KR100446621B1

KR100446621B1 - 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 ｍｏｄｙ３유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트

Info

Publication number: KR100446621B1
Application number: KR10-2001-0080909A
Authority: KR
Inventors: 이연수; 김미경; 이정남
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2001-12-18
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2004-09-07
Also published as: EP1321531A2; US7208272B2; EP1559794A2; CN1254549C; JP3892803B2; EP1321531A3; JP2003199593A; KR20030050478A; CN1473943A; US20030149258A1; EP1559794A3

Abstract

본　발명은　사람의 MODY3（maturity-onset diabetes of the young) 관련 유전자인 HNF-1a（hepatocyte nuclear factor-1a）의　프로모터，　엑손１∼１０　부분을　단일　또는　다중 중합효소 연쇄반응（PCR)에　의해　증폭하는 프라이머　세트，　전기　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　각　프라이머를　사용하여　HNF-1a　유전자의　염기서열을　분석하는　방법， 및　전기　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　각　프라이머를　포함하는　표적　DNA 서열　증폭용　키트에　관한　것이다．　본 발명에　의하면，　상기　프라이머　세트는　다중　PCR에　의해　해당　유전자　산물을　신속하고도　정확하게　그리고　경제적으로 증폭하므로，DNA　칩 등과　같이　혼성화를　이용한 MODY3 유전자 변이 분석 및　질병의　진단에　그　이용가치가 매우 높을　것이다.　　　　　　　　　　　　　

Description

다중　중합효소　연쇄반응에　의한 ＭＯＤＹ３ 유전자의　증폭을 위한 프라이머 세트{Primer sets for MODY3 gene amplification by multiplex polymerase chain reaction}

　　　본 발명은 다중 중합효소　연쇄반응에　의한 MODY3(maturity-onset diabetes of the young) 유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트에 관한 것이다. 좀 더　구체적으로, 본 발명은 사람의 MODY3 관련 유전자인 HNF-1a（hepatocyte nuclear factor-1a）의　프로모터，　엑손１내지 1０　부분을　단일　또는　다중 중합효소 연쇄반응에　의해　증폭하는 프라이머　세트，　전기　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　각　프라이머를　사용하여　HNF-1a　유전자의　염기서열을　분석하는　방법， 및　전기　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　각　프라이머를　포함하는　표적　DNA 서열　증폭용　키트에　관한　것이다．　

　　　인간 유전자에 대한　연구에　있어서，　연구자들에게 가장 큰 문제 중의 하나는 30억　개의 염기서열을 가진 복잡한 유전체에서 자신이 원하는 하나의 유전자만을 선택하여　분석을 수행하는데 따르는 어려움이었다. 　　　　　이러한　어려움을 해결하기　위해서 도입된 실험 방법 중 가장 획기적인 것 중의　하나는　특정서열을　증폭하는　중합효소　연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)이다. 　이 반응은 이미 알고 있는 유전자 염기서열에서， 그　서열의　말단에　상보적인 염기들로　이루어진　프라이머　쌍을　이용하여 그 사이에 있는 유전자를 짧은 시간 안에 수　십만　배 이상 증폭을 시키는 것이다(참조：　Saiki 등, Science 239: 487, 1988)．

　　　이와　같은　PCR은 최근에 들어서 빠른 속도로 밝혀지고 있는 질병 관련 유전자들의 분석에 많이 사용되고　있다. 　특정 유전자의 변형이 어떤 질병을 유발할 경우에， 그 유전자의 변형에 따른 질병의 발생 여부 또는 발생 가능성을 진단하기 위해서， PCR을 통해서 유전자를 증폭시킨 후 염기서열　분석 (sequencing), 혼성화 (hybridization), 단일 가닥 구조 다형성(SSCP: single strand conformational polymorphism) 등을 통해서 유전자　변이(mutation 또는 polymorphism)를 알아보는 방법은 이미 의료계에서 유전자 변이 분석의 방법으로 널리 이용되고 있다.

　이러한　질병 관련 유전자 변이 검사에서 관련 유전자의 크기가 작을 경우에는 단일 PCR 반응(single PCR)으로 모든 분석을 수행할 수 있으나, 유전자의 크기가 상대적으로 클 경우에는(일반적으로 1kb 이상) 단일 PCR 반응이 불충분할 수 있으며，동일 유전자의 각기　다른 부위를 증폭하기 위해서 여러 번의 PCR 반응이 필요할 수 있다. 　이제까지 발견된 질병　관련 유전자의 크기가 보통 1.5kb 이상이 대부분이었던 것을 감안한다면， 단일 PCR　보다는 여러 번의 PCR이 질병　관련 유전자 변이 검사에서 보다 많이 요구된다고 하겠다.

　　　그러나，　동일 유전자에 대한 여러 번의 PCR은, 환자의 유전자 염기서열　분석에 있어서 가장 큰 문제로 여겨지는 샘플(환자의 DNA 또는 혈액)을 다량으로 확보해야만 이루어 질 수 있다는 단점을 내포한다. 　또한， 여러　번의 PCR을 하기 위한 비용과 노동력 및 시간이 필요하여， 단일 PCR 반응에 비해서 많은 단점을 보이고 있다.

