JP2774121B2 - 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅 - Google Patents

標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅

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JP2774121B2 JP63507108A JP50710888A JP2774121B2 JP 2774121 B2 JP2774121 B2 JP 2774121B2 JP 63507108 A JP63507108 A JP 63507108A JP 50710888 A JP50710888 A JP 50710888A JP 2774121 B2 JP2774121 B2 JP 2774121B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、遺伝子自体の検出のため又は遺伝子を含有
する生物体の検出のために特定の遺伝子の存在を検出す
る診断測定に関し、そして特に検出工程に先立って検出
されるべき遺伝子のコピー数を増加せしめる技法に向け
られる。本発明はさらに、特定のポリヌクレオチド配列
の多くのコピーを必要とするあらゆる方法に関する。
発明の背景 サンプル中の分析対象、例えば細菌、ウイルス又は遺
伝欠陥を示すものとしての特定のDNA又はRNA配列の存在
の検出に頼る多数の診断測定が開発されている。幾つか
の例においては、診断に使用できる遺伝子は、ハイブリ
ダイゼーション、特異的抗体との反応、又は他の方法の
いずれかにより直接検出するのに十分な量で存在する。
しかしながら、注目の遺伝子が少量存在するか、又はサ
ンプル中の類似の配列により惹起されるバックグラウン
ドが十分に高い場合には、標的にされる遺伝子の確実で
鋭敏な検出が困難である。不明瞭な結果は診断試験にお
いて満足できるものではない。
この様な診断目的の感受性及び特異性を増加せしめる
ための種々の方法が開発されている。有効ではあるがし
かし長時間を要する技法である細胞培養による標的に増
幅が長い間唯一の確実な方法であった。他の技法は、標
的と結合するであろうプローブに付加された鋭敏なレポ
ーター基を用いて検出系の感度を上昇せしめる。鋭敏な
レポーター基の例には放射性分子及び蛍光分子が含まれ
るであろう。プローブと連結された酵素、例えばパーオ
キシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼもまた基質発
色物質に対するそれらの触媒作用を通して感受性を改良
する。増加した感受性はまた、レポーター基の増幅によ
っても得られる。この様な増幅はまたアビジン−ビオチ
ン相互作用、核酸とのネットワーク形成、又はRNAレポ
ーター基の直接的酸素的複製により達成されている。こ
の後者の技法は約12分間に1,000,000コピーまでのRNAを
生じさせる。他の技法は検出系で使用されるレポーター
基ではなく標的核酸配列を増幅する。
標的核酸配列の増幅のための１つの方法はポリメラー
ゼ連鎖反応又はPCR技法として知られており、そして遺
伝的欠陥を担当する遺伝子を検出するために開発されて
いる。この方法は、標的DNAの変性、プライマーアニー
リング及びDNAポリメラーゼによる延長の反復サイクル
において特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用す
る。１つのプライマーから生じた延長生成物が他のプラ
イマーのための追加の標的配列として使用される。標的
配列の増幅の程度が行われるサイクル数により制御さ
れ、そして理論的には簡単な式2n（ｎはサイクル数）に
より計算される。サイクル当りの平均効率が約65％〜85
％である場合、標的配列の30万〜480万コピーを得るの
に25サイクルが必要である。
このポリメラーゼ連鎖反応は非常に鋭敏で且つ有望な
方法であるが、この技法に内在する幾つかの限界及び欠
点が存在する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の各サイ
クルは最も良くてもわずか２倍の増幅をもたらし、そし
てそれ故に実質的な増幅を達成するために多数のサイク
ル（20〜30）が必要である。さらに、各PCRサイクル中
に生ずる高温変性が使用される酵素を不活性化し、そし
てそれ故に高価な酵素の反復添加を必要とする。
従って、遺伝子増幅の速度を上昇せしめる技法（従っ
て、より少い酵素及びより少いサイクル数で足りる）
は、特定の標的核酸配列の検出を含むすべての診断法及
び増加した数の特異的に増幅されたポリヌクレオチド
（RNA又はDNA）を必要とするあらゆる方法のために、非
常に有利であろう。
関連文献 PCR法は、Saiki等、“βグロビンゲノム配列の酵素的
増幅及び鎌形赤血球貧血の制限部位分析”、Science（1
985）230:1350-1354;Saiki等、“酵素的に増幅されたβ
−グロビン及びHLA-DQ α DNAの対立遺伝子特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ”Nature（1986）324:163-166;
並びにScharf等、“酵素的に増幅されたゲノム配列の直
接クローニング及び配列分析”、Science（1986）233:1
076-1078、を含む多数の刊行物に記載されている。さら
に、３件の米国特許出願、すなわち1985年３月28日出願
の出願No.716,975、1985年10月10日出願の出願No.791,3
08、及び1986年２月７日出願の出願No.828,144に基く優
先権を主張する、1986年12月10日に公表されたヨーロッ
パ特許出願No.0200362 A2（出願No.86302298-4）を参照
のこと。
発明の概要 本発明は、標的鋳型からコピーを作る２つの方法を交
互に用いることによる標的オポリヌクレオチド配列のコ
ピー数を迅速に増加せしめる（酵素的サイクルにより）
方法を提供する。第一の一連の段階において、プロモー
ターを含んで成る中間体二本鎖ポリヌクレオチドが生産
され、次に標的配列が生産される。次に第二工程におい
て、この二本鎖中間体を使用することにより、該二本鎖
中間体のプロモーター領域に結合するRNAポリメラーゼ
を用いて多数のRNAコピーを調製する。次に、逆転写酵
素を用いて二本鎖プロモーター含有中間体の第二の（又
はさらなる）集合を調製することにより、他の増幅サイ
クルを開始するために各RNAコピーが標的配列として使
用され得る。従って本発明の方法は、サンプル中に存在
する標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を、従来法よ
り迅速にインビトロで増加せしめる方法を提供する。こ
