DE69736667T2

DE69736667T2 - Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm)

Info

Publication number: DE69736667T2
Application number: DE69736667T
Authority: DE
Inventors: McClellan Michael San Diego BECKER; Mehrdad San Diego MAJLESSI
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: WO1998002582A2; US6130038A; AU3728897A; US6903206B1; US20050106610A1; DK0912767T3; ES2270467T3; CA2260749A1; JP4527789B2; JP2008283973A; ATE339514T1; EP0912767B1; JP2000514307A; DE69736667D1; EP0912767A2; AU726821B2; WO1998002582A3; KR20000023814A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen und Amplifizieren von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Oligonukleotiden, die ein oder mehrere Nukleotide mit einer Modifikation oder Modifikationen, die in einer erhöhten Affinität für das Ziel resultieren, enthalten. Von solchen Oligonukleotiden wurde unerwarteterweise entdeckt, dass sie mit einer wesentlich höheren Rate an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisieren, als ein entsprechendes unmodifiziertes Oligonukleotid an dasselbe Ziel hybridisiert. Demzufolge bieten die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Vorteile für Anwendungen, die Nukleinsäurehybridisierung einsetzen, wie Diagnostik in der Medizin und Tiermedizin, Nahrungsmittelprüfung und forensische Medizin.
Allgemeiner Stand der Technik
In der jüngsten Vergangenheit ist Nukleinsäurehybridisierung zu einem zunehmend an Bedeutung gewinnenden Mittel zum Identifizieren, Messen und Nachweisen des Vorliegens von bestimmten Nukleinsäuren in einer gegebenen Probe geworden. Auf diese Weise haben beispielsweise die Gebiete der medizinischen Diagnostik, Umwelt- und Nahrungsmittelprüfung und forensischen Medizin alle von der Anwendung von Nukleinsäurehybridisierung als eine schnelle, einfache und außerordentlich genaue Methode zum Prüfen auf das Vorliegen oder Fehlen von gegebenen biologischen Kontaminanten oder Mikroorganismen in einer Probe profitiert.
Die meisten Nukleinsäurehybridisierungsschemata haben Merkmale gemein. Ein solches typisches Merkmal ist die Verwendung von einzelsträngigen Nukleinsäuresonden (oder denaturierten doppelsträngigen Sonden) mit einer definierten oder bekannten Nukleotidsequenz. Sondenmoleküle können von biologischen Quellen stammen, wie genomische DNA oder RNA, oder können enzymatisch synthetisiert sein, entweder in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle oder in vitro. Derzeit sind die meisten im allgemeinen Gebrauch befindlichen Nukleinsäuresonden Oligonukleotidsonden, die unter Anwendung chemischer Syntheseverfahren hergestellt wurden („synthetische Oligonukleotide"). Ein solches Syntheseverfahren ist die automatisierte sequentielle Addition von 3'-aktivierten, geschützten Nukleotiden an das 5'-Ende einer wachsenden, an die feste Phase gebundenen Oligonukleotidkette, gefolgt von Spaltung des vollständigen Oligonukleotids von dem Träger und Entschützung. Siehe z. B. Eckstein, Oligonucleotides & Analogues: A Practical Approach (1991).
Synthetische Oligonukleotide zur Verwendung als Hybridisierungssonden sind in der Regel Desoxyribonukleotide mit einer Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist. DNA-Oligonukleotide werden traditionell aus einer Reihe von Gründen bevorzugt. Zu diesen zählt die größere Stabilität, die DNA bei enzymatischer Hydrolyse nach dem Aussetzen gegenüber üblichen Proben aufgrund des nahezu ubiquitären Vorliegens verschiedener RNAses in Proben aufweist. Von RNA ist auch bekannt, dass sie weniger chemisch stabil ist als DNA, z. B. wird der RNA-Abbau durch das Vorliegen von basischen Schwermetallen erleichtert. Im Vergleich zu RNA neigt DNA zudem weniger dazu, unter Assaybedingungen stabile sekundäre Strukturen anzunehmen. Derartig sekundäre Strukturen können bewirken, dass Oligonukleotide zur intermolekularen Hybridisierung nicht mehr zur Verfügung stehen. Dennoch können RNA-Oligonukleotide verwendet werden, selbst wenn sie weniger bevorzugt sind.
Nukleinsäurehybridisierung nutzt die Fähigkeit von einzelsträngigen Nukleinsäuren aus, stabile Hybride mit entsprechenden Regionen von Nukleinsäuresträngen mit komplementären Nukleotidsequenzen zu bilden. Derartige Hybride bestehen für gewöhnlich aus doppelsträngigen Duplexen, obgleich dreisträngige Strukturen ebenfalls bekannt sind. Allgemein ausgedrückt werden DNA- oder RNA-Einzelstränge von Nukleotiden gebildet, die die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Thymidin (T), Guanin (G), Uracil (U) oder Inosin (I) enthalten. Die einzelsträngigen Ketten können hybridisieren, um eine doppelsträngige Struktur bilden, die von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Paaren von komplementären Basen zusammengehalten wird. Im Allgemeinen ist A mittels einer Wasserstoffbrücke an T oder U gebunden, während G oder I mittels einer Wasserstoffbrücke an C gebunden ist. Entlang der doppelsträngigen Kette liegen klassische Basenpaare AT oder AU, TA oder UA, GC oder CG vor. Darüber hinaus können einige fehlgepaarte Basenpaare (z. B. AG, GU) vorliegen. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen können sich DNA/DNA-, RNA/DNA- oder RNA/RNA-Hybride bilden.
Mit „komplementär" ist gemeint, dass die Nukleotidsequenzen von entsprechenden Regionen von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren oder zwei verschiedenen Regionen derselben einzelsträngigen Nukleinsäure eine Nukleotidbasenzusammensetzung aufweisen, die den Einzelsträngen ermöglicht, in einer stabilen doppelsträngigen, mit Wasserstoffbrücken gebundenen Region unter strengen Hybridisierungsbedingungen zusammen zu hybridisieren. Wenn eine angrenzende Sequenz von Nukleotiden einer einzelsträngigen Region eine Reihe von „kanonischen", mit Wasserstoffbrücken gebundenen Basenpaaren mit einer analogen Sequenz von Nukleotiden der anderen einzelsträngigen Region bilden kann, so dass A mit U oder T ein Paar bildet und C mit G ein Paar bildet, sind die Nukleotidsequenzen „perfekt" komplementär.
Die extreme Spezifität von Nukleinsäurehybridisierung, die unter gewissen Umständen die Unterscheidung von Nukleinsäuren ermöglichen kann, die sich durch nur eine Base unterscheiden, hat die Entwicklung von auf der Hybridisierung basierenden Assays von Proben, die spezifische Mikroorganismen, gegebene genetische Markierungssubstanzen tragende Nukleinsäuren, Gewebe, biologische Flüssigkeiten und dergleichen enthalten, ermöglicht. Derartige Assays können oftmals Nukleinsäuren, die zu bestimmten Spezies von Mikroorganismen gehören, in einer Probe, die andere, eng damit verwandte Spezies enthält, identifizieren. Nukleinsäurehybridisierungsassays können auch bestimmte Individuen oder Gruppen von Individuen innerhalb einer Spezies erkennen oder identifizieren, wie bei der forensischen Anwendung von RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) und PCR (polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion) zur Prüfung von Proben mit menschlichem Ursprung.
Die Anwendung von Oligonukleotiden als ein diagnostisches Werkzeug bei der Prüfung mittels Nukleinsäurehybridisierung umfasst häufig, muss dies jedoch nicht umfassen, die Verwendung einer Reportergruppe oder eines „Markers", die bzw. der mit dem Oligonukleotidsondenmolekül oder sowohl der Sonde als auch dem Ziel verbunden ist. Ein solcher Reportergruppen-Teil kann beispielsweise ein Radioisotop, chemilumineszierendes oder fluoreszierendes Agens oder Enzym enthalten, das mit dem Oligonukleotid verbunden ist. Der Marker wird eingesetzt, um zu bewirken, dass die Sonde zum Nachweis fähig ist, insbesondere wenn die Sonde an die Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist.
Die Mehrheit von Assayverfahren, die Nukleinsäuren einsetzen, wendet einen physikalischen Trennschritt an, um das Proben/Analyt-Hybrid von ungebundener Sonde zu trennen. Diese Assayverfahren werden „heterogene" Assays genannt. In Nukleinsäurehybridisierungsassays ist ein Analytmolekül die Ziel-Nukleinsäurespezies, die nachgewiesen, quantifiziert und/oder identifiziert werden soll. Ein „Hybrid" ist eine zum Teil oder gänzlich doppelsträngige Nukleinsäure, die zwei einzelsträngige Nukleinsäuren umfasst, wie eine Sonde und eine Ziel-Nukleinsäure, mit einer Komplementaritätsregion, was unter Assay- und/oder Amplifikationsbedingungen in intermolekularer Wasserstoffbrückenbindung resultiert.
Zu Assayverfahren, die einen physikalischen Trennschritt anwenden, zählen Verfahren, die im Trennvorgang eine Festphasenmatrix einsetzen, wie Glas, Mineralien oder polymere Materialien. Das Trennen kann vorzugsweise das Binden des Sonden/Analyt-Komplexes an die Festphasenmatrix umfassen, wobei ermöglicht wird, dass die nicht assoziierten Sondenmoleküle in einer flüssigen Phase bleiben. Eine solche Bindung kann nichtspezifisch, wie beispielsweise im Fall von Hydroxyapatit, oder spezifisch, wie beispielsweise mittels sequenzspezifischer Wechselwirkung der Ziel-Nukleinsäure mit einer „Capture"-Sonde (Einfangsonde), die direkt oder indirekt an dem festen Träger immobilisiert wird, sein. In einem beliebigen derartigen Fall ist die Menge an Sonde, die nach einem Waschschritt an dem Festphasenträger gebunden bleibt, zu der Menge an Analyt in der Probe proportional.
Alternativ kann der Assay vorzugsweise das Binden der unhybridisierten Sonde umfassen, während das Hybrid belassen wird, um in der flüssigen Phase zu bleiben. In diesem Fall ist die Menge an Sonde in der flüssigen Phase nach einem Waschschritt zu der Menge an Analyt in der ursprünglichen Probe proportional. Wenn die Sonde eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid ist, kann der feste Träger ohne Einschränkung ein Adsorptionsmittel wie Hydroxyapatit, ein polykationischer Teil, ein hydrophobes oder „Umkehrphasen"-Material, eine Ionenaustauschmatrix wie DEAE, eine Gelfiltrationsmatrix oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Festphasenmaterialien beinhalten. Der feste Träger kann ein oder mehrere Oligonukleotide oder einen anderen spezifischen Bindungsteil enthalten, um die Sonde, das Ziel oder beide direkt oder indirekt einzufangen. Im Fall von Medien, wie Gelfiltration, Polyacrylamidgel oder Agarosegel, liegt die Trennung nicht in der Bindung des Oligonukleotids begründet, sondern wird von Molekularsiebung unterschiedlich großer oder geformter Moleküle bewirkt. In den letzteren zwei Fällen kann die Trennung elektrophoretisch vom Anlegen eines elektrischen Stroms durch das Gel angetrieben werden, die die Differentialmigration von Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Größen oder Formen, wie doppelsträngigen und einzelsträngigen Nukleinsäuren, durch das Gel bewirkt.
Ein heterogenes Assayverfahren kann auch das Binden der Sonde an eine Festphasenmatrix vor der Zugabe einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den betreffenden Analyten enthält, umfassen. Die Probe kann unter Bedingungen mit dem Marker in Kontakt gebracht werden, die bewirken würden, dass die gewünschte Nukleinsäure markiert wird, wenn sie in der Probenmischung vorliegt. Die Festphasenmatrix kann derivatisiert oder aktiviert werden, so dass zwischen der Sonde und der Matrix eine kovalente Bindung gebildet wird. Alternativ kann die Sonde über starke nichtkovalente Wechselwirkungen an die Matrix gebunden werden, einschließlich, ohne Einschränkung, der folgenden Wechselwirkungen: ionische, hydrophobe, Umkehrphase, Immunbindung, Chelat und Enzym-Substrat. Nachdem die matrixgebundene Sonde unter Bedingungen, die die Bildung eines Hybrids ermöglichen, der markierten Nukleinsäure ausgesetzt wird, wird der Trennschritt mittels Waschen von jeglichem ungebundenen, markierten Analyten von der Festphasenmatrix durchgeführt. Umgekehrt kann der Analyt an die Festphasenmatrix gebunden und mit markierter Sonde in Kontakt gebracht werden, wobei die überschüssige freie Sonde vor Nachweis des Markers von der Matrix gewaschen wird.
Noch eine andere Art von Assaysystem wird als „homogener Assay" bezeichnet. Homogene Assays können im Allgemeinen in Lösung, ohne einen Festphasentrennschritt, stattfinden und nutzen häufig chemische Unterschiede zwischen der freien Sonde und dem Analyt/Sonden-Komplex aus. Ein Beispiel eines Assaysystems, das in einem homogenen oder heterogenen Format verwendet werden kann, ist der Hybridisierungsschutzassay (hybridization protection assay, HPA), in Arnold et al., US-Patentschrift 5,283,174, offenbart, in dem eine Sonde mit einem chemilumineszierenden Teil verknüpft, mit einem Analyten in Kontakt gebracht und dann selektivem chemischem Abbau oder einer nachweisbaren Änderung der Stabilität unterzogen wird unter Bedingungen, die das chemilumineszierende Reagens, das an unhybridisierte Sonde gebunden oder mit dieser verbunden ist, verändern, ohne das chemilumineszierende Reagens zu verändern, das an ein Analyt/Sonden-Konjugat gebunden oder mit diesem verbunden ist. Die anschließende Initiierung einer chemilumineszierenden Reaktion bewirkt, dass der mit dem Hybrid assoziierte Marker Licht ausstrahlt.
Kompetitionsassays, in denen eine markierte Sonde oder ein markierter Analyt mit seinem unmarkierten Analogon um Bindung konkurriert, werden ebenfalls häufig in einem heterogenen Format verwendet. Je nachdem, wie das System entworfen ist, kann entweder die Menge an gebundener, markierter Sonde oder die Menge an ungebundener, markierter Sonde mit der Menge an Analyt in einer Probe korreliert werden. Ein solcher Assay kann jedoch auch in einem homogenen Format ohne einen physikalischen Trennschritt oder in einem Format, das Elemente sowohl eines homogenen als auch eines heterogenen Assays einbindet, verwendet werden.
Die hierin beschriebenen Assayverfahren sind lediglich beispielhaft und sollten nicht als die Nukleinsäuren einsetzende Assayformate, die Fachmännern bekannt sind, erschöpfend aufgefasst werden.
Nukleinsäurehybridisierung ist in Verfahren eingesetzt worden, die auf das Verwenden von Oligonukleotiden als Therapeutika, um die Genexpression in lebenden Organismen zu modifizieren oder zu inhibieren, abzielen. In einem Beispiel einer solchen Nutzung können Oligonukleotid „Antisense"-Agentien spezifisch eine mRNA-Spezies targetieren, die für ein fehlerhaftes Genprodukt kodiert, wie ein Virusprotein oder ein Onkogen. Siehe z. B. Zamecnik und Stephenson, 75 Proc. Nat'1 Acad. Sci. (USA), 280-284 (1978); Stephenson und Zamecnik, 75 Proc. Nat'1 Acad. Sci. (USA), 285-288 (1978); und Tullis, US-Patentschrift Nr. 5,023,243. Obgleich sich der Anmelder nicht auf eine Theorie beschränken will, wird angenommen, dass der RNA/DNA-Duplex, der aus der Bindung des Antisense-Oligonukleotids an RNA-Ziele resultiert, als ein Substrat für RNAse H, ein RNA abbauendes Enzym, das in den meisten Zellen vorliegt und für in einem RNA/DNA-Duplex enthaltene RNA spezifisch ist, fungieren kann. Gemäß diesem Modell wird das Ziel-RNA-Molekül mittels Hybridisierung an das Antisense-Oligonukleotid zerstört. Es existieren Variationen dieser allgemeinen Strategie, in denen beispielsweise das Oligonukleotid eine Struktur aufweist, die dem Oligonukleotid eine enzymatische Aktivität verleiht, wie die RNAse-Aktivität so genannter Ribozyme. Siehe z. B. Goodchild, PCT-Veröffentlichung Nr. WO93/15194.
Da therapeutische Antisense-Oligonukleotide vorwiegend dazu entworfen werden, in vivo zu funktionieren, müssen Formulierungen zur Abgabe solcher Agentien die normale Zellfunktion nicht wesentlich inhibieren. Somit sind Nukleaseinhibitoren, die manchmal in diagnostischen Invitro-Tests integriert werden können, um den Oligonukleotidabbau zu verhindern, nicht zur Verwendung in vivo geeignet. Dieses Faktum hat im Design verschiedener Oligonukleotide resultiert, die an der Verknüpfung zwischen den Nukleotiden, an den Basen- oder Zuckerteilen oder an Kombinationen dieser Stellen modifiziert wurden, um über eine höhere Nukleaseresistenz als unmodifizierte DNA zu verfügen.
Deshalb wurde eine Reihe von Oligonukleotidderivaten mit Modifikationen an der Stickstoffbase hergestellt, einschließlich des Austauschs der Aminogruppe an der 6-Position von Adenosin durch Wasserstoff, um Purin zu erzielen; der Substitution des 6-Ketosauerstoffs von Guanosin mit Wasserstoff, um 2-Amino-Purin zu erzielen, oder mit Schwefel, um 6-Thioguanosin zu erzielen, und des Austauschs des 4-Ketosauerstoffs von Thymidin durch entweder Schwefel oder Wasserstoff, um 4-Thiothymidin bzw. 4-Hydrothymidin zu erzielen. All diese Nukleotidanaloga können als Reaktionspartner für die Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden. Siehe z. B. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, oben. Andere substituierte Basen sind in der Technik bekannt. Siehe z. B. Cook et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO92/02258 mit dem Titel Nuclease Resistant, Pyrimidine Modified Oligonucleotides that Detect and Modulate Gene Expression. Basenmodifizierte Nukleotidderivate zur Oligonukleotidsynthese können im Handel erhalten werden.
In ähnlicher Weise ist von einer Reihe von Nukleotidderivaten mit Modifikationen des Ribofuranosyl- oder Desoxyribofuranosyl-Teils berichtet worden. Siehe z. B. Cook et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO94/19023 mit dem Titel Cyclobutyl Antisense Oligonucleotides, Methods of Making and Use Thereof; McGee et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO94/02501 mit dem Titel Novel 2'-O-Alkyl Nucleosides and Phosphoramidites, Processes for the Preparation and Uses Thereof; und Cook, PCT-Veröffentlichung Nr. WO93/13121 mit dem Titel Gapped 2'-modified Oligonucleotides.
Die meisten Oligonukleotide, die solche modifizierten Basen umfassen, sind mit Blick auf eine erhöhte zelluläre Aufnahme, Nukleaseresistenz und/oder eine gesteigerte Substratbindung formuliert worden. Anders ausgedrückt, solche Oligonukleotide werden als genmodulierende Therapeutika beschrieben.
Nukleinsäuren mit modifizierten Nukleotidresten existieren in der Natur. Daher können modifizierte Basen in RNA methylierte oder dimethylierte Basen, desaminierte Basen, carboxylierte Basen, thiolierte Basen und Basen mit verschiedenen Kombinationen dieser Modifikationen enthalten. Darüber hinaus ist bekannt, dass 2'-O-alkylierte Basen in natürlich vorkommenden Nukleinsäuren vorliegen. Siehe Adams, The Biochemistry of the Nucleic Acids, 7, 8 (11. Ausg. 1993).
EP0742287A2 (McGall et al.) offenbart eine Auswahl von möglichen Modifikationen für Oligonukleotidsonden, die an festen Substraten angeheftet sind. Verschiedene Modifikationen werden gewählt, um in den Sonden sekundäre Strukturen zu erzeugen und/oder die Affinität der Sonden für ihre Ziele zu ändern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines 2'-O-Methyl-modifizierten Oligonukleotids mit einer bekannten Nukleotidsequenz als eine Sonde für eine gefaltete Zielsequenz von rRNA, tRNA oder viraler RNA, die in einer Probe vorliegt, die Nicht-Ziel-Nukleinsäure enthält, bereit, wobei das modifizierte Oligonukleotid mehr als 4 aneinandergrenzende Nukleotide aufweist, die modifiziert wurden, um eine 2'-O-Methyl-Substitution zu enthalten, und wobei die Hybridisierungsrate zwischen dem modifizierten Oligonukleotid und dem Ziel höher als die Hybridisierungsrate zwischen dem unmodifizierten Oligonukleotid und dem Ziel ist.
Im Wesentlichen können alle Nukleotide des Oligonukleotids sein.
Eine unmarkierte Helfersonde kann zusammen mit dem modifizierten Oligonukleotid verwendet werden.
Ein Ribofuranosyl-Teil des Oligonukleotids ist vorzugsweise modifiziert.