　　　이와　같은　단점을 해소하기　위해서　고려된　방법이 다중　중합효소　연쇄반응（multiplex PCR，이하　편의상　"다중 PCR"이라　함)이다. 다중 PCR은 증폭시키고자　하는 여러 가지 유전자 부위를 하나의 반응 용기 내（one tube reaction)에서 동시에 이루어지도록 하는 것이다. 　즉, 각각의 유전자 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머　세트들（primer sets)을　한꺼번에 넣고 PCR 증폭시키는　것이다.

　　　다중　PCR　반응을　위해서는　유전자 증폭　시작　부위의　염기로　이루어지는 프라이머들을　디자인할　때，① 각각의　프라이머들이 특정　유전자　조각만을 증폭시키고, ②　각각의 유전자 조각의 증폭이 다음 단계의 분석에 충분할 만큼 이루어져야 하고, ③　PCR 반응시 프라이머　간의 방해가 없어야 하는 등의 조건을 만족시켜야 한다.

　　　이러한　조건을　충족시키는 프라이머를　이용한 다중　PCR　반응은, 단일 PCR 반응에　비해서, 특정 유전자를 증폭시키는 데 필요한 시간과　노동력을 크게 줄일　뿐만　아니라, 많은 반응을 하나의 반응 용기 내에서　수행하므로　매우 경제적이다.　 특히，　경제성 및　환자　혈액(또는 DNA)의　최소　필요량을　추구하는　DNA　칩을　이용한　유전자　변이　분석시， 샘플의　준비에　필수적인　기술이다．

　　　한편，　MODY3는 제2형 당뇨병의 10~30% 이상을　차지하는　MODY　질병 （MODY1,2,3,4,5)의　한　유형에 해당하며，HNF-1a （hepatocyte nuclear factor-1a） 유전자에서의　점돌연변이（point mutation)에　의해　유발되는　질병인　것으로　알려지고 있다（참조：　Matschinsky & Magnuson, in 'Molecular Pathogenesis of MODYs', Karger, 1998)．　따라서， 이 유전자의 변이에 대한 분석이 DNA　칩에서　손쉽고 빠르게 이루어진다면， 당뇨의 발병 전에 이미 유전적 발병 소인을 파악하게 되어， 미리 식이요법 등을 통해서 당뇨병의 발병을 예방할 수 있을 것으로 예상된다.

　　　　이러한　배경 하에，　본　발명에서는　다중 PCR 반응을　이용하여 MODY3　유전자를　효과적으로　증폭시킬　수 있는 프라이머　세트를 디자인하고자　하였다．　　프라이머의　디자인 시에는　상기에서　예시한 다중 PCR 프라이머의　조건이외에，Tm(melting temperature)　값,　헤어핀　형성여부，　프라이머끼리의　이량체　형성여부, 자가　조합（self assembly)　　여부, 반복서열　존재여부　등의　각종　요건도　고려하였다.

　　　　상기한 프라이머　디자인　조건과 PCR 실험 조건에 대한 정확한 조절을 통해서 수립된　본　발명의　프라이머　세트는　MODY3 유전자의 증폭을 위한 다중　PCR에　매우 적합하다는　것을　확인하고， 본 발명을 완성하게　되었다．　

　　　　결국，　본　발명의 주된　목적은 MODY3 유전자인 HNF-1a의　특정　서열을　단일　또는　다중 PCR 반응에　의해　증폭하는 프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머를　제공하는　것이다．

　　　　본 발명의　다른　목적은　전기　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머를,　사용하여　HNF-1a　유전자의　염기서열을　분석하는　방법을　제공하는　것이다．

　　　　본　발명의　또　다른　목적은　전기　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머를　포함하는　특정　서열　증폭용　키트를　제공하는　것이다．

　　　도 1은 MODY3 유전자의　프로모터，　엑손　１∼１０　부분을　단일 PCR　증폭　 및　다중　PCR　증폭하여　얻은 산물을　１.8% 아가로스　젤　전기영동한　결과를　나타내는　사진이다．　

　　　도　２(A)~(E)는　MODY3 유전자의　프로모터　증폭용　프라이머　세트, 엑손1　증폭용　프라이머　세트, 엑손2　증폭용　프라이머　세트, 엑손8　증폭용　프라이머　세트의　양쪽 말단에서부터　3개 뉴클레오티드가 추가 또는 결실되는　변형　프라이머를　사용하여　다중　PCR한　결과를　나타내는　１.8% 아가로스　젤　전기영동　사진이다．

도　３은　각　엑손 별　프라이머를　DIG（digoxigenin)으로　표지한　후　단일　PCR　산물과　다중　PCR　산물에　혼성화시킨　결과를　나타내는　서던　블롯（Southern blot）사진이다．

　　　도　４는　MODY3 유전자의　프로모터　증폭용　프라이머　세트를　사용하여　증폭한　PCR 산물의　염기서열을　분석하고,　MODY3 유전자의　프로모터　염기서열과　비교하여　나타낸　결과이다．

　　　도　５는　다중　PCR 반응　조성액을　-20℃　냉동고 및　-70℃ 냉동고에　보관하면서， 보관기간에　따른　반응　조성액의　안정성을 조사한　결과를　나타내는　아가로스　젤　전기영동　사진이다．　

　　　도　６（A)~6(C)는 PCR 증폭　장치에　따른　다중　PCR 산물의 양상을 나타낸　아가로스　젤　전기영동　사진이다.　

