CN114096683A - 用于确定样品中***毛滴虫的存在的寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
用于多重扩增和/或检测***毛滴虫的方法。多阶段扩增提供快速、定量、灵敏的检测，且在低分析物浓度下具有较低变异性。描述了可用于扩增和确定测试样品中***毛滴虫的存在的检测探针、捕获探针、扩增寡核苷酸、核酸组合物、探针混合物、方法和试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C§119(e)要求于2019年7月3日提交的临时申请号62/870,308的优先权益，所述临时申请的全部内容特此通过引用并入本文。
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背景技术
***毛滴虫(Trichomonas vaginalis)是引起***滴虫病的原生动物寄生虫，所述毛滴虫病是最常见的和可治疗的性传播疾病之一。在全球范围内，***毛滴虫每年感染约1.8亿人，通常是通过人与人之间的直接接触，使其成为最常见的性传播疾病(STD)病原体。在美国，据信***毛滴虫每年感染约700万人。尽管它很流行，但没有积极的控制或预防计划。众所周知，女性感染会导致***炎、尿道炎和***。并发症包括早产、后代出生体重低、胎膜早破以及流产后和子宫切除术后感染。据报道，这与***、输卵管***和***有关。***毛滴虫也被认为是HIV和其他STD病原体传播的辅助因素。该生物体也可以在穿过产道期间传给新生儿。在男性中，***滴虫病的症状包括尿道分泌物、尿道狭窄、***、尿急和排尿时有灼烧感。据估计，10-50％的***毛滴虫感染在女性中是无症状的。这个数字在男性中可能更高。
鉴于其相对流行以及与其他STD相关，人们对有效诊断***滴虫病越来越感兴趣。细胞培养被认为是目前临床检测***毛滴虫的“金标准”。然而，由于其相对脆弱的性质，培养生物体在技术上具有挑战性，并且通常需要长达7天才能达到最大灵敏度。即便如此，细胞培养方法的灵敏度估计也只有约85-95％。
发明内容
描述了用于多阶段(包括双阶段)扩增和/或检测***毛滴虫的寡核苷酸和组合物以及使用所述寡核苷酸和组合物的方法。在一些实施例中，描述了用于扩增和/或检测样品中的***毛滴虫的寡核苷酸和组合物以及使用所述寡核苷酸和组合物的方法。在多阶段扩增中，使靶标核酸序列的至少一部分在不支持靶标核酸序列指数扩增的条件下经历第一阶段扩增反应。第一阶段扩增反应产生第一扩增产物，随后使其在允许第一扩增产物指数扩增的条件下经历第二阶段扩增反应，从而产生第二扩增产物。与单阶段形式相比，多阶段扩增在低端分析物浓度下提高了灵敏度和精度。多阶段扩增在精度和更短的检测时间方面都具有卓越的性能。
在一些实施例中，***毛滴虫靶标核酸序列的多阶段扩增包括：
a)将含有或疑似含有***毛滴虫靶标核酸序列的样品与靶标捕获混合物接触，其中所述靶标捕获混合物包含含有RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(启动子引物)和任选的靶标捕获寡核苷酸(TCO)，以形成预扩增杂交体；
b)分离所述预扩增杂交体；
c)使所述预扩增杂交体与第一阶段扩增混合物接触；其中所述第一阶段扩增混合物包含：含有非RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(非启动子引物)；逆转录酶、RNA聚合酶、dNTP和NTP，其中所述第一阶段扩增混合物缺乏指数扩增所需的至少一种组分；
d)在支持线性扩增条件下，在基本上等温的转录相关扩增反应中扩增所述预扩增杂交体的靶标核酸序列的至少一部分，以形成第一扩增产物；
e)使所述第一扩增产物与第二阶段扩增混合物接触，其中所述第二阶段扩增混合物包含含有RNA聚合酶启动子的寡核苷酸或所述第一阶段扩增混合物中缺乏的指数扩增所需的至少一种组分；
f)在基本上等温的转录相关扩增反应中以指数方式扩增所述第一扩增产物，以产生第二扩增产物；和
g)检测第二扩增产物。
在一些实施例中，第二阶段扩增混合物含有检测寡核苷酸。
在一些实施例中，***毛滴虫靶标核酸序列包含由SEQ ID NO:173表示的含有***毛滴虫16S rRNA核苷酸序列的一部分的核苷酸序列或其互补序列。
在一些实施例中，靶标捕获寡核苷酸(TCO)包含：与靶标核酸序列的区域和固定的捕获探针结合区域互补的靶标特异性(TS)序列。固定化捕获探针结合区可以是但不限于核酸序列。在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:39、40或41或其互补序列。在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:1、2或3或其互补序列。
在一些实施例中，启动子引物是扩增寡核苷酸，其包含：3'靶标特异性序列和包含RNA聚合酶启动子序列的5'启动子序列。3'靶标特异性序列含有与靶标核酸区域(启动子引物结合位点)互补的区域并与靶标核酸杂交。启动子引物能够与其靶标核酸中的靶标序列(启动子引物结合位点)结合，并能够通过RNA或DNA依赖性聚合酶启动RNA或DNA的模板依赖性合成。启动子序列可以是但不限于T7启动子序列。在一些实施例中，启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47或48。在一些实施例中，启动子引物包含SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12。
在一些实施例中，预扩增杂交体包含与启动子引物杂交的靶标核酸。在一些实施例中，预扩增杂交体包含与TCO和启动子引物中的每一者杂交的靶标核酸。在一些实施例中，分离预扩增杂交体包括使用固体支持物捕获预扩增杂交体。在一些实施例中，固体支持物包括固定的捕获探针。固体支持物可以是但不限于可磁性吸引的颗粒。在一些实施例中，分离预扩增杂交体包括去除未与靶标核酸杂交的启动子引物。
在一些实施例中，非启动子引物(也称为NT7引物)是在启动子-引物端下游的启动子引物延伸的cDNA产物中特异性结合其靶标序列的扩增寡核苷酸。启动子引物与非启动子引物组合以形成扩增对并一起被构造成扩增靶标核酸的一部分。非启动子引物缺乏启动子引物的RNA聚合酶启动子序列。在一些实施例中，非启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54或55。在一些实施例中，非启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19。
在一些实施例中，在第一阶段等温转录相关扩增反应期间，在其靶标序列处与靶标核酸特异性结合的启动子引物使用靶标核酸作为模板通过逆转录酶(RT)延伸以产生cDNA拷贝。然后使用cDNA作为模板，酶促延伸非启动子引物以产生双链DNA。接下来，以双链DNA作为模板以从启动子引物提供的RNA聚合酶启动子进行RNA转录。然后非启动子引物与RNA结合，并被逆转录酶延伸以产生第一扩增产物。在没有额外启动子引物的情况下，不会发生指数扩增。然后将第一扩增产物与第二阶段扩增混合物接触以启动指数第二阶段扩增。
在一些实施例中，第一阶段和第二阶段等温转录相关扩增反应中的每一个都包括RNA聚合酶和逆转录酶。在一些实施例中，逆转录酶包括内源性RNA酶H活性。
在一些实施例中，检测寡核苷酸含有与存在于第二扩增产物中的核碱基序列互补的靶标特异性(TS)序列。检测寡核苷酸靶标特异性序列长度为10个或更多个核碱基。在一些实施例中，检测寡核苷酸靶标特异性序列长度为10-30个核碱基。在一些实施例中，检测寡核苷酸含有可检测分子。在一些实施例中，可检测分子包含荧光团。在一些实施例中，检测寡核苷酸含有荧光团和猝灭剂。检测寡核苷酸可以是但不限于Torch。检测寡核苷酸可以是DNA、RNA或DNA和RNA的组合。检测寡核苷酸还可以具有一种或多种修饰的核苷酸，包括但不限于甲氧基RNA。在一些实施例中，Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61或62。在一些实施例中，Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28。
在一些实施例中，适用于***毛滴虫多阶段扩增的第一阶段扩增的组合物包含：(a)任选的靶标捕获寡核苷酸，(b)与***毛滴虫靶标核酸序列的第一部分杂交的启动子引物；(c)非启动子引物；以及(d)在线性第一阶段扩增反应期间扩增靶标核酸所必需的额外组分，但缺乏靶标核酸序列指数扩增所需的至少一种组分。在一些实施例中，缺乏指数扩增所需的至少一种组分是额外(游离)启动子引物。在一些实施例中，第一阶段扩增缺乏未与靶标核酸杂交的启动子引物。额外组分可包括以下一种或多种：RNA依赖性DNA聚合酶、RNA聚合物、dNTP、NTP、缓冲液和盐。
在一些实施例中，适用于***毛滴虫多阶段扩增的第二阶段或后续阶段扩增的组合物包含：(a)第一扩增产物，(b)启动子引物，(c)非启动子引物，(d)在指数第二阶段扩增反应期间扩增靶标核酸所必需的其他必要组分。额外组分可包括以下一种或多种：RNA依赖性DNA聚合酶、RNA聚合物、dNTP、NTP、缓冲液和盐。
在一些实施例中，描述了用于***毛滴虫的多阶段扩增和/或检测的方法。这些方法包括：
(a)在允许启动子引物与靶标核酸序列的第一部分杂交的条件下，将含有或疑似含有***毛滴虫靶标核酸的样品与对靶标核酸序列的第一部分具有特异性的启动子引物接触，从而产生包含第一扩增寡核苷酸和靶标核酸序列的预扩增杂交体；
(b)通过将靶标捕获到固相支持物上来分离预扩增杂交体，然后洗涤以去除未与步骤(a)中靶标核酸序列的第一部分杂交的任何启动子引物；
(c)在第一阶段扩增反应混合物中在支持其线性扩增但不支持其指数扩增的条件下在第一阶段、基本上等温的、转录相关的扩增反应中扩增步骤(b)中分离的预扩增杂交体的靶标核酸序列的至少一部分(即第一阶段扩增反应混合物缺乏第一扩增产物的指数扩增所需的至少一种组分)，从而得到包含第一扩增产物的反应混合物；
(d)将包含第一扩增产物的反应混合物与第一扩增产物的指数扩增所必需但包含第一扩增产物的反应混合物中缺乏的至少一种组分组合，以产生第二阶段扩增反应混合物；
(e)在基本上等温的转录相关扩增反应中，在第二阶段扩增混合物中以指数方式扩增第一扩增产物，以产生第二扩增产物；和
(f)任选地检测第二扩增产物。
在一些实施例中，第一扩增产物的指数扩增所必需的至少一种组分包括引物启动子(例如，除了与靶标核酸杂交并作为预扩增杂交体的一部分分离的启动子引物之外的启动子引物)。在一些实施例中，步骤(c)的第一扩增产物是与样品中的靶标核酸序列具有相同极性的cDNA分子，并且步骤(e)的第二扩增产物是RNA分子。可以使用序列特异性检测探针检测第二扩增产物。序列特异性检测探针可以是但不限于当与第二扩增产物杂交时产生可检测信号的构象敏感探针。在一些实施例中，步骤中的序列特异性检测探针是荧光标记的序列特异性杂交探针。检测可以以规律时间间隔进行。在一些实施例中，检测是实时进行的。在一些实施例中，检测第二扩增产物包括使用线性校准曲线定量样品中的靶标核酸序列。
在一些实施例中，所述寡核苷酸、组合物和方法可用于检测样品中存在的小于或等于10个细胞/ml、小于或等于1个细胞/ml、小于或等于0.1个细胞/ml或小于或等于0.01个细胞/ml拷贝的***毛滴虫16SrRNA。在一些实施例中，所述寡核苷酸、组合物和方法可用于检测具有0.002或更多个细胞/ml的样品中的***毛滴虫16S rRNA。在一些实施例中，当***毛滴虫以0.002或更多个细胞/ml存在于样品中时，使用所述寡核苷酸的检测率大于或等于90％或大于等于95％。
在一些实施例中，所述寡核苷酸、组合物和方法适用于在多重多阶段反应中扩增和/或检测***毛滴虫。多重多阶段反应可用于检测***毛滴虫和一种或多种其他靶标序列和/或生物体。在一些实施例中，描述了CV/TV多重测定。CV/TV多重测定含有用于捕获、扩增和检测白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropicalis)、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)、***滑念珠菌(C.parapsilosis)、光滑念珠菌(C.glabrata)和***毛滴虫的寡核苷酸。
附图说明
图1示出多阶段(包括双阶段)正向转录介导的扩增(TMA)的流程图。在该实施例中，含有T7启动子的扩增引物(“T7引物”)在靶标捕获期间与靶标核酸序列杂交，随后去除过量的T7引物。扩增过程分为至少两个不同的阶段。在第一阶段期间，除了额外的T7引物(RT：逆转录酶；T7：T7 RNA聚合酶)外，还引入NT7引物以及所有必需的扩增和酶试剂(分别为AR和ER)。在逆转录酶存在的情况下，与靶标杂交的T7引物延伸，产生cDNA拷贝，并且靶标RNA模板被RT的RNA酶H活性降解。NT7引物随后与cDNA杂交，并且然后延伸，填充T7引物的启动子区域并创建有活性的双链模板。然后T7聚合酶由模板产生多个RNA转录物。NT7引物随后与RNA转录物杂交并延伸，产生靶标RNA模板的无启动子cDNA拷贝。RNA链随后被RT的RNA酶活性降解。由于第1阶段扩增混合物中没有额外T7引物，所以反应无法进一步进行。然后通过添加T7引物开始第二阶段，从而启动第1阶段中产生的cDNA库的指数扩增。
具体实施方式
为了本公开清楚起见，而不是作为限制，本发明的具体实施方式分为以下小节。
A.定义
本文中所提及的所有专利案、申请案、公开申请案和其它公开案均以全文引用的方式并入。在不同的内容可能在不同的时间与同一引用相关联的程度上，意指与实际申请日期的引用相关联的内容。实际申请日期是指公开所述引用的最早优先权日。除非由上下文中清楚本发明的任何要素、实施例、步骤、特性或方面可以彼此组合执行，否则如果本节中给出的定义与通过引用方式并入本文的专利案、申请案、公开申请案和其它公开案中给出的定义相反或不一致，则本节中给出的定义优先于通过引用并入本文的定义。
如本文中所使用，“一”意指“至少一个”或“一个或多个”。
贯穿整个说明书和权利要求书的近似语言可用于修饰任何定量或定性表示，这些表示可以允许变化而不导致与其相关的基本功能发生变化。因此，由诸如“约”或“大约”之类的术语修饰的值不限于指定的精确值，并且可以包括与指定值不同的值。在一些实施例中，约或大约表示不显着的变化和/或小于5％的变化。
“样品”是含有或疑似含有感兴趣分析物，例如微生物、病毒、核酸例如基因(例如靶标核酸)或其组分的样本或物质，其包括在分析物中或源自分析物的核酸序列。样品可以来自任何来源，例如但不限于生物样本、临床样本和环境来源。生物样本包括但不限于源自活的或死的生物体的组织或材料，其可能含有分析物或在分析物中或源自分析物的核酸。生物样品的实例包括但不限于呼吸组织、渗出液(例如支气管肺泡灌洗液)、活检物、痰液、气管抽吸物、唾液、粘液、外周血、血浆、血清、***、脑脊液，胃肠道组织、粪便、尿液、泌尿生殖***、生物体液、组织或材料以及活检物，包括但不限于来自或源自生殖器病变、***生殖器病变、口腔病变、皮肤粘膜病变、皮肤病变、眼部病变或其组合的样本。环境样品的实例包括但不限于水、冰、土壤、泥浆、碎片、生物膜、大气尘粒和气溶胶。样品还可以包括体外细胞培养成分的样品，所述细胞培养成分包括例如由于培养基中细胞和组织的生长而产生的条件培养基。样品可以是处理的样本或材料，例如通过使用过滤、离心、沉降或粘附到介质(例如基质或支持物)处理样品而获得的。样品的其他处理可包括但不限于以物理或机械方式破坏组织、细胞聚集体或细胞以将包括核酸的细胞内组分释放到可能含有其他组分的溶液中的处理，所述其他组分例如但不限于酶、缓冲液、盐、去污剂等。
术语“接触”意指将两个或更多个组分放在一起。接触可以通过将所有组分混合在流体或半流体混合物中来实现。当将一种或多种组分与固体表面诸如固体组织切片或基材上的一种或多种其他组分物理接触时，也可以实现接触。
“核酸”是指多核苷酸化合物(包括寡核苷酸)，其包含通过标准磷酸二酯键或其他键共价连接的具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷或核苷类似物。核酸包括RNA、DNA、嵌合DNA-RNA聚合物或其类似物。在核酸中，主链可以由多种键构成，包含但不限于以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯键、肽-核酸(PNA)键(PCT公开号：WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸中的糖部分可以是但不限于核糖、脱氧核糖或具有取代例如2'甲氧基和2'卤化物(例如2'-F)取代的类似化合物。含氮碱基可以是但不限于常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如肌苷；《核酸生化(The Biochemistry of the NucleicAcids)》5-36，亚当斯(Adams)等人编，第11版,1992)、嘌呤或嘧啶碱基的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂-嘧啶、在各种化学位置具有改变的或置换取代基的嘧啶或嘌呤，例如2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶，或吡唑并-化合物，例如未取代的或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶(例如，美国专利第5,378,825号、第6,949,367号和PCT公布第WO 93/13121号))。核酸可以包括“无碱基”位置，其中主链在一个或多个位置不具有含氮碱基(美国专利第5,585,481号)，例如，一个或多个无碱基位置可以形成将单独的寡核苷酸序列连接在一起的接头区域。核酸可以仅包含在常规RNA和DNA中发现的常规糖、碱基和键，或者可以包括常规组分和取代物(例如，由2'甲氧基主链连接的常规碱基，或者包含常规碱基和一种或多种类似物的混合物的核酸)。所述术语包括“锁核酸”(LNA)，它含有一个或多个LNA核苷酸单体，其中双环呋喃糖单元锁定在RNA模拟糖构象中，这增强了对ssRNA、ssDNA或dsDNA中互补序列的杂交亲和力(Vester等人，2004，《生物化学(Biochemistry)》43(42):13233-41)。核酸可包含修饰的碱基。修饰的碱基可以改变核酸的功能或行为。除非另有说明，否则特别是在权利要求中对“序列SEQ ID NO:X”的提及是指相应序列列表条目的碱基序列，并且不需要主链的身份(例如，RNA、2’-O-Me RNA或DNA)或碱基修饰(例如，胞嘧啶残基的甲基化)。
“靶标核酸”或“靶标”是含有靶标核酸序列的核酸。“靶标核酸序列”、“靶标序列”或“靶区”是特定脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，其包含待扩增的靶标生物体诸如***毛滴虫的核苷酸序列。靶标序列或其互补序列含有与用于扩增和/或检测所述靶标核酸的捕获寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或检测寡核苷酸杂交的序列。除了可能不被扩增的靶标序列之外，靶标核酸可包含其它序列。靶标核酸可以是DNA或RNA并且可以是单链或双链的。靶标核酸可以是但不限于基因组核酸，转录的核酸，例如rRNA，或衍生自基因组或转录的核酸的核酸。
“寡核苷酸(oligonucleotide)”、“寡聚物”或“寡核苷酸(oligo)”是由偶联在一起的两个或更多个核苷亚基或核碱基亚基组成的聚合物。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA及其类似物。在一些实施例中，寡核苷酸的大小范围具有5至15nt下限和50至500nt上限。在一些实施例中，寡核苷酸的大小范围为10-100nt、10-90nt、10-80nt、10-70nt或10-60nt。寡核苷酸不由野生型染色体DNA或其体内转录产物组成。寡核苷酸可以通过使用任何熟知的体外化学或酶促方法合成制备，并且可以在合成后通过使用标准方法例如高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。所描述的寡核苷酸包括含有RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(也称为启动子引物；例如，T7引物)、含有非RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(例如，NT7引物，也称为非启动子引物)、检测探针寡核苷酸(也称为检测寡核苷酸或检测探针；例如，Torch)和靶标捕获寡核苷酸(TC寡核苷酸)。N7和NT7引物是引物寡核苷酸，并且可称为“扩增寡核苷酸”。
核苷亚基的糖基团可以是核糖、脱氧核糖及其类似物，包括例如具有2'-取代的核糖核苷，包括但不限于例如甲氧基RNA。(包含具有2'取代的核苷亚基并且可用作检测探针、捕获探针和/或扩增寡核苷酸的寡核苷酸由贝克尔(Becker)等人，“用于使用修饰的引物扩增靶标核酸的方法(Method for Amplifying Target Nucleic Acids Using ModifiedPrimers)”，美国专利第6,130,038号公开)。核苷亚基可以通过诸如磷酸二酯键、修饰的键或不阻止寡核苷酸与其互补靶标核酸序列杂交的非核苷酸部分的键连接。修饰的键包括其中标准磷酸二酯键被不同键置换的那些键，例如硫代磷酸酯键或甲基膦酸酯键。核碱基亚基可以例如通过用假肽主链置换DNA的天然脱氧核糖磷酸主链来连接，所述假肽主链例如2-氨基乙基甘氨酸主链，其通过羧甲基接头将核碱基亚基偶联至中心仲胺。(具有假肽主链的DNA类似物通常称为“肽核酸”或“PNA”，并且由尼耳森(Nielsen)等人，“肽核酸(PeptideNucleic Acids)”，美国专利第5,539,082号公开。)寡核苷酸或寡聚体的其他非限制性实例。本公开涵盖任何核酸类似物，条件是修饰的寡核苷酸可以在严格杂交条件或扩增条件下与靶标核酸杂交。在检测探针的情况下，修饰的寡核苷酸还必须能够在严格杂交条件下优先与靶标核酸杂交。所描述的寡核苷酸被构造成与来源于***毛滴虫或念珠菌靶标核酸的***毛滴虫或念珠菌靶标核酸或核酸序列特异性杂交。
