CN111465680A - 组合物、其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含如下组分的组合物：(A)胆碱或胆碱衍生物的有机酯的至少一种盐，和(B)至少一种选自两性和阴离子和非离子表面活性剂的表面活性剂。

Description

组合物、其制备和用途
本发明涉及包含如下组分的组合物：
(A)至少一种根据通式(I)的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化的C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可带有一个
或多个羟基或C＝O或COOH基团，如果适用的话，是部分或完全中
和的，
R2相同或不同，选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同，选自氢和C1-C4烷基，
X是C2-C4亚烷基，和
A-是无机或有机抗衡阴离子，
和(B)至少一种选自两性和阴离子和非离子表面活性剂的表面活性剂。
制备组合物，尤其是洗涤剂组合物，用于各种清洁应用，例如洗衣或自动洗碟。它们都必须满足许多不同的要求。虽然固体组合物起传统作用，同时液体组合物也具有它们的优点。它们可以完全转移到洗衣机内，而不会在剂量单元中留下未使用的洗涤剂的残留物。尤其是对于所谓的彩色衣物洗涤剂，液体衣物洗涤剂是非常重要的。
洗涤剂制造商要求他们使用的成分(包括助洗剂)具有很大的灵活性。随着液体重垢洗涤剂的日益普及，众所周知的助洗剂是柠檬酸钠，柠檬酸的三钠盐。柠檬酸钠适合用作重垢型洗衣洗涤剂中的助洗剂，因为它具有螯合自来水中的钙和镁离子的能力，并且与磷酸盐助洗剂不同，它是环境安全的。它特别适用于液体洗涤剂配制剂，因为不像其他环境安全的洗涤剂助洗剂，柠檬酸三钠是良好可溶的。然而，通常要求30重量％的最小水含量。这种要求限制了洗衣洗涤剂制造商的灵活性。鉴于该工业中的现代趋势，即缩小剂量单元(小袋)的尺寸并因此降低含水量，这种要求甚至更有害。
洗衣洗涤剂面临的另一个问题是储存期。尤其是液体组合物通常在一段时间后丧失其活性。已经确定了各种原因。在一段时间后可能失活的一种成分是酶。尽管酶是例如用于去除食物污渍如蛋、水果等的有用组分，但它们的活性在货架上或最终用户处一段时间后劣化。已知作为酶稳定剂的硼化合物，参见例如US4,465,619，现在正在详细研究。
在WO97/03156中，公开了某些胆碱衍生物及其作为表面活性剂的用途。
因此，本发明的目的是提供一种组合物，其允许灵活配制，甚至具有高或低的水含量。本发明的另一个目的是提供一种组合物，其具有优异的储存期，特别是对于其中所含的酶。本发明的另一个目的是提供制备这种组合物的方法，并且本发明的另一个目的是提供这种组合物的用途。
因此，已经发现了开头所定义的组合物，下文也定义为本发明组合物或根据本发明的组合物。本发明组合物包含(A)至少一种通式(I)的盐，以下也统称为酯(A)或盐(A)或组分(a)，和(B)至少一种选自两性和阴离子和非离子表面活性剂的表面活性剂，下文中也称为表面活性剂(B)或组分(B)。
盐(A)是胆碱或胆碱衍生物的有机酯的盐。盐(A)的阴离子-抗衡离子-可以是无机或有机的，优选有机的。盐(A)的无机抗衡离子的实例是硝酸根、氢氧根、硫酸根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、碳酸根、碳酸氢根和卤离子，例如溴离子或氯离子。优选的是卤离子，尤其是氯离子，以及硫酸根、碳酸根和碳酸氢根。有机抗衡离子的实例是乳酸根、乙酸根、酒石酸根、柠檬酸根和CH3SO3 -(甲磺酸根)。在具有二价或三价抗衡离子的实施方案中，存在相应摩尔量的阳离子。
盐(A)中的氮原子带有三个甲基和一个羟乙基。在本发明的上下文中使用的术语胆碱衍生物是指带有至少一个除甲基之外的烷基或除2-羟乙基之外的羟烷基或另外的烷氧基的化合物。
更具体地说，盐(A)是通式(I)的化合物
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A-(I)其中
n选自1-12，例如1-9，优选1、2、3或4，甚至更优选n为1，m选自0-50，例如2-50，优选为10-25，然而，最优选m为0。
R1选自线性或支化的C1-C10烷基，和C6-C10芳基，其中R1可带有一个或多个羟基或C＝O或COOH基团，如果适用的话，是部分或完全中和的。R1的优选实例为未取代的C1-C6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正己基，优选的未取代的C1-C10烷基为甲基和乙基，进一步取代的C1-C10烷基为-CH(OH)-CH(OH)-COOH、CH(OH)-CH3、(E)-CH＝CHCOOH、(Z)-CH＝CHCOOH、-C6H5、对-HO-C6H4-、邻,对-二羟基苯基和3,4,5-三羟基苯基。在优选实施方案中，O-C(O)-R1一起构成柠檬酸盐。甚至更优选R1为甲基。
R2相同或不同，选自苯基和C1-C10烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、2-正丙基庚基或异癸基，优选线性C1-C10烷基，更优选线性C1-C4烷基，
甚至更优选至少两个R2基团为CH3，第三个R2选自线性C1-C10烷基，最优选所有R2相同且为甲基。
R3和R4相同或不同，选自氢和C1-C4烷基，优选是正-例如甲基、乙基、正丙基和正丁基，甚至更优选R3和R4都是氢。在另一个实施方案中，R3为C1-C4烷基，R4为氢，优选R3为甲基，R4为氢。
X是C2-C4亚烷基，例如-CH2-CH2-、-CH(CH3)-CH2-、-(CH2)3-、CH2-CH(CH3)-或-(CH2)4-，和
A-是无机或有机抗衡阴离子。盐(A)的无机抗衡离子的实例是硫酸根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、碳酸根、碳酸氢根和卤离子，例如溴离子或氯离子。优选的是卤离子，尤其是氯离子，以及硫酸根、碳酸根和碳酸氢根。有机抗衡离子的实例是乳酸根、乙酸根、酒石酸根、柠檬酸根和CH3SO3 -(甲磺酸根)。
盐(A)的最优选实例是胆碱酯与酒石酸根或柠檬酸根作为抗衡离子的盐，以及乙酰胆碱、柠檬酸胆碱和酒石酸胆碱的盐，例如乳酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐。
组分(a)不是表面活性剂。在一个实施方案中，5g组分(a)在1000g水中的溶液在20℃和101.3kPa下具有＞45mN/m的动态表面张力。在1000g水中的5g组分(a)的溶液在20℃和101.3kPa下可具有≥50mN/m的动态表面张力。动态表面张力可以用气泡压力张力计测量，其中测量通过毛细管在液体中形成的气泡的最大内部压力；测量值通常对应于在某一表面老化时的表面张力，即从气泡形成开始到出现压力最大值的时间。在一个实施方案中，在用气泡压力张力计在20℃和101.3kPa下测量动态表面张力期间的表面老化为50ms。
在如下实施方案中，其中抗衡阴离子A-是-或可以是-二价的，例如硫酸根、酒石酸根、碳酸根，或多价的，例如磷酸根或柠檬酸根，必要的正电荷可以由另一盐(A)衍生的阳离子，或由碱金属阳离子，例如钾或优选钠，或由未取代的或被C1-C4烷基和/或2-羟乙基取代的铵提供。
在R1带有一个或多个羧基的实施方案中，它们可以是游离COOH基团或用碱如钾或尤其是钠部分或完全中和的，或者它们可以例如用(R2)3N+-(CH2)n-(O-X)m-OH酯化。如果适用的话，这些实施方案产生相应的二羧酸或三羧酸的二酯或三酯。例如酒石酸或柠檬酸的单酯和二酯的混合物，以及柠檬酸的二酯和三酯的混合物也是可行的。
在本发明的优选实施方案中，盐(A)选自
(CH3)3N+-(CH2)2-O-C(O)-R5 (A1)- (II)
其中(A1)-选自甲磺酸根、酒石酸根和柠檬酸根
并且其中R5选自-CH2-C(OH)(COOX2)-CH2-COOX2和–CH(OH)-CH(OH)-COOX1
其中X1选自氢、碱金属，尤其是钠，和(CH3)3N+-(CH2)2-
并且其中X2相同或不同，选自氢、碱金属，尤其是钠，和(CH3)3N+-(CH2)2-。优选实施方案中，O-C(O)-R5和(A1)-的酯基彼此对应。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物含有占整个组合物的0.5-30重量％，优选0.5-6重量％，更优选1-3重量％的盐(A)。
在本发明的一个实施方案中，盐(A)含有作为杂质的化合物(A’)
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO-
其中变量R1、R2、X、n和m与相应盐(A)中的相同。所述杂质可以为至多50摩尔％，优选0.1-20摩尔％，甚至更优选1-10摩尔％的盐(A)。尽管杂质(A’)可能源于盐(A)的合成，并且可以通过纯化方法除去，但不优选除去它。
本发明组合物进一步含有至少一种表面活性剂(B)，选自两性表面活性剂，尤其是选自阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，下文中也分别称为两性表面活性剂(B)、阴离子表面活性剂(B)和非离子表面活性剂(B)。
合适的阴离子表面活性剂(B)的实例是C8-C18烷基硫酸酯、C8-C18脂肪醇聚醚硫酸酯、乙氧基化C4-C12烷基酚(乙氧基化：1-50mol氧化乙烯/mol)的硫酸半酯、C12-C18磺基脂肪酸烷基酯如C12-C18磺基脂肪酸甲酯，此外C12-C18烷基磺酸和C10-C18烷基芳基磺酸的碱金属盐和铵盐。优选上述化合物的碱金属盐，特别优选钠盐。
阴离子表面活性剂(B)的具体实例是通式(III)的化合物
CsH2s+1-O(CH2CH2O)t-SO3M (III)
其中
s是10-18，优选12-14，甚至更优选s＝12的数，
t是1-5，优选2-4，甚至更优选3的数。
M选自碱金属，优选钾，甚至更优选钠。
在表面活性剂(B)中，变量s和t可以是平均数，因此它们不必是整数，而在根据式(III)的单个分子中，s和t都表示整数。
合适的阴离子表面活性剂(B)的其他实例是皂，例如硬脂酸、油酸、棕榈酸、醚羧酸酯和烷基醚磷酸酯的钠盐或钾盐。
优选的非离子表面活性剂(B)为烷氧基化醇、氧化乙烯和氧化丙烯的二嵌段和多嵌段共聚物以及脱水山梨糖醇与氧化乙烯或氧化丙烯的反应产物、烷基多苷(APG)、羟烷基混合醚和胺氧化物。
烷氧基化醇和烷氧基化脂肪醇的优选实例为例如通式(IV)化合物：
Figure BDA0002512543760000061
其中
R6相同或不同且选自氢和线性C1-C10烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，且特别优选氢或甲基，
R7选自支化或线性的C8-C22烷基，例如n-C8H17、n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33或n-C18H37，
R8选自C1-C10烷基甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基或异癸基。
变量m和x为0-300，其中n和m的总和至少为1，优选3-50。优选m为1-100且x为0-30。
在一个实施方案中，通式(III)化合物可为嵌段共聚物或无规共聚物，其中优选嵌段共聚物。
烷氧基化醇的其他优选实例为例如通式(V)化合物：
Figure BDA0002512543760000062
其中