　　　　이하, 본　발명을　보다　구체적으로 설명하고자 한다.

　　　　본　발명의　목적을　달성하기　위하여，　본　발명에서는　다음과　같은　요소들을　포함하는　여러　가지　인자들을　고려하여，　인간　HNF-1a 유전자의　특정　서열　즉，　프로모터　또는　엑손　１내지１０　부분의　증폭에　효과적인　PCR 프라이머를　디자인한다：　①　프라이머들이 특정　부위만을 증폭시킬　것， ②　그　증폭이 다음 단계의 분석에 이용될　수　있을　만큼　충분할　것, ③　PCR 반응시 프라이머　간의 방해가 없을　것，④　Tm　값,　⑤　헤어핀　형성이　없을　것，　⑥　동일　프라이머　끼리의　이량체　형성（primer self-dimer)이나　프라이머　쌍끼리의　이량체　형성(primer pair-dimer)이　없을　것, ⑦　하나의 염기가 4번 이상 계속하여 반복해서 들어가지 않을　것，　⑧　마이크로새털라이트（microsatellite）부분을 포함하지　않을　것, ⑨　반복서열（repetitive sequence）부분을 포함하지　않을　것.　　　　　

　　　상기에서　디자인된　프라이머는　본　발명　특유의　것으로，　상업적으로　유통되고　있는　프라이머　디자인　소프트웨어로　용이하게　구할　수　없다.　본 발명의 프라이머의 염기서열을 표 1에 도시했다.　

　　　본　발명의　프라이머에는　디자인된　각　프라이머에서　염기의　부가，　결실，　치환　등이　가해진　변형체，　바람직하게는　프라이머　세트에서 양쪽 말단으로 최대 3개 뉴클레오티드가　추가　또는　결실된　올리고뉴클레오티드도　포함된다．　　　

　　　본　발명에서　디자인된　프라이머　세트　각각을　별도의　튜브에　넣고　PCR한　다음， 그　단일　PCR 산물의 염기서열　분석　 및　서던　블롯팅（Southern blotting）등을　통해，　해당　유전자　부위가　증폭되었음을　확인한다．　그런　다음，　상기　１０가지　프라이머　세트　모두를　한　튜브에　넣고　다중　PCR　증폭，　다중　PCR 산물의 염기서열　분석　등을　하여도， 단일　PCR에　의한　증폭　결과와　마찬가지로　해당　특정　유전자　부위가　효과적으로　증폭되는　것을　확인한다．　또한，　각각의 PCR 산물이 다음 단계의 분석에 이용될　정도로　충분히　증폭되며，PCR시에 프라이머　간의 방해나 프라이머끼리의 상호 작용에 의한 부산물이 생성되지　않는다는　점　등이　실험을　통해　입증되므로써，　본　발명의　프라이머　세트는　MODY3 유전자 증폭을 위한 PCR, 특히　다중　PCR을위하여 매우 적합하다는 것을　알　수　있다. 　　

　　　유전자　증폭이　DNA 칩　등을　이용한　MODY3 유전자의　염기 변이　분석에　필수적으로　요구되는　과정이라는　점을　감안할　때，　본　발명의　프라이머　세트를　이용하는　다중　PCR에　의한　MODY3 유전자의　증폭은 MODY3 유전자의 염기　변이　분석을 빠르고 경제적이며 정확하게 하는데　크게　기여하게　된다． 결국，　본 발명의　프라이머는 그 경제적 가치와 정확성으로 인하여 상업적인 이용 가능성이 매우 높다고 할 것이다. 　특히， DNA　칩 등과　같이　혼성화를　이용한 MODY3 유전자 변형 분석에 그　이용가치가 매우 높다.

　　　종래의 각종 유전자 검사 및 진단 방법에서는 유전자들의 각 부분을 각각 증폭시켜야 하기 때문에，　다량의 환자 혈액 필요(많은 DNA 필요)，다량의 시약 필요(중합효소 등 증폭시 필요한 각종 시약)，분석에 장시간이　요구되는　등의　단점을 가졌다. 　그러나，　소량의　시료를　요하는　DNA칩을 이용하여　환자의 진단 및 분석을　수행하는 경우，　본　발명의　프라이머　세트를　이용하는　다중　PCR은　소량의　시료로도　MODY3 유전자의 모든 부분을 신속히　정확하게　증폭하므로，　매우　효과적이다

　　　아울러，　본　발명의　프라이머는　MODY3 유전자의　염기서열　분석이나　표적　DNA 서열　증폭용　키트에　효과적으로　사용될　수　있다．

　　　이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게서 자명할 것이다.

