JP4796259B2 - 複数のアナライトの検出において使用するための組成物 - Google Patents
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Description
【背景技術】
1.技術分野
本発明は単一の試験媒体中の多くの異なる成分を検出するための方法、組成物およびキットに関する。
臨床診断分野は、迅速および正確に測定される目的物質の種類、並びに、測定の方法の双方に関して、近年広範に拡大している。液体中に低濃度で存在する物質を検出するための簡便で信頼性が高く無害な手段が望ましい。臨床化学分野では、これらの物質は10-12モル未満の濃度で体液中に存在する。低濃度のこれら物質の検出の困難性は、利用できるサンプルサイズが比較的小さいことにより増強される。
【0002】
血中および他の生物学的液体中の複数のアナライトを測定する必要性は医療の多くの諸領域において益々顕著になってきている。内分泌学分野では、多くの種類のホルモンの血漿中濃度に関する知識が診断上の問題を解決するために、また、疾患の進行を調べる際に比率が参考になるような所定の診断のためのマーカーパネルが必要となる。更に必要とされるものはアレルギー試験、ウィルス汚染に関する輸血用血液のスクリーニングまたは遺伝子診断のような他の領域における証拠である。
【0003】
多くの感染性物質のいずれもが何らかの病理学的疾患状態をもたらす。疾患状態の診断および検査はサイトカインおよびケモカインのパネル、組織特異的疾患マーカーのパネル、診断用抗体および抗原のパネルなどのような試料中の多くのアナライトの測定により最も良好に評価できる。マルチアナライトの同時分析の利用に関わる別の例は所定の細胞集団における遺伝子のパネルの発現濃度の測定または単一の試料中の複数の核酸配列の同時検出および定量である。複数のアナライトの同時検出および定量の別の利点は分析のスループットの潜在的向上および被験試料に内部対照を取りこませる能力である。
【0004】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイのような別のアッセイにおいては、時間のかかる分離および移行の工程を用いることなく単一の管内で特定の標的と陽性対照の配列を検出および定量する必要がある。原則として内部対照は標準曲線の必要性をなくす。管を開封することなく単一の管内で増幅および検出を行なうことはまた汚染の問題も克服する。突然変異の分析においては、単一の管内で2種またはそれ以上の変位体を測定する能力は突然変異集団の出現の定量的モニタリングを可能とする。
【0005】
大部分のマルチアナライトアッセイは不均質であって感度が不良であり、ダイナミックレンジが小さく(2〜100倍のアナライトの濃度差を測定する)、場合によっては複雑な装置の使用が必要になる。より高い感度、大きいダイナミックレンジ(アナライト濃度差103〜104倍)および少なくより安定な試薬を用いる均質なアッセイはマルチアナライトのアッセイの簡素さおよび信頼性を向上させる。
【0006】
蛍光化合物および化学ルミネセンス化合物のようなルミネセンス化合物はその発光能力のためにアッセイ分野で広範に応用されている。この理由から、ルミネッサーは核酸アッセイおよびイムノアッセイのようなアッセイにおいて標識物質として利用されている。例えば、多くの特異的結合対がルミネッサーにコンジュゲートされ、種々のプロトコルが使用されている。ルミネッサーコンジュゲートはアナライトを含有していることが疑われる試料中のアナライトの量に関係して固相および液相に分配することができる。相の各々のルミネセンスを測定することにより試料中のアナライトの濃度に観察されたルミネセンスの水準を関係付けることができる。
【0007】
単一の試料中の複数のアナライトの同時検出および定量またはマルチ分析のためのこれまでに報告されているシステムはそれぞれが特異的なアナライトに相当する複数のレポーター基に基づいている。マルチアナライトアッセイにおいて識別可能なシグナルを生成するために、種々の標識物質が使用されており、(a)2種の異なる放射性同位体標識物質、(b)2種以上の異なる蛍光標識物質、(c)蛍光または化学ルミネセンス標識物質、(c)寿命と波長を測定する種々のランタニドキレート、(e)酵素およびアクリジニウムエステル、(f)種々のアナライトの空間的分割、(g)逐次的基質添加を行なう種々の酵素、および(h)種々の寿命を有するジオキセタノンを生成する種々のアクリジニウムが挙げられる。
【0008】
別の手法においては、種々のアナライトと示差的に反応して複数のシグナルを生成する単一のレポーター基を用いる。単一の反応混合物において複数のシグナルが関与する分析の場合は、シグナルを波長の差および/または発光半減期の差に基づいて分割してよい。
【0009】
2.関連技術の簡単な説明
米国特許5,656,207号(Woodhead等)(Woodhead I)は標識手法を用いて複数のアナライトを検出または定量するための方法を開示している。
標識手法を用いて複数のアナライトを検出またはていりょうすることはWoodhead等(Woodhead II)により論じられている。
【0010】
複数の特異的核酸配列の同時検出および定量のための組成物および方法が米国特許5,827,656号(Nelson等)(Nelson I)および5,658,737号(Nelson等)(Nelson II)に開示されている。
米国特許5,395,752号(Law等)は長発光波長の化学ルミネセンス化合物および試験アッセイにおけるその使用を開示している。
【0011】
Flow Metrix Systemを用いたウィルス核酸の検出のための迅速で感度の高い複合的なアッセイがSmith等によりClinical Chemistry (1998) 44 (9):2054-2056に記載されている。
Narang等はキャピラリー系のフローイムノセンサーを用いたマルチアナライトの検出を論じている(Analytical Biochemistry (1998) 255: 13-19)。
【0012】
混合リンパ球培養物反応における細胞のシミュレーションの迅速マルチパラメーター分析はTraganos等によりThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry (1977) 25 (7): 881-887に記載されている。
米国特許5,340,716号(Ullman等)は光活性化化学ルミネセンス標識物質を利用したアッセイ法を記載している。
光活性化可能な化学ルミネセンスマトリックスは米国特許5,709,994号に記載されている。
【0013】
【発明の開示】
本発明の1つの特徴は媒体中の2種以上の成分の存在または相対量を測定するための方法である。成分を含有することが疑われる媒体および増感剤試薬少なくとも2種および活性化された増感剤試薬の生成物により活性化可能な反応性試薬少なくとも1種を包含する組合せが提供される。増感剤試薬は活性化に基づいて識別可能である。増感剤試薬と反応性試薬の組合せにより成分の示差的検出が可能となる。増感剤試薬は示差的に活性化され、生成物による反応性試薬の活性化に相応して発生するシグナルの量が測定される。シグナルの量は媒体中の成分の各々の量に関係している。
【0014】
本発明の別の実施態様は媒体中の成分の2種以上の存在または相対量を測定する方法である。成分を含有していることが疑われる媒体を含む組合せが提供される。また更に1重項酸素を発生することが可能であり、活性化に基づいて識別可能な増感剤試薬少なくとも2種が組合せにおいて提供される。組合せは1重項酸素により活性化可能な反応性試薬少なくとも1種を含む。増感剤試薬と反応性試薬の組合せにより成分の示差的検出が可能となる。増感剤試薬は示差的に活性化され、反応性試薬の活性化の結果として発生したシグナルの量を測定する。シグナルの量は媒体中の成分各々の量に関係している。
【0015】
本発明の別の実施態様は媒体中の成分2種以上の存在または相対量を測定するための方法である。この方法では(1)成分を含有していることが疑われる媒体、(2)増感剤試薬少なくとも2種、ただし増感剤試薬は1重項酸素を発生することが可能であり、増感の波長により検出可能であるもの、および(3)1重項酸素により活性化可能な反応性試薬少なくとも1種からなる組合わせを提供する。第1の特異的結合対(sbp)構成員は増感剤試薬の各々と会合している。第1のsbp構成員は成分または第2のsbp構成員と結合して成分の量に関係した複合体を形成することが可能である。増感剤試薬は示差的に活性化される。反応性試薬の各々の活性化の結果として発生したシグナルの量を検出し、その量は媒体中の成分各々の量に関係している。
【0016】
本発明の別の実施態様は媒体中の成分2種以上の存在または相対量を測定するための均質な方法である。(1)成分を含有することが疑われる媒体、(2)成分の各々のための光増感剤、および(3)一重項酸素により活性化可能な化学ルミネセンス組成物、ただしその各々が第2の粒子と会合しているものを包含する組合せが提供される。第1の粒子と会合している光増感剤は一重項酸素を発生することが可能であり、増感の異なる波長を有している。化学ルミネセンス組成物の1種以上は発光の異なる波長により、または、崩壊の異なる速度により、示差的に検出可能である。光増感剤の増感の異なる波長および化学ルミネセンス組成物の発光の異なる波長または崩壊の異なる速度により、成分各々の示差的検出が可能となる。第1の特異的結合対(sbp)構成員は光増感剤の各々と会合している。第1のsbp構成員は成分または第2のsbpと結合して成分の量に関係した複合体を形成することが可能である。光増感剤は光により示差的に照射される。化学ルミネセンス組成物の各々により発生されたルミネセンスの量は活性化後のある時点において、そして、崩壊速度に相応する波長およびルミネセンス発光の波長において、検出され、その量は媒体中の成分各々の量に関係している。
【0017】
本発明の別の実施態様は複数の増感剤試薬および一重項酸素により活性化可能な反応性試薬少なくとも1種のパッケージされた組合せを包含するキットである。増感剤試薬の各々は(1)一重項酸素を発生することが可能であり粒子と会合している増感剤組成物、および(2)特異的結合対(sbp)の構成員を包含する。増感剤組成物の一部または全部は増感の異なる波長を有する。
【0018】
本発明の別の実施態様はビス(トリ−アルキル1−シリル)シリコンテトラ−アルキル2−ナフタロシアニンである化合物である。本実施態様の1つの特徴はビス(トリ−アルキル1−シリル)シリコンテトラ−アルキル2−ナフタロシアニンの調製方法であり、その方法はトリ−アルキル1−シリルクロリドでジヒドロオキシシリコンテトラ−アルキル2−ナフタロシアニンを処理することを包含する。
【0019】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は増感の波長の差により通常は示差的に活性化可能な種々の増感剤試薬の使用によるアッセイにおける種々のアナライトの定量的検出を可能にする。好ましくは、増感剤試薬は一重項酸素を発生することが可能である。通常は一重項酸素により活性化されることのできる増感剤試薬の活性化の結果として活性化されることのできる反応性試薬を使用する。マルチ分析のためのこれまでの化学ルミネセンスまたは蛍光に基づいた均質な方法は崩壊速度および/または発光波長に基づく特定のシグナルの分割に基づいていたが、本発明の方法は特定の増感剤の増感のルミネセンス波長に基づいた特異的シグナルの判別に基づいている。反応性試薬はケミルミネッサー、フルオレッサー、光活性インジケーター前駆体等、または、これらの組合せであってよい。一重項酸素との反応により活性化される他のシグナル生成アクセプターもまた本発明のマルチ分析に用いて良い。複数の増感剤と適当な複数のアクセプターの組合せにより分析のマルチ度を更に高めることができる。
【0020】
本発明の特定の実施態様の説明を更に行なう前に、多くの用語を定義し、詳細に説明する。
成分 - 目的となる成分;検出すべき化合物または組成物である。成分はアナライト、比較対照化合物、対照化合物、カリブレーション用物質等である。
【0021】
アナライト - アナライトは通常は特異的結合対(sbp)の構成員であり、リガンドであってよく、これは通常は1価(モノエピトープ性)または多価(ポリエピトープ性)、通常は抗原またはハプテン性のものであり、単一の化合物または共通のエピトープまたは抗原決定基部位少なくとも1つを共有している複数の化合物である。アナライトは最近のような菌体の一部またはA、B、D等の血液群の抗原を有する細胞、または、HLA抗原であることができ、或いは、アナライトは微生物、例えば最近、カビ、原虫またはウィルスであってもよい。
【0022】
多価のリガンドのアナライトは通常はポリ(アミノ酸)、即ちポリペプチドおよび蛋白、多糖類、核酸およびこれらの組合せである。このような組合せには最近、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜等の成分が含まれる。
大部分について、本発明を適用することのできるポリエピトープ性のリガンドのアナライトは少なくとも約5000、より通常は少なくとも約10,000の分子量を有する。ポリ(アミノ酸)類においては、目的のポリ(アミノ酸)は一般的に分子量約5,000〜5,000,000であり、より通常は約20,000〜1,000,000であり;目的となるホルモンでは、分子量は通常は約5,000〜60,000の範囲のものである。
【0023】
広範な蛋白は、同じ構造的特徴を有する蛋白、特定の生物学的機能を有する蛋白、特定の微生物に関係する蛋白、特に疾患誘発微生物等のファミリーと考えられる。このような蛋白には、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー、組織特異的抗原などが包含される。このような蛋白には例えばプロタミン、ヒストン、アルブミン、グロブリン、硬蛋白、リン蛋白、ムコ蛋白、色素蛋白、リポ蛋白、核蛋白、糖蛋白、T細胞受容体、プロテオグリカン、HLA、未分類蛋白、例えばソマトトロピン、プロラクチン、インスリン、ペプシン、ヒト血漿中に存在する蛋白、血液凝固因子、蛋白ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ルテオトロピン、プロラクチン、絨毛性ゴナドドロピン、組織ホルモン、サイトカイン、癌抗原、例えばPSA、CEA、フェトプロテイン、酸ホスファターゼ、CA19.9およびCA125、組織特異的抗原、例えばアルカリホスファターゼ、ミオグロビン、CPK−MBおよびカルシトニンおよびペプチドホルモンが包含されるがこれらに限定されない。目的となるその他の重合体物質はムコ多糖類および多糖類である。
【0024】
モノエピトープ性のリガンドのアナライトは一般的に分子量約100〜2,000、より通常は分子量125〜1,000である。アナライトには薬剤、代謝産物、農薬、汚染物質等が包含される。目的の薬剤にはアルカロイドも包含される。アルカロイドとしては、モルヒネアルカロイド、例えばモルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、その誘導体および代謝産物;コカインアルカロイド、例えばコカインおよびベンジルエクゴニン、その誘導体および代謝産物;麦角アルカロイド、例えばリセルグ酸のジエチルアミド;ステロイドアルカロイド;イミナゾリルアルカロイド;キナゾリンアルカロイド;イソキノリンアルカロイド;キノリンアルカロイド、例えばキニンおよびキニジン;ジテルペンアルカロイド、およびその誘導体または代謝産物が包含される。
【0025】
薬剤の次のグループには、ステロイド、例えばエストロゲン、アンドロゲン、アンドレコルチコステロイド、胆汁酸、強心性ステロイドおよびアグリコン類、例えば、ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニン、その誘導体および代謝産物が包含される。更にまた、ステロイド擬似物質、例えばジエチルスチルベストロールモ包含される。
【0026】
薬剤の次のグループは5または6環員のラクタム類、例えばバルビツール酸塩、例えばフェノバルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトスキシミドおよびこれらの代謝産物である。
薬剤の次のグループは炭素原子2〜3個のアルキルを有するアミノアルキルベンゼン、例えばアンフェタミン;カテコールアミン、例えばエフェドリン、L−ドパ、エピネフリン;ナルセイン;パパベリン;および上記物質の代謝産物である。
【0027】
薬剤の次のグループはベンズ複素環、例えばオキシアゼパム、クロロプロマジン、テグレトールおよびそれらの誘導体および代謝産物が包含され、複素環はアゼピン、ジアゼピンおよびフェノチアジンである。
薬剤の次のグループはプリン類であり、例えばテオフィリン、カフェイン、その代謝産物および誘導体である。
【0028】
薬剤の次のグループはマリファナから誘導されたものを包含し、例えばカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールが挙げられる。
薬剤の次のグループはホルモン類であり、例えばチロキシン、コルチゾール、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジオール、エストロン、プロゲストロン、ポリペプチド例えばアンジオテンシン、LHRHおよび免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、FK506、ミコフェノール酸等である。
【0029】
薬剤の次のグループはビタミン類、例えばA、B、例えばB12、C、D、EおよびK、葉酸、チアミンである。
薬剤の次のグループはプロスタグランジン類であり、これらはヒドロキシル化および不飽和の程度と部位が異なっている。
薬剤の次のグループは3環式の抗欝剤、例えばイミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリミプラミン、クロミプラミン、ドキセピンおよびデスメチルドキセピンが包含される。
【0030】
薬剤の次のグループは抗新生物剤、例えばメトトレキセートである。
薬剤の次のグループは抗生物質であり、例えばペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、その代謝産物および誘導体を包含する。
