DE69233146T2 - Partikel, die eine Zusammensetzung beinhalten, die eine chemilumineszierende Verbindung umfassen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, Zusammensetzungen und Sets zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung spezifische Bindungstests, die keinen Trennschritt erfordern.
  • Das Gebiet der klinischen Diagnose hat in den letzten Jahren eine große Expansion erfahren – sowohl, was die Vielzahl der Materialien (Analyten) betrifft, die leicht und präzise bestimmt werden können, als auch in Hinblick auf die Verfahren zur Bestimmung. Zweckmäßigerweise sind zuverlässliche und ungefährliche Mittel zum Detektieren des Vorhandenseins niedriger Konzentrationen an Materialien in Flüssigkeiten erwünscht. In der klinischen Chemie können diese Materialien in Körperflüssigkeiten in molaren Konzentrationen von unter 1012 vorhanden sein. Die Schwierigkeit, niedrige Konzentrationen dieser Materialien zu detektieren, wird durch die relativ geringen verwendbaren Probengrößen verschärft.
  • Bei der Entwicklung eines Tests gibt es viele Überlegungen. Eine Überlegung ist die Signalreaktion auf Veränderungen in der Konzentration des Analyten. Eine zweite Überlegung besteht darin, wie einfach es ist, die Vorschrift für den Test in die Praxis umzusetzen. Eine dritte Überlegung ist die Interferenzschwankungen von Probe zu Probe. Einfache Herstellung und Reinigung der Reagenzien, Verfügbarkeit der Ausrüstung, einfache Automatisierung und Wechselwirkung mit Material von Interesse sind einige der zusätzlichen Überlegungen bei der Entwicklung eines nützlichen Tests.
  • Eine umfangreiche Kategorie von Techniken umfasst die Verwendung eines Rezeptors, der sich in Abhängigkeit vom Vorhandensein eines Analyten spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation eines markierten Liganden binden kann. Die beobachtete Wirkung der Bindung durch den Rezeptor ist von der Markierung abhängig. In manchen Fällen sorgt die Bindung des Rezeptors lediglich für eine Differenzierung in Bezug auf das Molekulargewicht zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem Liganden. In anderen Fällen erleichtert die Bindung des Rezeptors die Trennung von gebundenem markiertem Liganden von freiem markiertem Liganden oder kann die Beschaffenheit des Signals beeinflussen, das von der Markierung erhalten wird, so dass das Signal mit der Rezeptormenge variiert, die an markierten Liganden gebunden ist. Eine weitere Variation besteht darin, dass der Rezeptor markiert und der Ligand unmarkiert ist. Alternativ dazu werden sowohl der Rezeptor als auch der Ligand markiert oder unterschiedliche Rezeptoren mit zwei verschiedenen Markierungen markiert, woraufhin die Markierungen in Wechselwirkung treten, wenn sie sich in großer Nähe zueinander befinden, und die vorhandene Ligandenmenge das Ausmaß beeinflusst, in dem die Markierungen des Rezeptors in Wechselwirkung treten können.
  • Es besteht weiterhin Bedarf an neuen und präzisen Techniken, die für ein weites Spektrum unterschiedlicher Liganden adaptiert oder in spezifischen Fällen eingesetzt werden können, wo andere Verfahren nicht leicht adaptiert werden können.
  • Homogene Immuntests für kleine Moleküle sind bereits beschrieben worden. Diese Tests umfassen unter anderem den SYVA's FRAT®-Test, den EMIT®-Test, den Enzym-Channeling-Immuntest, und den Fluoreszenzenergietransfer-Immuntest (FETI); Enzyminhibitor-Immuntests (Hoffman LaRoche und Abbott Laboratories): Fluoreszenzpolarisationsimmuntest (Dandlicker). Alle diese Verfahren weisen begrenzte Empfindlichkeit auf, und nur wenige, darunter FETI und Enzym-Channeling, eignen sich für große Multiepitop-Analyten.
  • Lumineszierende Verbindungen, wie z. B. fluoreszierende Verbindungen und chemolumineszierende Verbindungen, finden aufgrund ihrer Fähigkeit, Licht auszusenden, im Testbereich breite Anwendung. Aus diesem Grund werden Lumineszenzmittel als Markierungen in Tests wie Nucleinsäuretests und Immuntests eingesetzt. Beispielsweise wird ein Element eines spezifischen Bindungspaares an ein Lumineszenzmittel konjugiert, und es werden verschiedene Vorschriften eingesetzt. Das Lumineszenzmittelkonjugat kann in Bezug auf die Analytmenge in einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält, zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase verteilt werden. Durch Messen der Lumineszenz einer der Phasen kann beobachtete Ausmaß an Lumineszenz mit der Konzentration des Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt werden.
  • Teilchen, wie z. B. Liposomen und Erythrozytenghosts, werden als Träger für eingekapselte wasserlösliche Materialien verwendet. Beispielsweise werden für eine Vielzahl von Anwendungen Liposomen eingesetzt, um biologisch aktives Material einzukapseln, wie z. B. Arzneimittelabgabesysteme, worin ein Medikament während der Liposomherstellung eingeschlossen und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht wird.
  • Teilchen, wie z. B. Latexperlen und Liposomen, werden ebenfalls in Tests eingesetzt. Beispielsweise kann in homogenen Tests ein Enzym in der wässrigen Phase eines Liposoms eingeschlossen sein, das mit einem Antikörper oder Antigen markiert ist. Die Liposomen werden dazu veranlasst, das Enzym in Gegenwart einer Probe oder eines Komplements freizusetzen. Antikörper- oder Antigen-markierte Liposomen, bei denen wasserlösliche fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Farbstoffe in einer wässrigen Phase eingekapselt sind oder Lipid-lösliche Farbstoffe, die in der Lipid-Doppelschicht des Lipidvesikels gelöst sind, werden ebenfalls eingesetzt, um auf Analyten zu testen, die fähig sind, in eine immunochemische Reaktion mit dem Oberflächen-gebundenen Antikörper oder Antigen einzutreten. Detergenzien werden eingesetzt, um die Farbstoffe aus der wässrigen Phase der Liposomen freizusetzen.
  • Chemolumineszierende Markierungen weisen bei Ligandenbindungstests außergewöhnliche Empfindlichkeit auf, aber üblicherweise sind ein oder mehrere chemische Aktivierungsschritte erforderlich. Fluoreszierende Markierungen weisen diesen Nachteil nicht auf, sind aber weniger empfindlich.
  • Chemolumineszierende Markierungen sind für Immuntests und Nucleinsäuretests beschrieben worden, worin eine Gruppe, die kovalent an einen Bindungspartner gebunden ist, bei chemischer Aktivierung Licht aussendet. Ein Nuclein- und Testset, bei dem ein Acridiniumester eingesetzt wird, wird von Genprobe vertrieben (Pace2 system®, San Diego, CA, USA), und MagicLite®-Immuntestsets, bei denen dieser Typ von Markierung eingesetzt wird, werden von CIBA-GEIGY (Basel, Schweiz) verkauft. Energieübertragung von einer markierten Nucleinsäuresonde zu einem fluoreszierenden Akzeptor, der an eine zweite Sonde gebunden ist, wurden von Heller et al., I und II, s. unten, für einen Sandwich-Nucleinsäuretest beschrieben. Maggio I, s. unten, erörtert ein ähnliches Verfahren für Immuntests. Die Energieübertragung von einem Lumineszenzmittel, das kovalent an ein Polynucleotid gebunden ist, auf ein eingelagertes Fluoropor wurde von Heller et al., IV, s. unten, beschrieben. Die Übertragung von einem eingelagerten Farbstoff auf ein Fluoreszenzmittel auf einem Polynucleotid wurde vor kurzem von Cardullo et al., s. unten, beschrieben. Weiters hat McCapra, s. unten, die Verwendung von Photosensibilatoren als Markierungen beschrieben, worin der Photosensibilisator Sauerstoff in seinen Singulettzustand aktiviert, der wieder mit einer Verbindung reagiert, die bei Erwärmung Licht erzeugt.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.345.776 (McCapra) offenbart spezifische Bindungstests, bei denen ein Sensibilisator als Markierung eingesetzt wird. Zu den Sensibilisatoren gehört jede Gruppierung, die, wenn sie durch Anregung mit Strahlung mit einer oder mehreren Wellenlängen oder andere chemische oder physikalische Stimuli (z. B. Elektronenübertragung, Elektrolyse, Elektrolumineszenz oder Energieübertragung) einen angeregten Zustand erreicht, der (a) bei Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff molekularen Sauerstoff im Singulettzustand erzeugt oder (b) bei Wechselwirkung mit einem Leuko-Farbstoff eine reduzierte Form annehmen kann, die durch Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff in ihren ursprünglichen, nicht angeregten Zustand zurückgeführt werden kann, was zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid führt. Beide Wechselwirkungen mit dem angeregten Sensibilisator ergibt bei der Zugabe von Reagenzien ein detektierbares Signal.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.070.685 (Heller et al. I) beschreibt eine homogene Nucleinsäurehybridisierung, die durch nicht-strahlende Energieübertragung diagnostisch ist.
  • Ein Diagnoseverfahren durch Lichtaussendungs-Polynucleotid-Hybridisierung wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0.070.687 (Heller et al. II) beschrieben.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.232.967 (Morrison I) erörtert Verfahren und Zusammensetzungen zur Durchführung von Tests für Target-Polynucleotidstränge. Die Verfahren umfassen das Kontaktieren einer Probe mit einem Reagens, das eine erste und eine zweite Polynucleotidsonde umfasst. Die erste und die zweite Sonde können eine erste Position, in der die Sonden aneinander gebunden sind, sowie eine zweite Position einnehmen, worin die Sonden an ein Target gebunden sind. Die Sonden umfassen Markierungsgruppierungen, die zur Wechselwirkung fähig sind, um ein Signal zu erzeugen, das anzeigt, dass sich die Sonden in einer der beiden Positionen befinden.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.315.364 beschreibt einen immunochemischen Test zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration von Antigen oder Antikörpern in einem Fluid. Der Test umfasst (a) das Bilden eines ternären Komplexes aus einem ersten markierten Antikörper oder Antigen, einem zweiten markierten Antikörper oder Antigen und dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper, und (b) das Detektieren eines Signals, das in Gegenwart von zumindest einem Substrat erzeugt wird, durch eine Wechselwirkung zwischen der ersten Markierung und der zweiten Markierung, verstärkt durch ihre Nähe zueinander gebunden an die antigenische Substanz.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.229.943 (Heller et al. III) beschreibt fluoreszierende Stokes-Verschiebungssonden für einen Polynucleotidhybridisierungstest.
  • US-Patent Nr. 4.226.993 (Buckler et al.) beschreibt immunfunktionalisierte Phthalhydrazide, die als Zwischenprodukte bei der Synthese von chemolumineszierenden Phthalhydrazid-markierten Konjugaten nützlich sind. Die Konjugate sind als Reagenzien in spezifischen Bindungstests nützlich, um Liganden oder ihre spezifischen Bindungspartner in flüssigen Medien zu bestimmen.
  • Die US-Patente Nr. 4.380.580 und 4.383.031 (Boguslaski et al. I und Boguslaski et al. II) beschreiben heterologe bzw. homologe chemolumineszierende spezifische Bindungstests.
  • US-Patent Nr. 4.220.450 (Maggio I) erörtert chemisch induzierte Fluoreszenzimmuntests.
  • US-Patent Nr. 4.652.533 (Jolley) beschreibt ein Verfahren zum Festphasen-Immuntest, in dem eine lumineszierende Markierung enthalten ist.
  • US-Patent Nr. 4.277.437 (Maggio II) offenbart Sets zur Durchführung chemisch induzierter Fluoreszenz-Immuntests.
  • Heller et al. (IV) beschreiben in "Rapid Detection and identification of Infectious Agents" (1985) Academic Press, Inc., S. 245–257, chemolumineszierende und fluoreszierende Sonden für DNA-Hybridisierungssysteme.
  • Hara et al. beschreiben in Bull. Chem. Soc. Jpn. 57, 3.009–3.010 (1984), einen Immuntest unter Verwendung einer Metallkomplexverbindung als chemolumineszierender Katalysator.
  • Kuschnir et al. beschreiben in Chemical Communications (1969) 193 die photosensibilisierte Chemolumineszenz von Luminol in 6-Aminophthalazin-l,4-(2H3H)-dion.
  • Die Detektion von Nucleinsäure-Hybridisierung durch nicht-radioaktive Fluoreszenzresidenzenergie-Transfer wird von Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8790-8794 (1988), beschrieben.
  • Morrison et al. beschreiben in Analytical Biochemistry 183, 231–244 (1989), die Detektion von Polynucleotiden in Lösungsphase unter Einsatz von interaktiven fluoreszierenden Markierungen und kompetitiver Hybridisierung.
  • Zomer et al. beschreiben in Analytica Chemica Acta 227, 11–19 (1989), chemolumineszierende Markierungen.
  • Morrison II erörtert in Analytical Biochemistry 174, 101–120 (1988), die zeitaufgelöste Detektion von Energie: Theorie und Anwendung für Immuntests.
  • US-Patent Nr. 4.299.916 (Litman et al. I) beschreibt die bevorzugte Signalerzeugung auf einer Oberfläche bei Immuntests.
  • US-Patent Nr. 4.233.402 (Maggio et al.) beschreibt Reagenzien und Verfahren unter Einsatz von Kanalbildung.
  • US-Patent Nr. 4.261.968 (Ullman et al. I) beschreibt Fluroeszenz-Quenchen mit immunologischen Paaren in Immuntests.
  • US-Patent Nr. 4.318.707 (Litman et al. II) erörtert ein makromolekulares Fluoreszenz-Quencher-Teilchen in spezifischen Rezeptortests.
  • US-Patent Nr. 4.650.770 (Liu et al.) erörtert energieabsorbierendes Teilchen-Quenchen in lichtaussendenden kompetitiven Proteinbindungstests.
  • US-Patent Nr. 4.654.300 (Zuk et al.) beschreibt einen Quenchtest mit fluoreszierenden Mikroperlen.
  • US-Patent Nr. 4.174.384 (Ullman et al. II) beschreibt Fluoreszenz-Quenchen mit immunologischen Paaren in Immuntests.
  • US-Patent Nr. 4.193.983 (Ullman et al. III) offenbart markierte Liposomteilchen-Zusammensetzungen und Immuntests damit.
  • Die US-Patente Nr. 4.199.559 und 3.996.345 (Ullman et al. IV und V) beschreiben Fluoreszenz-Quenchen mit immunologischen Paaren in Immuntests.
  • O'Connell et al., Clin. Chem. 31(9), 1424–1426 (1985), offenbaren einen kolorimetrischen Immuntest auf Digoxin unter Einsatz großer, unilamellarer Phospholipidvesikel, bei denen Farbstoff in die wässrige Phase des Liposoms eingeschlossen ist.
  • Die Patente Nr. 3.850.578 (McConnell); 4.483.921 (Yaverbaum); und 4.483.929 (Szoka) offenbaren immunreaktive Liposomreagenzien, in denen Antigen oder Antikörper an die Oberfläche von Lipid-Vesikeln gebunden ist.
  • Die US-Patente Nr. 4.529.561 (Hunt et al.); 4.522.803 (Lenk et al.); und 4.485.054 (Mezei et al.) offenbaren eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Lipidvesikeln.
  • US-Patent Nr. 4.311.712 (Evans et al.) offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Liposomgemischs.
  • US-Patent Nr. 4.588.578 (Fountain et al.) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von einphasigen Lipidvesikeln und die Verwendung derartiger Vesikel für Arzneimittelabgabesysteme.
  • US-Patent Nr. 4.576.912 offenbart ein Verfahren zur Erhöhung des Fluoreszenzausmaßes eines Immuntests unter Einsatz bestimmter langkettiger Träger, die mit einer Vielzahl von Fluorophoren markiert sind.
  • US-Patent Nr. 4.891.324 beschreibt ein Teilchen mit Lumineszenzmittel für Tests.
  • Das Selektive Abtöten von T-Lymphozyten durch phototoxische Liposomen wird von Yemu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 246–250 (1987), beschrieben.
  • Mew et al., J. of Immunology 130(3), 1473–1477 (1983), offenbaren Photoimmuntherapie: Behandlung von Tiertumoren mit Tumor-spezifischen monoklonalen Antikörper-Hämatoporphyrin-Konjugaten.
  • Die Beobachtung von einzelnen kleinen Molekülen mit dem Lichtmikroskop wird von Hirschfeld, Applied Optics 15(12), 3135–3139 (1976), erörtert.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.322.926 (McCapra et al.) beschreibt Tests, bei denen verbesserte chemolumineszierende Ester, Thioester und Amide eingesetzt werden.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.352.713 (Schaap) beschreibt ein Verfahren und Zusammensetzungen, die für verbesserte Chemolumineszenz von 1,2-Dioxetanen sorgen.
  • US-Patent Nr. 4.978.614 (Bronstein) offenbart ein Verfahren zum Detektieren einer Substanz unter Einsatz des enzymatisch herbeigeführten Abbaus von Dioxetanen.
  • Bronstein et al. (US-Patent Nr. 4.956.477) offenbaren die Synthese von 1,2-Dioxetanen.
  • Schaap et al. beschreiben in der WO 90/07511 die verstärkte Lumineszenz von 1,2-Dioxetanen durch Energietransfer auf gebundene Fluoreszenzmittel.
  • US-Patent Nr. 4.959.182 (Schaap) offenbart ein Verfahren und eine Zusammensetzung, die für verstärkte Chemolumineszenz von 1,2-Dioxetanen sorgen.
  • US-Patent Nr. 4.962.192 (Schaap) und 4.857.652 (Schaap) beschreiben chemolumineszierende 1,2-Dioxetan-Verbindungen.
  • Bronstein et al. beschreiben in US-Patent Nr. 4.931.223 ein Verfahren unter Einsatz von chemolumineszierenden 1,2-Dioxetanen.
  • Die Reinigung stabiler wasselöslicher Dioxetane wird in der WO 90/02742 (Edwards et al.) beschrieben.
  • Neue chemolumineszierende fusionierte polyzyklische Ringe enthaltende 1,2-Dioxetane, und Tests, bei denen sie eingesetzt werden, werden in der WO 90/00164 (Edwards et al.) beschrieben.
  • Die WO 89/06226 (Edwards et al.) erörtert die Synthese von 1,2-Dioxetanen und Zwischenprodukte dafür.
  • Neckers et al. beschreiben in US-Patent Nr. 4.315.998 Polymer-gebundene photosensibilisierende Katalysatoren.
  • Ein Verfahren zum Detektieren einer Substanz unter Einsatz des enzymatisch induzierten Abbaus von Dioxetanen wird in der WO 88/00695 (Bronstein et al.) beschrieben.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.324.202 (Zomer et al.) offenbart Acridinium-Verbindungen als chemoluminogene Markierungen.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.144.914 (Alberella et al.) beschreibt einen Hybridisierungstest, bei dem markierte Paare von Hybridbindungsreagenzien eingesetzt werden.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 0.401.001 (Urdea et al.) beschreibt chemolumineszierende, doppelt angeregte 1,2-Dioxetane.
  • Die EP-A-345.776 offenbart spezifische Bindungstests, bei denen ein Sensibilisator als Markierung eingesetzt wird. Die offenbarten Sensibilatoren umfassen Gruppierungen, die, wenn sie durch die Strahlung mit einer oder mehreren Wellenlängen oder einen anderen chemischen oder physikalischen Reiz stimuliert werden, einen angeregten Zustand erreichen, der unter Zugabe anderer Reagenzien ein detektierbares Signal erzeugt.
  • Die EP-A-70.685 offenbart einen homogenen lichtaussendenden Hybridisierungstest. Licht-markierte erste und zweite einzelne einstrangige Reagenssegmente werden mit einem einstrangigen komplementären Target-Polynucleotid von einer physiologischen Probe hybridisiert. Eine der Licht-Markierungen gehört dem Absorber/Emitter-Typ an, so dass von der anderen Lichtmarkierung absorbierte Energie als andere Wellenlänge wieder ausgesandt wird.
  • Die EP-A-275.139 offenbart ein Testverfahren zum Bestimmen eines Analyten. Das Verfahren wird unter Einsatz einer Zusammensetzung durchgeführt, die ein Konjugat eines ersten sbp-Elements mit einem Teilchen umfasst. Ein Lumineszenzmittel ist reversibel mit einer nicht-wässrigen Phase des Teilchens assoziiert.
  • Die WO 91/03479 offenbart die Synthese eines wasserlöslichen chemolumineszierenden 1,2-Dioxetans.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Bestimmen eines Analyten.
  • Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, worin das Verfahren das Behandeln eines Mediums umfasst, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, so dass eine an sich metastabile Spezies gebildet wird, wobei die Spezies fähig ist, in das Medium zu diffundieren und selektiv mit einer Substanz im Me dium zu reagieren, die fähig ist, mit der metastabilen Spezies zu reagieren, die aufgrund des Vorhandenseins des Analyten in große Nähe mit der Spezies gebracht wird. Das Verfahren umfasst weiters die Bestimmung, ob die Spezies mit der Substanz reagiert hat, wobei deren Reaktion die Menge an Analyt im Medium anzeigt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Verbesserung eines Tests auf einen Analyten in einem flüssigen Medium. Der Test umfasst die Schritte des Behandelns eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, um einen spezifischen Bindungspaar- (sbp-) Komplex zu bilden, in Bezug auf das Vorhandensein des Analyten, und des Bestimmens, ob der Komplex gebildet wurde. Die Verbesserung umfasst das Kombinieren (1) eines Photosensibilisators, der mit einem Element eines spezifischen Bindungspaares verbunden ist, und (2) einer chemolumineszierenden Verbindung mit dem Medium, die mit einem sbp-Element assoziiert ist, worin die Lichtmenge, die bei Aktivierung des Photosensibilisators von der chemolumineszierenden Verbindung ausgesandt wird, mit der Menge an Analyt im Medium in Zusammenhang steht.
  • Eine weitere Ausführungsform eines Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung umfasst das Behandeln eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, unter solchen Bedingungen, dass der Analyt, wenn er vorhanden ist, bewirkt, dass ein Photosensibilisator und eine chemolumineszierende Verbindung in große Nähe zueinander kommen. Als Ergebnis kann vom Photosensibilisator erzeugter Singulettsauerstoff die chemolumineszierende Verbindung aktivieren, die daraufhin Licht oder Lumineszenz erzeugt. Die erzeugte Lichtmenge steht mit der Analytmenge im Medium in Zusammenhang.
  • Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung zum Bestimmen eines Analyten umfasst als ersten Schritt das Bereitstellen einer Kombination, die ein Medium umfasst, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, eines Photosensibilisators, der mit einem sbp-Element assoziiert ist, und eines suspendierbaren Teilchens, das eine chemolumineszierende Verbindung umfasst. An das suspendier bare Teilchen ist ein sbp-Element gebunden. Die Kombination wird so behandelt, dass der Photosensibilisator angeregt wird, der in seinem angeregten Zustand fähig ist, Sauerstoff in einen Singulettzustand zu aktivieren. Die Kombination wird dann bezüglich der ausgesandten Lumineszenzmenge untersucht. Das Ausmaß dieser Lumineszenz steht mit der Analytmenge im Medium in Beziehung. Alternativ dazu wird die chemolumineszierende Verbindung mit einem sbp-Element assoziiert, und das suspendierbare Teilchen umfasst einen Photosensibilisator und weist ein daran gebundenes sbp-Element auf.
  • Eine weitere Ausführungsform besteht in einem Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, worin eine Kombination bereitgestellt wird. Die Kombination umfasst ein Medium, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, einen Photosensibilisator, der mit einem ersten sbp-Element assoziiert ist, und eine chemolumineszierende Verbindung, die mit einem zweiten sbp-Element assoziiert ist. Der Photosensibilisator wird dann angeregt und kann Sauerstoff in einen Singulettzustand anregen, wobei der Singulettsauerstoff die chemolumineszierende Verbindung aktiviert, wenn sie in große Nähe mit dem Photosensibilisator gebracht wird. Die von der Kombination ausgesandte Lumineszenz wird mit der Analytmenge in Beziehung gesetzt.
  • Eine weitere Ausführungsform besteht in einem Verfahren zum Bestimmen eines Analyten. Das Verfahren umfasst das Kombinieren in einem wässrigen Medium einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Analyten enthält, eines ersten suspendierbaren Teilchens, das eine darin aufgenommene chemolumineszierende Verbindung und ein daran gebundenes sbp-Element aufweist, und eines zweiten suspendierbaren Teilchens, in das ein Photosensibilisator aufgenommen ist, der fähig ist Sauerstoff in seinen Singulettzustand anzuregen, worin an das Teilchen ein sbp-Element gebunden ist. Das Medium wird dann bestrahlt, um den Singulettzustand von Sauerstoff zu induzieren, und die vom Medium abgegebene Lumineszenzmenge wird gemessen. Das Ausmaß dieser Lumineszenz steht mit der Analytmenge im Medium in Beziehung.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein suspendierbares Teilchen umfassen, in dem eine chemolumineszierende Verbindung aufgenommen ist, worin an das Teilchen ein sbp-Element gebunden ist. Die Zusammensetzung kann weiters ein suspendierbares Teilchen umfassen, in dem ein Photosensibilisator aufgenommen ist.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Sets, die in abgepackter Kombination eine Zusammensetzung umfassen, die (1) ein suspendierbares Teilchen, das eine chemolumineszierende Verbindung aufweist, worin an das Teilchen ein sbp-Element gebunden ist, und (2) einen Photosensibilisator umfasst. Das Set kann weiters eine Zusammensetzung umfassen, die ein zweites suspendierbares Teilchen umfasst, das einen Photosensibilisator umfasst, worin an das Teilchen ein sbp-Element gebunden ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Set (1) eine chemolumineszierende Verbindung, die mit einem ersten spb-Element assoziiert ist, und (2) einen mit einem zweiten sbp-Element assoziierten Photosensibilisator, der in seinem angeregten Zustand fähig ist, Sauerstoff in seinen Singulettzustand anzuregen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Bereitstellen (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, (2) eines Markierungsreagens, das ein erstes sbp-Element umfasst, das mit einer photochemisch aktivierbaren chemolumineszierenden Verbindung assoziiert ist, worin das erste sbp-Element fähig ist, sich an den Analyten oder ein zweite sbp-Element zu binden, um einen Komplex zu bilden, der mit dem Vorhandensein des Analyten in Beziehung steht, das photochemische Aktivieren der chemolumineszierenden Verbindung und das Detektieren des Ausmaßes an Lumineszenz, das von der chemolumineszierenden Verbindung erzeugt wird, wobei sein Ausmaß mit der Menge an Analyt im Medium in Beziehung steht.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zum Bestimmen eines Analyten als ersten Schritt das Kombinieren, in einem Testmedium, (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, und (2) eines Markierungsreagens, das ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element) umfasst, das an eine photochemisch aktivierbare chemolumineszierende Verbindung gebunden ist, unter Bedingungen, worin ein sbp-Element-Komplex gebildet wird, der das Markierungsreagens umfasst, in Bezug auf das Vorhandensein von Analyt im Medium. Das Testmedium wird mit Licht bestrahlt, um die photochemisch aktivierbare chemolumineszierende Verbindung zu aktivieren. Des Testmedium wird auf Lichtemission untersucht. Das Vorhandensein oder die Intensität einer solchen Signal-Lichtemission wird mit der Analytmenge im Medium in Beziehung gesetzt. Ein Energie-Akzeptor ist im Medium enthalten, worin die Energie von der chemolumineszierenden Verbindung den Energie-Akzeptor aktivieren kann.
  • Eine weitere Ausführungsform besteht in einem Verfahren zum Bestimmen eines Analyten. Das Verfahren umfasst das gleichzeitige oder vollständige oder teilweise aufeinander folgende Kombinieren, in einem wässrigen Medium, (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) eines Markierungsreagens, das ein erstes Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element), das an eine Verbindung gebunden ist, die bei Reaktion mit Licht oder Singulettsauerstoff zur Chemolumineszenz fähig ist, und (3) eines insolubilisierten Reagens, der einen Energieakzeptor umfasst, der an ein zweites sbp-Element gebunden ist oder fähig ist, daran gebunden zu werden. Es werden Bedingungen gewählt, worin ein sbp-Element-Komplex, der das Markierungsreagens umfasst, in Bezug auf das Vorhandensein von Analyt im Medium gebildet wird, und Energie von der chemolumineszierenden Verbindung fähig ist, den Energieakzeptor zu aktiveren. Die Verbindung wird mit Licht oder Singulettsauerstoff aktiviert. Das Testmedium wird auf Lumineszenz untersucht, wobei dessen Vorhandensein oder Intensität mit der Menge an Analyt im Medium in Beziehung steht.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, worin das Verfahren umfasst: (a) das gleichzeitige oder vollständig oder teilweise aufeinander folgende Kombinieren, in einem Testmedium, (1) eines Me diums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) eines Markierungsreagens, das ein erstes Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element) umfasst, das an eine Verbindung gebunden ist, die bei Reaktion mit Singulettsauerstoff zu Chemolumineszenz fähig ist, (3) eines Singulettsauerstoff-Generators, und (4) eines Reagens, das einen Energieakzeptor umfasst, der an ein zweites sbp-Element gebunden ist oder daran gebunden werden kann, unter Bedingungen, worin ein sbp-Element-Komplex, der das Markierungsreagens umfasst, in Relation zum Vorhandensein von Analyt im Medium gebildet wird und Energie von der chemolumineszierenden Verbindung den Energieakzeptor aktivieren kann, (b) das Anregen des Singulettsauerstoff-Generators, und (c) das Untersuchen des Testmediums auf ein Signal, wobei dessen Vorhandensein oder Intensität mit der Analytmenge im Medium in Beziehung steht.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen eines Polynucleotidanalyten, worin das Verfahren umfasst: (a) das Kombinieren, in einem Testmedium, (1) einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Polynucleotidanalyten enthält, und (2) eines Markierungsreagens, das eine photochemisch anregbare chemolumineszierende Verbindung umfasst, die an ein Polynucleotid gebunden ist, wobei zumindest ein Abschnitt davon fähig ist, mit dem Polynucleotidanalyten zu hybridisieren, unter Bedingungen, worin das Markierungsregens mit dem Polynucleotidanalyten hybridisiert, wenn er vorhanden ist, (b) das Bestrahlen des Testmediums, um die photochemisch aktivierbare chemolumineszierende Verbindung zu aktivieren, und (c) das Messen der Lumineszenz des Mediums. Das Ausmaß an Lumineszenz steht mit der Analytmenge in der Probe in Beziehung.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die eine photochemisch anregbare chemolumineszierende Verbindung umfasst, die an ein sbp-Element gebunden ist. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Set, das eine derartige Zusammensetzung umfasst.
  • Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend nur anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
  • 1 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf Vitamin B12 ist.
  • 2 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf Digoxin ist.
  • 3 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf HCG gemäß vorliegender Erfindung ist.
  • 4 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests gemäß vorliegender Erfindung ist.
  • 5 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Tests auf TSH gemäß vorliegender Erfindung ist.
  • 6 ein Abschnitt der graphischen Darstellung von 5 ist.
  • 7 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines weiteren Tests auf HCG gemäß vorliegender Erfindung ist.
  • 8 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eine DNA-Hybrid-Detektionstests ist.
  • 9 eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Detektion eines synthetischen Targets ist.
  • 10 eine graphische Darstellung eines Gesamt-Triiodthyronintests ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Bestimmen eines Analyten.
  • Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, wobei das Verfahren das Behandeln eines Mediums, von den vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, um eine an sich metastabile Spezies zu bilden. Die Spezies kann in das Medium diffundieren und selektiv mit einer Substanz im Medium reagieren, die fähig ist, mit der der metastabilen Spezies zu reagieren, die durch das Vorhandensein des Analyten in große Nähe zur Spezies gebracht wird. Das Verfahren umfasst weiters die dahingehende Bestimmung, ob die Spezies mit der Substanz reagiert hat, wobei ihre Reaktion die Analytmenge im Medium anzeigt.
  • Im Allgemeinen befindet sich die metastabile Spezies in einem angeregten Zustand. Die metastabile Spezies hat eine Lebensdauer von weniger als 1 ms, üblicherweise weniger als 100 μs, häufiger weniger als 10 μs. Die metastabile Spezies ist im Medium diffundierend, d. h. wird an einer Stelle erzeugt und wandert von der Stelle der Bildung zu einer anderen Stelle, wo sie Energie übertragen oder mit einem Molekül an dieser Stelle reagieren kann.
  • Die metastabile Spezies kann jedes reaktive Zwischenprodukt sein, wie z. B. ein Radikalion, Nitren, Carben, aus der Gruppe trans-Cyclohexen, α-Lacton, Trimethylmethan und dergleichen. Von besonderem Interesse sind angeregte Singulettzustände, wie z. B. Singulettsauerstoff, Triplettzustände und Dioxetane, einschließlich Dioxetanonen und Dioxetandionen. Triplettzustände werden im Allgemeinen gebildet, indem ein geeigneter Sensibilisator, wie z. B. Pyren, mit einem Energieakzeptor, wie z. B. einem Anthracen, kombiniert wird. Beispielsweise kann Dibromanthracen als Energieakzeptor fungieren, der einen Triplettzustand annimmt. Der Triplettzustand kann seine Energie weiter auf ein anderes Molekül übertragen und eine detektierbare photochemische Reaktion, wie z. B. die Erzeugung von Licht, in Gang setzen. Dioxetane, wie z. B. Dioxetandione, werden aufgrund der Reaktion von aktiven Molekülen mit Singulettsauerstoff oder Wasserstoffperoxid gebildet. Beispielsweise bilden geeignete Oxalate und Wasserstoffperoxid Dioxetandione. Enzyme, wie z. B. Meerrettichperoxidase, können Radikalkationen oder Singulettsauerstoff erzeugen, die ebenso metastabil sind und mit einem anderen Molekül reagieren können, um ein detektierbares Signal zu ergeben.
  • Das Vorhandensein eines spezifischen Bindungspaarkomplexes kann bestimmt werden, indem bewirkt wird, dass eine metastabile Spezies von einem Element des Komplexes erzeugt wird, woraufhin sie selektiv mit einem anderen Element des Komplexes in Wechselwirkung treten kann, ohne mit diesem Element in Wechselwirkung zu treten, wenn es nicht innerhalb des Komplexes vorliegt.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung bindet sich eine Zusammensetzung, die einen Photosensibilisator und einen Liganden, einen Rezeptor oder ein Polynucleotid umfasst, in einem Test an eine Zusammensetzung, die eine chemolumineszierende Verbindung und einen Liganden, einen Rezeptor oder ein Polynucleotid umfasst. Die chemolumineszierende Verbindung kann mit Singulettsauerstoff reagieren, und das gebildete Produkt wird unter Emission von Licht abgebaut. Der Singulettsauerstoff wird durch den Photosensibilisator üblicherweise durch Bestrahlung des Photosensibilisators erzeugt. Singulettsauerstoff, der vom Photosensibilisator erzeugt wird, der nicht an die Zusammensetzung gebunden ist, die eine chemolumineszierende Verbindung umfasst, kann die chemolumineszierende Verbindung nicht erreichen, bevor er zerfällt (die t1/2 beträgt in Wasser etwa 2 μs). Die Zusammensetzung, die einen Photosensibilisator umfasst, der an die Zusammensetzung gebunden wird, die die chemolumineszierende Verbindung umfasst, erzeugt Singulettsauerstoff, der mit der chemolumineszierenden Verbindung reagiert, weil ein derartiger Singulettsauerstoff die kurze Distanz überleben kann, die nun zwischen dem Photosensibilisator und der chemolumineszierenden Verbindung liegt. Die Kürze der Distanz resultiert aus dem Vorhandensein eines Analyten in der Probe. Vorzugsweise verläuft ein Abschnitt der Distanz, die vom Singulettsauerstoff durchlaufen wird, durch ein organisches Medium, wo der Singulettsauerstoff eine viel längere Lebensdauer hat, nämlich mehr als etwa 100 μs. Der Analyt muss die Bindung zwischen der Zusammensetzung, die den Photosensibilisator umfasst, und der Zusammensetzung, die die chemolumineszierende Verbindung umfasst, modulieren. Übli cherweise ist zumindest einer) von chemolumineszierender Verbindung und Photosensibilisator mit der Oberfläche assoziiert, insbesondere, wenn die Oberfläche suspendierbare Teilchen umfasst.
