CN112840021A

CN112840021A - 在液体中稳定水解酶的化合物

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Publication number: CN112840021A
Application number: CN201980065416.2A
Authority: CN
Inventors: S·许弗; O·斯潘根伯格; G·拜尔; A·加西亚马科斯; C·埃斯珀
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2018-10-05
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2021-05-25
Also published as: BR112021005412A2; JP2022504229A; US20210395650A1; EP3861115A1; MX2021003930A; WO2020069915A1

Abstract

本发明涉及酶制剂，包含组分(a)：至少一种通式(I)的化合物，其中式(I)的各变量如下：R¹选自H和C₁‑C₁₀烷基羰基，其中烷基可以是线性或支化的并且可以带有一个或多个羟基；R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁‑C₈烷基和支化C₃‑C₈烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆‑C₁₀芳基和C₆‑C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁‑C₈烷基或支化C₃‑C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H；组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)的酶，优选至少一种选自蛋白酶的酶，更优选至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)的酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶；以及任选组分(c)：至少一种选自溶剂、不同于组分(a)的酶稳定剂和稳定该液体酶制剂本身的化合物的化合物。

Description

在液体中稳定水解酶的化合物

本发明涉及一种酶制剂，优选一种液体酶制剂，包含：

组分(a)：至少一种通式(I)的化合物：

其中在式(I)中的各变量如下：

R¹选自H和C₁-C₁₀烷基羰基，其中烷基可以是线性或支化的并且可以带有一个或多个羟基，

R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁-C₅烷基和支化C₃-C₁₀烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H；

组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)的酶，优选至少一种选自蛋白酶的酶，更优选至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)的酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶；

以及任选

组分(c)：至少一种选自溶剂、不同于组分(a)的酶稳定剂和稳定该液体酶制剂本身的化合物的化合物。

酶在商业上通常作为液体浓缩物生产，该浓缩物通常衍生于发酵液。若该酶保留在含水环境中，则它倾向于失去酶催活性，因此常规做法是将其转化成无水形式：含水浓缩物例如可以在载体材料存在下冻干或喷雾干燥而形成集料。固体酶产品通常需要在使用前“溶解”。为了在液体产品中稳定酶，通常使用酶抑制剂，优选可逆酶抑制剂来暂时抑制酶活性，直到该酶抑制剂释放。

已知硼酸和有机硼酸可逆地抑制蛋白水解酶。通过有机硼酸抑制一种丝氨酸蛋白酶—枯草溶菌素的讨论提供在Molecular&Cellular Biochemistry 51，1983，第5-32页中。为了再活化，需要在应用之前或之中除去该抑制剂，这里如可以通过稀释进行。

由于环境考量，需要至少降低用于酶稳定化的含硼化合物的量。寻求在酶存在下用作酶稳定剂的替代品。

本发明要解决的问题涉及提供一种有助于在液体含酶产品的储存过程中降低酶催活性损失的化合物。本发明的另一目的是要提供一种允许灵活配制到具有一种类型的酶或酶混合物的液体洗涤剂配制剂或清洁配制剂中的酶制剂。

该问题通过提供通式(I)的化合物解决：

其中在式(I)中的各变量如下：

R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁-C₅烷基和支化C₃-C₁₀烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H；以及

其中所述化合物支持至少一种选自水解酶(EC 3)，优选选自蛋白酶，更优选选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，最优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶在该酶在液体产品中的储存过程中酶催活性的保留。

酶名称基于the Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology(IUBMB)的推荐对本领域熟练技术人员是已知的。酶名称包括：EC(酶学委员会)号、推荐名称、别名(若有的话)、催化活性和其他因素；见http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/，2018年6月28日最后更新的版本。

本发明一方面提供了一种酶制剂，包含：

组分(a)：至少一种选自通式(I)的化合物的酶稳定剂：

其中在式(I)中的各变量如下：

R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁-C₅烷基和支化C₃-C₁₀烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H，和

以及任选

本发明的酶制剂在20℃和101.3kPa下可以为液体。液体包括溶液、乳液和分散体，凝胶等，只要该液体为流体且可倾倒。在本发明的一个实施方案中，本发明的液体洗涤剂组合物具有在约500-20,000mPa*s范围内的动态粘度，这在25℃下根据Brookfield，例如转子3在20rpm下用Brookfield粘度计LVT-II测定。

在一个实施方案中，液体是指在储存该液体酶制剂之后，优选在37℃下储存至少20天之后该酶制剂不显示出可见沉淀形成或浊度。

组分(a)

更具体而言，组分(a)是通式(I)的化合物：

其中在式(I)中的各变量如下所定义：

R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁-C₈烷基和支化C₃-C₈烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H。线性C₁-C₈烷基的实例是甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基等。支化C₃-C₈烷基的实例是2-丙基、2-丁基、仲丁基、叔丁基、2-戊基、3-戊基、异戊基等。未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基的实例是苯基、1-萘基、2-萘基、邻羧基苯基、间羧基苯基、对羧基苯基、邻羟基苯基、对羟基苯基等。

在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹选自H、乙酰基和丙酰基。在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹为H。在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹为乙酰基。在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹为丙酰基。

在一个实施方案中，式(I)化合物中的R²为H并且R³、R⁴相互独立地选自线性C₁-C₈烷基和支化C₃-C₈烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基。

在一个实施方案中，式(I)化合物中的R²、R³、R⁴相同，其中R²、R³、R⁴选自线性C₁-C₈烷基和支化C₃-C₈烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基。

在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹为H并且R²、R³、R⁴选自线性C₂-C₄烷基、苯基甲基和邻羧基苯基(水杨基)。

在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹、R²和R³为H并且R⁴选自线性C₂-C₄烷基，优选C₂烷基。在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹和R²为H并且R³和R⁴选自线性C₂-C₄烷基，优选C₂烷基。

在一个实施方案中，式(I)化合物中的R¹为乙酰基并且R²、R³、R⁴选自线性C₂-C₄烷基，优选C₂和C₄烷基。

组分(a)包括式(I)化合物的盐。盐包括碱金属和铵盐，例如单-和三乙醇胺的那些。优选钾盐和钠盐。

在本发明的一个实施方案中，酶制剂，优选液体酶制剂相对于该酶制剂的总重量以在0.1-30重量％范围内的量包含组分(a)。该酶制剂可以以在0.1-15重量％，0.25-10重量％，0.5-10重量％，0.5-6重量％或1-3重量％范围内的量包含组分(a)，全部相对于该酶制剂的总重量。

在本发明的一个实施方案中，化合物(a)包含化合物(a)的至少一种至少部分水解衍生物作为杂质。在本发明的一个实施方案中，组分(a)包含如下的完全水解化合物(a’)作为杂质：

其中变量R¹、R²、R³和R⁴与上面对组分(a)所述相同。

该杂质可以占组分(a)的至多50mol％，优选0.1-20mol％，甚至更优选1-10mol％。尽管杂质可能源自组分(a)的合成并且可以通过提纯方法除去，但优选不除去它。

组分(b)

在本发明的一个方面，至少一种包含在组分(b)中的酶是液体酶浓缩物的一部分。“液体酶浓缩物”在本文是指包含至少一种酶的任何液体含酶产品。在酶浓缩物上下文中的“液体”涉及在20℃和101.3kPa下的物质外观。

该液体酶浓缩物可以由固体酶在溶剂中的溶解得到。该溶剂可以选自水和有机溶剂。由固体酶在溶剂中溶解得到的液体酶浓缩物可以包含高达饱和浓度的酶量。

本文的溶解是指固体化合物通过与至少一种溶剂接触而液化。溶解是指固体化合物完全溶解在规定溶剂中达到饱和浓度，其中没有发生相分离。

在本发明的一个方面，所得酶浓缩物的组分(b)可以不含水，这意味着存在非显著量的水。非显著量的水在本文是指该酶制剂包含小于25重量％，小于20重量％，小于15重量％，小于10重量％，小于7重量％，小于5重量％，小于4重量％，小于3重量％，小于2重量％的水，全部相对于该酶浓缩物的总重量，或者不含水。在一个实施方案中，不含水的酶浓缩物是指该酶浓缩物不包含显著量的水，但确实相对于该酶浓缩物的总重量以30-80重量％的量包含有机溶剂。

包含水的液体酶浓缩物可以称为“含水酶浓缩物”。含水酶浓缩物可以是其中固体酶产品已经溶于水中的含酶溶液。在一个实施方案中，“含水酶浓缩物”是指通过发酵由酶生产得到的含酶产品。

发酵是指在合适的营养培养基中培养表达所需酶的重组细胞，从而允许重组宿主细胞生长(该过程可以称为发酵)并表达所需蛋白质的过程。在发酵结束时，通常收集并进一步加工发酵液，其中该发酵液包含液体级分和固体级分。取决于该酶是否已经分泌到该液体级分中，所需蛋白质或酶可以从该发酵液的液体级分或细胞溶解产物回收。所需酶的回收使用本领域熟练技术人员已知的方法。适合从发酵液回收蛋白质或酶的方法包括但不限于收集、离心、过滤、浸出和沉淀。

液体酶浓缩物可以以在0.1-40重量％，或0.5-30重量％，或1-25重量％，或3-25重量％，或5-25重量％范围内的量包含酶，全部相对于该酶浓缩物的总重量。在一个实施方案中，液体酶浓缩物由发酵得到并且是含水的。

由发酵得到的含水酶浓缩物可以以大于约50重量％，大于约60重量％，大于约70重量％，或大于约80重量％的量包含水，全部相对于该酶浓缩物的总重量。由发酵得到的含水酶浓缩物可以包含残留组分如来自发酵培养基的盐、来自生产宿主细胞的细胞碎片、在发酵过程中由生产宿主细胞产生的代谢物。在一个实施方案中，残留组分可以以小于30重量％，小于20重量％，小于10重量％，或小于5重量％的量包含在液体酶浓缩物中，全部相对于该含水酶浓缩物的总重量。

至少一种包含在组分(b)中的酶选自水解酶(EC 3)，下文也称为酶(组分(b))。优选的酶(组分(b))选自作用于酯键上的酶(E.C.3.1)，糖基化酶(E.C.3.2)和肽酶(E.C.3.4)。作用于酯键上的酶(E.C.3.1)在下文也称为脂酶(组分(b))。糖基化酶(E.C.3.2)在下文也称为淀粉酶(组分(b))和纤维素酶(组分(b))。肽酶在下文也称为蛋白酶(组分(b))。

水解酶(组分(b))在本发明上下文中由多肽序列(本文也称为氨基酸序列)标识。多肽序列规定了包括酶的“活性部位”在内的三维结构，后者又决定了该酶的催化活性。多肽序列可以由SEQ ID NO标识。根据世界知识产权局(WIPO)标准ST.25(1998)，本文中的氨基酸使用首字母大写的三字母码或相应的单字母表示。

本发明的酶(组分(b))涉及亲本酶和/或变体酶，二者均具有酶催活性。具有酶催活性的酶是酶促活性的或者产生酶催转化，这意味着酶作用于底物上并将这些转化为产物。术语“酶”在本文中不包括酶的无活性变体。

(亲本蛋白或酶，也称为“亲本酶”的)“亲本”序列是用于对该序列引入变化(例如通过引入一种或多种氨基酸替代、***、缺失或其组合)，从而得到亲本序列的“变体”的起始序列。术语亲本酶(或亲本序列)包括野生型酶(序列)和合成产生的序列(酶)，它们用作引入(其他)变化的起始序列。

术语“酶变体”或“序列变体”或“变体酶”涉及在其氨基酸序列上一定程度不同于其亲本酶的酶。若无相反指明，具有“酶催活性”的变体酶是指该变体酶与相应亲本酶具有相同类型的酶催活性。

在描述本发明的变体时使用如下所述的命名：

氨基酸替代按如下描述：提供该亲本酶的原始氨基酸，随后是在该氨基酸序列中的位置编号，随后是被替代的氨基酸。

氨基酸缺失按如下描述：提供该亲本酶的原始氨基酸，随后是在该氨基酸序列中的位置编号，随后是*。

氨基酸***按如下描述：提供该亲本酶的原始氨基酸，随后是在该氨基酸序列中的位置编号，随后是原始氨基酸和额外的氨基酸。例如在紧随甘氨酸的位置180处***赖氨酸表示为“Gly180GlyLys”或“G180GK”。

在其中替代和***发生在相同位置的情况下，这可以表示为S99SD+S99A或者简言之S99AD。在其中***与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，显然出现命名简并。若例如在上述实施例中在甘氨酸之后***甘氨酸，这将由G180GG表示。

当在某一位置可以引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号隔开，例如“Arg170Tyr，Glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸替代。或者不同的改变或任选替代可以示于括号中，例如Arg170[Tyr，Gly]或Arg170{Tyr，Gly}；或者简言之R170[Y,G]或R170{Y，G}；或者全长表示为R170Y，R170G。