R6相同或不同且选自氢和线性C1-C10烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，且特别优选氢或甲基，
R9选自支化或线性的C6-C20烷基，特别是n-C8H17、n-C10H21、n-C12H25、n-C13H27、n-C15H31、n-C14H29、n-C16H33或n-C18H37，
a为0-10，优选1-6的数，
b为1-80，优选4-20的数，
d为0-50，优选4-25的数。
a+b+d的总和优选为5-100，甚至更优选9-50。
羟烷基混合醚的优选实例为通式(VI)化合物：
Figure BDA0002512543760000071
其中各变量定义如下：
R6相同或不同且选自氢和线性C1-C10烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，且特别优选氢或甲基，
R7选自支化或线性的C8-C22烷基，例如iso-C11H23、iso-C13H27、n-C8H17、n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33或n-C18H37，
R8选自C1-C18烷基，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基和正十八烷基。
变量m和x为0-300，其中n和m的总和至少为1，优选5-50。优选m为1-100且n为0-30。
通式(V)和(VI)的化合物可为嵌段共聚物或无规共聚物，其中优选嵌段共聚物。
其他合适的非离子表面活性剂选自包含氧化乙烯和氧化丙烯的二嵌段和多嵌段共聚物。其他合适的非离子表面活性剂选自乙氧基化或丙氧基化的脱水山梨糖醇酯。胺氧化物或烷基多苷，尤其是线性C4-C18烷基多苷和支化C8-C18烷基多苷如通用平均式(VII)的化合物同样合适：
Figure BDA0002512543760000072
其中：
R10为C1-C4烷基，特别是乙基、正丙基或异丙基，
R11为-(CH2)2-R10，
G1选自具有4-6个碳原子的单糖，尤其是选自葡萄糖和木糖，y为1.1-4，其中y为平均数。
非离子表面活性剂的其他实例为通式(VIII)和(IX)的化合物：
Figure BDA0002512543760000081
AO选自氧化乙烯、氧化丙烯和氧化丁烯，
EO为氧化乙烯，CH2-CH2-O，
R10为C1-C4烷基，特别是乙基、正丙基或异丙基，
R12选自支化或线性的C8-C18烷基
A3O选自氧化丙烯和氧化丁烯，
w为15-70，优选30-50的数，
w1和w3为1-5的数，且
w2为13-35的数。
在EP-A 0 851 023和DE-A 198 19 187中可见合适的其他非离子表面活性剂的综述。
也可存在两种或更多种不同非离子表面活性剂(B)的混合物。
可存在的其他表面活性剂选自两性(两性离子)表面活性剂和阴离子表面活性剂及其混合物。
两性表面活性剂(B)的实例为在使用条件下在相同分子中具有正电荷和负电荷的那些。两性表面活性剂的优选实例为所谓的甜菜碱表面活性剂。甜菜碱表面活性剂的很多实例每分子具有一个季化氮原子和一个羧酸基团。两性表面活性剂的特别优选实例为椰油酰胺基丙基甜菜碱(月桂酰胺基丙基甜菜碱)。
胺氧化物表面活性剂的实例为通式(X)化合物
R13R14R15N→O (X)
其中R13、R14和R15彼此独立地选自脂族、环脂族或C2-C4亚烷基C10-C20烷基酰氨基结构部分。优选R12选自C8-C20烷基或C2-C4亚烷基C10-C20烷基酰氨基且R13和R14均为甲基。
特别优选的实例为月桂基二甲基氧化胺，有时也称为月桂胺氧化物。其他特别优选的实例为椰油酰胺基丙基二甲基氧化胺，有时也称为椰油酰胺基丙基胺氧化物。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物含有0.1-60重量％的表面活性剂(B)，优选选自阴离子表面活性剂(B)、非离子表面活性剂(B)、两性表面活性剂(B)和胺氧化物表面活性剂以及至少两种上述表面活性剂的组合。在优选的实施方案中，本发明组合物含有5-30重量％的阴离子表面活性剂和至少一种非离子表面活性剂，例如3-20重量％。
本发明组合物在环境温度(20℃)下可以是液体。优选地，它们在环境温度下是稳定的液体。在此上下文中，术语“稳定的”是指这样的本发明组合物是液体并且甚至在储存20天后也不显示痕量的沉淀物形成或混浊。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物是水性的，通常含有5-95重量％的水，例如5-30重量％和更优选5-25重量％，或20-70重量％的水和0-20重量％的有机溶剂。优选5-15重量％的水，并且没有显著量的有机溶剂，例如1重量％或更少。
本发明组合物可以是碱性的或显示中性或微酸性pH值，例如6-14，优选6.5-13，更优选8-10.5，最优选8.5-9.0。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物另外包含(C)至少一种酶，在下文中也称为酶(C)，例如水解酶(C)。优选的酶(C)选自蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，在下文中也分别称为蛋白酶(C)、淀粉酶(C)或脂肪酶(C)。
已经发现，本发明组合物中的酶(C)具有特别高的寿命。在本发明组合物中特别有益的酶(C)选自水解酶(EC 3)。优选的酶(C)选自作用于酯键的酶(E.C.3.1)、糖基化酶(E.C.3.2)和肽酶(E.C.3.4)。作用于酯键的酶(E.C.3.1)，在下文中也相应地称为脂肪酶(组分(b))。糖基化酶(E.C.3.2)在下文中也称为淀粉酶(C)和纤维素酶(C)。肽酶在下文中也称为蛋白酶(C)。
本发明上下文中的水解酶(C)通过多肽序列(本文也称为氨基酸序列)来确定。多肽序列规定了三维结构，包括酶的“活性位点”，其又决定了酶的催化活性。多肽序列可根据世界知识产权局(WIPO)标准ST.25(1998)通过SEQ ID编号来确定，本文的氨基酸使用三字母代码表示，其中第一个字母为大写字母或对应的一个字母。
本发明上下文中的酶(C)可涉及亲本酶和/或变体酶，两者均具有酶活性。具有酶活性的酶是酶活性的或发挥酶转化作用，这意味着酶作用于底物并将其转化为产物。术语“酶”在本文中排除酶的无活性变体。
亲本蛋白质或酶(也称为“亲本酶”)的“亲本”序列是用于向序列中引入改变(例如通过引入一个或多个氨基酸取代、***、缺失或其组合)而得到亲本序列的“变体”的起始序列。术语亲本酶(或亲本序列)包括野生型酶(序列)和合成产生的序列(酶)，其用作引入(进一步)改变的起始序列。
术语“酶变体”或“序列变体”或“变体酶”是指与其亲本酶在其氨基酸序列上一定程度上不同的酶。如果没有另外说明，变体酶“具有酶活性”是指该变体酶具有与各自亲本酶相同类型的酶活性。
在描述本发明的变体时，使用了以下命名法：
如下方式描述氨基酸取代：提供亲本酶的原始氨基酸，之后是氨基酸序列内的位置编号，之后是取代的氨基酸。
如下方式描述氨基酸删除：提供亲本酶的原始氨基酸，之后是氨基酸序列内的位置编号，之后为＊。
如下方式描述氨基酸***：提供亲本酶的原始氨基酸，之后是氨基酸序列内的位置编号，之后是原始氨基酸和加入的氨基酸。例如，在180位***紧挨甘氨酸的赖氨酸，被命名位“Gly180GlyLys”或“G180GK”。
在取代和***发生在同样位置的情况下，可表示为S99SD+S99A或简短表示为S99AD。
当氨基酸残基与被***的现有氨基酸残基相同的情况下，显然术语中的简并性出现了。例如如果在上述实例中甘氨酸之后***了甘氨酸，将表示为G180GG。
一个位置可引入不同改变，不同的改变用逗号隔开，例如“Arg170Tyr，Glu”表示在170位的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。或者不同改变或任选的取代可在括号中表示，例如Arg170[Tyr,Gly]或Arg170{Tyr,Gly}；或简短表示为R170[Y,G]或R170{Y,G}；或长久(inlong)表示为R170Y、R170G。
酶变体可以通过与亲本酶比较时它们的序列同一性来定义。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了计算序列同一性，在第一步中，必须产生序列比对。根据本发明，必须产生成对全局比对，这意味着必须在两个序列的全长上对其进行比对，这通常通过使用称为比对算法的数学方法来产生。
在本发明上下文中，使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)生成比对。优选地，程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))被用于本发明的目的，使用程序默认参数(空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5和矩阵＝EBLOSUM62)。根据本发明，应用以下％同一性的计算：％同一性＝(相同残基/比对区的长度，其在全长上显示本发明的相应序列)·100。
在本发明上下文中，酶变体可描述为如下氨基酸序列，其与相应亲体酶的氨基酸序列相比至少n％相同，“n”为10-100的整数。在一个实施方案中，变体酶当与亲体酶的全长氨基酸序列比较时，至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，其中酶变体具有酶活性。
酶变体可以通过与亲本酶比较时它们的序列相似性来定义。序列相似性通常以“％序列相似性”或“％相似性”提供。％序列相似性考虑到限定的氨基酸组共有相似的性质，例如通过它们的大小、通过它们的疏水性、通过它们的电荷或通过其他特征。在本文中，一个氨基酸与相似氨基酸的交换可称为“保守突变”。
为了确定根据本发明的％相似性，应用以下方法：氨基酸A与氨基酸S相似；氨基酸D与氨基酸E和N相似；氨基酸E与氨基酸D和K和Q相似；氨基酸F与氨基酸W和Y相似；氨基酸H与氨基酸N和Y相似；氨基酸I与氨基酸L和M和V相似；氨基酸K与氨基酸E和Q和R相似；氨基酸L与氨基酸I和M和V相似；氨基酸M与氨基酸I和L和V相似；氨基酸N与氨基酸D和H和S相似；氨基酸Q与氨基酸E和K和R相似；氨基酸R与氨基酸K和Q相似；氨基酸S与氨基酸A和N和T相似；氨基酸T与氨基酸S相似；氨基酸V与氨基酸I和L和M相似；氨基酸W与氨基酸F和Y相似；氨基酸Y与氨基酸F和H和W相似。
保守性氨基酸取代可能发生在功能蛋白(如酶)的多肽序列的全长上。在一个实施方案中，这种突变不涉及酶的功能域。在一个实施方案中，保守突变不涉及酶的催化中心。
为了考虑保守突变，可以从相同的比对计算两个氨基酸序列的序列相似性的值，其用于计算％同一性。
根据本发明，应用以下％相似性的计算：％相似性＝[(相同残基+相似残基)/比对区的长度，其在全长上显示本发明的相应序列]·100。
在本发明上下文中，酶变体可描述为如下氨基酸序列，其与相应亲体序列相比至少m％相似，“m”为10-100的整数。在一个实施方案中，当与亲体酶的全长多肽序列相比时，变体酶至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相似，其中变体酶具有酶活性。
“酶活性”意指通过酶发挥的催化作用，通常以每毫克酶的单位数(比活性)表示，其涉及每分钟每个酶分子转化的底物分子(分子活性)。
当所述酶变体表现出相应亲本酶的酶活性的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少10％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％时，变体酶可具有根据本发明的酶活性。