실시예　1 :　다중　PCR을 통해 １０가지　해당　유전자　부위의 증폭

실험예 1－１：　MODY3 유전자의　１０가지　해당부위　증폭용　프라이머　제작　

　　　　각　프라이머　제작시， 예상되는 PCR　산물들의 크기가　최소 25bp정도 차이　나도록　프라이머를　디자인하였다. 또한，　프라이머　제작 시에 다음의　사항들이　고려되었다： ①　프라이머들이 특정　부위만을 증폭시킬　것， ②　그　증폭이 다음 단계의 분석에 이용될　수　있을　만큼　충분할　것, ③　PCR 반응시 프라이머　간의 방해가 없을　것，④　Tm　값,　⑤　헤어핀　형성이　없을　것，　⑥　동일　프라이머　내에서의　이량체　형성（primer self-dimer)이나　프라이머　쌍 끼리의　이량체　형성(primer pair-dimer)이　없을　것, ⑦　하나의 염기가 4번 이상 계속하여 반복해서 들어가지 않을　것， ⑧　마이크로새털라이트（microsatellite）부분을 포함하지　않을　것, ⑨　반복서열（repetitive sequence）부분을 포함하지　않을　것.

　　　프라이머들에 대한 분석　과정에서는　HYBsimulator^TM(Advanced Gene Computing Technologies, Inc)가　사용되었다.

　　　또한，　PCR 산물의　증폭 효율성을 증대시키기 위해서，　정방향　프라이머（forward primer）에는 T7 프로모터　서열(taatacgactcactataggg；　서열번호　１）을，　역방향　프라이머（reverse primer) 에는 T3 프로모터　서열 （gtaaccctcactaaaggga；　서열번호　２） 을　5'말단에 첨가시킨　후， 후술하는　PCR 반응에　사용하였다. 상기 디자인된 프라이머는 통상의 올리고 뉴클레오티드합성방법에 의해 제조하였다.

각 프라이머의　서열 및 특성은　하기　표 1에 나타내었다.

　표１：

실험예 １－２：　단일 PCR에　의한　MODY3 유전자의　증폭

　실험예１－１에서　제작된　각　프라이머　세트가　해당　유전자　부위를　증폭하는지　확인하기　위하여，　각　엑손별로　다음과　같은　반응 용액의 조성으로，　초기　변성（initial denaturation，95℃에서　5분), 변성(95℃에서　30초),　어닐링 （annealing，64℃에서　15초), 연장 （extension，　72℃에서　30초), 최종　연장 （final extension， 72℃에서　３분) 을　30회（cycles) 반복하는　단일　PCR을　수행하였다．

　　　　　DNase　및　RNase가　제거된　멸균된 물 12.8㎕

　　　　　dNTP 믹스(각　뉴클레오티드　2.5mM) 2㎕

　　　　　10X Taq 중합효소　완충용액　　 2㎕

　　　　　프라이머　세트(각　프라이머　10pmol) 2㎕

　　　　　지놈 DNA (200-1.0㎍) 　　　　 1㎕

　　　　　Taq 중합효소 (5Unit/ ㎕) 0.2㎕　　

　　　상기의　단일　PCR　결과는　1.8% 아가로스　젤　전기영동　상에서 분자량　마커를　기준으로 하여 확인하였는데，　도　１에　나타내었다. 　도　１에서，　레인　１ 및　레인　１３은　５０bp　DNA　래더（ladder)　분자량　마커를　나타내고，　레인　２는 프로모터， 레인 3은 엑손 1, 레인 4는 엑손 2, 레인 5는 엑손 3, 레인 6은 엑손 4, 레인 7은 엑손 5, 레인 8은 엑손 6, 레인 9는 엑손 7, 레인 10은 엑손 ８＆９, 레인 １１은 엑손 10부분을 각각　증폭한　PCR 산물을　나타내며，　레인　１２은　하기　실험예　１－３에서　얻은　다중　PCR 산물을　나타낸다．　

　　　도　１에서　보듯이，　실험예１－１에서　제작된　각　프라이머　세트의　해당　유전자　부위의　정확한　증폭은　단일　PCR 및　하기　실험예　１－３의　다중　PCR을　통해　알　수　있었다．

실험예 １－3： 다중　PCR에　의한　MODY3 유전자의　증폭

실험예 １－2를 통해 해당　유전자　부위가　각각　증폭되는　것을 확인하고，　실험예１－１에서　제작된　각　프라이머　세트를　한 튜브에 넣고 모두 증폭이 되도록 다중 PCR을 수행하였다. 다중　PCR은　다음과　같은　반응 용액의 조성으로，　초기　변성（95℃에서　5분), 변성(95℃에서　30초),　어닐링（64℃에서　15초), 연장（72℃에서　30초), 최종　연장（72℃에서　３분)을　30회（cycles) 반복하여　수행하였다．