薬剤の次のグループはヌクレオシドおよびヌクレオチドであり、例えばATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミジン、およびシチジンおよびその適切な糖およびホスフェート置換物である。
【0031】
薬剤の次のグループは種々の個々の薬剤、例えばメタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン剤、クロラムフェニコール、抗コリン作用性薬剤、例えばアトロピン、その代謝産物および誘導体が包含される。
疾患状態に関連する代謝産物にはスペルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸およびポルフィリン1型が包含される。
【0032】
薬剤の次のグループはアミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカシンである。
目的となる農薬としては、ポリハロゲン化ビフェニル類、ホスフェートエステル、チオホスフェート、カーバメート、ポリハロゲン化スルフェンアミド、その代謝産物および誘導体が挙げられる。
【0033】
受容体アナライトについては、分子量は一般的に1,000〜2×108、より通常は10,000〜106である。免疫グロブリン、IgA、IgG、IgEおよびIgMについては、分子量は一般的に約160,000〜約106である。酵素は通常は分子量約10,000〜1,000,000である。天然の受容体は広範囲なものがあり、一般的に分子量は約25,000以上であり、106より大きい分子量もあり、例えばアビジン、DNA、RNA、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランスコルチン等が挙げられる。
【0034】
アナライトという用語は更にポリヌクレオチドアナライト例えば以下に定義するポリヌクレオチドを包含する。これらには、m−RNA、r−RNA、t−RNA、DNA、DNA−RNA二重鎖などが包含される。アナライトという用語には更に、ポリヌクレオチド結合剤である受容体、例えば制限酵素、活性化剤、リプレッサー、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵素、化学療法剤等が包含される。
【0035】
アナライトは宿主の体液を含む生物学的組織のような試料中に直接検出される分子であってよい。試料は直接分析するか、または、前処理してアナライトをより容易に検出できるようなものとしてもよい。更にまた、目的のアナライトは、目的のアナライトに相補的な特異的結合対構成員のように、試料中に目的のアナライトが存在する場合にのみその存在が検出される、目的のアナライトを立証する物質を検出することにより測定しても良い。即ち、アナライトを立証する物質はアッセイにおいて検出されるアナライトとなるのである。生物学的組織には臓器または宿主の他の身体部分から摘出された組織を包含し、例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、***、糞便、喀痰物、脳髄液、涙液、粘液等が挙げられる。
【0036】
増感剤 - 活性化されることにより、反応性試薬を活性化することのできる一重項酸素のような生成物を形成する分子、通常は化合物である。本発明において有用な増感剤は活性化の異なる波長または活性化の異なる様式を有することによるなど、示差的に活性化可能なものである。増感剤は光活性化可能(例えば染料および芳香族化合物)または化学活性化可能(例えば酵素および金属塩)であることができる。概ね増感剤は光増感剤である。しかしながら、その他の増感剤には、例えば外部の光源による活性化により、或いは、好適度は低いがこれによることなく一重項酸素を生成することのできるその他の物質および組成物も包含される。即ち、例えばモリブデート(MoO4 --)塩およびクロロパーオキシダーゼおよびミエロパーオキシダーゼ+ブロミドまたはクロリドイオン(kanofsky, J. Biol. Chem. (1983) 259: 5596) は過酸化水素から一重項酸素および水への変換を触媒することがわかっている。これらの組成物の何れも、例えばsbp構成員に結合する粒子に含めることができ、そして、過酸化水素が補助的試薬に含まれる、クロロパーオキシダーゼが表面に結合する、そしてモリブデートがリポソームの水相に組み込まれるようなアッセイ法において用いることができる。本発明の範囲内の増感剤として含めることができるその他のものは、真の増感剤ではないが熱、光、イオン化照射または化学的活性化により一重項酸素の分子を放出する化合物である、化合物のこの種のうちよく知られたものは、エンドパーオキシド類、例えば1,4−ビスカルボキシエチル−1,4−ナフタレンエンドパーオキシド、9,10−ジフェニルアントラセン−9,10−アントラセンンドパーオキシドおよび5,6,11,12−テトラフェニルナフタレン5,12−エンドパーオキシドを包含する。加熱またはこれらの化合物による直接の光の吸収により、一重項酸素が放出される。
【0037】
光増感剤 - 通常は光による励起により一重項酸素を発生する増感剤。光により励起されると、増感剤は通常は共有結合した原子、通常は複数の共役二重または三重結合を有するものである化合物となる。化合物は約200〜約1100nm、通常は約300〜約1000nm、好ましくは約450〜約950nmの波長範囲で光を吸収し、励起波長において約1000M-1cm-1より大きく、好ましくは、約50,000M-1cm-1より大きく、より好ましくは、約100,000M-1cm-1より大きい最大吸収における消衰係数を有する。好ましくは、増感剤は約400〜約1000nm、より好ましくは約600〜約800nmの長い個別の波長において励起される。
【0038】
光により励起される光増感剤は相対的に光安定であり、好ましくは一重項酸素とは効率的に反応しない。殆どの有用な光増感剤には幾つかの構造的特徴が有る。大部分の光増感剤は硬い多くの場合は芳香族の構造の内部に保持された共役二重または三重結合を少なくとも1つ、よりしばしば3つ以上有している。これらはしばしばカルボニルまたはイミン基または周期律表の3〜6列から選択される重い原子、特にヨウ素または臭素のような系内交叉を促進する基少なくとも1つを含有する場合が多く、或いは、それらは伸長した芳香族構造を有する場合がある。典型的な光増感剤はアセトン、ベンゾフェノン、9−チオキサントン、エオシン、9,10−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、メタロポルフィリン、例えばヘマトポルフィリン、フタロシアニン、ナフトシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフラーレン等およびこれらの化合物をより親油性またはより親水性とするため、および/または例えばsbp構成員への結合のための連結基としての1〜50原子の置換基を有する上記化合物の誘導体を包含する。本発明において利用してよい他の光増感剤の例は上記特性を有しN.F. Turroの「Molecular Photochemistry」, p 132, W.A. Benjamin Inc., NY. 1965に記載されているものである。
【0039】
本発明で使用して良い長居波長の増感剤染料の例は光力学的治療に使用できる長い波長の増感剤染料(Woehrie等、Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 1996, 319-327, および Macromol. Symp. 1996, 105, 127-138)、730〜770nmに吸収のあるメタロテキサフィリン(Harriman等、J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1989, 314)およびテキサフィリン(J.L. Sessier and S.J. Wegnorn, 1997, Tetrahedron Organic Chemistry Series Vol. 15)である。
【0040】
光増感剤を油滴、リポソーム、ラテックス粒子等に取り込む際に親油性の構成員に溶解できるようにするために光増感剤は好ましくは比較的非極性である。
反応性試薬−増感剤により生成された生成物により活性化可能な通常は化合物である分子。反応性試薬は例えば、化学ルミネセンス組成物、光活性化可能なインジケーター前駆体、光活性化可能な発色団、光活性化可能な蛍光団等である。
【0041】
化学ルミネセンス組成物 - ケミルミネッサー;増感剤の生成物との反応により検出可能な変化を起こす化合物。ケミルミネッサーの例は、一重項酸素と反応して例えばヒドロパーオキシドまたはジオキセタンを形成できるオレフィン、塩基または酵素により活性化できる安定なジオキセタン、一重項酸素と反応してジケトンを形成できるアセチレン、パーオキシドで活性化され、アゾ化合物またはアゾカルボニル、例えばルミノールを形成できるヒドラゾンまたはヒドラジド、ルシフェリンのような化学ルミネセンス酵素基質、エンドパーオキシドを形成できる芳香族化合物等であるがこれらに限定されない。
【0042】
化学ルミネセンス化合物は一重項酸素との反応により何れかの検出可能なシグナルを生成することができる。シグナルは通常は電磁気的放射として開始および/または検出され、そして好ましくは化学ルミネセンス、蛍光、電子ルミネセンスまたはりん光のようなルミネセンスである。
【0043】
一重項酸素と反応することのできるオレフィン−オレフィンと一重項酸素との典型的な反応はジオキセタンを形成する2+2付加である。適当なオレフィンは通常、非反応性の橋頭炭素を除きオレフィン系炭素に結合した飽和C−H基は有さず、そして、好ましくはオレフィン系炭素に直接結合した、または、オレフィンとコンジュゲートした電子供与基1つ以上を有する。ジオキセタンは自発的または加熱により自発的化学ルミネセンスを伴いながら解離することができるか、または、形成したカルボニル基が蛍光基の一部として形成され得るか、または、蛍光分子を与えるようなその後の反応を起こすことができる。或いは、この解離反応は元々蛍光の基からのクエンチング基の分離をもたらし、これによりその蛍光特性が回復する。
【0044】
オレフィンとの一重項酸素の反応の別の種類は、ジエン、通常はナフタレン、アントラセン、オキサゾール、フラン、インドール等のような芳香族化合物との4+2環付加である。このような反応は先ずエンドパーオキシドをもたらす。場合によりエンドパーオキシドは転位して適当な位置に有る基と反応することができる活性エステルまたは無水物となり、これにより蛍光を発し得るラクトンまたはラクタムが生成する。或いは、エンドパーオキシドは蛍光または化学ルミネセンス化合物の前駆体を酸化する。エンドパーオキシドはまた自発的に、または、加熱により化学ルミネセンス発光を伴いながら解離するか、または、蛍光ロイコ染料を酸化することができる。
【0045】
オレフィンとの一重項酸素の反応の更に別の種類はアリルヒドロパーオキシドを形成する「エン」反応である。適当なオレフィンはオレフィン系炭素に連結した反応性の飽和C−Hを有する。この生成物は同じ分子の活性エステルと反応でき、これにより自発的または過熱により化学ルミネセンス発光を伴いながら解離できるジオキセタノンを形成する。
【0046】
一般的に目的のオレフィンは一重項酸素との反応により化学反応を起こして、通常は250〜1200nmの波長範囲内の光の同時または後続する発光を伴いながら分解することが可能な、準安定な反応生成物、通常はジオキセタンまたはエンドパーオキシドを形成する。好ましいものは通常は電子供与基を有する富電子のオレフィンである。このような富電子オレフィンの例は、エノールエーテル、エナミン、9−アルキルデン−N−アルキルアクリダン、アリールビニルエーテル、1,4−ジオキセン、1,4−チオキセン、1,4−オキサジン、アリールイミダゾール、9−アルキリデン−キサンタン類およびルシゲニンである。
【0047】
一重項酸素との目的のオレフィンの反応により生成したルミネセンスは好ましくは300ナノメーターより大きい、好ましくは500ナノメーターより大きい、より好ましくは550nmより大きい波長である。試料の成分が光の吸収に顕著に影響するような領域を越えた波長の光を吸収する化合物を本発明では特に使用する。血清の吸光度は500nmを超えると急速に低下し、600nmを超えると有意ではなくなる。550nmより大きいルミネセンスは特に好都合である。しかしながら、試料の妨害吸収が無い場合は、より短い波長のルミネセンスも有用である。好ましくは、化学ルミネセンスオレフィンは約400nmより短い光を吸収し、光増感による一重項酸素の望ましくない形成の危険性を伴わない室内光における好都合な作業を可能にする。
【0048】
適当な富電子化学ルミネセンスオレフィンの例は米国特許5,709,994号に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。このようなオレフィンは一般的にオレフィンとのコンジュゲート形成において電子供与基を有する。
【0049】
ジオキセタンはルミネセンス性のみであるか、または、蛍光エネルギーアクセプターを伴っている。エノールエーテルがこのようなオレフィンの例である。多くの場合、エノールエーテル化合物は、一重項酸素に対するオレフィンの反応性を増大させ、そして/または、形成されるジオキセタンの解離の生成物に蛍光を付与する位置においてアリール基が電子供与基で置換されているオレフィン系炭素に結合したアリール基少なくとも1つを有する。電子供与基は例えばヒドロキシル、アルコキシ、ジ置換アミノ、アルキル、チオ、フリル、ピリル等であることができる。好ましくはエノールエーテルはオレフィン系炭素に直接結合した電子供与基を有する。
エナミンがこのようなオレフィンの別の例である。一般的に、有用なエナミンはエノールエーテルに関して上記した規則に従う。
【0050】
ケミルミネッサーの別のファミリーは親生成物の一般名のロフィンをともなう2,4,5−トリフェニルイミダゾールである。化学ルミネセンス類縁体にはパラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換基が包含される。
記載した条件を満足する別の化学ルミネセンスオレフィンは欧州特許出願0,345,776号に記載されている。
【0051】
光活性インジケーター前駆体 - 一重項酸素と反応することにより、光活性インジケータを形成するか、または、反応により光活性インジケーターに変換される副次的化合物と反応することができる化合物を形成する、通常は化合物である分子。光活性インジケーター化合物をもたらすような化合物を与えることのできる一重項酸素との反応は数種類ある。使用する反応の種類および望ましい光活性インジケーターの選択は光活性インジケーター前駆体および本発明で用いる何らかの副次的化合物の構造に関する指針となる。
【0052】
光活性インジケーター前駆体は好ましくはきわめて急速な、通常は少なくとも約104〜約106秒-1、好ましくは約106〜約108秒-1、より好ましくは約109秒-1より大きい一重項酸素との反応を起こす。反応して光活性前駆体を与える中間体が反応の初期生成物である場合、中間体は好ましくは、一重項酸素の形成と光への曝露により光活性インジケーターから発せられる蛍光の検出との間の所望の時間と比較して短い寿命を有する。一重項酸素発生と蛍光検出が同時である場合は、寿命は通常は約10-3〜約10秒、好ましくは約10-3である。一重項酸素の発生と蛍光検出が逐次的である場合は、寿命は約10-3〜約30分以上、好ましくは約1秒未満〜約60秒である。
【0053】
一重項酸素のより高い反応速度は電子の富んだ光活性インジケーター前駆体中に一重項酸素反応性基を与えることにより達成される。これらの基は通常はオレフィンまたはアセチレン、ヒドラジンおよびヒドロキシルアミン誘導体、セレナイドおよびテルライドであるが、これらの基に限定されない。例えばテルライドは一重項酸素と急速に反応してオレフィンを形成することから、特に有用であることがわかっている。反応速度はテルライドの電子の利用性(酸化能力)により決定される。例えばテルル原子上のアリール環置換基上の電子供与基は速度を高めることができる。テルルからセレン(次に低いカルコゲニド)への変更により速度は低下するが、分子の酸化安定性は上昇する。
光活性インジケーター前駆体がヒドラジンまたはヒドラジドを含有する場合は、一重項酸素との反応は二重結合を生成する。例えば一重項酸素はヒドラジドを直接蛍光光活性インジケーターに変換することができる。
【0054】
ヒドラジンの酸化能力は反応の高い速度を得るためには重要な要因である。アシルヒドラジドおよびジアシルヒドラジドは本発明における光活性インジケーター前駆体としてなお使用できるものの、アシル基(例えばヒドラジド中のもの)のような電子吸引性基は反応を遅くする。反応の急速性が不十分である場合は塩基の存在により加速できることが多い。例えば3−アミノフタロイルヒドラジドは、富電子である強塩基の存在下にアニオンを形成し、一重項酸素と急速に反応してホルムアルデヒドインジケーターとしての3−アミノフタレートを形成することができる。しかしながら、懸濁性の粒子が疎水性マトリックス内部に光活性インジケーター前駆体を含んでいる場合は、ヒドロキシルイオンは塩基として使用できない。アガロースのような親水性粒子を代わりに用いることにより、ヒドロキシルイオンへの接触を可能とすることができる。通常は光活性インジケーター前駆体は懸濁性粒子が親水性である場合はその粒子に共有結合する。有用な一重項酸素反応の更に別の例は欧州特許出願0515194号に記載されているもののような富電子オレフィンとの反応である。2種の基本的な種類の反応が記載されている。そのうちの1つは「エン」反応であり、これは二重結合の位置をシフトさせ、ヒドロパーオキシドを生成する。二重結合のシフトは光活性インジケーター前駆体中の2つの助色団をコンジュゲートさせ、これにより蛍光光活性インジケーターを生成する。
【0055】