酶变体可以由其与亲本酶相比较时的序列同一性定义。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了计算序列同一性，在第一步中必须产生序列比对。根据本发明，必须产生成对总体比对，这意味着两个序列必须在其完整长度上比对，这通常使用称为比对算法的数学方法产生。

根据本发明，比对通过使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)产生。优选使用程序默认参数(缺口开启＝10.0，缺口延伸＝0.5和矩阵＝EBLOSUM62)将程序“NEEDLE”(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))用于本发明的目的。

根据本发明应用％同一性的下列计算：％同一性＝(相同的残基/在其完整长度上显示本发明相应序列的比对区域的长度)*100。

根据本发明酶变体可以描述为至少n％与相应亲本酶的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中“n”为10-100的整数。在一个实施方案中，当与亲本酶的全长度氨基酸序列相比较时，变体酶至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同，其中该酶变体具有酶催活性。

酶变体可以由其与亲本酶相比较时的序列相似性定义。序列相似性通常作为“％序列相似性”或“％相似性”提供。％序列相似性考虑的是限定组的氨基酸共享类似性能，例如其尺寸、其疏水性、其电荷或其他特性。本文中用相似氨基酸交换一种氨基酸可以称为“保守突变”。

为了根据本发明确定％相似性，应用下列内容：氨基酸A与氨基酸S相似；氨基酸D与氨基酸E和N相似；氨基酸E与氨基酸D、K和Q相似；氨基酸F与氨基酸W和Y相似；氨基酸H与氨基酸N和Y相似；氨基酸I与氨基酸L、M和V相似；氨基酸K与氨基酸E、Q和R相似；氨基酸L与氨基酸I、M和V相似；氨基酸M与氨基酸I、L和V相似；氨基酸N与氨基酸D、H和S相似；氨基酸Q与氨基酸E、K和R；氨基酸R与氨基酸K和Q相似；氨基酸S与氨基酸A、N和T相似；氨基酸T与氨基酸S相似；氨基酸V与氨基酸I、L和M相似；氨基酸W与氨基酸F和Y相似；氨基酸Y与氨基酸F、H和W相似。

保守氨基酸替代可以在功能蛋白如酶的多肽序列的全长度序列上发生。在一个实施方案中，该类突变并不涉及酶的功能域。在一个实施方案中，保守突变并不涉及酶的催化中心。

为了考虑保守突变，可以由相同比对计算两个氨基酸序列的序列相似性的值，后者用来计算％同一性。

根据本发明应用％相似性的下列计算：％相似性＝[(相同的残基+相似的残基)/在其完整长度上显示本发明相应序列的比对区域的长度]*100。

根据本发明酶变体可以描述为至少m％与相应亲本序列相似的氨基酸序列，其中“m”是10-100的整数。在一个实施方案中，当与亲本酶的全长度多肽序列相比较时，变体酶至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似，其中该变体酶具有酶催活性。

“酶催活性”是指酶所施加的催化效果，通常表示为单位/毫克酶(比活性)，后者涉及每分子酶每分钟转化的底物分子数(分子活性)。

当所述酶变体显示出相应亲本酶的酶催活性的至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或100％时，变体酶根据本发明可能具有酶催活性。

蛋白酶

在本发明的一个方面，至少一种包含在组分(b)中的酶选自水解酶(EC3)，优选至少一种选自蛋白酶的酶，更优选至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)的酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶。

蛋白酶是EC 3.4类别的成员。蛋白酶(组分(b))包括氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基肽酶和三肽基肽酶(EC 3.4.14)、肽基二肽酶(EC3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(EC 3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC3.4.23)、金属内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)或未知催化机理的内肽酶(EC 3.4.99)。

在一个实施方案中，至少一种蛋白酶(组分(b))选自丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶的特征在于在催化活性部位具有丝氨酸，其在催化反应过程中与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶(组分(b))在本发明上下文中选自胰凝乳蛋白酶(例如EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.37或EC3.4.21.71)、粒酶(例如EC 3.4.21.78或EC 3.4.21.79)、激肽释放酶(例如EC 3.4.21.34，EC 3.4.21.35，EC 3.4.21.118或EC 3.4.21.119)、纤溶酶(例如EC 3.4.21.7)、胰蛋白酶(例如EC 3.4.21.4)、凝血酶(例如EC 3.4.21.5)和枯草溶菌素。枯草溶菌素也已知为枯草杆菌肽酶，例如EC 3.4.21.62，后者在下文也称为“枯草溶菌素”。

Siezen等(1991)，Protein Eng.4:719-737和Siezen等(1997)，Protein Science6:501-523已经提出了临时称为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶亚组。枯草杆菌酶包括枯草溶菌素家族、耐热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和超嗜热蛋白酶家族。

枯草杆菌酶亚组是枯草溶菌素，后者为来自MEROPS数据库(http:// merops.sanger.ac.uk)所定义的家族S8的丝氨酸蛋白酶。肽酶家族S8包括丝氨酸内肽酶枯草溶菌素及其同系物。在亚族S8A中，活性部位残基通常出现在基元Asp-Thr/Ser-Gly(与异种集团AA中天冬氨酸内肽酶家族中的基序相似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。

枯草溶菌素相关类别的丝氨酸蛋白酶(组分(b))共享限定催化三联体的共同氨基酸序列，这将它们与胰凝乳蛋白酶相关类别的丝氨酸蛋白酶区分开来。枯草溶菌素和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶均具有包括天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。

实例包括WO 89/06276和EP 0283075，WO 89/06279，WO 89/09830，WO 89/09819，WO 91/06637和WO 91/02792中所述的枯草溶菌素。

蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白。蛋白水解活性与蛋白质在限定的时间内被蛋白酶或蛋白水解酶降解的速率有关。

分析蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的(例如见Gupta等(2002)，Appl.Microbiol.Biotechnol.60：381-395)。蛋白水解活性可以通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，简写为AAPF；例如见DelMar等(1979)，AnalyticalBiochem 99，316-320)作为底物测定。pNA通过蛋白水解裂解与该底物分子分离，导致释放出黄色的游离pNA，后者可以通过测量OD₄₀₅而量化。

蛋白水解活性可以以单位/克酶提供。例如，1U蛋白酶可能对应于在pH 8.0和37℃下每分钟释放1μmol福林阳性氨基酸和肽类(作为酪氨酸)的蛋白酶量(酪蛋白作为底物)。

枯草溶菌素类型(EC 3.4.21.62)的蛋白酶(组分(b))可以是选自如下的源自微生物的细菌蛋白酶：芽孢杆菌属(Bacillus)，梭菌属(Clostridium)，肠球菌属(Enterococcus)，地芽孢杆菌属(Geobacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，乳球菌属(Lactococcus)，海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶，或革兰氏阴性细菌多肽如弯曲杆菌属(Campylobacter)，大肠杆菌(E.coli)，黄杆菌属(Flavobacterium)，梭杆菌属(Fusobacterium)，螺杆菌属(Helicobacter)，泥杆菌属(llyobacter)，奈瑟菌属(Neisseria)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。

在本发明的一个方面，至少一种蛋白酶(组分(b))选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。

在本发明的一个实施方案中，至少一种蛋白酶(组分(b))选自下列：来自解淀粉芽孢杆菌BPN'的枯草溶菌素(由Vasantha等(1984)J.Bacteriol.，第159，第811-819页和JAWells等(1983)在Nucleic Acids Research，第11卷，第7911-7925页中所述)；来自地衣芽孢杆菌的枯草溶菌素(枯草溶菌素Carlsberg；公开于EL Smith等(1968)，J.Biol Chem，第243卷，第2184-2191页和Jacobs等(1985)，Nucl.Acids Res，第13卷，第8913-8926页中)；枯草溶菌素PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列描述于EP 283075 A2中)；WO 89/06279中所公开的枯草溶菌素147和/或309(分别为

)；如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素，如来自WO 95/23221中所述迟缓芽孢杆菌DSM 5483或迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体的枯草溶菌素；DE 10064983中所公开的来自嗜碱芽孢杆菌(DSM 11233)的枯草溶菌素；WO 2003/054184中所公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14391)的枯草溶菌素；WO 2003/056017中所公开的来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(DSM 14390)的枯草溶菌素；WO 2003/055974中所公开的来自芽孢杆菌属(DSM 14392)的枯草溶菌素；WO2003/054184中所公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14393)的枯草溶菌素；如WO 2005/063974中所述具有SEQ ID NO:4的枯草溶菌素；如WO 2005/103244中所述具有SEQ ID NO:4的枯草溶菌素；如WO 2005/103244中所述具有SEQ ID NO:7的枯草溶菌素；以及如申请DE102005028295.4中所述具有SEQ ID NO:2的枯草溶菌素。

在一个实施方案中，组分(b)至少包含在WO 89/06279表I中作为序列a)公开的枯草溶菌素309(本文可以称为Savinase)或至少80％与其相同且具有蛋白水解活性的其变体。

按照本发明有用的蛋白酶(组分(b))的实例包括WO 92/19729，WO 95/23221，WO96/34946，WO 98/20115，WO 98/20116，WO 99/11768，WO 01/44452，WO 02/088340，WO 03/006602，WO 2004/03186，WO 2004/041979，WO 2007/006305，WO 2011/036263，WO 2011/036264和WO 2011/072099中所述变体。合适的实例尤其包括如EP 1921147中所述衍生于SEQ ID NO:22的枯草溶菌素蛋白酶的变体(为来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的成熟碱性蛋白酶的序列)，在下列位置中的一个或多个中具有氨基酸替代：3，4，9，15，24，27，33，36，57，68，76，77，87，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，106，118，120，123，128，129，130，131，154，160，167，170，194，195，199，205，206，217，218，222，224，232，235，236，245，248，252和274(根据BPN'编号)，它们具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，该蛋白酶在位置Asp32、His64和Ser221(根据BPN'编号)处不突变。

合适的蛋白酶(组分(b))包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，当与如上所公开的亲本酶的全长度多肽序列相比较时，它们至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。

合适的蛋白酶(组分(b))包括具有蛋白水解活性的蛋白酶变体，当与亲本酶的全长度多肽序列相比较时，它们至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似。

在一个实施方案中，至少一种蛋白酶(组分(b))具有如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22，或者为至少80％与其相同并且具有蛋白水解活性的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶的特征在于在位置101(根据BPN'编号)处具有氨基酸谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)，或天门冬酰胺(N)，或谷氨酰胺(Q)，或丙氨酸(A)或甘氨酸(G)，或丝氨酸(S)并且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶包含一个或多个其他替代：(a)在位置3处的苏氨酸(3T)、(b)在位置4处的异亮氨酸(4I)、(c)在位置63处的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A，63T或63R)、(d)在位置156处的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)、(e)在位置194处的脯氨酸(194P)、(f)在位置199处的蛋氨酸(199M)、(g)在位置205处的异亮氨酸(205I)、(h)在位置217处的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D，217E或217G)、(i)两种或更多种根据(a)-(h)的氨基酸的组合。至少一种蛋白酶(组分(b))可以与EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同并且特征在于与氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN'编号)一起包含一种氨基酸(根据(a)-(h))或根据(i)的组合并具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶的特征在于包含突变(根据BPN'编号)R101E或S3T+V4I+V205I，或R101E和S3T，V4I和V205I，或S3T+V4I+V199M+V205I+L217D并且具有蛋白水解活性。

在一个实施方案中，如EP 1921147中所述根据SEQ ID NO:22的蛋白酶的特征在于包含突变(根据BPN'编号)S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D并且具有蛋白水解活性。

在一个实施方案中，至少一种蛋白酶选自市售蛋白酶，后者包括但不限于以牌号

Duralase^TM，Durazym^TM，

Ultra，

Ultra，

Ultra，

Ultra，

和

(Novozymes A/S)销售的产品，以牌号

Prime，Purafect

Purafect

Purafect

和

(Danisco/DuPont)，Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)销售的那些，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP；示于US 5,352,604图29中的序列)及其变体以及来自Kao Corp.的KAP(Bacillus alkalophilus枯草溶菌素)。

根据本发明，组分(b)可以包含至少两种蛋白酶，优选选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶的组合—全部如上所公开。

在一个实施方案中，组分(b)如上面所公开的那样包含至少一种选自根据EP1921147中所述SEQ ID NO:22的蛋白酶或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶。

在一个实施方案中，组分(b)如上面所公开的那样包含至少一种选自WO 89/06279表I a)所公开的枯草溶菌素309或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶，优选选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶和至少一种脂酶的组合。

脂酶

“脂酶”、“脂解酶”、“类脂酯酶”全部涉及EC类别3.1.1的酶(“羧酸酯水解酶”)。脂酶是指具有脂酶活性(或脂解活性；三酰甘油脂酶，EC 3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74；具有角质酶活性的酶在本文可以称为角质酶)、甾醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)的活性蛋白。

测定脂解活性的方法在文献中是众所周知的(例如见Gupta等(2003)，Biotechnol.Appl.Biochem.37，第63-71页)。例如，脂酶活性可以通过在底物棕榈酸对硝基苯酯(pNP棕榈酸酯，C:16)中酯键水解并且释放pNP而测量，后者为黄色并且可以在405nm下检测。