在一个实施方案中，本发明组合物包含至少一种蛋白酶(C)。在本发明上下文中，具有蛋白水解活性的酶(C)被称为“蛋白酶”或肽酶。这些酶是EC 3.4类的成员。
蛋白酶(C)进一步分类为氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基肽酶和三肽基肽酶(EC 3.4.14)、肽基二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸-型羧肽酶(EC 3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)、金属内肽酶(EC3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC3.4.25)或未知催化机制的内肽酶(EC 3.4.99)。
蛋白酶(C)可以是任何种类的内肽酶或任何种类的内肽酶的混合物。在一个实施方案中，根据本发明的蛋白酶选自丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。
丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶的特征在于在催化活性位点含有丝氨酸，其在催化反应期间与底物形成共价加合物。
在本发明上下文中，丝氨酸蛋白酶选自糜蛋白酶(例如EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.37或EC3.4.21.71)、颗粒酶(例如、EC3.4.21.78或EC 3.4.21.79)、激肽释放酶(例如EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC3.4.21.118、或EC 3.4.21.119、)纤溶酶(例如EC 3.4。21.7)、胰蛋白酶(例如EC3.4.21.4)、凝血酶(例如EC 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶也称为亚肽酶，例如EC 3.4.21.62，后者在下文也称为“枯草杆菌蛋白酶”。
蛋白酶(C)的晶体结构显示活性位点通常位于相邻结构域之间的分子表面上的凹槽中，并且底物特异性由沿着负责断裂水解的催化位点的一侧或两侧上的凹槽分布的结合位点的性质决定。因此，蛋白酶(C)的特异性可以通过使用概念模型来描述，在模型中每个特异性亚位点能够容纳单个氨基酸残基的侧链。这些位点从催化位点S1、S2...Sn朝向底物的N末端编号，S1′、S2′...Sn′朝向C末端编号。它们容纳的这些残基分别编号为P1、P2...Pn和P1′、P2′...Pn′：
底物 P3 P2 P1 + P1’ P2’ P3’
酶 S3 S2 S1 ＊ S1’ S2’ S3’
在该表示中，酶的催化位点标记为“＊”，并且肽键切割(易断裂键)用符号“+”表示。
一般说来，三种主要类型的蛋白酶活性(蛋白水解活性)是：胰蛋白酶样，其中在P1处的Arg(N)或Lys(K)之后存在酰胺底物的裂解，胰凝乳蛋白酶样，其中裂解发生在P1处的一个疏水氨基酸之后，弹性蛋白酶样为P1处Ala(A)之后的裂解。
Siezen等人(1991)，Protein Eng，4：719-737和Siezen等人(1997)，ProteinScience 6：501-523提出了一种暂命名为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶亚组。它们以超过170个氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶的同源性分析来定义，所述丝氨酸蛋白酶之前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由***或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，并且根据Siezen等人现在是枯草杆菌酶的一个亚组。已经鉴定了多种枯草杆菌酶，并且已经确定了许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于这些枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述，可参考Siezen等人(1997)，Protein Science6：501-523。
枯草杆菌酶可分为6个亚组，即枯草杆菌蛋白酶家族、热酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、kexin家族和热解蛋白家族。
枯草杆菌酶的亚组是枯草杆菌蛋白酶，其是来自S8家族的丝氨酸蛋白酶，如MEROPS数据库(http://merops.sanger.ac.uk)所定义。肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物。在亚家族S8A中，活性位点残基经常出现在基序Asp-Thr/Ser-Gly，其类似于AA中天冬氨酸内肽酶家族中的序列基序，His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。
家族S8、亚家族A的著名成员是：
Figure BDA0002512543760000141
Figure BDA0002512543760000151
枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶类共有限定催化三联体的共同氨基酸序列，其将它们与胰凝乳蛋白酶相关类的丝氨酸蛋白酶区分开。枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶都具有包含天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。
在枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶(C)中，从氨基到羧基末端读取的这些氨基酸的相对顺序是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。在胰凝乳蛋白酶相关蛋白酶中，相对顺序是组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。因此，本文的枯草杆菌蛋白酶是指具有枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。实例包括如WO 89/06276和EP 0283075、WO 89/06279、WO 89/09830、WO89/09819、WO 91/06637和WO 91/02792中所述的枯草杆菌蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶类型的亲体蛋白酶(EC 3.4.21.62)和变体可以是细菌蛋白酶。所述细菌蛋白酶可以是***多肽，例如芽孢杆菌、梭状杆菌、肠球菌、地芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、海洋杆菌、葡萄球菌、链球菌或链霉菌蛋白酶、或革兰氏阴性细菌多肽、例如弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、llyobacter、奈瑟菌、假单胞菌、沙门氏菌或解脲支原体蛋白酶。它们充当非特异性内肽酶，即它们水解任何肽键。
可商购的蛋白酶包括以如下商品名销售的那些：
Figure BDA0002512543760000152
Figure BDA0002512543760000153
Figure BDA0002512543760000154
Figure BDA0002512543760000155
和
Figure BDA0002512543760000156
(Novozymes A/S)，以如下商品名销售的那些：
Figure BDA0002512543760000157
Figure BDA0002512543760000158
Figure BDA0002512543760000159
Figure BDA00025125437600001510
Figure BDA00025125437600001511
和
Figure BDA00025125437600001512
(Dan-isco/DuPont)、AxapemTM(Gist-Brocases N.V.)，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP；US 5,352,604的图29中显示的序列)及其变体和来自Kao的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
在本发明的一个方面，亲本酶和变体可以是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、芽孢杆菌、芽孢杆菌、芽孢杆菌。扁豆、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，枯草杆菌酶选自以下：
·来自解淀粉芽孢杆菌BPN′的枯草杆菌蛋白酶(由Vasantha等人(1984)J.Bacteriol，第159卷，第811-819页和JA Wells等人(1983)在Nucleic Acids Research，第11卷，第7911–7925页中描述)，
·来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg；在EL Smith等人(1968)，J.Biol Chem，第24卷，第2184-2191页和Jacobs等人(1985)在Nucl.AcidsRes，第13卷中公开，p.8913-8926)中公开，
·枯草杆菌蛋白酶PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列描述于EP 283075A2)，
·GB 1243784 中公开的枯草杆菌蛋白酶147和/或
Figure BDA0002512543760000161
Figure BDA0002512543760000162
·如WO 91/02792中公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483或如WO 95/23221中所述的迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体，
·DE 10064983中公开的来自嗜碱芽孢杆菌(DSM 11233)的枯草杆菌蛋白酶，
·如WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14391)的枯草杆菌蛋白酶，
·在WO 2003/056017中公开的芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(DSM14390)，
·在WO 2003/055974中公开的芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(DSM14392)，
·在WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14393)的枯草杆菌蛋白酶，
·具有如WO 2005/063974中所述的SEQ ID NO：4的枯草杆菌蛋白酶或与其至少40％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶，