他の光活性インジケーター前駆体は一重項酸素と反応してヒドロパーオキシドを形成し、これが酸化性基と内部反応を起こし、蛍光光活性インジケーターを与える。或いは、1,3−ジフェニルプロペンのような光活性インジケーター前駆体との一重項酸素の反応により形成されたヒドロパーオキシドは蛍光光活性インジケーターを形成するように副次的化合物として存在する染料のロイコ型を酸化する作用を有する。ヒドロパーオキシドはまた、副次的化合物のV族元素を酸化することによりそれが会合蛍光基の電子供与クエンチング剤として機能することができるようにすることもできる。副次的化合物はまた、ヒドロパーオキシドと反応してその後除去されることにより蛍光光活性インジケーターを形成することができる中間体を生成するヒドロパーオキシドと反応することができるセレンまたはテルルを有する場合がある。
【0056】
或いは、光活性インジケーター前駆体は一重項酸素とゆっくり反応するか、または完全には反応しないが、一重項酸素のヒドロパーオキシド反応生成物および副次的分子と反応する場合がある。例えば以下に示す反応においては、副次的化合物は一重項酸素と反応してヒドロパーオキシドを形成し、これが次に光活性インジケーター前駆体と反応して蛍光光活性インジケーターを形成する。
上記した例のおのおのにおいて、副次的化合物および光活性インジケーター前駆体は共有結合していてよい。そのような場合、得られる分子は光活性インジケーター前駆体と称する。
【0057】
従って光活性インジケーター前駆体の構造は使用する特定の一重項酸素反応により決定され、そして、それは通常は、光活性インジケーターを生成するために必要とされる一重項酸素との反応により開始される如何なるその後の反応も比較的急速に進行するように設計される。更にまた光活性インジケーター前駆体の構造は所望の吸収と発光の波長を有し、比較的高い蛍光量子収率、好ましくは0.1より高値、より好ましくは0.4より高値、および、所望の励起波長において高い消衰係数、好ましくは1000M-1cm-1よりこうち、より好ましくは10,000M-1cm-1より高値を有する光活性インジケーターの形成をもたらす。
【0058】
他の種類の光活性インジケーター前駆体もまた本発明において使用することができる。例えば一重項酸素との反応の際に化学ルミネセンスを生じる化合物はしばしば、本発明の光活性インジケーターとして機能できる蛍光生成物に変換される。
【0059】
「光活性インジケーター」とは250〜1100nm、好ましくは300〜950nmの波長の光を吸収下後に蛍光またはりん光、好ましくは蛍光により光を発するか、またはその励起エネルギーをアクセプター分子に移行させ、次にこれが蛍光またはりん光による光を発する分子を指す。好ましくは、発光の量子収率は高く、通常は少なくとも0.1、好ましくは少なくとも0.4、より好ましくは0.7より高値であり、吸収最大の消衰係数は通常は5000M-1cm-1より高値である。光活性インジケーターは典型的には典型的には300〜400ナノメートルの光を吸収し、400〜500ナノメートルの光を発光する蛍光漂白剤のような蛍光化合物;キサンテン類、例えばローダミンおよびフルオレセイン;クマリン類、例えばアンビリフェロン;芳香族アミン類、例えばダンシル;スクワレート染料;ベンゾフラン類;シアニン類、メロシアニン類、希土類キレート、等である。りん光の光活性インジケーターにはポルフィリン類、フタロシアニン類、ポリ芳香族化合物、例えばピレン、アントラセンおよびアセナフタレンが包含される。光活性インジケーターにはまた、クロメン類も包含される。アクセプター分子にエネルギーを移行できる光活性インジケーターは通常は250〜550nmを吸収する。このようなアクセプター分子はルミネセンス性であり、上記した蛍光およびりん光の光活性インジケーターの何れも包含することができる。
【0060】
光活性インジケーター前駆体および光活性インジケーターに関するより詳細な記述は米国特許5,807,675号(Davalian等)に記載されており、関連部分は参照により本明細書に組み込まれる。
【0061】
蛍光エネルギーアクセプター - 化学ルミネセンス化合物はその近接部に蛍光エネルギーアクセプターを有して良い。典型的には、蛍光エネルギーアクセプターは310nmより高い、通常は350nmより高い、そして好ましくは約400nmより高い実質的吸収を有する発色団である。1/2ピーク高における発光バンドの幅は通常は100nm未満、好ましくは50nm未満、より好ましくは25nm未満である。蛍光エネルギーアクセプターの選択は特定のケミルミネッサーおよび発光の所望の波長および寿命により主に決定される。蛍光エネルギーアクセプターはケミルミネッサーにより発光された光を吸収することが可能でなければならない。好ましくは、蛍光エネルギーアクセプターの吸収最大はケミルミネッサーの発光最大と同様の波長において起こらなければならない。通常は10を超える、好ましくは103を超える、特に104を超える高い消衰係数が望ましい。蛍光エネルギーアクセプターは好ましくは、通常は少なくとも0.1、好ましくは0.4より大きい、高い蛍光量子収率を有する。
【0062】
好ましい蛍光エネルギーアクセプターは長波長で、好ましくは疎水性のエミッターであり、例えば多環芳香族炭化水素、例えばアントラセン類、例えばビスフェニルエチニルアントラセン;クマリン類;ナフタレン類;フラロシアニン類;スクアレイン類、ビス−(4−ジメチルアミノフェニル)スクアレイン;ポルフィリン類;ポリアセチレン、オキサジン染料;希土類のキレート、特にEu、TbおよびSm等である。一般的にこれらの染料はエネルギー転移過程においてアクセプターとして機能し、好ましくは高い蛍光量子収率を有し、一重項酸素と急速に反応しない。これらはケミルミネッサーと共にマトリックスに取り込むことができる。親水性蛍光染料、好ましくはシアニン染料、キサンテン類、例えばフルオレセインおよびテキサスレッドおよびアンベリフェロン類も使用してよい。
【0063】
蛍光エネルギーアクセプターとして有用な多くの種類の分子がUllman等の米国特許4,261,968号、4,174,384号、4,199,559号および3,996,345号、コラム8および9に記載されており、関連部分は参照により本明細書に組み込まれる。
【0064】
蛍光エネルギーアクセプターは一重項酸素と反応して蛍光化合物を形成する化合物、または、結果的に蛍光化合物に変換される副次的化合物と反応できる化合物の結果として形成されてよい。蛍光エネルギーアクセプターはケミルミネッサーも包含する化合物の部分として取り込まれてよい。例えば蛍光エネルギーアクセプターは希土類、例えばユーロピウム、サマリウム、テルル等の金属キレートも含んでよい。これらの物質はそれらの狭いバンドのルミネセンスのために特に好都合である。
本明細書では、「会合する(associated with)」とは共有結合によるか、または非共有結合によるか、または、マトリックスへの取り込みのような取り込みによる会合を包含する。
【0065】
マトリックス - 有機または無機、固体または液体、水不溶性物質の透明または部分的に透明であるものを包含する支持体。そこにとり取り込まれる反応性試薬を有するマトリックスの主な条件は、取り込まれた反応性試薬の近接位置までは少なくともそこに含まれる一重項酸素を拡散できるものであることである。マトリックスはビーズ、フィルム、膜、管、ウェル、ストリップ、ロッド等を含む粒子のような多くの形状の何れかを有することができる。マトリックスの表面は好ましくは親水性であるか、または親水性を付与できるものである。マトリックスの本体は好ましくは疎水性である。マトリックスはそれが使用される媒体中に懸濁可能なものでありうる。本発明に従って懸濁可能なマトリックスの例は例えば、ラテックス、脂質2層物、油滴、細胞およびヒドロゲルのような重合体マトリックスであるがこれらに限定されない。他のマトリックス組成物には重合体、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ナイロン、ポリ(ビニルブチレート)等が包含され、これらは何れもそれ自体で、または他の物質と組み合わせて使用される。
【0066】
マトリックスへのsbp構成員の結合は直接または関節、共有結合、または非共有結合であってよく、文献記載のよく知られた手法により達成することができる。例えば「Immobilized Enzymes」、Ichiro Chibata, Halsted Press, New York(1978)および Cuatrecasas, J. Bil. Chem., 245:3059(1970)を参考にすることができる。
【0067】
マトリックスの表面は通常は多官能性であるか、または、多官能性化されることが可能なものであるか、あるいは、共有結合または特異的または非特異的な非共有結合性の相互作用を介してsbp構成員等に結合が可能なものである。このような結合は、非共有結合性の相互作用を用いる場合は間接的であり、共有結合性の相互作用を用いる場合は直接的である。広範な種類の官能基を使用または取り込むことができる。官能基はカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などを包含する。表面に広範な種類の化合物を結合する方法はよく知られており、文献に記載されている(上記参照)。オリゴヌクレオチドまたはsbp構成員への連結基の長さは、結合すべき化合物の性質、結合すべき化合物と特異的結合特性表面との間の距離の影響などに応じて、広範に変化する。
【0068】
反応性試薬はマトリックスの調製の間、またはその後にマトリックスに取りこまれる。反応性試薬は通常はマトリックス中に溶解するように選択されるが、マトリックスに共有結合してもよい。反応性試薬は、共有結合されない場合は、マトリックスからの解離性を低下させるため通常は疎水性である。一般的に、マトリックス組成物は反応性試薬とマトリックスの会合に都合が良いように選択する。
【0069】
本発明の組成物中のマトリックスと会合するかこれに取りこまれている反応性試薬の量は反応性試薬、例えばケミルミネッサー、蛍光エネルギーアクセプター、光活性インジケーター前駆体など、および、マトリックスの性質および得られる試薬の用途のような多くの要因に応じて変化する。反応性試薬は本発明で生成するシグナルを至適化するために、即ち、アッセイのバックグラウンドに対して最高のシグナルが得られるために必要な量でマトリックス中存在する。一般的に、反応性試薬の量は経験的に決定され、通常は10-8〜1M、好ましくは10-5〜10-2M、より好ましくは、10-3〜10-1Mである。
【0070】
一般的に、sbp構成員はマトリックス表面上に存在する分子に対し、約0.5〜100、通常は1〜90、多くの場合約5〜80、好ましくは約50〜100モル%の量で存在する。sbp構成員の特定の量は多くの要因により変化することもあり、通常は経験的に最も良く決定される。
【0071】
粒子 - 約20nm以上約20ミクロン未満、通常は約40nm以上約10ミクロン未満、好ましくは約0.10〜2.0ミクロンの直径を有する粒子であり、通常は1ピコリットル未満の体積を有する。粒子はどのような密度を有していても良いが、好ましくは水に近い密度を有し、一般的には約0.7〜約1.5g/mLである。粒子は荷電または非荷電であってよいが、荷電している場合、好ましくは負荷電である。粒子は固体(例えば有機または無機の重合体またはラテックス)、油滴(例えば炭化水素、フルオロカーボン、シリコン液)または小嚢胞体(例えばリン脂質のような合成物、または、細胞および細胞内小器官のような天然物)であってよい。
【0072】
固体粒子は通常はアッセイ媒体中に容易に分散できる付加重合体または縮重合体の何れかの重合体である。固体粒子はsbp構成員に直接または間接に表面で結合または連結され、そして、その体積内に反応性試薬を取りこむように吸着性または官能性付与可能なものあってよい。
固体粒子はポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリレーとおよびメタクリレートの単独重合体および共重合体、特にエステルおよびアミド、シリコーン等よりなることができる。粒子は上記した通りsbp構成員に結合または連結してよい。
【0073】
油滴 - 水溶液中の懸濁液、即ち、乳液として存在する例えばリン脂質、スフィンゴミエリン、アルブミン等のような両親媒性(amphiphilic)分子である乳化剤によりコーティングされるかまたは安定化された親油性化合物よりなる水非混和性の液体粒子である。油滴を含有するエマルジョンは従来の操作法に従って、適切な親油性化合物とアニオン系、カチオン系または非イオン系の界面活性剤を合わせ、その際界面活性剤は混合物の約0.1〜5、より通常は約0.1〜2重量%の量で存在させ、そして、水性媒体中の混合物を超音波または回転攪拌により攪拌することにより調製できる。代表的な親油性化合物は炭化水素油脂、ハロゲン化炭素、例えばフッ化炭素、アルキルフタレート、トリアルキルホスフェート、トリグリセリド等を包含する。
【0074】
Sbp構成員、適切には反応性試薬および増感剤試薬は、多くの方法で液滴に結合することができる。上記したGiaeverの記載に従って、特定のsbp構成員、例えば蛋白性sbp構成員は、乳化工程の前後に水性媒体中にsbp構成員の過剰量を導入することにより、液滴上にコーティングすることができる。洗浄段階で過剰のsbp構成員を除去するのが望ましい。油の官能性付与によりsbp構成員に連結するための上記した官能基が導入される。
増感剤試薬または反応性試薬は油滴が油相に可溶であるように選択してよい。油がフルオロカーボンである場合は、フッ化増感剤試薬または反応性試薬が相当する未フッ化誘導体よりもより可溶である場合が多い。
【0075】
リポソーム - 概ね球状の1つ以上の脂質2重層よりなる微小嚢胞体であり、本発明で使用するのに好ましい物質の1つである。リポソームは約20nm以上約20ミクロン未満、通常は約40nm以上約10ミクロン未満の直径を有する。好ましくは、リポソームの直径は沈殿や浮遊を制限するためには約2ミクロン未満である。
【0076】
本発明で利用可能な粒子を調製する際に用いられるリン脂質はレシチンを含む天然の膜中に存在するリン脂質またはリン脂質混合物の何れであることもでき、または、飽和または不飽和の12炭素ないしは24炭素の直鎖の脂肪酸の合成グリセリルホスフェートジエステルであってホスフェートはモノエステルとして存在することができるもの、または、極性アルコールのエステル、例えばエタノールアミン、コリン、イノシトール、セリン、グリセロール等が挙げられる。特に好ましいリン脂質には、L−a−パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、L−α−ジオレオイルホスファチジルグリセロール、L−α(ジオレオイル)ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)およびL−α−(ジオレオイル)ホスファチジル(4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシアミド)エタノール(DOPE−MCC)が包含される。
【0077】
本発明で使用するためには、リポソームはsbp構成員に結合することが可能であり、そして、水性または非水性の相の何れかと会合している増感剤試薬または反応性試薬を有することが可能でなければならない。
リポソームは、水溶液中の乾燥リン脂質またはリン脂質代替品の水和および機械的分散を含む種々の方法により調製して良い。この方法で構成したリポソームは、種々の大きさ、組成および挙動を有する。機械的に分散させたリポソームの不均一性および挙動の非一貫性を低減する1つの方法は、超音波処理である。このような方法はリポソームの平均の大きさを減少させる。あるいは、リポソームの製造過程の最終工程として押出法を使用できる。米国特許4,529,561号は粒径の均一性を改善するために均一の孔径を有する膜を通して加圧下にリポソームを押し出す方法を開示している。
【0078】
脂質の二重層中に溶解した増感剤試薬または反応性試薬を含有するリポソームの調製は種々の方法、例えば、Olsen等のBiochemiica et Biophysica Acta, 557 (9), 1979に記載されている方法で行うことができる。
【0079】
ラテックス粒子 - 「ラテックス」とは通常20nm〜20mm、好ましくは100〜1000nmの粒径を有する粒状の水懸濁性の非水溶性の重合体物質である。ラテックスは、置換ポリエチレン、例えばポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミドポリスチレン、アミノ基保有ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニルアクリレート共重合体等である。スチレンおよびカルボキシル化スチレン、またはアミノ、ヒドロキシル、ハロなどのような他の活性基で官能性を付与されたスチレンの非交差結合重合体が好ましい。多くの場合、ブタジエンのようなジエンによる置換スチレンの共重合体が使用される。
【0080】
本発明で使用されるラテックス粒子との増感剤試薬または反応性試薬の会合には、重合による粒子の形成の過程の取りこみが関与して良いが、通常は粒子への非共有結合性の溶解による前形成された粒子への取りこみが関与することが通常である。通常は、試薬の溶液を用いる。
sbp構成員または標識試薬の構成員はラテックス粒子の表面に物理的に吸着されるか、または、他のマトリックスに関して上記した態様と同様にして粒子に共有結合するか連結する。
【0081】
特異的結合対の構成員(「sbp構成員」) ─ 他の分子の特定の空間的および極性上の機構に対して特異的に結合し、これによりそれに対して相補的であると定義される、表面上または空洞部内の領域を有する2種の分子のうちの一方。特異的結合対の構成員はリガンドおよび受容体(抗リガンド)と称される。これらは通常は免疫学的一対、例えば抗原−抗体の構成員であるが、他の特異的結合対、例えばビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二重鎖、IgG−蛋白A、ポリヌクレオチド対、例えばDNA−DNA、DNA−RNA等は免疫学的な一対ではないが本発明のsbp構成員の定義に含まれるものとする。
【0082】
ポリヌクレオチド - 天然の状態で約50〜500,000以上のヌクレオチドを有し、単離された状態で約15〜約50,000以上のヌクレオチド、通常は約15〜20,000ヌクレオチド、多くの場合15〜10,000ヌクレオチドを有する重合体ヌクレオチドである化合物または組成物。ポリヌクレオチドには天然または合成による精製または未精製の形態の如何なる原料に由来する核酸も包含し、例えばDNA(dsNDAおよびssDNA)およびRNA、通常はDNAであり、そして、t−RNA、m−RNA、r−RNA、ミトコンドリアDNAおよびRNA、クロロプラストDNAおよびRNA、DNA−RNAハイブリッド、またはこれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、微生物、例えば細菌、酵母、ウィルス、ウイルス擬似物、カビ、真菌、植物、動物、ヒトのような生物学的材料に由来するゲノムおよびその断片等が挙げられる。