の方法は、特定の具体的例において、トキソプラズマ・
ゴンディー（Toxoplasma gondii）についての診断測定
に適用される。
図面の簡単な説明 本発明は、図面と共に以下に記載する具体的な説明に
より、一層よく理解されるであろう。
図１は、本発明の方法の異る段階において存在するポ
リヌクレオチドを示す模式図である。
具体的な態様の記載 本発明は、標的オリグヌクレオチド配列のコピー数を
増加せしめる方法を提供し、そしてそれ故にサンプル中
に少量存在する特定のポリヌクレオチド配列を認識する
ことを意図する診断測定において特に有用である。これ
はまた、特定の配列のポリヌクレオチドの迅速な生成に
より利益を受ける任意の方法において有用である。
標的ポリヌクレオチド配列はより大きな分子の部分で
あることができ、又は特定の配列が核酸全体を構成する
ようにはじめから個別分子として存在することもでき
る。増幅されるべき標的細胞が最初に純粋な形で存在す
る必要はない。これは複雑な混合物の微小部分、例えば
分析されるべき特定の生物学的サンプルのごくわずかな
部分を構成する特定の微生物の核酸配列の部分であるこ
とができる。
ポリヌクレオチドを含有する出発反応混合物は所望に
より１種類より多くの標的配列を含有することができ
る。従って、本発明の方法は、１種類の特定のポリヌク
レオチド標的配列を多量に生産するためのみではなく、
同一又は異るポリヌクレオチド分子上に位置する１種類
より多くの異る標的配列を同時に増幅せしめるためにも
有用である。複数の標的配列が存在する場合、本発明の
必要な唯一の変更は、所望の標的配列のそれぞれのため
にプライマー（後で検討する）を提供することである。
本発明の方法により任意の特定のポリヌクレオチド標
的配列を増幅することができる。後記のように２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを調製することができるよ
うに十分に、配列の両末端における十分な数の核酸が知
られることのみが必要である。配列の両端の塩基につい
ての知識が多くなるに従って、標的配列に対するプライ
マーの特異性が高くなり、そしてそれ故にこの方法の効
率が高くなる。増幅されるべき標的の一端又は両端の配
列に関する情報が幾分不明瞭である場合は特に、本明細
書において使用するプライマーなる語は複数のプライマ
ーを意味することができると確認されよう。例えば、核
酸配列が既知の蛋白質配列から推定される場合、遺伝コ
ードの縮重に基くすべての可能性あるコドンの変化を代
表する配列を含有するプライマーの集合が各鎖について
使用されるであろう。この集合の１つのプライマーは標
的配列の末端と相同である。
この方法は、標的配列を含有しそしてさらに標的配列
の上流に位置するプロモーターを含有する二本鎖ポリヌ
クレオチド中間体を調製することにより開始する。この
二本鎖中間体は、短いオリゴヌクレオチドをプライマー
配列として使用しそして該プライマーが結合するより長
いポリヌクレオチド鎖を鋳型として使用して該プライマ
ーを延長することにより調製される。相補的標的鎖は単
鎖状態（すでにこの形で存在しなければ）で得られ、そ
して相補鎖中の標的領域の５′末端又はその近傍の相補
鎖中領域に相補的な結合配列から上流のプロモーター配
列を含有するオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ
する。このプライマー中の結合配列は、コピーされるべ
き特定の標的配列への５′又は標的配列の５′末端に存
在する標的ポリヌクレオチド分子中の配列と実質的に同
等である。このプライマーは、もとの標的鎖と同じ意味
のDNA分子のDNAポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用
いる合成を開始するために使用される。
次に、この新しく合成された鎖に第二のオリゴヌクレ
オチドがハイブリダイズする。この第二のオリゴヌクレ
オチドプライマーは標的分子の３′−末端に対応する領
域に相補的である。プライマー領域間のヌクレオチドの
数は好ましくは300末端、さらに好ましくは200未満であ
り、しかし10より多く、さらに好ましく15より多い。第
二プライマーが延長される場合、標的配列のコピー及び
第一プライマーが生成する。従って、得られる生成物
は、本発明の方法の第一の部分を構成する標的配列への
５′のプロモーター領域を含有する。
次に、中間体プロモーター含有二本鎖ポリヌクレオチ
ドは中間体中に形成されたプロモーター領域に結合する
ことができるDNA依存性RNAポリメラーゼの鋳型して使用
される。このポリメラーゼ酵素は標的配列をコピーし、
これによってプロモーターから下流の標的配列の多数の
RNAコピーを提供する。生産されるコピー数はプロモー
ター、使用されるRNAポリメラーゼ及び反応条件に依存
し、しかし10コピーは容易に生産され、そして強力なプ
ロモーター、活性RNAポリメラーゼ及び適当な反応条件
を選択することにより100コピー以上を生産することが
できる。
RNAコピーのそれぞれは、特定の標的の追加のコピー
の生産のための鋳型として使用することができる。上に
使用した第二オリゴヌクレオチドとの反応、相補的配列
をもたらすプライマーの延長、第一プライマーとの反応
及び生ずるハイブリドの両方向への延長（第一プライマ
ーは標的コピーの生産のためのプライマーとして働き、
そして相補鎖の３′−末端はプロモーター領域のコピー
が作られるようにプライマーとして働く）が、RNAコピ
ーを調製するための鋳型として使用された上記の類似の
二本鎖プロモーター含有中間体を生産するであろう。次
に、プロモーター依存性RNAポリメラーゼを用いるRNA−
生産サイクルを反復することができる。サイクル当りわ
ずか10個のRNAコピーが生産されれば、３サイクルが反
応媒体中に依存する標的配列数の一千倍の増加をもたら
すであろう。鋳型当り100コピーのRNAが生産されれば、
３サイクルにより100万コピーの標的配列が生産される
であろう。
上記の方法は、標的鎖と該標的鎖に対する相補鎖とを
含んで成る二本鎖ポリヌクレオチド標的か、又は最初の
標的がRNAのごとき単鎖である場合には相補的標的鎖の
存在を仮定している。標的が最初に単鎖RNA又はDNAであ
れば、相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
上記の方法と同様の方法で調製することができる。例え
ば、上記の第二オリゴヌクレオチドプライマーは標的分
子の３′−端末に対応する領域に相補的である。この第
二オリゴヌクレオチドプライマー、又は標的配列への
３′の異る領域に対して相補的な異るプライマーを用い
て、方法の第一段階において使用される相補鎖を調製す
ることができる。他の変法は、標的鎖（その相補鎖では