·具有如WO 2005/103244中所述的SEQ ID NO：4的枯草杆菌蛋白酶或与其至少80％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶，
·具有如WO 2005/103244中所述的SEQ ID NO：7的枯草杆菌蛋白酶或与其至少80％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶，和
·如DE 102005028295.4申请中所述的具有SEQ ID NO：2的枯草杆菌蛋白酶或与其至少66％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶。
根据本发明的有用蛋白酶(C)的实例包括描述于以下的变体：WO92/19729、WO 95/23221、WO 96/34946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/11768、WO 01/44452、WO 02/088340、WO 03/006602、WO2004/03186、WO 2004/041979、WO 2007/006305、WO 2011/036263、WO2011/036264和WO 2011/072099。适宜的实例尤其包括源自SEQ ID NO:22的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶变体，如EP 1921147中所述(其是来自芽孢杆菌DSM 5483的成熟碱性蛋白酶的序列)，其在以下一个或多个位置具有氨基酸取代：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(根据BPN的编号)，它具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，这种枯草杆菌蛋白酶在Asp32、His64和Ser221位置未发生突变(根据BPN′编号)。
在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶具有如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22，或与其至少80％相同并具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，并且通过在101位具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)、或天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)、或丙氨酸(a)、或甘氨酸(G)、或丝氨酸(S)(根据BPN′编号)表征，并具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，其特征在于在101位具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)(根据BPN’编号)并具有蛋白水解活性。这样的枯草杆菌蛋白酶变体可以包含101位的氨基酸取代，例如R101E或R101D，单独或与位置3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274(根据BPN′编号)处的一处或多处取代，并具有蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，并且其特征在于包含至少以下氨基酸(根据BPN′编号)并具有蛋白水解活性：
(a)位置3的苏氨酸(3T)
(b)位置4的异亮氨酸(4I)
(c)63位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A，63T或63R)
(d)第156位的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)
(e)第194位脯氨酸(194P)
(f)位置199的蛋氨酸(199M)
(g)位置205的异亮氨酸(205I)
(h)位置217的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D，217E或217G)，
(i)根据(a)至(h)的两种或更多种氨基酸的组合。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，并且其特征在于包含一个氨基酸(根据(a)-(h))或根据(i)的组合和氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN′编号)，并具有蛋白水解活性。
在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且其特征在于包含突变(根据BPN′编号)R101E，或S3T+V4I+V205I，或S3T+V4I+V199M+V205I+L217D，且具有蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶包含与EP 1921147中描述的SEQ ID NO：22具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且进一步的特征在于包含R101E和S3T、V4I和V205I(根据BPN′编号)并具有蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶包含与EP 1921147中描述的SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的氨基酸序列，进一步的特征在于包含R101E，和选自S156D、L262E、Q137H、S3T、R45E、D、Q、P55N、T58W、Y、L、Q59D、M、N、T、G61D、R、S87E、G97S、A98D、E、R、S106A、W、N117E、H120V、D、K、N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A、G、Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T、D和L262N、Q、D(如WO 2016/096711并且根据BPN′编号)的一个或多个取代，并且具有蛋白水解活性。
如上所述计算枯草杆菌蛋白酶变体的％同一性。如上公开的与各亲本序列至少n％相同的枯草杆菌蛋白酶变体酶包括n为至少40至100的变体。取决于如上提供的适用的％-同一性值，在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体具有蛋白水解作用，当与亲本酶的全长多肽序列相比时，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在另一个实施方案中，本发明涉及枯草杆菌蛋白酶变体，其包含不属于相应枯草杆菌蛋白酶的功能结构域的保守性突变。取决于如上所述适用的％-同一性值，该实施方案的枯草杆菌蛋白酶变体具有蛋白水解活性，与亲本酶的全长多肽序列相比时，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似。
根据本发明的蛋白酶(C)，包括丝氨酸蛋白酶，具有“蛋白水解活性”或“蛋白酶活性”。该性质与蛋白酶的水解活性有关(蛋白质水解，意指在多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键水解)，蛋白酶在含有蛋白质，例如酪蛋白、血红蛋白和BSA的底物上。定量地，蛋白水解活性与蛋白酶或蛋白水解酶在限定的时间内降解蛋白质的速率有关。分析蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的(参见例如Gupta等(2002)，Appl.Microbiol.Biotechnol.60：381-395)。
蛋白水解活性本身可以通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，短AAPF；参见例如DelMar等人(1979)，Analytical Biochem 99,316-320)来确定，作为底物pNA通过蛋白水解切割从底物分子上切下，使游离pNA的黄色释放，其可通过测量OD405来定量。
当所述蛋白酶变体表现出相应亲本蛋白酶的蛋白水解活性的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少10％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％时，所述蛋白酶变体可以具有蛋白水解活性。
优选地，本发明中使用的枯草杆菌蛋白酶的pI值(等电点)为pH 7.0至pH 10.0，优选pH 8.0至pH 9.5。
脂肪酶和角质酶
在一个实施方案中，本发明组合物(C)包含至少一种脂肪酶。“脂肪酶”、“脂解酶”、“脂质酯酶”均指EC 3.1.1类的酶(“羧酸酯水解酶”)。这种酶(C)可具有脂肪酶活性(或脂解活性；三酰基甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)，角质酶活性(EC 3.1.1.74；具有角质酶活性的酶在本文中可称为角质酶)，甾醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。
可商购的脂肪酶(C)包括但不限于以商品名Lipolase TM、Lipex TM、Lipolex TM和Lipoclean TM(Novozymes A/S)、Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(Gist-Brocades/现在DSM)销售的那些。
在本发明的一个方面，合适的脂肪酶选自以下：
·来自Humicola(同义词嗜热真菌属)的脂肪酶，例如来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)，如EP258068、EP305216、WO92/05249和WO2009/109500中所述，或来自H.insolens，如WO 96/13580中所述，
·如WO 92/05249中所述的源自米黑根毛霉的脂肪酶。
·来自假单胞菌菌株的脂肪酶(其中一些现已更名为伯克霍尔德氏菌)，例如来自P.alcaligenes或类产碱假单孢菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272、WO 94/25578、WO95/30744、WO 95/35381、WO 96/00292)、洋葱头锈菌(P cepacia)(EP 331376)，施氏假单孢菌(P.stutzeri)(GB1372034)、荧光假单孢菌(P.fluorescens)、假单孢菌属菌株SD705(WO95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单孢菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、门多萨假单孢菌(Pseudomonas mendocina)(WO 95/14783)、颖壳假单孢菌(P.glumae)(WO95/35381，WO 96/00292)
·来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.priistinaespiralis)(WO2012/137147)的脂肪酶，GDSL型链霉菌脂肪酶(WO2010/065455)，
