CN117241678A - 用于动物健康的饲料组合物 - Google Patents

Abstract

本文尤其提供了可用于改善动物健康和/或性能的包含生物高效蛋白酶的日粮、饲料和饲料添加剂组合物，及其制备和使用方法。

Description

用于动物健康的饲料组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年10月16日提交的美国临时专利申请号63/092,847的优先权，将该申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本文尤其提供了可用于改善动物健康和/或性能的包含蛋白酶的日粮、饲料和饲料添加剂组合物，及其制备和使用方法。

背景技术

蛋白质是动物和人的必需营养因子。大多数牲畜和很多人类从植物性蛋白质源中获得必需的膳食蛋白质。重要的植物性蛋白质源是例如油籽作物、豆科植物和谷类。然而，这些源可能是低效的，因为当单胃动物(例如猪和家禽)的饲料中包括植物性蛋白质源(例如豆粕)时，大量的含蛋白质固体通常不被消化。

在过去的几年里，继其他常见的饲料添加剂酶像木聚糖酶、淀粉酶和植酸酶被接受之后，蛋白酶在动物饲料中的使用变得更加普遍。动物饲料中的蛋白酶补充可以通过减少动物为实现希望的增重所需的粗蛋白的量来帮助降低与动物饲料相关的成本。然而，外源蛋白酶对动物性能的影响不一定从成分反映出蛋白质的体外消化率，并且还会受到多种影响其总体生物功效的因素的影响(Romero和Plumstead,2013.Proc.24thAus.Poult.Sci.Symp.[24界澳大利亚家禽科学研讨会进展]澳大利亚新南威尔士悉尼)。例如，肉仔鸡中的丝氨酸蛋白酶似乎没有显示出对完全饲料的蛋白质消化率的线性剂量响应，但是存在最佳值(Argüelles-Ramos等人,2010.SPSS Meeting[SPSS会议]摘要,12)，之后随着蛋白酶剂量的增加，边际减少是明显的。这表明由于蛋白酶活性，肠中膳食蛋白质的水解与不确定的生理相互作用之间的平衡可能会限制蛋白质保留的进一步改善(Romero和Plumstead,2013)。

因此，需要的是增加蛋白酶生物功效的膳食条件和/或饲料，以帮助指导日粮的配制，使蛋白质在向单胃动物施用后的利用最大化。

本文公开的主题解决了这些需求，并且还提供了另外的益处。

发明内容

本文尤其提供了经配制以增加蛋白酶的生物功效的含蛋白酶的组合物(包括日粮、饲料和饲料添加剂组合物)，及其制备和使用方法。

相应地，在一些方面，本文提供了一种用于改善含蛋白酶的饲料或日粮的生物功效的方法，该方法包括向动物饲料中添加含蛋白酶的饲料添加剂组合物，该动物饲料的特征为以下中的一个或多个：(a)酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；(b)含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；(c)小于1mm的尺寸的大部分颗粒；和/或(d)低缓冲容量。在一些实施例中，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶80％同一。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，豆粕的ADF含量大于约58g/kg、60g/kg、62g/kg、64g/kg或66g/kg。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，豆粕的含硫氨基酸含量小于约12g/kg或11g/kg。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，动物饲料中至少约60％的颗粒的尺寸小于1mm。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，在将0.3mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液后，稳定化的pH小于4.2。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将小于0.44mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液中，以使pH值达到4.0。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成的组的另外的酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或其发酵物。在一些实施例中，该DFM包含来自以下的一个或多个属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)或巨球菌属(Megasphaera)、及其组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该DFM包含来自以下的一个或多个物种的细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、肠球菌属物种(Enterococcus sp)、片球菌属物种(Pediococcussp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus sp)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、特恩丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivariu)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸杆菌属物种(Propionibacteria sp)、或其组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种精油。在一些实施例中，该精油是百里香酚和/或肉桂醛。

在其他方面，本文提供了一种用于为动物配制日粮的方法，该方法包括将蛋白酶与以下中的一种或多种组合：(a)酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；和/或(b)含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；其中，任选地，(c)该日粮中的大部分颗粒的尺寸小于1mm；和/或(d)该日粮具有低缓冲容量。在一些实施例中，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌属蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶80％同一。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，豆粕的ADF含量大于约58g/kg、60g/kg、62g/kg、64g/kg或66g/k。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，豆粕的含硫氨基酸含量小于约12g/kg或11g/kg。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，日粮中至少约60％的颗粒的尺寸小于1mm。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，在将0.3mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液后，稳定化的pH小于4.2。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将小于0.44mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液中，以使pH值达到4.0。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成的组的另外的酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或其发酵物。在一些实施例中，该DFM包含来自以下的一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属或巨球菌属、及其组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该DFM包含来自以下的一个或多个物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属物种、片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌、埃氏巨型球菌、丙酸杆菌属物种、或其组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含一种或多种精油。在一些实施例中，该精油是百里香酚和/或肉桂醛。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该动物是单胃动物。在一些实施例中，该动物是家禽(例如，肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡、鸠鸽科(columbidae)或水禽)、猪、兔、牛(包括小牛)、山羊(包括小山羊)、绵羊(包括羔羊)、马、昆虫、伴侣动物(例如狗、猫)或鱼。

在另外的方面，本文提供了一种通过本文公开的任一方法配制的日粮。

在又其他方面，本文提供了一种日粮，该日粮包含：(a)包含蛋白酶的饲料添加剂组合物；以及一种或多种的(b)酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；和/或(b)含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；其中，任选地，(c)该日粮中的大部分颗粒的尺寸小于1mm；和/或(d)该日粮具有低缓冲容量。在一些实施例中，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌属蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶80％同一。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，豆粕的ADF含量大于约58g/kg、60g/kg、62g/kg、64g/kg或66g/kg。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，豆粕的含硫氨基酸含量小于约12g/kg或11g/kg。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，日粮中至少约60％的颗粒的尺寸小于1mm。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，在将0.3mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液后，稳定化的pH小于4.2。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将小于0.44mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液中，以使pH值达到4.0。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成的组的另外的酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或其发酵物。在一些实施例中，该DFM包含来自以下的一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属或巨球菌属、及其组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该DFM包含来自以下的一个或多个物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属物种、片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌、埃氏巨型球菌、丙酸杆菌属物种、或其组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种精油。在一些实施例中，该精油是百里香酚和/或肉桂醛。

在其他方面，本文提供了一种用于改善饲料转化率(FCR)或用于增加动物的体重增重的方法，该方法包括向该动物施用本文公开的日粮中的任一种。在一些实施例中，该动物是单胃动物。在一些实施例中，该动物是家禽(例如，肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡、鸠鸽科或水禽)、猪、兔、小牛、牛、山羊、绵羊、昆虫、伴侣动物(例如狗、猫)或鱼。

本文所述的方面和实施例中的每一个能够一起使用，除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除。

在本说明书通篇中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。出于所有目的，将本文所引用的所有专利、专利申请和其他出版物的公开内容通过引用以其全文特此并入。

具体实施方式

近几年来，蛋白酶在动物(例如家禽和猪)的日粮中的使用在大规模牲畜生产中得到了更广泛的接受，因为生产者试图保持最低成本的同时，从饲料中提取最大量的营养物。然而，与所有外源添加的膳食酶的情况一样，给定的蛋白酶从给定的饲料中提取营养物的能力的生物功效可由于与伴随饲料、饲料添加剂、以及所讨论的动物的消化道相关的任何数量的因素而变化。如本文更详细地描述，本申请的诸位发明人惊奇地发现含蛋白酶的饲料添加剂、饲料和日粮的生物功效可以通过包括以下中的一种或多种的膳食配制推荐而改善：使用ADF值更高的豆粕；使用含硫氨基酸的含量有限的豆粕；确保大部分饲料或喂养料具有小的粒度，以及配制具有低缓冲容量的日粮。根据这些因素中的一种或多种配制的日粮导致与饲喂不以该方式配制的日粮的对照动物相比，饲喂这些日粮的动物的增重和饲料转化率改善。

I.定义

如本文所用，关于蛋白酶的短语“改善的生物功效”或“改善生物功效”意指含有蛋白酶的饲料或日粮、或向根据本文公开的方法配制的饲料或日粮中添加的含蛋白酶的饲料添加剂组合物导致关于蛋白酶改善一个或多个参数中动物性能的能力的更高可能性或更大一致性。在一些非限制性实施例中，与对照日粮相比，向根据本文公开的方法配制的日粮中添加的蛋白酶导致体重增重≥3％的改善，或者与对照日粮相比，饲料转化率≥3％的改善。

如本文所用，饲料或饲料组分的“酸性洗涤纤维(ADF)含量”是指饲料中动物(例如单胃动物)难于或不能消化的植物材料的百分比。难于或无法消化的部分典型地含有纤维素、木质素和二氧化硅。与ADF较低的饲料相比，ADF较高的饲料的可消化能更低。在实验室分析期间，ADF是将饲料样品在酸性洗涤剂溶液中煮沸后剩余的残余物。ADF通常用于计算消化率、总可消化营养物(TDN)和/或泌乳净能(NEL)。

饲料或饲料组分的“含硫氨基酸含量”是指该饲料或饲料组分中胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的定量。