Das Oligonukleotid kann mit einem konjugierten Molekül verbunden sein, wobei das konjugierte Molekül die Funktion ausübt, die Bindungsaffinität und die Hybridisierungsrate des Oligonukleotids gegenüber dem Ziel zu erhöhen, wobei das konjugierte Molekül aus der Gruppe bestehend aus kationischen Aminen, interkalierenden Farbstoffen, Antibiotika, Proteinen, Peptidfragmenten und Metallionenkomplexen ausgewählt ist.
Das Oligonukleotid ist vorzugsweise zwischen 10 und 100 Basen lang, mehr bevorzugt zwischen 10 und 15 Basen lang.
Das Oligonukleotid kann weiterhin einen Marker enthalten, vorzugsweise wobei der Marker ein chemilumineszierendes Agens oder ein fluoreszierendes Agens ist.
Die Probe kann einem Amplifikationsvorgang unterzogen worden sein.
Das Oligonukleotid kann direkt oder indirekt an einen festen Träger immobilisiert werden.
Die Probe kann eine aus einer klinischen Quelle, einer Nahrungsmittelquelle oder einer Umweltquelle erhaltene sein.
Die Sonde und ein beliebiger Sonden/Ziel-Komplex können frei in Lösung sein.
Die in der Erfindung verwendeten Oligonukleotide können gänzlich modifiziert sein.
Obgleich sich der Ausdruck T_m auf die Temperatur bezieht, bei der sich 50 % einer Population gleicher Mengen komplementärer Nukleinsäurestränge in der doppelsträngigen Form befinden, soll die „T_m eines Oligonukleotids" oder einer Nukleinsäure (einzelsträngig) überall in dieser Offenbarung für die T_m eines Oligonukleotids oder einer Nukleinsäure in einem Nukleinsäureduplex mit einem Ziel stehen, wobei die Nukleinsäure eine Basensequenzregion enthält, die zu einer Basensequenzregion des Oligonukleotids exakt komplementär ist, sofern nicht anders angegeben.
Da die T_m der modifizierten Oligonukleotide höher als die entsprechender, unmodifizierter Oligonukleotide mit derselben Basensequenz ist, bedeutet die Verwendung der Erfindung, dass hierin beschriebene Zusammensetzungen und diagnostischen Verfahren Oligonukleotide und Oligonukleotidsonden mit einer kleineren Länge verwenden können, als ansonsten für die spezifische Hybridisierung und den spezifischen Nachweis der Ziele der Erfindung praktisch sind. Die Verwendung von kürzeren Oligonukleotiden zum spezifischen Binden an Ziel-Nukleinsäuren bei einer gegebenen Temperatur hat weitere Vorteile. Zum Beispiel werden kürzere Oligonukleotide im Allgemeinen eine bessere Fähigkeit zum Unterscheiden perfekt komplementärer Ziele von „fehlgepaarten" Basensequenzregionen aufweisen. Bei kürzeren Oligonukleotiden ist es außerdem weniger wahrscheinlich, dass sie unerwünschte Basensequenzen überlappen. Darüber hinaus können die modifizierten Oligonukleotide aufgrund der höheren T_m bei höheren Temperaturen stabil hybridisieren als ihre unmodifizierten Entsprechungen.
Die Verwendung höherer Hybridisierungstemperaturen treibt die Hybridisierungsreaktion kinetisch an, was in schnelleren Hybridisierungsraten resultiert, als bei niedrigeren Temperaturen auftreten würden. Des Weiteren resultieren die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten modifizierten Oligonukleotide in schnelleren Hybridisierungsraten als die unmodifizierten Versionen, selbst wenn die Temperatur nicht erhöht wird.
Eine erhöhte Hybridisierungsrate führt zu mehreren weiteren Vorteilen in diagnostische Assays. Zum Beispiel können diagnostische Assays, die gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, schneller als in bereits existierenden Hybridisierungsassays durchgeführt werden. In Fällen, in denen die Resultate des Assays einen Ablauf einer medizinischen Behandlung oder anderen Aktion vorschreiben können, hat ein schnelleres Assayresultat deutliche Vorteile bei der Prognose und kann in einer effektiveren Behandlung resultieren. Zudem können aufgrund schnellerer Hybridisierungsraten und einer höheren Affinität modifizierter Oligonukleotide für die Ziele der Erfindung zum Erzielen desselben Signalausmaßes niedrigere Sondenkonzentrationen verwendet werden. Folglich kann der Assayhintergrund (oder das „Assayrauschen") verringert werden und die niedrigere Sondenkonzentration kann dabei helfen, unerwünschte Kreuzreaktionen mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren auszumerzen. Darüber hinaus können diese Assays in größeren Probenvolumina laufen gelassen werden, wodurch die Sensitivität des Assays erhöht wird.
Somit können Hybridisierungsassay-Sonden gemäß der Verwendung der Erfindung dazu entworfen werden, aus der erhöhten Rate zielspezifischer Hybridisierung einen Vorteil zu ziehen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt die IUPAC-Nomenklatur für eine Probenahme von Acridiniumestern bereit, die in der vorliegenden Offenbarung als nachweisbare chemilumineszierende Marker verwendet werden können.
2 zeigt eine Anordnung, wobei der Nachweis eines Analyten zunächst die Hybridisierung des Analyten an eine Nukleinsäure, bei der es sich nicht um die Sonde handelt, bedingt. Gemäß dieser Anordnung kann sich die Sonde weder an den Analyten oder die Nicht-Sonden-Nukleinsäure binden, bevor der Analyt an die Nicht-Sonden-Nukleinsäure hybridisiert wurde. (Fettgedruckte Abschnitte stellen Komplementaritätsregionen zwischen dem Analyten und der Nicht-Sonden-Nukleinsäure dar.) Die Hybridisierung des Analyten an die Nicht-Sonden-Nukleinsäure verändert jedoch die Konfiguration der Nicht-Sonden-Nukleinsäure in ausreichendem Maße, um die Hybridisierung der Nicht-Sonden-Nukleinsäure an die Sonde zu ermöglichen, wodurch der Nachweis des Analyten möglich gemacht wird.
3 zeigt die Schmelzkurve einer 2'-O-Methyl-Oligonukleotidsonde mit entweder einem RNA-Ziel oder einem DNA-Ziel (zwei unabhängige Versuche), wobei das Schmelzen als ein Anstieg der Lichtextinktion bei 260 nm (hyperchromatische Verschiebung) gezeigt ist.
4 zeigt die Hybridisierung einer einzigen Konzentration von mit Acridiniumester markierten Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden mit identischer Basensequenz an unterschiedliche Mengen eines vollständig komplementären RNA-Ziels während einer festgelegten Hybridisierungszeitspanne.
5 zeigt die Hybridisierung von unterschiedlichen Mengen an mit Acridiniumester markierten Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden mit identischer Basensequenz an festgelegte Mengen eines vollständig komplementären RNA-Ziels während einer festgelegten Hybridisierungszeitspanne.
6 zeigt die Hybridisierung einer festgelegten Menge an mit Acridiniumester markierten Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden mit identischer Basensequenz an eine festgelegte Menge eines vollständig komplementären RNA-Ziels für verschiedene Hybridisierungszeitspannen.
7 zeigt die Hybridisierung einer DNA- oder 2'-O-Methyl-Oligonukleotidsonde an ein vollständig komplementäres RNA-Ziel. Die Daten sind gemäß der Gleichung 1n(1 – H) = (k)(C_ot) aufgezeichnet, wobei H die prozentuale Hybridisierung, k die Hybridisierungsratenkonstante, C_o die Sondenkonzentration und t die Zeit ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Sofern nicht deutlich anders angegeben, werden die folgenden Ausdrücke die angegebenen Bedeutungen überall in dieser Patentschrift haben.
Mit „Nukleinsäureanalyt" oder „Analyt" ist eine Nukleinsäure, die in einer Probe nachgewiesen werden soll, oder eine Nukleinsäure, die als Folge einer Nukleinsäurenamplifikationsreaktion synthetisiert wurde und die mindestens etwa 20 Nukleotiden der Nukleotidbasensequenz einer Nukleinsäure, die in einer Probe nachgewiesen werden soll, oder das Komplement davon enthält, gemeint.
Mit „Synthetisieren" einer Nukleinsäure oder eines Oligonukleotids ist das Herstellen der Nukleinsäure durch chemische Synthese oder enzymatische Mittel gemeint. Es ist bekannt, dass bestimmte Nukleinsäurepolymeraseenzyme modifizierte Nukleotide während einer enzymatischen Synthese integrieren können.
Mit „modifiziert", einem „modifizierten Nukleotid" oder „Modifikation" ist eine zweckmäßige Variante der klassischen Ribo- und Desoxyribonukleotide A, T, G, C und U gemeint. Bei Verwendung in dieser Patentschrift wird modifiziert für eine Variante der klassischen Nukleotide' stehen, wobei die Varianten zu einer höheren Bindungseffizienz führen, wenn ein Oligonukleotid, das die modifizierten Nukleotide enthält, an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert wird, als wenn dasselbe Oligonukleotid die klassischen Nukleotide enthält. In einigen Fällen kann auf ein Oligonukleotid mit einem modifizierten 3'-Ende verwiesen werden. Das bedeutet, dass das 3'-Ende des Oligonukleotids eine Substitution enthält, die die Verlängerung des 3'-Endes mit einer Nukleinsäurepolymerase inhibiert oder verhindert.
Mit „konjugiertes Molekül" ist ein Molekül gemeint, das sich mit einem Oligonukleotid auf eine solche Art und Weise koppeln kann, dass mindestens einige der Charakteristika sowohl des Moleküls als auch des Oligonukleotids im kombinierten Produkt bewahrt werden. Meistens verleiht das konjugierte Molekül dem Oligonukleotid eine neue physikalische oder chemische Eigenschaft, während das Oligonukleotid seine Fähigkeit zum Bilden von Basenpaaren beibehält.
Mit „Bindungsaffinität" ist ein Maß der Stärke der Wasserstoffbrückenbindung zwischen mindestens zum Teil komplementären Nukleinsäuren unter definierten Nukleinsäurehybridisierungsbedingungen gemeint. Eine zweckmäßige Maßeinheit der Bindungseffizienz ist die T_m, bei der es sich um die Temperatur handelt, bei der sich 50 % einer Population der zwei Stränge in der doppelsträngigen oder hybridisierten Form befinden.
Mit „Marker" ist ein Reporterteil gemeint, der nachgewiesen werden kann, als eine Anzeige des Vorliegens des Oligonukleotids, mit dem es verbunden ist. Wenn das markierte Oligonukleotid an ein oder mehrere Oligonukleotide hybridisiert ist, kann das Vorliegen des Markers auch eine Anzeige des Vorliegens des anderen Oligonukleotids bzw. der anderen Oligonukleotide sein. Geeignete Reporterteile sind in der Technik wohl bekannt und beinhalten beispielsweise Radioisotope, Farbstoffe, chemilumineszierende, fluoreszierende, chemilumineszierende und elektrochemilumineszierende Verbindungen, Nukleinsäuresequenzen, Enzyme, Enzymsubstrate, Chromophore und Haptene.
Mit „Nukleinsäureassaybedingungen" sind Umweltbedingungen, einschließlich Temperatur und Salzkonzentration, für die gegenüber der Bildung von stabilen Hybriden zwischen nicht komplementären Basensequenzregionen bevorzugte Bildung von stabilen Hybriden zwischen komplementären Basensequenzregionen gemeint.
Mit „Acridiniumesterderivat" oder „AE" ist eine beliebige einer Familie von chemilumineszierenden Verbindungen gemeint, die vom Acridiniumring abgeleitet sind und einen markierten Ester oder eine markierte esterartige Verknüpfung an der C9-Position, die den Acridiniumring mit einer Abgangsgruppe verbindet, aufweist. Die Abgangsgruppe ist vorzugsweise eine Aryl- oder substituierte Arylgruppe. Substitutionen, wie Alkyl (z. B. Methyl), Alkoxy (z. B. Methoxy), Aryl und Halogenid (z. B. Br und F), können an entweder dem Acridiniumring oder der Abgangsgruppe oder beiden vorgenommen werden. Beispiele solcher Acridiniumester sind in 1 bereitgestellt.
Hierin ist die unerwartete Entdeckung der Erfinder beschrieben, dass Oligonukleotide, die ein oder mehrere Nukleotide enthalten und derart modifiziert sind, dass die Oligonukleotide für ein gegebenes Ziel eine erhöhte T_m haben (im Vergleich zu anderweitig identischen unmodifizierten Oligonukleotiden), an ein gegebenes Ziel verglichen mit unmodifizierten Oligonukleotiden mit einer erhöhten Rate hybridisieren werden. Ein maximaler Anstieg der Hybri disierungsrate eines modifizierten Oligonukleotids tritt ein, wenn ein „Cluster" von Nukleotiden modifiziert ist. Mit „Cluster" ist gemeint, dass mindestens etwa 4 von 5 aneinandergrenzenden Nukleotiden so modifiziert sind. Somit können Oligonukleotide, die eine Mischung von modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden enthalten, zum Erhöhen der Zielhybridisierungsrate genauso wirksam sein wie Oligonukleotide, die zu 100 % modifizierte Nukleotide enthalten. Gesichtspunkte der Erfindung zeichnen sich durch „chimäre" Oligonukleotide aus, die sowohl modifizierte als auch unmodifizierte Oligonukleotide enthalten.
Bei Verwendung in diesem Zusammenhang ist eine „Ziel"-Nukleinsäure eine Nukleinsäure, die mit einem Oligonukleotid hybridisiert werden soll. Eine solche Nukleinsäure kann eine natürlich vorkommende Nukleinsäure sein, z. B. ribosomale RNA, sie kann das Produkt (d. h. ein „Amplicon") von Nukleinsäurenamplifikationsverfahren wie PCR oder einem auf Transkription basierten Amplifikationsverfahren sein, wie im Folgenden vollständiger beschrieben, oder sie kann ein anderes synthetisches Oligonukleotid sein.
Hierin sind diagnostische Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, die modifizierte Oligonukleotide einbeziehen, die gegenüber einem unmodifizierten Oligonukleotid mit derselben Basensequenz einen Anstieg der Rate der Oligo/Ziel-Hybridisierung zeigen.
Modifikationen der 2'-Position des Desoxyribofuranosylrings (oder Ribofuranosylrings) umfassen die Platzierung einer Gruppe, bei der es sich nicht um Wasserstoff oder Hydroxyl handelt, an der 2'-Position des Ribofuranosylrings. Ungeachtet der Beschaffenheit der Substitution muss sie die Fähigkeit eines Oligonukleotids, das eine oder mehrere solche Nukleotidmodifikationen enthält, an ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer komplementären Nukleotidbasensequenz zu hybridisieren, nicht sterisch hindern. Die Hybridisierung von komplementären, doppelsträngigen Nukleinsäuren, in denen ein Strang solche Modifikationen enthält, ist im Vergleich zu Situationen, in denen kein Strang so modifiziert ist, deutlich gesteigert.
Wenn ein modifiziertes Oligonukleotid als eine „erhöhte" oder „höhere" Affinität oder Rate aufweisend bezeichnet wird, ist gemeint, dass die Hybridisierungsrate oder die Affinität des modifizierten Oligonukleotids höher als die Hybridisierungsrate oder Bindungsaffinität eines unmodifizierten Oligonukleotids mit derselben Länge und Basensequenz gegenüber demselben Ziel ist.
Oligonukleotide, die mit einer Methoxygruppe an der 2'-Zucker-Position substituiert sind, zeigen eine Präferenz für RNA-Ziele gegenüber DNA-Zielen mit einer Sequenz, die zum RNA-Ziel identisch ist (jedoch T durch U substituiert haben), im Hinblick auf sowohl die T_m als auch die Hybridisierungskinetik. Andere derartige Oligonukleotide sind in der Technik bekannt.
Konjugierte Moleküle, die an Oligonukleotide angeheftet sind, die wie hierin beschrieben modifiziert sind, können die Funktion ausüben, die Bindungsaffinität und die Hybridisierungsrate dieser Oligonukleotide gegenüber einem Ziel weiter zu erhöhen. Zu solchen konjugierten Molekülen können beispielsweise kationische Amine, interkalierende Farbstoffe, Antibiotika, Proteine, Peptidfragmente und Metallionenkomplexe zählen. Zu üblichen kationischen Aminen zählen beispielsweise Spermin und Spermidin, d. h. Polyamine. Zu interkalierenden Farbstoffen, die in der Technik bekannt sind, zählen beispielsweise Ethidiumbromid, Acridine und Proflavin. Zu Antibiotika, die an Nukleinsäuren binden können, zählen beispielsweise Actinomycin und Netropsin. Zu Proteinen, die an Nukleinsäuren binden können, zählen beispielsweise Restriktionsenzyme, Transkriptionsfaktoren und DNA und RNA modifizierende Enzyme. Peptidfragmente, die an Nukleinsäuren binden können, können beispielsweise ein SPKK-Motiv (SPKK = Serin-Prolin-Lysin(Arginin)-Lysin(Arginin)), ein KH-Motiv oder ein RGG-Box-Motiv (RGG = Arginin-Glycin-Glycin) enthalten. Siehe z. B. Suzuki, EMBOJ, 8:797-804 (1989); und Bund et al., Science, 265:615-621 (1994). Zu Metallionenkomplexen, die Nukleinsäuren binden, zählen beispielsweise Kobalthexamin und 1,10-Phenanthrolin-Kupfer. Oligonukleotide stellen noch eine andere Art von konjugiertem Molekül dar, wenn beispielsweise das resultierende Hybrid drei oder mehr Nukleinsäuren enthält. Ein Beispiel eines solchen Hybrids wäre ein Triplex, der aus einer Ziel-Nukleinsäure, einer Oligonukleotidsonde, die an das Ziel hybridisiert ist, und einem konjugierten Oligonukleotidmolekül, das an die Sonde hybridisiert ist, besteht. Konjugierte Moleküle können über eine Vielfalt an Mitteln an Oligonukleotide binden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Interkalierung, Groove-Interaktion, elektrostatische Bindung und Wasserstoffbrückenbindung. Fachmänner werden andere konjugierte Moleküle zu schätzen wissen, die an die modifizierten Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung angeheftet werden können. Siehe z. B. Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1(3):165-187 (1990). Darüber hinaus kann ein konjugiertes Molekül an ein Nukleotid oder Nukleotide entweder vor oder nach der Synthese des Oligonukleotids, das das Nukleotid bzw. die Nukleotide enthält, gebunden oder mit diesen verbunden werden.
Der Anmelder hat außerdem unerwarteterweise entdeckt, dass der beobachtete Anstieg der Hybridisierungsrate von modifizierten Oligonukleotiden gegenüber ihren Zielen nicht immer unbegrenzt mit einer zunehmenden Anzahl von aneinandergrenzenden modifizierten Nukleotiden zunimmt, insbesondere wenn das Ziel über eine offene oder entfaltete Struktur verfügt oder wenn Helfersonden vorliegen. Unter solchen Umständen wird die Platzierung von modifizierten Nukleotiden in einer im Wesentlichen aneinandergrenzenden Anordnung, d. h. etwa 4 von 5 aneinandergrenzenden Nukleotiden, im Oligonukleotid, gefolgt von der Hybridisierung an ein komplementäres Ziel, nur bis zu einer gegebenen Anzahl von Modifikationen in einer erhöhten Hybridisierungsrate resultieren. Die Addition von modifizierten Nukleotiden zu dem Cluster über diese Anzahl hinaus wird im Allgemeinen die Hybridisierungsrate nicht im Wesentlichen weiter erhöhen.
In modifizierten Oligonukleotiden, die 2'-O-Methyl-Substitutionen einsetzen, werden optimale Hybridisierungsraten in Oligonukleotiden mit einem Cluster von etwa 8 aneinandergrenzenden modifizierten Resten erhalten. In Anbetracht der Entdeckung, dass modifizierte Oligonukleotide die Hybridisierungsrate erhöhen können, war unerwartet, dass dieser Effekt nicht immer zur Erhöhung der T_m, die von solchen Additionen beigesteuert wird, parallel läuft. Das heißt, die Addition von modifizierten Oligonukleotiden über die Clustergröße mit optimaler Rate hinaus wird die T_m weiter erhöhen.
Obgleich sich der Anmelder nicht auf eine Theorie beschränken will, wird angenommen, dass solche Cluster als „Verkernungszentren" fungieren, bei denen es sich in einem die Rate beschränkenden Schritt um die ersten Regionen des Oligonukleotids oder der Nukleinsäure handelt, die eine Wasserstoffbrückenbindung bilden, gefolgt von schneller Wasserstoffbrückenbindung mit den übrigen Basen. Obwohl das gesamte Oligonukleotid oder die gesamte Nukleinsäure so modifiziert werden kann, scheint durch wesentliches Überschreiten der optimalen Clustergröße wenig Vorteil in Form von einer erhöhten Hybridisierungsrate gewonnen zu werden.
Wenn die Struktur des Ziels jedoch naturgemäß geschlossen oder gefaltet ist und keine Helfersonden eingebunden sind, kann die Hybridisierungsrate zwischen dem Oligonukleotid und dem Ziel im Allgemeinen mittels Hinzufügen von modifizierten Nukleotiden zu dem Oligonukleotid in Höhe von mehr als etwa 4 aneinandergrenzenden Nukleotiden gesteigert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden im Wesentlichen alle Nukleotide eines Oligonukleotids, das zu dem strukturell geschlossenen Ziel komplementär ist, modifiziert sein.