·如WO2011/084412中公开的来自嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶，
·WO2011/084417中公开的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的脂肪酶，
·例如如WO 00/60063中所公开的芽孢杆菌(Bacillus)脂肪酶，如Dartois等人(1992)Biochemica et Biophysica Acta，1131,253-360或WO2011/084599所公开的来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，嗜热脂肪芽杆菌(B.stearothermophilus)(JP S64-074992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
·如WO 94/01541中公开的来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶。
·来自门多萨假单孢菌的角质酶(US 5389536，WO 88/09367)
·来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶(WO 2010/107560)
·如WO 90/09446、WO 00/34450和WO 01/92502中公开的来自Fusarun solanipisi的角质酶
·如WO 00/34450和WO 01/92502中公开的来自柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)的角质酶
合适的脂肪酶(C)还包括称为酰基转移酶或过水解酶的那些，例如，与南极假丝酵母脂肪酶A(WO2010/111143)具有同源性的酰基转移酶，来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(WO 2005/056782)，来自CE7家族的过水解酶(WO 2009/67279)，以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是S54V变体(WO2010/100028)。
合适的脂肪酶还包括那些具有脂解酶活性的上述脂肪酶和/或角质酶的变体。这种合适的脂肪酶变体例如是通过WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/60063、WO 2007/087508、EP 407225和EP 260105中公开的方法开发的那些。
合适的脂肪酶/角质酶(C)还包括那些具有脂解酶活性的上述脂肪酶/角质酶的变体。合适的脂肪酶/角质酶变体包括与如上公开的亲本酶的全长多肽序列相比具有至少40-100％同一性的变体。在一个实施方案中，具有脂解活性的脂肪酶/角质酶变体可以是当与如上公开的亲本酶的全长多肽序列相比时至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在另一个实施方案中，本发明组合物包含至少一种脂肪酶/角质酶变体，其包含不属于相应脂肪酶/角质酶的功能结构域的保守突变。具有脂解活性的该实施方案的脂肪酶/角质酶变体与亲本酶的全长多肽序列相比，可以是至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似。
脂肪酶(C)具有“脂解活性”。测定脂解活性的方法在文献中是众所周知的(参见例如Gupta等人(2003)，Biotechnol.Appl.Biochem.37，第63-71页)。例如，脂肪酶活性可以通过底物对硝基苯基棕榈酸酯(pNP-棕榈酸酯，C：16)中的酯键水解来测量，并且释放的pNP是黄色的，可以在405nm处检测到。
当所述脂肪酶变体表现出相应亲本脂肪酶的脂解活性的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少10％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％时，脂肪酶变体可具有根据本发明的脂解活性。
在本发明的一个实施方案中，可以使用上述脂肪酶(C)中的至少两种的组合。
脂肪酶(C)可以以其非纯化形式或纯化形式使用，例如借助于众所周知的吸附方法(例如苯基琼脂糖吸附技术)纯化。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物中包含的脂肪酶(C)的量使得最终的本发明组合物具有的脂解酶活性为100-0.005LU/mg，优选25-0.05LU/mg组合物。脂肪酶单位(LU)是在pH恒定器中每分钟产生1μmol可滴定脂肪酸的脂肪酶的量。在下列条件下：温度30℃；pH＝9.0；底物是3.3重量％橄榄油和3.3％***树胶，在13mmol/l Ca2+和20mmol/lNaCl在5mmol/l Tris-缓冲液中的乳液。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物中包含的蛋白酶(C)的量使得最终的本发明组合物具有0.1-50GU的蛋白水解酶活性。
优选在组合物中使用脂肪酶(C)和蛋白酶(C)的组合，例如1-2重量％的蛋白酶(C)和0.1-0.5重量％的脂肪酶(C)。
在本发明上下文中，当与储存前的初始酶活性相比时，酶(C)的“在应用中可获得的”酶活性等于100％时，称其为稳定的。当与储存前的初始酶活性相比时，在应用中可获得的酶的酶活性为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％，则在本发明中，酶可以被称为稳定的。
在一个实施方案中，与储存前的初始脂解活性相比，在37℃储存30天后可得到的脂解活性至少为60％。
当与储存前的初始酶活性比较时，从100％减去a％得到“储存期间酶活性的损失”。在一个实施方案中，当在储存期间基本上不发生酶活性损失时，即，当与储存前的初始酶活性相比时，酶活性损失等于0％，根据本发明的酶是稳定的。在本发明中，基本上没有酶活性损失可以指，当与储存前的初始酶活性相比时，酶活性损失小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
在一个实施方案中，与储存前的初始脂解活性相比，在37℃储存30天后脂解活性的损失小于40％。
本发明中酶活性损失的降低可以指与储存前的初始酶活性相比，酶活性损失降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。
在本发明的一个实施方案中，盐(A)与本身已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂组合使用。丝氨酸蛋白酶抑制剂的实例是硼酸、硼酸盐或另一种硼酸衍生物或肽醛。该抑制剂对丝氨酸蛋白酶Ki(M，mol/L)的抑制常数可以是1E-12-1E-03；更优选1E-11-1E-04；甚至更优选：1E-10-1E-05；甚至更优选1E-10-1E-06；最优选1E-09-1E-07，但是优选在本发明配制剂中使用盐(A)而没有硼基抑制剂。
本发明组合物优选用作洗涤剂组合物。然而，本发明组合物可以用于其他领域，例如用于制造皮革。在该本发明组合物中，酶(C)和优选的脂肪酶(C)的存在量可以是0.01-4.0重量％，优选0.1-1.5重量％。在非洗涤剂应用中，盐(A)：脂肪酶(C)的重量比优选为0.5∶1-50∶1，更优选为5∶1-20∶1，甚至更优选为5∶1-10∶1。非洗涤剂液体组合物中的其他成分可选自多元醇和多元醇的混合物，例如山梨糖醇、甘油和丙二醇，各自的量为1-60％，少量的非离子表面活性剂(购自Softanol)0-5％，钙离子0.001％-0.5％，水。其他实例是防腐剂，例如2-苯氧基乙醇。
本发明组合物可以含有一种或多种除盐(A)、表面活性剂(B)或酶(C)以外的成分，例如有机溶剂、香料、染料、生物杀伤剂、防腐剂、水溶助长剂、助洗剂、粘度调节剂、聚合物、缓冲剂、消泡剂和抗腐蚀添加剂。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的组合物可包含一种或多种有机溶剂，例如乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲醚、乙二醇***、乙二醇丙醚和苯氧基乙醇，优选乙醇、异丙醇或丙二醇。有机溶剂的优选量为0.5-25重量％，相对于整个本发明组合物。尤其是当本发明组合物以小袋等形式递送时，8-25重量％的有机溶剂。
香料的实例是水杨酸苄酯、可作为
Figure BDA0002512543760000251
商购的2-(4-叔丁基苯基)2-甲基丙醛和己基肉桂醛。
染料的实例是酸性蓝9、酸性黄3、酸性黄23、酸性黄73、颜料黄101、酸性绿1、溶剂绿7和酸性绿25。
本发明液体洗涤剂组合物可以包含一种或多种防腐剂或生物杀伤剂。生物杀伤剂和防腐剂防止本发明液体洗涤剂组合物由于来自微生物的侵袭而改变。生物杀伤剂和防腐剂的实例是BTA(1,2,3-苯并***)、苯扎氯铵、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(“BIT”)、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(“MIT”)和5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(“CIT”)、苯甲酸、山梨酸、丁基氨基甲酸碘丙炔酯(“IPBC”)、二氯二甲基乙内酰脲(“DCDMH”)、溴氯二甲基乙内酰脲(“BCDMH”)和二溴二甲基乙内酰脲(“DBDMH”)。
粘度调节剂的实例是琼脂、角叉菜、黄蓍胶、***树胶、海藻酸盐、果胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、明胶、刺槐豆胶、交联聚(甲基)丙烯酸酯，例如用二-(甲基)丙烯酰胺交联的聚丙烯酸，还有硅酸、粘土(例如但不限于蒙脱石)、沸石、糊精和酪蛋白。
本发明上下文中的水溶助长剂是促进在水中显示有限溶解度的化合物溶解的化合物。水溶助长剂的实例是有机溶剂如乙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇，以及在正常条件下无限制地与水混溶的其他有机溶剂。合适的水溶助长剂的其他实例是甲苯磺酸、二甲苯磺酸和枯烯磺酸的钠盐。
聚合物的实例尤其是聚丙烯酸及其相应的碱金属盐，特别是其钠盐。合适的聚合物特别是聚丙烯酸，优选具有2,000-40,000g/mol，优选2,000-10,000g/mol，特别是3,000-8,000g/mol的平均分子量Mw的聚丙烯酸，各自用碱，特别是用钠部分或完全中和。合适的还有共聚多羧酸盐，特别是丙烯酸与甲基丙烯酸和丙烯酸或甲基丙烯酸与马来酸和/或富马酸的那些。聚丙烯酸及其相应的碱金属盐可用作抗污再沉积剂。
聚合物的其他实例是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。聚乙烯基吡咯烷酮可以用作染料转移抑制剂。
聚合物的其他实例是聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氧乙烯对苯二甲酸酯和每分子用一个或两个亲水基团封端的聚对苯二甲酸乙二醇酯，其中亲水基团选自CH2CH2CH2-SO3Na、CH2CH(CH2-SO3Na)2和CH2CH(CH2SO2Na)CH2-SO3Na。
