada en la anterior, una cloroperoxidasa sustituye al "rose bengal". En este ensayo, el paso de irradiación es remplazado por la adición de bromuro de sodio y peróxido de hidrógeno para producir oxígeno singlete. La luz emitida se mide tal como se ha descrito más arriba.
En otra realización según la presente invención, un primer conjunto de gotas de aceite (Reactivo 3) se prepara a partir de una solución del fotosensibilizador y clorofila en aceite mineral, según Giaever et al., ver más arriba. Las gotas de aceite, que oscilan entre 0,1 y 2 micrómetros de diámetro, se funcionalizan y engarzan a un anticuerpo monoclonal contra la gonadotropina crónica humana (HCG). La clorofila es lipofílica y, por tanto, se disuelve de forma irreversible en la gota de aceite lipofílica. Se prepara un segundo conjunto de gotas de aceite (Reactivo 4) de forma similar. En este conjunto de gotas las gotas de aceite se engarzan covalentemente a un segundo anticuerpo monoclonal contra la HCG, el cual reconoce una parte de la molécula de HCG diferente de la reconocida por el primer anticuerpo monoclonal mencionado más arriba. La 9-(difenilmetilidino)-N-metilacridina se disuelve irreversiblemente en la gota de aceite lipofílica mediante la inclusión de un grupo N,N-didocecilcarboxamida unido a uno de los grupos fenilo de la acridina. Los anticuerpos monoclonales se preparan mediante tecnología estándar de línea celular híbrida. Se combina una muestra de orina sospechosa de contener HCG (50 microlitros) con un cantidades en exceso de Reactivo 3 y Reactivo 4 en un medio acuoso tamponado (500 \mul) a pH 7,5. Se incuba el medio a 25ºC durante un período de 20 minutos. El medio, sin separación, se irradia a 633 nm usando un láser de He/Ne durante un período de un minuto, y la luz emitida se mide como se ha descrito más arriba. La cantidad de luz se compara con la cantidad emitida por muestras que contienen cantidades conocidas de HCG, y la cantidad de HCG en la muestra se determina comparando los valores. De esta forma se realiza un inmunoensayo para HCG homogéneo, sensible y conveniente.
En una estrategia alternativa basada en la anterior, el Reactivo 3 tiene un anticuerpo contra la fluoresceína en lugar del anticuerpo contra la HCG, y un reactivo adicional (Reactivo 3A) tiene el anticuerpo contra la HGC unido covalentemente a la fluoresceína. El Reactivo 4 tiene avidina en lugar del segundo anticuerpo contra la HCG, y un cuarto reactivo (Reactivo 4A) tiene el segundo anticuerpo unido covalentemente a biotina. En el ensayo se combinan el Reactivo 4A y el Reactivo 3A con la muestra y se incuban. A continuación, se añaden los Reactivos 3 y 4 y se incuban. Entonces se lleva a cabo el resto del anterior procedimiento de ensayo.
En otro procedimiento que no se halla dentro del ámbito de la presente invención, se forma un conjunto de liposomas conjunto de liposomas (Reactivo 5) (0,2 micrómetros de diámetro) mediante extrusión a presión elevada de una suspensión de fosfolípidos, en un tampón a pH 7,4, a través de una membrana con poros de 0,2 micrómetros, usando un instrumento diseñado con éste propósito y comercialmente disponible. Un análogo de la tiroxina se une covalentemente al liposoma, formando primero grupos mercaptoacetamida sobre el liposoma mediante reacción de la fosfatidiletanolamina en el liposoma con un éster activo de metilcarboximetildisulfuro seguido por reacción con ditioeritritol. A continuación se deja reaccionar la bromoacetil-tiroxina con los liposomas sulfhidrilatados. Se disuelve un colorante de metaloporfirina en la parte lipofílica del liposoma. Otro conjunto de liposomas (Reactivo 6) se utiliza para unir un anticuerpo monoclonal contra la tiroxina. El anticuerpo se une covalentemente por medios similares a los empleados en la unión de la tiroxina. Se une covalentemente una enamina (2-dimetilaminometilenepirano), a través de un grupo de engarce carboxamida, a la superficie del liposoma. El Reactivo 5 y el Reactivo 6 se combinan en un medio de ensayo acuoso tamponado (500 \mul) a pH 8,0, junto con una muestra de suero sospechosa de contener tiroxina, la cual contiene ácido anilinonaftalenosulfónico para desplazar la tiroxina de las proteínas unidoras (50 microlitros), y aceptar energía procedente del pirano activado por oxígeno para proporcionar la emisión con longitud de onda larga. Entonces se incuba el medio de ensayo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se irradia el medio, sin un paso de separación, a 650 nm durante un período de 1 minuto, y la luz emitida resultante se mide con un luminómetro. El valor obtenido se compara con valores obtenidos realizando un ensayo similar con cantidades conocidas de tiroxina. De esta forma se cuantifica la cantidad de tiroxina en la muestra de suero.
En una estrategia alternativa basada en la anterior, el Reactivo 6 tiene avidina en vez del anticuerpo contra la tiroxina. Un reactivo adicional (Reactivo 6A) tiene un anticuerpo contra la tiroxina unido covalentemente a la biotina. El Reactivo 5 tiene un anticuerpo contra la fluoresceína en vez de la tiroxina, y un reactivo adicional (Reactivo 5A) tiene la tiroxina unido covalentemente a la fluoresceína. En el ensayo se combinan los Reactivos 5A y 6A con la muestra y se incuban. A continuación, se añaden los Reactivos 5 y 6, se incuba la mezcla, y se sigue el resto del procedimiento de ensayo.
En otra alternativa basada en la anterior, el colorante de metaloporfirina se remplaza con molibdato potásico que se incorpora en la fase acuosa de los liposomas. En este ensayo, el paso de irradiación se remplaza por la adición de peróxido de hidrógeno para producir oxígeno singlete. La luz emitida se mide tal como se ha descrito más
arriba.
En otro procedimiento, tampoco abarcado por la invención, se forma 2-hidroxietil-9,10-dibromoantraceno en un cristalito de colorante, de forma similar a la descrita por Gribnau. Se une un anticuerpo monoclonal, que reconoce el antígeno de superficie de la hepatitis B, al cristalito de colorante mediante un grupo de engarce carbamato. Se trata una partícula de látex para inmovilizar un segundo anticuerpo contra el antígeno de superficie de la hepatitis B mediante un anclaje covalente. Además, la partícula de látex se une covalentemente a 9-(benzal-9H-xanteno) a través de un grupo de engarce amida. El cristalito de colorante tiene un tamaño de partícula de un promedio de 2 micrómetros, y las partículas de látex tienen un diámetro promedio de 0,2 micrómetros. Los anticuerpos monoclonales se preparan mediante tecnología estándar de línea celular híbrida. Se combina una muestra de suero, de un paciente sospechoso de padecer la hepatitis (50 \mul), en un medio de ensayo acuoso (500 \mul) a pH 7,0 con un exceso del cristalito de colorante y partículas de látex descritas más arriba. Entonces se incuba el medio de ensayo a temperatura ambiente durante un período de 30 minutos, y, a continuación, se irradia a 350 nm con una fuente de luz de xenón durante un período de 1 minuto. La presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B en la muestra causa que el cristalito de colorante y las partículas de látex pasen a estar en estrecha proximidad gracias a la unión inmune de los respectivos anticuerpos con el antígeno. A partir de la irradiación del medio, el 9,10-dibromoantraceno se excita y convierte el oxígeno molecular a oxígeno singlete. El oxígeno singlete reacciona con el xanteno para rendir dioxetano, el cual decae espontáneamente a temperatura ambiente para producir luz. La luz se mide fotométricamente, y la cantidad de luz por encima de cierto nivel umbral indica la presencia de antígeno de superficie de la hepatitis B en la muestra. La irradiación del medio se realiza a temperatura ambiente, y el ensayo se lleva a cabo de manera homogénea para obtener un ensayo del antígeno de superficie de la hepatitis B.
Preferiblemente, en este ensayo el Eu(TTA)_{3} se disuelve en las partículas de látex para causar que el derivado del xanteno excitado transfiera su energía al Eu(TTA)_{3}, el cual emite por encima de 600 nm. Esto evita la interferencia del suero que, de otra forma, sucedería debido a la absorción, por parte de componentes del suero, de la luz emitida directamente a partir de la luminiscencia del xanteno.
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En otro procedimiento, no abarcado por la invención, el ensayo sirve para la determinación de un determinado antígeno de grupo sanguíneo sobre la superficie de hematíes, en concreto, un antígeno de grupo A. Se utilizan las partículas de látex, preparadas tal como se ha descrito más arriba, que tienen un tamaño de partícula de 150-500 nm. Las partículas de látex tienen un anticuerpo contra el antígeno de grupo A covalentemente anclado sobre la partícula de látex. Las partículas también tienen el enoléter 2-p-dimetilaminofenil-3-fenil-5,6-dihidrodioxeno disuelto en el látex. Este reactivo de partículas de látex se combina en el medio acuoso (500 \mul) con sangre entera (100 \mul) y 1 \times 10^{4} M de fotosensibilizador, el cual es un fotosensibilizador hidrofóbico, en concreto, el ácido fenazina-2-carboxílico. El colorante hidrofóbico se intercala dentro de los hematíes presentes en la muestra. El medio se incuba a 25ºC durante un período de 10 minutos, y a continuación se irradia a 400-450 nm con una fuente de tungsteno durante un período de 30 segundos. La luz emitida por el medio se mide y se compara con la cantidad de luz obtenida en muestras que se sabe carecen de hematíes con el antígeno del grupo A. Por tanto, la cantidad de luz por encima de un nivel umbral indica la presencia del antígeno de grupo sanguíneo A.
En otro procedimiento, que tampoco ilustra la presente invención, el analito es un antígeno HLA sobre la superficie de una célula. Una muestra (50 \mul) sospechosa de contener el antígeno HLA se combina en un medio de ensayo acuoso (500 \mul) tamponado a pH 7,4. Al medio también se le añade una cantidad en exceso de un reactivo que es un anticuerpo contra el antígeno HLA covalentemente unido a eosina a través de un grupo de engarce tioéter. También se añade un compuesto quimioluminiscente al medio de ensayo. El compuesto quimioluminiscente se escoge de forma que se intercale dentro de la célula que contenga el antígeno HLA. El compuesto quimioluminiscente es una acridina, en concreto la 9-(dodecilfenilmetilidino-1)-N-(2-sulfonoxietil)acridina. El medio de ensayo se incuba a temperatura ambiente durante un período de 1 hora, y a continuación se irradia a 500-550 nm con una fuente de luz de tungsteno-halógena durante un período de 1 minuto. La luz emitida por el medio de ensayo se mide, y la cantidad de luz por encima de un nivel umbral es indicativa de la presencia del antígeno HLA.
La presente invención abarca además composiciones que comprenden una partícula que puede suspenderse, de 0,04 a 4000 nanómetros de diámetro promedio, la cual incluye un compuesto quimioluminiscente. El compuesto quimioluminiscente puede estar unido covalentemente a la matriz de la partícula, o puede estar disuelto en la matriz, o disuelto en un solvente que se disuelve en la matriz. Las partículas serán preferentemente poliméricas, o serán gotas de aceite, o vesículas tales como liposomas. Cuando la partícula es un liposoma, el compuesto quimioluminiscente estará asociado con la bicapa lipídica, o disuelto en el interior acuoso del liposoma. La partícula tendrá un miembro de un sbp unido sobre sí. Preferiblemente, las partículas unidas a un sbp serán de 100 a 1000 mm de diámetro promedio. También se abarcan composiciones de dos miembros de un sbp complementarios unidos entre ellos, en donde uno está asociado con un fotosensibilizador y el otro está asociado con un compuesto quimioluminiscente.
Otro procedimiento, que no ilustra la presente invención, proporciona una combinación que comprende (1) un medio que se sospecha contiene el analito, y (2) una reactivo marcador que comprende un primer miembro de un par de unión específica (sbp) asociado con un PACC. Se escogen las condiciones de forma que se forme un complejo de miembro de sbp en relación con la presencia del analito. Por ejemplo, el primer miembro de un sbp puede ser capaz de unir el analito o un segundo miembro de un sbp para formar un complejo relacionado con la presencia del analito. El procedimiento comprende además, la activación fotoquímica del PACC y la detección de la cantidad de luminiscencia generada por el PACC. La cantidad de luminiscencia está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Generalmente, el PACC se activa fotoquímicamente mediante irradiación con luz, la cual puede activar directamente el PACC o puede activar un fotosensibilizador, el cual, una vez irradiado, causa la conversión del oxígeno molecular a oxígeno singlete. Entonces, el oxígeno singlete activa el PACC. El fotosensibilizador puede estar unido a un ligando, puede estar suelto en solución, o puede estar unido a una superficie, dependiendo de la naturaleza del ensayo. El producto formado por la activación del PACC con el oxígeno singlete puede descomponerse espontáneamente con emisión de luz, o puede ser tratado ulteriormente física o químicamente para emitir luz.
