ES2204050T3 - Particulas que tienen una composicion incorporada que comprende un compuesto quimioluminiscente. - Google Patents
Particulas que tienen una composicion incorporada que comprende un compuesto quimioluminiscente.Info
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Abstract
Partículas que tienen incorporada en su interior una composición que comprende un compuesto quimioluminiscente, el cual es una sustancia que se somete a una reacción química con oxígeno singlete para formar una especie intermedia metaestable que se puede descomponer con la emisión simultánea o posterior de luz y una molécula fluorescente, la cual se excita mediante el compuesto quimioluminiscente activado y emite a una longitud superior a la longitud de onda de emisión del compuesto quimioluminiscente.
Description
Partículas que tienen una composición incorporada
que comprende un compuesto quimioluminiscente.
Esta invención se refiere a procedimientos,
composiciones y equipos para determinar un analito en una muestra.
En concreto, esta invención se refiere a ensayos de unión específica
que no precisan de un paso de separación.
El campo del diagnóstico clínico ha visto una
amplia expansión en años recientes, tanto en la variedad de
materiales (analitos) que podrían determinarse fácil y precisamente,
así como en los procedimientos para la determinación. Se desean
medios apropiados, fidedignos, y no peligrosos para detectar la
presencia de concentraciones bajas de materiales en líquidos. En la
química clínica estos materiales podrían estar presentes en fluidos
corporales en concentraciones inferiores a 10^{-12} molar. La
dificultad para detectar concentraciones bajas de estos materiales
está agravada por los tamaños relativamente pequeños de muestras que
pueden usarse.
En el desarrollo de un ensayo hay múltiples
consideraciones. Una consideración es la respuesta de la señal a
cambios en las concentraciones de analito. Una segunda consideración
es la facilidad con la que podría llevarse a cabo el protocolo para
el ensayo. Una tercera consideración es la variación en la
interferencia de muestra a muestra. La facilidad de preparación y
purificación de los reactivos, la disponibilidad del equipamiento,
la facilidad de automatización e interacción con los materiales de
interés son algunas de las consideraciones adicionales al
desarrollar un ensayo útil.
Una amplia categoría de técnicas implica el uso
de un receptor que puede unirse específicamente a una determinada
organización espacial y polar de un ligando marcado en función de la
presencia de un analito. El efecto de unión por parte del receptor
observado dependerá del marcaje. En algunos casos la unión al
receptor meramente proporciona los medios para diferenciar en el
peso molecular entre ligando marcado unido y no unido. En otros
casos la unión del receptor facilitará la separación del ligando
marcado unido del ligando marcado libre, o podría afectar la
naturaleza de la señal obtenida a partir de la marca de manera que
la señal varíe con la cantidad de receptor unido al ligando marcado.
Aún otra variación es que el receptor se marca y el ligando no se
marca. Alternativamente, tanto el receptor como el ligando se
marcan, o receptores diferentes se marcan con dos marcas diferentes,
en donde las marca interaccionan cuando están en estrecha proximidad
y la cantidad de ligando presente afecta el nivel al que la marcas
del receptor podrían interaccionar.
Hay una continua necesidad de técnicas nuevas y
precisas que puedan adaptarse a un amplio espectro de ligandos
diferentes, o usarse en casos específicos en los que otros métodos
podrían no ser fácilmente adaptables.
Se han descrito previamente inmunoensayos
homogéneos para moléculas pequeñas. Estos ensayos incluyen, entre
otros, el ensayo FRAT® de SYVA, el ensayo EMIT®, el inmunoensayo de
canalización enzimática (enzyme channeling immunoassay), y el
inmunoensayo de transferencia de energía de fluorescencia
(fluorescence energy transfer immunoassay, FETI); los inmunoensayos
de inhibición enzimática (Hoffman La Roche y Abbott Laboratories);
el inmunoensayo de polarización de la fluorescencia (Dandlicker).
Todos estos procedimientos tienen una sensibilidad limitada, y
solamente unos pocos, incluyendo el FETI y la canalización
enzimática, son apropiados para analitos grandes y
multiepitópicos.
Los compuestos luminiscentes, tales como los
compuestos fluorescentes y los compuestos quimioluminiscentes,
encuentran múltiples aplicaciones en el campo de los ensayos debido
a su capacidad para emitir luz. Por este motivo, los emisores de luz
(luminiscers) se han utilizado como marcadores en ensayos
tales como ensayos de ácidos nucleicos e inmunoensayos. Por ejemplo,
un miembro de un par de unión específica se conjuga con un emisor de
luz y se emplean varios protocolos. El emisor de luz conjugado puede
repartirse entre una fase sólida y una fase líquida en proporción
con la cantidad de analito en una muestra sospechosa de contener el
analito. Midiendo la luminiscencia de cualquiera de las fases, se
puede relacionar el nivel de luminiscencia observado con una
concentración del analito en la muestra.
Se han usado partículas tales como liposomas y
fantasmas de eritrocitos como portadores de materiales solubles en
agua encapsulados. Por ejemplo, los liposomas se han empleado para
encapsular material biológicamente activo para una diversidad de
usos, tales como sistemas de suministro de fármacos en los que se
atrapa un medicamento durante la preparación del liposoma y, a
continuación, se administra al paciente a tratar.
También se han usado en ensayos partículas tales
como cuentas de látex y liposomas. Por ejemplo, en ensayos
homogéneos podría atraparse un enzima en la fase acuosa de un
liposoma marcado con un anticuerpo o antígeno. Se provoca que los
liposomas liberen el enzima en presencia de una muestra y
complemento. También se han usado liposomas marcados con anticuerpos
o antígenos, que tienen colorantes fluorescentes o no fluorescentes
solubles en agua encapsulados en una fase acuosa, o colorantes
solubles en lípidos disueltos en la bicapa lipídica de la vesícula
lipídica, para ensayos de analitos capaces de entrar en una reacción
inmunoquímica con el anticuerpo o antígeno unido sobre la
superficie. Se han usado detergentes para liberar los colorantes a
partir de la fase acuosa de los liposomas.
Los marcadores quimioluminiscentes ofrecen una
sensibilidad excepcional en ensayos de unión a ligandos, pero
normalmente se precisan uno o dos pasos químicos de activación. Los
marcadores fluorescentes no tienen este defecto pero son menos
sensibles.
\newpage
Se han descrito marcadores quimioluminiscentes
para inmunoensayos y ensayos de ácidos nucleicos en los que un
grupo, que está unido covalentemente a una pareja de unión, emite
luz a partir de su activación química. Genprobe vende un equipo para
el ensayo de ácido nucleico que utiliza un éster de acridina (Pace2
System®, San Diego, CA), y CIBA-GEIGY (Basilea,
Suiza) vende los equipos para inmunoensayos MagicLite® basados en
este tipo de marcador. La transferencia de energía desde una sonda
de ácido nucleico marcada a un aceptor fluorescente unido a una
segunda sonda ha sido descrito por Heller et al., I y II,
véase más abajo, para un ensayo sándwich de ácido nucleico. Magio I,
véase más abajo, discute un procedimiento similar para
inmunoensayos. La transferencia de energía desde un emisor de luz,
covalentemente unido a un polinucleótido, hasta un fluoróforo
intercalado fue mencionada por Heller et al., IV, véase más
abajo. La transferencia desde un colorante intercalado hasta un
emisor de fluorescencia sobre un polinucleótido fue descrita
recientemente por Cardullo et al., ver más abajo. Más aún,
McCapra, ver más abajo, ha descrito el uso de fotosensibilizadores
como marcadores en donde el fotosensibilizador activa el oxígeno a
su estado de singlete, el cual a su vez reacciona con un compuesto
que, al calentarse, produce luz.
La solicitud de patente europea nº 0.345.776
(McCapra) describe ensayos de unión específica que utilizan un
sensibilizador como marcador. Los sensibilizadores incluyen una
porción que, cuando se estimula mediante excitación con radiación de
una o más longitudes de onda, u otros estímulos químicos o físicos
(por ejemplo, transferencia de electrones, electrólisis,
electroluminiscencia o transferencia de energía) alcanzará un estado
excitado que (a) a partir de la interacción con oxígeno molecular
producirá un oxígeno molecular singlete, o (b) a partir de la
interacción con un leuco-colorante asumirá una forma
reducida que puede devolverse a su estado original no excitado
mediante interacción con oxígeno molecular, causando la producción
de peróxido de hidrógeno. Cualquier interacción con el
sensibilizador excitado producirá, con la adición de reactivos, una
señal detectable.
La solicitud de patente europea nº 0.070.685
(Heller et al., I) describe un diagnóstico de híbridación
homogénea de ácido nucleico mediante transferencia de energía no
radiante.
En la solicitud de patente europea nº 0.070.687
(Heller et al., II) se describe un procedimiento de
diagnóstico de híbridación de polinucleótido que emite luz.
La solicitud de patente europea nº 0.232.967
(Morrison I) discute procedimientos y composiciones para realizar
ensayos para hebras polinucleotídicas diana. Los procedimientos
incluyen poner en contacto una muestra con un reactivo que incluye
una primera y una segunda sonda polinucleotídica. La primera y
segunda sondas son capaces de asumir una primera posición en la que
las sondas están unidas entre ellas, y una segunda posición en la
que las sondas están unidas a una diana. Las sondas incluyen
porciones de marcaje capaces de interaccionar para producir una
señal indicativa de que las sondas están en una de las dos
posiciones.
La solicitud de patente europea nº 0.315.364
describe un ensayo inmunoquímico para determinar la presencia o
concentración de antígeno o anticuerpos en un fluido. El ensayo
comprende (a) formar un complejo ternario de un primer anticuerpo o
antígeno marcado, un segundo anticuerpo o antígeno marcado, y el
antígeno o anticuerpo a determinar, y (b) detectar una señal
producida en presencia de al menos un sustrato, por una interacción
entre la primera marca y la segunda marca, potenciada por su
proximidad entre ellas, unidas a la sustancia antigénica.
La solicitud de patente europea nº 0.229.943
(Heller et al., III) describe sondas de desplazamiento Stokes
fluorescentes para ensayos de híbridación de polinucleótidos.
La patente estadounidense nº 4.226.993 (Buckler
et al.) describe ftalohidrazidas
inmuno-funcionalizadas, las cuales se usan como
intermediarias en la síntesis de conjugados quimioluminiscentes
marcados con ftalohidrazida. Los conjugados son útiles como
reactivos en ensayos de unión específica para determinar ligandos, o
sus parejas de unión específica, en medio líquido.
Las patentes estadounidenses nº 4.380.580 y
4.383.031 (Bogulaski et al., I; y Bogulaski et al.,
II) describen, respectivamente, ensayos de unión específica
quimioluminiscentes heterogéneos y homogéneos.
La patente estadounidense nº 4.220.450 (Maggio I)
discute inmunoensayos fluorescentes químicamente inducidos.
La patente estadounidense nº 4.652.533 (Jolley)
describe un procedimiento de inmunoensayo en fase sólida que
incorpora una marca luminiscente.
La patente estadounidense nº 4.277.437 (Maggio
II) describe equipos para llevar a cabo inmunoensayos fluorescentes
químicamente inducidos.
Heller et al. (IV) describen sondas
quimioluminiscentes y fluorescentes para sistemas de híbridación de
ADN en "Rapid Detection and Identification of Infectious
Agents" (1985), Academic Press, Inc., páginas
245-257.
Hara et al., describen un inmunoensayo
usando un compuesto metal-complejo como catalizador
quimioluminiscente en el Bull. Chem. Soc. Jpn. (1984)
57:3009-3010.
Kuschnir et al., describen la
quimioluminiscencia fotosensible del luminol en
6-aminoftaloazina-1,4-(2H3H)-diona
en Chemical Communications (1969) 193.
La detección de la híbridación de ácido nucleico
mediante transferencia de energía de residencia de fluorescencia no
radiante es descrita por Cardullo et al., en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1988) 85:8790-8794.
Morrison et al. describen una detección en
fase soluble de polinucleótidos usando marcas fluorescentes
interactivas e híbridación competitiva en Analytical
Biochemistry (1989) 183:231-244.
Zomer et al., describen marcas
quimioluminógenas en Analytica Chemical Acta (1989)
227:11-19.
Morrison II discute la detección resuelta en el
tiempo de la transferencia de energía: teoría y aplicación a
inmunoensayos en Analytical Biochemistry (1988)
174:101-120.
La patente estadounidense nº 4.299.916 (Litman
et al., I) describe la producción preferente de señal sobre
una superficie en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.233.402 (Maggio
et al.) describe reactivos y procedimientos que emplean la
canalización.
La patente estadounidense nº 4.261.968 (Ullman
et al., I) describe la atenuación de la fluorescencia con
pares inmunológicos en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.318.707 (Litman
et al., II) discute un partícula macromolecular atenuadora
de la fluorescencia en ensayos de receptor específicos.
La patente estadounidense nº 4.650.770 (Liu et
al.,) discute la atenuación, mediante partículas absorbentes de
energía, en ensayos de unión a proteína competitivos que emiten
luz.
La patente estadounidense nº 4.654.300 (Zuk et
al.) describe un ensayo de atenuación con microcuentas
fluorescentes.
La patente estadounidense nº 4.174.384 (Ullman
et al., I) describe la atenuación de la fluorescencia con
pares inmunológicos en inmunoensayos.
La patente estadounidense nº 4.193.983 (Ullman
et al., II) descubre composiciones de partículas liposómicas
marcadas, e inmunoensayos con las mismas.
Las patentes estadounidenses nº 4.199.559 y
3.996.345 (Ullman et al., IV y V) describen la atenuación de
la fluorescencia con pares inmunológicos en inmunoensayos.
O'Connell et al., Clin. Chem.
(1985) 31(9): 1424-1426 descubre un
inmunoensayo colorimétrico para digoxina utilizando grandes
vesículas fosfolipídicas unilamelares que tienen colorante atrapado
en la fase acuosa del liposoma.
Las patentes nº 3.850.578 (McConnell); 4.483.921
(Yaverbaum); y 4.483.929 (Szoka) descubren reactivos liposomales
inmunoreactivos en los que el antígeno o anticuerpo se une a la
superficie de las vesículas lipídicas.
Las patentes estadounidenses nº 4.529.561 (Hunt
et al.); 4.552.803 (Lenk et al.); y 4.485.054 (Mezei
et al.) descubren una variedad de procedimientos para
preparar vesículas lipídicas.
La patente estadounidense nº 4.311.712 (Evans
et al.) descubre un proceso para preparar un mezcla
liofilizada de liposomas.
La patente estadounidense nº 4.588.578 (Fountain
et al.) descubre un procedimiento para la preparación de
vesículas lipídicas monofásicas, y el uso de dichas vesículas para
sistemas de suministro de fármacos.
La patente estadounidense nº 4.576.912 descubre
un procedimiento para potenciar el nivel fluorescente de un
inmunoensayo usando ciertos portadores de cadena larga marcados con
una diversidad de fluoróforos.
La patente estadounidense nº 4.891.324 describe
un partícula con una sustancia luminiscente para ensayos.
La destrucción selectiva de linfocitos T mediante
liposomas fototóxicos está descrita por Yemu et al., (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
246-250.
Mew et al., en J. of Immunology
130(3): 1473-1477 (1983) descubre la
fotoinmunoterapia: el tratamiento de tumores animales con conjugados
de anticuerpos monoclonales específicos contra el tumor y
hematoporfirina.
La observación mediante microscopía óptica de
moléculas pequeñas solas es discutida por Hirschfeld (1976)
Applied Optics 15(2): 3135-3139.
Applied Optics 15(2): 3135-3139.
\newpage
La solicitud de patente europea nº 0.322.926
(McCapra et al .) describe ensayos que utilizan
ésteres, tioésteres y amidas quimioluminiscentes mejorados.
La solicitud de patente europea nº 0.352.713
(Schaap) describe un procedimiento y composiciones que proporcionan
una quimioluminiscencia mejorada a partir de
1,2-dioxetanos.
La patente estadounidense nº 4.978.614
(Bronstein) descubre un procedimiento para detectar una sustancia
usando la descomposición enzimáticamente inducida de dioxetanos.
Bronstein et al. (patente estadounidense
nº 4.956.477) discuten la síntesis de
1,2-dioxetanos.
Schaap et al. describen en WO 90/07511 la
luminiscencia mejorada a partir de 1,2-dioxetanos a
través de la transferencia de energía hacia emisores de
fluorescencia trabados.
La patente estadounidense nº 4.959.182 (Schaap)
descubre un procedimiento y composiciones que proporcionan una
quimioluminiscencia potenciada a partir de
1,2-dioxetanos.
Las patentes estadounidenses nº 4.962.192
(Schaap) y 4.857.652 (Schaap) describen compuestos
quimioluminiscentes de 1,2-dioxetano.
Bronstein et al. describen un
procedimiento usando 1,2-dioxetanos
quimioluminiscentes en la patente estadounidense nº 4.931.223.
La purificación de dioxetanos solubles en agua y
estables se descubre en WO 90/02742 (Edwards et al.).
En WO 90/00164 (Edwards et al.) se
descubren anillos policíclicos fundidos quimioluminiscentes
novedosos que contienen 1,2-dioxetanos, y ensayos en
los que se usan.
WO 89/06226 (Edwards et al.) discute la
síntesis de 1,2-dioxetanos e intermedios de los
mismos.
Neckers et al. describen catalizadores
fotosensibilizadores unidos a polímeros en la patente estadounidense
nº 4.315.998.
En WO 88/00695 (Bronstein et al.) se
discute un procedimiento para detectar una sustancia usando la
descomposición de dioxetanos inducidas enzimáticamente.
La solicitud de patente europea nº 0.324.202
(Zomer et al.) descubre compuestos de acridina como
marcadores quimioluminógenos.
La solicitud de patente europea nº 0.144.914
(Alberella et al.) describe un ensayo de híbridación que
emplea pares marcados de reactivos de unión híbridos.
La solicitud de patente europea nº 0.401.001
(Urdea et al.) describe 1,2-dioxetanos
quimioluminiscentes doblemente disparados.
EP-A-345776
describe ensayos de unión específica que utiliza un sensibilizador
como marcador. Los sensibilizadores descritos incluyen porciones
que, cuando son estimuladas mediante radiación de una o más
longitudes de onda, u otros estímulos químicos o físicos, consigue
un estado excitado que, con la adición de otros reactivos, produce
una señal detectable.
EP-A-70685
describe un ensayo de híbridación de emisión de luz homogénea. Los
segmentos de reactivo primero marcado con luz y segundo de cadena
sencilla se híbridan con un polinucleótido de cadena sencilla diana
complementario procedente de una muestra fisiológica. Una de las
marcas de luz es del tipo receptor/emisor de tal manera que la
energía absorbida de otra marca de luz vuelve a ser emitida con una
longitud de onda diferente.
EP-A-275139
describe un procedimiento de ensayo para la determinación de un
analito. El procedimiento se lleva a cabo utilizando una composición
que incluye un conjugado de un primer miembro de sbp con una
partícula. Un compuesto luminiscente se asocia de manera reversible
con una fase no acuosa de la partícula.
WO 91/03479 describe la síntesis de
1,2-dioxetanos quimioluminiscentes solubles en
agua.
La presente invención se dirige a procedimientos
para la determinación de un analito.
Un aspecto de la invención es un procedimiento
para la determinación de un analito en donde el procedimiento
comprende tratar un medio sospechoso de contener un analito para
formar una especie intrínsecamente metaestable, siendo capaz la
especie de difundir en el medio y de reaccionar de manera selectiva
con una sustancia en el medio capaz de reaccionar con la especie
metaestable llevada hasta una proximidad estrecha a la especie
gracias a la presencia del analito. El procedimiento comprende,
además, determinar si la especie ha reaccionado con la sustancia,
indicando, la reacción de la misma, la cantidad de analito en el
medio.
Otra realización de la presente invención es una
mejora en un ensayo de un analito en un medio líquido. El ensayo
comprende los pasos de tratar un medio sospechoso de contener el
analito para formar un complejo que es par de unión específica (sbp)
en relación con la presencia del analito, y determinar si se ha
formado el complejo. La mejora comprende combinar con el medio (1)
un fotosensibilizador asociado con un miembro de un par de unión
específica, y (2) un compuesto quimioluminiscente asociado con un
miembro sbp y en donde la cantidad de luz emitida por el compuesto
quimioluminiscente, a partir de la activación por el
fotosensibilizador, está relacionada con la cantidad de analito en
el medio.
Otra realización de un procedimiento según la
presente invención comprende tratar un medio, sospechoso de contener
un analito, en condiciones tales que el analito, si está presente,
afecta al fotosensibilizador; y un compuesto quimioluminiscente que
pasa a estar en estrecha proximidad. Como resultado, el oxígeno
singlete producido por el fotosensibilizador puede activar el
compuesto quimioluminiscente, el cual subsiguientemente produce luz
o luminiscencia. La cantidad de luz producida está relacionada con
la cantidad de analito en el medio.
En otra realización, un procedimiento de la
presente invención para determinar un analito comprende como primer
paso proporcionar una combinación que comprende, un medio sospechoso
de contener un analito, un fotosensibilizador asociado con un
miembro de un par de unión específica (sbp), y una partícula que
puede suspenderse que comprende un compuesto quimioluminiscente. La
partícula que puede suspenderse tiene un miembro de un par de unión
específica (sbp) unido a sí. La combinación se trata para excitar el
fotosensibilizador, el cual es capaz, en su estado excitado, de
activar el oxígeno a un estado de singlete. A continuación se
examina la combinación por la cantidad de luminiscencia emitida. La
cantidad de dicha luminiscencia está relacionada con la cantidad de
analito en el medio. Alternativamente, el compuesto
quimioluminiscente está asociado con un miembro de un sbp, y la
partícula que puede suspenderse comprende un fotosensibilizador, y
tiene un miembro de un sbp unido a sí.
Otra realización es un procedimiento para
determinar un analito en donde se proporciona una combinación. La
combinación comprende un medio sospechoso de contener un analito, un
fotosensibilizador asociado con un primer miembro de un sbp, y un
compuesto quimioluminiscente asociado con un segundo miembro del
sbp. A continuación, se excita el fotosensibilizador, y es capaz de
activar el oxígeno a un estado singlete, oxígeno singlete que activa
el compuesto quimioluminiscente cuando está en estrecha proximidad
con el fotosensibilizador. La luminiscencia emitida a partir de la
combinación está relacionada con la cantidad de analito.
Otra realización es un procedimiento para
determinar un analito. El procedimiento comprende combinar en un
medio acuoso, una muestra sospechosa de contener un analito, una
primera partícula que puede suspenderse que tiene un compuesto
quimioluminiscente incorporado en la misma, y un miembro de un sbp
unido a la misma, y una segunda partícula que puede suspenderse que
tiene incorporado en ella un fotosensibilizador capaz de activar el
oxígeno a su estado de singlete, en donde la partícula tiene un
miembro de un sbp unido a sí misma. A continuación, se irradia el
medio para producir el estado singlete del oxígeno, y se mide la
cantidad de luminiscencia emitida a partir del medio. La cantidad de
dicha luminiscencia está relacionada con la cantidad de analito en
el medio.
Otra realización de la presente invención implica
composiciones que comprenden una partícula que puede suspenderse que
tiene incorporado sobre ella un compuesto quimioluminiscente, en
donde la partícula tiene un miembro de un sbp unido a sí. La
composición puede comprender además una partícula que puede
suspenderse que tiene un fotosensibilizador incorporado en ella.
Otra realización de la presente invención se
refiere a un equipo que comprende, en una combinación empaquetada,
una composición que incluye (1) una partícula que puede suspenderse
que tiene un compuesto quimioluminiscente, en donde la partícula
tiene un miembro de un sbp unido a sí, y (2) un fotosensibilizador.
El equipo puede incluir, además, una composición que comprenda una
segunda partícula que puede suspenderse que comprende un
fotosensibilizador, en donde la partícula tiene un miembro de un sbp
unido a sí.
En otra realización, el equipo comprende (1) un
compuesto quimioluminiscente asociado con un primer miembro de un
sbp, y (2) un fotosensibilizador capaz, en su estado excitado, de
activar el oxígeno a su estado singlete, asociado con un segundo
miembro de un sbp.
Otra realización de la presente invención
comprende proporcionar (1) un medio sospechoso de contener el
analito, (2) un reactivo de marca que comprende un primer miembro de
un par de unión específico (sbp) asociado con un compuesto
quimioluminiscente fotoquímicamente activable en donde el primer
miembro de sbp es capaz de unirse al analito o a un segundo miembro
sbp para formar un complejo relacionado con la presencia del
analito, activando fotoquímicamente el compuesto quimioluminiscente
y detectando la cantidad de luminiscencia generada por el compuesto
quimioluminiscente, estando relacionada la cantidad de la misma con
la cantidad de analito en el medio.
En otro aspecto un procedimiento de la presente
invención para determinar un analito comprende como primer paso
combinar en un medio de ensayo (1) un medio sospechoso de contener
un analito y (2) un reactivo de marca que comprende un miembro de un
par de unión específico (miembro sbp) unido a un compuesto
quimioluminiscente fotoquímicamente activable bajo condiciones en
las que se forme un complejo de un miembro sbp que implique el
reactivo de marca respecto a la presencia de analito en el medio. El
medio de ensayo se irradia con luz para activar el compuesto
quimioluminiscente fotoquímicamente activable. El medio de ensayo es
examina por la emisión de luz. La presencia o intensidad de dicha
señal de emisión de luz se relaciona con la cantidad de analito en
dicho medio. Se incluye un aceptor de energía en el medio donde la
energía procedente del compuesto quimioluminiscente es capaz de
activar el aceptor de energía.
Otra realización es un procedimiento para
determinar un analito. El procedimiento comprende combinar en un
medio acuoso bien simultáneamente o total o parcialmente de manera
secuencial (1) un medio sospechoso de contener un analito, (2) un
reactivo de marca que comprende un primer miembro de un par de unión
específica (miembro sbp) unido a un compuesto capaz de dar
quimioluminiscencia en la reacción con luz o oxígeno singlete y (3)
un reactivo insoluble que comprende un aceptor de energía unido a, o
capaz de llegarse a unir con, un segundo miembro sbp. Las
condiciones se escogen en donde se forme un complejo de un miembro
sbp que implique el reactivo de marca en relación a la presencia de
analito en el medio y la energía del compuesto quimioluminiscente es
capaz de activar el aceptor de energía. El aceptor de energía se
activa con luz u oxígeno singlete. El medio de ensayo se examina por
luminiscencia, estando relacionada la presencia o intensidad de la
misma con la cantidad de analito en el medio.
Otra realización de la invención es un
procedimiento para determinar un analito, en donde el procedimiento
comprende: (a) combinar en un medio de ensayo, bien simultánea o,
total o parcialmente, secuencialmente, (1) un medio sospechoso de
contener un analito, (2) una reactivo marcador que comprende un
primer miembro de un par de unión específica (miembro de un sbp)
unido a un compuesto capaz de quimioluminiscencia a partir de la
reacción con oxígeno singlete, (3) un generador de oxígeno singlete,
y (4) un reactivo que comprende un aceptor de energía unido a, o
capaz de pasar a estar unido a, un segundo miembro de un sbp, en
condiciones en las que se forma un complejo de miembros de un sbp,
que implica el reactivo marcador, en relación con la presencia de
analito en el medio, y la energía procedente del compuesto
quimioluminiscente es capaz de activar el aceptor de energía, (b)
activar el generador de oxígeno singlete, y (c) examinar el medio de
ensayo en busca de una señal, la presencia o intensidad de la cual
está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento para determinar un analito polinucleotídico, donde el
procedimiento comprende (a) combinar en un medio de ensayo (1) una
muestra sospechosa de contener un analito polinucleotídico y (2) un
reactivo de marca que comprende un compuesto quimioluminiscente
fotoquímicamente activable unido a un polinucleótido, por lo menos
una porción de la cual es capaz de híbridar con dicho analito
polinucleótido, bajo condiciones en las que el reactivo de marca
híbrida con el analito polinucleótido si está presente, (b) irradiar
el medio de ensayo para activar el compuesto quimioluminiscente
fotoquímicamente activable y (c) medir la luminiscencia del medio.
La cantidad de luminiscencia se relaciona con la cantidad de analito
en la muestra.
Otra realización de la invención es una
composición que comprende un compuesto quimioluminiscente,
fotoquímicamente activable, unido a un miembro de un sbp. Otra
realización de la invención es un equipo que comprende una
composición tal.
Las realizaciones de la invención se describen
más abajo a modo de ejemplo solamente, y con referencia a los
esquemas que acompañan, de los cuales:
La Figura 1 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para Vitamina B_{12}.
La Figura 2 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para digoxina.
La Figura 3 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para HCG según la presente invención.
La Figura 4 es una representación gráfica de los
resultados de una prueba según la presente invención.
La Figura 5 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo para TSH según la presente invención.
La Figura 6 es una parte de la representación
gráfica de la Figura 5.
La Figura 7 es una representación gráfica de los
resultados de otro ensayo para HCG según la presente invención.
La Figura 8 es una representación gráfica de los
resultados de un ensayo de detección de ADN híbrido.
La Figura 9 es una representación gráfica de los
resultados de detección de una diana sintética.
La Figura 10 es una representación gráfica de un
ensayo de triodotironina total.
La presente invención se dirige a procedimientos
para determinar un analito.
Un aspecto de la invención es un procedimiento
para determinar un analito, en donde el procedimiento comprende
tratar un medio sospechoso de contener un analito para formar una
especie intrínsecamente metaestable. La especie es capaz de difundir
en el medio y de reaccionar, de manera selectiva, con una sustancia
en el medio capaz de reaccionar con la especie metaestable llevada a
una proximidad estrecha a la especie gracias a la presencia del
analito. El procedimiento comprende, además, determinar si la
especie ha reaccionado con la sustancia, indicando la reacción de la
misma la cantidad de analito en el medio.
Generalmente, la especie metaestable es un estado
excitado. La especie metaestable tiene una vida media de menos de un
milisegundo, habitualmente inferior a 100 microsegundos, más
habitualmente menos de 10 microsegundos. La especie metaestable se
difunde en el medio, es decir, se produce en un sitio y migra hacia
otro sitio desde el sitio de formación, en donde puede transferir
energía o reaccionar con una molécula en ese sitio.
La especie metaestable podría ser cualquier
intermediario reactivo tal como un ion radical, nitreno, carbeno,
procedente del grupo trans-ciclohexeno,
\alpha-lactona, trimetilmetano, y similares. Son
de particular interés los estados de singlete excitados tales como
el oxígeno singlete, los estados tripletes, y los dioxetanos,
incluyendo las dioxetanonas y las dioxetanodionas. Los estados
triplete se forman generalmente combinando un sensibilizador
apropiado, tal como, por ejemplo, el pireno, con un aceptor de
energía, tal como un antraceno. Por ejemplo, el dibromoantraceno
puede actuar como un aceptor de energía que asume un estado
triplete. El estado triplete puede proceder a transferir su energía
a otra molécula e iniciar un reacción fotoquímicamente detectable,
tal como la producción de luz. Los dioxetanos, tales como las
dioxetanodionas, se forman a partir de la reacción de moléculas
activas con oxígeno singlete o peróxido de hidrógeno. Por ejemplo,
los oxalatos apropiados y el peróxido de hidrógeno forman
dioxetanodionas. Enzimas tales como la peroxidasa de rábano
silvestre pueden generar cationes radicales o un oxigeno singlete
que, probablemente, son metaestables y pueden reaccionar con otra
molécula para ocasionar una señal detectable.
La presencia de un complejo de par de unión
específica puede determinarse causando que un miembro del complejo
produzca una especie metaestable, a partir de la cual esta puede
interaccionar selectivamente con otro miembro del complejo, sin
interaccionar con ese miembro cuando no está dentro del
complejo.
En un aspecto de la presente invención, una
composición, que comprende un fotosensibilizador y un ligando,
receptor, o polinucleótido, se une en un ensayo a una composición,
que comprende un compuesto quimioluminiscente y un ligando,
receptor, o polinucleótido. El compuesto quimioluminiscente puede
reaccionar con oxígeno singlete, y el producto formado se descompone
con emisión de luz. El oxígeno singlete es generado por el
fotosensibilizador, habitualmente mediante irradiación del
fotosensibilizador. El oxígeno singlete producido por el
fotosensibilizador, que no está unido a la composición, que
comprende un compuesto quimioluminiscente es incapaz de alcanzar el
compuesto quimioluminiscente antes de sufrir la atenuación (la
t_{1/2} es de aproximadamente dos microsegundos en agua). La
composición que comprende un fotosensibilizador que pasa a estar
unida a la composición que comprende el compuesto quimioluminiscente
produce oxígeno singlete que reacciona con el compuesto
quimioluminiscente, porque dicho oxígeno singlete puede sobrevivir a
la corta distancia, conseguida ahora, entre el fotosensibilizador y
el compuesto quimioluminiscente. La cortedad de la distancia resulta
de la presencia de un analito en la muestra. Preferiblemente, una
parte de la distancia recorrida por el oxígeno singlete es a través
de un medio orgánico, en donde el oxígeno singlete tiene una vida
media mucho mayor, es decir, superior a aproximadamente cien
microsegundos. El analito debe modular la unión entre la composición
que comprende el fotosensibilizador y la composición que comprende
el compuesto quimioluminiscente. Habitualmente, al menos uno de los
compuestos quimioluminiscentes y el fotosensibilizador está asociado
con una superficie, en particular, allí donde la superficie
comprende partículas que pueden suspenderse.
