KR101718800B1 - 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도 - Google Patents

약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노복합체, 그리고 이를 포함하는 약제학적 조성물, 약물 전달 시스템 및 약물 운반 방법에 관한 것이다. 본 발명의 나노복합체는 핵산 분자, 일가양이온성 약물 및 생체적합성 폴리머 계면활성제로 구성되며, 10 nm 이하의 유체역학적 크기를 가지면서 수용성 환경에서 콜로이드 형태로 균일하게 분포한다. 또한, 본 발명의 나노스케일 콜로이드 제형은 안정적인 단일복합체의 형성을 통해 생리학적 환경에 풍부한 뉴클레아제들(예컨대, 혈청 뉴클레아제들)로부터 핵산 분자를 보호할 수 있고, 마이셀성 구조를 통해 세포 투과 및 인 비보 운반의 개선 뿐 아니라 마이셀성 부동태화(micellar passivation)에 의한 핵산 분자의 추가적인 보호를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노복합체 및 이를 포함하는 조성물 및 시스템은 활성 성분(예컨대, 핵산 분자 및 일가양이온성 약물)을 안정적으로 목적 세포/조직에 운반할 수 있으며, 상기 활성 성분에 따라 다양한 질환(구체적으로, 암)의 치료 또는 검출에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도{Nanocomplexs for Co-delivering a Drug and siRNA and Uses Thereof}
본 발명은 약물 및 siRNA의 공동-운반용 나노복합체, 그리고 이를 포함하는 약제학적 조성물, 약물 전달 시스템 및 약물 운반 방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference, RNAi)의 발견 이래로, 작은 간섭성 RNA들(siRNAs)이 새로운 강력한 치료적 전략으로 탐구되어 왔었다[1-4]. siRNA의 유망한 적용들 중에서, 공격적인 암세포들에서 발생되는 약물 저항 경로들의 하향-조절은 안 좋은 예후를 가지는 특이적 종양 타입들의 타겟팅 치료를 가능하게 한다. 공동-운반 시스템을 통해 그러한 유전자-타겟팅 siRNA를 항암제들과 조합하는 것은 상기 저항성 세포들을 무력화시켜 화학치료법의 치료 효능을 크게 개선시킬 수 있다(화학요법민감화(chemosensitization))[5-10]. 하지만, 임상적 관점에서 siRNA 치료법의 개발은 적합한 비바이러스 운반 시스템들의 부재로 인해 제한되고 있다. 많은 시도들이 DNA 운반에 적용되는 유사한 방법들로 행해졌을 지라도, siRNA는 DNA와 비교하여 짧은 체인 길이 및 견고한 백본 구조 같은 다른 물리화학적 특징들을 가지기 때문에 상기 시도들은 siRNA의 운반에 완벽하게 적합하지는 않다[11, 12]. 나노성(nanoscopic) 유전자 패키징을 위한 전형적인 기작은 주로 다가음이온성 유전자들과 복합체화 제제들(양이온성 폴리머들 또는 리포좀들) 간의 정전기성 다중복합체화(electrostatic polycomplexation)에 기반되어 왔었다[13-16]. 또한, 이전 연구들[17, 18]은 DNA와 일가양이온성 계면활성제들 간의 정전기성 상호작용이 비수용성 기능적 고체들을 제조하기 위한 유기-가용성 복합체들을 생산할 수 있다는 것을 보였다. 상술한 복합체들에서, 상기 다가음이온성 DNA 백본 상의 각 음이온성 전하는 양이온성 계면활성제 분자와 단일복합체화를 이룬다. 그 결과, DNA의 모든 단일 체인은 복수의 단일복합체화에 의해 많은 계면활성제들로 둘러싸여지고, 전체적으로 전하 중성화가 용해성 역전(solubility reversal)을 유도하여 유기 용해성을 가지는 계면활성제-덮여진(jacketed) 소수화된 DNA 체인들을 생산시킨다. 하지만, 임상적 이용에 있어서 상기 결과적인 폴리플렉스/리포플렉스 시스템들은 짧고/견고한 siRNA의 비효율적/느슨한 패키징에 따라 완전한 복합체화를 위해 요구되는 높은 몰 비율의 세포독성 양이온성 제제들-대-siRNA 같은 해결되야 할 문제들을 가진다. 따라서, 임상 적용을 위한 보다 효율적인 siRNA/약물 공동-운반 시스템이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 목적 핵산 분자를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 핵산 분자(예를 들어, siRNA) 및 일가양이온성 약물(예를 들어, 항암제인 벤제토늄 클로라이드)을 결합시킨 다수의 단일복합체(monocomplex)를 생체적합성 폴리머 계면활성제(예를 들어, 플루로닉 F-68)로 포집(encapsulation)시켜 3원 나노복합체를 제형화시켰으며, 상기 나노복합체가 보다 용이하고 안정적으로 세포(구체적으로는, 종양 세포) 내로 침투하고, 이에 따라 공동-운반된 치료제들(즉, 핵산 분자 및 일가양이온성 약물)이 목적 세포/조직에서 탁월한 상승적 목적 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 나노복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 약물 전달 시스템(drug delivery system)을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적 세포 또는 조직(cell or tissue of interest)으로의 약물 운반 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (i) 타겟팅 모이어티(targeting moiety)를 가지는 핵산 분자; 및 (ii) 일가양이온성 약물로 이루어진 단일복합체(hydrophobically associated multiple monocomplex, HMplex); 및 (b) 복수의 상기 단일복합체들을 포집하는 생체적합성 폴리머 계면활성제를 포함하는 나노복합체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 나노복합체를 포함하는 약물 전달 시스템을 제공한다.
본 발명자들은 목적 핵산 분자를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 핵산 분자(예를 들어, siRNA) 및 일가양이온성 약물(예를 들어, 항암제인 벤제토늄 클로라이드)을 결합시킨 다수의 단일복합체(monocomplex)를 생체적합성 폴리머 계면활성제(예를 들어, 플루로닉 F-68)로 포집시켜 3원 나노복합체를 제형화시켰으며, 상기 나노복합체가 보다 용이하고 안정적으로 세포(구체적으로는, 종양 세포) 내로 침투하고, 이에 따라 공동-운반된 치료제들(즉, 핵산 분자 및 일가양이온성 약물)이 목적 세포/조직에서 탁월한 상승적 목적 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
인간 게놈 프로젝트가 완성됨에 따라 유전자를 이용한 질환 치료가 강력한 수단이 되었다. 즉, 특정 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자의 발현을 조절함으로써 상기 질환을 치료하고자 하는 수많은 시도들(예컨대, 예를 들어, 암에서 과다발현되는 유전자인 Bcl-2의 발현을 억제하여 암을 치료하고자 하는 방법)이 행해졌다. 이러한 시도가 매우 효과적이고 간편한 치료법으로 기능할 수 있지만, 이를 위한 전제조건은 상기 유전자의 발현을 조절(증가 또는 억제)하기 위한 유효물질을 목적 세포/조직으로 전달하는 것이다.
임상적으로 적용 가능한 약물 전달 시스템을 위해, 본 발명자들은 다가음이온성 핵산 분자와 양이온성 계면활성제 간의 정전기성 상호작용에 의해 형성되는 복합체에서 나타나는 용해성 역전(solubility reversal)을 통해 상기 핵산 분자를 외부 환경으로부터 보호할 수 있다는 사실에 착안하여 본 발명의 나노복합체를 제조하였다.
본 발명의 나노복합체는 3가지 구성성분으로 구성된다: (a) 타겟팅 모이어티를 포함하는 핵산 분자; (b) 일가양이온성 약물; 및 (c) 생체적합성 폴리머 계면활성제.