“脂解活性”是指脂酶所产生的催化效果，其可以以脂解单位(LU)提供。例如，1LU可能对应于在下列条件下在pH恒定下每分钟产生1μmol可滴定脂肪酸的脂酶量：温度30℃；pH＝9.0；底物可以是3.3重量％橄榄油和3.3％***胶在13mmol/l Ca²⁺和20mmol/l NaCl存在下在5mmol/lTris缓冲液中的乳液。

脂酶(组分(b))包括细菌或真菌来源的那些。在本发明的一个方面，合适的脂酶(组分(b))选自下列：来自腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热真菌属(Thermomyces))的脂酶，例如如EP 258068，EP 305216，WO 92/05249和WO 2009/109500中所述来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))或如WO 96/13580中所述来自特异腐质霉(H.insolens)；如WO 92/05249中所述衍生于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂酶；来自假单胞菌属菌株的脂酶(这些中的一些现在重新命名为伯克氏菌(Burkholderia))，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272，WO 94/25578，WO 95/30744，WO 95/35381，WO 96/00292)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1372034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)，门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(WO 95/14783)，荚壳假单胞菌(P.glumae)(WO 95/35381，WO96/00292)；来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 2012/137147)的脂酶，GDSL类型链霉菌属脂酶(WO 2010/065455)；如WO 2011/084412所公开来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂酶；如WO 2011/084417所公开来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的脂酶；例如如WO 00/60063所公开的芽孢杆菌属脂酶，如Dartois等(1992)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360或WO 2011/084599所公开来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP S64-074992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂酶；如WO 94/01541所公开来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂酶；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5389536，WO 88/09367)；来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶(WO 2010/107560)；如WO 90/09446，WO 00/34450和WO 01/92502所公开来自太阳镰刀菌(Fusarum solani pisi)的角质酶；以及如WO 00/34450和WO 01/92502所公开来自柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)的角质酶。

合适的脂酶(组分(b))还包括称为酰基转移酶或过水解酶的那些，例如与南极假丝酵母脂酶A同源的酰基转移酶(WO 2010/111143)，来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的酰基转移酶(WO 2005/056782)，来自CE7家族的过水解酶(WO 2009/67279)以及耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)过水解酶的变体，尤其是S54V变体(WO 2010/100028)。

合适的脂酶(组分(b))还包括为上述脂酶的具有脂解活性的变体的那些。该类合适的脂酶变体(组分(b))例如是由WO 95/22615，WO 97/04079，WO 97/07202，WO 00/60063，WO 2007/087508，EP 407225和EP 260105中所公开的方法培养的那些。

合适的脂酶(组分(b))包括具有脂解活性的脂酶变体，当与如上所公开的亲本酶的全长度多肽序列相比较时，它们至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。

合适的脂酶(组分(b))包括具有脂解活性的脂酶变体，当与亲本酶的全长度多肽序列相比较时，它们至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似。

在一个实施方案中，至少一种脂酶(组分(b))选自真菌三酰甘油脂酶(EC类别3.1.1.3)。真菌三酰甘油脂酶(组分(b))可以选自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginose)脂酶。在一个实施方案中，疏绵状嗜热丝孢菌脂酶(组分(b))选自根据US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶及其具有脂解活性的变体。根据US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶在本文可以称为Lipolase。

疏绵状嗜热丝孢菌脂酶(组分(b))可以选自具有脂解活性的变体，当与US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的全长度多肽序列相比较时，它们至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。

疏绵状嗜热丝孢菌脂酶(组分(b))可以选自具有脂解活性的仅包含保守突变的变体，但是它们并不涉及US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的功能域。当与US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的全长度多肽序列相比较时，该实施方案的具有脂解活性的脂酶变体可以至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似。

疏绵状嗜热丝孢菌脂酶(组分(b))可以与US 5869438的特征在于具有氨基酸T231R和N233R的SEQ ID NO:2至少80％相同。所述疏绵状嗜热丝孢菌脂酶可以进一步包含下列氨基酸交换中的一种或多种：Q4V，V60S，A150G，L227G，P256K。

在一个实施方案中，至少一种脂酶选自市售脂酶，后者包括但不限于以牌号Lipolase^TM，Lipex^TM，Lipolex^TM和Lipoclean^TM(Novozymes A/S)，Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(Gist-Brocades/现为DSM)销售的产品。

根据本发明，组分(b)可以包含至少两种脂酶，优选选自根据US 5869438的SEQ IDNO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶根据及其如上所公开的具有脂解活性的变体的脂酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶和至少一种根据US 5869438的SEQID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据EP 1921147中所述SEQ IDNO:22的蛋白酶或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶和至少一种根据US 5869438的SEQID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其具有脂解活性的变体—全部如上所公开。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自WO 89/06279表I a)中所公开的枯草溶菌素309或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶和至少一种根据US 5869438的SEQ IDNO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其具有脂解活性的变体—全部如上所公开。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶，优选选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶和至少一种淀粉酶的组合。

淀粉酶

在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种淀粉酶(组分(b))。本发明的“淀粉酶”(组分(b))(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些(分别为EC 3.2.1.1和3.2.1.2)。包括化学修饰或蛋白质工程突变体。

本发明的淀粉酶(组分(b))具有涉及多糖中葡糖苷键的(内)水解的“淀粉分解活性”或“淀粉酶活性”。α-淀粉酶活性可以通过本领域熟练技术人员已知的测量α-淀粉酶活性的分析测定。测量α-淀粉酶活性的分析实例是：

α-淀粉酶活性可以通过使用Phadebas片剂作为底物的方法(Phadebas淀粉酶测试，由Magle Life Science提供)测定。淀粉被该α-淀粉酶水解，得到可溶性蓝色碎片。以分光光度法在620nm下测量的所得蓝色溶液的吸光度为α-淀粉酶活性的函数。测量的吸光度在给定的条件集下与所述α-淀粉酶的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)成正比。

α-淀粉酶活性还可以通过使用亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法测定。D-麦芽七糖苷是一种被保护的寡糖，可以由内淀粉酶裂解。在裂解之后，包括在该试剂盒中的α-葡糖苷酶消化该底物而释放游离PNP分子，后者呈黄色并且因此可以通过可见分光光度法在405nm下测量。含有EPS底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Roche Costum Biotech制造(目录号10880078103)。时间依赖性吸收曲线的斜率在给定的条件集下与所述α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。

淀粉分解活性可以以单位/克酶提供。例如，在pH 6.9和20℃下1单位α-淀粉酶可以在3分钟内由淀粉释放1.0mg麦芽糖。

至少一种淀粉酶(组分(b))可以选自下列：如WO 95/10603所述具有SEQ ID NO:2的来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶；如WO 02/10355所公开具有SEQ ID NO:6的来自嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶；如WO 99/19467所公开具有SEQ ID NO:6的来自芽孢杆菌属707的淀粉酶；如WO 96/23872所述具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的来自崛越氏芽孢杆菌(Bacillushalmapalus)的淀粉酶，也描述为SP-722；如WO 00/22103所公开具有SEQ ID NO:4的来自芽孢杆菌属DSM 12649的淀粉酶；如WO 2009/061380所公开具有SEQ ID NO:2的来自芽孢杆菌属菌株TS-23的淀粉酶；如WO2013/184577所公开具有SEQ ID NO:1的来自噬纤维菌属(Cytophaga sp.)的淀粉酶；如WO 2010/104675所公开具有SEQ ID NO:1的来自巨大芽孢杆菌DSM 90的淀粉酶；如WO 00/60060所述包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-485的来自芽孢杆菌属的淀粉酶。

合适的淀粉酶(组分(b))包括具有淀粉酶活性的淀粉酶变体，当与如上所公开的亲本酶的全长度多肽序列相比较时，它们至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。

合适的淀粉酶(组分(b))包括具有淀粉酶活性的淀粉酶变体，当与亲本酶的全长度多肽序列相比较时，它们至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似。

至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2006/002643所述的SEQ ID NO:12或者与其至少80％相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:12至少80％相同并且在位置Y295F和M202LITV处包含替代。

至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2011/098531所述的SEQ ID NO:6或者与其至少80％相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:6至少80％相同并且在一个或多个选自193[G,A,S,T或M]，195[F,W,Y,L,I或V]，197[F,W,Y,L,I或V]，198[Q或N]，200[F,W,Y,L,I或V]，203[F,W,Y,L,I或V]，206[F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D或E]，210[F,W,Y,L,I或V]，212[F,W,Y,L,I或V]，213[G,A,S,T或M]和243[F,W,Y,L,I或V]的位置处包含替代。

至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2013/001078所述的SEQ ID NO:1或者与其至少85％相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:1至少85％相同并且在对应于位置G304，W140，W189，D134，E260，F262，W284，W347，W439，W469，G476和G477的两个或更多个(几个)位置处包含改变。

至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2013/001087所述的SEQ ID NO:2或者与其至少85％相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:2至少85％相同并且包含位置181+182，或182+183或183+184的缺失且具有淀粉分解活性。在一个实施方案中，所述淀粉酶可以在对应于W140，W159，W167，Q169，W189，E194，N260，F262，W284，F289，G304，G305，R320，W347，W439，W469，G476和G477的任一位置中包含一个或两个或更多个进一步修饰。

在一个实施方案中，至少一种淀粉酶选自市售淀粉酶，后者包括但不限于以牌号Duramyl^TM，Termamyl^TM，Fungamyl^TM，Stainzyme^TM，Stainzyme Plus^TM，Natalase^TM，LiquozymeX和BAN^TM(来自Novozymes A/S)以及Rapidase^TM，Purastar^TM，Powerase^TM，Effecten^TM(M100，来自DuPont)，Preferenz^TM(S1000，S110和F1000；来自DuPont)，PrimaGreen^TM(ALL；DuPont)，Optisize^TM(DuPont)销售的产品。

根据本发明，组分(b)可以包含至少两种淀粉酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶、至少一种脂酶和至少一种淀粉酶的组合。

纤维素酶

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶，优选选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶和至少一种纤维素酶的组合。

本发明的酶制剂可以包含至少一种纤维素酶(组分(b))。三种主要类型的纤维素酶是已知的，即纤维二糖水解酶(1,4-P-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)、内切-ss-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.4)和ss-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。

“纤维素酶”、“纤维素酶”或“纤维素分解酶”(组分(b))是纤维素水解中涉及的酶。测量“纤维素酶活性”或“纤维素分解活性”的分析对本领域熟练技术人员而言是已知的。例如，纤维素分解活性可以凭借纤维素酶将羧甲基纤维素水解成还原性碳水化合物这一事实测定，后者的还原能力借助铁氰化物反应根据Hoffman，W.S.，J.Biol.Chem.120，51(1937)比色测定。

纤维素分解活性可以以单位/克酶提供。例如，在pH 5.0和37℃下1单位可以在1小时内由纤维素释放1.0μmol葡萄糖(2小时温育时间)。

本发明的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。在一个实施方案中，至少一种纤维素酶选自包含纤维素结合域的纤维素酶。在一个实施方案中，至少一种纤维素酶选自仅包含催化畴的纤维素酶，这意味着该纤维素酶没有纤维素结合域。

在一个实施方案中，至少一种纤维素酶(组分(b))选自市售纤维素酶，后者包括但不限于Celluzyme^TM，Endolase^TM，Carezyme^TM，Cellusoft^TM，Renozyme^TM，Celluclean^TM(来自Novozymes A/S)，Ecostone^TM，Biotouch^TM，Econase^TM，Ecopulp^TM(来自AB EnzymesFinland)，Clazinase^TM，Puradax HA^TM，Genencor洗涤剂纤维素酶L，IndiAge^TM Neutra(来自Genencor International Inc./DuPont)，Revitalenz^TM(来自DuPont的2000)，Primafast^TM(DuPont)和KAC-500^TM(来自Kao Corporation)。

根据本发明，组分(b)可以包含至少两种纤维素酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶和至少一种纤维素酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶、至少一种脂酶和至少一种纤维素酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶、至少一种淀粉酶和至少一种纤维素酶的组合。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶、至少一种脂酶、至少一种淀粉酶和至少一种纤维素酶的组合。

组分(c)

在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂包含组分(c)，后者包括至少一种选自溶剂、不同于组分(a)的酶稳定剂和稳定该液体酶制剂本身的化合物的化合物。

不同于组分(a)的酶稳定剂：

本发明的液体酶制剂可以包含至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂。所述酶稳定剂(组分(c))可以选自含硼化合物、多元醇、肽醛、其他稳定剂及其混合物。

含硼化合物：

含硼化合物(组分(c))可以选自硼酸或其衍生物和有机硼酸或其衍生物如芳基硼酸或其衍生物、其盐及其混合物。硼酸在本文可以称为原硼酸。

在一个实施方案中，含硼化合物(组分(c))选自芳基硼酸及其衍生物。在一个实施方案中，含硼化合物选自也称为苯基硼酸(PBA)的苯硼酸(BBA)、其衍生物及其混合物。在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物选自式(IIIa)和式(IIIb)的衍生物：