なく）に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて開始することである。次にプロモーター配列含
有プライマーを、第１プライマーから延長される相補鎖
にハイブリダイズせしめる。
オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅されるべき各
特定の配列の異る鎖に対して「実質的に」相補的である
ように選択される。このことは、プライマーがそれらの
対応する鎖とハイブリダイズするために十分に相補的で
なければならないことを意味する。従って、プライマー
はそれが結合する鋳型の正確な配列を反映する必要はな
い。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの
５′−末端に付加し、プライマー配列の残りの部分が鋳
型鎖と相補的であるようにすることができる。言うまで
もなく、上記のように、１つのこのような非相補的ヌク
レオチド断片は本発明に必要なプロモーター配列であろ
う。しかしながら、プロモーター配列が存在しない場合
でも、他の非相補的ヌクレオチド断片を付加することが
できる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を提
供する配列を提供して、プラスミドへの挿入が容易な増
幅された標的配列を調製を可能にすることができる。あ
るいは、プライマー配列が増幅されるべき鎖（又はその
相補鎖）の配列と十分に相補的であってそれとハイブリ
ダイズしそして延長生成物の合成のための鋳型を形成す
るものであれば、プライマーの結合配列に非相補的塩基
を散在せしめることができる。例えば、特定の制限酵素
開裂部位を提供するために中程度の長さ（例えば約15ヌ
クレオチド）中で１個の単一ヌクレオチドを置換するこ
とができる。
所望により、両プライマーにプロモーター配列を含め
ることにより完全サイクルにより生産されるコピー数を
さらに増加せしめることができる。
本発明の方法の操作は図及び以下の詳細な記載により
容易に理解することができる。図及び以下の検討におい
て示される模式的単鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドのた
めに標準的命名法及び方向が用いられる。二本鎖ポリヌ
クレオチドの上鎖の左端は５′−末端であり、同じ鎖の
左端が３′−末端である（矢じりにより示される）。相
補鎖は逆向きの方法を有するから下鎖はその３′−端末
が左にそしてその５′−末端が右に示される。困乱を回
避するため、二本鎖ポリヌクレオチドの部分として示さ
れていない場合でも下鎖はこの方法で示される。種々の
配列が文字及び符号により特定される本明細書（特許請
求の範囲を含む）に記載される配列のために同じ約束が
適用される。本方法の各段階の生成物のすべてが示され
るのではなく、本発明に関連するもののみが示される。
図の第１行には、後の段階でこの分子に対して行われ
るであろう操作において定義される一連の領域に含む二
本鎖標的ポリヌクレオチド分子が示される。前に検討し
たように、もとの標的が単鎖RNA（又はDNA）分子である
場合最初の段階のために二本鎖標的が作られる。ポリヌ
クレオチドの５′−末端において、後の操作でコピーさ
れないセグメントがX1として特定される。これに続き、
後の段階で使用されるプライマーの配列の一部を成す配
列P1のセグメントが存在する。コピーされるべき配列で
ある標的配列Ｔが配列P1に続く。異るプライマーと結合
する配列P2がＴの３′−末端に存在する。P2の後に追加
のヌクレオチドが存在することがあるが、しかしコピー
されない。これらのヌクレオチドは図中でX2と命名され
る。X1もX2も本発明の操作には必要ではなく、そしてそ
れ故に場合によっては存在し、０から数百又は数千のヌ
クレオチドにわたる。アポストロープ又は「プライム」
（′）は反対鎖に存在する相補的配列を示す。この単鎖
標的分子はオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で変
性され、そして次に第２行に示すようにオリゴヌクレオ
チドと標的とのアニールを許容するように条件が変えら
れる。
図の第２行は第一オリゴヌクレオチドプライマーPR-P
1を示し、これは複合構造であるがその３′−末に配列P
1を有し変性された標的分子のP1′セグメントにハイブ
リダイズする。このオリゴヌクレオチドプライマーの
５′−部分PRは、その二本鎖構造においてRNAポリメラ
ーゼのための機能的プロモーターを含んで成る配列を含
有する。配列PRはこの発明に不都合な影響を与えない追
加のヌクレオチドを含有することができる。PR-P1プラ
イマーは適当な酵素（DNA標的のためにはDNA依存性DNA
ポリメラーゼ、あるいはRNA及び／又はDNA標的のために
はRNA依存性DNAポリメラーゼ）により延長され、図に第
３行に示されるように鎖PR-P1-T-P2-X2を与える。プロ
モーター領域の単鎖性は、図においてこの領域の２本の
鎖間の接触の不存在により、そして明細書により次の様
に示される： 特に自動装置を用いての迅速なハイブリダイゼーション
（アニーリング）及び循環を許容するため、本発明のこ
のプライマー（及び他のプライマー）は好ましくは比較
的短かく、すなわち50個以下のヌクレオチドから成る。
図の第３行に示す二本鎖ポリヌクレオチドを変性した
後、第４行に示すようにアニーリング条件下で混合物に
配列P2′の第二プライマーを添加する。配列P2′はすで
に記載した配列P2′と同一であり、そのPR-P1-T-P2-X2
のP2セグメントにそれ自体相補的である。
図に第５行目は示される鋳型上でプライマーを延長す
ることにより得られる生成物を示す。この段階でのプロ
モーター領域は今や二本鎖であり、そしてそれ故にDNA
依存性RNAポリメラーゼの結合にために使用することが
できる。この明細書において、この二本鎖中間体は次の
様に示される。
PR-P1-T-P2-X2 PR′‐P1′‐Ｔ′‐P2′ RNAポリメラーゼにより生産されるコピーが図の第６
行に示される。すべてプロモーター領域の下流に由来す
るコピーされたセグメントはP1R-TR-P2R（ＲはRNAコピ
ーであることを示す）で表わされる。このRNA分子は、P
1-T-P2と同一であるか、又はわずかに長いかもしくは短
い。なぜなら、これはRNAポリメラーゼによりコピーさ
れる最初のヌクレオチドに及びその後に配列PR-P1のす
べてを含有するからである。最初の標的鎖が単鎖DNA標
的であれば、P1R-TR-P2RはもとのDNA＋RNAポリメラーゼ
によりコピーされるプロモーター含有セグメントPRの幾
らかの部分又は−ポリメラーゼによりコピーされない幾
らかのヌクレオチドである。
RNAコピーが追加の増幅のために再循されるべき場
合、プロモーター含有二本鎖DNA中間体の調製について
前に検討した段階を反復する。同じプライマーセグメン