본 발명에서 사용되는 용어 "타겟팅 모이어티(targeting moiety)"는 발암성 유전자 또는 이의 전사체의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드 서열로, 상기 핵산 분자는 발암성 유전자와 결합하여 발현을 억제하는 모티프 서열이다. 예를 들어, 본 발명의 나노복합체가 암을 타겟팅하는 경우 상기 타겟팅 모이어티는 발암성 유전자의 전사체(즉, mRNA)와 결합하여 이중 가닥 mRNA를 형성함으로써 상기 발암성 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 나노복합체를 이용하여 암을 치료하는 경우, 본 발명의 핵산 분자는 발암성 유전자를 타겟팅한다. 발암성 유전자는 암의 형성, 유지, 증식, 사멸 또는 생존에 영향을 미치는 당업계에 잘 알려져 있는 유전자로, 예를 들어 Bcl-2, Bcl-3, Bcl-4, Bcl-5, Bcl-6, HER2/Neu, HER3, HER4, raf, c-fos, c-jun, c-myc, c-kit, c-met, c-ret, Akt, hTERT, erbB, Sis, src, mdm2, abl, flt3, API, AMLl, axl, alk, fins, fps, gip, lck, MLM, PRAD-I 및 trk를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 타겟팅 모이어티를 포함하는 핵산 분자는 다가음이온성을 띄는 핵산 분자라면 어떠한 것도 이용될 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노복합체 내 핵산 분자는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임 및 DNAyme을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 siRNA를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노복합체로 타겟팅되는 유전자는 발암성 유전자이고, 보다 구체적으로는 Bcl-2이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자의 길이는 100개 이하의 염기, 보다 구체적으로는 70개 이하의 염기, 보다 더 구체적으로는 50개 이하의 염기, 보다 더욱 더 구체적으로는 40개 이하의 염기, 및 가장 구체적으로는 20 내지 30개의 염기이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동적인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자 치료법(gene therapy)으로 기능한다. 또한, siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 구체적으로는 15 내지 80 염기, 및 가장 구체적으로는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3’-말단 돌출한 구조와 5’-말단 쪽이 돌출한 구조도 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수는 1 내지 8개의 염기, 보다 구체적으로는 2 내지 6개의 염기일 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수도 있다. 더욱이, siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 체인 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템-루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, 인 비보에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중 가닥의 스템을 형성한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "마이크로RNA(microRNA, miRNA)"는 21-25개의 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로서 mRNA(messenger RNA)의 3’-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질로, 전장 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다(Bartel DP, et al ., Cell, 23;116(2): 281-297(2004)). miRNA의 생성은 Drosha(RNaseIII type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 miRNA로 만들어진다[Kim VN, et al ., Nat Rev Mol Cell Biol., 6(5): 376-385(2005)]. 상술한 바와 같이 제조된 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성, 등에 관여한다[Wienholds E, et al ., Science, 309(5732): 310-311(2005); Nelson P, et al ., Trends Biochem Sci., 28: 534-540(2003); Lee RC, et al ., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A, et al ., Nat Rev Cancer, 6: 259-269(2006)].
본 명세서에서 용어 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "앱타머(aptamer)"는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오타이드(일반적으로, RNA 분자)를 의미한다. 구체적으로는, 본 명세서에서의 "앱타머"는 올리고뉴클레오타이드 앱타머(예컨대, RNA aptamer)를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al ., Nature 355(6360):564-6(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 일반적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100개의 염기, 구체적으로는 8 내지 60개의 염기, 및 보다 구체적으로는 10 내지 40개의 염기일 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 백본(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al ., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55, 1995).
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 구체적으로는 생리학적 조건 하(세포 내)에서 핵산 분자 내 타겟팅 모이어티가 타겟(예컨대, Bcl-2 유전자)에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
다음으로, 본 발명의 나노복합체는 본 발명의 핵산 분자의 다가음이온성에 결합하는 일가양이온성 약물을 포함한다. 본 발명의 나노복합체에 이용될 수 있는 약물은 일가양이온성을 가지면서 상기 핵산 분자와 정전기성 상호작용을 통해 안정적인 단일복합체(monocomplex)를 형성할 수 있는 물질이라면 어떠한 것도 적용가능하다. 일반적으로, 핵산 분자와 일가양이온성 약물(또는 계면활성제)은 함께 응집되어 단일복합체들(예컨대, HMplex들)을 이루지만 이들은 자가-어셈블리를 통해 큰 유체역학적 크기(예컨대, 200-500 nm)를 가지는 비수용성 이중 복합체들을 형성한다. 이러한 크기의 복합체들은 실제 적용에서 활성 성분의 세포 내 전달(즉, 투과)의 어려움 같은 문제들을 가진다. 이를 해결하기 위해, 본 발명자들은 생체적합성 폴리머 계면활성제를 이용하여 상기 이중 복합체들을 포집(구체적으로는, 마이셀성 포집)하여 보다 작은 크기의 균일한 콜로이드 제형을 만들었는데(참고: 도 1), 이는 상기 3가지 구성성분인 핵산 분자, 일가양이온성 약물 및 생체적합성 폴리머 계면활성제가 정전기적/소수성 상호작용에 의해 나노구조를 형성한다는 것을 의미한다. 더욱이, 상기 나노복합체는 마이셀성 구조를 가져 세포 내로 용이하게 침투할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 단일복합체는 핵산 분자와 일가양이온성 약물의 자가-어셈블리를 통해 형성된다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 핵산 분자와 일가양이온성 약물의 전하 비율은 1:2 이상, 보다 구체적으로는 1:3 이상, 및 보다 더 구체적으로는 1:4 이상이다.
본 발명의 나노복합체의 또 다른 기술적 특징은 상기 일가양이온성 약물이 응집체 형성의 구조적인 기능만을 가지는 것이 아니라, 활성 물질로서도 기능한다는 것이다. 통상적인 약물 전달 시스템, 예컨대 리포좀 매개된 약물 전달 시스템에서 양이온성 지질 또는 폴리머는 주로 리포좀 내에 활성 성분들의 운반을 위한 부형제로서 기능한다. 이와 대조적으로, 본 발명의 예시적인 실시예(항암제를 이용하는 경우)에서, 상기 일가양이온성 약물은 핵산 분자와 응집하여 단단한 단일복합체를 형성함으로써 생리학적 환경, 즉 체액 내로 투여되어도 혈청 뉴클레아제로부터 핵산 분자를 보호하는 구조적인 보호 기능 뿐 아니라, 세포 내로 전달되어 상기 단일복합체가 해체된 후 자체적으로 항암 활성을 나타낸다. 그 결과, 상기 핵산 분자와 일가양이온성 약물이 상승적인 효과를 나타낸다(참고: 도 6 및 도 9).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 일가양이온성 약물은 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride, BZT)이다.
또 다른 중요한 측면으로 콜로이드 제형의 제조에 사용되는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 일반적으로 큰 유체역학적 크기를 가지는 본 발명의 HMplex들을 임상적으로 적용가능한 콜로이드 제형으로 포집시킨다. 본 발명의 나노복합체에 이용되는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 본 발명의 단일복합체들을 포집(구체적으로는, 마이셀성 포집)시킬 수 있는 물질이라면 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체(polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer), 폴리비닐 알코올 및 젤라틴을 포함하며, 보다 더 구체적으로는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 다음의 화학식 1로 표시되는 비-이온성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체(폴록사머)이다:
화학식 1
(PE)x-(PPO)y-(PE)z
상기 화학식에서, PE는 에틸렌옥사이드, PPO는 프로필렌옥사이드, x, y 및 z는 각각 독립적으로 1-10,000의 정수이다.