Un fotosensibilizador puede emplearse en un cierto número de estrategias diferentes para producir oxígeno singlete, el cual activa el PACC. El fotosensibilizador puede emplearse directamente, no estando unido a un miembro de un sbp. En esta estrategia se emplea una concentración del fotosensibilizador relativamente elevada, usualmente al menos 10^{-7} M, preferiblemente al menos 10^{-6} M, más preferiblemente al menos 10^{-5} M. Generalmente, la cantidad de fotosensibilizador empleada en esta estrategia es aquélla suficiente para producir una concentración de oxígeno singlete que resulta en la activación del PACC. Esta estrategia puede usarse cuando la emisión del PACC se modifica sustancialmente cuando se forma un complejo, o cuando la cantidad de PACC en el medio se ve afectada por la presencia del analito. Esto se onseguirá habitualmente separando la marca unida y no unida. Cuando no se desea una separación, la emisión del PACC en el complejo puede modificarse mediante un aceptor de energía, el cual se lleva a una estrecha proximidad con el PACC uniendo el aceptor de energía al complejo formado a resultas de la presencia del analito. Cuando el aceptor de energía es fluorescente, la longitud de onda de la emisión es habitualmente modificada. Cuando el receptor de energía no es fluorescente, la quimioluminiscencia será habitualmente atenuada cuando el PACC pase a estar unido al complejo.
En un procedimiento adicional, un fotosensibilizador y el PACC se reparten entre el conjunto de la solución del medio de ensayo y una superficie, tal como se describe en la presente invención. Este reparto dependerá de la cantidad de analito presente en la muestra a analizar, y el fotosensibilizador habitualmente estará unido a un miembro de un sbp. Las moléculas de fotosensibilizador que no pasan a estar asociadas con la superficie producen oxígeno singlete, el cual es incapaz de alcanzar el PACC antes de decaer en el medio acuoso. No obstante, cuando ambos, el fotosensibilizador y el PACC se asocian con la superficie gracias a la formación de un complejo, a resultas de la presencia del analito, el oxígeno singlete producido a partir de la irradiación del fotosensibilizador puede activar el PACC antes de decaer. En este procedimiento, la cantidad de fotosensibilizador empleado puede ser considerablemente menor que en el uso descrito previamente del fotosensibilizador que no implica un miembro de un sbp unido al fotosensibilizador.
Como puede verse, estos ensayos proporcionan un procedimiento conveniente para detectar y medir una amplia variedad de analitos de una manera simple, eficiente y reproducible, los cuales pueden emplear la inspección visual o equipamiento convencional para medir la cantidad de luz producida durante la reacción.
Cuando se causa que el fotosensibilizador pase a estar asociado con la superficie a resultas de la presencia de analito, habitualmente estará asociado con un miembro de un sbp. Esto puede conseguirse de diferentes formas. El fotosensibilizador puede contener una funcionalidad para su anclaje sobre un miembro de un sbp, o el miembro de un sbp puede contener la funcionalidad para su anclaje al fotosensibilizador. El anclaje puede conseguirse mediante un enlace directo entre las dos moléculas, o puede emplearse un grupo de engarce entre el miembro de un sbp y el fotosensibilizador. En una realización de la invención, el fotosensibilizador puede unirse o incorporarse en una partícula, a la cual también está unido un miembro de un sbp. En ambos casos, el miembro del sbp es capaz de unirse al analito. El fotosensibilizador puede incorporarse dentro de la partícula gracias a ser soluble en al menos una fase de la partícula. El fotosensibilizador puede unirse a la partícula cuando no se incorpora dentro de la partícula. Para este propósito el fotosensibilizador, o la partícula, o un componente de la misma, se funcionaliza para proporcionar un medio para unir el fotosensibilizador y la partícula. Para partículas que son gotas de aceite o bicapas lipídicas, el fotosensibilizador puede unirse a la partícula mediante anclaje a una cadena hidrocarbonada larga que es compatible con la composición de la partícula. Frecuentemente, al menos una, preferiblemente dos, cadenas hidrocarbonadas se emplean, que tienen de 8 a 20 ó más átomos de carbono.
Si la partícula es una gota de un fluorocarburo, el fotosensibilizador puede fluorarse para mejorar su solubilidad y reducir el intercambio, y la cadena hidrocarbonada usada para en engarce preferiblemente se remplazará con una cadena de fluorocarburo. Para partículas de silicona, el fotosensibilizador puede unirse a un polisiloxano. Habitualmente, será deseable minimizar la carga y polaridad del fotosensibilizador, de forma que resida dentro de la parte no acuosa de la partícula. Tal como se menciona más arriba, la estrategia que implica fotosensibilizador unido a un miembro de un sbp se describe totalmente en la presente invención.
Tal como se ha mencionado más arriba, el PACC está "asociado con un miembro de un sbp" y, por tanto, funciona como una marca. Tal como se usa en ésta, el término "asociado con un miembro de un sbp" incluye lo siguiente: habitualmente, la asociación del PACC y el miembro de un sbp es a través de una unión covalente. No obstante, este reactivo marca puede además comprender una partícula que se puede suspender, a la cual el PACC está unido o en la cual el PACC se incorpora de forma no covalente. La partícula que se puede suspender también tendrá un miembro de un sbp unido sobre sí. Este miembro de un sbp es generalmente capaz de unirse al analito o a un miembro de un sbp capaz de unirse al analito. Cuando se utiliza otro miembro de un sbp y también es capaz de unirse al analito, resulta un protocolo de ensayo en "sandwich". El miembro de un sbp unido al PACC también puede ser análogo al analito, en cuyo caso puede resultar un protocolo de ensayo competitivo.
El fotosensibilizador sirve para activar el PACC cuando se irradia el medio que contiene los reactivos anteriores. El medio se irradia con luz que tiene una longitud de onda de energía suficiente para convertir el fotosensibilizador a un estado excitado, y hacerlo capaz de activar el oxígeno molecular a oxígeno singlete. Cuando está unido a un miembro de un sbp, la concentración del fotosensibilizador puede ser muy baja, frecuentemente 10^{-6} a 10^{-12} M o inferior. Cuando el fotosensibilizador no está unido, estará frecuentemente en una concentración suficiente para absorber una cantidad apreciable de luz, habitualmente al menos un 0,1%, preferiblemente entre el 1 y el 80%.
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El estado excitado del fotosensibilizador será habitualmente el estado triplete más bajo, y es al menos 25 kcal/mol, preferiblemente al menos 23 kcal/mol, más energético que el estado basal. Generalmente, el medio es irradiado con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 300 a 1200 nm, usualmente de 450 a 950 nm, preferiblemente de 550 a 800 nm. El período de irradiación dependerá del tiempo de vida del PACC activado, la intensidad de luz, y la intensidad de emisión deseada. Para PACC activados de vida breve, el período puede ser inferior a un segundo, habitualmente aproximadamente un milisegundo, pero puede ser tan corto como un microsegundo cuando se use una lámpara de flash intensa o láser. Para PACC activados de vida larga, el período de irradiación puede ser más largo y puede usarse una fuente de luz continua y menos intensa. En general, la intensidad de luz integrada durante el período de irradiación debería ser suficiente para excitar al menos el 0,1% de las moléculas de fotosensibilizador, preferiblemente al menos el 30%, y más preferiblemente cada molécula de fotosensibilizador será excitada al menos una vez.
La luminiscencia o luz producida en cualquiera de las estrategias anteriores puede medirse visualmente, fotográficamente, actinométricamente, espectrofotométricamente, o por cualquier otro medio apropiado para determinar la cantidad de la misma, que está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Un láser de helio-neón es una fuente de luz barata para la excitación a 632,6 nm. Los fotosensibilizadores que absorben luz en esta longitud de onda son compatibles con la línea de emisión de un láser helio-neón y son, por tanto, particularmente útiles en la presente invención. Otras fuentes de luz incluyen, por ejemplo, otros láseres tales como de argón, YAG, He/Cd, y rubí; fotodiodos; lámparas de vapor de mercurio, sodio y xenón; lámparas incandescentes tales como de tungsteno y tungsteno/halógenas; y lámparas de flash.
Otro procedimiento para determinar un analito comprende (a) combinar en un medio de ensayo, bien simultáneamente, o total o parcialmente de forma secuencial (1) un medio que se sospecha contiene un analito, (2) un reactivo marcado que comprende un primer miembro de un par de unión específica (miembro de un sbp) unido a un compuesto capaz de quimioluminiscencia a partir de la reacción con oxígeno singlete, y (3) un reactivo insolubilizado que comprende un aceptor de energía fluorescente unido a, o capaz de pasar a estar unido a, un segundo miembro de un sbp, en condiciones en las que se forma un complejo de miembros de un sbp que implica dicho reactivo marcador, en relación a la presencia de analito en dicho medio, y la energía de dicho compuesto quimioluminiscente es capaz de activar dicho aceptor de energía fluorescente, (b) activar dicho compuesto con luz, y (c) examinar dicho medio de ensayo en busca de una señal, estando relacionada la presencia o intensidad de la misma con la cantidad de analito en el medio.
Las composiciones de la invención pueden adaptarse a la mayoría de los ensayos que implican miembros de un sbp, tales como un ligando-receptor, por ejemplo, reacciones antígeno-anticuerpo, ensayos de unión de polinucleótidos, y demás. Los ensayos pueden ser homogéneos o heterogéneos, competitivos o de "sandwich". En una estrategia de ensayo homogéneo, la muestra puede tratarse previamente, si es necesario, para suprimir materiales no deseados. La reacción inmunológica de un ensayo de tipo "sandwich" habitualmente implica un miembro de un sbp, por ejemplo, un anticuerpo, que es complementario del analito y está unido al PACC, un segundo miembro de un sbp, por ejemplo, anticuerpo, que también es complementario al analito, y la muestra de interés. En un protocolo competitivo, el PACC puede estar asociado a un miembro de un sbp que es análogo a, habitualmente un derivado de, el analito, o con un miembro de un sbp complementario del analito, por ejemplo, un anticuerpo.
El PACC puede utilizarse bien por sí mismo o asociado con un aceptor de energía. La capacidad de luminiscencia producida por un PACC activado para activar el aceptor de energía estará gobernada por la unión de los dos miembros de un sbp, o puede ser la consecuencia de una concentración relativamente elevada del aceptor de energía en la vecindad del PACC activado, en donde la concentración habitualmente será al menos micromolar, usualmente al menos milimolar. Cuando el PACC está unido a un miembro de un sbp, su concentración, por contra, puede ser bastante baja, a menudo 10^{-5} a 10^{-15}, usualmente 10^{-8} a 10^{-14}, y la detección del alcance de la misma puede llevarse a cabo en una solución homogénea sin separación, sólo a condición de que la intensidad de la luminiscencia sea modificada cuando el PACC está en un complejo unidor.
En una estrategia de ensayo heterogéneo, una muestra sospechosa de contener un analito, el cual es un miembro de un sbp, se combina con un reactivo que está formado por un miembro de un sbp complementario unido a un soporte, el cual puede ser una superficie o una partícula que tienen el PACC. También puede emplearse un aceptor de energía asociado con otro miembro de un sbp, en donde el miembro del sbp es bien complementario (sandwich) o análogo (competitivo) al analito. Estos materiales se combinarán generalmente bien simultáneamente o total o parcialmente de forma secuencial. A continuación se separa el soporte de la fase líquida, y la fase sólida o la fase líquida se examinan en busca de la presencia de energía luminiscente, habitualmente irradiando la fase concreta en cuestión, y midiendo la cantidad de luz emitida.
Un ensayo para el analito normalmente se realizará en un medio acuoso tamponado a un pH moderado, generalmente aquél que proporciona una sensibilidad de ensayo óptima. Tal como se ha explicado más arriba, el ensayo puede realizarse bien sin separación (homogéneo) o con separación (heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo.
El medio acuoso puede ser solamente agua, o puede incluir desde un 0,01 hasta un 80 ó más de porcentaje de volumen de un cosolvente. El pH del medio estará usualmente en el rango de aproximadamente 4 a 13, más habitualmente en el rango de aproximadamente 5 a 10, y preferiblemente en el rango de aproximadamente 6,5 a 9,5. El pH será habitualmente un compromiso entre el óptimo de unión de los miembros unidores y el pH óptimo para los otros reactivos del ensayo, tales como los miembros del sistema de producción de señal. Por ejemplo, el PACC puede requerir un cierto rango de pH con objeto de decaer para producir luminiscencia.
Pueden usarse varios tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Los tampones ilustrativos incluyen el borato, fosfato, carbonato, tris, barbital, y similares. El tampón concreto empleado no es crítico para esta invención, pero en un ensayo individual puede preferirse uno u otro tampón.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el ensayo, y usualmente una temperatura constante, preferiblemente, temperatura ambiente, durante el período de medición. Las temperaturas de incubación normalmente oscilarán desde aproximadamente 5ºC hasta 99ºC, usualmente desde aproximadamente 15ºC hasta 70ºC, más habitualmente 20ºC hasta 45ºC. Las temperaturas durante las mediciones normalmente oscilarán desde aproximadamente 10ºC hasta 70ºC, más usualmente desde aproximadamente 20ºC hasta 45ºC, más habitualmente 20ºC a 25ºC. En algunos casos, el PACC puede precisar de calentamiento hasta 100ºC con objeto de decaer para producir luminiscencia.
La concentración de analito que puede ensayarse generalmente variará desde aproximadamente 10^{-5} hasta 10^{-17} M, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6} hasta 10^{-14}. Las consideraciones como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de detección concreta, y la concentración del analito de interés, normalmente determinarán las concentraciones de los diversos reactivos.