トP1及びP2′又は同一プロモーターセグメントPRを使用
する必要はないが、PR-P1及びP2′はすでに入手可能で
あり、そして変更することなく使用することができる。
他のプライマー配列が使用される場合、生ずるコピーは
最初のコピーよりわずかに短いか又は長いであろうが、
しかしもとのP1-T-P2配列を維持すべきある特別の必要
性又は要望なければ、前記のことは本発明に不都合な影
響を与えない。P2′プライマーとの最初のアニーリン
グ、及びこれに続くプライマーの延長が図の第７行目に
示される生成物をもたらす。この二本鎖中間体の変性及
びプライマーPR-P1とのアニーリングが第８行目に示す
生成物をもたらす。この中間体は両方向に延長され得
る。なぜなら、P1配列は鋳型として相補鎖を用いるプラ
イマーとして機能し、そして相補鎖は鋳型として配列PR
を用いるプライマーをとして機能するからである。
第１行目〜第５行目により示される段階において使用
されたのと同じプライマーがこの段階で使用されれば、
生成物は第５行目に示されたものと類似しており、上鎖
の範囲のみが異るであろう。RNAポリメラーゼにより下
方鋳型鎖のみが使用されるから、このことはその後のRN
A重合になんらの影響も与えないであろう。異るプライ
マー配列が使用されれば、生ずる鋳型鎖は使用されるプ
ライマーに依存して長いか又は短いであろう。この段階
で使用されるプライマーの少なくとも一つがその５′−
末端においれRNAポリメラーゼのためのプロモーターを
示す配列を有するなら、生ずる材料はなお、さらなる増
幅が可能であろう。従って、図中の第９行目のプロモー
ター含有二本鎖DNA中間体をDNA依存性RNAポリメラーゼ
と共に使用して多数のRNAコピーを再度生産することが
できる。
最初に使用したプライマーが、標的分子を含有するDN
A混合物中の意図しない配列とハイブリダイズする場
合、サイクルが反復されるときに異るプライマーを用い
ることにより利点が達成し得る。例えば、ヒトの流体又
は組織サンプル中の細菌又は寄生体感染が検出されるべ
き場合のように、多くのポリヌクレオチド配列を含有す
る粗分析対象中で特定の標的核酸が検出されるべき場
合、プライマーオリゴヌクレオチドと宿主DNAとのハイ
ブリダイゼーションが意図しない宿主配列の増幅をもた
らし得る。増幅されたバックグラウンド材料にプロモー
ター配列が存在するであろうから、標的配列の増加と共
に特定のバックグラウンド配列の量の有意な増加が見ら
れる。この問題を回避するため、異るサイクルの間に異
るプライマー及び／又はプロモーターを用いてバックグ
ラウンドの増幅を防止することができる。例えば、もと
のプロイマーの結合領域の近傍の又はそれとオーバーラ
ップする標的配列に属する異る結合領域（P1X及び／又
はP2′X）を第二サイクルで用いることができる。その
増幅が望ましくない他のバックグラウンドポリヌクレオ
チド配列との結合が有在し得るが、同じバックグラウン
ド物質が増幅されないであろう。連続する対のプライマ
ーは標的分子の相補鎖上に接近して一緒に存在するであ
ろうから、この発明の具体例に従えば、逐次段階におい
て使用されるプライマーはプライマーの重ねセット（ne
sted set）として記載することができる。第二の（及び
連続する）サイクルはまた、異るRNAポリメラーゼと結
合する異るプロモーター領域（例えば、PRX）を用いる
ことができる。溶液中に存留する第一のRNAポリメラー
ゼの分解、及びそれに続くPRXに結合する第二のポリメ
ラーゼの導入はバックグラウンドコピーではなく標的コ
ピーを増加せしめるであろう。但し、バックグラウンド
コピーの追加の群が生ずるかも知れない。さらに、過剰
に存在するかも知れない先行するサイクルからのプライ
マーを所望により除去することができる。プライマーを
除去するための適当な技法はそれらを標的から区別する
特徴、例えばサイズ、又は標的が二本鎖DNAとして又はR
NAとして存在する場合に単鎖DNAとしてのプライマーの
存在、に頼る。例えば、ゲルクロマトグラフィーは大き
な標的から小さいプライマーを除去し、他方、特異的ヌ
ークレアーゼ又は抗体は二本鎖標的からプライマーを除
去するであろう。
異るプロモーターと共に重ね合わされたセットのプラ
イマー又は異るプライマーを使用する例として、第一増
幅サイクルにおいて所望の標的配列が50の係数をもって
増加すると仮定しよう。同時に、バックグラウンド配列
へのプライマーの結合が生じ、バックグラウンド配列も
また50の係数をもって増加する。第二増幅サイクルが重
ねプライマーを使用し、そして再び50倍の増幅が起これ
ば、標的配列は2500倍増加し、他方、（最悪の場合で
も）２つのバックグラウンド配列がそれぞれ50倍増加す
る。重ねプライマーの３サイクルの後、標的の増加係数
は125,000であり、（最悪に場合でも）３つのバックグ
ラウンド配列が50倍増加するであろう。
本発明の個々の段階はすべて常用のものであり、そし
て既知の試薬及び技法を用いて行うことができる。特に
設計された試薬はプライマーPR-P1及びP2′である。し
かしながら、これらのセグメントは全合成により、又は
天然源からの所望の配列の単離により容易に得ることが
できる。配列P2（及び従ってその相補配列P2′）並びに
P1が標的分子中で知られている場合、全合成が最も容易
に行われる。プロモーター配列を有するDNAセグメント
の全合成は容易に達成される。なぜなら、プロモーター
配列自体は公表されているからである。標的分子の配列
が未知の場合、標的分子を制限エンドヌクレアーゼ又は
他の方法により断片化し、そしてセグメントを本発明の
ために選択することができる。RNAポリメラーゼ及びそ
の関連するプロモーター配列はこれらの成分の多くの入
手可能な起源から選択することができる。例えば、T7バ
クテリオファージからのT7 RNAポリメラーゼがニューイ
ングランドバイオラブスから入手可能である。他のRNA
ポリメラーゼには、ニューイングランド・バイオラブス
ら入手可能なバクテリオファージSP6からのSP6、又はシ
グス・ケミカル社、セントルイス、ミズリーから入手可
能なE.コリＫ−12株からのＫ−12が含まれる。対応する
プロモーターは、ポリメラーゼが得られた生成物から単
離することができ、又は配列が既知の場合には化学的に
合成することができる。
本発明の方法において使用される他の生化学試薬には
プライマー配列を延長して二本鎖ポリヌクレオチドを形
成することができる酵素が含まれる。この様な酵素には
逆転写酵素及び他のDNAポリメラーゼが含まれる。特に
好ましい酵素はライフサイエンス社（Lifescience In
c.）からのAMV逆転写酵素又はベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）、フ
ァルマシア（Pharmacia）、U.S.バイオケミカルス（U.