【0083】
リガンド - それに対する受容体が天然に存在するか、調製することができる何れかの有機化合物。
リガンド類縁体 - 通常は分子量が100より大きい修飾リガンド、有機ラジカルまたは分析対象の類縁体であり、受容体に対する類似のリガンドと競合し、その修飾によりリガンド類縁体が別の分子に結合する手段が得られる。リガンド類縁体は通常はハブまたは標識にリガンド類縁体を連結する結合で水素が置き換えられているよりも高度にリガンドと異なっているが、これに限定されない。リガンド類縁体はリガンドと同様にして受容体に結合することができる。類縁体は例えばリガンドに対する抗体のイディオタイプに対抗する抗体である。
【0084】
受容体(「抗リガンド」) - 分子の特定の空間的または極性上の機構、例えばエピトープ性または抗原決定基の部位を認識することの可能な何れかの化合物または組成物。代表的な受容体には天然の受容体、例えばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Fab断片、レクチン、核酸、蛋白A、相補成分C1q等が挙げられる。
特異的結合 - 他の分子の実質的に小さい認識と対照的な、2つの異なる分子の一方のもう一方に対する特異的認識。一般的に、分子はその表面上またはその空洞部に2つの分子の間の特異的認識をもたらす領域を有する。特異的結合の例は抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。
【0085】
非特異的結合 - 特定の表面構造とは比較的無関係の分子間の非共有結合。非特異的結合は分子間の疎水的相互作用のような幾つかの要因により起こる。
抗体 - 他の分子の特定の空間的および極性上の機構に特異的に結合し、このためそれに対して相補的と定義される免疫グロブリン。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよく当該分野で知られた方法、例えば宿主の免疫化および血清(ポリクローナル)の採取、連続ハイブリッド細胞系統を調製し、分泌された蛋白(モノクローナル)を採取する方法、または、天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくとも解読するヌクレオチド配列またはその突然変異型をクローニングして発現する方法等で調製できる。抗体は完全な免疫グロブリンまたはその断片を包含し、そのような免疫グロブリンには種々のクラスおよびアイソタイプ、例えばIgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3、IgM等が包含される。これらの断片としては、Fab、FvおよびF(ab′)2、Fab′等が包含される。更に、免疫グロブリンまたはその断片の凝集物、重合体およびコンジュゲートも特定の分子への結合親和性が維持される限りにおいて、適宜使用することができる。
【0086】
置換された - 分子の水素原子がハロゲンのような単一の原子、または1〜50原子(このような原子の原子価を満足するために必要な水素原子以外)ただしその原子は相互に独立して炭素、酸素、窒素、イオウ、ハロゲン(塩素、臭素、ヨウ素、フッ素)およびリンから選択され、1つ以上の金属原子に結合していてもしていなくても良い置換基のような官能基を形成する原子団の一部であってよい別の原子で置き換えられていることを意味する。
【0087】
電子供与基 - 分子に結合した場合に分子を分極させ電子供与基が貧電子状態となり分子の他の部分に対して相対的に陽荷電し、即ち、電子密度が低下する置換基。このような基にはアミン、エーテル、チオエーテル、ホスフィン、ヒドロキシ、オキシアニオン、メルカプタンおよびこれらのアニオン、スルフィド等が包含されるがこれらに限定されない。
【0088】
1〜50原子(このような原子の原子価を満足するために必要な水素原子以外)を有する置換基のような官能基を形成する原子であって、その原子は相互に独立して炭素、酸素、窒素、イオウ、ハロゲンおよびリンから選択されるもの―有機性の基;有機性の基は基の原子の原子価を満足するために必要な数の水素原子を除き1〜50原子を有する。一般的に、主な原子は炭素(C)であるが、酸素(O)、窒素(N)、イオウ(S)、リン(P)であってもよく、O、N、SまたはPが存在する場合はこれらは炭素またはそれらの1つ以上に対して相互に、または、水素または金属原子に結合して種々の官能基、例えばカルボキシル基(カルボン酸)、ヒドロキシル基(アルコール)、メルカプト基(チオール)、カルボキサミド、カーバメート、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エステル、リン酸、リン酸エステル、尿素、カーバメート、ホスホアミド、スルホナミド、エーテル、スルフィド、チオエーテル、オレフィン、アセチレン、アミン、ケトン、アルデヒドおよびニトリル、および、アルキル、アルキリジン、アリール、アラルキルおよび上記した官能基の1つ以上で置換されたアルキル、アリールおよびアラルキル、例えばフェニル、ナフチル、フェナントリル、m−メトキシフェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、N−モルホリノを形成し、そして、一緒になって、環、例えばアダマンチル、N−メチルアクリダニリド、キサンタニリジン、1−(3,4−ベンゾ−5−ヒドロフリリデン)等を形成してよい。
【0089】
連結基 - 分子間の共有結合に関与する基。連結基は分子の性質、即ち、増感剤、反応性試薬、マトリックス、sbp構成員、または、連結すべき粒子またはその一部と会合した分子により異なる。通常存在する、または、マトリックスまたはsbp構成員上に導入される官能基を上記物質の連結のために用いる。
大体、カルボニル官能基はオキソカルボニル、例えば、アルデヒドおよび非オキソカルボニル(窒素およびイオウの類縁体を含む)、例えばカルボキシ、アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチオノカルボキシの双方で使用される。
【0090】
オキソの代替官能基は活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、オレフィン、特に活性化されたオレフィン、アミノ、ホスホロ等を包含する。連結基の説明は米国特許3,817,837号に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0091】
連結基は結合手であるか、または、通常炭素、酸素、イオウ、窒素、ハロゲンおよびリンよりなる群から相互に独立して選択される、1〜100原子、通常は約1〜70原子、好ましくは1〜50原子、より好ましくは1〜20原子の鎖であることもできる。連結基中のヘテロ原子の数は標準では約0〜20個、通常約1〜15個、好ましくは2〜6個である。鎖内の原子は1〜50原子の置換基に関して上記したものと同様に、水素以外の原子で置換されてよい。一般的規則として、特定の連結基の長さは合成の簡便性、および、エネルギー収受体、蛍光団、重原子のような系間交差の分析のための基等のような何れかの所望の基の取りこみが可能となるように適宜選択できる。連結基は、ジアゾ基、芳香族基が通常関与するが、脂肪族または芳香族であって良い。
【0092】
ヘテロ原子が存在する場合は、酸素は通常は炭素、イオウ、窒素またはリンに結合したオキソまたはオキシとして存在し、窒素は通常は炭素、酸素、イオウまたはリンに結合したニトロ、ニトロソまたはアミノとして存在し;イオウは酸素と同様であり;リンは通常はホスホンートおよびホスフェートモノ−またはジエステルとして炭素、イオウ、酸素または窒素に結合している。
連結基とコンジュゲートすべき分子との間の共有結合の形成における共通の官能基は、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテルおよびカルボキシレート、スルホネートおよびホスフェートエステル、アミドおよびチオエステルである。
【0093】
大部分において、連結基は非オキソカルボニル基、例えば窒素およびイオウの類縁体、ホスフェート基、アミノ基、アルキル化剤、例えばハロまたはトシルアルキル、オキシ(ヒドロキシルまたはイオウ類縁体、メルカプト)オキシカルボニル(例えばアルデヒドまたはケトン)または活性オレフィン例えばビニルスルホンまたはα,β−不飽和エステルを有する。このような官能基はアミン基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えばブロモアセチルに連結する。アミンおよびカルボン酸またはその窒素誘導体またはリン酸が連結される場合は、アミド、アミジンおよびホスホアミドが形成される。メルカプタンおよび活性オレフィンが連結される場合は、チオエーテルが形成される。メルカプタンおよびアルキル化剤が連結される場合は、チオエーテルが形成される。アルデヒドおよびアミンが還元条件下に連結される場合は、アルキルアミンが形成される。カルボン酸またはリン酸およびアルコールが連結される場合は、エステルが形成される。
【0094】
親水性または水溶性を付与する基または官能基 - これは親水性の官能基であり、水による固体のぬれ性およびそれが結合する化合物の水溶性を増大させる。このような官能基または官能性は1〜50以上の原子を有する置換基であることができ、そして、スルホネート、スルフェート、ホスフェート、アミジン、ホスホネート、カルボキシレート、ヒドロキシル、特にポリオール類、アミン、エーテル、アミド等を有する基を包含する。代表的な官能基はカルボキシアルキル、スルホンオキシアルキル、CONHOCH2COOH、CO−(グルコサミン)、糖、デキストラン、シクロデキストリン、SO2NHCH2COOH、SO3H、CONHCH2CH2SO3H、PO3H2、OPO3H2、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトンおよびこれらの組合せである。上記官能基の大部分は結合基としても利用でき、これによりsbp構成員等と標識を有する粒状組成物の結合が可能になる。
【0095】
親油性または脂溶性を付与する基または官能基 - これは水による表面のぬれ性およびそれが結合するする化合物の水溶性を低下させる親油性の官能基である。このような官能基または官能性は1〜50以上の原子、通常は水素またはハロゲンで置換された炭素原子を含み、そしてアルキル、アルキリデン、アリールおよびアラルキルを包含する。親油性の基または官能基は炭素原子6個以上、通常は10個以上、好ましくは12個以上であり通常は炭素原子30個以下を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族基1〜6個を通常有する。脂肪族基は脂環族、複素環、または芳香環であってよい5〜6員の環に結合していてよい。親油性の基は非水性マトリックス中の溶解度を増大させるために標識または他の物質に結合していて良い。
【0096】
補助的物質 - 種々の補助的物質を本発明によるアッセイで用いる場合が多い。例えば、緩衝液は通常は試験媒体中に存在し、アッセイ媒体およびアッセイ成分の安定化剤も同様である。多くの場合、上記添加物のほかに、アルブミンのような蛋白;ホルムアミドのような有機溶媒;第4アンモニウム塩;デキストランスルフェートのようなポリアニオン;界面活性剤、特に非イオン系界面活性剤;結合増強剤、例えばポリアルキレングリコール等を含む。
【0097】
完全または部分的に逐次的な - これは本発明で使用する試料および種々の物質を一度に(同時に)ではなく混合する場合、1つ以上の物質を残りの物質の1つ以上と組合せ、下位の組合せを形成して良い。下位の組合せの各々を次に本発明の1つ以上の工程に付す。即ち、下位の組合せの各々を所望の結果の1つ以上を達成する条件下でインキュベートすることができる。
【0098】
上記した通り、本発明は媒体中の成分2種以上の存在または相対量を測定することに関する。成分を含有していることが疑われる媒体および増感剤試薬少なくとも2種および活性化された増感剤試薬の生成物と反応することの可能な反応性試薬少なくとも1種を包含する組合せが提供される。好ましくは増感剤試薬は一重項酸素を発生することが可能である。反応性試薬との増感剤試薬の各々の相互作用は各該当成分に相応し、これによりその検出を可能とする。増感剤試薬は示差的に活性化され、そして、シグナルの量は各特定の相互作用に関して測定する。シグナルの量は成分の各々の量に関係したものとなる。反応性試薬はマトリックスにとり込まれるかそれに連結されることによりそれと会合してよい。さらにまた、増感剤試薬はマトリックスにとり込まれるかそれに連結されることによりそれと会合してよい。1つの増感剤試薬および1つの反応性試薬は前出の米国特許5,709,994号に記載の方法と同様に同じマトリックス内で会合していてよい。
【0099】
アッセイは一般的には最高のアッセイ感度を与える中性pHにおいて水性緩衝媒体中において通常は行なわれる。水性媒体は単に水であるか、または、0.01〜80容量%異常の共溶媒を含有してよい。媒体のpHは通常は約4〜13、より通常は約5〜10、そして好ましくは約6.5〜9.5の範囲である。pHは通常は最高のアッセイ感度および特異性が達成されるように選択される。考慮すべき要因としては、関与する反応速度のpH依存性、結合構成員の結合および非特異的結合の最少化である。
【0100】
所望のpHを達成し、そのpHを測定中維持するために種々の緩衝物質を使用してよい。代表的な緩衝物質の例は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等である。使用する特定の緩衝物質は本発明においては重要ではないが、個々のアッセイにおいて1つ以上の緩衝物質を用いるのが好ましい。
【0101】
アッセイを実施する際には温和な温度を通常は用い、そして普通は一定温度、好ましくは室温を測定中に用いる。インキュベーション温度は通常約5℃〜99℃、普通は約15〜70℃、より普通には20〜45℃である。測定中の温度は一般的には約10〜70℃、普通約20〜45℃、更には20〜25℃である。
【0102】
場合により、活性化反応性試薬、例えば活性化ケミルミネッサーは、その反応生成物が常温で比較的安定であることから、崩壊させてルミネセンスを得るためには100℃まで加熱することが必要な場合がある。相対的に安定なジオキセタンは例えば一重項酸素とアダマンチリデンとの反応(例えば前出のMcCapra参照)により形成することができ、そして、比較的安定なエンドパーオキシドは一重項酸素と1,4−ジ置換ナフタレンおよびアントラセンとの反応(例えばN.J. Turro, Modern Molecular Photochemistry (1978) Benjamin Cummings Publishing CO., p594参照)により形成できる。上記した双方の状況下、安定した物質は通常は200℃未満、好ましくは約50〜100℃の温度で加熱することにより崩壊を起こす。このような加熱により一重項酸素/オレフィン付加物の急速な分解が起こり、即ち、単時間の発光が起こる。この方法の使用は、異なるケミルミネッサーからの個別のシグナルを寿命および波長で完全に分割することが困難な場合に必要となる。
【0103】
検出すべき成分の濃度は、一般的に約10-5〜10-17M、より通常は約10-6〜10-14Mである。アッセイが定性的であるか、半定量的であるか、定量的であるかどうかにより、そして、特定の検出方法、および、対象成分の性質および濃度を考慮することにより、通常は種々の試薬の濃度が決定される。
アッセイ媒体中の種々の試薬の濃度は一般的に検出すべき成分の濃度範囲により決定されるが、各試薬の最終濃度は通常そのレンジにおけるアッセイの感度を旨適化するために経験的に決定される。即ち、重要である検出すべき成分の濃度の変化は正確に測定できるシグナルの相違をもたらすものでなければならない。
【0104】
上記した通り、増感剤試薬および反応性試薬の一方または両方とも好ましくは粒子の形態のマトリックスを有していてよく、これに増感剤または反応性試薬は、または増感剤および反応性試薬が会合する。本実施態様においては、マトリックスは増感剤試薬または反応性試薬または双方をその内部および/またはその表面に取りこんだ状態で保有している。マトリックスに会合している増感剤または反応性試薬の量は通常はマトリックスの約20重量%まで、より普通にはマトリックスの約0.01〜約20重量%である。蛍光エネルギーアクセプター1種以上を反応性試薬と組合せて使用する場合は、蛍光エネルギーアクセプターは通常は約10-7〜約10-1M、好ましくは約10-5〜約10-2Mである。
【0105】
添加の順序は広範に変動して良いが、アッセイの性質に応じて特定の好適例がある。最も単純な添加の順序は全ての物質を同時に添加することである。あるいは、試薬を完全または部分的に逐次的に混合することもできる。通常は約5秒〜約24時間、普通は約30秒〜約6時間、通常は約2分〜1時間のインキュベーション工程1回以上を試薬の添加後に設ける。
【0106】
本発明の方法の示差的活性化の主な制御は増感剤の性質に関係する。活性化の異なる波長に寄与する構造的特徴は電子供与および/または電子吸引基、分子内コンジュゲーションの程度、分子の平坦さ、結合の緊張度、金属リガンド、分子内の複素環原子の存在等を包含する。活性化の異なる波長に寄与する別の特徴としては、pH、溶媒の極性、分子複合体、および例えば蛍光団からのエネルギーの転移が挙げられる。エネルギー転移機序を用いる場合は、光活性化のための発光波長の変調のために種々の蛍光団と組合せて同じ増感剤成分を選択してよい。これによりマルチ度が向上する。一重項酸素発生の効率はまた増感剤の選択においても要因となる。
【0107】
光活性化増感剤を得るには媒体を光で照射して増感剤を活性化する。照射は通常は石英ハロゲンまたは水銀ハロゲンのような白熱灯、発光ダイオード、固体およびガスのレーザーを用いて行なう。活性化の波長は上記した通りである。
