MX2011003178A - Mezclas de alfa-amilasa y metodos para usar esas mezclas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una mezcla de una alfa-amilasa, que incluye alfa-amilasa de B. stearothermophilus (AmyS) en donde el aminoácido en la posición S242 es sustituido y una alfa-amilasa de B. licheniformis. La invención también se refiere a procedimientos que usan las mezclas de alfa-amilasa para licuefacción y sacarificación de almidón, producción de etanol y producción de edulcorante.

Description

MEZCLAS DE ALFA-AMILASA Y METODOS PARA USAR ESAS MEZCLAS Campo de la Invención En la presente se describe una mezcla de una alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus y una alfa-amilasa de Bacillus lichenifor is. La mezcla de alfa-amilasa descrita en la presente es adecuada para numerosas aplicaciones tales como licuefacción y sacarificación de almidón, producción de etanol, y/o producción de edulcorante.

Antecedentes de la Invención Las alfa-amilasas (alfa-1 , 4 -glucan-4 -glucanohidrolasas , E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas, que catalizan la hidrólisis de almidón y otros 1,4-oligo- y polisacáridos glucosídicos lineales y ramificados.

Las amilasas se pueden usar comercialmente en las etapas iniciales (licuefacción) de procesamiento de almidón; en molienda de maíz en húmedo; en producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices de detergentes; en la industria textil para eliminación de apresto de almidón; en aplicaciones de horneado; en la industria de bebidas de fermentación; en campos de petróleo en procedimientos de barrenado; en eliminación de tinta de papel reciclado y en alimento para animales.

Las alfa-amilasas son aisladas de una amplia Ref. 218814 variedad de fuentes de bacterias, hongos, plantas y animales. Muchas a-amilasas industrialícente importantes son aisladas de Bacillus sp . , en parte debido a la capacidad generalmente alta de Bacillus para secretar amilasas en el medio de crecimiento. Además, existe la necesidad de mezclas de alfa-amilasas, o variantes de las mismas, que pueden capitalizar sobre las mejores propiedades de por lo menos dos alfa-amilasas de por lo menos dos cepas bacterianas.

Por ejemplo, las alfa-amilasas aisladas de B. stearothermophilus (AmyS) se han usado en aplicaciones de etanol como combustible debido a la propiedad de disminución rápida de viscosidad. Las plantas para etanol como combustible tienen 20-30 min de tiempo de pasta acuosa antes de que la pasta acuosa pase a través del paso de calentamiento directo y en esos 20-30 min la viscosidad tiene que ser descompuesta para fluir por la tubería sin problemas. Sin embargo, ciertas alfa-amilasas o variantes de las mismas no son termoestables , por lo que aunque disminuyen la viscosidad de una pasta acuosa con el tiempo, adolecen de pendiente de DE más baja y reducción de viscosidad más baja en licuefacción secundaria, en donde la pasta acuosa puede mantenerse a 85-90°C hasta por 90-120 min.

Por lo tanto, existe la necesidad en la industria de la identificación y optimización de amilasas y sus mezclas, útiles en varios procedimientos de producción, por ejemplo, procedimientos de licuefacción comerciales y procedimientos de producción de etanol.

Los agentes de licuefacción de almidón de baja viscosidad son útiles en el procedimiento de producción de etanol actual. Si se pudiera encontrar una forma de producir esos agentes de licuefacción de baja viscosidad como materiales de alimentación de fermentación mediante el uso de una mezcla optimizada de alfa-amilasas , o variantes de los mismos, esto representaría una contribución útil para la técnica. Además, si se pudiera encontrar una forma de tratar granos molidos enteros con una mezcla de alfa-amilasas , o variantes de la misma, de dos diferentes especies bacterianas para mejorar la licuefacción de almidón, esto también representaría una contribución útil a la técnica.

Un desafío adicional en la preparación de materiales de alimentación para fermentación es que las alfa-amilasas de B . stearothermophilus, por ejemplo, se ha encontrado que son menos efectivas en hidrolizar la amilasa lineal, lo que da por resultado un almidón residual insoluble deteriorado bajo condiciones de fermentación por levadura. El alto nivel de almidón residual en el caldo de fermentación por levadura se ha considerado como uno de los principales factores que influyen en el ensuciamiento del evaporador que afecta las operaciones de procesamiento corriente abajo en los procedimientos de producción de etanol. Por lo tanto, si se pudiera encontrar una forma de reducir almidón insoluble residual en el caldo de fermentación mediante el uso de una mezcla optimizada de alfa-amilasas , o variantes de las mismas, esto también representaría una contribución útil a la técnica.

Sumario de la Invención Se describe un procedimiento de licuefacción para granos enteros molidos en el procedimiento de fermentación. El procedimiento comprende poner en contacto una pasta acuosa acuosa que contiene grano entero molido con una mezcla de almidón-alfa-amilasas de licuefacción de por lo menos dos especies bacterianas diferentes.

En una modalidad, la presente invención comprende una mezcla de alfa-amilasa que comprende: (i) una alfa-amilasa de B. stearothermophilus (AmyS) en donde el aminoácido en la posición S242 es sustituido, mediante el uso del sistema de número de aminoácido mostrado en SEQ ID NO: 2 ; y (ii) una alfa-amilasa de B. licheniformis. La mezcla puede comprender además una fitasa.

En una modalidad, se puede usar una relación en peso de aproximadamente 40% de la AmyS con la sustitución de S242 y aproximadamente 60% de alfa-amilasa de B. licheniformis . De esta manera, las propiedades superiores de cada enzima, reducción rápida de viscosidad de agentes de licuefacción de almidón y termoestabilidad, respectivamente, pueden ser explotadas por completo en un método de fermentación de alcohol. En otra modalidad preferida, la relación en peso de AmyS con la sustitución S242 a alfa-amilasa de B. licheniformis es 10:90 para explotar por completo las propiedades de las enzimas en un método para hacer un edulcorante. En otras modalidades, la relación en peso de AmyS con la sustitución de S242 a alfa-amilasa de B. licheniformis puede ser 5:95, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 50:50, 60:40, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90: 10, o valores intermedios de los mismos.

En otra modalidad, se puede usar una relación de actividad de aproximadamente 1400 AAU/g a aproximadamente 14000 AAU/g de la AmyS con la sustitución de S242, y de aproximadamente 8000 LU/g a aproximadamente 19000 LU/g de alfa-amilasa de B. licheniformis . La relación de AmyS con la sustitución de S242 a alfa-amilasa de B. licheniformis puede ser 1400 AAU/g: 14000 LU/g, 2000 AAU/g : 15000 LU/g, 2100 AAU/g: 16000 LU/g, 1900 AAU/g : 17000 LU/g, o valores intermedios de los mismos. En otras modalidades, la relación de alfa-amilasa de B. licheniformis a AmyS con la sustitución de S242 es de aproximadamente 5.5 LU/AAU a aproximadamente 9.5 LU/AAU. La relación de actividad de alfa-amilasa de B. licheniformis a AmyS con la sustitución de S242 está en el intervalo de aproximadamente 0.1 LU/AAU a aproximadamente 9.5 LU/AAU. Por ejemplo la relación de actividad puede ser 0.1 LU/AAU, 0.2 LU/AAU, 0.3 LU/AAU, 0.4 LU/AAU, 0.5 LU/AAU, 1.0 LU/AAU, 1.5 LU/AAU, 2.0 LU/AAU, 2.5 LU/AAU, 3.0 LU/AAU, 4.0 LU/AAU, 5.0 LU/AAU, 5.5 LU/AAU, 6.0 LU/AAU, 6.5 LU/AAU, 7.0 LU/AAU, 7.5 LU/AAU, 8.0 LU/AAU, 8.5 LU/AAU, 9.0 LU/AAU, 9.5 LU/AAU o valores intermedios de los mismos.

La AmyS puede comprender la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, en donde el residuo S242 es sustituido. En una modalidad preferida, la AmyS comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4, que tiene una sustitución de S242Q comparada con SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO : · 2). Esta enzima es designada aquí ya sea como "AmyS S242Q" o sólo "S242Q." En otra modalidad, la AmyS se puede seleccionar de una de las enzimas AmyS que comprenden las secuencias de polipéptido de SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16, en donde el residuo S242 es sustituido .

La sustitución de S242 puede ser una sustitución de S242A, S242E, S242Q, S242F, S242H o S242N. En una modalidad, la sustitución de aminoácido en la posición S242 altera la termoestabilidad de la AmyS. La AmyS con la sustitución en la posición S242 puede tener una termoestabilidad más alta entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 95 °C comparada con una AmyS sin la sustitución de S242.

En una modalidad, la AmyS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la AmyS de SEQ ID NO: 1, en donde la AmyS tiene actividad de alfa-amilasa. La AmyS puede comprender ua sustitución de una cisteína en los aminoácidos 349 y 428, mediante el uso de SEQ ID NO: 1 para numeración. La AmyS también puede comprender una sustitución de N193 y/o V416. La AmyS también puede comprender una deleción de aminoácidos 179 y 180, mediante el uso de SEQ ID NO : 1 para numeración.

Las enzimas AmyS pueden tener una secuencia de aminoácidos alterada comparada con una AmyS de tipo silvestre que altera una o más propiedades de la enzima, v.gr., especificidad de sustrato, unión a sustrato, patrón de escisión de sustrato, estabilidad térmica, perfil de pH/actividad, perfil de pH/estabilidad, estabilidad hacia oxidación, dependencia de Ca+, y/o actividad específica. Por ejemplo, la alteración puede dar por resultado una enzima que tenga una dependencia de Ca2+ reducida y/o un perfil de pH/actividad y/o termoestabilidad, comparada con una AmyS de tipo silvestre.

La alfa-amilasa de B. licheniformis puede ser una enzima de tipo silvestre purificada. La alfa-amilasa de B. licheniformis puede tener una o más sustituciones de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre seleccionada del grupo que consiste de M15T, H133Y, N188S y A209V. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa de B . licheniformis comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20, que también se conoce como . SPEZYME® FRED . En una modalidad, la alfa-amilasa de B. licheniformis comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% de identidad de secuencia a SPEZYME® FRED (SEQ ID NO: 20) .

La invención además se refiere a constructos de ADN que codifican las enzimas de la invención, a métodos para preparar y purificar las enzimas, y al uso de las enzimas en varios procedimientos industriales, v.gr., licuefacción de almidón o producción de edulcorante.

En un aspecto, la invención se refiere a hidrolizar un sustrato de almidón soluble mediante el uso de actividad de alfa-amilasa (AA) y una enzima hidrolizante de ácido fítico (FTU, o fitasa) , en donde la relación de AAU: FTU es de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 15:1, preferiblemente de 1:10 a aproximadamente 10: 1. En una modalidad la relación de AAU: FTU es de 1:4 a 3:1. En una modalidad adicional la relación de AAU: FTU es 1:1. La fitasa puede ser una enzima de tipo silvestre de cualquier fuente. La enzima hidrolizante de ácido fítico puede ser una fitasa de bacteria o de hongo. La fitasa de hongo puede ser una fitasa de Aspergillus o una fitasa de Buttiauxella . En algunas modalidades, la fitasa de bacteria es de Escherichia coli. En una modalidad, la fitasa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

Se provee un método para licuar almidón, que comprende añadir una mezcla de amilasa descrita anteriormente a una solución que comprende almidón, y licuar la solución que comprende almidón. Una mezcla de amilasa preferida para esta aplicación tiene una relación de actividad de aproximadamente 40% (como AAU/g DS) de la AmyS con la sustitución de S242 y aproximadamente 60% (como LU/g DS) alfa-amilasa de B . licheniformis. Se pueden ser usar otras relaciones para esta aplicación, tales como 15:85, 20:80, 30:70, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 y 85: 15.

El sustrato de almidón se puede obtener de maíz, sorgo, centeno, cebada, trigo, zahina o avena. Otras fuentes de almidón incluyen otros granos, pastos, tubérculos y raíces y de manera más específica arroz, salvados, mandioca, mijo, papa, camote y tapioca. El sustrato puede incluir material vegetal, tal como almidón granulado ya sea de un procedimiento de molienda en seco o en húmedo. El método puede comprender un paso de licuefacción primario y/o secundario, que incluye añadir sustrato adicional a la pasta acuosa en el paso de licuefacción primario y/o secundario. El método puede comprender el uso de una mezcla de amilasa que comprende además una enzima hidrolizante de ácido fítico.

También se provee un método para sacarificar el almidón licuado para obtener azúcares fermentables . En algunas modalidades, el método además comprende fermentar los azúcares fermentables bajo condiciones de fermentación adecuadas para obtener productos finales tales como alcohol. Los alcoholes producidos por el método de la presente incluyen por ejemplo, etanol y butanol .

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento de conversión de almidón y/o un procedimiento de fermentación de etanol que no requiere la adición de un ácido o base para ajustar el pH. Una modalidad se refiere a un paso de licuefacción libre de ajuste de pH, en donde el pH de la licuefacción está en el intervalo de pH 4.5 a 5.4, y compuestos químicos neutralizantes de ácido no se añaden al paso de procedimiento de licuefacción. En otra modalidad, el pH de la licuefacción está en el intervalo de pH de 4.8 a 5.8, y compuestos químicos neutralizantes de ácido no se añaden al paso de procedimiento de licuefacción.

En una modalidad, el método comprende poner en contacto una pasta acuosa de grano molido que contiene almidón granulado tanto con una enzima hidrolizante de ácido fítico como una mezcla de alfa-amilasas descrita anteriormente a una temperatura de 0-30°C menor que la temperatura de gelatinización de almidón, elevar la temperatura por arriba de la temperatura de gelatinización, hidrolizar el almidón gelatinizado, y obtener un sustrato fermentable .

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un azúcar fermentable que comprende (a) mezclar material que contiene almidón molido con agua y subproducto líquido de la destilación, en donde el subproducto líquido de la destilación está en el intervalo de 10 a 70% v/v, y obtener una pasta acuosa que comprende almidón y que tiene un contenido de sólidos secos (ds) de 20 a 50% p/p, (b) tratar la pasta acuosa con una fitasa antes de o simultáneamente con la licuefacción del almidón, (c) licuar el almidón, (d) añadir una mezcla de alfa-amilasa descrita anteriormente al almidón ya sea durante el paso (b) y/o simultáneamente con el paso de licuefacción, y (e) sacarificar el almidón licuado para obtener azúcares fermentables , en donde el pH no es ajustado durante cualquiera de los pasos (a) , (b) , (c) , (d) o (e) . En algunas modalidades, el azúcar fermentable es recuperado y purificado o isomerizado. En otras modalidades, la fitasa se añade antes del paso de licuefacción. En modalidades adicionales, la mezcla de alfa-amilasa se añade con la fitasa. En modalidades adicionales, una segunda dosis de la mezcla de alfa-amilasa se añade durante el paso de licuefacción o se añade durante el paso de sacarificación.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento de producción de alcohol a partir del material que contiene almidón, que comprende licuar y sacarificar un sustrato de almidón como se describió antes para obtener azúcares fermentables y fermentar adicionalmente los azúcares fermentables bajo condiciones de fermentación adecuadas para obtener alcohol. En algunas modalidades, los pasos de sacarificación y fermentación son simultáneos. En algunas modalidades, el alcohol es etanol o butanol .

En una modalidad adicional, la mezcla de amilasa descrita anteriormente puede ser usada para convertir un agente de licuefacción de baja viscosidad a un edulcorante, tal como glucosa, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, y similares. Una mezcla de amilasa preferida para esta aplicación tiene una relación de actividad de aproximadamente 15% (como AAU/g DS) de la AmyS con la sustitución de S242 y aproximadamente 85% (como LU/g DS) de alfa-amilasa de B. licheniformis. Otras relaciones se pueden usar para esta aplicación, tales como 5:95, 10:90 y 20:80 y valores intermedios de los mismos.

Un método para producir un edulcorante puede comprender poner en contacto un sustrato de almidón con una mezcla de amilasa como se describió antes, licuar el sustrato de almidón, e incubar el sustrato a alta temperatura para producir un producto que comprende glucosa. El paso de incubación puede ser un paso de licuefacción secundario. El paso de incubación puede ser conducido a una temperatura de aproximadamente 90-100°C, v.gr., aproximadamente 95°C. La incubación puede ser conducida durante un tiempo suficiente para que el producto comprenda aproximadamente 2-14 DE de glucosa. En una modalidad, el producto comprende aproximadamente 10 DE de glucosa. El método para producir un edulcorante además puede comprender sacarificar el producto para producir una solución rica en glucosa. La solución rica en glucosa puede comprender 80-99% glucosa. En una modalidad, la solución rica en glucosa comprende aproximadamente 93-96% de glucosa. La sacarificación puede comprender poner en contacto el producto de glucosa con glucoamilasa o una mezcla de enzima, tal como OPTIMAX™ 4060 -VHP, que comprende una glucoamilasa y una pululanasa.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1D muestran posiciones correspondientes en otras alfa-amilasas tipo SPEZYME® Xtra progenitoras se pueden encontrar por alineación. Cabe notar que SEQ ID NO : 4 es AmyS S242Q. AmyS S242A AmyS S242E son expuestas en SEQ ID NOS: 3 y 5, respectivamente.

La figura 2 muestra el plásmido pHPLT-AmyS.

La figura 3 muestra el por ciento de actividad residual de variantes de genoteca S242 después de estrés término a 95°C durante 30 minutos. Posiciones de variante P, S, W e Y están ausentes y son reemplazadas por AmyS de tipo silvestre (" t"). Un control de SPEZYME®® Xtra es marcado como "Z." Otro control positivo, AmyS con una deleción de ?179-180 y una truncación C-terminal de 29 aminoácidos (SEQ ID NO: 16) también se muestra ("$") . S242A y S242Q muestran claramente actividades residuales más altas que el tipo silvestre .