Die Rate der In-Lösung-Hybridisierung von zwei komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie der Konzentration der Nukleinsäuren, der Hybridisierungstemperatur und den Eigenschaften der Lösemittellösung, wie die Salzkonzentration. Verschiedene Methodologien sind eingesetzt worden, um Hybridisierungsraten zu erhöhen, von denen die Mehrheit entweder das Ändern des Lösemittelsystems, wie mittels Bildung von Emulsionen von unmischbaren Lösemitteln; das Einsetzen von Nukleinsäurefällungsmitteln (z. B. Kohne et al., US-Patentschrift Nr. 5,132,207) oder Volumenausschlussmitteln, wie Polyethylenglykol; oder das Erhöhen der Konzentration eines Nukleinsäurestrangs einbeziehen.
Ein mit der letzteren Vorgehensweise in einem diagnostischen Assay verbundenes Problem besteht darin, dass die Ziel-Nukleinsäure für gewöhnlich in recht geringen Mengen vorliegt. Folglich macht die Erhöhung der Nukleinsäurekonzentration die Verwendung eines Überschusses des Oligonukleotids erforderlich, was in höheren Kosten und erhöhter Reagensvergeudung resultiert und, wenn das Oligonukleotid markiert ist, das Risiko inakzeptabel hoher Hintergründe mit sich bringt. Die anderen Verfahren, wie diejenigen, die die Verwendung mehrerer Lösemittel und Agentien, wie Polyethylenglykol, bedingen, können praktische Schwierigkeiten darbieten, wie unmäßige Probenhandhabung und Zeit.
Hierin sind Mittel zum Erhöhen der Hybridisierungsraten als auch der Bindungsaffinität von Oligonukleotiden für RNA-Ziele unter Verwendung von Oligonukleotiden beschrieben, die Nukleotide mit einer Substitution an der 2'-Position des Ribofuranosylrings („2'-modifiziertes Oligonukleotid") enthalten; einschließlich einer Alkoxy-Substitution, auch einschließlich einer Methoxy-Substitution. Diese Eigenschaften machen Verfahren nützlich, die solche Oligonukleotide in einem diagnostischen Hybridisierungsassayformat einsetzen, indem sie die Rate und das Ausmaß der Hybridisierung eines solchen Oligonukleotids erhöhen, ohne eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentrationen der hybridisierenden Nukleinsäuren, eine Änderung der Eigenschaften oder der Zusammensetzung der Hybridisierungslösung, die Addition von „Helferoligonukleotiden", wie in Hogan & Milliman, US-Patentschrift Nr. 5,030,557 offenbart; oder eine Erhöhung der Hybridisierungstemperatur bedingen.
Nichtsdestoweniger kann die Verwendung der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere dieser anderen Techniken in einer beliebigen Vorgehensweise ergänzen, bei der eine Erhöhung der Rate der Nukleinsäurehybridisierung von Vorteil wäre.
Wie oben erwähnt, betrifft ein hierin beschriebener Vorteil die Fähigkeit von 2'-O-Methyl-modifizierten Oligonukleotiden, sich vorzugsweise an RNA anstatt von DNA zu hybridisieren. Diese Eigenschaft ermöglicht das Design von Oligonukleotidsonden, die RNA targetieren. Es können Sonden hergestellt werden, die nicht dazu neigen, unter strengen Hybridisierungsbedingungen an DNA zu binden, selbst wenn die DNA-Sequenz mit der RNA-Ziel-Sequenz identisch ist (mit der Ausnahme, dass T in der DNA-Sequenz durch U substituiert ist). Solche Eigenschaften können in einer Reihe von verschiedenen Formaten angewendet werden, in denen der spezifische Nachweis von RNA von Vorteil wäre. Zum Beispiel zum Anzeigen und Messen von Veränderungen der Rate der Transkription von bestimmten RNA-Spezies, wie beispielsweise spezifischen mRNA-Spezies, zum Überwachen der Wirksamkeit einer gegebenen Therapie, zum spezifischen bevorzugten Sondieren von tRNA oder RNA gegenüber den Genen, die für diese RNA-Spezies kodieren, und zum spezifischen Nachweisen von RNA-Viren in Nukleinsäurepräparaten, die große Mengen an chromosomaler DNA enthalten, sogar DNA-Präparaten, die DNA-Versionen der viralen Sequenzen enthalten.
Ein weiterer Vorteil dieses und anderer Gesichtspunkte ist eine im Vergleich zu der T_m von Ziel/Oligo-Hybriden, in denen das Oligonukleotid ein Desoxyoligonukleotid ist, erhöhte Ziel/Oligo-T_m, wenn modifizierte Oligonukleotide, wie 2'-modifizierte Nukleotide, verwendet werden. Mit „Ziel/Oligo" ist ein mit Wasserstoffbrücken gebundener, doppelsträngiger Nukleinsäurenkomplex gemeint, der ein einzelsträngiges Oligonukleotid umfasst. Die Stabilität des Ziel/Sonden-Komplexes nimmt mit einer Erhöhung der Anzahl von 2'-modifizierten Nukleotidresten, die in der Sonde enthalten sind, zu. Im Gegensatz dazu scheint die Erhöhung der Hybridisierungsrate in Nukleinsäuren mit einem Cluster von etwa 8 2'-modifizierten Nukleotidresten optimal zu sein und beim Hinzufügen von aufeinander folgenden modifizierten Oligonukleotidresten über diese Anzahl hinaus nicht wesentlich zuzunehmen. Des Weiteren könnten „chimäre" Oligonukleotide mit mindestens einem solchen Cluster von modifizierten Nukleotiden so entworfen werden, dass sie höhere Hybridisierungsraten haben, ohne notwendigerweise die T_m des Oligonukleotids insgesamt gegenüber dessen Ziel wesentlich zu erhöhen.
Eine erhöhte T_m kann in einem beliebigen diagnostischen Vorgang ausgenutzt werden, in dem die zusätzliche Stabilität eines Nukleinsäureduplex gewünscht ist. Zum Beispiel können höhere Hybridisierungstemperaturen verwendet werden, um die Hybridisierungsrate zu beschleunigen. Eine höhere T_m ermöglicht außerdem die Verwendung von wesentlich kürzeren Oligonukleotiden, als bisher praktisch waren, was in einer Einsparung der Kosten, die mit dem Produzieren von Oligonukleotiden zur Hybridisierung zusammenhängt, sowie anderen Vorteilen resultiert, wie oben erwähnt.
Chimäre Oligonukleotide können einen modifizierten Teil enthalten, der dazu entworfen ist, an Ziel-Nukleinsäure zu binden, und können außerdem einen Desoxynukleotid-Teil enthalten, der entweder direkt oder indirekt an ein an die feste Phase gebundenes Oligonukleotid binden kann. Zur Beispielführung und nicht zur Einschränkung kann ein solches Oligonukleotid ein Ziel-Capture-Oligonukleotid sein, das dazu entworfen ist, eine Ziel-Nukleinsäure zu binden (z. B. in Lösung) und die gebundene Ziel-Nukleinsäure mit einer derivatisierten Festphasenmatrix, wie einem Kügelchen, einer Mikrosphäre, einer polymeren Substanz, wie Agarose oder Dextran, oder mit einem magnetisierten Teilchen zu verknüpfen. Derivate, die mit einer solchen Matrix verknüpft sind, können Antikörper, Liganden oder gänzlich oder zum Teil einzelsträngige Oligonukleotide mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, wie einem homopolymeren Strang, beinhalten, die dazu entworfen sind, das Capture-Oligonukleotid oder ein intermediäres Oligonukleotid zu binden. Das gebundene Ziel kann dann mit einer Sonde (entweder RNA, DNA oder modifiziert) weiter hybridisiert und die ungebundene Sonde vor Nachweis des Vorliegens der Ziel-Nukleinsäure vom immobilisierten Ziel/Sonden-Komplex gewaschen werden.
Es kann in bestimmten Fällen vorteilhaft sein, die Temperatur zum Hybridisieren eines modifizierten Oligonukleotids an sein Ziel anzuheben. Wie oben beschrieben, hebt das Erhöhen der Hybridisierungstemperatur auch die Hybridisierungsrate an, solange die Hybridisierungstemperatur ausreichend unter der T_m des gewünschten Hybrids liegt. Die hierin beanspruchten Hybridisierungsverfahren, die modifizierte Oligonukleotide mit einer höheren T_m als ihre unmodifizierten Entsprechungen einsetzen, können bei höheren Temperaturen durchgeführt werden, als anderweitig angewendet werden würden. In einem solchen Fall wird der Anstieg der Rate, der mit der Modifikation allein zusammenhängt, durch die angehobene Temperatur weiter erhöht.
Es folgen Beispiele, die Ausführungsformen der Erfindung umfassen, die nicht als den Schutzumfang der Erfindung darüber hinaus einschränkend verstanden werden sollten. Fachmänner werden leicht weitere Ausführungsformen, die auf der Offenbarung basieren, die in dieser Patentschrift enthalten ist, begreifen.
Modifizierte Sonden für Nukleinsäurehybridisierungsassays
Nukleinsäurehybridisierungsassays setzen eine oder mehrere Nukleinsäuresonden ein, die eine Nukleinsäure; die nachgewiesen werden soll, targetieren, d. h. eine Nukleotidbasensequenz aufweisen, die zu dieser Nukleinsäure im Wesentlichen komplementär ist. Oftmals wird die Sonde ein Oligonukleotid (eine einzelsträngige Nukleinsäure, die zwischen etwa 10 und etwa 100 Nukleotide lang ist) umfassen, das synthetisch so hergestellt wird, dass es eine gegebene Nukleotidsequenz aufweist. Mit „im Wesentlichen komplementär" ist gemeint, dass das Oligo unter geeignet selektiven Bedingungen an sein Ziel binden wird, um einen mit Wasserstoffbrücken gebundenen Duplex zu bilden.
Obgleich eine Hybridisierungsassay-Sonde im Allgemeinen mit einem nachweisbaren Marker verbunden wird, kann die Sonde unmarkiert sein und Sonden/Ziel-Hybride mittels beispielsweise UV-Extinktion, HPLC-Chromatographie, Gelelektrophorese und anschließender Färbung des Nukleinsäurehybrids oder mittels anderer in der Technik wohl bekannter Verfahren nachgewiesen werden. In Hybridisierungsassays werden die Sonde und das Ziel miteinander unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine stabile und spezifische Hybridisierung ermöglichen. Das resultierende Hybrid wird dann vom unmarkierten Hybrid getrennt und der Marker nachgewiesen, oder der Marker kann unter Bedingungen nachgewiesen werden, die den Nachweis des Hybrids mit Präferenz gegenüber der unmarkierten Sonde ermöglichen.
Verfahren zum Trennen von Nukleinsäuren, wie Gelausschlusschromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Hydroxyapatitabsorption, sind in der Technik bekannt. Der Anmelder bevorzugt ein Assayformat, in dem markiertes Hybrid und markierte unhybridisierte Sonde aufgrund der Bildung einer Doppelhelix chemisch unterschieden werden können. Ein besonders bevorzugtes Assayformat ist der Hybridisierungsschutzassay (hybridization protection assay, HPA), siehe US-Patentschrift 5,283,174 an Arnold et al., in dem markierte unhybridisierte Sonde selektiv unnachweisbar gemacht werden kann, während hybridisierte Sonde verhältnismäßig unbeeinträchtigt bleibt. Folglich ist der Markernachweis in diesem Format eine Anzeige des markierten Hybrids.
Hierin ist die Verwendung von modifizierten Oligonukleotiden als Sonden in einem Hybridisierungsassay beschrieben. Modifizierte Oligonukleotide mit einer höheren zielspezifischen T_m als unmodifizierte Oligonukleotide mit derselben Basensequenz können zum Erhöhen der Hybridisierungsrate des Assays im Vergleich zu Assays, die unmodifizierte Oligonukleotide mit derselben Basensequenz einsetzen, verwendet werden. Solche Assayverfahren können höhere Hybridisierungstemperaturen einsetzen, als bei Verwendung von unmodifizierten Oligonukleotiden praktikabel sind. Die höhere Hybridisierungstemperatur erhöht weiterhin die Hybridisierungsrate und kann außerdem das Ausmaß an Kreuzhybridisierung (Hybridisierung der Sonde mit Nicht-Ziel-Sequenzen) reduzieren, wodurch die Spezifität des Assays gesteigert wird.
Die Sonden dieser Erfindung können ein Cluster von etwa 4 oder mehr im Wesentlichen aneinandergrenzenden, modifizierten Nukleotidresten, die mit unmodifizierten Resten gemischt sind, umfassen. Alternativ kann die Sonde zu 100 modifizierte Reste umfassen.
Eine Oligonukleotidsonde, die modifiziert wurde, um 2'-O-Methyl-Substitutionen zu enthalten, resultiert darin, dass die Oligonukleotidsonde eine erhöhte Affinität und eine erhöhte Rate der Hybridisierung an RNA-Ziele aufweist, jedoch mit geringer Auswirkung auf die DNA-Affinität oder Rate der Bildung von Sonden/DNA-Hybriden. Wiederum wurde festgestellt, dass diese Präferenz für RNA optimiert ist, wenn das Oligonukleotid mindestens einen Cluster von etwa 4 bis etwa 8 modifizierten Basen aufweist.
Da wie hierin beschriebene modifizierte Oligonukleotide eine drastisch erhöhte Hybridisierungsrate aufweisen, können solche modifizierten Oligonukleotidsonden in vielen Fällen ohne das Erfordernis der Addition von unmarkierten „Helfersonden", die in Hogan, oben, offenbart sind, als ein Mittel zum Erhöhen der Raten der Hybridisierung der Sonde an das Ziel verwendet werden. Nichtsdestotrotz hat der Anmelder festgestellt, dass in manchen Fällen bei der kombinierten Verwendung von solchen modifizierten Oligonukleotiden und Helfersonden diese dazu zusammenarbeiten können, die Hybridisierungsrate noch weiter zu erhöhen. In jedem Fall führt die Verwendung von solchen modifizierten Oligonukleotiden in diagnostischen Verfahren zu einer schnelleren Identifizierung von biologischen Analyten, was wiederum beispielsweise zu wirksameren Behandlungen von Erkrankungszuständen führt, die von solchen Analyten verursacht oder angezeigt werden.
Wie im Folgenden ausführlicher beschrieben ist, hat der Anmelder festgestellt, dass Sonden, die eine Affinität mit Präferenz für RNA-Ziele aufzeigen, zum spezifischen Nachweisen von RNA gegenüber DNA mit derselben Sequenz (mit der Ausnahme, dass U in der RNA-Sequenz mit T substituiert ist) verwendet werden können. Derartige Verfahren finden beispielsweise Anwendung beim spezifischen Nachweis von RNA-Viren in Zellen, die DNA-Versionen des viralen Genoms enthalten, oder beim spezifischen Nachweis von Niveaus der RNA-Transkription in Zellen.
Es können auch Sonden erdacht werden, die sowohl zum Ziel komplementäre Sequenzen als auch weitere, zum Ziel nicht komplementäre Sequenzen enthalten. Diese zum Ziel nicht komplementären Sequenzen können andere Funktionen haben. Zum Beispiel können die Sequenzen zu einem anderen Oligonukleotid oder einer anderen Ziel-Nukleinsäure komplementär sein oder sie haben funktionelle Eigenschaften, wie Promotorsequenzen und Restriktionsorte. Folglich kann eine Sonde mehr als eine Funktion haben, von denen nur eine als eine Anzeige des Vorliegens eines Ziels nachgewiesen werden soll.
Darüber hinaus können Sonden so entworfen werden, dass sie mindestens einen Nukleinsäurestrang aufweisen, der über mindestens zwei separate zum Ziel komplementäre Sequenzen verfügt, die an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisieren können. Ein Beispiel solcher Sonden wird von Hogan et al., US-Patentschriften Nr. 5,424,413 und 5,451,503, beschrieben. Die von Hogan et al. beschriebenen Sonden enthalten weiterhin mindestens zwei verschiedene Armregionen, die nicht mit dem Ziel hybridisieren, jedoch über komplementäre Regionen verfügen, die aneinander hybridisieren können. Diese Armregionen können so entworfen werden, dass sie das Vorliegen des Ziels erfordern, damit ihre komplementären Sequenzen unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Dementsprechend müssen zum Ziel komplementäre Sequenzen der Sonde an das Ziel hybridisieren, bevor komplementäre Armregionen aneinander hybridisieren können. Die resultierende Struktur wird als eine verzweigte Nukleinsäure bezeichnet.
Andere Sonden können so entworfen werden, dass sie nicht spezifisch an das Ziel binden können. Um beim Nachweisen des Ziels von Nutzen zu sein, müssen diese Sonden mit einer anderen Nukleinsäure, die sich mit dem Ziel binden kann, entweder direkt oder indirekt, hybridisieren können. In einer solchen Anordnung kann eine Nukleinsäure derart strukturiert sein, dass sie mindestens eine erste Nukleotidbasensequenzregion und eine zweite Nukleotidbasensequenzregion, die sich nicht überlappen, enthalten, wobei die erste Nukleotidregion zu einer Nukleotidbasensequenz des Ziels komplementär ist und die zweite Nukleotidregion zu einer Nukleotidbasensequenz der Sonde komplementär ist. In dieser Anordnung stünde die zweite Nukleotidregion der Nukleinsäure zur Bindung mit der Sonder nicht zur Verfügung, bis das Ziel mit der ersten Nukleotidregion der Nukleinsäure hybridisiert hat. Die Bindung der Nukleinsäure und des Ziels würde die Konfiguration der Nukleinsäure verändern, was folglich ermöglicht, dass die zweite Nukleotidregion der Nukleinsäure mit der Sonde bindet. Siehe 2. Natürlich könnte diese Anordnung derart modifiziert werden, dass eine indirekte Bindung zwischen der Nukleinsäure und dem Ziel, die mit einer oder mehreren dazwischen liegenden oder koppelnden Nukleinsäuren erreicht wird, die zweite Nukleotidregion der Nukleinsäure zur Bindung mit der Sonde zur Verfügung stellt.
Modifizierte Oligonukleotide zur Nukleinsäurenamplifikation
Hierin sind Verfahren zum Einsetzen von modifizierten Oligonukleotidprimern, Promotor-Primern und/oder Spleißmatrizen zur Nukleinsäurenamplifikation und Zusammensetzungen, die solche Oligonukleotide umfassen, beschrieben, wobei die Oligonukleotide mindestens einen Cluster von modifizierten Basen enthalten, der eine erhöhte Hybridisierungsrate bewirkt.
Zu Primer einsetzenden Amplifikationsverfahren zählen das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (polymerase chain reaction, PCR) und dessen Variationen, wie von Mullis et al. beschrieben (siehe die US-Patentschriften Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159, die europäischen Patentanmeldungen Nr. 86302298.4, 86302299.2 und 87300203.4 und 155 Methods in Enzymology, 335-350 (1987)). Die PCR-Methodik zählt heutzutage für Fachmänner zum Allgemeinwissen.
PCR wurde mit RNA-Transkription gekoppelt, indem eine Promotorsequenz in einen der in der PCR-Reaktion verwendeten Primer integriert und die doppelsträngige DNA dann nach Amplifikation mittels des PCR-Verfahrens als eine Matrize für die Transkription einzelsträngiger RNA verwendet wurde. (Siehe z. B. Murakawa et al., DNA, 7:287-295 (1988)).
Andere Amplifikationsverfahren wenden mehrere Zyklen von RNA-gerichteter DNA-Synthese und Transkription zum Amplifi zieren von DNA- oder RNA-Zielen an. Siehe z. B. Burg et al., US-Patentschrift Nr. 5,437,990; 89/1050; Gingeras et al., WO 88/10315; Davey und Malek, EPO-Veröffentlichung Nr. 0 329 822; Malek et al., WO 91/02818, Kacian und Fultz, US-Patentschrift Nr. 5,480,783; McDonough et al., WO 94/03472; und Kacian et al., WO 93/22461. Urda et al., WO 91/10746, beschreiben ein Verfahren, das eine Signalamplifikation unter Verwendung einer T7-Promotorsequenz erzielt.
Jedes dieser Verfahren macht von einem oder mehreren Oligonukleotidprimern oder Spleißmatrizen Gebrauch, die an eine gegebene betreffende Nukleotidsequenz oder in der Nähe dieser hybridisieren können. Nach der Hybridisierung des Primers wird der zum Ziel komplementäre Nukleinsäurestrang enzymatisch synthetisiert, entweder durch Verlängerung des 3'-Endes des Primers oder durch Transkription, wobei ein Promotor-Primer oder eine Spleißmatrize verwendet wird. In manchen Amplifikationsverfahren, wie PCR, werden Durchgänge von Primer-Verlängerung mittels eines Nukleinsäure polymerisierenden Enzyms mit Hitzedenaturierung komplementärer Nukleinsäurestränge abgewechselt. Andere Verfahren, wie die von Kacian & Fultz, oben, McDonough et al., oben, und Kacian et al., oben, sind auf isothermer Transkription basierende Amplifikationsverfahren.
In jedem Amplifikationsverfahren können jedoch Nebenreaktionen, die von der Hybridisierung des Primers an Nicht-Ziel-Sequenzen verursacht werden, die Sensitivität der zielspezifischen Reaktion verringern. Diese konkurrierenden „Fehlanpassungen" können durch Anheben der Temperatur der Reaktion reduziert werden. Das Anheben der Temperatur kann jedoch außerdem ebenfalls das Ausmaß an zielspezifischer Primerbindung senken.