　　　　　DNase　및　RNase가　제거된　물 20.4㎕

　　　　　dNTP 믹스(각　뉴클레오티드　2.5mM) ５㎕

　　　　　10X Taq 중합효소　완충용액　　５㎕

　　　　　프라이머　세트(각　프라이머　10pmol) １8㎕

　　　　　지놈 DNA (200-1.0㎍) 　　　　 1 ㎕

　　　　　Taq 중합효소 (5Unit/ ㎕) 0.６㎕　　

　　　상기의　다중　PCR　결과는　1.8% 아가로스　젤　전기영동　상에서 분자량　마커를　기준으로 하여 확인하였는데， 도　１의　레인　１２에　나타내었다．　도　１에서　보듯이，　다중　PCR을　통해，１０가지　해당　유전자　부위（579, 459, 365, 308, ３３２，２４１，２８６，230, 414, 171bp)가 모두 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.

　　실험예 １－4：　변형된　프라이머를　이용한　다중　PCR로부터의　MODY3 유전자　증폭　

　　실험예 １－3을 통해 총 １０개의 유전자가 증폭되는 것을 확인하고서，4개　프라이머　세트(프로모터, 엑손　1, 엑손　2, 엑손　8)의　양쪽 말단에서부터　3 뉴클레오티드가 추가 또는 결실되는　변형　프라이머（참조：　표　２）를 합성하여，　실험예 １－3의 방법으로　다중　PCR을 수행하였다.

표　２：　

프라이머　명칭	염기서열
프로모터　정방향	( tgg) ccgtgagcatcctctgcc ctt (서열번호23:ccgtgagcatcctctgcc ctt )
프로모터　역방향	*acc* gcgtgggttgcgtttgcc (tgc) (서열번호24: *acc* gcgtgggttgcgtttgcc)
엑손 1 정방향	*ccg* cgtggccctgtggcagc (cga) (서열번호25: *ccg* cgtggccctgtggcagc)
엑손　1 역방향	(ggg) ctcgttaggagctgaggg ggg (서열번호26:ctcgttaggagctgaggg ggg )
엑손 2 정방향	(ccc) ttgctgagcagatcccgtc ctt (서열번호27:ttgctgagcagatcccgtc ctt )
엑손 2 역방향	*atg* gggatggtgaagcttcca (gcc) (서열번호28: *atg* gggatggtgaagcttcca)
엑손 8 정방향	*ggt* ggcccagtacacccacac (ggg) (서열번호29: *ggt* ggcccagtacacccacac)
엑손 8 역방향	(ggg) cagggacagtaagggagg ggg (서열번호30:cagggacagtaagggagg ggg )

(xxx) : 표１의　해당　프라이머를　기준으로　결실된 뉴클레오티드

xxx : 표１의　해당　프라이머를　기준으로　추가된 뉴클레오티드

　　　다중　PCR의 결과는 도 ２의 A~E에　나타내었다．　도 ２의 A는　변형된　프로모터　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과， 도 ２의 B는　변형된　엑손１　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과，도 ２의 C는　변형된　엑손2　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과, 도 ２의 D는　변형된　엑손8　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과，　도 ２의 E는 상기　기술한　변형된　프라이머　세트　모두를　사용하여　다중　PCR한　결과를　각각　나타낸다．　도 ２의 A 내지 E에서，　레인　１은　５０bp　DNA　래더　분자량　마커를　나타내고，　레인　２는　상기　표　１의　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과，　레인　３은　상기　표　２의　변형된　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과，　레인　４는　변형　유무에　관계없이　해당　프라이머　세트　자체를　빼고서　다중　PCR한　결과를　각각　나타낸다(화살표는 빠진 밴드를가리킴)．　　　

　　　도 ２의 A 내지 E에서　보듯이，　4개의 변형된 프라이머　세트에 의해서도 원래의 프라이머 세트와 마찬가지로 해당　유전자　부위가 모두 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2 : 다중　PCR에　의해　증폭된 산물의 확인

실험예 ２－１ : 서던　블롯팅（Southern blotting）을　통한　다중　PCR 산물의　확인

　　　 실시예 １의　실험예　１－２와　실험예　１－３에서와　같이　PCR 산물을　증폭시킨　후，1.8% 아가로스　젤　상에서 각 산물을 전개하였다 (참조:　도　１). 이 젤을　변성　용액 ( 0.5N NaOH　＋　1.5M NaCl)에서 15분간 천천히 흔들어 주면서， 젤　상의　이중가닥 DNA를 변성시켰다． 이와　같은 과정을 두　번 반복한 후, 증류수로 젤을　세척하고서， 15분간 중화　용액 (3M　NaCl이　포함된　0.5M Tris-HCl,　pH　7.5)에서 천천히 흔들어 주면서 젤을　두　번 중화시켰다. 그런　다음，　젤에　존재하는 DNA와　나일론막（nylon membrane）을 20X SSC용액에서 12시간 정도 반응시켜，　모세관현상을 이용하여 DNA를　나일론막으로　이동시켰다．　　이어，　나일론막을　120℃에서 30분간 방치하거나 U.V.를　조사함으로써　교차결합（crosslink）시키고, 증류수로 그　막을 1-2분 세척한 후 건조시켰다.