Las figuras 4A-4I muestran .alineaciones por pares para SEQ ID NOS: 1 y 14.

La figura 5 muestra las curvas de fusión térmica y los puntos de fusión para el tipo silvestre y variantes de amilasa sin calcio añadido.

La figura 6 muestra las curvas de fusión térmica y los puntos de fusión para el tipo silvestre y variantes de amilasa con calcio.

La figura 7 muestra el perfil de actividad de SPEZYME® Xtra y dos variantes relativas a Liquozyme SC para tres puntos de tiempo.

La figura 8 muestra la reducción de viscosidad de harina de maíz debido a la acción de las alfa-amilasas Liquozyme SC, SPEZYME® Ethyl o SPEZYME® Xtra a una dosis de 30 ug.

La figura 9 muestra la reducción de viscosidad de viscosidad de harina de maíz debido a la acción de las alfa-amilasas Liquozyme SC o SPEZYME® Xtra, o una de dos variantes (S242A y S242Q) a una dosis de 30 ug.

La figura 10 muestra la reducción de viscosidad de viscosidad de harina de maíz debido a la acción de las alfa-amilasas Liquozyme SC o SPEZYME® Xtra, o una de dos variantes (S242A y S242Q) a una dosis de 20 ug.

La figura 11 muestra la progresión de DE de maíz molido tratado con Liquozyme SC, SPEZYME® Xtra, o una de dos variantes (S242A y S242Q) con el tiempo (0, 30, 60 y 90 minutos) .

La figura 12 muestra la viscosidad después de calentamiento directo de maíz entero molido tratado con Liquozyme SC, SPEZYME® Xtra, o una de dos variantes (S242A y S242Q) con el tiempo (0, 30, 60 y 90 minutos) .

La figura 13 muestra la progresión de DE de maíz entero molido tratado con una mezcla de AmyS S242Q (SEQ ID NO: 4) y SPEZYME® FRED, y cada enzima individualmente, en un procedimiento de licuefacción intermitente a 85-90°C con el tiempo (30, 60, 90 y 120 minutos) .

La figura 14 muestra la viscosidad de pasta acuosa de maíz entero molido tratado con una mezcla de AmyS S242Q (SEQ ID NO: 4) y SPEZYME® FRED, y cada enzima individualmente, en un procedimiento de licuefacción intermitente a 85-90°C con el tiempo (30, 60, 90 y 120 minutos) .

La figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de SPEZYME® FRED representados en SEQ ID NO: 20.

La figura 16 muestra el desarrollo de DE de un sustrato de almidón mediante el uso de una mezcla de AmyS S242Q (SEQ ID NO : 4) y SPEZYME® FRED .

Listado de Secuencias Un listado de secuencias, que comprende SEQ ID NO: 1-20, se anexa y se incorpora por referencia en su totalidad.

Descripción Detallada de la Invención Se provee una mezcla de una variante de una alfa-amilasa progenitora de B. stearothermophilus y una alfa-amilasa termoestable de B. licheniformis. En una modalidad preferida, la mezcla de alfa-amilasa contiene por lo menos aproximadamente 50% por actividad como AAU/g DS de la enzima de variante de alfa-amilasa de B. stearothermophilus. Un intervalo preferido es de aproximadamente 10% a aproximadamente 90% por actividad como AAU/g DS de la enzima de variante de alfa-amilasa de B. stearothermophilus . En una modalidad particularmente preferida, una relación de actividad de aproximadamente 10% a aproximadamente 70% (como AAU/g DS) de alfa-amilasa de B. stearothermophilus y de aproximadamente 30% a aproximadamente 90% (como LU/g DS) de alfa-amilasa de B. licheniformis se usará de modo que las propiedades superiores de cada cepa son explotadas, es decir, reducción rápida de viscosidad de almidón de agentes de licuefacción y termoestabilidad, respectivamente.

La mezcla de una variante de una alfa-amilasa progenitora de B. stearothermophilus y una alfa-amilasa termoestable de B. licheniformis tendrán otras propiedades ventajosas relacionadas con el procesamiento de un agente de licuefacción de almidón, representado por los niveles de DS, pH, contenido de calcio, y licuefacción y temperaturas de cocción. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los niveles de DS pueden variar de aproximadamente 32% a aproximadamente 40%, o más altas. En otro aspecto, el pH en un agente de licuefacción de almidón puede variar de aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente pH 6.0. Los niveles de calcio pueden variar hasta aproximadamente 10 ppm de calcio añadido. Tcai.dir puede variar de aproximadamente 100°C a aproximadamente 110°C, mientras que Tsost. Puede variar de aproximadamente 85°C a aproximadamente 95°C. Estos procedimientos pueden incluir licuefacción de almidón para producir edulcorantes tales como jarabes de glucosa, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, por ejemplo. Aunque estos procedimentos se aplican muy particularmente a la producción de edulcorantes, en algunas modalidades el procedimiento puede ser aplicado a la producción de materiales de alimentación para fermentación. Los agentes de licuefacción así producidos como materiales de alimentación para fermentación pueden ser usados en los procedimientos de fermentación, como se describe más adelante con más detalle, para producir productos finales útiles, que incluyen etanol o butanol .

En algunos aspectos, la presente invención se basa en técnicas y métodos de rutina usados en el campo de ingeniería genética y biología molecular. Los siguientes recursos incluyen descripciones de metodología general útil de conformidad con la invención: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a Ed . , 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990) y Ausubel et al., Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994). Estas referencias generales proveen definiciones y métodos conocidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a algunos métodos, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que éstos pueden variar.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto en la técnica al cual atañe esta descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED . , John Wiley and Sons, New York (1994) , y Hale y Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N. Y. (1991) proveen a un experto el significado general de muchos de los términos usados en esta invención.

Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos.

La invención se describirá ahora con detalle a manera de referencia únicamente mediante el uso de las siguientes definiciones y ejemplos. Todas las patentes y publicaciones, con la inclusión de todas las secuencias descritas dentro de esas patentes y publicaciones, referidas aquí son incorporadas expresamente por referencia.

Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo.

A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 51 a 3 ' ; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi , respectivamente .

Los encabezados provistos en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención que se pueden tener por referencia a la especificación como un todo.

A. Definiciones Como se usa en la presente, el término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto de los carbohidratos de polisacárido complejos de plantas, compuesto de amilosa y amilopectina con la fórmula (C6Hio05)x, en donde X puede ser cualquier número. En particular, el término se refiere a la amilasa y/o amilopectina de cualquier material a base de plantas que incluyen pero no se limitan a granos, pastos, tubérculos y raíces y de manera más específica trigo, cebada, maíz, centeno, avena, sorgo, sorgo, arroz, zahina, salvados, mandioca, mijo, papa, camote y tapioca.

El término "alfa-amilasa (v.gr., E.C. clase 3.2.1.1)" se refiere a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces alfa- 1 , 4 -glucosídicos . Estas enzimas también se han descrito como aquellas que efectúan la exohidrólisis o endohidrólisis de enlaces 1 , 4 -a-D-glucosídicos en polisacáridos que contienen unidades D-glucosa 1,4-a-enlazada. Otro término usado para describir estas enzimas es "glicogenasa" . Enzimas ilustrativas incluyen alfa-1, 4-glucano 4 -glucanohidrasa glucanohidrolasa .

El término "recombinante" , cuando se usa en referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de una ácido nucleico o proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Por lo tanto, por ejemplo, células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera son anormalmente expresados, sub-expresados o no expresados en absoluto.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan intercambiablemente en la presente. El código convencional de una letra o de tres letras para residuos de aminoácidos se usa en la presente.

Una "secuencia de señal" significa una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteína, que facilita la secreción de la forma madura de la proteína fuera de la célula. La definición de una secuencia de señal es una funcional. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal que es digerida durante el proceso de secreción.

Un "gen" se refiere a un segmento de ADN que está implicado en la producción de un polipéptido e incluye regiones que preceden y que siguen a las regiones codificantes así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones) .

El término "ácido nucleico" abarca ADN, ARN, de cadena sencilla o de doble cadena y modificaciones químicas de los mismos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se pueden usar intercambiablemente en la presente. Puesto que el código genético es degenerado, más de un codón se puede usar para codificar un aminoácido particular, y la presente invención abarca polinucleótidos, que codifican una secuencia de aminoácido particular. Un "vector" se refiere a una secuencia de polinucleótido diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores de lanzadera, plásmidos, partículas de fago, casetes y similares.

Un "vector de expresión", como se usa aquí, significa un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que es operablemente enlazada a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar expresión del ADN en un hospedero adecuado. Esas secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosoma adecuados en el ARNm, incrementadores y secuencias que controlan la terminación de transcripción y traducción.

Un "promotor" es una secuencia reguladora que está implicada en la unión de ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. El promotor puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivo. Un promotor preferido usado en la invención es cbhl de Trichoderma reeséi, que es un promotor inducible.

"Bajo control transcripcional " es un término bien entendido en la técnica que indica que la transcripción de una secuencia de polinucleótido, usualmente una secuencia de ADN, depende de que sea operablemente enlazada a un elemento que contribuye al inicio de, o promueve la transcripción.

"Bajo control traduccional " es un término bien entendido en la técnica que indica un proceso regulador que ocurre después de que se ha formado el AR m.

Como se usa en la presente, cuando se describen proteínas y genes que las codifican, el término para el gen es en cursivas (v.gr. , el gen que codifica amyL (B. licheniformis AA) puede ser denotado como amyL) . El término para la proteína generalmente no está en cursivas y la primera letra es generalmente en mayúsculas, (v.gr., la proteína codificada por el gen amyL puede ser denotada como AmyL o amyL) .

El término "derivado" abarca los términos "originados de", "obtenidos" u "obtenibles de", y "aislados de" .

El término "operablemente enlazado" se refiere a yuxtaposición en donde los elementos están en una disposición que les permite estar funcionalmente relacionados. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia .

El término "marcador selectivo" se refiere a un gen capaz de expresarse en un hospedero que permite la fácil selección de aquellos hospederos que contienen un ácido. nucleico o vector introducido. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen pero no se limitan a antimicrobianos (v.gr. , higromicina, bleomicina o cloranfenicol ) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional sobre la célula hospedera.

Un polinucleótido o un polipéptido que tiene un cierto por ciento (v.gr., 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) de identidad de secuencia con otra secuencia significa que, cuando está alineada, ese porcentaje de bases o residuos de aminoácidos son los mismos al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o identidad pueden ser determinados mediante el uso de cualquier programa de software adecuado conocido en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en CURRENT PR0T0COLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Suplemento 30, sección 7.7.18). Los programas preferidos incluyen el Vector NTI Advance™ 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) , GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc . Nati, Acad. Sci USA 85:2444-2448), y BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Nati Cent. Biotechnol . Inf . , Nati Lib. Med. (NCIB NLM NIH) , Bethesda, Md. , y Altschul et al., (1997) NAR 25:3389-3402) programs . Otro programa de alineación preferido es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA) , preferiblemente mediante el uso de parámetros por omisión. Otro programa de software de secuencias que encuentra uso es el TFASTA Data Searching Program disponible en Sequence Software Package Versión 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) . Un experto en la técnica reconocerá que las secuencias abarcadas por la invención también son definidas por la capacidad para hibridar bajo condiciones de hibridación astringentes con la secuencia de amyS ilustrada (v.gr. , SEQ ID NO: 5 de WO 06/002643). Un ácido nucleico es hibridable a otra secuencia de ácido nucleico cuando una forma de cadena sencilla del ácido nucleico puede alinear al otro ácido nucleico bajo condiciones apropiadas de temperatura y concentración iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas en la técnica (Véase, v.gr., Sambrook (1989) supra, particularmente los capítulos 9 y 11) . En algunas modalidades, las condiciones astringentes corresponden a una Tm de 65°C y 0. IxSSC, 0.1% SDS.

"Cepa hospedera" o "célula hospedera" significa un hospedero adecuado para un vector de expresión o constructo de ADN que comprende un polinucleótido que codifica una enzima variante alfa-amilasa de conformidad con la invención. De manera específica, las cepas hospederas son preferiblemente células bacterianas. En una modalidad preferida de la invención, la "célula hospedera" significa que tanto las células como protoplastos creados por las células de una cepa microbiana y particularmente un Bacillus sp.

El término "cultivo" se refiere a crecimiento de una población de células microbianas bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En una modalidad, cultivo se refiere a bioconversión fermentativa de un sustrato de almidón que contiene almidón granulado a un producto extremo (típicamente en un recipiente o reactor) . La fermentación es el rompimiento enzimático y anaeróbico de sustancias orgánicas por microorganismos para producir compuestos orgánicos más simples. Aunque la fermentación ocurre bajo condiciones anaeróbicas, no se pretende que el término sea limitado únicamente a condiciones anaeróbicas estrictas, ya que la fermentación también ocurre en presencia de oxígeno .

El término "poner en contacto" se refiere a la colocación de las enzima (s) respectivas en proximidad suficientemente cercana al sustrato respectivo para permitir que la enzima (s) convierta el sustrato al producto final. Los expertos en la técnica reconocerán que la mezcla de soluciones de la enzima con los sustratos respectivos puede efectuar el contacto.

El término "conversión enzimática" en general se refiere a la modificación de un sustrato por acción de enzima. El término como, se usa en la presente, también se refiere a la modificación de un sustrato de almidón por la acción de una enzima.

Como se usa en la presente, el término "sacarificación" se refiere a conversión enzimática de almidón a glucosa u otros polisacáridos de peso molecular bajo.

El término "gelatinización" significa solubilización de una molécula de almidón por cocción para formar una suspensión viscosa.

El término "licuefacción" se refiere a la etapa en conversión de almidón en la cual el almidón gelatinizado es hidrolizado para dar dextrinas solubles de peso molecular bajo.

El término "grado de polimerización (DP) " se refiere al número (n) de unidades anhidroglucopiranosa en un sacárido dado. Ejemplos de DPI son los monosacáridos , tales como glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos, tales como maltosa y sacarosa. Un DP>3 denota polímeros con un grado de polimerización mayor que 3.

Los términos "producto final" o "producto final deseado" se refieren a cualquier producto de molécula derivado de fuente de carbono que es enzimáticamente convertido a partir del sustrato de almidón.

Como se usa en la presente, el término "unidad de enzima" se refiere a la cantidad de enzima que produce una cantidad dada de producto por cantidad dada de tiempo bajo condiciones de prueba. En algunas modalidades, una unidad de enzima se refiere a la cantidad de enzima que produce 1 micromol de producto por minuto bajo las condiciones especificadas de la prueba. Por ejemplo, en una modalidad, el término "unidad de actividad de glucoamilasa" (GAU) se define como la cantidad de enzima requerida para producir 1 g de glucosa por hora de sustrato de almidón soluble (4% ds) bajo condiciones de prueba de 60°C y pH 4.2.

Actividad de alfa-amilasa (AAU) se determinó por la velocidad de hidrólisis de almidón, como es reflejada en la velocidad de reducción de capacidad de tinción con yodo medida espectrofotométricamente . Una AAU de actividad de alfa-amilasa bacteriana es la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 10 mg de almidón por min bajo condiciones estandarizadas.

La actividad de alfa-amilasa también se puede determinar como unidad de almidón soluble (SSU) y se basa en el grado de hidrólisis de sustrato de almidón de papa soluble (4% DS) por una alícuota de la muestra de enzima a pH 4.5, 50°C. El contenido de azúcar reductor se mide mediante el uso del método de DNS como se describe en Miller, G. L. (1959) Anal. Chem. 31:426-428.

La actividad de la alfa-amilasa en unidades Liquefon (LU) se midió de conformidad con el método descrito en USP 5,958,739. En resumen, el método de prueba usa p-nitrofenilo maltoheptósido como un sustrato con el azúcar terminal no reductor químicamente bloqueado. La velocidad de liberación de p-nitrofenilo es proporcional a actividad de alfa-amilasa y la liberación es monitoreada a 410 nm. La actividad se calcula contra un control estándar.

Como se usa en la presente, el término "contenido de sólidos secos (ds) " se refiere a los sólidos totales de una pasta acuosa en % sobre una base de peso seco. El término "pasta acuosa" se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.

El término "almidón residual" se refiere al almidón restante (soluble o insoluble) que queda en una composición después de fermentación de un sustrato que contiene almidón.

Como se usa en la presente, "un paso de recirculación" se refiere a la recirculación de componentes de la malta, que pueden incluir almidón residual, enzimas y/o microorganismos para fermentar sustratos que comprenden almidón .

El término "malta" se refiere a una mezcla de una fuente de carbono fermentable (carbohidrato) en agua usada para producir un producto fermentado, tal como un alcohol. En algunas modalidades, el término "cerveza" y "malta" se usan de manera intercambiable.

El término "subproducto de la destilación" significa una mezcla de sólidos no fermentados y agua, que es el residuo después de la remoción de alcohol de una malta fermentada.

Los términos "grano seco de destiladores (DDG) " y "grano seco de destiladores con solubles (DDGS) " se refieren a un subproducto útil de fermentación de grano.

Como se usa en la presente, "microorganismo etanologénico" se refiere a un microorganismo con la capacidad para convertir un azúcar u oligosacárido a etanol. Los microorganismos etanologénicos son etanologénicos en virtud de su capacidad para expresar una o más enzimas que individualmente o juntas convierten el azúcar a etanol.

Como se usa en la presente, el término "productor de etanol" o microorganismo productor de etanol" se refiere a cualquier organismo o célula que es capaz de producir etanol a partir de una hexosa o pentosa. Generalmente, las células productoras de etanol contienen una alcohol deshidrogenasa y una piruvato descarboxilasa . . Ejemplos de microorganismos productores de etanol incluyen microorganismos de hongos tales como levadura. Una levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces, particularmente, S. cerevisiae .