如本文所用，术语“缓冲容量”是指配制的日粮中饲料和/或饲料添加材料抵抗pH变化的能力。典型地，缓冲容量以改变给定量的组合物的pH所需的强酸或强碱的量表示。

术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用，并且是指属于动物界的任何生物体，且包括但不限于哺乳动物(不包括人)、非人动物、家畜、牲畜、农场动物、动物园动物、种畜等。例如，可以提及所有非反刍动物和反刍动物。在实施例中，该动物是非反刍动物，即单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pig和swine)，如仔猪、生长猪、母猪；家禽，如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，如虾和对虾。在另外的实施例中，该动物是反刍动物，包括但不限于牛、年幼的小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

如本文所用，术语“动物性能”可以通过饲料效率和/或动物的增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中营养物的消化率(例如，氨基酸消化率或磷消化率)和/或饲料中的可消化能或可代谢能和/或通过氮保留和/或通过动物避免疾病的负面影响的能力或通过受试者的免疫响应确定。

“动物性能改善”意指如与不包含本文所述的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮的饲料相比，包含所述含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮的饲料的使用导致饲料效率增加、和/或增重增加、和/或饲料转化率降低、和/或饲料中的营养物质或能量的消化率改善。在一些实施例中，“动物性能改善”意指存在饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低。如本文所用，术语“饲料效率”是指在一段时间期间给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。性能参数的改善可能是相对于对照，其中使用的含蛋白酶的饲料不包含本文公开的一种或多种日粮或膳食参数。在一些实施例中，动物性能改善是由于动物的日粮中提供的蛋白酶的生物功效改善。

“饲料效率增加”意指与在不存在根据本发明的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用所述含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮导致每单位饲料摄入量的增重增加。

如本文所用，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物重量增加指定量的饲料量。改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮导致饲喂给动物以使动物重量增加指定量所需的饲料量与在饲料不包含所述含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮时使动物重量增加相同量所需的饲料量相比较低。

如本文所用，术语“直接饲喂微生物(DFM)”是指供动物食用的组合物(即，作为动物饲料或作为动物饲料的组分)，该组合物含有有活力的微生物，即能够生存和繁殖的微生物。参见例如美国专利号8,420,074。直接饲喂微生物可包含本文所述的任何微生物菌株中的一种或多种(如任何1、2、3、4、5或6种或更多种)。术语“益生菌”、“益生菌培养物”和“DFM”在本文中可互换地使用，并定义当例如以足够数量摄取或局部应用时有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一种或多种可证明的健康益处如健康、消化、和/或性能益处)的活微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可改善一个或多个黏膜表面的微生物平衡。例如，黏膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用，术语“益生菌”还涵盖可刺激免疫***的有益分支并同时减少黏膜表面(例如肠道)中的炎症反应的活微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但已表明至少10⁶-10¹²、例如至少10⁶-10¹⁰、例如10⁸-10⁹cfu作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。

如本文所用，术语“CFU”意指“集落形成单位”并且是有活力的细胞的量度，其中集落代表衍生自单个祖细胞的细胞的集合。

术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式的或环境中的物质，并且不反映分离物已被纯化的程度，但表示从天然形式或天然环境中分离或分开。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从与其天然相关的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除的任何物质，包括但不限于任何细胞(如宿主细胞)、酶、工程化酶、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的物质经人工修饰的任何物质；或(4)通过增加物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质。

术语“百分比同一性”是如通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列串之间匹配的核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知的方法容易地计算“同一性”和“相似性”，这些方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,NY[牛津大学出版社，纽约州](1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press,NY[学术出版社，纽约州](1993)；Computer Analysisof Sequence Data[序列数据的计算机分析],第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,NJ[胡马纳出版社，新泽西州](1994)；Sequence Analysis inMolecular Biology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press,NY[斯托克顿出版社，纽约州](1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公共可用的计算机程序中。百分比同一性可使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见，Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊],90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用几个搜索参数，其中大部分被设置为默认值。NCBI BLAST算法找到在生物相似性方面最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-3402,1997；以及Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。用于核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。用于氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。

如本文所用，关于核苷酸或氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to或correspond to)或“对应”是指(i)在核酸或蛋白质或肽中所列举位置处的核苷酸或氨基酸残基；或(ii)与在核酸或蛋白质或肽中所列举的残基类似、同源或等同的核酸或氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。

如本文所用，“施用(administer或administering)”意指如通过饲喂或通过灌胃将一种或多种微生物菌株、外源性饲料酶和/或菌株以及外源性饲料酶引入动物的行为。

如本文所用，术语“饲料”在本文中与“喂养料”、“动物饲料组合物”和“秣料(fodder)”同义使用。饲料广义上是指用于滋养动物并用于维持动物(包括新生或年幼和发育中的动物)的正常或加速生长的液体或固体材料。该术语包括适合于动物(例如像反刍动物，如牛)摄入的化合物、制剂、混合物或组合物。在一些实施例中，饲料或饲料组合物包含基础食物组合物和一种或多种饲料添加剂或含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮。如本文所用，术语“饲料添加剂”是指出于用另外的组分强化基础饲料以促进饲料摄入、治疗或预防疾病、或改变代谢的目的而包括的组分。饲料添加剂包括预混物。如本文所用，术语“食物”以广义使用-并且涵盖用于人的任何形式的食物和食物产品以及用于动物的食物(即饲料)。

如本文所提及的“预混物”可以是由微量成分组成的组合物，这些微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混到商业口粮内的组合物。

某些范围在本文中以数值前加术语“约”呈现。术语“约”在本文中用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等同物的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有特别定义。

除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。

如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后的情况或对范围的限制发生或不发生，并且意指该描述包括其中该情况或对范围的限制发生的情形以及其中其不发生的情形。例如，任选地含有另外的外源性酶的组合物意指酶可以存在或不存在于组合物中。

应进一步注意，可以撰写权利要求书以排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

还应注意的是，如本文所用，术语“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”是指组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总组合物的小于30％重量的总量，并且不会影响或干扰一种或多种组分的作用或活性。

应进一步注意，如本文所用，术语“包含(comprising)”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，但是包含该一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或任选的一种或多种组分。

还应注意的是，如本文所用，术语“由……组成(consisting of)”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。

在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同这样的较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同这样的较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语的其他定义可在本说明书通篇出现。

II.组合物

A.饲料和日粮

如实例部分所述，进行一系列六只动物的试验来评估蛋白酶在几种日粮中的生物功效。发现了对四个特定的膳食参数中的一个或多个施加的限制与动物性能(例如但不限于体重增重、饲料摄入量、和/或饲料转化率中的一个或多个)的改善相关。

1.豆粕含量

豆粕用于食物和动物饲料，主要作为蛋白质补充物，但也作为可代谢能的来源。全球约98％的豆粕用作动物饲料。2010至2012年，在美国大豆总产量中，约44％作为大豆出口，并且53％在美国压榨。在压榨的吨数中，19％作为豆油回收，并且其余作为豆粕回收。在美国生产的大豆总吨数中，约35％作为豆粕饲喂美国牲畜和家禽。据估计，在美国用于饲喂动物的豆粕中，48％饲喂家禽，26％饲喂猪，12％饲喂肉牛，9％饲喂奶牛，3％用于鱼饲料，并且约2％用于宠物食物。豆粕典型地与低蛋白饲料结合使用，作为确保足够的蛋白质摄入量的重要补充物。

典型地，一蒲式耳(即60磅或27.2kg)的大豆得到48磅(21.8kg)的豆粕。一些但并非全部的豆粕是由油提取后剩下的残余物生产的。主要用于食物但也用于工业油、肥皂和生物柴油的油的去除涉及压榨、以及压缩或溶剂提取。一些但并非全部的豆粕含有碾碎的豆壳。豆粕在生产期间经热处理，使大豆中的胰蛋白酶抑制剂变性，否则其会干扰蛋白质消化。

生产三种主要种类的豆粕：全脂豆粕；不带壳的脱脂豆粕；和带壳的脱脂豆粕。

由全大豆制成的全脂豆粕具有高可代谢能浓度(例如，猪对该产品的可代谢能是约3.69兆卡(即15.4MJ)/kg干物质)。粗蛋白浓度为约38％(如所饲喂)。有时将这种产品饲喂各种类别的牲畜。

不含壳的脱脂豆粕具有中等能量浓度(例如，猪对该产品的可代谢能是约3.38兆卡(即14.1MJ)/kg干物质)。粗蛋白浓度为约48％。该百分比在典型的如所饲喂的88％的干物质含量下计算。因此，基于干物质表示的粗蛋白浓度为54％。通常将该产品喂养猪、肉鸡和蛋鸡。

脱脂豆粕可含有豆壳，这些豆壳易于被例如反刍牲畜消化。该产品通常作为蛋白质补充物饲喂家养反刍动物。反刍动物可代谢能浓度为约3.0兆卡(即约12.5MJ)/kg干物质，且粗蛋白浓度为约44％。后一百分比在典型的如所饲喂的90％的干物质含量下计算。因此，基于干物质的粗蛋白浓度为约49％。

在一些实施例中，本文公开的含蛋白酶的饲料或日粮包含酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg(如大于约57g/kg、58g/kg、59g/kg、60g/kg、61g/kg、62g/kg、63g/kg、64g/kg、65g/kg、66g/kg或更多)的豆粕。豆粕的ADF含量可根据本领域已知的任一方式(包括实例7中描述的方式)确定。