　　상기에서　기술한　바와　같이　DNA가 부착된　막을　20ml　혼성화용액에 넣어 62℃에서 2시간 정도 예혼성화（prehybridization）반응을 시키고서　그　용액을 버렸다. 　그런　다음，　예혼성화된　DNA 부착 막과　　DIG（digoxigenin）표지의　프로브　5pmol/ml(100pmol(5pmol/㎕) 농도의 PCR 프라이머와 digoxigenin-11-ddUTP　0.05 mM을 37℃에서 반응시킨　후, 1 ㎕의 EDTA(200mM, pH8.0)를 넣어 표지　반응을 종결시키고서，　이것을 프로브로　사용하기 위해　10ml의 혼성화용액　백（bag)에 넣고， 62℃에서 12시간 정도 반응시켰다. 　이 반응　동안 DIG　표지의　프로브는　막에　있는 DNA와 상보적인 유전자 부위에 결합을 하게 된다. 그리고 결합하지 못한 프로브를　제거하기 위해서 2X 세척용　용액 (2X SSC+0.1% SDS)으로　상온에서 5분간 2회 반복　세척하고, 0.5X 세척용　용액 (0.5X SSC+0.1% SDS)으로 62℃에서 15분간 2회 반복　세척하였다.

　　그런　다음，DIG에 결합할 항체를 넣어　주기　전에， 다른 부분에 항체가　붙지 않도록 20ml 블로킹　용액에서 30-60분간 처리한　다음, 새로운 블로킹　용액(20ml)에 알칼리성　포스파타제（alkaline phosphatase）가 연결된 항체를 1㎕　첨가하여 30분 정도 반응시켰다. 　이어，　세척　완충액 (100mM maleic acid, 150mM NaCl, pH7.5(상온 20℃),　0.3% Tween 20)으로 15분씩 두　번 세척해 주었다. 그 다음， 막　위에 있는 DNA와 프로브의 결합을 확인하기 위해서,　알칼리성　포스파타제의　기질(substrate)인 CDP-스타를　검출　완충용액에 1:100의 비율로 섞어 막에 5분간 처리한 후, X-ray 필름에 감광시켰다. 　감광된 필름을　현상하여 프로브가　붙은 위치를 확인하였고， 그 결과는 도 ３에　나타내었다. 도 3은 각 엑손 별 프라이머를 DIG으로 표지한 후 단일 PCR 및 다중 PCR 산물에 혼성화(hybridization)한 결과이다. 도　3에서，　레인　１및　레인　１３은　DIG(digoxigenin)으로 표지된　분자량　마커를　나타내고，　레인　２는 프로모터， 레인 3은 엑손 1, 레인 4는 엑손 2, 레인 5는 엑손 3, 레인 6은 엑손 4, 레인 7은 엑손 5, 레인 8은 엑손 6, 레인 9는 엑손 7, 레인 10은 엑손 ８&９, 레인 １１은 엑손 10부분을 증폭한 PCR 산물이다.　레인　１２은　다중　PCR 산물을　나타낸다．

　　도 ３에서　보듯이，　단일　PCR과 다중 PCR의 같은 위치에서 프로브가 붙음으로써，　증폭된 산물이 동일함을　알 수 있었다.

실험예 2－２: 서열분석을　통한　다중　PCR 산물의　확인

　실시예 １의　실험예　１－３에서와　같이　다중　PCR 산물을　증폭시킨　후，1.8% 아가로스　젤　상에서 각 산물을 전개시키고，　각각의 DNA 밴드를　잘라내어 젤　추출　키트（gel extraction kit）를 사용하여 DNA를 정제하였다. 이렇게 정제된 DNA를 ABI3700을 이용하여 염기서열을 확인하였고, 그　염기서열을　DNAstar 소프트웨어를　사용하여 MODY3 유전자와　비교　분석하였으며，　그　결과는　도 ４에 나타내었다. 　도　４는　프로모터　프라이머　세트를　사용하여　PCR한　결과에　해당한다．　인간 게놈 DNA(human genomic DNA)를 프라이머 1(서열번호3) 및 2(서열번호4)를 사용하여 PCR 증폭한 후 그 증폭 산물에 대해서 자동 서열분석(automatic sequencing) 방법을 사용하여 염기서열을 분석하고 MODY3 유전자와 비교하여 본 결과(Query)이다. 정렬(alignment) 결과는 434 레지듀 오버랩(residues overlap)에서 100% 동일함을 보였다. 갭 빈도(gapfrequency)는 0%였다. 프로모터　이외의 나머지 8개 엑손에 대한 분석결과도 이와　같은 방법으로　염기서열을　확인하였는　바，　모두　１００％ 상동성을　나타내었다．