El término "heterólogo" con referencia a un polinucleótido o proteína se refiere a un polinucleótido o proteína que no ocurre naturalmente en una célula hospedera. En algunas modalidades, la proteína es una proteína industrial comercialmente importante. Se pretende que el término abarque proteínas que son codificadas por genes que ocurren naturalmente, genes mutados y/o genes sintéticos.

El término "endógeno", con referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que ocurre naturalmente en la célula hospedera.

Los términos "recuperado", "aislado" y "separado", como se usa en la presente, se refieren a un compuesto, proteína, célula, ácido nucleico o aminoácido que es removido de por lo menos un componente con el cual está naturalmente asociado.

Como se usa en la presente, los términos "transformado", "establemente transformado" y "transgénico" , usados en referencia a una célula, significan que la célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (v.gr., heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que es mantenido a través de generaciones múltiples.

Como se usa en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual un polipéptido es producido con base en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.

El término "introducido", en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa "transíección" , o "transformación" o " transducción" e incluye referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica en donde la secuencia de ácido nucleico puede ser incorporada en el genoma de la célula (v.gr., cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial) , convertido a un replicón autónomo, o transitoriamente expresado (v.gr., AR m transfectado) .

Como se usa en la presente, el término "actividad específica" significa una unidad de enzima definida como el número de moles de sustrato convertidos a producto por una preparación de enzima por tiempo unitario bajo condiciones específicas. La actividad específica es expresada como unidades (U) /mg de proteína.

El término "rendimiento" se refiere a la cantidad de producto final o productos finales deseados producidos mediante el uso de los métodos de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, el rendimiento es mayor que aquel producido mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el término se refiere al volumen del producto final y en otra modalidad el término se refiere a la concentración del producto final.

"ATCC" se refiere al American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo) con sede en Manassas, Va. 20108 (ATCC) .

"NRRL" se refiere al Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research (Depósito de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola, Centro para Investigación de Uso Agrícola) (y anteriormente conocido como USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoría, 111.

"Un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

Como se usa en la presente, el término "que comprende" y sus cognados se usan en su sentido inclusivo; es decir, equivalente al término "que incluye" y sus cognados correspondientes .

Nomenclatura En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos convencionales de una letra y tres letras para residuos de aminoácidos. Para facilidad de referencia, las variantes de alfa-amilasa de la invención se describen por el uso de la siguiente nomenclatura: Aminoácido (s) original (es) : posición(es) : aminoácido (s) sustituido (s) De conformidad con esta nomenclatura, por ejemplo la sustitución de serina por una alanina en la posición 242 se muestra como: Ser242Ala o S242A una deleción de alanina en la posición 30 se muestra como: Ala30* o A30* o ??30 e inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como lisina, se muestra como: Ala30AlaLys o A30AK Una deleción de un tramo consecutivo de residuos de aminoácidos, tales como residuos de aminoácidos 30-33, se indica como (30-33)* o ?(?30-?33).

En donde una alfa-amilasa específica contiene una "deleción" en comparación con otras alfa-amilasas y se hace una inserción en esa posición, esto se indica como: *36Asp o *36D para inserción de un ácido aspártico en la posición 36.

Múltiples mutaciones son separadas por signos positivos, es decir: Ala30Asp+Glu34Ser o A30N+E34S Que representan mutaciones en las posiciones 30 y 34 en donde la alanina y ácido glutámico son sustituidos por asparagina y serina, respectivamente.

Con uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición dada, se indica como A30N,E o A30N o A30E Además, cuando una posición adecuada para modificación es identificada en la presente sin que ninguna modificación específica sea sugerida, cabe entender que cualquier residuo de aminoácido puede sustituir al residuo de aminoácido presente en la posición. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una alanina en la posición 30, pero no se especifica, cabe entender que la alanina puede ser deletada o sustituida para cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera de: R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

Además, "A30X" significa cualquiera de las siguientes substituciones: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y, o A30 V; o en forma abreviada: A30R, , D, C, Q, E, G, H, I , L, K, M, F,P,S,T, ,Y,V.

Si la enzima progenitora —usada para la numeración— ya tiene el residuo de aminoácido en cuestión sugerido para sustitución en esa posición se usa la siguiente nomenclatura: "X30N" o "X30N,V" en el caso en donde, por ejemplo, uno de N o V está presente en el tipo silvestre.

Por lo tanto, significa que otras enzimas progenitoras correspondientes son sustituidas a una "Asn" o "Val" en la posición 30.

Características de residuos de aminoácidos Aminoácidos cargados: Asp, Glu, Arg, Lys, His Aminoácidos negativamente cargados (con el residuo más negativo primero) : Asp, Glu Aminoácidos positivamente cargados (con el residuo más positivo primero) : Arg, Lys, His Aminoácidos neutros: Gli, Ala, Val, Leu, He, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys , Asn, Gln, Ser, Thr, Pro Residuos de aminoácidos hidrofóbicos (con el residuo más hidrofóbico listado al último) : Gli, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp, Aminoácidos hidrofílicos (con el residuo más hidrofxlico listado al último) : Thr, Ser, Cys, Gln, Asn Alfa-Amilasas La mezcla de amilasas comprende una alfa-amilasa AmyS y una alfa-amilasa de B. licheniformis. La enzima AmyS puede comprender la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, en donde el residuo S242 es sustituido. En una modalidad preferida, la AmyS comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4, también conocida como "AmyS S242Q" o S242Q, " que tiene una sustitución de S242Q comparada con SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2). En otra modalidad, la AmyS se puede seleccionar de una de las enzimas AmyS que comprende la secuencia de polipéptido de SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16 , en donde el residuo S242 es sustituido .

La sustitución de S242 puede ser una sustitución de S242A, S242E, S242Q, S242F, S242H o S242N. En una modalidad, la sustitución de aminoácido en la posición S242 altera la termoestabilidad de la AmyS. La AmyS con la sustitución en la posición S242 pueden tener una termoestabilidad más alta entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 95°C comparada con una AmyS sin la sustitución de S242.

En una modalidad, la AmyS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la AmyS de SEQ ID NO : 1, en donde la AmyS tiene actividad de alfa-amilasa . La AmyS puede comprender una sustitución de una cisteína en los aminoácidos 349 y 428, mediante el uso de SEQ ID NO : 1 para numeración. La AmyS también puede comprender una sustitución de N193 y/o V416. La AmyS también puede comprender una deleción de los aminoácidos 179 y 180, mediante el uso de SEQ ID NO : 1 para numeración.

Las enzimas AmyS pueden tener una secuencia de aminoácidos alterada comparada con una AmyS de tipo silvestre que altera una o más propiedades de la enzima, v.gr. , especificidad de sustrato, unión a sustrato, patrón de escisión de sustrato, estabilidad térmica, perfil de pH/actividad, perfil de pH/estabilidad, estabilidad hacia oxidación, dependencia de Ca+, y/o actividad específica. Por ejemplo, la alteración puede dar por resultado una enzima que tenga una dependencia de Ca+ reducida y/o un perfil de pH/actividad alterado y/o termoestabilidad, comparada con una AmyS de tipo silvestre.

Un número de alfa-amilasas producidas por Bacillus sp . Son altamente homologas (idénticas) a nivel de aminoácido.

La identidad de un número de alfa-amilasas de Bacillus conocidas se puede encontrar en la Tabla 1 siguientes: TABLA 1 Por ciento de identidad Por ejemplo, la alfa-amilasa de B. licheniformis (LAT) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7 se ha encontrado que es aproximadamente 81% homologa con la alfa-amilasa de B. amyloliquefacíens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 9 y aproximadamente 65% homologa con la alfa-amilasa de G. stearothermophilus (BSG) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1. Alfa-Amilasas homologas adicionales incluyen SP690 y SP722 descritas en WO 95/26397 y la alfa-amilasa #707 derivada de Bacillus sp., mostrada en SEQ ID NO: 6 y descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), p . 25-31.

La alfa-amilasa KSM AP1378 se describe en WO 97/00324 (de KAO Corporation) .

Las alfa-amilasas homologas adicionales incluyen la alfa-amilasa producida por la cepa B. lichenformis descrita en EP 0252666. (ATCC 27811), y las alfa-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras alfa-amilasas tipo SPEZYME® Xtra comerciales están comprendidas en los productos vendidos bajo los siguientes nombres comerciales: SPEZYME®® AA y Ultraphlow (disponible de Danisco US Inc, Genencor División), y Keistase™ (disponible de Daiwa) y Liquezyme SC (disponible de Novozymes, Dinamarca) .

Debido a la homología sustancial encontrada entre estas alfa-amilasas , se considera que pertenecen a la misma clase de alfa-amilasas , a saber la clase de alfa-amilasas tipo "SPEZYME® Xtra".

Por consiguiente, en el presente contexto, el término alfa-amilasa tipo "SPEZYME® Xtra" pretende indicar una alfa-amilasa, en particular alfa-amilasa de Bacillus, especialmente alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus, que, a nivel de aminoácido, presenta una identidad sustancial a la alfa-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, aquí. SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2) está comercialmente disponible de Danisco US Inc, Genencor División. Geobacillus stearothermophilus ha sido referida como Bacillus stearothermophilus en la literatura y las dos se pueden usar intercambiablemente aquí.

En otras palabras, todas las siguientes alfa-amilasas, que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16 en la presente se considera que son una "alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra". Otras alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra son alfa-amilasas i) que despliega por lo menos 60%, tal como por lo menos 70%, v.gr.,. por lo menos 75%, o por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% de homología (identidad) con por lo menos una de las secuencias de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16, y/o es codificada por una secuencia de ADN que híbrida a las secuencias de ADN que codifican las alfa-amilasas anteriormente especificadas que son evidentes de SEQ ID NOS: 9 (BAN) , 5 (BSG) , 3 (SP722), 1 (SP690), 7 (LAT) , 11 (AA560) de WO 06/002643 y de la presente especificación (esas secuencias codificantes codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16 en la presente, respectivamente) .

Otra alfa-amilasa amilasa de Bacillus licheniformis útil es SPEZYME® FRED (SEQ ID NO: 20) , comercialmente disponible de Danisco US Inc, Genencor División. Esta alfa-amilasa puede ser referida aquí como SPEZYME® FRED o "Fred" (SEQ ID NO: 20) .

Homología (Identidad) La homología se puede determinar como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia de la segunda. La homología se puede determinar adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tales como GAP provistos en el paquete de programas GCG (descrito anteriormente) . Por lo tanto, Gap GCG v8 se puede usar con la matriz de puntuación por omisión para identidad y los siguientes parámetros por omisión: Sanción de creación de espacio de 5.0 y sanción de extensión de espacio de 0.3, respectivamente para comparación de secuencia de ácido nucleico, y sanción de creación de espacio de 3.0 y sanción de extensión de espacio de 0.1, respectivamente, para comparación de secuencia de proteína. GAP usa el método de Needleman y Wunsch, (1970), J.

Mol. Biol. 48:443-453, para hacer alineaciones y para calcular la identidad.

Una alineación estructural entre SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2) y, . gr . , otra alfa-amilasa se puede usar para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtras. Un método para obtener esa alineación estructural es el uso del programa Pile Up del paquete GCG mediante el uso de valores por omisión de sanciones de espacio, es decir, una sanción de creación de espacio de 3.0 y sanción de extensión de espacio de 0.1. Otros métodos de alineación estructural incluyen el análisis de agregación hidrofóbica (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp . 149-155) y trenzado en reversa (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol . 7, No. 1 pp . 142-149 (1998).

Hibridación La sonda de oligonucleótido usada en la caracterización de la alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra anterior puede ser preparada adecuadamente sobre la base de secuencia de nucleótidos o aminoácidos completa o parcial de la alfa-amilasa en cuestión.

Las condiciones adecuadas para probar hibridación implican pre-remojo en 5X SSC y prehibridación durante 1 hora a 40°C en una solución de 20% de formamida, 5X de solución de Denhardt, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6.8, y 50 mg de ADN de timo de ternera sonicado desnaturalizado, seguido por hibridación en la misma solución complementada con 100 mM de ATP durante 18 horas a 40°C, seguido por lavado tres veces del filtro en 2X de SSC, 0.2% de SDS a 40°C durante 30 minutos (astringencia baja) , preferida a 50°C (astringencia media) , muy preferiblemente a 65 °C (astringencia alta) , muy preferiblemente aún a 75°C (astringencia muy alta) . Más detalles acerca del método de hibridación se puede encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor, 1989.

En el presente contexto, se pretende que "derivado de" no sólo indique una alfa-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de esa cepa y producida en un organismo hospedero transformado con la secuencia de ADN. Finalmente, se pretende que el término indique una alfa-amilasa, que es codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y que tenga las características de identificación de la alfa-amilasa en cuestión. También se pretende que el término indique que la alfa-amilasa progenitora puede ser una variante de una alfa-amilasa que ocurre naturalmente, es decir, una variante, que es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, deleción) de uno o más residuos de aminoácidos de la alfa-amilasa que ocurre naturalmente.

Propiedades alteradas La siguiente sección describe la relación entre mutaciones, que están presentes en una variante descrita en la presente, y alteraciones deseables en propiedades (relativas a las de una alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra progenitora) , que puede resultar de la misma.

Como se mencionó antes la invención se refiere a una alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra con propiedades alteradas .

Las alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra progenitoras específicamente contempladas en conexión con pasar por las propiedades alteradas específicamente contempladas son la alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtra progenitora antes mencionada y las alfa-amilasa tipo SPEZYME® Xtras híbridas progenitoras.

La alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 2) se usa como el punto de partida, pero posiciones correspondientes en, v.gr., las alfa-amilasas SP722, BLA, BAN, AA560, SP690, KSM AP1378, #707 y otras alfa-amilasas de Bacillus se deben entender como se describe y se contempla específicamente también.

En un aspecto, la invención se refiere a variante con propiedades alteradas como se mencionó antes.

En el primer aspecto, una variante de una alfa-amilasa de G. stearothermophilus progenitora, que comprende una alteración en una o más posiciones (mediante el uso de SEQ ID NO: 1 para la numeración de aminoácidos) seleccionadas del grupo de: P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74 , A82, Q86, Q89, A93, G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, 1130, G132, Q135, P145, G146, G148, S153, Y159, W166, S169, K171, W187, P209, N224, S242, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474 , R483, en donde (a) las alteraciones son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en orientación 3' del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de G. stearothermophilus progenitora que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.

Específicamente contempladas en la presente son S242A, S242Q, S242N y S242E. Además, los residuos R179, G180, 1181, G182, K183 se escogieron para explorar el efecto de mutaciones en la región de unión de calcio-sodio, y P245 se escogió porque una prolina a la mitad de una hélice alfa es inusual. Posiciones correspondientes en otras alfa-amilasas tipo SPEZYME® Xtra progenitoras se pueden encontrar por alineación como se describió antes y como se muestra en la alineación en la figura 4. Por lo tanto, en un segundo aspecto, una variante de una alfa-amilasas tipo SPEZYME® Xtra progenitora, que comprende una alteración en una o más de las posiciones enumeradas anteriormente (mediante el uso de SEQ ID NO: 1 para la numeración de aminoácidos) se contempla en la presente.

Estabilidad En el contexto de las variantes descritas en la presente, mutaciones (que incluyen sustituciones y deleción de aminoácidos) de importancia con respecto a lograr estabilidad alterada, en particular estabilidad mejorada (es decir, más alta o más baja), a temperaturas especialmente altas (es decir, 70-120°C) y/o pH extremo (es decir, pH bajo o alto, es decir, pH 4-6 o pH 8-11, respectivamente) , en particular a concentraciones de calcio libre (es decir, no unido, por lo tanto en solución) por abajo de 60 ppm, incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades Alteradas". La estabilidad se puede determinar como se describe en la sección "Métodos" más adelante.

Estabilidad de Ca2+ Estabilidad de Ca2+ alterada significa que la estabilidad de la enzima bajo agotamiento de Ca2+ ha sido mejorada, es decir, estabilidad más alta o más baja. En el contexto de las variantes actualmente descritas, mutaciones (que incluyen sustituciones y deleciones de aminoácidos) de importancia con respecto a lograr estabilidad de Ca2+ alterada, en particular estabilidad de Ca2+ mejorada, es decir, estabilidad más alta o más baja, a pH especialmente alto (es decir, pH 8-10.5) incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades Alteradas".

Actividad Específica En un aspecto adicional, mutaciones importantes (que incluyen sustituciones y deleciones de aminoácidos) con respecto a obtener variantes que presentan actividad específica alterada, en particular actividad específica incrementada o disminuida, especialmente a temperaturas de 10-60°C, preferiblemente 20-50°C, especialmente 30-40°C, incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades Alteradas". La actividad específica se puede determinar como se describe en la sección "Métodos" más adelante.

Estabilidad a la Oxidación Las variantes descritas pueden tener estabilidad a la oxidación alterada, en particular estabilidad a la oxidación más alta, en comparación con la alfa-amilasa progenitora. La estabilidad a la oxidación incrementada es ventajosa en, v.gr., composiciones detergentes y la estabilidad a la oxidación disminuida puede ser ventajosa en composición para licuefacción de almidón. La estabilidad a la oxidación se puede determinar como se describe en la sección "Métodos" más adelante.

Perfil de pH Alterado Posiciones y mutaciones importantes con respecto a obtener variantes con perfil de pH alterado, en particular actividad mejorada a pH especialmente alto (es decir, pH 8-10.5) o pH bajo (es decir, pH 4-6) incluyen mutaciones de residuos de amino localizados cerca de los residuos del sitio activo .

Mutaciones/sustituciones específicas preferidas son aquellas listadas anteriormente en la sección "Propiedades Alteradas" para las posiciones en cuestión. Las pruebas adecuadas se describen en la sección "Métodos" más adelante.