缓冲剂的实例是单乙醇胺和N,N,N-三乙醇胺。
消泡剂的实例是聚硅氧烷。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物可含有一种或多种除盐(A)以外的助洗剂。
本发明组合物可含有1-40重量％的除盐(A)以外的洗涤剂助洗剂，例如但不限于沸石、磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、聚合物助洗剂或氨基羧酸盐，例如亚氨基琥珀酸酯的碱金属盐，例如IDS-Na4，此外次氮基三乙酸(“NTA”)、甲基甘氨酸二乙酸(“MGDA”)、谷氨酸二乙酸(“GLDA”)、乙二胺四乙酸(“EDTA”)或二亚乙基三胺五乙酸(“DTPA”)。优选的碱金属盐是钾盐，尤其是钠盐。
洗涤剂助洗剂的其他实例是具有配位基团的聚合物，例如其中20-90摩尔％的N-原子带有至少一个CH2COO-基团的聚乙烯亚胺，以及上述螯合剂的相应碱金属盐，尤其是它们的钠盐。
合适聚合物的其他实例是聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。聚亚烷基亚胺可以原样使用或作为聚烷氧基化衍生物使用，例如乙氧基化或丙氧基化的。聚亚烷基亚胺每分子含有至少三个亚烷基亚胺单元。
在本发明的一个实施方案中，所述亚烷基亚胺单元是C2-C10亚烷基二胺单元，例如1,2-丙二胺，优选α,ω-C2-C10亚烷基二胺，例如1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺(也称为1,6-己二胺)、1,8-二胺或1,10-癸二胺，甚至更优选1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺和1,6-己二胺。
在本发明的另一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺选自聚亚烷基亚胺单元，优选聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺单元。
术语“聚乙烯亚胺”在本发明上下文中不仅是指聚乙烯亚胺均聚物，还是指与其它亚烷基二胺结构单元，例如NH-CH2-CH2-CH2-NH结构单元、NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元、NH-(CH2)4-NH结构单元、NH-(CH2)6-NH结构单元或(NH-(CH2)8-NH结构单元一起含有NH-CH2-CH2-NH结构单元的聚亚烷基亚胺，但NH-CH2-CH2-NH结构单元就摩尔份额而言占多数。优选的聚乙烯亚胺含有就摩尔份额而言占多数的NH-CH2-CH2-NH结构单元，例如参照所有亚烷基亚胺结构单元计相当于60摩尔％或更多，更优选相当于至少70摩尔％。在一个具体实施方案中，术语聚乙烯亚胺是指每聚乙烯亚胺单元仅带有1个或0个不同于NH-CH2-CH2-NH的亚烷基亚胺结构单元的那些聚亚烷基亚胺。
术语“聚丙烯亚胺”在本发明中不仅是指聚丙烯亚胺均聚物，还是指与其它亚烷基二胺结构单元，例如NH-CH2-CH2-CH2-NH结构单元、NH-CH2-CH2-NH结构单元、NH-(CH2)4-NH结构单元、NH-(CH2)6-NH结构单元或(NH-(CH2)8-NH结构单元一起含有NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元的聚亚烷基亚胺，但NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元就摩尔份额而言占多数。优选的聚丙烯亚胺含有就摩尔份额而言占多数的NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元，例如参照所有亚烷基亚胺结构单元计相当于60摩尔％或更多，更优选相当于至少70摩尔％。在一个具体实施方案中，术语聚丙烯亚胺是指每聚丙烯亚胺单元仅带有1个或0个不同于NH-CH2-CH(CH3)-NH的亚烷基亚胺结构单元的那些聚亚烷基亚胺。
分支可以是亚烷基氨基(alkylenamino)，例如但不限于-CH2-CH2-NH2基团或(CH2)3-NH2-基团。较长分支可以是例如-(CH2)3-N(CH2CH2CH2NH2)2或-(CH2)2-N(CH2CH2NH2)2基团。高度支化的聚乙烯亚胺是例如具有0.25-0.95，优选0.30-0.80，特别优选至少0.5的支化度的聚乙烯亚胺树枝状聚合物或相关分子。可以例如通过13C-NMR或15N-NMR谱法，优选在D2O中测定支化度，并如下定义：
DB＝D+T/D+T+L
其中D(树枝状)对应于叔氨基的分数，L(线性)对应于仲氨基的分数且T(末端)对应于伯氨基的分数。
在本发明中，支化聚乙烯亚胺单元是具有0.25-0.95，特别优选0.30-0.90％，非常特别优选至少0.5的DB的聚乙烯亚胺单元。
优选的聚乙烯亚胺单元是几乎或完全没有表现出支化的那些，因此是主要线性或线性的聚乙烯亚胺单元。
在本发明上下文中，CH3基团不被视为分支。
在本发明的一个实施方案中，聚乙烯亚胺具有1至1000mg KOH/g，优选10-500mgKOH/g，最优选50-300mg KOH/g的伯胺值。伯胺值可根据ASTM D2074-07测定。
在本发明的一个实施方案中，聚乙烯亚胺具有10-1000mg KOH/g，优选50-500mgKOH/g，最优选50-500mg KOH/g的仲胺值。仲胺值可根据ASTM D2074-07测定。
在本发明的一个具体实施方案中，聚乙烯亚胺具有1-300mg KOH/g，优选5-200mgKOH/g，最优选10-100mg KOH/g的叔胺值。叔胺值可根据ASTM D2074-07测定。
在本发明的一个具体实施方案中，通过15N-NMR谱法测定叔N原子的摩尔份额。在叔胺值和根据13C-NMR谱法的结果不一致的情况下，通过13C-NMR谱法获得的结果是优选的。
在本发明的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺的平均分子量Mw为250至100,000g/mol，优选至50,000g/mol，更优选800至25,000g/mol。聚亚烷基亚胺的平均分子量Mw可通过中间体相应聚亚烷基亚胺的凝胶渗透色谱法(GPC)测定，用1.5重量％甲酸水溶液作为洗脱剂和交联聚甲基丙烯酸羟乙酯作为固定相。
所述聚亚烷基亚胺可以是游离的或烷氧基化的，所述烷氧基化选自乙氧基化、丙氧基化、丁氧基化和前述中至少两种的组合。优选氧化乙烯、1,2-氧化丙烯和氧化乙烯与1,2-氧化丙烯的混合物。如果使用至少两种氧化烯的混合物，它们可以逐步或同时反应。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺每单元带有至少6个氮原子。
在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺是用每NH基团2-50摩尔的氧化烯、优选每NH基团5-30摩尔的氧化烯、甚至更优选每NH基团5-25摩尔的氧化乙烯或1,2-氧化丙烯或其组合烷氧基化的。在本发明的上下文中，NH2单元被计算为两个NH基团。优选地，所有-或几乎所有-NH基团被烷氧基化，并且没有可检测量的NH基团留下。
取决于这种烷氧基化聚亚烷基亚胺的制备，分子量分布可以是窄的或宽的。例如，多分散性Q＝Mw/Mn为1-3，优选至少1.2和更优选1.2-2.5，或者它也可以大于3和至多20，例如3.5-15，和在宽分子量分布的情况下更优选4-5.5。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺的多分散性Q为2-10。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺选自聚乙氧基化聚乙烯亚胺、乙氧基化聚丙烯亚胺、乙氧基化α,ω-己二胺、乙氧基化和丙氧基化聚乙烯亚胺、乙氧基化和丙氧基化聚丙烯亚胺以及乙氧基化和聚丙氧基化α,ω-己二胺。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚乙烯亚胺的平均分子量Mn(数均)为2,500-1,500,000g/mol，通过GPC测定，优选至多500,000g/mol。
在本发明的一个实施方案中，平均烷氧基化聚亚烷基亚胺选自乙氧基化α,ω-己二胺和乙氧基化和聚丙氧基化α,ω-己二胺，各自均具有800-500,000g/mol的平均分子量Mn(数均)。
在本发明的一个可供选择的实施方案中，本发明组合物是无助洗剂的，即基本上不含附加的洗涤剂助洗剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明液体组合物可以包含约0.1-约15％，更特别地0.25-10％，最特别地约0.5-5％的盐(A)。
因此，稳定的液体酶配制剂可以含有0.5-20重量％，特别是1-10重量％的酶(C)(蛋白酶和任选的第二种酶的总和)和0.01％-10重量％的盐(A)，更特别是0.05-5重量％，最特别是0.1-2重量％的盐(A)。
琥珀酸酯助洗剂优选以其水溶性盐的形式使用，包括钠盐、钾盐。铵和链烷醇铵盐。琥珀酸酯助洗剂的具体实例包括：月桂基琥珀酸酯、肉豆蔻基琥珀酸酯、棕榈基琥珀酸酯、2-十二碳烯基琥珀酸酯(优选)、2-十五碳烯基琥珀酸酯等。月桂基琥珀酸酯是上述组中优选的助洗剂。
本发明组合物允许灵活配制，即使具有高或低的水含量。本发明的另一个目的是提供一种组合物，其具有优异的储存期，特别是对于其中所含的酶。因此，本发明组合物非常适于洗涤织物。因此，本发明的另一方面涉及本发明组合物用于洗涤织物的用途。特别地，本发明液体配制剂非常适于织物的洗涤。
本发明洗涤剂组合物可用作织物清洁组合物，硬表面清洁组合物，轻型清洁组合物，包括餐具清洁组合物，和自动洗碗机洗涤剂组合物。
本发明的另一方面涉及盐(A)用于稳定酶的用途。盐(A)已在上面更详细地定义。
本发明的另一方面是制备本发明组合物的方法，下文中也称为本发明的制备方法。本发明的制备方法包括以下步骤(a)混合
(A)至少一种盐(A)，和
(C)至少一种酶，
(b)加入至少一种选自两性和阴离子和非离子表面活性剂的表面活性剂(B)。
步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行。然而，在表面活性剂(B)可导致泡沫形成的实施方案中，优选首先混合盐(A)和酶(C)，然后加入表面活性剂(B)。
盐(A)和酶(C)的混合可以在任何类型的容器中进行。优选地，避免混合期间的起泡和高剪切速率。优选的装置是管式混合器和静态混合器。
在本发明制备方法的优选实施方案中，盐(A)是通式(I)的化合物：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化的C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可带有一个或多个羟基或C＝O或COOH基团，如果适用的话，是部分或完全中和的，
R2相同或不同，选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同，选自氢和C1-C4烷基，
X是C2-C4亚烷基，和
A-是无机或有机抗衡阴离子。变量R1、R2、m、n和A-如上所定义。优选地，通式(I)的化合物中R2均为甲基。
在本发明制备方法的优选实施方案中，盐(A)具有选自卤离子、硫酸根、碳酸根、酒石酸根、柠檬酸根、乳酸根和甲磺酸根的抗衡离子。
在本发明制备方法的优选实施方案中，至少一种酶(C)选自蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。