化学活性化された増感剤は活性化の時間に応じて選択し、これは活性化の種類に関係する。化学活性化増感剤には、化合物が増感剤としてのその機能を発揮することを妨害する部分への化学的に弱い結合を有する化合物が包含される。このような弱い結合はエステル、アミド、アセタールのような部分へのものである。化合物は、弱い結合を破壊して化合物が本発明の増感剤として機能できる陽にする、酸または塩基のような物質による処理により化学活性化される。化学活性化された増感剤を得るためには、通常は増感剤を活性化するための適切な化学的試薬により媒体を処理する。通常はこれには媒体への化学的試薬の添加が含まれる。
【0108】
分子の酵素的活性化もまた本発明の範囲に包含される。酵素による基の除去は化合物を活性化して光増感剤とする。光不安定な保護/マスキング基もまた有用である。複数の光不安定な基を単一の増感基ト組み合わせて使用することにより、マルチ度が向上する。
上記した通り、異なる増感剤を種々の反応性試薬と組合せて使用することによりより高いマルチ度を達成できる。化学ルミネセンス化合物は発光波長および/または崩壊速度に基づいて示差される。ルミネセンスの崩壊に寄与する構造的特徴は前出のSchaapとMcCapraが論じており、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる。ルミネセンスまでの時間を制御するための別の要因は粒子のようなマトリックスの組成である。一般的にマトリックスがケミルミネッサーの溶解している非極性の物質からなる場合、崩壊時間は極性物質に相関して増大する。ルミネセンスの速度を制御するために使用してよい別の要因は温度である。一般的に温度の上昇により崩壊時間は減少する。
【0109】
シグナル発生化合物、例えばケミルミネッサー、フルオレッサー、蛍光エネルギーアクセプターなどの性質がシグナル測定の態様を決定する。方法において発生する光は、目視、写真、化学光量測定、分光分析により、または媒体中の各成分の量に関係するその量を測定するための何らかの好都合な方法により測定できる。発光された光は例えばルミノメーターまたは管硬性物質を用いることにより、シグナル発生試薬がアッセイ媒体と接触している間に、測定してよい。
【0110】
本発明の方法および組成物の1つの特定の用途は各々が特異的結合対(sbp)の構成員である複数のアナライトの存在または相対量を測定するための方法である。複数のアナライトを含有することが疑われる媒体、複数の光増感剤および1種以上の反応性試薬を包含する組合せが提供される。光増感剤と反応性試薬の組合せの数は媒体中のアナライトの各々を示差するのに十分なものとする。例えばケミルミネッサーのような単一の反応性試薬と組合せて各アナライトにつき異なる光増感剤を用いてよい。一方、光増感剤の数は示差すべきアナライトの総数より少なくてもよい。このような場合、1種より多いケミルミネッサーは、それらが発光の波長またはまた崩壊の速度により識別できる場合は、用いてもよい。各光増感剤試薬は光増感剤が会合している粒子に結合した第1のsbpを有する。各々の第1のsbp構成員はアナライトまたは第2のsbp構成員と結合して各アナライトの量に関係する複合体を形成することができる。組合せは、sbp構成員がアナライトまたは各々の第2のsbp構成員に結合できるのに十分な条件下、媒体中でインキュベートする。媒体を示差的に光照射する。反応性試薬の各々により生成されるルミネセンス発光の量は特定の光増感剤の照射に相当する照射の後の時点において検出する。複数の反応性試薬を用いる場合は、各反応性試薬の発光の波長および発光の時間も考慮する。測定されたルミネセンス発光の量を次に媒体中の各アナライトの量と相関させる。
【0111】
各々が特異的結合対(sbp)の構成員である複数のアナライトの存在または相対量を測定するための方法における別の実施態様においては、複数のアナライトを含有していることが疑われる媒体、複数の光増感剤および1種以上の反応性試薬を包含する組合せが提供される。上記した通り、光増感剤および反応性試薬の組合せの数は媒体中のあならの各々を示差するのに十分なものである。各試薬は光増感剤と反応性試薬が会合している粒子に結合した第1のsbp構成員を含む。各第1のsbp構成員はアナライトまたは第2のsbp構成員と結合してそれぞれのアナライトの量に関係している複合体を形成することができる。Sbp構成員がアナライトまたは各々の第2のsbp構成員に結合するのに十分な条件下、媒体中で組合せをインキュベートする。このことは、各々の粒子試薬が結合した媒体中で全アナライトに結合する結合試薬が連結している支持体を使用するなどの標準的手法により達成してよい。洗浄等により支持体から未結合の試薬を分離した後、結合した試薬を示差的に光照射する。反応性試薬の各々により発生したルミネセンス発光の量を特定の光増感剤の照射に相当する照射後の時点において検出する。複数の反応性試薬を使用する場合は、各々の反応性試薬からの発光の波長および発光の時間を考慮する。各測定ルミネセンス発光の量を次に媒体中の各アナライトの量と相関づける。この方法により、同じマトリックス内で反応性試薬と組合せた増感剤試薬が単にシグナル発生物質として機能する。
【0112】
本発明の方法および組成物はリガンド−受容体、例えば抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合アッセイ等のようなsbp構成員の関わる大部分のアッセイに適合させてよい。アッセイは通常は均質なまたは不均質な、好ましくは均質な、例えば競合的およびサンドイッチのアッセイである。特異的結合アッセイにおいては、試料は必要により前処理して望ましくない物質を除去したり、アナライトを検出可能としてよい。
【0113】
前述した通り、上記した第1のsbp構成員はアナライトまたはアナライトに結合できる第2のsbp構成員に結合する。第2のsbp構成員がやはりアナライトに結合可能である場合は、サンドイッチアッセイのプロトコルが得られる。サンドイッチ型のアッセイのための免疫学的反応は通常は、sbp構成員、例えば抗体を含み、これはアナライト、第2のsbp構成員、例えば抗体に相補的であり、更にこれがアナライトに相補的であり、粒状のマトリックスおよび目的の試料に結合する。
【0114】
或いはsbp構成員の1つはアナライトに類縁であることができ、このような場合、競合的アッセイプロトコルが得られる。競合的アッセイプロトコルの免疫学的反応には通常、アナライトに相補的なsbp構成員およびアナライトに類縁する、通常はその誘導体であるsbp構成員が関与する。このようなsbp構成員の1つがマトリックスと会合する。
【0115】
1つの種類のアッセイにおいては、sbp構成員であるアナライトを含有することが疑われる試料および他のアッセイ試薬を合わせてインキュベートする。次に使用する光増感剤の数に相当する適切な波長で媒体を照射する。通常は試料中の各アナライトの量に関係する発酵光量を測定することにより、媒体を発光の有無に関し示差的に検査する。この方法は分離工程を使用しない均質なアッセイである。或いは、粒状または非粒状のマトリックスを用い、アッセイ試薬と合わせてインキュベートした後、これを液相から分離し、次に固相または液相を示差的に照射し、発光の有無に関して示差的に検査してよい。
【0116】
アッセイプロトコルの別の例は、非限定的な例として以下に記載する。化学ルミネセンス化合物を、アナライトに相補的な特異的結合試薬(例えば抗体、居りぬく、受容体等)に連結した粒子に会合させる。増感剤粒子をアナライトに相補的な第2の特異的結合し約に結合させる。各別個のアナライトにつき1つの増感剤粒子試薬が存在する。サンドイッチアッセイフォーマットにおいては、アナライトは増感剤粒子とケミルミネッサー粒子オの双方を近接させる。光による増感剤粒子の活性化により、一重項酸素が形成され、これが粒子標識試薬に到達する。通常は増感剤試薬は示差的に活性化され、各化学ルミネセンス組成物により発光された光を順次検出して測定する。
【0117】
活性化の異なる波長または活性化の異なる様式を有する増感剤試薬および異なる寿命および異なる発光最大を有する反応性試薬を慎重に選択することにより、高い感度および広いダイナミックレンジでアッセイを行なうことができる。アッセイの感度と精度はマトリックスの表面の試薬のコーティングのような試薬の調製に留意することにより旨適化してよい。即ち、試料中の複数の成分の同時検出および定量を行なうことができる。上記した通り、本発明で使用する試薬は一重項酸素により活性化される場合に最も効果的となる。シグナルは発光の波長および/または時間の相違と組合せた活性化の波長または様式における相違により分別することができる。
【0118】
上記した組成物およびアッセイは説明のためのものであり、当業者が本発明の範囲を解釈したり不必要な実験を行なうことなく本発明を実施する際に制限を与えるものではない。成分、例えばアナライト、標識試薬、粒子、他の試薬および反応条件の選択は本明細書の開示および後に記載する実施例を参照することにより当業者に示唆されるものである。
【0119】
本発明の別の特徴は媒体中の2種以上の成分の存在または相対量を測定するための本発明のアッセイ方法を好都合に実施するために有用なキットに関する。本発明の要件の汎用性を増強するために、同じか別個の容器中にパックされた組合せとして試薬を提供することにより、試薬の比率は方法およびアッセイのために実質的に旨適化されたものとなる。試薬は各々個別の容器にいれてよく、或いは、試薬の交叉反応性や安定性に応じて種々の試薬を1つ以上の容器中に組み合わせてもよい。
【0120】
本発明のキットはパッケージされた組合せ中に複数の増感剤試薬を含有し、その各々は(1)一重項酸素を発生することができる増感剤試薬および(2)特異的結合対(sbp)の構成員を包含する。増感剤試薬の少なくとも部分は異なる増感波長を有する。増感剤は活性化されて一重項酸素を形成し、そして、光増感剤であってもよい。キットは更に一重項酸素により活性化され得る反応性試薬少なくとも1種を包含する。キットは更に複数の反応性試薬を包含してよく、その際、該複数の反応性試薬の1種以上は示差的に検出される。反応性試薬は上記成分と結合することのできるsbp構成員と会合していてよく、そして更に粒子と会合していてよい。増感剤試薬は粒子と会合していてよい。
【0121】
キットは更に、酵素基質、別のsbp構成員、補助的試薬などのようなアッセイを実施するための他の個別にパックされた試薬を含むことができる。
キット内の種々の試薬の相対量は、本発明の方法において起こることが必要である反応を実質的に至適化する試薬の濃度を得るために、そして、アッセイの感度を実質的に更に至適化するために広範囲変動することができる。適切な状況下において、キット内の試薬1種以上は、賦形剤を含有する通常は凍結乾燥物された乾燥粉末として提供されることができ、これは溶解により本発明の方法またはアッセイを実施するために適切な濃度を有する試薬溶液を与える。キットは更に上記した本発明の方法の説明書を含むことができる。
【0122】
上記した通り、本発明の別の実施態様はビス(トリ−アルキル1−シリル)シリコンテトラ−アルキル2−ナフタロシアニンである化合物である。特定の実施態様においては、例示であり限定しないが、アルキル1はヘキシルであり、アルキル2はブチルであり、化合物はビス(トリn−ヘキシルしリル)シリコンテトラ−t−ブチルナフタロシアニンである(後に記載するナフタロシアニン増感剤の合成と題されたセクションを参照)。アルキル1およびアルキル2は相互に独立してアルキル基であり、これは通常は炭素原子1〜30個、好ましくは炭素原子4〜20個を有する炭素原子と水素を含む基である。アルキル基は直鎖または分枝鎖であってよい。
【0123】
本発明の1つの特徴はビス(トリ−アルキル1−シリル)シリコンテトラ−アルキル2−ナフタロシアニンの調製方法である。方法はJ. Sounik, 「Synthesis and Characterization of Group IV Naphthalocyanines」m Case Western Reserve, 1988 に記載の論文に開示される方法の変法である。本発明の方法においては、デヒドロキシシリコンテトラ−アルキル2−ナフタロシアニンをトリ−アルキル1−シリルクロリドで処理する。特定の例においては、限定しないが、方法はビス(トリ−n−ヘキシルシリル)シリコンテトラ−t−ブチルナフタロシアニンの調製に関する。この特定の実施態様においては、方法はジヒドロキシシリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニンをトリ−n−ヘキシルシリルクロリドで処理することを包含する(後に記載するナフタロシアニン増感剤の合成と題されたセクション参照)。
【0124】
簡単に記載すると、ビス(トリ−n−ヘキシルシリル)シリコンテトラ−t−ブチルナフタロシアニンの合成は6−t−ブチル−2,3−ジイソシアネートのナフタレンを強塩基、例えば、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド等で、適当な溶媒中、例えばメタノール、エタノール中等で処理し、その後約0.5〜約10時間、約15℃〜約80℃の温度で、NH3ガスで処理することによる6−t−ブチル−ジイミノベンズ(f)イソインドリンの調製が含まれる。次に、ジクロロシリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニン(t−bu4−NcCl2)を上記した通り調製される6−t−ブチル−ジイミノベンズイソインドリンから調製する。後者の化合物は例えばキノリン等のような適当な有機溶媒に溶解し、シリコンテトラクロリドを添加する。混合物を約15分〜約4時間、約30〜約200℃の温度まで加熱する。次にジヒドロシリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニン(t−bu4−Nc(OH)2)を、例えば濃硫酸による処理などにより、ジクロロシリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニン(t−bu4−NcCl2)から調製する。溶液を約50〜約80℃の温度で約2〜約6時間攪拌する。洗浄し乾燥した後、上記反応の生成物を強塩基、例えば濃NH4OH等で処理する。
【0125】
ビス(トリ−n−ヘキシルしリル)シリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニン(t−bu4−Nc[hex3Si]2)の調製は上記した通り調製したt−bu4−Nc(OH)2を適当な有機溶媒、例えばピリジンなどに溶解しH、ピリ陣中のトリ−n−ヘキシルシリルクロリドの溶液と合わせることにより行なう。通常は反応は不活性雰囲気下、例えばアルギン、窒素等の雰囲気下、約100℃〜約130℃の温度で、約0.5〜約4時間行なう。上記した反応の何れかの生成物は、クロマトグラフィー、再結晶などのようなよく知られた手法により精製してよい。
【0126】
【実施例】
本発明を以下に示す説明のための実施例により更に記載する。特段の記載が無い限り、ここに記載した部およびパーセントは重量によるものである。温度は摂氏(℃)で示す。以下の調製および実施例は本発明を説明するものであり、限定する意図は無い。
【0127】
融点はHooverのキャピラリー装置を用いて測定し、未補正のままとした。1H NMRスペクトルはBruker WP-250 MHzまたはBrucker WP-300 MHzのNMR分光光度計で記録した。化学シフトはppmで記録した(δ0.0)。NMRの多重度は以下の略記法、即ちs,一重線;d,二重線;t,三重線;m,多重線;Hz,ヘルツを用いて記録した。赤外スペクトルはPerkin-Elmer 297 IR分光光度計を用いて記録した。脱着化学イオン化(CI)および電子イオン化(EI)はVarian-MAT311A、2重焦点高分解能質量分析器で行った。Finnigan TSQ-70またはMAT-8230を用いて高速原子衝撃質量スペクトル(FAB/LSIMS)を行った。一部の質量スペクトルはUC Berkeley Mass Spectrometry Laboratoryから入手した。粒径の測定はNICOMP Submicron Particle Sizer Model 370を用いて行なった。超遠心分離はDu Pont Instruments Sorvall RC 5B Refrigerated Superspeed Centrifugeを用いて行なった。UVスペクトルはHewlett Packard 8452A型 Diode Array Spectrophotometerを用いて行なった。蛍光の測定は光源として675および780nmのレーザーを装着した専用の化学ルミノメーターを用いて行なった。
【0128】
トルエンおよびTHFはアルゴン上でナトリウムから蒸留し、ジイソプロピルエチルアミンは3Åのシーブ上で乾燥した。2−エトキシエタノールはAldrich Chemical Co.より入手し、真空下に再蒸留した。他の溶媒は特段の記載が無い限り精製することなく使用し、大部分の反応はアルゴン下で実施した。フラッシュクロマトグラフィーに使用したシリカゲルは230〜400メッシュASTMのものをScientific Productsから購入し、TLCプリペラティブプレート(1000μ)および分析用プレート(250μ)はAnaltechより購入した。
【0129】
1−クロロ−9,10−ビス(フェニルメチル)アントラセン(1−Cl−BPEA)アントラセンおよびルブレン(5,6,11,12−テトラフェニルナフタセン)はAldrich Chemical Co.より購入した。ルブレンは塩化メチレンから再結晶させ、使用時まで褐色ビン中4℃で保存した。ヘプタデシルベンゼンはPfaltz and Bauer, Inc. (Waterbury, CT) から購入した。
カルボキシ変性ポリスチレン(ラテックス)粒子はSeradyn, Incより購入した。粒子は203±4.0nmであった。カルボキシルの滞留位置は49.5Å平方(0.09ミリ等量/g)であった。固形分は10%(100mg/mL)であった。
【0130】
デキストランT−500はPharmacia (piscataway, NJ)より入手した。SIAXおよびTCEPはMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR)より購入した。HBR−1はScantibodiesより入手した。硫酸ゲンタマイシンはLife technologiesより入手した。緩衝液等の調製に用いたKathon保存料および他の一般的試薬はSigma(St Louis, MO)より入手した。