S.Biochemicals）、又はバイオラブス（Biolabs）から
のポリメラーゼＩ（Klenow）断片である。
本発明の個々の段階は容易に自動化することができ
る。反応は、単一容器中で逐次試薬を添加しそして必要
に応じて条件を変えることによって行うことができる。
変性条件は一般に上昇した温度、特に95℃から100℃ま
での範囲の温度を用いる。アニーリング及びプライマー
延長はさらに短い温度、典型的には35°〜50℃において
起こる。示された高温においてはポリヌクレオチドと共
に多くの蛋白質が変性するため、必要に応じて追加の蛋
白質を添加することができる。存在する他の試薬は適切
なpH及びイオン条件において反応を維持するための緩衝
液、並びに延長反応において使用されるべき（検出可能
なシグナルを提供するために最終的にラベルされるか又
は修飾される）モノヌクレオチドトリホスフェートを含
むことができる。
二本鎖ポリヌクレオチドを変性するために高温が使用
される場合、試薬又は溶液を分離する必要はない。他の
変性条件、例えば溶剤の使用は好ましくない。なぜな
ら、アニーリング条件から変性条件に進む時及びアニー
リング条件に戻るときに付加された分離段階が必要だか
らである。しかしながら、多くの変性、アニーリング及
び延長条件が知られており、そして所望により使用する
ことができる。
標的配列の多数のコピーを種々の方法で使用すること
ができる。例えば、本発明の方法を、遺伝子操作法のプ
ラスミド又は他の標的に挿入するための遺伝子の多数コ
ピーを調製するために使用することができる。標的配列
についての診断測定において使用される場合、検出段階
（プローブとのハイブリダイゼーション、プローブ、抗
体又はリガンド標的が配列Ｔ内にあり、すなわちプライ
マー又はプロモーター領域の部分を含まないのであれ
ば、抗体又は特異的リガンドとの反応）を、反応媒体か
ら増幅された標的を単離することなく行うことができ
る。領域P1及びP2内のプローブ標的を選択することがで
きるが、プライマー分子との結合又はそれによる妨害を
回避するために標的遺伝子コピー（P1-T-P2又はP1R-TR-
P2R）の分離が必要であろう。RNAが生産される段階にお
いて、ラベルされたリボシドトリホスフェート（例え
ば、放射能ラベル、ビオチン又はアビジンラベル）を使
用することもできる。本発明により生じたポリヌクレオ
チド生成物の他の用途には、変異誘発、遺伝子操作及び
クローニング、遺伝分析、治療（遺伝子療法及び化学療
法の両者）、蛋白質の生産（インビトロ翻訳及び細胞へ
の導入の両者）、並びに特定のポリヌクレオチド配列の
多数コピーを有利に用いる他の任意の方法が含まれる。
例えば、RNA制御分子を多量に生産することができる。
今、本発明を一般的に記載したが、本発明の限定を意
図することなく例示の目的で与えられる以下の詳細な例
に言及することにより一層よく理解されよう。
例 本発明の技法が、トキソプラズマ・ゴンディー（Toxo
plasma gondii）のクロン化された遺伝子、具体的には
遺伝子B1として同定される35倍反復抗原遺伝子を用いて
評価された。示された遺伝子はT.ゴンディー（T.gondi
i）（RH株）からのゲノムDNAの挿入部を含む組換DNAラ
イブラリーから得られた。このライブラリーは発現ベク
ターλgtll中に構成され、そして免疫感作されたラビッ
トからの抗血清を用いてスクリーニングされた。こうし
て同定された組換体がサブクローニングされそしてさら
に特徴付けられた。これらの研究において使用れた標的
遺伝子は、T.ゴンディーのゲノム中でタンデムに多数回
反復する2.2キロ塩基対（kb）の部分であることが見出
された。この遺伝子の同定及び制限地図は公表されてい
る（Boothroyd等、“Antigen and Tubulin Genes of To
xoplasma Gondii,Moleculur Strategies of Parasitic
Invasion,Ayabian"等編、UCLA Symposia Vol.42,237-25
0,Alan Liss、ニューヨーク、1987）。１個の完全反復
のヌクレオチド配列が決定されている（しかし公表され
ていない。）本研究に関連する配列の部分を下に再現す
る。使用される番号系はゲノム中の反復を規定するEcoR
I部位から数える。配列は二本鎖分子として示され、上
鎖は左から右に５′−３′方向にある。オリゴヌクレオ
チドセグメントは同じ意味の鎖、そしてそれ故に同じ配
列に下線が付されている。
遺伝子増殖の最終目的は診断測定における本方法の潜
在的使用のためであったから、標的遺伝子は、それが診
断のための標的遺伝子の必要な残りの基準に合うか否か
を見るために試験された。これらは、標的遺伝子が寄生
体のほとんど又はすべての株に存在し、他の感染体（特
に診断において困乱を生じさせるもの）のゲノム中に存
在せす、そして宿主のゲノム中に検出されないことであ
る。予備的研究が示すところによれば、この遺伝子は試
験された寄生体のすべての株に存在し、そしてヒト宿主
のゲノムを含む試験された他の生物体のゲノムとの交差
反応性は存在しない。
多数のプライマーが本発明の方法における使用のため
に評価された。これらのプライマーは前記の配列中の下
線により特定される。プライマーは20〜40ヌクレオチド
（任意的プロモーター配列を含めて）の長さであり、効
果的なアニーリングの標的配列との相動性を示した。グ
アノシン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）残基が各プライマー
の３′−末端に存在し、そこから延長が起こる効果的な
塩基対合を保証した。延長が効率的で且つ迅速であるよ
うに、反対の鎖に対して相補なプライマー間に150以下
の塩基対を伴うプライマーを選択した。他のプライマー
との又は単一のプライマー中で安定な塩基対構造を形成
する（これはプライマーが標的配列にアリールするのを
防止するであろう）能力を欠くプライマーをさらに選択
した。増幅段階のために本質的ではないが、「内部」増
幅されたDNAについてのプローブ（すなわち、増幅され
た生成物に対して特異的であるがプライマーとハイブリ
ダイズしないであろうプローブ）のクローニング及び作
製を促進するために便利な制限部位を挟むようにプライ
マーを選択した。この「内部」増幅されたDNAは一般的
記載及び請求の範囲中のセクションＴと同等である。
T7 RNAポリメラーゼプロモーターを含む二本鎖断片の
生成のために使用される反応条件はすでに記載されてい
るもの〔Saiki等、Nature（1986），324:163-166〕と類
似した。反応媒体は、100μｌ容量中に10mM Tris（pH7.
5）、10mM MgCl2、1.5mM dNTP、1.5μＭオリゴヌクレオ
チドプライマー、及び実験に応じて種々の量の標的含有
DNA（0.15pg〜1.0μｇ）を含有した。各サイクルは90℃
における２分間の変性（変性が10分間起こる第一サイク
ルを除く）、ドライアイス上での５秒間の迅速冷却、回
転（チューブの上部での凝集を除去するため）、35℃に
て２分間のプライマーのアニーリング、E.コリ（E.Col
i）ポリメラーゼＩのKlenow断片の２ユニットの添加、
及び35℃にて２分間の延長から成る。
本発明の方法はまた、標的遺伝子特異的オリゴヌクレ
オチドの１つ（上に特定したオリゴ＃１）の５′−末端
にバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼのためのプ
ロモーターを含有せしめることにより行われた。T7プロ
モーター配列はTAATACGACTCACTATAGGGである。これらの
追加の20ヌクレオチドを最初の段階の増幅された二本鎖
DNA生成物に導入することにより、この配列を欠くオリ
ゴヌクレオチドが使用された場合より20bp大きい生成物
を得た。例えば、オリゴ＃１及び＃２を用いて増幅され
たDNAは117bpであり、オリゴヌクレオチドに対する相同
性を含む標的の97bpよりも20bp大である（そして同様
に、＃１及び＃３を用いれば生成物は151bp＝131bp＋20
bpである）。
これらの追加された配列はT7 RNAポリメラーゼのため
の効率的にプロモーターとして機能した。インビトロT7
転写反応はT7 RNA供給者の指示に従って行われた。DNA
鋳型（プロモーター領域を含有する）は上記の反応から
さらに処理することなく直接得た。インビトロで生成し
たT7 RNA転写物のオートラジオグラムは、それらがDNA
鋳型よりも17ヌクレオチド短いことを確認した。言い換
えれば、151塩基対の二本鎖DNA中間対生成物は134nt RN
A、すなわち標的配列からの131nt及びT7プロモーター配
列からの3nt（GGG）を与えた。RNA転写物に〔32P〕‐UT
Pを導入することにより、臭化エチジウム染色に比べ
て、増幅された生成物の検出感度の約300倍の増加が得
られた。
本発明の測定は特に、高い非活性、低いRNA収量を与
えるように設計され、そしてそれ故にT7転写から生じた
標的配列の最大モル増加を示さない。しかしながら、高
収量条件のもとでは、T7 RNAポリメラーゼはDNA鋳型分
子当り50〜100RNA分子を生産することが知られている
〔Davanloo等、“Cloning and expression of glne for
the bacteriophage T7 RNAポリメラーゼ”、Pro.Natl.