本发明将通过工作实施例进一步说明。
一般备注：除非另外特别说明，百分比为重量百分比。
酶的重量％是指所用的和商业上可获得的酶制剂-纯蛋白质的重量％相当低-因此所述的周转次数/mg是重要的。
乙酰胆碱(A.12)购自Sigma Aldrich。抗衡离子是氯离子。
(A.14)的前体可直接产生，而不是在三甲胺的乙氧基化中使用HCl，或通过胆碱碳酸氢盐与甲磺酸的反应产生，参见Chem.Eng.Data，2007，52 1280-1285。
I.盐(A)的合成
基于蒸馏掉的水量和通过IR光谱，可以显示酯化反应完成。
90％甲磺酸是指10％水和90％甲磺酸的混合物。
I.1合成本发明的盐(A.1)
将225g(1.5摩尔)酒石酸溶解在280g的75重量％胆碱盐酸盐(1.5摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入15g的90重量％含水甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g二甘醇稀释。得到617g量的黄色液体。用7.8g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.1)。
I.2合成本发明的盐(A.2)
将150g酒石酸(1.0摩尔)溶解在374g的75重量％胆碱盐酸盐(2.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入15g的90重量％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g二甘醇稀释。得到607g量的黄色液体。用8.7g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.2)。
I.3合成本发明的盐(A.3)
将210g柠檬酸一水合物(1.0摩尔)溶解在374g的75重量％胆碱盐酸盐(2.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入18g的90重量％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g二甘醇稀释。得到607g量的黄色液体。用10.3g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.3)。
I.4合成本发明的盐(A.4)
将210g柠檬酸一水合物(1.0摩尔)溶解在561g的75重量％胆碱盐酸盐(3.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入18g的90重量％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用270g二甘醇稀释。得到868g量的黄色液体。用9.6g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.4)。
I.5合成本发明的盐(A.5)
将210g柠檬酸一水合物(1.0摩尔)溶解在485g的75重量％胆碱甲磺酸盐(2.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入18g的90重量％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g二甘醇稀释。得到663g量的黄色液体。用12.5g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.5)。
I.6合成本发明的盐(A.6)
将98,1g马来酸酐(1.0摩尔)与363g的胆碱甲磺酸盐(2.0摩尔)作为干物质混合。在旋转蒸发器中将混合物加热至135℃。混合1小时后，加入12g的甲磺酸(纯)，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。混合1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g二甘醇稀释。得到653g量的黄色液体。用8.9g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.6)。
I.7合成本发明的盐(A.7)
将210g柠檬酸一水合物(1.0摩尔)溶解在437g的70重量％β-甲基胆碱盐酸盐(HO-CH(CH3)-CH2-N(CH3)3Cl，2.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入18g的90重量％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g二甘醇稀释。得到676g量的黄色液体。用12.3g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.7)。
I.8合成本发明的盐(A.8)
将105g柠檬酸一水合物(0.5摩尔)溶解在327g的70重量％β-甲基胆碱盐酸盐(1.5摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入13g的90重量％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用170g二甘醇稀释。得到471g量的黄色液体。用21.7g三乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.8)。I.9合成本发明的盐(A.9)
将210g柠檬酸一水合物(1.0摩尔)溶解在520g的70重量％β-正丙基胆碱盐酸盐(2.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入18g的90％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用250g丙二醇稀释。得到774g量的黄色液体。用11.9g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.9)。
I.10合成本发明的盐(A.10)
将210g柠檬酸一水合物(1.0摩尔)溶解在520g的70％二甲基一丁基胆碱盐酸盐(2.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入18g的90％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g丙二醇稀释。得到788g量的黄色液体。用11.4g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.10)。
I.11合成本发明的盐(A.11)
将105g柠檬酸一水合物(0.5摩尔)溶解在397g的60重量％二甲基正辛基胆碱盐酸盐(1.0摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在90分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入9.5g的90％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用200g丙二醇稀释。得到470g量的黄色液体。用8.9g乙醇胺中和200g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.11)。
I.13合成本发明的盐(A.13)
将85g五倍子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸，0.5摩尔)分散在121g的75重量％胆碱甲磺酸盐(0.5摩尔)水溶液中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在90分钟内除去水–油浴温度为100-120℃，50-80毫巴。加入8g的90％甲磺酸，并在800毫巴的压力下将温度升至145℃。旋转蒸发1小时后，压力连续降低到10毫巴，同时在145℃下另外除去水4.5小时，得到浅黄色物质，用100g二甘醇稀释。得到271g量的黄色液体。用4.6g乙醇胺中和100g所得液体的等分试样至pH值为6-6.5(10％水溶液)。得到本发明的盐(A.13)。
对比盐：
C-(A.15)胆碱盐酸盐，75重量％的水溶液，购自BASF SE
C-(A.16)将75g(0.5摩尔)酒石酸分批溶解(15g单位)在206g的80重量％胆碱碳酸氢盐(1.0摩尔)水溶液中。搅拌溶液直到CO2放出停止。通过旋转蒸发(2L烧瓶)在90分钟内除去水–油浴温度为120℃，10毫巴。得到透明物质，用150g二甘醇稀释。得到390g透明溶液，C-(A.16)。不能检测到酯的形成。
C-(A.17)将105g(0.5摩尔)柠檬酸一水合物分批溶解(20g单位)在206g的80重量％胆碱碳酸氢盐(1.0摩尔)水溶液中。搅拌溶液直到CO2放出停止。通过旋转蒸发(2L烧瓶)在90分钟内除去水–油浴温度为120℃，10毫巴。得到透明物质，用150g二甘醇稀释。得到412g透明溶液，C-(A.17)。
不能检测到酯的形成
C-(A.18)将105g(0.5摩尔)柠檬酸一水合物分批溶解(20g单位)在309g的80重量％胆碱碳酸氢盐(1.5摩尔)水溶液中。搅拌溶液直到CO2放出停止。通过旋转蒸发(2L烧瓶)在90分钟内除去水–油浴温度为120℃，10毫巴。得到透明物质，用150g二甘醇稀释。得到497g透明粘稠溶液，C-(A.18)。
不能检测到酯的形成
C-(A.19)：柠檬酸一水合物，C-(A.20)：柠檬酸单钠盐，C-(A.21)：柠檬酸二钠盐，C-(A.22)：柠檬酸三钠盐。C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)是用于洗涤剂配制剂中的已知助洗剂化合物。
II.应用试验
II.1稳定液体配制剂的形成
低水液体洗涤剂配制剂用二醇如二甘醇或DPG代替水，因此溶解度是不可避免的。盐(A.1)至(A.11)和C-(A.16)至C-(A.18)各自可溶于二甘醇和/或二丙二醇中，因此可以在无水的情况下配制。
将50g C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)各自与100g二甘醇一起加入烧瓶中，并在搅拌下在100℃加热30分钟。除去热源，将所得白色悬浮液在10小时内冷却至环境温度。过滤(滤纸)所得浆液，滤饼用50g异丙醇洗涤两次。分离的化合物C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)通过重量分析测定，表明在不存在水时，由于溶解度不足，C-(A.19)和C-(A.20)和C-(A.21)和C-(A.22)都不能使用。获得以下量的滤饼：
C-(A.19)：44.0g；C-(A.20)：45.8g；C-(A.21)：47.2g；C-(A.22)：48.2g II.2酶稳定性试验
在37℃下评价脂肪酶和蛋白酶在水中的储存稳定性。
通过混合表1的组分制备基础配制剂I-VI，制备基础试验配制剂。
如果适用，将相应的盐(A)或对比化合物以表1中所示的量加入到相应的基础配制剂中。
向相应基础配制剂中加入表1所示量的酶(C)。表1中提供的酶量是指活性蛋白。加入脂肪酶或蛋白酶，取决于测量的是哪种酶活性。
Figure BDA0002512543760000361
100L(CAS-编号9001-62-1，EC-编号232-619-9)购自Sigma-Aldrich。
Figure BDA0002512543760000362