상기 폴록사머는 폴리프로필렌 옥사이드의 소수성 센터 및 폴리에틸렌 옥사이드의 양 끝의 친수성 폴리 택(tag)으로 구성된 양친매성 삼중블럭(tri-block) 구조로, 소수성 오일 물질의 물 용해도를 증가시키거나 서로 다른 성질을 지니는 두 물질의 혼화성(miscibility)를 증가시키는 데 이용될 수 있으며, 상기 x, y 및 z의 구성에 따라 다양한 플루로닉스(pluronics) 상표명(BASF Corporation)으로 구입이 가능하고, 예를 들어 플루로닉 F-38, F-68, F-77, F-98, F-108 및 F-127을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 폴록사머는 양친매성 구조를 가지기 때문에, 소수성 오일 물질의 물 용해도를 증가시키거나 서로 다른 성질을 지니는 두 물질의 혼화성(miscibility)를 증가시키는 데 폴록사머를 이용한다. 폴록사머는 공업, 화장품 또는 의학 분야에 응용되며, 특히 약물 운반 시스템의 모델 시스템으로 유용하게 이용된다. 또한, 폴록사머의 첨가는 세포 완충 효능(cell cushioning effects)으로 인해 세포를 낮은 스트레스 조건에 놓이게 하기 때문에 세포 배양 배지에 매우 유용하다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 플루로닉 F-68이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 나노복합체는 세포 투과능을 가진다(참고: 도 7a).
또한, 본 발명의 나노복합체 내 핵산 분자 또는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 형광성 모이어티로 표지될 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노복합체는 50 nm 이하, 보다 구체적으로는 40 nm 이하, 보다 더 구체적으로는 20 nm 이하, 및 가장 구체적으로는 10 nm 이하의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 가지고, 수용성 환경에서 콜로이드 형태로 균일하게 분포한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 나노복합체는 상기 핵산 분자와 일가양이온성 약물의 타겟(예컨대, 특정 질환과 관계된 유전자)에 따라 다양하게 적용가능하다. 본 발명의 나노복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 암 치료에 적용하는 경우 상기 복합체 내 핵산 분자와 일가양이온성 약물은 항암 기능을 제공한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 핵산 분자는 발암성 유전자인 Bcl-2의 발현을 억제하는 핵산 분자이고 일가양이온성 약물은 항암제, 보다 구체적으로는 벤제토늄 클로라이드(BZT)이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여(예컨대, 종양주변 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여)할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 나노복합체를 대상자(subject)에게 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상자의 목적 세포 또는 조직에서 형광을 측정하는 단계를 포함하는 목적 세포 또는 조직(cell or tissue of interest)으로의 약물 운반 방법을 제공한다.
본 발명의 약물 운반 방법은 본 발명의 나노복합체를 유효성분으로 포함하기 때문, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노복합체는 종양 조직으로 비경구 투여, 보다 구체적으로는 종양주변 투여, 정맥내 투여 또는 복강내 투여된다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 대상자는 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 나노복합체를 대상자에게 투여한 후, 목적 세포/조직에서 상기 나노복합체로부터 유래되는 형광을 검출한다. 구체적으로는, 본 발명의 나노복합체의 핵산 분자 또는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 형광성 모이어티로 표지될 수 있으며, 이로부터 유래되는 형광을 통해 보다 간편하고 용이하게 타겟을 검출할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 말단 부위에 로다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체 같은 형광성 모이어티가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 형광성 모이어티는 Cy5.5 (694), ATTO 390™ (479), ATTO　425™ (484), ATTO　465™ (508), ATTO　488™ (523), ATTO　495™ (527), ATTO　520™ (538), ATTO　532™ (553), ATTO　Rho6G™ (570), ATTO　550™ (576), ATTO　565™ (592), ATTO　Rho3B™ (565), ATTO　Rho11™ (608), ATTO　Rho12™ (532), ATTO　Thio12™ (579), ATTO　610™ (634), ATTO　611 X™ (681), ATTO　620™ (643), ATTO　Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO　647™ (669), ATTO　647 N™ (669), ATTO　655™ (684), ATTO　Oxa12™ (663), ATTO　700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO　740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705), Quasar 705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 상기 형광성 모이어티 유도체는 본 발명의 나노복합체 형성을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광성 모이어티(fluorescent moiety)"는 본 발명의 핵산 분자 또는 생체적합성 폴리머 계면활성제에 연결 또는 컨쥬게이션되어 형광 시그널을 창출하는 형광 분자 또는 이의 유도체 또는 컨쥬게이트를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "연결(link)" 또는 "화학적 결합(컨쥬게이션)"은 최소 하나의 화학적 결합을 통해 두 개의 구성요소들을 연결하는 것을 의미하며, 상기 화학적 결합은 공유결합, 수소 결합, 이온 결합, 배위 결합, 등과 같이 당업계에 알려진 어떠한 결합을 포함할 수 있고, 구체적으로는 공유 결합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 핵산 분자 또는 일가양이온성 약물의 효과적인 운반을 확인하기 위해, 상기 형광 검출 이외에도 타겟 유전자의 발현의 검출을 통해 실시할 수 있으며, 상기 발현 검출은 공지된 다양한 방법에 따라 실시할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노복합체 내 핵산 분자에 의해 타겟팅되는 타겟 유전자의 발현은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 검출될 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR; 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호) 및 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)을 포함하나, 이에 한정되지는 않으며 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 본 명세서의 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 암세포 또는 종양 조직)에서 mRNA를 추출하여 검출하는 것이다. 따라서, 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
mRNA를 얻기 위하여, 시료(구체적으로는, 세포)에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J., et al ., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C., et al ., Plant Mol. Biol. Rep., 9: 242(1991); Ausubel, F. M., et al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P., et al ., Anal. Biochem. 162: 156(1987)). 예컨대, 트라이졸(Trizol)을 이용하여 용이하게 세포 내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 진핵세포로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85: 8998(1988); Libert F, et al ., Science, 244: 569(1989); 및 Sambrook, J., et al ., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 상기 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus, Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber, Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 유전자(예컨대, 발암성 유전자)의 발현 및 존재 유무를 확인할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 나노복합체, 그리고 이를 포함하는 약제학적 조성물, 약물 전달 시스템 및 약물 운반 방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 나노복합체는 핵산 분자, 일가양이온성 약물 및 생체적합성 폴리머 계면활성제로 구성되며, 10 nm 이하의 유체역학적 크기를 가지면서 수용성 환경에서 콜로이드 형태로 균일하게 분포한다.
(c) 또한, 본 발명의 나노스케일 콜로이드 제형은 안정적인 단일복합체의 형성을 통해 생리학적 환경에 풍부한 뉴클레아제들(예컨대, 혈청 뉴클레아제들)로부터 핵산 분자를 보호할 수 있고, 마이셀성 구조를 통해 세포 투과 및 인 비보 운반의 개선 뿐 아니라 마이셀성 부동태화(micellar passivation)에 의한 핵산 분자의 추가적인 보호를 제공할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 나노복합체 및 이를 포함하는 조성물 및 시스템은 활성 성분(예컨대, 핵산 분자 및 일가양이온성 약물)을 안정적으로 목적 세포/조직에 운반할 수 있으며, 상기 활성 성분에 따라 다양한 질환(구체적으로, 암)의 치료 또는 검출에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 3원 HMplex 복합체화의 도식적 예시(a) 및 결과적인 3원 HMplex들의 콜로이드 특성(b-d)을 보여준다: (b) TEM 이미지; (c) DLS에 의해 측정된 유체역학적 크기(빈 원) 및 제타 포텐셜(검은색 사각형); 및 (d) 지시된 다양한 전하 비율(N/P = BZT 암모늄/siRNA 포스페이트)로 PBS(pH 7.4)에서 제조된 HMplex들의 아가로오스 겔 전기영동.