Acad.Sci.USA（1984）81:2035-2039〕。
この方法は、図に示しそして上に記載したT7RT増幅の
幾つかのサイクルを用いて行われた。この方法をここで
は便宜上T7RT法と称する。この方法は従来技術のPCR法
に比べて幾つかの利点を有する。第一に、増幅されるべ
き標的配列はRNA又はDNAのいずれでもよく、このこと
は、選択された遺伝子が高度に発現される場合に重要で
ある。なぜなら、AMV逆転写酵素はRNA又は単鎖DNAを鋳
型として使用することができるからである。これはま
た、レトロウイルスの検出の場合のように標的配列がRN
Aのみである増幅のために有意義である。第二に、両配
列を含む各全サイクルからの増幅はPCR技法よりも高く
（T7RTについてはサイクル当り100までであり、これに
対してPCR技法についてはサイクル当り最大２であ
る）、サイクル数の減少（T7RTでは３サイクルで106倍
増幅、これに対してRCRについては少なくとも20〜25）
及び酵素のより少い量の対応する使用が可能となる。第
三に、蛋白質への翻訳、化学的不安定性のごとくRNAがD
NAより好ましい任意の方法のために、多量のRNAが生産
され得る。
T7RT法の最初の研究は前のセクションに記載したのと
同じオリゴヌクレオチド及び標的配列を使用した。図に
示すように、各サイクルのために２種類の酵素、すなわ
ちAMV逆転写酵素及びT7 RNAポリメラーゼが逐次使用さ
れる。変性、アニーリング及び延長の反復される段階は
サンプル温度の変化（変性のためには90〜100℃、アニ
ーリングのためには37〜41℃）、並びに増幅されるべき
核酸、適当な緩衝液（酵素の供給者により示された）、
NTP及びdNTP、モル過剰のオリゴヌクレオチドプライマ
ー並びにRNアーゼ阻害剤を含有するサンプルへの酵素の
添加により実現される。
第一の実験において、プロモーター配列（上記のごと
き）を含有するように最初に合成された遺伝子断片を使
用してT7RT法の実施可能性を証明した。まず、基質DNA
をT7 RNAポリメラーゼにより転写した。これは134ntのR
NA生成物を生ずると予想された。次に、この材料を、放
射能標識されたdNTPの存在下でAMV逆転写酵素を用い
て、前記のようにそして図に示すようにして二本鎖DNA
にもどした。予想され（そして得られた）主たるDNA生
成物は134ntであり、インプット遺伝子断片の連続する
存在のため151ntの少量の材料が存在した。T7ポリメラ
ーゼを省略したほか、対照サンプルを同様に処理した。
この逆転写酵素段階につづき、AMVRTによる直接増幅の
第二サイクルを各サンプルに対して行った。これは、プ
ライマーとしてオリゴ＃１（これはその５′末端にT7プ
ロモーターの追加の17ヌクレオチドを有する）を用いて
の134nt生成物の合成により151nt生成物の実質的な量の
合成をもたらした。調節された反応の151nt生成物に比
べて134nt物質は約10倍多かった（１回のT7RTサイクル
の後）から、T7増幅は、PCR法のみの約4.5サイクルによ
り得られるそれに相当した。この増幅はT7RT法を最適化
することなく達成されたから、PCR法に対する効率及び
コストの一層大きな改良が期待される。
この明細書に記載したすべての公開及び特許出願は、
この発明が属する分野における当業者のレベルを示すも
のである。この明細書のすべての公表及び特許出願は、
各個々の公開又は特許出願が引用により組み込まれるべ
き旨が示されているのと同じ程度に引用によりこの明細
書に組み込まれる。
今やこの発明は十分に記載されており、添付された請
求の範囲の本質又は範囲を逸脱することなく多くの変更
を行うことができることは当業者に明らかであろう。
本発明は要約すると次の通りである。
1.反応媒体中の標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を
検出目的で増加させる方法であって、 （Ａ） 標的単鎖ポリヌクレオチド分子と第一プライマ
ー配列とをハイブリダイズせしめ、次に該第一プライマ
ー配列を伸長させることにより該第一プライマーの伸長
生成物を形成せしめ、そして第二プライマーとのハイブ
リダイゼーションのために利用可能な該第一プライマー
の伸長生成物を作り、該第一プライマー及び該第二プラ
イマーの少なくとも一方はプロモーター配列を含有して
おり、そして該第二プライマー、及び必要であれば該第
一プライマーの前記伸長生成物を伸長させて、前記標的
配列から上流に第一プロモーターを有する第一の二本鎖
DNA中間体を生成せしめ； （Ｂ） 前記プロモーターに結合することができるRNA
ポリメラーゼを用いて前記中間体から前記標的配列の複
数のRNAコピーを成長せしめ； （Ｃ） 前記第一の二本鎖DNA中間体と同一であるか又
はそれとは異り、そして前記標的配列から上流に第二プ
ロモーター配列を有する第二の二本鎖DNA中間体を調製
し、この第二プロモーター配列は、前記第一の二本鎖DN
A中間体のそれと同一でもよく又は異っていてもよく、
前記第二の二本鎖DNA中間体は前記RNAコピーから、該RN
Aコピーを第三のプライマー配列とハイブリダイズせし
め次に該第三プライマーを伸長させることにより該第三
プライマーの伸長生成物を形成しそして第四のプライマ
ーとのハイブリダイゼーションのために利用可能な前記
第三プライマーの伸長生成物を作ることにより調製した
ものであり、該第三プライマー及び第四プライマーの少
なくとも一方は前記第二プロモーター配列を含有してお
り、そして該第三プライマー及び該第四プライマーは前
記第一プライマー及び第二プライマーから異っていても
よく、又は同一であってもよく、そして前記第四プライ
マー及び必要であれば前記第三プライマーの前記伸長生
成物を伸長させて前記第二の二本鎖DNA中間体を生成せ
しめ； （Ｄ） 前記第二プロモーターと結合することができる
RNAポリメラーゼを用いて前記第二の二本鎖DNA中間体か
ら複数のRNAコピーを成長せしめ； （Ｅ） 前記標的配列から上流にさらなるプロモーター
配列を有するさらなる二本鎖DNA中間体を調製し、この
さらなるプロモーターは前記第一の二本鎖DNA中間体及
び前記第二の二本鎖DNA中間体のそれとは異っていても
よく又は同一でもよく、前記さらなる二本鎖DNA中間体
は、前記第二の二本鎖DNA中間体からの前記RNAコピーか
ら、該RNAコピーをさらなるプライマー配列とハイブリ
ダイズせしめ次に該さらなるプライマーを伸長せしめて
該さらなるプライマーの伸長生成物を形成せしめそして
他のプライマーとのハイブリダイゼーションのために利
用可能な前記さらなるプライマーの伸長生成物を使うこ
とにより調製したものであり、該さらなるプライマー及
び該他のプライマーの少なくとも一方がプロモーター配
列を含有しており、そして前記他のプライマー及び必要
であれば前記さらなるプライマーの前記伸長生成物を伸
長せしめて前記さらなる二本鎖DNA中間体を生成せし