序列同一性可以通过使用算法对比序列来确定(如威斯康星州麦迪逊575科学博士Genetics Computer Group的威斯康星州遗传学软件包7.0版中的BESTFIT、FASTA和TFASTA)，使用默认空位参数或通过检查和最佳对齐来确定(即在比较窗口中导致最高的序列相似性百分比)。序列同一性百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，再将匹配位置的数目除以总数而得出的匹配和不匹配位置的数量不计算比较窗口中的空位(即窗口大小)，并将结果乘以100即可得出序列同一性的百分比。除非另有说明，否则两个序列之间的比较窗口是由两个序列中较短的一个的全长定义的。
术语“互补性”是指多核苷酸通过传统的沃森-克里克Watson-Crick或其他非传统类型与另一个多核苷酸序列形成氢键(杂交)的能力。互补性百分比表示第一条核酸序列中连续链中碱基的百分比，该序列可以与第二核酸序列形成氢键(例如Watson-Crick碱基对)(例如5/10、6/10、7/10、8/10、9/10、10/10为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。互补性百分比的计算方法类似于识别百分比。
“严格杂交条件”或“严格条件”意指允许寡核苷酸优先与靶标核酸(例如来源于***毛滴虫的rRNA或rDNA)杂交，而不是与衍生自密切相关的非靶标微生物的核酸杂交的条件。严格杂交条件可根据包括GC含量和探针长度、探针序列与可能存在于测试样品中的非靶标序列的序列之间的相似度以及靶标序列在内的因素而变化。杂交条件包括杂交试剂或溶液的温度和组成。
靶标核酸的“扩增”是指在体外产生与靶标核酸序列的至少一部分相同和/或互补的靶标核酸的多个拷贝的过程。核酸扩增程序的实例包括转录介导的扩增(TMA，美国专利第5,399,491号、第5,554,516号、第5,437,990号、第5,130,238号、第4,868,105号和第5,124,246号，其通过引用并入本文)。
“单阶段扩增”是指当扩增开始时，核酸扩增所需的所有组分都存在于反应混合物中的核酸扩增反应。在单阶段扩增中，与所需扩增反应一起开始的不需要的副反应通常会与所需扩增反应竞争并降低其整体性能。在多重单阶段扩增反应中，反应混合物中以较高量存在的分析物或总体扩增效率高于其他分析物的分析物的扩增与混合物中其他分析物的扩增过度竞争并降低其他分析物的扩增。
“扩增产物”意指在核酸扩增反应中产生且来源于靶标核酸或本身来源靶标核酸的核酸的核酸分子。扩增产物含有所有或一部分靶标核酸序列，其可以与靶标核酸同义或反义。
“线性扩增”是指被设计为与反应中靶标核酸的量成线性比例地产生靶标核酸的增加的扩增机制。例如，可以使用转录相关反应由DNA靶标制备多个RNA拷贝，其中拷贝数的增加可以通过线性因子(例如，模板的起始拷贝数×n)描述。在一些实施例中，在第二阶段扩增反应开始之前，多阶段扩增程序中的第一阶段线性扩增使靶标核酸链或其互补链的起始数目增加至少10倍、至少100倍或至少1,000倍。线性扩增***的实例是“基于T7的DNA线性扩增(T7-based Linear Amplification of DNA)”(TLAD；参见Liu等人，BMC基因组学(BMC Genomics)，4:文章编号19，2003年5月9日)。本文公开了其他方法。因此，术语“线性扩增”是指不导致靶标核酸序列指数扩增的扩增反应。术语“线性扩增”不是指简单地制造核酸链的单个拷贝的方法，诸如将RNA分子转录成单个cDNA分子，如在逆转录(RT)-PCR的情况中那样。
“指数扩增”是指被设计为与反应中靶标核酸的量成几何比例地产生靶标核酸的增加的核酸扩增。例如，PCR为每个原始靶链和存在的每个合成链产生一条DNA链。类似地，转录相关的扩增为每个原始靶链和每个随后合成的链产生多个RNA转录物。扩增是指数的，因为在随后的扩增轮次中合成的链被用作模板。扩增反应实际上不需要产生指数增加的量的被认为是指数扩增的核酸，只要扩增反应被设计为产生这样的增加即可。
术语“基本上等温的扩增”是指在基本恒定的温度下进行的扩增反应。在反应的等温部分之前或之后可以在可变温度下进行一个或多个步骤，例如第一变性步骤和最终热灭活步骤或冷却步骤。应当理解，该定义不排除温度的微小变化，而是用于将等温扩增技术与本领域已知的基本上依赖于“循环温度”以产生扩增产物的其他扩增技术区分开来。例如，等温扩增与PCR不同之处在于，后者依赖于加热变性循环，然后在较低温度下进行引物杂交和聚合。
对值范围的引用还包括该范围内的整数和由该范围内的整数定义的子范围。
B.多阶段扩增方法
所公开的方法使用等温扩增***的方面，其通常被称为“转录相关扩增”方法，所述方法通过从核酸模板产生多个转录物来扩增靶标序列。此类方法通常使用一种或多种扩增寡核苷酸，其中一种提供RNA聚合酶启动子序列、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)以及具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶，以在靶标序列附近产生功能性启动子序列序列，并且然后从启动子转录靶标序列(例如参见美国专利第4,868,105号、第5,124,246号、第5,130,238号、第5,399,491号、第5,437,990号、第5,554,516号和第7,374,885号；以及PCT公开第WO 1988/001302号、第WO 1988/010315号和第WO 1995/003430号)。实例包括转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和自我持续序列复制(3SR)。
为了帮助理解本文公开的一些实施例，简要总结了之前已经详细描述的TMA方法(例如，美国专利第5,399,491号、第5,554,516号和第5,824,518号)。在TMA中，含有待扩增序列的靶标核酸作为单链核酸(例如，ssRNA或ssDNA)提供。可以使用将双链核酸(例如，dsDNA)转化为单链核酸的任何常规方法。启动子引物(例如，T7引物)在其靶标序列处特异性结合靶标核酸，并且逆转录酶(RT)使用靶链作为模板延伸启动子引物的3'端以生成cDNA拷贝，从而得到RNA:DNA双链体。RNA酶活性(例如，RT酶的RNA酶H)消化RNA:cDNA双链体的RNA。第二引物(例如，NT7引物)在启动子-引物端的下游特异性结合其cDNA中的靶标序列。然后RT通过使用cDNA作为模板延伸第二引物的3'端来合成新的DNA链，以生成含有功能性启动子序列的dsDNA。对功能性启动子具有特异性的RNA聚合酶启动转录，以产生与初始靶链互补的多个(例如，100至1000个)RNA转录物(扩增的拷贝或扩增子)。第二引物与每个扩增子中的靶标序列特异性结合，并且RT从扩增子RNA模板生成cDNA，以产生RNA:cDNA双链体。RNA酶从RNA:cDNA双链体中消化扩增子RNA，并且启动子引物的靶标特异性序列与其在新合成的DNA中的互补序列结合，并且RT延伸启动子引物的3'端以及形成dsDNA的cDNA的3'端，所述dsDNA含有与RNA聚合酶结合的功能性启动子并将与靶链互补的额外扩增子转录。在反应过程中重复使用这些步骤的自催化循环会产生初始靶标序列的扩增。可以在扩增期间(实时检测)或在反应终点时(终点检测)通过使用与扩增子中含有的序列特异性结合的探针来检测扩增子。检测从结合的探针产生的信号表明样品中存在靶标核酸。
描述了使用多阶段扩增程序扩增和/或检测***毛滴虫的方法。所述方法包括扩增样品中的***毛滴虫靶标核酸序列，包括以下步骤。最初，使靶标核酸序列在不支持靶标核酸序列指数扩增的条件下经历第一阶段扩增反应。第一阶段扩增反应产生第一扩增产物，随后使其在允许第一扩增产物指数扩增的条件下经历第二阶段扩增反应，从而产生第二扩增产物。
***毛滴虫靶标核酸序列可以是任何RNA或DNA序列。在一些实施例中，靶标序列是RNA序列，例如mRNA或rRNA序列。在一些实施例中，***毛滴虫靶标核酸序列是由SEQ IDNO:173或其互补序列表示的16S rRNA序列。在一些实施例中，***毛滴虫靶标核酸序列包含SEQ ID NO:174或其互补序列或由其组成。在一些实施例中，***毛滴虫靶标核酸序列包含SEQ ID NO:175或其互补序列或由其组成。在一些实施例中，***毛滴虫靶标核酸序列由存在于SEQ ID NO:173、174或175中的核苷酸序列或其互补序列组成。
在一些实施例中，启动子引物靶向的靶标序列部分(启动子引物结合位点)可以不同于靶标捕获寡核苷酸(如果使用的话)靶向的部分(例如不重叠)。启动子引物结合位点可以完全或部分与靶标捕获寡核苷酸结合位点重叠或与其相同。在一些实施例中，靶标序列的扩增区域与靶标捕获结合位点部分或完全重叠。在一些实施例中，靶标序列的扩增区域不与靶标捕获结合位点重叠。
在一些实施例中，在第一扩增步骤之前，在允许启动子引物与样品中靶标核酸序列的一部分杂交的条件下，使样品与一种或多种启动子引物接触。启动子引物包含3'靶标特异性(TS)序列、RNA聚合酶启动子序列和任选的一个或多个标签序列。RNA聚合酶启动子序列被RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶识别。标签序列可以是但不限于扩增引物结合位点、用于捕获的特异性结合位点或测序引物结合位点。一种或多种启动子引物可以靶向相同或不同的靶标核酸序列。不同的靶标核酸序列可以来自相同或不同的生物体。
在一些实施例中，可能期望在第一阶段扩增之前分离靶标核酸序列。为此，样品可以在允许靶标捕获寡核苷酸与靶标核酸序列的一部分(TCO结合位点)杂交的条件下与靶标捕获寡核苷酸接触。在一些实施例中，靶标核酸被直接捕获到固体支持物上，例如通过与固定的捕获探针相互作用。在一些实施例中，靶标核酸作为三分子复合物(预扩增杂交体)的成员被捕获到固体支持物上，其中靶标捕获寡核苷酸桥接靶标核酸和固定的捕获探针。在一些实施例中，固体支持物包含多个可使用磁场操纵的磁性或可磁化颗粒或珠粒。分离靶标核酸序列的步骤可包括洗涤靶标捕获寡核苷酸:靶标核酸序列杂交体以去除可能干扰后续扩增的不需要的组分。分离靶标核酸序列的步骤还可包括洗涤靶标捕获寡核苷酸:靶标核酸序列杂交体以基本上去除过量的未与靶标核酸杂交的启动子引物。
在一些实施例中，分离靶标核酸序列的步骤包括在允许启动子引物和TCO与靶标核酸序列杂交的条件下使样品与启动子引物和TCO接触。启动子引物靶向的靶标序列部分可以与靶标捕获寡核苷酸靶向的部分不同(例如不重叠)。启动子引物靶向的靶标序列部分可以与靶标捕获寡核苷酸靶向的部分完全或部分重叠，或甚至相同。启动子引物包含3'靶标特异性序列、RNA聚合酶启动子序列和任选的一个或多个标签序列。在一些实施例中，RNA聚合酶启动子序列被RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶识别。标签序列可以是但不限于扩增引物结合位点、用于捕获的特异性结合位点或测序引物结合位点。
在一些实施例中，一种或多种靶标捕获寡核苷酸和一种或多种启动子引物被提供在靶标捕获试剂(TCR混合物)中。一种或多种启动子引物可与一种或多种靶标核酸序列杂交以形成预扩增杂交体(连同TCO)并在靶标捕获步骤期间与一种或多种靶标核酸序列一起分离。该方法的一个优点是通过在靶标捕获期间将启动子引物与靶标核酸序列杂交，可以洗涤捕获的核酸以去除样品组分，包括未杂交的启动子引物。在多阶段反应中，去除未杂交的启动子引物可使第一阶段的扩增不受过量启动子引物的干扰，从而基本上减少或消除多重反应常见的问题。在单阶段多重扩增反应中，引物会相互干扰。在多重反应和多重反应中，过量的引物更容易发生错误引发(与非靶标核酸杂交)。在多重反应中，各种生物体各自都有自己的rRNA和寡核苷酸，错误引发是一个更大的问题。多阶段扩增通过在严格条件下将启动子引物与其预期靶标杂交，然后洗去过量的启动子引物来解决这些问题。多阶段扩增的第一阶段扩增反应中存在的所得1:1引物/靶标比率可以将靶标核酸群体提高到允许后续添加过量引物的水平，同时降低错误引发的水平或任何错误引发对扩增的作用。
第一阶段扩增反应在不支持靶标核酸序列指数扩增的条件下进行。在一些实施例中，第一阶段扩增反应是线性扩增反应。第一阶段扩增反应通常会产生约2倍至约10,000倍的扩增。在一些实施例中，第一阶段扩增反应将产生靶标核酸序列的约10倍至约10,000倍扩增。在一些实施例中，第一阶段扩增反应是基本上等温的，即它不涉及PCR和其他流行扩增技术的热循环特性。第一阶段扩增反应可在43±2℃、43±2℃、42±1℃、42±0.5℃、43±0.5℃、44±0.5℃、41-45℃或42-44℃下进行。
在一些实施例中，第一扩增反应涉及使靶标核酸序列与第一阶段扩增反应混合物(例如AMP混合物)接触来进行，所述第一阶段扩增反应混合物支持靶标核酸序列的线性扩增并且缺乏其指数扩增所需的至少一种组分。在一些实施例中，其指数扩增所需的至少一种组分是额外的或过量的启动子引物。在一些实施例中，AMP反应混合物包含一种或多种扩增酶。一种或多种扩增酶可以是但不限于：DNA聚合酶、RNA聚合酶或其组合。DNA聚合酶可以是但不限于RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)、DNA依赖性DNA聚合酶或其组合。在一些实施例中，AMP混合物还包含核糖核酸酶(RNA酶)，诸如RNA酶H或具有RNA酶H活性的逆转录酶。在一些实施例中，AMP混合物包含具有RNA酶H活性的逆转录酶和RNA聚合酶。RNA聚合酶可以是但不限于T7 RNA聚合酶。在一些实施例中，AMP混合物含有一种或多种含有非RNA聚合酶启动子的扩增寡核苷酸(例如，非启动子引物(即NT7引物))。一种或多种非启动子引物可以靶向相同或不同的靶标核酸序列。不同的靶标核酸序列可以来自相同或不同的生物体。在一些实施例中，AMP混合物包含：一种或多种非启动子引物、RNA聚合酶、核糖核苷酸三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。AMP混合物可以另外含有其他组分，包括但不限于缓冲液、dNTP、NTP和盐。
在一些实施例中，第一阶段扩增反应不能支持指数扩增反应，因为缺乏指数扩增所需的一种或多种组分，存在抑制指数扩增的试剂，和/或反应混合物的温度不利于指数扩增。缺乏指数扩增所需的一种或多种组分和/或抑制剂和/或反应条件没有限制地可以选自以下任一者：扩增寡核苷酸(例如，启动子引物、非启动子引物或其组合)、酶(例如聚合酶，诸如RNA聚合酶)、核酸酶(例如，核酸外切酶、核酸内切酶、切割酶、RNA酶、磷酸化酶、糖基化酶等)、酶辅因子、螯合剂(例如EDTA或EGTA)、核糖核苷酸三磷酸(NTP)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、Mg2+、盐、缓冲液、酶抑制剂、阻断寡核苷酸、pH、温度、盐浓度及其任何组合。在一些情况下，可以间接地涉及缺乏的组分，诸如逆转第一阶段反应中存在的指数扩增的抑制剂的作用的试剂。在一些实施例中，缺乏一种或多种组分是启动子引物(作为预扩增杂交体的一部分，过量的与靶标核酸杂交的启动子引物中的额外启动子引物)。
第二阶段(或较晚阶段，如果存在多于2个阶段)扩增反应在允许靶标核酸序列指数扩增的条件下进行。在一些实施例中，第二阶段扩增反应是指数扩增反应。在一些实施例中，第二阶段扩增反应是基本上等温的反应，例如像转录相关扩增反应或链置换扩增反应。在一些实施例中，第二阶段扩增反应是转录介导的扩增(TMA)反应。在一些实施例中，第二阶段扩增反应在43±2℃、43±2℃、42±1℃、42±0.5℃、43±0.5℃、44±0.5℃、41-45℃或42-44℃下进行。
在一些实施例中，第二(或稍后)阶段扩增包括使第一扩增产物与第二阶段扩增反应混合物(例如PRO混合物)接触，其与第一阶段扩增反应混合物组合支持靶标核酸序列的指数扩增。因此，第二阶段扩增反应混合物通常至少包含第一阶段扩增反应混合物中缺乏的指数扩增所需的一种或多种组分。在一些实施例中，第二阶段扩增反应混合物包含一种或多种选自以下的组分：扩增寡核苷酸(例如启动子引物)、逆转录酶、聚合酶、核酸酶、磷酸化酶、酶辅因子、螯合剂、核糖核苷酸三磷酸(NTP)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、Mg2+、最佳pH、最佳温度、盐及其组合。聚合酶可以是但不限于RNA依赖性DNA聚合酶(例如逆转录酶)、DNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶及其组合。在一些实施例中，第二阶段扩增反应混合物还包含RNA酶，诸如RNA酶H或具有RNA酶H活性的逆转录酶。在一些实施例中，第二阶段扩增反应混合物包含启动子引物、具有RNA酶H活性的逆转录酶和/或RNA聚合酶。在一些实施例中，第二阶段扩增反应混合物进一步包含检测寡核苷酸。检测寡核苷酸可以是但不限于Torch或分子信标。
在一些实施例中，靶标捕获试剂含有一种或多种靶标捕获寡核苷酸和一种或多种T7启动子引物，AMP试剂含有缓冲液、dNTP、NTP、盐和一种或多种非T7引物，启动子(PRO)试剂含有缓冲液、dNTP、NTP、盐、表面活性剂、一种或多种T7启动子引物和一种或多种Torch寡核苷酸，并且酶(ENZ)试剂含有缓冲液、去污剂、螯合剂、逆转录酶和DNA聚合酶。
本发明方法可用于检测和/或定量生物样品中的***毛滴虫靶标核酸序列。第二阶段扩增反应可以是定量扩增反应。还描述了用于检测第二扩增产物的方法。可以使用本领域已知的多种检测技术来检测和/或定量第二扩增产物。检测和/或定量可以通过使用例如检测探针、测序反应、电泳、质谱、熔解曲线分析或其组合来完成。在一些实施例中，使用检测探针检测和/或定量第二扩增产物。检测探针可以是但不限于分子torch(Torch，如US6,534,274中所述)、分子信标、杂交开关探针或其组合。在一些实施例中，检测和/或定量可以实时进行。检测探针可以以基本上相同的成功度包含在第一和/或第二阶段扩增反应中。检测探针可以提供在第一和/或第二阶段扩增反应混合物(例如，AMP混合物和/或PRO混合物)中。在一些实施例中，PRO混合物含有检测探针。检测探针可以包括Torch。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将第二扩增产物与另一团选自但不限于以下的一种或多种扩增组分接触的步骤：扩增寡核苷酸(启动子引物或非启动子引物)、逆转录酶(例如，具有RNA酶H活性的逆转录酶)、聚合酶(例如RNA聚合酶)、核酸酶、磷酸化酶、酶辅因子、螯合剂、核糖核苷酸三磷酸(NTP)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，Mg2+、盐及其组合。由于一些扩增反应组分可能会耗尽，因此该额外步骤可以促进第二阶段扩增反应。
所述方法可用于在多重反应中扩增和/或检测样品中的多个不同靶标核酸序列。在一些实施例中，对于多重反应，使多个靶标核酸序列在不支持任何靶标核酸序列指数扩增的条件下经历第一阶段扩增反应。第一阶段扩增反应产生多个第一扩增产物，随后使其在允许第一扩增产物指数扩增的条件下经历第二(和任选地稍后)阶段扩增反应，从而产生多个第二扩增产物。
在一些实施例中，提供了用于扩增样品中的多个不同靶标核酸序列的方法，其中一些但不是全部靶标核酸序列经历线性扩增，和/或一些但不是全部靶标核酸序列经历指数扩增。考虑了第一阶段扩增的至少四种变体：(1)一些靶标序列经历线性扩增，并且其余未扩增；(2)一些靶标序列经历指数扩增，并且其余未扩增；(3)一些靶标序列经历线性扩增，一些经历指数扩增，并且其余未扩增；并且(4)一些靶标序列经历线性扩增，并且其余经历指数扩增。在一些实施例中，第一阶段扩增可导致所有靶标核酸序列(选项4)或仅其子集(选项1-3)的扩增。靶标核酸序列的子集可以代表已知以相对低的量存在的靶标和/或与其他靶标相比难以扩增的靶标。第一阶段扩增反应产生一种或多种第一扩增产物。然后使样品中的第一扩增产物和任何未扩增的靶标核酸序列在允许其指数扩增的条件下经历第二阶段扩增反应，从而产生多个第二扩增产物。在一些实施例中，可以存在多于两个阶段，其中上述条件1-4可适用于除最终阶段之外的所有阶段，并且其中对于最后阶段，使样品中的任何未扩增或线性扩增的靶标核酸序列在允许其指数扩增的条件下经历扩增反应。
应当理解，上文与多阶段单重(即单靶标)扩增结合讨论的各种任选要素和参数也适用于本文所述的多阶段多路扩增模式。
C.用于***毛滴虫多阶段扩增的组合物
在一些实施例中，描述了用于捕获样品中的***毛滴虫靶标核酸序列的TCR混合物，其包含：(a)具有与靶标核酸序列杂交的区域的靶标捕获寡核苷酸(TCO)。在一些实施例中，TCR混合物进一步包含与靶标核酸序列杂交的启动子引物。在一些实施例中，TCR混合物任选地含有扩增酶。TCR混合物可用于从样品中分离和/或纯化靶标核酸序列。在一些实施例中，靶标核酸被分离为含有靶标核酸、TCO和启动子引物的预扩增杂交体。
“靶标捕获寡核苷酸”(TCO)包括通过使用结合对成员例如互补核酸序列或生物素和链霉抗生物素蛋白来桥接或连接靶标核酸和固定的捕获探针的核酸寡核苷酸。在一些实施例中，靶标捕获寡核苷酸非特异性地结合靶标核酸并将其固定到固体支持物。TCO含有与靶标核酸序列互补的序列区域，即靶标特异性(TS)序列。在一些实施例中，靶标捕获寡核苷酸与靶标核酸中的TCO结合序列特异性结合(杂交)。TCO靶标特异性序列包含与靶标核酸中存在的核苷酸序列具有至少90％、至少95％或100％互补性的10-35个核苷酸序列并且与靶标核酸序列中的区域(TCO结合位点)杂交。在一些实施例中，TCO靶标特异性序列的长度为20-30个核苷酸。在一些实施例中，TCO靶标特异性序列的长度为22-26个核苷酸并且与靶标核酸中存在的核苷酸序列具有至少90％互补性。TCO靶标特异性和TCO结合位点可能完全互补，或者也可能存在一个或多个错配。在两种方法中，靶标捕获寡核苷酸包含与固定捕获探针结合的固定捕获探针结合区(例如，通过特异性结合对相互作用)。特异性结合对(或结合伴侣)的成员是相互特异性识别和结合的部分。成员可被称为第一结合对成员(BPM1)和第二结合对成员(BPM2)，它们代表多个特异性结合在一起的部分。特异性结合对的示例例如是受体及其配体、酶及其底物、辅因子或辅酶、抗体或Fab片段及其抗原或配体、糖和凝集素、生物素和链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、配体和螯合剂试剂、蛋白质或氨基酸及其特异性结合金属诸如组氨酸和镍、基本上互补的多核苷酸序列(包括完全或部分互补的序列)以及互补的同聚序列。特异性结合对可以是天然存在的(例如酶和底物)、合成的(例如合成受体和合成配体)或天然存在的BPM和合成BPM的组合。在一些实施例中，靶标特异性序列和固定的捕获探针结合区都是核酸序列。靶标特异性序列和捕获探针结合区可以彼此共价连接，或者可以位于通过一个或多个接头连接的不同寡核苷酸上。在一些实施例中，捕获探针结合区包括：poly A序列、poly T序列或polyT-polyA序列。在一些实施例中，polyT-polyA序列包含dT3dA30。一种或多种靶标捕获寡核苷酸可用于靶标捕获和/或扩增反应。一种或多种靶标捕获寡核苷酸可以结合相同或不同的靶标序列。靶标序列可以来自相同或不同的基因和/或来自相同或不同的生物体。