在另外的实施例中，本文公开的含蛋白酶的饲料或日粮包含含硫氨基酸含量小于约13g/kg(例如小于约12g/kg或11g/kg)的豆粕。含硫氨基酸含量可根据本领域已知的任一方式(包括实例8中描述的方式)确定。

在一些实施例中，与不含有ADF含量大于约56g/kg和/或含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕的含蛋白酶的饲料或日粮相比，含有ADF含量大于约56g/kg和/或含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕的含蛋白酶的饲料或日粮可导致关于蛋白酶在一个或多个参数中以如下程度改善动物性能的能力的更高可能性或更大一致性：大于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。在一些实施例中，动物性能改善由参数确定，该参数可以包括但不限于增加的增重和/或降低的饲料转化率。

2.粒度

当大部分喂养料(例如至少50％或更多，如50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)具有小于约1mm(例如小于以下中的任一个：约950μm、900μm、850μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、500μm、450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm或更小，包括落入这些尺寸之间的所有值)的粒度时，如本文公开的用于提高蛋白酶功效的含蛋白酶的饲料或日粮具有更高的蛋白酶生物功效。

小于约1mm的粒度可通过本领域已知的任一方式生产，包括但不限于通过选自由以下组成的组的方法：研磨、碾磨、粉碎、冻干、高剪切制粒、鼓式制粒、鼓式干燥、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、喷雾蒸煮、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片、或上述方法的任何组合。喂养料中的粒度和尺寸小于约1mm的粒度的百分比可通过本领域已知的任一方式(包括实例9中描述的方式)确定。

在一些实施例中，与不具有小于约1mm的粒度的含蛋白酶的饲料或日粮相比，具有小于约1mm的粒度的含蛋白酶的饲料或日粮可导致关于蛋白酶在一个或多个参数中以如下程度改善动物性能的能力的更高可能性或更大一致性：大于约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，该含蛋白酶的饲料或日粮任选地还可包括ADF含量大于约56g/kg和/或含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕。在一些实施例中，动物性能改善由参数确定，该参数可以包括但不限于增加的增重和/或降低的饲料转化率。

3.缓冲容量

本文公开的含蛋白酶的饲料或日粮可配制成具有低缓冲容量，以改善蛋白酶的生物功效。在一些实施例中，在将适度的酸添加到动物饲料的悬浮液后的稳定化pH小于约4.2(如小于约4.1、4、3.9、3.8、3.7、3.6或3.5)时，饲料或日粮具有低缓冲容量。在另一实施例中，在将0.3mol/kg的HCl添加到10％的动物饲料悬浮液后的稳定化pH小于约4.2(如小于约4.1、4、3.9、3.8、3.7、3.6或3.5)时，饲料或日粮具有低缓冲容量。在仍另外的实施例中，当添加低于约0.44mol/kg(如低于约0.43mol/kg、0.42mol/kg、0.41mol/kg、0.4mol/kg、0.39mol/kg、0.38mol/kg、0.37mol/kg、0.36mol/kg或0.35mol/kg)的HCl以使pH值达到4.0时，饲料或日粮具有低缓冲容量。缓冲容量可通过本领域已知的任一方式(包括实例10中描述的方法)确定。

在一些实施例中，与不具有低缓冲容量的含蛋白酶的饲料或日粮相比，具有低缓冲容量的含蛋白酶的饲料或日粮可导致关于蛋白酶在一个或多个参数中以如下程度改善动物性能的能力的更高可能性或更大一致性：大于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，含蛋白酶的饲料或日粮任选地还可包括ADF含量大于约56g/kg和/或含硫氨基酸含量小于约13g/kg和/或大部分饲料或日粮粒度小于约1mm的豆粕。在一些实施例中，动物性能改善通过参数确定，该参数可以包括但不限于增加的增重和/或降低的饲料转化率。

4.蛋白酶

如本文所用，术语“蛋白酶(protease)”与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。适用于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中的任一个的蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌蛋白酶(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.X.X)。在一个实施例中，蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体(例如为增加的热稳定性、增加的活性或增加的pH耐受性而工程化的突变体)也是适合的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。例如，碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。

碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如，美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例还包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体。

在另一实施例中，蛋白酶可以是表11中引用的一种或多种商业产品中的一种或多种蛋白酶。

表11：代表性商业蛋白酶

代表性商业蛋白酶实例。

在一个实施例中，蛋白酶选自由以下组成的组：枯草杆菌蛋白酶、茅孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶和拟诺卡氏菌属蛋白酶。

在一些实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO：1的蛋白酶共享至少约80％的氨基酸序列同一性(例如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性中的任一者)。在另一实施例中，该蛋白酶与编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸共享至少约80％的氨基酸序列同一性(例如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性中的任一者)。

应当理解，一个蛋白酶单位(PU)是在pH 7.5(40mM Na₂PO₄/乳酸缓冲液)和40℃下在一分钟内从底物(0.6％酪蛋白溶液)中释放一微克酚类化合物(以酪氨酸当量表示)的酶的量。这可被称为确定1PU的测定法。

在一个实施例中，饲料添加剂组合物包含500-1000、1000-2500、2500-5000、5000-10000、10000-25000、25000-50000、50000-75000、75000-100000、100000-125000、125000-150000、150000-175000、175000-200000和大于200000的蛋白酶单位/g饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，饲料、饲料添加剂组合物或日粮包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的蛋白酶单位/g饲料、饲料添加剂组合物、或日粮，或添加到饮用水中。

B.另外的外源性酶

补充性酶可用作饲料添加剂组合物、动物饲料和日粮(特别是家禽和猪饲料)的添加剂，作为改善营养物利用率和性能特征的手段。

在一个实施例中，本公开涉及一种包含含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮的组合物，其特征为以下中的一个或多个：酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；小于1mm的尺寸的大部分颗粒；和/或低缓冲容量以及一种或多种外源性饲料酶。外源性饲料酶可包括但不限于木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和另外的蛋白酶。

1.木聚糖酶

木聚糖酶是将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶的名称。木聚糖酶，例如内切-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)可将木聚糖主链水解。在一个实施例中，本文提供了包含本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中的任一种和一种或多种木聚糖酶的组合物。

在一个实施例中，木聚糖酶可以是任何可商购的木聚糖酶。合适地，木聚糖酶可以是内切-1,4-P-d-木聚糖酶(分类为EC 3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)。在一个实施例中，本公开涉及DFM与内木聚糖酶(例如，内切-1,4-P-d-木聚糖酶)和另一种酶的组合。本文提到的所有E.C.酶分类涉及在国际生物化学与分子生物学联合会(InternationalUnion of Biochemistry and Molecular Biology)命名委员会的Enzyme Nomenclature–Recommendations[酶命名法-推荐](1992)——ISBN 0-12-226164-3中提供的分类，将其并入本文

在另一实施例中，木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(Trichodermna)、嗜热真菌属(Therinomyces)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的木聚糖酶。在仍另一实施例中，木聚糖酶可以是Axtra或Avizyme/>中的木聚糖酶，两者都是可从丹尼斯科公司(Danisco A/S)商购的产品。在一个实施例中，木聚糖酶可以是两种或更多种木聚糖酶的混合物。在仍另一实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。在又另一实施例中，木聚糖酶来自选自由以下组成的组的生物体：芽孢杆菌属、木霉属(Trichoderma)、嗜热真菌属(Thermomyces)、曲霉属、青霉属和腐质霉属(Humicola)。在又另一实施例中，木聚糖酶可以是表12中引用的一种或多种木聚糖酶或一种或多种商业产品。

表12：代表性商业木聚糖酶

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮(例如本文描述的用于提高蛋白酶生物功效的那些中的任一种)和木聚糖酶。在一个实施例中，组合物包含1000-5000、5000-10000、10000-15000、15000-20000、20000-25000、25000-30000、30000-40000、40000-50000、50000-60000、60000-70000、70000-80000、80000-90000、90000-100000、100000-125000、125000-150000和大于150000的木聚糖酶单位/g饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-9000、9000-10000和大于10000的木聚糖酶单位/kg饲料添加剂组合物、饲料或日粮。

应当理解，一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物释放0.5μmol的还原糖等同物(为木糖，通过二硝基水杨酸(DNS)测定-还原糖方法)的酶的量(Bailey等人,Journal of Biotechnology[生物技术杂志],第23卷,(3),1992年5月,257-270)。

2.淀粉酶

淀粉酶是一类能够将淀粉水解为较短链的寡糖(如麦芽糖)的酶。然后与从原始的淀粉分子转移相比，葡萄糖部分可更容易地从麦芽糖转移到单甘油酯或糖基单甘油酯。术语淀粉酶包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、形成G4的淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。淀粉酶可以是细菌或真菌来源的，或是化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。在一个实施例中，本文提供了包含本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中的任一种和一种或多种淀粉酶的组合物。

在一个实施例中，淀粉酶可以是两种或更多种淀粉酶的混合物。在另一实施例中，淀粉酶可以是来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶(例如α-淀粉酶)和来自解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶(例如α-淀粉酶)。在一个实施例中，α-淀粉酶可以是Axtra或Avizyme/>中的α-淀粉酶，两者都是可从丹尼斯科公司商购的产品。在又另一实施例中，淀粉酶可以是抗胃蛋白酶α-淀粉酶，如抗胃蛋白酶木霉属(如里氏木霉(Trichoderma reesei))α淀粉酶。在英国申请号101 1513.7(将其通过引用并入本文)和PCT/IB2011/053018(将其通过引用并入本文)中教导了一种合适的抗胃蛋白酶α-淀粉酶。