실시예 3 : 다중　PCR 반응　조성액의　안정성　시험

다중　PCR 반응　조성액의 안정성（stability）을 검사하기 위하여，　상기　실험예　１－3에　개시된　PCR 반응　조성액(지놈　DNA 제외)을 대량 조제하여，　한 번 PCR 반응 분량인 49㎕씩을 0.2ml PCR 튜브에 분주하고，　-20℃　냉동고 　 및　-70℃ 냉동고에　3개월 동안 보관하면서，１일，３일，　４일，　１주，　２주，　3주, 12주째　되는　날에　PCR 튜브를　꺼내어　다중　PCR 반응을 수행하였다（참조：　도　５). 도5에서 레인 1은 분자량마커, 레인 2는 -20℃의 실험결과, 레인 3은 -70℃의 실험결과를 나타낸다(왼쪽에서부터 각각 레인 1, 레인 2, 레인 3).　도　５에서　보듯이，　본　발명의　다중　PCR 프라이머를　포함한 PCR 반응　조성액은　3개월　동안 냉동고(-20℃　또는　-70℃)에서 보관하여도 PCR 산물에 변화를 주지 않는 안정한 조성액 임을 알　수　있었다．　

실시예 4 : 다양한　PCR 증폭　장치에　따른　유전자　증폭　양상

PCR 증폭　장치에　따른　PCR 산물의 양상을 확인하기 위해서，　상기　실험예　１－3에서　개시된　다중　PCR 반응　조성액과 반응조건으로， PCR　증폭장치만을　달리하여 유전자를　증폭시키고　아가로스　젤　전기영동하였다（참조：　도　６（A)~6(C)).

도　６（A)는　MJ Research사의　PTC-100　기종을　PCR 증폭장치로　사용한　경우의　다중　PCR 산물을　나타내고，　도　６（B)는 Applied Biosystems사의 GeneAmp 9700 기종을　PCR 증폭장치로　사용한　경우의　다중　PCR 산물을　나타내며,　도　６（C)는 ThermoHybaid사의 MBS (Multi-Block System) 기종을　PCR 증폭장치로　사용한　경우의　다중　PCR 산물을　나타낸다．　

　　　도　６（A)~6(C)에서，　레인　１은　５０bp　DNA　래더　분자량　마커를　나타내고，　레인　２는　상기　표　１의　프라이머　세트를　사용하여　다중　PCR한　결과를　나타낸다．화살표는 각각 350bp 및 50bp를 가르킨다.　　

　　　도　６（A)~6(C)에서　보듯이，PCR 증폭장치가　다르더라도　동일한　패턴의　PCR산물이　생성되었는　바，　본　발명의　프라이머　세트를　사용한　다중　PCR은　매우 안정화되고 경제적인　방법임을 알　수　있었다.

　　　이상에서　설명하고　입증하였듯이, 본　발명에서　디자인된　MODY3 유전자　증폭용　프라이머　세트는　단일　또는　다중　PCR에　의해　해당　유전자　산물을　효과적으로　증폭하였다．　특히，　다중　PCR에　의한　MODY3 유전자의　각　엑손　증폭은　DNA 칩（소량의　시료　요구）을　이용한　유전자　분석　 및　질병의　진단을　가능케　한다．　