“固定的捕获探针”提供了将靶标捕获寡核苷酸连接到固体支持物的方法。在一些实施例中，固定的捕获探针含有与固体支持物连接的碱基序列识别分子，这有助于将结合的靶多核苷酸与未结合的材料分离。可以使用任何已知的固体支持物，例如溶液中游离的基质和颗粒。例如，固体支持物可以是硝化纤维、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯和磁性可吸引颗粒。在一些实施例中，支持物包括单分散的磁性球体(即，尺寸±约5％中为均匀)。固定的捕获探针可以直接(例如，通过共价键或离子相互作用)或间接连接到固体支持物。有用的固体支持物的常见实例包括磁性颗粒或珠粒。
术语“靶标捕获”是指将靶标核酸与样品混合物的其他组分例如细胞片段、细胞器、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他核酸选择性地分开或分离。靶标捕获***可以是特异性的并将预定的靶标核酸与其他样品组分选择性分离(例如，通过使用对预期靶标核酸具有特异性的序列，例如TCO靶标特异性序列)，或者它可以是非特异性的并且通过使用靶标的其他特征(例如，将靶标核酸与不表现出物理特征的其他样品组分区分开来的靶标核酸的该物理特性)将靶标核酸与其他样品组分选择性地分离。先前已经详细描述了靶标捕获方法和组合物(美国专利第6,110,678号和第6,534,273号；以及美国公开第2008/0286775A1号)。在一些实施例中，靶标捕获利用溶液相中的靶标捕获寡核苷酸和连接到支持物的固定捕获探针，以与靶标核酸形成复合物并将捕获的靶标与其他组分分开。
术语“分开”、“分离”或“纯化”通常是指从混合物中的一种或多种其他组分中去除混合物例如样品的一种或多种组分。样品组分包括通常在一般为水性溶液相中的核酸，其可包括细胞碎片、蛋白质、碳水化合物、脂质和其它化合物。在一些实施例中，将至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的靶标核酸与混合物中的其他组分分离或去除。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:39、40或41或与SEQ ID NO:39、40或41具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，TCO的靶标特异性序列包含SEQID NO:39、40或41或与SEQ ID NO:39、40或41具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，TCO包含SEQ ID NO:39、40或41或与SEQ ID NO:39、40或41具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，TCO包含SEQ ID NO:39。在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQID NO:1、2或3或与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，TCO包含SEQ ID NO:1、2或3或与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，TCO的核苷酸序列由核苷酸序列SEQ ID NO:1、2或3或与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列组成。在一些实施例中，TCO由SEQ ID NO:1、2或3或与SEQ IDNO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列组成。
“扩增寡核苷酸”(或更简单地“引物”)是与靶标核酸或其互补序列杂交且参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增寡核苷酸含有与核酸模板(靶标核酸序列)互补并与模板复合(通过氢键或杂交)以产生适用于启动RNA或DNA依赖性聚合酶合成的引物:模板复合物的至少一个3'端。扩增寡核苷酸通过向其3'端添加共价键合的核苷酸碱基来延伸，这些碱基与模板互补。结果是引物延伸产物。扩增寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸。在一些实施例中，扩增寡核苷酸的长度至少为15个核苷酸。在一些实施例中，扩增寡核苷酸的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。扩增寡核苷酸在其3'端含有与靶标核酸区域(扩增引物结合位点)至少90％、至少95％或100％互补并杂交的靶标特异性(TS)序列。扩增寡核苷酸靶标特异性序列可以与靶标核酸的区域完全互补，或者它可以具有一个或多个错配，条件是扩增寡核苷酸能够通过RNA或DNA依赖性聚合酶启动模板依赖性合成。在一些实施例中，扩增寡核苷酸靶标特异性序列的长度至少为10个连续核苷酸。在一些实施例中，扩增寡核苷酸靶标特异性序列的长度至少为15个连续核苷酸。在一些实施例中，扩增寡核苷酸靶标特异性序列的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸。连续碱基可以与扩增寡聚物所结合的靶标序列至少90％、至少95％或完全(100％)互补。几乎所有已知的DNA聚合酶(包括逆转录酶)都需要将寡核苷酸与单链模板复合(“引发”)以启动DNA合成，而RNA复制和转录(从DNA复制RNA)通常不需要引物。
在一些实施例中，扩增寡核苷酸包含位于靶标特异性序列的5'的RNA聚合酶启动子序列。RNA聚合酶启动子序列可以是但不限于T7、T3或SP6启动子序列。含有T7 RNA聚合酶启动子序列的扩增寡核苷酸在本文中称为启动子引物。在一些实施例中，RNA聚合酶启动子序列是T7启动子序列(T7引物)。T7启动子序列的长度可为约25至30个核苷酸。示例性的T7启动子序列包括但不限于SEQ ID NO:65(5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3')和SEQ IDNO:66(5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3')。
在一些实施例中，启动子引物是T7引物。在一些实施例中，T7引物包含与SEQ IDNO:176的区域或其互补序列具有至少90％互补性的核酸序列。在一些实施例中，启动子引物含有与SEQ ID NO:176中的区域或其互补序列具有至少90％互补性的15-30个连续碱基。在一些实施例中，T7启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47或48或与SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47或48具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，T7引物的靶标特异性序列包含SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47或48或与SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47或48具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，T7启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12或与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，T7启动子引物包含SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12或与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，T7引物的核苷酸序列由核苷酸序列SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12或与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列组成。在一些实施例中，T7引物由SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12或与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列组成。
启动子引物(例如，T7引物)在其靶标序列处特异性结合靶标核酸，并且逆转录酶(RT)使用靶链作为模板延伸启动子引物的3'端以生成cDNA拷贝，从而得到RNA:DNA双链体。RNA酶活性(例如，RT酶的RNA酶H)消化RNA:cDNA双链体的RNA。
在一些实施例中，用于***毛滴虫靶标核酸序列线性扩增的第一阶段扩增混合物(AMP混合物)包含：含有非RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(也称为非启动子引物或NT7引物)；逆转录酶、RNA聚合酶、dNTP和NTP，其中第一阶段扩增混合物缺乏指数扩增所需的至少一种组分。RNA聚合物可以是T7 RNA聚合酶。AMP混合物另外含有在线性第一阶段扩增反应期间扩增靶标核酸所必需的必要组分，条件是不存在靶标核酸序列的指数扩增所需的至少一种组分。在一些实施例中，缺乏指数扩增所需的至少一种组分是额外的启动子引物。
在一些实施例中，NT7引物包含与SEQ ID NO:177的区域或其互补序列具有至少90％互补性的核酸序列。在一些实施例中，NT7引物含有与SEQ ID NO:177中的区域或其互补序列具有至少90％互补性的15-30个连续碱基。在一些实施例中，非启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54或55或与SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54或55具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，非启动子引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19或与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，非启动子引物包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19或与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，非启动子引物的核苷酸序列由核苷酸序列SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19或与SEQ IDNO:13、14、15、16、17、18或19具有至少90％同一性的核酸序列组成。在一些实施例中，非启动子引物由SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19或与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19具有至少90％同一性的核酸序列组成。
“检测寡核苷酸”、“检测探针”或“探针”是在促进核酸杂交的条件下与靶标序列(例如扩增产物)特异性杂交以检测靶标核酸或其扩增产物的寡核苷酸。检测可以是直接的(即，检测寡核苷酸直接与靶标杂交)或间接的(即，检测寡核苷酸与连接检测寡核苷酸与靶标的中间结构杂交)。检测寡核苷酸的靶标序列通常是指检测寡核苷酸与之特异性杂交的较大序列中的特定序列。检测寡核苷酸可包括靶标特异性序列和非靶标互补序列。此类非靶标互补序列可包括赋予期望的二级或三级结构(例如发夹结构)的序列，其可用于促进检测和/或扩增。(例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第5,925,517号；第6,150,097号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；以及美国专利申请公开第20060068417A1号和第20060194240A1号)。互补序列和非互补序列可以是连续的或通过接头连接。在一些实施例中，接头是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16接头。在一些实施例中，接头是C9接头。检测寡核苷酸可以是RNA、DNA，含有一种或多种修饰的核苷酸，或其组合。在一些实施例中，检测寡核苷酸含有一个或多个2'甲氧基核苷酸。在一些实施例中，检测寡核苷酸含有所有2'甲氧基核糖核苷酸。
在一些实施例中，检测寡核苷酸含有一种或多种可检测标记物或标记。可检测标记物可以是但不限于荧光分子。荧光分子可以附着在检测寡核苷酸的5'或3'端或沿着寡聚物的任何位置。在一些实施例中，检测寡核苷酸可以是分子信标或Torch。在一些实施例中，检测寡核苷酸可以是水解检测寡核苷酸。检测寡核苷酸可以含有连接到5'端的荧光分子和连接到3'端的猝灭剂。或者，可以将荧光分子连接到检测寡核苷酸的3'端，并且将猝灭剂连接到检测寡核苷酸的5'端。
“标记”或“可检测的标记”是指与被检测或导致可检测信号的检测寡核苷酸直接或间接地连接的部分或化合物。直接连接可以使用共价键或非共价相互作用(例如，氢键、疏水或离子相互作用，以及螯合物或配位复合物的形成)，而间接连接可以使用桥接部分或接头(例如，通过抗体或一种或多种额外的寡核苷酸，其扩增了可检测的信号。可以使用任何可检测部分，例如放射性核素、配位体(如生物素或抗生物素蛋白)、酶、酶底物、反应性基团、发色团(如赋予可检测颜色的染料或颗粒(例如乳胶或金属珠粒))、发光化合物(例如生物发光、磷光或化学发光化合物)以及荧光化合物(即，荧光团)。荧光团包括但不限于FAMTM、TETTM、CAL FLUORTM(橙色或红色)、QUASARTM、荧光素、六氯荧光素(HEX)、罗丹明、羧基-X-罗丹明(ROX)、四甲基罗丹明、IAEDANS、EDANS、DABCYL、香豆素、BODIPY FL、萤光黄、曙红、赤藓红、德克萨斯红、ROX、CY染料(如CY5)、花青5.5(Cy5.5)和荧光素/QSY7染料化合物。在一些实施例中，检测寡核苷酸在寡核苷酸的5'端和标记之间包含碱基间隔区。间隔区(或接头)可以是烷基。荧光团可与猝灭剂分子组合使用，所述猝灭剂分子在紧邻荧光团时吸收光以减少背景荧光。此类猝灭剂包括但不限于
猝灭剂
BLACKHOLE QUENCHERTM(或BHQTM，包括但不限于，黑洞猝灭剂-2(BHQ2))或TAMRATM化合物。可结合本发明使用的相互作用供体/受体标签对的实例，不试图区分FRET与非FRET对，包括但不限于荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/DABCYL、香豆素/DABCYL、荧光素/荧光素、BODIPY-FL/BODIPY-FL、荧光素/DABCYL、CalRed-610/BHQ-2，荧光素黄/DABCYL，类星体750/BHQ-2，BODIPY/DABCYL，曙红/DABCYL，赤藓红/DABCYL，四甲基罗丹明/DABCYL，德克萨斯红/DABCYL，CY5/BHQ1，CY5/BHQ2，CY3/BHQ1，CY3/BHQ2和荧光素/QSY7染料。在一些实施例中，检测寡核苷酸含有均相***中可检测的标记，其中混合物中结合的标记检测寡核苷酸与未结合的标记检测寡核苷酸相比显示出可检测的变化，这允许在没有从未杂交的标记检测寡核苷酸中物理去除杂交的情况下检测标记(例如，美国专利第5,283,174号、第5,656,207号和第5,658,737号)。本领域已知的可检测标记或检测寡核苷酸包括但不限于化学发光标记(包括吖啶酯化合物，美国专利第5,656,207号、第5,658,737号和第5,639,604号)、TaqManTM探针、分子torch和分子信标。TaqManTM探针包含供体和受体标记，其中在扩增期间，在酶降解检测寡核苷酸时检测荧光，以便从猝灭剂的存在中释放荧光团。分子torch和信标以开放和封闭构型存在，其中所述封闭构型猝灭荧光团，并且所述开放位置将荧光团与猝灭剂分离以使其发荧光。与靶标的杂交打开以其它方式封闭的检测寡核苷酸。
在一些实施例中，检测探针是Torch。在一些实施例中，Torch包含与SEQ ID NO:178的区域或其互补序列具有至少90％互补性的核酸序列。在一些实施例中，启动子引物含有与SEQ ID NO:177中的区域或其互补序列具有至少90％互补性的10-30个连续碱基。在一些实施例中，Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61或62或与SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61或62具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28或与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，Torch包含SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28或与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，Torch的核苷酸序列由核苷酸序列SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28或与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列组成。在一些实施例中，Torch由SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28或与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列组成。在一些实施例中，torch含有连接到5'端的荧光分子和连接到3'端的猝灭剂。或者，可以将荧光分子连接到torch的3'端并且将猝灭剂连接到检测寡核苷酸的5'端。在一些实施例中，torch在3'端含有5-6个核苷酸序列，其与在5'端的5-6个核苷酸互补并可杂交。在一些实施例中，与5'端的5-6个核苷酸互补并可杂交的3'端的5-6个核苷酸序列通过接头连接至torch。在一些实施例中，接头是C1-16接头。在一些实施例中，接头是C9接头。
扩增产物的“检测”可以使用任何已知方法完成。例如，扩增的核酸可以与导致可检测的物理变化(例如，电变化)的表面缔合。扩增的核酸可以在溶液相中或通过将其浓缩在基质中或基质上并检测核酸或与其缔合的标记(例如嵌入剂，诸如溴化乙锭或cyber绿)来检测。其他检测方法使用与扩增产物中的序列互补的探针并检测探针:产物复合物的存在，或使用探针复合物来扩增从扩增产物中检测到的信号(例如，美国专利第5,424,413号、第5,451,503号和第5,849,481号)。其他检测方法使用探针，其中信号的产生与靶标序列的存在相关联，因为只有当标记的探针与扩增产物结合时才会产生信号变化，例如在分子信标、分子torch或杂交开关探针中(例如，美国专利第5,118,801号、第5,312,728号、第5,925,517号、第6,150,097号、第6,361,945号、第6,534,274号、第6,835,542号、第6,849,412号和第8,034,554号；和美国公开第2006/0194240A1号)。可以使用在靶标扩增期间存在并与扩增子实时杂交的检测寡核苷酸实现检测。检测寡核苷酸可含有荧光团和猝灭剂。Torch在每个端都含有互补区域。这些互补区域相互结合，形成“封闭”Torch。在封闭构型中，荧光团和猝灭剂非常接近，并且荧光团信号被猝灭。也就是说，当被光激发时，它不会发出可检测的信号。然而，当torch与互补靶标结合时，torch内的互补区域被迫分开以形成“开放”torch。在开放形式中，荧光团和猝灭剂并不靠近，并且在激发时(即不再猝灭)可检测到荧光团信号。扩增子与Torch的结合导致猝灭剂与荧光团的分离。它可以响应特定波长的光刺激和信号发射而激发荧光团。Torch可以在扩增过程中出现，并与互补扩增子结合，因为它是实时生成的。随着创建更多的扩增子，将束缚更多的Torch并创建更多的信号。信号最终达到可以在背景以上检测到的水平，并最终达到所有可用Torch都绑定到扩增子且信号达到最大值的程度。在扩增开始时，且扩增序列的拷贝数低，大多数检测寡核苷酸是封闭的(3'端和5'端为碱基对，并且荧光信号被猝灭。在扩增期间，更多的检测寡核苷酸与靶标序列结合，从而将检测寡核苷酸的3'端和5'端分开，从而导致荧光增强(荧光猝灭减少)。进一步扩增后，荧光信号达到最大值。
在一些实施例中，以时间间隔进行检测。检测可以通过以规律时间间隔测量荧光来完成。时间间隔可以是但不限于：1-60s、1-120s、1-180s、1-240s或1-300s。在一些实施例中，时间间隔是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60s。对于以规律时间间隔进行的检测，每个间隔称为一个周期。检测可进行20-240个循环、30-210个循环、40-180个循环、50-150个循环或60-120个循环。例如，每30秒检测一次，持续60分钟，构成120个循环。检测可能发生在循环的开始或结束。检测也可以连续进行。