  • Der obige Ansatz unter Beteiligung von Singulettsauerstoff-Anregung einer chemolumineszierenden Verbindung in großer Nähe zu einem Photosensibilisator ist von McCapra, s. oben, zu unterscheiden. Auf Seite 4, Zeilen 38–46, von McCapra wird ein Test beschrieben, der in einem Quenching-Format durchgeführt wird. Beim Test von McCapra wird ein Reaktand eingesetzt, der sich spezifisch an einen Komplex des Analyten binden kann und spezifische Material binden kann, an das der Sensibilisator konjugiert wird, um einen Sensibilisator-Konjugat-Reaktandenkomplex zu bilden. Eine Quenching-Gruppierung ist an den Reaktanden gebunden. Wenn sie in große Nähe zum Sensibilisator gebracht wird, verringert oder quencht die Quenching-Gruppierung das Signal, das als Ergebnis der Anregung von gebundenem Sensibilisator erzeugt wird, oder verringert oder quencht die Übertragung von Elektronen oder Energie für den angeregten Sensibilisator auf eine Zwischenspezies (d. h. molekularen Sauerstoff oder einen Leukofarbstoff). In diesem Quenching-Format wird das Vorhandensein von Analyt mit der Lumineszenz der zerfallenden Dioxetane in Beziehung gesetzt. McCapra bezieht sich dann auf die US-Patente Nr. 4.220.450 und 4.277.437, die oben beschrieben sind.
  • Dieses von McCapra beschriebene Quenching-Testformat umfasst nur das Quenchen von angeregtem Sensibilisator und beinhaltet nicht die Singulettsauerstoff-Anregung einer chemolumineszierenden Verbindung, die mit einem spezifischen Bindungselement assoziiert ist.
  • Weiters beschreibt McCapra auf Seite 14, Zeilen 35–36 die Übertragung von Energie von einer chemolumineszierenden Gruppierung, um einen Sensibilisator in einem Polynucleotidsondentest anzuregen. Diese Beschreibung von McCapra unterscheidet sich völlig von der vorliegenden Erfindung, die das Zusammenbringen in große Nähe zueinander eines Photosensibilisators und einer chemolumineszierenden Verbindung durch das Vorhandensein eines Analyten umfasst, wobei der angeregte Photosensibilisator Singulettsauerstoff erzeugt, der wiederum die chemolumineszierende Verbindung anregt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird als Markierung eine Gruppe verwendet, die photochemisch zu einem lumineszierenden Erzeugnis aktiviert werden kann. Die Gruppe ist mit einem Element eines spezifischen Bindungspaares assoziiert, und dieses Reagens wird als markierte Regens in Tests zur Detektion eines Analyten verwendet. Photochemische Aktivierung kann durch Bestrahlung der Gruppe mit Licht oder durch Umsetzen von Singulett mit der Gruppe erreicht werden. Vorzugsweise wird ein Sensibilisator verwendet, um die Photoaktivierung zu unterstützen, wenn die Anregung durch Singulettsauerstoff erfolgt. Üblicherweise absorbiert der Sensibilisator Licht, und der so gebildete angeregte Sensibilisator aktiviert Sauerstoff und der Singulettsauerstoff reagiert mit der Markierung, was ein metastabiles lumineszierendes Zwischenprodukt ergibt. Die als Markierung verwendete Gruppe kann jede chemolumineszierende Verbindung umfassen, die Photoaktivierung mit oder ohne Sensibilisierung erfährt, und es handelt sich vorzugsweise um eine Gruppe, die durch Reaktion mit Singulettsauerstoff angeregt wird. Die Markierungen gemäß vorliegender Erfindung können sowohl bei homogenen als auch bei heterogenen Testvorschriften eingesetzt werden, um einen Analyten zu bestimmen. Wünschenswert ist keine Zugabe von chemischen Reagenzien erforderlich, um die chemolumineszierende Verbindung mit oder ohne einen Sensibilisator und Energieakzeptor zu aktivieren. Bei einer homogenen Vorschrift werden alle Reagenzien kombiniert, und das Medium wird bestrahlt, um die chemolumineszierende Verbindung zu aktivieren.
  • In der Testvorschrift werden die Komponenten in Kombination bereitgestellt, und das in Abhängigkeit von der Anregung von Sauerstoff durch Sensibilisator erzeugte Licht ist von der Analyt-Konzentration abhängig. Vorteilhaft können die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt werden, ohne das Medium zu erwärmen, um Licht zu erzeugen. Folglich kann der Test gemäß vorliegender Erfindung bei einer konstanten Temperatur durchgeführt werden.
  • Bevor mit der Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, werden eine Reihe von Begriffen definiert und im Detail beschrieben.
  • Analyt: Die zu detektierende Verbindung oder Zusammensetzung. Der Analyt kann aus einem Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) bestehen und kann ein Ligand sein, der einwertig (monoepitopisch) oder mehrwertig (polyepitopisch), üblicherweise antigenisch oder haptenisch ist und aus einer einzelnen Verbindung oder einer Vielzahl von Verbindungen besteht, die zumindest eine epitopische oder determinante Stelle gemeinsam haben. Der Analyt kann ein Teil einer Zelle wie eines Bacteriums oder einer Zelle sein, die die ein Blutgruppenantigen, wie A, B, D usw. trägt, oder eines HLA-Antigens oder eines Mikroorganismus, z. B. Bacterium, Fungus, Protozoe oder Virus.
  • Die mehrwertigen Ligandenanalyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren sowie Kombinationen davon. Derartige Kombinationen umfassen Komponenten von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen, Zellmembran und dergleichen. Größtenteils weisen die polyepitopischen Ligand-Analyten, auf die die vorliegende Erfindung angewandt werden kann, ein Molekulargewicht von zumindest etwa 5.000, häufiger zumindest etwa 60.000, auf. In der Poly(aminosäure)kategorie haben die Poly(aminosäuren) von Interesse im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 5.000.000, häufiger von etwa 20.000 bis 1.000.000; bei den Hormonen von Interesse liegt das Molekulargewicht üblicherweise im Bereich von etwa 5.000 bis 60.000.
  • Eine große Vielzahl von Proteinen kann als Familie von Proteinen mit ähnlichen Strukturmerkmalen betrachtet werden, Proteine mit bestimmtem biologischen Funktionen, Proteinen, die mit spezifischen Mikroorganismen verbunden sind, bestimmte Erkrankung verursachende Mikroorganismen usw. Derartige Proteine sind beispielsweise Immunglobuline, Zytokine, Enzyme, Hormone, Krebsantigene, Nährstoffmarker, gewebespezifische Antigene usw.
  • Bei den folgenden handelt es sich um Klassen von Proteinen, die aufgrund der Struktur verwandt sind:
    Protamine
    Histone
    Albumine
    Globuline
    Skleroproteine
    Phusphoproteine
    Mucoproteine
    Chromoproteine
    Lipoproteine
    Nucleoproteine
    Glykoproteine
    T-Zellen-Rezeptoren
    Proteoglykane
    HLA
    unklassifizierte Proteine, z. B. Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin
  • Eine Anzahl von Proteinen, die im menschlichen Plasma zu finden sind, sind von klinischer Bedeutung, und dazu gehören:
    Präalbumin
    Albumin
    α1-Lipoprotein
    α1-Glykoprotein
    Transcortin
    4.6S-Postalbumin
    Tryptophan-armes α1-Glykoprotein
    α1X-Glykoprotein
    Thyroxin-bindendes Globulin
    Inter-α-trypsin-Inhibitor
    Gc-Globulin
    (Gc 1-1)
    (Gc 2-1)
    (Gc 2-2)
    Haptoglobin
    (Hp 1-1)
    (Hp 2-1)
    (Hp 2-2)
    Ceruloplasmin
    Cholinesterase
    α2.Lipoprotein(e)
    Myoglobin
    C-reaktives Protein
    α2-Macroglobulin
    α2-Hs-Glykoprotein
    Zn-α2-Glykoprotein
    α2-Neuraminoglykoprotein
    Erythropoietin
    β-Lipoprotein
    Transferrin
    Hemopexin
    Fibrinogen
    Plasminogen
    β2-Glykoprotein I
    β2-Glykoprotein II
    Immunglobulin G
    (IgG) oder γG-Globulin
  • Molekülformel:
    γ2K2 oder γ2λ2
    Immunoglobulin A (IgA)
    oder γA-Globulin in
  • Molekülformel:
    (α2K2)a oder (α2K2)a Immunglobulin M
    (IgM) oder γM-Globulin
  • Molekülformel:
    (μ2K2)5 oder (μ2λ2)5
    Immunglobulin D (IgD)
    oder γD-Globulin (γD)
  • Molekülformel:
    (δ2K2) oder δ2λ2)
    Immunglobulin E (IgE)
    oder γE-Globulin (γE)
  • Molekülformel:
    (ε2K2) oder (ε2λ2)
    Freie K- und λ-Leichtketten
  • Komplementfaktoren:
    Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Wichtige Blutgerinnungsfaktoren sind:
    Figure 00260002
  • Wichtige Proteinhormone sind:
  • Peptid- und Proteinhormone
    • Parathyreoidhormon (Parathormon)
    • Thyrocalcitonin
    • Insulin
    • Glucagon
    • Relaxin
    • Erythropoietin
    • Melanotropin (Melanocyten-stimulierend) Hormon; Intermedin)
    • Somatotropin (Wachstumshormon)
    • Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon)
    • Thyrotropin
    • Follikel stimulierendes Hormon
    • Luteinisierendes Hormon (interstitielle Zellen stimulierendes Hormon)
    • Luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Polactin
    • Gonadotropin (choriones Gonadotropin)
  • Gewebehormone
    • Secretin
    • Gastrin
    • Angiotensin I und II
    • Bradykinin
    • Menschliches Plazenta-Lactogen
  • Cytokine
    • IL I
    • IL II
    • IL VI
    • EGF
    • TNF
    • NGF
  • Krebsantigene
    • PSA
    • CEA
    • α-Fetoprotein
    • Saure Phosphatase
    • CA 19.9
    • CA 125
  • Gewebespezifische Antigene
    • Alkalische Phosphatasen
    • Myoglobin
    • CPK-MB
    • Calcitonin
    • Myelin-Basisprotein
  • Peptidhormone von der Neurohypophyse
    • Oxytocin
    • Vasopressin
    • Freisetzungsfaktoren (RF)
    • CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF
  • Andere polymere Materialien von Interesse sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.
  • Veranschaulichende Beispiele für Mikroorganismen sind:
    Corynebakterien
    Löffler-Diphtherie-Bazillus
    Pneumokokken
    Diplococcus pneumoniae
    Streptokokken
    Streptococcus aureus
    Streptococcus albus
    Neisseria
    Meningokokkus
    Gonokokkus
    Enterobacteriaceae
    Escherichia coli
    Aerobacter aerogenes Bakterien der Koligruppe
    Klebsiella pneumoniae
    Salmonella typhosa
    Salmonella choleraesuis Salmonellae
    Salmonella typhimurium
    Shigella dysenteria
    Shigella schmitzii
    Shigella arabinotarda Shigellae
    Shigella flexneri
    Shigella boydii
    Shigella sonnei
    Andere Darmbakterien
    Proteus vulgaris
    Proteus mirabilis Proteus-Spezies
    Proteus morgani
    Pseudomonas aeruginosa
    Alcaligenes faecalis
    Vibrio cholerae
    Haemophilus-Bordetella-Gruppe Rhizopus oryzae
    Haemophilus influenzae, H. ducryi Rhizopus arrhizua
    Phycomycetes
    Haemophilus haemophilus Rhizopus nigricans
    Haemophilus aegypticus Sporotrichum schenkii
    Haemophilus parainfluenza Flonsecaea pedrosoi
    Bordetella pertussis Flonsecaea compact
    Pasteurellae Flonsecaea dermatidis
    Pasteurella pestis Cladosporium carrionii
    Pasteurella tulareusis Phialophora verrucosa
    Brucellae Aspergillus nidulans
    Brucella melitensis Madurella mycetomi
    Brucella abortus Madurella grisea
    Brucella suis Allescheria boydii
    Aerobe sporenbildende Bazillen Phialophora jeanselmei
    Bacillus anthracis Microsporum gypseum
    Bacillus subtilis Trichophyton mentagrophytes
    Bacillus megaterium Keratinomyces ajelloi
    Bacillus cereus Microsporum canis
    Anaerobe sporenbildende Bazillen Trichophyton rubrum
    Clostridium botulinum Microsporum adouini
    Clostridium tetani Viren
    Clostridium perfringens Adenoviren
    Clostridium novyi Herpesviren
    Clostridium septicum Herpes simplex
    Clostridium histolyticum Varicella (Windpocken)
    Clostridium tertium Herpes zoster (Gürtelrose)
    Clostridium bifermentans Virus B
    Clostridium sporogenes Cytomegalovirus
    Mycobacteria Pockenviren
    Mycobacterium tuberculosis hominis Variola (Pocken)
    Mycobacterium bovis Kuhpocken
    Mycobacterium avium Rinderpocken-Virus
    Mycobacterium leprae Paravakzine
    Mycobacterium paratuberculosis Molluscum contagiosum
    Actinomyces (pilzartige Bakterien) Picornaviren
    Actinomyces Isaeli Poliovirus
    Actinomyces bovis Coxsackie-Virus
    Actinomyces naeslundii ECHO-Viren
    Nocardia asteroides Rhinoviren
    Nocardia brasiliensis Myxoviren
    Spirochäten Influenza (A, B und C)
    Treponema pallidium Spirillum minus Parainfluenza (1-4)
    Treponema pertenue Streptobacillus Mumps-Virus
    monoiliformis Pseudogeflügelpest-Virus
    Treponema carateum Masern-Virus
    Borrelia recurrentis Rinderpest-Virus
    Leptospira icterohaemorrhagiae Hundestaupe-Virus
    Leptospira canicola RS-Virus
    Trypanasomes Röteln-Virus
    Mycoplasmas ARBO-Viren
    Mycoplasma pneumoniae
    Andere Pathogene EEE-Virus
    Eucephalitis-Virus
    Listeria monocytogenes WEE-Virus
    Eucephalitis-Virus
    Erysipelothrix rhusiopathiae Sindbis-Virus
    Streptobacillus monoiliformis Chikungunya-Virus
    Donvania granulomatis Semliki Forest-Virus
    Bartonella bacilliformis Mayora-Virus
    Rickettsiae (bakterienartige Parasiten) St. Louis-Virus
    Encephalitis-Virus
    Rickettsia prowazekii California Enzephalitis-Virus
    Rickettsia mooseri Colorado-Zeckenfieber-Virus
    Rickettsia rickettsii Gelbfieber-Virus
    Rickettsia conori Dengue-Virus
    Rickettsia australis Reoviren
    Rickettsia sibiricus Reoviren-Typen 1-3
    Rickettsia akari Retroviren
    Rickettsia tsutsugamushi Human-Immunschwäche-Viren (HIV)
    Rickettsia burnetti Human-T-Zellen-Lymphotrophie-Virus
    Rickettsia quintana I & II (HTLV)
    Chlamydia (nicht klassifizierbare Hepatitis-Viren
    Parasiten – Bakterien/Viren) Hepatitis A-Virus
    Chlamydia-Agentien (Benennung Hepatitis B-Virus
    ungewiss) Hepatitis NichtA-NichtB-Virus
    Pilze Tumor-Viren
    Cryptococcus neoformans Rauscher-Leukämie-Virus
    Blastomyces dermatidis Gross-Virus
    Histoplasma capsulatum Maloney-Leukämie-Virus
    Coccidioides immitis Human-Papillom-Virus
    Paracoccidioides brasiliensis
    Candida albicans
    Aspergillus fumigatus
    Mucor corymbifer (Absidia corymbifera)
  • Die munoepitopischen Ligandenanalyten besitzen ein Molekulargewicht von im Allgemeinen etwa 100 bis 2.000, noch häufiger von 125 bis 1.000. Zu den Analyten zählen Arzneimittel, Metaboliten, Pestizide, Schmutzstoffe und dergleichen. Zu den Arzneimitteln von Interesse zählen Alkaloide. Beispiele für Alkaloide sind Morphinalakaloide, umfassend Morphin, Codein, Heroin, Dextromethoprhan, ihre Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, umfassend Kokain und Benzylecgonin, ihre Derivate und Metaboliten; Ergotalkaloide, umfassend Lysergsäurediamid; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide; Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, umfassend Chinin und Chinidin; Diterpenalkaloide, ihre Derivate und Metaboliten.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln enthält Steroide, z. B. Östrogene, Androgene, andreokortikale Steroide, Gallensäuren, karidotone Glykoside und Aglykone, z. B. Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, ihre Derivate und Metaboliten. Ferner sind steroide mimetische Substanzen, wie z. B. Diethylstilbestrol, enthalten.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Lactame mit Elementen in Form von 5- bis 6-Ringen, z. B. Barbiturate wie etwa Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin, Primidon, Ethosuximid und ihre Metaboliten.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, umfassend Amphetamine; Catecholamine wie etwa Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin; Nacrein; Papaverin; und Metaboliten davon.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Benzoheterozyklen, z. B. Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, ihre Derivate und Metaboliten, wobei die heterozyklischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Purine wie etwa Theophyllin, Koffein, ihre Metaboliten und Derivate.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind jene, die von Marihuana herrühren, z. B. Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Hormone, wie z. B. Thyroxin, Cortisol, Triiodthyronin, Testosteron, Estradiol, Estron, Progestron, Polypeptide wie z. B. Angiotensin, LHRH und Immunsuppressiva, wie z. B. Cyclosporin, FK506, Mykophenolsäure usw.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Vitamine, wie z. B. A, B wie etwa B12, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Prostaglandine, die sich in ihrem Grad und den Stellen der Hydroxylierung und Ungesättigtheit unterscheiden.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind die trizyklischen Antidepressiva, z. B. Imipramin, Dismethylimipramin, Amitriptylin, Nortriptylin, Protriptylin, Trimipramin, Chlornipramin, Doxepin und Demethyldoxepin.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind die Anti-Neoplastika, zu denen Methotrexat gehört.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Antibiotika, z. B. Penicillin, Chlormycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, ihre Metaboliten und Derivate.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Nucleoside und Nucleotide, z. B. ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidine mit ihren geeigneten Zucker- und Phosphatsubstituenten.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind verschiedene individuelle Medikamente, z. B. Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Lidocain, Procainamid, Acetylpro cainamid, Propanolol, Griseofulvin, Valproinsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Chloramphenicol, Anticholinergika, wie z. B. Atropine, ihre Metaboliten und Derivate.
  • Mit Krankheitszuständen assoziierte Metaboliten sind Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1.
  • Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Aminoglykoside, z. B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
  • Zu Pestiziden von Interesse zählen polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, ihre Metaboliten und Derivate.
  • Für Rezeptoranalyten reichen die Molekulargewichte im Allgemeinen von 10.000 bis 2 × 108, noch häufiger von 10.000 bis 106. Für Immunglobuline IgA, IgG, IgE und IgM variieren die Molekulargewichte im Allgemeinen von etwa 160.000 bis etwa 106. Enzyme reichen hinsichtlich des Molekulargewichts normalerweise von etwa 10.000 bis 1.000.000. Natürliche Rezeptoren variieren stark und besitzen ein Molekulargewicht von im Allgemeinen zumindest etwa 25.000, möglicherweise 106 oder mehr; dazu zählen Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-Bindungsglobulin, Thyroxin-Bindungspräalbumin, Transcortin usw.
  • Der Ausdruck Analyt umfasst ferner Polynucleotid-Analyten, wie z. B. die unten definierten Polynucleotide. Dazu zählen m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA, DNA-RNA-Duplexe usw. Der Ausdruck Analyt umfasst außerdem Rezeptoren, die Polynucleotid-Bindemittel sind, z. B. Restriktionsenzyme, Aktivatoren, Repressoren, Nucleasen, Polymerasen, Histone, Reparaturenzyme, Chemotherapeutika und dergleichen.
  • Der Analyt kann ein Molekül sein, das sich direkt in einer Probe, wie z. B. einer Körperflüssigkeit aus einem Wirt, befindet. Die Probe kann direkt untersucht oder vorbehandelt werden, um den Analyten leichter detektierbar zu machen. Außerdem kann der Analyt von Interesse bestimmt werden, indem ein Mittel detektiert wird, das den Analyten von Interesse untersuchen kann, z. B. ein sbp, das zum Analyten von Interesse komplementär ist, dessen Gegenwart nur dann detektiert wird, wenn sich der Analyt von Interesse in einer Probe befindet. Das den Analyten untersuchende Mittel wird somit zum Analyten, der in einem Test detektiert wird. Die Körperflüssigkeit kann z. B. Harn, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Stuhl, Sputum, Zerebrospinalflüssigkeit, Tränen, Mukus und dergleichen sein.
  • Element eines spezifischen Bindungspaars ("sbp-Element"): Eines von zwei unterschiedlichen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist. Die Elemente des sbp werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind üblicherweise die Elemente eines immunologischen Paars, wie z. B. Antigen-Antikörper, obwohl andere sbp wie etwa Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nucleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, Polynucleotidpaare, wie z. B. DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen, keine immunologischen Paare sind, aber im Schutzbereich der Erfindung und in der Definition von sbp-Element enthalten sind.
  • Polynucleotid: Eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nucleotid ist, das im natürlichen Zustand etwa 50 bis 500.000 oder mehr Nucleotide aufweist und im isolierten Zustand etwa 15 bis 50.000 oder mehr Nucleotide, üblicherweise etwa 15 bis 20.000 Nucleotide, noch häufiger 15 bis 10.000 Nucleotide, besitzt. Das Polynucleotid enthält Nucleinsäuren aus jeder beliebigen Quelle in gereinigter oder nicht gereinigter Form, natürlich vorkommend oder synthetisch produziert, z. B. DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, üblicherweise DNA, und kann t-RNA, m-RNA, r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und RNA, DNA-RNA-Hybride oder Gemische davon, Gene, Chromosome, Plasmide, die Genome von biologischem Material, wie z. B. Mikroorganismen wie etwa Bakterien, Hefe, Viren, Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen, Tiere, Menschen, sowie Fragmente davon und dergleichen sein.
  • Ligand: Jede beliebige organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.
  • Ligandanalog: Ein modifizierter Ligand, ein organischer Rest oder Analytenanalog, üblicherweise mit einem Molekulargewicht von mehr als 100, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation die Möglichkeit bietet, einen Ligandanalog mit einem anderen Molekül zu verbinden. Der Ligandanalog unterscheidet sich vom Liganden üblicherweise – aber nicht notwendigerweise – durch mehr als eine Ersetzung eines Wasserstoffs mit einer Bindung, die den Ligandanalog mit einem Hub oder Marken verknüpft. Der Ligandanalog kann sich in ähnlicher Weise wie der Ligand an den Rezeptor binden. Der Analog könnte beispielsweise ein gegen den Idiotyp eines Liganden-Antikörpers gerichteter Antikörper sein.
  • Rezeptor ("Antiligand"): Jede Verbindung oder Zusammensetzung, die eine bestimmte räumliche und polare Organisation eines Moleküls erkennen kann, z. B. eine Epitop- oder Determinantenstelle. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-Bindungsglobulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nucleinsäuren, Protein A, Komplementkomponente C1q und dergleichen.
  • Spezifische Bindung: Die spezifische Erkennung eines von zwei unterschiedlichen Molekülen für das andere (im Vergleich zur wesentlich weniger stark ausgeprägten Erkennung anderer Moleküle). Im Allgemeinen besitzen die Moleküle Bereiche auf ihren Oberflächen oder Hohlräumen, die zur spezifischen Erkennung zwischen den zwei Molekülen führen. Beispiele für spezifische Bindung sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Polynucleotid-Wechselwirkungen usw.
  • Nichtspezifische Bindung: Nichtkovalente Bindung zwischen Molekülen, die relativ unabhängig von spezifischen Oberflächensutrukturen ist. Nichtspezifische Bindung kann die Folge verschiedener Faktoren sein, z. B. hydrophober Wechselwirkungen zwischen Molekülen.
  • Antikörper: Ein Immunglobulin, das sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und durch auf dem Gebiet bekannte Techniken erzeugt werden, z. B. durch Immunisierung eines Wirts und Gewinnung von Seren (polyklonal), durch Herstellung kontinuierlicher Hybridzelllinien und Gewinnung des sekretierten Proteins (monoklonal) oder durch Klonieren und Exprimieren von Nucleotidsequenzen oder mutagenisierten Versionen davon, die zumindest für die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die spezifische Bindung natürlicher Antikörper erforderlich sind. Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder ein Fragment davon enthalten, welche Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen, wie z. B. IgA, IgD, IgE, IGG1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM usw., umfassen. Fragmente davon sind Fab, Fv und F(ab')2, Fab' und dergleichen. Darüber hinaus können Aggregaten, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder ihrer Fragmente in geeigneten ällen verwendet werden, sofern die Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül aufrechterhalten bleibt.
  • Alkyl: Ein einwertiger, verzweigter oder unverzweigter Rest, der von einem aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines H-Atoms abgeleitet ist; dazu zählen Niederalkyl und langkettiges Alkyl.
  • Niederalkyl: Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl usw.
  • Langkettiges Alkyl: Alkyl mit mehr als 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. Hexyl, Heptyl, Octyl usw.
  • Alkyliden: Zweiwertiger organischer Rest, abgeleitet von einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, z. B. Ethyliden, bei dem 2 Wasserstoffatome vom gleichen Kohlenstoffatom entfernt wurden.
  • Aryl: Organischer Rest, abgeleitet von einem aromatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines Atoms und umfassend einen oder mehrere aromatische Ringe, üblicherweise 1 bis 4 aromatische Ringe, z. B. Phenyl (von Benzol), Naphthyl (von Naphthalin) usw.
  • Aralkyl: Organischer Rest mit einer Alkylgruppe, an die eine Arylgruppe gebunden ist, z. B. Benzol, Phenethyl, 3-Phenylpropyl, 1-Naphthylethyl usw.
  • Alkoxy: Alkylrest, der über ein Sauerstoffatom am Rest eines Moleküls gebunden ist, z. B. Methoxy, Ethoxy usw.
  • Aryloxy: Arylrest, der über ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z. B. Phenoxy, Naphthoxy usw.
  • Aralkoxy: Aralkylrest, der über ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z. B. Benzoxy, 1-Naphthylethoxy usw.
  • Substituiert: Bedeutet, dass ein Wasserstoffatom eines Moleküls durch ein anderes Atom ersetzt wurde, das ein einzelnes Atom, wie etwa Halogen usw., oder Teil einer Gruppe von Atomen sein kann, die eine Funktionalität bilden, z. B. als Substituent mit 1 bis 50 Atomen (mit Ausnahme der erforderlichen Wasserstoffatome, die zur Erfüllung der Valenz solcher Atome notwendig sind), welche Atome unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor ausgewählt sind und an eines oder mehrere Metallatome gebunden sein können.
  • Alkylthio: Alkylrest, der über ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z. B. Phenylthio, Naphthylthio usw.
  • Arylthio: Arylrest, der über ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls gebunden ist, z. B. Phenylthio, Naphthylthio usw.
  • Elektronen-spendende Gruppe: Substituent, der – wenn er an ein Molekül gebunden ist – das Molekül polarisieren kann, sodass die Elektronen-spendende Gruppe arm an Elektronen und im Verhältnis zu einem anderen Teil des Moleküls positiv geladen wird, d. h. reduzierte Elektronendichte aufweist. Solche Gruppe können u. a. Amine, Ether, Thioether, Phosphine, Hydroxy, Oxyanionen, Mercaptane und ihre Anione, Sulfide usw. sein.
  • Substituent mit 1 bis 50 Atomen (mit Ausnahme der erforderlichen Wasserstoffatome, die zur Erfüllung der Valenz solcher Atome notwendig sind), welche Atome unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor ausgewählt sind: Organischer Rest, der 1 bis 50 Atome mit Ausnahme der erforderlichen Anzahl an Wasserstoffatomen besitzt, die zur Erfüllung der Valenz der Atome im Rest notwendig sind. Im Allgemeinen ist das vorherrschende Atom Kohlenstoff (C), es kann aber auch Sauerstoff (0), Stickstoff (N), Schwefel (S) oder Phosphor (P) sein, worin 0, N, S oder P – falls vorhanden – an Kohlenstoff oder an eines oder mehrere voneinander oder an Wasserstoff oder ein Metallatom gebunden sind, um verschiedene funktionelle Gruppen zu bilden, z. B. Carbonsäuren, Alkohole, Thiole, Carbonsäureamide, Carbamate, Carbonsäureester, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Phosphorsäuren, Phosphorsäureester, Harnstoffe, Carbamate, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether, Olefine, Acetylene, Amine, Ketone, Aldehyde, Nitrile und dergleichen. Beispiele für solche organische Reste oder Gruppen sind u. a. Alkyl, Alkylidin, Aryl, Aralkyl sowie Alkyl, Aryl und Aralkyl, substituiert mit einer oder mehreren der obigen Funktionalitäten.
  • Linkergruppe: Die kovalente Verbindung zwischen Molekülen. Die Linkergruppe variiert je nach Beschaffenheit der verbundenen Moleküle, d. h. Photosensibilisator, Chemolumineszenzverbindung, sbp-Element oder Molekül, das mit einem Teilchen assoziiert ist oder einen Teil davon bildet. Funktionelle Gruppen, die normalerweise vorhanden sind oder in einen Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung eingebaut werden, dienen dazu, diese Materialien mit einem sbp-Element oder einem Teil chen zu verknüpfen; Beispiele sind die lipophile Verbindung eines Liposoms oder Öltröpfchens, Latexteilchens, Silikonteilchens, Metallsols oder Farbstoffkristallits.
  • Zumeist werden Carbonylfunktionalitäten verwendet – sowohl Oxocarbonyl, wie z. B. Aldehyd, als auch Nicht-Oxocarbonyl (einschließlich Stickstoff- und Schwefelanaloge), z. B. Carboxy, Amidin, Amidat, Thiocarboxy und Thionocarboxy.
  • Alternative Funktionalitäten von Oxo sind aktives Halogen, Diazo, Mercapto, Olefin, insbesondere aktiviertes Olefin, Amino, Phosphoro und dergleichen. Eine Beschreibung von Linkergruppen findet sich in der US-A-3.817.837, welche Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
  • Die Linkergruppen können von einer Bindung bis zu einer Kette mit 1 bis 100 Atomen, üblicherweise mit 1 bis 70 Atomen, vorzugsweise mit 1 bis 50 Atomen, noch bevorzugter mit 1 bis 20 Atomen, die jeweils unabhängig voneinander aus der normalerweise aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff und Phosphor bestehenden Gruppe ausgewählt sind, reichen. Die Anzahl an Heteroatomen in den Linkergruppen reicht normalerweise von etwa 0 bis 20, üblicherweise von etwa 1 bis 15, noch bevorzugter von etwa 2 bis 6. Die Atome in der Kette können mit anderen Atomen als Wasserstoff substituiert sein (ählich wie oben für den Substituenten mit 1 bis 50 Atomen beschrieben). Allgemein gesprochen kann die Länge einer jeweiligen Linkergruppe willkürlich gewählt werden, um die Synthese zu vereinfachen und jede gewünschte Gruppe, wie z. B. einen Energie-Akzeptor, ein Fluorophor, eine Gruppe zur Analyse von Zwischensystemübergängen, wie z. B. ein schweres Atom und dergleichen, inkorporieren zu können. Die Linkergruppen können aliphatisch oder aromatisch sein, obwohl im Falle von Diazogruppen üblicherweise aromatische Gruppen enthalten sind.
  • Wenn Heteroatome vorhanden sind, ist Sauerstoff normalerweise als Oxo oder Oxy, gebunden an Kohlenstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor, vorhanden; Stickstoff ist normalerweise als Nitro, Nitroso oder Amino vorhanden, normalerweise gebunden an Koh lenstoff, Sauerstoff, Schwefel oder Phosphor; Schwefel ist analog zu Sauerstoff; Phosphor hingegen ist an Kohlenstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff gebunden, üblicherweise als Phosphonat und Phosphatmono- und -diester.
  • Gemeinsame Funktionalitäten bei der Schaffung einer kovalenten Bindung zwischen der Linkergruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamin, Amidin, Thioamid, Ether, Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidin, Azo, Thioether sowie Carboxylat, Sulfonat, Phosphatester, Amide und Thioester.
  • Zumeist besitzen der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung eine Nicht-Oxocarbonylgruppe mit Stickstoff- und Schwefelanalogen, eine Phosphatgruppe, eine Aminogruppe, ein Alkylierungsmittel, wie z. B. Halogen oder Tosylalkyl, Oxy (Hydroxyl oder das Schwefelanalog Mercapto), Oxocarbonyl (z. B. Aldehyd oder Keton) oder aktives Olefin, wie etwa Vinylsulfon oder α,β-ungesättigten Ester. Diese Funktionalitäten werden mit Aminogruppen, Carboxylgruppen, aktiven Olefinen, Alkylierungsmitteln, wie z. B. Bromacetyl, verknüpft. Wenn ein Amin und Carbonsäure oder ihr Stickstoffderivat oder Phosphorsäure verbunden werden, entstehen Amide, Amidine und Phosphoramide. Wenn Mercaptan und aktivertes Olefin verbunden werden, entstehen Thioether. Wenn ein Mercaptan und ein Alkylierungsmittel verbunden werden, entstehen Thioether. Wenn Aldehyd und ein Amin unter reduzierenden Bedingungen verbunden werden, entsteht ein Alkylamin. Wenn eine Carbonsäure oder Phosphorsäure und ein Alkohol verbunden werden, entstehen Ester.
  • Hydrophilie oder Wasserlöslichkeit verleihende Gruppe oder Funktionalität: Hydrophile Funktionalität, die die Benetzbarkeit von Feststoffen mit Wasser und die Löslichkeit von Verbindungen, an die sie gebunden ist, in Wasser erhöht. Eine derartige funktionelle Gruppe oder Funktionalität kann ein Substituent mit 1 bis 50 oder mehr Kohlenstoffatomen sein; Beispiele sind Sulfonat, Sulfat, Phosphat, Amidin, Phosphonat, Carboxylat, Hydroxyl, insbesondere Polyole, Amin, Ether, Amid und dergleichen. Beispiele für funktionelle Gruppen sind Carboxyalkyl, Sulfonoxyalkyl, CONHOCH2COOH, CO-(Glucos amin), Zucker, Dextran, Cyclodextrin, SO2NHCH2COOH, SO3H, CONHCH2CH2SO3H, PO3H2, OPO3H2, Hydroxyl, Carboxyl, Keton und Kombinationen davon. Die meisten der obigen Funktionalitäten können auch als Bindungsgruppen verwendet werden, die die Bindung des Photosensibilisators oder der Chemolumineszenzverbindung an ein sbp-Element oder einen Träger ermöglichen.