め、ここで前記さらなるプライマー及び前記他のプライ
マーは、前記第一プライマー及び前記第二プライマー、
並びに前記第三プライマー及び第四プライマーとは異っ
ていてもよく、又は同一でもよい； ことを特徴とする方法。
2.（Ｆ） 前記さらなるプロモーターに結合することが
できるRNAポリメラーゼを用いて前記さらなる二本鎖DNA
中間体から前記標的配列の複数のRNAコピーを成長させ
ることを含んで成る、１項に記載の方法。
3.1又は複数のサイクルを含んで成り、前サイクルは段
階（Ｅ）及び（Ｆ）の反復を含んで成り、そして反復サ
イクルの前記さらなるプライマー及び他のプライマー
は、先に使用されたいずれかのプライマーと同一でもよ
く又は異っていてもよい、ことを特徴とする２項に記載
の方法。
4.2種類の異るプライマーのみを用いる、１〜３項のい
ずれか１項に記載の方法。
5.前記第二の二本鎖DNA中間体からの前記RNAコピーが前
記標的単鎖ポリヌクレオチドに対して相補的である、１
〜３項のいずれか１項に記載の方法。
6.前記第二の二本鎖DNA中間体からの前記RNAコピーが前
記標的単鎖ポリヌクレオチド分子と同じ意見である、１
〜３項のいずれか１項に記載の方法。
7.前記二本鎖中間体中のプライマー配列が10〜300塩基
対により分離されている、１〜６項のいずれか１項に記
載の方法。
8.前記二本鎖中間体中のプライマー配列が10〜200塩基
対により分離されている、７項に記載の方法。
9.前記二本鎖中間体中のプライマー配列が15塩基対以上
により分離されている、７又は８項に記載の方法。
10.前記二本鎖中間体中のプライマー配列が150塩基対以
下により分離されている。7,8又は２項に記載の方法。
11.相互に異る複数の前記標的配列のコピー数を、検出
目的で同時に増加させることを含んで成る１〜10項のい
ずれか１項に記載の方法。
12.前記プライマー配列が、結合配列のハイブリダイゼ
ーション標的に対して相補的でない１又は複数の塩基を
含有する結合配列を含んで成る、１〜11項のいずれか１
項に記載の方法。
13.前記プライマー配列が、結合配列及び該結合配列の
５′−末端に結合した非相補的塩基の配列を含んで成
る、12項又は13項に記載の方法。
14.前記非相補的塩基対が、制限エンドヌクレアーゼ開
裂部位を提供する、12項又は13項に記載の方法。
15.前記プライマー配列が、特定のアミノ酸配列をコー
ドする種々のヌクレオチド配列に対して相補的な複数の
ヌクレオチド配列を含んで成る複数のヌクレオチド配列
の集りである、１項〜14項のいずれか１項に記載の方
法。
16.段階（Ａ），（Ｃ）及び（Ｅ）のいずれか１つにお
ける前記プライマーの少なくとも１つがプロモーター配
列を含有する、１項〜15項のいずれか１項に記載の方
法。
17.プライマーを用いる次の段階を進行する前に、前段
階からのプライマーを除去する、１項〜16項のいずれか
１項に記載の方法。
18.前記第一プライマーがプロモーター配列外にある、
１項〜17項のいずれか１項に記載の方法。
19.段階（Ａ）で使用するプライマーが段階（Ｃ）及び
（Ｅ）で使用するプライマーと異る、１項〜18項のいず
れか１項に記載の方法。
20.段階（Ｃ）及び（Ｅ）において使用するプライマー
が、段階（Ａ）におけるプライマーの結合領域間に位置
する前記標的配列の結合領域とハイブリダイズする、19
項に記載の方法。
21.段階（Ｅ）において使用するプライマーが段階
（Ｃ）におけるプライマーの結合領域間に位置する前記
標的配列の結合領域とハイブリダイズする、19項又は20
項に記載の方法。
22.段階（Ａ）において使用するプライマーが反復サイ
クルの段階（Ｅ）において使用するプライマーと異る、
３項に記載の方法。
23.反復サイクルの段階（Ｅ）において使用するプライ
マーが、段階（Ａ）において使用するプライマーの結合
領域間に位置する前記標的配列の結合領域にハイブリダ
イズする、22項に記載の方法。
24.プライマーの伸長が、DNA依存性DNAポリメラーゼはR
NA依存性DNAポリメラーゼの使用によるものである１項
〜23項のいずれか１項に記載の方法。
25.プライマーの伸長が逆転写酵素の使用によるもので
ある、24項に記載に方法。
26.前記逆転写酵素がAMV逆転写酵素である25項に記載の
方法。
27.プロモーターを用いて次の段階を進行させる前に、
先行段階からのプロモーターを認識するRNAポリメラー
ゼを変性させる、１項〜26項のいずれか１項に記載の方
法。
28.段階（Ａ）におけるプロモーター配列が、段階
（Ｃ）又は段階（Ｅ）におけるプロモーター配列と異
る、１項〜27項のいずれか１項に記載の方法。
29.段階（Ａ）におけるプロモーター配列が、反復サイ
クルの段階（Ｅ）において使用するプロモーター配列と
異る、３項に記載の方法。
30.プロモーター配列がSP6プロモーター配列であり、そ
してSP6プロモーター配列を含んで成る二本鎖DNA中間体
からのRNAの成長がSP6 RNAポリメラーゼによるものであ
る、１項〜26項のいずれか１項に記載の方法。
31.プロモーター配列がT7プロモーター配列であり、そ
してT7プロモーター配列を含んで成る二本鎖DNA中間体
からのRNAの成長がT7 RNAポリメラーゼによるものであ
る、１項〜30項のいずれか１項に記載の方法。
32.前記単鎖ポリヌクレオチド分子が、 （ｉ） 二本鎖DNA分子の鎖を分離し；又は （ii） 単鎖DNA分子の相補的DNAコピーを作り；又は （iii） 単鎖RNA分子の相補的DNAコピーを作る； ことにより得られるものである。１項〜31項のいずれか
１項に記載の方法。
33.前記反応媒体中の前記標的ポリヌクレオチド配列がR
NAである、１項〜32項のいずれか１項に記載の方法。
34.前記標的単鎖ポリヌクレオチドをまず該標的配列の
下流のプライマー配列とハイブリダイズせしめることを
含んで成り、前記第二プライマーが前記プロモーター配
列を含んで成る、33項に記載の方法。
35.前記標的ポリヌクレオチド配列が、個別の分子又は
大きな分子の部分である、１項〜34項のいずれか１項に
記載の方法。
36.前記プライマーが50個以下のヌクレオチドを含んで
成る、１項〜35項のいずれか１項に記載の方法。
37.前記プライマーが20〜40ヌクレオチドを含んで成
る、36項に記載の方法。
38.生物体中に存在する標的配列を検出することを含ん
で成り、該生物体のための宿主のゲノムが、核酸ハイブ
リダイゼーションにより前記標的核酸配列から区別でき
ないポリヌクレオチド配列を伴わないことを特徴とす
る、生物体の存在を診断するための１項〜37項のいずれ
か１項に記載に方法。
39.前記標的ポリヌクレオチド配列が、最初には、全核
酸配列の小部分として前記反応媒体中に存在する、１項
〜38項のいずれか１項に記載の方法。
40.ハイブリダイゼーションのために利用できるプライ
マー伸長生成物の製造を、熱の適用以外の方法で行う、