Somit können, wie hierin beschrieben, Primer, die eine hohe Affinität für das Ziel aufweisen und in der Zielbinderegion modifizierte Nukleotide umfassen, in Nukleinsäurenamplifikationsverfahren verwendet werden, um kleine Mengen einer Ziel-Nukleinsäuresequenz aufgrund der erhöhten Temperatur und folglich der erhöhten Hybridisierungsrate mit mehr Sensitivität nachzuweisen und zu amplifizieren, um Moleküle zu targetieren, und gleichzeitig das Ausmaß an konkurrierenden Nebenreaktionen (Kreuzreaktivität) aufgrund von unspezifischer Primerbindung zu reduzieren. Manche Oligonukleotide können mindestens einen Cluster von modifizierten Basen enthalten, aber weniger als alle Nukleotide sind in bevorzugten Oligonukleotiden modifiziert.
Ebenfalls beschrieben sind modifizierte Oligonukleotidprimer, die in einer Nukleinsäurenamplifikationsreaktion verwendet werden, in der eine Ziel-Nukleinsäure RNA ist. Siehe z. B. Kacian und Fultz, oben. Das Ziel kann die anfangs in der Probe vorliegende Nukleinsäure sein oder kann ein Zwischenprodukt der Nukleinsäurenamplifikationsreaktion sein. Die Verwendung von 2'-modifizierten Primern, wie Oligonukleotiden, die 2'-O-Methyl-Nukleotide enthalten, ermöglicht aufgrund der verhältnismäßig höheren T_m, die dem Hybrid verliehen wird, ihre Verwendung bei einer höheren Hybridisierungstemperatur im Vergleich zum Desoxyoligonukleotid mit derselben Sequenz. Zudem kann der Wettbewerb um Primermoleküle durch Nicht-Ziel-DNA-Sequenzen in einer Versuchsprobe aufgrund der Präferenz solcher 2'-modifizierten Oligonukleotide für RNA gegenüber DNA ebenfalls verringert werden. Des Weiteren ermöglicht die Verwendung von modifizierten Oligonukleotidprimern mit Kinetik- und Gleichgewichtspräferenzen in Anwendungen, in denen spezifi sche RNA-Sequenzen in einer Population von DNA-Molekülen mit derselben (unter der Annahme, dass U und T gleichwertig sind) Nukleinsäuresequenz nachgewiesen werden sollen, die spezifische Amplifikation von RNA gegenüber DNA in einer Probe.
Probenverarbeitung
Wie hierin beschrieben, können modifizierte Oligonukleotide mit erhöhter zielspezifischer Hybridisierungskinetik und erhöhten Bindungsaffinitäten im Vergleich zu ihren unmodifizierten Analoga in einer Vielfalt an Hybridisierungsassayprobenverarbeitungsmethoden verwendet werden.
Mit Probenverarbeitung sind Verfahren gemeint, die die Unterscheidung von Analyt- und Nicht-Analyt-Nukleinsäuren ermöglichen oder verstärken. Solche Verfahren können beispielsweise die direkte oder indirekte Immobilisierung von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden aus der flüssigen Phase in einem heterogenen Assay umfassen. Manche solche Verfahren können zwei oder mehr Hybridisierungsereignisse umfassen, die in einer solchen Immobilisierung resultieren.
Zum Beispiel erörtern Ranki et al., US-Patentschriften Nr. 4,486,539 und 4,563,419, ein Nukleinsäure-„Sandwich"-Hybridisierungsverfahren in einem Schritt, das die Verwendung einer an die feste Phase gebundenen Nukleinsäure mit einer zum Ziel komplementären Sequenz und einer markierten Nukleinsäuresonde, die zu einem separaten Abschnitt der Ziel-Nukleinsäure komplementär ist, umfasst. Stabinsky, US-Patentschrift Nr. 4,751,177, erörtert Verfahren, die die Verwendung eines „Mediator"-Polynukleotids umfasst, das angeblich Sensitivitätsprobleme im Verfahren von Ranki, die mit der Leckage des immobilisierten Oligonukleotids vom festen Träger zusammenhängen, überwindet.
Andere Verfahren können ein immobilisiertes Oligonukleotid, beispielsweise ein Oligonukleotid, das einen homopolymeren Strang, wie Poly-T, oder eine einfache kurze Wiederholungssequenz enthält, und zwei oder mehr koppelnde Oligonukleotide, von denen eines mit dem immobilisierten Oligonukleotid hybridisieren kann und von denen ein anderes spezifisch mit dem Ziel hybridisieren kann, einsetzen. Jedes der koppelnden Oligonukleotide kann an mindestens ein anderes koppelndes Oligonukleotid binden. Wenn ein koppelndes Oligonukleotid keine Sequenz enthält, die zu dem Ziel oder dem immobilisierten Oligonukleotid komplementär ist, wird es mit mindestens zwei anderen koppelnden Oligonukleotiden gleichzeitig hybridisieren können. Der feste Träger kann sich aus Materialien zusammensetzen, zu denen Nitrocellulose, eine polymere Substanz, wie Polyacrylamid oder Dextran, metallische Substanzen oder Glas mit kontrollierter Porösität (Controlled Pore Glass) zählen. Der Träger kann in Formen wie einer Schicht, einer Membran oder einem Teilchen vorliegen. Darüber hinaus kann der feste Träger eine magnetische Ladung aufweisen, um das Zurückgewinnen von Probe und/oder Wegspülen von ungebundenen Nukleinsäuren oder anderen Probebestandteilen zu erleichtern.
Das Verbinden des immobilisierten Oligonukleotids mit dem festen Träger kann mittels eines beliebigen Verfahrens erreicht werden, das das immobilisierte Oligonukleotid über die gesamten Assayschritte weiterhin binden wird. Darüber hinaus ist wichtig, dass, wenn der feste Träger in einem Assay verwendet werden soll, er im Wesentlichen unter Assaybedingungen nicht zur unspezifischen Bindung oder Adsorption von Nicht-Ziel-Oligonukleotiden oder -Nukleinsäuren fähig ist.
Zu üblichen Immobilisierungsverfahren zählen das Binden der Nukleinsäure oder des Oligonukleotids an Nitrocellulose, derivatisierte Cellulose oder Nylon und ähnliche Materialien. Die letzteren zwei dieser Materialien bilden mit dem immobilisierten Oligonukleotid kovalente Wechselwirkungen, während das erstere das Oligo mittels hydrophober Wechselwirkungen bindet. Bei Verwendung dieser Materialien ist es wichtig, eine „blockierende" Lösung, wie jene, die ein Protein, wie Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA), enthalten, oder eine „Träger"-Nukleinsäure, wie Lachssperma-DNA, zu verwenden, um verfügbare Bindungsstellen auf dem festen Träger vor der Verwendung im Assay zu belegen.
Zu anderen Immobilisierungsverfahren können die Verwendung eines Linkerarms, beispielsweise N-Hydroxysuccinamid (NHS) und dessen Derivate, zählen, um das Oligonukleotid mit dem festen Träger zu verbinden. In solchen Verfahren übliche feste Träger sind, ohne Einschränkung, Siliciumdioxid, Polyacrylamidderivate und metallische Substanzen. In einem solchen Verfahren kann ein Ende des Linkers eine reaktionsfähige Gruppe (wie eine Amidgruppe) enthalten, die mit dem festen Träger eine kovalente Bindung bildet, während das andere Ende des Linkers eine andere reaktionsfähige Gruppe enthält, die mit dem zu immobilisierenden Oligonukleotid binden kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Oligonukleotid eine Bindung mit dem Linker an seinem 3'-Ende bilden. Der Linker ist vorzugsweise im Wesentlichen ein geradkettiger Kohlenwasserstoff, der das immobilisierte Oligonukleotid in einigem Abstand von der Oberfläche des festen Trägers positioniert. Es können jedoch nichtkovalente Verknüpfungen, wie Chelatbildung oder Antigen-Antikörper-Komplexe, verwendet werden, um das Oligonukleotid mit dem festen Träger zu verbinden.
Eine wünschenswerte Ausführungsform des letzteren Assaysystems schließt zwei koppelnde Oligonukleotide ein: (i) ein erstes koppelndes Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz enthält, die zum immobilisierten Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär ist, beispielsweise mit einer Poly-A-Nukleotidsequenz, die zu einer Poly-T-Sequenz am immobilisierten Oligo komplementär ist, und (ii) ein zweites koppelndes Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz enthält, die zu der Ziel-Nukleinsäure, einer nachweisbar markierten Sonde oder beiden im Wesentlichen komplementär ist. Das zweite koppelnde Oligonukleotid kann eine Nukleotidsequenz enthalten, die zu der Ziel-Nukleinsäure im Wesentlichen komplementär ist. Darüber hinaus enthält jedes koppelnde Oligonukleotid in der bevorzugten Ausführungsform eine weitere Nukleotidsequenz, die dem ersten und dem zweiten koppelnden Oligonukleotid ermöglicht, unter Assaybedingungen aneinander zu hybridisieren. Es können jedoch ein oder mehrere zusätzliche koppelnde Oligonukleotide in das System eingebracht werden, so dass das erste und das zweite koppelnde Oligonukleotid mittels dieser zusätzlichen, dazwischen liegenden koppelnden Oligonukleotide indirekt aneinander gebunden sind. Die zusätzlichen koppelnden Oligonukleotide wären im Wesentlichen nicht dazu fähig, unter Assaybedingungen mit einem beliebigen von der Ziel-Nukleinsäure, der nachweisbar markierten Oligonukleotidsonde oder dem immobilisierten Oligonukleotid zu hybridisieren.
Noch ein anderes Assaysystem mit praktischen Vorteilen in Bezug auf Leichtigkeit und Schnelligkeit der Verwendung kann ein immobilisiertes Oligonukleotid mit einem Abschnitt, der zu einem einfangenden (capturing) Oligonukleotid komplementär ist, umfassen. Das einfangende Oligonukleotid (Capture-Sonde) wird eine Basensequenz enthalten, die eine Hybridisierung an das Ziel ermöglicht. Das einfangende Oligonukleotid wird außerdem einen Marker aufweisen, der in oder in der Nähe der an das Ziel bindenden Nukleotidsequenzregion angeheftet ist, wie ein substituierter oder unsubstituierter Acridiniumester, der in einem homogenen oder halbhomogenen Assaysystem zum spezifischen Nachweisen von Hybrid-Nukleinsäuren ohne Nachweisen einzelsträngiger Nukleinsäuren, wie der Capture-Sonde selbst, verwendet werden kann. Ein solches vom Anmelder bevorzugtes System ist der HPA, der oben erörtert wurde. Im HPA-Format wird der Marker, der an einer beliebigen Capture-Sonde, die nicht an ihr Ziel hybridisiert wurde, enthalten ist, mit der Addition von Base hydrolysiert werden, während das Ziel/Capture-Sonden-Hybrid den damit assoziierten Marker vor der Hydrolyse schützen würde.
Ein Vorteil dieses letzteren Assaysystems besteht darin, das nur ein zielspezifisches Hybridisierungsereignis (markierte Capture-Sonde/Ziel) zum Nachweis des Ziels erfolgen muss, anstelle von zwei derartigen Ereignissen (Capture-Sonde/Ziel und markierte Sonde/Ziel) in den anderen hierin beschriebenen Probenverarbeitungsvorgängen. Weniger Oligonukleotide im Assay würde zum Trend beitragen, den Assay schneller und einfacher zu optimieren machen, da die Gesamtrate, mit der markiertes Ziel eingefangen wird, von der am langsamsten hybridisierenden Sonde begrenzt wird. Darüber hinaus muss, obgleich der Abschnitt des Ziels, der zum einfangenden Oligonukleotid komplementär ist, in diesen anderen Assaysystemen nicht so spezifisch wie die Sondenbindungsregion des Ziels sein muss, diese Basensequenz selten genug sein, um eine beträchtliche Sättigung der Capture-Sonde mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren zu vermeiden. Folglich kann diese Präferenz für zwei separate und spezifische Zielsequenzen dem Finden eines geeigneten Ziels, auf die solche Assays gerichtet sind, Einschränkungen auferlegen. Im Gegensatz dazu muss im letzteren Assay nur eine solche Zielsequenz gefunden werden, da dieselbe Nukleotidsequenz gleichzeitig zum Immobilisieren und Nachweisen der Ziel-Nukleinsäure funktioniert.
Ungeachtet der angewendeten Vorgehensweise ist ein notwendiges Element eines beliebigen Assays ein Verfahren zum Nachweis des gewünschten Ziels. Eine Reihe Möglichkeiten, die Fachmännern bekannt sind, ist möglich. Eine solche Möglichkeit ist die direkte Verwendung einer markierten Nukleinsäuresonde. Eine solche Sonde würde eine Nukleotidsequenzregion aufweisen, die spezifisch mit der betreffenden Ziel-Nukleinsäure hybridisierbar und zu dieser im Wesentlichen komplementär ist. Bei Hybridisierung des Ziels und Immobilisierung des Ziel/Sonden-Hybrids kann ungebundene Sonde weggespült oder deaktiviert und der verbleibende, mit dem Hybrid assoziierte Marker nachgewiesen und/oder gemessen werden.
Eine andere Möglichkeit kombiniert die Elemente des Nachweises und der Nukleinsäurenamplifikation. In einem solchen System wird die Ziel-Nukleinsäure immobilisiert, wie, zum Beispiel und ohne Einschränkung, in den oben beschriebenen Assaymethoden beschrieben. Ein oder mehrere Amplifikationsoligonukleotide (siehe z. B. Kacian et al., WO93/22461), wie ein Primer, ein Promotor-Primer oder eine Spleißmatrize, die mit einer spezifischen Region der Ziel-Nukleinsäure hybridisieren können, können unter Nukleinsäurenamplifikationsbedingungen, z. B. bei Vorliegen einer oder mehrerer Nukleinsäurepolymerasen und Ribo- und/oder Desoxyribonukleotidtriphosphate, mit der immobilisierten Ziel-Nukleinsäure in Kontakt gebracht werden.
Der resultierende Polynukleotidstrang (Amplicon) kann direkt zur spezifischen Hybridisierung und zum spezifischen Nachweis mit einer markierten Hybridisierungsassay-Sonde oder zur weiteren Amplifikation mittels Hybridisieren des Polynukleotidstrangs mit einem oder mehreren zusätzlichen Amplifikationsoligonukleotiden unter Nukleinsäurenamplifikationsbedingungen zur Verfügung gestellt werden. Wenn die letztere Möglichkeit gewählt wird, kann die Amplifikationsreaktion fortgesetzt werden, bis der gewünschte Amplifikationsgrad erzielt wird, dann können die resultierenden Amplicone, die Kopien mindestens eines Abschnitts der immobilisierten Ziel-Nukleinsäure, Polynukleotide, die zu mindestens einem Abschnitt der immobilisierten Ziel-Nukleinsäure komplementär sind, oder beides umfassen können, unter Verwendung einer oder mehrerer markierter Oligonukleotidsonden nachgewiesen werden. Wenn die Amplifikationsreaktion stattfinden soll, während das Ziel immobilisiert wird, ist es wichtig, dass der Abschnitt des Zielmoleküls, der als eine Matrize für die Amplicone verwendet werden soll, nicht die Nukleotidsequenzregion enthält, die zur Immobilisierung der Ziel-Nukleinsäure erforderlich ist. Obgleich Amplicone mit einer Richtung oder beiden Richtungen mit den markierten Sonden nachgewiesen werden können, werden in einer bevorzugten Ausführungsform nur Amplicone mit der entgegengesetzten Richtung zum immobilisierten Ziel, d. h. zu diesem komplementäre, nachgewiesen.
Ein heterogenes Zieleinfangverfahren wie dieses ist besonders vorteilhaft, da rohe klinische Proben Substanzen enthalten können, die die Amplifikationsreaktion inhibieren oder stören. Somit kann die Fähigkeit zum Trennen der Ziel-Nukleinsäure von solchen störenden Substanzen die Sensitivität von Nukleinsäurenamplifikation ermöglichen oder verstärken.
Dieses mit der festen Phase assoziierte Amplifikationsschema kann in unzähligen Assaysystemen verwendet werden, einschließlich der oben beschriebenen. Der Anmelder bevorzugt gegenwärtig ein Assaysystem, das ein oder mehrere koppelnde Oligonukleotide, wie oben beschrieben, einsetzt, die die Ziel-Nukleinsäure indirekt mit dem festen Träger verknüpfen können. Es ist gleichfalls bevorzugt, dass die komplementären Nukleotidsequenzregionen des an den Träger gekoppelten Oligonukleotids und des einfangenden Oligonukleotids, das dazu entworfen ist, an es zu hybridisieren, zumindest zum Teil homopolymer sind oder einfache sich wiederholende Nukleotidsequenzen enthalten, um eine schnelle Hybridisierung zu fördern. Zusätzlich oder alternativ dazu können diese Regionen von einem oder beiden des immobilisierten Oligonukleotids und des einfangenden Oligonukleotids auf eine Weise modifiziert werden, die mit der Offenbarung dieser Patentschrift im Einklang steht, um die Rate der Hybridisierung zwischen diesen Oligonukleotiden zu erhöhen. In einem solchen System ist dem das Ziel einfangenden Oligonukleotid und der Ziel-Nukleinsäure vorzugsweise möglich, vor dem Hybridisieren an das immobilisierte Oligonukleotid in Lösung zu hybridisieren. In der derzeit bevorzugten Ausführungsform wird das immobilisierte Ziel gewaschen, das Amplifikationsoligonukleotid (oder die Amplifikationsoligonukleotide) wird unter Nukleinsäurenamplifikationsbedingungen mit dem immobilisierten Ziel in Kontakt gebracht und nach der Amplifikation wird die markierte, auf Amplicon gerichtete Sonde hinzugefügt und nachgewiesen.
Der Anmelder bevorzugt, das auf Transkription basierende Amplifikationsverfahren zu verwenden, das in Kacian & Fultz, oben, beschrieben wird. Gemäß diesem Verfahren werden ein Promotor-Primer mit einer 3'-Region, die zu einem Abschnitt des Ziels komplementär ist, und einer 5'-Region und ein Primer mit derselben Nukleotidsequenz wie ein Abschnitt des Ziels mit einem Ziel-RNA-Molekül in Kontakt gebracht. Der Primer und der Promotor-Primer definieren die Grenzen der zu amplifizierenden Zielregion, einschließlich beider Richtungen, die an dem Zielmolekül und dessen Komplement vorliegen, und folglich die Länge und Sequenz des Amplicons. Die Amplifikationsoligonukleotide und die immobilisierte Ziel-RNA können bei Vorliegen wirksamer Mengen von reverser Transkriptase, die von Moloney-Maus-Leukämievirus abgeleitet ist, und T7-RNA-Polymerase, sowohl Ribonukleotid- als auch Desoxyribonukleotidtriphosphaten und erforderlichen Salzen und Cofaktoren bei 42 °C in Kontakt gebracht werden. Unter diesen Bedingungen findet die Nukleinsäurenamplifikation statt, die vorwiegend in der Produktion von RNA-Ampliconen mit einer Richtung, die zu der der Ziel-Nukleinsäure entgegengesetzt ist, resultiert. Diese Amplicone werden dann in dem Hybridisierungsschutzassay, wie in Arnold, oben, offenbart, nachgewiesen, z. B. mittels Verwendung einer mit Acridiniumester markierten Hybridisierungsassay-Sonde mit derselben Richtung wie die Ziel-Nukleinsäure.
Der 3'-Terminus des immobilisierten Oligonukleotids, des das Ziel einfangenden Oligonukleotids und des koppelnden Oligonukleotids bzw. der koppelnden Oligonukleotide kann „capped" oder blockiert sein, um ihre Verwendung als Matrizen für Nukleinsäurepolymerase-Aktivität zu verhindern oder inhibieren. Das Anheften des Cap kann die Addition von 3'-Desoxyribonukleotiden (wie Cordycepin), 3'-, 2'-Didesoxynukleotidresten, Nicht-Nukleotid-Linkern, wie in Arnold et al., oben, offenbart, Alkandiol-Modifikationen oder nicht komplementären Nukleotidresten an den 3'-Terminus umfassen.
Obgleich die Primer nach der Immobilisierung des Ziels mit dem Ziel in Kontakt gebracht werden können, können Vorteile in Bezug auf die Hybridisierungskinetik zum Kombinieren der Ziel-Nukleinsäure und mindestens einem dazu komplementären Primer zur selben Zeit, zu der die das Ziel einfangende Oligonukleotid hinzugefügt wird, bestehen. Der Anmelder glaubt, dass es vorteilhaft ist, die Hybridisierung des Ziels in Lösung vor der Immobilisierung des Ziels durchzuführen, da die Hybridisierung in Lösung schneller erfolgen kann, als wenn eine Nukleinsäure immobilisiert wird.
Desgleichen, obgleich der Anmelder bevorzugt, Amplicone mit der entgegengesetzten Richtung zum Ziel zu bilden und nachzuweisen, gibt es keinen Grund, warum man nicht Amplicone mit einer oder beiden Richtungen bilden und nachweisen könnte. Darüber hinaus scheint es wichtig zu sein, wenn Ziel-Nukleinsäuren, die in rohen klinischen Proben enthalten sind, amplifiziert werden, vor dem Amplifikationsschritt einen Waschschritt durchzuführen, um eine Enzyminhibition und/oder einen Nukleinsäureabbau aufgrund von in der Probe vorliegenden Substanzen zu verhindern.
Es wird dem Fachmann klar sein, dass diese Methodik, entweder wie beschrieben oder mit offensichtlichen Abänderungen, für verschiedene andere Amplifikationsschemata, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion, zugänglich ist.
Modifizierte Oligonukleotide in der Probenverarbeitung