其中

R1选自氢、羟基、未被取代或取代的C₁-C₆烷基和未被取代或取代的C₁-C₆链烯基；在优选实施方案中，R选自羟基和未被取代的C₁烷基；

R2选自氢、羟基、未被取代或取代的C₁-C₆烷基和未被取代或取代的C₁-C₆链烯基；在优选实施方案中，R选自H、羟基和取代的C₁烷基。

在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物(组分(c))选自4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)、4-羧基苯基硼酸(4-CPBA)、4-(羟甲基)苯基硼酸(4-HMPBA)和对甲苯基硼酸(p-TBA)。

其他合适的衍生物(组分(c))包括2-噻吩基硼酸、3-噻吩基硼酸、(2-乙酰胺基苯基)硼酸、2-苯并呋喃基硼酸、1-萘基硼酸、2-萘基硼酸、2-FPBA、3-FBPA、1-噻蒽基硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基-2-噻吩基硼酸、1-苯并噻吩-2-硼酸、2-呋喃基硼酸、3-呋喃基硼酸、4,4-联苯基二硼酸、6-羟基-2-萘硼酸、4-(甲硫基)苯基硼酸、4-(三甲基甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸、5-氯噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴苯基硼酸、3-氯苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩硼酸、对甲基苯基乙基硼酸、2-噻蒽基硼酸、二苯并噻吩硼酸、9-蒽硼酸、3,5-二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、邻氯苯基硼酸、对氯苯基硼酸、间溴苯基硼酸、对溴苯基硼酸、对氟苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5-三甲基苯基硼酸、3-氯-4-氟苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二(三氟甲基)苯基硼酸、2,4-二氯苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸及其混合物。

多元醇：

多元醇(组分(c))可以选自含有2-6个羟基的多元醇。合适的实例包括乙二醇、丙二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、果糖、乳糖和四氢呋喃二醇。

肽醛：

肽醛(组分(c))可以选自二-、三-或四肽醛和醛类似物(呈B1-BO-R形式，其中R为H、CH₃、CX₃、CHX₂或CH₂X(X＝卤素)，BO为单一氨基酸残基(在一个实施方案中，具有任选被取代的脂族或芳族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基(在一个实施方案中，1、2或3个)构成，任选包含N-末端保护基团，或者如WO 09/118375和WO 98/13459所述，或者为蛋白质类型的蛋白酶抑制剂如RASI，BASI，WASI(稻、大麦和小麦的双官能α-淀粉酶/枯草溶菌素抑制剂)或CI₂或SSI。

其他稳定剂：

其他稳定剂(组分(c))可以选自盐如NaCl或KCl，以及乳酸和甲酸的碱金属盐。

其他稳定剂(组分(c))可以选自锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源—它们在成品组合物中对酶提供该类离子，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))。

稳定该液体酶制剂本身的化合物

稳定该液体酶制剂本身的化合物是指其量有效确保储存稳定性的任何化合物，产生液体制剂的储存稳定性所需要的酶稳定剂除外。

储存稳定性在液体制剂上下文中对本领域熟练技术人员而言通常包括产品外观和剂量均匀性这两个方面。

产品外观受该产品的pH和化合物如防腐剂、抗氧化剂、粘度改性剂、乳化剂等存在的影响。

剂量均匀性通常与产品的均匀性相关。

本发明的酶制剂可以是碱性的或者具有中性或稍微酸性pH值，例如6-14，6.5-13，8-10.5或8.5-9.0。

本发明的液体酶制剂可以包含至少一种防腐剂。防腐剂以有效防止该液体酶制剂，优选该含水酶制剂的微生物污染的量加入。

合适防腐剂的非限制性实例包括(季)铵化合物、异噻唑啉酮类、有机酸和甲醛释放剂。合适(季)铵化合物的非限制性实例包括氯苄烷铵、聚六亚甲基双胍(PHMB)、二癸基二甲基氯化铵(DDAC)和N-(3-氨基丙基)-N-十二烷基-1,3-丙二胺(二胺)。合适异噻唑啉酮类的非限制性实例包括1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(MIT)、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CIT)、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮(OIT)和2-丁基苯并[d]异噻唑-3-酮(BBIT)。合适有机酸的非限制性实例包括苯甲酸、山梨酸、L-(+)-乳酸、甲酸和水杨酸。合适甲醛释放剂的非限制性实例包括N,N'-亚甲基二吗啉(MBM)、2,2',2”-(六氢-1,3,5-三嗪-1,3,5-三基)三乙醇(HHT)、(亚乙二氧基)二甲醇、α,α',α”-三甲基-1,3,5-三嗪-1,3,5(2H,4H,6H)-三乙醇(HPT)、3,3′-亚甲基二[5-甲基

唑烷](MBO)和顺式-1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮

金刚烷氯化物(CTAC)。

其他有用的防腐剂包括碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)，卤素释放化合物如二氯二甲基乙内酰脲(DCDMH)、溴氯二甲基乙内酰脲(BCDMH)和二溴二甲基乙内酰脲(DBDMH)；溴代硝基化合物如拌棉醇(Bronopol)(2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇)、2,2-二溴-2-氰基乙酰胺(DBNPA)；醛类如戊二醛；苯氧基乙醇；联苯-2-酚；以及吡啶硫酮锌或钠。

溶剂

在一个实施方案中，本发明的酶制剂是含水的，以在5-95重量％，5-30重量％，5-25重量％或20-70重量％范围内的量包含水，全部相对于该酶制剂的总重量。

在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲基醚、乙二醇乙基醚、乙二醇丙基醚和苯氧基乙醇的有机溶剂，优选乙醇、异丙醇或丙二醇。此外，本发明的酶制剂可以包含至少一种选自诸如2-丁氧基乙醇、异丙醇和d-柠檬烯的化合物的有机溶剂。

所述酶制剂相对于该酶制剂的总重量可以以在0-20重量％范围内的量包含有机溶剂。在一个实施方案中，该酶制剂以在5-15重量％范围内的量包含水并且不包含显著量的有机溶剂，例如1重量％或更少，全部相对于该酶制剂的总重量。

在一个实施方案中，本发明的酶制剂至少包含：

组分(a)：至少一种选自通式(I)的化合物的酶稳定剂：

其中在式(I)中的各变量如下：

组分(b)：至少一种选自蛋白酶的酶，更优选至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)的酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶；以及任选至少一种选自脂酶和淀粉酶的酶；以及

组分(c)：至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂，优选选自如上所公开的含硼化合物，更优选选自如上所公开的苯基硼酸(PBA)或其衍生物，最优选为4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)。

酶制剂的制备

本发明涉及一种制备酶制剂的方法，所述方法包括至少混合如上所公开的组分(a)和如上所公开的组分(b)的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及一种制备酶制剂的方法，所述方法包括混合如上所公开的组分(a)、(b)和(c)的步骤，其中组分(b)优选包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)的蛋白酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶；以及任选至少一种选自脂酶和淀粉酶的酶。在一个实施方案中，组分(c)包含至少一种如上所公开的溶剂。在一个实施方案中，组分(c)包含至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂，优选选自如上所公开的含硼化合物，更优选选自如上所公开的苯基硼酸(PBA)或其衍生物，最优选为4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)—全部如上所公开。

组分(b)可以是固体。可以在二者与至少一种溶剂(组分(c))接触之前将固体组分(b)加入固体组分(a)中。至少一种溶剂如上所公开。与至少一种溶剂(组分(c))的接触可能导致至少一种分子组分(a)和至少一种分子组分(b)的增溶，从而导致至少一种分子组分(b)的稳定化。在一个实施方案中，固体组分(a)和(b)完全溶于至少一种溶剂(组分(c))中而没有相分离。

固体组分(a)可以在与固体或液体组分(b)混合之前溶于至少一种溶剂(组分(c))中。在一个实施方案中，组分(a)在与组分(b)混合之前完全溶于至少一种溶剂(组分(c))中。至少一种溶剂如上所公开。

组分(b)可以是液体，其中至少一种酶可以包含在如上所公开的液体酶浓缩物中。可以对液体组分(b)补加固体组分(a)，其中固体组分(a)溶于液体组分(b)中。在一个实施方案中，液体组分(b)是含水的，优选由发酵得到。在一个实施方案中，当固体组分(a)溶于液体组分(b)中时，可以不加入额外溶剂。

在一个实施方案中，将如上所公开的组分(c)与组分(a)和(b)混合，其中该混合的特征在于在一步或多步中进行。

酶稳定化

本发明涉及一种通过加入组分(a)的步骤稳定组分(b)的方法，其中组分(a)和(b)是上面公开的那些。在一个实施方案中，组分(b)为液体。在一个实施方案中，本发明涉及一种通过加入组分(a)的步骤稳定组分(b)的方法，其中组分(b)包含至少一种蛋白酶以及任选一种选自脂酶和淀粉酶的酶。

在一个实施方案中，本发明涉及一种通过加入组分(a)和至少一种如上所公开的不同于组分(a)的酶稳定剂的步骤稳定组分(b)的方法。至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂优选选自如上所公开的含硼化合物，更优选选自如上所公开的苯基硼酸(PBA)或其衍生物，最优选为4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)。

本发明进一步涉及一种在液体配制剂中稳定至少一种水解酶的方法，包括在一步或多步中以非指定顺序至少将组分(a)和(b)以及任选至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂—全部如上所公开—与一种或多种配制剂组分混合。至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂优选选自如上所公开的含硼化合物，更优选选自如上所公开的苯基硼酸(PBA)或其衍生物，最优选为4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)。

在一个实施方案中，本发明涉及一种通过加入组分(a)以及任选至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂的步骤在至少一种表面活性剂存在下稳定组分(b)的方法，其中组分(a)和(b)是上面公开的那些且至少一种表面活性剂选自非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂，全部如下所述。在一个实施方案中，液体配制剂是洗涤剂配制剂。至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂优选选自如上所公开的含硼化合物，更优选选自如上所公开的苯基硼酸(PBA)或其衍生物，最优选为4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)。

本发明涉及组分(a)作为组分(b)的添加剂的用途。在一个实施方案中，组分(a)和(b)是固体，并且组分(b)在固体组分(a)和(b)的混合物与至少一种溶剂(如上所公开的组分(c))接触时稳定化。与至少一种溶剂(组分(c))接触可能导致至少一种分子组分(a)和至少一种分子组分(b)的增溶，从而导致至少一种分子组分(b)的稳定化。在一个实施方案中，固体组分(a)和(b)完全溶于至少一种溶剂(组分(c))中而没有相分离。

在一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物作为至少一种水解酶(组分(b))的添加剂的用途：

其中在式(I)中的各变量如下所定义：

R¹选自H和C₁-C₁₀烷基羰基，其中烷基可以是线性或支化的并且可以带有一个或多个羟基；

R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁-C₈烷基和支化C₃-C₈烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H；

其中式(I)化合物和该水解酶是固体并且其中该水解酶的酶催活性在式(I)化合物和该水解酶与至少一种溶剂[组分(c)]接触时稳定化。

在本发明的一个实施方案中，组分(a)相对于该酶制剂的总重量以在0.1-30重量％范围内的量加入。该酶制剂可以以在0.1-15重量％，0.25-10重量％，0.5-10重量％，0.5-6重量％或1-3重量％范围内的量包含组分(a)，全部相对于该酶制剂的总重量。

在一个实施方案中，至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂以对于可逆抑制至少一种包含在组分(b)中的蛋白酶的蛋白水解活性有效的量加入。

在一个实施方案中，将所述式(I)化合物用作组分(b)的添加剂，其中组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)的蛋白酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶，其中式(I)化合物和该蛋白酶是固体并且其中该蛋白酶的蛋白水解活性在式(I)化合物和该蛋白酶与至少一种溶剂[组分(c)]接触时稳定化。

在一个实施方案中，将所述式(I)化合物与至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂，优选至少一种含硼化合物一起用作组分(b)的添加剂，其中组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)的蛋白酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶，其中式(I)化合物和该蛋白酶是固体并且其中该蛋白酶的蛋白水解活性在式(I)化合物和该蛋白酶与至少一种溶剂[组分(c)]接触时稳定化。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶以及至少一种根据US 5869438的SEQID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体，其中式(I)化合物、该蛋白酶和该脂酶是固体并且其中该蛋白酶的蛋白水解活性和/或该脂酶的脂解活性在式(I)化合物、该蛋白酶和该脂酶与至少一种溶剂[组分(c)]接触时稳定化。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的蛋白酶或其如上所公开的具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶和至少一种根据US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体，其中式(I)化合物、该蛋白酶和该脂酶是固体并且该蛋白酶的蛋白水解活性和/或该脂酶的脂解活性在式(I)化合物、该蛋白酶和该脂酶与至少一种溶剂[组分(c)]接触时稳定化。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自如WO 89/06279表I a)中所公开的枯草溶菌素309或其如上所公开的具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶和至少一种根据US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体，其中式(I)化合物、该蛋白酶和该脂酶是固体并且该蛋白酶的蛋白水解活性和/或该脂酶的脂解活性在式(I)化合物、该蛋白酶和该脂酶与至少一种溶剂[组分(c)]接触时稳定化。