DNAオリゴヌクレオチド、プローブおよびリンカーはOligos Etc. Inc. (Wilsonville, OR)より購入し、凍結乾燥粉末として入手し、使用時まで滅菌水に溶解し凍結保存した。
【0131】
以下の略記法は以下に記載の通りの意味を有する。
・HPLC - 高速液体クロマトグラフィー
・BSA - ウシ血清アルブミン、Sigma Chemical Company, St. Louis MOより入手
・g - グラム
・s - 秒
・ms - ミリ秒
・mM - ミリモル
・DMF - ジメチルホルミアミド
・DMSO - ジメチルスルホキシド
・THF - テトラヒドロフラン
・NMR - 核磁気共鳴スペクトル分析
・TMSCI - テトラメチルシリルクロリド
・EDAC - 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩
・EDTA - エチレンジアミン4酢酸
・MES - 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸
・MOPS - 3−(モルホリノ)プロパンスルホン酸
・EtOAc - 酢酸エチル
・Me - メチル
・OMe - メトキシ
・OAc - アセテート
・MeOH - メタノール
・MS - 質量スペクトル
【0132】
・ナフタロシアニン(Nc) - ビス(トリヘキシルシリル)シリコン−t−ブチル4−ナフタロシアニン
・フタロシアニン(Pc) - ビス(トリヘキシルシリル)シリコン−t−ブチル4−フタロシアニン
・SIAX - スクシンイミジル6−((ヨードアセチル)アミノ)ヘキサノエート
・1O2 - 一重項酸素
・SiO2 - シリカゲル
・TEA - トリエチルアミン
・THF - テトラヒドロフラン
・TCEP - トリス−カルボキシエチルホスフィン
・IHBB - 50mM KCl, 4mM NgCl2, 10mMトリスHCl, 200μg/ml BSA, pH8.3
・DPAビーズ - チオキセンおよび9,10−ジフェニルアントラセンの混合物で染色したラッテクス粒子
・TARビーズ - チオキセン、1−クロロ−9,10−ビスフェニルエチルアントラセンおよびルブレンの混合物で染色したラッテクス粒子
・dopDPA - 可塑剤としてヘプタデシルベンゼンでドープしたDPAビーズ
・dopTAR - 可塑剤としてヘプタデシルベンゼンでドープしたTARビーズ
・緩衝液A - 0.1M Trisma塩基、0.3M NaCl, 25mM EDTA, 1mg/mlデキストランT−500, 1mg/ml BSA, 0.3%(v/v) HBR−1, 0.05% Kathon, 0.01% 硫酸ゲンタマイシン、pH8.2
・h - 時間
・min - 分
【0133】
試薬の調製
C−28チオキセンの合成:
乾燥DMF(200mL)中の4−ブロモアニリン(30g, 174ミリモル)の溶液に1−ブロモテトラデカン(89.3ml, 366ミリモル)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(62.2mL, 357ミリモル)を添加した。反応溶液をアルゴン下16時間90℃で加熱し、その後室温に冷却した。この反応溶液に再度1−ブロモテトラデカン(45ml, 184ミリモル)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(31mL, 178ミリモル)を添加し、反応混合物を更に15時間90℃で加熱した。冷却後、反応溶液を真空下に濃縮し、残留物をCH2Cl2(400mL)で希釈した。CH2Cl2溶液を1N水性NaOH(2×)、水および塩水で洗浄し、Na2SO4上に乾燥し、真空下に濃縮し、暗茶色の油状物(約110g)を得た。溶離剤としてヘキサンを用いたWaters 500 Prep LC systemによるシリカゲル上のプリペラティブカラムクロマトグラフィーにより得られた黄色油状物は主生成物(4−ブロモ−N,N−ジ−(C14H29)−アニリン)と共に少量の成分1−ブロモテトラデカンを含有していた。後者の化合物を真空蒸留(bp 105〜110℃、0.6mm)により混合物から除去し、茶色油状物として生成物50.2g(51%)を得た。アルゴン下乾燥THF(30ml)中のマグネシウム片(9.60g, 395ミリモル)の混合物に、THF(250mL)中の上記置換アニリン生成物(44.7g, 79ミリモル)の溶液を滴加した。ヨウ素の結晶を少量添加してグリニャール試薬の形成を開始した。反応混合物の温度が上昇し還流が開始した時点で、添加速度を調節して穏やかな還流を維持した。添加終了後、混合物を更に1時間還流下に加熱した。冷却した上澄み溶液を別の漏斗にカニューレで移し、アルゴン下−30℃でTHF(300ml)中のフェニルグリオキサール(11.7g, 87ミリモル)の溶液に滴加した(2.5時間)。反応混合物を1時間かけて0℃まで徐々に加熱し、更に30分間攪拌した。得られた混合物を氷水(800mL)と酢酸エチル(250mL)との混合物に注ぎ込んだ。有機層を分離し、水層を酢酸エチル(3×)で抽出した。合わせた有機層を水(2×)、塩水で洗浄し、MgSO4上に乾燥した。溶媒を蒸発させ暗緑色の油状の液体として粗生成物48.8gを得た。この液体のフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン勾配溶離、1.5:98.5、3:97、5:95 酢酸エチル:ヘキサン)によりベンゾイン生成物24.7g(50%)を得た(LSIMS(C42H69NO2):[M−H]+ 618.6、1H NMR(250 MHz、CDCl3)は予測されたベンゾイン生成物と一致していた)。乾燥トルエン(500mL)中の上記ベンゾイン生成物(24.7g, 40ミリモル)の溶液に、順次、2−メルカプトエタノール(25g, 320ミリモル)およびTMSCI(100ml, 788ミリモル)を添加した。反応溶液をアルゴン下23時間還流下に加熱し、その後室温に冷却した。これに、更にTMSCl(50mL, 394ミリモル)を添加し、反応溶液を更に3時間還流下に加熱した。得られた溶液を冷却し、冷2.5N NaOH水溶液で塩基性とし、CH2Cl2(3×)で抽出した。合わせた有機層をNaHCO3(2×)飽和水溶液および塩水で洗浄し、Na2SO4上に乾燥し、真空下に濃縮し、茶色の油状の液体を得た。Waters 500 Prep LC systemによるシリカゲル上のプリペラティブカラムクロマトグラフィー(ヘキサン勾配溶離、1:99、2:98 酢酸エチル:ヘキサン)によりオレンジイエローの油状物としてC−28チオキセン15.5g(60%)を得た(LSIMS(C44H71NOS):[M−H]+ 661.6、1H NMR(250 MHz、CDCl3)は予測されたC−28チオキセン生成物、2−(4−(N,N−ジ−(C14H29)−アニリノ)−3−フェニルチオキセンと一致していた)。
【0134】
フタロシアニン増感剤の合成
新しく切り出した金属ナトリウム(5.0g、208ミリモル)を磁気攪拌子、還流コンデンサ、乾燥管およびガスバブラーを装着した2L容の三口フラスコ中の無水メタノール300mLに添加した。ナトリウムが完全に溶解した後、4−t−ブチル−1,2−ジシアノベンゼン(38.64g、210ミリモル、TCI Chemical, Portland ORより入手)を漏斗を用いて添加した。混合物は透明化し、温度を約50℃に上昇させた。この時点で無水アンモニアガスの連続気流をガラスバブラーを介して反応混合物に1時間導入した。次に反応混合物を4時間還流下に加熱し、その間反応の過程を通してアンモニアガスの気流を継続し、固体の析出を開始させた。得られた懸濁液を蒸発乾固させ(ハウスバキューム)、残存物を水(400mL)に懸濁し、濾過した。固体を乾燥した(60℃、ハウスバキューム、P2O5)。生成物(1,3−ジイミノイソインドリン, 42.2g)の収率は概ね定量的であった。この物質を更に精製することなく次の工程に用いた。コンデンサと乾燥管を装着した1L容の三口フラスコに、上記生成物(18g, 89ミリモル)およびキノリン(200mL, Aldrich Chemical Company, St. Louis MO)を添加した。4塩化ケイ素(11mL, 95ミリモル, Aldrich Chemical Company)を10分間かけて攪拌溶液にシリンジで添加した。添加終了後、反応混合物を1時間オイルバス中で180〜185℃に加熱した。反応混合物を室温に戻し、濃塩酸を慎重に添加して反応混合物を酸性化(pH5〜6)した。暗茶色の反応混合物を冷却し濾過した。固体を水100mLで洗浄し、乾燥(ハウスバキューム、60℃、P2O5)した。固体を1L容の丸底フラスコに入れ、濃硫酸(500mL)を攪拌しながら添加した。混合物を60℃で4時間攪拌し、次に粉砕氷(2000g)で慎重に希釈した。得られた混合物を濾過し、固体を水100mLで洗浄し、乾燥した。暗青色の固体を1リットルの丸底フラスコに移し、濃アンモニア(500mL)を添加し、混合物を2時間還流下に攪拌しながら加熱し、室温に冷却し、濾過した。固体を水50mLで洗浄し、真空下に乾燥(ハウスバキューム、60℃、P2O5)し、暗青色の固体として生成物であるシリコンテトラ−t−ブチルフタロシアニン12gを得た。3−ピコリン(12g, Aldrich Chemical Companyより入手)、トリ−n−ブチルアミン(無水、40mL)およびトリ−n−ヘキシルクロロシラン(11.5g)を、磁気攪拌子および還流コンデンサの装着した1L容の三口フラスコ中の上記生成物12gに添加した。混合物を1.5時間還流下に加熱し、次に室温に冷却した。ピコリンを高真空下(約1mmHgにおいてオイルポンプ使用)に留去し乾固させた。残留物をCH2Cl2に溶解しシリカゲルカラム(ヘキサン)を用いて精製し、暗青色の固体として純粋な生成物、ジ−(トリ−n−ヘキシルシリル)−シリコンテトラ−t−ブチルフタロシアニン10gを得た。(LSIMS:[M−H]+ 1364.2;吸収スペクトル:メタノール:674nm (ε 180,000): トルエン 678nm, 1H NMR (250MHz, CDCl3): δ: -2.4(m, 12H), -1.3(m, 12H), 0.2-0.9(m, 54H), 1.8(s, 36H), 8.3(d, 4H)および9.6(m, 8H)は予測された上記生成物と一致していた。
【0135】
ナフタロシアニン増感剤の合成
1.6−t−ブチル−ジイミノベンズ(f)イソインドリン(2)イソインドリンの調製
【化1】
6−t−ブチル−2,3−ジシアノナフタレン(1)(9.07g, 38.7ミリモル)をMeOH 50mLに懸濁した。アルゴン下に攪拌しながら1.05NのNaOMe/MeOH(Na0から新たに調製)8.5mlを添加し、明黄色の懸濁液を周囲温度で1時間NH3ガスでバブリングした。更に75mLのMeOHで希釈したが微細な懸濁液は溶解しなかった。NH3のバブリングを懸濁液が透明化するまで2時間65℃で継続し、その後更に1時間継続した。揮発物質をロータリーエバポレーターで除去し、粘稠な半固体を水200mLで磨砕した。周囲温度で一夜真空下(<1mmHg)に乾燥した後、固体9.2gを乳鉢と乳棒で粉砕し、微細な緑茶色の粉末とした。NMR(250MHz、CDCl3)によればジシアノナフタレンは存在しておらず、所望の生成物と合致していた。TLC(2:1 MeOH/CH2Cl2)はn−ブチルジイミノベンズイソインドリンの試料と同等であった。
【0136】
2.ジクロロシリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニン(t−bu4−NcCl2)(3)の調製
【化2】
6−t−ブチル−ジイミノベンズイソインドリン(2)(9.01g, 35.9ミリモル)。前述した通り調製し、100mLのキノリン中で攪拌した。4塩化珪素(4.0ml, 35ミリモル)を穏やかな発熱が30℃未満で維持されるような速度(〜30分)で1mLずつ添加した。次に反応混合物を60℃〜180℃にオイルバスでゆっくり加熱し、その温度で1時間アルゴン下に攪拌した。周囲温度まで冷却した後、反応混合物を各々150mLの1:1 水/MeOHが入った250cc容のポリプロピレン遠沈ボトル2本にピペットで移した。残留物を50mLの1:1 水/MeOHを用いて2本に注ぎ込んだ。ボトルを数回反転させることにより内容物を混合し、6K rpmで10分間遠心分離し、傾瀉し、固体を200mLの1:1 水/MeOH中に再懸濁した。この工程を3回反復し、最終的な固体を60℃/P2O5で真空乾燥し、得られた粗生成物(3)8.9gを乳鉢と乳棒で磨砕して緑色粉末とし、直接次の段階に用いた。TLC(2:1 MeOH/CHCl2)によれば出発物質は存在していなかった。
【0137】
3.ジヒドロキシシリコンテトラ−t−ブチル−ナフタロシアニン(t−bu4−Nc(OH)2)(4)の調製
【化3】
上述した通り調製したt−bu4−NcCl2(3)の一部(5.8g, 5.7ミリモル)を濃硫酸150mL中に溶解した。透明な濃紫色の溶液を60℃で4時間攪拌し、氷800ccに注ぎ込んだ。茶色の懸濁液を遠心(6k rpm, 6分)して圧縮し、固体を各々250ccの遠沈ボトル中で水200mLずつを用いて2回洗浄した。最終的な固体を60℃/P2O5で真空乾燥し、黒色(暗赤色系茶色)の固体6.1gを得た。この固体をボトルから250mLの濃NH4OHを用いてフラスコに洗い出した。暗緑色の懸濁液をゆっくり100℃まで加熱した。30分後、発泡が停止し、加熱を2時間継続した。冷却後、懸濁液を水200mLを用いて2本の250cc容の遠沈ボトルに洗い出した。固体をボトル当たり水150mLを用いて遠心分離(3×、6K〜12K rpm)により反復洗浄した。圧縮が不完全であったため、最終的な遠心分離を16K rpmで水25mLずつを用いて2本の30cc容試験管中で行なった。固体を真空乾燥(16時間、30mmHg、60℃、P2O5)し、計量した(2.822g)。更に乾燥(3d、<1mmHg、100℃)したところ、部分的に乾燥した固体はなお水5%を含有していた(一部の反応では収率が低下した)。生成物の同定はMS(M+ 998)により行なった。
【0138】
4.ビス(トリ−n−ヘキシルシリル)シリコンテトラ−t−ブチルナフタロシアニン(t−bu4−Nc[hex3Si]2)(5)の調製
【化4】
上述した通り調製したt−bu4−Nc(OH)2(4)(1.61g, 1.6ミリモル)を15mL−n−ヘキシルシリルクロリドヘキシルシリルクロリド/30mL乾燥ピリジンの溶液に溶解した。アルゴンをバブリングした後、溶液を1時間120℃に加熱した。更に2時間反応混合物を加熱したがTLC(SiO2, 10% CH2Cl2/ヘキサン)によれば生成物の分布には変化はなかった。反応混合物を周囲温度まで冷却し、反応混合物をヘキサン150mLと水100mLとの間に分配した。ヘキサン層が透明になって深緑色となるまで混合物を30分間攪拌した。水層を除去し、最終的に水層が無色(pH約6)となるまで、有機層を水150mLずつで2回洗浄した。有機層を濾過(ガラスウール/漏斗)し、濃縮して約25mLとし、クロマトグラフィーに付した(SiO2、5% CH2Cl2/ヘキサン)。t−ブチル異性体を分離するために再度クロマトグラフィー(クロマトトロン;SiO2ローター、0〜10% CH2Cl2/ヘキサン)が必要であった。主異性体の一部(94g)を単離し、そのままビーズ染色のために用いた。
【0139】
ヒドロキシプロピルアミノデキストランの合成
ヒドロキシプロピルアミノデキストランはメカニカルスターラーと滴下漏斗のついた3口丸底フラスコ中の水500mLにデキストランT−500(Pharmacia, Uppsala, Sweden)100gを溶解することにより調製した。溶液に水酸化ナトリウム45g、EDTA 50mg、NaBH4 50mg、ヒドロキノン50mgおよびN−(2,3−エポキシプロピル)フタルイミド200gを添加した。混合物を2時間90℃の水浴中で加熱攪拌した。少量をメタノールから3回析出させ、NMRで分析した。7.3〜7.6のピークが顕れたことにより、フタルイミドの取り込みが確認された。メタノール3.5Lを添加することにより主反応混合物を沈殿させ、その後固体を収集した。0.1M酢酸塩緩衝液500mL中に上記生成物を溶解し、35%ヒドラジン50mLを添加し、そしてpHを3.5に調節することによりフタルイミド保護基を除去した。混合物を1時間80℃で加熱し、pHを再度3.2とし、混合物を更に30分間加熱した。少量をメタノールから3回析出させた。NMRによればフタルイミド基は既に存在していなかった。反応混合物をpH8まで中和し、室温で保存した。
【0140】
50,000の分子量カットオフフィルターを用いたタンジェンシャルフロー濾過を行ない、そして水、0.01M HCl、0.01M NaOHそして最後に水を用いて洗浄することにより生成物を精製した。生成物の溶液を濾過して濃縮することにより700mLとし、次に凍結乾燥した。トリニトロベンゼンスルホネートを用いた反応性アミンの測定によれば16グルコース残基当たり約1アミンであった。
【0141】
フタロシアニン染色増感剤ビーズの調製
メカニカルスターラー、ガラス栓を有する三口丸底フラスコの1つの口部に温度計を装着し反対側の口部に漏斗を装着したものにカルボキシレート変性ラテックス(Seradyn)600mLをいれることにより増感剤ビーズを調製した。フラスコを94±1℃に維持されたオイルバス中に浸積した。口部中の漏斗を介してビーズを添加し、ビーズ容器をエトキシエタノール830mL、エチレングリコール1700mLおよび0.1NのNaOH 60mLで洗浄し、漏斗を介して洗液をフラスコに添加した。漏斗を24−40ゴムセプタムと交換した。ビーズを40分間94±1℃の温度で765rpmで攪拌した。
【0142】