Modifizierte Oligonukleotide, die an komplementäre Ziele mit gesteigerter Kinetik hybridisieren können, können in Probenverarbeitungsverfahren verwendet werden, die Nukleinsäurehybridisierung einsetzen, einschließlich der oben beschriebenen Zieleinfangverfahren. Angesichts der vorliegenden Offenbarung wird offensichtlich sein, dass solche zum Teil oder gänzlich modifizierte Oligonukleotide in diesen Systemen als Hybridisierungsassay-Sonden oder Amplifikationsoligonukleotide eingesetzt werden können. Darüber hinaus können gänzlich oder zum Teil modifizierte Oligonukleotide mit gesteigerter zielgerichteter Hybridisierungskinetik in heterogenen Assays, die Nukleinsäurehybridisierung einsetzen, als immobilisierte Oligonukleotide, das Ziel einfangende Oligonukleotide und/oder ein oder mehrere koppelnde Oligonukleotide verwendet werden. Zum Beispiel können solche Modifikationen verwendet werden, um die Gesamtdauer des Assays zu verringern oder zu ermöglichen, dass die Hybridisierungsschritte des Assays bei einer einzigen Temperatur erfolgen. Die dadurch erlangten Vorteile einer verringerten Dauer und der Leichtigkeit der Durchführung des Assays in einer klinischen Umgebung wären Fachmännern klar.
Darüber hinaus können Oligonukleotide modifiziert werden, um Hybribisierungskinetik und/oder Gleichgewichtspräferenzen für eine spezifische Art von Nukleinsäure, wie RNA oder DNA, aufzuweisen. Wie oben offenbart, hybridisieren 2'-O-Methyl-Oligonukleotide vorzugsweise mit RNA gegenüber DNA. Folglich können das Ziel einfangende Oligonukleotide, die 2'-O-Methyl-Oligonukleotide enthalten, verwendet werden, um spezifisch RNA-Ziel-Nukleinsäuren, wie mRNA oder rRNA, unter Hybridisierungsbedingungen, die nicht die Hybridisierung des Oligonukleotids an genomische Versionen davon fördern, einzufangen. Desgleichen können 2'-O-Methyl-modifizierte Amplifikationsoligonukleotide und/oder markierte Sonden entworfen werden, wodurch RNA anstelle von DNA zur Amplifikation und/oder zum Nachweis targetiert wird, wie oben beschrieben.
Modifizierte Helferoligonukleotide
Helferoligonukleotide sind in Hogan, oben, beschrieben. Helferoligonukleotide sind im Allgemeinen unmarkiert und werden zusammen mit markierten Hybridisierungsassay-Sonden verwendet, um die T_m der markierten Sonde und die Hybridisierungsrate zu erhöhen, indem Ziel-Nukleotidsequenzregionen, die an der sekundären Struktur beteiligt sein können, „geöffnet" werden, wodurch diese Regionen zur Hybridisierung mit der markierten Sonde zur Verfügung gestellt werden.
Angesichts der vorliegenden Offenbarung werden Fachmänner leicht erkennen, dass die Verwendung von modifizierten Helferoligonukleotiden, die mit der Ziel-Nukleinsäure bei einer erhöhten Rate gegenüber ihren unmodifizierten Entsprechungen hybridisieren werden, zu noch höheren Hybridisierungsraten der markierten Sonde an ihr Ziel führen kann. Folglich sollen Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen von Oligonukleotiden, die solche modifizierten Helferoligonukleotiden einsetzen, vom Schutzumfang dieser Erfindung umfasst sein. Bevorzugte Helferoligonukleotide weisen Modifikationen auf, die ihnen eine größere Avidität mit RNA gegenüber DNA geben. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten solche Modifikationen einen Cluster von mindestens etwa 4 2'-O-Methyl-Nukleotiden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform würden solche Modifikationen einen Cluster von etwa 8 2'-O-Methyl-Nukleotiden enthalten.
Diagnostische Kits
Die hierin beschriebenen Verfahren legen auch eindeutig diagnostische Kits nahe, die speziell zur Verwendung in solchen Verfahren formuliert sind. Diese Kits werden ein oder mehrere Oligonukleotide enthalten, die in einem diagnostischen Nukleinsäurehybridisierungsassay verwendet werden sollen. Mindestens eines dieser Oligonukleotide wird einen Cluster von mindestens etwa 4 modifizierten Nukleotiden enthalten, die dazu entworfen sind, mit einer erhöhten Rate gegenüber einem anderweitig identischen Oligonukleotid an eine Ziel-Nukleinsäureregion zu hybridisieren.
Solche diagnostischen Kits können, ohne Einschränkung, eines oder eine beliebige Kombination der hierin beschriebenen Sonden-, Amplifikations-, Helfer- und Probenverarbeitungsoligonukleotide enthalten.
Das Kit kann mindestens eine markierte Oligonukleotidsonde mit einer Region enthalten, die einen oder mehrere Cluster von mindestens etwa 4 aneinandergrenzenden 2'-modifizierten Nukleotidresten enthält. Die Region kann einen oder mehrere Cluster von etwa 8 2'-modifizierten Nukleotiden enthalten.
Ein Acridiniumesterderivat kann als ein nicht radioaktiver Marker und die Addition einer Methoxygruppe als eine 2'-Modifikation verwendet werden. Mindestens eines der modifizierten Oligonukleotide kann einen oder mehrere Cluster von mindestens etwa 4 2'-O-Methyl-Nukleotiden umfassen. Mindestens ein Oligonukleotid kann einen oder mehrere Cluster von etwa 8 2'-O-Methyl-Nukleotiden enthalten.
Kits, die einen oder mehrere der hierin offenbarten modifizierten Oligonukleotide enthalten, könnten zur Verwendung in einem beliebigen diagnostischen Hybridisierungsassayverfahren oder verwandtem Amplifikationsverfahren vertrieben werden. In einem solchen Assay würde mindestens eines der modifizierten Oligonukleotide, die im Kit enthalten sind, als eine Sonde fungieren, die an eine Ziel-Nukleinsäure hybridisieren kann. Wenn die modifizierte Sonde mit einer Probe, die die Ziel-Nukleinsäure enthält, in Kontakt gebracht wird, wird die Sonde verglichen mit einer unmodifizierten Sonde mit einer identischen Basensequenz verbesserte Hybridisierungseigenschaften aufzeigen. Zum Beispiel wird die Hybridisierungsbindungsaffinität zwischen dem Ziel und der Sonde größer als die Hybridisierungsbindungsaffinität zwischen dem Ziel und einer unmodifizierten Form der Sonde sein, wenn sie denselben Hybridisierungsassaybedingungen unterworfen werden. Darüber hinaus wird die Hybridisierungsrate zwischen dem Ziel und der Sonde höher als die Hybridisierungsrate zwischen dem Ziel und einer unmodifizierten Form der Sonde sein, wenn sie denselben Hybridisierungsassaybedingungen unterworfen werden.
Um die Hybridisierungseigenschaften der Sonde weiter zu verbessern, können ein oder mehrere konjugierte Moleküle an die Sonde gebunden werden, vorzugsweise in einer Region, die einen Cluster von mindestens etwa 4 modifizierten Nukleotiden enthalten. Es wird auch erwartet, dass das Kit mit Anleitungen zur Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotide in einem diagnostischen Hybridisierungsassay abgepackt werden würde.
Hierin sind Verfahren zum Erhöhen sowohl der Bindungsavidität als auch der Hybridisierungsrate zwischen einer diagnostischen Nukleinsäuresonde und deren Ziel-Nukleinsäure beschrieben, indem Sondenmoleküle mit einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden, vorzugsweise einem Cluster von etwa 4 oder mehr und mehr bevorzugt etwa 8 modifizierten Nukleotiden eingesetzt werden. Die Modifikationen können 2'-Modifikationen am Ribofuranosylring umfassen. Die Modifikationen können weiterhin eine 2'-O-Methyl-Substitution umfassen.
Es ist außerdem beschrieben, wie Verfahren zum Erhöhen der Rate der Hybridisierung eines einzelsträngigen Oligonukleotids an eine Ziel-Nukleinsäure über die Einbindung mehrerer modifizierter Nukleotide in das Oligonukleotid bereitzustellen sind. Eine auf diese Weise erzielte erhöhte Hybridisierungsrate würde zusätzlich zum Anstieg der Hybridisierungskinetik erfolgen, die durch Anheben der Temperatur, der Salzkonzentration und/oder der Konzentration der Nukleinsäurereaktionspartner erreicht wird.
Eine weitere Beschreibung betrifft diagnostische Verfahren zum selektiven Targetieren von RNA anstelle von DNA über die Verwendung von Oligonukleotiden, die modifiziert wurden, um eine erhöhte Zielbindungseffektivität aufzuweisen und an RNA mit einer gesteigerten Rate gegenüber DNA zu hybridisieren. Solche Oligonukleotide können eine 2'-O-Methyl-Modifikation am Ribofuranosylring umfassen.
Es sind Probenverarbeitungsverfahren beschrieben, die ein immobilisiertes Oligonukleotid einsetzen, um Ziel-Nukleinsäuren direkt oder indirekt einzufangen. Solche Verfahren können ein oder mehrere Oligonukleotide einsetzen, die spezifisch an die Ziel-Nukleinsäure hybridisieren können, was deren Nachweis und Immobilisierung ermöglicht. Ein einziges markiertes Oligonukleotid kann für sowohl das Einfangen als auch den Nachweis des Ziels verantwortlich zeichnen. Eine koppelnde oder Brücken bildende Nukleinsäure kann an sowohl das immobilisierte Oligonukleotid als auch das Oligonukleotid, das für das Einfangen und den Nachweis des Ziels verantwortlich zeichnet, binden. Weitere koppelnde Nukleinsäuren sind möglich. Einige oder alle der Oligonukleotide, die in Probenverarbeitungsverfahren verwendet werden, können Modifikationen enthalten, die die Rate der zielspezifischen Hybridisierung beschleunigen.
Hierin sind zielspezifische Oligonukleotide von zwischen etwa 10 und etwa 100 Basen beschrieben, vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 15 Basen und mehr bevorzugt zwischen etwa 12 und etwa 15 Basen, die vorzugsweise mindestens einen Cluster von mindestens etwa 4 Nukleotiden, mehr bevorzugt etwa 8 Nukleotiden enthalten, der dazu modifiziert ist, ihre zielspezifische Bindungseffektivität zu steigern, während sie gleichzeitig ihre Diskrimination zwischen Ziel- und Nicht-Ziel-Nukleotidsequenzen verglichen mit längeren unmodifizierten Oligonukleotiden, die dazu entworfen sind, an dieselbe Stelle zu hybridisieren, verbessern.
Hierin sind Kits beschrieben, wobei die Kits einen oder mehrere Oligonukleotide enthalten, die modifizierte Nukleotide enthalten, die die Funktion ausüben, die Rate der Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid und einer Ziel-Nukleinsäure zu erhöhen. Kits könnten eine beliebige Kombination von Sonden-, Amplifikations-, Helfer- und Probenverarbeitungsoligonukleotiden enthalten. Die modifizierten Oligonukleotide dieser Kits könnten mindestens einen Cluster von etwa 4 2'-O-Methyl-Modifikationen am Ribofuranosylring enthalten. Kits, die diese modifizierten Oligonukleotide enthalten, können zur Verwendung in sowohl diagnostischen Hybridisierungsassays als auch Amplifikationsassays bereitgestellt werden. Solche Kits können weiterhin schriftliche Anleitungen enthalten, die praktische Ärzte zur Verwendung der modifizierten Oligonukleotide in entweder diagnostischen Hybridisierungsassays oder Amplifikationsassays oder beiden anweisen.
Die diagnostischen Verfahren können speziell angepasst werden, um die Hybridisierungseigenschaften modifizierter Oligonukleotide mit erhöhter Bindungsaffinität auszunutzen. Diese Verfahren können zum Nachweis oder zur Quantifizierung einer beliebigen Ziel-Nukleinsäure verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure RNA. Die Verfahren können „chimäre" Oligonukleotide einsetzen, die sich aus Regionen unmodifizierter Oligodesoxy- oder Oligoribonukleotide in Kombination mit Regionen modifizierter Oligonukleotide zusammensetzen, oder können gänzlich modifizierte Oligonukleotide verwenden. Vorzugsweise sind die Oligonukleotide nicht gänzlich modifiziert. Die Regionen können einfach dazu entworfen sein, die schnelle Hybridisierung von Sonde an Ziel zu fördern; oder sie können andere Funktionen aufweisen. Zum Beispiel kann ein chimäres Oligonukleotid dazu entworfen sein, sowohl an RNA als auch an DNA zu binden. In einem solchen Fall kann der RNA bindende Teil des Oligonukleotids mehrere modifizierte Nukleotide enthalten, um vorzugsweise das RNA-Ziel zu binden. Alternativ kann die Region modifizierter Reste dazu entworfen sein, auf ein in leichtem Überfluss vorliegendes Ziel gerichtet zu werden, um die Hybridisierungsrate zu erhöhen.
In Anbetracht der vorliegenden Offenbarung wird verstanden werden, dass bestimmte Verfahren und Zusammensetzungen, einschließlich der Kits, Oligonukleotide mit mehr als einer Art von Modifikation, die sich auf die Hybridisierungseigenschaften des resultierenden Oligonukleotids, d. h. T_m und Hybridisierungskinetik, auswirkt, einsetzen können. Solche mehrfachen Modifikationen können auf eine kooperative Art und Weise dazu agieren, die Hybridisierungsrate weiter zu erhöhen oder die Spezifität des resultierenden Oligonukleotids für eine gegebene Art von Nukleinsäureziel, wie RNA, zu erhöhen. Des Weiteren können chimäre Oligonukleotide Regionen unterschiedlich modifizierter Oligonukleotide, die entweder 2'-modifizierte Nukleotide oder Nukleotide mit anderen Modifikationen oder beide enthalten, aufweisen oder aus diesen bestehen.
Beispiele
Sofern nicht anders angegeben, wurden in allen folgenden Beispielen Oligodesoxyribonukleotide, Oligoribonukleotide und modifizierte Oligonukleotide mittels Anwendung von standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie synthetisiert, von der verschiedene Verfahren in der Technik wohl bekannt sind.
Siehe z. B. Carruthers et al., 154 Methods in Enzymology, 287 (1987). Sofern hierin nicht anders aufgeführt, waren modifizierte Nukleotide 2'-O-Methyl-Nukleotide, die in der Synthese wie ihrer Phosphoramidit-Analoga verwendet wurden. Der Anmelder stellte die Oligonukleotide unter Verwendung eines Expedite 8909-DNA-Synthesizer (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA) her.
Zudem, sofern nicht anders angegeben, enthielten als markiert aufgeführte Oligonukleotide einen Acridiniumphenylester. Acridiniumphenylesterverbindungen sind Derivate von Acridin, die im Zentrum über einen quartären Stickstoff verfügen und an der 9-Position derivatisiert sind, um eine Phenylestereinheit zu erhalten. Abgangsgruppen, bei denen es sich nicht um Phenyleinheiten handelt, sind jedoch in der Technik wohl bekannt. Acridiniumester haben die Eigenschaft, mit Wasserstoffperoxid zu reagieren, um einen vorübergehenden Dioxetanring zu bilden, der den C-9-Kohlenstoff des Acridiniumrings umfasst, worauf die Bildung eines angeregten Acridons folgt. Die Strahlungsrelaxation des angeregten Acridons resultiert in der Erzeugung von Licht. Die Synthese von Acridiniumestern sowie eine allgemeine Beschreibung ihrer Verwendung als chemilumineszierende Markierungsreagentien sind in Weeks et al., Acridinium Esters as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem., 29:1474-1478 (1984), beschrieben.
In diesen Beispielen wurden die Acridiniumester unter Anwendung von Standardtechniken der Chemie an eine monomere Nicht-Nukleotid-Einheit mit einem primären Amin-„Linkerarm" angeheftet, der mit der Acridiniumestereinheit verbunden ist, die während der chemischen Synthese der Oligonukleotide zwischen aneinandergrenzende Sequenzen von Nukleotiden inseriert oder an einer Endposition des Oligonukleotids angeordnet wird. Siehe Arnold et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Proben, EPA-Veröffentlichung Nr. EPA 313219. Es wird jedoch verstanden werden, dass die Präferenz von 2'-modifizierten Oligonukleotiden für RNA-Ziele und die Auswirkung der modifizierten Oligonukleotide auf die Rate der Hybridisierung an DNA-Ziele nicht von dem Vorliegen oder der spezifischen Beschaffenheit eines Markers bestimmt werden. Folglich werden Fachmänner erkennen, dass in der Verwendung der vorliegenden Erfindung verwendete Oligonukleotide mit einer Vielfalt an Markern markiert sein können oder sie können unmarkiert sein.
Acridiniumesterderivate können mit dem Linkerarm/Hybridisierungssonden-Konjugat unter Anwendung von in der Technik wohl bekannter Techniken verbunden werden. Vorzugsweise wendet der Anmelder die in Nelson et al., Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press 1992) und Arnold et al., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Proben, EPA-Veröffentlichung Nr. EPA 313219, beschriebenen Verfahren an.
Des Weiteren, sofern nicht anders angegeben, waren alle Ziel-Nukleinsäuren RNA.
Beispiel 1: Auswirkung von 2'-Modifikationen auf die T_m von Sonden/Ziel-Hybriden
Oligonukleotidsonden mit identischer Sequenz, die unterschiedliche Mengen an 2'-O-Methyl-Nukleotiden enthielten, wurden jeweils individuell an perfekt komplementäre synthetische RNA-Ziele derselben Länge hybridisiert. Die Sonden sequenz wies SEQ ID NO:1 und die Zielsequenz SEQ ID NO:2 auf. Die Nukleotidbasensequenzen dieser Oligonukleotide waren wie folgt:
SEQ ID NO:1 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
SEQ ID NO:2 5'-ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC-3'
Die Sonden, wie im Folgenden dargestellt, wurden so synthetisiert, dass sie keine 2'-O-Methyl-Nukleotide (Sonde A), alle 2'-O-Methyl-Nukleotide (Sonde B) oder eine Kombination von Desoxy- und 2'-O-Methyl-Nukleotiden (Sonden C, D und E) enthielten. Sonde C enthielt vier aneinandergrenzende Desoxyribonukleotide, die direkt neben jeder Seite der Linkeranheftungsstelle positioniert waren, und 2'-O-Methyl-Ribonukleotide an allen anderen Basen; Sonde D enthielt vier aneinandergrenzende 2'-O-Methyl-Nukleotide, die direkt neben jeder Seite der Linkeranheftungsstelle positioniert waren, und Desoxyribonukleotide an allen anderen Basen und Sonde E enthielt acht aneinandergrenzende 2'-O-Methyl-Nukleotide, die direkt neben jeder Seite der Linkeranheftungsstelle positioniert waren, und Desoxyribonukleotide an allen anderen Basen. Die T_m jedes Hybrids wurde unter Anwendung sowohl eines Chemilumineszenz- als auch eines optischen Verfahrens bestimmt.
Chemilumineszenzverfahren
Unter Anwendung des Chemilumineszenzverfahrens wurden ungefähr 1 pmol des RNA-Ziels und 0,1 pmol jeder Oligonukleotidsonde, wie oben beschrieben mit „Standard"-Acridiniumester (4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat-fluorsulfonat) bei 60 °C 60 Minuten lang in 30 μl Lithiumsuccinat-Puffer (1,5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 1,5 mM EGTA (Ethylenglykolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure), 310 mM Lithiumlaurylsulfat, 0,1 M Lithiumsuccinat (pH 5,2)) hybridisieren gelassen. Die resultierende Lösung wurde dann mit Lithiumsuccinat-Puffer auf 500 μl verdünnt und 50-μl-Aliquots wurden bei verschiedenen Temperaturen 7 Minuten lang inkubiert. Jede Probe wurde danach weitere 7 Minuten auf Eis gekühlt. Der Acridiniumester, der mit unhybridisierten Sondenmolekülen gekoppelt war, wurde hydrolysiert, indem 150 μl einer Lösung zugegeben wurden, die 190 mM Na₂B₄O₇ (pH 7,6), 7 % (v/v) TRITON^® X-100 (Polyoxyethylen-p-t-octylphenol) und 0,02 % (w/v) Gelatine enthielt, und die Proben wurden 10 Minuten lang bei 60 °C erhitzt. Die verbleibende (mit dem Hybrid assoziierte) Chemilumineszenz jeder Probe wurde in einem LEADER^® 50-Luminometer (MGM Instruments; Hamden, Ct., USA) mittels der automatischen Injektion einer Lösung, die 0,1 % (v/v) H₂O₂ in 0, 001 M HNO₃, 0,5-2 Sekunden später gefolgt von einer Injektion von 200 μl 1 N NaOH bestimmt. Die resultierende Lichtemission wurde über ein 2-Sekunden-Intervall integriert.
Optisches Verfahren
Unter Anwendung des optischen Verfahrens wurde ein identischer Satz von Oligonukleotidsonden synthetisiert, die einen Linkerarm aufwiesen, aber nicht mit einem Acridiniumester markiert wurden. Vier Mikrogramm jeder Oligonukleotidsonde wurden bei 60 °C 60 Minuten lang in 30 μl eines Hybridisierungspuffers, der 200 mM Lithiumhydroxid, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 17 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat und 190 mM Bernsteinsäure (pH 5,2) enthielt, an 4 μg des komplementären RNA-Ziels hybridisieren gelassen. Nach der Hybridisierung wurden 600 μl des Hybridisierungspuffers zugegeben, die Probe in zwei Teile aufgeteilt und das Schmelzverhalten jedes Probenteils auf einem Beckman DU640-Spektrophotometer, das mit einem Mikro-T_m-Analysezubehörteil ausgerüstet war, untersucht. Die Temperatur wurde um 1 °C pro Minute bei Temperaturen, die mehr als 10 °C entweder niedriger oder höher als die T_m waren, und um 0,5 °C pro Minute in Intervallen von 0,2 °C bei allen anderen Temperaturen variiert. Veränderungen der Hypochromatizität wurden überwacht und in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten gezeigt. Tabelle 1