La estrategia anterior, que implica la excitación
del oxígeno singlete de un compuesto quimioluminiscente en estrecha
proximidad con un fotosensibilizador, se debe distinguir de la de
McCapra, véase más arriba. En la página 4, líneas
38-46, de McCapra se describe un ensayo realizado en
un formato de atenuación. El ensayo de McCapra utiliza un reactivo
que es capaz de unirse específicamente a un complejo del analito y
un material de unión específica, al cual se conjuga el
sensibilizador para formar un complejo sensibilizador
conjugado-reactivo. La parte atenuante está unida al
reactivo. Cuando se pone en estrecha proximidad con el
sensibilizador, la porción atenuante reduce o atenúa la señal
producida como resultado de la excitación del sensibilizador unido,
o reduce o atenúa la transferencia de electrones o la energía para
el sensibilizador excitado hasta una especie intermedia (es decir,
oxígeno molecular o un leuco-colorante). En este
formato atenuador, la presencia de un analito está relacionada con
la luminiscencia de los dioxetanos que decaen. A continuación,
McCapra se refiere a las patentes estadounidenses nº 4.220.450 y
4.277.437, las cuales se describen más arriba.
Este formato de ensayo de atenuación descrito por
McCapra implica solamente la atenuación del sensibilizador excitado
y no abarca la activación del oxígeno singlete de un compuesto
quimioluminiscente asociado con un miembro de unión específica.
Más aún, en la página 14, líneas
35-36, McCapra describe la transferencia de energía
desde una porción quimioluminiscente para excitar un sensibilizador
en un ensayo de sonda polinucleotídica. Esta descripción por McCapra
es totalmente distinta de la presente invención, que implica,
gracias a un analito que está presente en la muestra, llevar a una
proximidad estrecha un fotosensibilizador y un compuesto
quimioluminiscente, donde el fotosensibilizador excitado produce
oxígeno singlete, el cual, a su vez, activa el compuesto
quimioluminiscente.
En otro aspecto de la presente invención se usa
un grupo, que puede ser activado fotoquímicamente hasta un producto
luminiscente, como marca. El grupo está asociado con un miembro de
un par de unión específica, y este reactivo se usa como un reactivo
marcado en ensayos para la detección de un analito. La activación
fotoquímica puede conseguirse mediante irradiación del grupo con luz
o mediante reacción del singlete con el grupo. Preferiblemente, se
utiliza un sensibilizador para ayudar en la fotoactivación, siendo
la activación mediante un oxígeno singlete. Normalmente, el
sensibilizador absorbe luz, y el sensibilizador excitado formado de
esta manera activa el oxígeno, y el oxígeno singlete reacciona con
la marca para dar un intermediario metaestable luminiscente. El
grupo usado como marca podría incluir cualquier compuesto
quimioluminiscente que experimenta fotoactivación con o sin
sensibilización, y preferiblemente es un grupo que se activa
mediante reacción con oxígeno singlete. Las marcas de la presente
invención pueden usarse tanto en protocolos de ensayos homogéneos
como heterogéneos. De manera deseable, no se precisa de la adición
de reactivos químicos para activar el compuesto quimioluminiscente
con o sin el sensibilizador y el aceptor de energía. En un protocolo
homogéneo todos los reactivos se combinan y se irradia el medio para
activar el compuesto quimioluminiscente.
En el protocolo de ensayo, los componentes se
proporcionan en combinación y la luz producida, como una función de
la activación del oxígeno por el sensibilizador, será una función de
la concentración del analito. De manera ventajosa, los
procedimientos de la presente invención pueden llevarse a cabo sin
calentar el medio para producir luz. En consecuencia, el ensayo de
la presente invención puede realizarse a temperatura constante.
Antes de proceder con una descripción de las
realizaciones específicas de la presente invención, se definirán y
describirán con detalle un cierto número de términos.
Analito: el compuesto o composición a detectar.
El analito puede constar de un miembro de par de unión específica
(sbp), y podría ser un ligando, el cual es monovalente
(monoepitópico) o polivalente (poliepitópico), habitualmente
antigénico o hapténico, y es un único compuesto o una pluralidad de
compuestos que comparten, al menos, un sitio epitópico o un
determinante común. El analito puede ser parte de una célula, tal
como una bacteria; o una célula portadora de un antígeno de un grupo
sanguíneo, tal como A, B, D, etc., o un antígeno HLA; o un
microorganismo, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoos, o
virus.
Los analitos ligandos polivalentes normalmente
serán poli(aminoácidos), es decir, polipéptidos y proteínas,
polisacáridos, ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos.
Dichas combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus,
cromosomas, genes, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, y
similares.
En la mayor parte de los casos, los analitos
ligando poliepitópicos, a los que puede aplicarse la presente
invención, tendrán un peso molecular de al menos aproximadamente
5.000, más habitualmente de al menos aproximadamente 10.000. En la
categoría poli(aminoácidos), los poli(aminoácidos) de
interés tendrán generalmente un peso molecular de, desde
aproximadamente 5.000 hasta 5.000.000, más habitualmente un peso
molecular de desde aproximadamente 20.000 hasta 1.000.000; entre las
hormonas de interés, los pesos moleculares oscilarán habitualmente
desde aproximadamente 5.000 hasta 60.000 de peso molecular.
Una amplia variedad de proteínas podrían
considerarse como la familia de proteínas que tienen características
estructurales similares, proteínas que tienen determinadas funciones
biológicas, proteínas relacionadas con microorganismos específicos,
particularmente microorganismos causantes de enfermedades, etc.
Dichas proteínas incluyen, por ejemplo, las inmunoglobulinas,
citoquinas, enzimas, hormonas, antígenos cancerígenos, marcadores
nutricionales, antígenos específicos de tejido, etc.
Las siguientes son clases de proteínas
relacionadas por su estructura:
protaminas
histonas
albúminas
globulinas
escleroproteínas
fosfoproteínas
mucoproteínas
cromoproteínas
lipoproteínas
nucleoproteínas
glicoproteínas
receptores de células T
proteoglicanos
HLA
proteínas no clasificadas, por ejemplo,
somatotropina, prolactina, insulina, pepsina.
Un cierto número de proteínas que se encuentran
en el plasma humano son clínicamente importantes, e incluyen:
Prealbúmina
Albúmina
\alpha_{1}-Lipoproteína
\alpha_{1}-Antitripsina
\alpha_{1}-Glicoproteína
Transcortina
4,6S-Postalbúmina
Pobre en triptófano
\alpha_{1}-glicoproteína
\alpha_{1}X-Glicoproteína
Globulina unidora de tiroxina
Inhibidor de la
inter-\alpha-tripsina
Gc-globulina
- (Gc 1-1)
- (Gc 2-1)
- (Gc 2-2)
Haptoglobina
- (Hp 1-1)
- (Hp 2-1)
- (Hp 2-2)
Ceruloplasmina
Colinesterasa
\alpha_{2}-Lipoproteína(s)
Mioglobina
Proteína C-reactiva
\alpha_{2}-Macroglobulina
\alpha_{2}-HS-Glicoproteína
Zn-\alpha_{2}-Glicoproteína
\alpha_{2}-Neuramino-Glicoproteína
Eritropoietina
\beta-Lipoproteína
Transferrina
Hemopexina
Fibrinógeno
Plasminógeno
\beta_{2}-Glicoproteína I
\beta_{2}-Glicoproteína
II
Inmunoglobulina G
(IgG) o \gammaG-Globulina
- Fórmula molecular:
- \gamma_{2}\kappa_{2} o \gamma_{2}\lambda_{2}
Inmunoglobulina A
(IgA) o \gammaA-Globulina
- Fórmula molecular:
- (\alpha_{2}\kappa_{2})^{n} o (\alpha_{2}\kappa_{2})^{n}
Inmunoglobulina M
(IgM) o \gammaM-Globulina
- Fórmula molecular:
- (\mu_{2}\kappa_{2})^{5} o (\mu_{2}\lambda_{2})^{5}
Inmunoglobulina D (IgD)
o \gammaD-Globulina
(\gammaD)
- Fórmula molecular:
- (\delta_{2}\kappa_{2}) o (\delta_{2}\lambda_{2})
Inmunoglobulina E (IgE)
o \gammaE-Globulina
- Fórmula molecular:
- (\varepsilon_{2}\kappa_{2}) o (\varepsilon_{2}\lambda_{2})
Cadenas ligeras \kappa y \lambda libres
Factores de complemento:
C'1
- C'1q
- C'1r
- C'1s
C'2
C'3
- \beta_{1}A
- \alpha_{2}D
C'4
C'5
C'6
C'7
C'8
C'9
Los factores de coagulación sanguínea importantes
incluyen:
Denominación internacional | Nombre |
I | Fibrinógeno |
II | Protrombina |
Iia | Trombina |
III | Tromboplastina tisular |
V y VI | Proaccelerina, globulina aceleradora |
VII | Proconvertina |
VIII | Globulina antihemofílica (AHG) |
IX | Factor de Christmas, componente de la tromboplastina de plasma (PTC) |
X | Factor de Stuart-Prower, autoprotrombina III |
XI | Antecedente de la tromboplastina de plasma (PTA) |
XII | Factor de Hagemann |
XIII | Factor estabilizante de la fibrina |
Las hormonas proteicas importantes incluyen:
Hormona paratiroidea
(paratromona)
Tirocalcitonina
Insulina
Glucagón
Relaxina
Eritropoietina
Melanotropina
- (hormona estimuladora de los melanocitos:intermedina)
\newpage
Somatotropina
- (hormona del crecimiento)
Corticotropina
- (hormona adrenocorticotrópica)
Tirotropina
Hormona estimuladora del folículo
Hormona luteinizante
- (hormona estimuladora de las células intersticiales)
Hormona luteomamotrópica
- (luteotropina, prolactina)
Gonadotropina
- (gonadotropina coriónica)
Secretina
Gastrina
Angiotensinas I y II
Bradiquinina
Lactógeno placentario humano
IL I
IL II
IL VI
EGF
TNF
NGF
PSA
CEA
a-Fetoproteína
Fosfatasa ácida
CA19.9
CA125
\newpage
Fosfatasa alcalina
Mioglobina
CPK-MB
Calcitonina
Proteína básica de la mielina
Oxitocina
Vasopresina
Factores liberadores (RF)
- CRF, LRF, TRF, RF de la somatotropina,
- GRF, FSH-RF, PIF, MIF
Otros materiales poliméricos de interés son los
mucopolisacáridos y los polisacáridos.
Los microorganismos ilustrativos incluyen:
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los analitos ligandos monoepitópicos generalmente
tendrán un peso molecular desde aproximadamente 100 hasta 2000, más
habitualmente un peso molecular desde 125 hasta 1000. Los analitos
incluyen fármacos, metabolitos, pesticidas, contaminantes, y
similares. Los alcaloides están incluidos entre los fármacos de
interés. Entre los alcaloides están los alcaloides de la morfina,
que incluyen la morfina, codeína, heroína, dextrometorfano, sus
derivados y metabolitos; los alcaloides de la cocaína, que incluyen
la cocaína y la bencilecgonina, sus derivados y metabolitos; los
alcaloides del cornezuelo, que incluyen la dietilamida del ácido
lisérgico; los alcaloides de esteroides; los alcaloides de
iminazoilo; los alcaloides de quinazolina; los alcaloides de
isoquinolina; los alcaloides de quinolina, que incluyen la quinina y
quinidina; alcaloides de diterpenos, sus derivados y
metabolitos.
El siguiente grupo de fármacos incluyen los
esteroides, que incluyen los estrógenos, andrógenos, esteroides
androcorticales; los ácidos biliares; los glicósidos cardiotónicos;
y las agliconas, que incluyen la digoxina y digoxigenina, saponinas
y sapogeninas, sus derivados y metabolitos. También se incluyen las
sustancias imitadoras de esteroides, tales como el
dietilestilbestrol.
El siguiente grupo de fármacos son las lactamas
que tienen desde 5 hasta 6 miembros anulares, las cuales incluyen
los barbitales, por ejemplo, el fenobarbital y secobarbital, la
difenilhidantonina, la primidona, la etosuximida, y sus
metabolitos.
El siguiente grupo de fármacos son los
aminoalquilbencenos, con alquilos de desde 2 hasta 3 átomos de
carbono, que incluyen las anfetaminas; catecolaminas, que incluyen
la efedrina, la L-dopamina, la epinefrina; la
narceína; la papaverina; y los metabolitos de los anteriores.
El siguiente grupo de fármacos son los
benzoheterociclos, que incluyen el oxazepam, la cloroprozamina, el
tegretol, sus derivados y metabolitos, siendo los anillos
heterociclos azepinas, diazepinas y fenotiazinas.
El siguiente grupo de fármacos son las purinas,
que incluyen la teofilina, la cafeína, sus metabolitos y
derivados.
El siguiente grupo de fármacos incluye aquellas
derivadas de la marihuana, lo que incluye el cannabinol y el
tetrahidrocannabinol.
El siguiente grupo de fármacos son las hormonas
tales como la tiroxina, el cortisol, la triyodotironina, la
testosterona, el estradiol, la estrona, la progesterona,
polipéptidos tales como la angiotensina, la LHRH, e inmunosupresores
tales como la ciclosporina, FK506, ácido micofenólico, y demás.
El siguiente grupo de fármacos incluye las
vitaminas, tales como la A, B, por ejemplo, B_{12}, C, D, E y K,
ácido fólico, tiamina.
El siguiente grupo de fármacos son las
prostaglandinas, las cuales difieren por el grado y sitios de
hidroxilación e insaturación.
El siguiente grupo de fármacos son los
antidepresivos tricíclicos, que incluyen las imipramina, la
dismetilimipramina, la amitriptilina, la nortriptilina, la
protriptilina, la trimipramina, la clomipramina, la doxepina, y la
desmetildoxemina.
El siguiente grupo de fármacos son los
anti-neoplásicos, que incluyen el metotrexato.
El siguiente grupo de fármacos son los
antibióticos, los cuales incluyen la penicilina, cloromicetina,
actinomicetina, tetraciclina, terramicina, los metabolitos y
derivados.
El siguiente grupo de fármacos son los
nucleótidos y nucleósidos, los cuales incluyen el ATP, NAD, FMN,
adenosina, guanosina, timidina, y citidina, con sus sustituyentes
azúcar y fosfato apropiados.
El siguiente grupo de fármacos son diversos
fármacos individuales que incluyen la metadona, meprobamato,
serotonina, meperidina, lidocaína, procainamida, acetilprocainamida,
propranolol, griseofilvina, ácido valproico, butirofenonas,
antihistaminas, cloramfenicol, fármacos anticolinérgicos, tales como
la atropina, sus metabolitos y derivados.
Los metabolitos relacionados con estados
alterados incluyen la espermina, la galactosa, el ácido
fenilpirúvico, y la porfirina de Tipo 1.
El siguiente grupo de fármacos son los
aminoglicósidos, tales como la gentamicina, kanamicina, tobramicina,
y amikacina.
Entre los pesticidas de interés están los
bifenilos polihalogenados, ésteres de fosfato, tiofosfatos,
carbamatos, sulfenamidas polihalogenados, sus metabolitos y
derivados.
Para analitos receptores, los pesos moleculares
oscilarán generalmente desde 10.000 hasta 2\times10^{8}, más
habitualmente desde 10.000 hasta 10^{6}. Para las
inmunoglobulinas, IgA, IgG, IgE e IgM, los pesos moleculares
variarán generalmente desde aproximadamente 160.000 hasta
aproximadamente 10^{6}. Los enzimas normalmente oscilarán desde
aproximadamente 10.000 hasta 1.000.000 de peso molecular. Los
receptores naturales varían ampliamente, teniendo generalmente un
peso molecular de aproximadamente 25.000 y, pudiendo tener un peso
molecular de 10^{6} o superior, incluyendo tales materiales como
la avidina, ADN, ARN, globulina unidora de tiroxina, la prealbúmina
unidora de tiroxina, la transcortina, etc.
El término analito incluye además analitos
polinucleotídicos tales como aquellos polinucleótidos definidos más
adelante. Estos incluyen el m-ARN, el
r-ARN, el t-ARN, el ADN, los
dúplexes DNA-ARX, etc. El término analito también
incluye receptores que son agentes unidores de polinucleótidos,
tales como, por ejemplo, enzimas de restricción, activadores,
represores, nucleasas, polimerasas, histonas, enzimas reparadores,
agentes quimioterapéuticos, y similares.
El analito podría ser una molécula que se
encuentra directamente en una muestra tal como un fluido biológico
procedente de un huésped. La muestra puede examinarse directamente,
o podría pre-tratarse para producir el analito más
fácilmente detectable. Más aún, el analito de interés podría
determinarse detectando un agente probador del analito de interés,
tal como un miembro de un par de unión específica complementario del
analito de interés, cuya presencia será detectada solamente cuando
el analito de interés esté presente en la muestra. Por tanto, el
agente probador del analito pasa a ser el analito que se detecta en
el ensayo. El fluido corporal puede ser, por ejemplo, orina, sangre,
plasma, suero, saliva, semen, heces, esputos, fluido cerebroespinal,
lágrimas, mocos, y similares.
Miembro de un par de unión específica ("miembro
de un sbp"): una de dos moléculas diferentes, que tiene un área
sobre la superficie o en una cavidad que se une específicamente a, y
se define, por tanto, como complementaria a una determinada
organización espacial y polar sobre la otra molécula. Los miembros
del par de unión específica se denominan ligando y receptor
(antiligando). Normalmente serán miembros de un par inmunológico tal
como antígeno-anticuerpo, aunque otros pares de
unión específica, tales como la biotina-avidina, las
hormonas-receptores de hormonas, dúplexes de ácidos
nucleicos, IgG-proteína A, pares polinucleotídicos
tales como ADN-ADN, ADN-ARN, y
similares, no son pares inmunológicos pero se incluyen en la
invención y en la definición de miembro de un sbp.
Polinucleótido: un compuesto o composición
que es un nucleótido polimérico que tiene en el estado natural
aproximadamente de 50 a 500.000 ó más nucleótidos, y que tiene en el
estado aislado aproximadamente de 15 a 50.000 ó más nucleótidos,
habitualmente aproximadamente de 15 a 20.000 nucleótidos, más
frecuentemente de 15 a 10.000 nucleótidos. El polinucleótido incluye
ácidos nucleicos procedentes de cualquier fuente en forma purificada
o no purificada, que ocurren naturalmente o son producidos
sintéticamente, incluyendo el ADN (dsADN y ssADN) y ARN,
habitualmente ADN, o podría ser t-ARN,
m-ARN, r-ARN, ADN y ARN
mitocondrial, ADN y ARN de cloroplastos, híbridos
ADN-ARN, o mezclas de los mismos, genes, cromosomas,
plásmidos, los genomas de materiales biológicos tales como
microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, virus, viroides,
mohos, hongos, plantas, animales, humanos, y fragmentos de los
mismos o similares.
Ligando: cualquier compuesto orgánico para
el que existe de manera natural, o puede prepararse, un
receptor.
Análogo de ligando: un ligando modificado,
un radical orgánico o análogo de analito, habitualmente de un peso
molecular superior a 100, el cual puede competir con el ligando
análogo por un receptor, proporcionando la modificación medios para
unir un análogo de ligando a otra molécula. El análogo de ligando
diferirá usualmente del ligando en más que el reemplazo de un
hidrógeno con un enlace que une el análogo del ligando a un eje o
marca, pero no es imprescindible. El análogo del ligando puede
unirse al receptor de manera similar al ligando. El análogo podría
ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un
anticuerpo del ligando.
Receptor ("antiligando"): cualquier
compuesto o composición capaz de reconocer una determinada
organización espacial y polar de una molécula, por ejemplo, sitio
epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen
receptores que existen de manera natural, por ejemplo, globulina
unidora de tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas,
ácidos nucleicos, proteína A, componente C1q de complemento, y
similares.
Unión específica: el reconocimiento
específico de una de dos moléculas diferentes por parte de la otra
en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras
moléculas. Generalmente, las moléculas tienen áreas sobre sus
superficies o en cavidades que originan el reconocimiento específico
entre las dos moléculas. Son ejemplo de unión específica las
interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones
enzima-sustrato, interacciones polinucleotídicas, y
demás.
Unión no específica: unión no covalente
entre moléculas que es relativamente independiente de las
estructuras específicas sobre la superficie. La unión no específica
podría ser el resultado de varios factores, incluyendo interacciones
hidrofóbicas entre moléculas.
Anticuerpo: una inmunoglobulina que se une
específicamente a, y se define, por tanto, como complementaria de
una determinada organización espacial y polar de otra molécula. El
anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse
mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica tales como la
inmunización de un huésped y la extracción del suero (policlonal) o
preparando líneas celulares híbridas continuas y recogiendo la
proteína secretada (monoclonal) o mediante clonación y expresión de
secuencias nucleotídicas, o versiones mutadas de las mismas, que
codifican al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la
unión específica de los anticuerpos naturales. Los anticuerpos
pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la
misma, inmunoglobulinas que incluyen las diversas clases e isotipos,
tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los
fragmentos de las mismas incluyen Fab, Fv y F(ab')_{2},
Fab', y similares. Además, los agregados, polímeros y conjugados de
las inmunoglobulinas o sus fragmentos pueden usarse donde sea
apropiado, con tal que se mantenga la afinidad de unión por una
molécula determinada.
Alquilo: un radical monovalente ramificado
o no ramificado derivado de un hidrocarburo alifático mediante la
eliminación de un átomo de H; incluye tanto alquilos inferiores como
alquilos superiores.
Alquilo inferior: un alquilo que contiene
de 1 a 5 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, metilo, etilo,
propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo, isopentilo,
etc.
Alquilo superior: un alquilo que contiene
más de 6 átomos de carbono, habitualmente de 6 a 20 átomos de
carbono, tal como, por ejemplo, hexilo, heptilo, octilo, etc.
Alquilideno: un radical orgánico divalente
derivado de un hidrocarburo alifático, tal como, por ejemplo, el
etilideno, en el que 2 átomos de hidrógeno se toman del mismo átomo
de carbono.
Arilo: un radical orgánico derivado de un
hidrocarburo aromático mediante la eliminación de un átomo, y que
contiene uno o más anillos aromáticos, habitualmente de uno a cuatro
anillos aromáticos, tal como, por ejemplo, fenilo (a partir del
benceno), naftilo (a partir del naftaleno), etc.
Arilalquilo: un radical orgánico que tiene
un grupo alquilo al cual se une un grupo arilo, por ejemplo,
bencilo, fenetilo, 3-fenilpropilo,
1-naftiletilo, etc.
Alcoxi: un radical alquilo unido al resto
de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, metoxi,
etoxi, etc.
Ariloxi: un radical arilo unido al resto
de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo, fenoxi,
naftoxi, etc.
Arilalcoxi: un radical arilalquilo unido
al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, por ejemplo,
benzoxi, 1-naftiletoxi, etc.
Sustituido: quiere decir que un átomo de
hidrógeno de una molécula ha sido reemplazado por otro átomo, el
cual puede ser un único átomo, tal como un halógeno, etc., o parte
de un grupo de átomos que forman una funcionalidad, tal como un
sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos (distintos de los átomos de
hidrógeno necesarios para satisfacer las valencias de dichos
átomos), átomos que se seleccionan independientemente de entre el
grupo que consiste en: carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y
fósforo, y los cuales podrían estar unidos o no a uno o más átomos
metálicos.
Alquiltio: un radical alquilo unido al
resto de una molécula mediante un átomo de azufre, por ejemplo,
metiltio, etiltio, etc.
Ariltio: un radical arilo unido al resto
de una molécula mediante un átomo de azufre, por ejemplo, feniltio,
naftiltio, etc.
Grupo donante de electrones: un
sustituyente que, cuando está unido a una molécula, es capaz de
polarizar la molécula de tal manera que el grupo donante de
electrones se empobrece en electrones y pasa a estar cargado
positivamente en relación a otras partes de la molécula, es decir,
tiene una densidad electrónica reducida. Tales grupos podrían ser, a
modo de ilustración y no de limitación, las aminas, éteres,
tioéteres, fosfinas, hidroxi, oxianiones, mercaptanos y sus aniones,
sulfuros, etc.
Un sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos
(distintos del requisito de átomos de hidrógenos necesarios para
satisfacer las valencias de dichos átomos), átomos que se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en carbono,
oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo: un radical orgánico; el
radical orgánico tiene de 1 a 50 átomos distintos del requisito de
número de átomos de hidrógeno necesario para satisfacer las
valencias de los átomos del radical. Generalmente, el átomo
predominante es el carbono (C), pero también podría serlo el oxígeno
(O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), en donde el O, N, S ó
P, si están presentes, están unidos al carbono, o a uno o más de
entre ellos, o al hidrógeno, o a un átomo metálico, para formar
varios grupos funcionales, tales como, por ejemplo, ácidos
carboxílicos, alcoholes, tioles, carboxamidas, carbamatos, ésteres
de ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ésteres de ácidos
sulfónicos, ácidos fosfóricos, ésteres de ácidos fosfóricos, ureas,
carbamatos, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros, tioéteres,
olefinas, acetilenos, aminas, cetonas, aldehídos, nitrilos, y
similares. Son ilustrativos de dichos radicales o grupos orgánicos,
a modo de ilustración y no de limitación, el alquilo, la
alquilidina, el arilo, el arilalquilo, y el alquilo, arilo, y
arilalquilo sustituidos con una o más de las funcionalidades antes
mencionadas.
Grupo de enlace: el enlace covalente entre
moléculas. El grupo de enlace dependerá ampliamente dependiendo de
la naturaleza de las moléculas, es decir, el fotosensibilizador, el
compuesto quimioluminiscente, el miembro de un sbp, o la molécula
asociada con o parte de una partícula, que está siendo enlazado. Los
grupos funcionales que están normalmente presentes o que se
introducen sobre un fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente se emplearán para el enlace de estos materiales a
un miembro de un sbp, o a una partícula tal como un componente
lipofílico de un liposoma o gota de aceite, partícula de látex,
partícula de silicona, sol de metal, cristalito de colorante.
En la mayor parte, las funcionalidades carbonilo
encontrarán uso, tanto oxocarbonilo, por ejemplo, aldehído, como
no-oxocarbonilo (incluyendo análogos de nitrógeno y
azufre), por ejemplo, carboxi, amidina, amidato, tiocarboxi y
tionocarboxi.
Las funcionalidades alternativas a oxo incluyen
halógenos activos, diazo, mercapto, olefina, en particular olefina
activada, amino, fósforo y similares. Una descripción de grupos
enlace podría encontrarse en la patente estadounidense nº 3.817.837,
cuya descripción se incorpora aquí como referencia.
Los grupos de enlace pueden variar de un enlace a
una cadena de desde 1 hasta 100 átomos, habitualmente de
aproximadamente 1 a 70 átomos, preferiblemente de 1 a 50 átomos, más
preferiblemente de 1 a 20 átomos, cada uno seleccionado
independientemente de entre el grupo que normalmente consiste en
carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno, y fósforo. El número de
heteroátomos en los grupos enlace normalmente oscilará desde
aproximadamente 0 hasta 20, habitualmente desde aproximadamente 1
hasta 15, más preferiblemente de 2 a 6. Los átomos en la cadena
podrían sustituirse con otros átomos distintos de hidrógeno de
manera similar a la descrita para el sustituyente que tiene de 1 a
50 átomos. Como regla general, la longitud de un determinado grupo
enlace puede seleccionarse arbitrariamente para proporcionar los
medios convenientes a la síntesis, y la incorporación de cualquier
grupo deseado, tal como un grupo aceptor de energía, un fluoróforo,
un grupo para el análisis del entrecruzado del sistema, tal como un
átomo pesado, y similares. Los grupos de enlace podrían ser
alifáticos o aromáticos, aunque con grupos diazo, estarán
habitualmente implicados los grupos aromáticos.
Cuando los heteroátomos están presentes, el
oxígeno estará normalmente presente como oxo y oxi, unido a carbono,
azufre, nitrógeno o fósforo, el nitrógeno estará normalmente
presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono,
oxígeno, azufre o fósforo; el azufre sería análogo al oxígeno;
mientras que el fósforo estará unido a carbono, oxígeno, azufre o
nitrógeno, usualmente como fosfonato y fosfato mono- o diéster.
Las funcionalidades comunes en la formación de un
enlace covalente entre el grupo enlace y la molécula a conjugar
serán la alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea,
guanidina, azo, tioéter, y ésteres, amidas y tioésteres de
carboxilato, sulfonato y fosfato.
En la mayor parte de los casos, el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente tendrán un
grupo no-oxocarbonilo, incluyendo análogos de
nitrógeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, un agente
alquilante tal como un halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el
análogo de azufre, mercapto), oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o
cetona), u olefina activa, tal como una vinilsulfona o un éster
\beta-insaturado. Estas funcionalidades estarán
unidas a grupos amina, grupos carboxílicos, olefinas activas,
agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Allí donde una amina
y ácido carboxílico, o su derivado nitrogenado o ácido fosfórico, se
enlazan, se formarán amidas, amidinas u fosforamidas. Allí donde se
enlazan el mercaptano y una olefina activada, se formarán tioéteres.
Allí donde se enlazan un mercaptano y un agente alquilante, se
formarán tioéteres. Allí donde se enlazan un aldehído y una amina en
condiciones reductoras, se formará una alquilamina. Allí donde se
enlazan un ácido carboxílico o ácido fosfato y un alcohol, se
formarán ésteres.
Un grupo o funcionalidad que proporciona
hidrofobicidad o solubilidad en agua: es una funcionalidad
hidrofílica, la cual aumenta la capacidad de empaparse de los
sólidos con agua, y la solubilidad en agua de los compuestos a los
que está unida. Dicho grupo funcional o funcionalidad puede ser un
sustituyente que tiene de 1 a 50 ó más átomos, y puede incluir un
sulfonato, sulfato, fosfato, amidina, fosfonato, carboxilato,
hidroxilo, en particular polioles, amina, éter, amida, y similares.
Son ilustrativos los grupos funcionales: carboxialquilo,
sulfonoxialquilo, CONHOCH_{2}COOH, CO-(glucosamina), azúcares,
dextrano, ciclodextrina, SO_{2}NHCH_{2}COOH, SO_{3}H,
CONHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2},
hidroxilo, carboxilo, cetona, y combinaciones de los mismos. La
mayoría de la funcionalidades anteriores también pueden usarse como
grupos de anclaje, los cuales permiten el anclaje del
fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente a un miembro de un
sbp o a un soporte.
Un grupo o funcionalidad que proporciona
lipofilicidad o solubilidad en lípidos: es una funcionalidad
lipofílica, la cual disminuye la capacidad de empaparse de las
superficies por parte del agua, y la solubilidad en agua de los
compuestos a los cuales está unida. Dicho grupo funcional o
funcionalidad puede contener de 1 a 50 ó más átomos, habitualmente
átomos de carbono sustituidos con hidrógeno o halógeno, y puede
incluir alquilo, alquilideno, arilo y arilalquilo. El grupo o
funcionalidad lipofílico normalmente tendrá de uno a seis grupos
alifáticos de cadena lineal o ramificada de al menos 6 átomos de
carbono, más habitualmente de al menos 10 átomos de carbono, y
preferiblemente al menos 12 átomos de carbono, habitualmente no más
de 30 átomos de carbono. El grupo alifático podría estar unido a
anillos de desde 5 hasta 6 miembros, los cuales podrían ser
alicíclicos, heterocíclicos, o aromáticos. Fotosensibilizador: un
sensibilizador para la generación de oxígeno singlete, habitualmente
mediante excitación con la luz. El fotosensibilizador puede ser
fotoactivable (por ejemplo, colorantes y compuestos aromáticos) o
activado químicamente (por ejemplo, enzimas y sales metálicas).
Cuando es excitado por la luz, el fotosensibilizador es
habitualmente un compuesto formado por átomos covalentemente unidos,
usualmente con múltiples enlaces dobles y triples conjugados. El
compuesto debería absorber luz en el rango de longitud de onda
200-1100 nm, habitualmente 300-1000
nm, preferiblemente 450-950 nm, con un coeficiente
de extinción en su máximo de absorbancia superior a 500 M^{-1}
cm^{-1}, preferiblemente al menos 5000 M^{-1} cm^{-1}, más
preferiblemente al menos 50.000 M^{-1} cm^{-1} en la longitud de
onda de excitación. La vida media de un estado excitado producido a
partir de la absorción de luz en ausencia de oxígeno será
habitualmente de al menos 100 ns, preferiblemente al menos 1 ms. En
general, la vida media debe ser lo suficientemente larga como para
permitir la transferencia de energía al oxígeno, el cual estará
normalmente presente en concentraciones en el rango de 10^{-5}
hasta 10^{-3}, dependiendo del medio. El estado excitado del
sensibilizador habitualmente tendrá un número cuántico de espín (S)
diferente del de su estado elemental, y será usualmente un triplete
(S=1) cuando, como es habitualmente el caso, el estado elemental sea
un singlete (S=0). Preferiblemente, el sensibilizador tendrá un
elevado rendimiento de entrecruzado del intersistema. Es decir, la
fotoexcitación del sensibilizador producirá un estado de vida largo
(usualmente triplete), con una eficiencia de al menos un 10%,
deseablemente al menos un 40%, preferiblemente superior al 80%. El
fotosensibilizador será habitualmente, como mucho, débilmente
fluorescente en las condiciones de ensayo (rendimiento cuántico
habitualmente inferior al 0,5, preferiblemente inferior al 0,1).