<110> LEE, Yeon Su KIM, Mi Kyung LEE, Jung Nam <120> Primer set for MODY3 gene amplification by multiplex polymerase chain reaction <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteriophage T7 <400> 1 taatacgact cactataggg 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Bacteriophage T3 <400> 2 gtaaccctca ctaaaggga 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying promoter of MODY3 gene <400> 3 tggccgtgag catcctctgc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying promoter of MODY3 gene <400> 4 gcgtgggttg cgtttgcctg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon1 of MODY3 gene <400> 5 cgtggccctg tggcagccga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon1 of MODY3 gene <400> 6 gggctcgtta ggagctgagg g 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon2 of MODY3 gene <400> 7 cccttgctga gcagatcccg tc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon2 of MODY3 gene <400> 8 gggatggtga agcttccagc c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon3 of MODY3 gene <400> 9 gcaaggtcag gggaatggac 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon3 of MODY3 gene <400> 10 cgccgttgta cctattgcac tcc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon4 of MODY3 gene <400> 11 ggctcatggg tggctatttc tgc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon4 of MODY3 gene <400> 12 cgtgtccctt gtccccacat acc 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon5 of MODY3 gene <400> 13 tgctgaggca ggacactgct tc 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon5 of MODY3 gene <400> 14 tacaagcaag gacactcacc agc 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon6 of MODY3 gene <400> 15 cccggacaca gcttggcttc c 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon6 of MODY3 gene <400> 16 atccccacca gcttaccgat gac 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon7 of MODY3 gene <400> 17 caggcctggc ctccacgcag 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon7 of MODY3 gene <400> 18 ggggctctgc agctgagcca t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon8 and 9 of MODY3 gene <400> 19 ggcccagtac acccacacgg g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying exon8 and 9 of MODY3 gene <400> 20 gggcagggac agtaagggag g 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon10 of MODY3 gene <400> 21 gccttgtttg cctctgcagt g 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying exon10 of MODY3 gene <400> 22 ggccatctgg gtggagatga ag 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified forward primer for amplifying promoter of MODY3 gene <400> 23 ccgtgagcat cctctgccct t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified reverse primer for amplifying promoter of MODY3 gene <400> 24 accgcgtggg ttgcgtttgc c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified forward primer for amplifying exon1 of MODY3 gene <400> 25 ccgcgtggcc ctgtggcagc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified reverse primer for amplifying exon1 of MODY3 gene <400> 26 ctcgttagga gctgaggggg g 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified forward primer for amplifying exon2 of MODY3 gene <400> 27 ttgctgagca gatcccgtcc tt 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified reverse primer for amplifying exon2 of MODY3 gene <400> 28 atggggatgg tgaagcttcc a 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified forward primer for amplifying exon8 of MODY3 gene <400> 29 ggtggcccag tacacccaca c 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified reverse primer for amplifying exon8 of MODY3 gene <400> 30 cagggacagt aagggagggg g 21

Claims

　인간　HNF-1a 유전자의　특정 서열을　증폭하는,　하기 프라이머 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종의 PCR 프라이머 세트 또는 그 세트를 구성하는 각 프라이머:

서열번호 ３과 ４의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 ５과 ６의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호　７과 ８의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 ９와　１０의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 １１과 1２의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 1３과 1４의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트；

서열번호 1５과　1６의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 1７와 1８의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 1９과　２０의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트；　및，

서열번호 ２１과　２２의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트.
인간　HNF-1a 유전자의　특정 서열　다수（multiple target DNA sequences）를　동시에　증폭하기　위해　하기　프라이머　세트를　포함하는　다중　PCR 프라이머　세트：

서열번호 ３과 ４의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 ５과 ６의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호　７와 ８의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 ９과　１０의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 １１와 1２의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 1３과 1４의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트；

서열번호 1５과 1６의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 1７와 1８의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트;

서열번호 1９와　２０의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머　세트；　및，

서열번호 ２１와　２２의 염기서열 또는 이들 염기서열의 3′ 말단, 5′ 말단, 또는 3′및 5′양쪽 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 더 연결 또는 결실된 올리고뉴클레오티드로　구성된 프라이머　세트.
제 1항 있어서, 상기 프라이머　세트를　구성하는 각 뉴클레오티드의　5'말단에는 서열번호 1의 T7 프로모터　서열　또는 서열번호 2의 T3 프로모터　서열이 부착되어　있는　것을 특징으로 하는 PCR 프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머.
제 3항에 있어서, 서열번호 3,5,7,9,11,13,15,17，１９，２１의 5'말단에는 서열번호 1의 T7 프로모터　서열이　부착되어　있고, 서열번호 4,6,8,10,12,14,16,18，２０，２２의 5'말단에는 서열번호 2의 T3 프로모터　서열이　부착된　것을 특징으로 하는 PCR 프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머.
제 2항에 있어서, 상기 프라이머　세트를　구성하는 각 뉴클레오티드의　5'말단에는 서열번호 1의 T7 프로모터　서열　또는 서열번호 2의 T3 프로모터　서열이 부착되어　있는　것을 특징으로 하는 PCR 프라이머　세트　또는 그　세트를　구성하는　프라이머.
제 5항에 있어서, 서열번호　3,5,7,9,11,13,15,17，１９，２１의 5'말단에는 서열번호 1의 T7 프로모터　서열이　부착되어　있고, 서열번호 4,6,8,10,12,14,16,18，２０，２２의 5'말단에는 서열번호 2의 T3 프로모터　서열이　부착된　것을 특징으로 하는 PCR 프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의　프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머를　사용하여, 인간　HNF-1a 유전자의　특정 서열을　 PCR에 의해 증폭하는　방법.
제 7항에 있어서, PCR은 0.1μM~1μM 농도의 프라이머, 100ng~1㎍의　주형 DNA(template DNA), 초기　변성　1~5분 (90~98℃), 변성　10초~1분(90~98℃), 어닐링　5초~3분(60~65℃), 연장　5초~5분(70~75℃), 최종　연장　1~10분(70~75℃)의 반응 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머를　사용하여, 인간　HNF-1a 유전자의　특정　염기서열을 분석하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 프라이머　세트　또는　그　세트를　구성하는　프라이머를　함유하는, 인간　HNF-1a 유전자의　특정 서열　증폭용 PCR 키트.