Rendimiento de Lavado Posiciones y mutaciones importantes con respecto a obtener variantes con rendimiento de lavado mejorado a pH especialmente alto (es decir, pH 8.5-11) incluyen las mutaciones/sustituciones específicas listadas anteriormente en la sección "Propiedades Alteradas" para las posiciones en cuestión. El rendimiento de lavado puede ser probado como se describe más adelante en la sección "Métodos".

Mutaciones Generales en Variantes de la Invención Una variante descrita en la presente en una modalidad puede comprender una o más modificaciones además de aquellas delineadas anteriormente. Por lo tanto, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina (Pro) presentes en la parte de la variante de alfa-amilasa que es modificada es/son reemplazadas por un residuo que no es prolina que puede ser cualquiera de los posibles residuos que no son prolina, que ocurren naturalmente, y que preferiblemente es una Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Valina o Leucina.

Análogamente, en una modalidad, uno o más residuos de cisteína presentes en la alfa-amilasa progenitora pueden ser reemplazados por un residuo que no es cisteína tal como Serina, Alanina, Treonina, Glicina, Valina o Leucina.

Cabe entender que la presente invención abarca variantes que incorporan dos o más de las modificaciones anteriormente delineadas.

Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones en una o más de las siguientes posiciones (mediante el uso de SEQ ID NO: 7 para la numeración) : M15, V128, Allí, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412, en particular las siguientes mutaciones sencillas, dobles o triples o múltiples: M15X, en particular M15T,L; V128X, en particular V128E; H133X, en particular H133Y; N188X, en particular N188S,T,P; M197X, en particular M197T,L; A209X, en particular A209V; M197T/W138F; M197T/138Y; 15T/H133Y/N188S ; M15N128E/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C; H133Y/T149I ; G475R, H133Y/S187D; H133Y/A209V.

En el caso de la alfa-amilasa progenitora que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 7, residuos de aminoácidos relevantes que pueden ser deletados o sustituidos con una vista a mejorar la estabilidad a la oxidación incluyen el residuo de cisterna sencillo (C363) y los residuos de metionina localizados en las posiciones M8 , M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 y M438 en SEQ ID NO . 2.

Con respecto a incrementar la estabilidad térmica de una variante de alfa-amilasa en relación con su alfa-amilasa progenitora, parece ser que es particularmente deseable deletar por lo menos uno, y preferiblemente dos o incluso tres, de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 son F178, R179, G180, 1181, G182 y K183.

Deleciones por pares particularmente interesantes de este tipo son R179*+G180* ; y I181*+G182* (SEQ ID NOs . 16 o 15, respectivamente) (o equivalentes de estas deleciones por pares en otra alfa-amilasa que cumple con los requerimientos de una alfa-amilasa progenitora en el contexto de la presente descripción) .

Otros residuos de interés incluyen N193F y V416G en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 2.

Métodos de Preparación de Variantes de a-Amilasa Varios métodos para introducir mutaciones en genes son conocidos en la técnica. Después de una breve discusión de la clonación de secuencias de ADN que codifican a-amilasa, los métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica a-amilasa se describirá.

Clonación de una Secuencia de ADN que Codifica a- Amilasa La secuencia de ADN que codifica una a-amilasa progenitora se puede aislar de cualquier célula o microorganismo que produce la a-amilasa en cuestión, mediante el uso de varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o genoteca de ADNc se debe construir mediante el uso de ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la oí-amilasa que ha de ser estudiada. Después, si la secuencia de aminoácidos de la o¡-amilasa es conocida, sondas de oligonucleótido marcadas, homologas pueden ser sintetizadas y usadas para identificar clones que codifican a-amilasa de una genoteca genómica preparada del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótido marcada que contiene secuencias homologas a un gen de -amilasa conocido se podría usar como una sonda para identificar clones que codifican a-amilasa, mediante el uso de hibridación y condiciones de lavado de astringencia más baja.

Otro método adicional para identificar clones que codifican -amilasa implicaría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar bacterias a-amilasa-negativas con la genoteca de ADN genómico resultante, y después colocar en placas las bacterias transformadas en agar que contiene un sustrato para a-amilasa, lo que permite que los clones expresen la a-amilasa que ha de ser identificada.

Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente por métodos estándares establecidos, v.gr., el método de fosfoamidita descrito por S. L. Beaucage y . H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984) . En el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, v.gr., en un sintetizador de ADN automático, purificados, alineados, ligados y clonados en vectores apropiados.

Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mixto genómico y sintético, origen mixto sintético y de ADNc u origen mixto genómico y ADNc, preparado por ligación de fragmentos de origen sintético, genómico o ADNc (según sea apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN de entrada) , de conformidad con técnicas estándares. La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) mediante el uso de cebadores específicos, por ejemplo como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,683,202 o R. K. Saiki et al. (1988).

Mutagénesis Dirigida al Sitio Una vez que una secuencia de ADN que codifica -amilasa has sido aislada, y sitios deseables para mutación identificados, las mutaciones pueden ser introducidas mediante el uso de oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótido que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son insertados durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, un solo espacio de ADN de cadena sencilla, que hace puente con la secuencia que codifica a-amilasa, se crea en un vector que porta el gen de o¡-amilasa. Después, el nucleótido sintético, que porta la mutación deseada, es alineado a una porción homologa del ADN de cadena sencilla. El espacio restante es después llenado con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo es ligado mediante el uso de T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). La patente de E.U.A. No. 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican múltiples mutaciones al realizar alteraciones menores del cásete. Sin embargo, una variedad incluso mayor de mutaciones pueden ser introducidas en cualquier tiempo por el método de Morinaga, debido a que una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, pueden ser introducidos.

Otro método de introducción de mutaciones en la secuencia de ADN que codifica -amilasas se describe en Nelson y Long (1989) . Implica la generación de 3 pasos de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida al usar una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. A partir del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que porta la mutación puede ser aislado por digestión con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.

Métodos alternativos para proveer variantes de la invención incluyen transposiciones genéticas, v.gr., como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N. V.) o en WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) , u otras técnicas correspondientes que dan por resultado una enzima híbrida que comprende la mutación (es) , v.gr., sustitución (es) y/o deleción (es) , en cuestión.

Expresión de Variantes de Alfa-Amilasa De conformidad con la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por los métodos descritos anteriormente, o por cualesquiera métodos alternativos conocidos en la técnica, puede ser expresada, en forma de enzima, mediante el uso de un vector de expresión que típicamente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión a ribosoma, señal de traducción y, opcionalmente, un gen represor u varios genes activadores .

El vector de expresión recombinante que porta la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención puede ser cualquier vector, que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección de vector a menudo dependerá de la célula hospedera en la cual ha de ser introducida. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de replicación cromosómica, v.gr., un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula hospedera, es integrado en el genoma de la célula hospedera y replicado junto con el cromosoma (s) en el cual ha sido integrado.

En el vector, la secuencia de ADN debe ser operablemente conectada a una secuencia de promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera de elección y se puede derivar de genes que codifican proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula hospedera. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en un hospedero bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores del gene dagA de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) de Geobacillus stearothermophilus, los promotores de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para transcripción en un hongo hospedero, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica amilasa de A. oryzae TAKA, ácido aspártico proteinasa de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de A. niger, alfa-amilasa estable al ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans .

El vector de expresión de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operablemente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de alfa-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden ser adecuadamente derivadas de las mismas fuentes que el promotor.

El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula hospedera en cuestión. Ejemplos de esas secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl y pIJ702.

El vector también puede comprender un marcador seleccionable , v.gr., un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula hospedera, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confieres resistencia a antibióticos tales como resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina . Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que da origen a resistencia a la higromicina, o la selección se puede lograr mediante la co-transformación, v.gr., como se describe en O 91/17243.

Aunque la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, v.gr., cuando se usan ciertas bacterias como células hospederas, generalmente se prefiere que la expresión seas extracelular . En general, las alfa-amilasas de Bacillus mencionadas aquí comprenden una pre-región que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta pre-región puede ser reemplazada por una pre-región o secuencia de señal diferente, lograda convenientemente por sustitución de las secuencias de ADN que codifican las pre-regiones respectivas.

Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de alfa-amilasa, el promotor, t'erminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (compárese, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed. , Cold Spring Harbor, 1989).

La célula de la invención, ya sea que comprenda un constructo de ADN o un vector de expresión de la invención como se definió antes, se usa ventajosamente como una célula hospedera en la producción recombinante de una variante de alfa-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, convenientemente al integrar el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma del hospedero. Esta integración es generalmente considerada como una ventaja ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga establemente en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma del hospedero se puede realizar de conformidad con métodos convencionales, v.gr., por recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se describió antes en conexión con los diferentes tipos de células hospederas.

La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, v.gr., una célula bacteriana o de hongo (que incluye levaduras) .

Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias Gram-positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram-negativas tales como E. coli. La transformación de las bacterias se puede efectuar, por ejemplo, por transformación de protoplastos o mediante el uso de células competentes de una manera conocida per se.

El organismo de levadura puede ser seleccionado favorablemente de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, v.gr., Saccharomyces cerevisiae. Los hongos filamentosos pueden pertenecer ventajosamente a una especie de Aspergillus, v.gr., Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células de hongos pueden ser transformadas por un proceso que implica formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguida por regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Un proceso adecuado para transformación de células hospederas de Aspergillus se describe en EP 238 023.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de producción de una variante de alfa-amilasa de la invención, el método comprende cultivar una célula hospedera como se describió antes bajo condiciones que conducen a la producción de la variante y recuperación de la variante de las células y/o medio de cultivo.

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula hospedera en cuestión y obtener la expresión de la variante de alfa-amilasa de la invención. Los medios adecuados están disponible de proveedores comerciales o se pueden preparar de conformidad con recetas publicadas (v.gr., como se describe en catálogos del American Type Culture Collection) .

La variante de alfa-amilasa secretada de las células hospederas puede ser recuperada convenientemente del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración, y precipitar componentes proteináceos del medio por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, o similares.

Fitasas Las fitasas útiles para la invención incluyen enzimas capaces de hidrolizar ácido fítico bajo las condiciones definidas de los pasos de incubación y licuefacción. En algunas modalidades, la fitasa es capaz de liberar por lo menos un fosfato inorgánico a partir de un hexafosfato de inositol (ácido fítico) . Las fitasas se pueden agrupar de conformidad con su preferencia para una posición específica del grupo éster fosfato sobre la molécula de fitato en la cual se inicia la hidrólisis (v.gr. , como 3-fitasas (EC 3.1.3.8) o como 6-fitasas (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo típico de fitasa es mio-inositol-hexacifosfato-3-fosfohidrolasa .

Las fitasas se pueden obtener de microorganismos tales como organismos fúngicos y bacterianos. Algunos de estos microorganismos incluyen v.gr., Aspergillus (v.gr., A. niger, A. terreus, A. ficum y A. fumigatus) , Myceliophthora (M. thermophila) , Talaro yces (T. thermophilics) Trichoderma spp ( T. reesei) y Thermomyces ( O 99/49740). También las fitasas están disponibles de especies de Penicillium, v.gr., P. hordei (ATCC No. 22053), P. piceum (ATCC No. 10519), o P. brevicompactum (ATCC No. 48944). Véase, por ejemplo USP 6,475,762. Además, las fitasas están disponibles de Bacillus (v.gr., B. subtilis, Pseudomonas, Peniophora, E. coli, Citrobacter, Enterbacter y Buttiauixella (véase WO2006/043178) .

Las fitasas comerciales están disponibles tales como NATUPHOS (BASF) , RONOZYME P (Novozymes A/S) , PHZYME (Danisco A/S, Diversa) y FINASE (AB Enzymes) . El método para determinar la actividad de fitasa microbiana y la definición de una unidad de fitasa ha sido publicada por Engelen et al. (1994) J. of AOAC International, 77: 760-764. La fitasa puede ser una fitasa de tipo silvestre, una variante o fragmento de la misma.

En una modalidad, la fitasa útil en la presente invención es una derivada de la bacteria Buttiauxiella spp. La Buttiauxiella spp. incluye B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae. Cepas de especies de Buttiauxiella están disponibles de DSMZ, el Germán National Resource Center for Biological Material (Centro Alemán de Recursos Nacionales para Material Biológico) (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania). La cepa P 1-29 de Buttiauxiella sp. depositada bajo el número de acceso NCIMB 41248 es un ejemplo de una cepa particularmente útil de la cual una fitasa se puede obtener y usar de conformidad con la invención. En algunas modalidades, la fitasa es BP-tipo silvestre, una variante de la misma (tal como BP-11) descrita en WO 06/043178 o una variante como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. 11/714,487, presentada el 6 de marzo de 2007 (publicada como US 2008-0220498) . Por ejemplo, un BP-tipo silvestre y variantes de la misma se describen en la tabla 1 de WO 06/043178, en donde la numeración es en referencia a SEQ ID NO: 3 de la solicitud del PCT publicada.

En una modalidad preferida, una fitasa útil en la presente invención es una que tiene por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 88%, por lo menos 90%, por lo menos 93%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% y por lo menos 99% identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 19 (BP-17) mostrada en la tabla 2 y variantes de la misma. Muy preferiblemente, la fitasa tendrá por lo menos 95% a 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 19 o variantes de la misma. En algunas modalidades, la fitasa comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

Tabla 2 Secuencia de Proteína Madura de fitasa de Buttiauxiella BP-17 (SEQ ID NO; 19) NDTPASGYQV EKWTLSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR WSQSVEPGC QLQ En algunas modalidades, la cantidad (dosis) de fitasa usada en los procedimientos de incubación y/o licuefacción está en el intervalo de aproximadamente 0.001 a 50 FTU/gds, (v.gr., en el intervalo de aproximadamente 0.01 a 25 FTU/gds, aproximadamente 0.01 a 15 FTU/g ds, aproximadamente 0.01 a 10 FTU/g ds, aproximadamente 0.05 a 15 FTU/g ds, y aproximadamente 0.05 a 5.0 FTU/g.

Campos de Aplicación Industrial La mezcla de alfa-amilasas presentada aquí posee propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, la mezcla de amilasas se puede usar para procedimientos de almidón, en particular conversión de almidón, especialmente licuefacción de almidón (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 3,912,590, EP solicitudes de patente nos. 252 730 y 63 909, WO 99/19467, y WO 96/28567 todas las referencias son incorporadas aquí por referencia) . También se contemplan mezclas de amilasa que además comprenden una glucoamilasa, pululanasa, y/o otra alfa-amilasa .

Además, las mezclas de amilasa son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y alcoholes, tales como etanol o butanol , de almidón o granos enteros (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,231,017, incorporada aquí por referencia) .

Las mezclas de amilasa también son útiles para eliminar apresto de textiles, telas y prendas (véase, v.gr., O 95/21247, patente de E.U.A. No. 4,643,736, EP 119,920 incorporada aquí por referencia) , fabricación o elaboración de cerveza, en la producción de pulpa y papel.

Conversión de Almidón Los procedimientos de conversión de almidón convencionales, tales como los procedimientos de licuefacción y sacarificación se describen, v.gr., en la patente de E.U.A. No. 3,912,590 y solicitudes de patente EP Nos. 252,730 y 63,909, incorporadas aquí por referencia. En una modalidad, el procedimiento de conversión de almidón que degrada el almidón a componentes de carbohidrato de peso molecular más bajo tales como azúcares o reemplazadotes de grasa incluyen un paso de desramificación.

Conversión de Almidón a Azúcar En el caso de convertir almidón en un azúcar, el almidón es despolimerizado . Un procedimiento de despolimerización representativo comprende un paso de pre-tratamiento y dos o tres pasos de procedimiento consecutivos, es decir un procedimiento de licuefacción, un procedimiento de sacarificación y dependiente del producto final deseado opcionalmente un procedimiento de isomerización .

Pre-Tratamiento de Almidón Nativo El almidón nativo consiste de gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando una pasta acuosa de almidón es calentada, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, lo que hace que se dispersen las moléculas de almidón en la solución. Durante este procedimiento de "gelatinización" hay un incremento drástico en viscosidad. Como el nivel de sólidos es 30-40% en un procedimiento industrial típico, el almidón tiene que se adelgazado o "licuado" para que pueda ser manejado. Esta reducción en viscosidad es actualmente obtenida en su mayor parte por degradación enzimática.

Licuefacción Durante el paso de licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades más cortas ramificadas y lineales por una alfa-amilasa . Los productos pueden incluir glucosa (a/k/a DPI), así como maltodextranos y otros oligosacáridos de cadena corta (DP2+) . El procedimiento de licuefacción se lleva a cabo a 105-110°C durante 5 a 10 minutos seguido por 1-2 horas a 95°C. El pH está entre 5.5 y 6.2. Para asegurar estabilidad de enzima óptima bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones de calcio libre) . Después de este tratamiento, el licuado de almidón tendrá un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.

Sacarificación Después del procedimiento de licuefacción, las dextrinas solubles y oligosacáridos de cadena corta son convertidos a azúcares fermentables tales como glucosa y maltosa mediante la adición de una glucoamilasa (v.gr., OPTIDEX® L-400) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (patente de E.U.A. No. 4,335,208) o una pululanasa. Antes de este paso, el pH es reducido a un valor por abajo de 4.5, al mantener la temperatura elevada (por arriba de 95°C) para inactivar la alfa-amilasa en licuefacción para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamado "precursores de panosa" que no pueden ser hidrolizados apropiadamente por la enzima desramificante.

La temperatura es bajada a 60°C, y se añaden la glucoamilasa y una enzima desramificante. El procedimiento de sacarificación procede durante 24-72 horas.