在一些实施例中，扩增寡核苷酸(启动子引物或非启动子引物)、检测寡核苷酸或靶标捕获寡核苷酸含有一个或多个修饰的核苷酸。寡核苷酸可具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个修饰的核苷酸。在一些实施例中，超过50％、超过60％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过950％或100％的核苷酸被修饰。修饰的核苷酸包括具有修饰的核碱基的核苷酸。修饰的核碱基包括但不限于合成和天然核碱基、5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。修饰的核苷酸还包括具有修饰的碱基的核苷酸，包括但不限于2'-修饰的核苷酸(包括但不限于2'-O-甲基核苷酸和2'-卤素核苷酸，例如2'-氟核苷酸)。修饰的核苷酸还包括具有修饰键的核苷酸，例如但不限于硫代磷酸酯键。
本文所述的任何寡核苷酸可含有一个或多个标签。“标签”可以是出于在结合靶标序列之外赋予一些额外功能的目的而与寡核苷酸共价连接的核苷酸序列。寡核苷酸标签的非限制性实例包括RNA聚合酶的5'启动子、引物结合位点、测序标签、质量标签、条形码标签、捕获标签等(例如，美国专利第5,422,252号、第5,882,856号、第6,828,098号以及PCT公开第05/019479号)。标签也可以是出于赋予一些额外功能的目的而与寡核苷酸共价连接的非核苷酸分子。
在预期进行多重扩增的情况下，本发明组合物可以包含多种不同的靶标捕获寡核苷酸启动子引物和与多种不同的靶标核酸序列杂交的非启动子引物。不同的靶标核酸序列可以是在相同或不同的生物体中。
如上所述，本文公开的方法和组合物可用于体外扩增靶标核酸序列以产生可被检测以指示样品中靶标核酸的存在的扩增序列。所述方法和组合物可用于合成扩增的核酸以提供用于诊断和/或预测医学病状、检测环境和/或食物样品的纯度或质量、或调查法医证据的有用信息。所述方法和组合物有利于在较宽动态范围内提供相对快速且执行成本低廉的高灵敏度测定，使其适用于高通量和/或自动化***。所述方法和组合物可用于分析单个靶标序列的测定，即单重扩增***，并且特别可用于同时分析多个不同靶标序列的测定，即多重扩增***。在一些实施例中，组合物和反应混合物以试剂盒形式提供，所述试剂盒包括有用的定义的测定组分，因为它们允许使用者有效地执行在测定中一起使用这些组分以扩增所需靶标的方法。
D.用于多阶段扩增和检测***毛滴虫的寡核苷酸组合物。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:41，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:47，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:51，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:11，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:15，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:24。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:41，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:50，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:56。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:41，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:50，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:57。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:41，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:49，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:57。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:41，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:45，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:51，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:9，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:15，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:40，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:50，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:56。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:40，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:50，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:57。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:40，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:49，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:57。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:40，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:45，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:51，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:9，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:15，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:40，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:42，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:49，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:56。
在一些实施例中，TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，T7引物包含核苷酸序列SEQID NO:4，NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13，并且Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20。
表1中提供了其他寡核苷酸。
表1.寡核苷酸和***毛滴虫靶标序列。
*(L)是任选的接头。接头可以是核酸接头或非核酸接头。接头包括但不限于C1-C16、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16、PEG或其他合适的接头。
E.组合物和试剂盒
本发明提供了可用于扩增、检测和/或定量样品中的***毛滴虫的寡聚物、组合物和试剂盒。寡聚物、组合物和试剂盒可用于单重或多重多阶段扩增方法。
描述了用于确定样品中***毛滴虫靶标核酸的存在与否或者定量其数量的反应混合物。各种反应混合物包括但不限于靶标捕获(TCR)混合物、扩增(AMP)混合物、启动子引物(PRO)混合物和酶(ENZ)混合物。根据本公开，混合物独立地包含以下一种或多种：启动子引物(例如，T7引物)、非启动子引物(NT7寡核苷酸)、TCO、检测寡核苷酸、逆转录酶、RNA聚合酶、dNTP、NTP、缓冲液、盐及其组合，如本文所述，用于扩增和/或检测样品中的***毛滴虫靶标核酸。在一些实施例中，可以在试剂盒中提供本文所述的任何寡核苷酸组合。组合物，试剂盒和/或反应混合物可能还包括许多任选的组分。在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种测试样品组分，其中可能存在或不存在***毛滴虫靶标核酸。在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种对照寡核苷酸，包括但不限于对照TCO、对照启动子引物、对照非启动子引物、对照检测寡核苷酸及其组合。试剂盒可以包括用于扩增和检测***毛滴虫的寡核苷酸，或者它可以包括用于扩增和检测***毛滴虫和一种或多种其他生物体(包括但不限于念珠菌种)的寡核苷酸。
在一些实施例中，组合物或试剂盒包含检测寡核苷酸，其包括一种或多种检测寡核苷酸。检测寡核苷酸独立地包含一种或多种荧光标记和一种或多种猝灭剂。在一些实施例中，组合物或试剂盒包括一种或多种Torch检测寡核苷酸。在一些实施例中，组合物或试剂盒包括两种或更多种Torch检测寡核苷酸。两种或更多种Torch寡核苷酸可检测来自不同生物体的扩增产物，并可在不同通道中检测。
在一些实施例中，试剂盒、组合物或反应混合物还含有以下一种或多种：DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、阳性对照核酸、阴性对照核酸、对照核酸、dNTP(例如dATP，dTTP，dGTP和dCTP)、NTP(例如ATP、UTP、GTP和CTP)、KCl、MgCl2、乙酸钾、缓冲液、BSA、蔗糖、海藻糖、DMSO、甜菜碱、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、非离子型去污剂、铵离子、EDTA以及其他适用于等温扩增和/或检测的试剂或缓冲液。DNA聚合酶可以是但不限于逆转录酶。缓冲液可以是但不限于Tris-HCl和Tris-乙酸盐。非离子型去污剂可以是但不限于Tween-20和Triton X-100。
在一些实施例中，用于***毛滴虫的所述引物和检测寡核苷酸从生产日期算起具有至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月或至少24个月的保质期。
本文所公开的任何方法也应理解为针对该方法的目的，公开了该方法中所涉及的材料的相应用途。包含***毛滴虫序列的任何寡核苷酸和包含此类寡核苷酸的任何组合(例如，试剂盒和组合物)应理解为还公开用于检测和/或定量***毛滴虫或扩增***毛滴虫核酸序列，以及用于制备用于检测和/或定量***毛滴虫的组合物，或用于扩增***毛滴虫核酸序列。
在一些实施例中，试剂盒还包括用于根据本发明的实践方法的一组说明，其中该说明书可与包装***物和/或试剂盒或其组分的包装相关联。
通过以下实例可以进一步理解本文所述的组合物和方法的实施例。实例中使用的方法步骤已在本文中描述，并且以下信息更具体地描述了方法中使用的典型试剂和条件。可以使用基本上不影响过程或结果的其他试剂和条件，只要遵循以上描述中提供的指导即可。此外，所公开的方法和组合物可以手动地执行或在自动装置或任何类型的已知装置(例如，测试管、多管单元装置、多孔装置如96孔微量滴定板等)中使用的执行一个或多个步骤(例如，移液、混合、温育等)的***中执行。
实例
在实例中描述的方法中使用的示例性试剂包括以下。
“样品传输介质”或“STM”是包含EDTA、EGTA和月桂基硫酸锂(LLS)的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.7)。
“靶标捕获试剂”或“TCR”是包含氯化锂和EDTA，以及250μg/ml具有与其共价结合的(dT)14寡核苷酸的磁性颗粒(1微米SERA-MAGTM MG-CM颗粒，印第安纳州印第安纳波利斯Seradyn有限公司(Seradyn,Inc.Indianapolis,IN))的HEPES缓冲溶液(pH 6.4)。
“靶标捕获洗涤液”或“TC洗涤液”是包含氯化钠、EDTA、0.3％(v/v)无水乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯和0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的HEPES缓冲溶液(pH 7.5)。
“扩增试剂”或“AR”是包含氯化镁、氯化钾、四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、四种核糖核苷酸三磷酸(rATP)、rCTP、rGTP和rUTP)的HEPES缓冲溶液(pH 7.7)。引物和/或探针可以添加到扩增试剂中的反应混合物中，或者可以与试剂(无引物扩增试剂)分开添加。
如在扩增或预扩增反应混合物中使用的，“酶试剂”或“ENZ”是包含MMLV逆转录酶(RT)、T7 RNA聚合酶、盐和辅因子的HEPES缓冲溶液(pH 7.0)。
实例A.多阶段扩增/检测
T7引物在靶标捕获期间与靶标序列杂交，然后去除过量T7引物。
在第一阶段期间，除了额外的T7引物外，NT7引物与所有必需的扩增、检测和酶试剂一起被引入。在逆转录酶存在的情况下，与捕获的靶标杂交的T7引物被延伸，产生cDNA拷贝，并且靶标RNA模板被逆转录酶的RNA酶H活性降解。NT7引物随后与cDNA杂交并延伸，填充T7引物的启动子区域并创建有活性的双链DNA模板。然后T7聚合酶从模板中产生多个RNA转录物。NT7引物随后与RNA转录物杂交并延伸，产生靶标RNA模板的无启动子cDNA拷贝。RNA链被逆转录酶的RNA酶活性降解。由于第1阶段扩增混合物中没有可用的游离T7引物，因此反应不会进一步进行。然后通过添加T7引物和任选的检测寡核苷酸开始第二阶段，从而启动第1阶段中产生的cDNA库的指数扩增。
对于多重扩增和检测，使用TCO、T7引物、NT7引物和Torch寡核苷酸中每一种的一种或多种。寡核苷酸可扩增相同靶标核酸中的不同序列或不同靶标核酸中的序列或其组合。不同的靶标核酸可以来自相同或不同的生物体。
板设置：
在一些实施例中，设置四个不同的板以用于两个自动化KingFisher装置上。
1.板1(TCR板)含有裂解的样品。将靶标捕获试剂(100μL)添加到此板中。使TCO和T7引物与靶标核酸(400μL样品)杂交。TCO:靶标核酸:T7引物(预扩增杂交体)使用磁铁使用磁珠(在固体支持物上的捕获探针)进行捕获。
2.板2是装有500μL/孔的APTIMA洗涤缓冲液的深孔板。Aptima洗涤缓冲液含有用于洗涤细胞裂解过程中残留的任何过量蛋白质和脂质的去污剂和酒精。
3.板3含有200μL/孔的用于提供预扩增杂交体的第二次洗涤的APTIMA洗涤缓冲液。
4.板4含有50μL/孔的AMP试剂。在一些实施例中，AMP试剂含有缓冲液、盐、dNTP、NTP和一种或多种非T7引物。
靶标捕获和分离：将TCO和T7引物添加到含有(或疑似含有)靶标核酸的样品中。T7引物以大约1个T7引物与1个靶标核酸的比率添加。将TCO和T7引物与靶标核酸一起温育一段时间以允许TCO和T7引物与靶标核酸杂交。然后纯化预扩增杂交体，去除过量的或未杂交的T7引物。然后使用具有用于TCO的聚(dT)结合配偶体的磁性颗粒分离预扩增杂交体。
1.将板1(TCR板)放入加热块中并加热至62℃持续30min。然后在室温下放置20min-2h。在一些实施例中，用65℃的盖子覆盖TCR板以防止在孔的顶部形成冷凝。然后将捕获的预扩增杂交体转移到板2。
2.第一次洗涤(约10min)后，将深孔梳/磁铁盖添加到板2中，以捕获预扩增杂交体。将捕获的预扩增杂交体转移到板3。
3.第二次洗涤后，将小梳子(磁铁盖)添加到板3，以捕获预扩增杂交体。将洗涤的预扩增杂交体捕获并转移到板4。将第4个板转移到热循环仪中进行实时等温扩增和检测。
多阶段转录介导的扩增和实时检测。
第一阶段扩增：使NT7引物、酶、dNTP和NTP(AMP混合物)与含有预扩增杂交体的纯化靶标核酸一起存在。将混合物温育一段时间以允许形成第一扩增产物。
1.将含有NT7引物和纯化的靶标核酸的AMP板与杂交的T7引物一起在44℃下温育5分钟。
2.向板的每个孔中添加25μL含有逆转录酶、T7RNA聚合酶、dNTP和NTP的ENZ混合物，将其密封并以1400rpm的速度混合1分钟；在热循环仪上44℃温育5分钟。
第二阶段扩增：将T7引物添加到第一扩增产物中并温育一段时间以形成第二扩增产物。
3.向每个孔中添加25μL PRO混合物，将其密封，并以1400rpm的速度混合1min。在一些实施例中，PRO混合物含有缓冲液、盐、表面活性剂、dNTP、NTP、一种或多种T7引物和Torch探针。
4.运行反应程序：在43℃下进行30秒的120个循环，并且在每个循环结束时进行标记检测(收集)。
检测：通过以规律间隔记录检测寡核苷酸的荧光信号来实时检测靶标核酸序列的扩增。实例1.***毛滴虫双阶段实时TMA寡核苷酸筛选。
使用以下条件如上所述进行多阶段扩增。
表1-1.TCR混合物：TCO最终浓度＝15pmol/反应。
表1-2.AMP混合物：NT7引物最终反应浓度＝2.67pmol/反应。
表1-3.PRO混合物：T7引物最终反应浓度＝2.67pmol/反应，并且Torch寡核苷酸最终反应浓度＝15pmol/反应。
表1-4.反应混合物：每个反应的体积
| μL/反应 | |
| TCR混合物 | 100 |
| AMP混合物 | 50 |
| ENZ混合物 | 25 |
| PRO混合物 | 25 |
表1-5.组合：TCO为SEQ ID NO:2；运行反应，其中每个反应以0、1.00×102、1.00×104和1.00×105个靶细胞进行。
表1-6.寡核苷酸
结果：没有组合产生足够强的曲线以能够扩增和/或检测***毛滴虫。
实例2.***毛滴虫双阶段实时TMA寡核苷酸筛选。
筛选替代靶标捕获并滴定***毛滴虫T7引物，以查看测定性能是否有所改善。使用以下条件如上所述进行多阶段扩增。
表2-1.TCR混合物：TCR寡核苷酸最终浓度为15pmol/反应。
表2-2.AMP混合物：NT7引物最终反应浓度为2.67pmol/反应。
表2-3.PRO混合物：Torch寡核苷酸最终反应浓度为15pmol/反应。
表2-4.反应混合物：每个反应的体积
| μL/反应 | |
| AMP混合物 | 50 |
| PRO混合物 | 25 |
| TCR混合物 | 100 |
| ENZ混合物 | 25 |
表2-5.组合：T7引物＝SEQ ID NO:6；NT7引物＝SEQ ID NO:15；Torch寡核苷酸＝SEQ ID NO:26。运行反应，其中每个反应以0、1.00×103和1.00×105个靶细胞进行。
表2-6.寡核苷酸
| SEQ ID NO. | 类型 | 长度 | OD/mL | pmol/μL |
| 25 | Torch | 30 | 23.1 | 93.32 |
| 26 | Torch | 30 | 23.56 | 95.18 |
| 8 | T7 | 55 | 27.0 | 59.72 |
| 15 | nT7 | 22 | 43.16 | 237.77 |
| 2 | TCO | 60 | 30.62 | 61.85 |
| 8 | T7 | 49 | 36.79 | 91.00 |
| 7 | T7 | 54 | 28.07 | 63.00 |
| 3 | TCO | 57 | 25.7 | 54.65 |
| 1 | TCO | 55 | 34.1 | 75.14 |
| 3 | TCO | 57 | 25.23 | 53.65 |
| 1 | TCO | 55 | 38.05 | 83.85 |
| 6 | T7 | 49 | 36.79 | 91.00 |
| 4 | T7 | 52 | 32.32 | 75.33 |
| 5 | T7 | 46 | 42.06 | 110.82 |
结果：没有组合产生足够强的曲线以能够扩增和/或检测***毛滴虫。
实例3.***毛滴虫双阶段实时TMA寡核苷酸筛选。
使用以下条件如上所述进行多阶段扩增。
表3-1.TCR混合物：TCO储备液浓度＝61.85pmol/μL；TCO最终浓度＝15pmol/反应。
表3-2.AMP混合物：NT7引物最终反应浓度＝10pmol/反应。
表3-3.PRO混合物：T7引物最终反应浓度＝10pmol/反应，并且Torch寡核苷酸最终反应浓度＝15pmol/反应。
表3-4.反应混合物：每个反应的体积
表3-5.组合：TCO＝SEQ ID NO:2。
表3-6.寡核苷酸
| 寡核苷酸类型 | SEQ ID NO. | 长度 | OD/mL | pmol/μL |
| nT7 | 14 | 20 | 36.64 | 222.04 |
| nT7 | 13 | 25 | 36.44 | 176.66 |
| nT7 | 15 | 22 | 43.16 | 237.77 |
| Torch | 20 | 19 | 31.53 | 201.13 |
| Torch | 21 | 17 | 25.86 | 184.37 |
| Torch | 22 | 28 | 29.8 | 128.99 |
| Torch | 22 | 27 | 28.28 | 126.95 |
| Torch | 25 | 30 | 23.1 | 93.32 |
| Torch | 26 | 30 | 23.56 | 95.18 |
| T7 | 9 | 50 | 33.74 | 81.79 |
| T7 | 10 | 45 | 31.1 | 83.76 |
| T7 | 6 | 49 | 36.79 | 91.00 |