酶的稳定化可能涉及随时间的稳定性(例如储存稳定性)、热稳定性、pH稳定性和化学稳定性。术语“酶稳定性”在本文优选涉及酶催活性例如在储存或操作过程中随时间的保留。术语“储存”在本文中意欲表示从被制备时开始到用于最终应用中的时间点储存产品或组合物这一事实。在储存过程中作为时间函数的酶催活性保留称为“储存稳定性”。在一个实施方案中，储存是指在37℃下储存至少20天。储存可能是指在37℃下储存21、28或35天。

为了确定酶催活性随时间的变化，可以在限定条件下在时间为零时(即在储存前)测量酶的“初始酶催活性”并且可以在随后的某一时间点(即在储存之后)测量“储存后的酶催活性”。

储存后的酶催活性除以初始酶催活性乘以100得到“残留酶催活性”(a％)。

当酶的残留酶催活性与储存前的初始酶催活性相比为至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％或100％时，根据本发明它是稳定的。

从100％减去a％得到与储存前的初始酶催活性相比较时的“储存过程中的酶催活性损失”。在一个实施方案中，当在储存过程中基本没有出现酶催活性损失，即与储存前的初始酶催活性相比时酶催活性损失等于0％时，根据本发明酶是稳定的。在本发明中基本没有酶催活性损失可能是指酶催活性损失与储存前的初始酶催活性相比时小于30％，小于25％，小于20％，小于15％，小于10％，小于9％，小于8％，小于7％，小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％或小于1％。

在本发明的一个方面中，将组分(a)用于减少组分(b)储存过程中的酶催活性损失。％酶催活性损失减少的计算按如下进行：(稳定化酶的％酶催活性损失)–(未稳定化酶的％酶催活性损失)。损失减少的值显示出当在某一时间点与相同酶在没有组分(a)存在下的酶催活性损失相比较时，至少一种包含在组分(b)中的酶在组分(a)存在下的酶催活性损失减少。

在本发明中酶催活性损失减少可能是指在组分(a)存在下的酶催活性损失当与在没有组分(a)存在下的酶催活性损失相比较时减少至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.5％。

本发明一方面涉及一种通过加入式(I)化合物的步骤减少至少一种包含在液体中的蛋白酶(组分(b))在储存过程中的蛋白水解活性损失的方法：

其中在式(I)中的各变量如下所定义：

R²、R³、R⁴相互独立地选自H、线性C₁-C₈烷基和支化C₃-C₈烷基、未被取代或者被一个或多个羧酸基团或羟基取代的C₆-C₁₀芳基和C₆-C₁₀芳基烷基，其中后者的烷基选自线性C₁-C₈烷基或支化C₃-C₈烷基，其中R²、R³和R⁴中至少一个不为H。

在一个实施方案中，该减少至少一种包含在液体中的蛋白酶(组分(b))在储存过程中的蛋白水解活性损失的方法包括加入式(I)化合物的步骤和加入至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂，优选含硼化合物的步骤。

在一个实施方案中，该蛋白酶(组分(b))包含在一种液体酶制剂中，或者该蛋白酶包含在一种包含至少一种表面活性剂的液体组合物，如液体洗涤剂配制剂中。

在一个实施方案中，该减少至少一种蛋白酶的蛋白水解活性损失的方法的特征在于组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)的蛋白酶，最优选至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶以及至少一种根据US 5869438的SEQID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的蛋白酶或其如上所公开的具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶以及至少一种根据US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自如WO 89/06279表I a)中所公开的枯草溶菌素309或其如上所公开的具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶以及至少一种根据US5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其如上所公开的具有脂解活性的变体。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，优选选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶以及至少一种淀粉酶，优选选自WO2013/001078的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2及其具有淀粉分解活性的变体的淀粉酶。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的蛋白酶或其如上所公开的具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶以及至少一种淀粉酶，优选选自WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2及其具有淀粉分解活性的变体的淀粉酶。

在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自如WO 89/06279表I a)中所公开的枯草溶菌素309或其如上所公开的具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶以及至少一种淀粉酶，优选至少一种淀粉酶选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体—全部如上所公开。

在本发明的一个方面，组分(a)稳定至少一种包含在组分(b)中的蛋白酶。至少一种包含在组分(b)中的蛋白酶优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体—全部如上所公开。在一个实施方案中，组分(a)用于在一种液体酶制剂中稳定蛋白酶[组分(b)]。在一个实施方案中，组分(a)用于在一种包含至少一种表面活性剂的液体组合物中，优选在液体洗涤剂组合物中稳定蛋白酶[组分(b)]。稳定化就此而言可能是指在37℃下储存21、28和/或35天过程中的稳定化。

在一个实施方案中，将组分(a)加入组分(b)中在储存过程中稳定蛋白酶，其中稳定化的特征在于：

(a)在37℃下储存21天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>70％，≥75％或≥80％，和/或

(b)在37℃下储存28天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>65％，≥70％或≥75％，和/或

(c)在37℃下储存35天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>60％或≥65％。

在一个实施方案中，将组分(a)加入组分(b)中在储存过程中稳定蛋白酶，其中组分(a)的特征在于式(I)化合物中的R¹为H并且R²、R³、R⁴选自线性C₂-C₄烷基，以及其中稳定化的特征在于：

(a)在37℃下储存21天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>70％，≥75％，≥80％或≥83％，和/或

(b)在37℃下储存28天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>65％，≥70％，≥75％或≥79％，和/或

(c)在37℃下储存35天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>60％，或≥65％，≥70％或≥72％。

在一个实施方案中，将组分(a)加入组分(b)中在储存过程中稳定蛋白酶，其中组分(a)的特征在于式(I)化合物中的R¹为乙酰基并且R²、R³、R⁴选自线性C₂-C₄烷基，优选C₂和C₄烷基，以及其中稳定化的特征在于：

(a)在37℃下储存21天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>70％，≥75％，≥80％或≥85％，和/或

(b)在37℃下储存28天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>65％，≥70％，≥75％，≥80％或≥81％，和/或

(c)在37℃下储存35天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>60％或≥65％，≥70％，≥75％或≥77％。

在一个实施方案中，将组分(a)加入组分(b)中在储存过程中稳定蛋白酶，其中组分(a)的特征在于式(I)化合物中的R¹和R²为H，R⁴选自线性C₂-C₄烷基，优选C₂烷基并且R³等于R¹/R²或R⁴，以及其中稳定化的特征在于：

(a)在37℃下储存21天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>70％，≥75％，≥80％或≥81％，和/或

(b)在37℃下储存28天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>65％，≥70％，≥75％或≥76％，和/或

(c)在37℃下储存35天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>60％，≥65％或≥69％。

在一个实施方案中，将组分(a)加入组分(b)中在储存过程中稳定蛋白酶，其中组分(a)的特征在于式(I)化合物中的R¹为H并且R²、R³、R⁴选自苯基甲基和水杨基，以及其中稳定化的特征在于：

(b)在37℃下储存28天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>65％，≥70％，≥75％，≥80％或≥82％，和/或

(c)在37℃下储存35天后的残留蛋白水解活性当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时>60％，≥65％，≥70％或≥75％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<25％或≤20％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<30％或≤25％，和/或

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<40％或≤35％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<25％，≤20％或≤17％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<30％，≤25％或≤22％。

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<40％或≤35％，≤30％或≤28％。

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<30％，≤25％或≤21％。

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<40％，≤35％，≤30％或≤25％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<25％，≤20％或≤19％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<30％，≤25％或≤24％。

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<40％，≤35％，≤30％或≤31％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<25％，≤20％或≤15％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<30％，≤25％，≤20％或≤17％。

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与储存前的初始蛋白水解活性相比较时<40％，≤35％，≤30％，≤25％或≤23％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％，和/或

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥11％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥14％，和/或

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥12％。

在一个实施方案中，将组分(a)加入组分(b)中在储存过程中稳定蛋白酶，其中组分(a)的特征在于式(I)化合物中的R¹为乙酰基并且R²、R³、R⁴选自线性C₂-C₄烷基，优选C₂和C₄烷基，以及其中稳定化的特征在于：(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存

在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥14％，和/或(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存

在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥15％，和/或(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存

在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或15％。

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥12％，和/或

(a)在37℃下储存21天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％或≥13％，和/或

(b)在37℃下储存28天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％，≥15％或≥16％，和/或

(c)在37℃下储存35天过程中的蛋白水解活性损失当与在没有组分(a)存在下的蛋白水解活性损失相比较时的减少≥10％，≥15％，≥20％，≥25％或≥29％。

在上述实施方案的实施方案中，组分(a)用于在一种液体酶制剂中稳定蛋白酶[组分(b)]。此外，在上述实施方案的实施方案中，由组分(a)稳定的蛋白酶选自如WO 89/06279中所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792中所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体以及根据如EP1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体—全部如上所公开。

在本发明的一个方面，组分(a)用于在一种包含至少一种表面活性剂的液体组合物中，优选在一种液体洗涤剂组合物中稳定化包含至少一种蛋白酶和至少一种脂酶的组分(b)，其中

·至少一种蛋白酶优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体—全部如上所公开；

·至少一种脂酶选自疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体，优选根据US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的三酰甘油脂酶或其具有脂解活性的变体—全部如上所公开。

在本发明的一个方面，组分(a)用于在一种包含至少一种表面活性剂的液体组合物中，优选在一种液体洗涤剂组合物中稳定化包含至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶的组分(b)，其中

·至少一种淀粉酶选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体—全部如上所公开。

酶制剂在配制方法中的用途

本发明一方面涉及待配制到洗涤剂配制剂如I&I和家庭护理配制剂中的本发明液体酶制剂在洗衣和硬表面清洁中的用途，其中在一步或多步中以非指定顺序至少将组分(a)和(b)与一种或多种洗涤剂组分混合。在一个实施方案中，在一步或多步中以非指定顺序至少将组分(a)、(b)和(c)与一种或多种洗涤剂组分混合，其中组分(c)包含至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂，优选含硼化合物。

本发明一方面涉及一种包含本发明的液体酶制剂和一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂配制剂。

取决于所需应用如洗涤白色纺织品、彩色纺织品和羊毛，洗涤剂组分在类型和/或在洗涤剂配制剂中的量上可变。选取的组分进一步取决于洗涤剂配制剂的物理形式(液体、固体、凝胶、在小袋中提供或作为片剂提供等)。例如选取用于洗衣配制剂的组分进一步取决于区域***均硬度有关。

单独洗涤剂组分和在洗涤剂配制剂中的用量对本领域熟练技术人员而言是已知的。合适的洗涤剂组分尤其包含表面活性剂、助洗剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、水溶助长剂和缓蚀剂。其他实例例如描述于“complete Technology Bookon Detergents with Formulations(Detergent Cake，Dishwashing Detergents，Liquid&Paste Detergents，Enzyme Detergents，Cleaning Powder&Spray Dried WashingPowder)”，Engineers India Research Institute(EIRI)，第6版(2015)中。对本领域熟练技术人员而言另一参考书可能是“Detergent Formulations Encyclopedia”，SolverchemPublications，2016。

应理解的是该洗涤剂组分此外还有包含在本发明酶制剂中的组分。若本发明酶制剂中所含组分也是洗涤剂组分，则它可以是需要调节以使得该组分对该洗涤剂配制剂中所需目的有效的浓缩物。

洗涤剂组分在洗涤剂配制剂的最终应用中可以具有不止一种功能，因此在本文中就特定功能所提到的任何洗涤剂组分也可以在洗涤剂配制剂的最终应用中具有另一功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂配制剂的最终应用中的功能通常取决于其在该洗涤剂配制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。

术语“有效量”包括单独组分提供有效去污和/或有效清洁条件(例如pH、发泡量)的量，某些组分有效提供光学益处(例如荧光增白、染料转移抑制)的量和/或某些组分有效帮助加工(在加工、储存和使用过程中维持物理特性；例如粘度改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的量。

在一个实施方案中，洗涤剂配制剂是不止两种洗涤剂组分的配制剂，其中至少一种组分有效去污，至少一种组分有效提供最佳清洁条件并且至少一种组分有效维持该洗涤剂的物理特性。

本发明的洗涤剂配制剂可以包含溶于溶剂中的组分(a)和组分(b)。溶解可以指溶于整个洗涤剂配制剂中。溶解可以指组分(a)和组分(b)是可以包封的本发明液体酶制剂的一部分。包封液体酶制剂可以是液体洗涤剂配制剂的一部分或固体洗涤剂配制剂的一部分。

