JP2020536525A - プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記Illumina Tag1配列及びIllumina Tag2配列は、Illuminaプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンAdapters、アダプター上の配列又はその相補又は逆相補配列の任意の組み合わせであり;
伸長アームは、核酸テンプレートと相補的に結合する15−45bpの塩基配列である。
代替的に、前記リンカーアームの5’末端は、リン酸化修飾が行われ;
代替的に、前記Illumina Tag1配列及びIllumina Tag2配列は、Illuminaプラットフォーム用ライブラリー調製キット内のトランスポゾンAdapters、アダプター上の配列又はその相補配列の任意の組み合わせから選択される。
テンプレートDNAは、前記プローブとハイブリダイズ、伸長、ライゲーションして第1の産物を得るハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップと、
過剰プローブ及びテンプレートDNAを酵素で切断して消化し、タグ付きプライマーを使ってPCR増幅して第2の産物を得る第2の産物取得ステップと、
第2の産物を精製してライブラリーを得る精製ステップと
ライブラリーをシーケンサーにロードしてシーケンシングするステップと、
を含む。
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水 6μL;
50ng/μLのテンプレートDNA 2μL;
3I10−3μMの前記プローブ 1μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
プロセスは、95℃で5分間変性させ、60℃で2時間インキュベーションすることであり;その後、上記反応系に以下の試薬を加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは60℃で1時間インキュベーションすることであり;
精製水 1.4μL;
1mM dNTPs 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase 1μL;
10IAmpligase Buffer 0.5μL;
50mM NAD+ 0.1μL;
Phusion(登録商標) High−Fidelity
DNA Polymerase 1μL;
又はテンプレートがRNAの場合、
ヌクレアーゼフリー水 5.5μL;
50ng/μLのテンプレートRNA 2μL;
3I10−3μMの前記プローブ 1μL;
RNase Inhibitor 0.5μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
70℃で2分間変性させ、65℃で2時間インキュベーションした後、以下の試薬を加え、42℃で1時間反応させて伸長、ライゲーション反応を行い;
1mMのdNTPs 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase 1μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
50mMのNAD+ 0.1μL;
5I First−Strand Buffer 4μL;
100mMのDTT 2μL;
SMART MMLV RT 1μL;
又は、テンプレートDNA、前記プローブ、ポリメラーゼ及びリガーゼを同時に添加し、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーションを同時に行って第1の産物を得;
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水 3.4μL;
50ng/μLのテンプレートDNA 2μL;
3I10−3μMの前記プローブ 1μL;
1mM dNTPs 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase 1μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
50mM NAD+ 0.1μL;
Phusion(登録商標) HiFi DNA Polymerase
0.5μL;
反応プロセスは、95℃5分間、60℃3時間である。
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第1の産物
Exonuclease I 0.5μL;
Exonuclease III 0.5μL;
37℃で40分間インキュベーションし、95℃で5分間インキュベーションし;
さらに以下の試薬を加え:
2I iProof HF Master Mix 50μL;
精製水 29μL;
20μMのタグ付き上流プライマー 2μL;
20μMのタグ付き下流プライマー 2μL;
USER酵素 1μL;
インキュベーション37℃15分間、予備変性98℃30秒間、変性98℃10秒間、アニーリング58℃30秒間、伸長72℃30秒間を1サイクルとして26サイクルを行い;72℃で2分間伸長し、4℃で保温し;
又はエキソヌクレアーゼ、タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーを同時に添加し、酵素切断・消化、線形化及びPCR増幅を同時に行って第2の産物を得;
前記タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーの3’末端にホスホロチオエートを修飾し、5’末端にホスホロチオエート、アミノ或いはスペンサーアームを修飾することで、エキソヌクレアーゼによって切断されることを防止し;
好ましくは、テンプレートがDNAの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第1の産物 18μL;
Exonuclease Lambda 0.5μL;
Exonuclease III 1μL;
2I iProof HF Master Mix 50μL;
H2O 29.5μL;
20μMのタグ付き上流プライマー 2μL;
20μMのタグ付き下流プライマー 2μL;
