CN104869841A - 具有蛋白酶活性的多肽和编码它的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体，载体和宿主细胞(包含植物和动物细胞)，以及生产和使用(尤其在动物饲料和洗涤剂中使用这些蛋白酶)这些蛋白酶的方法。
相关技术说明
本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
多年来，洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用了不同酶，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每种酶适于除去不同类型的污物。除这些酶之外，洗涤剂组合物典型地包括成分的复合物组合。例如，大多数清洁产品包括表面活性剂体系、漂白剂或助洗剂。不管当前洗涤剂的复杂度如何，但是对于研发包括新的酶和/或酶共混物的新的洗涤剂组合物仍存在需要。
传统地，已经在升高的温度下进行洗涤，并且已经选择熟知的洗涤剂在较高的温度下进行。
对改进洗涤过程以便使得它们更环保的增加的聚焦导致如下全球趋势：降低洗涤时间、pH和温度，并且减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。因此存在希望，例如希望在较低温度下洗涤，并且因此对在不同条件下(例如在低温下)具有高性能的洗涤剂蛋白酶存在需要。
在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物性蛋白来源获得这些必需蛋白。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。
当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉固体未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。
动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多鱼中，胃展现了低至pH 1-2的强酸性pH，而肠展现了在pH 6-7范围内的一个更中性的pH。除了胃和肠之外在胃之前家禽还具有一个嗉囊，该嗉囊中的pH主要取决于咽下的饲料并因此典型地处于pH 4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，假如该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下的话。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的：它是高度地酸稳定的以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的宽的生理pH下是有效地有活性的。
另外，动物饲料常常是以丸形式配制的，其中在该造丸过程中采用蒸汽。因此以下也是令人希望的，在动物饲料中使用的蛋白酶能在暴露于蒸汽处理之后保持活性。
在动物饲料中使用蛋白酶以改善饲料中蛋白的消化是已知的。WO95/28850披露了一种植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶组合以改善植物性蛋白的溶解度。WO 01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 01/58276披露了与以下蛋白酶相关的酸稳定性蛋白在动物饲料中的用途：衍生自拟诺卡菌NRRL 18262(10R蛋白酶)的蛋白酶，连同衍生自白拟诺卡氏菌DSM 14010的一种蛋白酶。WO04/072221、WO 04/111220、WO 04/111223、WO 05/035747以及WO05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。另外，WO 04/072279披露了其他蛋白酶的用途。WO 04/034776披露了一种枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的用途。WO 04/077960披露了一种通过采用一种细菌或真菌蛋白酶增加草料或谷物在反刍动物中的消化率的方法。
包含一种蛋白酶的并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包含ProAct(DSM NP/诺维信公司(Novozymes))、(丹尼斯克公司(Danisco))、(丹尼斯克公司)、(丹尼斯克公司)、AllzymeTM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、PoultrygrowTM(杰夫公司(Jefo))和DP100(诺伟思公司(Novus))。
发明概述
本发明涉及具有蛋白酶活性的一种分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或***；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
本发明还涉及本发明的蛋白酶在动物饲料和清洁过程，生产动物饲料组合物和洗涤剂组合物的方法，以及动物饲料组合物和洗涤剂组合物中的用途。
本发明还涉及编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-185至-157或由其组成的信号肽的一种多核苷酸、编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-156至-1或由其组成的前肽的一种多核苷酸、或编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-185至-1或由其组成的信号肽和前肽的一种多核苷酸，其每一者被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及涉及产生一种蛋白质的方法。
序列表综述
SEQ ID NO:1是来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的DNA序列
SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列
SEQ ID NO:3是成熟变孢指孢囊菌蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是枯草杆菌蛋白酶309蛋白酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:5是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是克劳氏芽孢杆菌分泌信号。
附图简要说明
图1示出了来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1在37℃下、对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性曲线。
图2示出了来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时后的残余活性)。
图3示出了来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1在pH 7.0下、对Protazyme AK的温度活性曲线。
图4示出了来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1在pH 9.0、25℃下，对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性。
图5示出来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1与10R蛋白酶相比，对大豆-玉米粉的活性。
定义
具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5；欧洲生物化学杂志1995，232，1-6；欧洲生物化学杂志1996，237，1-5；欧洲生物化学杂志1997，250，1-6；以及欧洲生物化学杂志1999，264，610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或
(b)S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；
如在生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.(2010)MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidasedatabase)，核酸研究(Nucleic Acids Res)38，D227-D233中。
为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S1家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行测定，而不论其是天然或野生型蛋白酶；还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。
S1家族的蛋白酶包含按His、Asp、Ser顺序的催化三联体。该催化三联体的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。来自变孢指孢囊菌(SEQ ID NO:2)的S1蛋白酶1的催化三联体的氨基酸可能是位置His-32、Asp-56和Ser-136。
可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。蛋白酶底物的实例是酪蛋白(例如天青精交联酪蛋白(AZCL-酪蛋白))、或suc-AAPF-pNA。适合的蛋白酶测定的实例描述于实验部分中。
术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性(EC 3.4.21.)。用于测定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。出于本发明的目的，如在本申请的实例中所述，可以使用Protazyme AK片剂(交联并且染色的酪蛋白，来自麦格酶公司(Megazyme))，来测定蛋白酶活性。本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
术语“等位基因变体”意指占用同一染色***点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“催化结构域”意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。
术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌(zinc)、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与根据本发明的蛋白酶以及该组合物中使用的其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其意图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂)。
术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的蛋白酶以外，该术语涵盖了包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白***或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。