在本发明的一个实施方案中，洗涤剂配制剂，优选液体洗涤剂配制剂相对于该洗涤剂配制剂的总重量以在0.1-30重量％范围内的量包含组分(a)。该酶制剂可以以在0.1-15重量％，0.25-10重量％，0.5-10重量％，0.5-6重量％或1-3重量％范围内的量包含组分(a)，全部相对于该洗涤剂配制剂的总重量。

在本发明的一个实施方案中，洗涤剂配制剂，优选液体洗涤剂配制剂包含0.5-20重量％，特别是1-10重量％组分(b)和0.01-10％，更特别是0.05-5重量％，最特别是0.1-2重量％组分(a)，全部相对于该洗涤剂配制剂的总重量。

本发明的洗涤剂配制剂包含至少一种选自表面活性剂、助洗剂、聚合物、香料和染料的化合物。

本发明的洗涤剂配制剂包含至少一种选自非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的表面活性剂。

该洗涤剂配制剂相对于该洗涤剂配制剂的总重量可以包含0.1-60重量％表面活性剂。该洗涤剂配制剂可以包含至少一种选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂和氧化胺表面活性剂的化合物以及前述中至少两种的组合。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂配制剂包含5-30重量％阴离子表面活性剂和例如在3-20重量％范围内的至少一种非离子表面活性剂，全部相对于该洗涤剂配制剂的总重量，其中该洗涤剂配制剂可以是液体。

至少一种非离子表面活性剂可以选自烷氧基化醇，氧化乙烯和氧化丙烯的二-和多嵌段共聚物以及脱水山梨醇与氧化乙烯或氧化丙烯的反应产物，烷基聚糖苷(APG)，羟烷基混合醚和氧化胺。

烷氧基化醇和烷氧基化脂肪醇的优选实例例如是通式(IV)的化合物：

其中

R³相同或不同且选自氢和线性C₁-C₁₀烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，特别优选氢或甲基，

R⁴选自支化或线性C₈-C₂₂烷基，例如n-C₈H₁₇、n-C₁₀H₂₁、n-C₁₂H₂₅、n-C₁₄H₂₉、n-C₁₆H₃₃或n-C₁₈H₃₇，

R⁵选自C₁-C₁₀烷基，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基或异癸基。

变量m和n在0-300范围内，其中n和m之和至少为1，优选在3-50范围内。优选m在1-100范围内并且n在0-30范围内。

在一个实施方案中，通式(IV)的化合物可以是嵌段共聚物或无规共聚物，优选嵌段共聚物。

烷氧基化醇的其他优选实例例如是通式(V)的化合物：

其中

R⁶相同或不同且选自氢和线性C₁-C₁₀烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，特别优选氢或甲基，

R⁷选自支化或线性C₆-C₂₀烷基，尤其是n-C₈H₁₇、n-C₁₀H₂₁、n-C₁₂H₂₅、n-C₁₃H₂₇、n-C₁₅H₃₁、n-C₁₄H₂₉、n-C₁₆H₃₃、n-C₁₈H₃₇，

a为0-10，优选1-6范围内的数，

b为1-80，优选4-20范围内的数，

c为0-50，优选4-25范围内的数。

a+b+c之和优选在5-100，甚至更优选9-50范围内。

在一个实施方案中，烷氧基化醇选自式(V)的那些，其中没有R⁶和R⁷选自n-C₈H₁₇、n-C₁₀H₂₁、n-C₁₂H₂₅、n-C₁₃H₂₇、n-C₁₅H₃₁、n-C₁₄H₂₉、n-C₁₆H₃₃、n-C₁₈H₃₇；a和c为0，b在4-20范围内，优选9。

羟烷基混合醚的优选实例是通式(VI)的化合物：

其中各变量如下所定义：

R⁸相同或不同且选自氢和线性C₁-C₁₀烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，特别优选氢或甲基，

R⁹选自线性或支化C₈-C₂₂烷基和C₈-C₂₂链烯基；实例包括异-C₁₁H₂₃、异-C₁₃H₂₇、n-C₈H₁₇、n-C₁₀H₂₁、n-C₁₂H₂₅、n-C₁₄H₂₉、n-C₁₆H₃₃或n-C₁₈H₃₇，

R¹⁰选自线性或支化C₁-C₁₈烷基和C₂-C₁₈链烯基；实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基和正十八烷基。

变量m和x在0-300，优选0-100范围内；m和x之和至少为1，优选在5-50范围内。

通式(V)和(VI)的化合物可以是嵌段共聚物或无规共聚物，优选嵌段共聚物。

其他合适的非离子表面活性剂选自由氧化乙烯和氧化丙烯构成的二-和多嵌段共聚物。其他合适的非离子表面活性剂选自乙氧基化或丙氧基化脱水山梨醇酯。氧化胺或烷基聚糖苷，尤其是线性C₄-C₁₈烷基聚葡糖苷和支化C₈-C₁₈烷基聚糖苷如平均通式(VII)的化合物同样是合适的。

其中：

R¹¹为C₁-C₄烷基，尤其是乙基、正丙基或异丙基，

R¹²为-(CH₂)₂-R¹¹，

G¹选自具有4-6个碳原子的单糖，尤其选自葡萄糖和木糖，

y在1.1-4范围内，其中y为平均数。

非离子表面活性剂的其他实例是通式(VIIIa)和(VIIIb)的化合物：

其中

AO选自氧化乙烯、氧化丙烯和氧化丁烯，

EO为氧化乙烯CH₂CH₂-O，

R¹³为C₁-C₄烷基，尤其是乙基、正丙基或异丙基，

R¹⁴选自支化或线性C₈-C₁₈烷基，

A³O选自氧化丙烯和氧化丁烯，

w为15-70，优选30-50范围内的数，

w1和w3为1-5范围内的数，以及

w2为13-35范围内的数。

合适的其他非离子表面活性剂的综述可以在EP-A 0 851 023和DE-A 198 19 187中找到。

在一个实施方案中，该洗涤剂配制剂包含两种或更多种不同非离子表面活性剂的混合物。

至少一种两性表面活性剂可以选自在使用条件下在相同分子中带有正电荷和负电荷的表面活性剂。两性表面活性剂的优选实例是所谓的甜菜碱表面活性剂。甜菜碱表面活性剂的许多实例每分子带有一个季化氮原子和一个羧酸基团。两性表面活性剂的特别优选实例是椰油酰胺基丙基甜菜碱(月桂酰胺基丙基甜菜碱)。

氧化胺表面活性剂的实例是通式(IX)的化合物：

R¹³R¹⁴R¹⁵N→O (IX)

其中R¹³、R¹⁴和R¹⁵相互独立地选自脂族、脂环族或C₂-C₄亚烷基-C₁₀-C₂₀烷基酰胺基结构部分。优选R¹²选自C₈-C₂₀烷基或C₂-C₄亚烷基-C₁₀-C₂₀烷基酰胺基以及R¹³和R¹⁴均为甲基。

特别优选的实例是月桂基二甲基氧化胺，有时也称为月桂氧化胺。另一特别优选的实例是椰油酰胺基丙基二甲基氧化胺，有时也称为椰油酰胺基丙基氧化胺。

至少一种阴离子表面活性剂可以选自C₈-C₁₈烷基硫酸，C₈-C₁₈脂肪醇聚醚硫酸，乙氧基化C₄-C₁₂烷基酚的硫酸半酯(乙氧基化：1-50mol氧化乙烯/mol)，C₁₂-C₁₈磺基脂肪酸烷基酯，例如C₁₂-C₁₈磺基脂肪酸甲基酯，此外还有C₁₂-C₁₈烷基磺酸和C₁₀-C₁₈烷基芳基磺酸的碱金属和铵盐。优选上述化合物的碱金属盐，特别优选钠盐。

阴离子表面活性剂的具体实例是通式(X)的化合物：

C_sH_2s+1-O(CH₂CH₂O)_t-SO₃M (X)

其中

s为在10-18，优选12-14范围内的数，甚至更优选s＝12，

t为在1-5，优选2-4范围内的数，甚至更优选3，

M选自碱金属，优选钾，甚至更优选钠。

变量s和t可以是平均数并且因此它们不一定为整数，而在式(X)的单个分子中，s和t均表示整数。

合适阴离子表面活性剂的其他实例是皂类，例如硬脂酸、油酸、棕榈酸、醚羧酸和烷基醚磷酸的钠或钾盐。

本发明的洗涤剂配制剂可以包含1-40重量％的至少一种洗涤剂助剂。洗涤剂助剂的实例包括但不限于沸石，磷酸盐，膦酸盐，柠檬酸盐，聚合物助洗剂或氨基羧酸盐如亚氨基二琥珀酸碱金属盐，例如IDS-Na₄，此外还有次氮基三乙酸(“NTA”)，甲基甘氨酸二乙酸(“MGDA”)，谷氨酸二乙酸(“GLDA”)，乙二胺四乙酸(“EDTA”)或二亚乙基三胺五乙酸(“DTPA”)。优选的碱金属盐是钾盐，尤其是钠盐。

洗涤剂助剂的其他实例是具有络合基团的聚合物，例如其中20-90mol％的N原子带有至少一个CH₂COO^-基团的聚乙烯亚胺，以及上述多价螯合剂的相应碱金属盐，尤其是其钠盐。

合适聚合物的其他实例是聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。聚亚烷基亚胺可以直接使用或者作为多烷氧基化衍生物使用，例如乙氧基化或丙氧基化。聚亚烷基亚胺每分子包含至少3个亚烷基亚胺单元。

在本发明的一个实施方案中，所述亚烷基亚胺单元是C₂-C₁₀亚烷基二胺单元，例如1,2-丙二胺，优选α,ω-C₂-C₁₀亚烷基二胺，例如1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺(也称为1,6-亚己基二胺)、1,8-二胺或1,10-癸二胺，甚至更优选1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺和1,6-己二胺。

在本发明的另一实施方案中，所述聚亚烷基亚胺选自聚亚烷基亚胺单元，优选聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺单元。

术语“聚乙烯亚胺”在本发明上下文中不仅涉及聚乙烯亚胺均聚物，而且涉及与其他亚烷基二胺结构单元，例如NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH结构单元、NH-CH₂-CH(CH₃)-NH结构单元、NH-(CH₂)₄-NH结构单元、NH-(CH₂)₆-NH结构单元或(NH-(CH₂)₈-NH结构单元一起包含NH-CH₂-CH₂-NH结构单元的聚亚烷基亚胺，但是NH-CH₂-CH₂-NH结构单元就摩尔份额而言占多数。优选的聚乙烯亚胺包含NH-CH₂-CH₂-NH结构单元，其就摩尔份额而言占多数，例如相对于所有亚烷基亚胺结构单元占60mol％或更多，例如占至少70mol％。在特殊实施方案中，术语聚乙烯亚胺涉及每个聚乙烯亚胺单元仅带有一个或不带不同于NH-CH₂-CH₂-NH的亚烷基亚胺结构单元的那些聚亚烷基亚胺。

术语“聚丙烯亚胺”在本发明上下文中不仅涉及聚丙烯亚胺均聚物，而且涉及与其他亚烷基二胺结构单元，例如NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH结构单元、NH-CH₂-CH₂-NH结构单元、NH-(CH₂)₄-NH结构单元、NH-(CH₂)₆-NH结构单元或(NH-(CH₂)₈-NH结构单元一起包含NH-CH₂-CH(CH₃)-NH结构单元的聚亚烷基亚胺，但是NH-CH₂-CH(CH₃)-NH结构单元就摩尔份额而言占多数。优选的聚丙烯亚胺包含NH-CH₂-CH(CH₃)-NH结构单元，其就摩尔份额而言占多数，例如相对于所有亚烷基亚胺结构单元占60mol％或更多，例如占至少70mol％。在特殊实施方案中，术语聚丙烯亚胺涉及每个聚丙烯亚胺单元仅带有一个或不带不同于NH-CH₂-CH(CH₃)-NH的亚烷基亚胺结构单元的那些聚亚烷基亚胺。

支链可以是亚烷基氨基，如但不限于-CH₂-CH₂-NH₂基团或(CH₂)₃-NH₂基团。更长支链例如可以是-(CH₂)₃-N(CH₂CH₂CH₂NH₂)₂或-(CH₂)₂-N(CH₂CH₂NH₂)₂基团。高度支化的聚乙烯亚胺例如是聚乙烯亚胺树枝体或支化度在0.25-0.95，优选0.30-0.80范围内，特别优选至少0.5的相关分子。支化度例如可以通过¹³C-NMR或¹⁵N-NMR光谱法优选在D₂O中测定并且按如下定义：

DB＝D+T/D+T+L

其中D(树枝状)对应于叔氨基的比例，L(线性)对应于仲氨基的比例且T(末端)对应于伯氨基的比例。

在本发明上下文中，支化聚乙烯亚胺单元是DB在0.25-0.95，特别优选0.30-0.90％范围内，非常特别优选至少0.5的聚乙烯亚胺单元。优选的聚乙烯亚胺单元是很少支化或者没有支化的那些，因此是主要呈线性或线性聚乙烯亚胺单元。