도 2는 1, 2 및 5의 전하 비율(N/P = BZT 암모늄/siRNA 포스페이트)에서 DLS에 의해 측정된 siRNA/BZT 이중 복합체들(F-68이 없음)의 유체역학적 크기를 보여준다.
도 3a는 free siRNA 및 3원 HMplex들의 아가로오스 겔 전기영동으로, 양자 모두 지시된 시간 동안 37℃에서 50% 혈청에서 반응시켰다. 24시간 혈청 반응 후, HMplex들은 200 μg의 헤파린 나트륨으로 복합체 해체시켰다. 가장 오른쪽 패널은 혈청 내 뉴클레아제에 대해 3원 HMplex 복합체화에 의해 보호되어 배출된 온전한 siRNA를 보여준다. 도 3b는 F-68에 의한 마이셀성 포집 및 포집되지 않은 siRNA/BZT 나노복합체들에 대한 헤파린 다가음이온 경쟁 어세이를 보여준다. 시료들에 다양한 양들의 헤파린 나트륨을 30분 동안 상온에서 처리하였다. 대조군(C)은 free siRNA이다. 도 3c는 30분 동안 헤파린 처리를 하거나 또는 처리하지 않은 Cy5.5-표지된 siRNA(λex = 670 nm)로 제조된 3원 HMplex들의 형광 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 Cy5.5-표지된 siRNA(왼쪽 칼럼) 또는 Cy5.5-표지된 F-68(오른쪽 칼럼)을 37℃에서 1시간 및 4시간 동안 처리하여 제조하였던 3원 HMplex들로 처리된 MDA-MB-231 세포들의 광학 및 NIRF 이미지들이다.
도 5는 TAMRA-표지된 siRNA, BZT 및 Cy5.5-표지된 F-68로 구성된 3원(ternary) HMplex들로 4시간 동안 처리된 MDA-MB-231 세포들의 형광 현미경 이미지들을 보여준다.
도 6a는 MDA-MB-231 세포들에서 Bcl-2 유전자 발현의 하향-조절을 보여주는 반-정량적 RT-PCR 결과이다. Bcl-2 mRNA 레벨은 β-액틴의 유전자 발현 강도로 표준화시킨 후 플롯팅하였다. 도 6b는 siRNA 또는 scRNA를 포함하는 3원 HMplex들로 처리한 MDA-MB-231 세포들에서 유도되는 아팝토시스에 대한 유세포 분석을 보여준다. FITC-표지된 아넥신 V로 아팝토틱 세포들을 염색시켰다. 도 6c는 정상세포들(NIH-3T3 및 MRC-5) 및 암세포들(MDA-MB-231)에 대한 3원 HMplex들(siRNA)의 세포독성을 비색성 MTT 어세이에 의해 평가한 결과이다.
도 7a는 MDA-MB-231 이종이식 마우스에 종양주변으로 주입되는 Cy5.5-표지된 siRNA로 제조된 3원 HMplex들의 종양 축적을 보여주는 인 비보 NIRF 이미지들이다(λex = 675 nm; λem = 720 nm). 도 7b는 Cy5.5-표지된 free siRNA 또는 Cy5.5-siRNA로 구성된 HMplex의 종양주변 주입 후 4일째에 절제된 종양 절편들의 저배율(×200) 및 고배율(×1,000) 조직학적 사진이다. Cy5.5-siRNA 및 DAPI-염색된 핵들의 형광 시그널이 각각 빨간색 및 파란색으로 제시된다.
도 8은 MDA-MB-231 이종이식 마우스에 종양주변으로 주입된 Cy5.5-표지된 free siRNA의 종양 축적을 나타내는 인 비보 NIRF 이미지들이다(λex = 675 nm; λem = 720 nm).
도 9는 Bcl-2 타겟팅 HMplex 또는 비타겟팅 HMplex(HMplex/siRNA 또는 HMplex/scRNA)로 종양주변으로 주입된 MDA-MB-231 이종이식 마우스 또는 처리되지 않은 MDA-MB-231 이종이식 마우스(대조군)에서 30일 동안 종양 성장 억제(a) 및 몸무게 변화들(b)을 보여주는 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
실험재료
모든 화합물들은 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였고, 추가적인 정제 없이 사용하였다. 리포펙타민 2000 및 SYBR® 골드는 인비트로젠(Carlsbad, CA, USA)에서 구매하여 제조자의 지시서에 따라 이용하였다. 주문 Bcl-2 siRNA(센스 가닥, 5'-GUACAUCCAUUAUAAGCUG-dTdT; 및 안티센스 가닥, CAGCUUAUAAUGGAUGUAC-dTdT)[20], 스크램블된 siRNA(scRNA; AccuTarget™ 음성 대조군 siRNA), Cy5.5- 또는 TAMRA-표지된 siRNA, 및 PCT 프리 믹스(AccuPower® PCR PreMix)는 바이오니아(Daejeon, Korea)에서 구매하였다. F-68의 근적외 형광(near-infrared fluorescence, NIRF)을 위해, F-68(100 mg)과 Cy5.5-VS(BioActs Co. Ltd., Korea)를 PBS(pH 8.0)에서 2시간 동안 상온에서 혼합시켜 비닐술론-기능화된 Cy5.5(Cy5.5-VS)가 F-68의 하이드록시기에 컨쥬게이션되었다. 상기 Cy5.5-표지된 F-68을 셀룰로오스 에스테르 막(Spectra/Por membrane®; MWCO, 3.5 kDa) 내에서 Milli-Q 물로 하루 동안 투석시킨 후 동결건조시켰다.
HMplex 의 제조 및 특성 규명
HMplex들은 플루로닌 F-68(2.5 mg)의 존재 또는 부존재 하에서 9.3 μg의 siRNA(또는 scRNA)와 다양한 양의 BZT(23.8-476.8 μg)을 500 μL PBS(pH 7.4)에서 3시간 동안 상온에서 혼합시켜 제조하였고, 이에 따라 다양한 전하 비율(N/P = BZT 암모늄/siRNA 포스페이트 = 1-20)을 가진다. 상기 HMplex들의 형광 표지를 위해, Cy5.5-표지된 F-68 또는 Cy5.5-표지된 siRNA가 복합체화를 위해 사용되었다. 투과전자현미경(TEM) 이미지들은 200 kV에서 작동되는 CM30 전자현미경(FEI/Philips)으로 얻었다. TEM 시료 제조를 위해, 한 방울의 시료 분산액이 탄소로 코팅된 200 메쉬 구리 그리드 위에서 건조되었으며 2중량% 우라닐 아세테이트 용액을 이용하여 음적으로 염색되었다. HMplex들의 유체역학적 크기(hydrodynamic size) 및 제타 포텐셜(zeta potential)은 zeta-sizer(Nano-ZS, Malvern, UK)를 이용하여 결정하였다. 겔 지연 어세이(gel retardation assay)를 위해, HMplex들을 2% 아가로오스 겔에 로딩하여 TBE 완충액에서 100V로 전기영동시켰다. 전기영동 후, SYBR 골드-염색된 siRNA 밴드들을 겔 영상분석 시스템(gel documentation system; MiniBis Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Israel)을 이용하여 시각화시켰다. 모든 인 비트로 및 인 비보 실험들은 고정된 전하 비율(N/P = 4)을 가진 HMplex들로 실시하였다.
세포 배양
세포 배양 배지, 항생제, FBS(fetal bovine serum) 및 BCS(bovine calf serum)는 (주)웰진(대한민국)에서 구매하였다. NIH3T3(마우스 배아성 섬유아세포주), MRC-5(인간 태아 폐 섬유아세포들) 및 인간 TNBC 세포들(MDA-MB-231)은 제조자의 설명서에 따라 배양하였다. MRC-5는 습도-유지된 5% CO2 배양기에서 37℃로 10% FBS, L-글루타민(5×10-3 M) 및 젠타마이신(5 μg/mL)을 포함하는 DMEM 배지에서 유지하였다. MDA-MB-231 및 NIH-3T3은 습도-유지된 5% CO2 배양기에서 37℃로 10% 혈청(각각, FBS 및 BCS), L-글루타민(5×10-3 M) 및 젠타마이신(5 μg/mL)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다.