Mientras que las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo estarán generalmente determinadas por el rango de concentraciones de interés del analito, la concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determinará empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el rango. Esto es, una variación en la concentración del analito que sea significativa debería proporcionar una diferencia de señal medible con precisión.
Mientras que el orden de adición puede variar ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple, en particular para un ensayo homogéneo, es añadir todos los materiales simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden combinarse total o parcialmente de forma secuencial. Opcionalmente, puede implicarse un paso de incubación después de que los reactivos sean combinados, generalmente oscilando desde aproximadamente 30 segundos hasta 6 horas, más habitualmente desde aproximadamente 2 minutos hasta 1 hora.
En un ensayo homogéneo, después de que todos los reactivos hayan sido combinados, éstos pueden incubarse, si se desea. A continuación, se irradia la combinación y se mide la emisión de luz resultante. La luz emitida está relacionada con la cantidad de analito en la muestra ensayada. Las cantidades de los reactivos de la invención empleados en un ensayo homogéneo dependen de la naturaleza del analito.
Los siguientes ensayos se proporcionan a modo de ilustración y no de limitación.
Los ensayos H e I siguientes ilustran la presente invención y las formas de usar composiciones de la invención sin experimentación indebida. Se apreciará que la elección de analitos, fotosensibilizadores, PACC, superficies, partículas y condiciones de reacción será evidente para los especialistas en la técnica a la luz de los descubrimientos en la presente invención y en los ejemplos que siguen.
En los siguientes ensayos, los componentes se combinan en un medio predominantemente acuoso de pH 6 a 8,5.
A. En un ensayo para la HCG se combina una muestra de orina con (1) un anticuerpo contra la HCG, unido a partículas de látex de 1 micrómetro teñidas con el fotosensibilizador, ftalocianina de cobre, y (2) un anticuerpo contra un epítopo separado y no solapado de la HCG, unido al PACC 4. Después de incubar la suspensión durante 30 minutos, las partículas se separan del medio mediante centrifugación, se lavan e irradian con luz de 600 nm. La intensidad de la luz emitida a continuación de la irradiación está relacionada con la cantidad de HCG en la muestra. Las partículas separadas pueden irradiarse directamente, o suspenderse en un solvente acuoso o no acuoso antes de la irradiación.
B. En un procedimiento para el ensayo de HCG en suero similar a A, las cuentas de látex que se usan están teñidas con el fotosensibilizador, ftalocianina de cobre, y, a continuación de su incubación, se separan del medio y a continuación se irradían con luz a 600 nm. La intensidad de la luz emitida está relacionada con la cantidad de HCG en la muestra.
C. En un ensayo para la digoxina en suero, el PACC, luminol, conjugado con la digoxigenina, se incuba con la muestra en un pocillo de poliestireno que se ha teñido con tetradecilftalocianina. La superficie del pocillo está recubierta con un anticuerpo contra la digoxina. Después de una incubación de 30 minutos y de retirar el medio de ensayo, se irradia el pocillo con luz de 600 nm. Es preferible añadir una solución alcalina antes de la irradiación (pH 10-12). La intensidad de la luz emitida a continuación de la irradiación está inversamente relacionada con la concentración de digoxina en la muestra.
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D. En un ensayo para la albúmina en orina, se combina la muestra con (1) un anticuerpo contra la albúmina marcado con el PACC, y (2) un anticuerpo contra la albúmina dirigido contra un epítopo de la albúmina que no se solapa, anticuerpo que está marcado con un aceptor de energía,
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El fotosensibilizador, azul de metileno, está incluido en el medio de ensayo. Se incuba el medio durante 10 minutos, y entonces se irradia con luz de 600 nm. La intensidad de la luz emitida por el aceptor de energía (aproximadamente 500 nm) a continuación del final de la irradiación está directamente relacionada con la cantidad de albúmina en la muestra.
E. En un ensayo para la tiroxina en suero, se combina la muestra con tiroxina unida a cuentas de látex, dentro de las cuales se ha incorporado el PACC 10, en donde X_{2} es N(CH_{3})_{2}. En el medio de ensayo se incluye anticuerpo contra la tiroxina, unido a "rose bengal". A continuación de una incubación de 10 minutos, se irradia el medio con luz de 550 nm, y se mide la luz emitida a continuación del final de la irradiación. La intensidad de luz emitida está inversamente relacionada con la cantidad de tiroxina en la muestra.
F. En un ensayo para una secuencia polinucleotídica diana en una muestra que contiene ADN, se mezcla con la muestra un oligonucleótido de 25 bases complementario de la secuencia diana y conjugado con PACC 23, que es el 9-fenilmetilidenxantano. Entonces se calienta el medio hasta 75ºC y se enfría a 55ºC para permitir la hibridación del oligonucleótido con cualquier secuencia diana presente. El aceptor de energía e intercalador, naranja de acridina, y el fotosensibilizador, ácido ftalocianina-tetrasulfónico, están presentes en la solución de hibridación o pueden añadirse una vez completada la reacción de hibridación. Entonces se irradia la solución con luz de 600 nm, y se mide la intensidad de luz emitida por el naranja de acridina (aproximadamente a 500 nm) a partir del final de la irradiación. La intensidad de luz esta directamente relacionada con la presencia de la secuencia diana.
G. En un ensayo para una secuencia polinucleotídica diana en una muestra que contiene ADN, se provoca la hibridación de un oligonucleótido de 25 bases, complementario de la secuencia diana y marcado con el fotosensibilizador, ftalocianina, con la diana, tal como en E, más arriba. Un compuesto que se une al surco menor del ADN de doble hebra, el colorante Hoechst 33258, el cual está unido al PACC 20, N-metil-9-fenilmetilidenacridina, está presente en el medio, o se añade a continuación de la hibridación. Entonces se irradia el medio con luz de 600 nm, y se mide la intensidad de luz emitida a partir del final de la irradiación. La intensidad de luz esta directamente relacionada con la cantidad de secuencia diana presente en la muestra.
H. En un ensayo para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero, se combina la muestra con (1) partículas de látex de 150 nm teñidas con el PACC, y recubiertas con anticuerpos contra el HBsAg, y (2) con cuentas de látex de 150 nm teñidas con el fotosensibilizador tetrafenil-porfirina, y recubiertas con anticuerpos contra el HBsAg. Después de incubar la muestra durante una hora, se irradia la suspensión con luz de 550 nm. A continuación del final de la irradiación, se mide la intensidad de la luz emitida y se relaciona con la cantidad de HBsAg en la muestra.
I. En un ensayo para HBsAg en sangre completa, se sigue el procedimiento H. excepto que las cuentas de látex que contienen PACC se remplazan por cuentas de látex teñidas con PACC 23, que el el 9-fenilmetiliden-xanteno, y el aceptor de energía
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Se mide la intensidad de luz emitida a 610 a 620 nm y se relaciona con la concentración de HBsAg en la muestra.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a equipos que contienen la composición de la invención, útiles para realizar convenientemente el procedimiento de ensayo para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra sospechosa de contener el analito. Para mejorar la versatilidad de la presente invención, los reactivos pueden proporcionarse en una combinación empaquetada, en el mismo contenedor o contenedores separados, de forma que la proporción de los reactivos proporcione una optimación sustancial del procedimiento y ensayo. Los reactivos pueden estar cada uno en contenedores separados, o varios reactivos pueden combinarse en uno o más contenedores dependiendo de la reactividad cruzada y estabilidad de los reactivos.
Un tipo de equipo comprende (1) una composición que incluye una partícula que se puede suspender que comprende un compuestos quimioluminiscente, teniendo la partícula un miembro de un sbp unido sobre sí, y (2) un fotosensibilizador con una partícula, a la cual está unido un miembro de un sbp. El equipo puede incluir además otros reactivos, empaquetados por separado, para llevar a cabo un ensayo, incluyendo los reactivos auxiliares, y demás.
El compuesto quimioluminiscente puede contener un grupo olefina y uno o más sustituyentes donantes de electrones en conjugación con dicho grupo olefina.
El compuesto quimioluminiscente puede seleccionarse de entre el grupo consistente en 9-alquiliden-N-metilacridano, enoléteres y enaminas.
El fotosensibilizador o dicho compuesto quimioluminiscente puede estar asociado con una partícula que puede suspenderse que comprende la superficie.
También se puede conseguir que una superfície se pusiera en estrecha proximidad, y la supercifie está sobre una partícula suspendida, y la partícula se selecciona de entre el grupo consistente en partículas de látex, bicapas lipídicas, gotas de aceite, partículas de sílica, soles metálicos, y cristalitos de colorante.
El fotosensibilizador puede ser un colorante seleccionado del grupo consistente en el azul de metileno, el rosa de bengala, las porfirinas y las ftalocianinas.
Tanto el fotosensibilizador como el compuesto quimioluminiscente pueden tener un miembro de un par de unión específica (sbp) asociado consigo, y dicho miembro del spb se selecciona de forma independiente del grupo consistente en ligandos, receptores, polinucleótidos, y agentes unidores de polinucleótido.
La presente solicitud proporciona un equipo que comprende, en una combinación empaquetada, (1) una composición que incluye una partícula que se puede suspender que comprende un compuestos quimioluminiscente, teniendo dicha partícula un miembro de un sbp unido sobre ella, y (2) una segunda partícula que se puede suspender que comprende dicho fotosensibilizador, el cual es capaz, en su estado excitado, de activar oxígeno a su estado excitado, teniendo dicha segunda partícula unido sobre ella un miembro de un sbp.
Ejemplos
La invención se demuestra además mediante los siguientes ejemplos ilustrativos. Las partes y porcentajes usados en ésta son en peso, a menos que se indique lo contrario. Las temperaturas están en grado centígrados (ºC).
Abreviaturas
Ab_{F} - Anticuerpo monoclonal contra la fluoresceína.
Ab_{IF} - Anticuerpo monoclonal contra el factor intrínseco.
B_{12}-LC_{25}-F - Vitamina B_{12} unida a carboxifluoresceína (F) a través de un grupo de engarce con una longitud de cadena de 25 átomos de carbono, en concreto, HN(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}-O-CH_{2}CONH(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}NHCO.
BA-C_{18} - 4-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi)benzal-9-metil-acridina.
t-Bu - ter-butil.
TFA - Ácido trifluoroacético.
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Biotina-LC_{21}-F
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BSA - Albúmina de suero bovino.
Chl-a - Clorofila-a.
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D-H_{2}O - Agua desionizada.
DPPC - Dipalmitoilfosfatidilcolina.
DPPG - Dipalmitoilfosfatidilglicerol.
DPPE - Dipalmitoilfosfatidiletanolamina.
EDAC - 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro.
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F - Fluoresceína.
F-NHS - El éster N-hidroxisuccinimida de la 6-carboxifluoresceína.
F-LC_{21}NH_{2} - Carboxifluoresceína a la que se ha unido el grupo engarce HN(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}-O-CH_{2}CONH
(CH_{2})_{6}NH_{2}.
HCG - Gonadotropina de corion humana.
Lip - Liposoma.
nC_{10} - Complejo cloruro de tetra-(n-decil)ftalocianina aluminio.
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OD - Gota de aceite.
OD/BA-C_{18} - Gotas de aceite que contienen BA-C_{18}.
PB - Cuentas de poliestireno.
PB/BA-C_{18} - PB que contiene BA-C_{18}.
PB/nC_{10} - PB que contienen tetra-(n-decil)ftalocianina aluminio.
PBS - Solución salina tamponada con fosfato, 0,02 M NaP_{i}, 0,14 M NaCl, pH 7,2.
P_{i} - fosfato.
Sulfo-NHS - Sulfo-N-hidroxisuccinamida.
TSH - Hormona estimuladora de la tiroides u hormona tirotrópica.
SATA - ácido S-acetiltioglicólico N-hidroxisuccinimida éster.
RLU - Unidades de luz relativas.
Ab_{1}(HCG) - Anticuerpo monoclonal anti-HCG\beta (12A8).
Ab_{2}(HCG) - Anticuerpo monoclonal anti-HCG\alpha (9D7).
Ab_{1}(TSH) - Anticuerpo monoclonal anti-TSH\beta_{1} (35).
Ab_{2}(TSH) - Anticuerpo monoclonal anti-TSH\beta_{2} (9G3). (Nota: para Ab_{1}(TSH) y Ab_{2}(TSH), Ab_{1} y Ab_{2} son anticuerpos contra la cadena \beta de la TSH, contra dos epítopos diferentes).
NHS - N-hidroxisuccinamida.
IF - Factor intrínseco.
DMSO - Dimetilsulfóxido.
avidina-PB/BA-C_{18} - PB/BA-C18 unido covalentemente a avidina.
Ab_{F}-PB/nC_{10} - PB/nC_{10} recubiertas con Ab_{F}.
DMF - Dimetilformamida.
DCC - Diciclohexilcarbodiimida.
TEA - Trietilamina.
TLC - Cromatografía en capa fina.
TNBSA - ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfónico.
Dig-CMO - O-carboximetiloxima de digoxigenina-3-ona.
BGG - Gammaglobulina bovina.
Biotina-LC_{7}-NHS - Sulfosuccinimidil-6-(biotinamido)-hexanoato.