シリコンテトラ−t−ブチルフタロシアニン(10.0g)を60±5℃のベンジルアルコール300mLに溶解した。3mL/分の速度で120±10℃に加熱した100mL容のシリンジを用いてセプタムを介して上記丸底フラスコに85mLを添加した。次に残りのフタロシアニン溶液を同様に添加した。フタロシアニンが入っていたシリンジとフラスコをベンジルアルコール40mLで洗浄し、丸底フラスコに移した。15分後、脱イオン水900mLおよび0.1NのNaOH 75mLを40分間かけて滴加した。オイルバスの温度をゆっくり40±10℃まで戻し、その後攪拌を停止した。次にビーズを43ミクロンのポリエステルフィルターで濾過し、エタノール:水 100:0〜10:90を用いてMicrogonタンジェンシャルフロー濾過装置(Microgon, Inc., Laguna Hills, CA)に付し、次に43ミクロンのポリエステルフィルターを介して濾過した。
【0143】
ナフタロシアニン染色増感剤ビーズの調製
カルボキシル化ラテックスビーズの10%懸濁液(4.4mL)をエトキシエタノール4.4mL、エチレングリコール8.8mL、および0.1Nの水酸化ナトリウム溶液0.44mLと混合した。ナフタロシアニン(0.475mg)をベンジルアルコール0.4mLに溶解した。希釈されたビーズ懸濁液1mL(25mgビーズ)を13×100mmのガラス管に移し、95℃に維持したヒートブロック内にいれた。染料溶液200μLを別の管に移し、ヒートブロック内にいれた。温度が平衡に達するまで数分間保持した後、管の内容物を急速に混合し加熱を更に20分間継続した。染色されたビーズの懸濁液をヒートブロックから取り外し、室温に戻した時点でこれをエタノール3mLで希釈し、十分混合した。次に懸濁液を遠心分離してビーズのペレットを得た。上澄みを捨て、ペレットを超音波処理により水中50%エタノールに懸濁した。遠心分離を反復し、ペレットを水中10%エタノールに懸濁した。懸濁液を低速で遠心分離して染色工程で生じた痕跡量の破砕物を沈殿させた。上澄み内に残存するビーズを傾瀉し、4℃で保存した。
【0144】
ヒドロキシプロピルアミノデキストランコーティングフタロシアニン増感剤ビーズの調製
ヒドロキシプロピルアミノデキストラン溶液を50mM MES pH6中2mg/mlの濃度で調製した。水7.5mL中フタロシアニン増感剤ビーズ150mgを回転攪拌しながらヒドロキシプロピルアミノデキストラン溶液7.5mLに滴加した。水中EDAC溶液(80mg/mL)188μLを回転攪拌しながらコーティング混合物中に添加した。混合物を暗所室温で一夜インキュベートした。混合物を水12mLで希釈し、遠心分離した。上澄みを捨て、ビーズペレットを超音波処理により水40mLに懸濁した。ビーズを遠心分離の反復と超音波処理による懸濁により水(各々40mL)で3回洗浄した。最終ペレットを水5mLに懸濁した。
【0145】
ヒドロキシプロピルアミノデキストランコーティングナフタロシアニン増感剤ビーズ
ヒドロキシプロピルアミノデキストラン溶液を50mM MES pH6中10mg/mlの濃度で調製した。水中10%エタノール1mL中のナフタロシアニン増感剤ビーズ20gを回転攪拌しながらヒドロキシプロピルアミノデキストラン溶液1mLにゆっくり添加した。水0.2mLに溶解したEDAC 2mgを回転攪拌しながらコーティング混合物に添加した。室温で一夜インキュベートした後、混合物を遠心分離し、上澄みを捨て、ビーズペレットを超音波処理により水2mLに懸濁した。遠心分離により水洗を2回反復し、最終ビーズペレットを水1mLに懸濁した。
【0146】
ヒドロキシプロピルアミノデキストランコーティング dopTARケミルミネッサービーズの調製
カルボキシル化ラテックスビーズの10%懸濁液(120mL)を三口丸底フラスコ中93℃に加熱し、次にエトキシエタノール166mL、エチレングリコール336mLおよび0.1MのNaOH 12mLと混合した。メカニカルスターラーと温度計を装着し、混合物を攪拌しながら95℃とし、次に更に40分間攪拌した。別のフラスコにおいて、C−28チオキセン2.45g、2−クロロ−9,10−ビス(フェニルエチニル)アントラセン191.8mgおよびルブレン323.9mgをエトキシエタノール264mLに溶解し、溶解するまで攪拌しながら95℃に加熱した。染料の溶液をビーズ懸濁液に注ぎ込み、95℃で20分間攪拌した後、ゆっくり放冷して約47℃とし、43μMのポリエステルフィルターを通して濾過することにより染色過程で生じた破砕物を除去した。ビーズをp698/4フィルターを用いながらMicrogon装置でタンジェンシャルフロー濾過により洗浄した。洗浄溶媒(1:2 v/v エトキシエタノールおよびエチレングリコール)で系をプライミングした後、染色されたビーズ混合物を添加し、濃縮して約20mg/mLとし、次に洗浄溶媒6LとNaOHでpH10に調節した水中の10%v/v エタノール4.8Lで洗浄した。洗浄の間TARビーズを濃縮して約50mg/mLとし、次に遮光4℃でで保存した。
【0147】
可塑剤をビーズに取り込ませることによりルミネセンスの崩壊速度を大きくした。n−ヘプタデシルベンゼン250μL、エタノール20mLおよび25mLの50mM MES pH6に溶解したヒドロキシプロピルアミノデキストラン0.5gを含有する混合物を調整した。混合物をオイルバス中80℃に加熱し、激しく攪拌して可塑剤を分散させた。上記した染色TARビーズ(10%エタノール中25mg/mLに希釈)40mLおよび30mLの50mM MES pH6を含有する第2の混合物もまた80℃に加熱した。2種の混合物を合わせ一夜80℃で攪拌放置した。
【0148】
冷却後、ビーズ懸濁液の上面に浮遊する過剰の可塑剤の少量からピペットによりビーズを分離した。水3mL中のEDAC(200mg)を添加し、混合物を2時間室温で攪拌した。次に混合物を遠心分離してビーズを回収した。ビーズペレットを超音波処理により懸濁し、遠心分離と超音波懸濁を交互に行なうことにより各40mLの水で3回洗浄した。次に最終ビーズペレットを水約35mLに懸濁した。
【0149】
ヒドロキシプロピルアミノデキストランコーティング dopDPAケミルミネッサービーズの調製
カルボキシル化ラテックスビーズの10%懸濁液(10mL)をエトキシエタノール10mL、エチレングリコール20mLおよび0.1Nの水酸化ナトリウム溶液1mLと攪拌子のついた250mL容のエルレンマイヤーフラスコ中で混合した。フラスコを95℃に維持したオイルバス中に固定した。別のフラスコ中でC28チオキセン200mgおよび9,10−ジフェニルアントラセン30mgをエトキシエタノール20mLに溶解し、95℃とした。フラスコの内容物を急速に混合し、95℃における加熱を90分間継続した。フラスコをオイルバスから取り出し、室温に戻した。冷却後、混合物をエタノール60mLで希釈し、十分混合し、染色されたビーズを遠心分離により収集した。上澄みを捨て、ビーズペレットを超音波処理によりエタノール20mLに懸濁した、遠心分離を反復し、エタノール20mLを再度用いてビーズを洗浄した。最終遠心分離の後、ビーズを水40mL中に懸濁した。
【0150】
可塑剤をビーズに取り込むことによりルミネセンスの崩壊速度を大きくした。上記で得られた染色されたDPAビーズを攪拌子を装着した125mL容のエルレンマイヤーフラスコにいれ、80℃のオイルバスに入れた。エタノール40mLを50mL容のエルレンマイヤーフラスコにいれ、ヘプタデシルベンゼン(HB)可塑剤300mgを添加した。溶液をオイルバス中で平衡化し、次に激しく混合しながら急速にビーズ懸濁液に添加した。混合物を90分間オイルバス中80℃でインキュベートした。
【0151】
ビーズ/可塑剤混合物をインキュベートする間、ヒドロキシプロピルアミノデキストランの溶液を調整した。ヒドロキシプロピルアミノデキストラン320mgを16mLの50mM MES pH6に溶解し、溶液をオイルバス中80℃に加温した。次に激しく攪拌しながらビーズ懸濁液に1回で溶液を添加した。フラスコには縮合器を装着して蒸発による損失を最小限とし、80℃の加熱を一夜継続した。
混合物を室温に冷却し、水中EDAC 50mgを攪拌しながら添加した。室温での攪拌を2時間継続し、その時点でエタノール20mLを添加し、懸濁液を遠心分離した。上澄みを捨て、超音波処理により50%水性エタノール40mL中にビーズを懸濁した。遠心分離を反復し、ビーズを超音波処理により0.5MのNaCl中に懸濁した。最終遠心分離の後、ビーズを10%水性エタノール、50mM NaCl中に懸濁した。
【0152】
A 24 オリゴヌクレオチドコーティングフタロシアニン増感剤粒子(Pc−A 24 )の調製
ヒドロキシプロピルアミンコーティングフタロシアニン増感剤ビーズ65mgを5mLの50mM MOPS pH7に懸濁した。10%(w/v)のSIAX溶液をDMF中に調製し、77μLを回転攪拌しながらビーズ懸濁液に添加した。混合物を暗所90分間室温でインキュベートし、次にSIAX溶液更に77μL分を添加し、混合物を更に60分間インキュベートした。懸濁液を遠心分離し、上澄みを捨てた。ビーズペレットを超音波により水6mLに懸濁し、遠心分離を反復した。ペレットを水6.5mLに懸濁し、4℃で保存した。
【0153】
オリゴヌクレオチドのカップリングのための調製においては、ビーズを遠心分離し、上澄みを捨て、カップリング緩衝液1.34mLをペレットに添加した。カップリング緩衝液の組成は以下の混合物(0.2Mホウ酸塩を900μL、2M EDTA pH9および0.4Mホウ酸塩pH9.45を333μLおよび2MのNa2SO4を1000μL)とし、これは脱気しアルゴン置換しておいた。脱気およびアルゴン飽和の後、カップリング緩衝液混合物に10%Tween 20洗剤9μLを添加した。
【0154】
−PO2OCH2CH2CH2SSCH2CH2CH2OHで3′末端の修飾された5′A24(配列番号1)オリゴヌクレオチドを水に溶解し、260nmの光学密度により濃度を測定した。入手元の提示した消衰係数を用いたところ濃度は915.8nmあることがわかった。ビーズmg当たりオリゴヌクレオチド約12nmolをカップリング操作に用いた。
オリゴヌクレオチド溶液760μLを遠沈管にいれ、2.5MのNaOAc pH5.3を76μL添加した。水中20mMのTCEP 147μLをオリゴヌクレオチド溶液に添加し、混合物を暗所室温で1時間インキュベートした。200プルーフのエタノール4倍容量を混合物に添加して還元されたオリゴヌクレオチドを析出させた。混合物を1時間−20℃の冷凍庫に入れることにより析出を促進した。沈殿を遠心分離により採取し、次に脱気しアルゴン飽和させておいた495μLの5mM Na2HPO4、2mM EDTA pH6に溶解した。
【0155】
次にオリゴヌクレオチド溶液をカップリング緩衝液下のビーズペレットに添加し、混合物を超音波処理してビーズを懸濁させた。懸濁液を23時間37℃でインキュベートした。
ヨードアミノデキストランコーティング上の残存ヨード基をメルカプト酢酸との反応によりキャッピングした。ビーズ懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットを0.4Mホウ酸塩pH9.45中10mMのメルカプト酢酸5mL中で超音波処理することにより懸濁し、混合物を1時間37℃でインキュベートした。ビーズを遠心分離により回収し、5mLのブロッキング緩衝液(0.1M NaCl、0.17M グリシン、10mg/ml BSA、0.1% Tween 20、1mM EDTA pH9.2、滅菌濾過済み、および50μL/mLのウシ胸腺DNA添加)中に懸濁した。混合物を37℃で3時間インキュベートシた。遠心分離した後、ビーズを1回当たり5mLの緩衝液Aを用いて延伸することにより2回洗浄した。最終ペレットを6mLのIHBB緩衝液中に懸濁し、90分間95℃でインキュベートした。冷却後、ビーズを遠心分離し、上澄みを捨て、ペレットを0.125M NaOAc pH5と30%過酸化水素溶液の等量混合物6mL中に懸濁した。37℃で2.5時間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上澄みを捨て、保存緩衝液(50mM KCl, 10mMトリス、4mM EDTA、0.2%アセチル化BSA pH8.2)を用いた遠心分離により1回当たり緩衝液5mlを用いながらビーズを3回洗浄した。最終ペレットを保存緩衝液6mLに超音波処理により懸濁し、遮光下4℃で保存した。
【0156】
( AGTA ) 6 オリゴヌクレオチドコーティング dopDPAケミルミネッサー粒子(dopDPA− ( AGTA ) 6 )の調製
Pc−A24ビーズの調製に関して上記した操作法と同様にしてオリゴヌクレオチドコーティングビーズを調製した。しかしながら、増感剤ビーズのみをパーオキシドで処理した。−PO2OCH2CH2CH2SSCH2CH2CH2OHで3′末端の修飾された5′−(AGTA)6−3′(配列番号2)オリゴヌクレオチドを用いた。
【0157】
( ATAG ) 6 オリゴヌクレオチドコーティングナフタロシアニン増感剤粒子(dNc− ( ATAG ) 6 )の調製
Pc−A24ビーズの調製に関して上記した操作法と同様にしてオリゴヌクレオチドコーティングビーズを調製した。しかしながら、増感剤ビーズのみをパーオキシドで処理した。−PO2OCH2CH2CH2SSCH2CH2CH2OHで3′末端の修飾された5′−(ATAG)6−3′(配列番号3)オリゴヌクレオチドを用いた。
【0158】
A 24 オリゴヌクレオチドコーティング dopDPAケミルミネッサー粒子(dopTAR−A 24 )の調製
Pc−A24ビーズの調製に関して上記した操作法と同様にしてオリゴヌクレオチドコーティングビーズを調製した。しかしながら、増感剤ビーズのみをパーオキシドで処理した。−PO2OCH2CH2CH2SSCH2CH2CH2OHで3′末端の修飾された5′A24(配列番号1)オリゴヌクレオチドを用いた。
【0159】
( AGTA ) 6 オリゴヌクレオチドコーティングフタロシアニン増感剤粒子(Pc− ( AGTA ) 6 )の調製
Pc−A24ビーズの調製に関して上記した操作法と同様にしてオリゴヌクレオチドコーティングビーズを調製した。しかしながら、増感剤ビーズのみをパーオキシドで処理した。−PO2OCH2CH2CH2SSCH2CH2CH2OHで3′末端の修飾された5′−(AGTA)6−3′(配列番号2)オリゴヌクレオチドを用いた。
【0160】
オリゴヌクレオチドプローブおよびリンカーの配列
RL−2プローブ:
RL−3プローブ:
RF−3プローブ:
AL−1リンカー:
SP−1リンカー:
SOリンカー:
CL−1リンカー:
HA−1リンカー:
X=C7アミン(CH2CH(CH2OH)CH2CH2CH2CH2NH3)でブロックされた3′末端
B=ビオチン
【0161】
実施例1
スキーム1のアッセイ
ビーズに連結したオリゴヌクレオ
チド配列に相補的な末端配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーを用い、Oligo Etcにより合成した。上記したビーズ、即ち、5 ′(ATAG)3 ′ 6−Ncを配列番号8として上記したSP−1リンカーの相補テイル、即ち、5 ′(CTAT)3 ′ 6に結合させた。同様に、リンカーのもう一方の末端はスキーム1に示すとおりケミルミネッサービーズに相補的である(図1)。リンカーの存在下、2種のビーズを単純な「サンドイッチ」型のアッセイにおいて共存させ、そして、それらが近接していることと一重項酸素の移行により、リンカー濃度に正比例するシグナルを発生した。
【0162】
プロトコル1:
【0163】
リンカーのワーキング溶液は2μg/mL tRNAを含有するDNAse非含有水中に凍結濃縮物から新しく希釈した。
CL−1リンカーワーキング溶液:1nm、500pM、100pM、50pM、10pM、10pM、5pMおよび0pM(水)
SP−1リンカーワーキング溶液:1nm、500pM、100pM、50pM、10pM、10pM、5pMおよび0pM(水)
混合リンカー(CL−1/SP−1)ワーキング溶液:500/500pM、500/50pM、50/500pM、50/50pM
45μLのマスターミックスをPCRチューブに入れ、ワーキング溶液5μLを添加し混合した。材料を鉱物油20μLで被覆し、2分間95℃、15分間50℃、そして60分間37℃のPCRサイクルでインキュベートした。試験管を37℃に維持したヒートブロックに移し、その間シグナルを読み取った。各試料を3回読み取った。
3回の読み取り値を平均し、標準曲線を作成した。標準曲線から混合リンカー試料中のリンカーの濃度を求めた。
【0164】
アッセイ:
リンカーCL−1およびSP−1の標準曲線をプロトコル1により求めた。IHBB緩衝液中の2種の増感剤ビーズおよびケミルミネッサービーズよりなる「マスターミックス」等量ずつ(典型的には45μL)を数本のPCR管の各々にいれた。次に、連続希釈したリンカー標準溶液の一部(典型的には5μL)、次いで鉱物油(20μL)を添加した。リンカーのワーキング溶液は濃縮保存溶液から新しく調製した。同セットの標準液を第2のリンカーを用いて調製した。インキュベーションの後、試料を二重レーザーリーダーで読み取り、結果を表1に示した。各試料を先ず675nmのレーザーで照射し、次に780nmのレーザーで照射した。読み取りは3回反復し、平均した。平均値は試料中にリンカーが存在しない場合の読み取り値を差し引くことにより補正した。次に、補正した平均値を用いて標準曲線を作成した(図2)。同様にして、試料のセットを3ビーズの「マスターミックス」およびリンカー混合物を用いて調製した。インキュベートの後、試料を前述したトリ読み取り、結果を表2にまとめた。読み取り値の補正された平均値から、標準曲線を参照することによりリンカー混合物を定量した。括弧内に示す定量値は図2にに示すとおりであり、1番目のコラムに示す混合リンカーの既知濃度と比較することができる。
【0165】
【表1】
【0166】
【表2】
数値(斜体太字)はリンカーアッセイの標準曲線より求めた。単一のリンカーを用いた。
【0167】
実施例2
スキーム2のアッセイ
オリゴヌクレオチドプローブおよびリンカーはOligos Etcにより合成した。本アッセイにおいては、プローブの一方の末端がビーズ上のオリゴヌクレオチドと結合し、もう一方がリンカーと結合するようにプローブは相補配列を有している。リンカーはプローブに関して共通でありケミルミネッサービーズと結合する一方の末端を有する。リンカーのもう一方の末端はスキーム2に従ってフタロシアニン増感剤またはナフタロシアニン増感剤の何れかと結合するプローブに特異的なものとした(図3)。プローブはリンカーよりも過剰に存在するが、ビーズ上の相補オリゴヌクレオチドの総量よりは多くなく、これにより、各ビーズは幾つかのプローブで修飾され遊離のプローブが溶液中に残存しないようにした。リンカー存在下ではプローブ修飾ビーズは「サンドイッチ」型アッセイにおいてリンカーと結合し、これによりリンカー濃度と正比例してシグナルが発生している。