인 비트로 세포독성 및 안정성 평가
HMplex들에 대한 인 비트로 세포독성 연구들은 비색성 MTT 어세이를 이용하여 정상세포들(MRC-5 및 NIH-3T3) 및 암세포들(MDA-MB-231)에 대해 실시하였다. 세포들에 다양한 농도의 HMplex들을 4시간 동안 처리하고 냉장 PBS(pH 7.4)로 두 번 세척시킨 후 추가적으로 44시간 동안 혈청-부재 배지에서 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 세포들에 MTT 시약들을 처리하고 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. HMplex들의 복합체 안정성은 헤파린 다가음이온 경쟁 어세이 및 혈청 안정성 어세이로 평가하였다. 헤파린 다가음이온 경쟁 어세이에 있어서, 1 μg siRNA를 포함하는 HMplex들을 다양한 양의 헤파린(0-200 μg)과 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 2% 아가로오스 겔에서 전기영동시켰다. 복합체화된 siRNA는 SYBR 골드 염색으로 검출하였다. 혈청 안정화 연구들에서, HMplex들 또는 네이키드 siRNA를 50% FBS/PBS(pH 7.4)에서 전결정된 시간(0-24시간) 동안 37℃에서 반응시켰다. 각 시료에서 얻어진 분취액(aliquots)을 2% 아가로오스 겔에서 전기영동시키고 SYBR 골드로 시각화시켜 분석하였다.
인 비트로 세포내 흡수 및 아팝토시스의 평가
MDA-MB-231 세포들을 공초점 디쉬(35 mm coverglass bottom dishes)에 분주하였다(2×105 세포). 70-80%의 컨플루언스에 도달했을 때, 세포들에 free Cy5.5-siRNA 또는 이를 포함하는 HMplex들을 혈청-부재 배지에서 1시간 또는 4시간 동안 처리하였다. 이후, 세포들을 냉장 PBS(pH 7.4)로 2번에 걸쳐서 세척하고 4%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 형광 이미지들은 Nuance FX 멀티스펙트럼 이미징 시스템(CRI, USA)이 장착된 LEICA DMI3000B를 이용하여 얻었다. 아팝토시스의 결정을 위해, MDA-MB-231 세포들을 6-웰 배양 플레이트에 분주하고(2×105 세포) 12시간 동안 배양하였다. 혈청-부재 배지에서 siRNA 또는 scRNA의 HMplex들을 2시간 동안 처리한 후, 세포들을 냉장 PBS(pH 7.4)로 2번에 걸쳐서 세척하고 추가적으로 44시간 동안 배양하였다. 이후, 세포들을 냉장 PBS(pH 7.4)로 2번에 걸쳐서 세척하고 원심분리를 통해 수집하였다. 아팝토틱 세포들을 선택적으로 염색하기 위해 아넥신 V-FITC(BioVision, Inc., USA)를 세포에 첨가한 후 문헌적으로 공개된 과정[21]을 실시하였다. 상기 염색된 아팝토틱 세포들의 녹색 형광 강도는 유세포 분석법(Guava easyCyte™ Flow Cytometers; EMD Millipore, USA)으로 분석하였다.
Bcl-2 하향-조절의 평가
HMplex들에 의한 인 비트로 유전자 사일런싱은 반-정량적 역전사-PCR(RT-PCR)로 평가하였다. MDA-MB-231 세포들을 6-웰 배양 플레이트에 분주하고(2×105 세포) 12시간 동안 배양하였다. 70-80%의 컨플루언스에 도달했을 때, 세포들에 140 nM의 최종 RNA 농도를 가지는 siRNA 또는 scRNA의 HMplex들을 첨가하였다. 혈청-부재 배지에서 2시간 동안 배양시킨 후, 세포들을 냉장 PBS(pH 7.4)로 2번에 걸쳐서 세척하고 추가적으로 44시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 원심분리로 수집한 후 제조자의 지시서에 따라 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. Bcl-2 mRNA의 하향-조절은 Veriti® 96-웰 Thermal Cycler(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 PCR 프리 믹스에서의 반-정량적 RT-PCR의 하기 조건 하에서 내인성 액틴 레벨에 대해 Bcl-2 발현 레벨을 표준화시킴으로써 결정하였다: 하나의 사이클이 94℃에서 60초, 50℃에서 60초 및 72℃에서 60초로 이루어진 총 25 사이클; 및 72℃에서 10분의 최종 연장 단계. 결과들은 최소 3개의 독립적인 실험들의 평균으로 제시하였다. Bcl-2 및 β-액틴에 대한 주문 프라이머들은 다음과 같았다: 1) Bcl-2; 센스 프라이머, 5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCG-3' 및 안티센스 프라이머, 5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'; 및 2) β-액틴, 센스 프라이머, 5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'; 및 안티센스 프라이머, 5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'.
안정성, 종양주변 운반 및 종양 성장 억제에 대한 인 비보 연구들
동물 실험들은 한국과학기술원(KIST)에 의해 확립된 가이드라인들에 따라 실시하였다. 동물 실험들에 있어서, Crlj 누드 마우스(5-주령 암컷; Orient Bio Inc., Korea)를 0.5% 펜토바르비탈 나트륨(0.010 mL/g)의 복강내 주사로 마취시켰다. 종양 이종이식 모델을 위해, MDA-MB-231 세포들(1.0×107 세포)이 피하 주입을 통해 마우스 옆구리에 접종되었다. 인 비보 안정성 테스트를 위해, HMplex들(60 μL, 140 nM siRNA)을 종양주변 투여경로(peritumoral route)로 종양 이종이식 마우스 모델에 주입하였다(그룹 당 n = 3). 인 비보 형광 이미지들은 전결정된 시간 포인트들에서 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템(Caliper, USA)으로 얻었다. 종양주변으로 적용된 HMplex들의 종양내 분포를 조사하기 위해, 종양들을 마우스들로부터 절제하여 중성 완충화된 포르말린에 고정시키고 파라핀에 임베드시켰다. 상기 조직 블락들을 5 μm 절편들로 절단한 후 형광 이미지들은 Nuance FX 멀티스펙트럼 이미징 시스템(CRI, USA)이 장착된 LEICA DMI3000B를 이용하여 얻었다. 종양 성장 억제는 종양 용적(tumor volume)을 측정하여 관찰하였다. 종양 용적이 약 50 mm3에 이르는 경우, HMplex들을 종양주변 투여경로로 국부적으로 투여하였으며(1일), 국소 투여는 4일 및 6일째에 반복하여 실시하였다. 종양 용적 및 무게를 4주의 기간 동안 기록하였다(그룹 당 n = 3).