在此将术语“酶洗涤益处”或“洗涤”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要的洗涤益处是在洗涤和或清洁之后没有或有非常少的可见污垢的污物去除，预防或减少在洗涤过程中释放的污垢的再沉积(一种也被称作抗再沉积的效果)，完全或部分恢复纺织品的白度(一种也被称作增白的效果)，这些纺织品初始是白色的但是在重复使用和洗涤后获得浅灰色或浅黄色的外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。
在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
在此将术语“改进的洗涤性能”定义为一种酶，例如一种蛋白酶(还有酶的共混物，不只是变体还有骨架，以及与某种清洁组合物组合，等)相对于另一种蛋白酶或亲本蛋白酶的洗涤性能展示出例如所述蛋白酶的洗涤性能的改变，例如增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。
术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于使用埃德曼(Edman)降解化学的氨基酸测序，成熟多肽是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO 3的氨基酸1至187。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸656至1216。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼***DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“核酸构建体”意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。
术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产***内部的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。
术语“基本上纯的多肽”意指包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料的任何纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如玷污的家居衣物。当使用术语织物或服装时，旨在也包括广义术语纺织品。
不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的术语“纺织品护理益处”，对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一纺织品转移至另一纺织品或同一纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。
术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、***和/或缺失)的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且***意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。
在此将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度可包括来自以下列表的一个或若干个问题：着色剂或染料作用；不完全污物去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。
发明详细说明
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少78％，至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽，该多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少81％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少83％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少86％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少87％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少88％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少89％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少91％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少92％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少93％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少94％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少96％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
本发明的多肽优选地包括或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至187或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或其全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。
在一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸101至1405、核苷酸188至1222、核苷酸665至1222、或核苷酸800至1200。在另一个方面中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO：1。
在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或***的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或***的数目不超过20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19。在另一个实施例中，包括在SEQ ID NO:2的成熟多肽中的取代、缺失和/或***的位置的数目是在1和20之间，例如1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:2的成熟多肽中的取代、缺失和/或***的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2的成熟多肽中的取代、缺失和/或***的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽中的保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。通过与10R蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 5)比对，在本发明的多肽中，形成催化三联体的必需氨基酸已经被鉴定为对应于SEQ ID NO:2中的His-32、Asp-56和Ser-136的氨基酸。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
实施方式
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸汽稳定性、pH特性如酸稳定性等。
酸度/碱度特性
在本发明的某些实施例中，就pH而言，本发明的蛋白酶展现了有益的特性，例如酸稳定性等。蛋白酶在一个低的pH下的稳定性是有益的，这是因为该蛋白酶可以在穿越胃之后在肠中具有活性。因为洗涤剂组合物常常具有碱性pH，所以蛋白酶在高pH下的稳定性对清洁和洗涤是有益的。在本发明的一个实施例中，该蛋白酶在pH 4下2小时之后保留>90％的活性，如使用实例4中所述的方法确定的。在本发明的另一个实施例中，该蛋白酶在pH 10下2小时之后保留>90％的活性，如使用实例4中所述的方法确定的。
本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了出人意料的pH特性，尤其是pH稳定性特性，这使得它们成为用于在动物饲料和/或洗涤剂中使用的感兴趣的候选物。
洗涤性能
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的洗涤性能。因而，与不具有任何蛋白酶的洗涤剂相比，来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1在去污方面更有效。甚至在20℃，来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶在除去血液和鸡蛋污物方面是有效的。
饲料应用
本发明的蛋白酶在从pH 4-11的广范围内对Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有活性并且在pH 6-11范围中展现尤其高的活性，在与小肠连同家禽的作物相关的pH下，对饲料相关的大豆粉-玉米粉底物具有活性并且经受低至3的pH 2小时后仍保留多于70％活性。因而，来自本发明的变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1适用于多种饲料应用。
具有蛋白酶活性的多肽的来源
可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经***来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是一种***多肽，如具有蛋白酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳酸杆菌属属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、糖丝菌属(Saccharothrix)或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一个方面中，该多肽是来自放线菌纲的细菌的蛋白酶，例如来自放线菌目，或来自微单孢菌亚目，或来自微单孢菌科，或来自指孢囊菌属。在另一个方面中，该多肽是一种变孢指孢囊菌多肽。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。使用的菌株在登录号ATCC 31203或DSM 43911下是公开可获得的。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上)。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide toMethods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由指孢囊菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。