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Todos los anticuerpos monoclonales se produjeron mediante tecnología estándar de células híbridas. En resumen, el inmunogén apropiado se inyectó en un huésped, habitualmente un ratón u otro animal apropiado, y después de un período de tiempo apropiado, se obtuvieron células pancreáticas del huésped. Alternativamente, se aislaron células no sensibilizadas del huésped y se sensibilizaron directamente con el inmunogén in vitro. Las células híbridas se formaron fusionando las células anteriores con una línea celular de mieloma apropiada, y cultivando las células fusionadas. Los anticuerpos producidos por las células híbridas cultivadas se examinaron por su capacidad de unión al antígeno concreto, por ejemplo, TSH o HCG. Se emplearon un cierto número de técnicas de examen, tales como, por ejemplo, exámenes ELISA. A continuación, se reclonaron las fusiones seleccionadas.
Ejemplo 1 Ensayo para la Vitamina B_{12} Preparación del conjugado B_{12}-LC_{25}-F
El conjugado B_{12}-LC_{25}-F, con un brazo espaciador con una longitud de 25 átomos de carbono (ver más abajo), se preparó introduciendo grupos carboxílicos en la molécula B_{12} haciendo reaccionar la molécula de B_{12} con metilisocianatoacetato (el cual reacciona con el grupo hidroxilo de la ribosa en la molécula de B_{12}, formando un enlace carbamato estable), seguido por hidrólisis básica del metiléster para generar el grupo carboxílico. El grupo carboxílico introducido en el sitio 5'-OH se convirtió en el éster NHS de B_{12}, y a continuación se hizo reaccionar con la amina de fluoresceína F-LC_{21}-NH_{2} para generar el producto final B_{12}-LC_{25}-F.
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(Esquema pasa a página siguiente)
A. Esquema sintético para la cadena de 21 átomos de carbono sobre la 5-carboxifluoresceína
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Se disolvieron 1,2 g (0,0056 moles) de la diamina monoprotegida 1C1 en 25 ml de diclorometano anhidro, y a esta solución se añadieron 0,64 g (0,0056 moles) de diglicólico anhidro 1A1, y se dejó la reacción durante 5 horas a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla de reacción, y se extrajo con 50 ml de agua, 50 ml de etilacetato. Se lavó la fase orgánica con HCl 0,1 N (50 ml), agua (2 \times 50 ml), y se secó con MgSO_{4}, y se concentró al vacío para rendir 1,35 g de 1A2.
^{1}H NMR 100 MHz (CD_{3}OD) \delta 4,0, 3,85(2s, 4, O-CH_{2}-CO), w 3,0, 2,82 (2t, 4, NCH_{2}), \delta 1,4 (s, CH_{3}).
Se disolvieron 500 mg (1,33 moles) de 5-carboxifluoresceína, 1A3, (secada a 80ºC sobre P_{2}O_{5}, al vacío 0,05 mm, 16 horas) en 20 ml de dimetilformamida anhidra. A la solución en agitación se le añadieron 280 mg (1,46 mmoles) de 1-etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida, y 168 mg (1,46 mmoles) de N-hidroxisuccinimida. Después de agitarla durante 16 horas, se añadieron 400 mg (1,85 mmoles) de mono t-Boc-1,6-diaminohexano, y se agitó la mezcla durante 4 horas adicionales a temperatura ambiente. La mezcla resultante se concentró hasta una solución espesa, y se disolvió en 1:9 metanol:etilacetato (100 ml), y se extrajo con agua (3 \times 50 ml), HCl 0,1 N (100 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó al vacío. El residuo se purificó sobre Analtech 1000 \mu, placas GF de gel de sílice de 20 \times 20 cm, usando 0,5% de ácido acético y 10% de metanol en dicloro-metano. Las bandas puras se juntaron y se extrajeron con (1:1) metanol/diclorometano, se concentraron, y el residuo se disolvió en el mínimo de metanol, y se añadió gota a gota en agua. A continuación se centrifugó la mezcla y el sólido se secó al vacío, rindiendo un 83% de 1A4.
Se trataron 3,5 g (0,0064 moles) de mono-t-Boc 1,6-diaminohexil-5-carbonil fluoresceína 1A4 (secada a 90ºC, sobre P_{2}O_{5}, en vacío de 0,05 mm, 16 horas) con 40 ml de diclorometano/ácido trifluoroacético 1/1. La solución se arremolinó en un baño de hielo, y transcurridos 5 minutos se evaporó el solvente y se secó el residuo crudo al vacío durante la noche.
Se combinaron 42 mg de mono-t-Boc ácido 1,6-diaminohexilglicólico amida 1A2, 22 mg (0,190 mmoles) de N-hidroxisuccinimida, y 36,4 mg (0,190 mmoles) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida en 4 ml de diclorometano anhidro, y se agitaron a temperatura ambiente durante 16 horas. La solución del ácido activado se añadió gota a gota en un solución en agitación de 75 mg (0,127 mmoles) del anterior derivado 1,6-diaminohexil-5-carboxilfluoresceína, 10 ml de dimetilformamida anhidra, y 66 ml de trietilamina. Después de 1 hora, se disolvió la reacción en agua y se extrajo con etilacetato. Se lavó la fase orgánica con agua (3 \times 25 ml), se secó con MgSO_{4}, se concentró y purificó sobre una placa GF de gel se sílice 1000 m Analtech de 20 \times 20 cm, 10% de metanol, 0,5% de ácido acético en diclorometano. La banda pura se aisló, se extrajo con metanol/diclorometano, se concentró y secó al vacío. Se disolvió el residuo en 4 ml de metanol y se añadió gota a gota a HCl 0,1 N (8 ml) arremolinado, se centrifugó y se secó. 84 mg de 1A5, rendimiento del 84%.
^{1}H NMR 500 MHz (CD_{3}OD) \delta 8,4 (d, 1, ArH, J=0,71 Hz) \delta 8,17 (dd, 1, ArH, J=8,0 Hz) \delta 7,3 (d, 1, ArH, H=8,0 Hz) \delta 4,04 (d, 4, O-CH_{2}-CO) \delta 1,41 (s, 9, 3CH_{3}).
Anal. Calc. para C_{42}H_{52}N_{4}O_{11} : C, 63,7; H, 6.8; N, 7,0
Encontrado: C, 63,56; H, 6,64; N, 7,0
A la anterior amina, t-Boc de cadena larga de 21 átomos, de la 5-carboxifluoresceína (secada a 80ºC sobre P_{2}O_{5}, al vacío de 0,05 mm) se le añadieron 5 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente. Transcurridos 5 minutos se evaporó el ácido y se secó a continuación a 80ºC al vacío para rendir la sal del ácido trifluoroacético 1A6.
FAB-MS C_{37}H_{44}N_{4}O (M+H)^{+} 689.
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(Esquema pasa a página siguiente)
B. Esquema sintético para la modificación de la B_{12} en la posición O^{5'} del anillo de la ribosa con un espaciador de 25 átomos engarzado a la 5-carboxifluoresceína
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Se disolvieron 25 mg (0,0185 mmoles) de vitamina B_{12} (1B1) (secada durante 48 horas a 80ºC, 10 \mu) en 1,25 ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta solución en agitación se añadieron 21,2 mg (0,185 mmoles) de metilisocianoacetato y se dejó progresar la reacción durante durante 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se añadió gota a gota dentro de 10 ml de solución de etilacetato en agitación. Se centrifugó el producto precipitado, se resuspendió a continuación en una cantidad mínima de metanol, y se precipitó de nuevo. Este material se purificó sobre una placa preparativa Whatman PLC_{18}F 1000 \mu de 20 \times 20 cm, eluyente 2:8 isopropanol:agua conteniendo 0,5 ml de ácido acético + 1 g de NaCl por cada 100 ml. Rf = 0.625. El aislamiento a partir del absorbente rindió el metiléster 1B2.
(+)-FAB-MS (C_{67}H_{93}CoN_{15}O_{17}P), P.M. 1469,6; (M+H) 1470,(M-CN)^{+} 1444.
Se disolvieron 40 mg (0,0272 mmoles) del B_{12}O^{5}'-carbonilglicina metiléster 1B2 en 2,5 ml 2/1 metanol/agua, pH ajustado a 9,5 con hidróxido amónico, y se agitaron durante 16 horas a temperatura ambiente.
análisis de tlc Whatman KC_{18}F
2:8 isopropanol:agua, 0,5% ácido acético, 1% NaCl
Rf \approx 0,79
La mezcla de reacción se concentró hasta secarla, y el producto se aisló usando dos placas Whatman PLC_{18}F 1000 \mu, 20 \times 20 cm, el mismo eluyente que más arriba. Se extrajo la banda pura con metanol, se concentró el extracto, se disolvió en 2:7 metanol-diclorometano, se filtró y concentró. Se disolvió el residuo en 4 ml de metanol, y se añadió gota a gota a 4 ml de etiléter. Se centrifugó el precipitado y se secó a 60ºC, sobre P_{2}O_{5}, 0,5 mm, 16 horas, para obtener 28 mg de producto 1B3.
(+)-FAB-MS (C_{66}H_{91}CoN_{15}O_{17}P), P.M. 1455,7; (M+H)^{+} 1456,(M-CN)^{+} 1431.
Se combinaron 15 mg (0,013 mmoles) de B_{12}O^{5}'-carbonilglicina 1B3, 3,66 mg (0,016 mmoles) de N,N-diciclohexilcarbodiimida, y 1,95 mg (0,017 mmoles) de N-hidroxisuccinimida, con 5 ml de dimetilformamida anhidra, y se agitaron a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió la mezcla de reacción gota a gota a una solución en agitación de 13,6 mg (0,17 mmoles) amina de cadena larga de 21 átomos de la 5-carboxifluoresceína 1A6 en 2,02 mg (0,02 mmoles) de trietilamina en 4 ml de dimetilformamida seca, y se agitaron durante 12 horas a temperatura ambiente.
El crudo de la reacción se concentró al vacío a 40ºC, y el residuo se disolvió en 2 ml de metanol, y se precipitó con 6 ml de etiléter, y se centrifugó. El sólido se purificó sobre una placa Whatman PLC_{18}F de 1000 \mu, 20 \times 20 cm, eluyente 7:3 metanol:agua, 0,5% ácido acético, Rf \sim 0,78, 37% de rendimiento de 1B4.
(+)-FAB-MS (C_{103}H_{133}CoN_{19}O_{25}P), (M+H)^{+} 2125, (M-CN)^{21} UV/max 360 (\varepsilon 26.600), 50 (\varepsilon 57.000), 550 (\varepsilon 9500).
II. Biotinilación de anticuerpos anti-factor intrínseco (Ab_{IF})
Los anticuerpos monoclonales anti-factor intrínseco (Ab_{IF}) se prepararon mediante tecnología estándar de células híbridas basada en la descrita por Kohler y Milstein en Nature 256 (1975) 495-497.
Usando biotina-LC_{7}-NHS de Pierce Chemical Co., Rockford, Ill, se realizaron tres niveles de biotinilación (Ab_{IF}:
biotina en la mezcla de reacción = 1:10, 1:50, ó 1:200). El Ab_{IF} estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05, pH = 7,8, a [Ig] = 2,5 mg/ml. A esta solución se le añadió DMSO (1% del volumen total) conteniendo la cantidad requerida de biotina-LC_{7}-NHS, y, a continuación, se incubó la solución durante la noche a 4ºC. Finalmente, las mezclas de reacción se purificaron sobre Sephadex® G25, y se dializaron extensivamente frente a NaP_{i} 0,05 M, 0,02% de NaN_{3}, pH = 7,2. Los anticuerpos anti-factor intrínseco biotinilados se almacenaron congelados.
III. Preparación de las partículas A. Materiales
Látex modificado con carboxilato, 175 nm: Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN 46032.
Látex modificado con carboxilato, 38 nm: Duke Scientific Corporation, Palo Alto, CA 94303.
Etilenglicol, alcohol bencílico, benzonitrilo: Aldrich Chemical Co.
Sephadex® G-25: Pharmacia.
nC_{10}: Ultra Diagnostics Corporation, Seattle, WA 98105.
B. Ab_{F}-PB/nC_{10} 1. Partículas de 38 nm de diámetro
Se preparó una solución 2,1 M de nC_{10} en alcohol bencílico. Se colocó etilenglicol (16 ml) en un vial de vidrio de 20 ml, y se calentó hasta 100ºC sobre una placa caliente de laboratorio. Se añadió el alcohol bencílico (1,6 ml) y se agitó la mezcla magnéticamente. Se añadió una solución de reserva de látex (2 ml, látex de 38 nm, modificado con carboxilato, conteniendo un 10% de sólidos) y se dejó equilibrar la mezcla durante 3 a 4 minutos. La solución de nC_{10} (0,4 ml) se añadió lentamente en alícuotas de 100 \mul. Se continuó el calentamiento a 100ºC durante 5 minutos, entonces se dejó enfriar la mezcla hasta la temperatura ambiente. Después de enfriada, se aplicó la mezcla a una columna de Sephadex G-25 (2,5 \times 15 cm) equilibrada con etanol acuoso al 50%. Las fracciones conteniendo látex se juntaron y se aplicaron a una segundo columna de Sephadex G-25 (2,5 \times 35 cm) equilibrada con agua. Se eluyó el látex en un volumen de 30 ml.