실험결과 및 추가논의사항
siRNA /약물 HMplex 제형의 디자인
본 발명자들은 3개의 활성 구성성분으로 구성된 자가-어셈블리된 3원(ternary) 복합체로서 HMplex-기반된 siRNA/약물 공동-운반 제형을 디자인하였다(도 1a). 일가양이온성 계면활성제로서, 본 발명자들은 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-3를 활성화시켜 암-특이적 아팝토시스를 유도하기 위해 보고되었던 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride, BZT)를 선택하였다[22]. 본 발명에서, BZT는 HMplex 형성을 위한 계면활성제로서 뿐 아니라 그 자체로 항암제로서의 이중 기능을 한다. 따라서, BZT는 별개의 항암제들 및 세포독성 일가양이온성 계면활성제들의 필요성을 없앨 수 있는데, 이는 공동-운반 구축을 단순하게 해줄 뿐 아니라 비특이적 세포독성을 최소화시킨다. 유전적 화학요법민감화를 위해, BZT를 Bcl-2 타겟팅 siRNA와 복합체화시켰다. 항-아팝토틱 Bcl-2 단백질이 모든 인간 암들의 50-70%에서 과다발현되고 화학약물들 및 방사선 처리에 대해 저항적으로 만들기 때문에, Bcl-2 유전자를 사일런싱시키는 것이 화학요법민감화를 위해 유망한 타겟이라는 것이 알려져 있었다[20, 23, 24]. 따라서, Bcl-2 siRNA와 BZT의 조합은 저항적 암세포들을 BZT의 항암 활성에 대해 민감화시킴으로써 치료의 상승적 효과(synergistic effect)를 나타낼 것이다. 마지막으로, Bcl-2 siRNA와 BZT 간에 형성된 유기-가용성 이중 HMplex는 생체적합성 폴리머 계면활성제인 플루로닉 F-68(국소적/정맥내 주입가능한 약제학적 성분으로서 미국 FDA 승인됨)의 마이셀에 포집시켜 3원 HMplex 내로 추가적으로 제형화시켰는데, 상기 플루로닉 F-68은 상기 복합체 안정성 뿐 아니라 세포 투과 및 인 비보 운반의 효율을 개선시킬 것이다[25].
콜로이드 크기는 나노치료법의 종양-타겟팅 효율을 결정하는 중요 매개변수이다. 종양 조직은 간질성 고혈압이 나노입자들의 수동적 확산 방해하는 치밀한 간질 매트릭스(interstitial matrix)로 구성된 특이적 미세환경을 가져 종양 내로의 깊은 투과를 제한한다[26-28]. 최신 연구들은 더 작은 나노입자들이 더 높은 속도의 종양 침투를 나타낸다는 것을 밝혔다[29-31]. 이러한 면에서, 본 발명자들은 F-68을 이용한 HMplex의 추가적인 마이셀 제형으로 상기 3원 복합체를 소형화시켜 종양내 확산 및 투과 효율을 증가시켰다.
3원 HMplex 들의 형성 및 특성
물-가용성 siRNA 및 BZT를 물에서 혼합하는 경우, 비수용성 이중 복합체들이 200-500 nm의 유체역학적 크기를 가지는 큰 나노응집체들의 형태를 자발적으로 형성하였다(도 2). 하지만, 콜로이드성 크기의 최소화를 위해 고안된 대로 전-용해된 플루로닉 F-68의 존재 하에서 siRNA와 BZT을 혼합하는 것은 어떠한 큰 응집체들 없이 보다 작은 콜로이드를 생산하였다. 도 1a에 도시된 대로, HMplex 복합체화(HMplexation)는 2개의 연속적인 과정들로 구성된다: 1) 반대로 전하된 카운터파트들 같의 많은 단일복합체화-유도된 소수성 결합을 통해 형성된 큰 나노응집체들(이중 복합체화); 및 2) 마이셀성 용해 및 계면활성제-부동태화된 작은 나노입자들 내로 상기 이중 복합체들의 포집(3원의 복합체화). 투과전자현미경(TEM) 및 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS) 연구들을 통해, 상기 결과적인 3원 HMplex가 치밀한 종양 조직 내로의 용이한 투과에 적합한 마이셀성 포집(10 nm 미만의 크기; 도 1b 및 도 1c)에 의해 매우 크게 소형화되었음을 확인하였다.
F-68의 존재 하에서 증가하는 전하 비율(N/P = BZT 암모늄/siRNA 포스페이트; siRNA 일정량에 대해 BZT의 상대적인 양 증가)에 따라, 상기 3원 HMplex의 제타 포텐셜은 유체역학적 크기에서의 작은 증가와 함께 음적 값으로부터 양적 값으로 점차적으로 변하였다(도 1c). 표면 전하 및 크기 모두에서 점차적인 변화들은 약 5의 전하 비율 이상에서 포화에 도달하였는데, 이는 상기 3원 HMplex 복합체화가 효율적이고 매우 낮은 N/P 비율로 완성될 수 있다는 것을 의미한다. 효율적인 HMplex 형성은 다양한 전하 비율을 가진 겔 지연 어세이로 확인하였다(도 1d). 2 또는 이상의 전하 비율에서, 복합체화되지 않은 free siRNA는 존재하지 않았는데, 이것은 모든 siRNA 체인들이 과도한 BZT에 의해 HMplex화되었다는 것을 의미한다. HMplex 복합체화에 의한 전하 역전 및 크기 증가로 인해, 겔을 통한 siRNA의 이동은 로딩 슬롯(loading slots)에 남아있는 HMplex와 함께 인가된 전기장 하에서 크게 지체되었다. 중요하게는, 상기 지연된 HMplex 밴드들은 일반적으로 강하게 상호작용하는 DNA/계면활성제 복합체들에서 관찰되는 인터칼레이팅 염료(SYBR® 골드)와 같이 염색되지 않았다[32]. 이것은 BZT와 F-68과 강한 총체적인 상호작용들을 통해 siRNA 체인들이 단단하게 패킹되고 HMplex 구조 내에 부동태화되었기 때문에 상기 양이온성 인터칼레이팅 염류는 상기 HMplex화된 siRNA에 접근가능하지 않다는 것을 의미한다.
3원 HMplex 복합체화에 의한 siRNA 의 보호
50% 혈청 배지에서 37℃로 반응시켜 상기 3원 HMplex(N/P = 4)와 free siRNA 간에서 뉴클레아제-풍부 혈청 내 분해에 대한 siRNA의 민감성(susceptibility)을 비교하였다. 각 전결정된 시간 포인트에서, 분취액이 채취되어 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 도 3a에서 볼 수 있듯이, free siRNA는 혈청에서 시간에 따라 점차적으로 분해되어 24시간째에 완전히 사라졌다. 대조적으로, 상기 HMplex화된 siRNA는 혈청 반응 동안 free siRNA로의 어떠한 분해 또는 복합체 형성의 주목할 만한 신호(sign) 없이 개선된 안정성을 나타냈다. 헤파린 처리에 의해 유도된 복합체 형성에서, 자유로운 온전한 siRNA가 혈청-처리된 HMplex들로부터 24시간 처리 후에도 방출되었는데, 이는 HMplex 복합체화에 의한 siRNA의 효과적인 보호를 의미한다.
상기 복합체 안정성에 대한 마이셀성 보호 효과(shielding effect)를 평가하기 위해, F-68로 포집되거나 또는 포집되지 않은 HMplex들(N/P = 4)에 다양한 농도의 헤파린 나트륨을 처리하였고, siRNA와 헤파린 간의 경쟁에 의해 유도되는 복합체 형성을 겔 전기영동으로 모니터링하였다(도 3b). F-68이 없는 이중 siRNA/BZT HMplex는 낮은 농도의 헤파린(10 μg)에서조차 복합체 형성된 siRNA를 배출하기 시작하는 것으로 나타났다. 매우 대조적으로, F-68 부동태화(passivation)를 포함하는 3원 HMplex는 매우 높은 헤파린 농도에서만 해체되었는데, 이는 명확하게 복합체화된 siRNA와 외부 다중음이온들 간의 경쟁을 차단하는 마이셀성 보호 효과에 의해 기인하는 것이다.