编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression andPurification)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其***载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列；可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控***的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核***中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核***中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处***或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝***到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝***孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474；以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选方面中，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在一个更优选的方面中，该细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个方面中，该细胞是指孢囊菌属细胞。在一个更优选的方面中，该细胞是变孢指孢囊菌细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。
表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990，Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998，Plant CellPhysiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998，J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998，Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、***、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然338:274)。
目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(PlantJ.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。
信号肽和前肽
本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQID NO:2的氨基酸-185至-157或由其组成。本发明还涉及一种编码前肽的分离的多核苷酸，该前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-156至-1或由其组成。本发明还涉及一种编码信号肽和前肽的分离的多核苷酸，该信号肽和前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-185至-1或由其组成。所述多核苷酸可以进一步包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质与信号肽和/或前肽可操作地连接。该蛋白质优选地对于该信号肽和/或前肽来说是外来的。在一个方面中，编码该信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:101的核苷酸1至187。在另一个方面中，编码该前肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸188至655。在另一个方面中，编码该信号肽和该前肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸101至655。
本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多种额外的清洁组合物组分的本发明的多肽。因而，在一个实施例中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽的洗涤剂组合物，这些多肽具有蛋白酶活性。
另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
本发明的酶
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.001-200mg的蛋白，例如0.005-100mg的蛋白，优选0.01-50mg的蛋白，更优选0.05-20mg的蛋白，甚至更优选0.1-10mg的蛋白。
可以使用常规的稳定剂来稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些稳定剂是例如多元醇，如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物，或者如在WO 2005/105826和WO 2009/118375中所述的可使用肽醛或酮对根据本发明的多肽进行稳定。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、以及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、以及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是一种化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述(2007)，胶体&界面科学新见(Current Opinion inColloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的***(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以包括按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂共助洗剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白***
该洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如约1％至约5％的漂白***。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白***。适合的漂白***组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白***的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白***，该***可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白***可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白***还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白***还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9到24个碳的支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R1独立地是含有从9到18个碳的支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白***描述于例如WO2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、WO 2007/087242中。合适的合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
该洗涤剂可以包括按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的一种聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂还披露于例如WO 2007/087257、WO 2007/087243中。
(另外的)酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的清洁剂相容(即最佳pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(GenencorInternational Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(KaoCorporation))。
蛋白酶：待与本发明的蛋白酶一起使用的适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰刀菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌属(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、61、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、G61E,D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、 Ultra、 Ultra、 Ultra、 Ultra、 以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPurafectPurafectPurafect 以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为柔毛腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO95/06720&WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶：可以与本发明的蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有一个缺失并且在位置193中具有一个取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ IDNO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C末端的截短和/或取代、缺失或***的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或***的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor InternationalInc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包括一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。
无尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-***-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]***-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个芯结构和连接至该芯结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。芯结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用结合在此)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他合适的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂、用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两层或更多层的片剂、规则或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩或浓缩的液体。
洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器剂量单位的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的隔室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及,羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混的组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol LLC公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征：
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包括从0％-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的多肽可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将一固体物体(例如洗衣皂条)放置于一个容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。
洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO 04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO09/112296、WO 09/112298、WO 09/103822、WO 09/087033、WO09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO09/122125、WO 09/095645、WO 09/040544、WO 09/040545、WO09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO09/068501、WO 09/065770、WO 09/021813、WO 09/030632以及WO09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO2011005623、WO 2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO2011005630、WO 2011005830、WO 2011005912、WO 2011005905、WO2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO 2010120863、WO2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO2010033897、WO 2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO2010030539、WO 2010024467、WO 2010024469、WO 2010024470、WO2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、WO 2010145887、WO2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO 2010099997、WO2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO2010003783、WO 2010003792、WO 2011023716、WO 2010142539、WO2010118959、WO 2010115813、WO 2010105942、WO 2010105961、WO2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO 2010078979、WO2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO2010060821、WO 2010049187、WO 2010031607、WO 2010000636，
用途
本发明还针对根据本发明的蛋白酶或其组合物在纺织品和织物洗衣中的使用方法，如居家衣物清洗和工业衣物清洗连同用于动物饲料。
本发明还针对用于在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方法。因而，在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的蛋白酶或包括根据本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物在清洁(例如衣物洗涤或餐具洗涤)中的用途，该蛋白酶与以下成熟多肽具有序列一致性因而，在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽的用途，这一分离的多肽在洗涤剂、清洁过程和/或衣物洗涤过程中具有蛋白酶活性。
在洗涤剂中的用途。可以将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。
本发明的蛋白酶在洗涤剂中的用途
对于洗涤剂配制者而言重要的污垢和污物由许多不同物质构成，已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用至其中的清洁过程中特异性地改善污物去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，例如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。
在一个方面中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽在洗涤剂组合物和清洁过程，例如衣物洗涤和硬表面清洁中的用途。因而，在一个方面中，本发明展示了本发明的多种示例性蛋白酶对各种污物以及在各种条件下的洗涤效果。在本发明的一个特定的方面中，该洗涤剂组合物及在清洁过程中的用途涉及本发明的蛋白酶与以上提及的去污酶中的至少一种一起使用。
在本发明的一个优选方面中，根据本发明有用的本发明的蛋白酶可以与至少两种酶组合。这些另外的酶详细描述于“其他酶”部分中，更优选是至少三种、四种或五种酶。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性(carbolytic activity)、蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。酶组合可以例如是本发明的一种蛋白酶与另一种去污酶，例如本发明的一种蛋白酶与一种淀粉酶、本发明的一种蛋白酶与一种纤维素酶、本发明的一种蛋白酶与一种半纤维素酶、本发明的一种蛋白酶与一种脂肪酶、本发明的一种蛋白酶与一种角质酶、本发明的一种蛋白酶与一种果胶酶或本发明的一种蛋白酶与一种抗再沉积酶。更优选地，本发明的蛋白酶可以与至少两种其他去污酶组合，例如本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种淀粉酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种半纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种半纤维素酶。甚至更优选地，本发明的一种蛋白酶可以与至少三种其他去污酶组合，例如本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一张半纤维素酶。本发明的蛋白酶可以与任何选自非穷尽性列表的酶组合，该列表包括：糖酶(例如淀粉酶)、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、黄原胶酶或支链淀粉酶，肽酶，其他蛋白酶或脂肪酶。
在本发明的另一个实施例中，本发明的蛋白酶可以与一种或多种金属蛋白酶组合，例如M4金属蛋白酶，包括NeutraseTM或嗜热菌蛋白酶。此类组合可以进一步包括如上概述的其他洗涤剂酶的组合。
清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是它也可以是工业洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水洗溶液。
经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤剂性能。
本发明进一步涉及本发明的蛋白酶在除去蛋白质污物过程中的用途。蛋白质污物可能是如食品污物等污物，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、奶、墨水、草、或其组合。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白***通常通过氧化除去颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。
在一个具体实施例中，本发明涉及包括本发明的蛋白酶的一种组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包括以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白***或漂白组分。
在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白***和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白***和/或漂白组分的量有所减小。优选地，作为一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白***和/或漂白组分的该至少一种组分按以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶的情况下组分在***中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个方面中，将本发明的蛋白酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白***或漂白组分和/或聚合物。
洗涤方法
包含本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约9的pH。可以在溶液中按以下浓度使用这些组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。
在具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
本发明涉及一种用包括本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。
一个优选实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个衣物洗涤或餐具洗涤过程。
另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污物的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。