在一个实施例中，用于在本发明中使用的淀粉酶可以是表13中引用的一种或多种商业产品中的一种或多种淀粉酶。

表13：代表性商业淀粉酶

应当理解，一个淀粉酶单位(AU)是在pH 8.0和40℃下，每分钟从非还原末端糖被化学封闭的对硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)释放(在过量α-葡糖苷酶的存在下)0.2μmol的糖苷键(表示为对硝基苯酚当量)的酶的量。(这在本文中可以称为确定1AU的测定法)。

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮(例如本文描述的用于提高蛋白酶生物功效的那些中的任一种)和淀粉酶。在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮(例如本文描述的用于提高蛋白酶生物功效的那些中的任一种)、木聚糖酶和淀粉酶。在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000、10000-12500、12500-15000、15000-17500、17500-20000和大于20000的淀粉酶单位/g饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，该含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-1000和大于1000的淀粉酶单位/kg饲料添加剂组合物、饲料或日粮。

4.植酸酶

在一个实施例中，本文提供了包含本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中的任一种和一种或多种植酸酶的组合物。用于在本发明中使用的植酸酶可以分类为6-植酸酶(分类为E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(分类为E.C.3.1.3.8)。在一个实施例中，用于在本发明中使用的植酸酶可以是下表14中的一种或多种商业产品中的一种或多种植酸酶：

表14：代表性商业植酸酶

在一个实施例中，植酸酶是柠檬酸杆菌属(Citrobacter)植酸酶，该柠檬酸杆菌属植酸酶衍生自例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)，优选地，例如如在WO 2006/038062(通过引用并入本文)和WO 2006/038128(通过引用并入本文)中公开的弗氏柠檬酸杆菌NCIMB 41247及其变体，如在WO 2004/085638中公开的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)YH-15，如在WO 2006/037328(通过引用并入本文)中公开的布氏柠檬酸杆菌ATCC51113，以及例如如在WO 2007/112739(通过引用并入本文)和WO 2011/117396(通过引用并入本文)中公开的其变体；无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)，优选地，如在WO 2006037327(通过引用并入本文)中公开的无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC 25405或无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC 25407；吉伦氏柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii)，优选地，如在WO2006037327(通过引用并入本文)中公开的吉伦氏柠檬酸杆菌DSM 13694；或中间柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedius)、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、啮齿类柠檬酸杆菌(Citrobacter murliniae)、鼠类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)、沃克曼氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)；柠檬酸杆菌属物种多肽或其变体。

在一些实施例中，植酸酶是以丹尼斯科公司Phyzyme XP^TM的名称销售的大肠杆菌(E.coli)植酸酶。替代性地，植酸酶可以是布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶，例如乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)植酸酶，例如，在WO 2006/043178、WO 2008/097619、WO2009/129489、WO 2008/092901、PCT/US2009/41011或PCT/IB2010/051804中教导的植酸酶，将所有这些文献通过引用并入本文。在又另一实施例中，植酸酶可以是WO 2020/106796中描述的植酸酶，将其通过引用以其全文并入本文。

在一个实施例中，植酸酶可以是来自哈夫尼亚菌属(Hafnia)(例如来自蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei))的植酸酶，如US 2008263688中教导的一种或多种植酸酶，将该文献通过引用并入本文。在一个实施例中，植酸酶可以是来自曲霉属(例如来自米曲霉(Apergillus orzyae))的植酸酶。在一个实施例中，植酸酶可以是来自青霉属(例如来自绳状青霉(Penicillium funiculosum))的植酸酶。

优选地，植酸酶以约200FTU/kg至约1000FTU/kg饲料、更优选地约300FTU/kg饲料至约750FTU/kg饲料、更优选地约400FTU/kg饲料至约500FTU/kg饲料的范围存在于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中。在一个实施例中，植酸酶以超过约200FTU/kg饲料、合适地超过约300FTU/kg饲料、合适地超过约400FTU/kg饲料存在于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中。在一个实施例中，植酸酶以少于约1000FTU/kg饲料、合适地少于约750FTU/kg饲料存在于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中。优选地，植酸酶以如下范围存在于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中：约40FTU/g至约40,000FTU/g组合物、更优选地约80FTU/g组合物至约20,000FTU/g组合物、以及甚至更优选地约100FTU/g组合物至约10,000FTU/g组合物、以及甚至更优选地约200FTU/g组合物至约10,000FTU/g组合物。在一个实施例中，植酸酶以超过约40FTU/g组合物、合适地超过约60FTU/g组合物、合适地超过约100FTU/g组合物、合适地超过约150FTU/g组合物、合适地超过约200FTU/g组合物存在于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中。在一个实施例中，植酸酶以少于约40,000FTU/g组合物、合适地少于约20,000FTU/g组合物、合适地少于约15,000FTU/g组合物、合适地少于约10,000FTU/g组合物存在于本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中。在一些实施例中，植酸酶的剂量率包含1000-150000FTU/g饲料添加剂组合物、和100-10000FTU/kg饲料和日粮。

应当理解，如本文所用，1FTU(植酸酶单位)定义为在ISO 2009植酸酶测定法(用于确定植酸酶活性的标准测定法)中定义的反应条件下，在一分钟内从底物释放1μmol无机正磷酸盐所需的酶量，并且1FTU可在国际标准ISO/DIS 30024:1-17,2009中找到。在一个实施例中，使用上述E.C.分类法对酶进行分类，并且E.C.分类法指定当在本文所教导的确定1FTU的测定法中测试时具有该活性的酶。

在一个实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮和木聚糖酶。在仍另一实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮和淀粉酶。在仍另一实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮和植酸酶。在仍另一实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮，以及木聚糖酶和淀粉酶。在仍另一实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮，以及木聚糖酶和植酸酶。在仍另一实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮，以及淀粉酶和植酸酶。在又另一实施例中，本公开涉及本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮，以及淀粉酶、木聚糖酶和植酸酶。

C.DFM配制品

另外地，本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮中的任一种可进一步结合一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或一种或多种DFM的发酵物配制。如本文所述，DFM可包含来自以下的一个或多个属的微生物：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属和巨球菌属、及其组合。

在一个实施例中，该DFM包含选自以下芽孢杆菌属物种的一种或多种细菌菌株：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和解淀粉芽孢杆菌。

如本文所用，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已被重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(现在为“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的生物体。在压力环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，尽管该特性也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧气芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

在另一方面，本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮可进一步与以下乳球菌属物种组合：乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)和乳酸乳球菌、及其组合。

本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮可进一步与以下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)、及其任何组合。

在仍另一方面，本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮可进一步与以下双歧杆菌属物种组合：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、及其任何组合。

替代性地，本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮可以与WO2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中含有的微生物组合，并总结如下：枯草芽孢杆菌菌株2084登录号NRRLB-50013、枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104、和枯草芽孢杆菌菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507(来自Enviva(以前称为/>)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自/>)；枯草芽孢杆菌菌株PB6(来自/>)；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌属NCIMB 10415(SF68)(来自/>)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自/>和/>)；地衣芽孢杆菌(来自/>)；肠球菌属和片球菌属(来自Poultry/>)；乳杆菌属、双歧杆菌属和/或肠球菌属(来自)；枯草芽孢杆菌菌株QST 713(来自/>)；解淀粉芽孢杆菌CECT-5940(来自/>和/>Plus)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)SF68(来自)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自/>)；乳酸菌7屎肠球菌(来自/>)；芽孢杆菌属菌株(来自/>)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(来自/>)；肠球菌属(来自Biomin/>)；乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、肠球菌属、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)(来自Biomin/>)；香肠乳杆菌(来自/>)；肠球菌属(来自Oralin/>)；肠球菌属(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM 1103(来自Probios-pioneer/>)；鼠李糖乳杆菌和香肠乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌(来自/>)；肠球菌属(来自/>)；酿酒酵母(来自Levucell SB/>)；酿酒酵母(来自Levucell SC 0和/>ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自/>(以前为/>))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自SC47)；丁酸梭菌(来自/>)；肠球菌属(来自Fecinor和Fecinor)；酿酒酵母NCYC R-625(来自/>)；酿酒酵母(来自/>)；肠球菌属和鼠李糖乳杆菌(来自/>)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自/>)；蜡样芽孢杆菌(来自/>)；蜡样芽孢杆菌东洋变体(Bacillus cereusvar.toyoi)NCIMB 40112/CNCM I-1012(来自/>)，或其他DFM，如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自/>YC)和枯草芽孢杆菌(来自/>)。

本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物、饲料或日粮可以与可商购自丹尼斯科公司的PRO组合。Enviva/>是芽孢杆菌属菌株2084登录号NRRL B-50013、芽孢杆菌属菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104和芽孢杆菌属菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469B中所教导的-通过引用并入本文)。

优选地，本文所述的另外的DFM包含通常被认为是安全(GRAS)并且优选地经GRAS批准的微生物。

本领域普通技术人员将很容易意识到来自本文所述属内的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物食用。