HMplex 복합체에서 Cy5.5-표지된 siRNA를 이용하여 복합체 형성 특징을 추가적으로 조사하였다. 도 3c에서 볼 수 있듯이, free Cy5.5-siRNA의 강한 근적외 형광(NIRF)이 3원 HMplex 복합체화에 의해 전체적으로 퀀칭되었다. 헤파린이 상기 비형광성 HMplex에 첨가되는 경우, Cy5.5-siRNA의 원래 형광 시그널(HMplex들의 복합체 형성에 따른 siRNA 방출의 지시인자)이 헤파린 양에 따라 회복되었다. 비형광성 HMplex의 초기 형성은 응집된 상태에서 공통적인 유기성 염료들의 전형적인 형광의 자가-퀀칭에 기인하며, 이는 상기 복수의 단일복합체화된 Cy5.5-siRNA/BZT 체인들이 서로 간의 강한 소수성 연결에 의해 가깝게 응집되어 안정적인 소형의 HMplex 나노구조를 구축한다는 것을 명확하게 증거한다.
HMplex 들의 세포내 흡수
Cy5.5-표지된 3원 복합체들(N/P = 4)을 이용하여 TNBC 세포(MDA-MB-231)에서 HMplex들의 세포 내재화(internalization)를 조사하였다. Cy5.5는 siRNA 또는 F-68에 표지되어 각각 NIRF 트랙킹을 위한 Cy5.5-siRNA/BZT/F-68 또는 siRNA/BZT/Cy5.5-F-68을 제조하였다(도 4). 세포 처리의 초기 단계(1 h)에서, F-68 시그널은 대부분 세포막 근처에 위치하는 반면에 siRNA 형광은 낮은 강도로 인해 거의 관찰되지 않았다. 도 3c에서 논의된 대로, siRNA의 퀀칭된 형광은 치밀하게 복합체화된 HMplex가 세포 내재화의 초기 단계에 구조적 통합성을 유지하였다는 것을 의미한다. 하지만, 4시간 처리 후에 siRNA 형광이 회복되어 세포질에 확산되어 관찰되었다. F-68 시그널의 분포도 유사하게 세포질 영역으로 이동하였고, 이는 siRNA와 공동-위치되는 것처럼 보인다(도 5). 이것은 상기 트랜스펙션된 HMplex가 세포질 환경에서 복합체 해체되고 free siRNA 및 BZT가 상기 치밀한 복합체로부터 배출되어 free Cy5.5-siRNA의 형광 강도를 회복한다는 것을 의미한다.
Bcl -2 유전자 사일런싱 및 아팝토시스에 대한 민감화
인간 TNBC 세포들(MDA-MB-231)은 아팝토시스 경로를 억제하는 Bcl-2 단백질들을 과다발현시키고 치료에 대해 저항성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 도 4에서 예시되는 대로, siRNA 운반에 의한 성공적인 RNA 간섭에 핵심 필요조건인 TNBC 세포들의 세포질 영역으로 3원 HMplex는 Bcl-2 타겟팅 siRNA를 트랜스펙션시키고 방출시킬 수 있다[1-4]. 더욱이, 공동-복합체화된 BZT가 동시에 세포내로 배출되어 아팝토시스를 촉발시킨다는 것이 합리적으로 예측된다. 따라서, 본 발명자들은 siRNA-매개된 Bcl-2 유전자 사일런싱을 위한 3원 HMplex(N/P = 4)의 가능성 및 이에 따른 공동-운반된 BZT에 의한 아팝토시스 유도에 대한 TNBC 세포들의 화학요법민감화를 탐구하였다. 이를 위해, TNBC 세포들에 siRNA 복합체들을 2시간 동안 처리하였고 상기 시료들을 세척시킨 후 추가적인 44시간 동안 반응시켰다. 도 6a는 siRNA 제형에 따라 TNBC 세포들에서 Bcl-2 하향-조절의 결과를 나타낸다. 비-타겟팅 스크램블 siRNA(scRNA)의 HMplex들은 Bcl-2 발현 상에 아주 작은 사일런싱 효과(비처리된 대조군 레벨과 비교하여 약 80%)를 보였는데, 이는 아마도 TNBC 세포들에 대해 공동-운반된 BZT의 세포독성으로 인한 것이다. Bcl-2 siRNA의 HMplex들에 의한 유전적 타겟팅과 함께, TNBC 세포들은 현저하게 감소된 레벨의 Bcl-2 발현을 나타냈는데, 이것은 심지어 표준 siRNA 운반 시스템(리포펙타민)보다 더 효과적인 레벨이다.
siRNA/BZT 공동-운반에 따른 아팝토시스의 민감화된 유도는 MDA-MB 231 세포들의 유세포 분석을 이용하여 평가하였다(도 6b). 비-타겟팅 scRNA의 HMplex(HMplex/scRNA)들은 BZT의 암-특이적 세포독성을 반영하는 아팝토틱 세포들의 개체군에서 아주 작은 증가를 나타냈다. 중요하게는, Bcl-2 타겟팅 siRNA의 HMplex들의 처리에 따라 아팝토시스의 레벨이 크게 증가하였다. 이러한 결과는 운반된 siRNA에 의한 Bcl-2 유전자 타겟팅이 상기 공동-운반된 BZT의 항암 효과에 대해 저항성 암세포들을 현저하게 민감화시켰다는 것을 확인해주며, 이는 상승적으로 증가된 조합 치료법에 대한 본 발명자들의 HMplex-기반된 디자인 전략을 유효화시켜 준다. Bcl-2 siRNA와 BZT 간의 HMplex가 정상 세포들에 대해 어떠한 눈에 띄는 비특이적 독성 없이 TNBC 세포들(MDA-MB-231)에 유의한 항암 효과를 나타낸다는 것이 주목할 만한 것이고, 이는 본 발명의 HMplex를 임상적 유용성과 함께 강력한 치료적 제형 후보로 만들어 준다(도 6c).
종양주변 주입에 따른 인 비보 종양 운반
마우스에 인간 삼중-음성 유방 종양(MDA-MB-231) 이종이식체들[19]로 공동-운반성 HMplex의 인 비보 치료적 유용성을 탐구하였다. HMplex들은 종양주변 투여경로로 투여하여 이들의 종양내 투과 및 축적을 조사하였다. 종양주변 투여경로가 수술 같은 국소적 치료 전 또는 후에 보조제 화학치료법에 의해 국부적 종양을 치료하는 데 혜택을 제공하기 때문에 선택하였다[33, 34]. 일반적으로, 치료적 나노입자들의 전신적 투여는 종종 부작용들을 야기하고 망상내피 시스템(RES)에 의한 여과 손실 또는 종양으로 지시된 제한적인 전신성 혈액 흐름 같은 다양한 이유들로 인해 높은 투여량을 요구한다[35, 36]. 직접적인 종양내 주입은 화학약물들의 국소 운반을 위한 가장 일반적인 투여경로이지만, 종양의 주입 영역으로부터 약물 유출 같은 제한점을 가진다[37, 38]. 종양주변 주입은 때때로 종양내 투여경로보다 나은 항암 효과들을 나타냈으며[39], 수술 가장자리에 숨겨진 검출되지 않은 암세포들을 치료할 가능성을 제공할 수 있다. 하지만, 종양주변 적용은 여전히 고형 종양들의 주변부에 존재하는 물리적 장벽들을 극복할 수 있는 더 높은 종양 투과율을 가지는 더 나은 나노입자들을 요구한다. 이러한 측면에서, 본 발명자들은 국소영역(locoregional) 화학치료법을 위한 종양주변 투여에 본 발명의 HMplex의 작은 콜로이드 크기로 인해 HMplex를 적용하였고, 플루로닉-코팅된 표면이 주변 장벽들을 가로지르는 데 도움을 줌으로써 종양 내로 깊은 투과를 용이하게 한다.