在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，如选自下组的酶，该组由以下各项组成：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，木聚糖酶或角质酶或其组合。在又另一个优选实施例中，这些组合物包括减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白***或漂白组分或聚合物。
还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以任何织物处理方法使用蛋白酶，这些方法在本领域是已熟知的(参见，例如，美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，通过一种方法改善织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一个方面中，在压力下用该溶液处理该织物。
在一个实施例中，在纺织品编织过程中或之后或者在脱浆阶段或一个或多个另外的织物加工步骤过程中应用该蛋白酶。在纺织品编织过程中，螺纹暴露于大量的机械应变中。在机械织布机上进行编织之前，为了提高拉伸强度并防止破裂，经常在经纱上涂上淀粉浆或淀粉衍生物。可以应用该蛋白酶来除去这些蛋白质浆或蛋白质衍生物。在编织完纺织品之后，织物可以进行到脱浆阶段。这之后可以是一个或多个另外的织物加工步骤。脱浆是从纺织品上除去浆料的作用。编织后，为了确保均匀和耐洗效果，应在对织物进行进一步加工之前除去所涂的浆料。还提供了一种脱浆方法，该方法包括通过酶的作用酶促水解浆料。
低温用途
本发明的一个实施例涉及一种进行衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁的方法，该方法包括使有待清洁的表面与本发明的一种蛋白酶接触，并且其中所述衣物洗涤、餐具洗涤、工业或机构清洁在约40℃或以下的温度下进行。本发明的一个实施例涉及本发明的蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中的用途，其中衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或以下。
在另一个实施例中，本发明涉及本发明的蛋白酶在除蛋白过程中的用途，其中除蛋白过程中的温度是约40℃或以下。
因而，本发明的一个方面涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽的用途，该多肽在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中具有蛋白酶活性，其中在衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或更低。
本发明还涉及本发明的蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的用途，该蛋白酶与具有(SEQ ID NO 4)的枯草杆菌蛋白酶309蛋白酶相比具有至少一种改进的特性，并且其中衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的温度在约40℃或以下的温度下进行。
在以上确定的方法和用途的每一者中，洗涤温度是约40℃或以下，例如约39℃或以下、例如约38℃或以下、例如约37℃或以下、例如约36℃或以下、例如约35℃或以下、例如约34℃或以下、例如约33℃或以下、例如约32℃或以下、例如约31℃或以下、例如约30℃或以下、例如约29℃或以下、例如约28℃或以下、例如约27℃或以下、例如约26℃或以下、例如约25℃或以下、例如约24℃或以下、例如约23℃或以下、例如约22℃或以下、例如约21℃或以下、例如约20℃或以下、例如约19℃或以下、例如约18℃或以下、例如约17℃或以下、例如约16℃或以下、例如约15℃或以下、例如约14℃或以下、例如约13℃或以下、例如约12℃或以下、例如约11℃或以下、例如约10℃或以下、例如约9℃或以下、例如约8℃或以下、例如约7℃或以下、例如约6℃或以下、例如约5℃或以下、例如约4℃或以下、例如约3℃或以下、例如约2℃或以下、例如约1℃或以下。
在另一个优选实施例中，洗涤温度在约5℃-40℃的范围内，例如约5℃-30℃、约5℃-20℃、约5℃-10℃、约10℃-40℃、约10℃-30℃、约10℃-20℃、约15℃-40℃、约15℃-30℃、约15℃-20℃、约20℃-40℃、约20-30℃、约25℃-40℃、约25℃-30℃或约30℃-40℃。在一个特别优选的实施例中，洗涤温度是约30℃。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该低温洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约9。
在具体实施例中，在以下硬度下执行该低温洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。
动物饲料
本发明还针对在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的本发明的蛋白酶的方法，以及包含本发明的蛋白酶的饲料组合物和饲料添加剂。
因而，在一个实施例中，本发明涉及包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽的饲料组合物或饲料添加剂，这些多肽具有蛋白酶活性。
本发明的另一个方面涉及用于蛋白的处理的方法，包括添加根据本发明的至少一种蛋白酶到至少一种蛋白或蛋白源，例如大豆中的步骤。因而，一个方面涉及用于蛋白的处理的方法，包括添加与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的至少一种分离的多肽到至少一种蛋白或蛋白源，例如大豆中的步骤。
术语动物包括所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犊)、鹿、yank、骆驼、美洲驼和袋鼠。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括，但不限于，小猪，成长猪，和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、bocachico、鲤科鱼、鲶鱼、cachama、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、guapote、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、pearlspot、pejerrey、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)；和甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物意思指适于或者意在由动物摄入的任意化合物、制剂、混合物或组合物。
在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。
在具体实施例中，明确限定了处于往饲料中添加的蛋白酶或当包含在饲料添加剂中时的形式的蛋白酶。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制剂至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制剂至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。
明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确剂量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果能够优化剂量。
然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必那么纯；可以例如包括其他酶，此时可将其称为蛋白酶制品。
该蛋白酶制剂可以(a)直接加入饲料(或者直接用于蛋白处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后加入饲料(或者用于处理过程中)的中间组合物，如饲料添加剂或者预混合物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制剂的纯度。
具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制剂，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制剂却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。
这类蛋白酶制品当然可以与其他酶混合。
该蛋白可以是一种动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者其可以是一种植物性蛋白。
本文所用术语植物性蛋白指的是包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白，包含修饰的蛋白和蛋白衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。
植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)，十字花科，藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。
在具体实施例中，植物性蛋白来源是得自蝶形花科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。
在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。
植物性蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。
大豆为优选的植物性蛋白来源。
植物性蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。
在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白如植物性蛋白或蛋白来源(或对其发挥作用或施加溶解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白来源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶促反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。
在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。
在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些蛋白是在摄入之前被水解的。
术语改善动物饲料的营养价值是指改善蛋白的可用性，从而导致蛋白提取的增加、高蛋白产量和/或改善的蛋白利用率。饲料的营养价值因此增加，而且蛋白和氨基酸消化率增加，和/或该动物的生长速率和/或体重增加和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)被改善。
能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。
在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。
除本发明的蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质和/或至少一种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