| T7 | 4 | 52 | 32.32 | 75.33 |
| T7 | 5 | 46 | 42.06 | 110.82 |
结果：AMP1/PRO1、AMP1/PRO3、AMP2/PRO3和AMP3/PRO5可以很好地扩增和/或检测***毛滴虫。
表3-7.结果(TC寡核苷酸＝809)
实例4.***毛滴虫双阶段实时TMA寡核苷酸筛选。
使用以下条件如上所述进行多阶段扩增。
表4-1.TCR混合物：
| SEQ ID NO. | μL储备液 | μL TC试剂 | N反应 | |
| TC1 | 3 | 9.61 | 3490.4 | 35 |
TC1寡核苷酸：储备液浓度＝54.65pmol/μL；最终浓度＝15pmol/反应
TCR混合物：100μL/反应
表4-2.AMP混合物。NT7引物＝10pmol/反应
| SEQ ID NO. | μL T7引物 | μL AMP试剂 | N反应 | |
| AMP4 | 19 | 3.00 | 747.0 | 15 |
| AMP5 | 16 | 3.00 | 747.0 | 15 |
| AMP6 | 17 | 3.00 | 747.0 | 15 |
| AMP7 | 18 | 3.00 | 747.0 | 15 |
表4-3.PRO混合物。T7引物＝10pmol/反应；Torch＝15pmol/反应
表4-4.反应混合物：每个反应的体积
| μL/反应 | |
| AMP混合物 | 50 |
| PRO混合物 | 25 |
| TCR混合物 | 100 |
| ENZ混合物 | 25 |
表4-5.寡核苷酸
表4-6.组合：TCO＝SEQ ID NO:3，T7引物＝SEQ ID NO:11。
虽然一些***显示出扩增，但没有一个***产生强烈的曲线。虽然指定的寡核苷酸可以是可行***的候选者，但没有组合在***毛滴虫的扩增/检测中表现良好。
实例5.口腔毛滴虫与***毛滴虫扩增***的交叉反应。
使用以下条件如上所述进行多阶段扩增。
表5-1.TCR混合物：TCO最终浓度＝15pmol/反应。(70次反应)
表5-2.AMP混合物：NT7引物最终反应浓度＝10pmol/反应。
表5-3.PRO混合物：T7引物最终反应浓度＝10pmol/反应，并且Torch寡核苷酸最终反应浓度＝15pmol/反应。
表5-4.反应混合物：每个反应的体积
| μL/反应 | |
| AMP混合物 | 50 |
| PRO混合物 | 25 |
| TCR混合物 | 100 |
| ENZ混合物 | 25 |
表5-5.组合：TCO＝SEQ ID NO:3；NT7引物＝SEQ ID NO:15。
表5-6.寡核苷酸
| SEQ ID NO. | 类型 | 长度 | OD/mL | pmol/μL |
| 23 | Torch | 28 | 29.8 | 128.99 |
| 64 | Torch | 26 | 26.6 | 124.00 |
| 3 | TCO | 57 | 25.7 | 54.65 |
| 11 | T7 | 49 | 31.86 | 78380 |
| 15 | NT7 | 22 | 43.16 | 237.77 |
结果：1×105个口腔毛滴虫细胞/反应的存在不干扰使用指定寡核苷酸进行的***毛滴虫检测。无论口腔毛滴虫是否存在，在相同的出现点检测到***毛滴虫并达到相同的RFU。指定的寡核苷酸检测到口腔毛滴虫，尽管出现时间明显变慢(较慢约8min对比约14min)和较低RFU(在15pmol Torch下约22,000对比约7300)。Torch SEQ ID NO:64显示出非常低的口腔毛滴虫背景。
实例6.口腔毛滴虫和人五滴虫与***毛滴虫扩增***的交叉反应。
使用以下条件如上所述进行多阶段扩增。将N7寡核苷酸SEQ ID NO:9与N7寡核苷酸SEQ ID NO:11进行比较，并将Torch SEQ ID NO:23与Torch SEQ ID NO:64进行比较，以了解扩增***毛滴虫对比口腔毛滴虫和人五滴虫的特异性。使用TCO SEQ ID NO:3和NT7引物SEQ ID NO:15如所述进行双阶段扩增反应。Torch SEQ ID NO:23提供了更强的扩增曲线(表5-7)。由于较晚的T时间和较低的RFU范围，N7寡核苷酸SEQ ID NO:11提供较少的背景(表5-8)。
表6-1.Torch比较。Torch以15pmol/反应使用。
| 条件 | 平均T时间 | 平均RDU范围 |
| 0个***毛滴虫/1×10<sup>5</sup>个口腔毛滴虫 | ||
| 口腔毛滴虫Torch，SEQ ID.NO:64 | 18.68 | 1756.2 |
| ***毛滴虫Torch，SEQ ID NO:24 | 7.2 | 8134.8 |
| 100个***毛滴虫/0个口腔毛滴虫 | ||
| 口腔毛滴虫Torch，SEQ ID.NO:64 | 7.5 | 16070.4 |
| ***毛滴虫Torch，SEQ ID NO:24 | 4.00 | 22537.4 |
| 100个***毛滴虫/1×10<sup>5</sup>个口腔毛滴虫 | ||
| 口腔毛滴虫Torch，SEQ ID.NO:64 | 7.68 | 17224.4 |
| ***毛滴虫Torch，SEQ ID NO:24 | 3.72 | 22310.33 |
表6-2.N7寡核苷酸比较。
在密切相关的非靶标物种人五滴虫和***毛滴虫之间没有观察到交叉反应。
***毛滴虫T7引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:24的性能在多重形式中使用包括念珠菌种组和光滑念珠菌在内的所有测定寡核苷酸得到证实。在CV/TV多重测定中，T7引物SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:9相比具有更低的口腔毛滴虫背景。
在CV/TV多重扩增测定中使用相同torch，与SEQ ID NO:9相比，T7引物SEQ ID NO:11具有更低的根据RFU范围的口腔毛滴虫背景(5,992对比4,921)和更后出现的T时间(14.88对比6.30)(表5-9)。
表6-3.N7寡核苷酸比较。
在CV/TV多重扩增测定中使用相同torch，与SEQ ID NO:9相比，T7引物SEQ ID NO:11具有更低的根据RFU范围的口腔毛滴虫背景(5,992对比4,921)和更后出现的T时间(14.88对比6.30)(表5-9)。
实例7.***毛滴虫和念珠菌属的多重扩增。
如上所述使用以下条件进行双阶段扩增。
表7-1.TCR混合物：靶标捕获试剂(Aptima TCR)+念珠菌和***毛滴虫靶标捕获寡核苷酸。
表7-2.AMP混合物：AMP试剂+NT7引物。混合物含有念珠菌(Calb、Cgla和Cpar)NT7引物和指定的***毛滴虫NT7引物。
| SEQ ID NO. | μL | pmol/μL储备液 | pmol/反应 | |
| 全部 | AMP试剂 | 1286.0 | ||
| 全部 | 35 | 3.12 | 25 | 3.00 |
| 全部 | 36 | 3.12 | 25 | 3.00 |
| 全部 | 34 | 2.60 | 50 | 5.00 |
| AMP1 | 14 | 5.20 | 50 | 10.00 |
| AMP2 | 14 | 5.20 | 50 | 10.00 |
| AMP3 | 13 | 5.20 | 50 | 10.00 |
| AMP4 | 15 | 5.20 | 50 | 10.00 |
| AMP5 | 15 | 5.20 | 50 | 10.00 |
| 总体积 | 1300 |
表7-3.PRO混合物：Pro试剂+念珠菌和***毛滴虫T7和Torch寡核苷酸
表7-4.反应混合物：每个反应的体积
| μL/反应 | |
| AMP混合物 | 50 |
| PRO混合物 | 25 |
| TCR混合物 | 100 |
| ENZ混合物 | 25 |
表7-5.***毛滴虫寡核苷酸。
| SEQ ID NO. | 类型 | 长度 | OD/mL | pmol/μL |
| 14 | nT7 | 20 | 36.64 | 222.04 |
| 13 | nT7 | 25 | 36.44 | 176.66 |
| 15 | nT7 | 22 | 43.16 | 237.77 |
| 20 | Torch | 19 | 31.53 | 201.13 |
| 21 | Torch | 17 | 25.86 | 184.37 |
| 23 | Torch | 28 | 29.8 | 128.99 |
| 9 | T7 | 50 | 33.74 | 81.79 |
| 6 | T7 | 49 | 36.79 | 91.00 |
| 4 | T7 | 52 | 32.32 | 75.33 |
| 2 | TCO | 60 | 30.62 | 61.85 |
| 3 | TCO | 57 | 25.7 | 54.65 |
表7-6.组合。反应物每个反应含有0、1.00×104或1.00×106个白色念珠菌或光滑念珠菌靶标或0、0.5或1个细胞/反应***毛滴虫。N＝2.
结果：在FAM通道中读取了白色念珠菌和***毛滴虫Torch。
当1×104个细胞/反应白色念珠菌存在于反应物中时，但不在1×106个细胞/反应白色念珠菌存在于反应物中时，S1***毛滴虫寡核苷酸部分抑制白色念珠菌扩增。当反应物中存在1×106个细胞/反应白色念珠菌时，5种***毛滴虫寡核苷酸组合均不影响白色念珠菌的扩增。此外，5种***毛滴虫寡核苷酸组合都不会对光滑念珠菌的扩增产生不利影响。
在0.1***毛滴虫细胞/反应下，***S4扩增并检测到***毛滴虫。在1***毛滴虫细胞/反应下，***S1、S2和S3扩增并检测到***毛滴虫。念珠菌寡核苷酸的存在并未显着抑制***毛滴虫的扩增。
实例8.多重测定优化。
使用以下条件如上所述进行多重多阶段扩增。使用含有羧基-X-罗丹明(ROX)的Torches SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23进行多重测定以检测***毛滴虫。***毛滴虫TCO为SEQ ID NO:3，NT7引物为SEQ ID NO:15，T7引物为SEQ ID NO:11。多重测定另外含有用于检测白色念珠菌和其他念珠菌(每个都在FAM通道中检测到)和光滑念珠菌(在HEX通道中检测到)的寡核苷酸。在Cy5.5通道中检测到对照Torch。念珠菌寡核苷酸列出于表9-5中。
四个靶标与竞争对照组合以多重格式进行测试。对念珠菌属和光滑念珠菌通道的寡核苷酸浓度进行滴定以在所有扩增***之间找到平衡。测试并验证TCR和NT7中增加量的T7念珠菌属寡核苷酸的制剂。接下来，在TCR和NT7中，随着光滑念珠菌T7的增加，测试了念珠菌属寡核苷酸浓度。两组测试均未显示对其他通道的抑制。
念珠菌属寡核苷酸浓度的优化看到FAM通道的改进，将***1的初始浓度(6pmol/rxn SEQ ID NO:35；5pmol/rxn SEQ ID NO:36)与***2增加的寡核苷酸浓度进行比较。
光滑念珠菌扩增***的第二次优化增加了寡核苷酸浓度以及增加的白色念珠菌寡核苷酸浓度。在不改变FAM中念珠菌属的扩增效率的情况下，观察到光滑念珠菌的HEX通道中更快的T时间。随着新的光滑念珠菌寡核苷酸浓度的增加，竞争对照也得到了改善。
在对靶标组合进行测试时，发现在存在高滴度***毛滴虫的情况下，光滑念珠菌的扩增之间存在显着的负相互作用。选择了4因素表征设计策略，其中光滑念珠菌和***毛滴虫的TCR中的T7和AMP中的NT7浓度高、中、低，以便确定哪些因素对每个分析物的T时间的影响最大。高浓度被设置为当前浓度。实验由20次运行组成。发现TCR中TV T7的较低浓度允许更快地扩增光滑念珠菌。
使用Torch SEQ ID NO:23***毛滴虫在多重测定中检测到0.001个细胞/mL。
实例9.分析灵敏度。
使用CV/TV多重测定在Aptima转运培养基(STM)中对每种念珠菌(白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、***滑念珠菌和光滑念珠菌)和***毛滴虫的培养裂解物进行连续稀释。对于每个种属，对白色念珠菌、热带念珠菌和都柏林念珠菌的1000CFU/mL到30CFU/mL、***滑念珠菌的300CFU/mL到3CFU/mL、光滑念珠菌的100CFU/mL至10CFU/mL、***毛滴虫的0.01个细胞/mL至0.0001个细胞/mL的1/2log滴定运行15次重复。使用以下条件如所述进行多阶段扩增。
念珠菌属的阳性百分比、平均T时间、平均RFU范围和平均T斜率示出在表9-7中。在FAM通道中检测到念珠菌属，在HEX通道中检测到光滑念珠菌，在ROX通道中检测到***毛滴虫，在Cy5.5通道中检测到光滑念珠菌竞争对照Torch。
***毛滴虫的阳性百分比、平均T时间、平均RFU范围和平均T斜率示出在表9-8中。达到100％***毛滴虫阳性信号的检测限为0.001个细胞/ml。
表9-1.靶标捕获混合物
*念珠菌属组＝白色念珠菌、***滑念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌
表9-2.AMP混合物
表9-3.PRO混合物
*念珠菌属组＝白色念珠菌、***滑念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌
表9-4.用于多重扩增测定的***毛滴虫多阶段扩增寡核苷酸。
表9-5.寡核苷酸
a小写＝甲氧基RNA；大写＝DNA
FAM＝荧光素；HEX＝六氯荧光素；ROX＝羧基-X-罗丹明；Cy5.5＝花青5.5；BBQ＝黑莓猝灭剂650
C9＝9碳链接头
表9-6.Torch寡核苷酸
表9-7.念珠菌属阳性汇总
表9-8：***毛滴虫裂解物的阳性汇总
使用正态Probit模型，有50％的概率(95％置信水平)检测到以0.0004(0.0003-0.0005)个细胞/mL存在的***毛滴虫，并且有95％的概率(95％置信水平)检测到以0.001(0.007-0.0003)个细胞/mL存在的***毛滴虫。使用Gompertz Probit模型，有50％的概率(95％置信水平)检测到以0.00004(0.0003-0.0006)个细胞/mL存在的***毛滴虫，并且有95％的概率(95％置信水平)检测到以0.0008(0.0006-0.0016)个细胞/mL存在的***毛滴虫。Probit值种类示出在表9-9和9-10。
表9-9.概率汇总，正态模型。
| 靶标 | 50％概率(95％CL) | 95％概率(95％CL) |
| 白色念珠菌 | 136(94-193)CFU/mL | 627(374-1927)CFU/mL |
| ***滑念珠菌 | 34(21-56)CFU/mL | 291(149-992)CFU/mL |
| 热带念珠菌 | 19(12-30)CFU/mL | 106(59-332)CFU/mL |
| 都柏林念珠菌 | 122(75-199)CFU/mL | 911(462-3389)CFU/mL |
| 光滑念珠菌 | 45(37-55)CFU/mL | 77(61-146)CFU/mL |
| ***毛滴虫 | 0.0004(0.0003-0.0005)个细胞/mL | 0.001(0.007-0.003)个细胞/mL |
表9-10.概率汇总，Gompertz模型。
实例10.计算机特异性分析。
对***毛滴虫、念珠菌和对照寡核苷酸(表9.5)和对照寡核苷酸(表9.5)进行计算机分析，以评估***与不期望的靶标交叉反应或形成不期望的分子间或分子内相互作用的可能性。还使用OLIGO 7和OligoAnalyzer应用程序对寡核苷酸进行相互作用分析。查询与正向和反向引物对的潜在相互作用，所述引物对主题起始位置等于或小于300bp且具有或不具有内部Torch序列。过滤与主题序列相同方向的正向引物、与主题序列相反方向的反向引物以及与主题序列相同方向的Torch序列的匹配。对于似乎有可能在ACV/TV***中被扩增和检测到的受试者，使用***毛滴虫和对照寡核苷酸作为对人类和GenBank数据库的查询来检查BLAST结果。在BLAST查询的所有数据集(细菌、真菌、病毒、人类)中，确定了一种可能感兴趣的仅引物相互作用：HIV-1(登录号AF254708)与寡核苷酸SEQ ID NO:36和11。在组11中在交叉反应性测试(参见下文)中对HIV-1进行测试，并且没有显示出交叉反应性或干扰的迹象。因此，这两种寡核苷酸对HIV的扩增可以忽略不计。
实例11.交叉反应测试。
在ROX通道中添加***毛滴虫作为靶标后，在四重测定组中针对各种生物体评估交叉反应性。使用所述***毛滴虫寡核苷酸如上所述进行多阶段扩增。组和结果示出在表10-1中。测试每个组的5个重复，以确定是否发生任何交叉反应。(注意：组10和12未列出，因为它们含有目标物种。)
表11-1：交叉反应组的平均RFU范围汇总
组7的一个重复在FAM通道中呈阳性。所有其他重复在所有通道中均呈阴性。重新评估了针对组7中生物体的交叉反应性。在重新测试这些生物体后，没有观察到交叉反应，并且所有重复都呈阴性。得出的结论是，组7中发现的假阳性重复是由于随机污染事件造成的。
实例12.用于***毛滴虫检测的ROX通道中的干扰。
在***毛滴虫存在的情况下以3×检测限(0.003个细胞/mL)测试了交叉反应组的五个重复。如所述进行多阶段扩增。在ROX通道中在任何组存在的情况下没有观察到干扰，并且所有重复都如预期的那样呈阳性。对照Torch(Cy5.5,RTF2)对所有重复均有效。结果表明，在来自以上实例的组1-9、11和13中的各种生物体存在的情况下，***毛滴虫寡核苷酸能够检测***毛滴虫。
表12-1：干扰组汇总。ROX通道中的***毛滴虫和Cy5.5通道中的对照Torch的的平均RFU范围。每个组含有0.003个细胞/mL的***毛滴虫。
在***毛滴虫存在的情况下以3×检测限(0.003个细胞/mL)测试了交叉反应组的五个重复。如所述进行多阶段扩增。在ROX通道中在任何组存在的情况下没有观察到干扰，并且所有重复都如预期的那样呈阳性。对照Torch(Cy5.5,RTF2)对所有重复均有效。结果表明，在来自以上实例的组1-9、11和13中的各种生物体存在的情况下，***毛滴虫寡核苷酸能够检测***毛滴虫。
实例13.***毛滴虫临床样品测试。
最初通过Aptima Trichomonas Assay测试呈阳性的十七(17)个***拭子临床标本使用Aptima CV/TV多重分析进行了测试。使用以下项如所述进行多阶段扩增：TCO SEQID NO.3、NT7引物SEQ ID NO.15、T7引物SEQ ID NO.11和Torch SEQ ID NO.24。采用每个纯样品的一个重复进行测试。15/17(88％)的样品通过CV/TV多重测定产生有效结果，并且都对***毛滴虫呈阳性。3/15(20％)的有效样品对念珠菌属和***毛滴虫均呈阳性。无效样品被判定为无效，因为所有通道都没有信号，并且记录了仪器错误，可能的原因是样品体积不足。
表13-1：在ATV IVD测定中具有>1000RLU且被认为对***毛滴虫呈阳性的样品的ACV/TV多重纯测试。n＝1。
然后在初始测试后使用STM进行系列稀释，并针对Aptima CV/TV多重和Aptima***毛滴虫IVD测定进行比较测试。根据纯样品测试的T时间，在STM中对临床样品进行1:5和1:10,000的稀释。对从纯样品测试中确定为无效的样品11207和13023进行1:10的稀释。每次稀释都用CV/TV多重测定进行，并用Aptima***毛滴虫测定重新测试。先前的无效样品在以1:10稀释度重新测试时为有效的。所有样品，包括先前的无效样品，都同意Aptima***毛滴虫测定解释。
表13-2：临床样品稀释比较。
实施例
实施例1.一种用于扩增样品中的***毛滴虫靶标核酸序列的扩增寡核苷酸，其包含：含有与SEQ ID NO:176或其互补区域具有至少90％互补性的15-30个连续碱基的启动子引物。
实施例2.如实施例1所述的扩增寡核苷酸，其中所述启动子引物包含T7 RNA聚合酶的5'启动子序列。
实施例3.如实施例2所述的扩增寡核苷酸，其中所述T7 RNA聚合酶的所述启动子序列包含SEQ ID NO:65或66。
实施例4.如实施例2所述的扩增寡核苷酸，其中所述启动子引物包含与SEQ IDNO:42、43、44、45、46、47或48具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例5.如实施例4所述的扩增寡核苷酸，其中所述启动子引物包含与SEQ IDNO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例6.一组扩增寡核苷酸，其包含如实施例1-5中任一项所述的扩增寡核苷酸和适用于扩增一种或多种额外靶标核酸的一种或多种额外扩增寡核苷酸。
实施例7.一种用于扩增样品中的***毛滴虫靶标核酸序列的扩增寡核苷酸，其包含：含有与SEQ ID NO:177或其互补序列的区域具有至少90％互补性的15-30个连续碱基的非启动子引物。
实施例8.如实施例6所述的扩增寡核苷酸，其中所述非启动子引物包含与SEQ IDNO:49、50、51、52、53、54或55具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例9.如实施例7所述的扩增寡核苷酸，其中所述非启动子引物包含与SEQ IDNO:13、14、15、16、17、18或19具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例10.一组扩增寡核苷酸，其包含如实施例7-9中任一项所述的非启动子引物和适用于扩增一种或多种额外靶标核酸的一种或多种额外非启动子引物。
实施例11.一种用于检测***毛滴虫靶标核酸扩增产物的检测寡核苷酸，其包含：与SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61或62具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例12.如实施例11所述的检测寡核苷酸，其中所述检测寡核苷酸是构象敏感的杂交探针，其在与***毛滴虫靶标核酸的扩增产物杂交时产生可检测信号。
实施例13.如实施例12所述的检测寡核苷酸，其中所述检测寡核苷酸含有荧光团和任选的猝灭剂。
实施例14.如实施例13所述的检测寡核苷酸，其中所述检测寡核苷酸是分子torch。