在本发明上下文中，CH₃基团不被看作支链。

在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺可以具有在1-1000mg KOH/g，优选10-500mg KOH/g，最优选50-300mg KOH/g范围内的伯胺值。伯胺值可以根据ASTM D2074-07测定。

在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺可以具有在10-1000mg KOH/g，优选50-500mg KOH/g，最优选50-500mg KOH/g范围内的仲胺值。仲胺值可以根据ASTM D2074-07测定。

在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺可以具有在1-300mg KOH/g，优选5-200mg KOH/g，最优选10-100mg KOH/g范围内的叔胺值。叔胺值可以根据ASTM D2074-07测定。

在本发明的一个实施方案中，叔N原子的摩尔份额通过¹⁵N-NMR光谱法测定。在叔胺值和根据¹³C-NMR光谱法的结果不一致的情况下，优选通过¹³C-NMR光谱法得到的结果。

在本发明的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺的平均分子量M_w在250-100,000g/mol，优选250-50,000g/mol，更优选800-25,000g/mol范围内。聚亚烷基亚胺的平均分子量M_w可以通过中间体相应聚亚烷基亚胺的凝胶渗透色谱法(GPC)测定，以1.5重量％甲酸水溶液作为洗脱剂和交联聚甲基丙烯酸羟乙酯作为固定相。

所述聚亚烷基亚胺可以是游离的或者被烷氧基化，所述烷氧基化选自乙氧基化、丙氧基化、丁氧基化以及前述中至少两种的组合。优选氧化乙烯、1,2-氧化丙烯以及氧化乙烯和1,2-氧化丙烯的混合物。若使用至少两种氧化烯的混合物，则它们可以逐步或同时反应。

在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺带有至少6个氮原子/单元。

在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺用2-50摩尔氧化烯/NH基团，优选5-30摩尔氧化烯/NH基团，甚至更优选5-25摩尔氧化乙烯或1,2-氧化丙烯或其组合/NH基团烷氧基化。在本发明上下文中，NH₂单元作为两个NH基团计。优选烷氧基化所有—或者几乎所有—NH基团并且没有留下可检测量的NH基团。

取决于该类烷氧基化聚亚烷基亚胺的制备，分子量分布可以是窄或宽的。例如，多分散性Q＝M_w/M_n在1-3范围内，优选至少2，或者它可以大于3并且至多为20，例如3.5-15，甚至更优选在4-5.5范围内。

在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺的多分散性Q在2-10范围内。

在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺选自多乙氧基化聚乙烯亚胺、乙氧基化聚丙烯亚胺、乙氧基化α,ω-己二胺、乙氧基化和丙氧基化聚乙烯亚胺、乙氧基化和丙氧基化聚丙烯亚胺以及乙氧基化和多丙氧基化α,ω-己二胺。

在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚乙烯亚胺的平均分子量M_n(数均)由GPC测定在2,500-1,500,000g/mol范围内，优选至多500,000g/mol。

在本发明的一个实施方案中，平均烷氧基化聚亚烷基亚胺选自乙氧基化α,ω-己二胺以及乙氧基化和多丙氧基化α,ω-己二胺，各自具有的平均分子量M_n(数均)在800-500,000g/mol，优选1,000-30,000g/mol范围内。

本发明的液体洗涤剂配制剂可以包含一种或多种缓蚀剂。合适缓蚀剂的非限制性实例包括硅酸钠，***类如苯并***类、二苯并***类、氨基***类、烷基氨基***类，苯酚衍生物如氢醌、邻苯二酚、羟基氢醌、没食子酸、间苯三酚和1,2,3-苯三酚，其他聚乙烯亚胺以及铋或锌的盐。缓蚀剂可以相对于该液体洗涤剂组合物的总重量以0.1-1.5重量％的量配制到本发明的液体洗涤剂配制剂中。

本发明的液体洗涤剂配制剂可以包含至少一种由如下组分构成的接枝共聚物：

(a)至少一种选自非离子单糖、二糖、寡糖和多糖的接枝基质，和通过接枝上如下组分得到的侧链：

(b)至少一种烯属不饱和单-或二羧酸，和

(c)至少一种通式(XI)的化合物：

其中各变量如下所定义：

R¹选自甲基和氢，

A¹选自C₂-C₄亚烷基，

R²相同或不同且选自C₁-C₄烷基，

X^-选自卤离子、单-C₁-C₄烷基硫酸根和硫酸根。

本发明的液体洗涤剂配制剂可以包含一种或多种缓冲剂如单乙醇胺和N,N,N-三乙醇胺。

可以改变本发明液体洗涤剂配制剂的起泡特性以满足各种目的。手洗餐具洗涤剂通常要求稳定泡沫。自动洗餐具洗涤剂通常要求低起泡。洗衣用洗涤剂可以从高起泡到温和或中等范围直到低起泡。通常将低起泡洗衣用洗涤剂推荐用于前面装料的转鼓洗衣机和洗衣烘干机组合。本领域熟练技术人员熟知在适合特定应用的洗涤剂配制剂中使用泡沫稳定剂或抑泡剂作为洗涤剂组分。泡沫稳定剂的实例包括但不限于链烷醇酰胺和烷基氧化胺。抑泡剂的实例包括但不限于磷酸烷基酯、聚硅氧烷和皂类。

本发明的液体洗涤剂配制剂可以包含一种或多种香料如水杨酸苄基酯、作为

市购的2-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙醛和己基肉桂醛。

本发明的液体洗涤剂配制剂可以包含一种或多种染料如酸性蓝9、酸性黄3、酸性黄23、酸性黄73、颜料黄101、酸性绿1、溶剂绿7和酸性绿25。

液体洗涤剂配制剂可以包含至少一种选自有机溶剂、防腐剂、粘度改性剂和水溶助长剂的化合物。

在本发明的一个实施方案中，液体洗涤剂配制剂包含的有机溶剂量相对于该液体洗涤剂配制剂的总重量为0.5-25重量％。尤其当本发明的液体洗涤剂配制剂以小袋等提供时，相对于该液体洗涤剂配制剂的总重量可以包含8-25重量％有机溶剂。有机溶剂是上面公开的那些。

本发明的液体洗涤剂配制剂可以以有效避免该液体洗涤剂配制剂的微生物污染的量包含一种或多种选自上面所公开那些的防腐剂。

在本发明的一个实施方案中，液体洗涤剂配制剂包含一种或多种粘度改性剂。合适粘度改性剂的非限制性实例包括琼脂，角叉菜胶，黄蓍胶，***树胶，黄原胶，藻酸盐，果胶，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，淀粉，明胶，刺槐豆胶，交联聚(甲基)丙烯酸酯，例如用二(甲基)丙烯酰胺交联的聚丙烯酸，此外还有硅酸，粘土如—但不限于—蒙脱土，沸石，糊精和酪蛋白。可以以有效提供所需粘度的量包含粘度改性剂。

在本发明的一个实施方案中，液体洗涤剂配制剂包含一种或多种水溶助长剂，后者可以为有机溶剂如乙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇以及在正常条件下没有限制地呈水溶混性的其他有机溶剂。合适水溶助长剂的其他实例是甲苯磺酸、二甲苯磺酸和枯烯磺酸的钠盐。可以以促进具有有限水溶性的化合物溶解或者使其能够溶解的量包含水溶助长剂。

在本发明的一个实施方案中，本发明配制剂不含磷酸盐和聚磷酸盐，其中磷酸氢盐包括在内，例如不含磷酸三钠，三聚磷酸五钠和偏磷酸六钠。就磷酸盐和聚磷酸盐而言，在本发明上下文中“不含”应理解为指磷酸盐和聚磷酸盐含量通过重量分析测定总共在10ppm-0.2重量％范围内。

在本发明的一个实施方案中，本发明配制剂不含那些不用作漂白催化剂的重金属化合物，尤其不含铁化合物。就重金属化合物而言，在本发明上下文中“不含”应理解为指不用作漂白催化剂的重金属化合物的含量通过沥滤方法测定总共在0-100ppm，优选1-30ppm范围内。在本发明上下文中，“重金属”是所有比重为至少6g/cm³的金属，锌和铋除外。重金属尤其是贵金属，以及还有铁、铜、铅、锡、镍、镉和铬。

在一个实施方案中，本发明的液体洗涤剂配制剂不含漂白剂，例如不含无机过氧化合物或含氯漂白剂如次氯酸钠，这意味着本发明的液体洗涤剂配制剂总共包含0.01重量％或更少的无机过氧化合物和含氯漂白剂，在每种情况下相对于该液体洗涤剂配制剂的总重量。

“洗涤剂配制剂”或“清洁配制剂”在本文是指指定用于清洁染污材料的配制剂。清洁可能指洗衣或硬表面清洁。染污材料根据本发明包括纺织品和/或硬表面。

术语“洗衣”涉及家庭洗衣和工业洗衣二者并且是指用包含本发明洗涤剂配制剂的溶液处理纺织品的方法。该洗衣方法可以通过使用工艺装置如家用或工业洗衣机进行。或者，该洗衣方法可以手动进行。

术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线(由用于针织或编织的天然或合成纤维制成的线)，纱线中间体，纤维，非织造材料，天然材料，合成材料以及由这些材料制成的织物(通过编织、针织或粘结纤维制成的纺织品)如服装(由纺织品制成的任何衣服制品)、布料和其他制品。

术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的实例是植物(如亚麻、黄麻和棉花)或动物来源的，包括蛋白质如胶原蛋白、角蛋白和蚕丝蛋白(例如丝绸、绵羊毛、山羊毛、马海毛、山羊绒)。合成来源的纤维实例是聚氨酯纤维如

或

聚酯纤维，聚烯烃如弹性聚烯烃，或聚酰胺纤维如尼龙。纤维可以是单纤维或纺织品如针织品、织造物或非织造物的一部分。

术语“硬表面清洁”在本文中定义为硬表面的清洁，其中硬表面可以包括家庭用途中的任何硬表面，如地板、家具、墙壁、卫生陶瓷、玻璃、包括刀具在内的金属表面或餐具。因此，术语“硬表面清洁”可能是指“餐具洗涤”，后者涉及所有形式的洗餐具，例如手洗或自动餐具洗涤(ADW)。洗餐具包括但不限于清洁所有形式的陶器如盘、杯、玻璃、碗，所有形式的刀具如勺、刀、叉和服务用具以及陶瓷制品，塑料如蜜胺，金属，瓷器，玻璃和丙烯酸系材料。

本发明一方面涉及提供一种至少包含组分(a)和(b)以及至少一种洗涤剂组分的液体洗涤剂配制剂，其中组分(b)包含至少一种蛋白酶和至少一种脂酶。

在一个实施方案中，本发明提供了一种至少包含组分(a)和(b)以及至少一种洗涤剂组分的液体洗涤剂配制剂，其中组分(b)包含至少一种选自如上所公开的疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体的脂酶以及至少一种优选选自如下的蛋白酶：如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体—全部如上所公开。

在上述实施方案的实施方案中，当与没有组分(a)的液体洗涤剂配制剂相比较时，该液体洗涤剂配制剂具有增加的储存稳定性。增加的储存稳定性就此而言可能是指该洗涤剂配制剂在37℃下储存1周[7天]，2周[14天]，4周[28天]，6周[42天]或8周[56天]之后没有显著的洗涤性能损失。

在储存之后没有显著的洗涤性能损失可能是指该洗涤剂：

i.当与相同洗涤剂在储存之前的洗涤性能相比较时，在37℃下储存4周之后具有至少90％的洗涤性能；和/或

ii.当与相同洗涤剂在储存之前的洗涤性能相比较时，在37℃下储存6周之后具有至少85％的洗涤性能；和/或

iii.当与相同洗涤剂在储存之前的洗涤性能相比较时，在37℃下储存8周之后具有至少80％的洗涤性能。

在一个实施方案中，当与没有组分(a)的液体洗涤剂配制剂相比较时，该至少包含组分(a)和(b)以及至少一种洗涤剂组分的液体洗涤剂配制剂具有增加的储存稳定性，其中组分(b)包含至少一种优选选自如上所公开的疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体的脂酶以及至少一种如上所公开的蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309、如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素和如本文所公开的根据如EP1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其变体。在一个实施方案中，增加的储存稳定性是指当与没有组分(a)的液体洗涤剂配制剂在相同温度下储存相同时间相比较时，液体洗涤剂配制剂在37℃下储存4-8周之后的洗涤性能增加至少5％，至少6％，至少7％，至少8％，至少9％或至少10％。增加的储存稳定性可能是指当与没有组分(a)的液体洗涤剂配制剂在相同温度下储存相同时间相比较时，液体洗涤剂配制剂在37℃下储存8周之后的洗涤性能增加至少5％，至少6％，至少7％，至少8％，至少9％或至少10％。

本发明一方面涉及提供一种至少包含组分(a)和(b)以及至少一种洗涤剂组分的液体洗涤剂配制剂，其中组分(b)包含至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶。