另外，可任选的，饲料添加成分是着色剂例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素；稳定剂；生长改善添加剂和芳香化合物/调味品，例如甲氧甲酚，茴香脑，十-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞、亚丁基苯酞、辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；产活性氧种类；另外，可以使用一种支持物，其可包含例如按重量计40％-50％的木质纤维、按重量计8％-10％的硬脂酸、按重量计4％-5％的姜黄粉、按重量计4％-58％的迷迭香粉、按重量计22％-28％的石灰岩、按重量计1％-3％的树胶如***树胶、按重量计5％-50％的糖和/或淀粉以及按重量计5％-15％的水。
本发明的一种饲料或饲料添加剂还可包含选自下组的至少一种其他的酶，该组由以下各项组成：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶如，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC3.2.1.17)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或它们的任何混合物。
在一个具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包括一种植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。
在一个具体实施例中，本发明的饲料或饲料添加剂还包括一种木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。
本发明的饲料或饲料添加剂还可以包括至少一种益生菌或直接饲喂微生物(DFM)，该益生菌或直接饲喂微生物任选地与选自下组的一种或多种其他的酶一起，该组由以下各项组成：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，像α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或它们的任何混合物。
该直接饲喂微生物可以是一种来自以下属的一种或多种的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉杆菌属、丙酸菌属、双歧杆菌属、梭菌属以及巨球形菌属或其任何组合，优选来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属、以及片球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌、嗜酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、路氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivariusssp.salivarius)、埃氏巨球形菌、丙酸杆菌属并且更优选来自以下枯草芽孢杆菌菌株3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；2084(NRRL B-500130)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-50105)；BS 18(NRRL B-50633)；以及BS 278(NRRL B-50634)。
在具体实施例中，这些其他酶被明确定义(如上对蛋白酶制剂定义的)。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫肽、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer(罗伯特·莱勒)，2000)、菌丝霉素(Plectasins)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO 03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。
产生活性氧的种类的实例为化学品，如过棚酸盐、过疏酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶和合成酶。
通常，脂溶性和水溶性维生素，以及微量矿物质形成部分所谓的意在加入饲料中的预混合物，而大量矿物质通常单独加入饲料。这些组合物的任一个类型，当富含于本发明的蛋白酶时，都是本发明的动物饲料添加剂。
在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。
下文列出了这些组分的非-排他性实例：
脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。
微量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
大量矿物质的实例为钙、磷和钠。
在WO 01/58275的表A中，列出了这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)。营养需求指的是应在饮食中提供指定浓度的这些组分。
在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275中的表A所详细说明的单个组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种，或直至所有15种单个组分中的任一种，一种或多种。更具体地，本发明的添加剂包含该至少一种单个组分，其含量能使其在饲料中的浓度落入表A第4或第5或第6栏所示的范围。
在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选使得其在饲料中的浓度落入在下表1中所限定的范围之内(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。
表1：一般性维生素建议
维生素 小猪饮食 肉仔鸡饮食
维生素A 10,000-15,000IU/kg饲料 8-12,500IU/kg饲料
维生素D3 1800-2000IU/kg饲料 3000-5000IU/kg饲料
维生素E 60-100mg/kg饲料 150-240mg/kg饲料
维生素K3 2-4mg/kg饲料 2-4mg/kg饲料
维生素B1 2-4mg/kg饲料 2-3mg/kg饲料
维生素B2 6-10mg/kg饲料 7-9mg/kg饲料
维生素B6 4-8mg/kg饲料 3-6mg/kg饲料
维生素B12 0.03-0.05mg/kg饲料 0.015-0.04mg/kg饲料
烟酸(维生素B3) 30-50mg/kg饲料 50-80mg/kg饲料
泛酸 20-40mg/kg饲料 10-18mg/kg饲料
叶酸 1-2mg/kg饲料 1-2mg/kg饲料
生物素 0.15-0.4mg/kg饲料 0.15-0.3mg/kg饲料
氯化胆碱 200-400mg/kg饲料 300-600mg/kg饲料
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所示的。此外，这类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275相当于US 09/779334，被列入本文作为参考。
根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，此外还包含至少一种本文所要求的蛋白酶。
此外，或替代地(对于以上所示的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5中的任何一个中(R.2-5)。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.，1984，官方分析方法(Official Methods of Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official Analytical Chemists)，华盛顿特区)。
可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirements inswine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会。美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩，ISBN 90-71463-12-5计算。
完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheiden voederwaarde wan voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7计算。
在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白。
本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(Dried Distillers Grains)(DDGS)，通常量为0-30％。
在另一具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
可将动物饮食制备成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明加入必需维生素和矿物质的足够量。以固体或液体酶配制品的形式加入酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可加入固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可加入该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，在造丸步骤之后加入一种液体蛋白酶/酶制剂。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。
该酶可以作为颗粒被添加至饲料混合物，该饲料混合物被任选地成丸或挤出。该颗粒典型地包括核心颗粒和一个或多个包衣，该包衣典型地是盐的和/或蜡质的包衣。核心颗粒可以是任选地与盐(例如有机的或无机的锌盐或钙盐)一起的活性化合物的均匀共混物，或是具有施加至其上的活性化合物的惰性颗粒。活性化合物是任选地与一种或多种另外的酶组合的本发明的蛋白酶。惰性颗粒可以是水溶性的或水不溶性的，例如淀粉，糖(例如蔗糖或乳糖)，或盐(例如NaCl、Na2SO4)。盐包衣典型地至少是1μm厚并且可以是一种具体的盐或多种盐的混合物，例如Na2SO4、K2SO4、MgSO4和/或柠檬酸钠。其他实例是在，例如，WO 2008/017659、WO2006/034710、WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO2000/70034中描述的那些，或是例如在WO 2001/00042中描述的聚合物包衣。
可替代地，可以通过冷冻液体酶溶液与膨胀剂(例如研磨的大豆粉)的混合物，并且然后冻干该混合物，来制备蛋白酶。
饮食中最终的酶浓度是在0.01-200mg酶蛋白/kg饮食范围内，例如在0.5-25mg酶蛋白/kg动物饮食的范围内。
当然，应该以有效量，即足以改善饲料的水解、消化性和/或改善营养价值的量使用蛋白酶。目前期望以下述量(剂量范围)中的一种或多种施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数(ppm)。
为了测定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性，底物和试验)测定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。
使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
材料与方法
洗涤测定
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