Normalmente, cuando se desnaturaliza la a-amilasa después del paso de licuefacción, aproximadamente 0.2-0.5% del producto de sacarificación es el trisacárido ramificado Glcpal-6Glc pal-4Glc (panosa) que no puede ser degradado por una pululanasa. Si la amilasa activa del paso de licuefacción está presente durante la sacarificación (es decir, sin desnaturalización), este nivel puede ser tan alto como 1-2%, que es altamente indeseable ya que reduce el rendimiento de sacarificación de manera significativa.

Isomerización Cuando el producto de azúcar final deseado es, v.gr. , jarabe con alto contenido de fructosa, el jarabe de dextrosa puede ser convertido a fructosa. Después del procedimiento de sacarificación, el pH se incrementa a un valor en el intervalo de 6-8, preferiblemente pH 7.5, y el calcio es removido por intercambio de iones. El jarabe de dextrosa es después convertido a jarabe con alto contenido de fructosa mediante el uso de, v.gr., una glucosa isomerasa inmovilizada (tal como Gensweet® IGI-HF) .

Producción de Etanol En general, la producción de alcohol (etanol) a partir de grano entero puede ser separada en 4 pasos principales : Molienda Licuefacción Sacarificación Fermentación Molienda El grano es molido para abrir la estructura y permitir el procesamiento posterior. Dos procedimientos usados son molienda en húmedo o en seco. En la molienda en seco, la semilla entera es molida y usada en la parte restante del procedimiento. La molienda en húmedo da una separación muy buena de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y con algunas excepciones se aplica en lugares en donde hay una producción paralela de jarabes.

Preparación de una pasta acuosa de material que contiene almidón El material que contiene almidón molido se combinará con agua y subproducto líquido de la destilación reciclado que da por resultado una pasta acuosa. La pasta acuosa comprenderá entre 15 y 55% ds p/p (v.gr., 20 a 50%, 25 a 50%, 25 a 45%, 25 a 40%, y 20 a 35% ds) . En algunas modalidades, el subproducto líquido de la destilación reciclado estará en el intervalo de 10 a 70% v/v (v.gr., 10 a 60%, 10 a 50%, 10 a 40%, 10 a 30%, 10 a 20%, 20 a 60%, 20 a 50%, 20 a 40% y también 20 a 30%) .

Una vez que el material que contiene almidón molido se combina con agua y subproducto líquido de la destilación, el pH no se ajusta en la pasta acuosa. Además, el pH no se ajusta después de la adición de fitasa y opcionalmente alfa-amilasa a la pasta acuosa. En una modalidad preferida, el pH de la pasta acuosa estará en el intervalo de pH 4.5 a menos de 6.0 (v.gr., pH 4.5 a 5.8, pH 4.5 a 5.6, pH 4.8 a 5.8, pH 5.0 a 5.8, pH 5.0 a 5.4 y pH 5.2 a 5.5). El pH de la pasta acuosa puede ser entre pH 4.5 y 5.2 de acuerdo con la cantidad de subproducto líquido de la destilación añadido a la pasta acuosa y el tipo de material que comprende el subproducto líquido de la destilación. Por ejemplo, el pH del subproducto líquido de la destilación puede estar entre pH 3.8 y pH 4.5. Como un ejemplo adicional, la tabla 3 siguiente ilustra el cambio de pH que ocurre con adición de incrementar cantidades de subproducto líquido de la destilación a una pasta acuosa de maíz entero molido (32% ds) después de agitar durante 2 horas a 155F.

Tabla 3 Subproducto líquido p/p pH final de la destilación % 0 5.52 20 5.29 40 5.16 50 5.09 60 5.05 80 4.98 100 4.94 Cabe mencionar, durante la producción de etanol, que se pueden añadir ácidos para reducir el pH en la cerveza para reducir el riesgo de contaminación microbiana antes de destilación .

En algunas modalidades, una fitasa se añadirá a la pasta acuosa, además de la mezcla de alfa-amilasa . En algunas modalidades, la fitasa y mezcla de alfa-amilasa se añadirá a la pasta acuosa secuencialmente y en otras modalidades la fitasa y mezcla de alfa-amilasa se añadirán simultáneamente. En algunas modalidades, la pasta acuosa que comprende la mezcla de alfa-amilasa y fitasa opcional se incubarán (pre-tratarán) durante un período de 5 minutos a 8 horas (v.gr., 5 minutos a 6 horas, 5 minutos a 4 horas 5 minutos a 2 horas, y 15 minutos a 4 horas) . En otras modalidades, la pasta acuosa se incubará a una temperatura en el intervalo de 40 a 115°C, (v.gr., 45 a 80°C, 50 a 70°C, 50 a 75°C, 60 a 110°C, 60 a 95°C, 70 a 110°C, y 70 a 85°C) .

En otras modalidades, la pasta acuosa se incubará a una temperatura de 0 a 30°C (v.gr., 0 a 25°C, 0 a 20°C, 0 a 15°C, 0 a 10°C y 0 a 5°C) por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón. En algunas modalidades, la temperatura estará por abajo de 68°C, por abajo de 65°C, por abajo de 62°C, por abajo de 60°C y por abajo de 55°C. En algunas modalidades, la temperatura estará por arriba de 45°C, por arriba de 50°C, por arriba de 55°C y por arriba de 60°C. En algunas modalidades, la incubación de la pasta acuosa que comprende una mezcla de alfa-amilasa y fitasa opcional a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón se refiere como una licuefacción primaria (Io) .

En una modalidad, el material que contiene almidón molido es almidón o sorgo. La pasta acuosa comprende 25 a 40% ds, el pH está en el intervalo de 4.8 a 5.2, y la pasta acuosa es incubada con una mezcla de alfa-amilasa y opcionalmente una fitasa durante 5 minutos a 2 horas, a un intervalo de temperatura de 60 a 75 °C.

En un paso de licuefacción adicional, el material incubado o pre-tratado que contiene almidón se expondrá a un incremento en temperatura tal como 0 a 45 °C por arriba de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón, (v.gr., 70°C a 120°C, 70°C a 110°C, y 70°C a 90°C) durante un período de 2 minutos a 6 horas (v.gr., 2 minutos a 4 hr) a un pH de aproximadamente 4.0 a 5.5 muy preferiblemente entre 1 hora y 2 horas. La temperatura puede ser incrementada por un sistema de calentamiento directo a alta temperatura convencional durante un período corto, por ejemplo, durante 1 a 15 minutos. Después, el almidón puede ser hidrolizado además a una temperatura que varía de 75 °C a 95°C, (v.gr., 80°C a 90°C y 80°C a 85°C) durante un período de 15 a 150 minutos (v.gr., 30 a 120 minutos) . En una modalidad preferida, el pH no se ajusta durante estos pasos del procedimiento y el pH del mosto licuado está en el intervalo de pH 4.0 a pH 5.8 (v.gr., pH 4.5 a 5.8, pH 4.8 a 5.4, y pH 5.0 a 5.2). En algunas modalidades, una segunda dosis de una mezcla de alfa-amilasa termoestable se añadirá al paso de licuefacción secundario, pero en otras modalidades no habrá una dosis adicional de una mezcla de alfa-amilasa.

Los pasos de incubación y licuefacción de conformidad con la invención pueden ser seguidos por pasos de sacarificación y fermentación bien conocidos en la técnica.

Licuefacción En el procedimiento de licuefacción, los gránulos de almidón son solubilizados por hidrólisis a maltodextrinas en su mayoría de un DP más alto que 4. La hidrólisis se puede llevar a cabo por tratamiento con ácido o enzimáticamente por alfa-amilasa . La hidrólisis con ácido se usa sobre una base limitada. El material de partida puede ser grano entero molido o una corriente lateral de procesamiento de almidón.

La licuefacción enzimática típicamente se lleva a cabo como un procedimiento de pasta acuosa caliente de tres pasos. La pasta acuosa se calienta a una temperatura entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y la enzima(s) se añade (n) . Después, la pasta acuosa se calienta directamente a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, se enfría a 60-95°C y más enzima (s) se añade (n) para obtener la hidrólisis final. El procedimiento de licuefacción se lleva a cabo a pH 4.5-6.5, típicamente a un pH entre 5 y 6. El grano molido y licuado también se conoce como malta.

Fermentación Levadura típicamente de Saccharomyces spp. Se añade a la malta y la fermentación se realiza durante 24-96 horas, tal como típicamente 35-60 horas. La temperatura es entre 26-34°C, típicamente a aproximadamente 32°C, y el pH es de pH 3-6, preferiblemente de alrededor de pH 4-5.

Cabe notar que el procedimiento más ampliamente usado es un procedimiento de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en donde no hay etapa de contención para la sacarificación, lo que significa que la levadura y enzima se añaden juntas. Cuando se realiza el SSF, es común introducir un paso de pre-sacarificación a una temperatura por arriba de 50°C, inmediatamente antes de la fermentación.

Sacarificación y Fermentación Material licuado que contiene almidón es sacarificado en presencia de enzimas sacarificantes, tales como glucoamilasas . El procedimiento de sacarificación puede durar 12 horas a 120 horas (v.gr., 12 a 90 horas, 12 a 60 horas y 12 a 48 horas) . Sin embargo, es común realizar un paso de pre-sacarificación durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas (v.gr., 30 a 90 minutos) en un intervalo de temperatura de 30 a 65°C y típicamente de alrededor de 60°C que es seguido por una sacarificación completa durante la fermentación referida como sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). El pH es usualmente entre 4.2-4.8, preferiblemente pH 4.5.

Azúcares fermentables obtenidos de granos, que incluyen granos enteros molidos, y almidones, que incluyen almidón de maíz, (v.gr. , dextrinas, monosacáridos , particularmente glucosa) son producidos a partir de sacarificación enzimática. Estos azúcares fermentables además pueden ser purificados y/o convertidos a productos de azúcar útiles. Además de los azúcares obtenidos de granos enteros molidos se pueden usar como un material de alimentación de fermentación en un procedimiento de fermentación microbiano para producir productos finales, tales como alcohol (v.gr., etanol y butanol) , ácidos orgánicos (v.gr., ácido succínico, ácido cítrico y ácido láctico), alcoholes de azúcar (v.gr., glicerol) , intermediarios de ácido ascórbico (v.gr., gluconato, 2 -ceto-D-gluconato, 2 , 5-diceto-D-gluconato y ácido 2 -ceto-L-gulónico) , aminoácidos (v.gr., lisina, ácido glutámico y glutamatos tales como, por ejemplo, glutamato de monosodio) , proteínas (v.gr., anticuerpos y fragmento de los mismos) .

En una modalidad preferida, los azúcares fermentables obtenidos durante los pasos de procedimiento de licuefacción se usan para producir alcohol y particularmente etanol. En la producción de etanol, un procedimiento de SSF se usa comúnmente en donde las enzimas sacarificantes y organismos termentadores (v.gr. , levadura) se añaden juntos y después se llevan a cabo a una temperatura de 30°C a 40°C.

El organismo usado en fermentaciones dependerá del producto final deseado. Típicamente, si el etanol es el producto final deseado, se usará levadura como el organismo termentador. En algunas modalidades preferidas, el microorganismo productor de etanol es una levadura y específicamente Saccharomyces . tales como cepas de S. cerevisiae (patente de E.U.A. No. 4,316,956). Una variedad de S. cerevisiae están comercialmente disponibles y éstas incluyen pero no se limitan a FALI (levadura de Fleischmann) , SUPERSTART (Alltech) , FERMIOL (DSM Specialties) , RED STAR (Lesaffre) y levadura de alcohol Angel (Angel Yeast Company, China) . La cantidad de levadura iniciadora utilizada en los métodos es una cantidad efectiva para producir una cantidad comercialmente significativa de etanol en una cantidad de tiempo adecuada, (v.gr., para producir por lo menos 10% de etanol a partir de un sustrato que tiene entre 25-40% DS en menos de 72 horas) . Las células de levadura son generalmente suministradas en cantidades de 104 a 1012, y preferiblemente de 107 a 1010 de conteo de levaduras viables por mi de caldo de fermentación. La fermentación incluirá además de un microorganismo termentador (v.gr., levadura), nutrientes, opcionalmente enzimas adicionales, que incluyen pero no se limitan a fitasas. El uso de levadura en fermentación es bien conocido y se hace referencia a THE ALCOHOL TEXTBOOK, K. JACQUES ET AL., EDS . 1999, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS, UK.

En modalidades adicionales, mediante el uso de microorganismos termentadores apropiados, como se conoce en la técnica, el producto final de fermentación puede incluir sin limitación glicerol, 1 , 3 -propanodiol , gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2 , 5-diceto-D-gluconato, ácido 2 -ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos y derivados de los mismos. De manera más específica, cuando el ácido láctico es el producto final deseado, un Lactobacillus sp . (L. casei) se puede usar; cuando glicerol o 1 , 3 -propanodiol son los productos finales deseados, E.coli se puede usar; y cuando 2-ceto-D-gluconato, 2 , 5 -diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico son los productos finales deseados, Pantoea citrea se puede usar como el microorganismo termentador. La lista enumerada anteriormente son sólo ejemplos y un experto en la técnica estará conciente de un número de microorganismos fermentadores que se pueden usar apropiadamente para obtener un producto final deseado.

Destilación Opcionalmente , después de la fermentación, alcohol (v.gr., etanol o butanol) se puede extraer, por ejemplo, por destilación y opcionalmente puede ser seguida por uno o más pasos de procedimiento.

En algunas modalidades, el rendimiento de etanol o butanol producido por los métodos abarcados por la invención será por lo menos 8%, por lo menos 10%, por lo menos 12%, por lo menos 14%, por lo menos 15%, por lo menos 16%, por lo menos 17% y por lo menos 18% (v/v) , y por lo menos 23 % v/v. El etanol obtenido de conformidad con el procedimiento de la invención se puede usar como, por ejemplo, combustible de etanol, etanol para bebidas, es decir, espíritus neutros potables, o etanol industrial.

Subproductos Los subproductos de granos de la fermentación típicamente se usan para alimento para animales ya sea en forma líquida o en forma seca. Si el almidón es molido en húmedo, subproductos que no son almidón incluyen proteína cruda, aceite y fibra, v.gr., harina de gluten de maíz. Si el almidón es molido en seco, los subproductos pueden incluir co-productos de alimento para animales, tales como granos secados en destiladores (DDG) y grano secado por el destilador más componentes solubles (DDGS) . Cuando el grano es molido en seco y mezclado en una pasta acuosa antes de licuefacción y sacarificación, sin embargo, no queda grano como un subproducto .

Detalles adicionales sobre cómo llevar a cabo licuefacción, sacarificación, fermentación, destilación y recuperación de alcoholes son bien conocidos por el experto en la técnica.

De conformidad con el procedimiento de la invención, la sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo simultáneamente o por separado.

Glucoamilasas y pululanasas Las glucoamilasas útiles incluyen aquellas purificadas a partir de Aspergillus niger (v.gr., AMG Gl o G2 de A. niger descritas en Boel et al. (1984), "Glucoamylases Gl and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs", EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102, o una variante de la misma, en particular una variante descrita en WO 00/04136 o WO 01/04273 o AMG de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448 o una glucoamilasa de Trichoderma reesei (véase WO 06/060062) .

En una modalidad, la composición de la invención también comprende una pululanasa, v.gr., una pululanasa de Bacillus. Véase, por ejemplo, WO 99/45124.

Métodos Fermentación y Purificación de Variantes de Alfa- Amilasa Una cepa de B. subtilis que porta el plásmido de expresión relevante puede ser fermentada y purificad como sigue: la cepa es sembrada por estrías en na placa de LB-agar con 10 micro g/ml de kanamicina de material de abastecimiento a -80°C, y crecimiento durante la noche a 37°C. Las colonias son transferidas a 100 mi de medio PS-I (más adelante) complementado con 10 micro g/ml de cloranfenicol en un matraz con agitación de 500 mi. El cultivo se agita a 37°C a 270 rpm durante 5 días .

Composición de medio PS-I Azúcar perlado 100 g/1 Harina de frijol de soya 40 g/l Na2HP04, 12 H20 10 g/l Pluronic ™ PE 6100 0.1 g/l CaC03 5 g/l Células y residuos de células son removidos del caldo de fermentación por centrifugación a 4500 rpm en 20-25 minutos. Posteriormente, el sobrenadante es filtrado para obtener una solución completamente clara. El filtrado es concentrado y lavado en un UF-filtro (10000 membrana cortada) y el regulador de pH es cambiado a 20 mM de Acetato a pH 5.5. El UF-filtrado se aplica sobre una S-sefarosa F.F. y la elución se lleva a cabo mediante elusión por pasos con 0.2M de NaCl en el mismo regulador de pH. El material eluido es dializado contra 10 mM de Tris, pH 9.0 y se aplica sobre una Q-Sefarosa F.F. y se eluye con un gradiente lineal de 0-0.3M de NaCl sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad (medida por la prueba de Phadebas) se ponen en acervo, el pH se ajusta a pH 7.5 y el color restante se remueve mediante un tratamiento con 0.5% p/vol de carbón activo en 5 minutos.

Determinación de Actividad Específica La actividad específica se determina mediante el uso de la prueba de Phadebas® (Pharmacia) como actividad/mg de enzima. Se siguen las instrucciones del fabricante (véase también más adelante bajo "Prueba para Actividad de Alfa-Amilasa") .

Determinación de Estabilidad La estabilidad de amilasa se puede medir mediante el uso del método como sigue: la enzima se incuba bajo las condiciones relevantes. Se toman muestras en varios puntos de tiempo, v.gr. , después de 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y se diluyen 25 veces (la misma dilución para todas las muestras tomadas) en regulador de pH de prueba (50 mM de regulador de pH Britton a pH 7.3) y la actividad se mide mediante el uso de la prueba de Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones estándares pH 7.3 , 37 °C.