Los fotosensibilizadores que han de ser excitados
mediante la luz serán relativamente fotoestables, y no reaccionarán
eficientemente con el oxígeno singlete. Varias características
estructurales están presentes en los sensibilizadores más adecuadas.
La mayoría de sensibilizadores tienen al menos uno, y frecuentemente
tres o más dobles o triples enlaces conjugados mantenidos en una
estructura rígida, frecuentemente aromática. Contendrán
frecuentemente al menos un grupo que acelera el cruce del
intersistema, tal como un grupo carbonilo o imina, o un átomo pesado
seleccionado de entre las columnas 3-6 de la tabla
periódica, especialmente yodo y bromo, o podrían tener estructuras
aromáticas extendidas. Los sensibilizadores típicos incluyen la
acetona, la benzofenona, la 9-tioxantona, la eosina,
el 9,10-dibromoantraceno, el azul de metileno, las
metaloporfirinas, tales como la hematoporfirina, las ftalocianinas,
las clorofilas, el rosa de bengala, el buckminsterfullereno, etc., y
derivados de estos compuestos que tienen sustituyentes de 1 a 50
átomos para hacer dichos compuestos más lipofílicos o más
hidrofílicos y/o como grupos de anclaje para el anclaje, por
ejemplo, a un miembro de un sbp. Son ejemplo de otros
fotosensibilizadores que podrían usarse en la presente invención
aquellos que tienen las propiedades anteriores y que se enumeran en
N. J. Turro, "Molecular Photochemistry", página 132, W. A.
Benjamin Inc., N.Y., 1965.
Los fotosensibilizadores son preferiblemente
relativamente no-polares para asegurar su disolución
en un miembro lipofílico cuando el fotosensibilizador es incorporado
a una gota de aceite, liposoma, partícula de látex, etc.
Se propone que los fotosensibilizadores útiles en
esta invención también incluyan otras sustancias y composiciones que
pueden producir oxígeno singlete con o, menos preferiblemente, sin
activación mediante una fuente externa de luz. Así pues, por
ejemplo, se ha observado que las sales de molibdato
(MoO_{4}^{=}) y la cloroperoxidasa, y la mieloperoxidasa más ion
bromuro o cloruro (Kanofsky, J. Biol. Chem. (1983)
259: 5596) catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno a
oxígeno singlete y agua. Cualquiera de estas composiciones puede,
por ejemplo, incluirse en partículas a las cuales está unido un
miembro de un sbp, y usarse en el procedimiento de ensayo en el que
el peróxido de hidrógeno está incluido como un reactivo secundario,
la cloroperoxidasa está unida a una superficie, y el molibdato se
incorpora en la fase acuosa de un liposoma. También están incluidos
como fotosensibilizadores, dentro del ámbito de los invención, los
compuestos que no son verdaderos sensibilizadores, pero que, al ser
excitados mediante calor, luz o activación química, liberarán una
molécula de oxígeno singlete. Los miembros mejor conocidos de esta
clase de compuestos incluyen los endoperóxidos tales como el
1,4-biscarboxietil-1,4-naftaleno
endoperóxido, el
9,10-difenilantraceno-9,10-endoperóxido,
y el
5,6,11,12-tretrafenilnaftaleno-5,12-endoperóxido.
El calentamiento o la absorción directa de luz por parte de estos
compuestos libera oxígeno singlete.
Soporte o superficie: una superficie
formada por un material insoluble poroso o no poroso en agua. La
superficie puede tener cualquiera de entre un cierto número de
formas, tales como cinta, barra, partícula, incluyendo cuentas, y
similares. La superficie puede ser hidrofílica o capaz de ser
convertida en hidrofílica, e incluye polvos inorgánicos tales como
sílice, sulfato magnésico y alúmina; materiales poliméricos
naturales, en particular materiales celulósicos y materiales
derivados de la celulosa, tales como papeles que contienen fibra,
por ejemplo, papel de filtro, papel cromatográfico, etc.; polímeros
sintéticos o que ocurren de manera natural modificados, tales como
la nitrocelulosa, el acetato de celulosa, el cloruro de polivinilo,
la poliacrilamida, dextrano entrecruzado, agarosa, poliacrilato,
polietileno, polipropileno,
poli(4-metilbuteno), poliestireno,
polimetacrilato, poli(etileno tereftalato), nilón,
polivinilbutirato, etc.; bien usados por sí mismos o conjuntamente
con otros materiales; vidrios disponibles como Biovidrio, cerámicas,
metales y similares. También pueden utilizarse los ensamblajes
naturales o sintéticos tales como los liposomas, vesículas
fosfolipídicas, y células.
La unión de miembros de un sbp al soporte o
superficie podría conseguirse mediante técnicas bien conocidas,
comúnmente disponibles en la literatura. Véase, por ejemplo,
"Immobilized enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva
York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059
(1970).
La superficie será habitualmente polifuncional, o
será capaz de ser "polifuncionalizada", o será capaz de unir un
oligonucleótido, un miembro de un sbp, un fotosensibilizador, y/o un
compuesto quimioluminiscente, a través de interacciones covalentes y
no covalentes específicas o no específicas. Están disponibles o
pueden incorporarse una amplia variedad de grupos funcionales. Los
grupos funcionales incluyen los ácidos carboxílicos, aldehídos,
grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, grupos
mercapto, y similares. La manera de enlazar una amplia variedad de
compuestos a superficies es bien conocida y está ampliamente
ilustrada en la literatura. Véase, por ejemplo, Cuatrecasas, J.
Biol. Chem. 245: 3059 (1970). La longitud de un grupo de engarce
al oligonucleótido o al miembro de un sbp podría variar ampliamente,
dependiendo de la naturaleza del compuesto que está siendo
engarzado, del efecto de la distancia entre el compuesto que está
siendo engarzado y la superficie en las propiedades de unión
específicas, y similares.
Partículas: partículas de al menos
aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 \mum,
habitualmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de
aproximadamente 10 \mum, preferiblemente desde aproximadamente
0,10 hasta 2,0 \mum de diámetro, que tienen normalmente un volumen
de menos de 1 picolitro. La partícula podría ser orgánica o
inorgánica, inflable o no inflable, porosa o no porosa, tener
cualquier densidad, pero preferiblemente de una densidad que se
aproxime a la del agua, generalmente desde aproximadamente 0,7 hasta
1,5 g/ml, preferiblemente que pueda suspenderse en agua, y compuesta
de un material que puede ser transparente, parcialmente
transparente, u opaco. Las partículas podrían tener o no una carga,
y cuando estén cargadas son preferiblemente negativas. Las
partículas podrían ser sólidas (por ejemplo, de polímeros, metales,
vidrio, orgánicas e inorgánicas, tales como de minerales, sales y
diátomos), gotas de aceite (por ejemplo, de hidrocarburos,
fluorocarburo, fluido de silicona), o vesículas (por ejemplo,
sintéticas tales como de fosfolípido, o naturales tales como
células y orgánulos). Las partículas podrían ser partículas de
látex, u otras partículas compuestas de polímeros orgánicos e
inorgánicos; bicapas lipídicas, por ejemplo, liposomas, vesículas
fosfolipídicas; gotas de aceite; partículas de silicona; soles de
metal; células; y cristalitos de colorante.
Las partículas orgánicas serán normalmente
polímeros, bien polímeros de adición o de condensación, los cuales
pueden dispersarse fácilmente en el medio de ensayo. Las partículas
orgánicas también serán adsortivas, o funcionalizables con objeto de
unir sobre su superficie, bien directa o indirectamente, un miembro
de un sbp, y de unir sobre su superficie o incorporar dentro de su
volumen un fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente.
Las partículas pueden derivarse a partir de
materiales que se encuentran de manera natural, materiales que se
encuentran de manera natural que se modifican sintéticamente, y
materiales sintéticos. Se prefieren los ensamblajes naturales o
sintéticos tales como las bicapas lipídicas, por ejemplo, liposomas
y vesículas no fosfolipídicas. Entre los polímeros orgánicos de
especial interés están los polisacáridos, en particular los
polisacáridos entrecruzados, tales como la agarosa, la cual está
disponible como Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y
Sephacryl, la celulosa, el almidón, y similares; los polímeros de
adición, tales como el poliestireno, la poliacrilamida, los
homopolímeros y copolímeros de derivados del acrilato y metacrilato,
en particular ésteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo
libres, incluyendo los hidrogeles y similares. Los polímeros
inorgánicos incluyen las siliconas, vidrios, disponible como
Bioglass, y similares. Los soles incluyen el oro, el selenio, y
otros metales. Las partículas también podrían ser colorantes
insolubles en agua tales como las porfirinas, la ftalocianinas,
etc., las cuales podrían actuar como fotosensibilizadores. Las
partículas también podrían incluir diátomos, células, partículas
virales, magnetosomas, núcleos celulares, y similares.
Cuando las partículas están comercialmente
disponibles, el tamaño de la partícula podría hacerse variar
rompiendo partículas mayores en partículas más pequeñas mediante
medios mecánicos, tales como molienda, sonicación, agitación,
etc.
Las partículas serán habitualmente
polifuncionales, o serán capaces de ser polifuncionalizadas, o serán
capaces de unirse a un miembro de un sbp, fotosensibilizador, o a un
compuesto quimioluminiscente, a través de interacciones covalentes o
no covalentes, específicas o no específicas. Una amplia variedad de
grupos funcionales están disponibles o pueden ser incorporados. Los
ejemplos de grupos funcionales incluyen los ácidos carboxílicos, los
aldehídos, los grupos amino, los grupos ciano, los grupos etileno,
los grupos hidroxilo, los grupos mercapto, y similares. Cuando se
emplea la unión covalente de un miembro sbp, un compuesto
quimioluminiscente, o un fotosensibilizador, a la partícula, la
manera de engarzarlos es bien conocida y está ampliamente ilustrada
en la literatura. Véase, por ejemplo, Cuatrecasas, J. Biol.
Chem. 245: 3059 (1970). La longitud de un grupo de
engarce podría variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del
compuesto que está siendo engarzado, de la naturaleza de la
partícula, y del efecto de la distancia entre el compuesto que está
siendo engarzado y la partícula, en la unión de miembros de sbp y el
analito, y similares.
El fotosensibilizador y/o el compuesto
quimioluminiscente pueden escogerse para disolverse en, o para
unirse no covalentemente sobre la superficie de las partículas. En
este caso, estos compuestos serán preferiblemente hidrofóbicos para
reducir su capacidad de disociarse de la partícula, y causar, por
tanto, que ambos compuestos se asocien con la misma partícula. Esta
posibilidad puede reducirse, aún más, utilizando partículas de tan
sólo una composición, que están asociadas bien con el
fotosensibilizador o con el compuesto quimioluminiscente; o usando
dos tipos de partículas que difieren en su composición, con objeto
de favorecer la asociación del fotosensibilizador con un tipo de
partículas, y la asociación del compuesto quimioluminiscente con el
otro tipo de partículas.
El número de moléculas fotosensibilizadoras o
quimioluminiscentes asociadas con cada partícula, en promedio será
habitualmente de al menos una, y podría ser suficientemente elevado,
de manera que la partícula consistiera enteramente en moléculas
fotosensibilizadoras o quimioluminiscentes. El número de moléculas
preferido se seleccionará empíricamente para proporcionar en el
ensayo la relación señal-ruido de fondo más intensa.
En algunos casos esto se conseguirá mejor asociando una
multiplicidad de diferentes moléculas fotosensibilizadoras a las
partículas. Habitualmente, la proporción de fotosensibilizador o
compuesto quimioluminiscente respecto el miembro de un sbp en las
partículas debería ser de al menos 1, preferiblemente de al menos
100 a 1, y más preferiblemente superior a 1000 a 1.
Gotas de aceite: son partículas fluidas
formadas por un compuesto lipofílico recubierto y estabilizado con
un emulsivo que es una molécula amfifílica, tal como, por ejemplo,
fosfolípidos, esfingomielina, albúmina, y similares.
\newpage
Los fosfolípidos se basan en éteres de ácidos
carboxílicos alifáticos de polioles alifáticos, en donde al menos un
grupo hidroxílico está sustituido con un éster de ácido carboxílico
de desde aproximadamente 8 hasta 36, más habitualmente de desde
aproximadamente 10 hasta 20 átomos de carbono, el cual podría tener
desde 0 hasta 3, más habitualmente desde 0 hasta 1 sitio de
insaturación etilénica, y al menos 1, normalmente tan sólo 1, grupo
hidroxilo sustituido con fosfato para formar un éster fosfato. El
grupo fosfato podría sustituirse además con pequeños compuestos
alifáticos, los cuales son de dos o más funcionalidades, teniendo
generalmente grupos hidroxilo o amino.
Las gotas de aceite pueden fabricarse según los
procedimientos convencionales, mediante combinación de los
compuestos lipofílicos apropiados con un tensioactivo, aniónico,
catiónico o no iónico, en donde el tensioactivo está presente en
desde aproximadamente 0,1 hasta 5, más habitualmente desde
aproximadamente 0,1 hasta 2 en porcentaje de peso de la mezcla, y
sometiendo la mezcla a agitación en un medio acuoso, tal como
sonicación o agitación con vórtex. Los compuestos lipofílicos
ilustrativos incluyen los aceites hidrocarburos, los halocarburos,
incluyendo los fluorocarburos, los alquilftalatos,
trialquilfosfatos, triglicéridos, etc.
Un miembro de un sbp será generalmente adsorbido
sobre la superficie de la gota lipídica, o unido directa o
indirectamente a un componente de superficie de la gota de aceite.
El miembro de un sbp podría incorporarse dentro de las partículas
líquidas, bien durante o después de la preparación de las partículas
líquidas. El miembro de un sbp normalmente estará presente en un
porcentaje molar de desde 0,5 hasta 100, más habitualmente de 1 a
90, frecuentemente desde aproximadamente 5 hasta 80, y
preferiblemente desde aproximadamente 50 hasta 100, de las moléculas
presentes sobre la superficie de la partícula.
La siguiente es una lista, a modo de ilustración
y no de limitación, de compuestos amfifílicos, los cuales podrían
utilizarse para estabilizar las gotas lipídicas:
fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
dimiristoilfosfatidilcolina, fosfatidil colina de huevo,
dipalmitoilfosfatidilcolina, ácido fosfatídico, cardiolipina,
lecitina, galactocerebrósido, esfingomielina, dicetilfosfato,
fosfatidilinositol, 2-trihexadecilamoniometilamina,
1,3-bis(octadecilfosfato)-propanol,
fosfato de estearoiloxietileno, fosfolípidos, dialquilfosfatos,
dodecil sulfato de sodio, detergentes catiónicos, detergentes
aniónicos, proteínas tales como la albúmina, detergentes no iónicos,
etc.
También podrían usarse otros compuestos que
tienen grupos lipofílicos y que han sido descritos previamente. En
la mayor parte de los casos, estos compuestos serán alquilbencenos,
que tienen grupos alquilo de 6 hasta 20 átomos de carbono,
habitualmente mezclas de grupos alquilo, los cuales pueden ser de
cadena lineal o ramificada, y que tienen un grupo carboxilo, un
grupo hidroxílico, un grupo polioxi alquileno (alquileno de 2 hasta
3 átomos de carbono), grupo carboxílico, grupo ácido sulfónico, o
grupo amino. Los ácidos grasos alifáticos podrían usarse,
normalmente tendrán de 10 hasta 36, más habitualmente de 12 hasta 20
átomos de carbono. También podrían encontrar un uso los alcoholes
grasos que tienen los limites de carbonos indicados para los ácidos
grasos, las aminas grasas con similares limitaciones de carbonos, y
varios esteroides.
Las gotas lipídicas pueden comprender un aceite
de fluorocarburo o un aceite de silicona (partícula de silicona).
Dichas gotas están descritas por Giaever en las patentes US Nº
4.634.681 y 4.619.904 (las descripciones de las cuales se incorporan
en aquí en su totalidad). Estas gotas se forman dispersando un
aceite de fluorocarburo o aceite de silicona en una fase acuosa. Las
gotas se preparan colocando una pequeña cantidad del aceite
seleccionado (generalmente, dichos aceites están disponibles
comercialmente) en un contenedor con una mayor cantidad de fase
acuosa. El sistema líquido se somete a agitación para generar la
emulsión, y a continuación se centrifuga. La fase homogénea se
retira y las gotas residuales se resuspenden en un medio acuoso
tamponado. Los pasos anteriores de centrifugación y decantación
pueden repetirse una o más veces antes de que las gotas sean
utilizadas.
Los miembros de un sbp se pueden unir a las gotas
en un cierto número de maneras. Tal como describe Giaever, el
miembro de un sbp determinado, particularmente un miembro proteico
de un sbp, puede ser recubierto sobre las gotas introduciendo un
exceso del miembro del sbp en el medio acuoso antes del paso de la
emulsión. Los pasos de lavado son deseables para retirar el exceso
de medio del sbp. La funcionalización del aceite introduce
funcionalidades descritas más arriba para engarzar a los miembros de
un sbp. Dichas funcionalidades también pueden emplearse para unir
las gotas a un fotosensibilizador o a un compuesto
quimioluminiscente. Por otra parte, el fotosensibilizador o el
compuesto quimioluminiscente se escogerán frecuentemente de manera
que sean solubles en la fase aceite de la gota lipídica, y no serán
unidos covalentemente. Cuando el aceite es un fluorocarburo, será a
menudo más soluble un fotosensibilizador o un compuesto
quimioluminiscente fluorado que el correspondiente derivado no
fluorado.
Otras gotas lipídicas descritas Giaever también
podrían encontrar un uso en la presente invención.
Liposomas: microvesículas de forma
aproximadamente esférica, y son uno de los materiales preferidos
para su uso en la presente invención. Los liposomas tienen un
diámetro que es al menos aproximadamente 20 nm y no más de
aproximadamente 20 micrones, habitualmente al menos aproximadamente
40 nm y menos de aproximadamente 10 micrones. Preferiblemente, el
diámetro de los liposomas será inferior a aproximadamente dos
micrones, con objeto de limitar la precipitación o la flotación.
La capa exterior de un liposoma consiste en una
bicapa amfifílica que encierra un volumen de agua o una solución
acuosa. Los liposomas con más de una bicapa se denominan vesículas
multilamelares. Los liposomas con una única bicapa se denominan
vesículas unilamelares. Las vesículas multilamelares son preferidas
en la presente invención cuando se usa un fotosensibilizador o
compuesto quimioluminiscente lipofílico, debido a su capacidad para
incorporar mayores cantidades de estos materiales que las vesículas
unilamelares. La bicapa amfifílica está frecuentemente formada por
fosfolípidos. Los fosfolípidos empleados en la preparación de
partículas utilizables en la presente invención pueden ser cualquier
fosfolípido o mezcla de fosfolípidos que se encuentre en membranas
naturales, incluyendo la lecitina, o diésteres sintéticos de
glicerolfosfato de ácidos grasos lineales de
12-carbonos o 24-carbonos saturados
o insaturados, en donde el fosfato puede estar presente como
monoéster, o como un éster de un alcohol polar tal como etanolamina,
colina, inositol, serina, glicerol, y similares. Los fosfolípidos
particularmente preferidos incluyen la
L-\alpha-palmitoil
oleoil-fosfatidilcolina (POPC), el palmitoil
oleoil-fosfatidilglicerol (POPG), el
L-\alpha-dioleoil-fosfatidilglicerol,
la
L-\alpha-dioleoil-fosfatidiletanolamina
(DOPE), y el
L-\alpha-dioleoil-fosfatidil
\beta-(4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxiamido)etanol
(DOPE-MCC).
Los fosfolípidos en la bicapa podrían
suplementarse con colesterol, y podrían reemplazarse por otros
compuestos amfifílicos que tengan un grupo cabeza polar,
habitualmente cargado, y una parte hidrofóbica habitualmente formada
por dos cadenas lineales de hidrocarburos. Ejemplos de dichos
sustituyentes incluyen el dialquilfosfato; los
dialcoxipropilfosfatos en los que los grupos alquilo tienen cadenas
lineales de 12-20 átomos de carbono; el cloruro de
N-(2,3-di(9-(Z)-octa-deceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA), tal y como se describe en la patente estadounidense nº
4.897.355 concedida el 30 de enero de 1990, la cual es incorporada
por la presente en ésta por referencia; la esfingomielina; la
cardiolipina; y similares.
Los liposomas utilizados en la presente invención
preferiblemente tienen una elevada densidad de carga negativa para
estabilizar la suspensión, y para prevenir la agregación
espontánea.
Para su uso en la presente invención, los
liposomas deberían ser capaces de unirse a un miembro de un sbp, y
ser capaces de tener un fotosensibilizador o un compuesto
quimioluminiscente asociados con cualquiera, la fase acuosa o la no
acuosa. Los liposomas utilizados en la presente invención
habitualmente tendrán miembros de sbp unidos a la superficie
exterior de la vesícula lipídica.
Los liposomas podrían producirse mediante una
variedad de procedimientos, incluyendo la hidratación y la
dispersión mecánica de fosfolípidos o sustitutos de fosfolípidos
secos en una solución acuosa. Los liposomas preparados de esta
manera tendrán una variedad de dimensiones, composiciones y
comportamientos. La sonicación es un procedimiento para reducir la
heterogeneidad e inconsistencia de comportamiento de los liposomas
mecánicamente dispersados. Dicho procedimiento disminuye el tamaño
promedio de los liposomas. Alternativamente, la extrusión puede
usarse como un paso final durante la producción de los liposomas. La
patente estadounidense nº 4.529.561 descubre un procedimiento de
extrusión de liposomas bajo presión a través de una membrana de
tamaño de poro uniforme para mejorar la uniformidad de tamaño.
La preparación de liposomas que contengan un
fotosensibilizador o un compuesto quimioluminiscente hidrofóbico o
amfifílico disuelto en la bicapa lipídica puede llevarse a cabo en
una variedad de procedimientos, incluyendo un procedimiento descrito
por Olsen et al., Biochemica et Biophisica Acta
557(9), 1979. En resumen, se seca una mezcla de lípidos que
contiene el compuesto apropiado en un solvente orgánico tal como
cloroformo hasta obtener una película delgada sobre las paredes de
un frasco de vidrio. La película lipídica se hidrata en un tampón
apropiado mediante agitación o haciéndola girar (vortexing).
A continuación, la suspensión de lípido se extruye a través de una
serie de membranas de filtro de policarbonato que tienen tamaño de
poros sucesivamente más pequeños. Por ejemplo, 2,0, 1,0, 0,8, 0,6,
0,4 y 0,2 micrones. Es deseable el filtrado repetido a través de
cualquiera de los filtros, y en particular a través de los filtros
más pequeños. Los liposomas pueden purificarse mediante, por
ejemplo, filtración en gel, tal como a través de una columna de
Sephacryl S-1000. La columna puede eluirse con
tampón y recogerse los liposomas. El almacenamiento en frío prolonga
la vida en almacenamiento de los liposomas producidos mediante este
procedimiento. Alternativamente, el fotosensibilizador o el
compuesto quimioluminiscente puede añadirse a la suspensión líquida
a continuación de la preparación de los liposomas.
El marcaje de gotas y liposomas implicará a
menudo, por ejemplo, la inclusión de grupos tiol, o maleimida, o
biotina, sobre las moléculas que forman la bicapa lipídica. Los
fotosensibilizadores, moléculas quimioluminiscentes, o miembros de
sbp podrían, entonces, unirse a la superficie mediante reacción de
las partículas con uno de estos materiales que está unido,
respectivamente, a un compuesto reactivo sulfhidrilo, un grupo
sulfhidrilo, o avidina. Los grupos reactivos sulfhidrilo incluyen
los reactivos alquilantes tales como la bromoacetamida y la
maleimida.
Los miembros de un sbp pueden atraerse hacia la
superficie de las partículas liposómicas mediante interacciones
hidrofóbicas débiles, no obstante, dichas interacciones no bastan
generalmente para soportar la fuerza de rotura que se encuentra
durante la incubación y lavado. Es preferible unir covalentemente
los miembros de un sbp a una partícula liposómica que se ha
funcionalizado, por ejemplo, mediante el uso de
DOPE-MCC, tal como se ha mostrado más arriba,
combinando dicho liposoma con el miembro de un sbp seleccionado
funcionalizado con un grupo mercaptano. Por ejemplo, si el miembro
de un sbp es un anticuerpo, éste podría hacerse reaccionar con
anhídrido S-acetil-mercaptosuccínico
(SAMSA) e hidrolizarse para proporcionar un anticuerpo modificado
con sulfhidrilo.
Partículas de látex: "Látex"
significa un material polimérico particulado insoluble en agua y que
puede suspenderse en agua, que usualmente tiene unas dimensiones de
partícula de 20 nm a 20 mm, más preferiblemente de 100 a 1000 nm de
diámetro. El látex es frecuentemente un polietileno sustituido, tal
como: poliestireno-butadieno, poliacrilamida
poliestireno, poliestireno con grupos amino, poli-ácido acrílico,
poli-ácido metacrílico, acrilonitrilo-butadieno,
copolímeros de estireno, acetato de
polivinilo-acrilato, polivinil pirridina,
copolímeros de vinilo-cloruro de acrilato, y
similares. Se prefieren los polímeros no entrecruzados de estireno y
estireno carboxilado, o estireno funcionalizado con otros grupos
activos tales como amino, hidroxilo, halo, y similares.
Frecuentemente se usarán copolímeros de estirenos sustituidos con
dienos, tales como butadieno.
La asociación del fotosensibilizador o del
compuesto quimioluminiscente con las partículas de látex usadas en
la presente invención podría implicar la incorporación durante la
formación de las partículas mediante polimerización, pero
habitualmente implicará la incorporación dentro de partículas
preformadas, habitualmente mediante disolución no covalente dentro
de las partículas. Habitualmente se empleará una solución del
compuesto quimioluminiscente o sensibilizador. Los disolventes que
podrían utilizarse incluyen alcoholes, incluyendo el etanol,
etilenglicol, y alcohol bencílico; amidas tales como la
dimetilformamida, formamida, acetamida, y tetrametilurea, y
similares; sulfóxidos tales como el dimetilsulfóxido y el sulfolano;
y éteres tales como el carbitol, etilcarbitol, dimetoxietano, y
similares; y el agua. El uso de solventes que tienen puntos de
ebullición elevados, en los que las partículas son insolubles,
permite el uso de temperaturas elevadas para facilitar la disolución
de los compuestos en las partículas, y son particularmente
apropiados. Los disolventes podrían usarse solos o en combinación.
Los disolventes particularmente preferidos para incorporar el
fotosensibilizador son aquellos que no atenúan el estado de triplete
excitado del fotosensibilizador, bien debido a sus propiedades
intrínsecas o porque pueden retirarse subsiguientemente de las
partículas gracias a su capacidad para ser disueltos en un
disolvente, como el agua, que es insoluble en las partículas. Se
prefieren los disolventes aromáticos, y, en general, solventes que
son solubles en la partícula. Para incorporar los compuestos
quimioluminiscentes en las partículas debería seleccionarse un
disolvente que no interfiera con la luminiscencia, debido a sus
propiedades intrínsecas o a su capacidad para ser retirados de las
partículas. Frecuentemente, también se preferirán los disolventes
aromáticos. Los disolventes aromáticos típicos incluyen el
dibutilftalato, el benzonitrilo, el naftonitrilo, el
dioctiltereftalato, diclorobenceno, difeniléter, dimetoxibenceno,
etc.
Excepto cuando el fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente está covalentemente unido a las partículas, será
habitualmente preferible usar fotosensibilizadores o compuestos
quimioluminiscentes electrónicamente neutros. Es preferible que el
medio líquido seleccionado no reblandezca las cuentas de polímero
hasta el punto de hacerlas pegajosas. Una técnica preferida
comprende suspender las partículas de látex seleccionadas en un
medio líquido en el cual el fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente tienen al menos una solubilidad limitada.
Preferiblemente, las concentraciones del fotosensibilizador y del
compuesto quimioluminiscente en el medio líquido se seleccionarán
para proporcionar partículas que tienen la máxima eficiencia en la
formación del oxígeno singlete y el máximo rendimiento cuántico de
emisión a partir del compuesto quimioluminiscente en el medio, sin
embargo, a veces, se preferirán soluciones menos concentradas. La
distorsión o disolución de las partículas en el disolvente puede
evitarse mediante la adición de un codisolvente miscible en el que
las partículas son insolubles.
Generalmente, la temperatura empleada durante el
proceso se escogerá para maximizar la capacidad de formación de
oxígeno singlete de las partículas marcadas con el
fotosensibilizador, y el rendimiento cuántico de las partículas de
compuesto quimioluminiscente, con la condición que las partículas no
deberían de fundirse o agregarse a la temperatura seleccionada.
Normalmente se emplean temperaturas elevadas. Las temperaturas para
el procedimiento generalmente irán desde 20ºC hasta 200ºC, más
usualmente desde 50ºC hasta 170ºC. Se ha observado que algunos
compuestos que son prácticamente insolubles a temperatura ambiente,
son solubles a elevadas temperaturas en, por ejemplo, alcoholes de
bajo peso molecular, tales como etanol y etilenglicol, y similares.
Se ha observado que las partículas de látex modificadas mediante
carboxilación toleran alcoholes de bajo peso molecular a dichas
temperaturas.
Un miembro de un sbp podría estar físicamente
adsorbido sobre la superficie de la partícula de látex, o podría
estar covalentemente unido a la partícula. En los casos en los que
el miembro de un sbp sólo está débilmente unido a la superficie de
la partícula de látex, la unión podría ser, en ciertos casos,
incapaz de soportar la fuerzas de rotura de
partícula-a-partícula que se
encuentran durante la incubación y lavados. Por tanto, se podría
unir, preferiblemente, de manera covalente los miembros de un sbp a
las partículas de látex en condiciones que minimizarán la adsorción.
Esto podría conseguirse mediante activación química de la superficie
del látex. Por ejemplo, puede formarse el éster de
N-hidroxisuccinimida de los grupos carboxílicos de
la superficie sobre las partículas activadas para reducir la unión
no específica de componentes del ensayo sobre la superficie de la
partícula, y, a continuación, se ponen en contacto con un engarce
que tiene grupos aminos que reaccionarán con los grupos éster o
directamente con un miembro de un sbp que tiene un grupo amino. El
engarce usualmente se seleccionará para reducir la unión no
específica de los componentes del ensayo a la superficie de la
partícula, y preferiblemente proporcionará una funcionalidad
apropiada tanto para el anclaje a la partícula de látex y el anclaje
al miembro de un sbp. Los materiales apropiados incluyen el
aminodextrano maleimidatado (MAD), la polilisina, los
aminosacáridos, y similares. El MAD puede prepararse tal como
describen Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
75(7): 3143, 1978.
En un procedimiento, primero se une el MAD a
partículas de látex que contienen carboxilos usando una carbodiimida
soluble en agua, por ejemplo,
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil
carbodiimida. A continuación, las partículas recubiertas se
equilibran en varios reactivos para prevenir la unión no específica.
Dichos reactivos incluyen proteínas, tales como la gammaglobulina
bovina (BGG) y un detergente, tal como el Tween-20,
Triton X-100, y similares. Entonces se añade un
miembro de un sbp que tiene un grupo sulfhidrilo, o convenientemente
modificado para introducirle un grupo sulfhidrilo, a la suspensión
de partículas, a partir de lo cual, se forma un enlace covalente
entre el miembro de un sbp y el MAD sobre las partículas. A
continuación, puede retirarse cualquier exceso de miembro de un sbp
que no haya reaccionado mediante lavado.
\newpage
Soles de metal: son aquellas partículas
formadas por un metal pesado, es decir, un metal con número atómico
superior a 20, tal como un metal del Grupo IB, por ejemplo, oro o
plata, o chalcogenos tales como selenio o telurio.
Las partículas de sol de metal están descritas,
por ejemplo, por Leuvering en la patente US Nº 4.313.734, cuyo
descubrimiento se incorpora aquí en su totalidad por referencia.
Dichos soles incluyen una dispersión acuosa coloidal de un metal,
compuesto metálico, o núcleo polimérico recubierto con un metal o
compuesto metálico.