实施例15.如实施例11所述的检测寡核苷酸，其中所述检测寡核苷酸含有与SEQID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例16.一组检测寡核苷酸，其包含如实施例11-15中任一项所述的检测寡核苷酸和适用于检测一种或多种额外靶标核酸的扩增产物的一种或多种额外检测寡核苷酸。
实施例17.一种用于捕获样品中的***毛滴虫靶标核酸的靶标捕获寡核苷酸(TCO)，其中所述TCO包含与SEQ ID NO:39、40或41具有至少90％同一性的核酸序列和与固定的捕获探针结合的固定的捕获探针结合区。
实施例18.如实施例17所述的TCO，其中所述固定的捕获探针结合区包含能够在测定条件下与结合到所述捕获探针的寡核苷酸稳定杂交的核酸序列。
实施例19.如实施例18所述的TCO，其中所述TCO包含与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例20.一组TCO，其包含如实施例17-19中任一项所述的TCO和用于捕获一种或多种额外靶标核酸的一种或多种额外TCO。
实施例21.一种用于检测样品中的***毛滴虫的组合物，其包含：
(a)启动子引物，其包含如实施例1-5中任一项所述的扩增寡核苷酸；
(b)非启动子引物，其包含如实施例7-9中任一项所述的扩增寡核苷酸；
(c)检测寡核苷酸，其包含如实施例11-15中任一项所述的检测寡核苷酸；和
(d)任选地，靶标捕获寡核苷酸(TCO)，其包含如实施例17-19中任一项所述的TCO。
实施例22.如实施例21所述的组合物，其中所述启动子引物存在于靶标捕获混合物中，所述非启动子引物存在于第一阶段扩增混合物中，并且所述启动子引物和检测寡核苷酸存在于第二阶段扩增混合物中。
实施例23.如实施例22所述的组合物，其中所述靶标捕获混合物进一步包含TCO。
实施例24.如实施例22所述的组合物，其中所述第一阶段扩增混合物含有以下一种或多种：逆转录酶、RNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸和核糖核苷酸三磷酸。
实施例25.如实施例21-24中任一项所述的组合物，其进一步包含固定的捕获探针，其中所述固定化捕获探针含有结合存在于所述TCO上的第二结合对成员的第一结合对成员。
实施例26.如实施例25所述的组合物，其中所述固定的捕获探针包含可磁性吸引的颗粒。
实施例27.如实施例22所述的组合物，其中所述第一阶段扩增反应混合物缺乏所述启动子引物。
实施例28.如实施例21所述的组合物，其中所述靶标捕获混合物含有一种或多种额外启动子引物，所述第一阶段扩增混合物含有一种或多种额外非启动子引物，并且所述第二扩增混合物含有一种或多种额外更多启动子引物和一种或多种检测寡核苷酸，其中所述一种或多种额外启动子引物、非启动子引物和检测寡核苷酸适用于扩增和检测除了***毛滴虫以外的物种。
实施例29.如实施例24所述的方法，其中所述除了***毛滴虫以外的物种中的至少一种是念珠菌属。
实施例30.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:11，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:15，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:24。
实施例31.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20。
实施例32.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
实施例33.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
实施例34.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:3，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:9，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:15，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:23。
实施例35.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20。
实施例36.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:14，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
实施例37.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。
实施例38.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:9，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:15，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:23。
实施例39.如实施例21所述的组合物，其中所述TCO包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述T7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:4，所述NT7引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:13，并且所述Torch包含核苷酸序列SEQ ID NO:20。
实施例40.一种检测样品中的***毛滴虫的方法，其包括：
(a)在允许启动子引物与***毛滴虫靶标核酸序列的第一部分杂交的条件下，使所述样品与所述启动子引物接触，从而产生包含所述启动子引物和所述靶标核酸序列的预扩增杂交体
其中所述启动子引物包含与SEQ ID NO:176的区域或其互补序列具有至少90％互补性的核酸序列。
(b)通过将靶标捕获到固相支持物上来分离所述预扩增杂交体，然后洗涤以去除未与步骤(a)中所述靶标核酸序列的所述第一部分杂交的任何启动子引物；
(c)在第一阶段扩增反应混合物中在支持其线性扩增但不支持其指数扩增的条件下在第一阶段、基本上等温的、转录相关的扩增反应中扩增步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶标核酸序列的至少一部分，从而得到包含第一扩增产物的反应混合物；
其中所述第一阶段扩增反应混合物包含非启动子引物，所述非启动子与所述启动子引物的延伸产物的一部分互补，并且包含与SEQ ID NO:177的区域或其互补序列具有至少90％互补性的核酸序列
其中所述第一扩增产物不是在第一阶段、基本上等温的、转录相关的扩增反应期间核酸合成的模板；
(d)将包含所述第一扩增产物的所述反应混合物与额外启动子引物组合，以产生第二阶段扩增反应混合物，
其中所述第二阶段扩增反应混合物另外包含检测寡核苷酸；
(e)在第二阶段，在所述第二阶段扩增反应混合物中进行基本上等温的转录相关扩增反应，对所述第一扩增产物进行指数扩增，从而合成第二扩增产物；
(f)用所述检测寡核苷酸在规律时间间隔检测所述第二阶段扩增反应混合物中所述第二扩增产物的合成；和
(g)使用步骤(f)的结果定量所述样品中的所述靶标核酸序列。
实施例41.如实施例40所述的方法，其中所述启动子引物包含T7 RNA聚合酶的5'启动子序列。
实施例42.如实施例41所述的方法，其中所述T7 RNA聚合酶的所述启动子序列包含SEQ ID NO:65或66。
实施例43.如实施例41所述的方法，其中所述启动子引物包含与SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47或48具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例44.如实施例43所述的方法，其中所述启动子引物包含与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例45.如实施例40所述的方法，其中所述非启动子引物在所述第一阶段等温转录相关扩增反应中被酶促延伸。
实施例46.如实施例45所述的方法，其中所述非启动子引物包含与SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54或55具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例47.如实施例46所述的方法，其中所述非启动子引物包含与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18或19具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例48.如实施例40所述的方法，其中分离预扩增杂交体包括使所述样品与靶标捕获寡核苷酸(TCO)接触，其中所述预扩增杂交体包含与所述TCO和启动子引物中的每一者杂交的所述靶标核酸序列。
实施例49.如实施例48所述的方法，其中所述TCO包含与SEQ ID NO:39、40或41具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例50.如实施例48所述的方法，其中所述TCO包含与SEQ ID NO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例51.如实施例40所述的方法，其中所述固体支持物包含固定的捕获探针。
实施例52.如实施例51所述的方法，其中所述固定的捕获探针包含可磁性吸引的颗粒。
实施例53.如实施例40所述的方法，其中所述第一阶段等温转录相关扩增反应和第二阶段等温转录相关扩增反应中的每一者都包含RNA聚合酶和逆转录酶，并且其中所述逆转录酶包含内源性RNA酶H活性。
实施例54.如实施例40所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应混合物缺乏游离启动子引物。
实施例55.如实施例40所述的方法，其中步骤(c)的所述第一扩增产物是与所述样品中的所述靶标核酸序列具有相同极性的cDNA分子，并且其中步骤(e)的所述第二扩增产物是RNA分子。
实施例56.如实施例40所述的方法，其中步骤(d)中的所述检测寡核苷酸是构象敏感的杂交探针，其在与所述第二扩增产物杂交时产生可检测的信号。
实施例57.如实施例56所述的方法，其中步骤(d)中的所述检测寡核苷酸是荧光标记的序列特异性杂交探针。
实施例58.如实施例57所述的方法，其中所述检测寡核苷酸含有与SEQ ID NO:178的区域或其互补序列具有至少90％互补性的区域。
实施例59.如实施例58所述的方法，其中所述检测寡核苷酸包含与SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61或62具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例60.如实施例59所述的方法，其中所述检测寡核苷酸包含与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列。
实施例61.如实施例40所述的方法，其中步骤(g)包括使用校准曲线和步骤(f)的结果对所述样品中的所述靶标核酸序列进行定量。
实施例62.如实施例40所述的方法，其中所述方法包括两种或更多种不同的启动子引物和两种或更多种不同的非启动子引物，其中所述两种或更多种不同的启动子引物和所述两种或更多种不同的非启动子引物扩增不同的靶标核酸以产生两种或更多种不同的扩增产物。
实施例63.如实施例62所述的方法，其进一步包括使用两种或更多种不同的检测寡核苷酸检测两种或更多种不同的扩增产物。
实施例63.如实施例62所述的方法，其中所述两种或更多种不同的靶标核酸来自不同的物种。
实施例64.如实施例63所述的方法，其中所述不同物种是念珠菌属。
序列表
<110> 基因探针公司（Gen-Probe Incorporated）
<120> 用于确定样品中***毛滴虫的存在的寡核苷酸
<130> 057516/546952
<150> 62/870,308
<151> 2019-07-19
<160> 178
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
gcctgctgct acccgtggat attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
ctaccagggt ctctaatcct gttggattta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
aatcaacgct agacaggtca accctttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
aatttaatac gactcactat agggagataa ccgaaggact tcggcaaagt aa 52
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
aatttaatac gactcactat agggagagct accctcttcc acctgc 46
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
aatttaatac gactcactat agggagaggc atcacggacc tgttattgc 49
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
gcaataattt aatacgactc actataggga gaggcatcac ggacctgtta ttgc 54
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
gcaataaatt taatacgact cactataggg agaggcatca cggacctgtt attgc 55
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
aatttaatac gactcactat agggagagct cgcagtccta ttgatcctaa 50
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
aatttaatac gactcactat agggagagca ccctctcagg ctcgc 45
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
aatttaatac gactcactat agggagagta gcgcaccctc tcaggctcg 49
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
aatttaatac gactcactat agggagagtt catgacgctg attacaaacg 50
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
ggcttcgggt ctttcaggat attgt 25
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
cgggtctttc aggatattgt 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
gctaacgagc gagattatcg cc 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
ggtagcaata acaggtccgt g 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
ggtccgtgat gccctttaga tg 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
cgtgatgccc tttagatgct ctg 23
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
cgtgatgccc tttagatgct ctgg 24
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
gccguuggug gugcacggc 19
<210> 21
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
gcguugauuc agcacgc 17
<210> 22
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
cgaaguccuu cgguuaaagu uccuucg 27
<210> 23
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
cgaaguccuu cgguuaaagu ucacuucg 28
<210> 24
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
cgaaguccuu cgguuaaagu uccuucg 27
<210> 25
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
uucgguuaaa guucuaauug ggacuccgaa 30
<210> 26
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
uucgguuaaa guucuaauug ggacaccgaa 30
<210> 27
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
gcgugcuaca auguuaggau cacacgc 27
<210> 28
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
gacugcgagc cugagagggu gacguc 26
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
gatggagcgt accaccgttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50
<210> 30
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
agatcggtat cgggtgcttg tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 53
<210> 31
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
gctcagaaaa ccagaagcga aacgggttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
aatttaatac gactcactat agggagatca agttcgcata ttgcac 46
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
aatttaatac gactcactat agggagaata ctgggccgac atccttacg 49
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
ggtagtttgg cttttctttg g 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
cgttacaaga aatatacacg g 21
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
gcattggagt ttctgctg 18
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
ggaugugacu gucaugccau cc 22
<210> 38
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
ggaauggcgc cguggauggu ugcauucc 28
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
gcctgctgct acccgtggat at 22
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
ctaccagggt ctctaatcct gttgga 26
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
aatcaacgct agacaggtca accc 24
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
taaccgaagg acttcggcaa agtaa 25
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
gctaccctct tccacctgc 19
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
ggcatcacgg acctgttatt gc 22
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
gctcgcagtc ctattgatcc taa 23
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