D.饲料添加剂组合物

在一个实施例中，本文提供了用于添加到本文公开的饲料或日粮(如特征为以下中的一个或多个的那些饲料或日粮：酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；小于1mm的尺寸的大部分颗粒；和/或低缓冲容量)中的任一种的含蛋白酶的饲料添加剂组合物以及任选地一种或多种外源性饲料酶和/或DFM。在一个实施例中，能以任何合适的方式配制饲料添加剂组合物，以确保配制品包含有活力的DFM和任选地活性酶。

在一个实施例中，含蛋白酶的饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其可替代物的形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、胚珠剂、药丸、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。

在另一实施例中，该含蛋白酶的饲料添加剂组合物能以固体形式使用。在一个实施例中，该固体形式是丸粒形式。固体形式的饲料添加剂组合物还可以含有以下中的一种或多种：赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，如淀粉(优选玉米、土豆或木薯淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒黏合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和***树胶；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石可被包括。

用于制备这些形式的营养上可接受的载剂的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、黏性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

在一个实施例中，将含蛋白酶的饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968(称为TPT颗粒)或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述(将每篇文献通过引用并入本文)。

在一个实施例中，可以将含蛋白酶的饲料添加剂组合物配制成包含以下的颗粒饲料组合物：包含蛋白酶以及任选地一种或多种外源性饲料酶、一种或多种DFM的活性剂和至少一种涂层。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留活性。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留选自由以下组成的组的活性水平：50％-60％活性、60％-70％活性、70％-80％活性、80％-85％活性、85％-90％活性、和90％-95％活性。

在另一实施例中，颗粒可以含有一个涂层。涂层可包含构成颗粒的至少55％w/w的水分水合材料。在另一实施例中，颗粒可以含有两个涂层。这两个涂层可以是水分水合涂层和防潮层涂层。在一些实施例中，该水分水合涂层可为颗粒的25％至60％w/w并且该防潮层涂层可为颗粒的2％至15％w/w。水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且防潮层涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

在又另一实施例中，颗粒可使用饲料制丸方法产生并且该饲料预处理方法可在70℃与95℃之间(如在85℃与95℃之间)进行长达若干分钟。在另一实施例中，该颗粒可使用蒸汽加热制丸方法产生，该方法可在85℃与95℃之间进行长达若干分钟。

在一个实施例中，该颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮层涂层并且水分水合材料可为无机盐。水分水合涂层可为颗粒的25％至45％w/w并且防潮层涂层可为颗粒的2％至20％w/w。

在一个实施例中，活性剂(例如蛋白酶)在选自以下中的一种或多种的条件后保留活性：(a)饲料制丸方法；(b)蒸汽加热饲料预处理方法；(c)储存；(d)作为未制丸混合物中的成分储存；和(e)作为包含至少一种选自以下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱、和导致酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。

在一些实施例中，该含蛋白酶的饲料添加剂组合物可以使用稀释剂(如淀粉粉末、石灰石、麦麸、玉米芯等)稀释。在一个实施例中，一种或多种DFM和这些酶可以处于适合食用的液体配制品中，优选地，这样的液体食用品含有以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨糖醇和/或甘油。在另一实施例中，可以通过将一种或多种酶施加(例如喷雾)到载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，该含蛋白酶的饲料添加剂组合物可被配制成预混物。仅举例而言，该预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一个实施例中，含蛋白酶的饲料添加剂组合物和任选的外源性饲料酶和/或一种或多种DFM可用至少一种生理上可接受的载剂配制，该载剂选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

在另一实施例中，该含蛋白酶的饲料添加剂组合物可以作为水性悬浮液和/或酏剂递送。可将该饲料添加剂组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳化剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(如水、丙二醇和甘油)进行组合，及其组合。

E.喂养料

在另一实施例中，本文提供了可用作饲料或用于制备饲料的含蛋白酶的饲料添加剂组合物，该饲料的特征为以下中的一个或多个：酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕内容物；含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕内容物；小于1mm的尺寸的大部分颗粒；和/或低缓冲容量。饲料可以呈溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。当用作饲料或用于制备饲料(如功能性饲料)时，该饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载剂、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。

在一个实施例中，将本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。在一个实施例中，该饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可以将本文公开的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分、或复合饲料的预混物混合，或将其混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。

在一个实施例中，秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属(brassicas)、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉油菜)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自天然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树-干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养物的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的精料或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充物。用于复合饲料的主要成分是饲料谷物，这些饲料谷物包括玉米、大豆、高粱、燕麦和大麦。

在一个实施例中，如本文公开的喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、具溶解物的干酒糟(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；获得自植物和动物来源的油和脂肪；以及矿物质和维生素。

在又另一实施例中，喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦，大麦，黑麦，燕麦，来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、具溶解物的干酒糟(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质来源也可视为高纤维：获得自来源如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的蛋白质

在仍另一实施例中，该饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牛用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、干椰肉、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新割的草和其他饲草植物；肉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；寡糖；糖渍饲草植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压榨、碾磨等制备；发芽谷物及豆科植物；酵母提取物。

在一个实施例中，将本文公开的含蛋白酶的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。替代性地，饲料添加剂组合物可包括在喂养料的乳液或原始成分中。在另一实施例中，使饲料添加剂组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。在仍另一实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物可以与受控量的耐氧埃氏巨型球菌DFM(M.esldenii)(和任选地一种或多种酵母菌株以及进一步任选地外源性酶)一起应用、散布、涂覆和/或浸渍于产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。

在又另一实施例中，该含蛋白酶的饲料添加剂组合物和任选的酶和/或DFM可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。

III.方法

A.用于改善含蛋白酶的饲料添加剂组合物的生物功效的方法

本文进一步提供了用于改善含蛋白酶的饲料添加剂组合物的生物功效的方法。该方法包括将含蛋白酶的饲料添加剂组合物添加到动物饲料或日粮中，该动物饲料或日粮的特征为以下中的一个或多个：酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；小于1mm的尺寸的大部分颗粒；和/或低缓冲容量。

在一些实施例中，该方法可采用酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg(如大于约57g/kg、58g/kg、59g/kg、60g/kg、61g/kg、62g/kg、63g/kg、64g/kg、65g/kg、66g/kg或更多)的豆粕。豆粕的ADF可根据本领域已知的任一方式(包括实例7中描述的方式)确定。在另外的实施例中，该方法使用含硫氨基酸含量小于约13g/kg(例如小于约12g/kg或小于约11g/kg)的豆粕。含硫氨基酸含量可根据本领域已知的任一方式(包括实例8中描述的方式)确定。

在一些实施例中，与不含有ADF含量大于约56g/kg和/或含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕的含蛋白酶的饲料或日粮的生物功效相比，该方法可导致含蛋白酶的饲料添加剂组合物中的蛋白酶的生物功效改善，如通过使动物性能改善大于约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％所表明。在一些实施例中，动物性能改善由参数确定，该参数可以包括但不限于增加的增重和/或降低的饲料转化率。

在该方法的一些实施例中，当大部分喂养料(例如至少50％或更多，如50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)具有小于约1mm(例如小于以下中的任一个：约950μm、900μm、850μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、500μm、450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm或更小，包括落入这些尺寸之间的所有值)的粒度时，含蛋白酶的饲料或日粮中的蛋白酶的生物功效得到改善。喂养料中的粒度和尺寸小于约1mm的粒度的百分比可通过本领域已知的任一方式(包括实例9中描述的方式)确定。

在一些实施例中，与不具有小于约1mm的粒度的含蛋白酶的饲料或日粮的生物功效相比，该方法可导致含蛋白酶的饲料添加剂组合物中的蛋白酶的生物功效改善，如通过使动物性能改善大于约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％所表明。在一些实施例中，动物性能改善由参数确定，该参数可以包括但不限于增加的增重和/或降低的饲料转化率。

当将含蛋白酶的饲料或日粮配制成具有低缓冲容量时，该饲料或日粮中的蛋白酶的生物功效也可得到改善。在一些实施例中，在将适度的酸添加到动物饲料的悬浮液后的稳定化pH小于约4.2(如小于约4.1、4、3.9、3.8、3.7、3.6或3.5)时，饲料或日粮具有低缓冲容量。在另一实施例中，在将0.3mol/kg HCl添加到10％的动物饲料悬浮液后的稳定化pH小于4.2(如小于约4.1、4、3.9、3.8、3.7、3.6或3.5)时，饲料或日粮具有低缓冲容量。在仍另外的实施例中，当添加低于约0.44mol/kg(如低于约0.43mol/kg、0.42mol/kg、0.41mol/kg、0.4mol/kg、0.39mol/kg、0.38mol/kg、0.37mol/kg、0.36mol/kg或0.35mol/kg)的HCl以使pH值达到4.0时，饲料或日粮具有低缓冲容量。缓冲容量可通过本领域已知的任一方式(包括实例10中描述的方法)确定。

在一些实施例中，与不具有低缓冲容量的含蛋白酶的饲料或日粮的生物功效相比，该方法可导致含蛋白酶的饲料添加剂组合物中的蛋白酶的生物功效改善，如通过使动物性能改善大于约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％所表明。在一些实施例中，动物性能改善由参数确定，该参数可以包括但不限于增加的增重和/或降低的饲料转化率。

B.用于改善动物性能的方法

本文进一步提供了用于提高动物的性能指标的方法。在另一实施例中，本公开涉及提高单胃动物的性能指标的方法。在仍另一实施例中，本公开涉及提高家禽(包括但不限于肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡、鸠鸽科或水禽)的性能指标的方法。在仍另一实施例中，本公开涉及提高猪、兔、小牛、山羊或绵羊的性能指标的方法。