Los soles de metal podrían ser de metales o
compuestos metálicos, tales como óxidos metálicos, hidróxidos
metálicos, y sales de metales, o de un núcleo polimérico recubierto
con metales o compuestos metálicos. Son ejemplo de tales metales el
platino, oro, plata, mercurio, plomo, paladio, y cobre y de tales
compuestos metálicos el yoduro de plata, el bromuro de plata, el
oxido hidratado de cobre, el óxido de hierro, el hidróxido de hierro
u óxido hidratado, el hidróxido de aluminio o el óxido hidratado, el
hidróxido de cromo o el óxido hidratado, el óxido de vanadio, el
sulfuro de arsénico, el hidróxido de manganeso, el sulfuro de plomo,
el sulfuro de mercurio, el sulfato de bario y el dióxido de titanio.
En general, los metales y compuestos metálicos útiles podrían ser
fácilmente demostrados mediante técnicas conocidas.
A veces es ventajoso usar soles formados por
partículas dispersas consistentes en un núcleo polimérico recubierto
con los metales o compuestos metálicos anteriormente mencionados.
Estas partículas tienen propiedades similares a las de la fase
dispersa de metales puros o compuestos metálicos, pero el tamaño,
densidad y contacto metálico pueden combinarse óptimamente.
Las partículas de soles metálicos pueden
prepararse de un gran número de formas que son conocidas en sí
mismas. Por ejemplo, para la preparación de sol de oro Leuvering se
refiere a un artículo de G. Frens en Nature Physical Sciences
241: 20 (1973).
Las partículas de soles metálicos pueden
modificarse para contener varios grupos funcionales, tal y como se
describe más arriba, para unirse a un miembro de un sbp, o a un
fotosensibilizador, o a un compuesto quimioluminiscente. Por
ejemplo, pueden usarse agentes de enlace poliméricos para recubrir
las partículas, tales como polímeros que contienen grupos tiol que
se unen fuertemente a muchos metales pesados, o agentes sililantes
que pueden unirse y formar recubrimientos poliméricos como, por
ejemplo, mediante reacción de partículas metálicas con
trialcoxiaminoalquisilanos, tal como se describe en la solicitud de
patente EPO 84400952.2 de Advanced Magnetics, para recubrir
partículas magnéticas.
Cristalitos de colorante: microcristales
de colorantes sólidos, insolubles en agua, puros o mezclados,
preferiblemente colorantes que pueden servir como los
fotosensibilizadores descritos más arriba. Los cristalitos de
colorantes útiles en la presente invención tienen un rango de tamaño
de 20 nm hasta 20 \mum.
Un procedimiento para preparar cristalitos de
colorante está descrito en la patente estadounidense nº 4.373.932
(Gribnau et al .), el descubrimiento de la cual se
incorpora en su totalidad en ésta por referencia. Gribnau describe
partículas coloidales de colorante y dispersiones acuosas de un
colorante o pigmento hidrofóbico, el cual podría tener un componente
inmunoquímicamente reactivo unido directa o indirectamente. Las
partículas de colorante se preparan en general dispersando un
colorante en agua y centrifugando a continuación. Se obtiene un
precipitado de colorante y se resuspende en agua, a la que se añaden
cuentas de vidrio. Esta suspensión se hace rodar durante varios días
a temperatura ambiente. Se decanta el líquido y se centrifuga, y se
obtienen las partículas de colorante después de aspirar el
líquido.
Otro procedimiento para preparar cristalitos de
colorante es mediante adición lenta al agua de una disolución del
colorante en un disolvente miscible con agua. Otro procedimiento es
mediante sonicación de una suspensión del colorante sólido en
agua.
La unión de miembros de sbp a las partículas de
colorante puede conseguirse mediante adsorción directa o indirecta,
o mediante anclaje químico covalente. Este último está gobernado por
la presencia de grupos funcionales apropiados en cualquier material
de recubrimiento y en el colorante. Por ejemplo, pueden introducirse
grupos funcionales sobre la superficie del cristalito de colorante
acoplando un compuesto que contenga un grupo amino aromático
diazotizado, y el grupo funcional deseado a un grupo fenólico o
anilino del colorante.
Cuando el colorante tiene un grupo carboxilo, el
cristalito de colorante puede activarse mediante una carbodiimida y
acoplarse a un componente amino primario. Los grupos amino primarios
alifáticos y los grupos hidroxilo pueden activarse, por ejemplo, con
bromuro de cianógeno o di o triazinas halosustituidas, después de lo
cual puede tener lugar el anclaje con un componente amino primario o
con, por ejemplo, un componente que contenga un grupo -SH o -OH.
También puede hacerse uso de compuestos reactivos bifuncionales. Por
ejemplo, puede usarse glutaraldehído para el acoplamiento mutuo de
componentes amino primarios del colorante y un miembro de un sbp, y,
por ejemplo, puede usarse un reactivo
hetero-bifuncional tal como el
N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato
para el acoplamiento de un componente amino primario a un componente
que contenga un grupo tiol.
Compuesto quimioluminiscente: una
sustancia que sufre una reacción química con el oxígeno singlete
para formar un intermediario metaestable que puede descomponerse con
la emisión simultánea o subsiguiente de luz dentro del rango de
longitud de onda de 250 a 1200 nm. La emisión ocurrirá habitualmente
sin la presencia de un aceptor de energía o catalizador para causar
la descomposición y emisión de luz. Preferiblemente, el
intermediario se descompone espontáneamente sin calentamiento o sin
la adición de reactivos secundarios después de su formación. No
obstante, para algunos compuestos quimioluminiscentes podría
requerirse la adición de un reactivo después de la formación del
intermedio, o el uso de una temperatura elevada, para acelerar la
descomposición. Los compuestos quimioluminiscentes son habitualmente
compuestos ricos en electrones que reaccionan con el oxígeno
singlete, frecuentemente con la formación de dioxetanos o
dioxetanonas. Son ejemplos de dichos compuestos los éteres de enol,
las enaminas, los 9-alquildenexantanos, las
9-alquilideno-N-alquilacridinas,
los aril-vinil-éteres, los dioxenos, los
arilimidazoles, y la lucigenina. Otros compuestos
quimioluminiscentes generan intermedios, a partir de la reacción con
oxígeno singlete, que subsiguientemente reaccionan con otro reactivo
con emisión de luz. Son ejemplo de compuestos las hidrazidas tales
como el luminol y los ésteres de oxalato.
Los compuestos quimioluminiscentes de interés
generalmente emitirán en longitudes de onda superiores a los 300
nanómetros, y usualmente por encima de los 400 nm. Los compuestos
que solos, o junto con una molécula fluorescente, emiten luz a
longitudes de onda más allá de la región en que los compuestos del
suero absorben luz serán de especial uso en la presente invención.
La fluorescencia del suero decae rápidamente por encima de los 500
nm y pasa a ser relativamente insignificante por encima de 550
nm.
Por tanto, cuando el analito está en el suero,
los compuestos quimioluminiscentes que emiten luz por encima de 550
nm, preferiblemente por encima de 600 nm, son de especial interés.
Con objeto de evitar la autosensibilización del compuesto
quimioluminiscente, es preferible que el compuesto
quimioluminiscente no absorba la luz usada para excitar el
fotosensibilizador. Puesto que generalmente será preferible excitar
el sensibilizador con longitudes de onda superiores a 500 nm, será,
por tanto, deseable que la absorción de luz por parte del compuesto
quimioluminiscente esté muy poco por encima de 500 nm.
Cuando se desee la emisión de longitudes de onda
largas a partir del compuesto quimioluminiscente, puede usarse un
emisor de longitudes de onda larga tal como un pireno, unido al
compuesto quimioluminiscente. Alternativamente, puede incluirse una
molécula fluorescente en el medio que contiene el compuesto
quimioluminiscente. Las moléculas fluorescentes preferidas serán
excitadas por el compuesto quimioluminiscente activado, y emitirán
en una longitud de onda superior a la longitud de emisión del
compuesto quimioluminiscente, habitualmente superior a 550 nm.
También es usualmente deseable que las moléculas fluorescentes no
absorban en las longitudes de onda usadas para activar el
fotosensibilizador. Los ejemplos de colorantes útiles incluyen la
rodamina, el etidio, el dansilo, el Eu(fod)_{3}, el
Eu(TTA)_{3}, el Ru(bpy)_{3}^{++}
(en donde el bpy = 2,2'-dipiridil), etc. En
general, estos colorantes actúan como aceptores en los procesos de
transferencia de energía, y preferiblemente tienen rendimientos
cuánticos fluorescentes elevados, y no reaccionan rápidamente con el
oxígeno singlete. Pueden incorporarse en partículas simultáneamente
a la incorporación del compuesto quimioluminiscente en las
partículas.
Las olefinas ricas en electrones generalmente
tienen un grupo donador de electrones en conjugación con la
olefina:
en donde A es un grupo donante de electrones tal
como, por ejemplo, N(D)_{2}, OD,
p-[C_{6}H_{4}N(D)_{2}]_{2}, furanilo,
N-alquilimidazola,
N-alquilpirrolilo, 2-indolilo, etc.,
donde D puede ser, por ejemplo, alquilo o arilo, y donde A está
unido directamente al carbono olefínico o unido mediante la
intermediación de otros enlaces dobles conjugados. Las otras
valencias de los átomos C en la olefina 1 son sustituyentes
de 1 a 50 átomos, los cuales podrían tomarse juntos para formar uno
o más anillos, que están fusionados o no fusionados, por ejemplo,
cicloalquilo, fenilo, 7-norbornilo, naftilo,
antracilo, acridanilo, adamantilo, y
demás.
Los enoléteres de uso en esta invención
generalmente tienen la estructura:
\newpage
en donde las D_{1} se toman independientemente,
y se seleccionan del grupo que consiste en H y sustituyentes de 1 a
50 átomos, preferiblemente, arilo, hidroxiarilo, aminoarilo,
t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo, etc., y podría
tomarse junto con uno o ambos de los átomos de carbono para formar
un anillo tal como un cicloalqueno, adamantilideno,
7-norbornilideno y similar, y D_{2} es
preferiblemente alquilo o arilo. Son ejemplo de enoléteres, a modo
de ilustración y no de limitación, el
2,3-diaril-4,5-dihidrodioxenos:
en donde X = O, S ó ND_{2}, y Ar y Ar' son
arilo, incluyendo el arilo sustituido en donde al menos un
sustituyente está presente como grupo amino, éter, o
hidroxilo.
9-(dialcoximetilideno)-xanteno:
Alcoxivinilpireno:
9-alcoximetilideno-10-alquilacridina:
y
\newpage
Los vinilsulfuros de uso en esta invención
generalmente incluyen los enoléteres antes mencionados, en donde el
átomo de oxígeno se sustituye por un átomo de azufre.
Las enaminas de uso en la presente invención
generalmente tienen la estructura:
en donde D_{3} podría ser independientemente
alquilo o arilo, y el resto de sustituyentes en la olefina se
seleccionan del grupo que consiste en H y sustituyentes de 1 a 50
átomos, preferiblemente arilo, hidroxiarilo, aminoarilo,
t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo,
etc.
Son ejemplo de enaminas, a modo de ilustración y
no de limitación,
dialquilaminovinilpireno:
dialquilaminovinil-9,10-difenilantraceno
en donde \Phi =
fenilo,
y demás
Las
9-alquilideno-N-alquilacridinas
generalmente tienen la estructura:
en donde D_{4} es alquilo, y el resto de
sustituyentes en la olefina se seleccionan del grupo que consiste en
H y sustituyentes de 1 a 50 átomos, preferiblemente arilo,
alcoxiarilo, aminoarilo, t-alquilo, H, alcoxi,
heteroarilo, etc., y podrían tomarse juntos para formar un anillo
tal como, por ejemplo, adamantilo, ciclopentilo,
7-norbornilo, y similares. Son ejemplo de acridinas,
a modo de ilustración y no de limitación, la
9-bencilideno-10-metilacridina
sustituida y
9-difenilmetileno-10-metilacridina
descritas por Singer et al., J. Am. Chem. Soc.
102: 3823 (1983), y McCapra, Chem. Comm. 944 (1977),
9-metilideno-10-metilacridinas
descritas por E. White, Chem. Letters 1491
(1979).
Los dioxetanos formados por la reacción del
oxígeno singlete con la estructura "chemiluneral", donde
los sustituyentes sobre los átomos de carbono (C) son aquellos
presentes en la olefina correspondiente:
algunos de los cuales se descomponen
espontáneamente, otros mediante calor y/o catálisis, habitualmente
mediante un aceptor de electrones ricos en energía, con la emisión
de luz. En algunos casos, el dioxetano se convierte espontáneamente
en un hidroperóxido, después de lo cual se requiere un pH
básico para volver a formar el dioxetano y permita la descomposición
y emisión de
luz.
Otra familia de compuestos quimioluminiscentes
son las
2,3-dihidro-1,4-ftaloazinedionas.
El compuesto más popular es el luminol, que es el compuesto
5-amino. Otros miembros de la familia incluyen los
sustituidos 6-amino,
5-amino-6,7,8-trimetoxi,
y el análogo dimetilamino[ca]benzo. Estos compuestos
son oxidados por el oxígeno singlete, en una reacción multietapa que
resulta en su descomposición, con la formación de un derivado
ftalato y emisión de luz.
Otra familia de compuestos quimioluminiscentes
son las 2,4,5-trifenilimidazolas, con la lofina como
nombre común del compuesto progenitor. Los análogos
quimioluminiscentes incluyen los sustituyentes
para-dimetilamino y -metoxi.
El siguiente grupo de compuestos
quimioluminiscentes incluye los compuestos
bis-arileno, incluyendo el
bis-9,9'-acridilideno y el derivado
10,10'-dimetilo del mismo descritos por Singer,
J. Org. Chem. 41: 2685 (1976), lucigenina, y
bis-9,9'-xantilidina.
Otros compuestos quimioluminiscentes que
satisfacen los requisitos mencionados más arriba podrían encontrarse
en la solicitud de patente europea nº 0.345.776, publicada el 13 de
diciembre de 1989.
Compuesto quimioluminiscente fotoquímicamente
activable (PACC): una sustancia que se somete a una reacción
química con la excitación directa o sensibilizada o que reacciona
con el oxígeno singlete para formar una producto de reacción
metaestable que es capaz de descomponerse con la emisión simultánea
o subsiguiente de luz, habitualmente en el rango de longitud de onda
de 250 a 1200 nm. El término "fotoactivable" incluye
"fotoquímicamente activable". Los PACC preferidos en la
presente invención son aquellos que reaccionan con el oxígeno
singlete para formar dioxetanos o dioxetanonas. Éstas últimas son
usualmente olefinas ricas en electrones. Son ejemplo de dichas
olefinas ricas en electrones los enoléteres, enaminas,
9-alquilideno-N-alquilacridinas,
arilviniléteres, dioxenos, arilimidazoles,
9-alquilideno-xantanos, y
lucigenina. Otros compuestos que se incluyen en el término
"PACC" incluyen el luminol, y otras ftalohidrazidas, y
compuestos quimioluminiscentes que están protegidos de sufrir una
reacción quimioluminiscente gracias a que están protegidos con un
grupo protector fotoquímicamente lábil, incluyendo dichos
compuestos, por ejemplo, la luciferina de luciérnaga, acuaforina,
luminol, etc.
Los PACC de interés preferiblemente emitirán con
una longitud de onda superior a los 300 nanómetros, preferiblemente
superior a 500 nanómetros, y más preferiblemente superior a 550 nm.
Los compuestos que absorben y emiten luz con una longitud de onda
más allá de la región donde los componentes de la muestra
contribuyen significativamente a la absorción de luz serán de
especial uso en la presente invención. La absorción del suero decae
rápidamente por encima de los 500 nm, y pasa a ser insignificante
por encima de 600 nm; por tanto, serán de especial interés los
compuestos quimioluminiscentes que emiten luz por encima de 600 nm.
No obstante, los compuestos quimioluminiscentes que absorben a una
longitud de onda más cortas son útiles cuando la abosrbancia de
interferencia de la muestra está ausente, o cuando se usa un
fotosensibilizador que absorbe luz de longitud de onda superior, y,
acto seguido, activa el compuesto quimioluminiscente.
Los PACC de esta invención se usan como marcas y
están asociados con un miembro de un sbp.
Los PACC 1 de más abajo generalmente no
contiene grupos CH o NH alílicos.
Las olefinas ricas en electrones apropiadas como
PACC de la presente invención están dentro del ámbito de los
"Compuestos Quimioluminiscentes" de la presente Sección. Los
PACC habitualmente no tienen ningún átomo portador de un átomo de
hidrógeno que esté unido directamente a la olefina, a menos que el
átomo esté en una posición que no pueda acomodar un doble enlace,
tal como en una posición de cabeza de puente en un sistema anular
bicíclico pequeño. Las olefinas más preferidas son aquéllas que
generan un dioxetano que decae rápidamente a temperatura ambiente
(menos de 60 minutos, preferiblemente menos de 5 minutos,
deseablemente menos de 30 s). Los dioxetanos podrían ser
luminiscentes solos o en conjunción con un aceptor de energía
fluorescente.
Los enoléteres apropiados como PACC de la
presente invención están también dentro del ámbito "Compuesto
Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son compuestos de
enoléteres particularmente útiles aquellos con un arilo en el mismo
carbono que el éter, en los que el anillo arilo es sustituido por un
grupo donante de electrones en una posición que proporciona
fluorescencia. El grupo donante de electrones puede ser, por
ejemplo, m-hidroxifenil,
m-dimetilaminofenil,
1-(5-aminonaftil), pirilo,
1-(3-hidroxipirilo), antracilo, crisilo, etc. Uno o
ambos grupos en la posición 2 pueden ser arilos, en los que la
cetona formada mediante el reemplazo del carbono 1 con oxígeno es
fluorescente, por ejemplo, \beta-naftilo, o
2-antrilo. Son ejemplos de enoléteres, a modo de
ilustración y no de limitación:
en donde X_{1} es H,
OC(O)CH_{3}, OCH_{3}, OH, descrito por Bronstein
et al ., en la patente estadounidense nº
4.956.477;
descrito por Bronstein et al ., en
la patente estadounidense nº
4.956.477;
en donde X_{2} es H, OH,
N(CH_{3})_{2}, u OCH_{3}, descrito por P.
Schaap, J. Am. Chem. Soc. 104: 3504 (1982) y P.
Schaap, Photochem and Photobiology 30: 35
(1979);
en donde X_{2} se define como más arriba,
X_{3} es H, OCH_{3} o N(CH_{3})_{2}, descrito
por P. Schaap, informe para la U.S. Army Research Office, 15 de
octubre de 1986, y S. D. Gagnon, tesis doctoral, Wayne State
University
(1982);
en donde X_{4} = O, S, CH_{3}N o PhN, e Y =
O, S, o CH_{3}N, y Ph = fenilo, descrito por P. Schaap, Report to
Office of Naval Research, 17 de marzo de
1987;
descrito por P. Schaap, informe para la U.S. Army
Research, 15 de octubre de
1986.
Las enaminas apropiadas como PACC de la presente
invención también se encuentran en el ámbito "Compuesto
Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son ejemplo de
enaminas particularmente útiles, a modo de ejemplo y no de
limitación, los anteriores enoléteres 3-5 con
N(CH_{3})_{2} en lugar de OCH_{3}. Aún otro
ejemplo es
Las
9-alquilideno-N-alquilacridinas
apropiadas como PACC también se encuentran dentro del ámbito
"Compuesto Quimioluminiscente" de la presente Sección. Son
particularmente útiles aquellos de la Fórmula 7 en donde el
resto de sustituyentes en la olefina son fenilo, naftilo,
fenantrilo, m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo,
metoxi, N-morfoleno, y podrían tomarse juntos para
formar un anillo tal como, por ejemplo, adamantilo,
N-metiacridanilida, xantanilidina,
1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno), y similares. Son ejemplos determinados de 9-alquilideno-N-alquilacridinas útiles como marcas en la presente invención, a modo de ilustración y no de limitación:
1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno), y similares. Son ejemplos determinados de 9-alquilideno-N-alquilacridinas útiles como marcas en la presente invención, a modo de ilustración y no de limitación:
descritos por Singer, J. Org. Chem.
41: 2685
(1976);
descrito por E. White, Chem. Letters;
12: 1491
(1979);
en donde R_{4} y R_{5} son independientemente
H o fenilo, descrito por Singer et al., J. Am. Chem.
Soc. 102: 3823
(1983);
descrito por McCapra, Chem. Comm.; N24,
944 (1977) y Singer, et al .,
ibid .;
descrito por McCapra,
ibid .;
descrito por McCapra,
ibid .
Las partes relevantes de las referencias
anteriores se incorporan en ésta por referencia.
Los
9-alquilideno-xantanos útiles como
PACC de la presente invención generalmente tienen la estructura:
donde los sustituyentes en la olefina se
seleccionan del grupo que consiste en H y sustituyentes de 1 a 50
átomos, preferiblemente fenilo, naftilo, fenantrilo,
m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi,
N-morfoleno, y podrían tomarse juntos para formar un
anillo tal como, por ejemplo, adamantilo,
N-metilacridanilido, xantanilidino,
1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno),
y similares, por ejemplo,
9-fenil-metiliden-xanteno.
Otra familia de PACC es la
2,3-dihidro-1,4-ftaloazinedionas.
El compuesto más conocido es el luminol, que es el compuesto
5-amino. Otros miembros de la familia incluyen el
5-amino-6,7,8-trimetoxi
y el análogo dimetilamino[ca]benzo. Debería destacarse
que el luminol se ha usado como marca en ensayos; no obstante, la
excitación del luminol se ha conseguido químicamente, no mediante
fotoactivación como es el caso en la presente invención. Estos
compuestos son oxidados hasta las
1,4-ftalazinidionas por el oxígeno singlete, y bajo
subsiguiente reacción con superóxido o peróxido de hidrógeno se
descomponen con emisión de luz.
Otra familia de PACC son la
2,4,5-trifenilimidazolas, con lofina como nombre
común para el compuesto progenitor. Los análogos quimioluminiscentes
incluyen los sustituyentes para-dimetilamino y
-metoxi.
Otros PACC que satisfacen los requisitos
detallados más arriba podrían encontrarse en la solicitud de patente
europea nº 0.345.776 publicada el 13 de diciembre de 1989.
Compuesto quimioluminiscente protegido: son
aquellos PACC que tienen un grupo protector fotoremovible. Cuando se
retira el grupo protector mediante fotoactivación, el compuesto
emite luz espontáneamente o a partir de su activación con
componentes que están presentes en el medio de ensayo. Los grupos
protectores fotoremovibles incluyen, a modo de ejemplo y no de
limitación, el o-nitrobencilo, el
o-acilfeniletilo, el alcoxibencilo, y similares,
habitualmente unidos a un heteroátomo del PACC. Son ejemplo de PACC
que pueden formar parte de los compuestos quimioluminiscentes
protegidos aquellas olefinas ricas en electrones mencionadas más
arriba. Son ejemplos particulares, a modo de ilustración, de
compuestos quimioluminiscentes protegidos según este aspecto de la
invención:
En el caso de compuestos quimioluminiscentes
protegidos, cualquier reactivo necesario estará presente antes de la
fotoactivación o fotolisis. Dichos reactivos pueden incluir enzimas
y sustratos para dichos enzimas. En algunos casos, el control del
pH es lo único que se precisa. Otros agentes son la fosfatasa
alcalina, la peroxidasa de rábano silvestre, el peróxido de
hidrógeno, etc. Aquellos especialistas en la técnica apreciarán
reactivos adicionales a partir de la selección de cualquier
compuesto quimioluminiscente protegido apropiado, guiados por los
principios anteriores. Por ejemplo, en el caso del compuesto
1 podría usarse la luciferasa de luciérnaga y su sustrato
luciferina. En el caso del compuesto 2 tan sólo es necesario
mantener un medio básico (pH > 9). En el caso de
2A, podrían usarse el peróxido de hidrógeno y la peroxidasa
de rábano silvestre.
Materiales auxiliares: frecuentemente se
emplearán varios materiales auxiliares en el ensayo según la
presente invención. Por ejemplo, los tampones estarán normalmente
presentes en el medio de ensayo, así como los estabilizadores para
el medio de ensayo y componentes del ensayo. Frecuentemente, además
de estos aditivos, podrían incluirse proteínas tales como albúminas,
disolventes orgánicos tales como formamida, sales de amonio
cuaternarias, policationes tales como el sulfato dextrano,
tensioactivos, en concreto tensioactivos no iónicos, potenciadores
de la unión, por ejemplo polialquilenglicoles o similares. Cuando el
fotosensibilizador es activado químicamente en vez de mediante
irradiación, a menudo se incluirá el peróxido de hidrógeno como un
reactivo auxiliar. Cuando sea deseable desplazar la longitud de
emisión del compuesto quimioluminiscente hacia longitudes de onda
más largas, o catalizar la descomposición de su forma activada por
oxígeno, podría emplearse una molécula fluorescente.
Total o parcialmente secuencialmente:
cuando la muestra y diversos agentes utilizados en la presente
invención se combinan de manera distinta a concomitantemente
(simultáneamente), uno o más podrían combinarse con uno o más de los
agentes restantes para formar una subcombinación. Cada
subcombinación puede entonces someterse a uno o más pasos del
presente procedimiento. Por tanto, cada una de las subcombinaciones
puede incubarse en condiciones que consigan uno o más de los
resultados deseados.
Aceptor de energía: también denominado en
ésta como aceptor de energía fluorescente. Un cromóforo que tiene
una absorción sustancial por encima de los 310 nm, normalmente por
encima de 350 nm, y preferiblemente superior a aproximadamente 400
nm. La elección del aceptor de energía también estará gobernada por
el PACC determinado. El aceptor de energía debería ser capaz de
absorber la luz emitida por el PACC. Preferiblemente, el máximo de
absorción del aceptor de energía debería estar en longitudes de onda
similares a la del máximo de emisión del compuesto
quimioluminiscente. Es deseable un elevado coeficiente de extinción,
habitualmente en exceso de 10, preferiblemente en exceso de
10^{3}, y particularmente preferido en exceso de 10^{4}.
Diversas moléculas diferentes útiles como aceptor
de energía son descritas por Ullman et al ., I, II, IV
y V, en las columnas 8 y 9, las partes relevantes de las cuales se
incorporan aquí por referencia. Generalmente, el aceptor de energía
es un compuesto fluorescente o emisor de fluorescencia, pero también
son útiles los aceptores de energía que tienen una muy débil
fluorescencia o que no la tienen.
Un grupo de emisores de fluorescencia que tienen
un cierto número de las propiedades deseables descritas más arriba
son los colorantes de xanteno, el cual incluye las fluoresceínas
derivadas del
3,6-dihidroxi-9-fenil-xanthidrol,
y las rosaminas y rodaminas derivadas del
3,6-diamino-9-fenil-xanthidrol.
Las rodaminas y fluoresceínas tienen un grupo
9-o-carboxifenilo, y son derivados
del
9-o-carboxifenil-xanthidrol.
Estos compuestos están comercialmente disponibles
con sustituyentes en el grupo fenilo, los cuales pueden usarse como
sitio de unión o como la funcionalidad de unión. Por ejemplo, están
disponibles compuestos de fluoresceína sustituidos con amino e
isotiocianato.
Las naftilaminas son otro grupo de compuestos
fluorescentes que tienen un grupo amino en la posición alfa o beta,
habitualmente en la posición alfa. Entre los compuestos naftilamino
se incluyen el
1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato,
el
1-anilino-8-naftalenosulfonato,
y el
2-p-toluidinil-6-naftalenosulfonato.
Los precursores de colorantes que son activados
para reaccionar con proteínas incluyen la
3-fenil-7-isocianatocoumarina;
acridinas tales como la 9-isotiocianatoacridina;
N-(p-(2-benzoxatolil)fenil)maleimida;
benzoxadiazolas tales como
y
la
4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola;
estilbenos tales como el
4-dimetilamino-4'-isotiocianatoestilbeno
y
4-dimetilamino-4'-maleimidoestilbeno.
Otros colorantes que pueden ser funcionalizados aún más para
combinar con un miembro de un sbp incluyen el naranja de acridina,
el
7-(p-metoxibenzilamino)-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola;
la N,N'-dioctabeciloxacarbocianina
p-toluensulfonato; pirenos tales como el ácido
8-hidroxi-1,3,6-pirenotrisulfónico,
y el ácido 1-pirenobutírico, la merocianina 540, el
rosa de bengala ("rose bengal"), así como otras
moléculas fluorescentes que pueden conseguirse
fácilmente.
Para ensayos de polinucleótidos pueden usarse una
amplia variedad de aceptores de energía, pero se prefieren aquellos
que tienen fluorescencia potenciada cuando se unen a ácidos
nucleicos de doble hebra. Los colorantes que se intercalan tales
como bromuro de etidio y naranja de acridina son ejemplos típicos.
Un derivado del rutenio desarrollado por Barton (J. Am. Chem.
Soc. (1990) 112: 4960) es particularmente atractivo
debido a que se activa, de manera espectacular, cuando se intercala.
Alternativamente, el aceptor de energía podría unirse a una segunda
sonda de polinucleótidos que puede unirse cerca de la sonda marcada
con el compuesto quimioluminiscente, o el aceptor de energía podría
no estar unido y dispersarse libremente en solución.
Los aceptores de energía que no son fluorescentes
pueden incluir cualquiera de una amplia variedad de colorantes azo,
colorantes cianino, 4,5-dimetoxifluoresceína,
formazanos, indofenoles, y similares.
Un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para determinar un analito. El procedimiento comprende
tratar un medio sospechoso de contener un analito con condiciones
tales que el analito, si está presente, afecta la cantidad de un
fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente que puede
ponerse en estrecha proximidad, en donde el oxígeno singlete de
corta vida generado por el fotosensibilizador puede reaccionar con
el compuesto quimioluminiscente antes de su decaimiento espontáneo.
El procedimiento comprende además medir la intensidad de
luminiscencia producida por el compuesto quimioluminiscente. La
intensidad de luminiscencia producida está relacionada con la
cantidad de analito en el medio. El compuesto quimioluminiscente es
capaz de ser activado por parte del oxígeno singlete, y el
fotosensibilizador cataliza la formación de oxígeno singlete,
habitualmente en respuesta a la fotoexcitación seguida por
transferencia de energía al oxígeno molecular. A menudo, una
superficie se llevará a una estrecha proximidad con el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, en donde la
superficie será preferiblemente la superficie de partículas que
pueden suspenderse. El producto formado por la activación del
compuesto quimioluminiscente se descompone, preferiblemente de
manera espontánea, con emisión de luz.
El procedimiento se basa en un analito que causa
o inhibe que las moléculas del fotosensibilizador y del compuesto
quimioluminiscente estén más próximas entre ellas que la distancia
promedio en el conjunto de la solución del medio de ensayo. Esta
repartición dependerá de la cantidad de analito presente en la
muestra a analizar. Las moléculas de fotosensibilizador que no pasan
a estar asociadas con el compuesto quimioluminiscente producen
oxígeno singlete que es incapaz de alcanzar el compuesto
quimioluminiscente antes de decaer en el medio acuoso. No obstante,
cuando el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pasan
a estar en estrecha proximidad entre ellos en respuesta a la
cantidad de analito, el oxígeno singlete producido a partir de la
irradiación del fotosensibilizador puede activar el compuesto
quimioluminiscente antes de decaer. Debido a que numerosas moléculas
de compuesto quimioluminiscente y/o moléculas de fotosensibilizador
pueden asociarse con una superficie, y debido a que la difusión está
restringida a una superficie, la presencia de una superficie en
conjunción con el fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente puede incrementar la eficiencia del, o la acción
del, oxígeno singlete con el compuesto quimioluminiscente antes de
su decaimiento. Por tanto, se prefiere la utilización de una
superficie que se lleva a la proximidad del compuesto
quimioluminiscente y del fotosensibilizador en función de la
presencia de analitos. El ensayo objeto proporciona un procedimiento
conveniente para detectar y medir una amplia variedad de analitos de
manera simple, eficiente y reproducible, que puede emplear un
equipamiento sencillo para medir la cantidad de luz producida
durante la reacción.
La cantidad de fotosensibilizador que pasa a
estar en estrecha proximidad del compuesto quimioluminiscente se ve
afectada por la presencia de analito en virtud a que el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están cada uno
asociado con un miembro de un sbp. Esto podría conseguirse de un
cierto número de maneras, y el término "asociado con" se define
por ello. El fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente
podrían contener funcionalidades para su anclaje covalente al
miembro de un sbp o a los miembros de un sbp, o grupos capaces de
unirse a miembros de un sbp, podrían contener funcionalidades para
su anclaje al fotosensibilizador y/o compuesto quimioluminiscente.
El anclaje podría conseguirse mediante un enlace directo entre las
dos moléculas, o podría emplearse un grupo de engarce entre un
miembro de un sbp y el fotosensibilizador o compuesto
quimioluminiscente. En otra realización uno de ellos o ambos, el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, pueden unirse
a superficies o incorporarse en partículas, a las que también están
unidos los miembros de un sbp. En ambos casos, cada uno de los
miembros de un sbp es capaz de unirse directa o indirectamente al
analito o a un componente del ensayo cuya concentración se ve
afectada por la presencia del analito. El fotosensibilizador y el
compuesto quimioluminiscente pueden incorporarse dentro de
partículas gracias a que son solubles en, al menos, una fase de las
partículas, en cuyo caso el fotosensibilizador y los compuestos
quimioluminiscentes estarán en concentraciones mucho más elevadas
dentro de la partícula que en el conjunto del medio de ensayo.