Pruebas para Actividad de Alfa-Amilasa 1. Prueba de Phadebas La actividad de alfa-amilasa se determina por un método que utiliza tabletas de Phadebas® como sustrato. Las tabletas de Phadebas (Prueba de Amilasa de Phadebas®, suministrada por Pharmacia Diagnostic) contiene un polímero de almidón de color azul insoluble entrelazado, que se ha mezclado con albúmina de suero de bovino y una sustancia reguladora de pH y se forman tabletas con la misma.

Para cada medición individual, una tableta es suspendida en un tubo que contiene 5 mi de regulador de pH Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl2, pH ajustado al valor de interés con NaOH) . La prueba se lleva a cabo en un baño de agua a la temperatura de interés . La alfa-amilasa que ha de ser probada se diluye en x mi de regulador de pH Britton-Robinson 50 mM. 1 mi de esta solución de alfa-amilasa se añade a los 5 mi de regulador de pH Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la alfa-amilasa que da fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de alfa-amilasa.

Es importante que la absorbancia de 620 nm medida después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en el intervalo de 0.2 a 2.0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este intervalo de absorbancia hay linealidad entre actividad y absorbancia (ley de Lambert-Beer) . La dilución de la enzima por lo tanto se debe ajustar para satisfacer este criterio. Bajo un conjunto especificado de condiciones (condiciones de temp., pH, tiempo de reacción, regulador de pH) 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cierta cantidad de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad de color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones. 2. Método Alternativo La actividad de alfa-amilasa se determina por un método que utiliza el sustrato de PNP-G7. PNP-G7, que es una abreviatura para p-nitrofenil-alfa, D-maltoheptaosido es un oligosacárido bloqueado que puede ser digerido por una endo-amilasa. Después de la digestión, la alfa-Glucosidasa incluida en el kit digiere el sustrato para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y por lo tanto se puede medir por espectofometría visible a ?=405 nm (400-420 nm) . Kits que contienen sustrato de PNP-G7 y alfa-Glucosidasa son fabricados por Boehringer-Mannheim (cat. No.1054635) .

Para preparar la solución de reactivo, 10 mi de sustrato solución reguladora de pH se añade a 50 mi de enzima/solución de regulador de pH como es recomendado por el fabricante. La prueba se realiza al transferir 20 micro I de muestra a una placa de microtitulación de 96 pozos e incubar a 25°C. Se añaden 200 microlitros de solución de reactivo pre-equilibrada a 25°C. La solución se mezcla y se pre-incuba 1 minuto y la absorción se mide cada 30 segundos sobre 4 minutos a OD 405 nm en un lector de ELISA.

La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones .

Determinación de Actividad de Fitasa (FTU) Actividad de Fitasa (FTU) se mide por la liberación de fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico forma un complejo amarillo con reactivo de molibdato ácido/vanadato y el complejo amarillo se mide a una longitud de onda de 415 nm en un espectrofotómetro y el fosfato inorgánico liberado es cuantificado con una curva estándar de fosfato. Una unidad de fitasa (FTU) es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fosfato inorgánico a partir de fitato por minuto bajo las condiciones de reacción dadas en el estándar Europeo (CEN/TC 327, 2005-TC327 I 003270XX) .

Determinación de Contenido de Acido Fítico Contenido de ácido fítico: Se extrajo ácido fítico de la muestra al ajustar el pH de la pasta acuosa al 5% (si es una muestra seca) a un pH de 10 y después se determinó por un método de HPLC mediante el uso de una columna de intercambio de iones. El ácido fítico se eluyó de la columna mediante el uso de un sistema de gradiente de NaOH. El contenido de ácido fítico en el líquido se calculó después al comparar con ácido fítico estándar.

La presente invención se describe con detalle adicional en los siguientes ejemplos que de ninguna manera se pretende que limiten el alcance de la invención como se reivindica. Las figuras anexas tienen la intención de ser consideradas como partes integrales de la especificación y descripción de la invención. Todas las referencias citadas son incorporadas específicamente en la presente por referencia para todo lo que se describe en las mismas. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, mas no para limitar la invención reivindicada.

EJEMPLOS En la descripción y sección experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: % en peso (por ciento en peso) ; °C (grados centígrados) ; H20 (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; dIH20 (agua desionizada, filtración en illi-Q) ; g o gm (gramos) ; ig (microgramos) ; mg (miligramos) ; kg (kilogramos) ; µ? (microlitros) ; mL y mi (mililitros) ; mm (milímetros) ; µp? (micrómetro o mieras) M (molar) mM (milimolar) ; µ? (micromolar) ; U (unidades) ; PM (peso molecular) ; seg (segundos) ; min (minuto/minutos) ; hr (hora/horas) ; OD (oxígeno disuelto) ; P/V (peso a volumen) ; P/P (peso a peso) ; V/V (volumen a volumen) ; IKA (IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC) ; Genencor (Danisco US Inc, Genencor División, Palo Alto, CA) ; Ncm (centímetro de Newton) y ETOH (etanol) , eq (equivalentes) ; N (normal) ; ds o DS (contenido de sólidos secos) , SAPU (unidad de proteasa de ácido espectrofotométrico, en donde en 1 SAPU es la cantidad de actividad de enzima proteasa que libera un micromol de tirosina por minuto a partir de un substrato de caseína bajo condiciones del ensayo) y GAU (unidad de glucoamilasa, que se define como la cantidad de enzima que producirá 1 g de azúcar reductora calculado como glucosa por hora de un substrato de almidón soluble a pH de 4.2 y 60°C) .

Ej emplo 1 Construcción de Variantes Las variantes en la posición S242 de la secuencia madura de AmyS se construyeron mediante el uso de un enfoque dirigido al sitio.

La plantilla para mutagénesis fue pHPLT-AmyS metilada (véase figura 2) mediante el uso de dam-Methylase de New England Biolabs (Massachusetts ) . Cebadores degenerados (S242F (orward) y S242R (everse) , que se dan más adelante) se sintetizaron y se diluyeron a 10 u en Operon (Hunts ville, AL) con secuencias hacia delante y en reversa complementarias ambas de las cuales contienen un 5' fosfato para ligación en la reacción. La secuencia de la alfa-amilasa progenitora se une a la misma como SEQ ID NO: 2. Se crearon genotecas con el kit Stratagene Quik-Change™ Multi-site (Stratagene, La Jolla CA) mediante el uso de cebadores de oligonucleótido aleatorizados con NN(G/C) en la posición objetivo. El aminoácido seleccionado (es decir, S242) fue aleatoriamente reemplazado por todas las 19 posibles alternativas.

S242 cebadores para mutagénesis: S242 F: 5 ' [Phos] GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG 3' SEQ ID NO: 17 S242 R: 51 [Phos] CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3' SEQ ID NO: 18 La reacción se realizó como sigue: Reacción de Cambio Rápido: La reacción consistió de 18 µ? de H20 destilada estéril, 2.5 µ? de lOx regulador de pH del kit, 1 uL de dNTPs del kit, 1.25 µ? de los cebadores hacia adelante (de 10 uM de material de abastecimiento) , 1.25 µ? de los cebadores de reversa (de 10 µ? de material de abastecimiento) , 1 µ? de ADN de plásmido de pHPLT-AmyS como plantilla (-70 ng) , y 1 µ? de la mezcla de enzima del kit para un total de 26.5 µ? .

Condiciones de Ciclaje: Las condiciones de ciclaje fueron 95°C durante 1 min una vez, después 95°C durante 1 min, 55°C durante 1 min, 65°C durante 10 min para 25 ciclos.

Un microlitro de Dpn 1 (10 U/µ?) se añadió a la mezcla de reacción de cambio rápido Multi-site y se incubó a 37°C durante 18 horas y después otros 0.5 µ? se añadieron durante 3 horas adicionales.

Un microlitro de reacción digerida por Dpnl se usó como plantilla para amplificación de círculo rodante con el kit de amplificación Templiphi (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y la reacción se realizó de conformidad con el protocolo Amersham. Un microlitro de ADN de círculo rodante fue transformado a 100 ul de células competentes de Bacillus subtilis (2 cepas de B. subtilis deletadas proteasa-deletadas (AaprE, AnprE, amyEwxylRPxylAconiK-phleo) ) y agitadas a 37°C durante 1 hora. La transformación entera enseguida se colocó sobre placas de LA + 10 ppm de Neo + 1% de almidón insoluble (25 ul en una placa, 75 µ? en otra placa) y se incubó durante la noche a 37°C. Noventa y seis transformantes se recogieron en 150 ul de LB + 10 ppm de Neo en una placa de micro- titulación y se hizo crecer durante la noche a 37°C. La placa durante la noche fue estampada sobre una placa grande de LA + 10 ppm de Neo + 1% de almidón insoluble con una herramienta de replicación de 96 espigas y sometida a Quintara Biosciences (Berkeley, CA) para PCR y secuenciación en colonias.

Después de que se determinaron secuencias de variantes, las variantes se recogieron en una placa de microtitulación de 96 pozos que contenía 125 ul de LB + 10 ppm de Neo, y se ordenaron las variantes en un formato quad (por cuadruplicado) con controles. La placa de microt itulación ordenada se hizo crecer durante 6 horas a 37°C y 250 rpm . Mediante el uso de una herramienta de replicación (Enzyscreen, Leiden, Países Bajos) la placa de cultivo de microtitulación se usó para inocular una nueva placa de microtitulación (placa de microtitulación y tapas de placa de Enzyscreen, Leiden, Países Bajos) que contenía 150 ul de medio MBD para expresión de proteína (G. Vogtentanz et al, A Bacillus subtilis fusión proteina system to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor, Prot . Expr. & Purif., 55 (2007) 40-52) y complementada con 5 mM de CaCl2 para expresión de proteína. Las placas de expresión se hicieron crecer durante 64 horas a 379C, 250 rpm, y 70% de humedad. Los cultivos de expresión enseguida se filtraron a través de una placa de microfiltro (0.22 um, Millipore, Billerica, MA) y se tamizaron para termoestabi 1 idad mejorada (véase ejemplo 3) .

Ejemplo 2 Expresión, Purificación y Caracterización de Variantes Las colonias se sembraron por estrías de las placas de microtitulación del ejemplo 1 y se pusieron sobre placas de almidón con 10 ppm de Neomicina. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C y colonias individuales se recogieron y se usaron para inocular matraces con agitación (250 mL con 25 mL de medio) que contenían medio (véase más adelante) y 20 ppm de Neomicina. Estas se hicieron crecer hasta 37°C, 275 rpm, durante aproximadamente 8 hr (hasta que se alcanzó una OD (600 nm) de 2.0) . Después de esto, los caldos de cultivo se mezclaron con 50% de glicerol a una relación de 2:1, se pusieron en tubos de cultivo individualmente marcados y se congelaron a -80°C. Fue a partir de estos materiales de abastecimiento de glicerol que se hizo la producción subsecuente de las amilasas seleccionadas.

Las fermentaciones para amilasas se llevaron a cabo en matraces de agitación de 500 mL con crecimiento a 37 °C durante 60 horas en medio de cultivo mínimo MOPS (Neidhardt et al., J. Bacteriol . (1974) 119 ( 3 ) : 736 - 747 ) con 1% (p/v) Soytone . Las enzimas fueron purificadas del caldo de fermentación mediante el uso de cromatografía de interacción hidrofóbica. En resumen, el caldo se concentró 10 veces y después se diluyó de nuevo con 50 mM de MES, 2 mM de CaCl2, H 6.8 con 1M de sulfato de amonio y se filtró en forma estéril mediante el uso de un filtro de fibra de vidrio. Las muestras después se cargaron sobre una columna de alta densidad de fenil sefaraosa FF (20 x 95mm; Amersham, GE Healthcare B io - Se ience s , Suecia) pre - equi 1 ibrada con el mismo regulador de pH . Las proteínas que no eran amilasa fueron eliminadas mediante lavado con 10 volúmenes de columna del mismo regulador de pH sin sulfato de amonio seguido por 5 volúmenes de columna de agua. Finalmente, las enzimas de interés se eluyeron con 50 mM de MES, 2 mM de CaCl2 pH 6.8 que contenía 40% de propi 1 engl icol .

Las concentraciones de proteína se determinaron ya sea mediante un método de densitometría de gel SDS page gel cuantitativo estándar o por una prueba de actividad mediante el uso de un kit de prueba de amilasa estándar de Megazyme (Wicklow, Irlanda) . Las pruebas se convirtieron mediante el uso de una curva estándar generada mediante el uso de amilasa purificada (Bacillus 707 amilasa; SEQ ID NO: 6) .

Ejemplo 3 Determinación de Propiedades Alteradas; Estrés Térmico Este ejemplo muestra que las variantes descritas en la presente pueden tener una propiedad alterada en relación con la alfa-amilasa progenitora. Una determinación selectiva de estabilidad térmica de alto rendimiento de variantes de alfa-amilasa (AmyS) de G. stearothermophilus se llevó a cabo.

Las condiciones de estrés térmico se investigaron y se escogieron de tal manera que después del estrés térmico la enzima de tipo silvestre de inicio mostró aproximadamente 40% de su actividad no estresada (es decir, actividad después de estrés térmico/actividad antes de estrés térmico fue de aproximadamente 0.4) . Genotecas de mutantes fueron determinadas selectivamente por cuadruplicado, y los ganadores potenciales fueron identificados como aquellos que mostraron actividad residual después de estrés térmico que fue por lo menos dos desviaciones estándares más que la actividad residual promedio de la enzima de tipo silvestre de inicio.

La expresión de amilasa fue aproximadamente 100 ppm en los sobrenadantes de cultivo de las placas de expresión. Después de 60-65 horas de crecimiento a 37°C en un agitador humidificado (250 rpm y 70% de humedad relativa) , los sobrenadantes de cultivo fueron clarificados para remover material celular mediante el uso de placas de filtro. Los sobrenadantes clarificados se diluyeron 10 veces en regulador de pH que contenía 50 mM de NaOAc/2.6 mM de CaCl2/0.002% de Tween-20, pH 5.8., a una concentración final de aproximadamente 10 ppm . Una alícuota del sobrenadante se diluyó adi c ionalmente a 0.02 ppm, y la actividad de las variantes de enzima se determinaron como se describe más adelante mediante el uso de un sustrato de almidón de maíz fluorescentemente marcado. Una segunda alícuota del sobrenadante fue sometida a un estrés térmico de 30 minutos a 95°C en un termociclador antes de ser' diluido a 0.02 ppm en 50 mM de NaOAc/2.6 mM de CaCl2/0.002% de Tween-20, pH 5.8 y probado para actividad residual mediante el uso del mismo sustrato fluorescente y prueba descritos más adelante.

La actividad de amilasa se determinó mediante el uso de la prueba de amilasa EnzCheck esencialmente como la describe el fabricante (Invitrogen, San Diego CA) . La concentración final de la amilasa en la prueba fue aproximadamente 0.02 ppm. El regulador de pH de prueba fue 50 mM de NaOAc/2.6 mM de CaCl2/0.002% de Tween-20, pH 5.8. El sustrato fue colorante de fluorescencia BODIPY conjugado con 100 pg/mL de DQ™ almidón de maíz (Invitrogen - Eugene, OR) . La fluorescencia incrementada, que indicaba actividad de amilasa, se midió mediante el uso de un Spectomax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . La reacción se monitoreó a temperatura ambiente durante 5 minutos con el instrumento de registro en modo cinético. La longitud de onda de excitación fue 485 nm ; la emisión se monitoreó a 520 nm con un filtro de corte a 515 nm .

La AmyS de tipo silvestre (Xtra) mostró 33-43% de actividad residual después de ser sometida a estrés térmico durante 30 minutos a 95°C. Variantes de AmyS S242A y S242Q retuvieron 55-65% y 70-80% de actividades residuales, respectivamente, después de las mismas condiciones de estrés térmico. Véase figura 3 y tabla 4. Estas mediciones de actividad residual indican que las dos variantes son más termoestables que la alfa-amilasa de tipo silvestre. En la tabla 4, se lista el por ciento de actividades residuales de cada muestra de variante. Algunas variantes están ausentes de las genotecas, como se indica por la letra de posición tachada. En lugar de las variantes, se usó el tipo silvestre (SPEZYME® Xtra) , como se muestra por el término "WT.11 Cada placa incluye SPEZYME® Ethyl (marcada como "$") y SPEZYME® Xtra (marcada como "Z") como controles.

Tabla 4 Ej emplo 4 Determinación de Propiedades Alteradas; DSC SPEZYME® Xtra, S242A y S242Q fueron purificadas de caldo de fermentación en matraz de agitación (véase ejemplo 2) mediante el uso de cromatografía de interacción hidrofóbica. La proteína se eluyó de la columna en forma purificada mediante el uso de 50 mM de MES, pH 6.8, que contenía 40% de propilenglicol y 2 mM de CaCl2.

El exceso de funciones de capacidad de calor se midió mediante el uso de un microcalorímetro de alto rendimiento de escudriñamiento ultrasensible, VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northarapton, MA) . El procedimiento estándar para mediciones de DSC y la teoría de la técnica se publicó anteriormente (Freiré, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods . Mol. Biol 41, 191-218) . Aproximadamente 500 µ??? de 0.5 mg/ml de a-amilasa de Bacillus stearothermophilus de tipo silvestre o variante S242S y S242Q (en ausencia y presencia de 2 mM de cloruro de calcio) se escudriñaron en un intervalo de temperatura de 30 -120oC. La misma muestra después se re-escudriñó para verificar la reversibilidad del procedimiento. Para -amilasa, el procedimiento de desdoblamiento térmico fue irreversible. El regulador de pH usado fue 10 mM de acetato de sodio, pH 5.5. A 200°C/hr de tasa de escudriñamiento se usó para reducir al mínimo cualesquiera artefactos que pudieran resultar de agregación. El punto medio térmico (Tm) de las curvas de DSC se usó como un indicador de la estabilidad térmica. La tabla 5 muestra los puntos de fusión térmica para las proteínas de amilasa probadas. Las curvas de fusión térmica y los puntos de fusión para el tipo silvestre y amilasa se muestran en la figura 5.