１項〜39項のいずれか１項に記載の方法。
41.溶剤を用いる40項に記載の方法。
42.前記標的が、トキソプラズマ・ゴンジー（Toxoplasm
a gondii）の抗写遺伝子である、１項〜41項にいずれか
１項に記載の方法。
43.前記プライマーが、次の配列： の少なくとも１つを含んで成る、42項に記載の方法。
44.1項〜43項のいずれか１項に記載の方法によって標的
配列のコピー数を増加せしめ、そして該増加したコピー
の存在を検出することを含んで成る、サンプル中の標的
ポリヌクレオチド配列の検出方法。
45.1項〜44項のいずれか１項に従って増加した標的ポリ
ヌクレオチド配列を、前記反応媒体から分離することな
く検出する方法。
46.1項〜45項のいずれか１項に従って標的ポリヌクレオ
チド配列を増加せしめることを含んで成る、ヒトの病気
と関連する病原体又は遺伝子欠陥を検出するための方
法。
47.次の配列： の１つを含んで成る少なくとも１つのプライマーを含ん
で成る、トキソプラズマ・ゴンジーの抗写遺伝子を検出
目的で増幅するための溶液。
48.前記47項に記載の溶液を含んで成る、トキソプラズ
マ・ゴンジーの抗写遺伝子を検出目的で増幅するための
キット。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 プレティー，フィリップ ジャーク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94025，メンロ パーク，サン マテオ ドライブ 100 (72)発明者 ブースロイド，ジョン チャールズ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94306，パロ アルト，ルーズベルト サークル 42

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】反応媒体中の標的ポリヌクレオチド配列の
    コピー数を検出目的で増加させる方法であって、 （Ａ） 標的単鎖ポリヌクレオチド分子と第一プライマ
    ー配列とをハイブリダイズせしめ、次に該第一プライマ
    ー配列を伸長させることにより該第一プライマーの伸長
    生成物を形成せしめ、そして第二プライマーとのハイブ
    リダイゼーションのために利用可能な該第一プライマー
    の伸長生成物を作り、該第一プライマー及び該第二プラ
    イマーの少なくとも一方はプロモーター配列を含有して
    おり、そして該第二プライマー、及び必要であれば該第
    一プライマーの前記伸長生成物を伸長させて、前記標的
    配列から上流に第一プロモーターを有する第一の二本鎖
    DNA中間体を生成せしめ； （Ｂ） 前記プロモーターに結合することができるRNA
    ポリメラーゼを用いて前記中間体から前記標的配列の複
    数のRNAコピーを成長せしめ； （Ｃ） 前記第一の二本鎖DNA中間体と同一であるか又
    はそれとは異り、そして前記標的配列から上流に第二プ
    ロモーター配列を有する第二の二本鎖DNA中間体を調製
    し、この第二プロモーター配列は、前記第一の二本鎖DN
    A中間体のそれと同一でもよく又は異っていてもよく、
    前記第二の二本鎖DNA中間体は前記RNAコピーから、該RN
    Aコピーを第三のプライマー配列とハイブリダイズせし
    め次に該第三プライマーを伸長させることにより該第三
    プライマーの伸長生成物を形成しそして第四のプライマ
    ーとのハイブリダイゼーションのために利用可能な前記
    第三プライマーの伸長生成物を作ることにより調製した
    ものであり、該第三プライマー及び第四プライマーの少
    なくとも一方は前記第二プロモーター配列を含有してお
    り、そして該第三プライマー及び該第四プライマーは前
    記第一プライマー及び第二プライマーから異っていても
    よく、又は同一であってもよく、そして前記第四プライ
    マー及び必要であれば前記第三プライマーの前記伸長生
    成物を伸長させて前記第二の二本鎖DNA中間体を生成せ
    しめ； （Ｄ） 前記第二プロモーターと結合することができる
    RNAポリメラーゼを用いて前記第二の二本鎖DNA中間体か
    ら複数のRNAコピーを成長せしめ； （Ｅ） 前記標的配列から上流にさらなるプロモーター
    配列を有するさらなる二本鎖DNA中間体を調製し、この
    さらなるプロモーターは前記第一の二本鎖DNA中間体及
    び前記第二の二本鎖DNA中間体のそれとは異っていても
    よく又は同一でもよく、前記さらなる二本鎖DNA中間体
    は、前記第二の二本鎖DNA中間体からの前記RNAコピーか
    ら、該RNAコピーをさらなるプライマー配列とハイブリ
    ダイズせしめ次に該さらなるプライマーを伸長せしめて
    該さらなるプライマーの伸長生成物を形成せしめそして
    他のプライマーとのハイブリダイゼーションのために利
    用可能な前記さらなるプライマーの伸長生成物を使うこ
    とにより調製したものであり、該さらなるプライマー及
    び該他のプライマーの少なくとも一方がプロモーター配
    列を含有しており、そして前記他のプライマー及び必要
    であれば前記さらなるプライマーの前記伸長生成物を伸
    長せしめて前記さらなる二本鎖DNA中間体を生成せし
    め、ここで前記さらなるプライマー及び前記他のプライ
    マーは、前記第一プライマー及び前記第二プライマー、
    並びに前記第三プライマー及び第四プライマーとは異っ
    ていてもよく、又は同一でもよい； ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】（Ｆ） 前記さらなるプロモーターに結合
    することができるRNAポリメラーゼを用いて前記さらな
    る二本鎖DNA中間体から前記標的配列の複数のRNAコピー
    を成長させることを含んで成る、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】１又は複数のサイクルを含んで成り、前サ
    イクルは段階（Ｅ）及び（Ｆ）の反復を含んで成り、そ
    して反復サイクルの前記さらなるプライマー及び他のプ
    ライマーは、先に使用されたいずれかのプライマーと同
    一でもよく又は異っていてもよい、ことを特徴とする請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】２種類の異るプライマーのみを用いる、請
    求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
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