Cuando el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente están
unidos covalentemente a partículas, el fotosensibilizador y el
compuesto quimioluminiscente o las partículas, o componentes de las
mismas, son funcionalizados para proporcionar un medio para anclar
el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente y las
partículas. Para partículas que son gotas de aceite o liposomas, el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente pueden unirse a
una o más cadenas hidrocarbonadas largas, teniendo generalmente cada
una al menos de 10 a 30 átomos de carbono. Si las partículas son
gotas de un fluorocarburo, el fotosensibilizador o el compuesto
quimioluminiscente incorporado en estas partículas podría estar
fluorado para mejorar su solubilidad y reducir el intercambio dentro
de otras partículas unidas con la otra marca, y la cadena de
hidrocarburo usada para el engarce se remplazará, preferiblemente,
por una cadena de fluorocarburo. Para partículas fluidas de
silicona, el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente
pueden unirse a un polisiloxano. Con el fin de maximizar el número
de moléculas de fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente
por partícula, usualmente será deseable minimizar la carga y
polaridad del fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente, de
manera que resida dentro de la parte no acuosa de la partícula.
Cuando la partícula es un liposoma y se desea retener el
fotosensibilizador o el compuesto quimioluminiscente en la fase
acuosa del liposoma, se preferirá el uso de fotosensibilizadores o
compuestos quimioluminiscentes que sean muy polares o estén muy
cargados.
No importa como estén unidos el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente, es crítico que
ningún compuesto sea capaz de disociarse de su miembro de un sbp, y
pase a asociarse con el miembro de un sbp unido al otro miembro del
par fotosensibilizador y compuesto quimioluminiscente durante el
curso del ensayo. Por tanto, la disociación de estos compuestos de
sus respectivos miembros de un sbp debería de ser lenta en relación
con el tiempo requerido para el ensayo.
El compuesto quimioluminiscente podría estar
unido a un miembro de un sbp que es capaz de unirse directa o
indirectamente al analito o a un componente del ensayo cuya
concentración se ve afectada por la presencia del analito. El
término "capaz de unirse directa o indirectamente" significa
que la entidad designada puede unirse específicamente a la entidad
(directamente), o puede unirse específicamente a un miembro de un
par de unión específica, o a un complejo de dos o más miembros de un
sbp, que sea capaz de unirse a la otra entidad (indirectamente). La
superficie tiene generalmente un miembro de un sbp unido sobre sí.
Preferiblemente, el compuesto quimioluminiscente está asociado con
la superficie, habitualmente dentro de una partícula que puede
suspenderse. Este miembro de un sbp es generalmente capaz de unirse
directamente o indirectamente al analito o a un receptor del
analito. Cuando los miembros de un sbp asociados con el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente son ambos
capaces de unir el analito, resulta un protocolo de ensayo en
"sándwich". Cuando uno de los miembros de un sbp asociado con
el fotosensibilizador o compuesto quimioluminiscente puede unir
tanto el analito como un análogo del analito, resulta un protocolo
de ensayo competitivo. El anclaje a una superficie o la
incorporación en una partícula del compuesto quimioluminiscente es
gobernado generalmente por los mismos principios descritos más
arriba para el anclaje del fotosensibilizador a, o la incorporación
dentro de, una partícula.
Habitualmente se causa que el fotosensibilizador
active el compuesto quimioluminiscente mediante la irradiación del
medio que contiene los reactivos anteriores. El medio debe
irradiarse con luz que tenga una longitud de onda con energía
suficiente para convertir el fotosensibilizador a un estado
excitado, y, por tanto, para hacerlo capaz de activar el oxígeno
molecular a oxígeno singlete. El estado excitado para el
fotosensibilizador capaz de excitar el oxígeno molecular es
generalmente un estado triplete, el cual es más de aproximadamente
20, habitualmente al menos 23 kcal/mol más energético que el estado
fundamental del fotosensibilizador. Preferiblemente, el medio se
irradia con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente
450 a 950 nm, aunque pueden usarse longitudes de onda más cortas,
por ejemplo, 230-950 nm. La luminiscencia producida
podría medirse de cualquier manera conveniente, tal como
fotográficamente, visualmente, o fotométricamente, para determinar
la cantidad de la misma, la cual está relacionada con la cantidad de
analito en el medio.
Aunque habitualmente será preferible excitar el
fotosensibilizador mediante irradiación con luz de una longitud de
onda que sea absorbida de manera eficiente por el
fotosensibilizador, podrían emplearse otros medios de excitación
como, por ejemplo, mediante transferencia de energía desde un estado
excitado de un donante de energía tal como un segundo
fotosensibilizador. Cuando se usa un segundo fotosensibilizador,
pueden usarse longitudes de onda que son absorbidas ineficientemente
por el fotosensibilizador pero absorbidas eficientemente por el
segundo fotosensibilizador. El segundo fotosensibilizador podría
estar unido a un componente del ensayo que está asociado, o pasa a
estar asociado, con el primer fotosensibilizador, por ejemplo, unido
a una superficie o incorporarse en la partícula que tiene el primer
fotosensibilizador. Cuando se emplea un segundo fotosensibilizador,
éste tendrá habitualmente un estado triplete de mínima energía a un
nivel de energía superior que el estado triplete de mínima energía
del primer fotosensibilizador.
La línea de emisión a 632,6 nm del láser de
helio-neón es una fuente de luz barata para la
excitación. Los fotosensibilizadores con un máximo de absorción en
la región de aproximadamente 620 a aproximadamente 650 nm son
compatibles con la línea de emisión de un láser de
helio-neón y son, por tanto, particularmente útiles
en la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para determinar un analito que comprende: (a)
proporcionar en combinación (1) un medio sospechoso de contener
analito, (2) un fotosensibilizador capaz, en su estado excitado, de
activar oxígeno a un estado singlete, estando asociado el
fotosensibilizador con un miembro de un sbp, y (3) una partícula que
puede suspenderse que comprende un compuesto quimioluminiscente, en
donde la partícula tiene un miembro de un sbp unido a sí, (b) tratar
la combinación con luz para excitar el fotosensibilizador, y (c)
examinar la combinación a partir de la cantidad de luminiscencia
emitida a partir de la misma. La cantidad de luminiscencia emitida
está relacionada con la cantidad de analito en el medio.
Preferiblemente, el compuesto quimioluminiscente se incorpora en una
partícula que puede suspenderse, y el miembro de un sbp se une a la
partícula. Más preferiblemente, el fotosensibilizador se incorpora
en una segunda partícula que puede suspenderse, la cual tiene un
miembro de un sbp unido sobre sí.
El procedimiento y composiciones de la invención
podrían adaptarse a la mayoría de análisis que implican miembros de
un sbp, tales como ligando-receptor: por ejemplo,
reacciones antígeno-anticuerpo; ensayos de unión de
polinucleótidos, y demás. Los ensayos podrían ser homogéneos o
heterogéneos, competitivos o no competitivos. Los componentes del
ensayo, compuesto quimioluminiscente y fotosensibilizador, pueden
utilizarse en un cierto número de maneras con (1) una superficie,
cuando se emplee, (2) ácido nucleico o receptor, y (3) ácido
nucleico o ligando. La asociación podría implicar enlaces covalentes
o no covalentes. Aquellos especializados en la técnica serán capaces
de escoger asociaciones apropiadas dependiendo del ensayo particular
deseado, en vista de la discusión ilustrativa precedente y
siguiente.
En una estrategia de ensayo homogéneo, la muestra
sería tratada previamente, si es necesario, para suprimir materiales
no deseados. La reacción para un tipo de ensayo en "sándwich"
no competitivo puede implicar un miembro de un sbp, (por ejemplo, un
anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, un receptor o ligando)
complementario al analito y asociado con un compuesto
quimioluminiscente; un fotosensibilizador asociado con un miembro de
un sbp, (por ejemplo, anticuerpo, sonda de ácido nucleico, receptor
o ligando) que es también complementario al analito; la muestra de
interés; y cualquier reactivo auxiliar requerido.
Preferiblemente, uno o ambos, el
fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente se incorporan
en partículas a las cuales se anclan los otros miembros de un sbp.
En un protocolo competitivo, un miembro del sbp puede ser un
derivado del analito, y el otro miembro del sbp puede ser
complementario al analito, por ejemplo, un anticuerpo. En cualquier
protocolo los componentes podrían combinarse bien simultáneamente o
total o parcialmente de manera secuencial. La capacidad del oxígeno
singlete producido por un fotosensibilizador activado para
reaccionar con el compuesto quimioluminiscente está gobernada por la
unión de un miembro de un sbp al analito. Por tanto, la presencia o
la cantidad de analito puede determinarse midiendo la cantidad de
luz emitida a partir de la activación del fotosensibilizador
mediante irradiación, calentamiento, o adición de un reactivo
químico, preferiblemente mediante irradiación. Tanto la reacción de
unión como la detección del alcance de la misma pueden llevarse a
cabo en una solución homogénea sin separación. Esto es una ventaja
de la presente invención con respecto a procedimientos previos de la
técnica que usaban la quimioluminiscencia.
En una estrategia de ensayo heterogénea, los
componentes del ensayo incluyen una muestra sospechosa de contener
un analito que es un miembro de un sbp; un miembro de un sbp unido a
un soporte, que puede ser una superficie no dispersable o una
partícula que tiene asociado consigo un miembro de un grupo que
consiste en el compuesto quimioluminiscente y el fotosensibilizador;
y un miembro de un sbp que tiene el otro miembro del grupo asociado
con él, en donde los miembros del sbp pueden unir
independientemente, bien directa o indirectamente, el analito o un
receptor para el analito. Estos componentes se combinan generalmente
bien simultáneamente, o total o parcialmente de manera secuencial.
La superficie o partículas pueden entonces separarse de la fase
líquida, y bien la fase separada o la fase líquida se somete a
condiciones para activar el fotosensibilizador, normalmente
irradiando la fase determinada en cuestión, y midiendo la cantidad
de luz emitida.
Las reacciones de unión en un ensayo para el
analito normalmente se llevarán a cabo en un medio acuoso a un
pH moderado, generalmente aquél que proporciona una
sensibilidad del ensayo óptima. Preferiblemente, la activación del
fotosensibilizador también se llevará a cabo en medio acuoso. No
obstante, cuando se emplea un paso de separación, pueden usarse
medios no acuosos, tales como, por ejemplo, acetonitrilo, acetona,
tolueno, benzonitrilo, etc., y medios acuosos con valores de
pH que sea muy elevados, es decir, superiores de 10,0, o muy
bajos, es decir, inferiores a 4,0, habitualmente muy elevados. Tal y
como se ha explicado más arriba, el ensayo puede realizarse bien sin
separación (homogéneo) o con separación (heterogéneo) de cualquiera
de los componentes o productos del ensayo.
El medio acuoso podría ser solamente agua, o
podría incluir desde un 0,01 hasta un 80 por ciento de volumen de un
codisolvente, pero habitualmente incluirá menos del 40% de un
codisolvente cuando se use un miembro de un sbp que sea una
proteína. El pH para el medio de la reacción de unión estará
usualmente en el rango de aproximadamente 4 a 11, más habitualmente
en el rango de aproximadamente 5 a 10, y preferiblemente en el rango
de aproximadamente 6,5 a 9,5. Cuando el pH no se cambia
durante la generación del oxígeno singlete, el pH será
habitualmente un compromiso entre el óptimo de unión de los miembros
unidores y el pH óptimo para la producción de señal y la
estabilidad de los otros reactivos del ensayo. Cuando se precisan
pH elevados para la producción de señal, puede insertarse un
paso, que implique la adición de una reactivo alcalino, entre la
reacción de unión y la generación de oxígeno singlete y/o producción
de señal. Habitualmente, el pH elevado será superior a 10,
habitualmente 10-14. Tal y como se menciona más
arriba, para ensayos heterogéneos también podrían usarse disolventes
no acuosos, siendo la principal consideración que el disolvente no
reaccione eficientemente con el oxígeno singlete.
Podrían usarse varios tampones para conseguir el
pH deseado y mantener el pH durante un ensayo. Los
tampones ilustrativos incluyen el borato, fosfato, carbonato, tris,
barbital, y similares. El tampón concreto empleado no es crítico
para esta invención, pero en un ensayo individual podría preferirse
uno u otro tampón.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas
para llevar a cabo las reacciones de unión de ligandos y receptores
proteicos en el ensayo, y habitualmente una temperatura constante,
preferiblemente, 25ºC a 40ºC, durante el período de medición. Las
temperaturas de incubación para la reacción de unión normalmente
oscilarán desde aproximadamente 5ºC hasta 45ºC, usualmente desde
aproximadamente 15ºC hasta 40ºC, más habitualmente 25ºC hasta 40ºC.
Cuando durante el ensayo ocurre la unión de ácidos nucleicos,
frecuentemente se usarán temperaturas más elevadas, habitualmente
20ºC a 90ºC, más habitualmente 35ºC a 75ºC. Las temperaturas durante
las mediciones, es decir, generación del oxígeno singlete y
detección de luz, generalmente oscilarán desde aproximadamente 20ºC
hasta 100ºC, más habitualmente desde 25ºC hasta 50ºC, más usualmente
25ºC hasta 40ºC.
La concentración de analito que podría ensayarse
generalmente variará desde aproximadamente 10^{-4} hasta inferior
a 10^{-16} M, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6}
hasta 10^{-14}. Las consideraciones como si el ensayo es
cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de
detección concreta, la concentración del analito de interés, y los
tiempos de incubación máximos deseados, normalmente determinarán las
concentraciones de los diversos reactivos.
En ensayos competitivos, mientras que las
concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo
estarán generalmente determinadas por el rango de concentraciones de
interés del analito, la concentración final de cada uno de los
reactivos normalmente se determinará empíricamente para optimizar la
sensibilidad del ensayo en el rango. Esto es, una variación en la
concentración del analito que sea significativa debería proporcionar
una diferencia de señal medible con precisión.
La concentración de los miembros de un sbp
dependerá de la concentración de analito, la velocidad de unión
deseada, y el grado con que los miembros del sbp se unen no
específicamente. Habitualmente, los miembros de un sbp estarán
presentes en, al menos, la concentración de analito más baja
esperada, preferiblemente al menos la concentración de analito más
elevada esperada, y para ensayos no competitivos las concentraciones
podrían ser 10 a 10^{6} veces la concentración de analito más
elevada, pero serán habitualmente inferiores a 10^{-4} M,
preferiblemente menos de 10^{-6} M, frecuentemente entre
10^{-11} y 10^{-7} M. La cantidad de fotosensibilizador o
compuesto quimioluminiscente asociado con un miembro de un sbp
generalmente será de al menos una molécula por miembro de sbp, y
podría ser tan elevada como 10^{5}, habitualmente al menos
10-10^{4}, cuando la molécula de
fotosensibilizador o quimioluminiscente se incorpora en una
partícula.
Mientras que el orden de adición podría variar
ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza
del ensayo. El orden de adición más simple es añadir todos los
materiales simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden
combinarse total o parcialmente de manera secuencial. Cuando el
ensayo es competitivo, a menudo será deseable añadir el análogo del
analito después de combinar la muestra y un miembro de un sbp capaz
de unir el analito. Opcionalmente, podría implicarse un paso de
incubación después de que los reactivos sean combinados,
generalmente oscilando desde aproximadamente 30 segundos hasta 6
horas, más habitualmente desde aproximadamente 2 minutos hasta 1
hora antes de que se provoque que el sensibilizador genere el
oxígeno singlete y se mida la emisión de luz.
En un orden de adición particularmente preferido,
un primer conjunto de miembros de un sbp que son complementarios de
y/o homólogos del analito se combina con el analito, seguido de la
adición de miembros del par de unión específico complementarios a
los primeros miembros del par de unión específico, cada uno asociado
con un miembro diferente del grupo que consiste en un
fotosensibilizador y un compuesto quimioluminiscente. A
continuación, la mezcla de ensayo, o un componente de la misma
separado, que se irradia y se mide la emisión de luz.
En un ensayo homogéneo, después de que todos los
reactivos hayan sido combinados, éstos pueden incubarse, si se
desea. A continuación, se irradia la combinación y se mide la
emisión de luz resultante. La luz emitida está relacionada con la
cantidad de analito en la muestra ensayada. Las cantidades de los
reactivos de la invención empleados en un ensayo homogéneo dependen
de la naturaleza del analito. Generalmente, el ensayo homogéneo de
la presente invención exhibe una sensibilidad incrementada frente a
ensayos conocidos como el ensayo EMIT®. Esta ventaja resulta
primordialmente de la relación señal-ruido mejorada
obtenida con el presente procedimiento.
Los siguientes ensayos se proporcionan a modo de
ilustración y no de limitación, para permitir que un especialista en
la técnica aprecie el alcance de la presente invención, y ponga en
práctica la invención sin experimentación indebida. Se apreciará que
la elección de analitos, fotosensibilizadores, compuestos
quimioluminiscentes, superficies, partículas y condiciones de
reacción será sugerente para aquellos especialistas en la técnica en
vista de los descubrimientos en ésta, en los ejemplos que
siguen.
En una realización de la invención, el compuesto
quimioluminiscente
9-benzal-10-metilacridina
se une covalentemente a un anticuerpo contra la hormona estimuladora
de la tiroides (TSH) (Reactivo 1). La
9-benzal-10-metilacridina,
funcionalizada con un N-hidroxisuccinimidil éster
de un grupo carboxilo anclado al anillo de fenilo, reacciona con los
grupos amino del anticuerpo. El grupo de engarce es un carboxamida.
El fotosensibilizador utilizado es el rosa de bengala ("rose
bengal"), el cual está unido covalentemente a partículas de
látex que tienen una dimensión promedio de 0,5 micras. Las
partículas de látex y el rosa de bengala están unidos covalentemente
entre ellos, a través de grupos clorometilo sobre el látex, para
proporcionar un grupo de engarce éster tal y como se describe en
J. Am. Chem. Soc. 97: 3741 (1975). La partícula de
látex está además engarzada a un segundo anticuerpo contra la TSH a
través de grupos N-hidroxisuccinimidiléster sobre
el látex (Reactivo 2). Ambos anticuerpos empleados son anticuerpos
monoclonales preparados mediante tecnología estándar de líneas
celulares híbridas. Un anticuerpo reconoce la subunidad \alpha de
la TSH, y el otro reconoce la subunidad \beta de la TSH. Al
realizar el ensayo se obtiene de un paciente una muestra sospechosa
de contener TSH. Quince microlitros de la muestra se combinan con
500 ml de medio acuoso, tamponado con tampón Tris a pH 8,0,
con los anteriores Reactivo 1 y Reactivo 2. Las cantidades de
Reactivo 1 y Reactivo 2 son suficientes para proporcionar
concentraciones de cada anticuerpo de aproximadamente 10^{-6}
molar. A continuación se incuba la mezcla de reacción durante un
período de una hora a 25ºC, y entonces se irradia durante 30
segundos con luz a 560 nm. Se mide la intensidad de luz emitida a
partir de la irradiación, y la energía luminosa total detectada
durante un período de 30 segundos se compara con los valores
obtenidos, en un procedimiento similar, con muestras con
concentraciones conocidas de TSH, para determinar la concentración
de TSH en la muestra desconocida. Alternativamente, a continuación
de la incubación, se separan las partículas de látex del medio y se
colocan en un medio acuoso tamponado a pH 9,5, se irradian de
manera similar, y la cantidad de luz emitida a partir del sistema se
mide como antes.
En un alternativa basada en la anterior, el
Reactivo 2 es rosa de bengala, unido covalentemente al segundo
anticuerpo, y no se emplea ninguna partícula de látex. En aún otra
estrategia alternativa basada en la anterior, el Reactivo 2 es rosa
de bengala unido covalentemente al segundo anticuerpo, y el Reactivo
1 es
9-benzal-10-metilacridina
unida covalentemente a las partículas de látex, a las que está unido
covalentemente el primer anticuerpo. En todavía otra alternativa
basada en la anterior, el Reactivo 1 es tal y como se ha descrito
inmediatamente más arriba, el Reactivo 2 es rosa de bengala (rose
bengal) unido covalentemente a partículas de látex, a las que está
unida covalentemente la avidina, y se emplea un tercer reactivo
(Reactivo 2A), que es el segundo anticuerpo unido covalentemente a
la biotina. El Reactivo 1 y el tercer reactivo se combinan con la
muestra y se incuban. Entonces se añade un exceso de Reactivo 2, y
el resto de procedimiento es tal como se ha descrito más arriba.
En otra alternativa basada en la anterior, una
cloroperoxidasa sustituye al rosa de bengala. En este ensayo, el
paso de irradiación es reemplazado por la adición de bromuro de
sodio y peróxido de hidrógeno para producir oxígeno singlete. La luz
emitida se mide tal y como se ha descrito más arriba.
En otra realización según la presente invención,
un primer conjunto de gotas de aceite (Reactivo 3) se prepara a
partir de una solución del fotosensibilizador y clorofila en aceite
mineral, según Giaever, supra. Las gotas de aceite, que
oscilan entre 0,1 y 2 micras de diámetro, se funcionalizan y
engarzan a un anticuerpo monoclonal contra la gonadotropina crónica
humana (HCG). La clorofila es lipofílica y, por tanto, se disuelve
de manera irreversible en la gota de aceite lipofílica. Se prepara
un segundo conjunto de gotas de aceite (Reactivo 4) de manera
similar. En este conjunto de gotas las gotas de aceite se engarzan
covalentemente a un segundo anticuerpo monoclonal contra la HCG, el
cual reconoce una parte de la molécula de HCG diferente de la
reconocida por el primer anticuerpo monoclonal mencionado más
arriba. La
9-(difenilmetilidino)-N-metilacridina
se disuelve irreversiblemente en la gota de aceite lipofílica
mediante la inclusión de un grupo
N,N-didocecilcarboxamida unido a uno de los grupos
fenilo de la acridina. Los anticuerpos monoclonales se preparan
mediante tecnología estándar de línea celular híbrida. Se combina
una muestra de orina sospechosa de contener HCG (50 microlitros) con
cantidades en exceso de Reactivo 3 y Reactivo 4 en un medio acuoso
tamponado (500 \mul) a pH 7,5. Se incuba el medio a 25ºC
durante un período de 20 minutos. El medio, sin separación, se
irradia a 633 nm usando un láser de He/Ne durante un período de un
minuto, y la luz emitida se mide como se ha descrito más arriba. La
cantidad de luz se compara con la cantidad emitida por muestras que
contienen cantidades conocidas de HCG, y la cantidad de HCG en la
muestra desconocida se determina comparando los valores. De esta
manera se realiza un inmunoensayo para HCG homogéneo, sensible y
conveniente.
En una estrategia alternativa basada en la
anterior, el Reactivo 3 tiene un anticuerpo contra la fluoresceína
en lugar del anticuerpo contra la HCG, y un reactivo adicional
(Reactivo 3A) tiene el anticuerpo contra la HGC unido covalentemente
a la fluoresceína. El Reactivo 4 tiene avidina en lugar del segundo
anticuerpo contra la HCG, y un cuarto reactivo (Reactivo 4A) tiene
el segundo anticuerpo unido covalentemente a biotina. En el ensayo
se combinan el Reactivo 4A y el Reactivo 3A con la muestra y se
incuban. A continuación, se añaden los Reactivos 3 y 4 y se incuban.
Después se lleva a cabo el resto del anterior procedimiento de
ensayo.
En otra realización de la presente invención, se
forma un conjunto de liposomas (Reactivo 5) (0,2 micras de diámetro)
mediante extrusión a presión elevada de una suspensión de
fosfolípidos, en un tampón a pH 7,4, a través de una membrana
con poros de 0,2 micras, usando un instrumento diseñado con éste
propósito y comercialmente disponible. Un análogo de la tiroxina se
une covalentemente al liposoma, formando primero grupos
mercaptoacetamida sobre el liposoma mediante reacción de la
fosfatidiletanolamina en el liposoma con un éster activo del
metilcarboximetildisulfuro seguido de la reacción con
ditioeritritol. A continuación, se deja reaccionar la
bromoacetil-tiroxina con los liposomas
sulfhidrilatados. Se disuelve un colorante de metaloporfirina en la
parte lipofílica del liposoma. Otro conjunto de liposomas (Reactivo
6) se utiliza para unir un anticuerpo monoclonal contra la tiroxina.
El anticuerpo se une covalentemente por medios similares a los
empleados en la unión de la tiroxina. Se une covalentemente una
enamina (2-dimetilaminometilenopirano), a través de
un grupo de engarce carboxamida, a la superficie del liposoma. El
Reactivo 5 y el Reactivo 6 se combinan en un medio de ensayo acuoso
tamponado (500 \mul) a pH 8,0, junto con una muestra de
suero sospechosa de contener tiroxina, la cual contiene ácido
anilinonaftalenosulfónico para desplazar la tiroxina de las
proteínas unidoras (50 microlitros), y aceptar energía procedente
del pirano activado por oxígeno para proporcionar la emisión con
longitud de onda larga. A continuación, se incuba el medio de ensayo
a temperatura ambiente durante 1 hora. Se irradia el medio, sin un
paso de separación, a 650 nm durante un período de 1 minuto, y la
luz emitida resultante se mide con un luminómetro. El valor obtenido
se compara con valores obtenidos realizando un ensayo similar con
cantidades conocidas de tiroxina. De esta manera se cuantifica la
cantidad de tiroxina en la muestra de suero.
En una estrategia alternativa basada en la
anterior, el Reactivo 6 tiene avidina en vez del anticuerpo contra
la tiroxina. Un reactivo adicional (Reactivo 6A) tiene un anticuerpo
contra la tiroxina unido covalentemente a la biotina. El Reactivo 5
tiene un anticuerpo contra la fluoresceína en vez de la tiroxina, y
un reactivo adicional (Reactivo 5) tiene la tiroxina unido
covalentemente a la fluoresceína. En el ensayo se combinan los
Reactivos 5A y 6A con la muestra y se incuban. A continuación, se
añaden los Reactivos 5 y 6, se incuba la mezcla, y se sigue el resto
del procedimiento de ensayo.
En otra alternativa basada en la anterior, el
colorante de metaloporfirina se reemplaza por molibdato potásico que
se incorpora en la fase acuosa de los liposomas. En este ensayo, el
paso de irradiación se reemplaza por la adición de peróxido de
hidrógeno para producir oxígeno singlete. La luz emitida se mide tal
y como se ha descrito más arriba.
En otra realización se forma el
2-hidroxietil-9,10-dibromoantraceno
en un cristalito de colorante, de manera similar a la descrita por
Gribnau. Se une, de manera covalente, un anticuerpo monoclonal, que
reconoce el antígeno de superficie de la hepatitis B, al cristalito
de colorante mediante un grupo de engarce carbamato. Se trata una
partícula de látex para inmovilizar un segundo anticuerpo contra el
antígeno de superficie de la hepatitis B mediante un anclaje
covalente. Además, la partícula de látex se une covalentemente a
9-(benzal-9H-xanteno) a través de un
grupo de engarce amida. El cristalito de colorante tiene un tamaño
de partícula de un promedio de 2 micras, y las partículas de látex
tiene un diámetro promedio de 0,2 micras. Los anticuerpos
monoclonales se preparan mediante tecnología estándar de línea
celular híbrida. Se combina una muestra de suero, de un paciente
sospechoso de padecer la hepatitis (50 \mul), en un medio de
ensayo acuoso (500 \mul) a pH 7,0 con un exceso del
cristalito de colorante y partículas de látex descritas más arriba.
A continuación, se incuba el medio de ensayo a temperatura ambiente
durante un período de 30 minutos, y, a continuación, se irradia a
350 nm con una fuente de luz de xenón durante un período de 1
minuto. La presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B en
la muestra causa que el cristalito de colorante y las partículas de
látex pasen a estar en estrecha proximidad gracias a la unión inmune
de los respectivos anticuerpos con el antígeno. A partir de la
irradiación del medio, el 9,10-dibromoantraceno se
excita y se convierte el oxígeno molecular a oxígeno singlete. El
oxígeno singlete reacciona con el xanteno para dar un dioxetano, el
cual decae espontáneamente a temperatura ambiente para producir luz.
La luz se mide fotométricamente, y la cantidad de luz por encima de
cierto nivel umbral indica la presencia de antígeno de superficie de
la hepatitis B en la muestra. La irradiación del medio se realiza a
temperatura ambiente, y el ensayo se lleva a cabo de manera
homogénea para obtener un ensayo del antígeno de superficie de la
hepatitis B.
Preferiblemente, en este ensayo el
Eu(TTA)_{3} se disuelve en las partículas de látex
para causar que el derivado del xanteno excitado transfiera su
energía al Eu(TTA)_{3}, el cual emite por encima de
600 nm. Esto evita la interferencia del suero que, de otra manera,
sucedería debido a la absorción, por parte de componentes del suero,
de la luz emitida directamente a partir de la luminiscencia del
xanteno.
En otra realización el ensayo sirve para la
determinación de un determinado antígeno de grupo sanguíneo sobre la
superficie de hematíes, en concreto, un antígeno de grupo A. Se
utilizan las partículas de látex, preparadas tal y como se ha
descrito más arriba, que tienen un tamaño de partícula de
150-500 nm. Las partículas de látex tienen un
anticuerpo contra el antígeno de grupo A anclado covalentemente
sobre la partícula de látex. Las partículas también tienen el
enoléter
2-p-dimetilaminofenil-3-fenil-5,6-dihidrodioxeno
disuelto en el látex. Este reactivo de partículas de látex se
combina en el medio acuoso (500 \mul) con sangre entera (100
\mul) y 1 \times 10^{4} M de fotosensibilizador, el cual es un
fotosensibilizador hidrofóbico, en concreto, el ácido
fenazina-2-carboxílico. El colorante
hidrofóbico se intercala dentro de los hematíes presentes en la
muestra. El medio se incuba a 25ºC durante un período de 10 minutos,
y, a continuación, se irradia a 400-450 nm con una
fuente de tungsteno durante un período de 30 segundos. La luz
emitida por el medio se mide y se compara con la cantidad de luz
obtenida en muestras que se sabe carecen de hematíes con el antígeno
del grupo A. Por tanto, la cantidad de luz por encima de un nivel
umbral indica la presencia del antígeno de grupo sanguíneo A.
En otra realización de la presente invención, el
analito es un antígeno HLA sobre la superficie de una célula. Una
muestra (50 \mul) sospechosa de contener el antígeno HLA se
combina en un medio de ensayo acuoso (500 \mul) tamponado a
pH 7,4. Al medio también se le añade una cantidad en exceso
de un reactivo que es un anticuerpo contra el antígeno HLA
covalentemente unido a eosina a través de un grupo de engarce
tioéter. También se añade un compuesto quimioluminiscente al medio
de ensayo. El compuesto quimioluminiscente se escoge de manera que
se intercale dentro de la célula que contenga el antígeno HLA. El
compuesto quimioluminiscente es una acridina, en concreto la
9-(dodecilfenilmetilidino-1)-N-(2-sulfonoxietil)acridina.
El medio de ensayo se incuba a temperatura ambiente durante un
período de 1 hora, y a continuación se irradia a
500-550 nm con una fuente de luz de
tungsteno-halógena durante un período de 1 minuto.
La luz emitida por el medio de ensayo se mide, y la cantidad de luz
por encima de un nivel umbral es indicativa de la presencia del
antígeno HLA.
La presente invención abarca además composiciones
que comprenden una partícula que puede suspenderse, de 0,04 a 4000
nanómetros de diámetro promedio, la cual incluye un compuesto
quimioluminiscente. El compuesto quimioluminiscente podría estar
unido covalentemente a la matriz de la partícula, o podría estar
disuelto en la matriz, o disuelto en un solvente que se disuelve en
la matriz. Las partículas serán preferentemente poliméricas, o serán
gotas de aceite, o vesículas tales como liposomas. Cuando la
partícula es un liposoma, el compuesto quimioluminiscente estará
asociado con la bicapa lipídica, o disuelto en el interior acuoso
del liposoma. La partícula tendrá un miembro de un sbp unido sobre
sí. Preferiblemente, las partículas unidas a un sbp serán de 100 a
1000 mm de diámetro promedio. También se abarcan composiciones
formadas por dos miembros de un sbp complementarios unidos entre
ellos, en donde uno está asociado con un fotosensibilizador y el
otro está asociado con un compuesto quimioluminiscente.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento que proporciona una combinación que comprende (1) un
medio sospechoso de contener el analito y (2) un reactivo de marca
que comprende un primer miembro de un par de unión específica (sbp)
asociado con un PACC. Las condiciones se escogen de tal manera que
se forme un complejo de un miembro sbp en relación con la presencia
del analito. Por ejemplo, el primer miembro de sbp puede ser capaz
de unirse al analito o a un segundo miembro de sbp para formar un
complejo relacionado con la presencia del analito. El procedimiento
comprende, además, activar fotoquímicamente el PACC y detectar la
cantidad de luminiscencia generada por el PACC. La cantidad de
luminiscencia está relacionada con la cantidad de analito en el
medio.