2. Partículas de 175 nm de diámetro
Se preparó una solución 2,1 M de nC_{10} en alcohol bencílico. Se colocó etilenglicol (80 ml) en un frasco Erlenmeyer de 125 ml, y se calentó hasta 110ºC sobre una placa caliente de laboratorio. Se añadió el alcohol bencílico (8 ml) y se agitó la mezcla magnéticamente. La solución de nC_{10} (2 ml) se añadió inmediatamente mediante suspensión de látex de reserva (10 ml, látex de 175 nm, modificado con carboxilato, conteniendo un 10% de sólidos). Se continuó el calentamiento a 100ºC hasta 110ºC durante 10 minutos mientras se agitaba enérgicamente. A continuación se colocó el frasco en un baño con agua a temperatura ambiente para enfriarlo. Después de enfriada, se diluyó la mezcla con un volumen igual de etanol, e inmediatamente se centrifugó a 15.000 rpm (Sorval, rotor SA 600) durante dos horas. Se decantó el sobrenadante débilmente azul, y se resuspendió el precipitado en etanol acuoso al 50% (20 ml) usando un sonicador de baño para dispersar las partículas. La centrifugación se repitió a 15.000 rpm 1 hora. Los sobrenadantes se decantaron y se resuspendió el precipitado en agua. A continuación de una centrifugación final, se resuspendieron los precipitados en agua hasta un volumen final de 20 ml.
3. La unión de la cuentas al Ab_{F} se describe en el Ejemplo 3, parágrafo V. C. Avidina-PB/BA-C_{18} Partículas de 175 nm de diámetro
Se preparó una solución de BA-C_{18} en benzonitrilo. Se colocó el etilenglicol (80 ml) en un frasco Erlenmeyer y se calentó hasta 100ºC sobre una placa caliente de laboratorio. Se añadió benzonitrilo (9 ml) y se agitó la mezcla magnéticamente. La solución de BA-C_{18} (1 ml) se añadió seguida inmediatamente por la suspensión de látex de reserva (10 ml, látex de 175 nm, conteniendo un 10% de sólidos, descrita más arriba). Se continuó el calentamiento a 100ºC durante 5 minutos mientras se agitaba enérgicamente. A continuación se colocó el frasco en un baño de agua a temperatura ambiente para enfriarlo. Después de enfriada, se diluyó la muestra con un volumen igual de etanol acuoso al 50%, y se centrifugó inmediatamente a 15.000 rpm (Sorval, rotor SA 600) durante un total de 4 horas. Se decantó el sobrenadante, y se resuspendió el sobrenadante en etanol acuoso usando un sonicador de baño para dispersar las partículas. Se repitió la centrifugación, 15.000 rpm durante 1 hora. Se decantaron los sobrenadantes y se resuspendió el precipitado en agua. A continuación de una centrifugación final, se resuspendieron los precipitados en agua hasta un volumen final de 20 ml.
La unión de la cuentas a avidina se describe en el Ejemplo 3, parágrafo VI.
IV. Protocolo de ensayo
Se realizó el ensayo mezclando 100 \mul de calibradores B_{12} (diluidos a partir de una solución de reserva original de 10 \mug/ml de B_{12}, 10 \muM KCN) en tampón de ensayo (0,05 M KP_{i}, 0,1% de BSA, pH 7,5, el BSA estaba libre de B_{12} y unidor de B_{12}) con 50 ml de 2,2 ng/ml B_{12}-LC_{25}-F, y 50 \mul de 88 ng/ml de factor intrínseco (IF) mezclados previamente con 8,8 \mug/ml Ab_{IF}-biotina. Estas mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad; a continuación se añadieron 0,75 ml de tampón 0,05 Tris-HCl, 0,05 NaP_{i}, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,2, conteniendo 10^{10} cuentas de avidina-PB/BA-C_{18} y 2,5 \times 10^{11} cuentas Ab_{F}-PB/nC_{10}, en cada tubo y se continuó la incubación durante 30 minutos adicionales mediante agitación en la oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, cada tubo se iluminó durante un minuto usando, como fuente de luz, una lámpara halógena ajustada con un filtro de corte a 650 nm, y, a continuación se midió la quimioluminiscencia integrando durante 20 segundos usando un luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la Figura 1.
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Ejemplo 2 Ensayo para la digoxina I. Preparación de los Ab_{Dig}-biotina
Los anticuerpos monoclonales anti-digoxina (Ab_{Dig}) se prepararon según tecnología estándar de línea celular híbrida, y los anticuerpos se purificaron mediante Proteína-A inmovilizada. A continuación, se preparó la Ab_{Dig}-biotina mezclando juntos el anticuerpo (aproximadamente 2-2,5 mg/ml en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M, pH 7,8) y biotina-LC_{7}-NHS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (solubilizada primero en DMF, y una pequeña alícuota se usó para la reacción) e incubando durante tres horas a 4ºC. En la mezcla de reacción, la relación molar de los reactivos fue anticuerpo:biotina-LC_{7}-NHS = 1:25. La biotina no acoplada se retiró mediante una columna Sephadex G-25. El conjugado final se guardó en NaP_{i} 0,05 M, 0,001% de Thimerosal, pH = 7,4, a 4ºC o congelado.
II. Preparación de Dig-LC_{9}-F
Este reactivo se preparó en tres pasos sucesivos mediante la preparación de (1) F-NHS, (2) F-LC_{9}-NH_{2}, y (3) Dig-LC_{9}-F.
A.
Preparación de F-NHS. A 2 ml de 100 mg/ml de 6-carboxifluoresceína y 30,6 ml/ml de NHS en DMF se les añadieron 0,4 ml de 275 mg/ml de DCC. Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La diciclohexilurea formada se retiró mediante filtración. La formación del F-NHS se comprobó mediante TLC sobre placas de sílice, usando el sistema solvente CH_{2}Cl_{2}:metanol:ácido acético = 85:15:1. El DMF se retiró mediante un rotavapor, y el producto (F-NHS) se secó más aún bajo presión reducida, y se guardó desecado a 4ºC.
B.
Preparación de F-LC_{9}-NH_{2}. A 1,5 ml de una solución de bis-(3-aminopropil)-metilamina (LC_{9}) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) en DMF se les añadieron 1,2 ml de 125 mg/ml F-NHS en DMF, seguidos por incubación a temperatura ambiente durante la noche con agitación en la oscuridad. La proporción molar de F-NHS:LC_{9} fue de 1:40. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó 1/20 con NaP_{i} 0,5 M pH 5,0, y el pH de la mezcla se ajustó a 5,0 mediante adición de ácido fosfórico (1,0 M), y toda la muestra se cargó sobre una columna de BioRex-70® (2,5 \times 10 cm), equilibrada en NaP_{i} 0,5 M/pH = 5,0. Una vez cargada, se lavó la columna con el tampón inicial hasta que se retiró toda la bis-(3-aminopropil)metilamina (seguido con la reacción TNBSA). Se lavó la columna con NaP_{i} 0,001 M/pH = 6,0 para retirar la 6-carboxifluoresceína contaminante. El lavado con tampón de baja fuerza iónica retiró, no tan sólo la 6-carboxifluoresceína, sino también otros contaminantes que contenían fluoresceína, los cuales no se han identificado. Entonces, se lavó la columna con D-H_{2}O para retirar las sales. Finalmente, se vació la columna con NH_{4}OH 0,8 M. El hidróxido amónico se retiró mediante liofilización. Después de comprobar su pureza, se almacenó el producto desecado a -20ºC. La reacción se siguió (y la pureza del producto se verificó) mediante electroforesis sobre papel (NaP_{i} 0,05 M/pH = 5,8, 20 minutos, usando el sistema de electroforesis paragon) y mediante TLC (placas de C_{18}, usando metanol al 50% en D-H_{2}O como solvente).
C.
Preparación de Dig-LC_{9}-F. Se preparó una solución que contenía 23,05 mg (0,05 mmoles) de Dig-CMO tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.039.385, Ejemplo 2, el descubrimiento de la cual se incorpora en ésta por referencia. 50,35 mg (0,1 mmoles) de F-LC_{9}-NH_{2} y 19,2 mg (0,1 mmoles) de EDAC en 1,5 ml de solvente DMF/DMSO (5:1) se agitaron durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La Dig-LC_{9}-F y la Dig-CMO (si había quedado algo reaccionar) se precipitaron añadiendo 3 ml de D-H_{2}O, se filtraron, y se descartó el solvente. El material filtrado se resolubilizó en un sistema solvente consistente en CH_{2}Cl_{2}:metanol:ácido acético = 60:40:5, y se cargó sobre una columna de gel de sílice de (1,5 \times 20 cm) en el mismo sistema solvente. En estas condiciones, la Dig-CMO se adelantó al conjugado Dig-LC_{9}-F, y la F-LC_{9}-NH_{2} permaneció unida a la parte superior de la columna. La pureza del material se verificó mediante placas de TLC de gel de sílice, usando el sistema solvente descrito más arriba, y mediante electroforesis sobre papel a pH = 5,8. Los solventes se retiraron del material purificado mediante rotavapor, y se resolubilizó el producto en un volumen mínimo de metanol/DMF (70:30), y se centrifugó a continuación para retirar los materiales insolubles (gel de sílice). El último paso se realizó para suprimir la mayor parte del gel de sílice, el cual podía solubilizarse y co-eluirse con el producto durante la purificación. Se almacenó el producto en un sistema solvente metanol/DMF (70:30) a -10ºC hasta -20ºC. La concentración del producto se determinó mediante A_{490} a partir de una curva estándar construida usando cantidades conocidas de 6-carboxifluoresceína.
III. Protocolo de ensayo
El ensayo se llevó a cabo mezclando 50 ml de calibradores de digoxina en suero (suero humano normal sin TSH) con 50 \mul de 1,74 ng/ml de conjugado digoxina-LC_{9}-F en tampón de ensayo (Tris-HCl 0,05 M, NaP_{i} 0,05, NaCl 0,15 M, 2 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml BGG/pH 8,2), y 50 \mul de 160 ng/ml Ab_{Dig}-biotina en el mismo tampón anterior. Estas mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos, a continuación se añadieron 0,75 ml de tampón Tris-HCl 0,05, NaP_{i} 0,05, NaCl 0,15 M, pH 8,2, conteniendo 10^{10} cuentas aceptoras (avidina-PB/BA-C_{18}) y 2,5 \times 10^{11} cuentas sensibilizadoras (Ab_{F}-PB/nC_{10}), en cada tubo, y se continuó la incubación, durante 30 minutos adicionales, mediante agitación en la oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, se iluminó cada tubo durante un minuto usando, como fuente de luz, una lámpara halógena ajustada con un filtro de corte a 650 nm, y a continuación se midió la luz quimioluminiscente durante 20 segundos integrando con un luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la Figura 2.
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Ejemplo 3 Ensayo para la Gonadotropina Coriónica Humana y ensayo para la Hormona Estimuladora de la Tiroides I. Reactivos y materiales A. El BA-C_{18} se sintetizó mediante el procedimiento siguiente
Todos los reactivos se obtuvieron de Aldrich Chemical Co., excepto cuando se indica.
1. Ácido p-formilfenoxiacético dioctadecilamida
A 100 ml de una solución recién destilada de tetrahidrofurano (THF) se le añadió ácido p-formilfenoxiacético (K & K Labs) (P.M. 180, 0.540 g, 3,0 mmoles), trietilamina (P.M. 101,19, 0,333 g, 3,3 mmoles), y trimetilacetilcloruro (P.M. 120,57, 0,398 g, 3,3 mmoles). Después de 30 minutos de calentamiento a reflujo, se añadió dioctadecilamina (Fluke) (P.M. 522,01, 1,723 g, 3,3 mmoles). La reacción se hizo refluir durante toda la noche.
Al día siguiente, se diluyó la mezcla de la reacción, y se extrajo de la solución de la reacción con cloruro de metilo. Los extractos de cloruro de metilo se secaron sobre sulfato sódico.
2. p-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi) benzal-9-metilacridina
A la 10-dimetoxifosfinil-9-metilacridina (Monatshi Chem., 114(3) (1988) (P.M. 303,27, 0,100 g, 3,3 mmoles) en THF anhidro se le añadieron 0,413 ml de solución 1,6 M de n-butil litio en hexano a -78ºC (baño de acetona/hielo seco) bajo argón. A partir de la adición de la solución n-butil litio, la solución apareció amarilla. Se añadió una solución de la anterior amida en THF 20 minutos después de la adición del n-butil litio. Se dejó que la solución de reacción se calentara hasta temperatura ambiente durante la noche.
Al día siguiente se aisló el producto mediante TLC (gel de sílice, 3:7 etilacetato/hexano). El producto aislado se analizó mediante espectro de masas y RMN, y se almacenó en la oscuridad.
B.
El colorante (nC_{10}) generador de oxígeno singlete procedía de ULTRA Diagnostic Corporation; EDAC, SATA, HCG, y BSA procedían de Sigma Co. El Ab_{1}(TSH)-biotina y el Ab_{2}(HCG)-biotina, y el Ab_{2}(TSH)-F se prepararon mediante procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 1, parágrafo II (ver también [la patente] estadounidense con número de serie 07/389.659 registrada en 4 de agosto de 1989, equivalente a la publicación de patente europea nº 411.945 publicada el 6 de febrero de 1991, cuyas partes relevantes se incorporan en ésta por referencia).