16.0L(CAS-编号9014-01-1，EC-编号232-752-2)购自Sigma-Aldrich。
加入水以达到平衡至100。
通过使用对硝基苯酚戊酸酯(2.4mM pNP-C5，在100mM Tris中pH8.0，0.01％Triton X100)作为底物。测定如表2所示的在某些时间点的Lipolase活性。在405nm处，在5分钟内，在20℃下每30秒测量吸收。时间依赖性吸收曲线的斜率(在405nm/分钟处吸光度增加)与脂肪酶的活性成正比。
表2显示了在储存之后测量的液体配制剂中的脂肪酶活性；在37℃下1-30天。参照在时间0时在参照配制剂中测定的100％值，计算表2中提供的脂解活性值。
配制剂的命名如下：句点前的罗马数字表征基础配制剂，***数字表征盐的类型。零点：无盐(A)。“C-”：对比配制剂。
表1：液体洗衣配制剂
Figure BDA0002512543760000371
(B.1)：n-C18烷基-(OCH2CH2)25-OH
(B.2)：C10-C18烷基多糖苷混合物
(B.3)：C10-C12烷基苯磺酸钠
(B.4)：异丙基苯磺酸钠
(B.5)：月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠–n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6)：n-C12H25(CH3)2N→O
＊对于对比试验，在没有酶的情况下重复实验
＊
＊＊对于不含盐(A)的对比试验，所述量的盐(A)用相同量的二甘醇代替。
在Thermo Fisher Scientific Gallery一通道干涉滤光光度计(由ThermoFisher Scientific制造)中通过用N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(p-pitroanilide)在DMSO中的滴定来测量蛋白酶的酶活性。对硝基苯胺的释放导致405nm处的吸光度增加，并且与以PROT单位测量的酶活性成比例。一种PROT是在pH 9.0和37℃每分钟从I mM N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺释放1μmol对硝基苯胺的酶量。在表2中，储存后测定配制剂和对比配制剂中的脂肪酶活性；在37℃下1-30天。100％的活性是指在水性环境和相同浓度下的活性。
表2：稳定性试验的结果
Figure BDA0002512543760000381
Figure BDA0002512543760000391
蛋白酶活性：
通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，简称AAPF)作为底物测定如表3所示的某些时间点的Savinase活性。通过蛋白水解切割将pNA从底物分子上切下，导致游离pNA的黄色释放，这通过测量OD405来测定。在20℃下进行测量。
表3显示了在37℃下储存1-30天后在液体配制剂中测量的蛋白酶活性。参考在时间0时在参考配制剂中测定的100％值计算表3中提供的蛋白水解活性值。
配制剂的命名如下：句点前的罗马数字表征基础配制剂，***数字表征盐的类型(A.#本发明的盐(组分(a))；C-(A.#)对比化合物)。零点(“0”)：无盐，而是二甘醇。
表3：有盐和无盐下的蛋白酶活性(A)
Figure BDA0002512543760000392
Figure BDA0002512543760000401
II.3织物清洁试验
进行这些配制剂在清洁两种类型的试验织物中的洗涤性能。试验布料样品包括由于CFT工艺而含有蛋白质和脂肪组分的复杂污垢，以及试验布料样品含有脂肪/颗粒类型的污垢。
如下进行试验：在launder-O-meter中用2.5g棉织物和5g/L的液体试验洗衣洗涤剂一起洗涤含有8个标准污染织物片的多污渍监测器，每个2.5×2.5cm大小且在两侧上缝合到聚酯载体上，如表4所示。
条件如下：装置：来自SDL Atlas，Rock Hill，USA的Launder-0-Meter。洗涤液：250ml，洗涤时间：60分钟，洗涤温度：30℃。水硬度：2.5mmol/L；Ca:Mg:HC03 4∶1∶8
织物与液体的比例1∶12在洗涤循环之后，将多污渍监测器在水中漂洗，随后在环境温度下干燥14小时的时间段。
使用以下预污染的试验织物：
CFT C-S-10：黄油，在棉花上
CFT C-S-62：猪油，染在棉花上
CFT C-S-68
EMPA 112：可可，在棉花上
EMPA 141/1：唇膏，在棉花上
EMPA 125：
wfk20D：颜料和皮脂类油脂，在涤棉交织布上
CFT C-S-70：巧克力，慕斯膏
wfk＝wfk试验织物GmbH，Krefeld
EMPA＝瑞士联邦材料研究所试验
CFT＝试验材料B.V.的中心
使用颜色测量来评估总清洁水平。使用具有UV截止滤光片的球面反射分光计(来自Datacolor，USA的SF 500型，波长范围360-700nm，光学几何形状d/8°)在460nm处测量监测器上污垢的反射值。此时，通过CIE-Lab色空间分类，测定洗涤前后的亮度L＊、红绿色轴的a＊值、黄蓝色轴的b＊值，对8个监视器的污垢进行平均化。由评估颜色工具根据以下等式自动定义和计算的颜色值的变化(ΔE)值：
ΔE＝ΔDelta a＊2+ΔDelta b＊2++ΔDelta L＊2,ΔE是所达到的清洁效果的量度。所有测量重复六次以得到平均数。注意，ΔE值越高，清洁性越好。技术人员可以检测到1个单位的差异。非专家可以容易地检测到2个单位。结果示于表5中
Rw＝洗涤的污垢反射率
Ro＝未弄脏的反射率
由于助洗剂导致的去污力的增加计算如下：在该研究期间，对每种布进行总共6次重复；计算90-95％的统计学置信水平。
通过混合表4的组分制备配制剂VII-XIII，制备试验配制剂。
如果适用，将相应的盐(A)或对比化合物以表4中提供的量加入到相应的基础配制剂中。
如果适用，以表4中提供的量将
Figure BDA0002512543760000422
100L加入到相应的基础配制剂中。
如果适用，以表4中提供的量将
Figure BDA0002512543760000423
16.0L加入到相应的基础配制剂中。
加入水以达到平衡至100。
表4：液体洗衣配制剂
Figure BDA0002512543760000421
(B.1)：n-C18烷基-(OCH2CH2)25-OH
(B.2)：C10-C18烷基多糖苷混合物
(B.3)：C10-C12烷基苯磺酸钠
(B.4)：异丙基苯磺酸钠
(B.5)：月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠–n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6)：n-C12H25(CH3)2N→O
Lipolase在储存前以7500LU/ml的量存在
由于盐(A)导致的去污力的增加计算如下：在该研究期间，每种布总共运行6个实例；计算>90％的统计置信水平。表5示出了上述多污渍监测器的ΔE的总和。用新鲜制备的配制剂进行launder-O-meter试验，并在37℃下储存2个月的储存温度。作为近似，37℃下一周等同于20℃下3 1/2周。
表5：launder-O-meter试验结果
Figure BDA0002512543760000431
对于不含盐(A)的对比试验，用相同量的二甘醇代替盐(A)。

Claims (15)

1.包含如下组分的组合物：
(A)至少一种根据通式(I)的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化的C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可带有一个或多个羟基或C＝O或COOH基团，如果适用的话，是部分或完全中和的，
R2相同或不同，选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同，选自氢和C1-C4烷基，
X是C2-C4亚烷基，和
A-是无机或有机抗衡阴离子，
和
(B)至少一种选自两性和阴离子和非离子表面活性剂的表面活性剂。
2.根据权利要求1的组合物，其中盐(A)具有选自卤离子、硫酸根、碳酸根、酒石酸根、柠檬酸根、乳酸根和甲磺酸根的抗衡离子。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中组合物另外包含(C)至少一种酶。
4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中至少一种酶(C)选自蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。
5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物在室温下为液体。
6.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中根据通式(I)的化合物中R2均为甲基。
7.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物含有0.5-30重量％的盐(A)。
8.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中盐(A)含有作为杂质的化合物(A’)
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO-
其中变量R1、R2、X、n和m与相应盐(A)中的相同。
9.根据前述权利要求中任一项的组合物用于洗涤织物的用途。
10.盐(A)用于稳定酶的用途，
11.一种制备组合物的方法，所述方法包括以下步骤
(a)混合
(A)至少一种盐(A)，其为通式(I)的化合物，和
(C)至少一种酶，
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化的C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可带有一个或多个羟基或C＝O或COOH基团，如果适用的话，是部分或完全中和的，
R2相同或不同，选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同，选自氢和C1-C4烷基，
X是C2-C4亚烷基，和
A-是无机或有机抗衡阴离子，
(b)加入至少一种选自两性和阴离子和非离子表面活性剂的表面活性剂(B)。
12.根据权利要求11的方法，其中盐(A)具有选自卤离子、硫酸根、碳酸根、酒石酸根、柠檬酸根、乳酸根和甲磺酸根的抗衡离子。
13.根据权利要求11或12的方法，其中至少一种酶(C)选自蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。
14.根据权利要求11-13中任一项的方法，其中根据通式(I)的化合物中R2均为甲基。
15.根据如下通式的盐：
(CH3)3N+-(CH2)CH(R3)-O-C(O)-R5 (A1)- (II)
其中(A1)-选自酒石酸根和柠檬酸根，
R3选自氢和C1-C4烷基，
并且其中R5选自-CH2-C(OH)(COOX2)-CH2-COOX2和–CH(OH)-CH(OH)-COOX1
其中X1选自氢、碱金属和(CH3)3N+-(CH2)2-
并且其中X2相同或不同，选自氢、碱金属和(CH3)3N+-(CH2)2-。
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