反応プロセスは、インキュベーション37℃40分間、インキュベーション95℃5分間、予備変性98℃30秒間、変性98℃10秒間、アニーリング58℃30秒間、伸長72℃30秒間を1サイクルとして26サイクルを行い;72℃で2分間伸長し、4℃で保温することであり;
又はテンプレートがRNAの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第1の産物 10.1μL;
Exonuclease I 1μL;
RNase A 0.1μL;
RNase H 0.1μL;
2I iProof HF Master Mix 50μL;
H2O 24.8μL;
20μMのタグ付き上流プライマー 2μL;
20μMのタグ付き下流プライマー 2μL;
インキュベーション37℃60分間、インキュベーション95℃5分間、予備変性98℃30秒間、変性98℃10秒間、アニーリング60℃30秒間、伸長72℃30秒間を1サイクルとして27サイクルを行い;72℃で2分間伸長し、4℃で保温する。
タグ付きプライマー内の下流プライマー構造は、5’末端から開始し、Illuminaシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、index配列領域及びIllumina Tag2全長配列領域である。
プローブと核酸サンプルのハイブリダイゼーションは、プローブの伸長アーム及びリンカーアームが一本鎖核酸サンプルの標的領域と相補的なペア配列を持っていることを意味し、適切なハイブリダイゼーション体系及び温度の下でハイブリダイゼーションが行われる。核酸サンプルは、DNA、RNA又はRNAの逆転写により得られたcDNAであり、DNAとcDNA又はDNAとRNAの混合物であり得る。図1では、改善されたMIPプローブ構造の1つを示す。プローブの由来は、様々な合成方法であるか、合成後に分子生物学的手法によって改造することができる。プローブは、次の8つの部分の構造で構成され、すなわち、1)核酸テンプレートに相補的に結合する可変長リンカーアーム(15〜45 nt);2)リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基で、マスクとして機能し;3)1〜2個のUID(Unique Identifier)配列で、前記UID配列は、3〜12個のランダムな塩基で構成され、オリジナルテンプレートの標識配列を区別するために用いられ;4)Illuminaシーケンシングプラットフォームシーケンシングの標識配列1(Tag1,Illumina Nextera Library Prep Kits内のNextera Transposase Adapters Read 2の1つの配列セグメントの逆相補配列5’−CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC−3’)に用いられ、前記配列3’末端は0〜16個の塩基を減らすことができ;5)0〜3個のデオキシウラシル(dU)塩基;6)Illuminaシーケンシングプラットフォームシーケンシングの標識配列2(Tag2,Illumina TruSeq試薬キット5末端のアダプター上の1つの配列セグメント5’−ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT−3’)に用いられ、前記配列5’末端は0〜19個の塩基を減らすことができ;ここで、シーケンシングに用いられる2つの標識配列1と2は、Illuminaプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンAdapters、アダプター上の配列又はその相補配列の任意の組み合わせであってもよい。7)伸長アームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない1〜3個のランダムな塩基で、マスクとして機能し;8)核酸テンプレートと相補的に結合する可変長伸長アーム(15〜45 nt)。伸長アームには、ホスホロチオエート修飾又はその他の修飾が可能であり;プローブの合成時、リンカーアームの5’末端にリン酸化を修飾し、合成時リン酸化修飾を行わず、リン酸化反応を通じてプローブの5’末端にリン酸化を修飾するよう選択できる)。
プローブの伸長アーム及びリンカーアームが標的領域に固定された後、DNAポリメラーゼの重合機能を利用して、伸長アームの3’末端からリンカーアームの5’末端まで伸長する。忠実度の高いDNAポリメラーゼが好ましい。テンプレートがRNAの場合、逆転写酵素で伸長される。次に、リガーゼによりニックを連結して環状産物を得る。当然、ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応は1つのステップで同時に実施することもできる。
後続のPCR増幅に対する核酸サンプル及び過剰プローブの影響を排除するため、一本鎖エキソヌクレアーゼ及び二本鎖エキソヌクレアーゼでプローブ及び一本鎖・二本鎖核酸サンプルを消化し、環状産物のみを残す。エキソヌクレアーゼは、単一の酵素でも複数の酵素の混合物でもよい。
PCR増幅効率を高めるため、USER酵素で環状産物を線状に切断してからプローブ構造内のシーケンシング標識配列と同じ又は相補的な構造を含有する上流・下流プライマー(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(ホスホロチオエート修飾を経ていないSEQ ID NO:9)及びAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(ホスホロチオエート修飾を経ていないSEQ ID NO:10)によりライブラリー増幅を行う。下線部分は、index配列で、混合ライブラリーのシーケンシング時に異なるライブラリーの標識を区別するために用いられ、その配列が変更できる。
ライブラリーから酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTPs)、イオン、プライマー及びプライマー二量体などの不純物を除去するため、Beckman社製のAgencourt AMPure XP磁気ビーズでライブラリーを精製し、電気泳動後の切り出したゲル回収又はカラム精製などの他の方法で精製してもよい。
調製されたライブラリーは、濃度、フラグメントの品質管理に合格した後、ハイスループットシーケンサーでシーケンシングする。本発明に係るライブラリーシーケンシング方法は、可逆終止法を含むが、これに限定されず、他のシーケンシングプラットフォームであってもよい。シーケンシングタイプは、シングルエンドシーケンシング又はダブルエンドシーケンシングにできる。本発明の実施形態では、前記シーケンシングプラットフォームは、Illuminaであり、シーケンシングタイプがダブルエンドシーケンシングである。