Generalmente, el PACC se activa fotoquímicamente
mediante irradiación con luz, el cual puede activar directamente
PACC, o puede activar un fotosensibilizador, el cual, a consecuencia
de la irradiación, puede causar la conversión del oxígeno molecular
a oxígeno singlete. Entonces, el oxígeno singlete activa el PACC. El
fotosensibilizador podría estar unido a un ligando, podría estar
libre en solución, o podría estar unido a una superficie,
dependiendo de la naturaleza del ensayo. El producto formado por la
activación del PACC con el oxígeno singlete podría descomponerse
espontáneamente con emisión de luz, o podría ser tratado
ulteriormente física o químicamente para emitir luz.
Un fotosensibilizador puede emplearse en un
cierto número de estrategias diferentes para producir oxígeno
singlete, el cual activa el PACC. El fotosensibilizador puede
emplearse directamente, no estando unido a un miembro de un sbp. En
esta estrategia, se emplea una concentración del fotosensibilizador
relativamente elevada, usualmente al menos 10^{-7} M,
preferiblemente al menos 10^{-6} M, más preferiblemente al menos
10^{-5} M. Generalmente, la cantidad de fotosensibilizador
empleada en esta estrategia es aquélla suficiente para producir una
concentración de oxígeno singlete que resulta en la activación del
PACC. Esta estrategia puede usarse cuando la emisión del PACC se
modifica sustancialmente cuando se forma un complejo, o cuando la
cantidad de PACC en el medio se ve afectada por la presencia del
analito. Esto se conseguirá habitualmente separando la marca unida y
no unida. Cuando no se desea una separación, la emisión del PACC en
el complejo puede modificarse mediante un aceptor de energía, el
cual se lleva a una estrecha proximidad con el PACC uniendo el
aceptor de energía al complejo formado a resultas de la presencia
del analito. Cuando el aceptor de energía es fluorescente, la
longitud de onda de la emisión es habitualmente modificada. Cuando
el receptor de energía no es fluorescente, la quimioluminiscencia
será habitualmente atenuada cuando el PACC pase a estar unido al
complejo.
En aún otra realización de la presente invención,
se reparten un fotosensibilizador y el PACC entre el conjunto de la
solución del medio de ensayo y una superficie, tal y como se
describe en la presente invención. Este reparto dependerá de la
cantidad de analito presente en la muestra a analizar, y el
fotosensibilizador habitualmente estará unido a un miembro de sbp.
Las moléculas de fotosensibilizador que no pasan a estar asociadas
con la superficie producen oxígeno singlete, el cual es incapaz de
alcanzar el PACC antes de decaer en el medio acuoso. No obstante,
cuando tanto el fotosensibilizador como el PACC se asocian con la
superficie gracias a la formación de un complejo, que resulta de la
presencia del analito, el oxígeno singlete producido a partir de la
irradiación del fotosensibilizador puede activar el PACC antes de
decaer. En este procedimiento, la cantidad de fotosensibilizador
empleado puede ser considerablemente menor que en el uso descrito
previamente del fotosensibilizador que no implica un miembro de un
sbp unido al fotosensibilizador.
Como puede verse, el presente ensayo proporciona
un procedimiento conveniente para detectar y medir una amplia
variedad de analitos de una manera simple, eficiente y reproducible,
el cual puede emplear la inspección visual o equipamiento
convencional para medir la cantidad de luz producida durante la
reacción.
Cuando se causa que el fotosensibilizador pase a
estar asociado con la superficie a resultas de la presencia de
analito, habitualmente estará asociado con un miembro de un sbp.
Esto podría conseguirse de diferentes maneras. El fotosensibilizador
podría contener una funcionalidad para el anclaje sobre un miembro
de un sbp, o el miembro de un sbp podría contener la funcionalidad
para el anclaje al fotosensibilizador. El anclaje podría conseguirse
mediante un enlace directo entre las dos moléculas, o puede
emplearse un grupo de engarce entre el miembro de un sbp y el
fotosensibilizador. En otra realización el fotosensibilizador puede
unirse a o incorporarse en una partícula, a la cual también está
unido un miembro de un sbp. En ambos casos, el miembro del sbp es
capaz de unirse al analito. El fotosensibilizador puede incorporarse
dentro de la partícula gracias a que es soluble en al menos una fase
de la partícula. El fotosensibilizador podría unirse a la partícula
cuando no se incorpora dentro de la partícula. Para este propósito
el fotosensibilizador, o la partícula, o un componente de la misma,
se funcionaliza para proporcionar un medio para unir el
fotosensibilizador y la partícula. Para partículas que son gotas de
aceite o bicapas lipídicas, el fotosensibilizador puede unirse a la
partícula mediante anclaje a una cadena hidrocarbonada larga que sea
compatible con la composición de la partícula. Frecuentemente, se
emplea al menos una, preferiblemente dos, cadenas hidrocarbonadas,
que tienen de 8 a 20 ó más átomos de carbono.
Si la partícula es una gota de un fluorocarburo,
el fotosensibilizador podría fluorarse para mejorar su solubilidad y
reducir el intercambio, y la cadena hidrocarbonada usada para el
engarce preferiblemente se remplazará con una cadena de
fluorocarburo. Para partículas de silicona, el fotosensibilizador
podría unirse a un polisiloxano. Habitualmente, será deseable
minimizar la carga y polaridad del fotosensibilizador, de manera que
resida dentro de la parte no acuosa de la partícula. Tal y como se
menciona más arriba, la estrategia que implica un fotosensibilizador
unido a un miembro de un sbp se describe totalmente en la presente
invención.
Tal y como se ha mencionado más arriba, el PACC
está "asociado con un miembro de un sbp" y, por tanto, funciona
en la presente invención como una marca. Tal como se usa en ésta, el
término "asociado con un miembro de un sbp" incluye lo
siguiente: habitualmente, la asociación del PACC y el miembro de sbp
es a través de una unión covalente. No obstante, este reactivo marca
puede además comprender una partícula que se puede suspender, a la
cual el PACC está unido o en la cual el PACC se incorpora de manera
no covalente. La partícula que se puede suspender también tendrá un
miembro de un sbp unido sobre sí. Este miembro de un sbp es
generalmente capaz de unirse al analito o a un miembro de un sbp
capaz de unirse al analito. Cuando se utiliza otro miembro de un sbp
y también es capaz de unirse al analito, resulta un protocolo de
ensayo en "sándwich". El miembro de un sbp unido al PACC
también puede ser análogo al analito, en cuyo caso puede resultar un
protocolo de ensayo competitivo.
Cuando se utiliza un fotosensibilizador, el
fotosensibilizador sirve para activar el PACC cuando se irradia el
medio que contiene los reactivos anteriores. El medio se irradia con
luz que tiene una longitud de onda de energía suficiente para
convertir el fotosensibilizador a un estado excitado, y hacerlo
capaz de activar el oxígeno molecular a oxígeno singlete. Cuando
está unido a un miembro de un sbp, la concentración del
fotosensibilizador podría ser muy baja, frecuentemente 10^{-6} a
10^{-12} M o inferior. Cuando el fotosensibilizador no está unido,
estará frecuentemente en una concentración suficiente para absorber
una cantidad apreciable de luz, habitualmente al menos un 0,1%,
preferiblemente entre el 1 y el 80%.
El estado excitado del fotosensibilizador será
habitualmente el estado triplete más bajo, y es al menos 25
kcal/mol, preferiblemente al menos 23 kcal/mol, más energético que
el estado basal. Generalmente, el medio es irradiado con luz que
tiene una longitud de onda de aproximadamente 300 a 1200 nm,
usualmente de 450 a 950 nm, preferiblemente de 550 a 800 nm. El
período de irradiación dependerá del tiempo de vida del PACC
activado, la intensidad de luz, y la intensidad de emisión deseada.
Para PACC activados de vida corta, el período podría ser inferior a
un segundo, habitualmente aproximadamente un milisegundo, pero
podría ser tan corto como un microsegundo cuando se use una lámpara
de flash intensa o láser. Para PACC activados de vida larga, el
período de irradiación puede ser más largo y puede usarse una fuente
de luz continua y menos intensa. En general, la intensidad de luz
integrada durante el período de irradiación debería ser suficiente
para excitar al menos el 0,1% de las moléculas de
fotosensibilizador, preferiblemente al menos el 30%, y más
preferiblemente cada molécula de fotosensibilizador será excitada al
menos una vez.
La luminiscencia o luz producida en cualquiera de
las estrategias anteriores puede medirse visualmente,
fotográficamente, actinométricamente, espectrofotométricamente, o
por cualquier otro medio apropiado para determinar la cantidad de
la misma, que está relacionada con la cantidad de analito en el
medio.
Un láser de helio-neón es una
fuente de luz barata para la excitación a 632,6 nm. Los
fotosensibilizadores que absorben luz en esta longitud de onda son
compatibles con la línea de emisión de un láser
helio-neón y son, por tanto, particularmente útiles
en la presente invención. Otras fuentes de luz incluyen, por
ejemplo, otros láseres tales como de argón, YAG, He/Cd, y rubí;
fotodiodos; lámparas de vapor de mercurio, sodio y xenón; lámparas
incandescentes tales como las de tungsteno y tungsteno/halógeno; y
lámparas de flash.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para determinar un analito, el cual comprende (a) combinar en un
medio de ensayo ya sea simultáneamente o total o parcialmente de
manera secuencial (1) un medio sospechoso de contener una analito,
(2) un reactivo de marca que comprende un primer miembro de un par
de unión específica (miembro de spb) unido a un compuesto capaz de
producir quimioluminiscencia en una reacción con oxígeno singlete, y
(3) un reactivo insolubilizado que comprende un aceptor de energía
fluorescente unido a, o capaz de llegarse unir a, un segundo miembro
de sbp en condiciones en las que se forma un complejo de un miembro
de sbp que implica dicho reactivo de marca en relación a la
presencia de analito en dicho medio y la energía procedente de dicho
compuesto quimioluminiscente es capaz de activar dicho aceptor de
energía fluorescente, (b) activar dicho compuesto con luz, y (c)
examinar dicho medio de ensayo para una señal, estando relacionada
la presencia o intensidad de la misma con la cantidad de analito en
dicho medio.
El procedimiento y composiciones de la invención
podrían adaptarse a la mayor parte de ensayos que implican miembros
de un sbp tales como un ligando-receptor, por
ejemplo, reacciones antígeno-anticuerpo, ensayos de
unión de polinucleótidos, y demás. Los ensayos podrían ser
homogéneos o heterogéneos, competitivos o "sándwich". En una
estrategia de ensayo homogéneo, la muestra podría tratarse
previamente, si es necesario, para suprimir materiales no deseados.
La reacción inmunológica de un ensayo de tipo "sándwich"
habitualmente implica un miembro de un sbp, por ejemplo, un
anticuerpo, que es complementario al analito y está unido al PACC,
un segundo miembro de un sbp, por ejemplo, anticuerpo, que también
es complementario al analito, y la muestra de interés. En un
protocolo competitivo, el PACC podría estar asociado a un miembro de
un sbp que es análogo a, habitualmente un derivado de, el analito, o
con un miembro de un sbp complementario del analito, por ejemplo, un
anticuerpo.
El PACC podría utilizarse bien por sí mismo o
asociado con un aceptor de energía. La capacidad de luminiscencia
producida por un PACC activado para activar el aceptor de energía
estará gobernada por la unión de los dos miembros de sbp, o podría
ser la consecuencia de una concentración relativamente elevada del
aceptor de energía en la vecindad del PACC activado, en donde la
concentración habitualmente será al menos micromolar, normalmente al
menos milimolar. Cuando el PACC está unido a un miembro de un sbp,
su concentración, por contra, podría ser bastante baja, a menudo
10^{-5} a 10^{-15}, usualmente 10^{-8} a 10^{-14}, y la
detección del alcance de la misma podría llevarse a cabo en una
disolución homogénea sin separación, sólo a condición de que la
intensidad de la luminiscencia sea modificada cuando el PACC está en
un complejo de unión.
En una estrategia de ensayo heterogéneo, una
muestra sospechosa de contener un analito, el cual es un miembro de
un sbp, se combina con un reactivo que está formado por un miembro
de un sbp complementario unido a un soporte, el cual podría ser una
superficie o una partícula que tienen el PACC. También podría
emplearse un aceptor de energía asociado con otro miembro de un sbp,
en donde el miembro del sbp es bien complementario (sándwich) o
análogo (competitivo) al analito. Estos materiales se combinan
generalmente bien simultáneamente o total o parcialmente de manera
secuencial. A continuación se separa el soporte de la fase líquida,
y la fase sólida o la fase líquida se examinan en busca de la
presencia de energía luminiscente, habitualmente irradiando la fase
concreta en cuestión, y midiendo la cantidad de luz emitida.
Un ensayo para el analito normalmente se
realizará en un medio acuoso tamponado a un pH moderado,
generalmente aquél que proporciona una sensibilidad de ensayo
óptima. Tal como se ha explicado más arriba, el ensayo puede
realizarse bien sin separación (homogéneo) o con separación
(heterogéneo) de cualquiera de los componentes o productos del
ensayo.
El medio acuoso podría ser solamente agua, o
podría incluir desde un 0,01 hasta un 80 ó más de porcentaje de
volumen de un codisolvente. El pH del medio estará usualmente
en el rango de aproximadamente 4 a 13, más habitualmente en el rango
de aproximadamente 5 a 10, y preferiblemente en el rango de
aproximadamente 6,5 a 9,5. El pH será habitualmente un
compromiso entre la unión óptima de los miembros unidores y el
pH óptimo para los otros reactivos del ensayo, tales como los
miembros del sistema de producción de señal. Por ejemplo, el PACC
activado podría requerir un cierto rango de pH con el fin de
que decaiga para producir luminiscencia.
Podrían usarse varios tampones para conseguir el
pH deseado y mantener el pH durante la determinación.
Los tampones ilustrativos incluyen el borato, fosfato, carbonato,
tris, barbital, y similares. El tampón concreto empleado no es
crítico para esta invención, pero en un ensayo individual podría
preferirse uno u otro tampón.
Normalmente se emplean temperaturas moderadas
para llevar a cabo el ensayo, y usualmente una temperatura
constante, preferiblemente, temperatura ambiente, durante el período
de medición. Las temperaturas de incubación normalmente oscilarán
desde aproximadamente 5ºC hasta 99ºC, usualmente desde
aproximadamente 15ºC hasta 70ºC, más habitualmente 20ºC hasta 45ºC.
Las temperaturas durante las mediciones normalmente oscilarán desde
aproximadamente 10ºC hasta 70ºC, más usualmente desde
aproximadamente 20ºC hasta 45ºC, más habitualmente 20ºC a 25ºC. En
algunos casos, el PACC podría precisar de calentamiento hasta 100ºC
con el fin de que decaiga para producir luminiscencia.
La concentración de analito que podría ensayarse
generalmente variará desde aproximadamente 10^{-5} hasta
10^{-17} M, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6}
hasta 10^{-14}. Las consideraciones, tales como si el ensayo es
cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de
detección concreta, y la concentración del analito de interés,
normalmente determinarán las concentraciones de los diversos
reactivos.
Mientras que las concentraciones de los diversos
reactivos en el medio de ensayo estarán generalmente determinadas
por el rango de concentraciones de interés del analito, la
concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se
determinará empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo
en el rango. Esto es, una variación en la concentración del analito
que sea significativa debería proporcionar una diferencia de señal
medible con precisión.
Mientras que el orden de adición podría variar
ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza
del ensayo. El orden de adición más simple, en particular para un
ensayo homogéneo, es añadir todos los materiales simultáneamente.
Alternativamente, los reactivos pueden combinarse total o
parcialmente de manera secuencial. Opcionalmente, podría implicarse
un paso de incubación después de que los reactivos sean combinados,
generalmente oscilando desde aproximadamente 30 segundos hasta 6
horas, más habitualmente desde aproximadamente 2 minutos hasta 1
hora.
En un ensayo homogéneo, después de que todos los
reactivos hayan sido combinados, éstos pueden incubarse, si se
desea. A continuación, se irradia la combinación y se mide la
emisión de luz resultante. La luz emitida está relacionada con la
cantidad de analito en la muestra ensayada. Las cantidades de los
reactivos de la invención empleados en un ensayo homogéneo dependen
de la naturaleza del analito.
Los siguientes ensayos se proporcionan a modo de
ilustración y no de limitación, para permitir que un experto en la
técnica aprecie el alcance de la presente invención, y ponga en
práctica la invención sin experimentación indebida. Se apreciará que
la elección de analitos, fotosensibilizadores, PACC, superficies,
partículas y condiciones de reacción serán sugerentes para aquellos
expertos en la técnica en vista del descubrimiento en el presente
documento y en los ejemplos que siguen.
En los siguientes ensayos, los componentes se
combinan en un medio predominantemente acuoso de pH 6 a
8,5.
A. En un ensayo para la HCG se combina una
muestra de orina con (1) un anticuerpo contra la HCG, unido a
partículas de látex de 1 micra y (2) un anticuerpo contra un epítopo
separado y no solapado de la HCG, unido al PACC 4. Después de
incubar la suspensión durante 30 minutos, las partículas se separan
del medio mediante centrifugación, se lavan e irradian con luz de
300 nm. La intensidad de la luz emitida a continuación de la
irradiación está relacionada con la cantidad de HCG en la muestra.
Las partículas separadas pueden irradiarse directamente, o
suspenderse en un disolvente acuoso o no acuoso antes de la
irradiación.
B. En un procedimiento similar a A para el ensayo
de HCG en suero, las cuentas de látex que son utilizadas se tiñen
con el fotosensibilizador, ftalocianina de cobre, y, después de la
incubación, se separan del medio y, a continuación, se irradia con
luz de 600 nm. La intensidad de la luz emitida se relaciona con la
cantidad de HCG en la muestra.
C. En un ensayo para la digoxina en suero, el
PACC luminol, conjugado con la digoxigenina, se incuba con la
muestra en un pocillo de poliestireno que se ha teñido con
tetradecilftalocianina. La superficie del pocillo está recubierta
con un anticuerpo contra la digoxina. Después de una incubación de
30 minutos y de retirar el medio de ensayo, se irradia el pocillo
con luz de 600 nm. Es preferible añadir una solución alcalina antes
de la irradiación (pH 10-12). La intensidad
de la luz emitida a continuación de la irradiación está inversamente
relacionada con la concentración de digoxina en la muestra.
D. En un ensayo para la albúmina en orina, se
combina la muestra con (1) un anticuerpo contra la albúmina
marcado con el PACC, y (2) un anticuerpo contra la albúmina dirigido
contra un epítopo de la albúmina que no se solapa, anticuerpo que
está marcado con un aceptor de energía,
El fotosensibilizador, azul de metileno, está
incluido en el medio de ensayo. Se incuba el medio durante 10
minutos, y entonces se irradia con luz de 600 nm. La intensidad de
la luz emitida por el aceptor de energía (aproximadamente 500 nm) a
continuación del final de la irradiación está directamente
relacionada con la cantidad de albúmina en la muestra.
E. En un ensayo para la tiroxina en suero, se
combina la muestra con tiroxina unida a cuentas de látex, dentro de
las cuales se ha incorporado el PACC 10, en donde X_{2} es
N(CH_{3})_{2}. En el medio de ensayo se incluye
anticuerpo contra la tiroxina unida al sensibilizador rosa bengala.
Después de una incubación de 10 minutos, se irradia el medio con luz
de 550 nm, y se mide la luz emitida a continuación del final de la
irradiación. La intensidad de luz emitida está inversamente
relacionada con la cantidad de tiroxina en la muestra.
F. En un ensayo para una secuencia
polinucleotídica diana en una muestra que contiene ADN, se mezcla
con la muestra un oligonucleótido de 25 bases complementario a la
secuencia diana y conjugado con PACC 23, que es el
9-fenilmetilidenxantano. A continuación, se
calienta el medio hasta 75ºC y se enfría a 55ºC para permitir la
híbridación del oligonucleótido con cualquier secuencia diana
presente. El aceptor de energía e intercalador, naranja de acridina,
y el fotosensibilizador, ácido
ftalocianina-tetrasulfónico, están presentes en la
disolución de híbridación o podrían añadirse una vez completada la
reacción de híbridación. Entonces, se irradia la solución con luz de
600 nm, y se mide la intensidad de luz emitida por el naranja de
acridina (aproximadamente a 500 nm) a partir del final de la
irradiación. La intensidad de luz está directamente relacionada con
la presencia de la secuencia diana.
G. En un ensayo para una secuencia
polinucleotídica diana en una muestra que contiene ADN, se provoca
la híbridación de un oligonucleótido de 25 bases, complementario a
la secuencia diana y marcado con el fotosensibilizador,
ftalocianina, con la diana, tal como en F, más arriba. Un compuesto
que se une al surco menor del ADN de doble cadena, el colorante
Hoechst 33258, el cual está unido al PACC 20,
N-metil-9-fenilmetilidenacridina,
está presente en el medio, o se añade a continuación de la
híbridación. Entonces se irradia el medio con luz de 600 nm, y se
mide la intensidad de luz emitida a partir del final de la
irradiación. La intensidad de luz emitida está directamente
relacionada con la cantidad de secuencia diana presente en la
muestra.
H. En un ensayo para el antígeno de superficie de
la hepatitis B (HBsAg) en suero, se combina la muestra con (1)
partículas de látex de 150 nm teñidas con el PACC, y recubiertas con
anticuerpos contra el HBsAg, y (2) con cuentas de látex de 150 nm
teñidas con el fotosensibilizador
tetrafenil-porfirina, y recubiertas con anticuerpos
contra el HBsAg. Después de incubar la muestra durante una hora, se
irradia la suspensión con luz de 550 nm. A continuación del final de
la irradiación, se mide la intensidad de la luz emitida y se
relaciona con la cantidad de HBsAg en la muestra.
I. En un ensayo para HBsAg en sangre completa, se
sigue el procedimiento H excepto que las cuentas de látex que
contienen PACC se remplazan por cuentas de látex teñidas con PACC
23, que es el
9-fenilmetiliden-xanteno, y el
aceptor de energía
Se mide la intensidad de luz emitida de 610 a 620
nm y se relaciona con la concentración de HBsAg en la muestra.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a equipos útiles para realizar convenientemente el procedimiento de
ensayo de la invención para determinar la presencia o cantidad de un
analito en una muestra sospechosa de contener el analito. Para
mejorar la versatilidad del sujeto de la invención, los reactivos
pueden proporcionarse en una combinación empaquetada, en el mismo
contenedor o contenedores separados, de manera que la proporción de
los reactivos proporcione una optimización sustancial del
procedimiento y ensayo. Los reactivos podrían estar cada uno en
contenedores separados, o varios reactivos podrían combinarse en uno
o más contenedores dependiendo de la reactividad cruzada y
estabilidad de los reactivos.
Un tipo de equipo comprende (1) una composición
que incluye una partícula que se puede suspender que comprende un
compuestos quimioluminiscente, teniendo la partícula un miembro de
un sbp unido sobre sí, y (2) un fotosensibilizador. El
fotosensibilizador puede estar anclado a un miembro de un sbp, o
puede estar asociado con una partícula, a la cual se ha unido un
miembro de un sbp. El equipo puede además incluir otros reactivos,
empaquetados por separado, para llevar a cabo un ensayo, incluyendo
reactivos auxiliares, y demás.
Otra realización de un equipo según la presente
invención comprende, en combinación empaquetada, un compuesto
quimioluminiscente asociado con un primer miembro de un sbp, y un
fotosensibilizador, capaz, en su estado excitado, de activar el
oxígeno a su estado singlete, asociado con un segundo miembro de un
sbp.
Otro tipo de equipo comprende (1) una composición
que incluye un PACC unido a un miembro de un sbp. El equipo también
comprende un fotosensibilizador, y puede incluir también uno o más
reactivos miembros de un sbp adicionales. Un aceptor de energía
puede estar unido a un miembro de un sbp para formar un reactivo, o
puede proporcionarse por sí mismo como reactivo. También puede
incluirse un miembro de un sbp que esté unido a una superficie. El
equipo puede además incluir otros reactivos empaquetados
separadamente para realizar un ensayo, incluyendo reactivos
auxiliares y demás.
En un aspecto, la presente invención proporciona
partículas según se define en la reivindicación 1.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para determinar un analito, según se
define en la reivindicación 8.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un dispositivo según se define en la reivindicación
10.
El compuesto quimioluminiscente puede contener un
grupo olefina y uno o más sustituyentes donadores de electrones en
combinación con dicho grupo olefina.
El compuesto quimioluminiscente se puede
seleccionar del grupo que consiste en
9-alquiliden-N-metil
acridinas, enoléteres y enaminas.
El fotosensibilizador o dicho compuesto
quimioluminiscente se puede asociar con una partícula suspendible
que comprenda la superficie.
A una superficie también se le puede causar que
se vuelva a una proximidad estrecha y la superficie está en una
partícula suspendible y la partícula se selecciona del grupo que
consiste en cuentas de látex, bicapas lipídicas, gotas de aceite,
partículas de sílice, soles metálicos y cristalitos de
colorante.
El fotosensibilizador puede ser un colorante
seleccionado del grupo que consiste en azul de metileno, rosa
bengala, porfirinas y ftalocianinas.
Cada uno, el fotosensibilizador y el compuesto
quimioluminiscente pueden tener un miembro de par de unión
específica (sbp) asociado con el mismo y dichos miembros de sbp se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en ligandos,
receptores, polinucleótidos y agentes de unión a
polinucleótidos.
La combinación empaquetada puede comprender (1)
una composición que comprenda una partícula suspendible que
comprende un compuesto quimioluminiscente, teniendo unida dicha
partícula a la misma un miembro de par de unión específica (sbp), y
(2) un fotosensibilizador que no está en dicha composición y que es
capaz de activar el oxígeno a su estado singlete en su estado
excitado.
El dispositivo puede comprender una composición
que comprenda una segunda partícula suspendible que comprende dicho
fotosensibilizador, teniendo unida dicha segunda partícula a la
misma un miembro sbp.
La activación fotoquímica puede comprender la
reacción de dicho PACC con oxígeno singlete.
El oxígeno singlete puede ser generado por
activación de un fotosensibilizador.
El analito y primer miembro sbp pueden ser
seleccionados independientemente del grupo que consiste en ligandos,
receptores y polinucleótidos.
El PACC puede contener un grupo olefina y uno o
más sustituyentes donadores de electrones en combinación con dicho
grupo olefina.
Dicho PACC se puede seleccionar del grupo que
consiste en 9-alquiliden acridinas, enoléteres,
9-alquiliden xantanos y anaminas.
Se puede incluir un aceptor de energía en dicho
medio y la energía de dicho PACC es capaz de activar dicho aceptor
de energía.
La invención se demuestra además mediante los
siguientes ejemplos ilustrativos. Las partes y porcentajes usados en
ésta son en peso, a menos que se indique lo contrario. Las
temperaturas están en grados centígrados (ºC).
Ab_{F} - Anticuerpo monoclonal de ratón contra
la fluoresceína.
Ab_{IF} - Anticuerpo monoclonal de ratón contra
el factor intrínseco.
B_{12}-LC_{25}-F
- Vitamina B_{12} unida a carboxifluoresceína (F) a través de un
grupo de engarce con una longitud de cadena de 25 átomos de carbono,
en concreto,
HN(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}OCH_{2}CONH(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}NHCO.
BA-C_{18} -
4-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi)benzal-9-metilacridina.
t-Bu - terc-butil.
TFA - Ácido trifluoroacético.
Biotina-LC_{21}-F
BSA - Albúmina de suero bovino.
Chl-a -
Clorofila-a.
D-H_{2}O - Agua
desionizada.
DPPC - Dipalmitoilfosfatidilcolina.
DPPG - Dipalmitoilfosfatidilglicerol.
DPPE - Dipalmitoilfosfatidiletanolamina.
EDAC - Hidrcloruro del
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
CH_{3}---CH_{2}-N=C=N---(CH_{2})_{3}---
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{N}{\uelm{\para}{H ^{+} C1 ^{-} }}---CH_{3}
F - Fluoresceína.
F-NHS - La
N-hidroxisuccinimida éster de la
6-carboxifluoresceína.
F-LC_{21}NH_{2} -
Carboxifluoresceína a la que se ha unido el grupo engarce
HN(CH_{2})_{6}NHCOCH_{2}OCH_{2}CONH
(CH_{2})_{6}NH_{2}.
(CH_{2})_{6}NH_{2}.
HCG - Gonadotropina de coriónica humana.
Lip - Liposoma.
nC_{10} - Complejo cloruro de
tetra-(n-decil)ftalocianina aluminio.
OD - Gota de aceite.
OD/BA-C_{18} - Gotas de aceite
que contienen BA-C_{18}.
PB - Cuentas de poliestireno.
PB/BA-C_{18} - PB que contienen
BA-C_{18}.
PB/nC_{10} - PB que contienen
tetra-(n-decil)ftalocianina aluminio.
PBS - Solución salina tamponada con fosfato, 0,02
M NaP_{i}, 0,14 M NaCl, pH 7,2.
P_{i} - fosfato.
Sulfo-NHS -
Sulfo-N-hidroxisuccinamida.
TSH - Hormona estimuladora de la tiroides u
hormona tirotrópica.
SATA - N-hidroxisuccinimida éster
del ácido S-acetiltioglicólico.
RLU - Unidades de luz relativas.
Ab_{1}(HCG) - Anticuerpo monoclonal
anti-HCG\beta (12A8).
Ab_{2}(HCG) - Anticuerpo monoclonal
anti-HCG\alpha (9D7).
Ab_{1}(TSH) - Anticuerpo monoclonal
anti-TSH\beta_{1} (35).
Ab_{2}(TSH) - Anticuerpo monoclonal
anti-TSH\beta_{2} (9G3). (Nota: para
Ab_{1}(TSH) y Ab_{2}(TSH), Ab_{1} y Ab_{2} son
anticuerpos contra la cadena \beta de la TSH, contra dos epítopos
diferentes).
NHS - N-hidroxisuccinamida.
IF - Factor intrínseco.
DMSO - Dimetilsulfóxido.
avidina-PB/BA-C_{18}
- PB/BA-C_{18} unido covalentemente a avidina.
Ab_{F}-PB/nC_{10} -
PB/nC_{10} recubiertas con Ab_{F}.
DMF - Dimetilformamida.
DCC - Diciclohexilcarbodiimida.
TEA - Trietilamina.
TLC - Cromatografía en capa fina.
TNBSA - ácido
2,4,6-trinitrobenzensulfónico.
Dig-CMO -
O-carboximetiloxima de
digoxigenina-3-ona.
BGG - Gammaglobulina bovina.
Biotina-LC_{7}-NHS
-
Sulfosuccinimidil-6-(biotinamido)-hexanoato.
Todos los anticuerpos monoclonales se produjeron
mediante tecnología estándar de células híbridas. En resumen, el
inmunogén apropiado se inyectó en un huésped, habitualmente un ratón
u otro animal apropiado, y después de un período de tiempo
apropiado, se obtuvieron células pancreáticas del huésped.
Alternativamente, se aislaron células no sensibilizadas del huésped
y se sensibilizaron directamente con el inmunogén in vitro.
Las células híbridas se formaron fusionando las células anteriores
con una línea celular de mieloma apropiada, y cultivando las células
fusionadas. Los anticuerpos producidos por las células híbridas
cultivadas se examinaron por su capacidad de unión al antígeno
concreto, por ejemplo, TSH o HCG. Se emplearon un cierto número de
técnicas de examen, tales como, por ejemplo, exámenes ELISA. A
continuación, se reclonaron las fusiones seleccionadas.
El conjugado
B_{12}-LC_{25}-F, con un brazo
espaciador con una longitud de 25 átomos de carbono (véase más
abajo), se preparó introduciendo grupos carboxílicos en la molécula
B_{12} haciendo reaccionar la molécula de B_{12} con
metilisocianatoacetato (el cual reacciona con el grupo hidroxilo de
la ribosa en la molécula de B_{12}, formando un enlace carbamato
estable), seguido por hidrólisis básica del metiléster para generar
el grupo carboxílico. El grupo carboxílico introducido en el sitio
5'-OH se convirtió en el éster NHS de B_{12}, y a
continuación se hizo reaccionar con la amina de fluoresceína
F-LC_{21}-NH_{2} para generar el
producto final
B_{12}-LC_{25}-F.
Se disolvieron 1,2 g (0,0056 moles) de la diamina
monoprotegida 1C1 en 25 ml de diclorometano anhidro, y a esta
disolución en agitación se añadieron 0,64 g (0,0056 moles) de
diglicólico anhidro 1A1, y se dejó la reacción durante 5
horas a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla de reacción, y
se extrajo con 50 ml de agua, 50 ml de etilacetato. Se lavó la fase
orgánica con HCl 0,1 N (50 ml), agua (2 \times 50 ml), y se secó
con MgSO_{4}, y se concentró al vacío para rendir 1,35 g de
1A2.
RMN-^{1}H 100 MHz (CD_{3}OD)
\delta 4,0, 3,85(2s, 4,
O-CH_{2}-CO), w 3,0, 2,82 (2t, 4,
NCH_{2}), \delta 1,4 (s, CH_{3}).