  • Lipophilie oder Lipidlöslichkeit verleihende Gruppe oder Funktionalität: Lipophile Funktionalität, die die Benetzbarkeit von Oberflächen durch Wasser und die Löslichkeit von Verbindungen, an die sie gebunden ist, in Wasser senkt. Eine solche funktionelle Gruppe oder Funktionalität kann 1 bis 50 oder mehr Atome enthalten, üblicherweise mit Wasserstoff oder Halogen substituierte Kohlenstoffatome, und kann Alkyl, Alkyliden, Aryl und Aralkyl umfassen. Die lipophile Gruppe oder Funktionalität besitzt normalerweise 1 bis 6 unverzweigte oder verzweigte aliphatische Gruppen von zumindest 6 Kohlenstoffatomen, noch häufiger von zumindest 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von zumindest 12 Kohlenstoffatomen, üblicherweise von nicht mehr als 30 Kohlenstoffatomen. Die aliphatische Gruppe kann an Ringe von 5 bis 6 Elementen gebunden sein, die alizyklisch, heterozyklisch oder aromatisch sein können.
  • Photosensibilisator: Ein Sensibilisator für die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff, üblicherweise durch Anregung mit Licht. Der Photosensibilisator kann photoaktivierbar (z. B. Farbstoffe und aromatische Verbindungen) oder chemisch aktivierbar (z. B. Enzyme und Metallsalze) sein. Bei Anregung durch Licht ist der Photosensibilisator üblicherweise eine Verbindung, die aus kovalent gebundenen Atomen besteht, üblicherweise mit mehreren konjugierten Doppel- oder Dreifachbindungen. Die Verbindung sollte Licht im Wellenlängenbereich von 200–1100 nm, üblicherweise 300–1000 nm, vorzugsweise 450–950 nm, absorbieren, wobei der Extinktionskoeffizient an ihrem Absorptionsmaximum bei der Anregungswellenlänge mehr als 500 M–1cm–1, vorzugsweise zumindest 5000 M–1cm–1, noch bevorzugter zumindest 50.000 M–1cm–1, beträgt. Die Lebensdauer eines nach Lichtabsorption in Abwesenheit von Sauerstoff erzeugten angeregten Zustands beträgt üblicherweise zumindest 100 ns, vorzugsweise zumindest 1 ms. Im Allge meinen muss die Lebensdauer ausreichend lang sein, um Energietransfer an den Sauerstoff zu ermöglichen, der in Abhängigkeit vom Medium normalerweise in Konzentrationen im Bereich von 10–5 bis 10–3 M vorhanden ist. Der angeregte Zustand des Sensibilisators besitzt üblicherweise eine andere Spinquantenzahl (S) als sein Grundzustand und ist üblicherweise ein Triplett (S = 1), wenn – was üblicherweise der Fall ist – der Grundzustand ein Singulett ist (S = 0). Vorzugsweise besitzt der Sensibilisator eine hohe Zwischensystemübergangs-Ausbeute. Das heißt, die Photoanregung eines Sensibilisators erzeugt den langen Lebenszustand (üblicherweise Triplett) mit einer Wirksamkeit von zumindest 10%, günstigerweise zumindest 40%, vorzugsweise mehr als 80%. Der Photosensibilisator ist üblicherweise höchstens schwach fluoreszierend unter den Testbedingungen (Quantenausbeute üblicherweise weniger als 0,5, vorzugsweise weniger als 0,1).
  • Photosensibilisatoren, die durch Licht anregbar sind, sind relativ photostabil und reagieren nicht wirkungsvoll mit Singulett-Sauerstoff. In den meisten geeigneten Sensibilisatoren sind mehrere Strukturmerkmale vorhanden. Die meisten Sensibilisatoren besitzen zumindest eine und häufig drei oder mehr konjugierte Doppel- oder Dreifachbindungen, die in einer starren und oft aromatischen Struktur gehalten werden. Sie enthalten häufig zumindest eine Gruppe, die den Zwischensystemübergang beschleunigt, z. B. eine Carbonyl- oder Imingruppe oder ein schweres Atom, das aus den Reihen 3–6 des Periodensystems ausgewählt ist, insbesondere Iod oder Brom, oder sie können erweiterte aromatische Strukturen aufweisen. Typische Sensibilisatoren sind Aceton, Benzophenon, 9-Thioxanthon, Eosin, 9,10-Dibromanthracen, Methyenblau, Metalloporphyrine, wie z. B. Hämatoporphyrin, Phthalocyanine, Chlorophylle, Diodeosin, Buckminsterfulleren usw., sowie Derivate dieser Verbindungen mit Substituenten mit 1 bis 50 Atomen, damit die Verbindungen lipophiler oder hydrophiler werden, und/oder als Bindungsgruppen zur Bindung z. B. an ein sbp-Element. Beispiele für andere hierin geeignete Photosensibilisatoren sind jene mit obigen Eigenschaften, die bei N. J. Turro, "Molecular Photochemistry", S. 132, W. A. Benjamin Inc., NY, USA, 1965, aufgelistet sind.
  • Die Photosensibilisatoren sind vorzugsweise relativ apolar, um Auflösung in einem lipophilen Element sicherzustellen, wenn der Photosensibilisator in ein Öltröpfchen, Liposom, Latexteilchen usw. inkorporiert wird.
  • Die hierin geeigneten Photosensibilisatoren können auch andere Substanzen und Zusammensetzungen enthalten, die Singulett-Sauerstoff mit oder – weniger bevorzugt – ohne Aktivierung durch eine externe Lichtquelle erzeugen können. Es wurde z. B. aufgezeigt, dass Molybdat- (MoO4 –) Salze und Chlorperoxidase sowie Myeloperoxidase plus Bromid- oder Chloridion (Kanofsky, J. Biol. Chem. 259, 5596 (1983)) die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Singulett-Sauerstoff und Wasser katalysiert. Beider dieser Zusammensetzungen können beispielsweise in Teilchen enthalten sein, an die ein sbp-Element gebunden ist, und im Test-Verfahren verwendet werden, worin Wasserstoffperoxid als zusätzliches Reagens enthalten ist, Chlorperoxidase an eine Oberfläche gebunden ist und Molybdat in der wässrigen Phase eines Liposoms inkorporiert ist. Im Schutzumfang der Erfindung sind als Photosensibilisatoren auch Verbindungen enthalten, die keine echten Sensibilisatoren sind, die aber bei Anregung durch Wärme, Licht oder chemische Aktivierung ein Molekül von Singulett-Sauerstoff freisetzen. Die bekanntesten Vertreter dieser Kategorie von Verbindungen sind Endoperoxide wie etwa 1,4-Biscarboxyethyl-1,4-naphthalinendoperoxid, 9,10-Diphenylanthracen-9,10-endoperoxid und 5,6,11,12-Tetraphenylnaphthalin-5,12-endoperoxid. Erwärmung oder direkte Absorption von Licht durch diese Verbindungen setzt Singulett-Sauerstoff frei.
  • Träger oder Oberfläche: Oberfläche aus einem porösen oder nichtporösen, wasserunlöslichen Material. Die Oberfläche kann eine beliebige Form aufweisen, z. B. als Streifen, Stab, Teilchen, Perle und dergleichen ausgestaltet sein. Die Oberfläche kann hydrophil sein oder hydrophiliert werden; Beispiele sind anorganische Pulver, wie z. B. Kieselsäure, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermaterialien, insbesondere Cellulosematerialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, z. B. faserhaltige Papiere, z. B. Filterpapier, chromatographisches Papier usw; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlo rid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) usw; entweder alleine oder in Kombination mit anderen Materialien verwendbar; als Bioglas, Keramik, Metalle und dergleichen erhältlich; natürliche oder synthetische Strukturen, wie z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel und Zellen, sind auch geeignet.
  • Die Bindung von sbp-Elementen an die Oberfläche oder den Träger kann durch allgemein bekannte und in der Literatur beschriebene Techniken erfolgen. Siehe z. B. "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970).
  • Die Oberfläche ist üblicherweise polyfunktionell oder kann polyfunktionalisiert werden oder in die Lage gebracht werden, ein Oligonucleotid, ein sbp-Element, einen Photosensibilisator und/oder eine Chemolumineszenzverbindung durch spezifische oder nichtspezifische, kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen zu binden. Es steht eine Vielzahl von funktionellen Gruppen zur Auswahl oder kann inkorporiert werden. Funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen. Die Art der Bindung einer Vielzahl von Verbindungen an Oberflächen ist allgemein bekannt und in der Literatur hinlänglich beschrieben. Siehe z. B. Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Die Länge einer Linkergruppe am Oligonucleotid oder sbp-Element kann stark variieren und hängt von der Beschaffenheit der verknüpften Verbindung, vom Einfluss des Abstands zwischen der verknüpften Verbindung und der Oberfläche sowie von den spezifischen Bindungseigenschaften und dergleichen ab.
  • Teilchen: Teilchen von zumindest etwa 20 nm und höchstens etwa 20 um, üblicherweise zumindest etwa 40 nm und weniger als etwa 10 um, vorzugsweise von etwa 0,10 bis 2,0 um, im Durchmesser mit einem Volumen von normalerweise weniger als 1 pl. Das Teilchen kann organisch oder anorganisch, quellbar oder nichtquellbar, porös oder nichtporös sein, es kann jede beliebige Dichte aufweisen, vorzugsweise jedoch eine ähnliche Dichte wie Wasser, im Allgemeinen von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml, es ist vorzugsweise suspendierbar in Wasser und besteht aus Material, das transparent, teilweise transparent oder undurchsichtig ist. Die Teilchen können eine Ladung aufweisen, und wenn sie geladen sind, sind sie vorzugsweise negativ. Die Teilchen können Feststoffe (z. B. Polymer, Metall, Glas, organische und anorganische Substanzen, wie z. B. Minerale, Salze und Diatome), Öltröpfchen (z. B. Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenstoff, flüssiges Silikon) oder Vesikel sein (z. B. synthetisch wie etwa Phospholipid oder natürlich wie etwa Zellen und Organellen). Die Teilchen können Latexteilen oder andere Teilchen sein, umfassend organische oder anorganische Polymere; Lipiddoppelschichten, z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel; Öltröpfchen; Silikonteilchen; Metallsole; Zellen; und Farbstoffkristallite.
  • Die organischen Teilen sind normalerweise Polymere, entweder Additions- oder Kondensationspoylmere, die leicht im Testmedium dispergierbar sind. Die organischen Teilchen sind auch adsorptiv oder funktionalisierbar, sodass sie an ihre Oberfläche entweder direkt oder indirekt ein sbp-Element binden und an ihre Oberfläche einen Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung binden bzw. sie in ihr Volumen inkorporieren.
  • Die Teilchen können von natürlich vorkommenden Materialien, natürlich vorkommenden Materialien, die synthetisch modifiziert sind, und synthetischen Materialien herrühren. Natürliche oder synthetische Strukturen, wie z. B. Lipiddoppelschichten, z. B. Liposomen und Nicht-Phospholipidvesikel, sind vorzuziehen. Unter den organischen Polymeren von besonderem Interesse sind Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide, z. B. Agarose, die als Sepharose erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose, Stärke und dergleichen; Additionspolymere, wie z. B. Polystyrol, Polyacrylamid, Homopolymere und Copolymere von Derivaten von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Ester und Amide mit freien Hydroxylfunktionalitäten wie etwa Hydrogele und dergleichen. Anorganische Polymere sind Silikone, Glase (erhält lich als Bioglas) und dergleichen. Zu Solen zählen Gold, Selen und andere Metalle. Teilchen können auch wasserunlösliche Farbstoffe, wie z. b. Porphyrine, Phthalocyanine usw. Sein, die auch als Photosensibilisatoren dienen können. Teilchen können auch Diatome, Zellen, virale Teilchen, Magnetosome, Zellkerne und dergleichen sein.
  • Wenn die Teilchen im Handel erhältlich sind, kann die Teilchengröße variiert werden, indem größere Teilchen durch mechanische Mittel, wie z. B. Mahlen, Ultraschallbehandlung, Schütteln usw. zu kleineren Teilchen zerkleinert werden.
  • Die Teilchen sind üblicherweise polyfunktionell oder können polyfunktionalisiert werden oder in die Lage gebracht werden, sich durch spezifische oder nichtspezifische, kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen an ein sbp-Element, einen Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung zu binden. Es steht eine Vielzahl von funktionellen Gruppen zur Verfügung, die auch inkorporiert werden können. Beispiele für funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen. Bei kovalenter Bindung des sbp-Elements, der Chemolumineszenzverbindung oder des Photosensibilisators an das Teilchen ist die Art der Verbindung allgemein bekannt und in der Literatur hinlänglich beschrieben. Siehe z. B. Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Die Länge der Linkergruppe kann stark variieren und hängt von der Beschaffenheit der verknüpften Verbindung, der Beschaffenheit des Teilchens, dem Einfluss des Abstands zwischen der verknüpften Verbindung und dem Teilchen auf die Bindung von sbp-Elementen und den Analyten und dergleichen ab.
  • Der Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung kann so gewählt werden, dass er/sie sich in der Oberfläche der Teilchen löst oder sich nichtkovalent an sie bindet. In diesem Fall sind diese Verbindungen vorzugsweise hydrophob, um ihre Fähigkeit zu verringern, sich vom Teilchen zu dissoziieren und dadurch zu bewirken, dass beide Verbindungen mit dem gleichen Teilchen assoziieren. Diese Möglichkeit kann weiter eingeschränkt werden, indem Teilchen von nur einer Zusammensetzung verwendet werden, die entweder mit dem Photosensibilisator oder der Chemolumineszenzverbindung assoziiert sind, oder indem zwei Arten von Teilchen verwendet werden, die sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung unterscheiden, sodass die Assoziation des Photosensibilisators mit einer Art von Teilchen und die Assoziation der Chemolumineszenzverbindung mit der anderen Art von Teilchen begünstigt wird.
  • Die Anzahl an Photosensibilisator- oder Chemolumineszenzverbindungs-Molekülen, die mit jedem Teilchen assoziiert sind, beträgt durchschnittlich zumindest 1 und kann ausreichend hoch sein, sodass das Teilchen zur Gänze aus Photosensibilisator- oder Chemolumineszenzverbindungs-Molekülen besteht. Die bevorzugte Zahl an Molekülen wird empirisch ermittelt, um das stärkste Signal gegenüber dem Hintergrund im Test zu erzielen. In einigen Fällen wird dies am besten durch Assoziation einer Vielfalt unterschiedlicher Photosensibilisator-Moleküle an Teilchen erreicht. Üblicherweise sollte das Verhältnis zwischen Photosensibilisator oder Chemolumineszenzverbindung und dem sbp-Element in den Teilchen zumindest 1, vorzugsweise zumindest 100 : 1, noch bevorzugter über 1.000 : 1, betragen.
  • Öltröpfchen: Flüssigkeitsteilchen, bestehend aus einer lipophilen Verbindung, die mit einem Emulgator überzogen und stabilisiert ist, der ein amphiphiles Molekül ist, z. B. Phospholipide, Sphingomyelin, Albumin und dergleichen.
  • Die Phospholipide basieren auf aliphatischen Carbonsäureestern aliphatischen Polyole, worin zumindest eine Hydroxylgruppe mit einem Carbonsäureester von etwa 8 bis 365, noch häufiger etwa 10 bis 20, Kohlenstoffatomen substituiert ist, die 0 bis 3, noch häufiger 0 bis 1, Stellen ethylenischer Unsättigungen und zumindest 1, normalerweise nur 1, Hydroxylgruppe, die mit Phosphat substituiert ist, um einen Phosphatester zu bilden, aufweisen können. Die Phosphatgruppe kann außerdem mit kleinen aliphatischen Verbindungen substituiert sein, die Di- oder höhere Funktionalität besitzen, im Allgemeinen mit Hydroxyl- oder Aminogruppen.
  • Die Öltröpfchen können in Einklang mit herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, indem die geeigneten lipophilen Verbindungen mit einem anionischen, kationischen oder nicht-ionogenen Tensid kombiniert werden, worin das Tensid in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.-%, noch häufiger 0,1 bis 2 Gew.-%, des Gemisches vorhanden ist, und das Gemisch in einem wässrigen Medium durchmischt wird, z. B. durch Ultraschallbehandlung oder Rühren. Beispiele für lipophile Verbindungen sind Kohlenwasserstofföle, Halogenkohlenstoffe wie etwa Fluorkohlenstoffe, Alkylphthalate, Trialkylphosphate, Triglyceride.
  • Ein sbp-Element ist üblicherweise an die Oberfläche des Öltröpfchens adsorbiert oder direkt oder indirekt an eine Oberflächenkomponente des Öltröpfchens gebunden. Das sbp-Element kann in die flüssigen Teilchen entweder während oder nach der Herstellung derselben inkorporiert werden. Das sbp-Element ist normalerweise in einer Menge von etwa 0,5 bis 100, häufiger 1 bis 90, noch häufiger etwa 5 bis 80, vorzugsweise etwa 50 bis 100, Mol-% der auf der Teilchenoberfläche vorhandenen Moleküle vorhanden.
  • Es folgt eine lediglich veranschaulichende und keinesfalls einschränkende Liste amphiphiler Verbindungen, die zur Stabilisierung der Öltröpfchen verwendet werden können: Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylchlolin, Phosphatidylserin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylcholin, Diapalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidinsäure, Cardiolipin, Lecithin, Galactocerebrosid, Sphingomyelin, Dicetylphosphat, Phosphatidylinosit, 2-Trihexadecylammoniumethylamin, 1,3-Bis(octadecylphosphat)propanol, Stearoyloxyethylenphosphat, Phospholipide, Dialkylphosphate, Natriumdodecylsulfat, kationische Detergenzien, anionische Detergenzien, Proteine, wie z. B. Albumin, nichtionogene Detergenzien usw.
  • Es können auch andere Verbindungen verwendet werden, die lipophile Gruppen aufweisen und bereits beschrieben wurden. Zumeist sind diese Verbindungen Alkylbenzole mit Alkylgruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, üblicherweise Gemische von Al kylgruppen, die unverzweigt oder verzweigt sein können, umfassend eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Polyoxyalkylengruppe (Alkylen von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen), Carbonsäuregruppe, Sulfonsäuregruppe oder Aminogruppe. Es können aliphatische Fettsäuren verwendet werden, die normalerweise etwa 10 bis 36, noch häufiger etwa 12 bis 20, Kohlenstoffatome besitzen. Fettalkohole mit denselben Kohlenstoffgrenzen wie für die Fettsäuren, Fettamine mit ähnlichen Kohlenstoffgrenzen und verschiedene Steroide kommen ebenfalls in Frage.
  • Die Öltröpfchen können ein Fluorkohlenstofföl oder ein Silikonöl (Silikonteilchen) umfassen. Solche Tröpfchen werden von Giaever in den US-Patenten 4.634.681 und 4.619.904 beschrieben, deren Offenbarung hierin zur Gänze aufgenommen ist. Diese Tröpfchen werden durch Dispergieren eines Fluorkohlenstofföls oder Silikonöls in einer wässrigen Phase gebildet. Die Tröpfchen werden hergestellt, indem eine geringe Menge des ausgewählten Öls (im Allgemeinen sind solche Öle im Handel erhältlich) in einen Behälter mit einer größeren Menge der wässrigen Phase eingebracht wird. Das flüssige System wird durchmischt, um Emulgierung zu bewirken, und dann zentrifugiert. Die homogene Phase wird entfernt, und die restlichen Tröpfchen werden in einem wässrigen gepufferten Medium resuspendiert. Die obigen Zentrifugations- und Dekantierungsschritte können ein- oder mehrmals wiederholt werden, bevor die Tröpfchen verwendet werden.
  • spb-Elemente können in unterschiedlicher Weise an Tröpfchen gebunden werden. Wie von Giaever beschrieben kann das jeweilige sbp-Element, insbesondere ein proteinhältiges sbp-Element, auf die Tröpfchen aufgebracht werden, indem ein Überschuss des sbp-Elements vor oder nach dem Emulgationsschritt in das wässrige Medium eingebracht wird. Waschschritte tragen dazu bei, überschüssiges sbp-Element zu entfernen. Die Funktionalisierung des Öls führt die oben beschriebenen Funktionalitäten ein, um Bindung an sbp-Elemente zu bewirken. Solche Funktionalitäten können auch dazu dienen, die Tröpfchen an einen Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung zu binden. Andernfalls wird der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbin dung häufig so gewählt, dass er/sie der Ölphase des Öltröpfchens löslich ist und nicht kovalent gebunden wird. Wenn das Öl ein Fluorkohlenstoff ist, sind ein fluorierter Photosensibilisator oder eine fluorierte Chemolumineszenzverbindung oft besser löslich als das entsprechende nichtfluorierte Derivat.
  • Andere von Giaever beschriebene Öltröpfchen finden in der Erfindung ebenfalls Anwendung.
  • Liposomen: Mikrovesikel mit etwa kugelförmiger Gestalt, die eines der bevorzugten Materialien zur Verwendung in der Erfindung sind. Die Liposomen besitzen einen Durchmesser, der zumindest etwa 20 nm und höchstens etwa 20 μm beträgt, üblicherweise zumindest etwa 40 nm und weniger als ewta 10 μm. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser der Liposomen weniger als etwa 2 μm, um das Absetzen oder die Flotation zu begrenzen.
  • Die äußere Hülle eines Liposoms besteht aus einer amphiphilen Doppelschicht, die ein Wasservolumen oder eine wässrige Lösung einschließt. Liposomen mit mehr als einer Doppelschicht werden als multilamellare Vesikel bezeichnet. Liposomen mit nur einer Doppelschicht werden als unilamellare Vesikel bezeichnet. Multilamellare Vesikel sind hierin vorzuziehen, wenn ein lipophiler Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung verwendet wird, da sie die Fähigkeit aufweisen, größere Mengen dieser Materialien zu inkorporieren als unilamellare Vesikel. Die amphiphile Doppelschicht besteht häufig aus Phospholipiden. Phospholipide, die bei der Herstellung hierin geeigneter Teilchen Anwendung finden, können jedes beliebige Phospholipid oder Phospholipidgemisch sein, das sich in natürlichen Membranen befindet, z. B. Lecithin oder synthetische Glycerylphosphatdiester gesättiger oder ungessätigter linearer Fettsäuren mit 12 oder 24 Kohlenstoffen, worin das Phosphat als Monoester oder als ein Ester eines polaren Alkohols vorhanden ist (z. B. Ethanolamin, Cholin, Inosit, Serin, Glycerin und dergleichen). Besonders bevorzugte Phospholipide sind L-α-Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin (POPG), L-α-Dioleoylphosphatidyl glycerin, L-α-(Dioleoyl)phosphatidylethanolamin (DOPE) und L-α-(Dioleoyl)phosphatidyl-β-(4-N-maleiidomethyl)cyclohexan-l-carboxyamido)ethanol (DOPE-MCC).
  • Die Phospholipide in der Doppelschicht können mit Cholesterin ergänzt und mit anderen amphiphilen Verbindungen ersetzt sein, die eine polare Kopfgruppe (üblicherweise geladen) und einen hydrophoben Abschnitt umfassen, der üblicherweise aus zwei linearen Kohlenwasserstoffketten bestehen. Beispiele für solche Substituenten sind Dialkylphosphat, Dialkoxypropylphosphate, worin die Alkylgruppen lineare Ketten von 12 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen, N-(2,3-Di(9-(Z)-octadecenyloxy))prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), wie dies in US-A-4.897.355 vom 30. Januar 1990 geoffenbart ist, die hierin durch Verweis aufgenommen ist, Sphingomyelin, Cardiolipin und dergleichen.
  • Hierin verwendete Liposomen besitzen vorzugsweise eine hohe negative Ladungsdichte, um die Suspension zu stabilisieren und spontane Aggregation zu verhindern.
  • Bei der Verwendung in der Erfindung sollten die Liposomen in der Lage sein, sich an ein sbp-Element zu binden und einen Photosensibilisator oder eine Chemolumineszenzverbindung aufzuweisen, die entweder mit der wässrigen oder der nichtwässrigen Phase assoziiert sind. Die in der Erfindung verwendeten Liposomen besitzen üblicherweise an die Außenfläche des Lipidvesikels gebundene sbp-Elemente.
  • Liposomen können durch eine Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, z. B. durch Hydratation und mechanische Dispersion von getrocknetem Phospholipid oder Phospholipid-Substitut in einer wässrigen Lösung. Auf diese Weise hergestellte Liposomen weisen eine Vielzahl von Dimensionen, Zusammensetzungen und Verhaltensweisen auf. Ein Verfahren zur Reduktion der Heterogenität und Inkonsistenz des Verhaltens mechanisch dispergierter Liposomen ist Ultraschallbehandlung. Ein solches Verfahren verringert die mittlere Liposomengröße. Alternativ dazu eignet sich Extrusion als letzter Schritt während der Produktion der Liposomen. US-A-4.529.561 offenbart ein Verfahren zum Extru dieren von Liposomen unter Druck durch eine Membran mit gleichmäßiger Porengröße, um die Größeneinheitlichkeit zu verbessern.
  • Die Herstellung von Liposomen mit einem hydrophoben oder amphiphilen Photosensibilisator oder einer Chemolumineszenzverbindung, gelöst in der Lipiddoppelschicht, kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, z. B. gemäß dem von Olsen et al., Biochemica et Biophysica Acta 557(9), 1979, beschriebenen Verfahren. Zusammenfassend gesagt wird ein Gemisch von Lipiden, umfassend die geeignete Verbindung in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, zu einem dünnen Film an den Wänden eines Glasgefäßes getrocknet. Der Lipidfilm wird durch Durchmischen oder Rühren in einem geeigneten Puffer hydriert. Anschließend wird die Lipidsuspension durch eine Reihe von Polycarbonat-Filtermembranen mit immer kleinere Porengrößen extrudiert, wie z. B. 2,0, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 und 0,2 μm. Wiederholte Filtration durch einen beliebigen dieser Filter, insbesondere durch den kleinsten Filter, ist günstig. Die Liposomen können beispielsweise durch Gelfiltration gereinigt werden, z. B. durch eine Säule aus Sephacryl S-1000. Die Säule kann mit Puffer eluiert werden, und die Liposomen können gesammelt werden. Kalte Lagerung verlängert die Lagerbeständigkeit der durch dieses Verfahren erzeugten Liposomen. Alternativ dazu kann der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung der Lipidsuspension nach der Produktion der Liposomen zugegesetzt werden.
  • Die Markierung von Tröpfchen und Liposomen umfasst oft z. B. den Einschluss von Thiol oder Maleimid oder Biotingruppen auf den Molekülen, die die Lipiddoppelschicht enthalten. Photosensibilisatoren, Chemolumineszenzmolekküle oder sbp-Elemente können dann durch Reaktion der Teilchen mit einem dieser Materialien, das an ein Sulfhydryl-Reagens, eine Sulfhydrylgruppe bzw. Avidin gebunden ist, an die Oberfläche gebunden werden. Sulfhydryl-reaktive Gruppen sind z. B. Alkylierungsreagenzien, wie z. B. Bromacetamid und Maleimid.
  • sbp-Elemente können durch schwache hydrophobe Wechselwirkungen an die Oberfläche der Liposomteilchen gebunden werden, doch solche Wechselwirkungen sind im Allgemeinen nicht ausreichend, um der Scherkraft während der Inkubation und des Waschens standzuhalten. Es ist vorzuziehen, sbp-Elemente kovalent an ein Liposomteilchen zu binden, das z. B. mittels DOPE-MCC funktionalisiert wurde (siehe oben), indem das Liposom mit dem mit einer Mercaptangruppe funktionalisierten ausgewählten sbp-Element kombiniert wird. Wenn beispielsweise das sbp-Element ein Antikörper ist, kann es mit S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMSA) umgesetzt und hydrolysiert werden, um einen Sulfhydryl-modifizierten Antikörper bereitzustellen.
  • Latexteilchen: Latex bezieht sich auf ein teilchenförmiges, in Wasser suspendierbares, wasserunlösliches polymeres Material, üblicherweise mit Teilchendimensionen von 20 nm bis 20 mm, noch bevorzugter 100 bis 1000 nm, im Durchmesser. Der Latex ist häufig ein substituiertes Polyethylen, wie z. B. Poly(styrol-butadien), Polyacrylamid-Polystyrol, Polystyrol mit Aminogruppen, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Acrylnitril-Butadien, Syrolcopolymere, Polyvinylacetatacrylat, Polyvinylpyrridin, Vinylchloridacrylat-Copolymere und dergleichen. Nichtvernetzte Polymere von Styrol und carboxyliertem Styrol oder mit anderen aktiven Gruppen, wie z. B. Amino, Hydroxyl, Halogen und dergleichen, funktionalisiertem Styrol sind vorzuziehen. Häufig werden Copolymere substituierter Styrole mit Dienen, wie z. B. Butadien, verwendet.
  • Die Assoziation des Photosensibifisators oder der Chemolumineszenzverbindung mit hierin verwendeten Latexteilchen kann Inkorporation während der Bildung der Teilchen durch Polymerisation umfassen, umfasst aber üblicherweise Inkorporation in vorgeformte Teilchen, üblicherweise durch nichtkovalente Lösung in den Teilchen. Üblicherweise wird eine Lösung der Chemolumineszenzverbindung oder des Sensibilisators verwendet. Geeignete Lösungsmittel sind Alkohole, z. B. Ethanol, Ehtylenglykol und Benzylalkohol; Amide, wie z. B. Dimethylformamid, Formamid, Acetamid und Tetramethylharnstoff und dergleichen; Sulfoxide, wie z. B. Dimethylsulfoxid und Sulfolan; und Ether, wie z. B. Carbitol, Ethylcarbitol, Dimethoxyethan und dergleichen; sowie Wasser. Die Verwendung von Lösungsmitteln mit hohen Siedepunkten, in denen die Teilchen unlöslich sind, erlaubt hohe Temperaturen, um das Auflösen der Verbindungen in den Teilchen zu erleichtern; diese Anwendung ist besonders wünschenswert. Die Lösungsmittel können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Besonders bevorzugte Lösungsmittel zum Inkorporieren von Photosensibilisator sind jene, die den angeregten Triplett-Zustand des Photosensibilisators nicht quenchen – entweder aufgrund ihrer inhärenten Eigenschaften, oder weil sie anschließend aus den Teilchen entfernt werden können (aufgrund ihrer Fähigkeit, in einem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser, das in den Teilchen unlöslich ist, gelöst zu werden). Aromatische Lösungsmittel sind vorzuziehen, im Allgemeinen Lösungsmittel, die im Teilchen löslich sind. Für das Inkorporieren von Chemolumineszenzverbindungen in Teilchen sollte ein Lösungsmittel gewählt werden, das aufgrund seiner inhärenten Eigenschaften oder seiner Fähigkeit, aus den Teilchen entfernbar zu sein, die Lumineszenz nicht beeinträchtigt. Häufig sind aromatische Lösungsmittel vorzuziehen. Typische aromatische Lösungsmittel sind Dibutylphthalat, Benzonitril, Naphthonitril, Dioctylterephthalat, Dichlorbenzol, Diphenylether, Dimethoxybenzol usw.
  • Außer wenn der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung kovalent an die Teilchen zu binden ist, ist es üblicherweise vorzuziehen, elektronisch neutrale Photosensibilisatoren oder Chemolumineszenzverbindungen zu verwenden. Es ist vorzuziehen, dass das gewählte flüssige Medium die Polymerperlen nicht bis zur Klebrigkeit erweicht. Eine bevorzugte Technik umfasst das Suspendieren der gewählten Latexteilchen in einem flüssigen Medium, in dem der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung zumindest begrenzte Löslichkeit aufweist. Vorzugsweise werden die Konzentrationen des Photosensibilisators und der Chemolumineszenzverbindung in flüssigen Medien so gewählt, dass Teilchen entstehen, die den höchsten Wirkungsgrad von Singulett-Sauerstoff-Bildung und die höchste Quantenausbeute der Emission aus der Chemolumineszenzverbindung in Medien aufweisen, doch es sind weniger konzentrierte Lösungen manchmal vorzuziehen. Verformung oder Auflösung der Teilchen im Lö sungsmittel kann durch Zugabe eines mischbaren Co-Lösungsmittels, in dem die Teilchen unlöslich sind, vermieden werden.
  • Im Allgemeinen wird die während des Verfahrens herrschende Temperatur so gewählt, dass die Fähigkeit der mit Photosensibilisator markierten Teilchen, Singulett-Sauerstoff zu bilden, und die Quantenausbeute der Chemolumineszenzverbindungs-Teilchen maximiert werden, mit der Maßgabe, dass die Teilchen bei der gewählten Temperatur nicht schmelzen oder aggregieren sollten. Es herrschen normalerweise erhöhte Temperaturen. Die Temperaturen des Verfahrens reichen im Allgemeinen von 20°C bis 200°C, noch häufiger von 50°C bis 170°C. Es wurde beobachtet, dass einige Verbindungen, die bei Raumtemperatur fast unlöslich sind, z. B. in niedermolekularen Alkoholen wie etwa Ethanol und Ethylenglykol bei erhöhten Temperaturen und dergleichen löslich sind. Carboxylierte modifizierte Latexteilchen tolerieren – wie aufgezeigt wurde – bei solchen Temperaturen niedermolekulare Alkohole.
  • Ein sbp-element kann physikalisch an die Oberfläche des Latexteilchens adsorbiert oder kovalent an das Teilchen gebunden werden. In Fällen, wo das sbp-Element nur schwach an die Oberfläche des Latex-Teilchens gebunden ist, kann die Bindung in bestimmten Situationen den während der Inkubation und der Waschungen herrschenden Scherkräften zwischen den Teilchen möglicherweise nicht standhalten. Daher kann es vorzuziehen sein, sbp-Elemente unter Bedingungen, die Adsorption minimieren, kovalent an die Latexteilchen zu binden. Dies kann durch chemisches Aktivieren der Latexoberfläche erfolgen. Beispielsweise können N-Hydroxysuccinimidester von Oberflächen-Carboxylgruppen gebildet werden, und die aktivierten Teilchen zur Reduktion nichtspezifischer Bindung von Testkomponenten an die Teilchenoberfläche werden dann mit einem Linker, der Aminogruppen aufweist, die mit den Estergruppen reagieren, oder direkt mit einem eine Aminogruppe besitzenden sbp-Element in Kontakt gebracht. Der Linker wird üblicherweise so gewählt, dass er nichtspezifische Bindung von Testkomponenten an die Teilchenoberfläche reduziert, und sorgt vorzugsweise für geeignete Funktionalität für die Bindung des Latexteilchens und des sbp-Elements. Zweckmäßige Materialien sind maleimidiertes Aminodextran (MAD), Polylysin, Aminosaccharide und dergleichen. MAD kann gemäß dem Verfahren von Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75(7), 3143 (1978), gebildet werden.