Se usó un luminómetro procedente de Turner Designs (modelo 20e).
II. Preparación de gotas de aceite estabilizadas con anticuerpo anti-HCG (Ab 1(HCG)-OD/BA-C 18)
Las gotas de aceite (OD) marcadas con anticuerpo anti-HCG se prepararon transfiriendo 1 ml de 10 mg/ml anti-HCG-\beta (12A8, IgG) a un tubo de vidrio conteniendo 50 \mul de BA-C_{18} en 5 mM, en dibutilftalato. La proteína estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6. El aceite se emulsionó mediante sonicación y mezcla mecánica continua simultánea. Debería destacarse que se precisaron sonicadores de elevada energía para preparar gotas de aceite más pequeñas. La sonicación se realizó durante 7 minutos usando un sonicador Bronson (como refrigerante se usó agua corriente a temperatura ambiente). La proteína no unida se retiró añadiendo una solución de Na_{2}SO_{4} al 25% hasta conseguir una concentración final de 8% al 9%, y centrifugando a continuación (microcentrífuga, posición 8, durante 10 minutos). El paso de lavado se realizó tres veces (la velocidad de centrifugación debería ajustarse de tal forma que las gotas de aceite se separan pero no coalescen). Después del lavado final se suspendieron las partículas en 1 ml de NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml BSA, pH 7,6, y se sonicaron de nuevo durante tres minutos. El volumen final de la preparación se ajustó a 5 ml, y se añadió sacarosa hasta una concentración final del 2%. Estas partículas Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18} se almacenaron a 4ºC. Las gotas de aceite se prepararon mediante el procedimiento descrito más arriba, y eran heterogéneas en tamaño con un diámetro promedio de 1-5 \mu.
III. Preparación de avidina-Lip/nC 10
Los liposomas se prepararon mediante el procedimiento de dilución en metanol. Típicamente, una mezcla de lípidos:colesterol (2,0 mg), DPPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala.) (23,8), DPPG ((Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala.) (6,5 mg), maleimida-DPPE (Molecular Probe, Eugene, Ore.) (0,5 mg), y nC_{10} (se disolvieron 0,5 mg en metanol templado (200 \mul), y a continuación se añadieron a 2 ml de tampón-B (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M, EDTA 5 mM, pH 6,0) agitado en vórtice. A continuación se pasó la suspensión a través de una columna (1,5 \times 20 cm) de Sephadex G-25 en tampón B. Las fracciones conteniendo liposomas juntas se centrifugaron mediante una microcentrífuga para suprimir cualquier partícula grande, cuando fue necesario. Finalmente, los liposomas que contenían maleimida se añadieron lentamente a una solución en agitación de avidina-SH succinilada en tampón B (preparada tal como se describe más arriba). Después de hacer fluir argón, se agitó suavemente esta mezcla (sin barra de agitación) durante toda la noche a 4ºC. Los grupos maleimida en exceso se bloquearon con ácido mercaptosuccinico 2 mM (en volumen de reacción) durante 30 minutos a 4ºC, seguido por la adición de ácido iodoacético hasta una concentración final de 5 mM para bloquear los grupos tiol en exceso (30 minutos a 4ºC). Entonces se concentró la mezcla de reacción hasta 2,5-3 ml con un aparato Centriprep-30®, y las moléculas de avidina no acopladas se suprimieron mediante filtración en gel en un columna (1,5 \times 50 cm) de Sepharosa-2B en tampón B.
IV. Preparación de avidina-SH succinilada
Se hizo reaccionar la avidina con SATA (5 moles por mol de avidina) (10 mg/ml de avidina en NaP_{i} 1M, pH 7,4) durante la noche a 4ºC. A la misma solución se le añadió anhidro succínico en DMF (50 moles por mol de avidina) (el DMF total fue inferior al 1% del volumen de reacción), y se incubó la solución durante 2 horas. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 7,4 mediante la adición de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M. Los grupos tiol protegidos (tioéster) se liberaron con hidroxilamina (0,1 M a pH 7,0) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las moléculas de bajo peso molecular en exceso se suprimieron mediante el uso de una columna 1,5 \times 30 cm de G-25 en tampón B (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M, EDTA 5 mM, pH 6,0, desgasada y saturada con argón). Se recogió el pico de proteína (avidina-SH) y se hizo reaccionar la proteína con liposomas conteniendo maleimida.
V. Preparación de cuentas teñidas con nC 10 y recubiertas con anti-fluoresceína (Ab F-PB/nC 10)
Se tiñeron cuentas de poliestireno carboxiladas (38 nm) (ver Ejemplo 1, parágrafo IIIB) con nC_{10}. Se usó la química de conjugación EDAC/sulfo-NHS para acoplar el Ab_{F} a estas cuentas de poliestireno. Típicamente, 10 ml de NaP_{i} 0,02 M, conteniendo 5 mg/ml de cuentas de poliestireno teñidas con nC_{10} y 11 mg/ml sulfo-NHS (pH ajustado a 5,5) se mezclaron con 1 ml de una solución recién preparada de EDAC (200 mg/ml) en D-H_{2}O. Después de incubar a temperatura ambiente (en la oscuridad) durante 25 minutos, se centrifugaron las cuentas para suprimir el exceso de EDAC (puesto que la EDAC causa microagregación de estas cuentas, fue posible apelotonarlas con centrífugas convencionales, por ejemplo, Sorval usando un rotor SA-600 a 15.000 rpm). Las cuentas precipitadas se resuspendieron en 3 ml de NaP_{i} 0,005 M/pH 5,8, y entonces se transfirieron dentro de una solución de proteína agitada (15 ml de Borax 0,02 M, NaCl 0,08 M, 2 mg/ml 3G1 IgG (Ab_{F}), 8 mg/ml BSA, pH 8,9). Se agitó la mezcla suavemente (sin remover) durante la noche a 4ºC. Los grupos reactivos que permanecían en las cuentas, si había alguno, se bloquearon con glicina 0,083 M y 15 mg/ml de BSA, pH 8,9, a 4ºC durante 60 minutos. Las proteínas no acopladas se suprimieron mediante lavados sucesivos con NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05, pH 7,6. El precipitado final se resuspendió en el tampón de lavado, se sonicó, y se almacenó, tal como estaba, a 4ºC. El tamaño final de las cuentas era de 140 nm.
VI. Preparación de cuentas teñidas con benzal-acridina u recubiertas con avidina (avidina-PB/BA-C 18)
Se tiñeron cuentas de látex carboxiladas (0,175 \mu) con el BA-C_{18} (ver Ejemplo 1, parágrafo IIIC). Se usó la química de conjugación EDAC/sulfo-NHS para conjugar la avidina a estas partículas. La activación de las cuentas mediante sulfo-NHS/EDAC se realizó de la misma forma como se ha descrito más arriba para la preparación de Ab_{F}-PB/nC_{10}. Se centrifugaron las cuentas activadas (100 mg) para retirar el exceso de EDAC, a continuación se resuspendieron en 2,5 ml de NaP_{i} 0,005 M/pH 5,8, y se transfirieron a una solución de proteína agitada (15 ml de Borax 0,025 M, 1,33 mg/ml de avidina, pH 9,1). A continuación se agitó la mezcla suavemente a 4ºC durante la noche. Los avidina en las cuentas se succiniló mediante la adición de 20 \mul de anhidro succínico en DMF (en exceso molar de 60 veces sobre la avidina) y se incubaron aún más a 4ºC durante 1 hora. Se bloquearon las cuentas con 7 mg/ml de BSA (concentración final en la mezcla de reacción) durante 60 minutos, a 4ºC. Finalmente, se lavaron las cuentas tres veces con NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6 mediante centrifugación, y se almacenaron en 10 ml de tampón de lavado. En el último paso, se sonicaron las cuentas para obtener partículas monodispersas. El tamaño de las cuentas no cambió significativamente después del marcaje con proteína (\sim190 nm). La avidina-PB/BA-C_{18} se almacenó en tampón de
lavado a 4ºC.
VII. Preparación de biotina-LC_{21}-F 1. Esquema de la reacción
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2. Materiales
6-carboxifluoresceína, Kodak; éster biotina-NHS, Pierce Chemical Co.; 4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina, Aldrich Chemical Co.; DMF seco destilado sobre óxido cálcico; resina de intercambio aniónico Ag-MP-1 (Cl^{-}), BioRad Laboratories.
3. Fluoresceína amina hidrocloruro VII3
Se disolvió la 6-carboxifluoresceína (VII 1) (10 g, 26,6 mmoles) en DMF seco (25 ml). La N-hidroxisuccinimida (3,22 g, 28 mmoles) se añadió como un sólido a la solución de DMF, y se dejó disolver. A continuación se enfrió la solución en un baño helado. La diciclohexilcarbodiimida (5,8 g, 28 mmoles) se disolvió en DMF seco (10 ml) y se añadió todo a la vez a la solución fría de DMF. Se revolvió la mezcla a temperatura de un baño de hielo durante 30 minutos, y entonces se dejó volver a temperatura ambiente. El curso de la reacción se siguió mediante TLC (10% MeOH-CH_{2}-Cl_{2} conteniendo un 1% de ácido acético). Transcurridas 3 horas, la formación del éster fluoresceína-NHS VII2 fue completa.
Se diluyó 4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina (25,5 g, 125 mmoles) con DMF seco (10 ml). Se enfrió la mezcla de reacción del éster de fluoresceína-NHS en un baño de hielo, en atmósfera de argón, y la solución de diamina se añadió gota a gota a lo largo de un período de 5 minutos. Se retiró el baño enfriador, y se continuó la agitación a temperatura ambiente. El curso de la reacción se siguió mediante TLC usando el sistema anterior. Cuando se juzgo que la reacción se había completado, se diluyó la mezcla con agua (100 ml), y se enfrió con hielo para precipitar la diciclohexilurea, la cual se retiró mediante filtración.
El filtrado se convirtió en una papilla con la resina de intercambio aniónico AG-MP-1(Cl^{-}), y se vertió dentro de una columna de cromatografía. Se lavó la resina con metanol acuoso al 50% hasta que ya no pudo detectarse la diamina libre mediante ninhidrina. Entonces se eluyó la resina con ácido clorhídrico 0,1 N en metanol acuoso al 50%. La fluoresceína amina hidrocloruro eluyó primero, seguida por la 6-carboxifluoresceína. Las fracciones puras se juntaron y se secaron en un rotavapor. Después de secado bajo vacío elevado se recuperaron 3,4 g de fluoresceína amina hidrocloruro VII3 pura.
4. Fluoresceína-LC 21-biotina VII4
La fluoresceína amina hidrocloruro VII3 (350 mg, 0,61 mmoles) se disolvió en DMF seco (15 ml). Se añadió trietilamina (300 ml) seguida por éster biotina-NHS (445 mg, 0,8 mmoles). El curso de la reacción se siguió mediante TLC (MeOH-CH_{2}-Cl_{2}/ácido acético/agua, 20:78:1:1). Cuando se juzgo que la reacción se había completado, se retiró el DMF en un rotavapor. Se disolvió el residuo en metanol (10 ml) y se convirtió en una papilla con gel de sílice (10 g). Se secó la papilla en un rotavapor hasta obtener un polvo que fluía libremente, el cual se convirtió en papilla en diclorometano y se aplicó a la parte superior de una columna de gel de sílice (2,5 \times 25 cm) equilibrada con diclorometano. Se eluyó la columna con la anterior mezcla de solventes para TLC. Las fracciones que contenían producto se juntaron y se suprimió el solvente en un rotavapor. Se disolvió el residuo en etanol y se filtró. El filtrado se evaporó lentamente, y el producto se depositó como una goma. Se secó la goma bajo vacío elevado para obtener 350 mg de fluoresceína-LC_{21}-biotina VII4 (F-LC_{21}-biotina), la cual se usó sin más caracterización.
VIII. Ensayos A. Curva estándar del ensayo de HCG (OD con Lip)
Se realizó un ensayo de HCG mezclando junto primero HCG (cantidades variables), Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18}, y Ab_{2}(HCG)-biotina. Después de su incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se añadió una cantidad en exceso de avidina-Lip/nC_{10}, y se continuó la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos adicionales. Finalmente, se iluminaron los tubos durante 1 minuto cada uno, y se midió la luminiscencia durante 20 segundos.
Protocolo
Combinar:
50 \mul de HCG en concentraciones variables en tampón de muestra (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 0,04% BSA, 20% sacarosa, 4 mg/ml sulfato de dextrano (T-500), pH 7,5).
50 \mul de 4 \mug/ml Ab_{2}(HCG)-biotina en tampón de ensayo (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 0,04% BSA, pH 7,5), y
50 \mul de reactivo Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18} (5 \times 10^{8} OD/tubo).
Incubar 1 hora a temperatura ambiente, con agitación, y en la oscuridad.
Añadir:
50 \mul de 1,5 \times 10^{12} avidina-nC_{10}-Lip (7,3 \times 10^{10} Lip/tubo).
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación, y en la oscuridad.
Iluminar durante 1 minuto, con lámpara halógena (120 mW de salida de luz cuando se usa un filtro de corte de 650 nm). A continuación, con la fuente de luz apagada, medir la intensidad de luz emitida durante 20 segundos. Los resultados se resumen en la Figura 3.