为了评定洗涤性能，在衣物洗涤中使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、织物和盖子剧烈振动从而使测试溶液与织物接触并以规则、周期性摆动方式应用机械压力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart(柯达(Kodak))、Midtager29、DK-2605(丹麦(Denmark))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度的值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(Int)：
Int = r 2 + g 2 + b 2 .
表1：标准洗涤剂和测试材料的组成
测试材料获得自测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。
蛋白酶测定法
1)Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
2)Protazyme AK测定：
底物：Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))
温度：受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 7.0。
通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德离心管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德离心管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorfthermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400转/分钟)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD650作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(bufferblind)(代替酶)。
3)Suc-AAPX-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPA-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1775)
Suc-AAPR-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1720)
Suc-AAPD-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1835)
Suc-AAPI-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1790)
Suc-AAPM-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1395)
Suc-AAPV-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1770)
Suc-AAPL-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1390)
Suc-AAPE-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1710)
Suc-AAPK-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1725)
Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
大豆-玉米粉测定法(SMM测定法)
在pH 3、4、5、6、和7处对大豆-玉米粉的蛋白酶活性
使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定以获得在pH 3-7时该蛋白酶的活性曲线。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CAPS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl或NaOH调节以给出pH-值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，此时将10ml测定缓冲液与1g大豆-玉米粉(30:70比例)混合。
在添加蛋白酶之前将2mL大豆-玉米粉浆液混合30min，并且在40℃孵育3小时(500rpm)。经由100μl 100mM乙酸钠(NaAc)缓冲液(9.565g/l NaAc，1.75g/l乙酸，5mM CaCl2，0.01％BSA，0.01％Tween20，pH6.0)添加蛋白酶。在离心(10min，4000rpm，0℃)之后收集上清液，并且基于邻苯二醛(OPA)方法使用比色测定来确定蛋白酶活性，该方法基本上根据尼耳森等人(尼耳森(Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，戴普曼(Dampmann)，C.用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(Improved method for determining food protein degree of hydrolysis)，《食品科学杂志》(J Food Sci)，2001,66:642-646)。本测定检测游离α-氨基基团，并且因此蛋白酶活性可被测量为吸光度的增加。将每份上清液的第一个500μl通过100kDa微量浓缩过滤器经由离心(60min，11,000rpm，5℃)进行过滤。将这些样品在去离子水中稀释10x，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。最后，将200μl OPA试剂分配在所有孔中，并振荡该板(10sec，750rpm)，并且在340nm下测量吸光度。蛋白酶活性水平被计算为酶处理的样品和空白样品的吸光度之间的差异，并且表示为‘Abs x稀释系数’。
实例
菌株
变孢指孢囊菌DSM 43911。
培养基和溶液
实例1：DNA制备和变孢指孢囊菌基因组的测序
通过“QIAamp DNA血液迷你试剂盒”(凯杰公司，希尔登，德国)分离变孢指孢囊菌(2011年重新分类为Saccharothrix variisporea(一种糖丝菌))的染色体DNA。将5ug的染色体DNA送至FASTERIS SA，瑞士进行基因组测序。将该基因组通过亿明达(Illumina)测序进行测序。将该基因组序列对于分泌的S1蛋白酶进行分析，并且选择一种S1蛋白酶(SEQ ID:1/SEQ ID:2)用于表达。
实例2：来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的表达
为了来自变孢指孢囊菌的S1A蛋白酶1(SEQ ID NO:2)的表达克隆，使用一种线性整合载体***。线性整合构建体是一种PCR融合产物，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因连同一个强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。通过SOE PCR进行融合(霍顿(Horton)，R.M.，亨特(Hunt)，H.D.，胡(Ho)，S.N.，皮伦(Pullen)，J.K.以及皮斯(Pease)，L.R.(1989)，不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接的工程化杂种基因(Engineering hybrid genes withoutthe use of restriction enzymes，gene splicing by overlap extension)基因(Gene)77:61-68)。专利申请WO 2003095658中也描述了SOE PCR方法。在三联启动子***(如WO 99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子***由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。针对氯霉素乙酰基转移酶的基因编码被用作标记(描述于例如戴德瑞奇森(Diderichsen)，B.；波尔森(Poulsen)，G.B.；约根森(Joergensen)，S.T.；枯草芽孢杆菌的一种有用的克隆载体(A usefulcloning vector for Bacillus subtilis)30:312(1993))。在芽胞杆菌染色体上通过同源重组将最终的基因构建体整合到果胶酸裂解酶位点中。
将基因特异性引物包含至两个侧翼片段的突出端，从菌株变孢指孢囊菌的染色体DNA扩增编码来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的基因。从菌株iMB1361的基因组DNA扩增上游和下游侧翼片段(描述于专利申请WO2003095658中)。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ ID NO 6))代替天然的分泌信号来表达该S1蛋白酶1。
通过重叠延伸(SOE)PCR反应使这2个载体片段和基因片段经受剪接，以将这3个片段装配进一个线性载体构建体中。将等分部分的该PCR产物转化到蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌宿主中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。将包含该整合表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。采集包含酶的上清液并如实例3中所描述的将该酶进行纯化。
实例3：来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的纯化
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的10mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)。将经G25葡聚糖凝胶转移的滤液施加到SP-sepharose FF柱(来自GE医疗公司)上，该柱以20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)平衡。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。将固体(NH4)2SO4添加至来自SP-sepharose FF柱的池至最终1.0M(NH4)2SO4浓度并且将盐调节的池施加到100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2、1.0M(NH4)2SO4、pH 6.0平衡的苯基-Toyopearl柱(来自东曹公司(TosoHaas))。在用平衡缓冲液洗涤该柱之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性(NH4)2SO4梯度(1.0-->0M)经三个柱体积进行洗脱。将来自柱的部分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH 9下的Suc-AAPF-pNA测定)，并且通过SDS-PAGE来对活性部分进行分析。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上仅有一条带可见的情况下，将各部分合并并且转移至G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的100mM H3BO3、10mM MES、1mM CaCl2(pH 6.0)。经G25葡聚糖凝胶转移的酶是纯化的制品，并且将其用于进一步表征。