  • In einem Verfahren wird MAD unter Einsatz eines wasserlöslichen Carbodiimids, z. B. von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, zunächst an Carboxyl-enthaltende Latexteilchen gebunden. Die beschichteten Teilchen werden dann in Reagenzien äquilibriert, um nichtspezifische Bindung zu verhindern. Solche Reagenzien enthalten Proteine wie etwa Rinder-Gamma-Globulin (BGG) und Detergens wie etwa Tween 20, TRI-TON X-100 und dergleichen. Ein sbp-Element, das eine Sulfhydrylgruppe aufweist oder in geeigneter Weise modifiziert ist, um eine Sulfhydrylgruppe einzuführen, wird dann einer Suspension der Teilchen zugesetzt, woraufhin eine kovalente Bindung zwischen dem sbp-Element und MAD auf den Teilchen entsteht. Jedes überschüssige unreagierte sbp-Element kann dann durch Waschen entfernt werden.
  • Metallsole: Jene Teilchen, die aus einem Schwermetall bestehen, d. h. ein Metall mit einer Ordnungszahl von mehr als 20, etwa Metalle der Gruppe IB, z. B. Gold oder Silber oder Chalcogene, wie z. B. Selen oder Tellur.
  • Metallsolteilchen werden beispielsweise von Leuvering in der US-A-4.313.734 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Verweis zur Gänze aufgenommen ist. Zu solchen Solen zählen eine kolloidale wässrige Dispersion eines Metalls, einer Metallverbindung oder von Polymerkernen, die mit einem Metall oder einer Metallverbindung beschichtet sind.
  • Die Metallsole können Metalle oder Metallverbindungen sein, z. B. Metalloxide, Metallhydroxide und Metallsalze, oder aus mit Metallen oder Metallverbindungen beschichteten Polymerkernen bestehen. Beispiele für derartige Metalle sind Platin, Gold, Silber, Quecksilber, Blei, Palladium und Kupfer; Beispiele für solche Metallverbindungen sind Silberiodid, Silberbromid, wässriges Kupferoxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid oder wässri ges -oxid, Chromhydroxid oder wässriges -oxid, Vanadiumoxid, Arsensulfid, Manganhydroxid, Bleisulfid, Quecksilbersulfid, Bariumsulfat und Titandioxid. Im Allgemeinen können geeignete Metalle oder Metallverbindungen mittels bekannter Techniken festgestellt werden.
  • Es ist manchmal vorteilhaft, Sole zu verwenden, die aus dispergierten Teilchen bestehen, die mit den oben erwähnten Metallen oder Metallverbindungen beschichtete Polymerkerne enthalten. Diese Teilchen besitzen ähnliche Eigenschaften wie die dispergierte Phase reiner Metalle oder Metallverbindungen, doch Größe, Dichte und Metallkontakt können optimal kombiniert werden.
  • Die Metallsolteilchen können gemäß unterschiedlicher an sich bekannter Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise bezieht sich zur Herstellung eines Goldsols Leuvering auf einen Artikel von G. Frens, Nature Physical Science 241, 20 (1973).
  • Die Metallsolteilchen können modifiziert werden, um verschiedene funktionelle Gruppen (s. o.) zur Verbindung mit einem sbp-Element, einem Photosensibilisator oder einer Chemolumineszenzverbindung zu enthalten. Beispielsweise können polymere Bindemittel dazu dienen, die Teilchen zu beschichten, z. B. Polymere, die Thiolgruppen enthalten, die sich fest an viele Schwermetalle binden, oder Silylierungsmittel, die sich an Polymerbeschichtungen binden und diese bilden können, z. B. durch Reaktion von Metallteilchen mit Trialkoxyaminoalkylsilanen; siehe EPO 84400952.2 von Advanced Magnetics über die Beschichtung magnetischer Teilchen.
  • Farbstoffkristallite: Mikrokristalle reiner oder vermischter, fester, wasserunlöslicher Farbstoffe, vorzugsweise von Farbstoffen, die als die oben beschriebenen Photosensibilisatoren dienen können. Die hierin geeigneten Farbstoffkristallite weisen eine Größe im Bereich von 20 nm bis 20 μm auf.
  • Ein Verfahren zur Herstellung von Farbstoffkristalliten ist im US-Patent 4.373.932 (Gribnau et al.) beschrieben, dessen Offenbarung hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen ist. Gribnau beschreibt kolloidale Farbstoffteilchen und wässrige Dispersionen eines hydrophoben Farbstoffs oder Pigments, der/das eine immunchemisch reaktive sowie direkt oder indirekt gebundene Komponente aufweisen kann. Die Farbstoffteilchen werden im Allgemeinen durch Dispergieren eines Farbstoffs in Wasser und anschließendes Zentrifugieren hergestellt. Ein Farbstoffpellet wird erhalten und in Wasser resuspendiert, dem Glasperlen zugegeben werden. Diese Suspension wird mehrere Tage lang bei Raumtemperatur gewalzt. Die Flüssigkeit wird dekantiert und zentrifugiert, und die Farbstoffteilchen werden nach Absaugen der Flüssigkeit erhalten.
  • Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Farbstoffkristalliten umfasst die langsame Zugabe einer Lösung des Farbstoffs in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu Wasser. Ein weiteres Verfahren sieht die Ultraschallbehandlung einer Suspension des festen Farbstoffs in Wasser vor.
  • Die Bindung von sbp-Elementen an die Farbstoffteilchen kann durch direkte oder indirekte Adsorption oder kovalente chemische Bindung erzielt werden. Das letztere Verfahren wird durch die Gegenwart geeigneter funktioneller Gruppen in jedem beliebigen Beschichtungsmaterial und im Farbstoff bestimmt. Beispielsweise können funktionelle Gruppen auf die Oberfläche des Farbstoffkristallits aufgebracht werden, indem eine Verbindung, die eine diazotierte aromatische Aminogruppe und die gewünschte funktionelle Gruppe enthält, an eine Phenol- oder Anilingruppe des Farbstoffs gekoppelt wird.
  • Wenn der Farbstoff eine Carboxylgruppe besitzt, kann der Farbstoffkristallit durch ein Carbodiimid aktiviert und an eine primäre Aminokomponente gekoppelt werden. Aliphatische primäre Aminogruppen und Hydroxylgruppen können z. B. durch Bromcyan oder Halogen-substituierte Di- oder Triazine aktiviert werden, woraufhin die Bindung mit einer primären Aminokomponente oder mit z. B. einer eine -SH- oder -ON-Gruppe enthaltenden Komponente stattfinden kann. Es können auch bifunktionelle reaktive Ver bindungen verwendet werden. Beispielsweise kann Glutaralhdeyhd für die gegenseitige Kopplung primärer Aminokomponenten des Farbstoffs und eines sbp-Elements verwendet werden, und es kann z. B. ein heterobifunktionelles Reagens wie etwa N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat zur Kopplung einer primären Aminokomponente an eine eine Thiolgruppe enthaltende Komponente verwendet werden.
  • Chemolumineszenzverbindung: Eine Substanz, die eine chemische Reaktion mit Singulett-Sauerstoff erfährt, um ein metastabiles Zwischenprodukt zu bilden, das sich mit der gleichzeitigen oder anschließenden Emission von Licht innerhalb des Wellenlängenbereichs von 250 bis 1200 nm zersetzen kann. Die Emission tritt üblicherweise ohne die Gegenwart eines Energieakzeptors oder Katalysators ein, um Zersetzung und Lichtemission zu bewirken. Vorzugsweise zersetzt sich das Zwischenprodukt spontan ohne Erhitzung oder Zugabe zusätzlicher Reagenzien nach seiner Bildung. Die Zugabe eines Reagens nach der Bildung des Zwischenprodukts oder das Vorsehen erhöhter Temperaturen zwecks Beschleunigung der Zersetzung ist allerdings für einige Chemolumineszenzverbindungen erforderlich. Die Chemolumineszenzverbindungen sind üblicherweise elektronenreiche Verbindungen, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, häufig unter Bildung von Dioxetanen oder Dioxetanonen. Beispiele für solche Verbindungen sind Enolether, Enamine, 9-Alkylidenxanthane, 9-Alkyliden-N-alkylacridane, Arylvinylether, Dioxene, Arylimidazole und Lucigenin. Andere Chemolumineszenzverbindungen liefertn nach Reaktion mit Singulett-Sauerstoff Zwischenprodukte, die anschließend unter Lichtemission mit anderen Reagenzien reagieren. Beispiele für solche Verbindungen sind Hydrazide wie etwa Luminol und Oxalatester.
  • Die Chemolumineszenzverbindungen von Interesse zeigen im Allgemeinen Emission bei Wellenlängen von über 300 nm, üblicherweise über 400 nm. Verbindungen, die alleine oder gemeinsam mit einem Fluoreszenzmolekül Licht mit Wellenlängen außerhalb jenes Bereichs emittieren, in dem Serumkomponenten Licht absorbieren, sind hierin besonders geeignet. Die Fluoreszenz von Serum fällt über 500 nm rasch ab und wird über 550 nm relativ insignifikant. Wenn daher der Analyt in Serum vorliegt, sind Che molumineszenzverbindungen, die Licht über 550 nm, vorzugsweise über 600 nm, emittieren, von besonderem Interesse. Um Autosensibilisierung der Chemolumineszenzverbindung zu vermeiden, ist es vorzuziehen, dass die Chemolumineszenzverbindungen kein Licht absorbieren, das zum Anregen des Photosensibilisators dient. Da es im Allgemeinen vorzuziehen ist, den Sensibilisator mit längeren Lichtwellenlängen als 500 nm anzuregen, ist es wünschenswert, dass die Lichtabsorption durch die Chemolumineszenzverbindung ganz knapp über 500 nm erfolgt.
  • Wenn langwellige Emission der Chemolumineszenzverbindung gewünscht ist, kann ein Emitter mit langer Wellenlänge wie etwa Pyren (gebunden an die Chemolumineszenzverbindung) verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Fluoreszenzmolekül im die Chemolumineszenzverbindung enthaltenden Medium vorgesehen sein. Bevorzugte Fluoreszenzmoleküle werden durch die aktivierte Chemolumineszenzverbindung angeregt und senden eine längere Wellenlänge aus als die Emissionswellenlänge der Chemolumineszenzverbindung (üblicherweise mehr als 550 nm). Es ist üblicherweise auch vorteilhaft, dass die Fluoreszenzmoleküle bei den Wellenlängen des zur Aktivierung des Photosensibilisators verwendeten Lichts nicht absorbieren. Beispiele für geeignete Farb-stoffe sind Rhodamin, Ethidium, Dansyl, Eu(fod)3, Eu(TTA)3, Ru(bpy)3 ++ (worin bpy = 2,2'-Dipyridyl) usw. Im Allgemeinen dienen diese Farbstoffe als Akzeptoren in Energietransferprozessen, weisen vorzugsweise hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten auf und reagieren nicht rasch mit Singulett-Sauerstoff. Sie können gleichzeitig mit der Inkorporation der Chemolumineszenzverbindung in die Teilchen in diese inkorporiert werden.
  • Die elektronenreichen Olefine besitzen im Allgemeinen eine Elektronen-spendende Gruppe in Konjugation mit dem Olefin:
    Figure 00620001
    worin A eine Elektronen-spendende Gruppe ist, z. B. N(D)2, OD, p-[C6H4N(D)2]2, Furanyl, N-Alkylimidazol, N-Alkylpyrrolyl, 2-Indolyl usw., worin D z. B. Alkyl oder Aryl sein kann und A entweder direkt an den Olefinkohlenstoff oder durch die unmittelbare Nähe anderer konjugierter Doppelbindungen gebunden ist. Die anderen Valenzen der C-Atome in Olefin 1 sind Substituenten mit 1 bis 50 Atomen, die gemeinsam einen oder mehrere Ringe bilden können, die fusioniert oder nichtfusioniert sind, z. B. Cycloalkyl, Phenyl, 7-Norbonyl, Naphthyl, Anthracyl, Acridanyl, Adamantyl usw.
  • Hierin geeignete Enolether weisen im Allgemeinen die folgende Struktur auf:
    Figure 00630001
    worin die Reste D1 unabhängig voneinander sind und aus der aus N und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, vorzugsweise Aryl, Hydroxyaryl, Aminoaryl, t-Alkyl, H, Alkoxy, Heteroaryl usw.; sie können auch mit einem oder beiden Kohlenstoffatomen kombiniert werden, um einen Ring, wie z. B. Cycloalken, Adamantyliden, 7-Norbornyliden und dergleichen, zu bilden; D2 ist vorzugsweise Alkyl oder Aryl. Beispiele für Enolether sind u. a. 2,3-Diaryl-4,5-dihydrodioxene:
    Figure 00630002
    worin X = 0, S oder ND2 ist und Ar und Ar' Aryl sind, z. B. substituiertes Aryl, worin zumindest ein Substituent als Amino-, Ether- oder Hydroxylgruppe vorhanden ist.
  • 9-(Dialkoxymethyleiden)xanthen:
    Figure 00640001
  • Alkoxyvinylpyren:
    Figure 00640002
  • 9-Alkoxymethyliden-l0-alkylacridan:
    Figure 00640003
  • Hierin geeignete Vinylsulfide enthalten im Allgemeinen die oben erwähnten Enolether, worin das Sauerstoffatom durch ein Schwefelatom ersetzt ist.
  • Hierin geeignete Enamine besitzen im Allgemeinen folgende Struktur:
    Figure 00650001
    worin die Reste D3 unabhängig voneinander Alkyl oder Aryl sein können und die übrigen Substituenten auf dem Olefin aus der Gruppe bestehend aus H und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen, vorzugsweise Aryl, Hydroxyaryl, Aminoaryl, t-Alkyl, H, Alkoxy, Heteroaryl usw., ausgewählt sind.
  • Beispiele für Enamine sind u. a.
  • Dialkylaminovinylpyren:
    Figure 00650002
  • Dialkylaminovinyl-9,10-diphenylanthracen
    Figure 00650003
    worin φ = Phenyl ist, usw.
  • 9-Alkyliden-N-alkylacridane besitzen im Allgemeinen folgende Struktur:
    Figure 00660001
    worin D4 Alkyl ist und die übrigen Substituenten auf dem Olefin aus der Gruppe bestehend aus H und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen ausgewählt ist, vorzugsweise Aryl, Alkoxyaryl, Aminoaryl, t-Alkyl, N, Alkoxy, Heteroaryl usw; sie können kombiniert werden, um einen Ring zu bilden wie etwa Adamantyl, Cyclophentyl, 7-Norbornyl und dergleichen. Beispiele für Acridane sind u. a. substituiertes 9-Benzyliden-l0-methylacridan und 9-Diphenylmethylen-l0-methylacridan (beschrieben bei Singer et al., J. Am. Chem. Soc. 102, 3823 (1983); und McCapra, Chem. Comm. 944 (1977)), 9-Methyliden-l0-methylacridane (beschrieben bei E. White, Chem. Letters 1491 (1979)).
  • Dioxetane werden durch die Reaktion von Singulett-Sauerstoff mit der chemiluneralen Struktur gebildet, worin die Substituenten auf den C-Atomen jene sind, die auf dem entsprechenden Olefin vorhanden sind:
    Figure 00660002
    von denen sich einige spontan zersetzen; andere werden durch Erhitzen und/oder Katalyse, üblicherweise durch einen elektronenreichen Energieakzeptor, unter Lichtemission gebildet. In einigen Fällen wird das Dioxetan spontan in ein Hydroperoxid umgewandelt, woraufhin ein basischer pH-Wert erforderlich ist, um das Dioxetan zu reformieren und Zersetzung und Lichtemission zu ermöglichen.
  • Eine weitere Familie von Chemolumineszenzverbindungen sind 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione. Die beliebteste Verbindung ist Luminol, die 5-Aminoverbindung. Andere Familienmitglieder sind das substituierte 6-Amino-, 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamino[ca]benz-Analog. Diese Verbindungen werden durch Singulett-Sauerstoff in einer aus mehreren Schritten bestehenden Reaktion oxidiert, die zur Zersetzung mit Bildung eines Phthalatderivats und Lichtemission führt.
  • Eine weitere Familie von Chemolumineszenzverbindungen sind die 2,4,5-Triphenylimidazole, wobei Lophin der gängige Name für die Stammverbindung ist. Chemolumineszenzanaloge umfassen p-Dimethylamino- und -Methoxysubstituenten.
  • Die, nächste Gruppe von Chemolumineszenzverbindungen umfasst Bisarylen-Verbindungen, z. B. bis-9,9'-Acridyliden und das 10,10'-Dimethylderivat davon (beschrieben von Singer, J. Org. Chem. 41, 2685 (1976)), Lucigenin und Bis-9,9'-xanthylidin.
  • Andere Chemolumineszenzverbindungen, die die obigen Anforderungen erfüllen, finden sich in der EP-A-0.345.776 vom 13. Dezember 1989.
  • Photochemisch aktivierbare Chemolumineszenzverbindung (PACC): Eine Substanz, die mit Singulett-Sauerstoff reagiert, um ein metastabiles Reaktionsprodukt zu bilden, das zur Zersetzung unter gleichzeitiger oder anschließender Lichtemission, üblicherweise in einem Wellenlängenbereich von 250 bis 1200 nm, fähig ist. Der Ausdruck "photoaktivierbar" umfasst auch "photochemisch aktivierbar". Hierin bevorzugte PACCs sind jene, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, um Dioxetane oder Dioxetanone zu bilden. Die Letzteren sind üblicherweise elektronenreiche Olefine. Beispiele für derartige elektronenreiche Olefine sind Enolether, Enamine, 9-Alkyliden-N-alkylacridane, Arylvinylether, Dioxene, Arylimidazole, 9-Alkylidenxanthane und Lucigenin. Andere Verbindungen, die auch unter die Kategorie "PACC" fallen, sind Luminol und andere Phthalhydrazide sowie Chemolumineszenzverbindungen, die aufgrund einer photochemisch labilen Schutzgruppe davor geschützt sind, eine Chemolumineszenzreaktion zu erfahren, wo bei solche Verbindungen z. B. Glühwürmchen-Luciferin, Aquaphorin, Luminol usw. sind.
  • Die PACCs von Interesse emittieren vorzugsweise bei einer Wellenlänge über 300 nm, noch bevorzugter über 500 nm, am bevorzugtesten über 550 nm. Verbindungen, die Licht bei Wellenlängen über jenem Bereich absorbieren und emittieren, in dem die Probenkomponenten signifikant zur Lichtabsorption beitragen, sind hierin besonders gut geeignet. Die Extinktion von Serum fällt über 500 nm rasch ab und wird über 600 nm insignifikant, weshalb Chemolumineszenzverbindungen, die Licht über 600 nm emittieren, von besonderem Interesse sind. Chemolumineszenzverbindungen jedoch, die bei kürzeren Wellenlängen absorbieren, sind geeignet, wenn keine Interferenzextinktion der Probe vorliegt oder wenn ein Photosensibilisator verwendet wird, der Licht mit längerer Wellenlänge absorbiert und daraufhin die Chemolumineszenzverbindung aktiviert.
  • Die PACCs der Erfindung werden als Marken verwendet und sind mit einem sbp-Element assoziiert.
  • Die unten angeführten PACCs 1 enthalten im Allgemeinen keine allylischen CH- oderNH-Gruppen.
  • Die als PACCs der Erfindung geeigneten elektronenreichen Olefine fallen in die Kategorie der hierin definierten "Chemolumineszenzverbindung". Die PACCs besitzen üblicherweise kein Wasserstoffatom tragendes Atom, das direkt an das Olefin gebunden ist, es sei denn, dieses Atom befindet sich an einer Position, die keine Doppelbindung bilden kann, z. B. an einer Brückenkopfposition eines kleinen bizyklischen Ringsystems. Die bevorzugteren Olefine sind jene, die ein Dioxetan liefern, das sich bei Raumtemperatur rasch zersetzt (weniger als 60 Minuten, vorzugsweise weniger als 5 Minuten, noch bevorzugter weniger als 30 Sekunden). Die Dioxetane können alleine oder in Kombination mit einem Fluoreszenzenergie-Akzeptor lumineszent sein.
  • Die als PACCs der Erfindung geeigneten Enolether fallen ebenfalls unter die hierin definierte Kategorie der "Chemolumineszenzverbindung". Besonders geeignete Enoletherverbindungen sind jene mit einem Aryl auf dem gleichen Kohlenstoff wie der Ether, worin der Arylring mit einer Elektronen-spendenden Gruppe an einer Position substituiert ist, die Fluoreszenz verleiht. Die Elektronen-spendende Gruppe kann z. B. m-Hydroxyphenyl, m-Dimethylaminophenyl, 1-(5-Aminonaphthyl), Pyryl, 1-(3-Hydroxypyryl), Anthracyl, Chrysyl usw. sein. Eine oder beide Gruppen an der 2-Position können Aryl sein, worin das Keton, das durch Ersetzen des 1-Kohlenstoffs mit Sauerstoff gebildet wird, fluoreszierend ist, z. B. β-Naphthyl oder 2-Anthryl. Illustrative und nicht-einschränkende Beispiele für Enolether sind:
    Figure 00690001
    Figure 00700001
    worin X1 = H, OC(O)CH3, OCH3, OH ist, beschrieben von Bronstein et al., US-Patent 4.956.477;
    Figure 00710001
    beschrieben von Bronstein et al., US-Patent 4.956.477;
    Figure 00710002
    worin X2 = N, OH, N(CH3)2 oder OCH3 ist, beschrieben von P. Schaap, J. Am. Chem. Soc. 104, 3504 (1982); und P. Schaap, Photochem. and Photobiology 30, 35 (1979);
    Figure 00710003
    worin X2 wie oben definiert ist, X3 = N, OCH3 oder N(CH3)2 ist, beschrieben von P. Schaap, Report to U.S. Army Research Office, 15. Oktober 1986, und S. D. Gagnon, Doktorarbeit, Wayne State University (1982);
    Figure 00710004
    worin X4 = O, S, CH3N oder PhN ist, Y = 0, S oder CH3N ist und Ph = Phenyl ist, beschrieben von P. Schaap, Report to Office of Naval Research, 17. März 1987;
    Figure 00720001
    beschrieben von P. Schaap, Report to U.S. Army Research, 15. Oktober 1986.
  • Die als PACCs der Erfindung geeigneten Enamine fallen ebenfalls unter die hierin definierte Kategorie der "Chemolumineszenzverbindung". Beispiele für besonders geeignete Enamine sind u. a. die obigen Enolether 3-5 mit N(CH3)2 anstelle von OCH3. Ein weiteres Beispiel ist
    Figure 00720002
  • Die als PACCs geeigneten 9-Alkyliden-N-alkylacridane fallen ebenfalls unter die hierin definierte Kategorie der "Chemolumineszenzverbindung". Besonders bevorzugt sind jene der Formel (7), worin die übrigen Substituenten auf dem Olefin Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m-Methoxyphenyl, Dimethylamino, Trityl, Methoxy und N-Morpholino sind; sie können gemeinsam einen Ring bilden, z. B. Adamantyl, N-Methyacridanylid, Xanthanylidin, 1-(3,4-Benzo-5-hydrofuryliden) und dergleichen. Als Marken geeignete, illustrative und nicht-einschränkende Beispiele für 9-Alkylidin-N-alkylacridane sind u. a.:
    Figure 00730001
    beschrieben von Singer, J. Org. Chem. 41, 2685 (1976);
    Figure 00730002
    beschrieben von E. White, Chem. Letters 12, 1491 (1979);
    Figure 00730003
    worin R4 und R5 unabhängig voneinander N oder Phenyl ist, beschrieben von Singer et al., J. Am. Chem. Soc. 102, 3823 (1983);
    Figure 00730004
    beschrieben von McCapra, Chem. Comm. N24, 944 (1977) und Singer et al., ebda.;
    Figure 00740001
    beschrieben von McCapra, ebda.:
    Figure 00740002
    beschrieben von McCapra, ebda.; Die relevanten Abschnitte der obigen Publikationen sind hierin durch Verweis aufgenommen.
  • Als PACCs geeignete 9-Alkylidenxanthane besitzen im Allgemeinen die folgende Struktur:
    Figure 00740003
    worin die Substituenten auf dem Olefin aus der Gruppe bestehend aus H und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen ausgewählt sind, vorzugsweise Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m-Methoxyphenyl, Dimethylamino, Trityl, Methoxy und N-Morpholino; sie können gemeinsam einen Ring, wie z. B. Adamantyl, N-Methyacridanylid, Xanthanylidin, 1-(3,4-Benzo-5-hydrofuryliden) und dergleichen, bilden, beispielsweise 9-Phenylmethylidenxanthen.
  • Eine weitere Familie von PACCs sind 2,3-Dihydro-l,4-phthalazindione. Die beliebteste Verbindung ist Luminol, die 5-Aminoverbindung. Andere Familienmitglieder sind das 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamino[ca]benz-Analog. Man beachte, dass Luminol als Marken in Tests verwendet wurde; die Anregung von Luminolen erfolgte allerdings chemisch, nicht durch Photoaktivierung wie in der vorliegenden Erfindung. Diese Verbindungen werden durch Singulett-Sauerstoff zu 1,4-Phthalazinidionen oxidiert und erfahren durch anschließende Reaktion mit Superoxid oder Wasserstoffperoxid Zersetzung unter Lichtemission.
  • Eine weitere Familie von PACCs sind 2,4,5-Triphenylimidazole, wobei Lophin der gängige Name für das Ausgangsprodukt ist. Chemolumineszenzanaloge sind z. B. p-Dimethylamino- und -methoxysubstituenten.
  • Andere PACCs, die die obigen Anforderuingen erfüllen, finden sich in der EP-A-0.345.776 vom 13. Dezember 1989.
  • Geschützte Chemolumineszenzverbindung: Jene PACCs, die eine durch Lichteinstrahlung entfernbare Schutzgruppe aufweisen. Wenn die Schutzgruppe durch Photoaktivierung entfernt wird, emittiert die Verbindung Licht spontan oder nach Aktivierung mit Komponenten, die im Testmedium vorhanden sind. Durch Photoaktivierung entfernbare Schutzgruppen sind u. a. o-Nitrobenzyl, o-Acylphenylethyl, Alkoxybenzyl und dergleichen, üblicherweise an ein Heteroatom der PACC gebunden. Beispiele für PACC, die einen Teil der geschützten Chemolumineszenzverbindungen bilden können, sind die oben erwähnten elektronenreichen Olefine. Konkrete Beispiele für geschützte Chemolumineszenzverbindungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind:
  • Figure 00760001
  • Im Fall geschützter Chemolumineszenzverbindungen sind allfällig notwendige Reagenzien vor der Photoaktivierung oder Photolyse vorhanden. Solche Reagenzien können Enzyme und Substrate für solche Enzyme sein. In einigen Fällen ist lediglich die Steuerung des pH-Werts erforderlich. Andere Mittel sind alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Wasserstoffperoxid usw. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, dass die Verwendung zusätzlicher Reagenzien nach Auswahl geeigneter geschützter Chemolumineszenzverbindungen in Einklang mit den obigen Prinzipien möglich ist. Beispielsweise kann im Fall von Verbindung 1 Glühwürmchen-Luciferase und ihr Luciferinsubstrat verwendet werden. Im Fall von Verbindung 2 ist es nur notwenig, ein basisches Medium aufrechtzuerhalten (pH > 9). Im Fall von 2A können Wasserstoffperoxid und Meerrettich-Peroxidase verwendet werden.
  • Zusatzmaterialien: Gemäß der Erfindung werden im Test häufig verschiedene Zusatzmaterialien verwendet. Beispielsweise sind im Testmedium normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren für das Testmedium und die Testkomponenten vorhanden. Häufig können neben diesen Additiven auch Proteine wie etwa Albumine, organische Lösungsmittel wie etwa Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykatione wie etwa Dextransulfat, Tenside, insbesondere nicht-ionogene Tenside, Bindungsbeschleuniger wie etwa Polyalkylenglykole oder dergleichen enthalten sein. Wenn der Photosensibilisator chemisch und nicht durch Bestrahlung aktiviert wird, ist oft Wasserstoffperoxid als Zusatzreagens enthalten. Wenn gewünscht wird, die Emissionswellenlänge der Chemolumineszenzverbindung zu einer längeren Wellenlänge zu verlagern oder die Zersetzung ihrer Sauerstoffaktivierten Form zu katalysieren, kann ein Fluoreszenzmolekül verwendet werden.
  • Ganz oder teilweise nacheinander: Wenn die Probe und verschiedene Mittel hierin auf andere Weise als gleichzeitig kombiniert werden, können eine oder mehrere Mittel mit einem oder mehreren der übrigen Mittel kombiniert werden, um eine Subkombination zu bilden. Jede Subkombination kann dann einen oder mehrere Schritte des vorliegenden Verfahrens durchlaufen. Jede der Subkombinationen kann demnach unter Bedingungen, die eines oder mehrere der gewünschten Ergebnisse liefern, inkubiert werden.
  • Energieakzeptor (hierin auch als Fluoreszenz-Energieakzeptor bezeichnet): Ein Chromophor mit starker Absorption bei mehr als 310 nm, normalerweise mehr als 350 nm, vorzugsweise mehr als 400 nm. Die Auswahl des Energieakzeptors hängt auch von der jeweiligen PACC ab. Der Energieakzeptor sollte das durch die PACC emittierte Licht absorbieren können. Vorzugsweise liegt das Absorptionsmaximum des Energieakzeptors bei einer ähnlichen Wellenlänge wie das Emissionsmaximum der Chemolumineszenzverbindung. Ein hoher Extinktionskoeffizient ist wünschenswert, üblicherweise von mehr als 10, vorzugsweise von mehr als 103, noch bevorzugter von mehr als 104.
  • Einige als Energieakzeptoren geeignete Moleküle werden von Ullman et al. I, II, IV und V, in den Spalten 8 und 9 beschrieben, wobei die relevanten Abschnitte dieser Veröffentlichung hierin durch Verweis aufgenommen sind. Im Allgemeinen ist der Energieakzeptor eine Fluoreszenzverbindung oder ein Fluoreszenzmittel, doch Energieakzeptoren mit sehr schwacher oder überhaupt keiner Fluoreszenz sind auch geeignet.
  • Eine Gruppe von Fluoreszenzmitteln mit einigen der oben beschriebenen günstigen Eigenschaften sind die Xanthenfarbstoffe, die von 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol abgeleiteten Fluoresceine sowie Rosamine und von 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol abgeleitete Rhodamine enthalten. Die Rhodamine und Fluoresceine besitzen eine 9-o-Carboxyphenylgruppe und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.
  • Diese Verbindungen sind im Handel erhältlich und besitzen Substituenten auf der Phenylgruppe, die als Bindungsstelle oder als Bindungsfunktionalität verwendet werden können. Beispielsweise sind Amino- und Isothiocyanat-substituierte Fluoresceinverbindungen erhältlich.
  • Eine weitere Gruppe von Fluoreszenzverbindungen sind Naphthylamine mit einer Aminogruppe an der α- oder (3-Position, üblicherweise α-Position. Naphthylamino-Verbindungen sind 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat.
  • Farbstoffvorläufer, die aktiviert werden, um mit Proteinen zu reagieren, sind 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin; Acridine, wie z. B. 9-Isothiocyanatoacridin; N-(p-(2-Benzoxazolyl)phenyl)maleimid; Benzoxadiazole wie etwa:
    Figure 00790001
    4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol; Stilbene, wie etwa 4-Dimethylamino-4'-isothiocyanatostilben und 4-Dimethylamino-4'-maleimidostilben. Andere Farbstoffe, die weiter funktionalisiert werden können, um eine Kombination mit einem sbp-Element zu bilden, sind Acridinorange, 7-(p-Methoxybenzylamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol; N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin-p-toluolsulfonat; Pyrene, wie z. B. 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure und 1-Pyrenbuttersäure, Merocyanin 540, Diodeosin sowie andere leicht erhältliche fluoreszierende Moleküle.
  • Für Polynucleotid-Tests können viele verschiedene Energieakzeptoren vewendet werden, doch jene, die verstärkte Fluoreszenz aufweisen, wenn sie an doppelstrangige Nucleinsäuren gebunden sind, sind vorzuziehen. Interkalierende Farbstoffe wie etwa Ethidiumbromid und Acridinorange sind typische Beispiele. Ein von Barton (J. Am. Chem. Soc. 112, 4960 (1990)) entwickeltes Rutheniumderivat ist besonders attraktiv, da es im interkalierten Zustand dramatisch aktiviert wird. Alternativ dazu kann der Energieakzeptor an eine zweite Polynucleotidsonde gebunden sein, die sich in der Nähe der mit Chemolumineszenzverbindung markierten Sonde binden kann, oder der Energieakezeptor kann ungebunden und in Lösung frei dispergiert sein.
  • Nichtfluoreszierende Energieakzeptoren können eine Vielzahl von Azofarbstoffen, Cyaninfarbstoffen, 4,5-Dimethoxyfluorescein, Formazane, Indophenole und dergleichen sein.
  • Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten. Das Verfahren umfasst die Behandlung eines Mediums, das vermutlich einen Analyten enthält, unter Bedingungen, die dafür sorgen, dass der Analyt – falls er vorhanden ist – die Menge eines Photosensibilisators und einer Chemolumineszenzverbindung, die einander nahe kommen können, beeinflusst, worin der durch den Photosensibilisator erzeugte kurzlebige Singulett-Sauerstoff mit der Chemolumineszenzverbindung vor der spontanen Zersetzung reagieren kann. Das Verfahren umfasst ferner die Messung der Intensität der durch die Chemolumineszenzverbindung erzeugten Lumineszenz. Die Intensität der erzeugten Lumineszenz steht mit der Analytenmenge im Medium in Zusammenhang. Die Chemolumineszenzverbindung ist zur Aktivierung durch Singulett-Sauerstoff fähig, und der Photosensibilisator katalysiert die Bildung von Singulett-Sauerstoff üblicherweise als Reaktion auf Lichtanregung, gefolgt von Energietransfer auf molekularen Sauerstoff. Oft wird eine Oberfläche in unmittelbare Nähe zum Photosensibilisator und zur Chemolumineszenzverbindung gebracht, wobei die Oberfläche vorzugsweise die Oberfläche der suspendierbaren Teilchen ist. Das durch die Aktivierung der Chemolumineszenzverbindung gebildete Produkt zersetzt sich vorzugsweise spontan unter Lichtemission.
  • Das Verfahren basiert auf einem Analyten, der bewirkt oder verhindert, dass Moleküle des Photosensibilisators und der Chemolumineszenzverbindung näher beieinander liegen als ihr mittlerer Abstand im Körper der Lösung des Testmediums. Diese Aufteilung hängt von der Menge des Analyten ab, die in der zu analysierenden Probe vorhanden ist. Die Photosensibilisatormoleküle, die sich nicht mit der Chemolumineszenzverbindung assoziieren, produzieren Singulett-Sauerstoff, der die Chemolumineszenzverbindung nicht erreichen kann, bevor die Zersetzung im wässrigen Medium erfolgt. Wenn jedoch der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung einander als Reaktion auf die Analytenmenge näher kommen, kann der durch Bestrahlung des Photosensibilisators erzeugte Singulett-Sauerstoff die Chemolumineszenzverbindung vor der Zersetzung aktivieren. Da zahlreiche Chemolumineszenzverbindungs-Moleküle und/ oder Photosensibilisator-Moleküle mit einer Oberfläche assoziiert werden können und da die Diffusion auf einer Oberfläche beschränkt ist, kann die Gegenwart einer Oberfläche in Kombination mit dem Photosensibilisator und der Chemolumineszenzverbindung den Wirkungsgrad oder die Wirkungsweise von Singulett-Sauerstoff mit der Chemolumineszenzverbindung vor der Zersetzung steigern. Die Verwendung einer Oberfläche, die als Funktion der Gegenwart von Analyten in die Nähe der Chemolumineszenzverbindung und des Photosensibilisators kommt, ist daher vorzuziehen. Der vorliegende Test bietet daher ein geeignetes Verfahren zum Detektieren und Messen einer Vielzahl von Analyten in einfacher, effizienter und reproduzierbarer Weise sowie unter Einsatz einfacher Geräte zur Messung der während der Reaktion erzeugten Lichtmenge.