nv: = nicht vorgenommen

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, kongruierten die unter Anwendung des Chemilumineszenz- und des optischen Verfahrens generierten T_m-Daten gut miteinander. Die etwas niedrigeren T_m-Werte, die mit dem Chemilumineszenzverfahren beobachtet wurden, können den niedrigeren Nukleinsäurekonzentrationen, die im Chemilumineszenzverfahren im Vergleich zum optischen Verfahren verwendet wurden, zugeschrieben werden. Die Daten zeigen, dass der Austausch aller Desoxyribonukleotidreste von Sonde A durch 2'-O-Methyl-Nukleotide (Sonde B) in Son den/RNA-Ziel-Hybriden mit einer T_m resultierte, die um etwa 20,4 °C angestiegen war. Die Sonden C, D und E zeigten T_m-Anstiege von 15 °C, 4 °C bzw. 11,6 °C. Durch Berechnen der Auswirkung jeder Substitution mit einem 2'-O-Methyl-Nukleotid auf die T_m offenbaren diese Daten, dass die T_m des 2'-O-Methyl-Oligonukleotid/RNA-Ziel-Hybrids für jeden derartigen Austausch um etwa 0,8 °C ansteigt. Dieser Effekt ist über die Anzahl von geprüften Substitutionen ungefähr linear.
Beispiel 2: Auswirkung von 2'-modifizierten Nukleotiden auf die T_m von Sonden/rRNA-Hybriden
Drei Sätze von Oligonukleotidsonden unterschiedlicher Länge und Sequenz wurden synthetisiert und jeder Satz enthielt zwei Oligonukleotide mit identischer Basensequenz. Sonde F war 17 Basen lang und enthielt einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Adeninbase befand. Sonde G war 18 Basen lang und enthielt gleichfalls einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Adeninbase befand. Sonde H war 20 Basen lang und enthielt einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Guaninbase befand.
Jeder Satz von Sonden enthielt ein Oligonukleotid, das komplett aus Desoxyribonukleotiden bestand, und ein weiteres Oligonukleotid, das nur 2'-O-Methyl-Nukleotide enthielt. Jede Sonde wurde dann an die entsprechende ribosomale RNA hybridisiert und die T_m der resultierenden Hybride mittels des oben beschriebenen Chemilumineszenzverfahrens bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2
Die Daten bestätigen die Ergebnisse von Beispiel 1, zeigen, dass der Austausch eines Desoxyribonukleotids durch ein 2'-O-Methyl-Nukleotid die T_m des resultierenden Sonden/RNA-Ziel-Hybrids erhöht. Darüber hinaus, wenn er als der Durchschnitt des Anstiegs der T_m der drei Sonden je modifiziertes Nukleotid berechnet wird, war der Beitrag jedes modifizierten Nukleotids ein Anstieg um 0,8 °C je modifiziertes Nukleotid.
Beispiel 3: Auswirkung von 2'-modifizierten Nukleotiden auf die T_m von Sonden/DNA-Hybriden
In diesem Beispiel wurde die Auswirkung von 2'-Modifikation auf Sonden/DNA-Zielen geprüft. Sonde I, die unterschiedliche Mengen an 2'-O-Methyl-Nukleotiden enthielt, wurde an ein exakt komplementäres DNA-Ziel derselben Länge hybridisiert und das Schmelzverhalten der resultierenden Hybride wurde mittels des oben beschriebenen Chemilumineszenzverfahrens untersucht. Sonde I war 29 Basen lang und enthielt einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Guaninbase befand.
Sonde I wurde entworfen, aus Folgendem zu bestehen: (i) allen Desoxyribonukleotiden; (ii) allen 2'-O-Methyl-Nukleotiden und (iii) allen 2'-O-Methyl-Nukleotiden mit Ausnahme von vier Desoxyribonukleotiden, die direkt auf jeder Seite des Markeranheftungsstelle positioniert wurden. Die Ergebnisse der T_m-Bestimmung sind in Tabelle 3 unten gezeigt.
Tabelle 3
Wie die Daten zeigen, bewirkte der Austausch von Desoxyribonukleotiden durch 2'-O-Methyl-Nukleotide in der Sonde I, dass die T_m des markierte Sonde/DNA-Ziels um ungefähr 0,3 °C je 2'-O-Methyl-Rest anstieg.
Eine ähnliche Prüfung wurde unter Verwendung von drei Sätzen unterschiedlicher Oligonukleotide vorgenommen. Jeder Satz enthielt zwei Oligonukleotide, wobei eines der Oligonukleotide Desoxyribonukleotide enthielt und das andere 100 2'-O-Methyl-Nukleotide enthielt, die identische Basensequenzen aufwiesen. Sonde J war 16 Basen lang und enthielt einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Adeninbase befand. Sonde K war 18 Basen lang und enthielt gleichfalls einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Adeninbase befand. Sonde L war 29 Basen lang und enthielt einen Acridiniumester-Marker, der mit einer Stelle verbunden war, die sich zwischen einer Thyminbase und einer Guaninbase befand.
In jedem Fall waren die synthetischen DNA-Ziele zu den Sonden vollständig komplementär. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten gezeigt. Tabelle 4
Die in den Tabellen 3 und 4 enthaltenen Daten veranschaulichen, dass die T_m von DNA-Zielen zu einem beträchtlich geringerem Ausmaß als bei RNA-Zielen erhöht wird, wenn 2'-O-Methyl-Substituenten in die Sonden eingeführt werden.
Beispiel 4: Analyse der Stabilitäten unterschiedlicher Arten von Nukleinsäurehybriden
Um die relativen Stabilitäten von Hybriden zu vergleichen, die verschiedene Kombinationen von DNA-, RNA- und 2'-O-Methyl-Nukleotid-Strängen enthalten, wurden mit Acridiniumester markierte Oligonukleotidsonden mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben) an synthetische Ziele mit einer perfekt komplementären Basensequenz hybridisiert. Die Sonden und Zielsequenzen enthielten 100 % Ribonukleotide (RNA), 100 Desoxyribonukleotide (DNA) oder 100 % 2'-O-Methyl-Nukleotide in den in Tabelle 5 angegebenen Kombinationen. Die Schmelzcharakteristika jedes geprüften Hybrids, wie entweder unter Anwendung des Chemilumineszenz- oder des optischen Verfahrens bestimmt, sind in Tabelle 5 unten gezeigt. Mehr als ein Datenpunkt in der Tabelle zeigt einen unabhängigen, doppelt ausgeführten Versuch an. Tabelle 5

kD: = keine Daten

Somit besagt dieser Versuch, dass die Stabilität von Hybriden aus markierter Sonden und Ziel die folgende Reihenfolge einhält: 2'-O-Methyl/2'-O-Methyl ≥ 2'-O-Methyl/RNA > RNA/RNA > DNA/DNA > 2'-O-Methyl/DNA > DNA/RNA.
Beispiel 5: Fähigkeit von verbesserter Stabilität von Hybriden aus 2'-modifiziertem Oligo und RNA, eine spezifische RNA-Targetierung zu ermöglichen
Wie in Beispiel 4 angegeben ist, waren 2'-O-Methyl/RNA-Hybride wesentlich stabiler als 2'-O-Methyl/DNA-Hybride. Um zu veranschaulichen, dass dieser Stabilitätsunterschied in einem diagnostischen Assay ausgenutzt werden kann, um spezifisch RNA-Moleküle anstelle von DNA-Molekülen mit einer identischen Sequenz (aber mit Uracil in der RNA, das Thymin in der DNA ersetzt) nachzuweisen, wurde der folgende Versuch vorgenommen.
Eine mit Acridiniumester markierte Oligonukleotidsonde mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben), die sich zu 100 % aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden zusammensetzte, wurde an ein vollständig komplementäres synthetisches RNA- oder DNA-Ziel hybridisieren gelassen. Mit Ausnahme der Tatsache, dass das Oligonukleotid markiert war, waren die Hybridisierung und die Messung der T_m ansonsten wie in Beispiel 1 unter der Überschrift „Optisches Verfahren" beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 oben gezeigt und sind in 3 weiter dargestellt.
Wie in 3 angezeigt ist, bildet das 2'-O-Methyl-Nukleotid bei 81,6 °C ein nachweisbares Hybrid mit dem RNA-Ziel, jedoch nicht mit dem DNA-Ziel. Im Gegensatz dazu demonstriert Tabelle 5, dass, wenn ein markiertes DNA-Oligonukleotid mit derselben Sequenz mit den identischen RNA- oder DNA-Zielen hybridisiert wird, die resultierenden Hybride im Wesentlichen ähnliche Schmelzcharakteristika aufweisen.
Folglich ist es gemäß dem hier demonstrierten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung möglich, RNA-Ziele spezifisch unter einfach ermittelten Hybridisierungsbedingungen mit Präferenz gegenüber DNA-Zielen nachzuweisen. Solche Verfahren können verwendet werden, als ein nicht exklusives Beispiel, um verschiedene RNA-Spezies, wie mRNA, tRNA oder rRNA, ohne Interferenz durch die identische Sequenz, die in der genomischen DNA des geprüften Organismus vorliegt, spezifisch nachzuweisen. Solche Verfahren können für Anwendungen geeignet sein, die das Überwachen der Rate der Expression eines bestimmten Genprodukts beinhalten. Andere Verwendungszwecke, die diese Fähigkeit der 2'-modifizierten Oligonukleotide ausnutzen, werden Fachmännern offenbar sein.
Beispiel 6: Auswirkung von 2'-modifizierten Nukleotiden auf die Hybridisierungskinetik von Oligonukleotiden
Die Auswirkung von 2'-modifizierten Oligonukleotiden auf die Hybridisierungskinetik wurde unter Anwendung von vier verschiedenen Verfahren veranschaulicht. Die in diesem Beispiel verwendeten Sondenmoleküle wurden wie zuvor beschrieben mit Standard-Acridiniumester markiert.

a) Bei der ersten Vorgehensweise wurden 2 fmol einer mit Acridiniumester markierten Sonde mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben) einen gleich bleibenden Zeitraum lang an verschiedene Mengen eines vollständig komplementären RNA-Ziels hybridisiert, worauf differentielle Hydrolyse und Nachweis des Markers folgte. Die Hybridisierung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 1 unter der Überschrift „Chemilumineszenzverfahren" beschrieben durchgeführt, mit den folgenden Unterschieden. Verschiedene Mengen des RNA-Ziels wurden bei 60 °C 45 Minuten lang an die markierte Sonde hybridisieren gelassen. 4 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs, wobei die Sonde entweder ein DNA-Oligonukleotid war (leere Kästchen) oder gänzlich aus 2'-O- Methyl-Nukleotiden bestand (gefüllte Raute); diese Ergebnisse sind zudem in Tabelle 6 unten tabelliert. Das Ausmaß der Hybridisierung ist in relativen Lichteinheiten (relative light units, rlu) ausgedrückt, wobei es sich um eine Maßeinheit der Anzahl von Photonen, die vom Acridiniumester-Marker emittiert werden, handelt: Tabelle 6

Die Ergebnisse zeigen, dass die Hybridisierungsrate in Abhängigkeit von der Konzentration des Ziels beträchtlich erhöht wird, wenn die Sonde 2'-O-Methyl-Nukleotide anstelle von unmodifizierten Nukleotiden enthält. Dies gilt für den gesamten Bereich von untersuchten Konzentrationen des Ziels. Zu Vergleichszwecken werden die Anfangssteigungen dieser Daten dazu verwendet, die relativen Hybridisierungsraten von Desoxyoligonukleotidsonden (Steigung = 1,0) und 2'-O-Methyl-Oligonukleotidsonden (Steigung = 2,5) abzuschätzen.