Se disolvieron 500 mg (1,33 moles) de
5-carboxifluoresceína, 1A3, (secada a 80ºC
sobre P_{2}O_{5}, al vacío 0,05 mm, 16 horas) en 20 ml de
dimetilformamida anhidra. A la solución en agitación se le añadieron
280 mg (1,46 mmoles) del
1-etil-3-dimetilaminopropilcarbodiimida,
y 168 mg (1,46 mmoles) de N-hidroxisuccinimida.
Después de agitarla durante 16 horas, se añadieron 400 mg (1,85
mmoles) de mono
t-Boc-1,6-diaminohexano,
y se agitó la mezcla durante 4 horas más a temperatura ambiente. La
mezcla resultante se concentró hasta una solución espesa, y se
disolvió en 1:9 metanol:etilacetato (100 ml), y se extrajo con agua
(3 \times 50 ml), HCl 0,1 N (100 ml). La fase orgánica se secó
sobre MgSO_{4} y se evaporó al vacío. El residuo se purificó sobre
Analtech 1000 \mu, placas GF de gel de sílice de 20 \times 20
cm, usando 0,5% de ácido acético y 10% de metanol en diclorometano.
Las bandas puras se juntaron y se extrajeron con (1:1)
metanol/diclorometano, se concentraron, y el residuo se disolvió en
el mínimo de metanol, y se añadió gota a gota en agua. A
continuación se centrifugó la mezcla y el sólido se secó al vacío,
rindiendo un 83% de 1A4.
Se trataron 3,5 g (0,0064 moles) de
mono-t-Boc
1,6-diaminohexil-5-carbonil
fluoresceína 1A4 (secada a 90ºC, sobre P_{2}O_{5}, en vacío de
0,05 mm, 16 horas) con 40 ml de diclorometano/ácido trifluoroacético
1/1. La disolución se arremolinó en un baño de hielo, y
transcurridos 5 minutos se evaporó el disolvente y se secó el
residuo crudo al vacío durante toda la noche.
Se combinaron 42 mg de
mono-t-Boc ácido
1,6-diaminohexilglicólico amida 1A2, 22 mg
(0,190 mmoles) de N-hidroxisuccinimida, y 36,4 mg
(0,190 mmoles) de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
en 4 ml de diclorometano anhidro, y se agitó a temperatura ambiente
durante 16 horas. La disolución del ácido activado se añadió, gota a
gota, a una disolución en agitación de 75 mg (0,127 mmoles) del
anterior derivado
1,6-diaminohexil-5-carboxilfluoresceína,
10 ml de dimetilformamida anhidra, y 66 ml de trietilamina. Después
de 1 hora, se disolvió la reacción en agua y se extrajo con acetato
de etilo. Se lavó la fase orgánica con agua (3 \times 25 ml), se
secó con MgSO_{4}, se concentró y purificó sobre una placa GF de
gel se sílice 1000 m Analtech de 20 \times 20 cm, 10% de metanol,
0,5% de ácido acético en diclorometano. La banda pura se aisló, se
extrajo con metanol/diclorometano, se concentró y secó al vacío. Se
disolvió el residuo en 4 ml de metanol y se añadió gota a gota a HCl
0,1 N (8 ml) arremolinado, se centrifugó y se secó. 84 mg de
1A5, rendimiento del 84%.
RMN-^{1}H 500 MHz (CD_{3}OD)
\delta 8,4 (d, 1, ArH, J=0,71 Hz) \delta 8,17 (dd, 1, ArH, J=8,0
Hz) \delta 7,3 (d, 1, ArH, H=8,0 Hz) \delta 4,04 (d, 4,
O-CH_{2}-CO) \delta 1,41 (s, 9,
3CH_{3})
Anal. Calc. para C_{42}H_{52}N_{4}O_{11}
: C, 63,7; H, 6.8; N, 7,0
Encontrado: C, 63,56; H, 6,64; N, 7,0
A la anterior amina, t-Boc de
cadena larga de 21 átomos, de la
5-carboxifluoresceína (secada a 80ºC sobre
P_{2}O_{5}, al vacío de 0,05 mm) se le añadieron 5 ml de ácido
trifluoroacético a temperatura ambiente. Transcurridos 5 minutos se
evaporó el ácido y se secó a continuación a 80ºC al vacío para
rendir la sal del ácido trifluoroacético 1A6.
FAB-MS C_{37}H_{44}N_{4}O
(M+H)^{+} 689.
Se disolvieron 25 mg (0,0185 mmoles) de vitamina
B_{12} (1B1) (secada durante 48 horas a 80ºC, 10 \mu) en
1,25 ml de dimetilsulfóxido anhidro. A esta disolución en agitación
se añadieron 21,2 mg (0,185 mmoles) de metilisocianoacetato y se
dejó progresar la reacción durante 24 horas a temperatura ambiente.
La mezcla de reacción se añadió gota a gota dentro de 10 ml de una
disolución de acetato de etilo en agitación. Se centrifugó el
producto precipitado, se resuspendió, a continuación, en una
cantidad mínima de metanol, y se precipitó de nuevo. Este material
se purificó sobre una placa preparativa Whatman PLC_{18}F 1000
\mu de 20 \times 20 cm, eluyente 2:8 isopropanol: agua que
contiene 0,5 ml de ácido acético + 1 g de NaCl por cada 100 ml. Rf =
0.625. El aislamiento a partir del absorbente rindió el metiléster
1B2.
(+)-FAB-MS
(C_{67}H_{93}CoN_{15}O_{17}P), P.M. 1469,6; (M+H)
1470,(M-CN)^{+} 1444.
Se disolvieron 40 mg (0,0272 mmoles) del
B_{12}O^{5}'-carbonilglicina metiléster
1B2 en 2,5 ml 2/1 metanol/agua, pH ajustado a 9,5 con
hidróxido amónico, y se agitaron durante 16 horas a temperatura
ambiente.
análisis de tlc Whatman KC_{18}F
2:8 isopropanol: agua, 0,5% ácido acético, 1%
NaCl
Rf 0,79
La mezcla de reacción se concentró hasta
sequedad, y el producto se aisló usando dos placas Whatman
PLC_{18}F 1000 \mu, 20 \times 20 cm, el mismo eluyente que más
arriba. Se extrajo la banda pura con metanol, se concentró el
extracto, se disolvió en 2:7 metanol-diclorometano,
se filtró y concentró. Se disolvió el residuo en 4 ml de metanol, y
se añadió gota a gota a 4 ml de etiléter. Se centrifugó el
precipitado y se secó a 60ºC, sobre P_{2}O_{5}, 0,5 mm, 16
horas, para obtener 28 mg de producto 1B3.
(+)-FAB-MS
(C_{66}H_{91}CoN_{15}O_{17}P), P.M. 1455,7;
(M+H)^{+} 1456,(M-CN)^{+}
1431.
Se combinaron 15 mg (0,013 mmoles) de
B_{12}O^{5}'-carbonilglicina 1B3, 3,66
mg (0,016 mmoles) de N,N-diciclohexilcarbodiimida,
1,95 mg (0,017 mmoles) de N-hidroxisuccinimida, con
5 ml de dimetilformamida anhidra, y se agitaron a temperatura
ambiente durante 16 horas. Se añadió la mezcla de reacción gota a
gota a una solución en agitación de 13,6 mg (0,17 mmoles) amina de
cadena larga de 21 átomos de la
5-carboxifluoresceína 1A6 en 2,02 mg (0,02
mmoles) de trietilamina en 4 ml de dimetilformamida seca, y se
agitaron durante 12 horas a temperatura ambiente.
El crudo de la reacción se concentró al vacío a
40ºC, y el residuo se disolvió en 2 ml de metanol, y se precipitó
con 6 ml de etiléter, y se centrifugó. El sólido se purificó sobre
una placa Whatman PLC_{18}F de 1000 \mu, 20 \times 20 cm,
eluyente 7:3 metanol:agua, 0,5% ácido acético, Rf 0,78, 37% de
rendimiento de 1B4.
(+)-FAB-MS
(C_{103}H_{133}CoN_{19}O_{25}P), (M+H)^{+} 2125,
(M-CN)^{21} UV/max 360 (\varepsilon
26.600), 50 (\varepsilon 57.000), 550 (\varepsilon 9500).
Los anticuerpos monoclonales de antifactores
intrínsecos (Ab_{IF}) se prepararon mediante tecnología estándar
de células híbridas basada en la descrita por Kohler y Milstein en
Nature 256 (1975) 495-497.
Usando
biotina-LC_{7}-NHS de Pierce
Chemical Co., Rockford, Ill, se realizaron tres niveles de
biotinilación (Ab_{IF}:
biotina en la mezcla de reacción = 1:10, 1:50, ó 1:200). El Ab_{IF} estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05, pH = 7,8, a [IgG] = 2,5 mg/ml. A esta disolución se le añadió DMSO (1% del volumen total) que contenía la cantidad requerida de biotina-LC_{7}-NHS, y, a continuación, se incubó la solución durante toda la noche a 4ºC. Finalmente, las mezclas de reacción se purificaron sobre Sephadex® G25, y se dializaron extensivamente frente a NaP_{i} 0,05 M, 0,02% de NaN_{3}, pH = 7,2. Los anticuerpos antifactor intrínseco biotinilados se almacenaron congelados.
biotina en la mezcla de reacción = 1:10, 1:50, ó 1:200). El Ab_{IF} estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05, pH = 7,8, a [IgG] = 2,5 mg/ml. A esta disolución se le añadió DMSO (1% del volumen total) que contenía la cantidad requerida de biotina-LC_{7}-NHS, y, a continuación, se incubó la solución durante toda la noche a 4ºC. Finalmente, las mezclas de reacción se purificaron sobre Sephadex® G25, y se dializaron extensivamente frente a NaP_{i} 0,05 M, 0,02% de NaN_{3}, pH = 7,2. Los anticuerpos antifactor intrínseco biotinilados se almacenaron congelados.
Látex modificado con carboxilato, 175 nm: Bangs
Laboratories, Inc., Carmel, IN 46032.
Látex modificado con carboxilato, 38 nm: Duke
Scientific Corporation, Palo Alto, CA 94303.
Etilenglicol, alcohol bencílico, benzonitrilo:
Aldrich Chemical Co.
Sephadex® G-25: Pharmacia.
nC_{10}: Ultra Diagnostics Corporation,
Seattle, WA 98105.
Se preparó una solución 2,1 mM de nC_{10} en
alcohol bencílico. Se colocó etilenglicol (16 ml) en un vial de
vidrio de 20 ml, y se calentó hasta 100ºC sobre una placa caliente
de laboratorio. Se añadió el alcohol bencílico (1,6 ml) y se agitó
la mezcla magnéticamente. Se añadió una solución de reserva de látex
(2 ml, látex de 38 nm, modificado con carboxilato, conteniendo un
10% de sólidos) y se dejó equilibrar la mezcla durante 3 a 4
minutos. La solución de nC_{10} (0,4 ml) se añadió lentamente en
alícuotas de 100 \mul. Se continuó el calentamiento a 100ºC
durante 5 minutos, entonces se dejó enfriar la mezcla hasta
temperatura ambiente. Después de enfriada, se aplicó la mezcla a una
columna de Sephadex G-25 (2,5 \times 15 cm)
equilibrada con etanol acuoso al 50%. Las fracciones que contenían
látex se juntaron y se aplicaron a una segunda columna de Sephadex
G-25 (2,5 \times 35 cm) equilibrada con agua. Se
eluyó el látex en un volumen de 30 ml.
Se preparó una disolución 2,1 mM de nC_{10} en
alcohol bencílico. Se colocó etilenglicol (80 ml) en un frasco
Erlenmeyer de 125 ml, y se calentó hasta 110ºC sobre una placa
caliente de laboratorio. Se añadió el alcohol bencílico (8 ml) y se
agitó la mezcla magnéticamente. La disolución de nC_{10} (2 ml) se
añadió inmediatamente mediante suspensión de látex de reserva (10
ml, látex de 175 nm, modificado con carboxilato, conteniendo un 10%
de sólidos). Se continuó el calentamiento a 100ºC hasta 110ºC
durante 10 minutos mientras se agitaba enérgicamente. A continuación
se colocó el frasco en un baño con agua a temperatura ambiente para
enfriarlo. Después de enfriada, se diluyó la mezcla con un volumen
igual de etanol, e inmediatamente se centrifugó a 15.000 rpm
(Sorval, rotor SA 600) durante dos horas. Se decantó el sobrenadante
débilmente azul, y se resuspendió el precipitado en etanol acuoso al
50% (20 ml) usando un sonicador de baño para dispersar las
partículas. La centrifugación se repitió a 15.000 rpm 1 hora. Los
sobrenadantes se decantaron y se resuspendió el precipitado en agua.
A continuación de una centrifugación final, se resuspendieron los
precipitados en agua hasta un volumen final de 20 ml.
3. La unión de la cuentas al Ab_{F} se describe
en el Ejemplo 3, parágrafo V
Se preparó una solución de
BA-C_{18} en benzonitrilo. Se colocó el
etilenglicol (80 ml) en un frasco Erlenmeyer y se calentó hasta
100ºC sobre una placa caliente de laboratorio. Se añadió
benzonitrilo (9 ml) y se agitó la mezcla magnéticamente. La
disolución de BA-C_{18} (1 ml) se añadió seguida
inmediatamente por la suspensión de látex de reserva (10 ml, látex
de 175 nm, conteniendo un 10% de sólidos, descrita más arriba). Se
continuó el calentamiento a 100ºC durante 5 minutos mientras se
agitaba enérgicamente. A continuación, se colocó el frasco en un
baño de agua a temperatura ambiente para enfriarlo. Después de
enfriada, se diluyó la muestra con un volumen igual de etanol acuoso
al 50%, y se centrifugó inmediatamente a 15.000 rpm (Sorval, rotor
SA 600) durante un total de 4 horas. Se decantó el sobrenadante, y
se resuspendió el sobrenadante en etanol acuoso usando un sonicador
de baño para dispersar las partículas. Se repitió la centrifugación,
15.000 rpm durante 1 hora. Se decantaron los sobrenadantes y se
resuspendió el precipitado en agua. A continuación de una
centrifugación final, se resuspendieron los precipitados en agua
hasta un volumen final de 20 ml.
La unión de la cuentas a avidina se describe en
el ejemplo 3, parágrafo VI.
Se realizó el ensayo mezclando 100 \mul de
calibradores B_{12} (diluidos a partir de una disolución de
reserva original de 10 \mug/ml de B_{12}, 10 \muM KCN) en
tampón de ensayo (0,05 M KPi, 0,1% de BSA, pH 7,5, el BSA
estaba libre de B_{12} y unidor de B_{12}) con 50 ml de 2,2
ng/ml B_{12}-LC_{25}-F, y 50
\mul de 88 ng/ml de factor intrínseco (IF) mezclados previamente
con 8,8 \mug/ml Ab_{IF}-biotina. Estas mezclas
se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la
oscuridad; a continuación se añadieron 0,75 ml de tampón 0,05
Tris-HCl, 0,05 NaP_{i}, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton
X-100, pH 8,2, que contenían 10^{10}
cuentas de avidina-PB/BA-C_{18} y
2,5 \times 10^{11} cuentas
Ab_{F}-PB/nC_{10}, en cada tubo y se continuó
la incubación durante 30 minutos adicionales mediante agitación en
la oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, cada tubo se
iluminó durante un minuto usando, como fuente de luz, una lámpara
halógena ajustada con un filtro de corte a 650 nm, y, a continuación
se midió la quimioluminiscencia integrando durante 20 segundos
usando un luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la
Figura 1.
Los anticuerpos monoclonales
anti-digoxina (Ab_{Dig}) se prepararon según
tecnología estándar de línea celular híbrida, y los anticuerpos se
purificaron mediante Proteína-A inmovilizada. A
continuación, se preparó la Ab_{Dig}-biotina
mezclando juntos el anticuerpo (aproximadamente
2-2,5 mg/ml en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M,
pH 7,8) y
biotina-LC_{7}-NHS (Pierce
Chemical Co., Rockford, Ill.) (solubilizada primero en DMF, y una
pequeña alícuota se usó para la reacción) e incubando durante tres
horas a 4ºC. En la mezcla de reacción, la relación molar de los
reactivos fue
anticuerpo:biotina-LC_{7}-NHS =
1:25. La biotina no acoplada se retiró mediante una columna
Sephadex G-25. El conjugado final se guardó en
NaP_{i} 0,05 M, 0,001% de Thimerosal, pH = 7,4, a 4ºC o
congelado.
Este reactivo se preparó en tres pasos sucesivos
mediante la preparación de (1) F-NHS, (2)
F-LC_{9}-NH_{2}, y (3)
Dig-LC_{9}-F.
A 2 ml de 100 mg/ml de
6-carboxifluoresceína y 30,6 ml/ml de NHS en DMF se
les añadieron 0,4 ml de 275 mg/ml de DCC. Se agitó la mezcla durante
toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La
diciclohexilurea formada se retiró mediante filtración. La formación
del F-NHS se comprobó mediante TLC sobre placas de
sílice, usando el sistema disolvente CH_{2}Cl_{2}:metanol:ácido
acético = 85:15:1. El DMF se extrajo mediante un rotavapor, y el
producto (F-NHS) se secó más aún bajo presión
reducida, y se guardó desecado a 4ºC.
A 1,5 ml de una solución de
bis-(3-aminopropil)-metilamina
(LC_{9}) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) en DMF se les
añadieron 1,2 ml de 125 mg/ml F-NHS en DMF, seguido
de la incubación a temperatura ambiente durante toda la noche con
agitación en la oscuridad. La proporción molar de
F-NHS:LC_{9} fue de 1:40. A continuación, la
mezcla de reacción se diluyó 1/20 con NaP_{i} 0,5 M pH 5,0,
y el pH de la mezcla se ajustó a 5,0 mediante adición de
ácido fosfórico (1,0 M), y toda la muestra se cargó sobre una
columna de BioRex-70® (2,5 \times 10 cm),
equilibrada en NaP_{i} 0,5 M/pH = 5,0. Una vez cargada, se
lavó la columna con el tampón inicial hasta que se retiró toda la
bis-(3-aminopropil)metilamina (seguido por
la reacción TNBSA). Se lavó la columna con NaP_{i} 0,001
M/pH = 6,0 para retirar la
6-carboxifluoresceína contaminante. El lavado con
tampón de baja fuerza iónica retiró, no tan sólo la
6-carboxifluoresceína, sino también otros
contaminantes que contenían fluoresceína, los cuales no se han
identificado. Entonces, se lavó la columna con
D-H_{2}O para retirar las sales. Finalmente, se
vació la columna con NH_{4}OH 0,8 M. El hidróxido amónico se
retiró mediante liofilización. Después de comprobar su pureza, se
almacenó el producto desecado a -20ºC. La reacción se siguió (y la
pureza del producto se verificó) mediante electroforesis sobre papel
(NaP_{i} 0,05 M/pH = 5,8, 20 minutos, usando el sistema de
electroforesis paragon) y mediante TLC (placas de C_{18}, usando
metanol al 50% en D-H_{2}O como solvente).
Se preparó una solución que contenía 23,05 mg
(0,05 mmoles) de Dig-CMO tal como se describe en la
patente estadounidense nº 4.039.385, Ejemplo 2, la descripción de la
cual se incorpora en ésta por referencia, 50,35 mg (0,1 mmoles) de
F-LC_{9}-NH_{2} y 19,2 mg (0,1
mmoles) de EDAC en 1,5 ml de disolvente DMF/DMSO (5:1) se agitaron
durante toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La
Dig-LC_{9}-F y la
Dig-CMO (si había quedado algo sin reaccionar) se
precipitaron añadiendo 3 ml de D-H_{2}O, se
filtraron, y se descartó el disolvente. El material filtrado se
resolubilizó en un sistema disolvente consistente en
CH_{2}Cl_{2}:metanol:ácido acético = 60:40:5, y se cargó sobre
una columna de gel de sílice de (1,5 \times 20 cm) en el mismo
sistema disolvente. En estas condiciones, la Dig-CMO
se adelantó al conjugado
Dig-LC_{9}-F, y la
F-LC_{9}-NH_{2} permaneció unida
a la parte superior de la columna. La pureza del material se
verificó mediante placas de TLC de gel de sílice, usando el sistema
disolvente descrito más arriba, y mediante electroforesis sobre
papel a pH = 5,8. Los disolventes se retiraron del material
purificado mediante rotavapor, y se resolubilizó el producto en un
volumen mínimo de metanol/DMF (70:30), y se centrifugó a
continuación para retirar los materiales insolubles (gel de sílice).
El último paso se realizó para extraer la mayor parte del gel de
sílice, el cual podía solubilizarse y co-eluirse con
el producto durante la purificación. Se almacenó el producto en un
sistema disolvente metanol/DMF (70:30) a -10ºC hasta -20ºC. La
concentración del producto se determinó mediante A_{490} a partir
de una curva estándar construida usando cantidades conocidas de
6-carboxifluoresceína.
El ensayo se llevó a cabo mezclando 50 ml de
calibradores de digoxina en suero (suero humano normal sin TSH) con
50 \mul de 1,74 ng/ml de conjugado
digoxina-LC_{9}-F en tampón de
ensayo (Tris-HCl 0,05 M, NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15
M, 2 mg/ml BSA, 0,2 mg/ml BGG/pH 8,2), y 50 \mul de 160
ng/ml Ab_{Dig}-biotina en el mismo tampón
anterior. Estas mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante
15 minutos, a continuación se añadieron 0,75 ml de tampón
Tris-HCl 0,05, NaP_{i} 0,05, NaCl 0,15 M,
pH 8,2, conteniendo 10^{10} cuentas aceptoras
(avidina-PB/BA-C_{18}) y 2,5
\times 10^{11} cuentas sensibilizadoras
(Ab_{F}-PB/nC_{10}), en cada tubo, y se continuó
la incubación, durante 30 minutos más, mediante agitación en la
oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, se iluminó cada tubo
durante un minuto usando, como fuente de luz, una lámpara halógena
ajustada con un filtro de corte a 650 nm, y a continuación se midió
la luz quimioluminiscente durante 20 segundos e integración con un
luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen en la Figura
2.
A. El BA-C_{18} se sintetizó
mediante el procedimiento siguiente.
Todos los reactivos se obtuvieron de Aldrich
Chemical Co., excepto cuando se indica.
A 100 ml de una disolución recién destilada de
tetrahidrofurano (THF) se le añadió ácido
p-formilfenoxiacético
(K & K Labs) (P.M. 180, 0.540 g, 3,0 mmoles), trietilamina (P.M. 101,19, 0,333 g, 3,3 mmoles), y trimetilacetilcloruro (P.M. 120,57, 0,398 g, 3,3 mmoles). Después de 20 minutos de calentamiento a reflujo, se añadió dioctadecilamina (Fluke) (P.M. 522,01, 1,723 g, 3,3 mmoles). La reacción se hizo refluir durante toda la noche.
(K & K Labs) (P.M. 180, 0.540 g, 3,0 mmoles), trietilamina (P.M. 101,19, 0,333 g, 3,3 mmoles), y trimetilacetilcloruro (P.M. 120,57, 0,398 g, 3,3 mmoles). Después de 20 minutos de calentamiento a reflujo, se añadió dioctadecilamina (Fluke) (P.M. 522,01, 1,723 g, 3,3 mmoles). La reacción se hizo refluir durante toda la noche.
Al día siguiente, se diluyó la mezcla de la
reacción, y se extrajo de la solución de la reacción con cloruro de
metilo. Los extractos de cloruro de metilo se secaron sobre sulfato
sódico.
A la
10-dimetoxifosfinil-9-metilacridina
(Monatshi Chem., 114(3) (1988) (P.M. 303,27, 0,100 g, 3,3
mmoles) en THF anhidro se le añadieron 0,413 ml de una solución 1,6
M de n-butil litio en hexano a -78ºC (baño de
acetona/hielo seco) bajo argón. A partir de la adición de la
solución n-butil litio, la disolución apareció
amarilla. Se añadió una solución de la anterior amida en THF 20
minutos después de la adición del n-butil litio. Se
dejó que la disolución de reacción se calentara hasta temperatura
ambiente durante toda la noche.
Al día siguiente se aisló el producto mediante
TLC (gel de sílice, 3:7 acetato de etilo/hexano). El producto
aislado se analizó mediante espectro de masas y RMN, y se almacenó
en la oscuridad.
B. El colorante (nC_{10}) generador de oxígeno
singlete procedía de ULTRA Diagnostic Corporation; EDAC, SATA, HCG,
y BSA procedían de Sigma Co. El
Ab_{1}(TSH)-biotina y el
Ab_{2}(HCG)-biotina, y el
Ab_{2}(TSH)-F se prepararon mediante
procedimientos similares a los descritos en el EJEMPLO 1, parágrafo
II (véase también la US con número de serie 07/389.659 presentada el
4 de agosto de 1989, equivalente a la publicación de patente europea
nº 411.945 publicada el 6 de febrero de 1991, cuyas partes
relevantes se incorporan en ésta por referencia).
Se usó un luminómetro procedente de Turner
Designs (modelo 20e).
Las gotas de aceite (OD) marcadas con anticuerpo
anti-HCG se prepararon transfiriendo 1 ml de 10
mg/ml anti-HCG-\beta (12A8, IgG)
a un tubo de vidrio conteniendo 50 \mul de
BA-C_{18} en 5 mM, en dibutilftalato. La proteína
estaba en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6. El aceite se
emulsionó mediante sonicación y mezcla mecánica continua simultánea.
Debería destacarse que se precisaron sonicadores de elevada energía
para preparar gotas de aceite más pequeñas. La sonicación se realizó
durante 7 minutos usando un sonicador Bronson (como refrigerante se
usó agua corriente a temperatura ambiente). La proteína no unida se
extrajo añadiendo una solución de Na_{2}SO_{4} al 25% hasta
conseguir una concentración final de 8% al 9%, y centrifugando, a
continuación, (microcentrífuga, posición 8, durante 10 minutos). El
paso de lavado se realizó tres veces (la velocidad de centrifugación
debería ajustarse de tal manera que las gotas de aceite se separan
pero no coalescen). Después del lavado final se suspendieron las
partículas en 1 ml de NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml BSA,
pH 7,6, y se sonicaron de nuevo durante tres minutos. El
volumen final de la preparación se ajustó a 5 ml, y se añadió
sacarosa hasta una concentración final del 2%. Estas partículas
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18}
se almacenaron a 4ºC. Las gotas de aceite se prepararon mediante el
procedimiento descrito más arriba, y eran heterogéneas en tamaño con
un diámetro promedio de 1-5 \mu.
Los liposomas se prepararon mediante el
procedimiento de dilución en metanol. Típicamente, una mezcla de
lípidos: colesterol (2,0 mg), DPPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster,
Ala.) (23,8), DPPG ((Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala.) (6,5 mg),
maleimida-DPPE (Molecular Probe, Eugene, Ore.) (0,5
mg), y nC_{10} (se disolvieron 0,5 mg en metanol templado (200
\mul), y, a continuación, se añadieron a 2 ml de
tampón-B (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M, EDTA 5 mM,
pH 6,0) agitado en vórtice. A continuación se pasó la
suspensión a través de una columna (1,5 \times 20 cm) de Sephadex
G-25 en tampón B. Las fracciones que contenían los
liposomas juntos se centrifugaron mediante una microcentrífuga para
suprimir cualquier partícula grande, cuando fue necesario.
Finalmente, los liposomas que contenían maleimida se añadieron
lentamente a una disolución en agitación de
avidina-SH succinilada en tampón B (preparada tal y
como se describe más arriba). Después de hacer fluir argón, se agitó
suavemente esta mezcla (sin barra de agitación) durante toda la
noche a 4ºC. Los grupos maleimida en exceso se bloquearon con ácido
mercaptosuccínico 2 mM (en volumen de reacción) durante 30 minutos a
4ºC, seguido por la adición de ácido iodoacético hasta una
concentración final de 5 mM para bloquear los grupos tiol en exceso
(30 minutos a 4ºC). A continuación, se concentró la mezcla de
reacción hasta 2,5-3 ml con un aparato
Centriprep-30®, y las moléculas de avidina no
acopladas se extrajeron mediante filtración en gel en una columna
(1,5 \times 50 cm) de Sepharosa-2B en tampón
B.
Se hizo reaccionar la avidina con SATA (5 moles
por mol de avidina) (10 mg/ml de avidina en NaP_{i} 1M, pH
7,4) durante la noche a 4ºC. A la misma solución se le añadió
anhidro succínico en DMF (50 moles por mol de avidina) (el DMF total
fue inferior al 1% del volumen de reacción), y se incubó la solución
durante 2 horas. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a
7,4 mediante la adición de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M. Los grupos tiol
protegidos (tioéster) se liberaron con hidroxilamina (0,1 M a
pH 7,0) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente,
las moléculas de bajo peso molecular en exceso se extrajeron
mediante el uso de una columna 1,5 \times 30 cm de
G-25 en tampón B (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,05 M,
EDTA 5 mM, pH 6,0, desgasada y saturada con argón). Se
recogió el pico de proteína (avidina-SH) y se hizo
reaccionar la proteína con liposomas que contenían maleimida.
Se tiñeron cuentas de poliestireno carboxiladas
(38 nm) (Véase Ejemplo 1, párrafo IIIB) con nC_{10}. Se usó la
química de conjugación EDAC/sulfo-NHS para acoplar
el Ab_{F} a estas cuentas de poliestireno. Típicamente, 10 ml de
NaP_{i} 0,02 M, que contenía 5 mg/ml de cuentas de poliestireno
carbozilado teñidas con nC_{10} y 11 mg/ml
sulfo-NHS (pH ajustado a 5,5) se mezclaron
con 1 ml de una solución recién preparada de EDAC (200 mg/ml) en
D-H_{2}O. Después de incubar a temperatura
ambiente (en la oscuridad) durante 25 minutos, se centrifugaron las
cuentas para eliminar el exceso de EDAC (puesto que la EDAC causa
microagregación de estas cuentas, fue posible apelotonarlas con
centrífugas convencionales, por ejemplo, Sorval usando un rotor
SA-600 a 15.000 rpm). Las cuentas precipitadas se
resuspendieron en 3 ml de NaP_{i} 0,005 M/pH 5,8, y
entonces se transfirieron dentro de una solución de proteína agitada
(15 ml de Borax 0,02 M, NaCl 0,08 M, 2 mg/ml 3G1 IgG (Ab_{F}), 8
mg/ml BSA, pH 8,9). Se agitó la mezcla suavemente (sin
remover) durante toda la noche a 4ºC. Los grupos reactivos que
permanecían en las cuentas, si había alguno, se bloquearon con
glicina 0,083 M y 15 mg/ml de BSA, pH 8,9, a 4ºC durante 60
minutos. Las proteínas no acopladas se suprimieron mediante lavados
sucesivos con NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6. El
precipitado final se resuspendió en el tampón de lavado, se sonicó,
y se almacenó, tal como estaba, a 4ºC. El tamaño final de las
cuentas era de 140 nm.
Se tiñeron cuentas de látex carboxiladas (0,175
\mu) con el BA-C_{18} (véase Ejemplo 1, párrafo
IIIC). Se usó la química de conjugación
EDAC/sulfo-NHS para conjugar la avidina a estas
partículas. La activación de las cuentas mediante
sulfo-NHS/EDAC se realizó de la misma manera como se
ha descrito más arriba para la preparación de
Ab_{F}-PB/nC_{10}. Se centrifugaron las cuentas
activadas (100 mg) para eliminar el exceso de EDAC, a continuación
se resuspendieron en 2,5 ml de NaP_{i} 0,005 M/pH 5,8, y se
transfirieron a una solución de avidina agitada (15 ml de Borax
0,025 M, 1,33 mg/ml de avidina, pH 9,1). A continuación se
agitó la mezcla suavemente a 4ºC durante toda la noche. Los avidina
en las cuentas se succiniló mediante la adición de 20 \mul de
anhidro succínico en DMF (en exceso molar de 60 veces sobre la
avidina) y se incubaron a 4ºC durante aún 1 hora más. Se bloquearon
las cuentas con 7 mg/ml de BSA (concentración final en la mezcla de
reacción) durante 60 minutos, a 4ºC. Finalmente, se lavaron las
cuentas tres veces con NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6
mediante centrifugación, y se almacenaron en 10 ml de tampón de
lavado. En el último paso, se sonicaron las cuentas para obtener
partículas monodispersas. El tamaño de las cuentas no cambió
significativamente después del marcaje con proteína (\sim190 nm).
La avidina-PB/BA-C_{18} se
almacenó en tampón de lavado a 4ºC.
6-carboxifluoresceína, Kodak;
éster biotina-NHS, Pierce Chemical Co.;
4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina,
Aldrich Chemical Co.; DMF seco destilado sobre óxido cálcico; resina
de intercambio aniónico Ag-MP-1
(Cl^{-}), BioRad Laboratories.