本文提供了方法，其包括向动物施用组合物，该组合物包含经配制以提高蛋白酶的生物功效的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的一种或多种，例如本文公开的包含蛋白酶或含蛋白酶的饲料添加剂组合物和以下中的一种或多种的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的任一种：酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；和/或含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；和/或(c)该饲料或日粮中的大部分颗粒的尺寸小于1mm；和/或(d)该日粮具有低缓冲容量。在仍另一实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向动物施用有效量的经配制以提高蛋白酶的生物功效的饲料、饲料添加剂组合物或日粮(例如本文公开的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的任一种)以提高动物性能。该有效量能以一剂或多剂向动物施用。

在另一实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向动物(例如单胃动物，如家禽或猪)施用有效量的经配制以提高蛋白酶的生物功效的含蛋白酶的饲料、饲料添加剂组合物或日粮(例如本文公开的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的任一种)以提高平均日饲料摄入量。在一些实施例中，相对于未施用经配制以提高蛋白酶的生物功效的饲料、饲料添加剂组合物或日粮的动物，该平均日饲料摄入量增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。

在另一实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向动物(例如单胃动物，如家禽或猪)施用有效量的经配制以提高蛋白酶的生物功效的含蛋白酶的饲料、饲料添加剂组合物或日粮(例如本文公开的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的任一种)以提高平均日增重。在一些实施例中，相对于未施用经配制以提高蛋白酶的生物功效的饲料、饲料添加剂组合物或日粮的动物，该平均日增重增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。

在另一实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向动物(例如单胃动物，如家禽或猪)施用有效量的经配制以提高蛋白酶的生物功效的含蛋白酶的饲料、饲料添加剂组合物或日粮(例如本文公开的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的任一种)以提高总增重。在一些实施例中，相对于未施用经配制以提高蛋白酶的生物功效的饲料、饲料添加剂组合物或日粮的动物，总增重增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。

在另一实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向动物(例如单胃动物，如家禽或猪)施用有效量的经配制以提高蛋白酶的生物功效的含蛋白酶的饲料、饲料添加剂组合物或日粮(例如本文公开的饲料、饲料添加剂组合物或日粮中的任一种)以降低饲料转化率(FCR)。在一些实施例中，相对于未施用经配制以提高蛋白酶的生物功效的饲料、饲料添加剂组合物或日粮的动物，FCR降低约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。

通过参照以下实例可以进一步理解本发明，这些实例是为了说明而提供的，而不是为了限制。

实例

实例1：体内肉鸡试验1

进行实验来评价含蛋白酶的饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能的生物功效。实验程序符合福利指南，并获得了该国相关动物护理和使用委员会(Animal Care and UseCommittee)的批准。

从商业孵化场获得雄性日龄肉仔鸡(Cobb 500)。将鸡分成21只禽的组，并分配到具有统一围栏重量的落地围栏中。将两种膳食处理随机分配到9组中的每一组。将围栏装在环境受控的房间内，温度适应禽的年龄，并且允许这些禽自由获得日粮和水。

使用了两期饲喂方案(开食和育肥)(表1a)。分别从第1天至第21天和第21天至第42天提供开食和育肥日粮。这些日粮经配制以分别含有2786kcal/kg的代谢能(ME)和19.7％粗蛋白、以及2870kcal/kg ME和17.2％粗蛋白。对于每种日粮，使用从CVB饲料表2018(荷兰动物饲料链联合会(Federatie Nederlandse Diervoederketen，FND)，worldwide web.cvbdiervoeding.nl/bestand/10501/cvb-feed-table-2018-edition-2.pdf.ashx)获得的成分比值来计算肉鸡的代谢能和粗蛋白含量。

表1a：使用的基础日粮的组成

*含有825FTU/kg的PHY

对于每种基础日粮，制备两种实验日粮：构成对照的未补充日粮和补充有4400U/kg的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶)(EC 3.4.21.62)的日粮，该枯草杆菌蛋白酶作为酶产品的一部分而被包括。

在第21天和第42天记录作为围栏重量测量的体重(BW)和每个围栏测量的饲料摄入量(FI)。每日记录死亡率和死禽的重量。体重增重(BWG)计算为在分开的天BW除以禽数之间的差异。饲料转化率(FCR)是通过将总饲料摄入量除以活禽加死禽的增重来计算的。

在育肥期，关于粒度和缓冲容量表征试验1所用的日粮。该日粮具有一小部分(<40％)尺寸超过1mm的颗粒。在添加0.3mol/kg的HCl后测量的pH值高于4.2，并且按照实例10中的程序，需要总共超过0.44mol/kg的HCl来达到4.0的pH值。

表1b总结了从第1天至第42天的整个实验时间段的生长性能的结果。与对照日粮相比，蛋白酶的补充未有效改善体重增重或饲料转化率。

表1b：计算的生长性能数据。

实例2：体内肉鸡试验2

进行实验来评价含蛋白酶的饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能的生物功效。实验程序符合福利指南，并获得了该国相关动物护理和使用委员会的批准。

从商业孵化场获得雄性日龄肉仔鸡(Ross 308)。将鸡分成10只禽的组，并分配到具有统一围栏重量的落地围栏中。将两种膳食处理随机分配到9组中的每一组。将围栏装在环境受控的房间内，温度适应禽的年龄，并且允许这些禽自由获得日粮和水。

使用了两期饲喂方案(开食和育肥)(表2a)。分别从第1天至第21天和第21天至第42天提供开食和育肥日粮。这些日粮经配制以分别含有2786kcal/kg的代谢能(ME)和19.7％粗蛋白、以及2870kcal/kg ME和17.2％粗蛋白。对于每种日粮，使用从CVB饲料表2018(荷兰动物饲料链联合会(FND)，world wide web.cvbdiervoeding.nl/bestand/10501/cvb-feed-table-2018-edition-2.pdf.ashx)获得的成分比值来计算肉鸡的代谢能和粗蛋白含量。

表2a：使用的基础日粮的组成。

	开食	育肥
			玉米	61.1	66.1
豆粕46％	28.4	19.4
			全脂大豆(烘烤)	1.94	5.00
麦麸	3.50	5.20
			大豆油	1.00	1.00
L-赖氨酸	0.20	0.23
			DL-甲硫氨酸	0.27	0.21
L-苏氨酸	0.03	0.03
			磷酸氢钙	0.96	0.45
碳酸钙	1.35	1.18
			盐	0.40	0.40
预混物	0.30	0.30
			酶产品*	0.01	0.01
填料空间	0.50	0.50

含有825FTU/kg的PHY

对于每种基础日粮，制备两种实验日粮：构成对照的未补充日粮和补充有4000U/kg的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶)(EC 3.4.21.62)的日粮，该枯草杆菌蛋白酶作为酶产品的一部分而被包括。

在第21天和第42天记录作为围栏重量测量的体重(BW)和每个围栏测量的饲料摄入量(FI)。每日记录死亡率和死禽的重量。体重增重(BWG)计算为在分开的天的BW除以禽数之间的差异。饲料转化率(FCR)是通过将总饲料摄入量除以活禽加死禽的增重来计算的。

在育肥期，关于粒度和缓冲容量表征试验1所用的日粮。该日粮具有一小部分(<40％)尺寸超过1mm的颗粒。在添加0.3mol/kg的HCl后测量的pH值高于4.2，并且按照实例10中的程序，需要总共超过0.44mol/kg的HCl来达到4.0的pH值。

表2b总结了从第1天至第42天的整个实验时间段的生长性能的结果。与对照日粮相比，该蛋白酶的补充导致体重增重和饲料转化率两者的改善>3％。

表2b：计算的生长性能数据。

实例3：体内肉鸡试验3

进行实验来评价含蛋白酶的饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能的生物功效。实验程序符合福利指南，并获得了该国相关动物护理和使用委员会的批准。

从商业孵化场获得雄性日龄肉仔鸡(Cobb 500)。将鸡分成16只禽的组，并分配到具有统一围栏重量的落地围栏中。将两种膳食处理随机分配到10组中的每一组。将围栏装在环境受控的房间内，温度适应禽的年龄，并且允许这些禽自由获得日粮和水。

使用了三期饲喂方案(开食、生长和育肥)(表3a)。分别从第1天至第10天、第10-25天、和第25天至第42天提供开食、生长和育肥日粮。这些日粮经配制以含有2812kcal/kg的代谢能(ME)和20.3％粗蛋白、2907kcal/kg ME和18.2％粗蛋白、以及2958kcal/kg ME和16.4％粗蛋白，分别用于三期。对于每种日粮，使用从CVB饲料表2018(荷兰动物饲料链联合会(FND)，world wide web.cvbdiervoeding.nl/bestand/10501/cvb-feed-table-2018-edition-2.pdf.ashx)获得的成分比值来计算肉鸡的代谢能和粗蛋白含量。

表3a：使用的基础日粮的组成。

	开食	生长	育肥
				玉米	65.1	70.6	74.9
豆粕48％	30.1	25.0	20.9
				大豆油	0.40	0.74	0.78
L-赖氨酸	0.34	0.30	0.27
				DL-甲硫氨酸	0.34	0.28	0.24
L-苏氨酸	0.10	0.08	0.06
				磷酸氢钙	1.24	0.98	0.84
碳酸钙	1.28	1.07	1.05
				盐	0.52	0.35	0.35
预混物	0.50	0.50	0.50
				酶产品*	0.06	0.06	0.06