B. Ensayo de la biotina-LC 21-F
El ensayo se realizó mezclando 50 ml de avidina-PB/BA-C_{18} (2 \times 10^{10} cuentas/ml), 50 ml de Ab_{F}-PB/nC_{10} (5 \times 10^{12} cuentas/ml), y 100 ml de biotina-LC_{21}-F (cantidades variables) en NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA/pH 7,6. Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1,5 horas con agitación en la oscuridad. Finalmente, se iluminó cada tubo con una fuente de lámpara halógena (ajustada con un filtro de corte de 650 nm) durante 1 minuto, transcurrido el cual se midió la emisión de luz durante 20 segundos integrando la intensidad de luz en un luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la Figura 4.
C. Curva estándar para el ensayo de TSH
El ensayo de TSH se realizó mezclando 200 \mul de THS en concentraciones variables en NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA/pH 7,6, con 50 \mul de 4 \mug/ml de Ab_{1}(TSH)-biotina y 4 \mug/ml de Ab_{2}(THS)-F. Estas mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas. A continuación, se añadieron 100 \mul de PBS, conteniendo 10^{10} cuentas de avidina-PB/BA-C_{18} y 2,5 \times 10^{11} cuentas de Ab_{F}-PB/nC_{10}, en cada tubo. Se continuó la incubación a temperatura ambiente durante otras 1,5 horas. Finalmente, se iluminó cada tubo con una fuente de lámpara halógena (ajustada con un filtro de corte de 650 nm), y después se midió la emisión de luz integrando la intensidad de luz durante 20 segundos (Figura 5 y Figura 6) en un luminómetro Turner 20e.
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Ejemplo 4
(No es un ejemplo de la invención)
Ensayo de la HCG usando un fotosensibilizador soluble y gotas de aceite de aceptor I. Reactivos
Gotas de aceite teñidas con colorante aceptor = Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18} (descritas en el Ejemplo 3, parte II).
Ab_{2}(HCG)-biotina - preparado de forma similar al Ejemplo 2, parte I, a partir del derivado NHS de la biotina, comprado a Pierce Chemical Co.
Estreptoavidina-T680 - de Ultralite Diagnostics Co., estreptoavidina marcada con el análogo soluble en agua del colorante nC_{10} descrito más arriba.
II. Ensayo
El ensayo se realizó mezcla 50 ml del tampón de muestra (NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA, 4 mg/ml de dextrano-SO_{4} (T500), 20% de sacarosa/pH 7,6) conteniendo cantidades variables de HCG con 50 \mul de 4 \mug/ml de anti-HCG-biotina en tampón de ensayo (NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA/pH 7,6) y 50 \mul del reactivo Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{19} conteniendo 5 \times 10^{8} gotas de aceite. Esta mezcla se incubó durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, se añadieron 50 \mul de 2 \mug/ml de estreptoavidina-T680 en tampón de ensayo en cada tubo, y la incubación continuó durante otros 30 minutos adicionales. Finalmente, se iluminó cada tubo durante 1 minuto con una fuente de luz de lámpara halógena (ajustada con un filtro de corte de 650 nm), y entonces se midió la emisión de luz durante 20 segundos usando el luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la Figura 7.
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Ejemplo 5 Ensayo homogéneo de oligonucleótidos diana
La secuencia diana se seleccionó a partir del ADNJ del gen K12 de Escherichia coli (J. C. A. Bardwell, K. Tilly, E. Craig, J. King, M. Zylicz, y C. Georgopoulos, J. Biol. Chem. 261: 1782-1785 (1986)). Se preparó un 50mero con la secuencia mostrada mediante la estrategia del fosfito-triéster usando un Biosearch 8750, incluyendo una biotina incorporada en el extremo 5' usando fosforamidito Biotina-ON^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA).
Secuencia:
GCGGGCGAAGGTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTA. La sonda fue un 30mero complementario incluyendo una fluoresceína (F) anclada a una C modificada, con la secuencia
57
La fluoresceína se introdujo mediante la incorporación del nucleótido modificado N^{4}-LCA-5-metildesoxicitidina CEDT-fosforamidito (American Bionetics, Hayward, CA) y el subsiguiente marcaje con el éster N-hidroxisuccinimida de la 5-carboxifluoresceína, usando un exceso molar de éster de 200 veces en pH 9,0 NaHCO_{3} conteniendo 30% (v/v) de DMF. El producto crudo se purificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Las cuentas de avidina-PB/BA-C_{18} y de Ab_{F}-PB/nC_{10} fueron las mismas descritas en ejemplos anteriores.
Se preparó una curva estándar para la diana diluyéndola en serie en NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5, conteniendo 4 g/l de albúmina de suero bovino y 10 mg/l de ADN de timo de ternera como portadores. Se añadieron alícuotas (5 \mul) a 4,8 pmoles de sonda marcada con fluoresceína en 5 \mul del mismo tampón en tubos de ensayo de polipropileno de 12 \times 75. Se taparon las mezclas y se calentaron a 72ºC durante 10 minutos para asegurar la total hibridación. Se añadieron aproximadamente 10^{10} cuentas donantes (sensibilizador) (Ab_{F}-PB/nC_{10}) en 50 \mul de NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5, conteniendo 4 g/l de albúmina de suero bovino, seguidas por 2,5 \times 10^{11} cuentas aceptoras (avidina-PB/BA-C_{18}) en 50 \mul del mismo [tampón]. Después de 30 minutos a temperatura ambiente con agitación en un agitador orbital, se ilumino cada tubo durante 1 minuto usando un lámpara halógena con un filtro de 650 nm tal como se ha descrito en ejemplos anteriores. La generación de luz se determinó durante 20 segundos usando un luminómetro Turner. La curva estándar resultante se muestra en la Figura 8.
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Ejemplo 6 Detección de diana sintética que se une a la sonda biotinilada y a la sonda fluoresceinada Preparación de la sonda biotinilada
Se disolvieron 50 nmoles del oligonucleótido 5'-amino-modificado y desalado (30-mero)
5'-UAA-TAC-AGG-TTG-TTG-CCT-TCA-CGC-TCG-AAA-3'
en 0,5 ml de tampón carbonato 0,1 M, pH 9,0. Se añadió una solución de succinimidil-6-(biotinamido)hexanoato (Pierce, #21336-G): 125 \mul de 120 mg/ml en DMF, a la solución tampón. Se incubó la mezcla durante la noche, y se purificó usando electroforesis preparativa (gel de poliacrilamida al 12% y urea 7 M en tampón TBE (ácido tris bórico y EDTA): base tris 89 mM (tri(hidroximetil)-aminometano), ácido bórico 89 mM, Na_{2} EDTA 2,5 mM (ácido etilendiaminotetraacético), pH 8,3), a 400 voltios durante 4 horas. El oligonucleótido biotinilado se extrajo del gel y se diluyó con 3 ml de NH_{4}CO_{3} 0,1 M a 37ºC durante la noche. El material se purificó de nuevo sobre una Sep-Pak (una columna C-18, Waters #51910), se secó al vacío, y se suspendió en agua doblemente destilada.
El rendimiento de la sonda biotinilada fue de 34,8 nmoles (58%).
Preparación de un sonda fluoresceinada
Se preparó una solución de 50 nmoles del oligonucleótido (30-mero) con una citosina central (en la posición 14) amino-modificada
5'-CTG-CCG-GTG-CGC-CAT-GUT-CGC-CCG-CCT-CAC-3'
en una mezcla de tampón NaHCO_{3} 0,1 M, pH 6,9 (190 \mul) y acetonitrilo (120 \mul). Se añadieron 200 \mul de una solución 0,1 M de succinimidil éster de 5/6-carboxifluoresceína (Molecular Probes, #01112) en DMF a la solución tampón. Se incubó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Los pasos restantes son los mismos que los descritos más arriba para la sonda biotinilada.
La sonda fluoresceinada se obtuvo con un rendimiento del 41%.
Procedimiento de ensayo Tampón de ensayo
Tris 10 mM (Tris(hidroximetil)aminometano), KCl 50 mM, pH 8,3, conteniendo 5 mg/ml de sulfato de dextrano, NaCl 0,5 M, 1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino), y 25 \mug/ml de ADN de timo de ternera.
Se añadieron 40 \mul de tampón de ensayo conteniendo sonda fluoresceinada (1,5 pmoles) y sonda biotinilada (1,2 pmoles) a 10 \mul de ADN diana sintético (65-meros) diluido en series en tampón de ensayo. Se hibridó la mezcla durante 5 minutos a 55ºC. Se añadieron las cuentas (20 \mug de cuentas de avidina y 40 \mug de cuentas anti-fluoresceína, cada una en 50 \mul de tampón de ensayo). La solución conteniendo las cuentas se incubó durante 15 minutos
a 55ºC.
Las cuentas de avidina se prepararon cargando cuentas de poliestireno de 0,175 \mu carboxiladas con benzalacridina, y las cuentas se decoraron con avidina, usando la química del EDAC (1-etil-3-(dimetilaminopropil)-carbodiimida hidrocloruro. Sigma Chemical Co., #E-6383).
La benzalacridina se preparó añadiendo 0,413 ml de solución 1,6 M de n-butil-litio en hexano a 10-dimetoxifosfinil-9-metil-acridina (Monatsh Chem. 114 3, 1988) en tetrahidrofurano anhidro (THF) a -78ºC (baño de acetona/hielo seco) bajo argón. A partir de la adición de la solución de t-butil-litio, se añadió una solución de la amida anterior en THF 20 minutos después de la adición del t-butil-litio. Se dejó calentar la solución de reacción hasta temperatura ambiente durante la noche. A continuación se aisló el producto mediante TLC (gel de sílice - 3:7 etilacetato/hexano). El producto aislado se analizó mediante análisis del espectro de masas y RMN, y se almacenó en la oscuridad.
Las cuentas anti-fluoresceína se prepararon cargando cuentas carboxiladas de poliestireno de 0,04 \mu con tetra-n-decil-Al-ftalocianina (Ultra Diagnostics, Lote #GR11-82), y se decoraron las cuentas con anticuerpo anti-fluoresceína usando la química del EDAC.
La señal se leyó iluminando durante 60 segundos la solución que contenía las cuentas con una lámpara halógena equipada con un filtro de corte de 650 nm. La luminiscencia se midió durante 20 segundos. Los resultados se resumen en la Tabla 1, y se muestran en la Figura 9.
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Ejemplo 7 Detección de producto de amplificación biotinilado Preparación mediante PCR de la secuencia biotinilada
Diana: ADN genómico de E. coli.
Cebadores: 100 nM de cada uno de: 24-mero biotinilado
5'-UCA-TGG-TTC-TGG-TCA-GGT-GCA-GAT-3'
y 18-mero no biotinilado
5'-TTT-GAG-CGC-GGG-CTG-TTG-3'
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Condiciones de ciclado:
Un ciclo:
94ºC 3 min
59ºC 1 min
72ºC 1,5 min 
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a continuación 35 ciclos:
94ºC 3 min
59ºC 1,5 min
72ºC 2 min 
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Detección usando una sonda fluoresceinada
Se añadieron 10 \mul de 1,5 pmoles de sonda fluoresceinada en tampón de ensayo, preparada según el procedimiento del Ejemplo 6, a 20 \mul de producto de PCR a varias concentraciones iniciales de diana. La mezcla se desanturalizó a 95ºC durante 5 minutos, a continuación se hibridó a 55ºC durante 5 minutos. Se añadieron las cuentas (20 \mug de benzalacridina y 30 \mug de cuentas de Al-ftalocianina en 50 \mul de tampón de ensayo). La solución conteniendo las cuentas se incubó durante 15 minutos a 55ºC. La señal se leyó siguiendo el procedimiento tal como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se resumen en la Tabla 2.
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Ejemplo 8 Ensayo de la triiodotironina total I. Preparación de las cuentas Materiales
Látex de 175 nm modificado con carboxilato, procedentes de Bangs Laboratories.
Etilenglicol, etoxietanol, alcohol bencílico, clorofila-a: Aldrich.
Europio (III) theonil-trifluoroacetato (EuTTA): Kodak.
Óxido de trioctilfosfina (TOPO): Aldrich.
Dioxeno [1-(4-dimetilaminofenil)-6-fenil-1,4-dioxeno]: preparado mediante una modificación de un procedimiento descrito en: K. A. Zaklika, T. Kissel, A. L. Thayer, P. A. Burns y P. Schaap: Photochem. Photobiol. 30:, 35-44 (1979).
Procedimientos 1. Cuentas del sensibilizador clorofila-a
Se añadió una solución de clorofila-a en alcohol bencílico (1,0 ml, 0,6 mM) a 8,0 ml de alcohol bencílico a 105ºC. Se añadió una suspensión de látex, de 175 nm de tamaño, modificado con carboxilato, en agua (10%, 1,0 ml) a la solución de alcohol bencílico. Se agitó la mezcla durante 5 minutos a 105ºC, y se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadió etanol (10,0 ml) y se centrifugó la muestra. El precipitado se resuspendió en una mezcla 1:1 de etanol-agua (10,0 ml), y se centrifugó la suspensión. El mismo procedimiento de resuspensión y centrifugación se repitió en agua (10,0 ml), y el precipitado se resuspendió en agua (1,8 ml).