El desdoblamiento térmico para las variantes de amilasa S242A y S242Q en ausencia y presencia de 2 mM de cloruro de calcio muestran incremento considerable en los puntos de fusión para las variantes cuando se comparan con los del tipo silvestre. En ausencia de cloruro de calcio añadido, la amilasa de tipo silvestre tiene un punto de fusión térmico de 100.8°C mientras que los Tm ' s para S242A y S242Q son 106.5°C y 110.1°C, respectivamente. Por lo tanto, la sustitución de S242 con A da por resultado un incremento en la Tm de 5.7°C, y la sustitución de S242 con Q da por resultado un incremento en la Tm de 9.3°C.

En presencia de 2 mM de cloruro de calcio, la amilasa de tipo silvestre caracterizada tiene un punto de fusión térmico de 106.8°C mientras que los Tm ' s para S242A y S242Q son 111.8°C y 113.8°C, respectivamente. Por lo tanto, en presencia de 2 mM de cloruro de calcio todas las tres proteínas desplegadas incrementó los valores de Tm. El incremento en Tm para tipo silvestre y las variantes S242A fue 6°C y 5.3°C, respectivamente. El incremento en Tm para las variantes S242Q fue 3.7°C. Esto sugiere que la variante S242Q es estabilizada menos por calcio o es menos dependiente de calcio para estabilidad. El incremento en la Tm de S242A y S242Q en relación con tipo silvestre en presencia de cloruro dé calcio fue 5°C y 3°C, respectivamente. Esto sugiere que las propiedades termodinámicas de las variantes difieren de las de SPEZYME® Xtra, y es consistente con su rendimiento incrementado en estudios de aplicación (véase ejemplo 5) .

Tabla 5 Ejemplo 5 Perfiles de Actividad Este ejemplo muestra que las variantes probadas tienen perfiles de actividad alterados en relación no sólo con la alfa-amilasa progenitora sino también a un estándar de la industria. Se hicieron determinaciones de proteína en muestras purificada o de placa. Todas las variantes experimentales y alfa-amilasas estándares fueron dosificadas en concentraciones de proteína iguales.

Ya sea las variantes de placa o purificadas se diluyeron hasta aproximadamente 20 ppm mediante el uso de regulador de pH de ácido málico a pH 5.6. El sustrato consistió de 15% de almidón de maíz en el mismo regulador de pH de ácido málico 50 mM, pH 5.6. Cuatrocientos microlitros de la suspensión de almidón se equilibró a 70°C durante 2.5 minutos. Después, 7 ul de la enzima diluida se añadió rápidamente al almidón equilibrado (cono de proteína final, alrededor de 0.36 ppm) . La mezcla de reacción se puso después en un bloque de calentamiento con agitación pre-calentado a 85°C y se mezcló a 300 rpm. A intervalos de tiempo predeterminados, las reacciones se extinguieron con 50 ul de 125 mM NaOH. Los tubos de reacción después se hicieron girar y el sobrenadante se diluyó 10 veces en 10 mM de NaOH, para ser analizados para perfil de DP por HPAEC-PAD.

Las reacciones se realizaron durante 4, 10 y 20 minutos. El área total de DP2 al final de la HPLC se integró y el área se dividió entre la proteína total y el tiempo de reacción .

La reacción de 4 min provee una indicación de qué tan rápido la enzima empieza a descomponer el sustrato; los 10 minutos proveen una indicación de la actividad térmica de la enzima, y los 20 minutos proveen una indicación de la estabilidad térmica de la enzima. Los resultados se proveen en la figura 6 y la figura 7.

Ejemplo 6 Licuefacción en el Viscosímetro Este ejemplo muestra que las variantes S242A y S242Q del ejemplo 3 que tuvieron actividad residual alterada en relación con el progenitor de tipo silvestre también tienen rendimiento alterado en relación con la alfa-amilasa progenitora. Las variantes de alfa-amilasa del ejemplo 2 fueron purificadas y caracterizadas para proteína total y actividad específica antes de su prueba en la aplicación.

La reducción de viscosidad de harina de maíz debido a la acción de la alfa-amilasa fue monitoreada mediante el uso de un instrumento HAAKE Viscotester 550. La pasta acuosa del sustrato se hace diario en modo intermitente con 30% de sólidos secos de harina de maíz. El pH se ajustó a 5.8 mediante el uso de ácido sulfúrico. 50 g de la pasta acuosa (15 g de sólidos secos) se pesa y se pre-incuba, con agitación, durante 10 minutos para calentar a 70°C. Con la adición de alfa-amilasa, la temperatura es inmediatamente aumentada de 70°C a 85°C con una velocidad de rotación de 75. Una vez que la temperatura de la pasta acuosa y mezcla de enzima alcanza 85°C, su . temperatura se mantiene constante y la viscosidad se monitorea durante 30 minutos adicionales. La viscosidad se midió a lo largo de la operación y se reporta en uNm. AmyS de tipo silvestre, S242A, y S242Q fueron todas ellas dosificadas con concentraciones de proteína iguales (20 ó 30 ug/50 g de pasta acuosa de harina de maíz) .

La prueba de aplicación del viscosímetro dio por resultado en ambas variantes de AmyS, S242A y S242Q, que tiene mejor rendimiento que las alfa-amilasas de marca fija - Liquozyme SC, Ethyl , y Xtra. Ambas variantes presentan la característica de viscosidad de pico bajo de Xtra y viscosidad final baja de Liquozyme SC y Ethyl. Cuando se carga a la concentración más baja de 20 ug de proteína total, las diferencias de viscosidades de pico más bajo de las variantes comparadas con las de Liquozyme SC son incrementadas adicionalmente . Véase figuras 8, 9 y 10.

Ejemplo 7 Licuefacción en un Calentador Directo Jet Cooker El maíz entero molido se suspendió a un 32% (sólidos secos de maíz) de pasta acuosa mediante el uso de una relación de 70:30 de agua a subproducto líquido de la destilación. El pH de la pasta acuosa se ajustó a pH 5.8 con NaOH 10 N. La pasta acuosa se calentó a 70°C mediante el uso de agua y vapor en un perol con camisa. Las enzimas de licuefacción (SPEZYME® Xtra, LiquozymeSC o S242Q) se añadieron y la pasta acuosa se calentó a 85°C durante aproximadamente 10 minutos. Después de 10 minutos adicionales de incubación a 85°C, la pasta acuosa se hizo pasar a través de un calentador directo Jet Cooker mantenido a 107°C con un tiempo de contención de 3 minutos mediante el uso de un calentador directo Jet Cooker de planta piloto grande (equipado con un hidrocalentador M103 de Hydro- thermal Corp., Waukesha, isconsin) . El agente de licuefacción se colectó del calentador directo Jet Cooker y se colocó en un baño de agua a 85 °C. Una segunda dosis de enzima de licuefacción se añadió después del calentamiento. El agente licuefaciente se agitó continuamente y se mantuvo a 85°C durante 90 minutos. Las muestras se colectaron a 0, 30, 60 y 90 minutos. Todas las muestras se probaron después del calentamiento para DE (mediante el uso del método de Schoorls; método disponible bajo pedido) , y para viscosidad (viscosímetro tipo Brookfield (Lab-line Instruments Inc. of Melrose Park, Illinois), husillo 3 a 20 rpms) . La dosificación de enzimas de licuefacción antes y después del calentamiento se indican en las siguientes figuras como "X + Y" en donde X representa el número de unidades de enzima añadida antes del calentamiento, e Y representa el número de unidades añadidas al agente de licuefacción después de que pasa a través del calentador directo Jet Cooker. Los resultados se muestran en las figuras 11 y 12.

Ejemplo 8 Licuefacción Intermitente mediante el Uso de Mezcla de las Alfa-Amilasas AmyS S242Q y SPEZYME® FRED Se usó maíz entero molido del molino de alimentación de Lader (Tiffany, Wisconsin) . Se usaron SPEZYME® FRED estándar de laboratorio (actividad 17,662 AAUs/g) y AmyS S242Q estándar de laboratorio .(actividad 14 , 234 AAUs/g) .

Tres pastas acuosas idénticas de maíz entero molido (700 g) se prepararon con agua que contenía 30% v/v de subproducto líquido de la destilación (obtenido de United Ethanol , Milton, Wisconsin) a 32% DS . Las muestras se ajustaron a pH 5.8 mediante el uso de NaOH 6N. Las pastas acuosas se mantuvieron en un baño de agua a 85°C con mezclado y AmyS S242Q (4 AAUs/g de ds de maíz) , Fred (20 LUs/g de ds de maíz) , y una mezcla de AmyS S242Q y Fred (2.8 AAUs/g de ds de maíz y 6 LUs/g de ds de maíz) se añadieron a cada pasta acuosa, respectivamente. El tiempo se inició cuando la temperatura de la pasta acuosa alcanzó 85°C. Las muestras se tomaron para prueba para DE (por Schoorls), °Brix, y viscosidad (por Brookfield) a 30, 60, 90 y 120 minutos. La progresión de DE y datos de viscosidad se resumen en la figura 13 y figura 14.

Como se muestra en la figura 13 y figura 14, la mezcla de AmyS S242Q/Fred redujo satisfactoriamente la viscosidad de la pasta acuosa a 1923 cP en 30 min. Además, la muestra que contenía la mezcla de AmyS S242Q/Fred mantuvo una pendiente de progresión de DE alta durante 120 min, que indicó buena termoestabl i 1 idad . Con respecto a reducción de viscosidad, la figura 14 muestra que AmyS S242Q por sí sola redujo rápidamente la viscosidad a 1584 cP en 30 min, mientras que Fred por sí sola dio por resultado una viscosidad muy alta de 12,000 cP a muestreo de 30 min. Fred por sí sola redujo la viscosidad a menos de 2000 cP por 90 minutos de tiempo de licuefacción, pero si no se señaló antes, esta longitud de tiempo no sería útil en la producción de etanol como se practica actualmente.

En resumen, la pasta acuosa de maíz molido tratada con la mezcla de AmyS S242Q/Fred demuestra las propiedades clave necesarias para producción de etanol eficiente, a saber una disminución rápida en viscosidad de pasta acuosa a por abajo de 2000 cP (en aproximadamente 30 minutos) , que es apropiada para plantas de etanol, y también a una pendiente de progresión de DE alta a lo largo de 120 min de tiempo de licuefacción, lo que demuestra termoestabilidad . Por lo tanto, la combinación de AmyS S242Q y Fred a estos niveles de actividad da por resultado propiedades marcadamente mejores que cualquier enzima por separado .

Ejemplo 9 Producción de Jarabe de Glucosa Mediante el Uso de Mezcla de las Alfa-Amilasas AmyS S242Q y SPEZYME® FRED Un jarabe de glucosa se preparó de un sustrato de almidón. El sustrato se preparó como una pasta acuosa que contenía 38 % ds de sólidos de almidón de maíz al suspender almidón de maíz seco en agua de osmosis de reversa (R.O.) . El pH se ajustó a 5.8, mediante el uso de S02 o carbonato de sodio, según sea apropiado. A esta pasta acuosa, 5 LU de SPEZYME® FRED y 0.6 AAU de AmyS S242Q se añadieron. La pasta acuosa se licuó con un calentador directo Jet Cooker Jet Cooker tipo inyección de vapor HydroHeater Brand a 108 °C con un tiempo de contención de residencia de 5 minutos. Después de esta licuefacción primaria, la pasta acuosa licuada fue sometida a cromatografía instantánea a presión atmosférica y mantenida a 95°C durante 120 minutos o hasta lograr 10 DE. El desarrollo de DE se muestra en la figura 16. La actividad de alfa-amilasa se terminó al ajustar el pH a 3.5 con HCl y al mantener a 95°C durante 20 minutos.

El almidón licuado se enfrió a 60°C, y el pH se ajustó a 4.5 mediante el uso de una solución al 20 % de carbonato de sodio. La sacarificación se hizo mediante tratamiento del almidón licuado a pH 4.5 con mezcla de enzima sacari f i cadora de marca OPTIMAX™ 4060 a una dosis de 0.16 GAU/g de sustancia seca. La producción de glucosa con el tiempo se muestra en la tabla 6.