b) Bei einer zweiten Vorgehensweise wurde eine gleich bleibende Menge (2 fmol) desselben Ziels, das in a) oben verwendet wurde, eine festgelegte Zeitspanne lang an verschiedene Mengen der perfekt komplementären Sonde hybridisiert. 5 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs, wobei die Sonde entweder ein DNA-Oligonukleotid war (leere Kästchen) oder gänzlich aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand (gefüllte Kästchen). Die Hybridisierungs- und Nachweisschritte waren genauso wie in a) oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierungsreaktion 30 Minuten lang anstatt 45 Minuten lang ausgeführt wurde. Die Daten sind in Tabelle 7 unten tabelliert. Tabelle 7

Wiederum zeigen die Ergebnisse in diesem Beispiel, dass die Hybridisierungsrate, die von der Konzentration der Sonde abhängig ist, beträchtlich erhöht wird, wenn die Sonde 2'-O-Methyl-Nukleotide anstelle von unmodifizierten Nukleotiden enthält. Die Steigungen dieser grafischen Darstellungen sind denen von 4 ähnlich, was darauf hinweist, dass der Unterschied bei der Hybridisierungskinetik zwischen 2'-O-Methyl/DNA- und DNA/DNA-Wechselwirkungen gleich bleibt, ungeachtet dessen, ob die Konzentration der Sonde oder die Konzentration des Ziels variiert wird. In diesem Versuch war die Anfangssteigung der Reaktionsmischung, die die DNA-Sonde enthielt, 1,0 und die der Reaktionsmischung, die die 2'-O-Methyl-Sonde enthielt, war 3,1.

c) Als eine dritte Veranschaulichung der Fähigkeit von 2'-modifizierten Oligonukleotiden, die Hybridisierungsrate zu erhöhen, wurden festgelegte Mengen von entweder modifizierter oder unmodifizierter Sonde (1 fmol) und Ziel (100 amol) unterschiedliche Zeitspannen lang hybridisieren gelassen. Die Hybridisierungs- und Nachweisprotokolle waren ansonsten genauso wie in b). 6 zeigt die Ergebnisse, wobei die Sonde entweder ein DNA-Oligonukleotid war (leere Kästchen) oder gänzlich aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand (gefüllte Rauten). Die Daten waren wie in Tabelle 8 unten folgt: Tabelle 8

Wiederum können die relativen Hybridisierungsraten aus den Anfangssteigungen der Kurven bestimmt werden (Desoxy = 1,0; 2'-O-Methyl = 2,2). In diesem Versuch war die Anfangssteigung der Reaktionsmischung, die das DNA-Oligonukleotid enthielt, 1,0 und die Anfangssteigung der Reaktionsmischung, die die 2'-O-Methyl-Oligonukleotidsonde enthielt, war 2,2-fach.

d) Das vierte Verfahren, das zum Aufzeigen der Unterschiede zwischen den Hybridisierungskinetiken von 2'-modifizierten und unmodifizierten Sonden verwendet wurde, war eine C_ot-Analyse. Es wurden mit Acridiniumester markierte Sonden mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben) verwendet. Entweder eine festgelegte Menge der Sonde und unterschiedliche Mengen des Ziels („Sondenüberschuss") oder eine festgelegte Menge des Ziels und unterschiedliche Mengen der Sonde („Zielüberschuss") wurden unterschiedliche Zeitspannen lang bei 60 °C hybridisieren gelassen. Die festgelegte Menge entweder der Sonde oder des Ziels war 0,25 fmol und die unterschiedliche Menge entweder der Sonde oder des Ziels beinhaltete Mengen im Bereich von 0,25 bis 50 fmol. Die Hybridisierung war ansonsten wie in Beispiel 1 unter der Überschrift „Chemilumineszenzverfahren" angegeben.

Die differentielle Hydrolyse des unhybridisierten Acridiniumesters und der Nachweis der hybridisierten Sonde wurden durchgeführt, indem der Probe 150 μl 190 mM Na₂B₄O₇ (pH 7,6), 7 % (v/v) TRITON^® X-100 und 0,02 % (w/v) Gelatine zugegeben wurden und die Mischung 10 Minuten lang auf 60 °C erhitzt wurde. Die Chemilumineszenz wurde in einem Luminometer abgelesen, wie oben beschrieben. Die prozentuale maximale Hybridisierung wurde als das Verhältnis des beobachteten rlu-Werts, geteilt durch den maximalen rlu-Wert, der beobachtet wurde, wenn sättigende Mengen der Sonde oder des Ziels in der Hybridisierungsreaktion verwendet wurden, definiert.
In der in 7 gezeigten grafischen Darstellung des C_ot ist die Quantität 1n(1 – H) über die Konzentration des Ziels mal der Hybridisierungszeit aufgetragen. Der Wert H ist als die prozentuale Hybridisierung der Sonde bei einer bestimmten Konzentration des Ziels nach einer bestimmten Zeit definiert.
In dieser grafischen Darstellung sind die relativen Raten der Hybridisierung von DNA- und 2'-O-Methyl-Oligonukleotidsonden durch die Inverse der relativen Verhältnisse von C_ot bei 50 % Hybridisierung (1n(1 – 0,5); Desoxy = 1,0 und 2'-O-Methyl = 2,2) angegeben.
Eine Aufstellung der mit diesen vier Verfahren bestimmten relativen Hybridisierungsraten einer mit Acridiniumester markierten Sonde, die völlig aus Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Ribonukleotiden besteht, ist in Tabelle 9 zusammengefasst. Die aus diesen Versuchen resultierenden Daten zeigen an, dass ein Oligonukleotid, das völlig aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden besteht, bei 60 °C 2,3-mal schneller als die entsprechende Desoxyribonukleotidsonde hybridisiert.
Tabelle 9
Beispiel 7: Kinetische Analyse der Hybridisierung von 2'- modifizierten Oligonukleotiden an weitere Ziele
Um diese Hybridisierungsratenvergleiche auf weitere Sonden- und Zielsequenzen auszuweiten, wurde Sonde H von Beispiel 2 oben völlig aus entweder Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Nukleotiden synthetisiert und bei Vorliegen von Helfersonden an rRNA hybridisiert. Es wurde eine C_ot-Analyse durchgeführt, wie in Beispiel 6(d). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten gezeigt.
Tabelle 10
In diesem Beispiel hybridisierte die Sonde, die völlig aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand, 3,75-mal schneller als die Desoxyribonukleotidsonde mit identischer Sequenz. Folglich scheint die verstärkte Hybridisierung durch mit Acridiniumester markierte Sonden, die 2'-O-Methyl-Nukleotide enthalten, nicht auf eine bestimmte Sonden- oder Zielsequenz beschränkt zu sein.
Beispiel 8: Auswirkung erhöhter Temperatur auf die Hybridisierungsrate von 2'-modifizierten Oligonukleotiden
Wie oben erwähnt, wird die Nukleinsäurehybridisierungskinetik durch eine Erhöhung der Temperatur beschleunigt. Die Vorteile dieser Beschleunigung können jedoch von den destabilisierenden Wirkungen der erhöhten Temperatur auf die Duplexbildung aufgehoben werden, insbesondere in diagnostischen Assays und Nukleinsäurenamplifikationsvorgängen, die verhältnismäßig kurze Oligonukleotide (zwischen etwa 10 und etwa 50 Basen lang) einsetzen. Wie unten gezeigt ist, kann die erhöhte Duplexstabilität, die von Oligonukleotiden bereitgestellt wird, die wie gegenwärtig beschrieben modifiziert wurden, diese destabilisierende Wirkung minimieren, was ermöglicht, die Hybridisierungsrate weiter zu erhöhen, indem die Hybridisierung bei einer höheren Temperatur durchgeführt wird, als ansonsten möglich wäre. Somit wird von den modifizierten Oligonukleotiden und der höheren Hybridisierungstemperatur eine kooperative Auswirkung auf die Hybridisierungskinetik bereitgestellt.
Eine mit Acridiniumester markierte Oligonukleotidsonde mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben), die völlig aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden besteht, wurde wie oben beschrieben an ein perfekt komplementäres RNA-Ziel derselben Länge hybridisieren gelassen. Die Hybridisierung und das C_ot-Protokoll waren wie in Beispiel 6(d) beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierungstemperaturen entweder 60 °C oder 70 °C waren. Wie mittels der Daten in Tabelle 11 unten gezeigt ist, bewirkte das Erhöhen der Temperatur der Hybridisierung des 2'-O-Methyl-Nukleotids an dessen Ziel auf 60 °C oder 70 °C, dass die Hybridisierungskinetik um das 1,5-fache beschleunigt wurde.
Tabelle 11
Beispiel 9: Auswirkung der Erhöhung der Salzkonzentration auf die Hybridisierungskinetik von 2'-modifizierten Oligonukleotiden
Die Hybridisierungskinetik wird auch durch Erhöhungen der Salzkonzentration beschleunigt. Das folgende Beispiel veranschaulicht die Auswirkung verschiedener Konzentrationen von Salz, z. B. LiCl, auf die Hybridisierungskinetik von 2'-O-Methyl-Nukleotiden. Eine mit Acridiniumester markierte Sonde mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben), die völlig aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand, wurde bei 80 °C an ein exakt komplementäres RNA-Ziel derselben Länge hybridisieren gelassen und eine C_ot-Analyse vorgenommen, wie in Beispiel 6(d) oben beschrieben. Die Hybridisierung wurde mit zwei unterschiedlichen LiCl-Konzentrationen durchgeführt. Wie in Tabelle 12 unten gezeigt ist, steigerte ein Erhöhen der Salzkonzentration von 0,5 auf 1,0 M LiCl die Hybridisierungskinetik auf das 2,9-fache.
Tabelle 12
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine zweifache Erhöhung der Salzkonzentration in einer Hybridisierungsreaktion zu einer 2,9-fachen Steigerung der Hybridisierungskinetik von modifizierten Oligonukleotiden führt.
Beispiel 10: Kombinierte Auswirkung der Erhöhung der Salzkonzentration und der Temperatur auf die Hybridisierungskinetik
Um die Auswirkung der gleichzeitigen Erhöhung der Hybridisierungstemperatur und der Salzkonzentration auf die Hybridisierungskinetik von 2'-modifizierten Oligonukleotiden zu demonstrieren, wurden die folgenden Reaktionen durchgeführt. Ein mit Acridiniumester markiertes DNA-Oligonukleotid und ein mit Acridiniumester markiertes Oligonukleotid mit 100 2'-O-Methyl-Nukleotiden, beide mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben), wurden in einer C_ot-Analyse jeweils separat an ein exakt komplementäres RNA-Zielmolekül hybridisieren gelassen. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie in Beispiel 6(d) beschrieben. Die Hybridisierungstemperatur und die Salzkonzentration waren wie in Tabelle 13 unten angegeben. Die Ergebnisse waren wie folgt: Tabelle 13
Wie die Daten zeigen, hybridisierte das 2'-O-Methyl-Nukleotid bei einer Hybridisierungstemperatur von 80 °C und in 1,0 M LiCl mit einer 8,6-mal schnelleren Rate an sein Ziel, als das entsprechende DNA-Oligonukleotid dies bei einer Temperatur von 60 °C und einer Salzkonzentration von 0,5 M LiCl tat.
Beispiel 11: Vergleich von Hybridisierungsraten von RNA-, DNA- und 2'-modifizierten Oligonukleotiden, die an komplementäre DNA- und RNA-Ziele hybridisieren
Die relativen Hybridisierungsraten von markierten RNA-, DNA- und 2'-O-Met.hyl enthaltenden Oligonukleotiden an vollständig komplementäre DNA- und RNA-Ziele wurden einzeln bestimmt. Die Bestimmung der Raten wurde wie in entweder Beispiel 6(c) oder 6(d) oben offenbart durchgeführt. Die markierten Oligonukleotide wiesen identische Basensequenzen von SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben) auf. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 unten zusammengefasst: Tabelle 14
Die in den Zeilen 1 bis 4 dargestellten Versuche wurden wie in Beispiel 6(c) offenbart unter Verwendung von 3 fmol der markierten Sonde und 0,3 fmol des Ziels durchgeführt. Die in den Zeilen 5 und 6 dargestellten Versuche wurden unter Anwendung des in Beispiel 6(d) beschriebenen Verfahrens offenbart durchgeführt. Wenn mehr als ein Ergebnis angezeigt ist, entspricht jeder Wert einem anderen individuellen Versuch.
Die Ergebnisse von Tabelle 14 demonstrieren, dass die Substitution von Desoxyribonukleotidresten mit entweder 2'-OH-Resten (RNA) oder 2'-O-Methyl-Resten die Affinität als auch die Hybridisierungskinetik der Sonde an ein RNA-Ziel fördert. Im Gegensatz dazu fördert die Substitution von Desoxyribonukleotidresten mit 2'-O-Methyl-Resten die Affinität oder die Hybridisierungskinetik der Sonde an ein DNR-Ziel nicht.
Die in Tabelle 14 dargestellten Ergebnisse offenbaren, dass die Substitution von Desoxyribonukleotidresten mit 2'-O-Methyl-Resten die Affinität und die Hybridisierungskinetik einer Sonde für ein RNA-Ziel fördert. Diese Versuche schließen jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass der Acridiniumester-Marker und/oder der Linker, über den er an die Sonde angeheftet ist, für diese Hybridisierungsratencharakteristika verantwortlich zeichnen kann. Um zu zeigen, dass sich der Acridiniumester-Marker und/oder der Linker nicht merklich auf die Hybridisierungsraten auswirken, wurde der folgende Versuch durchgeführt.
Eine RNA-Sonde mit SEQ ID NO:1, die mit Acridiniumester markiert war (siehe Beispiel 1 oben) und einen Nicht-Nukleotid-Linker enthielt, über den der Marker an die Sonde angeheftet war, wurde an ein exakt komplementäres Ziel hybridisieren gelassen, das komplett aus entweder 2'-O-Methyl- oder Desoxyribonukleotiden bestand. Die Hybridisierung und die C_ot-Analyse wurden wie in Beispiel 6(d) vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 unten angeführt.
Tabelle 15
Diese Daten lassen erkennen, dass die Substitution von Desoxyribonukleotiden mit 2'-O-Methyl-Resten die Hybridisierungskinetik eines Oligonukleotids, dem ein Acridiniumester und/oder ein Linker fehlt, fördert. Folglich liegt die erhöhte Hybridisierungsrate, die bei 2'-O-Methylmodifizierten Sonden beobachtet wird, nicht im Vorliegen eines Markers oder eines Linkerarms begründet, sondern ist eine inhärente Eigenschaft des 2'-O-Methyl-modifizierten Oligonukleotids.
Beispiel 12: Verhältnismäßige Auswirkung von Helfersonden auf die Hybridisierung von Sonden aus DNA-Sondengemischen und 2'-modifizierten Sondengemischen an ein rRNA-Ziel
Wie in Hogan, oben, offenbart ist, wird die Hybridisierung von einigen Sonden an Nukleinsäuren, insbesondere denjenigen, die ein beträchtliches Ausmaß an sekundärer Struktur aufweisen, durch die Verwendung von zusätzlichen Sonden, „Helfersonden" genannt, erleichtert. Ein Beispiel, obwohl nicht das einzige Beispiel, einer Nukleinsäurespezies mit einem hohen Grad an sekundärer Struktur ist ribosomale RNA (rRNA). Helfersonden können dabei helfen, die sekundäre Struktur, die die Zielregion maskieren kann, zu unterbrechen. Die Helfersonde wird für gewöhnlich auf eine Sequenzregion in der Nähe der Sonden-Ziel-Sequenz, jedoch vorzugsweise nicht mit dieser überlappend, gerichtet. In der Praxis werden Helfersonden im Allgemeinen nicht markiert und für gewöhnlich in einem großen molaren Überschuss verwendet. Die Auswirkung der Verwendung von Helfersonden auf die Hybridisierung markierter Sonden wird für gewöhnlich als eine erhöhte T_m und Hybridisierungsrate für das Hybrid aus markierter Sonde und Ziel ausgedrückt.
Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob 2'-modifizierte Oligonukleotidsonden dieselben Voraussetzungen für Helfersonden wie DNA-Sonden haben, wenn sie auf gegebene Zielregionen gerichtet werden, die ein hohes Ausmaß an sekundärer Struktur enthalten. Es wurden zwei Sondengemische hergestellt. Jedes Sondengemisch enthielt die Sonden F, G und H von Beispiel 2 oben. Die Oligonukleotide eines Sondengemischs bestanden aus 100 % 2'-O-Methyl-Nukleotiden und die Oligonukleotide des anderen Sondengemisches setzten sich komplett aus Desoxyribonukleotiden zusammen. Sofern angegeben, enthielten die Sondengemische die unmarkierten DNA-Helfersonden a, b, c, d, e und f mit Längen von 33, 36, 41, 31, 29 bzw. 40 Basen.
Jede Helfersonde wurde auf rRNA-Basensequenzen gerichtet, die sich nah zur Zielstelle einer der markierten Sonden befanden. Das Hybridisierungsausmaß wurde unter Anwendung des Hybridisierungsschutzassays (HPA), wie oben beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse wurden in relativen Lichteinheiten (rlu) angegeben.
Wie in Tabelle 16 unten gezeigt ist, hybridisierten die DNA-Sondengemische bei Fehlen von Helfersonden schlecht an rRNA. Im Gegensatz dazu, wenn Sondengemische, die 2'-O-Methyl-Sonden mit zu den DNA-Sondengemischen identischer Sequenz einsetzten, bei Fehlen von Helfersonden an rRNA hybridisiert wurden, wurden viel höhere Hybridisierungsniveaus beobachtet. Darüber hinaus fand, wenn mit beiden Sondengemischen Helfersonden verwendet wurden, mit den 2'-modifizierten Oligonukleotidsonden eine wesentlich stärkere Hybridisierung der Sonden an ihr Ziel statt. Da die Hybridisierung einer DNA-Sonde an eine rRNA stark vom Vorliegen von Helfersonden abhängt, obgleich das bei der Hybridisierung einer identischen 2'-O-Methyl-Sonde nicht der Fall ist, können 2'-O-Methyl-Sonden effizient an stark strukturierte RNA-Moleküle, wie ribosomale RNA, unter Bedingungen, unter denen DNA-Sonden dies nicht können, hybridisieren.
Tabelle 16
Die Daten in Tabelle 16 zeigen weiter an, dass Helfersonden nicht benötigt werden, um die Sondenbindung zu erleichtern, wenn 2'-modifizierte Oligonukleotide verwendet werden. In Assays, die sowohl Helfersonden als auch 2'-modifizierte Sonden einsetzen, kann jedoch eine noch größere Sensitivität als zuvor gesehen erzielt werden.
Beispiel 13: Verhältnismäßige Auswirkung von Helfersonden auf die Hybridisierung von einer einzigen DNA-Sonde und einer einzigen 2'-modifizierten Sonde an ein rRNA-Ziel
Die Ergebnisse der in Beispiel 12 beschriebenen Versuche wurden unter Verwendung von drei separaten markierten Sonden, entweder mit oder ohne Vorliegen der sechs in Beispiel 12 identifizierten Helferoligonukleotide ausgearbeitet. In diesem Beispiel wurden die Sonden F und H von Beispiel 2, die komplett aus Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestanden, an Ziel-rRNA bei Vorliegen oder Fehlen der angegebenen Helfersonden hybridisieren gelassen. Es wurden die Helfersonden a, b, c und d von Beispiel 12 oben verwendet. Tabelle 17 zeigt die Hybridisierungscharakteristika von DNA- und 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden von Sonde F. Tabelle 18 zeigt die Hybridisierungscharakteristika von DNA- und 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden von Sonde H. Jede markierte Sonde wurde bei Vorliegen oder Fehlen der verschiedenen angegebenen Helfersonden und Helfersondenkombinationen geprüft. Tabelle 17