도 7a는 종양주변으로 주입된 HMplex의 종양 축적 행동을 보여준다. 비교를 위해, free Cy5.5-siRNA 및 Cy5.5-siRNA의 HMplex들(N/P = 4)이 종양주변 투여경로로 MDA-MB-231 이종이식 마우스에 투여되고 NIRF 시그널들을 IVIS 이미징 시스템으로 모니터링하였다. HMplex 복합체화 없는 free Cy5.5-siRNA는 주입 후 1.5시간째에 종양에서 약한 형광을 나타냈다(도 8). 이것은 네이키드 siRNA의 낮은 인 비보 안정성 또는 낮은 종양 축적으로 인한 제거를 의미한다. 매우 대조적으로, 동일한 양의 Bcl-2 siRNA를 포함하는 HMplex들은 종양주변 주입 후 종양으로부터 초기 자가-퀀칭된 Cy5.5-siRNA 형광의 회복을 보였는데, 이는 도 2c에서 논의된 대로 HMplex들이 종양 내로 내재화되고 형광성 siRNA 체인들을 배출하도록 복합체 형성되었다는 것을 나타낸다. 회복된 종양 시그널은 주입 1-3시간째에 최대 강도에 도달하였으며, 이후에 점차적으로 감소하였다. 그럼에도 불구하고, 현저한 시그널이 주입 후 6일째에도 종양으로부터 검출되었으며, 이는 3원 HMplex 복합체화에 의한 siRNA의 인 비보 안정화 및 종양주변 운반에서의 성공을 나타낸다. 이러한 논거를 확인하기 위해, free Cy5.5-siRNA 또는 동일한 양의 Cy5.5-siRNA을 포함하는 HMplex들의 종양주변 주입 후 4일째에 절개된 종양 절편들로 조직학적 조사를 실시하였다(도 7b). HMplex들의 경우에, 명확한 Cy5.5-siRNA 시그널들이 암세포들의 세포질(DAPI-염색된 핵 영역들과 구분됨)에서 관찰되었는데, 이는 siRNA와 BZT 간의 복합체 해체가 세포 내재화 후에 일어난다는 것을 강하게 지지한다. 이것은 네이키드 Cy5.5-siRNA로 처리된 마우스로부터 유래된 종양 절편들의 무시할만한 세포질 시그널과 뚜렷하게 대조된다. 상술한 모든 결과들로부터, 3원 HMplex들이 실제로 종양주변 외부로부터 종양 조직 내로 siRNA 및 BZT를 공동-운반시키고 인 비보에서 암세포들의 세포질로 추가적으로 공동-운반시킨다는 것으로 결론짓는다.
MDA - MB -231 이종이식체들에서 HMplex 들에 의한 종양 억제
마지막으로, Bcl-2 siRNA 또는 scRNA의 HMplex들(N/P = 4)을 이용하여 인 비보 종양 억제 효과를 비교적으로 평가하였다. MDA-MB-231 이종이식 마우스들에 HMplex 시료들을 1일, 4일 및 6일째에 종양주변 주입에 의한 3번의 투여량으로 투여하였고, 종양 성장 및 몸무게를 30일 동안 모니터링하였다(도 9). 도 9a에서 볼 수 있듯이, Bcl-2 타겟팅 siRNA의 HMplex들(HMplex/siRNA)로 처리된 실험 그룹이 실험 기간 전반에 걸쳐서 유지되는 유의한 종양 억제 효과를 나타냈다. 비-타겟팅 scRNA의 HMplex들(HMplex/scRNA)도 어느 정도의 종양 억제를 나타냈는데, 이는 인 비트로에서 보여지듯이(도 6) 아마도 대부분이 공동-복합체화된 BZT의 항암 효과에 의한 것이다. 아팝토시스-유도성 BZT 효과에도 불구하고, HMplex들 모두는 실험 동안 최소한의 몸무게 변화들을 나타내는 것으로 모니터링(도 9b)되듯이 동물 생존율에 어떠한 독성 충격도 나타내지 않았다. 중요하게도, 치료 끝 지점에서 HMplex/siRNA에 의해 억제된 종양 용적(205 mm3)은 HMplex/scRNA에 의해 유도되는 값(440 mm3)의 반 미만인데, 공동-운반성 HMplex에 의한 유전자-타겟팅 RNAi와 화학치료법을 조합시키는 것이 실질적으로 인 비보에서 작동하여 저항성 TNBC의 국소 영역 화합치료법을 위한 치료 효율을 상승적으로 증가시킨다는 것을 확실하게 증명한다.
결론
본 발명자들은 Bcl-2 타겟팅 siRNA와 일가양이온성 항암제(BZT) 간의 단일복합체화-유도된 복수의 소수성 연결에 기반된 siRNA/약물 공동-운반을 위한 간단하고 생체적합적인 제형을 개발하였다. siRNA, BZT 및 플루로닉 F-68의 물리적 혼합은 유효성분들 간의 강력한 협력하는 정전기적/소수성 상호작용들로 인해 단단하게 복합체화된 나노구조의 자발적인 형성을 야기하는 것을 발견하였다. 마이셀성 부동태화 뿐 아니라 10 nm 미만의 작은 콜로이드 크기를 가지는 결과적인 조밀한 복합체화에 의해, 3원 HMplex는 siRNA의 적합한 보호, 및 종양주변 투여에 의해 siRNA 및 BZT의 성공적인 인 비보 공동-운반을 가능하게 하였다. 세포-내재화된 HMplex들이 세포질에서 복합체 해체되어 탑재물을 방출하여 협력적인 활성, 즉 siRNA에 의한 항-아팝토틱 Bcl-2를 사일런싱시켜 BZT에 의한 아팝토시스의 민감화된 유도를 촉발시킨다는 것을 인 비트로 및 인 비보에서 확인하였다. 이러한 유전자-타겟된 화학요법민감화 및 암-특이적 BZT의 독성 덕택에, 본 발명의 공동-운반성 HMplex는 마우스에서 공격적이고 저항적인 TNBC 모델 상에 상승적으로 증대된 치료 효과를 나타냈는데, 이는 타겟팅된 조합 치료법에 의한 국소 영역 암 치료에 대한 강력함을 증명하는 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (22)

  1. (a) 발암성 유전자의 전사체와 결합하여 상기 발암성 유전자의 발현을 억제하는 모티프 서열로 이루어진 타겟팅 모이어티(targeting moiety)를 가지는 핵산 분자와 일가양이온성 약물(monocationic drug)인 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride, BZT)의 자가-어셈블리를 통해 이루어진 단일복합체(hydrophobically associated multiple monocomplex, HMplex); 및 (b) 복수의 상기 단일복합체들을 생체적합성 폴리머 계면활성제인 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블락 공중합체를 이용하여 포집하여 형성된 것을 특징으로 하는 나노복합체(nanocomplex).
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 Bcl-2, Bcl-3, Bcl-4, Bcl-5, Bcl-6, HER2/Neu, HER3, HER4, raf, c-fos, c-jun, c-myc, c-kit, c-met, c-ret, hTERT, erbB 유전자 중에서 선택된 어느 하나인 발암성 유전자(oncogenic gene)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자와 상기 일가양이온성 약물인 벤제토늄 클로라이드의 자가-어셈블리는 정전기적 상호작용인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자와 상기 일가양이온성 약물인 벤제토늄 클로라이드의 전하 비율은 1:2 이상인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블락 공중합체는 플루로닉 F-68인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 포집은 상기 단일복합체와 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제의 소수성 상호작용에 의한 마이셀성 포집인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 나노복합체는 5nm 이상 50nm이하의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 가지는 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항 내지 제5항, 제8항 내지 제10항에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 나노복합체는 세포 투과능을 가지는 것을 특징으로 하는 나노복합체.
  14. 제13항의 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제13항의 나노복합체를 포함하는 약물 전달 시스템(drug delivery system).
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