*含有825FTU/kg的PHY

对于每种基础日粮，制备两种实验日粮：构成对照的未补充日粮和补充有3000U/kg的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶)(EC 3.4.21.62)的日粮，该枯草杆菌蛋白酶作为酶产品的一部分而被包括。

在第10天、第25天和第42天记录作为围栏重量测量的体重(BW)和每个围栏测量的饲料摄入量(FI)。每日记录死亡率和死禽的重量。体重增重(BWG)计算为在分开的天的BW除以禽数之间的差异。饲料转化率(FCR)是通过将总饲料摄入量除以活禽加死禽的增重来计算的。

关于酸性洗涤纤维(ADF)和含硫氨基酸的含量表征豆粕样品。测量的ADF含量低于56g/kg，并且含硫氨基酸的含量高于13g/kg。

在育肥期，关于粒度和缓冲容量表征试验3所用的日粮。尺寸超过1mm的颗粒构成超过40％的总样品重量。在添加0.3mol/kg的HCl后测量的pH值高于4.2，并且按照实例10中的程序，需要添加少量的HCl(<0.44mol/kg)来达到4.0的pH值。

表3b总结了从第1天至第42天的整个实验时间段的生长性能的结果。与对照日粮相比，蛋白酶的补充未有效改善体重增重或饲料转化率

表3b：计算的生长性能数据

实例4：体内肉鸡试验4

进行实验来评价含蛋白酶的饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能的生物功效。实验程序符合福利指南，并获得了该国相关动物护理和使用委员会的批准。

从商业孵化场获得雄性日龄肉仔鸡(Cobb 500)。将鸡分成20只禽的组，并分配到具有统一围栏重量的落地围栏中。将两种膳食处理随机分配到10组中的每一组。将围栏装在环境受控的房间内，温度适应禽的年龄，并且允许这些禽自由获得日粮和水。

使用了两期饲喂方案(开食和育肥)(表4a)。分别从第1天至第21天和第21天至第42天提供开食和育肥日粮。这些日粮经配制以分别含有2839kcal/kg的代谢能(ME)和21.4％粗蛋白、以及2992kcal/kg ME和18.0％粗蛋白。对于每种日粮，使用从CVB饲料表2018(荷兰动物饲料链联合会(FND)，world wide web.cvbdiervoeding.nl/bestand/10501/cvb-feed-table-2018-edition-2.pdf.ashx)获得的成分比值来计算肉鸡的代谢能和粗蛋白含量。将从INRA-CIRAD-AFZ饲料表中获得的AMEn肉鸡的值用于CVB饲料表2018中列出的没有用于肉鸡代谢能的成分比值的成分。

表4a：使用的基础日粮的组成。

*含有750FTU/kg的PHY

对于每种基础日粮，制备两种实验日粮：构成对照的未补充日粮和补充有4000U/kg的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶)(EC 3.4.21.62)的日粮，该枯草杆菌蛋白酶作为酶产品的一部分而被包括。

在第21天和第42天记录作为围栏重量测量的体重(BW)和每个围栏测量的饲料摄入量(FI)。每日记录死亡率和死禽的重量。体重增重(BWG)计算为在分开的天的BW除以禽数之间的差异。饲料转化率(FCR)是通过将总饲料摄入量除以活禽加死禽的增重来计算的。

关于酸性洗涤纤维(ADF)和含硫氨基酸的含量表征豆粕样品。该豆粕样品具有相对高的ADF含量(>56g/kg)和低含硫氨基酸含量(<13g/kg)。

在育肥期，关于粒度和缓冲容量表征试验4所用的日粮。该日粮具有一小部分尺寸超过1mm的颗粒(<40％的总样品重量)。在添加0.3mol/kg的HCl后测量的pH值高于4.2，然而按照实例10中的程序，需要添加少量的HCl(<0.44mol/kg)来达到4.0的pH值。

表4b总结了从第1天至第42天的整个实验时间段的生长性能的结果。与对照日粮相比，该蛋白酶的补充导致体重增重的改善>3％，其中饲料转化率没有变化。

表4b：计算的生长性能数据。

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实例5：体内肉鸡试验5

进行实验来评价含蛋白酶的饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能的生物功效。实验程序符合福利指南，并获得了该国相关动物护理和使用委员会的批准。

从商业孵化场获得雄性日龄肉仔鸡(Ross 308)。将鸡分成24只禽的组，并分配到具有统一围栏重量的落地围栏中。将两种膳食处理随机分配到8组中的每一组。将围栏装在环境受控的房间内，温度适应禽的年龄，并且允许这些禽自由获得日粮和水。

使用了三期饲喂方案(开食、生长和育肥)(表5a)。分别从第1天至第10天、第10-21天、和第21天至第42天提供开食、生长和育肥日粮。这些日粮经配制以含有2837kcal/kg的代谢能(ME)和22.1％粗蛋白、2943kcal/kg ME和20.6％粗蛋白、以及2999kcal/kg ME和18.4％粗蛋白，分别用于三期。对于每种日粮，使用从CVB饲料表2018(荷兰动物饲料链联合会(FND)，world wide web.cvbdiervoeding.nl/bestand/10501/cvb-feed-table-2018-edition-2.pdf.ashx)获得的成分比值来计算肉鸡的代谢能和粗蛋白含量。

表5a：使用的基础日粮的组成

*含有750FTU/kg的PHY

对于每种基础日粮，制备两种实验日粮：构成对照的未补充日粮和补充有4000U/kg的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶)(EC 3.4.21.62)的日粮，该枯草杆菌蛋白酶作为酶产品的一部分而被包括。

在第10天、第21天和第42天记录作为围栏重量测量的体重(BW)和每个围栏测量的饲料摄入量(FI)。每日记录死亡率和死禽的重量。体重增重(BWG)计算为在分开的天的BW除以禽数之间的差异。饲料转化率(FCR)是通过将总饲料摄入量除以活禽加死禽的增重来计算的。

关于酸性洗涤纤维(ADF)和含硫氨基酸的含量表征豆粕样品。该豆粕样品具有相对高的ADF含量(>56g/kg)和低含硫氨基酸含量(<13g/kg)。

在育肥期，关于粒度和缓冲容量表征试验5所用的日粮。该日粮具有一小部分尺寸超过1mm的颗粒(<40％的总样品重量)。在添加0.3mol/kg的HCl后测量的pH值低(<4.2)，并且按照实例10中的程序，需要添加少量的HCl(<0.44mol/kg)来达到4.0的pH值。

表5b总结了从第1天至第42天的整个实验时间段的生长性能的结果。与对照日粮相比，该蛋白酶的补充分别导致体重增重改善2.0％，以及饲料转化率改善>3％。

表5b：计算的生长性能数据。

实例6：体内肉鸡试验6

进行实验来评价含蛋白酶的饲料添加剂对肉仔鸡的生长性能的生物功效。实验程序符合福利指南，并获得了该国相关动物护理和使用委员会的批准。

从商业孵化场获得雄性日龄肉仔鸡(Ross 308)。将鸡分成23只禽的组，并分配到具有统一围栏重量的落地围栏中。将两种膳食处理随机分配到8组中的每一组。将围栏装在环境受控的房间内，温度适应禽的年龄，并且允许这些禽自由获得日粮和水。

使用了两期饲喂方案(开食和育肥)(表6a)。分别从第1天至第21天和第21天至第42天提供开食和育肥日粮。这些日粮经配制以分别含有2786kcal/kg的代谢能(ME)和19.7％粗蛋白、以及2870kcal/kg ME和17.2％粗蛋白。对于每种日粮，使用从CVB饲料表2018(荷兰动物饲料链联合会(FND)，world wide web.cvbdiervoeding.nl/bestand/10501/cvb-feed-table-2018-edition-2.pdf.ashx)获得的成分比值来计算肉鸡的代谢能和粗蛋白含量。

表6a：使用的基础日粮的组成。

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*含有750FTU/kg的PHY

对于每种基础日粮，制备两种实验日粮：构成对照的未补充日粮和补充有4000U/kg的来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶)(EC 3.4.21.62)的日粮，该枯草杆菌蛋白酶作为酶产品的一部分而被包括。

在第21天和第42天记录作为围栏重量测量的体重(BW)和每个围栏测量的饲料摄入量(FI)。每日记录死亡率和死禽的重量。体重增重(BWG)计算为在分开的天的BW除以禽数之间的差异。饲料转化率(FCR)是通过将总饲料摄入量除以活禽加死禽的增重来计算的。

关于酸性洗涤纤维(ADF)和含硫氨基酸的含量表征豆粕样品。该豆粕样品具有相对高的ADF含量(>56g/kg)和低含硫氨基酸含量(<13g/kg)。

在育肥期，关于粒度和缓冲容量表征试验6所用的日粮。该日粮具有一小部分尺寸超过1mm的颗粒(<40％的总样品重量)。在添加0.3mol/kg的HCl后测量的pH值低(<4.2)，并且按照实例10中的程序，需要添加少量的HCl(<0.44mol/kg)来达到4.0的pH值。