Tabelle 18
Die Tabellen 17 und 18 demonstrieren, dass die markierten DNA-Sonden Helferoligonukleotide benötigten, um unter den Assaybedingungen an ihre Ziele zu hybridisieren. Darüber hinaus zeigt Tabelle 18, dass die 2'-modifizierten Oligonukleotide bei Fehlen von Helfersonden in einem höherem Ausmaß an ihre Ziele hybridisierten, als die DNA-Oligonukleotide bei Vorliegen der hinzugefügten Helfer an dasselbe Ziel hybridisierten. Schließlich wiesen die 2'-O-Methyl-Oligonukleotide bei Vorliegen von Helferoligonukleotiden noch bessere Hybridisierungseigenschaften auf.
Beispiel 14: Verhältnismäßige Auswirkung der Temperatur auf die Hybridisierungseigenschaften von DNA-Sonden und 2'-modifizierten Sonden mit einem rRNA-Ziel bei Vorliegen oder Fehlen von Helfersonden
Die in Beispiel 13 dargelegten Daten zeigen, dass 2'-O-Methyl-Oligonukleotide bei Fehlen von Helfersonden in einem nachweisbaren Ausmaß an RNA-Ziele, sogar stark gefaltete Strukturen wie rRNA, hybridisieren. Nichtsdestotrotz können Helfersonden die Hybridisierung von 2'-O-Methyl-Oligonukleotiden an stark strukturierte RNA beschleunigen. Um die Auswirkung von Helfersonden näher zu untersuchen, wurden Desoxy- und 2'-O-Methyl-Oligonukleotidsonden bei Vorliegen oder Fehlen von Helfersonden bei unterschiedlichen Temperaturen an rRNA hybridisiert. Tabelle 19 stellt Studien dar, die unter Verwendung von mit Acridiniumester markierten Sonden mit einer Nukleotidsequenz von Sonde F von Beispiel 2 oben und den Helfersonden c und d von Beispiel 12 oben durchgeführt wurden. Tabelle 20 stellt Studien dar, die unter Verwendung von mit Acridiniumester markierten Sonden mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben) und den Helfersonden g und h mit 41 bzw. 32 Basen durchgeführt wurden. Tabelle 19
Tabelle 20
Diese Versuchen demonstrieren, dass Helfersonden bei 60 °C und 75 °C die Hybridisierungsraten der 2'-O-Methyl-Sonden an ihre Ziele um das 3,1- bis 4,3-fache erhöhten.
Beispiel 15: Auswirkung von 2'-modifizierten Nukleotiden auf die Hydrolyseeigenschaften von mit Acridiniumester markierten Sonden
Als eine weitere Demonstration der Auswirkung von modifizierten Oligonukleotiden auf die Leistungscharakteristika von diagnostischen Sondenmolekülen wurde eine Reihe von weiteren Versuchen durchgeführt. Diese Versuche basierten auf dem bevorzugten Nachweisverfahren des Anmelders, das den HPA-Nachweisassay einsetzt. Gemäß einem HPA-Format wird chemilumineszierender Acridiniumester an eine Sonde angeheftet und die Sonde wird an einen Analyten hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird mit unhybridisierter Sonde assoziierte Chemilumineszenz mittels kurzer Hydrolyse in Boratpuffer zerstört. Da Sonden/Analyt-Moleküle in diesem Vorgang nicht zerstört werden, ist die verbleibende Chemilumineszenz hybridisierter Sonde ein direktes Maß des vorliegenden Analyten. In dieser Anwendung sind die mit Acridiniumester markierten Sonden, die schneller hybridisieren, wenn sie unhybridisiert sind, als wenn sie in einem Proben/Analyt-Hybrid-Komplex vorliegen, bevorzugt. Die Hydrolyse der Sonde und des Hybrids ist pseudo-erster½ Ordnung und kann durch den Wert t½ charakterisiert werden, bei dem es sich um die Zeit, gemessen in Minuten, handelt, die zum Hydrolysieren von 50 % des Acridiniumesters, der an entweder die Sonde oder das Hybrid angeheftet ist, erforderlich ist. Folglich sind Sonden, die ein hohes DH- Verhältnis (DH = differentielle Hydrolyse) (t½ (Hybrid)/t½ (Sonde)) aufweisen, stark erwünscht.
Um die Auswirkung von modifizierten Oligonukleotiden auf die Hydrolyseeigenschaften von mit Acridiniumester markierten Sonden zu untersuchen, wurden vier Sätze von Sonden konstruiert, wobei jeder Satz eine andere Nukleotidbasensequenz aufweist und jedes Element eines Satzes identische Nukleotidbasensequenzen aufweist. Jeder Satz von Sonden enthielt eine Sonde, die komplett aus unmodifizierten Nukleotiden bestand, und eine andere Sonde, die komplett aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand. Die verwendeten Sonden waren die Sonden A und B von Beispiel 1 oben und die Sonden F, G und H von Beispiel 2 oben. Die DH-Verhältnisse jeder Sonde zu einem exakt komplementären RNA-Ziel wurden wie beispielsweise in Beispiel 1 oben beschrieben durchgeführt. Wie in Tabelle 21 unten zusammengefasst ist, hydrolysierten unhybridisierte Sonden, die Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Nukleotide enthielten, bei sehr ähnlichen Raten.
Tabelle 21
Im Gegensatz dazu war der mit dem Hybrid aus modifizierter Sonde und Ziel assoziierte Marker bei drei der Sequenzen gegenüber Hydrolyse ungefähr 2-mal so beständig wie in dem ansonsten identischen Hybrid aus unmodifizierter Sonde und Ziel. In einem Fall, in dem die Sonde eine ATAT-Sequenz enthielt, die den Acridiniumester-Linker umgab, war das DH-Verhältnis beim mit dem Hybrid aus modifizierter Sonde und Ziel assoziierten Marker um das 1,4-fache verringert.
Beispiel 16: Auswirkung der Position von 2'-modifizierten Nukleotiden auf die Hydrolyseeigenschaften von mit Acridiniumester markierter Sonde
Um zu untersuchen, ob modifizierte Nukleotiden sich nah bei der Stelle der Markeranheftung befinden müssen, um das DH-Verhalten von Acridiniumester zu verbessern, wurden die mit Acridiniumester markierten Sonden mit SEQ ID NO:1, die Cluster von 2'-O-Methyl-Nukleotiden an verschiedenen Positionen bezüglich der Acridiniumester-Linker-Stelle enthielten, an ein komplementäres RNA-Ziel hybridisiert. Diejenigen Nukleotide, die 2'-O-Methyl-Substitutionen enthielten, sind im Folgenden durch Unterstreichungen angezeigt
Sonde M: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde N: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde O: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde P: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Wie in Tabelle 22 unten gezeigt ist, lassen die Messungen erkennen, dass 4 aneinandergrenzende 2'-O-Methyl-Nukleotide zu beiden Seiten der Acridiniumester-Linker-Stelle dazu ausreichen, das DH-Verhalten einer mit Acridiniumester markierten Sonde so stark zu verbessern wie eine Sonde, die komplett aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden besteht. Mehr als ein Datenpunkt in der Tabelle zeigt unabhängige, doppelt ausgeführte Versuche an.
Tabelle 22
Beispiel 17: Auswirkung der Temperatur auf die Hydrolyseeigenschaften von 2'-modifizierten, mit Acridiniumester markierten Sonden
Wie oben erwähnt, können die modifizierten Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung aufgrund ihrer höheren Wärmebeständigkeit bei einer höheren Temperatur an eine Ziel-Nukleinsäure als unmodifizierte Oligonukleotide hybridisieren. Bei solchen höheren Temperaturen würde erwartet, dass die Hybridisierungsrate sowie die Rate anderer Reaktionen ansteigen würden. Zu solchen anderen Reaktionen zählt die Rate der Hydrolyse von Acridiniumester-Markern. Da das bevorzugte Nachweisverfahren des Anmelders den Hybridisierungsschutzassay (HPA) einsetzt, der oben beschrieben ist, wurde der folgende Versuch durchgeführt, um zu bestimmen, ob Nutzen, die dem diagnostischen Assay durch eine Erhöhung der Hybridisierungsrate verliehen werden, von einem Rückgang der DH-Verhältnisse von mit dem Hybrid assoziierten und unassoziierten Acridiniumester-Markern bei dieser höheren Temperatur aufgewogen werden würden.
Eine mit Acridiniumester markierte Sonde, die komplett aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand, wurde bei 60 °C, 70 °C und 80 °C an ein komplementäres RNA-Ziel hybridisieren gelassen. Die Hybridisierungsbedingungen waren ansonsten wie zuvor beschrieben.
Wie in Tabelle 23 unten zusammengefasst ist, wiesen mit Acridiniumester markierte Sonden, die 2'-O-Methyl-Nukleotide enthielten, bei 70 °C und 80 °C DH-Verhältnisse auf, die zu mit Acridiniumester markierten Sonden, die Desoxyribonukleotide enthielten, bei 60 °C vergleichbar waren. Folglich kann in diagnostischen Assays, die die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einsetzen, eine erhöhte Temperatur ohne eine nachweisbare Verringerung der Assaysensitivität aufgrund von Abbau des Markers verwendet werden.
Tabelle 23
Beispiel 18: Auswirkung von 2'-modifizierten Nukleotiden auf die Hydrolyseeigenschaften von verschiedenen mit Acridiniumester markierten Sonden
Die vorstehenden Versuche wurden unter Verwendung von Standard-Acridiniumester als dem nachweisbaren chemilumi neszierenden Marker vorgenommen. Um zu untersuchen, ob das Verhalten bei differentieller Hydrolyse von Markern, bei denen es sich nicht um Standard-Acridiniumester handelte, von die T_m erhöhenden modifizierten Nukleotiden verbessert wird, wurden Sonden mit SEQ ID NO:1, die entweder Desoxy- oder 2'-O-Methyl-Nukleotide enthielten, auf genau dieselbe Art und Weise und an genau derselben Position (siehe Beispiel 1 oben) mit Acridiniumester, o-diBr-Acridiniumester, 2-Me-Acridiniumester, Naphthylacridiniumester, o-F-Acridiniumester, 2,7-Diisopropylacridiniumester oder einer Mischung von 1- und 3-Me-Acridiniumester markiert und ihr DH-Verhalten untersucht. Siehe 1 für Beispiele von Acridiniumestern. Wie in Tabelle 24 unten zusammengefasst ist, resultierte die Verwendung von modifizierten Nukleotidsonden bei allen geprüften Acridiniumesterderivaten in einer 1,1- bis 6-fachen Erhöhung des DH-Verhältnisses. Tabelle 24
Beispiel 19: Beziehung zwischen der Hybridisierungskinetik und der in einer Sondensequenz enthaltenen Anzahl von 2'-modifizierten Nukleotiden
Um die Beziehung zwischen der Hybridisierungskinetik und der Anzahl von 2'-O-Methyl-Nukleotiden in einer Sondensequenz zu untersuchen, wurden mit Acridiniumester markierte Sonden mit SEQ ID NO:1 (siehe Beispiel 1 oben) synthetisiert. Diese synthetisierten Sonden enthielten zunehmende Mengen von 2'-O-Methyl-Resten (unterstrichene Basen zeigen das Vorliegen von 2'-O-Methyl-Resten an) zu beiden Seiten des AE-Linkers:
Sonde Q: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde R: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde S: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde T: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde U: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Sonde V: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 unten zusammengefasst. Tabelle 25
Wie oben zusammengefasst ist, reichten nur 8 2'-O-Methyl-Nukleotide (Sonde T) – 4 zu jeder Seite der Acridiniumester-Linker-Stelle – aus, um die Hybridisierungsrate einer Acridiniumester-Sonde auf dasselbe Niveau wie eine Sonde, die fast komplett aus 2'-O-Methyl-Nukleotiden bestand (Sonde V), zu beschleunigen. Im Gegensatz dazu ist die T_m einer Sonde, die vier 2'-O-Methyl-Nukleotide zu jeder Seite der Acridiniumester-Linker-Stelle enthielt, niedriger als die T_m eines Sonden/Ziel-Hybrids, wobei die Sonde weitere 2'-O-Methyl-Nukleotide enthält. Somit ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, die Leistung einer mit Acridiniumester markierten Sonde bezüglich ihrer Hybridisierungsrate, differentiellen Hydrolyse und Schmelzeigen schaften zu optimieren oder „abzustimmen". Zum Beispiel wird eine mit Acridiniumester markierte Sonde, die vier 2'-O-Methyl-Nukleotide zu jeder Seite der Acridiniumester-Linker-Stelle enthält, ihre Hybridisierungsrate und Eigenschaften bei differentieller Hydrolyse maximal optimiert haben, wohingegen ein Hybrid, das diese Sonde enthält, nur einen geringen Anstieg seiner Schmelztemperatur aufzeigen wird.
Wenn im Wesentlichen aneinandergrenzende 2'-O-Methyl-Nukleotide hinzugefügt werden, um Desoxyribonukleotide in der markierten Sonde zu ersetzen, werden die Hybridisierungsrate und Eigenschaften bei differentieller Hydrolyse des Sonden/Ziel-Hybrids im Wesentlichen konstant bleiben, während seine T_m weiter ansteigen wird. Die Fähigkeit, den Einfluss der Sonde auf die T_m eines Sonden/Ziel-Hybrids stufenweise zu steigern, ermöglicht, die Spezifität einer Sonde einzustellen, damit diese nicht mit eng verwandten Sequenzen kreuzreagiert, wie in Tabelle 25 oben gezeigt.
Beispiel 20: Auswirkung von Propin-Modifikationen auf die T_m von Sonden/Ziel-Hybriden
Um die allgemeine Zweckmäßigkeit der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung in der diagnostischen Anwendung von Nukleinsäurehybridisierungstechnologie zu veranschaulichen, wurden Oligonukleotide mit einer Modifikation konstruiert, bei der es sich nicht um eine 2'-Modifikation am Ribofuranosyl-Teil handelt, die jedoch ebenfalls eine Steigerung der Bindungsaffinität einer Sonde für ihr Ziel bewirkte. In diesem Beispiel wurden Oligonukleotide synthetisiert, die zwei Nukleotide enthielten, die an der Stickstoffbase modifiziert waren.
Speziell N-Diisobutylaminomethyliden-5-(1-propinyl)-2'-desoxycytidin (ein Cytidin-Analogon) und 5-(1-Propinyl)-2'-desoxyuridin (ein Thymidin-Analogon). Diese Nukleotidanaloga sind im Handel erhältlich, zum Beispiel von Glen Research in Sterling, VA, USA.
Als eine erste Erwägung wurden Sonden mit 22 Basen und einem Acridiniumester, der an einer Stelle angefügt war, die sich in den Sonden W und Y zwischen einer Thyminbase und einer Guaninbase und in Sonde X zwischen zwei Thyminbasen befand, bei Vorliegen von Helfersonden an Ziel-rRNA hybridisiert, um die Auswirkung der Modifikation auf die T_m von Acridiniumester-Hybriden zu untersuchen. Sonde W enthielt keine Propin-Modifikationen. Sonde X enthielt zwei Propin-Modifikationen, eine direkt neben jeder Seite der Markeranheftungsstelle. Sonde Y enthielt 11 Propin-Modifikationen, einschließlich vier aneinandergrenzenden Modifikationen direkt neben der und 5' zu der Markeranheftungsstelle und sieben Modifikationen, die sich an Basen befanden, die 3, 4, 6, 9 – 11 und 14 Basen von der Markeranheftungsstelle entfernt und 3' zu dieser angeordnet waren.
Die Hybridisierung und die T_m-Bestimmungen wurden wie oben beschrieben mit Nachweis von mit Acridiniumester markierten Hybriden durchgeführt. Wie unten in Tabelle 26 zusammengefasst ist, zeigen diese Daten an, dass die T_m des Oligonukleotids, wenn es an ein RNA-Ziel hybridisiert wird, um durchschnittlich 1 °C für jeden Austausch eines Pyrimidins durch ein mit Propin substituiertes Pyrimidin anstieg. Tabelle 26
Beispiel 21: Auswirkung von Propin-Modifikationen auf die Hybridisierungskinetik von Oligonukleotiden
Um die Auswirkung von Propingruppen auf die Hybridisierungskinetik von Oligonukleotiden zu untersuchen, wurde die Rate der Hybridisierung der mit Propin markierten Sonden von Beispiel 20 an RNA mittels C_ot-Analyse untersucht, wie in Beispiel 6 beschrieben. Wie unten in Tabelle 27 zusammengefasst ist, hybridisierte die Sonde, die zwei Propingruppen enthielt (Sonde W), mit derselben Rate wie die Sonde, die keine Propingruppen enthielt (Sonde X), wohingegen die Sonde, die 11 Propingruppen enthielt (Sonde Y), 1,9-mal schneller hybridisierte.
Tabelle 27
Diese Daten unterstützen die Allgemeingültigkeit der vorliegenden Erfindung, indem sie demonstrieren, dass Modifikationen an Oligonukleotiden, die in einer erhöhten T_m resultieren, außerdem bewirken, dass die Rate der Hybridisierung des modifizierten Oligonukleotids an sein Ziel im Vergleich zu einem unmodifizierten Oligonukleotid mit derselben Basensequenz ansteigt. Darüber hinaus demon striert dieses Beispiel zudem, dass solche Modifikationen im Stickstoffbasenteil als auch im Zuckerteil erfolgen können. Fachmänner werden erkennen, dass solche Modifikationen ebenfalls auch in der Verknüpfung zwischen den Nukleotiden erfolgen können.
Obgleich die vorstehende Offenbarung die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschreibt, sollte der Anmelder nicht darauf beschränkt werden. Fachmänner, an die sich diese Erfindung wendet, werden angesichts dieser Offenbarung weitere Ausführungsformen verstehen. Darüber hinaus liegen weitere Ausführungsformen innerhalb der Ansprüche, die diese Patentschrift abschließen, und ihrer Äquivalente. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines 2'-O-Methyl-modifizierten Oligonukleotids mit einer bekannten Nukleotidsequenz als eine Sonde für eine gefaltete Zielsequenz von rRNA, tRNA oder viraler RNA, die in einer Probe vorliegt, die Nicht-Ziel-Nukleinsäure enthält, wobei das modifizierte Oligonukleotid mehr als 4 aneinandergrenzende Nukleotide aufweist, die modifiziert wurden, um eine 2'-O-Methyl-Substitution zu enthalten, und wobei die Hybridisierungsrate zwischen dem modifizierten Oligonukleotid und dem Ziel höher als die Hybridisierungsrate zwischen dem unmodifizierten Oligonukleotid und dem Ziel ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei im Wesentlichen alle Nukleotide des Oligonukleotids modifiziert sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine unmarkierte Helfersonde zusammen mit dem modifizierten Oligonukleotid verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Ribofuranosyl-Teil des Oligonukleotids modifiziert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Oligonukleotid mit einem konjugierten Molekül verbunden ist, wobei das konjugierte Molekül die Funktion ausübt, die Bindungsaffinität und die Hybridisierungsrate des Oligonukleotids gegenüber dem Ziel zu erhöhen, wobei das konjugierte Molekül aus der Gruppe bestehend aus kationi schen Aminen, interkalierenden Farbstoffen, Antibiotika, Proteinen, Peptidfragmenten und Metallionenkomplexen ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Oligonukleotid zwischen 10 und 100 Basen lang ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Oligonukleotid zwischen 10 und 15 Basen lang ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Oligonukleotid weiterhin einen Marker enthält.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Marker ein chemilumineszierendes Agens oder ein fluoreszierendes Agens ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Probe einem Amplifikationsvorgang unterzogen wurde.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Oligonukleotid direkt oder indirekt an einem festen Träger immobilisiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Probe aus einer klinischen Quelle, einer Nahrungsmittelquelle oder einer Umweltquelle erhalten wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 12, wobei die Sonde und ein beliebiger Sonden/Ziel-Komplex frei in Lösung sind.