改善されたMIPプローブライブラリーによるターゲット領域の濃縮
本実施例では、ヒト乳癌感受性遺伝子(BRCA)を標的とする4つのプローブが使用された。実験は、2群に分けられ、実験群1がdU構造を含まないプローブであり、実験群2がdU構造を含むプローブであり、その他の構造及び配列が同じである。
精製水 6μL;
50ng/μLのHCT15細胞系DNA 2μL;
3I10−3μM P01−04又はP05−08プローブの等量混合合物
1μL;
10IAmpligase Buffer (Epicentre)
1μL。
精製水 1.4μL;
1mM dNTPs (NEB) 1μL;
5 U/μL Ampligase DNA ligase (Epicentre)
1μL;
10IAmpligase Buffer (Epicentre)
0.5μL;
50mM NAD+(NEB) 0.1μL;
Phusion(登録商標) High−Fidelity DNA
Polymerase(NEB) 1μL。
Exonuclease I (NEB) 0.5μL;
Exonuclease III(NEB) 0.5μL。
50μL;
精製水 29μL;
20μMのタグ1付きプライマー 2μL;
20μMのタグ2付きプライマー 2μL;
USER酵素(NEB) 1μL。
リンカーアーム、伸長アームの融解温度(Tm)値を最適化するMIPプローブライブラリーによるターゲット領域の濃縮
プローブ配列は、次の通りである。
P5に基づいて、その3’末端の最後の3つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
P6に基づいて、その3’末端の最後の3つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
P7に基づいて、その3’末端の最後の3つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
P8に基づいて、その3’末端の最後の3つの塩基間でホスホロチオエート修飾が行われた。
Exonuclease III(NEB) 0.5μL;
Exonuclease Lambda(NEB) 0.5μL;
3.上記反応系に以下の試薬を加えて産物の線形化及びPCR増幅を行った。
精製水 34μL;
20μMのタグ1付きプライマー 2μL;
20μMのタグ2付きプライマー 2μL;
USER酵素(NEB) 1μL。
改善されたプロセスのMIPスキームによるターゲット領域の濃縮
本実施例では、最適化プロセスは、酵素切断試薬、PCR試薬を反応管に同時に加えた。ハイブリダイゼーション反応系は、次の通りである。
50ng/μLのHCT15細胞系DNA 2μL;
3I10−3μM P05−08プローブの等量混合物 1μL;
10IAmpligase Buffer (Epicentre)
1μL。
1mM dNTPs (NEB) 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase (Epicentre)
1μL;
10IAmpligase Buffer (Epicentre)
0.5μL;
50mM NAD+(NEB) 0.1μL;
Phusion(登録商標) High−Fidelity DNA
Polymerase(NEB) 1μL。
Exonuclease III 1μL;
2I iProof HF Master Mix(Bio−Rad)
50μL;
H2O 29.5μL;
20μMのタグ3付きプライマー 2μL;
20μMタグ4付きプライマー 2μL。
改善されたプロセスのMIPスキームでRNAテンプレートに対しターゲット領域を濃縮
本実施例のプローブ配列は、次の通りである。
50ng/μLのH3122細胞系RNA 2μL;
3I10−3μM P13−14プローブの等量混合物 1μL;
RNase Inhibitor(TaKaRa) 0.5μL;
10IAmpligase Buffer (Epicentre)
1μL。
5U/μL Ampligase DNA ligase (Epicentre)
1μL;
10IAmpligase Buffer (Epicentre)
1μL;
50mM NAD+(NEB) 0.1μL;
5I First−Strand Buffer(TaKaRa)
4μL;
100mM DTT(TaKaRa) 2μL;
SMART MMLV RT(TaKaRa) 1μL。
RNase A 0.1μL;
RNase H 0.1μL;
2I iProof HF Master Mix(Bio−Rad)
50μL;
H2O 24.8μL;
20μMのタグ1付きプライマー 2μL;
20μMのタグ2付きプライマー 2μL。
Claims (10)
- 5’末端からリンカーアーム、マスク配列1、UID配列1、Illumina Tag1配列、Illumina Tag2配列、マスク配列2、伸長アームの順であり、前記UID配列1が3〜12個のランダムな塩基で構成され;前記マスク配列1は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基であり;前記マスク配列2は、0〜3個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
- 5’末端からリンカーアーム、マスク配列1、Illumina Tag1配列、Illumina Tag2配列、UID配列2、マスク配列2、伸長アームの順であり、前記UID配列2が3〜12個のランダムな塩基で構成され;前記マスク配列1は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基であり;前記マスク配列2は、0〜3個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
- 5’末端からリンカーアーム、マスク配列1、UID配列1、Illumina Tag1配列、Illumina Tag2配列、UID配列2、マスク配列2、伸長アームの順であり;前記UID配列1及びUID配列2は、いずれも3〜12個のランダムな塩基で構成され;前記マスク配列1は、リンカーアームに対応するテンプレート上流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基であり;前記マスク配列2は、0〜3個のリンカーアームに対応するテンプレート下流の配列に相補的でない0〜3個のランダムな塩基であることを特徴とする、プローブ。