Tabla 6 El jarabe de glucosa sacarificado final se probó para sedimento al centrifugar 100 mi a 2500 rpm durante 10 minutos. El jarabe contenía menos de 1.5 % de sedimento. Dos gotas del comprimido de centrífuga se removieron y resuspendieron en 5 mi con agua RO. Esta solución se enfrió en un baño de hielo a aproximadamente 10°C, y se añadió 0.5 mi de una solución de yodo 0.02 N. El color permaneció sin cambiar y se juzgó que es negativo a tinción de yodo.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan aquí por referencia. Varias modificaciones y varios de los métodos y sistema descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades preferidas específicas, cabe entender que la invención como se reivindica no debe limitarse a esas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvios para los expertos en la técnica se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NOS: 1-15 1 50 SÉQID. No (1) -AAP™GTNmQYFE7rfYLPDDGTLWTKVANE^aibILSSLGITALWL PAYKG SEQID No (1) -AAPFNGTMMQYFEWYtPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITAliWLPPAYKG SEQID No (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG' SEQID No (1) -AAPFNGTMMQYFE YLPDDGTLWTKVANEANLSSLGITALWLPPAY G SEQID. No (1 } -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTL TKVAEANNLSSLGITALWLPPAYKG SEQID No 6 (.1) HHNGTNGTMMQYFEWYLPNDGNHWNRLNSDASNLKSKGITAV IPPAW G SEQID No 7 (1) - -ANIiNGTLMQYFEWYMPNDGQH KRLQNDSAYLAEHGlTAVWIPPAYKG SEQID No 8 (1) - -ANI^GTL·MQYFEWYMProGQHWRRLQ^roSAYI-ÉHGITAWIPPAY G SEQID No 9 (1) VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAV IPPAYKG. SEQID No 10 (1) HHNGTNGTMMQYFE YLPNDGNHWNRLRSDASNLKDKGISAWIPPAWKG SEQID No 11 (1) HHNGTNGTÍMQYFEWHLP^GNHWNRLRDDASNLRNRGITÁIWIPPÁWKG SEQID No 12 (1) HHNGTNGT MQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDAANLKSKGITAVWIPPAWKG GEQID No 13 (1) - -DGLNGT MQYYE HLENDGQHWNRLHDDAAALSDAGITAIWIPPAYKG SEQID No 14 (1) - -DGLNGTMMQYYEWHLENDGQHWNRLHDDAEALSNAGITAIWIPPAYKG SEQID No 15 (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWIKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG Consenso (1) A NGTMMQYFEWYLPNDGQHW RL NDA NLSS GITAL IPPAYKG 51 100 SEQID No (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAG QVY SEQID No (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY SÉQID No (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY SEQID No (50) TSRSDVGYGVYDLYPLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY SEQID No (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY SEQID No (51) ASQKDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQAAVTSLKNNGIQVY SEQID NO ( 9) TSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVY SEQID No 8 (49) TSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVY SEQID No 9 (47) LSQSDNGYQPYDLYDLGEFQQKGTVRT YGT SELQDAIGSLHSRNVQVY SEQID No 10 (51) ASQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTRNQLQAAVNALKSNGIQVY SEQID No 11 (51) TSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLESAIHALKNNGVQVY SEQID No 12 (51.) TSQNPVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQGAVTSLKNNGIQVY SEQID No 13 (49) SQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAÍGSLKSNDINVY SEQID No 14 ( 9) NSQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAIGSLKSNDINVY SEQID No 15 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYIIQAIQAAHAAGMQVY Consenso (51) TSQSDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQL AI ALHA GIQVY 101 150 SEQID No 1 (100) ADWFDHKGGADGTEVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQA TKFDFPGRGN SEQID NO 2 (100) ADWFDHKGGADGTÉ YDAVEVNPSDRNQEISG.TYQIQAWTKFDFPGRGN SEQID NO 3 (100) ADWFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN SEQID No .4 (100) ADWFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQA TKFDFPGRGN SEQID No 5 (100) ADWFDHKGGADGTEWVDAVEVNPS RNQEISGTYQIQAWT FDKPGRGN SEQID NO 6 (101) GDWMNHKGGADATE VRAVEVNPNNRNQEVTGEYTIEAWTRFDFPGRGN SEQID NO 7 (99) GDWINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHLIKA THFHFPGRGS SEQID No 8 (99) GDWINHKGGADATEDVTA\¾VDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGS SEQID No 9 (97) GDWLNHKAGADATEDV A\¾VNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRG SEQID No 10 (101) GDW NHKGGADATEMVRAVEVNPNNRNQEVSGEYTIEAWTKFDFPGRGN SEQID No 11 (101) GDVVMNHKGGADATENVIAVEVI-iPNNRNQEISGDYTIEAWTKFPFPGRGN SEQID No 12 (101) GDWMNHKGGADGTÉMVNAVEVNRSNRNQEISGEYTIBANTKFDFPGRGN SEQID NO 13 (99) GDWMNHKGADF EAVQAVQVNP NRHQDISGAYTIDA TGFDFSGRNN SEQID NO 14 (99) GDWMNHKLGADFTEAVQAVQVNPSNRWQDISGVYTIDAWTGFDFPGRNN SÉQID No 15 (100) ADWFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQA TKFDFPGRGN Consenso (101) GDWMNHKGGADGTE V AVEVNPSDRNQEISG Y ? AWTKFDFPGRGN 151 200 SEQID NO (150 TYSSFK RVJYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKA DWEVDTEHGNYDY SEQID ÑO (150 TYSSFKVmWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAVÍDWEVDTENGNYDY SEQID No (150 TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY SEQID NO (150 TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY SEQID NO (150 TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS- I KFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY SEQID No (151 THSSF WRWYHFDGVD DQSRRLNNRIYKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDY SEQID No (149 TYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLN-RIYKFQG- -KAWDWEVSNENGNYDY SEQID No 8 (149 TYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLN-RIYKFQG- - KAWDWEVSNENGNYDY SEQID NO 9 (147 TYSDFKWHWYHFDGAD DESRKIS- IFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDY SEQID Nó 10 (151 THSNFKWRWYHFDGVDWDQSRKIiNNRIYKFRGDGKGWDWEVDTENGNYDY SEQID NO 11 (151 TYSDFKWR.WYHFDGVDWDQSRQFQNRIYKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDY SEQID NO 12 (151 THSNFKWRWYHFDGTDWDQSRQLQNKIYKFRGTGKAWDWEVDIENGNYDY SEQID No 13 (149 AYSDFKWRWFHFNGVDWDQRYQEN-HIFRFAN- -TNWNWRVDEENGNYDY SEQID No 14 (149 AYSDFKWRNFHFNGVDWDQRYQEN-HLFRFAN- -TNWNWRVDEENGNYDY SEQID No 15 (150 ???SFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRG- -KAWDWEVDTEFGNYDY Consenso (151 TYS FKWRWYHFDGVDWDESRKLN RIYKFRG GKAWDWEVDTENGNYDY 201 250 SEQID No 1 (199 LMYADLDMDHPEWTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWL SEQID NO 2 (199 LMYADLDMDHPEWTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWL SEQID No; 3 (199 LMYADLDMDHPEWTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFAFFPDWL SEQID NÓ 4 (199 U^YADLD DHPEWTELKNWGKWYVNTTTJIDGFRLDAVKHIKFQFFPDWL SEQID NO. 5 (19? LMYADLD DHPEVVTELKKWGKWYVNTTNIDGFRI^AVKHIKFEFFPDWL, SEQID Nó 6 (201 LMYADIDMDHPEWNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWI SEQID No 7 (196 I^IYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWV SEQID No 8 (196 LMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWV SEQID O 9 (196 ]_MYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWV SEQID NO 10 (201 LMYADID DHPEWNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWI SEQID NÓ 11 (201 LMYADVDMDHPEWNELRRWGEWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWL SEQID NO 12. (201 I^YADIDMDHPÉVINELRNWGWYTÑTLNLDGFRIDAVKHIKYSYTRDWL SEQID NO 13 (196 LLGSNIDFSHPEVQDELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDWV SEQID NO 14 (196 LLGSNIDFSHPEVQEELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDWV SEQID No 15 (197 L YADLD^HPEV\rELKNWGKWY\¾T.TNITCFRLDAVKHIKFSFFPDWL Consenso (201 LMYÁDID DHPEW ELKNWG WY NTLNLDGFRLDAVKHIKFSF DWL 251 300 SEQID NO (249 SYVRSQTGKPLFrVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA SEQID No (249 SYVRSQTGKPXJFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA SEQID No (249 SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA SEQID No (249 SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA SEQID NO (249 SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKT GTMSLFDAPLHNKFYTA SEQID No (251 NHVRSATGKNMFAVAEFWKNDLGAIENYLQKTNWNHSVFDVPLHYNLYNÁ SEQID No (.245 NHTOEKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAA SEQID No 8 (246 NHTOEKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAA SEQID No 9 (246 QAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAA SEQID No 10 (251 NHVRSATGKNMFAVAEF KNDLGAIENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNA SEQID No 11 [251 THVRNATGKEMFAVAEFWK DLGALENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNA SEQID No 12 (251 THVRNTTGKPMFAV EFVÍKNDLAAIENYLNKTSWNHSVroVPLHYNLYNA SEQID No 13 (246 RHQRNEADQDLFWGEYWKDDVGALEFYLDE NWEMSLFDVPLNYNFYRA SEQID No 14 (246 RHQRSEAEQDLFWGEYWKDDVGALEFYLDEMNWEMSLFDVPLNYNFYRA SEQID NO 15 (247 SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA Consenso (251 SHVRS TGK LFTVGEYW DIGALENYL KTNW MSLFDVPLHYNFY A 301 350 SEQID No 1 (299 SKSGGAFDMRTLMTNTL KDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP SEQID No 2 (299 SKSGGAFDMRTLMTNTLM DQPTI-AVrFVDNHDTEPGQAIiQSWVDPWF P SEQID No 3 (299 SKSGGAFDMRTl^Tl^LMKDQPTlAWFTONHDTEPGQALQS TOPWFKP SEQID NO 4 (299 S SGGAFDMRTLMTNTLM DQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP SEQID NO 5 (299 SKSGGAFDMRTLMTNTLM DQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQS VDPWFKP SEQID NO 6 (301 SKSGGNYDMRNIFNGTWQRHPSHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFKP SEQID NO 7 (29S STQGGGYDMRKLLNGTWSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQT EKP SEQID No 8 (296 STQGGGYDMRKLLNGTWSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKP SEQID. No 9 (296 SSQGGGYDMRRLLDGTWSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKP SEQID No 10 (301 SKSGGNYDIIRQIFNGT QRHPMHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWF P SEQID No 11 (301 SNSGGNYDHAKLLiNGTWQKHPMHAVTFVDNHDSQPGESLESFVQEWFKP SEQID No 12 (301 SNSGGYFDMRNILNGSWQKHPIHAVTFVDNHDSQPGEÁLESFVQSWFKP SEQID No 13 (296 SQQGGSYDMRNILRGSLVEAHPMHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWF P SEQID No 14 (296 SKQGGSYDMRNILRGSLVEAHPIHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWFKP SEQID No 15 (297 SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP Consenso (301 SKSGGAYDMR LL GTLV HP AVTFVDNHDTQPGQALESWVD WF P 351 400 SEQID No (349 LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQY IPSLKSKIDPLLIARRDYA SEQID. No (349 LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN- - - IPSLKSKIDPLLIARRDYA SEQID N (349 LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN 1PSLKSKÍDPLLIARRDYA SEQID No (349 LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN- - - IPSLKSKIDPLLIARRDYA SEQID No (349 LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN- .--IPSLKSKIDPLLIARRDYA SEQID NO (351 LAYALTLTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG- - -VPAMRSKIDPILEARQKYA SEQID NO (346 LAYAFILTR3SGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYA SEQID NÓ 8 (346 liAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYA SEQID No 9 (346 LAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYA SEQID No. 10 (351 LAYALTLTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG- - -VPAMRSKIDPILEARQKYA SEQID No 11 (351 LAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHS VPAMKAKIDPILEARQNFA SEQID No 12 (351 IAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG- - -VPSMKSKIDPLLQARQTYA SEQID No 13 (346 LAYATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDN¦* - - ISAKKDMIDELLDARQNYA SEQID NO 14 (346 LA ATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDN- - ISAKKDMIDELLDARQNYA SÉQID No 15 (347 LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN IPSLKSKIDPLLIARRDYA Consenso (351 LAYAFILTRE GYP VFYGDYYGIPQYN IPSLKSKIDPLL ARR YA 401 450 SEQID No ( 96 ) YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA SEQID No (396) YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVCKQHA SEQID No ( 96) YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA SEQID NO (396) YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTHKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA SEQID NO (396) YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA SEQID No ( 98) YGKQNDYLDHHNIIGWTREGN.TAHPNSGLATIMSDGAGGSKWMFVGRNKA SEQID NO (396) YGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNA SEQID ÑO 8 (396) YGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNA SEQID No 9 (396) YGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNA SEQID No 10 ( ,98 ) YGRQNDYLDHHNIIGWTREGNTAHPNSGLATIMSDGÁGGNKWMF'/GRNKA SEQID No 11 (398) YGTQHDYFDHHNIIGWTREGNTTHPNSGLATIMSDGPGGÉKWMYVGQNKA SEQID No 12 (398) YGTQHDYFDHHDIIGWTREGDSSHPNSGLATIMSDGPGGNKWMYVGKHKA SEQID No 13 (393) YGTQHDYFDH DWG TREGSSSRPNSGLATIMSNGPGGSKWMYVGRQNA SEQID NÓ 14 (393) YGTQHDYFDHWDIVGWTREGTSSRPNSGIATIMSNGPGGSKWMYVGQQHA SEQID- No 15 ( 94) YGTQHDYLDHSDIIGOTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGS WMYVGKQHA Consenso (401) YGTQHDYLDH DIIGWTREG TSKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQ A 451 500 SEQID No ( 46) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEF VNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT SEQID No (446) G VFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTT- SEQID No ( 6) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT SEQID No (446 ) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT SEQID NO (4 6) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDG GEFKyNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT SEQID NO ( 48j GQVWSDITGNRTGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK SEQID No (4 6) GETWHDITGNRSEPWINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQR SEQID NO 8 (446) GETWHDITGNRSEPWINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQR SEQID No 9 (4 6) GET YDITGNRSDTV IGSDG GEFHVNDGSVSIYVQK SEQID No 10 (4 8) GQV TDITGNRAGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK- - SEQID No 11 (448) GQV HDITGNKPGTVTINADGWftNFSVNGGSVSIWVKR SEQID No 12 (448) GQ RDITGNRSGTVTINADGWGNFTVNGGAVSVWVKQ SEQID No 13 (4 3) GQTWTDLTGNNGASVTINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ SEQID No 14 (4 3) GQTWTDLTGNHAAS TINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ------- SEQID No 1S <44 ) GKVFYDLTGN SDTVTINSDGWGEF VNGGSVSV VPRKTTVS Consenso (451) G VWYDLTGNRSDTVTINSDGWGEF VNGGSVSVWV R 501 520 SEQID NO 496) TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP SEQID NO 487)· -- SEQID No 496) TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP SEQID No 496) TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP SEQID No 496) TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP SEQID No 486) SEQID No 484) SEQID Nó 8 484) SEQID No 9 484) - - SEQID No 10 4S6) ..... _ SEQID No 11 486) -- SEQID NO 12 486) - SEQID No 13 481) SEQID No 14 481) SEQID No 15 487) --- Consenso 501) SEQ ID NO: 16: Secuencia de proteína de a-amilasa de Geohacillus stearothermophilus truncada (AmyS, a/k/a "EthyO"). La secuencia de señal se muestra en negrillas. 1 MLTFHRIIRK GWMFLLAFLL TASLPCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFE YL 51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITAL LPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG 101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADWFDH KGGADGTEWV 151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW 201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKN 251 GKWYV TTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY 301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TL TNTL KD 351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD 401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWTREGVTE ¦ 451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDG G 501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT SEQ ID NO: 17: S242 cebador para mutagénesis: S242 F: 5' [Phos]GTCAAGCATAl AAGT CNNSTl"rT rCCTGAlTGG rG 3' SEQ ID NO: 18: S242 cebador para mutagénesis: S242 R: 5'[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3' SEQ ID NO:19: Secuencia de proteína madura de fitasa de Buttiauxella BP-17 NDTPASGYQV EKWILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP E PVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAA GNI HSEQEWASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR WSQSVEPGC QLQ SEQ ID NO: 20: Secuencia de aminoácidos de a-an lasa SPEZYME® FRED 1 ANLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS 51 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD 101 VVINH GGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTH FHFPGRGSTY 151 SDFKWH YHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK A DWEVSSEN GNYDYLMYAD 201 IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE 251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG 301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF 351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH 401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGET H 451 DITGNRSEPV VINSEG GEF HVNGGSVSIY VQR hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (41)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una mezcla de alfa-amilasa, caracterizada porque comprende : (i) una alfa-amilasa de B. stearothermophilus (AmyS) en donde el aminoácido en la posición S242 es sustituido, mediante el uso del sistema de número de aminoácido mostrado en SEQ ID NO: 2; y (ii) una alfa-amilasa de B. licheniformis.

2. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una fitasa .

3. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mezcla comprende una relación en peso de aproximadamente 40% de la AmyS con la sustitución de S242 y aproximadamente 60% de alfa-amilasa de B. licheniformis .

4. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la relación en peso de AmyS con la sustitución de S242 a alfa-amilasa de B . licheniformis es 10:90.

5. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una relación de actividad de aproximadamente 1400 AAU/g a aproximadamente 14000 AAU/g de la AmyS con la sustitución de S242, y de aproximadamente 8000 LU/g a aproximadamente 19000 LU/g de alfa-amilasa de B. lichenifor is.

6. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la AmyS comprende la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : 2.

7. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la AmyS comprende la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 4.

8. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la AmyS se selecciona de una de las enzimas AmyS que comprende la secuencia de polipéptido de SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16.

9. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 ó 8, caracterizada porque la sustitución de S242 es una sustitución de S242A, S242E, S242Q, S242F, S242H o S242N.

10. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 ó 8, caracterizada porque la AmyS con la sustitución en la posición S242 tiene una termoestabilidad más alta entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 95 °C comparada con una AmyS sin la sustitución de S242.

11. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la AmyS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la AmyS de SEQ ID NO: 1, y en donde la AmyS tiene actividad de alfa-amilasa .

12. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la alfa-amilasa de B. licheniformis comprende una enzima purificada de tipo silvestre.

13. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la alfa-amilasa de B. licheniformis comprende una o más sustituciones de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre seleccionada del grupo que consiste de M15T, H133Y, N188S y A209V.

14. La mezcla de alfa-amilasa le conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la alfa-amilasa de B. licheniformis comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20.

15. La mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la alfa-amilasa de B. licheniformis comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 98% o 99% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 20.

16. Un método para licuar almidón caracterizado porque comprende : añadir una mezcla de amilasa de conformidad con la reivindicación 1 a una solución que comprende almidón, y licuar la solución que comprende almidón para formar una pasta acuosa.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la mezcla de amilasa tiene una relación de actividad de aproximadamente 40% (como AAU/g DS) de la AmyS con la sustitución de S242 y aproximadamente 60% (como LU/g DS) alfa-amilasa de B. licheniformis.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el almidón se obtiene de material vegetal, maíz, sorgo, centeno, cebada, trigo, zahina, avena, arroz, salvados, mandioca, mijo, papa, camote o tapioca.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el almidón es almidón granulado ya sea de un procedimiento de molienda en seco o en húmedo.

20. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además un paso de licuefacción primario y/o secundario, que incluye añadir sustrato adicional a la pasta acuosa en el paso de licuefacción primario y/o secundario.

21. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además añadir una enzima hidrolizante de ácido fítico.

22. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además sacarificar el almidón licuado para obtener azúcares fermentables .

23. El método de conformidad con la reivindicación 22 , caracterizado porque comprende además fermentar los azúcares fermentables bajo condiciones de fermentación adecuadas para obtener productos finales de alcohol.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los productos finales de alcohol son etanol o butanol .

25. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el pH de la licuefacción está en el intervalo de pH 4.5 a 5.4, y compuestos químicos neutralizantes de ácido no se añaden al paso de procedimiento de licuefacción.

26. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el pH de la licuefacción está en el intervalo de pH 4.8 a 5.8, y compuestos químicos neutralizantes de ácido no se añaden al paso de procedimiento de licuefacción.

27. Un método para obtener un sustrato fermentable caracterizado porque comprende: poner en contacto una pasta acuosa de grano molido que contiene almidón granulado con una enzima hidrolizante de ácido fítico y una mezcla de alfa-amilasas de conformidad con la reivindicación 1 a una temperatura de 0-30°C menor que la temperatura de gelatinización del almidón, aumentar la temperatura por arriba de la temperatura de gelatinización, hidrolizar el almidón gelatinizado, y obtener un sustrato fermentable.

28. Un método para producir un azúcar fermentable caracterizado porque comprende: (a) mezclar material que contiene almidón molido con agua y subproducto líquido de la destilación, en donde el subproducto líquido de la destilación está en el intervalo de 10 a 70% v/v, y obtener una pasta acuosa que comprende almidón y que tiene un contenido de sólidos secos (ds) de 20 a 50% p/p, (b) tratar la pasta acuosa con una fitasa antes de o simultáneamente con licuefacción del almidón, (c) licuar el almidón, (d) añadir una mezcla de alfa-amilasa de conformidad con la reivindicación 1 al almidón ya sea durante el paso (b) y/o simultáneamente con el paso de licuefacción, y (e) sacarificar el almidón licuado para obtener azúcares fermentables , en donde el pH no se ajusta durante cualquiera de los pasos (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el azúcar fermentable es recuperado y purificado o isomerizado.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la fitasa se añade antes del paso de licuefacción.

31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la mezcla de alfa-amilasa se añade con la fitasa.

32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque una segunda dosis de la mezcla de alfa-amilasa se añade durante el paso de licuefacción o se añade durante el paso de sacarificación.

33. Un método para producir glucosa caracterizado porque comprende : poner en contacto un sustrato de almidón con una mezcla de amilasa de conformidad con la reivindicación 1, licuar el sustrato de almidón, e incubar el sustrato a alta temperatura para producir un producto que comprende glucosa.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el paso de incubación es un paso de licuefacción secundario.

35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el paso de incubación es conducido a una temperatura de aproximadamente 90-100°C.

36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la incubación es conducida durante un tiempo suficiente para que el producto comprenda aproximadamente 2-14 DE de glucosa.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la incubación es conducida durante un tiempo suficiente para que el producto comprenda aproximadamente 10 DE de glucosa.

38. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende además sacarificar el producto para producir una solución rica en glucosa.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la solución rica en glucosa comprende 80-99% de glucosa.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la solución rica en glucosa comprende aproximadamente 93-96% de glucosa.

41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la sacarificación comprende poner en contacto el producto de glucosa con glucoamilasa o una mezcla de enzima que comprende una glucoamilasa y una pululanasa.