  • Die Menge des Photosensibilisators, der in die Nähe der Chemolumineszenzverbindung kommt, wird durch die Gegenwart von Analyt beeinflusst, da der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung jeweils mit einem sbp-Element assoziiert werden. Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, wobei der Ausdruck "assoziiert mit" dadurch definiert ist. Der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung können Funktionalitäten für die kovalente Bindung an sbp-Elementen enthalten, oder es können die sbp-Elemente bzw. Gruppen, die sich an sbp-Elemente binden können, Funktionalitäten zur Bindung an den Photosensibilisator und/oder die Chemolumi neszenzverbindung enthalten. Die Bindung kann durch direkte Bindung zwischen den zwei Molekülen erfolgen, oder es kann eine Linkergruppe zwischen einem sbp-Element und dem Photosensibilisator oder der Chemolumineszenzverbindung liegen. In einer anderen Ausführungsform können der Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung an Oberflächen gebunden oder in Teilchen inkorporiert sein, an die auch sbp-Elemente gebunden sind. In beiden Fällen kann sich jedes der sbp-Elemente direkt oder indirekt an den Analyten oder eine Testkomponente binden, deren Konzentration durch die Gegenwart des Analyten beeinflusst wird. Der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung können in Teilchen inkorporiert werden, da er bzw. sie in zumindest einer Phase der Teilchen löslich ist, in welchem Fall der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung in viel höherer Konzentration innerhalb des Teilchens vorliegt als im übrigen Testmedium. Wenn der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung kovalent an Teilchen gebunden sind, werden der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung oder die Teilchen oder Komponenten davon funktionalisiert, um ein Mittel zur Bindung des Photosensiblisators und der Chemolumineszenzverbindungen sowie der Teilchen bereitzustellen. Bei Teilchen, die Öltröpfchen oder Liposomen sind, kann der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung an einer oder mehreren langen Kohlenwasserstoffketten gebunden sein, wobei jede im Allgemeinen zumindest 10 bis 30 Kohlenstoffatome aufweist. Wenn die Teilchen Tröpfchen eines Fluorkohlenstoffs sind, kann der Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung (in diese Teilchen inkorporiert) fluoriert werden, um die Löslichkeit zu verstärken und den Austausch zu anderen mit dem anderen Marker gebundenen Teilchen zu verringern; die zur Verknüpfung verwendete Kohlenwasserstoffkette wird vorzugsweise durch eine Fluorkohlenstoffkette ersetzt. Bei flüssigen Silikonteilchen kann der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung an ein Polysiloxan gebunden sein. Um die Anzahl an Photosensibilisator- oder Chemolumineszenzverbindungs-Molekülen pro Teilchen zu maximieren, ist es üblicherweise wünschenswert, die Ladung und Polarität des Photosensibilisators oder der Chemolumineszenzverbindung zu minimieren, sodass er bzw. sie sich innerhalb des nichtwässrigen Abschnitts des Teilchens befindet. Wenn das Teilchen ein Liposom ist und man den Photosensibilisator oder die Chemolumineszenzverbindung in der wässrigen Phase des Liposoms halten möchte, ist es vorzuziehen, Photosensibilisatoren oder Chemolumineszenzverbindungen zu verwenden, die stark polar oder stark geladen sind.
  • Ungeachtet dessen, wie der Photosensibilisator und die Chemolumineszenzverbindung gebunden sind, ist entscheidend, dass sich keine der beiden Verbindungen von ihrem sbp-Element disoziieren kann, um sich während des Tests mit dem sbp-Element, das an das andere Element des Photosensiblisator-Chemolumineszenzverbindungs-Paars gebunden ist, zu assoziieren. Die Dissoziation dieser Verbindungen von ihren jeweiligen sbp-Elementen muss demnach im Verhältnis zur für den Test erforderlichen Zeit langsam sein.
  • Die Chemolumineszenzverbindung kann an ein sbp-Element gebunden sein, das sich direkt oder indirekt an den Analyten oder an eine Testkomponente binden kann, deren Konzentration durch die Gegenwart des Analyten beeinflusst wird. Der Ausdruck "kann sich direkt oder indirekt binden" bedeutet, dass sich die jeweilige Einheit spezifisch (direkt) an die Einheit binden kann oder sich spezifisch an ein spezifisches Bindungspaarelement oder an einen Komplex von zwei oder mehr sbp-Elementen binden kann, der die andere Einheit (indirekt) binden kann. Die Oberfläche besitzt im Allgemeinen ein daran gebundenes sbp-Element. Vorzugsweise ist die Chemolumineszenzverbindung mit der Oberfläche assoziiert, üblicherweise innerhalb eines suspendierbaren Teilchens. Dieses sbp-Element kann sich im Allgemeinen direkt oder indirekt an den Analyten oder einen Rezeptor für den Analyten binden. Wenn die mit dem Photosensibilisator und der Chemolumineszenzverbindung assoziierten sbp-Elemente beide in der Lage sind, sich an den Analyten zu binden, ergibt sich eine Sandwichtest-Arbeitsvorschrift. Wenn eines der mit dem Photosensibilisator oder der Chemolumineszenzverbindung assoziierten sbp-Elemente sowohl den Analyten als auch einen Analytenanalog binden kann, ergibt sich möglicherweise eine kompetitive Test-Arbeitsvorschrift. Die Bindung an eine Oberfläche oder die Inkorporation in einem Teilchen der Chemolumineszenzverbindung wird im Allgemeinen durch die gleichen Prinzipien bestimmt, die oben für die Bindung an ein oder die Inkorporation in ein Teilchen des Photosensiblisators beschrieben sind.
  • Üblicherweise wird bewirkt, dass der Photosensibilisator die Chemolumineszenzverbindung aktiviert, indem das die obigen Reaktanden enthaltende Medium bestrahlt wird. Das Medium muss mit Licht bestrahlt werden, das eine Wellenlänge mit Energie aufweist, die ausreicht, um den Photosensibilisator in einen angeregten Zustand überzuführen, wodurch er molekularen Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff aktivieren kann. Der angeregte Zustand für den Photosensiblisator, der molekularen Sauerstoff anregen kann, ist im Allgemeinen ein Triplett-Zustand, der mehr als etwa 20, üblicherweise zumindest 23, Kcal/mol energetischer als der Photosensibilisator-Grundzustand ist. Vorzugsweise wird das Medium mit Licht mit einer Wellenlänge von etwa 450 bis 950 nm bestrahlt, obwohl kürzere Wellenlängen auch in Frage kommen, z. B. 230 bis 950 nm. Die erzeugte Lumineszenz kann in jeder geeigneten Weise gemessen werden, z. B. fotografisch, visuell oder photometrisch, um ihre Menge zu bestimmen, die mit der Menge des Analyten im Medium in Zusammenhang steht.
  • Obwohl es üblicherweise vorzuziehen ist, den Photosensibilisator durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge, die wirkungsvoll vom Photosensibilisator absorbiert wird, anzuregen, sind auch andere Mittel zur Anregung möglich, z. B. durch Energietransfer aus einem angeregten Zustand eines Energiedonors, wie z. B. eines zweiten Photosensibilisators. Bei Verwendung eines zweiten Photosensibilisators können Wellenlängen von Licht verwendet werden, die vom Photosensibilisator ineffizient, aber vom zweiten Photosensibilisator in wirkungsvoller Weise absorbiert werden. Der zweite Photosensibilisator kann an eine Testkomponente gebunden sein, die mit dem ersten Photosensibilisator assoziiert ist oder sich mit diesem assoziiert (beispielsweise gebunden an eine Oberfläche oder in das Teilchen inkorporiert, das den ersten Photosensibilisator aufweist). Wenn ein zweiter Photosensibilisator verwendet wird, weist er üblicherweise einen Triplett-Zustand niedrigster Energie bei höheren Energiewerten auf als der Triplett-Zustand niedrigster Energie des ersten Photosensibilisators.
  • Die 632,6 nm-Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers ist eine kostengünstige Lichtquelle für die Anregung. Photosensibilisatoren mit Absorptionsmaxima im Bereich von etwa 620 bis etwa 650 nm sind mit der Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers kompatibel, weshalb sie sich hierin besonders eignen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen in Kombination (1) eines Mediums, das vermutlich Analyt enthält, (2) eines Photosensibilisators, der in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in einen Singulett-Zustand aktivieren kann, wobei der Photosensibilisator mit einem sbp-Element assoziiert ist, und (3) eines suspendierbaren Teilchens, umfassend eine Chemolumineszenzverbindung, worin das Teilchen ein daran gebundenes sbp-Element aufweist, sodass Analyt – sofern er vorhanden ist – die Menge der Chemolumineszenzverbindung und des Photosensibilisators beeinflusst, die einander nahe kommen können, (b) Behandeln der Kombination mit Licht, um den Photosensibilisator anzuregen, und (c) Untersuchen der Kombination hinsichtlich der Menge der daraus emittierten Lumineszenz. Die Menge der emittierten Lumineszenz steht in Beziehung zur Menge an Analyt im Medium. Vorzugsweise ist die Chemolumineszenzverbindung in ein suspendierbares Teilchen inkorporiert und das sbp-Element an das Teilchen gebunden. Noch bevorzugter ist der Photosensibilisator in ein zweites suspendierbares Teilchen inkorporiert, das ein daran gebundenes sbp-Element aufweist.
  • Das Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung können auf die meisten Tests eingestellt werden, die sbp-Elemente, wie z. B. Ligand-Rezeptor, umfassen, beispielsweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, Polynucleotid-Bindungstests usw. Die Tests können homogen oder heterogen, kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Die Testkomponenten, Chemolumineszenzverbindung und Photosensibilisator, können in unterschiedlicher Weise mit (1) einer Oberfläche (falls vorhanden), (2) Nucleinsäure oder Rezeptor und (3) Nucleinsäure oder Ligand verwendet werden. Die Assoziation kann kovalente oder nichtkovalente Bindungen enthalten. Fachleute auf dem Gebiet können die jeweiligen Assoziationen je nach dem Test auswählen, der im Lichte der obigen und folgenden Beschreibung gewünscht ist.
  • In einem homogenen Test kann die Probe allenfalls vorbehandelt werden, um unerwünschte Materialien zu entfernen. Die Reaktion für einen nichtkompetitiven Sandwich-Test kann Folgendes enthalten: ein sbp-Element (z. B. einen Antikörper, eine Nucleinsäuresonde, einen Rezeptor oder Liganden), das komplementär zum Analyten und mit einer Chemolumineszenzverbindung assoziiert ist; einen mit einem sbp-Element (z. B. Antikörper, Nucleinsäuresonde, Rezeptor oder Ligand) assoziierten Photosensibilisator, der ebenfalls zum Analyten komplementär ist; die Probe von Interesse; und gegebenenfalls erforderliche Zusatzreagenzien. Vorzugsweise sind der Photosensibilisator und/oder die Chemolumineszenzverbindung in Teilchen inkorporiert, an die die sbp-Elemente gebunden sind. In einer kompetitiven Arbeitsvorschrift kann ein sbp-Element ein Derivat des Analyten und das andere sbp-Element komplementär zum Analyten sein (z. B. Antikörper). In beiden Arbeitsvorschriften können die Komponenten entweder gleichzeitig oder zur Gänze oder teilweise nacheinander kombiniert werden. Die Fähigkeit von durch einen aktivierten Photosensibilisator erzeugtem Singulett-Sauerstoff, mit der Chemolumineszenzverbindung zu reagieren, wird durch die Bindung eines sbp-Elements am Analyten bestimmt. Demnach kann die Gegenwart oder Menge des Analyten durch Messen der Lichtmenge bestimmt werden, die nach Aktivierung des Photosensibilisator durch Bestrahlung, Erhitzen oder Zugabe eines chemischen Reagens, vorzugsweise durch Bestrahlung, emittiert wird. Sowohl die Bindungsreaktion als auch die Detektion ihres Ausmaßes können in einer homogenen Lösung ohne Trennung erfolgen. Dies ist ein Vorteil der Erfindung gegenüber Verfahren des Stands der Technik auf der Basis von Chemolumineszenz.
  • In einem heterogenen Test umfassen die Testkomponenten eine Probe, die vermutlich einen Analyten enthält, der ein sbp-Element ist; ein sbp-Element, das an einen Träger gebunden ist, der entweder eine nicht-dispergierbare Oberfläche oder ein Teilchen ist, mit dem ein Element einer Gruppe assoziiert ist, die aus der Chemolumineszenzverbindung und dem Photosensibilisator besteht; und ein sbp-Element, mit dem das andere Element der Gruppe assoziiert ist, worin die sbp-Elemente unabhängig voneinander entweder direkt oder indirket den Analyten oder einen Rezeptor für den Analyten binden können. Diese Komponenten werden im Allgemeinen entweder gleichzeitig oder zur Gänze oder teilweise nacheinander kombiniert. Die Oberfläche oder Teilchen werden dann von der flüssigen Phase abgetrennt, und es wird entweder die abgetrennte Phase oder die flüssige Phase Bedingungen unterzogen, um den Photosensibilisator zu aktivieren, üblicherweise durch Bestrahlen der jeweiligen Phase, und die Menge des emittierten Lichts zu messen.
  • Die Bindungsreaktionen in einem Test auf den Analyten erfolgen normalerweise in einem wässrigen Medium bei mittlerem pH-Wert, im Allgemeinen bei jenem, der optimale Testsensitivität bietet. Vorzugsweise erfolgt die Aktivierung der Photosensibilisators auch in einem wässrigen Medium. Wenn jedoch ein Trennschritt vorgesehen ist, eignen sich auch nichtwässrige Medien, z. B. Acetonitril, Aceton, Toluol, Benzonitril usw., und wässrige Medien mit sehr hohen pH-Werten, d. h. von mehr als 10,0, oder sehr niedrigen pH-Werten, d. h. weniger als 4,0, wobei sehr hohe üblich sind. Wie oben erwähnt kann der Test entweder ohne Trennung (homogen) oder mit Trennung (heterogen) der Testkomponenten oder -produkte erfolgen.
  • Das wässrige Medium kann nur Wasser sein oder 0,01 bis 80 Vol.-% eines Co-Lösungsmittels enthalten; üblicherweise enthält es weniger als 40% eines Co-Lösungsmittels, wenn ein sbp-Element verwendet wird, das ein Protein ist. Der pH-Wert für das Medium der Bindungsreaktion liegt üblicherweise im Bereich von etwa 4 bis 11, noch häufiger im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Wenn der pH-Wert während der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff nicht verändert wird, ist er üblicherweise ein Kompromiss zwischen optimaler Bindung der Bindungselemente und dem pH-Optimum zur Erzeugung eines Signals sowie der Stabilität anderer Reagenzien des Tests. Wenn erhöhte pH-Werte für die Signalerzeugung erforderlich sind, kann ein Schritt, der die Zugabe eiens alkalischen Reagens vorsieht, zwischen der Bindungsreak tion und der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff und/oder der Signalproduktion erfolgen. Üblicherweise sind die erhöhten pH-Werte höher als 10, noch häufiger 10 bis 14. Für heterogene Tests können auch die oben erwähnten nichtwässrigen Lösungsmittel verwendet werden, wobei die wichtigste Überlegung ist, dass das Lösungsmittel nicht wirkungsvoll mit Singulett-Sauerstoff reagiert.
  • Verschiedene Puffer können dazu dienen, den gewünschten pH-Wert zu erzielen und ihn während des Tests beizubehalten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils verwendete Puffer ist für die Erfindung nicht entscheidend, doch in einem konkreten Test kann ein oder oder anderer Puffer jeweils vorzuziehen sein.
  • Bei der Durchführung der Bindungsreaktionen proteinhaltiger Liganden und Rezeptoren im Test herrschen moderate Temperaturen und während der Messdauer üblicherweise konstante Temperaturen, vorzugsweise zwischen 25°C und 40°C. Die Inkubationstemperaturen für die Bindungsreaktion reichen normalerweise von etwa 5°C bis 45°C, noch häufiger von etwa 15°C bis 40°C, noch häufiger von 25°C bis 40°C. Wenn Bindung von Nucleinsäuren im Test erfolgt, herrschen oft höhere Temperaturen, üblicherweise 20°C bis 90°C, noch häufiger 35°C bis 75°C. Die Temperaturen während der Messungen, d. h. während der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff und der Lichtdetektion, reichen im Allgemeinen von etwa 20°C bis 100°C, noch häufiger von etwa 25°C bis 50°C, noch häufiger von 25°C bis 40°C.
  • Die zu untersuchende Konzentration von Analyten variiert im Allgemeinen zwischen etwa 10–4 bis unter 10–16 M, noch häufiger von etwa 10–6 bis 10–14 M. Überlegungen, z. B. ob der Test qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ ist, das jeweilige Detektionsverfahren, die Konzentration des Analyten von Interesse und die maximalen gewünschten Inkubationszeiten, sind normalerweise für die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien ausschlaggebend.
  • Während in kompetitiven Tests die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Testmedium im Allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von Interesse des Analyten bestimmt wird, wird normalerweise die Endkonzentration jedes Reagens empirisch ermittelt, um die Sensititivät des Tests im Bereich zu optimieren. Eine signifikante Variation der Konzentration des Analyten sollte eine präzise messbare Signaldifferenz liefern.
  • Die Konzentration der sbp-Elemente hängt von der Analytenkonzentration, der gewünschten Bindungsrate und dem Grad, in dem sich die sbp-Element nichtspezifisch binden, ab. Üblicherweise sind die sbp-Elemente in zumindest der niedrigsten erwarteten Analytenkonzentration vorhanden, vorzugsweise in zumindest der höchsten erwarteten Analytenkonzentration; bei nichtkompetitiven Tests können die Konzentrationen 10 bis 106 Mal so hoch wie die höchste Analytenkonzentration sein, üblicherweise weniger als 10–4 M, vorzugsweise weniger als 10–6 M, häufig zwischen 10–11 und 10–7 M. Die Menge an Photosensibilisator oder Chemolumineszenzverbindung, die mit einem sbp-Element assoziiert sind, beträgt üblicherweise zumindest ein Molekül pro sbp-Element und kann bis zu 105 betragen, üblicherweise zumindest 10 bis 104, wenn das Photosensibilisator- oder Chemolumineszenzmolekül in ein Teilchen inkorporiert ist.
  • Während die Reihenfolge der Zugabe stark variieren kann, sind je nach Beschaffenheit des Tests verschiedene Präferenzen zu beachten. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist die gleichzeitige Zugabe aller Materialien. Alternativ dazu könen die Reagenzien zur Gänze oder teilweise nacheinander kombiniert werden. Wenn der Test kompetitiv ist, ist es oft wünschenswert, den Analytenanalog nach dem Kombinieren der Probe und eines sbp-Elements, das den Analyten binden kann, zuzugeben. Gegebenenfalls kann der Inkubationsschritt nach dem Kombinieren der Reagenzien vorgesehen sein, im Allgemeinen etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, noch häufiger etwa 2 Minuten bis 1 Stunde, vor der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff durch den Sensibilisator und dem Messen der Lichtemission.
  • In einer besonders bevorzugten Reihenfolge der Zugabe wird eine erste Gruppe spezifischer Bindungspaarelemente, die komplementär zum und/oder homolog mit dem Analyten sind, mit dem Analyten kombiniert, gefolgt von der Zugabe spezifischer Bindungspaarelemente, die zu den ersten spezifischen Bindungspaarelementen komplementär sind, wobei jedes mit einem unterschiedlichen Element der Gruppe assoziiert ist, die aus einem Photosensibilisator und einer Chemolumineszenzverbindung besteht. Das Testgemisch oder eine abgetrennte Komponente davon wird dann bestrahlt und die Lichtemission gemessen.
  • In einem homogenen Test können nach dem Kombinieren aller Reagenzien diese auf Wunsch inkubiert werden. Dann wird die Kombination bestrahlt und das resultierende emittierte Licht gemessen. Das emittierte Licht wird mit der Menge des in der untersuchten Probe vorhandenen Analyten in Beziehung gesetzt. Die Mengen der in einem homogenen Test verwendeten Reagenzien der Erfindung hängen von der Beschaffenheit des Analyten ab. Im Allgemeinen weist der homogene Test der Erfindung höhere Sensitivität im Vergleich zu bekannten Tests wie dem EMIT®-Test auf. Dieser Vorteil ergibt sich hauptsächlich aus dem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis, das gemäß dem vorliegenden Verfahren erzielt werden kann.
  • Die folgenden Tests dienen zur Veranschaulichung und sind keinesfalls einschränkend; sie sollen es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ermöglichen, den Umfang der Erfindung abzuschätzen und diese ohne allzu viele Experimente durchzuführen. Man beachte, dass die Auswahl von Analyten, Photosensibilisatoren, Chemolumineszenzverbindungen, Oberflächen, Teilchen und Reaktionsbedingungen in den folgenden Beispielen den Fachleuten nahe gelegt wird.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Chemolumineszenzverbindung 9-Benzal-10-methylacridan kovalent an einen Antikörper für Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) gebunden (Reagens 1). Das 9-Benzal-l0-methylacridan, funktionalisiert mit einem N-Hydroxysuccinimdylester einer am Phenylring gebundenen Carboxylgruppe, reagiert mit den Aminogruppen des Antikörpers. Die Linkergruppe ist ein Carbamid. Der verwendete Photosensibilisator ist Diodeosin, das kovalent an Latexteilchen mit einer mittleren Größe von 0,5 um gebunden ist. Die Latexteilchen und Diodeosin sind mittels Chlormethylgruppen auf dem Latex kovalent aneinander gebunden, um eine Ester-Linkergruppe zu bilden (siehe J. Am. Chem. Soc. 97, 3741 (1975)). Das Latexteilchen ist ferner mittels N-Hydroxysuccinimidylester-Gruppen auf dem Latex an einen zweiten Antikörper für TSH gebunden (Reagens 2). Beide verwendete Antikörper sind monoklonale Antikörper, die durch herkömmliche Hybridzelllinien-Technologie produziert werden. Ein Antikörper erkennt die α-Untereinheit von TSH und der andere die β-Untereinheit von TSH. Bei der Durchführung des Test wird eine Serumprobe, die vermutlich TSH enthält, von einem Patienten gezogen. 50 μl der Probe werden in einem wässrigen 500 ml-Medium, gepuffert mit Tris-Puffer bei pH 8,0, mit obigem Reagens 1 und Reagens 2 kombiniert. Die Mengen an Reagens 1 und Reagens 2 sind ausreichend, um Konzentrationen jedes Antikörpers von etwa 10–6 M zu bilden. Das Reaktionsgemisch wird dann 1 h lang bei 25°C inkubiert und dann 30 s lang mit 560 nm Licht bestrahlt. Die nach der Bestrahlung emittierte Lichtintensität wird gemessen und die gesamte über den Zeitraum von 30 s detektierte Lichtenergie mit Werten verglichen, die in einem ähnlichen Verfahren mit Proben, die bekannte Konzentrationen an TSH aufweisen, erhalten wurden, um die TSH-Konzentration in unbekannten Proben zu ermitteln. Alternativ dazu werden nach der Inkubation die Latexteilchen vom Medium abgetrennt und in ein wässriges gepuffertes Medium mit pH 9,5 eingebracht, in ähnlicher Weise bestrahlt und die Menge an aus dem System emittiertem Licht wie oben gemessen.
  • Gemäß einer Alternative ist Reagens 2 Diodeosin, das kovalent mit dem zweiten Antikörper verbunden ist, und es wird kein Latexteilchen verwendet. In einer weiteren alternativen Ausführungsform auf der Basis der obigen ist Reagens 2 Diodeosin, das kovalent mit dem zweiten Antikörper verbunden ist, und Reagens 1 ist 9-Benzal-l0-methylacridan, das kovalent an Latexteilchen gebunden ist, an die der erste Antikörper kovalent gebunden ist. In einer weiteren alternativen Ausführungsform auf der Basis der obigen ist Reagens 1 wie oben beschrieben, Reagens 2 ist Diodoesin, das kovalent mit Latex teilchen verbunden ist, an die Avidin kovalent gebunden ist, und es wird außerdem kein drittes Reagens (Reagens 2A) verwendet, d. h., der zweite kovalent mit Biotini verbundene Antikörper wird verwendet. Reagens 1 und das dritte Reagens werden mit Probe kombiniert und inkubiert. Dann wird ein Überschuss von Reagens 2 zugegeben; das übrige Verfahren verläuft wie oben beschrieben.
  • In einer anderen Alternative auf der Basis der obigen tritt Chlorperoxidase an die Stelle von Diodeosin. In diesem Test erfolgt statt dem Bestrahlungsschritt die Zugabe von Natriumbromid und Wasserstoffperoxid, um Singulett-Sauerstoff zu erzeugen. Das emittierte Licht wird wie oben beschrieben gemessen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine erste Gruppe von Öltröpfchen (Reagens 3) aus einer Lösung des Photosensibilisators (Chlorophyll) in Mineralöl gemäß dem Verfahren von Giaever, s. o., hergestellt. Die Öltröpfchen, die einen Durchmesser von 0,1 bis 2 um aufweisen, werden funktionalisiert und mit einem monoklonalen Antikörper für choriales Human-Gonadotropin (HCG) verbunden. Das Chlorophyll ist lipophil und daher irreversibel im lipophilen Öltröpfchen gelöst. Eine zweite Gruppe von Öltröpfchen (Reagens 4) wird in ähnlicher Weise hergestellt. In dieser Gruppe von Tröpfchen wird das Öltröpfchen kovalent mit einem zweiten monoklonalen Antikörper für HCG verbunden, der einen anderen Abschnitt des HCG-Moleküls erkennt als der oben erwähnte erste monoklonale Antikörper. 9-(Diphenylmethylidin)-N-methylacridan wird irreversibel im lipophilen Öltröpfchen gelöst, indem eine N,N-Didodecylcarbonsäureamid-Gruppe, die an eine der Phenylgruppen des Acridan gebunden ist, miteinbezogen wird. Die monoklonalen Antikörper werden durch herkömmliche Hybridzelllinien-Technologie erzeugt. Eine Harnprobe, die vermutlich HCG (50 μl) enthält, wird in Überschussmengen von Reagens 3 und Reagens 4 in einem wässrigen gepufferten Medium (500 μl) bei pH 7,5 kombiniert. Das Medium wird 20 min lang bei 25°C inkubiert. Das Medium wird ohne Trennung unter Anwendung eines He/Ne-Lasers 1 min lang mit 633 nm bestrahlt und das emittierte Licht wie oben beschrieben gemessen. Die Lichtmenge wird mit der aus Proben emittierten Menge verglichen, die bekannte Men gen an HCG aufweisen, und der HCG-Gehalt in der unbekannten Probe durch Vergleichen der Werte ermittelt. Auf diese Weise wird ein geeigneter und sensitiver homogener Immuntest auf HCG durchgeführt.
  • In einer alternativen Vorgangsweise auf der Basis der obigen besitzt Reagens 3 Antikörper für Fluorescein anstelle des Antikörpers für HCG, und ein zusätzliches Reagens (Reagens 3A) besitzt einen kovalent mit Fluorescein verbundenen HCG-Antikörper. Reagens 4 besitzt Avidin anstelle des zweiten HCG-Antikörpers, und ein viertes Reagens (Reagens 4A) weist einen zweiten Antikörper auf, der kovalent an Biotin gebunden ist. Im Test werden Reagens 4A und Reagens 3A mit Probe kombiniert und inkubiert. Anschließend werden die Reagenzien 3 und 4 zugegeben und inkubiert. Anschließend wird der Rest des obigen Tests durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird unter Einsatz im Handel erhältlicher zu diesem Zweck entwickelter Instrumente eine Gruppe von Liposomen (Reagens 5, Durchmesser 0,2 μm) durch Hochdruckextrusion einer Phospholipid-Suspension in pH 7,4-Puffer durch eine 0,2 μm-Porenmembran geformt. Ein Thyroxin-Analog wird kovalent an das Liposom gebunden, indem zuerst Mercaptoacetamid-Gruppen auf dem Liposom durch Reaktion von Phosphatidylethanolamin im Liposom mit einem aktiven Ester von Methylcarboxymethyldisulfid gebildet werden, gefolgt von der Reaktion mit Dithioerythrit. Bromacetylthyroxin wird dann mit den sulfhydrylierten Liposomen umgesetzt. Ein Metalloporphyrin-Farbstoff wird im lipophilen Abschnitt des Liposoms gelöst. Eine weitere Gruppe von Liposomen (Reagens 6) dient dazu, einen monoklonalen Antikörper für Thyroxin zu binden. Der Antikörper wird durch ein ähnliches Verfahren wie bei der Bindung von Thyroxin kovalent gebunden. Ein Enamin (2-Dimethylaminomethylenpyran) wird mittels einer Carbamid-Linkergruppe kovalent an die Oberfläche des Liposoms gebunden. Reagens 5 und Reagens 6 werden in einem wässrigen gepufferten Testmedium (500 μl) von pH 8,0 mit einer Serumprobe kombiniert, die vermutlich Thyroxin enthält, das Anilinonaphthalinsulfonsäure enthält, um Thyroxin von Bindungsproteinen (50 μl) zu verdrängen und Energie aus dem Sauerstoff-aktivierten Pyran aufzuneh men, damit langwellige Emission ermöglicht wird. Das Testmedium wird dann 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wird ohne den Trennschritt bei 650 nm 1 min lang bestrahlt und das resultierende emittierte Licht mittels eines Luminometers gemessen. Der erhaltene Wert wird mit Werten verglichen, die unter Einsatz eines ähnlichen Tests mit bekannten Mengen an Thyroxin erzielt wurden. Auf diese Weise wird die Menge an Thyroxin in der Serumprobe quantifiziert.
  • In einer alternativen Vorgangsweise auf der Basis der obigen besitzt Reagens 6 Avidin anstelle des Antikörpers für Thyroxin. Ein zusätzliches Reagens (Reagens 6A) weist kovalent an Biotin gebundenen Antikörper für Thyroxin auf. Reagens 5 weist Antikörper für Fluorescein anstelle von Thyroxin auf, und ein zusätzliches Reagens (Reagens 5) besitzt an Fluorscein kovalent gebundenes Thyroxin. Im Test werden Reagenzien 5A und 6A mit Probe kombiniert und inkubiert. Dann werden Reagens 5 und b zugegeben, das Gemisch wird inkubiert und der Rest des Testverfahrens durchgeführt.
  • In einer alternativen Vorgangsweise auf der Basis der obigen wird der Metalloporphyrin-Farbstoff durch Kaliummolybdat ersetzt, das in die wässrige Phase der Liposomen inkorporiert ist. In diesem Test ist der Bestrahlungsschritt durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid ersetzt, um Singulett-Sauerstoff zu erzeugen. Das emittierte Licht wird wie oben beschrieben gemessen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird 2-Hydroxyethyl-9,10-dibromanthracen in einen Farbstoffkristalliten eingebracht (gemäß dem Verfahren von Gribnau). Ein monoklonaler Antikörper, der Hepatitis B-Oberflächen-Antigen erkennt, wird mittels einer Carbamat-Linkergruppe kovalent an den Farbstoffkristalliten gebunden. Ein Latexteilchen wird behandelt, um einen zweiten Antikörper für Hepatitis B-Oberflächen-Antigen mittels kovalenter Bindung zu immobilisieren. Das Latexteilchen wird ferner mittels einer Amid-Linkergruppe kovalent an 9-(Benzal-9H-xanthen) gebunden. Der Farbstoffkristallit besitzt eine Teilchengröße von durchschnittlich 2 μm und das Latexteilchen einen mittleren Durchmesser von 0,2 μm. Die monoklonalen Antikörper werden durch herkömmliche Hybridzelllinien-Technologie erzeugt. Eine Serumprobe eines Patienten, der vermutlich Hepatitis aufweist (50 μl), wird in einem wässrigen Testmedium (500 μl) bei pH 7,0 mit einem Überschuss des Farbstoffkristalliten und der oben beschriebenen Latexteilen kombiniert. Das Testmedium wird dann bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert und dann 1 min lang mit einer Xenon-Lichtquelle bei 350 nm bestrahlt. Die Gegenwart von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen in der Probe bewirkt, dass der Farbstoffkristallit und die Latexteilchen aufgrund der Immunbindung der jeweiligen Antikörper mit dem Antigen einander sehr nahe kommen. Nach Bestrahlung des Mediums wird das 9,10-Dibromanthracen angeregt und wandelt molekularen Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Der Singulett-Sauerstoff reagiert mit dem Xanthen, um ein Dioxetan zu ergeben, das bei Raumtemperatur spontan zerfällt, um Licht zu erzeugen. Das Licht wird photometrisch gemessen, und die Lichtmenge über einem bestimmten Schwellenwert zeigt die Gegenwart von Hepatitis B-Oberflächen-Antigen in der Probe an. Die Bestrahlung des Mediums erfolgt bei Raumtemperatur und der Test in homogener Weise, um einen Test auf Hepatitis B-Oberflächen-Antigen bereitzustellen.
  • Vorzugsweise wird in diesem Test Eu(TTA)3 in den Latexteilchen gelöst, um zu bewirken, dass das angeregte Xanthenderivat seine Energie auf Eu(TTA)3 überträgt, das bei über 600 nm emittiert. Dies vermeidet Seruminterferenz, die ansonsten aufgrund der Absorption durch Serumkomponenten von direkt aufgrund der Xanthen-Lumineszenz emittiertem Licht auftreten würde.