gcaccctctc aggctcgc 18
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
gtagcgcacc ctctcaggct cg 22
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
gttcatgacg ctgattacaa acg 23
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
ggcttcgggt ctttcaggat attgt 25
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
cgggtctttc aggatattgt 20
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
gctaacgagc gagattatcg cc 22
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
ggtagcaata acaggtccgt g 21
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
ggtccgtgat gccctttaga tg 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
cgtgatgccc tttagatgct ctg 23
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
cgtgatgccc tttagatgct ctgg 24
<210> 56
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
gccguuggug gugc 14
<210> 57
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
gcguugauuc agc 13
<210> 58
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
cgaaguccuu cgguuaaagu uc 22
<210> 59
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
uucgguuaaa guucuaauug ggacu 25
<210> 60
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 60
uucgguuaaa guucuaauug ggac 24
<210> 61
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 61
gcgugcuaca auguuaggau ca 22
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
gacugcgagc cugagagggu g 21
<210> 63
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
gcauggugcg aauugggaca ugc 23
<210> 64
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
gaagguuacu uugccgaagu ccuucg 26
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 65
aatttaatac gactcactat agggaga 27
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
gaaattaata cgactcacta tagggaga 28
<210> 67
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 67
ttgccgaagt ccttcggtta aagttctaat tg 32
<210> 68
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 68
uugccgaagu ccuucgguua aaguucuaau ug 32
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 69
caattagaac tttaaccgaa ggacttcggc aa 32
<210> 70
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 70
caauuagaac uuuaaccgaa ggacuucggc aa 32
<210> 71
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 71
tgccgaagtc cttcggttaa agttctaatt gg 32
<210> 72
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
ugccgaaguc cuucgguuaa aguucuaauu gg 32
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
ccaattagaa ctttaaccga aggacttcgg ca 32
<210> 74
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
ccaauuagaa cuuuaaccga aggacuucgg ca 32
<210> 75
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
gccgaagtcc ttcggttaaa gttctaattg gg 32
<210> 76
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
gccgaagucc uucgguuaaa guucuaauug gg 32
<210> 77
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 77
cccaattaga actttaaccg aaggacttcg gc 32
<210> 78
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
cccaauuaga acuuuaaccg aaggacuucg gc 32
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
ccgaagtcct tcggttaaag ttctaattgg g 31
<210> 80
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
ccgaaguccu ucgguuaaag uucuaauugg g 31
<210> 81
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
cccaattaga actttaaccg aaggacttcg g 31
<210> 82
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
cccaauuaga acuuuaaccg aaggacuucg g 31
<210> 83
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
cgaagtcctt cggttaaagt tctaattggg ac 32
<210> 84
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
cgaaguccuu cgguuaaagu ucuaauuggg ac 32
<210> 85
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
gtcccaatta gaactttaac cgaaggactt cg 32
<210> 86
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
gucccaauua gaacuuuaac cgaaggacuu cg 32
<210> 87
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n为a、c、g或t
<400> 87
cgaagtcntt cggttaaagt tctaattggg ac 32
<210> 88
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n为a、c、g或 u
<400> 88
cgaagucnuu cgguuaaagu ucuaauuggg ac 32
<210> 89
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n为a、c、g或t
<400> 89
gtcccaatta gaactttaac cgaangactt cg 32
<210> 90
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n为a、c、g或 u
<400> 90
gucccaauua gaacuuuaac cgaangacuu cg 32
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 91
gaagtccttc ggttaaagtt ctaa 24
<210> 92
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
gaaguccuuc gguuaaaguu cuaa 24
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 93
ttagaacttt aaccgaagga cttc 24
<210> 94
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 94
uuagaacuuu aaccgaagga cuuc 24
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 95
gtccttcggt taaagttcta attgg 25
<210> 96
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 96
guccuucggu uaaaguucua auugg 25
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
ccaattagaa ctttaaccga aggac 25
<210> 98
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 98
ccaauuagaa cuuuaaccga aggac 25
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 99
ttcggttaaa gttctaattg ggactccctg cg 32
<210> 100
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
uucgguuaaa guucuaauug ggacucccug cg 32
<210> 101
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 101
cgcagggagt cccaattaga actttaaccg aa 32
<210> 102
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 102
cgcagggagu cccaauuaga acuuuaaccg aa 32
<210> 103
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 103
ttgccgaagt ccttcggtta aagttctaat tgggactccc tgcg 44
<210> 104
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
uugccgaagu ccuucgguua aaguucuaau ugggacuccc ugcg 44
<210> 105
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
cgcagggagt cccaattaga actttaaccg aaggacttcg gcaa 44
<210> 106
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
cgcagggagu cccaauuaga acuuuaaccg aaggacuucg gcaa 44
<210> 107
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
ttcggttaaa gttctaa 17
<210> 108
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
uucgguuaaa guucuaa 17
<210> 109
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
ttagaacttt aaccgaa 17
<210> 110
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
uuagaacuuu aaccgaa 17
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
gctaacgagc gagattatcg cc 22
<210> 112
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
gcuaacgagc gagauuaucg cc 22
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
ggcgataatc tcgctcgtta gc 22
<210> 114
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
ggcgauaauc ucgcucguua gc 22
<210> 115
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
ggcatcacgg acctgttatt gc 22
<210> 116
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
ggcaucacgg accuguuauu gc 22
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
gcaataacag gtccgtgatg cc 22
<210> 118
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
gcaauaacag guccgugaug cc 22
<210> 119
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
aatttaatac gactcactat agggagaggc atcacggacc tgttattgc 49
<210> 120
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
aatttaatac gactcactat agggaga 27
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
gcctgctgct acccgtggat at 22
<210> 122
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
gccugcugcu acccguggau au 22
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
atatccacgg gtagcagcag gc 22
<210> 124
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
auauccacgg guagcagcag gc 22
<210> 125
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
gcctgctgct acccgtggat attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 34
<210> 127
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
gctaacgagc gagattatcg ccaagcaata acaggtccgt gatg 44
<210> 128
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
gtcccaatta gaactttaac cgaaggactt cggcaa 36
<210> 129
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 129
cgcagggagt cccaattaga actttaaccg aa 32
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 130
caattagaac tttaaccgaa g 21
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 131
ttgcttggcg ataatctcgc tcg 23
<210> 132
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 132
cctgttattg cttggcgata atctcgc 27
<210> 133
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 133
cggacctgtt attgcttggc gataatctc 29
<210> 134
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 134
gcctctcggc tttgcagtcc tatt 24
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
gttgatcctg ccaag 15
<210> 136
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 136
gccatgcaag tgttag 16
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
ccattcgact gagtgaccta tc 22
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 138
gattcctggt tcatgacgct g 21
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
ccgagtcatc caatcg 16
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 140
cctaccgtta ccttgttacg ac 22
<210> 141
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 141
gaaguccuuc gguuaaaguu cuaa 24
<210> 142
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 142
guccuucggu uaaaguucua auugg 25
<210> 143
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 143
gtgcgtgggt tgacctgtct agcgttgatt 30
<210> 144
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 144
gugcgugggu ugaccugucu agcguugauu 30
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 145
aatcaacgct agacaggtca acccacgcac 30
<210> 146
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 146
aaucaacgcu agacagguca acccacgcac 30
<210> 147
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 147
gacctgtcta 10
<210> 148
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 148
gaccugucua 10
<210> 149