在一个实施方案中，本发明提供了一种至少包含组分(a)和(b)以及至少一种洗涤剂组分的液体洗涤剂配制剂，其中组分(b)包含至少一种优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体、如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶以及至少一种优选选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，更优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体的淀粉酶—全部如上所公开。

本发明一方面涉及组分(a)在液体洗涤剂配制剂中稳定组分(b)的用途，其中组分(b)包含至少一种如上所公开的蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309或其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体—全部如本文所公开。

在一个实施方案中，本发明涉及组分(a)在液体洗涤剂配制剂中稳定组分(b)的用途，其中组分(b)包含至少一种如上所公开的蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309或其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体，以及至少一种优选选自如上所公开的疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体的脂酶—全部酶如本文所公开。

在一个实施方案中，本发明涉及组分(a)在液体洗涤剂配制剂中稳定组分(b)的用途，其中组分(b)包含至少一种如上所公开的蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309或其具有蛋白水解活性的变体、如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体，以及至少一种优选选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，更优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体的淀粉酶—全部酶如本文所公开。

稳定化组分(b)就此而言是指当与没有组分(a)的液体洗涤剂配制剂在相同温度下储存相同时间相比较时，包含组分(b)的液体洗涤剂配制剂在37℃下储存4-8周之后的洗涤性能增加至少5％，至少6％，至少7％，至少8％，至少9％或至少10％。稳定化组分(b)可能是指当与没有组分(a)的液体洗涤剂配制剂在相同温度下储存相同时间相比较时，包含组分(b)的液体洗涤剂配制剂在37℃下储存8周之后的洗涤性能增加至少5％，至少6％，至少7％，至少8％，至少9％或至少10％。

本发明一方面涉及组分(a)在液体洗涤剂配制剂中减少组分(b)在储存过程中的酶催活性损失，优选在37℃下储存21、28和/或35天过程中的酶催活性损失的用途，其中组分(b)包含至少一种蛋白酶，优选选自如WO89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体，以及至少一种优选选自疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体的脂酶—全部酶如上所公开。

本发明一方面涉及组分(a)在液体洗涤剂配制剂中减少组分(b)在储存过程中的酶催活性损失，优选在37℃下储存21、28和/或35天过程中的酶催活性损失的用途，其中组分(b)包含至少一种蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体，以及至少一种优选选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，更优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体的淀粉酶—全部酶如上所公开。

本发明一方面涉及一种通过将至少一种式(I)化合物加入包含至少一种蛋白酶的液体洗涤剂配制剂中而提高该洗涤剂配制剂的储存稳定性的方法：

其中式(I)的各变量如下：

在一个实施方案中，当与没有式(I)化合物的液体洗涤剂配制剂在相同条件下储存相比较时，所述液体洗涤剂配制剂在37℃下储存21，28和/或35天过程中的储存稳定性增加。本发明中增加的储存稳定性可能指在组分(a)存在下的酶稳定性当与在不存在组分(a)下的酶催活性相比较时增加至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.5％。

在一个实施方案中，所述液体洗涤剂配制剂包含至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶并且其中该液体洗涤剂配制剂任选包含至少一种优选选自疏绵状嗜热丝孢菌脂酶的脂酶，其中

(a)至少一种蛋白酶优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309或其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素或其具有蛋白水解活性的变体—全部如本文所公开，和

(b)至少一种优选选自如上所公开的疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体的脂酶。

在一个实施方案中，所述液体洗涤剂配制剂包含至少一种选自枯草溶菌素类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶并且其中该液体洗涤剂配制剂任选包含至少一种淀粉酶，其中

(b)至少一种淀粉酶优选选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，更优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体—如本文所公开。

其他用途

本发明涉及一种除污方法，包括使脏污与包含组分(a)和(b)以及一种或多种洗涤剂组分的本发明洗涤剂配制剂接触的步骤。在一个实施方案中，该除污方法包括通过自动装置如洗衣机或自动洗碗机进行的步骤。

在一个实施方案中，该洗涤剂配制剂包含本发明的酶制剂。

该方法一方面涉及除去包含脂肪的脏污。脂肪取决于熔融温度可以细分为乳脂、油脂或油。油在室温下通常为液体。油脂在室温下比油具有更高粘度并且可以称为糊状。在一个实施方案中，除去包含脂肪的脏污可以在清洁温度≤40℃下，在清洁温度≤30℃下，在清洁温度≤25℃下或在清洁温度≤20℃下进行。

本发明一方面涉及一种除去包含熔融温度低于清洁温度的脂肪化合物的脏污的方法。在一个实施方案中，待从纺织品除去的脏污包含熔融温度>30℃的脂肪化合物并且该除去在温度≤30℃的清洁温度下进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种在温度≤30℃的清洁温度下除去包含熔融温度>30℃的脂肪化合物的脏污的方法，其中该方法包括使该脏污与包含组分(a)和(b)以及一种或多种洗涤剂组分的本发明洗涤剂配制剂接触的步骤。组分(a)和(b)是如上所公开的那些。在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种优选选自疏绵状嗜热丝孢菌脂酶及其变体的脂酶和至少一种蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶—全部如上所公开。

该方法一方面涉及除去包含淀粉的脏污。在一个实施方案中，除去包含淀粉的脏污可以在清洁温度≤40℃下，在清洁温度≤30℃下，在清洁温度≤25℃下或在清洁温度≤20℃下进行。

在一个实施方案中，本发明涉及一种在温度≤30℃的清洁温度下除去包含淀粉的脏污的方法，其中该方法包括使该脏污与包含组分(a)和(b)以及一种或多种洗涤剂组分的本发明洗涤剂配制剂接触的步骤。组分(a)和(b)是如上所公开的那些。在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种蛋白酶，优选选自如WO 89/06279所公开的枯草溶菌素147和/或309及其具有蛋白水解活性的变体，如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体和根据如EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的枯草溶菌素及其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶，以及至少一种优选选自来自芽孢杆菌属707的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体和来自崛越氏芽孢杆菌的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体，更优选选自根据WO 2013/001078的SEQ ID NO:1和2的淀粉酶或其具有淀粉分解活性的变体的淀粉酶—全部酶如上所公开。

实施例

本发明由工作实施例进一步说明。

通用说明：百分数是重量百分数，除非另有具体说明。

I.测试化合物

A)式(I)化合物—(组分(a))：

A.1柠檬酸三乙酯—购自Sigma Aldrich

A.2柠檬酸三丙酯—购自Sigma Aldrich

A.3柠檬酸三丁酯—购自Sigma Aldrich

A.4柠檬酸乙酰三丁酯—购自Sigma Aldrich

A.5柠檬酸乙酰三乙酯—购自Sigma Aldrich

A.6柠檬酸单乙酯—购自Sigma AldrichA.7柠檬酸二乙酯

如Journal of Chemical&Engineering Data 2018，DOI:10.1021/acs.jced.7b01060，C.Berdugo，A.Suaza，M.Santaella，O.Sanchez所述合成

A.8柠檬酸三苄基酯

如WO2007/14471A1，2007所述合成；在专利中的位置：第19页第27-28栏；

A.9柠檬酸三水杨基酯

B)对比化合物：

B.1：柠檬酸—购自Sigma Aldrich

B.2：柠檬酸三钠盐—购自Sigma Aldrich

B.3：草酸二乙酯—购自Sigma Aldrich

B.4：甘油三乙酸酯(三醋精)—购自Sigma Aldrich

II.蛋白酶稳定性

蛋白酶的储存稳定性在37℃下评价。

基础测试配制剂通过根据表1混合各组分制备基础配制剂I-V而制备。

所用蛋白酶：

16.0L(CAS号9014-01-1，EC号232-752-2)购自Sigma-Aldrich。

若适用，以表1中所示量将相应组分(a)或对比化合物加入相应基础配制剂中。

以表1中所示量将蛋白酶(组分(b))加入相应基础配制剂中。表1中所提供的蛋白酶量涉及活性蛋白。

加入水以实现到100的平衡。

表1：液体配制剂

(Comp.1)：n-C₁₈烷基-(OCH₂CH₂)₂₅-OH

(Comp.2)：C₁₀-C₁₈烷基聚糖苷共混物

(Comp.3)：C₁₀-C₁₂烷基苯磺酸钠

(Comp.4)：枯烯磺酸钠

(Comp.5)：月桂醇聚醚硫酸钠—n-C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₃-SO₃Na

(Comp.6)：n-C₁₂H₂₅(CH₃)₂N→O

**对于没有本发明化合物的对比试验，用相同量的水代替它们。

表2所示在某些时间点的Savinase活性通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，简写为AAPF)作为底物测定。pNA通过蛋白水解裂解与该底物分子分离，导致释放出黄色的游离pNA，后者可以通过测量OD₄₀₅而测定。测量在20℃下进行。

表2显示了在37℃下储存1-30天之后在液体配制剂中测量的蛋白酶活性。表3所提供的蛋白水解活性值参考在参照配制剂中在时间0时测定的100％值而计算。

配制剂的命名如下：在句点之前的罗马数字表征基础配制剂，***数字表征化合物类型(A.#本发明化合物(组分(a))；(B.#)对比化合物)。

表2：在37℃下储存的时间过程中的蛋白酶活性

III.纺织品清洁试验

进行配制剂在清洁两种类型测试织物中的洗涤剂性能试验。测试布样含有由于CFT方法而包含蛋白组分和脂肪组分的复合脏污，并且测试布样含有脂肪/颗粒类型的脏污。

测试按如下进行：将包含8片标准化染污织物块—各自尺寸为2.5×2.5cm并且在两侧缝于聚酯载体的多重脏污监测器与2.5g棉织物和5g/L液体试验洗衣用洗涤剂，表3一起在瓶式去污力测试仪中洗涤。

条件如下：装置：来自SDL Atlas，Rock Hill，USA的瓶式去污力测试仪；洗液：250ml，洗涤时间：60分钟，洗涤温度：30℃。水硬度：2.5mmol/L；Ca:Mg:HCO₃ 4:1:8；织物/洗液比1:12。

在洗涤循环之后将多重脏污监测器在水中漂洗，随后在环境温度下干燥14小时的时间。

使用下列预染污测试织物：

CFT C-S-10：棉上的黄油

CFT C-S-62：棉上猪油着色

CFT C-S-68：棉上的巧克力冰淇淋

EMPA 112：棉上的热可可

EMPA 141/1：棉上的口红

EMPA 125：表面活性剂用监测器

wfk20D：在聚酯/棉混纺织物上的颜料和皮脂类脂肪

CFT C-S-70：巧克力慕斯

wfk＝wfk test fabrics GmbH，Krefeld

EMPA＝Swiss Federal Institute of Materials Testing

CFT＝Center for Test Material B.V.

总的清洁水平使用颜色测量评价。脏污在监测器上的反射度值使用具有UV截止滤光器的球面反射光谱仪(来自Datacolor，USA的SF 500型，波长范围360-700nm，光学几何d/8°)在460nm下测量。在这种情况下，借助CIE-Lab颜色空间分类在洗涤之前和之后测量亮度L*，在红-绿颜色轴上的a*值和在黄-蓝颜色轴上的b*值并对该监测器的8个脏污平均。色值变化(ΔE)值基于下列等式由评价颜色工具自动定义和计算：

[L*亮度，在红-绿轴上的a*色值，在蓝-黄轴上的b*色值]

ΔE是所实现的清洁效果的度量。所有测量重复6次以得到平均数。注意到更高的ΔE值显示更好的清洁。1个单位的不同可以由熟练技术人员检测到。非专家可以容易地检测到2个单位。结果示于表4中。

R_w＝洗涤过的脏污反射度

R_o＝未脏污反射度

去污力按如下计算：在该研究过程中每块布总共重复6次操作；计算的统计置信水平为90-95％。

测试配制剂通过混合根据表3的组分制备配制剂VI-X而制备。

若适用，以表3中提供的量将相应组分(a)或对比化合物加入相应基础配制剂中。

若适用，以表3中提供的量将

100L加入相应基础配制剂中。

若适用，以表3中提供的量将

16.0L加入相应基础配制剂中。

加入水以实现到100的平衡。

表3：液体洗衣用配制剂

(Comp.1)：n-C₁₈烷基-(OCH₂CH₂)₂₅-OH

(Comp.2)：C₁₀-C₁₈烷基聚糖苷共混物(Comp.3)：C₁₀-C₁₂烷基苯磺酸钠

(Comp.4)：月桂醇聚醚硫酸钠—n-C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₃-SO₃Na

(Comp.5)：n-C₁₂H₂₅(CH₃)₂N→O

瓶式去污力测试仪测试用新制备的配制剂和在37℃下在2个月储存过程中储存(1周[7天]，2周[14天]，4周[28天]，6周[42天]，8周[56天])的配制剂进行。作为近似，在37℃下1周等于在20℃下31/2周。

表4：瓶式去污力测试仪测试结果：上述多重脏污监测器的ΔE之和