  • Figure 00950001
  • In einer weiteren Ausführungsform dient der Test der Bestimmung eines konkreten Blutgruppen-Antigens an der Oberfläche eines roten Blutkörperchens, d. h. eines A-Gruppen-Antigens. Wie oben beschrieben erzeugte Latexteilchen mit einer Teilchengröße von 150 bis 500 nm werden verwendet. Die Latexteilchen besitzen einen Antikörper für das A-Gruppen-Antigen, der kovalent mit dem Latexteilchen verbunden ist. Die Teilchen besitzen auch den Enolether 2-p-Dimethylaminophenyl-3-phenyl-5,6-dihydrodioxen, der im Latex gelöst ist. Dieses Latexteilchenreagens wird im wässrigen Medium (500 μl) mit Vollblut (100 μl) und 1 × 10–4 M Photosensibilisator kombiniert, der ein hydrophober Photosensibilisator ist, nämlich Phenazin-2-carbonsäure. Der hydrophobe Farbstoff lagert sich in in der Probe vorhandenen roten Blutkörperchen ein. Das Medium wird 10 min lang bei 25°C inkubiert und dann mit einer Wolframquelle 30 s lang bei 400 bis 450 nm besrahlt. Das aus dem Medium emittierte Licht wird gemessen und mit der Lichtmenge verglichen, die von Proben erhalten wird, die bekanntermaßen frei von A-Gruppen-Antigen roter Blutkörperchen sind. Somit zeigt die Lichtmenge über einem Schwellenwert die Gegenwart des A-Blutgruppen-Antigens an.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Analyt ein HLA-Antigen auf der Oberfläche einer Zelle. Eine Probe (50 μl), die vermutlich das HLA-Antigen enthält, wird in einem auf pH 7,4 gepufferten wässrigen Testmedium (500 μl) kombiniert. Dem Medium wird auch eine Überschussmenge eines Reagens zugegeben, das ein Antikörper für das HLA-Antigen ist, der mittels einer Thioether-Linkergruppe kovalent an Eosin gekoppelt ist. Auch eine Chemolumineszenzverbindung wird dem Testmedium zugegeben. Die Chemolumineszenzverbindung wird so gewählt, dass sie sich in der das HLA-Antigen enthaltenden Zelle einlagert. Die Chemolumineszenzverbindung ist ein Acridan, nämlich 9-(Dodecylphenylmethylidin-1)-N-(2-sulfonoxyethyl)acridan. Das Testmedium wird bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert und dann bei 500 bis 550 nm mit einer Wolfram-Halogen-Lichtquelle 1 min lang bestrahlt. Das vom Testmedium emittierte Licht wird gemessen, und die Lichtmenge über einem Schwellenwert ist ein Indikator für die Gegenwart des HLA-Antigens.
  • Die Erfindung umfasst ferner Zusammensetzungen, die ein suspendierbares Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,04 bis 4000 nm und einer Chemolumineszenzverbindung enthalten. Die Chemolumineszenzverbindung kann kovalent an die Teilchenmatrix gebunden oder in der Matrix oder in einem in der Matrix gelösten Lösungsmittel gelöst sein. Die Teilchen sind vorzugsweise Polymer- oder Öltröpfchen oder Vesikel wie etwa Liposomen. Wenn das Teilchen ein Liposom ist, ist die Chemolumineszenzverbindung mit der Lipid-Doppelschicht assoziiert oder im wässrigen Inneren des Liposoms gelöst. Das Teilchen besitzt ein gebundenes sbp-Element. Vorzugsweise besitzen die gebundenen sbp-Elemente einen mittleren Durchmesser von 100 bis 1000 mm. Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, die aus zwei komplementären aneinander gebundenen sbp-Elementen bestehen, worin eines mit einem Photosensibilisator und das andere mit einer Chemolumineszenzverbindung assoziiert ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das eine Kombination bereitstellt, die (1) ein Medium, von dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, und (2) ein Markierungsreagens umfasst, das ein erstes Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) mit einer PACC assoziiert umfasst. Die Bedingungen sind so gewählt, dass der sbp-Element-Komplex in Bezug auf das Vorhandensein des Analyten gebildet ist. Beispielsweise kann das erste sbp-Element fähig sein, sich an den Analyten oder ein zweites sbp-Element zu binden, um einen Komplex zu bilden, der mit dem Vorhandensein des Analyten in Beziehung steht. Das Verfahren umfasst weiters das photochemische Anregen der PACC und das Detektieren des von der PACC erzeugten Lumineszenz-Ausmaßes. Das Lumineszenz-Ausmaß steht mit der Analytmenge im Medium in Beziehung.
  • Im Allgemeinen wird die PACC durch Bestrahlung mit Licht photochemisch angeregt, das die PACC direkt anregen kann oder einen Photosensibilisator anregen kann, der bei Bestrahlung bewirkt, dass molekularer Sauerstoff in Singulettsauerstoff umgewandelt wird. der Singulettsauerstoff regt dann die PACC an. Der Photosensibilisator kann je nach der Art des Tests an einen Liganden gebunden sein, kann frei in Lösung vorliegen oder kann an eine Oberfläche gebunden sein. Das durch die Anregung der PACC mit Singulettsauerstoff gebildete Produkt kann sich unter Lichtemission spontan zersetzen oder kann weiter physikalisch oder chemisch behandelt werden, um Licht auszusenden.
  • Ein Photosensibilisator kann bei einer Anzahl verschiedener Ansätze eingesetzt werden, um Singulett-Sauerstoff zu produzieren, der die PACC aktiviert. Der Photosensibilisator kann direkt, ohne an ein sbp-Element gebunden zu sein, eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren wird eine relativ hohe Konzentration des Photosensibilisators eingesetzt, üblicherweise zumindest 10–7 M, vorzugsweise zumindest 10–6 M, am bevorzugtesten zumindest 10–5 M. Im Allgemeinen ist die Menge des hierin eingesetzten Photosensibilisators ausreichend, um eine Konzentration von Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, die zur Aktivierung der PACC führt. Diese Vorgangsweise kann dann gewählt werden, wenn die Emission der PACC substanziell modifiziert wird, wenn ein Komplex gebildet oder die Menge der PACC im Medium durch die Gegenwart des Analyten beeinflusst wird. Dies wird üblicherweise erreicht, indem gebundener und ungebundener Marken voneinander getrennt werden. Wenn man keine Trennung möchte, kann die Emission der PACC im Komplex durch einen Energieakzeptor modifiziert werden, der in unmittelbare Nähe mit der PACC gebracht wird, indem der Energieakzeptor an den Komplex gebunden wird, der aufgrund der Gegenwart des Analyten entsteht. Wenn der Energieakzeptor fluoreszierend ist, ändert sich üblicherweise die Wellenlänge der Emission. Wenn der Energieakzeptor nicht fluoreszierend ist, wird die Chemolumineszenz üblicherweise gequencht, wenn sich die PACC an den Komplex bindet.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden ein Photosensibilisator und die PACC zwischen dem Lösungskörper des Testmediums und einer Oberfläche aufgeteilt (siehe vorliegende Anmeldung). Diese Aufteilung hängt von der Menge an Analyt ab, die in der zu analysierenden Probe vorhanden ist, wobei sich der Photosensibilisator üblicherweise an ein sbp-Element bindet. Die Photosensibilisator-Moleküle, die sich nicht mit der Oberfläche assoziieren, produzieren Singulett-Sauerstoff, der die PACC nicht erreichen kann, bevor der Zerfall im wässrigen Medium erfolgt. Wenn sich jedoch sowohl der Photosensibilisator als auch die PACC mit der Oberfläche assoziieren, da ein Komplex aufgrund der Gegenwart des Analyten entsteht, kann der durch Bestrahlung des Photosensibilisators erzeugte Singulett-Sauerstoff die PACC vor dem Zerfall aktivieren. In diesem Verfahren kann die Menge des eingesetzten Photosensibilisators deutlich geringer sein als in der obigen Verwendung des Photosensibilisators ohne daran gebundenes sbp-Element.
  • Man erkennt, dass der vorliegende Test ein geeignetes Verfahren zum Detektieren und Messen einer Vielzahl von Analyten in einfacher, wirkungsvoller und reproduzierbarer Weise darstellt, wobei visuelle Kontrolle durchgeführt oder herkömmliche Geräte eingesetzt werden können, um die während der Reaktion erzeugte Lichtmenge zu messen.
  • Wenn sich der Photosensibilisator aufgrund der Gegenwart von Analyt mit der Oberfläche assoziiert, wird er üblicherweise mit einem sbp-Element assoziiert. Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. Der Photosensibilisator kann eine Funktionalität zur Bindung an ein sbp-Element enthalten, oder das sbp-Element kann die Funktionalität zur Bindung an den Photosensibilisator enthalten. Die Bindung kann durch direkte Bindung zwischen den zwei Molekülen erreicht werden, oder es kann eine Linkergruppe zwischen dem sbp-Element und dem Photosensibilisator vorgesehen sein. In einer anderen Ausführungsform kann der Photosensibilisator an ein Teilchen gebunden oder in dieses inkorporiert sein, an welchem Teilchen auch ein sbp-Element gebunden ist. In beiden Fällen kann sich das sbp-Element an den Analyten binden. Der Photosensibilisator kann in das Teilchen inkorporiert sein, wenn er in zumindest einer Phase des Teilchens löslich ist. Der Photosensibilisator kann an das Teilchen gebunden sein, wenn er nicht darin inkorporiert ist. Zu diesem Zweck wird der Photosensibilisator oder das Teilchen oder eine Komponente davon funktionalisiert, um ein Mittel zur Bindung des Photosensibilisator und des Teilchens bereitzustellen. Für Teilchen, die Öltröpfchen oder Lipid-Doppelschichten sind, kann der Photosensibilisator durch Bindung an eine lange Kohlenwasserstofkette an das Teilchen gebunden werden, welche Kette mit der Teilchenzu sammensetzung verträglich ist. Häufig werden zumindest eine, vorzugsweise zwei, Kohlenwasserstoffketten mit 8 bis 20 oder mehr C-Atomen eingesetzt.
  • Wenn das Teilchen ein Tröpfchen eines Fluorkohlenstoffs ist, kann der Photosensibilisator fluoriert werden, um die Löslichkeit zu verbessern und Austausch zu verringern; die zur Verknüpfung dienende Kohlenwasserstoffkette wird vorzugsweise durch eine Fluorkohlenstoffkette ersetzt. Bei Silikonteilchen ist der Photosensibilisator an ein Polysiloxan gebunden. Üblicherweise ist es wünschenswert, die Ladung und Polarität des Photosensibilisators zu minimieren, sodass er sich innerhalb des nichtwässrigen Abschnitts des Teilchens befindet. Wie oben erwähnt, ist das Verfahren, das den an ein sbp-Element gebundenen Photosensibilisator vorsieht, hierin ausführlich beschrieben.
  • Wie oben erwähnt, ist die PACC "mit einem sbp-Element assoziiert" und funktioniert somit hierin als Marker. Der Ausdruck "mit einem sbp-Element assoziiert" bedeutet Folgendes: Üblicherweise erfolgt die Assoziation der PACC und des sbp-Elements durch kovalente Bindung. Dieses Markerreagens kann jedoch außerdem ein suspendierbares Teilchen umfassen, an das die PACC gebunden ist oder in das die PACC nichtkovalent inkorporiert ist. Das suspendierbare Teilchen besitzt auch ein daran gebundenes sbp-Element. Dieses sbp-Element kann sich im Allgemeinen an den Analyten oder an ein sbp-Element binden, das sich an den Analyten binden kann. Wenn ein anderes sbp-Element eingesetzt wird und sich auch an den Analyten binden kann, ergibt sich eine Sandwichtest-Arbeitsvorschrift. Das an die PACC gebundene sbp-Element kann auch zum Analyten analog sein, in welchem Fall sich eine kompetitive Test-Arbeitsvorschrift ergibt.
  • Wenn ein Photosensibilisator eingesetzt wird, dient dieser dazu, die PACC zu aktivieren, wenn das die obigen Reaktanden enhtaltende Medium bestrahlt wird. Das Medium wird mit Licht bestrahlt, dessen Wellenlänge ausreichende Energie aufweist, um den Photosensibilisator in einen angeregten Zustand überzuführen, in dem er molekularen Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff aktivieren kann. Bei der Bindung an ein sbp-Element kann die Photosensibilisator-Konzentration sehr niedrig sein, häufig 10–6 bis 10–12 M oder weniger. Wenn der Photosensibilisator ungebunden ist, liegt er häufig in einer Konzentration vor, die ausreicht, um eine große Lichtmenge zu absorbieren, üblicherweise zumindest 0,1%, vorzugsweise zwischen 1 und 80%.
  • Der angeregte Zustand des Photosensibilisators ist üblicherweise der niedrigste Triplett-Zustand und liegt bei um zumindest 25 kcal/Mol, vorzugsweise zumindest 23 kcal/Mol, höherer Energie als der Grundzustand. Im Allgemeinen wird das Medium mit Licht mit einer Wellenlänge von etwa 300 bis 1200 nm, üblicherweise 450 bis 950 nm, vorzugsweise 550 bis 800 nm, bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer hängt von der Lebensdauer der aktivierten PACC, der Lichtintensität und der gewünschten Emissionsintensität ab. Für kurzlebige aktivierte PACCs kann die Dauer weniger als 1 s, üblicherweise 1 ms, unter Umständen 1 μs, sein, wenn ein starkes Blitzlicht oder ein Laser eingesetzt wird. Bei langlebigeren aktivierten PACCs kann die Bestrahlungsdauer länger sein und eine weniger intensive konstante Lichtquelle eingesetzt werden. Im Allgemeinen sollte die gesamte Lichtintensität während der Bestrahlungsdauer ausreichen, um zumindest 0,1%, vorzugsweise zumindest 30%, am bevorzugtesten 100%, der Photosensibilisator-Moleküle zumindest einmal anzuregen.
  • Die Lumineszenz oder das Licht, das in jeder der obigen Vorgangsweisen erzeugt wird, kann visuell, fotografisch, aktinometrisch, spektralphotometrisch oder auf beliebige andere geeignete Weise gemessen werden, um die Menge zu bestimmen, die mit der Menge an Analyt im Medium in Beziehung steht.
  • Ein Helium-Neon-Laser ist eine kostengünstige Lichtquelle zur Anregung bei 632,6 nm. Photosensibilisatoren, die Licht bei dieser Wellenlänge absorbieren, sind mit der Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers kompatibel und sind daher hierin besonders gut geeignet. Andere Lichtquellen sind beispielsweise andere Laser, wie z. B. Argon, YAG, He/Cd und Rubin; Photodioden; Quecksilber-, Natrium- und Xenon-Dampflampen; Glühlampen, wie z. B. Wolfram und Wolfram/Halogen; und Blitzlicht.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, das Folgendes umfasst: (a) das gleichzeitige oder vollständig oder teilweise aufeinander folgende Kombinieren (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) eines Markierungsreagens, das ein erstes Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp-Element) gebunden an eine Verbindung umfasst, die bei Umsetzung mit Singulettsauerstoff zur Chemolumineszenz fähig ist, und (3) eines insolubilisierten Reagens, das einen fluoreszierenden Energieakzeptor umfasst, der an ein zweites sbp-Element gebunden ist oder gebunden werden kann, unter Bedingungen, worin ein sbp-Element-Komplex, der das Markierungsreagens umfasst, in Bezug auf das Vorhandensein von Analyt im Medium gebildet wird und Energie von der chemolumineszierenden Verbindung den Fluoreszenzenergieakzeptor anregen kann, (b) das Anregen der Verbindung mit Licht, und (c) das Untersuchen des Testmediums auf ein Signal, wobei dessen Vorhandensein oder Intensität mit der Analytmenge im Medium in Beziehung steht.
  • Das Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung können an die meisten Tests mit sbp-Elementen angepasst werden, beispielsweise Ligand-Rezeptor-, z. B. Antigen-Antikörper-Reaktionen, Polynucleotid-Bindungstests usw. Die Tests können homogen oder heterogen, kompetitiv oder Sandwich-artig sein. In einem homogenen Test kann die Probe – falls erforderlich – vorbehandelt werden, um unerwünschte Materialien zu entfernen. Die immunologische Reaktion für einen Sandwich-Test umfasst üblicherweise ein sbp-Element, z. B. einen Antikörper, der komplementär zum Analyten und an die PACC gebunden ist; ein zweites sbp-Element, z. B. Antikörper, der auch komplementär zum Analyten ist; und die Probe von Interesse. In einer kompetitiven Arbeitsvorschrift kann die PACC mit einem sbp-Element, das analog zum und üblicherweise ein Derivat des Analyten ist, oder mit einem sbp-Element, das komplementär zum Analyten ist, z. B. Antikörper, assoziiert werden.
  • Die PACC kann entweder alleine oder assoziiert mit einem Energieakzeptor eingesetzt werden. Die Fähigkeit der durch eine aktivierte PACC hervorgerufenen Lumineszenz, den Energieakzeptor zu aktivieren, kann durch die Bindung der zwei sbp-Elemente bestimmt sein oder sich aus der relativ hohen Konzentration des Energieakzeptors in der Nähe der aktivierten PACC ergeben, worin die Konzentration üblicherweise zumindest im Mikromol-, noch häufiger zumindest im Millimol-Bereich liegt. Wenn die PACC an ein sbp-Element gebunden ist, kann hingegen ihre Konzentration recht niedrig sein, häufig 10–5 bis 10–15, üblicherweise 10–8 bis 10–14, und die Detektion ihres Ausmaßes in homogener Lösung ohne Trennung erfolgen, mit der Maßgabe, dass die Lumineszenzintensität modifiziert ist, wenn sich die PACC in einem Bindungskomplex befindet.
  • In einem heterogenen Test wird eine Probe, die vermutlich einen Analyten enthält, der ein sbp-Element ist, mit einem Reagens kombiniert, das aus einem komplementären sbp-Element besteht, das an einen Träger gebunden ist, der eine Oberfläche oder ein Teilchen mit der PACC sein kann. Ein mit einem weiteren sbp-Element assoziierter Energieakzeptor kann auch eingesetzt werden, worin das sbp-Element entweder komplementär (Sandwich) oder analog (kompetitiv) zum Analyten ist. Diese Materialien werden im Allgemeinen entweder gleichzeitig oder zur Gänze oder teilweise nacheinander kombiniert. Der Träger wird dann von der flüssigen Phase abgetrennt und entweder die feste oder die flüssige Phase auf Gegenwart von Lumineszenzenergie untersucht, üblicherweise durch Bestrahlen der jeweiligen Phase und Messen der emittierten Lichtmenge.
  • Ein Test auf den Analyten erfolgt normalerweise in wässrigem gepuffertem Medium bei mittlerem pH-Wert, im Allgemeinen bei jenem, der für optimale Testsensitivität sorgt. Wie oben erläutert kann der Test entweder ohne Trennung (homogen) oder unter Trennung (heterogen) der Testkomponenten oder -produkte durchgeführt werden.
  • Das wässrige Medium kann nur Wasser sein oder 0,01 bis 80 oder mehr Vol.-% eines Co-Lösungsmittels enthalten. Der pH-Wert für das Medium liegt üblicherweise im Bereich von etwa 4 bis 13, noch häufiger im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Der pH-Wert ist üblicherweise ein Kompromiss zwischen optimaler Bindung der Bindungselemente und dem pH-Optimum für andere Reagenzien des Tests (z. B. Teile des Signal-erzeugenden Systems). Beispielsweise erfordert unter Umständen die aktiverte PACC einen bestimmten pH-Bereich, um zwecks Erzeugung von Lumineszenz zu zerfallen.
  • Es können verschiedene Puffer eingesetzt werden, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen und ihn während der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils eingesetzte Puffer ist für die Erfindung nicht entscheidend, doch es kann in einem bestimmten Test ein konkreter Puffer vorzuziehen sein.
  • Zur Durchführung des Tests herrschen normalerweise moderate Temperaturen und während der Messdauer üblicherweise konstante Temperaturen, vorzugsweise Raumtemperatur. Die Inkubationstemperaturen reichen normalerweise von etwa 5°C bis 99°C, üblicherweise von etwa 15°C bis 70°C, noch häufiger 20°C bis 45°C. Die Temperaturen während der Messungen reichen im Allgemeinen von etwa 10°C bis 70°C, noch häufiger von etwa 20°C bis 45°C, noch häufiger von 20°C bis 25°C. In einigen Fällen erfordern die aktivierten PACC möglicherweise Erhitzen auf 100°C, um zwecks Erzeugung von Lumineszenz zu zerfallen.
  • Die Konzentration des zu untersuchenden Analyten reicht im Allgemeinen von etwa 10–5 bis 10–17 M, noch häufiger von etwa 10–6 bis 10–14 M. Überlegungen, z. B. ob der Test qualitiativ, semiquantitativ oder quantitativ ist, das jeweilige Detektionsverfahren und die Konzentration des Analyten von Interesse, bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien.
  • Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Testmedium im Allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von Interesse des Analyten bestimmt werden, wird die Endkonzentration für jedes der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Sensititivät des Tests im gesamten Bereich zu optimieren. Eine signifikante Varia tion der Konzentration des Analyten sollte für eine präzise messbare Signaldifferenz sorgen.
  • Während die Reihenfolge der Zugabe stark variieren kann, gibt es je nach Beschaffenheit des Tests verschiedene Präferenzen. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe – insbesondere für einen homogenen Test – ist die gleichzeitige Zugabe aller Materialien. Alternativ dazu können die Reagenzien zur Gänze oder teilweise nacheinander kombiniert werden. Gegebenenfalls kann ein Inkubationsschritt nach dem Kombinieren der Reagenzien vorgesehen sein; er dauert im Allgemeinen etwa 30 s bis 6 h, noch häufiger etwa 2 min bis 1 h.
  • In einem homogenen Test können alle Reagenzien nach ihrem Kombinieren auf Wunsch inkubiert werden. Dann wird die Kombination bestrahlt und das resultierende emittierte Licht gemessen. Das emittierte Licht steht in Beziehung zur Analytenmenge in der untersuchten Probe. Die Mengen der hierin in einem homogenen Test eingesetzten Reagenzien hängen von der Beschaffenheit des Analyten ab.
  • Die folgenden Tests dienen zur Veranschaulichung und sind keinesfalls einschränkend; sie sollen es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ermöglichen, den Umfang der Erfindung abzuschätzen und diese ohne allzu viele Experimente durchzuführen. Man beachte, dass die Auswahl von Analyten, Photosensibilisatoren, PACCs, Oberflächen, Teilchen und Reaktionsbedingungen in den folgenden Beispielen den Fachleuten nahe gelegt wird.
  • In den folgenden Tests werden Komponenten in einem vorwiegend wässrigen Medium mit pH 6 bis 8,5 kombiniert.
    • A. In einem Test auf HCG wird eine Harnprobe mit (1) Antikörper gegen HCG, gebunden an 1 μm-Latexteilchen und eingefärbt mit dem Photosensibilisator Kupferphthalocyanin, und (2) einem Antikörper gegen ein getrenntes, nicht-überlappendes Epitop von HCG, gebunden an die PACC 4, kombiniert. Nach der Inkubation der Suspension über 30 min werden die Teilchen durch Zentrifugation vom Medium abgetrennt, gewaschen und mit 300-nm-Licht bestrahlt. Die Intensität des emittierten Lichts nach der Bestrahlung steht in Beziehung zum HCG-Gehalt in der Probe. Die abgetrennten Teilchen können direkt bestrahlt oder vor der Bestrahlung in einem wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmittel suspendiert werden.
    • B. Bei einer Durchführungsart des Tests auf HCG in Serum, der A ähnelt, werden die Latexperlen, die verwendet werden, mit dem Photosensibilisator Kupferphthalocyanin gefärbt, und nach Inkubation werden sie vom Medium abgetrennt und dann mit Licht mit 600 nm bestrahlt. Die Intensität des ausgesandten Lichts steht mit der Menge an HCG in der Probe in Beziehung.
    • C. In einem Test auf Digoxin in Serum wird die PACC, an Digoxigenin konjugiertes Luminol, mit der Probe in einem Polystyrolnapf inkubiert, der mit Tetradecylphthalocyanin eingefärbt wurde. Die Oberfläche des Napfs ist mit einem Antikörper gegen Digoxin bestrichen. Nach der 30-minütigen Inkubation und der Entfernung des Testmediums wird der Napf mit 600 nm-Licht bestrahlt. Es ist vorzuziehen, vor der Bestrahlung eine Basenlösung zuzusetzen (pH 10–12). Die Intensität des nach Bestrahlung emittierten Lichts ist umgekehrt proportional zur Konzentration von Digoxin in der Probe.
    • D. In einem Test auf Albumin in Harn wird die Probe mit (1) einem Antikörper gegen Albumin (mit der PACC markiert) und (2) einem Antikörper gegen Albumin, der gegen ein nicht-überlappendes Albuminepitop gerichtet, das mit Energieakzeptor markiert ist, kombiniert:
      Figure 01060001
  • Der Photosensibilisator Methylenblau ist im Testmedium enthalten. Das Medium wird 10 min lang inkubiert und dann mit 600 nm-Licht bestrahlt. Die Intensität des durch den Energieakzeptor nach Abschluss der Bestrahlung emittierten Lichts (etwa 500 nm) ist direkt proportional zur Menge an Albumin in der Probe.
    • E. In einem Test auf Thyroxin in Serum wird die Probe mit an Latexperlen gebundenem Thyroxin kombiniert, worin die PACC 10 inkorporiert wurde, worin X2 = N(CH3)2 ist. Antikörper gegen Thyroxin, gebunden an den Sensibilisator, Diodosin, ist im Testmedium enthalten. Nach 10-minütiger Inkubation wird das Medium mit 550 nm-Licht bestrahlt und das nach Abschluss der Bestrahlung emittierte Licht gemessen. Die emittierte Lichtintensität ist umgekehrt proportional zur Menge an Thyroxin in der Probe.
    • F. In einem Test auf eine Target-Polynucleotidsequenz in einer DNA umfassenden Probe wird ein 25-Basen-Oligonucleotid, das komplementär zur Targetsequenz und an PACC 23 konjugiert ist, die 9-Phenylmethylidenxanthan ist, mit der Probe vermischt. Das Medium wird dann auf 75°C erhitzt und auf 55°C abgekühlt, um Hybridisierung des Oligonucleotids mit jeder vorhandenen Targetsequenz zu ermöglichen. Der Energieakzeptor und Interkalator, Acridinorange, und der Photosensibilisator, Phthalocyanintetrasulfonsäure, sind in der Hybridisierungslösung vorhanden oder können nach Abschluss der Hybridisierungsreaktion zugegeben werden. Die Lösung wird dann mit 600 nm-Licht bestrahlt und die Intensität des von Acridinorange nach Abschluss der Bestrahlung emittierten Lichts (etwa 500 nm) gemessen. Die Lichtintensität ist direkt proportional zur Gegenwart der Targetsequenz.
    • G. In einem Test auf eine Target-Polynucleotidsequenz in einer DNA enthaltenden Probe wird ein 25-Basen-Oligonucleotid, das komplementär zur Targetsequenz und mit dem Photosensibilisator, Phthalocyanin, markiert ist, dazu gebracht, an das Target zu hybridisieren (siehe E). Eine Verbindung, die sich an den kleineren Strang doppelstrangiger DNA bindet, Hoechst Farbstoff 33258, gebunden an PACC 20, N-Methyl-9-phenylmethylidenacridan, ist im Medium enthalten oder wird nach Hybridisierung zugesetzt.
  • Das Medium wird dann mit 600 nm-Licht bestrahlt und das nach Abschluss der Bestrahlung emittierte Licht gemessen. Die emittierte Lichtintensität ist direkt proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen Targetsequenz.
    • H. In einem Test auf Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAg) in Serum wird die Probe mit (1) 150 nm Latexteilchen (gefärbt mit der PACC und beschichtet mit Antikörpern gegen HBsAg) und (2) mit 150 nm Latexperlen (gefärbt mit dem Photosensibilisator Tetraphenylporphyrin und beschichtet mit Antikörpern gegen HBsAg) kombiniert. Nach einstündiger Inkubation des Gemisches wird die Suspension mit 550 nm Licht bestrahlt. Nach Abschluss der Bestrahlung wird die emittierte Lichtintensität gemessen und zur Menge an HBsAg in der Probe in Beziehung gesetzt.
    • I. In einem Test auf HBsAg in Vollblut wird die Vorgangsweise aus H wiederholt, außer dass die PACC enthaltenden Latexperlen durch Latexperlen ersetzt sind, die mit PACC 23 eingefärbt sind, die 9-Phenylmethylidenxanthan und der Energieakzeptor ist.
  • Figure 01080001
  • Die Intensität des bei 610 bis 620 nm emittierten Lichts wird gemessen und zur Konzentration von HBsAg in der Probe in Beziehung gesetzt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Sets zur Durchführung des Testverfahrens der Erfindung, das die Gegenwart oder Menge eines Analyten in einer Probe bestimmt, die vermutlich den Analyten enthält. Um die Vielseitigkeit der Erfindung zu erhöhen, können die Reagenzien in verpackter Kombination, im gleichen oder in getrennten Behältern, bereitgestellt werden, sodass das Verhältnis der Reagenzien die Optimierung des Verfahrens und Tests ermöglicht. Die Reagenzien können in getrennten Behältern vor liegen, oder es können verschiedene Reagenzien in einem oder mehreren Behältern kombiniert sein; dies hängt von der Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagenzien ab.
  • Ein Typ von Set umfasst (1) eine Zusammensetzung mit einem suspendierbaren Teilchen, das eine Chemolumineszenzverbindung enthält, wobei das Teilchen ein daran gebundenes sbp-Element aufweist, und (2) einen Photosensibilisator. Der Photosensibilisator kann an das sbp-Element gebunden oder mit einem Teilchen assoziiert sein, an das ein sbp-Element gebunden ist. Der Set kann überdies andere getrennt verpackte Reagenzien zur Durchführung eines Tests, z. B. Zusatzreagenzien usw., enthalten.
  • Eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sets umfasst eine mit einem ersten sbp-Element assoziierte Chemolumineszenzverbindung und einen Photosensibilisator, der in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in seinen Singulett-Zustand aktivieren kann und mit einem zweiten sbp-Element assoziiert ist, in verpackter Kombination.
  • Ein weiterer Typ von Set umfasst (1) eine Zusammensetzung mit einer an ein sbp-Element gebundenen PACC. Das Set umfasst einen Photosensibilisator und kann auch ein oder mehrere zusätzliche sbp-Element-Reagenzien enthalten. Ein Energieakzeptor kann an ein sbp-Element gebunden sein, um ein Reagens zu bilden, oder selbst als Reagens bereitgestellt werden. Ein an eine Oberfläche gebundenes sbp-Element kann ebenfalls enthalten sein. Das Set kann überdies andere getrennt verpackte Reagenzien zur Durchführung des Tests enthalten, z. B. Zusatzreagenzien usw.
  • Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung in Anspruch 1 dargelegte Teilchen bereit.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein in Anspruch 8 dargelegtes Verfahren zum Bestimmen eines Analyten bereit.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein in Anspruch 10 dargelegtes Set bereit.
  • Die chemolumineszierende Verbindung kann eine Olefingruppe und einen oder mehrere Elektronendonor-Substituenten in Konjugation mit der Olefingruppe enthalten.
  • Die chemolumineszierende Verbindung kann aus der aus 9-Alkyliden-N-methylacridanen, Enolethern und Enaminen bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
  • Der Photosensibilisator oder die chemolumineszierende Verbindung kann mit einem suspendierbaren Teilchen assoziiert sein, das die Oberfläche umfasst.
  • Eine Oberfläche kann auch dazu gebracht werden, in große Nähe zu kommen, und die Oberfläche befindet sich auf einem suspendierbaren Teilchen, und das Teilchen ist aus der aus Latexteilchen, Lipid-Doppelschichten, Öltröpfchen, Silicateilchen, Metallsolen und Farbstoffkristalliten bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Der Photosensibilisator kann ein aus der aus Methylenblau, Diodeosin, Porphryrinen und Phthalocyaninen bestehenden Gruppe ausgewählter Farbstoff sein.
  • Sowohl mit dem Photosensibilisator als auch mit der chemolumineszierenden Verbindung kann ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) assoziiert sein, und die sbp-Elemente sind unabhängig voneinander aus der aus Liganden, Rezeptoren, Polynucleotiden und Polynucleotid-Bindungsmitteln bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Die abgepackte Kombination kann (1) eine Zusammensetzung, die ein suspendierbares Teilchen umfasst, das eine chemolumineszierende Verbindung umfasst, wobei an das Teilchen ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) gebunden ist, und (2) einen Photosensibilisator umfassen, der sich nicht in der Zusammensetzung befindet und fähig ist, in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in seinen Singulettzustand anzuregen.
  • Das Set kann eine Zusammensetzung umfassen, die ein zweites suspendierbares Teilchen umfasst, das den, Photosensibilisator umfasst, wobei an das zweite Teilchen ein sbp-Element gebunden ist.
  • Die photochemische Anregung kann die Umsetzung der PACC mit Singulettsauerstoff umfassen.
  • Der Singulettsauerstoff kann durch Anregung eines Photosensibilisators erzeugt werden.
  • Der Analyt und das erste sbp-Element können jeweils unabhängig voneinander aus der aus Liganden, Rezeptoren und Polynucleotiden bestehenden Gruppe ausgewählt werden.
  • Die PACC kann eine Olefingruppe und einen oder mehrere Elektronendonor-Substituenten in Konjugation mit der Olefingruppe enthalten.
  • Die PACC kann aus der aus 9-Alkylidencridanen, Enolethern, 9-Alkylidenxanthanen und Enaminen bestehenden Gruppe ausgewählt werden.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden veranschaulichenden Beispiele näher erläutert. Die hierin angeführten Teile und Prozentsätze beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht. Die Temperaturen sind in °C angegeben.
  • Abkürzungen:
    • AbF: Monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen Fluorescein
    • AbIF: Monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen Intrinsic Factor
    • B12-LC25-F: Vitamin B12, verbunden mit Carboxyfluorescein (F) mittels einer Linkergruppe mit einer Länge von 25 Atomen, d. h.: HN(CH2)6NHCOCH2OCH2CONH(CH2)6NHCOCH2NHCO
    • BA-C18: 4-(N,N-Dioctadecylcarbamidomethoxy)benzal-9-methylacridan
    • t-Bu: t-Butyl
    • TFA: Trifluoressigsäure
      Figure 01120001
    • Biotin-LC21-F
      Figure 01120002
    • BSA: Rinderserumalbumin
    • Chl-a: Chlorophyll-a
      Figure 01130001
    • D-H2O: Entionisiertes Wasser
    • DPPC: Dipalmitoylphosphatidylcholin
    • DPPG: Dipalmitoylphosphatidylglycerin
    • DPPE: Dipalmitoylphosphatidylethanolamin
    • EDAC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
      Figure 01130002
    • F: Fluorescein
    • F-NHS: der N-Hydroxysuccinimidester von 6-Carboxyfluorescein
    • F-LC21NH2: Carboxyfluorescein, an das die Linkergruppe HN(CH2)6NHCOCH2OCH2-CONH(CH2)6NH2 gebunden ist
    • HCG: Human-Chorion-Gonadotropin
    • Lip: Liposom
    • nC10: Tetra-(n-decyl)phthalocyaninaluminiumchlorid-Komplex
      Figure 01140001
    • OD: Öltröpfchen
    • OD/BA-C18: BA-C18 enthaltende Öltröpfchen
    • PB: Polystyrol-Perlen
    • PB/BA-C18: BA-C18 enthaltende PB
    • PB/nC10: Tetra-(n-decyl)aluminiumphthalocyanin enthaltende PB
    • PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,02 M NaPi, 0,14 M NaCl/pH 7,2
    • Pi: Phosphat
    • Sulfo-NHS: Sulfo-N-hydroxysuccinamid
    • TSH: Thyroid-stimulierendes Hormon oder Thyrotropin-Hormon
    • SATA: S-Acetylthioglykolsäure-N-hydroxysuccinimidester
    • RLU: Relative Lichteinheiten
    • Ab1 (HCG): Monoklonaler Anti-HCGβ-Antikörper (12A8)
    • Ab2 (HCG): Monoklonaler Anti-HCGα-Antikörper (9D7)
    • Ab1 (TSH): Monoklonaler Anti-TSHβ1-Antikörper (35)
    • Ab2 (TSH): Monoklonaler Anti-TSHβ2-Antikörper (9G3) (Beachte: Für Ab1 (TSH) und Ab2 (TSH) sind Ab, und Ab2 Antikörper gegen die β-Kette von TSH, für zwei unterschiedliche Epitope.)