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 149
tagacaggtc 10
<210> 150
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 150
uagacagguc 10
<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 151
ctagacaggt caacccacgc ac 22
<210> 152
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 152
cuagacaggu caacccacgc ac 22
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 153
gtgcgtgggt tgacctgtct ag 22
<210> 154
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 154
gugcgugggu ugaccugucu ag 22
<210> 155
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
cuagacaggu caacccacgc actttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 156
aatcaacgct agacaggtca accc 24
<210> 157
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 157
aaucaacgcu agacagguca accc 24
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 158
gggttgacct gtctagcgtt gatt 24
<210> 159
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 159
ggguugaccu gucuagcguu gauu 24
<210> 160
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 160
aatcaacgct agacaggtca accctttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57
<210> 161
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 161
tcaacgctag acaggtcaa 19
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 162
ucaacgcuag acaggucaa 19
<210> 163
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 163
ttgacctgtc tagcgttga 19
<210> 164
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 164
uugaccuguc uagcguuga 19
<210> 165
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 165
tcaacgctag acaggtcaat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52
<210> 166
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 166
aatcaacgct agacaggtc 19
<210> 167
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 167
aaucaacgcu agacagguc 19
<210> 168
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 168
gacctgtcta gcgttgatt 19
<210> 169
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 169
gaccugucua gcguugauu 19
<210> 170
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 170
aatcaacgct agacaggtct ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52
<210> 171
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 171
aaucaacgcu agacagguca accctttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57
<210> 172
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 172
ucaacgcuag acaggucaat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52
<210> 173
<211> 1574
<212> DNA
<213> ***毛滴虫（Trichomonas vaginalis）
<400> 173
tacttggttg atcctgccaa ggaagcacac ttaggtcata gattaagcca tgcaagtgtt 60
agttcaggta acgaaactgc gaatagctca ttaatacgct cagaatctat ttggcggcga 120
ccaacaggtc ttaaatggat agcagcagca actctggtgc taatacatgc gattgtttct 180
ccagatgtga attatggagg aaaagttgac ctcatcagag gcacgccatt cgactgagtg 240
acctatcagc ttgtacttag ggtctttacc taggtaggct atcacgggta acgggcggtt 300
accgtcggac tgccggagaa ggcgcctgag agatagcgac tatatccacg ggtagcagca 360
ggcgcgaaac tttcccactc gagactttcg gaggaggtaa tgaccagttc cattggtgcc 420
ttttggtact gtggataggg gtacggtttt ccaccgtacc gaaacctagc agagggccag 480
tctggtgcca gcagctgcgg taattccagc tctgcgagtt tgctccatat tgttgcagtt 540
aaaacgccgt agtctgaatt ggccagcaat ggtcgtacgt atttttacgt tcactgtgaa 600
caaatcagga cgcttagagt atggccacat gaatgactca gcgcagtatg aagtctttgt 660
tttcttccga aaacaagctc aatgagagcc atcgggggta gatctatctc atgacgagtg 720
gtggaatact ttgactcatg agagagaagc tgaggcgaag gcgtctacct agagggtttc 780
tgtcgatcaa gggcgagagt aggagtatcc aacaggatta gagaccctgg tagttcctac 840
cttaaacgat gccgacagga gtttgtcatt tgttaatggc agaatctttg gagaaatcat 900
agttcttggg ctctggggga actacgaccg caaggctgaa acttgaagga attgacggaa 960
gggcacacca ggggtggagc ctgtggctta atttgaatca acacggggaa acttaccagg 1020
accagatgtt ttttatgact gacaggcttc gggtctttca ggatattgtt tttggtggtg 1080
catggccgtt ggtggtgcgt gggttgacct gtctagcgtt gattcagcta acgagcgaga 1140
ttatcgccaa ttatttactt tgccgaagtc cttcggttaa agttctaatt gggactccct 1200
gcgattttag caggtggaag agggtagcaa taacaggtcc gtgatgccct ttagatgctc 1260
tgggctgcac gcgtgctaca atgttaggat caataggact gcgagcctga gagggtgcgc 1320
tactcttata atccctaacg tagttgggat tgacgtttgt aatcagcgtc atgaaccagg 1380
aatcctcgta aatgtgtgtc aacaacgcac gttgaatacg tccctgccct ttgtacacac 1440
cgcccgtcgc tcctaccgat tggatgactc ggtgaaatca ccggatgctt acgagcagaa 1500
agtgattaaa tcacgttatc tagaggaagg agaagtcgta acaaggtaac ggtaggtgaa 1560
cctgccgttg gatc 1574
<210> 174
<211> 550
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 174
attgacggaa gggcacacca ggggtggagc ctgtggctta atttgaatca acacggggaa 60
acttaccagg accagatgtt ttttatgact gacaggcttc gggtctttca ggatattgtt 120
tttggtggtg catggccgtt ggtggtgcgt gggttgacct gtctagcgtt gattcagcta 180
acgagcgaga ttatcgccaa ttatttactt tgccgaagtc cttcggttaa agttctaatt 240
gggactccct gcgattttag caggtggaag agggtagcaa taacaggtcc gtgatgccct 300
ttagatgctc tgggctgcac gcgtgctaca atgttaggat caataggact gcgagcctga 360
gagggtgcgc tactcttata atccctaacg tagttgggat tgacgtttgt aatcagcgtc 420
atgaaccagg aatcctcgta aatgtgtgtc aacaacgcac gttgaatacg tccctgccct 480
ttgtacacac cgcccgtcgc tcctaccgat tggatgactc ggtgaaatca ccggatgctt 540
acgagcagaa 550
<210> 175
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 175
gcttcgggtc tttcaggata ttgtttttgg tggtgcatgg ccgttggtgg tgcgtgggtt 60
gacctgtcta gcgttgattc agctaacgag cgagattatc gccaattatt tactttgccg 120
aagtccttcg gttaaagttc taattgggac tccctgcgat tttagcaggt ggaagagggt 180
agcaataaca ggtccgtgat gccctttaga tgctctgggc tgcacgcgtg ctacaatgtt 240
aggatcaata ggactgcgag cctgagaggg tgcgctactc ttataatccc taacgtagtt 300
gggattgacg tttgtaatca gcgtcatgaa 330
<210> 176
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 176
ttactttgcc gaagtccttc ggttaaagtt ctaattggga ctccctgcga ttttagcagg 60
tggaagaggg tagcaataac aggtccgtga tgccctttag atgctctggg ctgcacgcgt 120
gctacaatgt taggatcaat aggactgcga gcctgagagg gtgcgctact cttataatcc 180
ctaacgtagt tgggattgac gtttgtaatc agcgtcatga a 221
<210> 177
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 177
ggcttcgggt ctttcaggat attgtttttg gtggtgcatg gccgttggtg gtgcgtgggt 60
tgacctgtct agcgttgatt cagctaacga gcgagattat cgccaattat ttactttgcc 120
gaagtccttc ggttaaagtt ctaattggga ctccctgcga ttttagcagg tggaagaggg 180
tagcaataac aggtccgtga tgccctttag atgctctgg 219
<210> 178
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 178
ctaattggga ctccctgcga ttttagcagg tggaagaggg tagcaataac aggtccgtga 60
tgccctttag atgctctggg ctgcacgcgt gctacaatgt taggatcaat aggactgcga 120
gcctgagagg gt 132
Claims (20)
1.一种用于扩增样品中的***毛滴虫靶标核酸序列的扩增寡核苷酸，其包含：启动子引物，其包含具有与SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48或其互补序列具有至少90％同一性的靶标特异性序列并且具有在其5'端连接的T7 RNA聚合酶的启动子序列的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的扩增寡核苷酸，其中所述T7 RNA聚合酶的所述启动子序列包含SEQ ID NO:65或66。
3.根据权利要求1所述的扩增寡核苷酸，其中所述启动子引物包含与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列。
4.一组扩增寡核苷酸，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的扩增寡核苷酸和适用于扩增一种或多种额外靶标核酸的一种或多种额外扩增寡核苷酸。
5.一种用于扩增样品中的***毛滴虫靶标核酸序列的扩增寡核苷酸，其包含：非启动子引物，其中所述非启动子引物包含与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19或其互补序列具有至少90％同一性的核酸序列。
6.一组扩增寡核苷酸，其包含根据权利要求5所述的非启动子引物和适用于扩增一种或多种额外靶标核酸的一种或多种额外非启动子引物。
7.一种用于检测***毛滴虫靶标核酸扩增产物的检测寡核苷酸，其包含：具有与SEQID NO:56、57、58、59、60、61、62或其互补序列具有至少90％同一性的靶标特异性序列的核酸序列，并且其中所述检测寡核苷酸含有荧光团和任选的猝灭剂。
8.根据权利要求7所述的检测寡核苷酸，其中所述检测寡核苷酸含有与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列。
9.一组检测寡核苷酸，其包含根据权利要求7或8所述的检测寡核苷酸和适用于检测一种或多种额外靶标核酸的扩增产物的一种或多种额外检测寡核苷酸。
10.一种用于捕获样品中的***毛滴虫靶标核酸的靶标捕获寡核苷酸(TCO)，其中(i)所述TCO包含具有与SEQ ID NO:39、40或41具有至少90％同一性的靶标特异性序列的核酸序列和与固定的捕获探针结合的固定的捕获探针结合区；或(ii)所述TCO包含与SEQ IDNO:1、2或3具有至少90％同一性的核酸序列。
11.一种用于检测样品中的***毛滴虫的组合物，其包含：
(a)启动子引物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的扩增寡核苷酸；
(b)非启动子引物，其包含根据权利要求5或6中任一项所述的扩增寡核苷酸；
(e)检测寡核苷酸，其包含根据权利要求7-9中任一项所述的检测寡核苷酸；和
(f)任选地，靶标捕获寡核苷酸(TCO)，其包含根据权利要求10所述的TCO。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述启动子引物存在于靶标捕获混合物中，所述非启动子引物存在于第一阶段扩增混合物中，并且所述启动子引物和检测寡核苷酸存在于第二阶段扩增混合物中。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述靶标捕获混合物含有一种或多种额外启动子引物，所述第一阶段扩增混合物含有一种或多种额外非启动子引物，并且所述第二阶段扩增混合物含有一种或多种额外启动子引物和一种或多种额外检测寡核苷酸，其中所述一种或多种额外启动子引物、非启动子引物和检测寡核苷酸适用于扩增和检测除了***毛滴虫以外的物种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述除了***毛滴虫以外的物种中的至少一种是念珠菌属。
15.一种检测样品中的***毛滴虫的方法，其包括：
(a)在允许启动子引物与***毛滴虫靶标核酸序列的第一部分杂交的条件下，使所述样品与所述启动子引物接触，从而产生包含所述启动子引物和所述靶标核酸序列的预扩增杂交体
其中所述启动子引物包含与SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48或其互补序列具有至少90％同一性并且具有在其5'端连接的T7 RNA聚合酶的启动子序列的核酸序列；
(b)通过将靶标捕获到固相支持物上来分离所述预扩增杂交体，其中所述靶标捕获包括使所述样品与靶标捕获寡核苷酸(TCO)接触，其中所述预扩增杂交体包含与所述TCO和启动子引物中的每一者杂交的靶标核酸序列，然后洗涤以去除未与步骤(a)中的所述靶标核酸序列的所述第一部分杂交的任何所述启动子引物；
(c)在第一阶段扩增反应混合物中在支持其线性扩增但不支持其指数扩增的条件下在第一阶段、基本上等温的、转录相关的扩增反应中扩增步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶标核酸序列的至少一部分，从而得到包含第一扩增产物的反应混合物；
其中所述第一阶段扩增反应混合物包含非启动子引物，所述非启动子与所述启动子引物的延伸产物的一部分互补，并且包含与SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19或其互补序列具有至少90％同一性的核酸序列；
其中所述第一扩增产物不是在第一阶段、基本上等温的、转录相关的扩增反应期间核酸合成的模板；
(d)将包含所述第一扩增产物的所述反应混合物与额外启动子引物组合，以产生第二阶段扩增反应混合物，
其中所述第二阶段扩增反应混合物另外包含检测寡核苷酸；
(e)在第二阶段，在所述第二阶段扩增反应混合物中进行基本上等温的转录相关扩增反应，对所述第一扩增产物进行指数扩增，从而合成第二扩增产物；
(f)用所述检测寡核苷酸在规律时间间隔检测所述第二阶段扩增反应混合物中所述第二扩增产物的合成；和
(g)使用步骤(f)的结果定量所述样品中的所述靶标核酸序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述T7 RNA聚合酶的所述启动子序列包含SEQID NO:65或66，或其中所述启动子引物包含与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少90％同一性的核酸序列。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述非启动子引物在所述第一阶段等温转录相关扩增反应中被酶促延伸。
18.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(d)中的所述检测寡核苷酸是荧光标记的序列特异性杂交探针，其包含与SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90％同一性的核酸序列。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括两种或更多种不同的启动子引物和两种或更多种不同的非启动子引物，其中所述两种或更多种不同的启动子引物和所述两种或更多种不同的非启动子引物扩增不同的靶标核酸以产生两种或更多种不同的扩增产物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述不同物种是念珠菌属。
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