实例4：来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的表征
将Suc-AAPF-pNA测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 9.0测定缓冲液中，将蛋白酶孵育物的pH调节至相同的pH值。在pH 9.0下，测量相对于样品的残余活性，将该样品在稳定条件(5℃，pH 9.0)下保持。使用Protazyme AK测定法以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。使用Suc-AAPX-pNA测定法和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得这些酶在pH 9.0下的P1-特异性。结果示于表2-5和图1-4中。
表2：在37℃下的pH-活性曲线
pH 来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1
2 0.00
3 0.00
4 0.02
5 0.14
6 0.44
7 0.78
8 0.97
9 0.98
10 1.00
11 0.96
注释：活性是相对于酶的最佳pH而言。
表3：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)
pH 来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1
2 0.01
3 0.75
4 0.97
5 0.97
6 0.97
7 0.96
8 0.94
9 0.93
10 0.96
11 0.87
在5℃下2小时之后 1.00(在pH 9下)
注释：活性是相对于样品的残余活性，将该样品保持在稳定条件(5℃，pH 9.0)下。
表4：在pH 7.0处的温度活性曲线
温度(℃) 来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1
15 0.14
25 0.10
37 0.27
50 0.64
60 1.00
70 0.71
80 0.22
注释：活性是相对于酶的最佳温度而言。
表5：在pH 9.0处(25℃)对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性
Suc-AAPX-pNA 来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1
Suc-AAPA-pNA 0.08
Suc-AAPR-pNA 0.07
Suc-AAPD-pNA 0.00
Suc-AAPI-pNA 0.00
Suc-AAPM-pNA 0.43
Suc-AAPV-pNA 0.01
Suc-AAPL-pNA 0.14
Suc-AAPE-pNA 0.00
Suc-AAPK-pNA 0.07
Suc-AAPF-pNA 1.00
注释：活性是相对于该酶的最佳底物(Suc-AAPF-pNA)而言。
来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的其他特征
抑制剂：PMSF和CI-2A。
通过埃德曼降解确定N末端序列为：IDVIGGN。
通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝20kDa。
通过完整分子量分析确定的分子量是18553.9Da。
成熟序列(来自MS数据、埃德曼降解数据和DNA测序)：
IDVIGGNAYYMGGGGRCSVGFSVNGGFVTAGHCGTSGQSTTQPTGTFAGSSFPGNDYAWVRVAAGNTPRGLVNRYPGTVPVAGSTEAPVGASVCRSGSTTGWHCGTIQQRNTSVTYPQGTVSGVVRTNACAEPGDSGGSWISGDQAQGVTSGGSGNCSSGGTTYFQPVNEILQAYGLQLVTSGGTPT(SEQID NO 3)
来自这一成熟序列的计算的分子量是18554.1Da。
实例5：使用来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的AMSA洗涤
使用自动机械应力测定，使用一种液体洗涤剂和一种粉末洗涤剂，在2种不同的洗涤温度下，针对3种不同的技术污物，测试来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的洗涤性能。
如在AMSA中针对衣物洗涤方法所描述的，使用单循环洗涤程序，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表6中所指定。
表6：用于衣物洗涤实验的实验条件
洗涤剂剂量 2.5g/L粉末状标准洗涤剂A，8g/L液体标准洗涤剂B
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 20℃或40℃
水硬度 15°dH
蛋白酶浓度 30nm
小块布样 PC-05，PC-03，C-10
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3 -＝4:1:7.5)添加至测试***中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表7：在20℃，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自变孢指孢囊菌 的S1蛋白酶1的洗涤剂的Δ强度值。
结果显示与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的洗涤剂在去污方面更有效。在20℃，来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1在除去巧克力/乳、血液/乳、和油/乳污物方面是有效的。
表8：在40℃，与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自变孢指孢囊菌 的S1蛋白酶1的洗涤剂的Δ强度值。
结果显示与不具有蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的洗涤剂在去污方面更有效。在40℃，来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1在除去巧克力/乳、血液/乳、和油/乳污物方面是有效的。
表9：在20℃，与洗涤剂10R蛋白酶相比，包含来自变孢指孢囊菌的S1 蛋白酶1的洗涤剂的相对洗涤性能。
结果示出，在20℃，对于巧克力/乳、血液/乳、和油/乳污物，与洗涤剂10R蛋白酶(SEQ ID NO 5)相比，包含来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的洗涤剂具有改进的洗涤性能。
表10：在40℃，与具有10R蛋白酶的洗涤剂相比，包含来自变孢指孢囊 菌的S1蛋白酶的洗涤剂的相对洗涤性能。
结果示出，在40℃，对于巧克力/乳污物，与洗涤剂10R蛋白酶(SEQID NO 5)相比，包含来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1的洗涤剂具有改进的洗涤性能，并且与洗涤剂10R蛋白酶对于血液/乳、和油/乳污物的表现一样好。
实例6：对于大豆-玉米粉测定的蛋白酶活性
在下表11中示出了来自进行上述大豆-玉米粉测定的结果。变孢指孢囊菌S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的蛋白水解活性随着pH从pH 3增加至pH 6而增高，并且然后减少。在pH 6下的活性高于拟诺卡菌属蛋白酶10R(SEQ IDNO 5)的活性表明变孢指孢囊菌S1蛋白酶1可能具有在作物家禽中，在蛋白水解方面更有效的潜能。
表11：在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、和7.0下对大豆-玉米粉的蛋白酶活性
图5示出来自变孢指孢囊菌的S1蛋白酶1与10R蛋白酶(SEQ ID NO 5)相比，对大豆-玉米粉的活性。

Claims (22)

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或***；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
3.如权利要求2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至187。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或***。
5.一种包括如权利要求1-4中任一项所述的多肽的组合物。
6.如权利要求5所述的组合物，是一种洗涤剂组合物，例如用于衣物洗涤或自动餐具洗涤的一种组合物。
7.如权利要求6所述的组合物，进一步包括选自以下项的多种另外的酶中的一种：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶、甘露聚糖酶，或其任何混合物。
8.如权利6或7所述的组合物，包括选自以下项的一种或多种组分：表面活性剂、助洗剂等。
9.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽。
10.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求9所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
11.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求9所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
12.一种产生如权利要求1-4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
13.一种产生具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求11所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
14.一种用于提高动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加如权利要求1-4中任一项所述的至少一种蛋白酶。
15.一种动物饲料添加剂，包含
a.如权利要求1-4中任一项所述的至少一种蛋白酶；以及
b.至少一种脂-溶性维生素，和/或
c.至少一种水-溶性维生素，和/或
d.至少一种微量矿物质。
16.如权利要求15所述的动物饲料添加剂，其进一步包含淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和/或β-葡聚糖酶。
17.一种动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并包含如权利要求1-4中任一项所述的至少一种蛋白酶。
18.一种用于处理蛋白的方法，包含将如权利要求1-4中任一项所述的至少一种蛋白酶添加至至少一种蛋白或蛋白来源中的步骤。
19.如权利要求18所述的方法，其中大豆包含在该至少一种蛋白来源中。
20.如权利要求1-4中任一项所述的至少一种蛋白酶在洗涤剂中的用途或根据权利要求5至8中任一项所述的组合物在清洁过程中的用途。
21.一种动物饲料组合物，该组合物包括如权利要求1-4中任一项所述的多肽。
22.如权利要求11所述的动物饲料组合物，该组合物进一步包括以下各项中的一种或多种：淀粉酶；植酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶，β-葡聚糖酶，或其任何混合物。
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