    • NHS: N-Hydroxysuccinimid
    • IF: Intrinsic Factor
    • DMSO: Dimethylsulfoxid
    • Avidin-PB/BA-C18: Kovalent an Avidin gebundene PB/BA-C18
    • AbF-PB/nC10: mit AbF beschichtete PB/nC10
    • DMF: Dimethylformamid
    • DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
    • TEA: Triethylamin
    • DC: Dünnschichtchromatographie
    • TNBSA: 2,4,6-Trinitrobenzolsufonsäure
    • Dig-CMO: O-Carboxymethyloxim von Digoxigenin-3-on
    • BGG: Rinder-β-Globulin
    • Biotin-LC7-NHS: Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanat
  • Alle monoklonalen Antikörper wurden durch Standard-Hybridzelltechnologie erzeugt. Das geeignete Immunogen wurde in einen Wirt, üblicherweise eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier, injiziert, und nach einem ausreichenden Zeitraum wurden die Milzzellen aus dem Wirt erhalten. Alternativ dazu wurden unsensibilisierte Zellen aus dem Wirt isoliert und direkt in vitro mit dem Immunogen sensibilisiert. Hybridzellen wurden durch Fusionieren der obigen Zellen mit der geeigneten Myelom-Zelllinie und Kultivieren der fusionierten Zellen gebildet. Die durch die kultivierten Hybridzellen produzierten Antikörper wurden hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität an das jeweilige Antgen, z. B. TSH oder HSG, gescreent. Einige Screening-Techniken kamen dabei zum Einsatz, z. B. ELISA-Screens. Es wurden ausgewählte Fusionen anschließend rekloniert.
  • Beispiel 1
  • Test auf Vitamin B12
  • Herstellung von B12-LC25-F-Konjugat
  • B12-LC25-F-Konjugat mit einem Spacerarm mit einer Länge von 25 Atomen (siehe unten) wurde hergestellt, indem durch Umsetzen des B12-Moleküls mit Methylisocyanatoacetat (reagiert mit der Hydroxylgruppe von Ribose im B12-Molekül, wodurch eine stabile Carbamat-Bindung entsteht) Carboxylgruppen in das B12-Molekül eingeführt wurden, gefolgt von Basenhydrolyse des Methylesters, um die Carboxylgruppe zu erzeugen. Die eingearbeitete Carboxylgruppe an der 5'-OH-Stelle wurde in den NHS-Ester von B12 umgewandelt und dann mit dem Fluoresceinamin F-LC21-NH2 umgesetzt, um das Endprodukt B12-LC25-F zu ergeben.
    • A. Syntheseschema für die 21-atomige Kette auf 5-Carboxyfluorescein
      Figure 01180001
      1,2 g (0,0056 Mol) des monogeschützten Diamins 1C1 wurden in 25 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und dieser gerührten Lösung 0,64 g (0,0056Mol) Diglykolsäureanhydrid 1A1 zugesetzt; die Reaktion wurde 5 h lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und mit 50 ml Wasser, 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit 0,1 N HCl (50 ml), Wasser (2 × 50 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt, um 1,35 g 1A2 zu erhalten. 1H NMR 100 MHz (CD3OD) δ 4.0, 3.85 (2S, 4, O-CH2-CO) W 3.0, 2.82 (2t, 4, NCH2), δ 1.4 (S; CH3)
  • 500 mg (1,33 mMol) 5-Carboxyfluorescein, 1A3, (getrocknet bei 80°C über P2O5 in einem Vakuum von 0,05 mm, 16 h) wurden in 20 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Der gerührten Lösung wurden 280 mg (1,46 mMol) 1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid und 168 mg (1,46 Mol) N-Hydroxysuccinimid zugesetzt. Nach 16-stündigem Rühren wurden 400 mg (1,85 mMol) Mono-t-Boc-1,6-diaminohexan zugesetzt und das Gemisch weitere 4 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das resultierende Gemisch wurde zu einer dicken Lösung eingeengt und in 1 : 9 Methanol-Ethylacetat (100 ml) gelöst sowie mit Wasser (3 × 50 ml), 0,1 N HCl (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf Analtech 1000 μm, 20 × 20 cm Kieselgel GF-Platten unter Verwendung von 0,5% Essigsäure und 10% Methanol in Dichlormethan gereinigt. Die reinen Banden wurden vereinigt und mit 1 : 1 Methanol/Dichlormethan extrahiert, eingeengt und der Rückstand in der minimalen Menge an Methanol gelöst und in Wasser eingetropft. Das Gemisch wurde anschließend zentrifugiert und der Feststoff im Vakuum getrocknet, wobei 83% 1A4 erhalten wurden.
  • 3,5 g (0,0064 Mol) Mono-t-Boc-l,6-diaminohexyl-5-carbonylfluorescein 1A4 (getrocknet bei 90°C über P2O5 in einem Vakuum von 0,05 mm, 16 h) wurden mit 40 ml Dichlormethan/Trifluoressigsäure = 1 : 1 behandelt. Die Lösung wurde in einem Eisbad durch mischt und nach 5 min das Lösungsmittel abgedampft und der rohe Rückstand über Nacht im Vakuum getrocknet.
  • 42 mg Mono-t-Boc-1,6-diaminohexylglykolsäureamid 1A2, 22 mg (0,190 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 36,4 mg (0,190 mMol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wurden in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan kombiniert und 16 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung der aktivierten Säure wurde zu einer gerührten Lösung von 75 mg (0,127 mMol) des obigen 1,6-Diaminohexyl-5-carboxylfluorescein-Derivats, 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid und 66 ml Triethylamin zugetropft. Nach 1 h wurde die Reaktion in Wasser aufgenommen und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser (3 × 25 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet, eingeengt und auf einer 20 × 20 cm 1000 μm Analtech Kieselgel GF-Platte unter Verwendung von 10% Methanol; 0,5% Essigsäure in Dichlormethan gereinigt. Die reine Bande wurde isoliert, mit Methanol/Dichlormethan extrahiert, eingeengt und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 4 ml Methanol aufgenommen und zu gerührter 0,1 N HCl (8 ml) zugetropft, zentrifugiert und getrocknet, um 84 mg 1A5 mit einer Ausbeute von 84% zu erhalten.
    1H NMR 500 MHz (CD3OD) δ 8.4(d, 1, ArH, J=. 71Hz) δ 8.17 (dd, 1, ArH, J = 8.0 Hz) δ 7.3(d, 1, ArH, J = 8.0Hz) δ 4.04 (d, 4·O-CH2-CO) δ 1.41 (S, 9, 3CH3)
    Analyse: ber. für C42H52N4O11: C, 63.7; H, 6.8; N, 7.0
    gef.: C, 63.56; H, 6.64; N, 7.0
  • Dem obigen 21 Atome langen t-Boc-Amin von 5-Carboxyfluorescein (getrocknet bei 80°C über P2O5 in einem Vakuum von 0,05 mm) wurden bei Umgebungstemperatur 5 ml Trifluoressigsäure zugesetzt. Nach 5 min wurde die Säure abgedampft und anschließend im Vakuum bei 80°C getrocknet, um das Trifluoressigsäuresalz 1A6 zu erhalten.
    FAB-MS C37H4 4N4O(M + H)+ 689 B
    • B. Syntheseschema für die Modifikation von B12 an der O5'-Position des Riboserings mit einem mit 5-Carboxylfluorescein verbundenen 25-Atom-Spacer
      Figure 01210001
      25 mg (0,0185 mMol) Vitamin B12 (1B1) (48 h lang bei 80°C getrocknet, 10μl) wurden in 1,25 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst. Dieser Ausgangslösung wurden 21,2 mg (0,185 mMol) Methylisocyanatacetat zugesetzt und das Reaktionsgemisch 24 h lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde in 10 ml einer gerührten Ethylacetat-Lösung eingetropft. Das gefällte Produkt wurde abzentrifugiert, dann in der minimalen Menge an Methanol resuspendiert und erneut gefällt. Dieses Material wurde auf einer präparativen Whatman PLC18F-Platte mit 1000 um und 20 x 20 cm mittels Isopropanol: Wasser = 2 : 8 als Eluent, umfassend 0,5 ml Essigsäure + 1 g NaCl pro 100 ml, gereinigt. Rf = 625. Die Isolierung vom Absorptionsmittel ergab den Methylester 1B2. (+)-FABM5 (C67H93CoN15O17P) mw 1469.6; (M + H) 1470, (M-CN)+ 1444
  • 40 mg (0,0272 mMol) des B12-O5'-Carbonylglycinmethylesters 1B2 wurden in 2,5 ml 2 : 1 Methanol : Wasser aufgenommen, mit Ammoniumhydroxid auf pH 9,5 eingestellt und 16 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
    DC-Analyse Whatman KC18F
    2 : 8 = Isopropanol : Wasser, 0,5% Essigsäure, 1% NaCl, Rf = 0,79.
  • Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockene eingeengt und das Produkt unter Verwendung von zwei Whatman PLC18F-Platten mit 1000 um und 20 × 20 cm mit demselben Eluenten wie oben isoliert. Die reine Bande wurde mit Methanol extrahiert, der Extrakt eingeengt, in 2 : 7 = Methanol : Dichlormethan gelöst, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in 4 ml Methanol gelöst und zu 4 ml Ethylether zugetropft. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und bei 60°C über P2O5, 0,5 mm, 16 h lang getrocknet, um 28 mg von Produkt 1B3 zu ergeben.
    (+)-FAB-MS (C66H91CoN15O17P) mw 1455.7, (M + H)+ 1456,
    (M-CN)+ 1431
  • 15 mg ((0,013 mMol) B12O5'-Carbonylglycin 1B3, 3,66 mg (0,016 mMol) N,N-Dicyclohexylcarbodiimid, 1,95 mg (0,017 mMol) N-Hydroxysuccinimid wurden mit 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid kombiniert und 16 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer gerührten Lösung von 13,6 mg (0,17 mMol) 21-atomigem Amin von 5-Carboxyfluorescein 1A6 in 2,02 mg (0,02 mMol) Triethylamin in 4 ml trockenem Dimethylformamid zugetropft und 12 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das rohe Reaktionsgemisch wurde im Vakuum bei 40°C eingeengt und der Rückstand in 2 ml Methanol aufgenommen, mit 6 ml Ethylether gefällt und abzentrifugiert. Der Feststoff wurde auf einer Whatman PLC18F-Platte mit 1000 μm und 20 × 20 cm mittels Methanol : Wasser = 7 : 3 als Eluent, umfassend 0,5% Essigsäure gereinigt. Rf = 0,78. 37% Ausbeute an 1B4.
    (+)-FAB-MS (C103H133CoN19O25P), (M + H)+ 2125; (M-CN)21 UV/max 360(ε 26,600), 50(ε 57,000), 550(ε 9500).
  • II. Biotinylierung von Anti-Intrinsic Factor- (AbIF-) Antikörpern
  • Die monoklonalen Anti-Intrinsic Factor-Antikörper (AbIF) wurden durch Standard-Hybridzelltechnologie gemäß dem Verfahren von Kohlen und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975), hergestellt.
  • Unter Verwendung von Biotin-LC7-NHS von Pierce Chemical Co., Rockford, III, USA, wurden drei unterschiedliche Biotinylierungs-Niveaus (AbIF: Biotin im Reaktionsgemisch = 1 : 10, 1 : 50 oder 1 : 200) durchgeführt. AbIF lag in 0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl/pH = 7,8 ] = 2,5 mg/ml vor. Dieser Lösung wurde DMSbei [IgGO (1% des Gesamtvolumens) mit der erforderlichen Menge an Biotin-LC7-NHS zugegeben und die Lösung dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Schließlich wurden die Reaktionsgemische auf Sephadex® G25 gereinigt und gründlich gegen 0,05 M NaPi, 0,02% NaN3/pH 7,2 dialysiert. Die biotinylierten Anti-Intrinsic Factor-Antikörper wurden tiefgefroren gelagert.
  • III. Herstellung von Teilchen
  • A. Materialien
  • 175 nm Carboxylat-modifizierter Latex: Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN 46032 USA;
    38 nm Carboxylat-modofizierter Latex: Duke Scientific Corporation, Palo Alto, CA 94303 USA;
    Ethylenglykol, Benzylalkohol, Benzonitril: Aldrich Chemical Co.;
    Sephadex® G-25: Pharmacia;
    nC10: Ultra Diagnostics Corporation, Seattle, WA 98105, USA.
  • B. AbF-PB/nC10
  • 1. 38 nm-Durchmesser-Teilchen
  • Eine 2,1 mM Lösung von nC10 wurde in Benzylalkohol gebildet. Ethylenglykol (16 ml) wurde in ein 20 ml-Glasfläschchen gefüllt und auf einer Laborheizplatte erhitzt. Benzylalkohol (1,6 ml) wurde zugegeben und das Gemisch magnetisch gerührt. Die Stamm-Latexsuspension (2 ml, 38 nm Carboxylat-modifizierter Latex mit 10% Feststoffen) wurde zugegeben und das Gemisch 3 bis 4 min lang äquilibriert. Die nC10-Lösung (0,4 ml) wurde in 100 μl-Aliquoten langsam zugegeben. Das Erhitzen auf 100°C wurde 5 min lang fortgesetzt; anschließend wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch auf eine Säule von Sephadex G-25 (2,5 × 15 cm), äquilibriert mit 50% wässrigem Ethanol, aufgebracht. Die Latex enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und auf eine zweite, mit Wasser äquilibrierte Sephadex G-25-Säule (2,5 × 35 cm) aufgebracht. Der Latex wurde in einem Volumen von 30 ml eluiert.
  • 2. 175 nm-Durchmesser-Teilchen
  • Eine 2,1 mM Lösung von nC10 wurde in Benzylalkohol hergestellt. Ethylenglykol (80 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt und auf einer Laborheizplatte auf 110°C erhitzt. Benzylalkohol (8 ml) wurde zugegeben und das Gemisch magnetisch gerührt. Die nC10-Lösung (2 ml) wurde zugegeben und unmittelbar danach Stamm-Latexsuspension (10 ml, 175 nM Carboxylat-modifizierter Latex mit 10% Feststoffen) zugesetzt. Das Erhitzen wurde 10 min lang unter kräftigem Rühren bei 100°C bis 110°C fortgesetzt. Der Kolben wurde dann in ein bei Raumtemperatur gehaltenes Bad gelegt, um abzukühlen. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch mit demselben Volumen an Ethanol verdünnt und sofort bei 15.000 U/min (Sorval, SA 600 Rotor) 2 h lang zentrifugiert. Der blassblaue Überstand wurde dekantiert und das Pellet unter Verwendung eines Badbeschallers in 50% wässrigem Ethanol (20 ml) resuspendiert, um die Teilchen zu dispergieren. Die Zentrifugation wurde 1 h lang bei 15.000 U/min wiederholt. Die Überstände wurden dekantiert und das Pellet in Wasser resuspendiert. Nach einer letzten Zentrifugation wurden die Pellets in Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 ml resuspendiert.
  • 3. Die Bindung der Perlen an AbF ist in Beispiel 3, Abschnitt V beschrieben.
  • C. Avidin - PB/BA-C18
  • 175 nm-Durchmesser-Teilchen
  • Eine 10 mM Lösung von BA-C18 wurde in Benzonitril gebildet. Ethylenglykol (80 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt und auf einer Laborheizplatte auf 100°C erhitzt. Benzonitril (9 ml) wurde zugegeben und das Gemisch magnetisch gerührt. Die Ba-C18-Lösung (1 ml) wurde zugegeben und unmittelbar danach Stamm-Latexsuspension (10 ml, 175 nM Latex mit 10% Feststoffen, s. o.) zugesetzt. Das Erhitzen wurde 5 min lang unter kräftigem Rühren bei 100°C bis 110°C fortgesetzt. Der Kolben wurde dann in ein bei Raumtemperatur gehaltenes Bad gehängt, um abzukühlen. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch mit demselben Volumen an 50% Ethanol verdünnt und sofort bei 15.000 U/min (Sorval, SA 600 Rotor) 4 h lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet unter Verwendung eines Badbeschallers in 50 wässrigem Ethanol (20 ml) resuspendiert, um die Teilchen zu dispergieren. Die Zentrifugation wurde 1 h lang bei 15.000 U/min wiederholt. Die Überstände wurden dekantiert und das Pellet in Wasser resuspendiert. Nach einer letzten Zentrifugation wurden die Pellets in Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 ml resuspendiert.
  • Die Bindung der Perlen an Avidin ist in Beispiel 3, Abschnitt VI beschrieben.
  • IV. Test-Arbeitsvorschrift
  • Der Test erfolgte durch Vermischen von 100 μl B12-Kalibratoren (ausgehend von einer ursprünglichen 10 μg/ml B12-Stammlösung verdünnt, 10 μM KCN) in Testpuffer (0,05 KPi, 0,1% BSA, pH 7,5; das BSA war frei von B12 und B12-Bindemittel) mit 50 ml 2,2 ng/ml B12-LC25-F und 50 μl vorgemischtem 88 ng/ml Intrinsic Factor (IF), 8,8 μg/ml AbIF-Biotin. Diese Gemische wurden bei Raumtemperatur 15 min lang im Dunkeln inkubiert; dann wurden 0,75 ml 0,05 Tris-HCl, 0,05 NaPi, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100/pH 8,2 Puffer, umfassend 1010 Perlen Avidin-PB/BA-C18 und 2,5 x 1011 Perlen AbF- PB/nC10, in jedes Röhrchen eingefüllt und die Inkubation weitere 30 min lang durch Schütteln im Dunkeln bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurde jedes Röhrchen 1 min lang mit einer Halogenlampe als Lichtquelle beleuchtet, die mit einem 650 nm-Cutoff-Filter ausgestattet war, und danach das Chemolumineszenzlicht durch Integration 20 s lang mittels eines Turner 20e-Luminometers gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst.
  • Beispiel 2
  • Test auf Digoxin
  • I. Herstellung von AbDig-Biotin
  • Monoklonale Anti-Digoxin-Antikörper (AbDig) wurden gemäß herkömmlicher Hybridzelllinien-Technologie erzeugt und Antikörper durch immobilisiertes Protein A gereinigt. Dann wurde das AbDig-Protein durch Vermischen des Antikörpers (etwa 2 – 2,5 mg/ ml in 0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl/pH 7,8) und Biotin-LC7-NHS (Pierce Chemical Co., Rockford, III, USA) (zuerst in DMF und einer kleinen für die Reaktion eingesetzten Allquote solubilisiert) sowie dreistündiges Inkubieren bei 4°C hergestellt. Im Reaktionsgemisch betrug das Molverhältnis der Reaktanden Antikörper: Biotin-LC7-NHS = 1 : 25. Das ungekoppelte Biotin wurde mittels Sephadex G-25-Säule entfernt. Das fertige Konjugat wurde in 0,05 M NaPi, 0,001% Thimerosal/pH = 7,4 bei 4°C gelagert oder tiefgefroren.
  • II. Herstellung von Dig-LC9-F
  • Dieses Reagens wurde in drei aufeinander folgenden Schritten hergestellt, indem (1) F-NHS, (2) F-LC9-NH2 und (3) Dig-LC9-F erzeugt wurden.
    • A. Herstellung von F-NHS: 2 ml 100 mg/ml 6-Carboxyfluorescein und 30,6 mg/ml NHS in DMF wurden 0,4 ml 275 mg/ml DCC zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Der entstehende Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt. Die Bildung von F-NHS wurde durch DC auf Silicaplatten unter Verwendung von CH2Cl2 : Methanol : Essigsäure = 85 : 15 : 1 als Lösungsmittelsystem überprüft. DMF wurde durch Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt (F-NHS) unter reduziertem Druck weiter getrocknet und getrocknet bei 4°C gelagert.
    • B. Herstellung von F-LC9-NH2 Zu 1,5 ml einer Lösung von Bis-(3-aminopropyl)methylamin (LC9; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) in DMF wurden 1,2 ml 125 mg/ml F-NHS in DMF zugegeben, gefolgt durch Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht unter Schütteln im Dunkeln. Das Molverhältnis von F-NHS : LC9 betrug 1 : 40. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 1 : 20 mit 0,5 M NaPi/pH 5,0 verdünnt, der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von Phosphorsäure (1,0 M) auf 5,0 eingestellt und das gesamte Gemisch auf eine BioRex-70®-Säule (2,5 × 10 cm; äquilibriert in 0,5 M NaPi/pH 5,0) geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit dem Ausgangspuffer gewaschen, bis das gesamte Bis-(3-aminopropyl)methylamin entfernt war (überwacht mittels TNBSA-Reaktion). Die Säule wurde mit 0,001 M NaPi/pH 6,0 gewaschen, um die Verunreinigung 6-Carboxyfluorescein zu entfernen. Das Waschen mit Puffer mit geringer Ionenstärke entfernte nicht nur das 6-Carboxyfluorescein, sondern auch ein weiteres, nicht identifiziertes Fluorescein, das Verunreinigungen enthält. Dann wurde die Säule mit D-H2O gewaschen, um die Salze zu entfernen. Schließlich wurde die Säule mit 0,8 M NH4OH gestrippt. Ammoniumhydroxid wurde durch Lyophilisierung entfernt. Nach Überprüfen der Reinheit wurde das Produkt in getrocknetem Zustand bei –20°C gelagert. An die Reaktion schloss sich Papier-Elektrophorese, die auch die Reinheit des Produkts kontrollierte (0,05 M NaPi/pH 5,8, 20 min lang unter Verwendung des Paragon-Elektrophoresesystems), und DC (C18-Platten unter Einsatz von 50% Methanol in D-H2O als Lösungsmittel).
    • C. Herstellung von Dig-LC9Mol) Dig-CM-F: Eine Lösung mit 23,05 mg (0,05 mO (hergestellt gemäß US-Patent 4.039.385, Beispiel 2, dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist), 50,35 mg (0,1 mMol) F-LC9-NH2 und 19,2 mg (0,1 mMol) EDAC in ) EMF/DMS1,5 mO (5 : 1) als Lösungsmittel wurde über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Dig-LC9-F und Dig-CMO (wenn nicht umgesetzt) wurden durch Zugabe von 3 ml D-H2O gefällt, abfiltriert und das Lösungsmittel verworfen. Das abfiltrierte Material wurde in einem Lösungsmittelsystem, bestehend aus CH2Cl2 : Methanol : Essigsäure = 60 : 40 : 5, resolubilisiert und auf eine 1,5 × 20 cm große Kieselgelsäule im gleichen Lösungsmittelsystem geladen. Unter diesen Bedingungen bewegte sich Dig-CMO weiter als Dig-LC9-F-Konjugat, und F-LC9-NH2 blieb am Säulenkopf gebunden. Die Reinheit des Materials wurde durch DC-Kieselgelplatten unter Verwendung des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems und durch Elektrophorese auf Papier bei pH 5,8 überprüft. Die Lösungsmittel wurden aus dem gereinigten Material mittels Rotationsverdampfung entfernt und das Produkt im Volumen an Methanol/DMF (70 : 30) resolubilisiert und anschließend zentrifugiert, um die unlöslichen Materialien (Kieselgel) zu entfernen. Der letzte Schritt erfolgte, um den Großteil des Kieselgels zu entfernen, das während der Reinigung solubilisiert und mit dem Produkt co-eluiert werden kann. Das Produkt wurde im Lösungsmittelsystem Methanol/DMF (70 : 30) bei –10°C bis –20°C gelagert. Die Konzentration des Produkts wurde durch A490 anhand einer Standardkurve ermittelt, die unter Verwendung bekannter Mengen von 6-Carboxyfluorescein erstellt wurde.
  • III. Test-Arbeitsvorschrift
  • Der Test wurde durchgeführt, indem 50 ml Digoxin-Kalibratoren in Serum (normales Humanserum ohne TSH) mit 50 μl 1,74 ng/ml Digoxin-LC9-F-Konjugat in Testpuffer (0,05 M Tris-HCl, 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 2 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml BGG/pH 8,2) und 50 μl 160 ng/ml AbDig-Biotin im gleichen Puffer wie oben vermischt wurden. Diese Gemische wurden bei Raumtemperatur 15 min lang inkubiert; anschließend wurde 0,75 ml 0,05 M Tris HCl, 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 8,2 Puffer, umfassend 1010 Akzeptorperlen (Avidin-PB/BA-C18) und 2,5 × 1011 Sensibilisierungsperlen (AbF-PB/nC10)), je dem Röhrchen zugegeben und die Inkubation weitere 30 min lang durch Schütteln im Dunkeln bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurde jedes Röhrchen 1 min lang mittels einer Halogenlampe, die mit einem 650 nm-Cutoff-Filter ausgestattet war, als Lichtquelle beleuchtet und dann das Chemolumineszenzlicht durch Integration 20 s lang mit einem Turner 20e-Luminometer gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 zusammengefasst.
  • Beispiel 3
  • Test auf Human-Chorion-Gonadotropin und Test auf Thyroid-stimulierendes Hormon
  • I. Reagenzien und Materialien
    • A. BA-C18 wurde durch das nachstehend beschriebene Verfahren synthetisiert. Alle Reagenzien stammten – sofern nicht anders angegeben – von Aldrich Chemical Co.
  • 1. p-Formylphenoxyessigsäuredioctadecylamid
  • Einer 100 ml-Lösung von frisch destilliertem Tetrahydrofuran (THF) wurden p-Formylphenoxyessigsäure (K & K Labs, Molekulargewicht 180, 0,540 g, 3,0 mMol), Triethylamin (Molekulargewicht 101,19, 0,333 g, 3,3 mMol) und Trimethylacetylchlorid (Molekulargewicht 120,57, 0,398 g, 3,3 mMol) zugegeben. Nachdem das Gemisch 20 min lang rückflusserhitzt worden war, wurde Dioctadecylamin (Fluke; Molekulargewicht 522,01, 1,723 g, 3,3 mMol) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht am Rückfluss gehalten.
  • Am nächsten Tag wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid aus der Reaktionslösung extrahiert. Die Methylenchlrorid-Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet.
    • 2. p-(N,N-Dioctadecylcarbamidomethoxy)benzal-9-methylacridan 10-Dimethoxyphosphinyl-9-methylacridan (Monatshi Chem. 114, 3 (1988); Molekulargewicht 303,27, 0,100 g, 3,3 mMol) in wasserfreiem THF wurden 0,413 ml 1,6 M n-Butyllithium-Lösung in Hexan bei –78°C (Aceton/trockenes Eisbad) unter Argon zugegeben. Nach Zugabe der n-Butyllithium-Lösung schien die Lösung gelb. Eine Lösung des obigen Amids in THF wurde 20 min nach der Zugabe von n-Butyllithium zugegeben. Die Reaktionslösung wurde über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen.
  • Am nächsten Tag wurde das Produkt mittels DC (Kieselgel; 3 : 7 = Ethylacetat : Hexan) isoliert. Das isolierte Produkt wurde durch Massenspektralanalyse und NMR analysiert und im Dunkeln gelagert.
    • B. Singulett-Sauerstoff-Erzeugerfarbstoff (nC10) stammte von ULTRA Diagnostic Corporation. EDAC, SATA, HCG und BSA stammten von Sigma Co. Ab1(TSH)-Biotin und Ab2(HCG)-Biotin sowie Ab2(TSH)-F wurden gemäß einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1, Abschnitt II (siehe auch US 07/389.659, eingereicht am 4. August 1989, d. h. EP-A-411.945, veröffentlicht am 6. Februar 1991, dessen relevante Abschnitte hierin durch Verweis aufgenommen sind) hergestellt.
  • Es wurde ein Luminometer von Turner Designs (Modell 20e) eingesetzt.
  • II. Herstellung von mit Anti-HCG-Antikörper stabilisierten Öltröpfchen (Ab1(HCG)-OD/BA-C18)
  • Die mit Anti-HCG-Antikörper markierten Öltröpfchen (OD) wurden durch Übertragen von 1 ml 10 mg/ml Anti-HCG-β (12A8, IgG) in ein Glasröhrchen, das 50 μl 5 mM BA-C18 in Dibutylphthalat enthielt, hergestellt. Das Protein befand sich in 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 7,6. Das Öl wurde durch Beschallung und gleichzeitiges kontinuierliches mechanisches Rühren emulgiert. Man beachte, dass energiereiche Beschaller erfor derlich waren, um kleinere Öltröpfchen zu erzeugen. Die Beschallung erfolgte 7 min lang unter Verwendung des Bronson-Beschallers (als Kühlmittel wurde Leitungswasser mit Raumtemperatur eingesetzt). Ungebundenes Protein wurde durch Zugabe von 25 Na2SO4-Lösung, um eine Endkonzentration von 8% bis 9% zu erhalten, und anschließendes Zentrifugieren (Mikrozentrifuge, Einstellung 8, 10 min lang) entfernt. Der Waschschritt erfolgte drei Mal (die Zentrifugationsgeschwindigkeit sollte solcherart eingestellt sein, dass die Öltröpfchen abgetrennt werden, aber nicht koaleszieren). Nach dem letzten Waschgang wurden die Teilchen in 1 ml 0,05 M NaPi, 0,15 NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6 suspendiert und 3 min lang erneut beschallt. Das Endvolumen des Präparats wurde auf 5 ml eingestellt und Saccharose in einer Endkonzentration von 2% zugegeben. Diese Ab1(HCG)-OD/BA-C18-Teilchen wurden bei 4°C gelagert. Die durch das oben beschriebene Verfahren gebildeten Öltröpfchen waren größenmäßig heterogen und wiesen einen mittleren Durchmesser von 1 – 5 μm auf.
  • III. Herstellung von Avidin-Lip/nC10
  • Die Liposomen wurden durch das Methanol-Verdünnungsverfahren hergestellt. Typischerweise wurde ein Gemisch von Lipiden – Cholesterin (2,0 mg), DPPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA; 23,8 mg), DPPG (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA; 6,5 mg), Maleimid-DPPE (Molecular Probe, Eugene, OR, USA; 0,5 mg) und nC10 (0,5 mg waren in warmem Methanol gelöst; 200 μl) – zu 2 ml Wirbelpuffer-B (0,05 m NaPi, 0,05 M NaCl, 5 mM EDTA/pH 6,0) zugegeben. Die Suspension wurde dann durch eine 1,5 ×20 cm große Sephadex G-25-Säule in Puffer-B geschickt. Die gesammelten Liposomen enthaltenden Fraktionen wurden mittels Mikrozentrifuge zentrifugiert, um allenfalls große Teilchen zu entfernen. Schließlich wurden Maleimid enthaltende Liposomen langsam der gerührten succinylierten Avidin-SH-Lösung (wie oben gebildet) in Puffer-B zugegeben. Nach dem Spülen mit Argon wurde dieses Gemisch langsam (ohne Rührstäbchen) über Nacht bei 4°C vermischt. Die überschüssigen Maleimidgruppen wurden mit 2 mM Mercaptobernsteinsäure (im Reaktionsvolumen) 30 min lang bei 4°C blockiert, gefolgt von der Zugabe von Iodessigsäure bis zu einer Endkonzentration von 5 mM, um die überschüssigen Thiolgruppen zu blockieren (30 min lang bei 4°C). Das Reaktionsgemisch wurde dann mittels einer Centriprep-30®-Vorrichtung auf 2,5–3 ml eingeengt, und es wurden die ungebundenen Avidinmoleküle durch Gelfiltration auf einer 1,5 × 50 cm großen Sepharose-2B-Säule in Puffer-B entfernt.
  • IV. Herstellung von succinyliertem Avidin-SH
  • Avidin wurde mit SATA (5 Mol pro Mol Avidin; 10 mg/ml Avidin in 1 M NaPi/pH 7,4) über Nacht bei 4°C umgesetzt. Der gleichen Lösung wurde Bernsteinsäureanhydrid in DMF (50 Mol pro Mol Avidin) zugegeben (das gesamte DMF machte weniger als 1 des Reaktionsvolumens aus) und die Lösung 2 h lang inkubiert. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch Zugabe von 0,5 M Na2HPO4 auf 7,4 gehalten. Die geschützten Thiolgruppen (Thioester) wurden mit Hydroxylamin (0,1 M, pH 7,0) 1 h lang bei Raumtemperatur von Schutzgruppe befreit. Schließlich wurden überschüssige niedermolekulare Moleküle mittels einer 1,5 × 30 cm großen G-25-Säule in Puffer-B (0,05 M NaPi, 0,05 M NaCl, 5 mM EDTA/pH 6,0; entgast und mit Argon gesättigt) entfernt. Der Proteinpeak (Avidin-SH) wurde gesammelt und das Protein dann mit Maleimid enthaltenden Liposomen umgesetzt.
  • V. Herstellung von mit Anti-Fluorescein beschichteten und mit nC10 eingefärbten Perlen (AbF-PB/nC10)
  • Carboxylierte Polystyrolperlen (38 nm; siehe Beispiel 1, Abschnitt IIIB) wurden mit nC10 eingefärbt. EDAC/Sulfo-NHS-Konjugationschemie diente zur Bindung des AbF an diese Polystyrolperlen. Typischerweise wurden 10 ml 0,02 M NaPi, umfassend 5 mg/ml mit nC10 eingefärbte carboxylierte Polystyrolperlen und 11 mg/ml Sulfo-NHS (pH-eingestellt auf 5,5), mit 1 ml frisch hergestellter Lösung von EDAC (200 mg/ml) in D-H2O vermischt. Nach dem Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln über den Zeitraum von 25 min wurden die Perlen zentrifugiert, um überschüssiges EDAC zu entfernen (da EDAC Mikroaggregation dieser Perlen bewirkt, war es möglich, sie mit herkömmlichen Zentrifugen zu pelletieren, z. B. Sorval unter Verwendung von SA-600-Rotor bei 15.000 U/min). Die pelletierten Perlen wurden in 3 ml 0,005 M NaPi/pH 5,8 resuspendiert und dann in eine gerührte Proteinlösung eingebracht (15 mg 0,02 M Borax, 0,08 M NaCl, 2 mg/ml 3Gl IgG (AbF), 8 mg/ml BSA/pH 8,9). Das Gemisch wurde vorsichtig ohne Rühren über Nacht bei 4°C geschüttelt. Die übrigen reaktiven Gruppen auf den Perlen wurden – falls vorhanden – mit 0,083 M Glycin und 15 mg/ml BSA/pH 8,9 bei 4°C 60 min lang blockiert. Die ungebundenen Proteine wurden durch aufeinander folgende Waschungen mit 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 7,6 entfernt. Das fertige Pellet wurde in Waschpuffer resuspendiert, beschallt und in diesem Zustand bei 4°C gelagert. Die endgültige Größe dieser Perlen betrug 140 nm.