表6b总结了从第1天至第42天的整个实验时间段的生长性能的结果。与对照日粮相比，该蛋白酶的补充导致体重增重的改善>3％，其中饲料转化率没有变化

表6b：计算的生长性能数据。

实例7：膳食酸性洗涤纤维含量

对于饲料配制品中使用的豆粕，通过使用以下方法来测量酸性洗涤纤维(ADF)的含量：ISO 13906动物喂养料——酸性洗涤纤维(ADF)含量和酸性洗涤木质素(ADL)含量的确定。表7中示出了试验3-6所使用的豆粕的测量值。

表7：试验3-6中使用的豆粕的ADF含量

与试验3使用的豆粕样品(其ADF含量低于56g/kg)相比，试验4-6使用的豆粕样品具有相对高的ADF含量(>56g/kg)。

实例8：胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸定量

对于饲料配制品中使用的豆粕，使用以下方法来测量含硫氨基酸的含量：ISO13903动物喂养料——氨基酸含量的确定。

表8中示出了试验3-6所使用的豆粕的测量值。结果以胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的总和给出。

表8：试验3-6中使用的豆粕的胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸含量

与试验3使用的豆粕样品(其含硫氨基酸的含量高于13g/kg)相比，试验4-6使用的豆粕样品具有低的含硫氨基酸含量(<13g/kg)。

实例9：根据粒度对日粮分级

通过记录50ml固体样品的精确重量，然后手动通过1mm网格对样品进行筛分来确定粒度大于1mm的样品部分。记录保留的颗粒的精确重量，并且将该部分计算为保留的颗粒重量与全样品重量之间的比率。

表9中示出了试验1-6育肥期中直到第42天使用的日粮的测量值。

表9：试验1-6的粒度

与试验2和试验3使用的日粮(其中尺寸超过1mm的颗粒构成超过40％的总重)相比，试验1和试验4-6使用的日粮具有一小部分(<40％)尺寸超过1mm的颗粒。

实例10：日粮的缓冲容量测量

将5g的日粮样品(喂养料)和50ml的去离子水混合，并搅拌30分钟。添加1.5ml的1MHCl。再搅拌30分钟后，记录悬浮液的稳定化pH值。

使用滴定仪(775Dosimat，万通公司(Metrohm))添加另外的1MHCl，直到pH达到4.0，并保持在pH 4下搅拌30分钟。记录1M HCl的总体积(以ml计)，并将其转化为添加的molHCl/kg喂养料。

表10中示出了试验1-6育肥期中直到第42天使用的日粮的测量值。

表10：试验1-6的日粮的缓冲容量测量值。

对于试验1、3和4使用的总日粮，将相同量的酸(1.5ml 1M HCl)应用于样品测量的pH值高于4.2，而对于试验2、5和6使用的总日粮，测量的值较低(<4.2)。

需要向试验2-6添加少量的HCl(<0.44mol/kg)以达到4.0的pH值，而对于试验1使用的日粮，则需要添加超过0.44mol/kg的HCl。

序列

AQSVPYGVSQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLKVAGGASM VPSETNPFQDNNSHGTHVAG TVAALNNSIG VLGVAPSASL YAVKVLGADG SGQYSWIING IEWAIANNMD VINMSLGGPSGSAALKAAVD KAVASGVVVV AAAGNEGTSG SSSTVGYPGK YPSVIAVGAV DSSNQRASFS SVGPELDVMAPGVSIQSTLP GNKYGALNGT SMASPHVAGA AALILSKHPN WTNTQVRSSL ENTTTKLGDS FYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO:1)

序列表

<110> 杜邦营养生物科学公司（DuPont Nutrition Biosciences ApS）

<120> 用于动物健康的饲料组合物

<130> NB41830-WO-PCT

<150> US 63/092,847

<151> 2020-10-16

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 1

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

Claims (48)

1.一种用于改善含蛋白酶的饲料或日粮的生物功效的方法，所述方法包括向动物饲料中添加含蛋白酶的饲料添加剂组合物，所述动物饲料的特征为以下中的一个或多个：

(a)酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；

(b)含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；

(c)小于1mm的尺寸的大部分颗粒；和/或

(d)低缓冲容量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶80％同一。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述豆粕的ADF含量大于约58g/kg、60g/kg、62g/kg、64g/kg或66g/kg。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述豆粕的含硫氨基酸含量小于约12g/kg或11g/kg。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述动物饲料中至少约60％的颗粒的尺寸小于1mm。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在将0.3mol/kg HCl添加到10％的所述动物饲料的悬浮液后，稳定化的pH小于4.2。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将小于0.44mol/kg HCl添加到10％的所述动物饲料的悬浮液中，以使pH值达到4.0。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成的组的另外的酶。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或其发酵物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述DFM包含来自以下的一个或多个属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)或巨球菌属(Megasphaera)、及其组合。

12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述DFM包含来自以下的一个或多个物种的细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、肠球菌属物种(Enterococcus sp)、片球菌属物种(Pediococcus sp)、乳杆菌属物种(Lactobacillussp)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium sp)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、特恩丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalisssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivariu)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、丙酸杆菌属物种(Propionibacteria sp)、或其组合。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种精油。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述精油是百里香酚和/或肉桂醛。

15.一种用于为动物配制日粮的方法，所述方法包括将蛋白酶与以下中的一种或多种组合：

(a)酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；和/或

(b)含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；

其中，任选地，

(c)所述日粮中的大部分颗粒的尺寸小于1mm；和/或

(d)所述日粮具有低缓冲容量。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌属蛋白酶。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶80％同一。

18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述豆粕的ADF含量大于约58g/kg、60g/kg、62g/kg、64g/kg或66g/k。

19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述豆粕的含硫氨基酸含量小于约12g/kg或11g/kg。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述日粮中至少约60％的颗粒的尺寸小于1mm。

21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中在将0.3mol/kg HCl添加到10％的所述动物饲料的悬浮液后，稳定化的pH小于4.2。

22.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中将小于0.44mol/kg HCl添加到10％的所述动物饲料的悬浮液中，以使pH值达到4.0。

23.如权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述日粮进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成的组的另外的酶。

24.如权利要求15-23中任一项所述的方法，其中所述日粮进一步包含一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或其发酵物。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述DFM包含来自以下的一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属或巨球菌属、及其组合。

26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述DFM包含来自以下的一个或多个物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属物种、片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌、埃氏巨型球菌、丙酸杆菌属物种、或其组合。

27.如权利要求15-26中任一项所述的方法，其中所述日粮进一步包含一种或多种精油。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述精油是百里香酚和/或肉桂醛。

29.如权利要求15-28中任一项所述的方法，其中所述动物是单胃动物。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述动物是家禽(例如，肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡、鸠鸽科(columbidae)或水禽)、猪、兔、小牛、牛、山羊、绵羊、昆虫、伴侣动物(例如狗、猫)或鱼。

31.一种日粮，所述日粮通过如权利要求15-30中任一项所述的方法配制。

32.一种日粮，所述日粮包含：

(a)包含蛋白酶的饲料添加剂组合物；

以及(b)以下中的一种或多种：

(i)酸性洗涤纤维(ADF)含量大于约56g/kg的豆粕；和/或

(ii)含硫氨基酸含量小于约13g/kg的豆粕；

其中，任选地，

(iii)所述日粮中的大部分颗粒的尺寸小于1mm；和/或

(iv)所述日粮具有低缓冲容量。

33.如权利要求32所述的日粮，其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶或拟诺卡氏菌属蛋白酶。

34.如权利要求33所述的日粮，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶80％同一。

35.如权利要求32-34中任一项所述的日粮，其中所述豆粕的ADF含量大于约58g/kg、60g/kg、62g/kg、64g/kg或66g/kg。

36.如权利要求32-35中任一项所述的日粮，其中所述豆粕的含硫氨基酸含量小于约12g/kg或11g/kg。

37.如权利要求32-36中任一项所述的日粮，其中所述日粮中至少约60％的颗粒的尺寸小于1mm。

38.如权利要求32-37中任一项所述的日粮，其中在将0.3mol/kg HCl添加到10％的所述动物饲料的悬浮液后，稳定化的pH小于4.2。

39.如权利要求32-37中任一项所述的日粮，其中将小于0.44mol/kg HCl添加到10％的所述动物饲料的悬浮液中，以使pH值达到4.0。

40.如权利要求32-39中任一项所述的日粮，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶组成的组的另外的酶。

41.如权利要求32-40中任一项所述的日粮，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种直接饲喂微生物(DFM)或其发酵物。

42.如权利要求41所述的日粮，其中所述DFM包含来自以下的一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属或巨球菌属、及其组合。

43.如权利要求41或权利要求42所述的日粮，其中所述DFM包含来自以下的一个或多个物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌属物种、片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特恩丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌、埃氏巨型球菌、丙酸杆菌属物种、或其组合。

44.如权利要求32-43中任一项所述的日粮，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种精油。

45.如权利要求44所述的日粮，其中所述精油是百里香酚和/或肉桂醛。

46.一种用于改善饲料转化率(FCR)或用于增加动物的体重增重的方法，所述方法包括向所述动物施用如权利要求32-45中任一项所述的日粮。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述动物是单胃动物。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述动物是家禽(例如，肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡、鸠鸽科或水禽)、猪、兔、小牛、牛、山羊、绵羊、马、昆虫、伴侣动物(例如狗、猫)或鱼。