Se disolvió la
6-carboxifluoresceína (VII 1) (10 g, 26,6
mmoles) en DMF seco (25 ml). La N-hidroxisuccinimida
(3,22 g, 28 mmoles) se añadió como un sólido a la solución de DMF, y
se dejó disolver. A continuación, se mezcló la solución en un baño
helado. La diciclohexilcarbodiimida (5,8 g, 28 mmoles) se disolvió
en DMF seco (10 ml) y se añadió todo a la vez a la solución fría de
DMF. Se mezcló la mezcla a temperatura de un baño de hielo durante
30 minutos, y entonces se dejó volver a temperatura ambiente. El
curso de la reacción se siguió mediante TLC (10%
MeOH-CH_{2}-Cl_{2} conteniendo
un 1% de ácido acético). Transcurridas 3 horas, la formación del
éster fluoresceína-NHS VII2 fue completa.
Se diluyó la
4,9-dioxa-1,12-dodecanodiamina
(25,5 g, 125 mmoles) con DMF seco (10 ml). Se enfrió la mezcla de
reacción del éster de fluoresceína-NHS en un baño
de hielo, en atmósfera de argón, y la solución de diamina se añadió
gota a gota a lo largo de un período de 5 minutos. Se retiró el baño
enfriador, y se continuó la agitación a temperatura ambiente. El
curso de la reacción se siguió mediante TLC usando el sistema
anterior. Cuando se consideró que la reacción se había completado,
se diluyó la mezcla con agua (100 ml), y se enfrió con hielo para
precipitar la diciclohexilurea, la cual se retiró mediante
filtración.
El filtrado se convirtió en una "papilla"
con la resina de intercambio aniónico
AG-MP-1(Cl^{-}), y se
vertió dentro de una columna de cromatografía. Se lavó la resina con
metanol acuoso al 50% hasta que ya no pudo detectarse la diamina
libre mediante ninhidrina. Entonces se eluyó la resina con ácido
clorhídrico 0,1 N en metanol acuoso al 50%. La fluoresceína amina
hidrocloruro eluyó primero, seguida por la
6-carboxifluoresceína. Las fracciones puras se
juntaron y se llevaron hasta sequedad en un rotavapor. Después del
secado bajo vacío elevado se recuperaron 3,4 g de fluoresceína amina
hidrocloruro VII3 pura.
La fluoresceína amina hidrocloruro VII3
(350 mg, 0,61 mmoles) se disolvió en DMF seco (15 ml). Se añadió
trietilamina (300 ml) seguida del éster biotina-NHS
(445 mg, 0,8 mmoles). El curso de la reacción se siguió mediante TLC
(MeOH-CH_{2}Cl_{2}/ácido acético/agua,
20:78:1:1). Cuando se consideró que la reacción se había completado,
se retiró el DMF en un rotavapor. Se disolvió el residuo en metanol
(10 ml) y se convirtió en una "papilla" con gel de sílice (10
g). Se secó la papilla en un rotavapor hasta obtener un polvo que
fluía libremente, el cual se convirtió en papilla en diclorometano y
se aplicó a la parte superior de una columna de gel de sílice (2,5
\times 25 cm) equilibrada con diclorometano. Se eluyó la columna
con la anterior mezcla de solventes para TLC. Las fracciones que
contenían producto se juntaron y se eliminó el disolvente en un
rotavapor. Se disolvió el residuo en etanol y se filtró. El filtrado
se evaporó lentamente, y el producto se depositó como una goma. Se
secó la goma bajo vacío elevado para obtener 350 mg de
fluoresceína-LC_{21}-biotina VII4
(F-LC_{21}-biotina), la cual se
usó sin más caracterización.
Se realizó un ensayo de HCG mezclando junto
primero HCG (cantidades variables),
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18},
y Ab_{2}(HCG)-biotina. Después de la
incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se añadió una
cantidad en exceso de avidina-Lip/nC_{10}, y se
continuó la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos
más. Finalmente, se iluminaron los tubos durante 1 minuto cada uno,
y se midió la luminiscencia durante 20 segundos.
Combinar:
50 \mul de HCG en concentraciones variables en
tampón de muestra (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 0,4% BSA, 20%
sacarosa, 4 mg/ml sulfato de dextrano (T-500),
pH 7,5).
50 \mul de 4 \mug/ml
Ab_{2}(HCG)-biotina en tampón de ensayo
(NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 0,4% BSA, pH 7,5), y
50 \mul de reactivo
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18}
(5 \times 10^{8} OD/tubo).
Incubar 1 hora a temperatura ambiente, con
agitación, y en la oscuridad.
Añadir:
50 \mul de 1,5 \times 10^{12}
avidina-nC_{10}-Lip (7,3 \times
10^{10} Lip/tubo).
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente, con
agitación, y en la oscuridad.
Iluminar durante 1 minuto, con lámpara halógena
(120 mW. de salida de luz cuando se usa un filtro de corte de 650
nm). A continuación, con la fuente de luz apagada, medir la
intensidad de luz emitida durante 20 segundos. Los resultados se
resumen en la Figura 3.
El ensayo se realizó mezclando 50 ml de
avidina-PB/BA-C_{18} (2 \times
10^{10} cuentas/ml), 50 ml de
Ab_{F}-PB/nC_{10} (5 \times 10^{12}
cuentas/ml), y 100 ml de
biotina-LC_{21}-F (cantidades
variables) en NaP_{i} 0,05 N, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de
BSA/pH 7,6. Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente
durante 1,5 horas con agitación en la oscuridad. Finalmente, se
iluminó cada tubo con una fuente de lámpara halógena (ajustada con
un filtro de corte de 650 nm) durante 1 minuto, transcurrido el cual
se midió la emisión de luz durante 20 segundos integrando la
intensidad de luz en un luminómetro Turner 20e. Los resultados se
resumen en la Figura 4.
El ensayo de TSH se realizó mezclando 200 \mul
de TSH en concentraciones variables en NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15
M, 4 mg/ml de BSA/pH 7,6, con 50 \mul de 4 \mug/ml de
Ab_{1}(TSH)-biotina y 4 \mug/ml de
Ab_{2}(TSH)-F. Estas mezclas se incubaron a
temperatura ambiente durante 1,5 horas. A continuación, se añadieron
100 \mul de PBS, conteniendo 10^{10} cuentas de
avidina-PB/BA-C_{18} y 2,5
\times 10^{11} cuentas de
Ab_{F}-PB/nC_{10}, en cada tubo. Se continuó la
incubación a temperatura ambiente durante otras 1,5 horas.
Finalmente, se iluminó cada tubo con una fuente de lámpara halógena
(ajustada con un filtro de corte de 650 nm), y después se midió la
emisión de luz integrando la intensidad de luz durante 20 segundos
(Figura 5 y Figura 6) en un luminómetro Turner 20e.
Gotas de aceite teñidas con colorante aceptor =
Ab_{1}(HCG)-OD/BA-C_{18}
(descritas en el EJEMPLO 3, parte II).
Ab_{2}(HCG)-biotina -
preparado de manera similar al Ejemplo 2, parte I, a partir del
derivado NHS de la biotina, comprado a Pierce Chemical Co.
Estreptoavidina-T680 - de
Ultralite Diagnostics Co., estreptoavidina marcada con el análogo
soluble en agua del colorante nC_{10} descrito más arriba.
El ensayo se realizó mezclando 50 ml del tampón
de muestra (NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA, 4 mg/ml
de dextrano-SO_{4} (T500), 20% de
sacarosa/pH 7,6) conteniendo cantidades variables de HCG con
50 \mul de 4 \mug/ml de
anti-HCG-biotina en tampón de ensayo
(NaP_{i} 0,05 M, NaCl 0,15 M, 4 mg/ml de BSA/pH 7,6) y 50
\mul del reactivo Ab_{1}(HCG)-OD/
BA-C_{19} conteniendo 5 \times 10^{8} gotas
de aceite. Esta mezcla se incubó durante una hora a temperatura
ambiente en la oscuridad. A continuación, se añadieron 50 \mul de
2\mug/ml de estreptoavidina-T680, en tampón de
ensayo en cada tubo, y la incubación continuó durante otros 30
minutos más. Finalmente, se iluminó cada tubo durante 1 minuto con
una fuente de luz de lámpara halógena (ajustada con un filtro de
corte de 650 nm), y entonces se midió la emisión de luz durante 20
segundos usando el luminómetro Turner 20e. Los resultados se resumen
en la Figura 7.
La secuencia diana se seleccionó a partir del
ADNJ del gen K12 de Escherichia coli (J. C. A. Bardwell, K.
Tilly, E. Craig, J. King, M. Zylicz, y C. Georgopoulos, J. Biol.
Chem. 261: 1782-1785 (1986)). Se preparó un
50mero con la secuencia mostrada mediante la estrategia del
fosfito-triéster usando un Biosearch 8750,
incluyendo una biotina incorporada en el extremo 5' usando
fosforamidito Biotina-ON^{TM} (Clontech, Palo
Alto, CA).
Secuencia:
GCGGGCGAAGGTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTA
La sonda fue un 30mero complementario incluyendo
una fluoresceína (F) anclada a una C modificada, con la
secuencia
CTGCCGGTGCGCCATG
\uelm{C}{\uelm{\para}{F}}TCGCCCGCTTCAC
La fluoresceína se introdujo mediante la
incorporación del nucleótido modificado
N^{4}-LCA-5-metildesoxicitidina
CEDT-fosforamidito (American Bionetics, Hayward,
CA) y el subsiguiente marcaje con el éster
N-hidroxisuccinimida de la
5-carboxifluoresceína, usando un exceso molar de
éster de 200 veces en pH 9,0 NaHCO_{3} que contiene un 30%
(v/v) de DMF. El producto crudo se purificó mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida. Las cuentas de
avidina-PB/BA-C_{18} y de
Ab_{F}-PB/nC_{10} fueron las mismas descritas en
ejemplos anteriores.
Se preparó una curva estándar para la diana
diluyéndola en serie en NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 600 mM,
pH 7,5, conteniendo 4 g/l de albúmina de suero bovino y 10
mg/l de ADN de timo de ternera como portadores. Se añadieron
alícuotas (5 \mul) a 4,8 pmoles de sonda marcada con fluoresceína
en 5 \mul del mismo tampón en tubos de ensayo de polipropileno de
12 \times 75. Se taparon las mezclas y se calentaron a 72ºC
durante 10 minutos para asegurar la total híbridación. Se añadieron
aproximadamente 10^{10} cuentas donantes (sensibilizador)
(Ab_{F}-PB/nC_{10}) en 50 \mul de
NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 600 mM, pH 7,5, conteniendo 4
g/l de albúmina de suero bovino, seguidas por 2,5 \times 10^{11}
cuentas aceptoras
(avidina-PB/BA-C_{18}) en 50
\mul del mismo [tampón]. Después de 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación en un agitador orbital, se iluminó cada tubo
durante 1 minuto usando una lámpara halógena con un filtro de 650 nm
tal y como se ha descrito en ejemplos anteriores. La generación de
luz se determinó durante 20 segundos usando un luminómetro Turner.
La curva estándar resultante se muestra en la Figura 8.
Se disolvieron 50 nmoles del oligonucleótido
5'-amino-modificado y desalado
(30-mero)
5'-UAA-TAC-AGG-TTG-TTG-CCT-TCA-CGC-TCG-AAA-3'
en 0,5 ml de tampón carbonato 0,1 M, pH
9,0. Se añadió una solución de
succinimidil-6-(biotinamido)hexanoato
(Pierce, #21336-G): 125 \mul de 120 mg/ml en DMF,
a la solución tampón. Se incubó la mezcla durante toda la noche, y
se purificó usando electroforesis preparativa (gel de poliacrilamida
al 12% y urea 7 M en tampón TBE (ácido tris bórico y EDTA): base
tris (tri(hidroximetil)-aminometano) 89 mM,
ácido bórico 89 mM, Na_{2} EDTA 2,5 mM (ácido
etilendiaminotetraacético), pH 8,3), a 400 voltios durante 4
horas. El oligonucleótido biotinilado se extrajo del gel y se diluyó
con 3 ml de NH_{4}CO_{3} 0,1 M a 37ºC durante la noche. El
material se purificó de nuevo sobre una Sep-Pak (una
columna C-18, Waters #51910), se secó al vacío, y se
suspendió en agua doblemente
destilada.
El rendimiento de la sonda biotinilada fue de
34,8 nmoles (58%).
Se preparó una solución de 50 nmoles del
oligonucleótido amino-modificado en la citosina del
medio (en la posición 14) (30-mero)
5'-CTG-CCG-GTG-CGC-CAT-GUT-CGC-CCG-CCT-CAC-3'
en una mezcla de tampón NaHCO_{3} 0,1 M,
pH 6,9 (190 \mul) y acetonitrilo (120 \mul). Se añadieron
200 \mul de una solución 0,1 M de succinimidil éster del
5/6-carboxifluoresceína (Molecular Probes, #01112)
en DMF a la disolución tampón. Se incubó la mezcla durante toda la
noche a temperatura ambiente. Los pasos restantes son los mismos que
los descritos más arriba para la sonda
biotinilada.
La sonda fluoresceinada se obtuvo con un
rendimiento del 41%.
Tris 10 mM
(Tris(hidroximetil)aminometano), KCl 50 mM, pH
8,3, conteniendo 5 mg/ml de sulfato de dextrano, NaCl 0,5 M, 1 mg/ml
de BSA (albúmina de suero bovino), y 25 \mug/ml de ADN de timo de
ternera.
Se añadieron 40 \mul de tampón de ensayo
conteniendo sonda fluoresceinada (1,5 pmoles) y sonda biotinilada
(1,2 pmoles) a 10 \mul de ADN diana sintético
(65-meros) diluido en series en tampón de ensayo. Se
hibridó la mezcla durante 5 minutos a 55ºC. Se añadieron las cuentas
(20 \mug de cuentas de avidina y 40 \mug de cuentas
anti-fluoresceína, cada una en 50 \mul de tampón
de ensayo). La solución que contenía las cuentas se incubó durante
15 minutos a 55ºC.
Las cuentas de avidina se prepararon cargando
cuentas de poliestireno de 0,175 \mu carboxiladas con
benzalacridina, y las cuentas se decoraron con avidina, usando la
química del EDAC
(1-etil-3-(dimetilaminopropil)-carbodiimida
hidrocloruro. Sigma Chemical Co., #E-6383).
La benzalacridina se preparó añadiendo 0,413 ml
de una solución 1,6 M de
n-butil-litio en hexano a
10-dimetoxifosfinil-9-metil-acridina
(Monatsh Chem. 114 3, 1988) en tetrahidrofurano anhidro (THF)
a -78ºC (baño de acetona/hielo seco) bajo argón. A partir de la
adición de la solución de
t-butil-litio, se añadió una
solución de la amida anterior en THF 20 minutos después de la
adición del t-butil-litio. Se dejó
calentar la solución de reacción hasta temperatura ambiente durante
toda la noche. A continuación se aisló el producto mediante TLC (gel
de sílice - 3:7 etilacetato/hexano). El producto aislado se analizó
mediante análisis del espectro de masas y RMN, y se almacenó en la
oscuridad.
Las cuentas anti-fluoresceína se
prepararon cargando cuentas carboxiladas de poliestireno de 0,04
\mu con
tetra-n-decil-Al-ftalocianina
(Ultra Diagnostics, Lote #GR11-82), y se decoraron
las cuentas con anticuerpo anti-fluoresceína usando
la química del EDAC.
La señal se leyó iluminando durante 60 segundos
la solución que contenía las cuentas con una lámpara halógena
equipada con un filtro de corte de 650 nm. La luminiscencia se midió
durante 20 segundos. Los resultados se resumen en la TABLA 1, y se
muestran en la Figura 9.
Diana: ADN genómico de E. coli.
Cebadores: 100 nM de cada uno de:
24-mero biotinilado
5'-UCA-TGG-TTC-TGG-TCA-GGT-GCA-GAT-3'
y 18-mero no biotinilado
5'-TTT-GAG-CGC-GGG-CTG-TTG-3'.
Condiciones de ciclado:
Un ciclo:
94ºC | 3 min |
59ºC | 1 min |
72ºC | 1,5 min |
a continuación 35 ciclos:
94ºC | 3 min |
59ºC | 1,5 min |
72ºC | 2 min |
Se añadieron 10 \mul de 1,5 pmoles de sonda
fluoresceinada en tampón de ensayo, preparada según el procedimiento
del EJEMPLO 6, a 20 \mul de producto de PCR a varias
concentraciones iniciales de diana. La mezcla se desnaturalizó a
95ºC durante 5 minutos, a continuación se hibridó a 55ºC durante 5
minutos. Se añadieron las cuentas (20 \mug de benzalacridina y 30
\mug de cuentas de Al-ftalocianina en 50 \mul de
tampón de ensayo). La solución que contenía las cuentas se incubó
durante 15 minutos a 55ºC. La señal se leyó siguiendo el
procedimiento tal y como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados
se resumen en la TABLA 2.
Látex de 175 nm modificado con carboxilato,
procedentes de Bangs Laboratories.
Etilenglicol, etoxietanol, alcohol bencílico,
clorofila-a: Aldrich.
Theonil-trifluoroacetato de
Europio (III) (EuTTA): Kodak.
Óxido de trioctilfosfina (TOPO): Aldrich.
Dioxeno
[1-(4-dimetilaminofenil)-6-fenil-1,4-dioxeno]:
preparado mediante una modificación de un procedimiento descrito
en: K. A. Zaklika, T. Kissel, A. L. Thayer, P. A. Burns y P. Schaap:
Photochem. Photobiol. 30:, 35-44 (1979).
Se añadió una solución de
clorofila-a en alcohol bencílico (1,0 ml, 0,6 mM) a
8,0 ml de alcohol bencílico a 105ºC. Se añadió una suspensión de
látex, de 175 nm de tamaño, modificado con carboxilato, en agua
(10%, 1,0 ml) a la solución de alcohol bencílico. Se agitó la mezcla
durante 5 minutos a 105ºC, y se enfrió hasta temperatura ambiente.
Se añadió etanol (10,0 ml) y se centrifugó la muestra. El
precipitado se resuspendió en una mezcla 1:1 de
etanol-agua (10,0 ml), y se centrifugó la
suspensión. El mismo procedimiento de resuspensión y centrifugación
se repitió en agua (10,0 ml), y el precipitado se resuspendió en
agua (1,8 ml).
Se encontró que una solución preparada añadiendo
10 \mul de la suspensión de cuentas en dioxano
anterior(990 \mul) tenía una absorbancia de 0,11 a 660 nm,
correspondiente a 2,6 \mumoles de clorofila-a en
un gramo de cuentas.
Se irradió una mezcla de cuentas de
clorofila-a (200 \mug) y 2 \times 10^{-4}
moles de ácido
antraceno-9,10-dipropiónico (ADPA)
en dos ml de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5, conteniendo NaCl
100 mM) con una lámpara de tungsteno-halógena,
equipada con un filtro de corte de 645 nm, durante 20 minutos. Las
cuentas se retiraron mediante filtración, y la concentración del
producto de oxigenación se determinó espectrofotométricamente a 400
nm. Se encontró que la velocidad era de 3,0 nmoles de producto de
oxigenación por minuto. En las mismas condiciones, 38 pmoles de un
sensibilizador soluble,
aluminio-ftalocianina-tetrasulfonato,
generaron la misma cantidad de producto de oxigenación (la cantidad
de sensibilizador en la cuentas era de 200 \times 10^{-6}
\times 2,6 \times 10^{-6} = 520 pmoles).
Se centrifugó una suspensión de cuentas de látex
carboxiladas (175 nm de tamaño, 10% de sólidos en agua, 30,0 ml). Se
descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en
etilenglicol (60,0 ml). Se calentó la suspensión hasta 100ºC. Se
añadieron lentamente 9,0 ml de una disolución de alcohol bencílico,
la cual es 1,67 mM en clorofila a y 3,33 mM en
tetrabutil-esquarato [1,3-bis
(4-dibutilaminofenil)esquarato] a lo largo de
3 minutos a la suspensión. El calentamiento se prolongó durante 7
minutos, a continuación se enfrió la suspensión a temperatura
ambiente en un baño de agua. La suspensión de alcohol bencílico se
añadió a etanol frío (120 ml). Se centrifugó la mezcla y se descartó
el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en etanol al 50% en
agua, y se centrifugó la suspensión. El mismo procedimiento de
resuspensión y centrifugación se repitió en etanol al 5% en agua (30
ml).
La concentración del
tetrabutil-esquarato en las cuentas se determinó
espectrofotométricamente tal y como se ha descrito más arriba para
las cuentas de clorofila a. Se encontró que era 44 \muM de
colorante en las cuentas.
Veinticinco \mul de una solución 5 mM de ADPA
en etanol se añadieron a una suspensión de cuentas (100 \mug) en
tampón fosfato, pH 7,0 (20 mM, conteniendo NaCl 50 mM). La
mezcla se irradió como más arriba, usando un filtro de paso alto de
610 nm. La velocidad de formación de oxígeno singlete se calculó a
partir de la velocidad de disminución en la absorbancia (a 400 nm)
del ADPA. Se encontró que las cuentas generaban 7 \times 10^{-2}
\mumoles de oxígeno singlete/min.
Se añadieron 20 ml de cuentas de látex
carboxiladas de 175 nm (suspensión al 10% en agua) a etoxietanol
(20,0 ml). La mezcla se calentó hasta 90ºC. Se añadieron a la mezcla
20 ml de una solución que es dioxeno 10 mM, EuTTA 20 mM, y TOPO 60
mM en etoxietanol. El calentamiento continuó durante 7 minutos a una
temperatura de hasta 9ºC. La mezcla se enfrió a temperatura
ambiente. Se añadió etanol (40,0 ml) y se centrifugó la mezcla. El
precipitado se resuspendió en etanol al 80%, y se centrifugó la
suspensión. El procedimiento de resuspensión y centrifugación se
repitió en etanol al 10% (36 ml).
\newpage
La concentración de EuTTA en las cuentas se
determinó espectrofotométricamente como más arriba, y se encontró
que era 0,07 M. Puesto que la concentración de dioxeno no puede
determinarse en la presencia de EuTTA, se midió en cuentas que se
cargaron tan sólo con dioxeno, en las mismas condiciones. Se
encontró que la concentración era 0,016 M.
Se mezcló una suspensión de cuentas (25 \mug)
en tampón fosfato (0,5 ml, fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, 0,1% de Tween
20, pH 7,0) con una solución 2 \muM de
aluminio-ftalocianina-tetrasulfonato
(0,5 ml) en el mismo tampón. Se iluminó la mezcla durante 1 minuto
con una lámpara de tungsteno-halógena de 125 w
equipada con un filtro de paso alto de 610 nm. Después de la
iluminación, se colocó la mezcla en un luminómetro Turner
TD-20e, y se midió la luminiscencia durante 20
segundos. Se encontró que la intensidad era de 327 RLU (unidades de
luz relativas)/segundo.
La longitud de onda de la luz emitida se midió
usando un espectrofluorímetro de barrido
Perkin-Elmer 650-40. El pico de
emisión principal estaba centrado cerca de los 615 nm.
Se disolvieron 73,6 mg de
sulfo-NHS
(N-hidroxisulfosuccinimida, Pierce Chemical Co.,
#24510 G) en 6 ml de una suspensión de 4 mg/ml de cuentas de
poliestireno de 40 nm, modificadas con carboxilato (teñidas con
clorofila a y tetrabutil-esquarato), en agua. Se
añadieron 136 \mul de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M. El pH se
ajustó a 5,2. Se añadieron 136 \mul más de agua. Se añadieron
lentamente 130,4 mg de EDAC hidrocloruro del
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
Sigma Chemical Co, #E-6383) en 454 \mul a una
suspensión de cuentas en agitación. La suspensión se incubó durante
20 minutos a temperatura ambiente. Las cuentas se centrifugaron
durante 20 minutos a 15.000 rpm en un rotor Sorvall
SA-600 a 4ºC. Se descartó el sobrenadante. A
continuación, se resuspendieron las cuentas en 1,2 ml de fosfato
sódico 5 mM, pH 5,8, y la suspensión se sonicó hasta
dispersar de nuevo las cuentas. Las cuentas se añadieron lentamente
a 4,8 ml de una solución en agitación que contenía 1,7 mg/ml de IgG
(monoclonal anti-fluoresceína) + 6,7 mg/ml de BSA +
bórax 17 mM, pH 9,2, y se mezclaron suavemente durante toda
la noche a 4ºC. Se añadieron 800 \mul de glicina 2 M, que fue
seguida a continuación por 2,8 ml de 50 mg/ml de BSA en 0,1M de
bórax, a la suspensión de cuentas. Se sonicó la suspensión y se dejó
mezclar suavemente durante 3 horas a 4ºC. Las cuentas se
centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm. El sobrenadante se
descartó. Las cuentas se resuspendieron en 3 ml de fosfato sódico 50
mM + NaCl 150 mM, pH 7,6, y se sonicó la suspensión. Los
pasos de centrifugación, resuspensión y sonicación se repitieron un
total de tres centrifugaciones. Después de la tercera
centrifugación, las cuentas se resuspendieron en 2,4 ml de fosfato
sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. La suspensión resultante
se sonicó y almacenó a 4ºC.
Se disolvieron 4,4 mg de
sulfo-NHS en 0,4 ml de una suspensión de 25 mg/ml de
cuentas de poliestireno de 175 nm, modificadas con carboxilato
(teñidas con dioxeno/EuTTA/TOPO), en agua. Se añadieron 0,0160 ml de
Na_{2}HPO_{4} 0,25 M. Se añadieron, lentamente, 8 mg de EDAC,
disueltos en 0,030 ml de agua a una suspensión de cuentas girando.
La suspensión se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Las cuentas se centrifugaron durante 20 minutos a 15.000 rpm en un
rotor Sorvall SA-600 a 4ºC. Se descartó el
sobrenadante.
Las cuentas se resuspendieron en 0,6 ml de
fosfato sódico 0,005 M, pH 5,8. La suspensión se sonicó para
resuspender las cuentas. Las cuentas se añadieron lentamente de
nuevo a 3 ml de una solución en agitación que contenía 1,33 mg/ml de
avidina D (Vector) + bórax 17 mM, pH 9,2, y se mezclaron
suavemente durante toda la noche a 4ºC. Se añadieron 0,004 ml de
anhídrido succínico 1 M en DMF. La suspensión de incubó durante 1
hora a 4ºC con agitación suave. Se añadieron 0,4 ml de 50 mg/ml de
BSA en fosfato sódico 10 mM + NaCl 150 mM, pH 7,0. La
suspensión se dejó mezclar suavemente durante 3 horas a 4ºC. Las
cuentas se centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm. El
sobrenadante se descartó. Las cuentas se resuspendieron en 3 ml de
fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. Se sonicó la
suspensión. Los pasos de centrifugación, resuspensión y sonicación
se repitieron un total de tres centrifugaciones. Después de la
tercera centrifugación, las cuentas se resuspendieron en 2,25 ml de
fosfato sódico 50 mM + NaCl 150 mM, pH 7,6. La suspensión se
sonicó y almacenó a 4ºC.
Barbital 0,075 M, NaCl 0,2 M, BSA al 0,4%,1,25%
de IgG de ratón, 10 mg/ml de sulfato de dextrano (P.M.500.000), 1,0
mg/ml de dextrano T-500, 10 \mug/ml de IgG
agregado.
Avidina-EDAC, 175 nm, cargadas
con dioxeno/EuTTA/TOPO.
Anti-fluoresceína-EDAC,
40 nm, cargadas con clorofila-a/esquarato.
Se añadieron 50 \mul de una solución de ácido
8-anilino-1-naftaleno-sulfónico,
sal de amonio (Sigma, A-3125) en tampón de ensayo
(0,75 mg/ml) a 50 \mul de estándar de T_{3} o muestra. Se
añadieron 100 \mul de tampón de ensayo. Se añadieron 50 \mul de
anti-T_{3} biotinilado (70 ng/ml) en tampón de
ensayo. Se añadió el trazador,
T_{3}-LC_{21}-F1 (1,8 ng/ml)
T_{3}-LC_{21}-F1
en tampón de ensayo (50 \mul). Se incubó la
mezcla durante 15 minutos a 37ºC. Se añadieron 500 \mul de una
suspensión de cuentas de sensibilizador (50 \mug) y cuentas de
aceptor (6,25 \mug) en tampón de ensayo, y se incubó la mezcla
durante 15 minutos a 37ºC. Se añadió la solución de "detención"
(50 \mul) (fluoresceína 10 \muM, biotina 0,5
mM).
La señal se leyó mediante una lámpara halógena
con un filtro de corte de 610 nm, un minuto de iluminación, y 20
segundos de medición.
Los resultados se resumen en la Figura 10. La
señal de luminiscencia se representó como una función de la
concentración de T_{3}. La modulación de la señal fue del 94% con
8,5 ng/ml de T_{3}. A 0,5 ng/ml, la modulación de la señal fue del
38%.
TABLA 1 | ||
Detección de diana sintética que se une a la Bio-sonda y Fl-sonda. | ||
Diana (pmoles/150 \mul) (pM) | RLU | Conc. de la diana |
1. 1.07 | 1677 | 7490 |
2. 0.54 | 1671 | 3740 |
3. 0.27 | 1407 | 1930 |
4. 0.13 | 979 | 930 |
5. 0.067 | 688 | 461 |
6. 0.034 | 399 | 230 |
7. 0.017 | 192 | 120 |
8. 0.008 | 95 | 57 |
9. 0.004 | 58 | 30 |
10. 0.002 | 30 | 15 |
11. 0 | 17 | |
12. 0 | 16 |
TABLA 2 | |
Detección del producto de amplificación biotinilado. | |
Producto | RLU |
1. 20% (108)^{a} | 79 |
2. 20% (106)^{a} | 45 |
3. 20% (104)^{a} | 25 |
4. 20% (0)^{a} | 9 |
^{a} 20% de volumen de reacción de amplificación, con el número inicial de | |
moléculas diana en la mezcla de reacción (). |
Claims (11)
1. Partículas que tienen incorporada en su
interior una composición que comprende un compuesto
quimioluminiscente, el cual es una sustancia que se somete a una
reacción química con oxígeno singlete para formar una especie
intermedia metaestable que se puede descomponer con la emisión
simultánea o posterior de luz y una molécula fluorescente, la cual
se excita mediante el compuesto quimioluminiscente activado y emite
a una longitud superior a la longitud de onda de emisión del
compuesto quimioluminiscente.
2. Partículas de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la longitud de onda de emisión de la especie intermedia
metaestable está dentro del rango de 250-1200
nm.
3. Partículas de acuerdo con las reivindicaciones
1 ó 2, en donde el compuesto quimioluminiscente es un enol éter.
4. Partículas de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-3, en donde el enol éter tiene la
estructura:
en donde los D1 se toman independientemente y se
seleccionan del grupo que consiste en H y sustituyentes de 1 a 50
átomos, preferiblemente arilo, hidroxiarilo, aminoarilo,
t-alquilo, H, alcoxi, heteroarilo, y D2 es,
preferiblemente, alquilo o
arilo.
5. Partículas de acuerdo con la reivindicación 4,
en donde los D1 se toman en conjunto con uno o ambos átomos de
carbono para formar un anillo, preferiblemente, tal como
cicloalqueno, adamantilideno, 7-norbornilideno.
6. Partículas de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3 a 5, en donde el enol éter tiene la
estructura:
en donde X es O, S o ND_{2} y D es alquilo o
arilo, y Ar y Ar' son arilo incluyendo arilo sustituido, en donde
por lo menos un sustituyente está presente como un grupo amino, éter
o
hidroxilo.
7. Partículas de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde la molécula fluorescente es
rodamina, etidio, dansilo, (EU)fod_{3},
EU(TTA)_{3} o
Ru(2,2'-dipiridil)_{3}^{++}.
8. Procedimiento para determinar un analito, el
cual comprende:
(a) combinar ya sea simultáneamente o de manera
total o parcialmente secuencial
- (1) un medio sospechoso de contener un analito,
- (2) un fotosensibilizador capaz de activar el oxígeno a un estado singlete singlete en su estado excitado, dicho fotosensibilizador está asociado con un miembro de par de unión específica (sbp), y
- (3) las partículas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6, teniendo unidas dichas partículas a las mismas un miembro de sbp;
(b) formar un complejo de sbp que comprenda
dichas partículas;
(c) activar dicho fotosensibilizador para generar
oxígeno singlete; y
(d) determinar la cantidad de luminiscencia
emitida, estando relacionada la cantidad de dicha luminiscencia con
la cantidad de analito en dicho medio.
9. Procedimiento de la reivindicación 8, en donde
se asocian el fotosensibilizador y un miembro de sbp con una
partícula suspendible.
10. Dispositivo que comprende en una combinación
empaquetada:
(a) una composición que comprende una partícula
suspendible de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-6, teniendo unida dicha partícula a la misma un
miembro de par de unión específica; y
(b) un fotosensibilizador asociado con un segundo
miembro de sbp, que no está en dicha composición y que es capaz de
activar el oxígeno a su estado singlete en su estado excitado.
11. Dispositivo de la reivindicación 10 que
comprende una composición que comprende una segunda partícula
suspendible que incluye dicho fotosensibilizador, teniendo unida
dicha partícula a la misma un miembro de sbp.
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