  • VI. Herstellung von mit Avidin beschichteten und mit Benzalacridan gefärbten Perlen (Avidin-PB/BA-C18)
  • Carboxylierte Latexperlen (0,175 μ) wurden mit BA-C18 eingefärbt (siehe Beispiel 1, Abschnitt IIIC). EDAC/Sulfo-NHS-Konjugationschemie diente zum Konjugieren des Avidins an diese Teilchen. Die Aktivierung der Perlen durch Sulfo-NHS/EDAC erfolgte in gleicher Weise wie für das obige Präparat AbF-PB/nC10 beschrieben. Die aktivierten Perlen (100 mg) wurden zentrifugiert, um überschüssiges EDAC zu entfernen, anschließend in 2,5 ml 0,005 M NaPi/pH 5,8 resuspendiert und in eine gerührte Avidinlösung übertragen (15 ml 0,025 M Borax, 1,33 mg/ml Avidin/pH 9,1). Das Gemisch wurde vorsichtig bei 4°C über Nacht vermischt. Avidin auf den Perlen wurde durch Zugabe von 20 μl 1 M Bernsteinsäureanhydrid in DMF (60 facher Molüberschuss gegenüber Avidin) und einstündige Inkubation bei 4°C succinyliert. Die Perlen wurden mit 7 mg/ml BSA (Endkonzentration im Reaktionsgemisch) 60 min lang bei 4°C blockiert. Schließlich wurden die Perlen drei Mal mit 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl/pH 7,6 durch Zentrifugation gewaschen und in 10 ml Waschpuffer gelagert. Im letzten Schritt wurden die Perlen beschallt, um monodisperse Teilchen zu erhalten. Die Größe der Perlen änderte sich nach der Proteinmarkierung (ca. 190 nm) nicht signifikant. Avidi-PB/BA-C18 wurde in Waschpuffer bei 4°C gelagert.
  • VII. Herstellung von Biotin-LC21-F
  • 1. Reaktionsschema
  • Figure 01350001
  • 2. Materialien
  • 6-Carboxyfluorescein, Kodak; Biotin-NHS-Ester, Pierce Chemical Co.; 4,9-Dioxa-1,12-dodecandiamin, Aldrich Chemical, Co.; trockenes DMF, destilliert über Calciumoxid; Ag-MP-1 (C1) Anionenaustauschharz, BioRad Laboratories.
  • 3. Fluoresceinaminhydrochlorid VII3
  • 6-Carboxyfluorescein (VII 1; 10 g, 26,6 mMol) wurde in trockenem DMF (25 ml) gelöst. N-Hydroxysuccinimid (3,22 g, 28 mMol) wurde als Feststoff der DMF-Lösung zugegeben und gelöst. Das Gemisch wurde dann in einem Eisbad gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (5,8 g, 28 mMol) wurde in trockenem DMF (10 ml) gelöst und auf einmal der kalten DMF-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde bei Eisbadtemperatur 30 min lang gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Der Reaktionsverlauf wurde mittels DC verfolgt (10% MeOH-CH2Cl2, umfassend 1% Essigsäure). Nach 3 Stunden war die Bildung des Fluorescein-NHS-Esters VII2 abgeschlossen.
  • 4,9-Dioxa-1,12-dodecandiamin (25,5 g, 125 mMol) wurde mit trockenem DMF (10 ml) verdünnt. Das Fluorescein-NHS-Ester-Reaktionsgemisch wurde in Eis unter Argonatmosphäre gekühlt und die Diaminlösung 5 min lang zugetropft. Das Kühlbad wurde entfernt und Rühren bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der Reaktionsverlauf wurde mittels des obigen Systems durch DC verfolgt. Als die Reaktion als abgeschlossen eingestuft wurde, wurde das Gemisch mit Wasser (100 ml) verdünnt und in Eis gekühlt, um Dicyclohexylharnstoff zu fällen, der durch Filtration entfernt wurde.
  • Das Filtrat wurde mit AG-MP-1 (C1) Anionenaustauschharz aufgeschlämmt und in eine Chromatographiesäule gegossen. Das Harz wurde mit 50% wässrigem Methanol gewaschen, bis freies Diamin nicht mehr mittels Ninhydrin detektierbar war. Das Harz wurde dann mit 0,1 N Salzsäure in 50% wässrigem Methanol eluiert. Fluoresceinaminhydrochlorid eluierte zuerst, gefolgt von 6-Carboxyfluorescein. Reinfraktionen wurden gesammelt und auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. Nach dem Trocknen im Hochvakuum wurden 3,4 g reines Fluoresceinaminhydrochlorid VII3 gewonnen.
  • 4. Fluorescein-LC21-Biotin VII4
  • Fluoresceinaminhydrochlorid VII3 (350 mg, 0,61 mMol) wurde in trockenem DMF (15 ml) gelöst. Triethylamin (300 ml) wurde zugegeben, gefolgt von NHS-Ester (445 mg, 0,8 Mol). Der Reaktionsverlauf wurde durch DC (MemOH-CH2Cl2-Essigsäure-Wasser, 10 : 78 : 1 : 1) verfolgt. Als die Reaktion als abgeschlossen eingestuft wurde, wurde DMF auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mit Kieselgel (10 g) aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde auf dem Rotationsverdampfer zu einem frei fließenden Pulver getrocknet, das in Dichlormethan aufgeschlämmt und auf den Kopf einer mit Dichlormethan äquilibrierten Kieselgelsäule (2,5 × 25 cm) aufgebracht wurde. Die Säule wurde mit dem obigen DC-Lösungsmittelgemisch eluiert. Produkt enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und Lösungsmittel auf dem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in Ethanol aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wurde langsam eingedampft und das Produkt als Gummi abgelagert. Der Gummi wurde im Hochvakuum getrocknet, um 350 mg Fluorescein-LC21-Biotin VII4 (F-LC21-Biotin) zu ergeben, das ohne weitere Charakterisierung eingesetzt wurde.
  • VIII. Tests
  • A. HCG-Test-Standardkurve (OD mit Lip)
  • Ein HCG-Test erfolgte, indem zuerst NCG (variierende Mengen), Ab1(HCG)-OD/BA-C18 und Ab2(HCG)-Biotin miteinander vermischt wurden. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde eine überschüssige Menge an Avidin-Lip/nC10 zugegeben und die Inkubation weitere 30 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurden die Röhrchen jeweils 1 min lang bestrahlt und die Lumineszenz 20 s lang gemessen.
  • Arbeitsvorschrift:
  • Kombinieren von:
    50 μl HCG in variierender Konzentration in Probenpuffer (0,05 MNaPi, 0,15 MNaCl, 0,4% BSA, 20% Saccharose, 4 mg/ml Dextransulfat (T-500), pH 7,5);
    50 μl 4 μg/ml Ab2(HCG)-Biotin in Testpuffer (0,05 MNaPi, 0,15 M NaCl, 0,4% BSA, pH 7,5); und
    50 μl Ab1(HCG)-OD/BA-C18-Reagens (5 × 108 OD/Röhrchen)
    Inkubieren über 1 h bei Raumtemperatur mit Schütteln im Dunkeln
  • Zugabe von:
    50 μl 1,5 × 1012 Avidin-nC10 Lip (7,3 × 1010 lip/Röhrchen);
    30-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur mit Schütteln im Dunkeln
    1-minütiges Bestrahlen mit Halogenlampe (120 mW Lichtleistung bei Verwendung eines 650 nm-Cutoff-Filters). Dann bei abgeschalteter Lichtquelle Messen der Lichtintensität über 20 s. Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst.
  • B. Test auf Biotin-LC21-F
  • Der Test wurde durch Vermischen von 50 ml Avidin-PB/BA-C18 (2 × 1011 Perlen/ml), 50 ml AbF-PB/nC10 (5 × 1012 Perlen/ml) und 100 ml Biotin-LC21-F (variierende Mengen) in 0,05 NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6 durchgeführt. Dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1,5 h lang mit Schütteln im Dunkeln inkubiert. Schließlich wurde jedes Röhrchen mit einer Halogenlampe (ausgestattet mit 650 nm-Cutoff-Filter) 1 min lang bestrahlt, woraufhin die Lichtleistung 20 s lang durch Integration der Lichtintensität in einem Turner 20e-Luminometer gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in 4 zusammengefasst.
  • C. TSH-Test-Standardkurve
  • Der TSH-Test wurde durch Vermischen von 200 μl TSH in variierenden Konzentrationen in 0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6 mit 50 μl 4 μg/ml Ab1(TSH)-Biotin und 4 μg/ml Ab2(TSH)-F durchgeführt. Diese Gemische wurden bei Raumtemperatur 1,5 h lang inkubiert. Danach wurden 100 μl PBS mit 1010 Avidin-PB/BA-C18-Perlen und 2,5 × 1011 AbF-PB/nC10-Perlen jedem Röhrchen zugegeben. Die Inkubation wurde weitere 1,5 h lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Schließlich wurde jedes Röhrchen mit einer Halogenlampe (ausgestattet mit einem 650 nm-Cutoff-Filter) bestrahlt, woraufhin die Lichtleistung durch Integrieren der Lichtintensität über den Zeitraum von 20 s (5 und 6) in einem Turner 20e-Luminometer gemessen wurde.
  • Beispiel 4
  • Test auf HCG unter Verwendung von löslichem Photosensibilisator und
  • Akzeptor-Öltröpfchen
  • 1. Reagenzien
  • Mit Akzeptor-Farbstoff eingefärbte Öltröpfchen = Ab1(HCG)-OD/BA-C18 (beschrieben in Beispiel 3, Teil II).
  • Ab2(HCG)-Biotin – ähnlich hergestellt wie in Beispiel 2, Teil 1, aus NHS-Derivat von Biotin von Pierce Chemical Co.
  • Strepavidin-T680 – von Ultralite Diagnostics Co., Strepavidin, markiert mit einem wasserlöslichem Analog des oben beschriebenen nC10-Farbstoffs.
  • II. Test
  • Der Test wurde durch Vermischen von 50 μl Probenpuffer (0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA, 4 mg/ml Dextran-SO4 (T500), 20% Saccharose/pH 7,6), umfassend variierende Mengen an HCG mit 50 μl 4 μg/ml Anti-HCG-Biotin in Testpuffer (0,05 M NaPi, 0,15 M NaCl, 4 mg/ml BSA/pH 7,6) und 50 μl Ab1(HCG)-OD/BA-C18-Reagens mit 5 × 108 Öltröpfchen) durchgeführt. Dieses Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach wurden 50 μl 2 μg/ml Strepavidin-T680 in Testpuffer jedem Röhrchen zugegeben und die Inkubation weitere 30 min lang fortgesetzt. Schließlich wurde jedes Röhrchen 1 min lang mit einer Halogenlampe (ausgestattet mit 650 nm-Cutoff-Filter) bestrahlt und dann die Lichtleistung 20 s lang mit dem Turner 20e-Luminometer gemessen. Die Ergebnisse sind in 7 zusammengefasst.
  • Beispiel 5
  • Homogener Test auf Target-Oligonucleotid
  • Die Targetsequenz wurde aus Escherichia coli K12 DNAJ-Gen (J. C. A. Bardwell, K. Tilly, E. Craig, J. King, M. Zylicz und C. Georgopoulos, J. Biol. Chem. 261, 1782–1785 (1986)) ausgewählt. Ein 50mer mit der dargestellten Sequenz wurde durch das Phosphittriester-Verfahren unter Anwendung von Biosearch 8750 hergestellt, umfassend ein Biotin, das am 5'-Ende mittels Biotin-ONTM Phophoramidit (Clontech, Palo Alto, CA, USA) inkorporiert war.
  • Sequenz:
    Figure 01400001
  • Die Sonde war ein komplementäres 30mer mit einem Fluorescein (F), das an einem modifizierten C gebunden war; die Sequenz sieht folgendermaßen aus:
    Figure 01400002
  • Das Fluorescein wurde durch Inkorporieren von modifiziertem Nucleotid N4-LCA-5-Methyldesoxycytidin CEDT Phosphoramidit (American Bionetics, Hayward, CA, USA) und anschließendes Markieren mit dem N-Hydroxysuccinimidester von 5-Carboxyfluorescein unter Verwendung eines 200fachen Molüberschusses von Ester in pH 9,0 NaHCO3 mit 30% (Vol./Vol.) DMF eingeführt. Das Rohprodukt wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Avidin-PB/BA-C18- und AbF-PB/nC10-Perlen waren die gleichen wie in den obigen Beispielen.
  • Eine Standardkurve für das Target wurde durch Reihenverdünnung in 50 mM NaH2PO4, 600 mM NaCl, pH 7,5, umfassend 4 g/l Rinderserumalbumin und 10 mg/l Kalbsthymus-DNA als Träger, erstellt. Aliquoten (5 μl) wurden zu 4,8 pMol Fluorescein-markierter Sonde in 5 μl des gleichen Puffers in einem 12 × 75 Polypropylen-Reagensglas zugegeben. Die Gemische wurden abgedeckt und 10 min lang auf 72°C erhitzt, um vollständige Hybridisierung sicherzustellen. Etwa 1010 Donor (Sensibilisator) (AbF-PB/nC10)-Perlen wurden 50 μl 50 mM NaH2PO4, 600 mM NaCl, pH 7,5, umfassend 4 g/l Rinderserumalbumin, zugegeben, gefolgt von 2,5 × 1011 Akzeptor-(Avidin-PB/BA-C18)-Perlen in 50 μl der gleichen Substanz. Nach 30 min bei Raumtemperatur und Schütteln auf einer Orbitalschüttelvorrichtung wurde jedes Röhrchen 1 min lang mit einer mit einem 650 nm-Filter ausgestatteten Halogenlampe (s. o.) bestrahlt. Die Lichterzeugung im Zeitraum von 20 s wurde von einem Turner-Luminometer bestimmt. Die resultierende Standardkurve ist aus 8 ersichtlich.
  • Beispiel 6
  • Detektion von synthetischem Target, das sich an die biotinylierte Sonde und die fluoresceinierte Sonde bindet
  • Herstellung von biotinylierter Sonde
  • 50 nMol von entsalztem 5'-Amino-modOligonucleotid (30-Mer)
    Figure 01420001
    wurden in 0,5 ml 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,0, gelöst. Eine Lösung von Succinimidyl-6-(biotinamido)hexanat (Pierce # 21336-G), 125 μl 120 mg/ml in DMF wurde der Pufferlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht inkubiert und mittels präparativer Elektrophorese (12% Polyacrylamidgel und 7 M Harnstoff in TBE-Puffer (Tris-Borsäure-EDTA)) gereinigt: 89 mM Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)-Base, 89 mM Borsäure, 2,5 mM Na2 EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 8,3) bei 400 V, 4 h lang. Das biotinylierte Oligonucleotid wurde aus dem Gel geschnitten und mit 3 ml 0,1 M NH4CO3 bei 37°C über Nacht eluiert. Das Material wurde aus einer Sep-Pak (einer C-18-Säule von Waters # 51910) gereinigt, vakuumgetrocknet und in doppelt destilliertem Wasser suspendiert.
  • Die Ausbeute der biotinylierten Sonde betrug 34,8 nMol (58%).
  • Herstellung einer fluoresceinierten Sonde
  • Es wurde eine Lösung von 50 nMol an mittleren Cytosin (an Position 14) aminomodifiziertem Oligonucleotid (30-Mer)
    Figure 01420002
    in einem Gemisch aus 0,1 M NaHCO3-Puffer, pH 9,6 (190 μl) und Acetonitril gebildet. 200 μl 0,1 M Lösung von 5/6 Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (Molecular Probes, #01112) im DMF wurden der Pufferlösung zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die übrigen Schritte sind die gleichen wie oben in Zusammenhang mit der biotinylierten Sonde beschrieben.
  • Die fluoresceinierte Sonde wurde in einer Ausbeute von 41% erhalten.
  • Testverfahren
  • Testpuffer: 10 mM Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), 50 mM KCl, pH 8,3, umfassend 5 mg/ml Dextransulfat, 0,5 M NaCl, 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) und 25 μg/ml Kalbsthymus-DNA
  • 40 μl Testpuffer mit fluoreszeinierter Sonde (1,5 pMol) und biotinylierter Sonde (1,2 pMol) wurde 10 μl reihenverdünnter synthetischer Target-DNA (65-Mer) in Testpuffer zugegeben. Das Gemisch wurde 5 min lang bei 55°C hybridisiert. Perlen (20 μg Avidinperlen und 30 μg Anti-Fluorescein-Perlen, jeweils in 50 μl Testpuffer) wurden zugegeben. Die Lösung mit den Perlen wurde 15 min lang bei 55°C inkubiert.
  • Die Avidinperlen wurden hergestellt, indem 0,175 μ carboxylierte Polystyrolperlen mit Benzalacridan beladen wurden. Die Perlen wurden unter Anwendung von EDAC-Chemie (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, Sigma Chemical Co. #E-6383), mit Avidin versehen.
  • Benzalacridan wurde gebildet, indem 0,413 ml 1,6 M n-Butyllithium-Lösung in Hexan zu 10-Dimethoxyphosphinyl-9-methylacridan (Monatsh Chem. 114: 3, 1988) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) bei –78°C (Aceton/Trockeneis-Bad) unter Argon zugegeben wurden. 20 min nach Zugabe der t-Butyllithium-Lösung wurde eine Lösung des obigen Amids in THF zugegeben. Die Reaktionslösung wurde über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Produkt wurde anschließend mittels DC (Kieselgel; 3 : 7 = Ethylacetat/Hexan) isoliert. Das isolierte Produkt wurde durch Massenspektralanalyse und NMR analysiert und im Dunkeln gelagert.
  • Die Anti-Fluorescein-Perlen wurden durch Beladen von 0,04 μ carboxylierten Polystyrolperlen mit Tetra-n-decyl-Al-Phthalocyanin (Ultra Diagonistics, Lot #GR11-82) hergestellt und mit Anti-Fluorescein-Antikörper mittels EDAC-Chemie versehen.
  • Signal wurde durch Bestrahlen der die Perlen enthaltenden Lösung über 60 s mit einer mit einem 650 nm-Cutoff-Filter ausgestatteten Lampe abgelesen. Die Lumineszenz wurde 20 s lang gemessen. Die Ergebnise sind in Tabelle 1 zusammengefasst und in 9 dargestellt.
  • Beispiel 7
  • Detektion von biotinyliertem Amplifikationsprodukt PCR-Produktion biotinylierter Sequenz
  • Target: genomische E. coli-DNA
  • Primer: jeweils 100 nM 5'-biotinyliertes 24-mer
    Figure 01440001
    und nicht-biotinyliertes 18-mer
    Figure 01440002
    Zyklusbedingungen:
    Ein Zyklus:
    94°C 3 min
    59°C 1 min
    72°C 1,5 min
    Dann 35 Zyklen:
    94°C 1 min
    59°C 1,5 min
    72°C 2 min
  • Detektion mittels fluoresceinierter Sonde
  • 10 μl 1,5 pMol fluoresceinierter Sonde in Testpuffer, hergestellt gemäß der Vorgangsweise aus Beispiel 6, wurden zu 20 μl PCR-Produkt in verschiedenen anfänglichen Targetkonzentrationen zugegeben. Das Gemisch wurde 5 min lang bei 95°C denaturiert und dann 5 min lang bei 55°C hybridisiert. Perlen (20 μg Benzalacridan und 30 μg Al-Phthalocyanin-Perlen in 50 μl Testpuffer) wurden zugegeben. Die Perlen enthaltende Lösung wurde 15 min lang bei 55°C inkubiert. Signal wurde gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 6 abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
  • Beispiel 8
  • Test mit Voll-Triiodthyronin
  • I. Perlenherstellung
  • Materialien
  • 175 nm Carboxylat-modifizierter Latex von Bangs Laboratories;
    Ethylenglykol, Ethoxyethanol, Benzylalkohol, Chlorophyll-1: Aldrich;
    Europium(III)-theonyltrifluoracetonat (EuTTA): Kodak;
    Trioctylphosphinoxid (TOPO): Aldrich;
    Dioxen[1-(4-dimethylaminophenyl)-6-pohenyl-l,4-dioxen]: hergestellt in einer Modifikation des Verfahrens von K. A. Zaklika, T. Kissel, A. L. Thayer, P. A. Burns und P. Schaap:
    Photochem. Photobiol. 30, 30–35 (1979).
  • Verfahren
  • 1. Chlorophyll-a-Sensibilisatorperlen
  • Eine Lösung von Chlorophyll-a in Benzylalkohol (1,0 ml, 0,6 mM) wurde 8,0 ml Benzylalkohol bei 105°C zugegeben. Eine Suspension von Carboxylat-modifiziertem Latex mit einer Größe von 175 nm in Wasser (10%, 1,0 ml) wurde der Benzylalkohol-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 min lang bei 105°C gerührt und auf Raumtemperatur gekühlt. Ethanol (10,0 ml) wurde zugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wurde in einem 1 : 1-Ethanol-Wasser-Gemisch (10,0 ml) resuspendiert und die Suspension zentrifugiert. Die gleiche Vorgangsweise mit Resuspension und Zentrifugation wurde in Wasser (10,0 ml) wiederholt und das Pellet in Wasser resuspendiert (1,8 ml).
  • Charakterisierung
    • A. Farbstoffkonzentration: Eine Lösung, gebildet durch Zugabe von 10 μl der obigen Perlensuspension zu Dioxan (990 μl), wies eine Extinktion von 0,11 bei 660 nm auf, was 2,6 μMol Chlorophyll-a in 1 g Perlen entsprach.
    • B. Erzeugung von Singulett-Sauerstoff: Ein Gemisch aus Chlorophyll-a-Perlen (200 μg), 2 × 10–4 Mol Anthracen-9,10-dipropionsäure (ADPA) in 2 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5, umfassend 100 mM NaCl) wurde mit einer Wolfram-Halogen-Lampe, ausgestattet mit einem 645 nm-Cutoff-Filter, 20 min lang bestrahlt. Die Perlen wurden durch Filtration entfernt und die Konzentration des Oxidationsprodukts spektralphotometrisch bei nMol 400 nm bestimmt. Die ermittelte Rate betrug 3,0 Oxidationsprodukt pro min. Unter den gleichen Bedingungen erzeugten 38 pMol eines löslichen Sensibilisators, Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat, die gleiche Menge an Oxidationsprodukt (die Menge des Sensibilisators in den Perlen betrug 200·10–6·2,6·10–6 = 520 pMol).
  • 2. Chlorophyll-a/Tetrabutylsquarat-Sensibilisatorperlen
  • Eine Suspension von carboxylierten Latexperlen (Größe 175 nm, 10% Feststoffe in Wasser, 30,0 ml) wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Ethylenglykol (60,0 ml) resuspendiert. Die Suspension wurde auf 100°C erhitzt. 9,0 ml einer Benzylalkohol-Lösung, die 1,67 mM in Chlorophyll-a und 3,33 mM in Tetra-t-butylsquarat [1,3-Bis(4-dibutylaminophenyl)squarat] ist, wurde 3 min lang der Suspension langsam zugegeben. Das Erhitzen wurde 7 min lang fortgesetzt und die Suspension dann in einem Wasserbad auf Raumtemperatur gekühlt. Die Benzylalkohol-Lösung wurde kaltem Ethanol (120 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 50% Ethanol in Wasser resuspendiert und die Suspension zentrifugiert. Die gleiche Vorgangsweise mit Resuspension und Zentrifugation wurde in 5% Ethanol in Wasser (30 ml) wiederholt.
  • Charakterisierung
    • A. Farbstoffkonzentration: Die Konzentration des Tetrabutylsquarats in den Perlen wurde spektralphotometrisch bestimmt (wie oben in Zusammenhang mit den Chlorophyll-a-Perlen). Sie betrug 44 μM Farbstoff in den Perlen.
    • B. Erzeugung von Singulett-Sauerstoff: 25 μl einer 5 mM Lösung ADPA in Ethanol wurden der Suspension von Perlen (100 μg) in Phosphatpuffer, pH 7,0 (20 mM, umfassend 50 mM NaCl) zugegeben. Das Gemisch wurde wie oben mit einem 610 nm-Langpassfilter bestrahlt. Die Rate der Singulett-Sauerstoff-Erzeugung wurde anhand der Reduktionsrate der Extinktion (bei 400 nm) des ADPA errechnet. Es stellte sich heraus, dass die Perlen 7·10–2 μMol Singulett-Sauerstoff/min erzeugen.
  • 3. Dioxen/EuTTA/TOPO-Akzeptorperlen
  • 20 ml 175 nm carboxylierte Latexperlen (10% Suspension in Wasser) wurden zu Ethoxyethanol (20,0 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde auf 90°C erhitzt. 20 m) einer Lösung, die aus 10 mM Dioxen, 20 mM EuTTA und 60 mM TOPO in Ethoxyethanol bestand, wurden dem Gemisch zugegeben. Das Erhitzen erfolgte 7 min lang bei einer Temperatur von bis zu 97°C. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Ethanol (40,0 ml) wurde zugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wurde in 80% Ethanol resuspendiert und die Suspension zentrifugiert. Die Resuspension und Zentrifugation wurden in 10% Ethanol (36 ml) wiederholt.
  • Charakterisierung
    • A. Farbstoffkonzentration: Die Konzentration von EuTTA in den Perlen wurde wie oben spektralphotometrisch bestimmt und betrug 0,07 M.
  • Da die Konzentration von Dioxen nicht in Gegenwart von EuTTA bestimmbar ist, wurde sie unter den gleichen Bedingungen in Perlen gemessen, die nur mit Dioxen beladen waren. Die Konzentration betrug 0,016 M.
    • B. Signalerzeugung: Eine Suspension von Perlen (25 μg) in Phosphatpuffer (0,5 ml, 20 mM Phosphat, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,0) wurde mit einer Lösung von 2 μM Aluminium-Phthalocyanintetrasulfonat (0,5 ml) im gleichen Puffer vermischt. Das Gemisch wurde 1 min lang mit einer 125 W-Wolfram-Halogen-Lampe, die mit einem 610 nm-Langpassfilter ausgestattet war, beleuchtet. Nach der Beleuchtung wurde das Gemisch in ein Turner TD-20e-Luminometer eingebracht und die Lumineszenz 20 s lang gemessen. Die Intensität betrug 327 RLU (relative Lichteinheiten)/s.
  • Die Wellenlänge des emittierten Lichts wurde mit einem Perkin-Elmer 650-40-Scanning-Spektralfluorimeter gemessen. Der Haupt-Emissionspeak lag bei etwa 615 nm.
  • II. Testverfahren
  • EDAC/NHS-Kopplung von Antikörper an 40 nm-Perlen
  • 73,6 mg Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid, Pierce Chemical Co. #24510 G) wurden in 6 ml einer Suspension von 4 mg/ml Carboxylat-modifizierten 40 nm großen Polystyrolperlen (gefärbt mit Chlorophyll-a und Tetrabutylsquarat) in Wasser gelöst. 136 μl 0,5 M Na2HPO4 wurden zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,2 eingestellt. 136 μl zusätzliches Wasser wurden zugegeben. 130,4 mg EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, Sigma Chemical Co. #E-6383) in 454 μl Wasser wurden der gerührten Perlen-Suspension langsam zugegeben. Die Suspension wurde 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden 20 min lang bei 15.000 U/min in Sorvall SA-600 Rotor bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden in 1,2 ml 5 mM Natriumphosphat, pH 5,8, resuspendiert und die Suspension beschallt, um Perlen zu redispersieren. Die Perlen wurden langsam 4,8 ml zu einer gerührten Lösung von 1,7 mg/ml IgG (monoklonales Anti-Fluorescein) + 6,7 mg/ml BSA + 17 mM Borax, pH 9,2, zugegeben und vorsichtig über Nacht bei 4°C vermischt. 800 μl 2 M Glycin wurden der Perlensuspension zugegeben, gefolgt von 2,8 ml 50 mg/ml BSA in 0,1 M Borax. Die Suspension wurde beschallt und 3 h lang bei 4°C vorsichtig vermischt. Die Perlen wurden 30 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden in 3 ml 50 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert und die Suspension beschallt. Die Zentrifugations-, Resuspensions- und Beschallungsschritte wurden für insgesamt drei Zentrifugationen wiederholt. Nach der dritten Zentrifugation wurden die Perlen in 2,4 ml 50 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die resultierende Suspension wurde beschallt und bei 4°C gelagert.
  • EDAC/NNS-Kopplung von Avidin-D an 175 nm-Perlen
  • 4,4 mg Sulfo-NHS wurden in 0,4 ml einer Suspension von 25 mg/ml Carboxyiat-modifizierten 175 nm-Polystyrolperlen (gefärbt mit Dioxen/EuTTA/TOPO) in Wasser gelöst. 0,0160 ml 0,25 M Na2HPO4 wurden zugegeben. 8 mg EDAC, gelöst in 0,030 ml Wasser, wurde langsam der gerührten Perlensuspension zugegeben. Die Suspension wurde 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden 20 min lang bei 15.000 U/min in Sorvall SA-600 Rotor bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
  • Die Perlen wurden in 0,6 ml 0,005 M Natriumphosphat, pH 5,8, resuspendiert. Die Suspension wurde beschallt, um Perlen zu resuspendieren. Die Perlen wurden wiederum langsam zu 3 ml einer gerührten Lösung zugegeben, umfassend 1,33 mg/ml Avidin-D (Vector) + 17 mM Borax, pH 9,2, und vorsichtig über Nacht bei 4°C vermischt. 0,004 ml 1 M Bernsteinsäureanhydrid in DMF wurde zugegeben. Die Suspension wurde 1 h lang bei 4°C unter vorsichtigem Mischen inkubiert. 0,4 ml 50 mg/ml BSA in 10 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,0, wurden zugegeben. Die Suspension wurde vorsichtig 3 h lang bei 4°C vermischt. Die Perlen wurden 30 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden in 3 ml 50 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde beschallt. Die Zentrifugations-, Resuspensions- und Beschallungsschritte wurden über insgesamt drei Zentrifugationen wiederholt. Nach der dritten Zentrifugation wurden die Perlen in 2,25 ml 50 mM Natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde beschallt und bei 4°C gelagert.
  • Voll-T3-Test
  • Testpuffer: 0,075 M Barbital, 0,2 M NaCl, 0,4% BSA, 1,25% Mäuse-IgG, 10 mg/ml Dextransulfat (Molekulargewicht 500.000), 1,0 mg/ml Dextran T-500, 10 μg/ml aggregiertes IgG.
  • Perlen
  • Akzeptorperlen: Avidin-EDAC, 175 nm, beladen mit Dioxen/EuTTA/TOPO.
  • Sensibilisatorperlen: Anti-Fluorescein-EDAC, 40 nm, beladen mit Chlorophyll-a/Squarat
  • Test-Arbeitsvorschrift
  • 50 μl einer Lösung von 8-Anilino-l-napthalinsulfonsäure, Ammoniumsalz (Sigma, A-3125) in Testpuffer (0,75 mg/ml) wurden 50 μl T3-Standard oder Probe zugegeben. 100 μl Testpuffer wurden zugegeben. 50 μl biotinyliertes Anti-T3 (70 ng/ml) in Testpuffer wurden zugegeben. Der Tracer, T3-LC21-FI (1,8 ng/ml)
    Figure 01510001
    in Testpuffer (50 μl) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 15 min lang bei 37°C inkubiert. 500 μl einer Suspension von Sensibilisatorperlen (50 μg) und Akzeptorperlen (6,25 μg) in Testpuffer wurden zugegeben und das Gemisch 15 min lang bei 37°C inkubiert. Es wurde dann die "Stopperlösung" (50 μl; 10 μM Fluorescein, 0,5 mM Biotin) zugegeben.
  • Signal wurde durch eine mit einem 610 nm-Cutoff-Filter ausgestattete Halogenlampe abgelesen (Bestrahlung 1 min, Messung 20 s).
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in 10 zusammengefasst. Das Lumineszenzsignal ist als Funktion der T3-Konzentration aufgetragen. Die Signalmodulation betrug 94% mit 8,5 ng/ml T3. Bei 0,5 ng/ml betrug die Signalmodulation 38%.
  • Tabelle 1 Detektion von synthetischem Target, das sich an die Bio-Sonde und die FI-Sonde bindet
    Figure 01520001
  • Tabelle 2 Detektion von biotinyliertem Amplifikationsprodukt
    Produkt RLU
    1. 20% (108) 79
    2. 20% (106) 45
    3. 20% (104) 25
    4. 20% (0) 9

Claims (11)

  1. Teilchen, in denen eine Zusammensetzung enthalten ist, die eine chemolumineszierende Verbindung umfasst, bei der es sich um eine Substanz handelt, die eine chemische Reaktion mit Singulettsauerstoff eingeht, um eine metastabile Zwischenspezies zu bilden, die unter gleichzeitiger oder nachfolgender Emission von Licht und eines fluoreszierenden Moleküls zerfallen kann, das von der aktivierten chemolumineszierenden Verbindung angeregt wird und eine Wellenlänge aussendet, die länger als die Emissionswellenlänge der chemolumineszierenden Verbindung ist.
  2. Teilchen nach Anspruch 1, worin die Emissionswellenlänge der metastabilen Zwischenspezies im Bereich von 250 bis 1.200 nm liegt.
  3. Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, worin die chemolumineszierende Verbindung ein Enolether ist.
  4. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Enolether folgende Struktur aufweist:
    Figure 01540001
    worin die D1 unabhängig voneinander gewählt sind und aus der aus N und Substituenten mit 1 bis 50 Atomen bestehenden Gruppe, vorzugsweise Aryl, Hydroxyaryl, Aminoaryl, t-Alkyl, N, Alkoxy, Heteroaryl, ausgewählt sind und D2 vorzugsweise Alkyl oder Aryl ist.
  5. Teilchen nach Anspruch 4, worin die D1 zusammen mit einem oder beiden Kohlenstoffatomen einen Ring bilden, vorzugsweise z. B. Cycloalken, Adamantyliden, 7-Norbornyliden.
  6. Teilchen nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin der Enolether folgende Struktur aufweist:
    Figure 01550001
    worin X 0, S oder ND2 ist und D Alkyl oder Aryl ist, worin zumindest ein Substituent als Amino-, Ether- oder Hydroxylgruppe vorliegt.
  7. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das fluoreszierende Molekül Rhodamin, Ethidium, Dansyl, EU(fod)3, EU(TTA)3 oder Ru(2,2'-dipyridyl)3 ++ ist.
  8. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, welches folgende Schritte umfasst: (a) entweder gleichzeitiges oder vollständig oder teilweise aufeinander folgendes Kombinieren (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) eines Photosensibilisators, der in seinem angeregten Zustand fähig ist, Sauerstoff in einen Singulettzustand anzuregen, wobei der Photosensibilisator mit einem Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) assoziiert ist, und (3) der Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei an die Teilchen ein sbp-Element gebunden ist; (b) Bildung eines sbp-Element-Komplexes, der die Teilchen umfasst; (c) Aktivierung des Photosensibilisators, um Singulettsauerstoff zu erzeugen; und (d) Bestimmung des Ausmaßes an ausgesandter Lumineszenz, wobei das Ausmaß der Lumineszenz mit der Analytmenge im Medium in Beziehung steht.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Photosensibilisator und ein sbp-Element mit einem suspendierbaren Teilchen assoziiert sind.
  10. Set, das ein abgepackter Kombination Folgendes umfasst: (a) eine Zusammensetzung, die ein suspendierbares Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, wobei an das Teilchen ein Element eines spezifischen Bindungspaars (sbp) gebunden ist; und (b) einen mit einem zweiten sbp-Element assoziierten Photosensibilisator, der nicht in der Zusammensetzung vorliegt und fähig ist, in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in dessen Singulettzustand anzuregen.
  11. Set nach Anspruch 10, das eine Zusammensetzung umfasst, die ein zweites suspendierbares Teilchen umfasst, das den Photosensibilisator umfasst, wobei an das Teilchen ein sbp-Element gebunden ist.
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