【0168】
【表3】
【0169】
数個のスナップキャップPCR管の各々にマスターミックス45μLをいれた。リンカーワーキング保存用液5μLを添加し、鉱物油20μlで混合物を被覆した。PCRサイクラーを用いて材料を2分間95℃、15分間50℃、そして90分間37℃でインキュベートした。各試料は1回読み取った。
【0170】
アッセイ:
リンカーSOおよびAL−1の標準曲線はプロトコル2を用いて作成した。IHBB緩衝液中の両増感剤、単一のケミルミネッサーおよび3種のプローブよりなるマスターミックスを調製した。マスターミックス少量ずつ(45μL)をPCR管にいれ、次いで連続希釈したリンカー標準用液少量(5μL)および鉱物油(2μL)を添加した。各リンカーにつき試料は2連で用いた。インキュベーション後、試料を二重レーザーリーダーで読み取った(表3)。2連の結果の平均を求め、試料中にリンカーが存在しない場合の読み取り値を差し引くことにより平均値を補正した。次ぎに補正した平均値を用いてリンカーの標準曲線を作成した(図4)。同様に「マスターミックス」および2種のリンカーの混合物から試料セットを調製した。インキュベーション後、試料を同様に読み取り、結果を表4にまとめた。読み取り値の補正された平均値から、リンカーの標準曲線を用いてリンカー混合物を定量した。括弧内に示す定量値は表4に示すとおりであり、1番目のコラムに示す混合リンカーの既知濃度と比較することができる。
【0171】
【表4】
【0172】
【表5】
数値(斜体太字)はプローブリンカーアッセイの標準曲線より求めた。
【0173】
実施例3
CL−1およびHA−1のアッセイ
本試験のプロトコルは前述した実施例1のアッセイに関して記載したものと本質的に同様とした。簡単に説明すると、増感剤ビーズの各々3.75μgを含有するマスターミックス少量ずつ(典型的には45μL)を200μLのPCR管に添加した。適切な濃度の標的ポリヌクレオチド(5μL)(CL−1、HA−1またはその組合せ)をマスターミックスに添加した。次に鉱物油20μLを各管に添加した。管内の混合物を以下の熱サイクル、即ち95℃3分間、50℃15分間そして37℃120分に付した。試験管に照射して読み取った。
【0174】
バックグラウンド(反応管に標的ポリヌクレオチドが存在しない)を差し引いた後、他のチャンネルへの各オリゴヌクレオチドリンカーからのシグナルのクロスオーバーを測定した。次にシグナルを補正して他のチャンネルからのクロスオーバーを除いた。補正したシグナルを用いて2種のオリゴヌクレオチドリンカーの標準曲線をプロットし、また、あるオリゴヌクレオチドリンカーの存在の他のリンカーの定量に対する影響を調べた(表5および表6参照)。表5はHA−1の存在下のCL−1濃度の計算値を示す。表6はCL−1の存在下のHA−1濃度の計算値を示す。
【0175】
【表6】
【0176】
【表7】
【0177】
実施例4
Mycobacterium tuberculosis DNAの増幅および定量
ゲノム Mycobacterium tuberculosis (M.tb)標的DNAの増幅および検出を前述したPCRおよびシグナル生成システム用の試薬を用いて行なった。検出は、1種の化学ルミネセンス化合物および2種の増感剤を用いて行った。
ゲノム Mycobacterium tuberculosis (M.tb)標的DNA(GenBank Accession No. Y14045NID)はC.Green, SRI International, Menlo Park, CAから入手した。増幅および検出に使用した領域はM.tbゲノム当たりの複数のコピー(〜10コピー/ゲノム)で存在する挿入配列6110(IS6110)とした。494bpの内部対照(IC)アンプリコンの発生に使用した物を含むすべてのPCRプライマーを以下に記載する。配列の数はIS6110の配列である。ICアンプリコンに導入された24塩基のIC特異的配列に下線を付した。
【0178】
フォワードプライマーは以下の通りである。
ZL-3 18マー 2645-2662
5′CCGTCCCGCCGATCTCGT(配列番号12)
LB-3 18マー 2833-2850
5′CGATCGAGCAAGCCATCT 3′Tm 66.8(配列番号13)
【0179】
24塩基のQ配列をIS6110領域に導入するためのプライマーは以下の通りである。
LH-1
5′GACAGTGTAGATAGATGACAGTCGCATCGATCCGGTTCAGCG(配列番号14)
LH-2
5′CGACTGTCATCTATCTACACTGTCGGTGGATAACGTCTTTCAC(配列番号15)
【0180】
リバースプライマーは以下の通りである。
ZL-4 20マー 2952-2971
5′GACGGTTGGATGCCTGCCTC(配列番号16)
LH-4 22マー 3117-3138
5′ACTGGTAGAGGCGGCGATGGTT(配列番号17)
【0181】
Mt.tb IS6110に対する内部対照(IC)アンプリコンは以下の通り構築した。24塩基の内部配列を標準的PCR操作法を用いて導入した。使用したアウタープライマーはZL−3およびLH−4であった。24塩基IC配列による24塩基WT配列の置き換えのために使用したインターナルプライマーLH−1およびLH−2は上記した通りである。PCRアンプリコンはプライマー対ZL−3およびLH−2を用いて作成し、第2のアンプリコンはLH−1およびLH−4を用いて発生させた。予測されたアンプリコンはそれぞれ278および240塩基対であった。発生させた2種のアンプリコンを次にアニーリングし、伸長し、エクスターナルプライマーZL−3およびLH−4を用いて再増幅した。増幅産物を1.5%アガロースゲル上で泳動シ、494bpのアンプリコンをゲルから切り出した。ICアンプリコンをアウタープライマーZL−3およびLH−4を用いて再増幅し、494bpの産物をゲル精製した。最後に、ICアンプリコンをPCR増幅により作成し、ゲル電気泳動および既知のdsDNA標準物質を用いて定量した。ICアンプリコンはまた、標的の限界希釈法とその後のPCR増幅を用いて定量した。ICアンプリコンをMicrocon‐100(Amicon Inc., Beverly, Massachusetts)を用いて精製し、取りこまれなかったプライマーおよびヌクレオチドを除去し、細分して−20℃で凍結した。
【0182】
以下のプローブを検出に用いた。
共通のプローブは以下の通りである。
ZL-5 20マー 2869-2887
5′(T)20GCGTACTCGACCTGAAAGAC(配列番号18)
本プローブはWTおよびICの標的上に存在する共通の配列、並びに、標識された粒子上の共通(A)24配列に結合する。アッセイにおいては、プローブは1つのDopTARケミルミネッサー粒子(DopTar−(A)24)上の(A)24配列に結合する。
【0183】
WT特異的プローブは以下の通りである。
ZN-1 20マー 2901-2920
5′ACGGATAGGGGATCTCAGTA(TACT)5(配列番号19)
本プローブはWT特異的配列に結合し、また(TACT)5プローブテイルを介してフタロシアニン増感剤粒子(Pc−(AGTA)6)にも結合する。
【0184】
IC特異的プローブは以下の通りである。
IC 24マー 2901-2920 ICアプリコン上のみ
5′GACAGTGTAGATAGATGACAGTCG(CTAT)5(配列番号20)
これはIC特異的プローブであり、ICアンプリコン上に存在する24塩基の組み換えられた配列に結合する。アッセイにおいては、本プローブもまたプローブ上に存在する(CTAT)5テイルを介してナフタロシアニン増感剤粒子(Nc−(ATAG)6)に結合する。
【0185】
全オリゴヌクレオチドはOligo Etcを用いて合成した。更に、使用したプローブ配列は全て知られた方法で3′−アミノブロックされており、そして、ゲルを精製することによりPCR増幅の間にプローブの関与が無いようにした。
M.tb標的およびICのDNAを以下のプロトコルを用いてPCRにより増幅した。2種の増感剤を用いるアッセイにおいては。反応混合物の組成としては200μMヌクレオチドトリホスフェート(dNTP)(Pharmacia Biotech)、250nmプライマーlB−3およびZL−4、5ユニットのcPfu(Stratagene)、各25nmのプローブZL−5、ZN−1およびIC、3.75μgの共通のケミルミネッサー粒子(DopTar−(A24))、および各特異的増感剤粒子(Pc(AGTA)6およびNc−(ATAG)6)を50μLの反応において用いた。反応は10mMトリス塩酸、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mg/mLアセチル化BSA(Gibco BRL)よりなる緩衝液中で行なった。最後に、標的添加後、鉱物油20μLを各反応混合物に添加した。PCR熱サイクルは95℃(3分)、初期変性{95℃(20秒)、63℃(1分)、73℃(1分)}×36サイクル、次いで75℃(5分)とした。PCR増幅直後、2重鎖のアンプリコンを変性(95℃、2分)し、プローブを50℃(15分)で標的にアニーリングした。次に、プローブを60分間37℃で標識粒子に結合させた。
【0186】
一連の知られた量のM.tb標的DNAを試料に添加したIC DNAの一定量の存在下に増幅した。M.tb標的およびIC標的のプライマーLB−3およびZL−4を用いた増幅により、139−bpのアンプリコンが得られる。共通のプローブZL−5は一方ではWT M.tb並びにICアンプリコンの双方に結合し、そしてプローブのテイルを介して化学ルミネセンス粒子に結合する。しかしながら特定のプローブZN−1はWTアンプリコンに、そして、フタロシアニン粒子(Pc)に結合するのに対し、ICプローブはICアンプリコンに、そして、ナフタロシアニン粒子(Nc)に特異的に結合する。増幅および発生したアンプリコンへの試薬のアニーリングを行なった後、粒子形成した粒子対により発生された化学ルミネセンスシグナルを上記した通り読み取り装置により読み取った。WTシグナル(Pc)は1.0秒675nmのレーザーで管を照射し、その後1秒間化学ルミネセンスシグナルを読み取ることにより得た。この後、10秒間の遅れ時間を設けることにより第1の粒子対からの全ケミルミネッサーシグナルを完全に崩壊させた。ICシグナル(Nc)は780nmのレーザーを用いて1秒の照射および1秒の読み時間により6回読み取った。バックグラウンド(標的非存在)シグナルを読み取り値から差し引いた。クロストークシグナルを除去した後、補正したシグナルを求め、表7に示した(下記)。
【0187】
【表8】
* 補正Pcシグナル(WT)=[S−BPcマイナス(S−BNc×0.0022)]、ただし式中S−Bはシグナル−バックグラウンドである。補正ファクター0.0022はPcシグナルチャンネルへのNcのクロスオーバーシグナルが0.22%であることを反映している。
** 補正Ncシグナル(IC)=[S−BNcマイナス(S−BPc×0.0047)]、ただし式中S−Bはシグナル−バックグラウンドである。補正ファクター0.0047はNcシグナルチャンネルへのPcのクロスオーバーシグナルが0.47%であることを反映している。
【0188】
誘導されたWTの対数値(log WT Q)を反応当たりに添加したM.tbゲノムの対数値(log WTインプット)に対してプロットした。Log WT Qは式:Log(WT Q)=v(log(IC/(WT+IC))+w+log(WT/(WT+IC))から誘導され、式中、WTおよびICは各ビーズから得られた補正シグナルであり、vは理想的には−1の値を有し、そしてwは理想的にはlog(標的/反応当たり)の数値を有する。しかしながら、vおよびwはプローブ、増感剤および化学ルミネセンス試薬の特定の組合せおよびアッセイ条件に関する標準曲線への回帰により誘導されている。結果は図5に示す。
【0189】
上記した説明は本発明に関与する機序として特定の理論を含んでいる。このような理論は、本発明は記載した結果を達成することが明らかにされていることから、本発明を限定するものと見なしてはならない。
上記した本発明は理解を明確にする目的で説明と例示により一部詳細に記述したが、特定の変更や調整が請求項の範囲内において実施されることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明によるアッセイスキームを示す模式図である。
【図2】 標準曲線を示すグラフである。
【図3】 本発明のアッセイスキームを示す模式図である。
【図4】 標準曲線を示すグラフである。
【図5】 標準曲線を示すグラフである。
Claims (25)
- 生物学的サンプル中の2種またはそれ以上の異なるアナライトの存在または相対量を測定するための方法であって、
a)(1)該異なるアナライトを含有していることが疑われる生物学的サンプル、(2)1重項酸素を発生することができ、増感の波長により識別可能である増感剤試薬少なくとも2種、および、(3)1重項酸素により活性化可能な反応性試薬少なくとも1種、を組合わせて準備し、ここで第1の特異的結合対(sbp)構成員は該増感剤試薬の各々と会合し、そして、該第1のsbp構成員は該異なるアナライトの一つと、または、第2のsbp構成員と結合して該異なるアナライトの一つの量に関係した複合体を形成することが可能であり、そして
b)該増感剤試薬を示差的に活性化し、該反応性試薬の各々の活性化の結果として発生したシグナルの量を検出し、ここでその量は該生物学的サンプル中の該異なるアナライトの各々の量に関係しているものとする
ことを包含する上記方法。 - 複数の反応性試薬を用い、該反応性試薬が示差的に検出される請求項1記載の方法。
- 複数の反応性試薬が発光の異なる波長により、または、異なる崩壊速度により示差的に検出される化学ルミネセンス組成物である請求項2記載の方法。
- 第2のsbp構成員が該アナライトの一つと結合することが可能である請求項1記載の方法。
- 反応性試薬の少なくとも1種が蛍光エネルギーアクセプターを有する請求項1記載の方法。
- 反応性試薬の少なくとも1種が1重項酸素により活性化されて光活性インジケーターを形成する光活性インジケーター前駆体である請求項1記載の方法。
- 示差的な活性化が異なる波長の光で該組み合わせを照射することを包含する請求項1記載の方法。
- 反応性試薬が1重項酸素との反応により活性化可能である請求項1記載の方法。
- 増感剤の少なくとも1種が光増感剤である請求項1記載の方法。
- 光増感剤が染料である請求項9記載の方法。
- 反応性試薬または該増感剤試薬の少なくとも1種が粒子と会合している請求項1記載の方法。
- 生物学的サンプル中の2種またはそれ以上の異なるアナライトの存在または相対量を測定するためのホモジニアスな方法であって、下記工程:
a)(1)該異なるアナライトを含有することが疑われる生物学的サンプル、(2)該異なるアナライトの各々のための光増感剤であって、第1の粒子と会合し、1重項酸素を発生することが可能であり、そして増感の異なる波長を有する光増感剤、および、(3)1重項酸素により活性化可能な化学ルミネセンス組成物、ただしその各々は第2の粒子と会合しているもの、を組合わせて準備し、ここで該化学ルミネセンス組成物の1種またはそれ以上は発光の異なる波長または崩壊の異なる速度により示差的に検出可能であり、そして、増感の異なる波長および発光の異なる波長または崩壊の異なる速度は該異なるアナライトの各々の示差的検出をもたらし、そして、第1の特異的結合対(sbp)構成員は該光増感剤の各々と会合し、そして該第1のsbp構成員は該異なるアナライトの一つと、または、第2のsbp構成員と結合して該異なるアナライトの一つの量に関係する複合体を形成することが可能であるものとし、そして
b)光で該光増感剤の各々を示差的に照射し、そして、活性化後のある時点においてそして崩壊の速度に相応する波長および該ルミネセンス発光の波長において該化学ルミネセンス組成物の各々により発生されるルミネセンスの量を検出し、ここでその量は該生物学的サンプル中の該異なるアナライトの各々の量に関係するものとする
ことを包含する上記方法。 - 光増感剤の少なくとも1種が染料である請求項12記載の方法。
- 光増感剤の少なくとも1種がナフトシアニン類、フタロシアニン類、チアジン類、ポルフィリン類、メタロポルフィリン類、オキサジン類、シアニン類、スクワレイン類、キサンテン類、メロシアニン類よりなる群から選択される請求項12記載の方法。
- 化学ルミネセンス組成物の少なくとも1種がオレフィン系化合物である請求項12記載の方法。
- オレフィン系化合物がチオキセン類、ジヒドロオキサジン類およびジオキセン類よりなる群から選択される請求項15記載の方法。
- 第1および第2の粒子がラテックス粒子、リポソームおよび油滴よりなる群から独立して選択される請求項12記載の方法。
- アナライトがリガンド、受容体およびポリヌクレオチドよりなる群から選択される請求項12記載の方法。
- パックされた組合せ中に下記要素:
(a)複数の増感剤試薬であって、各々が(1)1重項酸素を発生することが可能である増感剤組成物、ここで、該増感剤組成物の各々は互いに異なる増感波長を有する、および(2)特異的結合対(sbp)の構成員を包含するもの、ただし、該増感剤組成物の少なくとも一部分が増感の異なる波長を有する該試薬、および、
(b)複数の反応性試薬であって、各々が1重項酸素により活性化可能であり、異なる発光波長または崩壊速度により示差的に検出可能である、反応性試薬
を包含するキット。 - 複数の反応性試薬が発光の異なる波長により、または、崩壊の異なる速度により示差的に検出可能な化学ルミネセンス組成物である請求項19記載のキット。
- 反応性試薬の各々が成分と結合することのできるsbp構成員と会合している請求項19記載のキット。
- 反応性試薬の少なくとも1種が1重項酸素により活性化されて光活性インジケーターを形成する光活性インジケーター前駆体である請求項19記載のキット。
- 増感剤の少なくとも1種が光増感剤である請求項19記載のキット。
- 光増感剤が染料である請求項23記載のキット。
- 反応性試薬の少なくとも1種または増感剤の1種が粒子と会合する請求項19記載のキット。
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