Caracterización
A.
Concentración de colorante: Se encontró que una solución preparada añadiendo 10 \mul de la anterior suspensión de cuentas en dioxano (990 \mul) tenía una absorbancia de 0,11 a 660 nm, correspondiente a 2,6 \mumoles de clorofila-a en un gramo de cuentas.
B.
Generación del oxígeno singlete: Se irradió una mezcla de cuentas de clorofila-a (200 \mug) y 2 \times 10^{-4} moles de ácido antraceno-9,10-dipropiónico (ADPA) en dos ml de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5, conteniendo NaCl 100 mM) con una lámpara de tungsteno-halógena, equipada con un filtro de corte de 645 nm, durante 20 minutos. Las cuentas se retiraron mediante filtración, y la concentración del producto de oxigenación se determinó espectrofotométricamente a 400 nm. Se encontró que la velocidad era de 3,0 nmoles de producto de oxigenación por minuto. En las mismas condiciones, 38 pmoles de un sensibilizador soluble, aluminio-ftalocianina-tetrasulfonato, generaron la misma cantidad de producto de oxigenación (la cantidad de sensibilizador en la cuentas era de 200 \times 10^{-6} \times 2,6 \times 10^{-6} = 520 pmoles).
C. Cuentas de sensibilizador clorofila-a/tetrabutil-esquarato
Se centrifugó una suspensión de cuentas de látex carboxiladas (175 nm de tamaño, 10% de sólidos en agua, 30,0 ml). Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en etilenglicol (60,0 ml). Se calentó la suspensión hasta 100ºC. Se añadieron lentamente 9,0 ml de solución de alcohol bencílico, la cual es 1,67 M en clorofila-a y 3,33 mM en tetrabutil-esquarato [1,3-bis(4-dibutilaminofenil)esquarato] a lo largo de 3 minutos a la suspensión. El calentamiento se prolongó durante 7 minutos, a continuación se enfrió la suspensión a temperatura ambiente en un baño de agua. La suspensión de alcohol bencílico se añadió a etanol frío (120 ml). Se centrifugó la mezcla y se descartó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en etanol al 50% en agua, y se centrifugó la suspensión. El mismo procedimiento de resuspensión y centrifugación se repitió en etanol al 5% en agua (30 ml).
Caracterización
A.
Concentración de colorante. La concentración del tetrabutil-esquarato en las cuentas se determinó espectrofotométricamente tal como se ha descrito más arriba para las cuentas de clorofila-a. Se encontró que era 44 \muM de colorante en las cuentas.
B.
Generación del oxígeno singlete. Veinticinco \mul de una solución 5 mM de ADPA en etanol se añadieron a una suspensión de cuentas (100 \mug) en tampón fosfato, pH 7,0 (20 mM, conteniendo NaCl 50 mM). La mezcla se irradió como más arriba, usando un filtro de paso alto de 610 nm. La velocidad de formación de oxígeno singlete se calculó a partir de la velocidad de disminución en la absorbancia (a 400 nm) del ADPA. Se encontró que las cuentas generaban 7 \times 10^{-2} \mumoles de oxígeno singlete/min.
3. Cuentas de aceptor Dioxeno/EuTTA/TOPO
Se añadieron 20 ml de cuentas de látex carboxiladas de 175 nm (suspensión al 10% en agua) a etoxietanol (20,0 ml). La mezcla se calentó hasta 90ºC. Se añadieron a la mezcla 20 ml de una solución que es dioxeno 10 mM, EuTTA 20 mM, y TOPO 60 mM en etoxietanol. Se añadió etanol (40,0 ml) y se centrifugó la mezcla. El precipitado se resuspendió en etanol al 80%, y se centrifugó la suspensión. El procedimiento de resuspensión y centrifugación se repitió en etanol al 10% (36 ml).
Caracterización
A.
Concentración de colorante. La concentración de EuTTA en las cuentas se determinó espectrofotométricamente como más arriba, y se encontró que era 0,07 M. Puesto que la concentración de dioxeno no puede determinarse en la presencia de EuTTA, se midió en cuentas que se cargaron tan sólo con dioxeno, en las mismas condiciones. Se encontró que la concentración era 0,016 M.
B.
Generación de la señal. Se mezcló una suspensión de cuentas (25 \mug) en tampón fosfato (0,5 ml, fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, 0,1% de Tween 20, pH 7,0) con una solución 2 \muM de aluminio-ftalocianina-tetrasulfonato (0,5 ml) en el mismo tampón. Se iluminó la mezcla durante 1 minuto con una lámpara de tungsteno-halógena de 125 w equipada con un filtro de paso alto de 610 nm. A continuación de la iluminación, se colocó la mezcla en un luminómetro Turner TD-20e, y se midió la luminiscencia durante 20 segundos. Se encontró que la intensidad era de 327 RLU (unidades de luz relativas)/segundo.
La longitud de onda de la luz emitida se midió usando un espectrofluorímetro de barrido Perkin-Elmer 650-40. El pico de emisión principal estaba centrado cerca de los 615 nm.
II. Procedimiento de ensayo Acoplamiento EDAC/NHS del anticuerpo a cuentas de 40 nm
Se disolvieron 73,6 mg de sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida, Pierce Chemical Co., #24510 G) en 6 ml de una suspensión de 4 mg/ml de cuentas de poliestireno de 40 nm, modificadas con carboxilato (teñidas con clorofila-a y tetrabutil-esquarato), en agua. Se añadieron 136 \mul de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M. El pH se ajustó a 5,2. Se añadieron 136 \mul adicionales de agua. 130,4 mg de EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro, Sigma Chemical Co, #E-6383) en 454 \mul se añadieron lentamente a una suspensión de cuentas en agitación. La suspensión se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las cuentas se centrifugaron durante 20 minutos a 15.000 rpm en un rotor Sorvall SA-600 a 4ºC. Se descartó el sobrenadante. A continuación, se resuspendieron las cuentas en 1,2 ml de fosfato sódico 5 mM, pH 5,8, y la suspensión se sonicó hasta dispersar de nuevo las cuentas. Las cuentas se añadieron lentamente a 4,8 ml de una solución en agitación que contenía 1,7 mg/ml de IgG (monoclonal anti-fluoresceína) + 6,7 mg/ml de BSA + bórax 17 mM, pH 9,2, y se mezclaron suavemente durante la noche a 4ºC. Se añadieron 800 \mul de glicina 2 M, que fue seguida a continuación por 2,8 ml de 50 mg/ml de BSA en 0,1 bórax, a la suspensión de cuentas. Se sonicó la suspensión y se dejó mezclar suavemente durante 3 horas a 4ºC. Las cuentas se centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm. El sobrenadante se descartó. Las cuentas se resuspendieron en 3 ml de fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6, y se sonicó la suspensión. Los pasos de centrifugación, resuspensión y sonicación se repitieron un total de tres centrifugaciones. Después de la tercera centrifugación, las cuentas se resuspendieron en 2,4 ml de fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. La suspensión resultante se sonicó y almacenó a 4ºC.
Acoplamiento EDAC/NHS de avidina-D a cuentas de 175 nm
Se disolvieron 4,4 mg de sulfo-NHS en 0,4 ml de una suspensión de 25 mg/ml de cuentas de poliestireno de 175 nm, modificadas con carboxilato (teñidas con dioxeno/EuTTA/TOPO), en agua. Se añadieron 0,0160 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,25 M. 8 mg de EDAC, disueltos en 0,030 ml de agua, se añadieron lentamente a una suspensión de cuentas girando. La suspensión se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las cuentas se centrifugaron durante 20 minutos a 15.000 rpm en un rotor Sorvall SA-600 a 4ºC. Se descartó el sobrenadante.
Las cuentas se resupendieron en 0,6 ml de fosfato sódico 0,005 M, pH 5,8. La suspensión se sonicó para resuspender las cuentas. Las cuentas se añadieron lentamente de nuevo a 3 ml de una solución en agitación que contenía 1,33 mg/ml de avidina-D (Vector) + bórax 17 mM, pH 9,2, y se mezclaron suavemente durante la noche a 4ºC. Se añadieron 0,004 ml de anhídrido succínico 1 M en DMF. La suspensión de incubó durante 1 hora a 4ºC con agitación suave. Se añadieron 0,4 ml de 50 mg/ml de BSA en fosfato sódico 10 mM + NaCl 150 mM, pH 7,0. La suspensión se dejó mezclar suavemente durante 3 horas a 4ºC. Las cuentas se centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm. El sobrenadante se descartó. Las cuentas se resuspendieron en 3 ml de fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. Se sonicó la suspensión. Los pasos de centrifugación, resuspensión y sonicación se repitieron un total de tres centrifugaciones. Después de la tercera centrifugación, las cuentas se resuspendieron en 2,25 ml de fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. La suspensión se sonicó y almacenó a 4ºC.
Ensayo de la T_{3} total
Tampón de ensayo: Barbital 0,075 M, NaCl 0,2 M, 0,4% de BSA, 1,25% de IgG de ratón, 10 mg/ml de sulfato de dextrano (P.M. 500.000), 1,0 mg/ml de dextrano T-500, 10 \mug/ml de IgG agregado.
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Cuentas
Cuentas de aceptor: Avidina-EDAC, 175 nm, cargadas con dioxeno/EuTTA/TOPO.
Cuentas de sensibilizador: Anti-fluoresceína-EDAC, 40 nm, cargadas con clorofila-a/esquarato.
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Protocolo de ensayo
Se añadieron 50 \mul de una solución de ácido 8-anilino-1-naftalen-sulfónico, sal de amonio (Sigma, A-3125) en tampón de ensayo (0,75 mg/ml) a 50 \mul de estándar de T_{3} o muestra. Se añadieron 100 \mul de tampón de ensayo. Se añadieron 50 \mul de anti-T_{3} biotinilado (70 ng/ml) en tampón de ensayo. Se añadió el trazador, T_{3}-LC_{21}-F1 (1,8 ng/ml)
58 
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en tampón de ensayo (50 \mul). Se incubó la mezcla durante 15 minutos a 37ºC. Se añadieron 500 \mul de una suspensión de cuentas de sensibilizador (50 \mug) y cuentas de aceptor (6,25 \mug) en tampón de ensayo, y se incubó la mezcla durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió la solución de "detención" (50 \mul) (fluoresceína 10 \muM, biotina 0,5 mM).
La señal se leyó mediante una lámpara halógena con un filtro de corte de 610 nm, un minuto de iluminación, y 20 segundos de medición.
Resultados
Los resultados se resumen en la Figura 10. La señal de luminiscencia se representó como una función de la concentración de T_{3}. La modulación de la señal fue del 94% con 8,5 ng/ml de T_{3}. A 0,5 ng/ml, la modulación de la señal fue del 38%.
Aunque la invención precedente ha sido descrita en cierto detalle, a modo de ilustración y ejemplo, con los propósitos de clarificación y entendimiento, será evidente que pueden practicarse ciertos cambios o modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
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TABLA 1
59
TABLA 2
60

Claims (10)

1. Composición que comprende:
a)
primeras partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un compuesto quimioluminiscente capaz de reaccionar con el oxígeno singlete, en donde dichas primeras partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un primer miembro de un par de unión específica, y
b)
segundas partículas que pueden suspenderse, que tienen incorporado sobre ellas un fotosensibilizador, en donde dicho fotosensibilizador es capaz, en su estado excitado, de activar el oxígeno a su estado singlete, en donde dichas segundas partículas que pueden suspenderse tienen unido sobre ellas un segundo miembro de un par de unión específica.
2. Composición según la reivindicación 1, en donde dichas partículas que pueden suspenderse se seleccionan de forma independiente del grupo consistente en partículas de látex, bicapas lipídicas, gotas de aceite, partículas de sílice, y soles metálicos.
3. Composición de la reivindicación 1 ó 2, en donde dichas primeras partículas que pueden suspenderse, dichas segundas partículas que pueden suspenderse, o ambas, son partículas de látex.
4. Composición de la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde dicho primer y segundo miembro de un par de unión específica se seleccionan independientemente del grupo consistente en receptores, ligandos y polinucleótidos.
5. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho primer miembro de un par de unión específica se selecciona del grupo consistente en receptores, ligandos y polinucleótidos.
6. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho compuesto quimioluminiscente contiene un grupo olefina.
7. Composición de la reivindicación 6, en donde dicho compuesto quimioluminiscente contiene un grupo olefina y uno o más sustituyentes donantes de electrones conjugados con dicho grupo olefina.
8. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho compuesto quimioluminiscente se selecciona del grupo consistente en 9-alquiliden-N-alquil acridanos, enoléteres, enaminas, y 9-alquilidenxantenos.
9. Composición de la reivindicación 8, en donde dicho compuesto quimioluminiscente es un 2,3-diaril-4,5-dihidrodioxeno con la fórmula:
61
en donde X = O,S ó ND_{2}, Ar and Ar' son arilos, incluyendo los arilos sustituidos en los que al menos uno de los sustituyentes está presente como grupo amino, éter o hidroxilo, y D_{2} es alquilo o arilo.
10. Composición de la reivindicación 9, en donde X es S.
ES99121547T 1991-05-22 1992-05-21 Procedimiento para determinar un analito en una muestra. Expired - Lifetime ES2280110T3 (es)

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