- Illumina Tag1配列とIllumina Tag2配列との間に、1〜3個のデオキシウラシル塩基であるdU領域が存在することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプローブ。
- 前記リンカーアームは、核酸テンプレートと相補的に結合する15−45bpの塩基配列であり;
前記Illumina Tag1配列及びIllumina Tag2配列は、Illuminaプラットフォーム用の任意のライブラリー調製キット内のトランスポゾンAdapters、アダプター上の配列又はその相補又は逆相補配列の任意の組み合わせであり;
伸長アームは、核酸テンプレートと相補的に結合する15−45bpの塩基配列である、
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブ。 - 前記伸長アームが修飾され;好ましくは、ホスホロチオエート修飾が行われ;より好ましくは、リンカーアームのTm値は、伸長アームのTm値より2℃以上高く;
代替的に、前記リンカーアームの5’末端は、リン酸化修飾が行われ;
代替的に、前記Illumina Tag1配列及びIllumina Tag2配列は、Illuminaプラットフォーム用ライブラリー調製キット内のトランスポゾンAdapters、アダプター上の配列又はその相補配列或いは逆相補配列の任意の組み合わせから選択される、
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブ。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブを使用し、
テンプレートDNAは、前記プローブとハイブリダイズ、伸長、ライゲーションして第1の産物を得るハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップと、
過剰プローブ及びテンプレートDNAを酵素で切断して消化し、タグ付きプライマーを使ってPCR増幅して第2の産物を得る第2の産物取得ステップと、
第2の産物を精製してライブラリーを得る精製ステップと、
ライブラリーをシーケンサーにロードしてシーケンシングするステップと、
を含む、ハイスループットシーケンシングに適用されるターゲット領域の濃縮方法。 - 前記ハイブリダイゼーション、伸長及びライゲーションの反応ステップ:テンプレートDNAと請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブは、先にハイブリダイズしてからポリメラーゼ、リガーゼを加えて伸長、ライゲーションさせて第1の産物を得;
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水 6μL;
50ng/μLのテンプレートDNA 2μL;
3I10−3μMの請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブ 1μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
プロセスは、95℃で5分間変性させ、60℃で2時間インキュベーションすることであり;その後、上記反応系に以下の試薬を加えて、伸長、ライゲーション反応を行い、反応プロセスは60℃で1時間インキュベーションすることであり;
精製水 1.4μL;
1mM dNTPs 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase 1μL;
10IAmpligase Buffer 0.5μL;
50mM NAD+ 0.1μL;
Phusion(登録商標) High−Fidelity DNA
Polymerase 1μL;
又はテンプレートがRNAの場合、
ヌクレアーゼフリー水 5.5μL;
50ng/μLのテンプレートRNA 2μL;
3I10−3μMの前記プローブ 1μL;
RNase Inhibitor 0.5μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
70℃で2分間変性させ、65℃で2時間インキュベーションした後、以下の試薬を加え、42℃で1時間反応させて伸長、ライゲーション反応を行い;
1mMのdNTPs 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase 1μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
50mMのNAD+ 0.1μL;
5I First−Strand Buffer 4μL;
100mMのDTT 2μL;
SMART MMLV RT 1μL;
又は、テンプレートDNA、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプローブ、ポリメラーゼ及びリガーゼを同時に添加し、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーションを同時に行って第1の産物を得;
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
精製水 3.4μL;
50ng/μLのテンプレートDNA 2μL;
3I10−3μMの前記プローブ 1μL;
1mM dNTPs 1μL;
5U/μL Ampligase DNA ligase 1μL;
10IAmpligase Buffer 1μL;
50mM NAD+ 0.1μL;
Phusion(登録商標) HiFi DNA Polymerase
0.5μL;
反応プロセスは、95℃5分間、60℃3時間である、
ことを特徴とする、請求項7に記載の方法。 - 前記第2の産物取得ステップは、先に過剰プローブ及びテンプレートDNAをエキソヌクレアーゼで消化し、次に第1の産物をUSER酵素で線形化してからタグ付きプライマーによってPCR増幅して、第2の産物を得;
好ましくは、反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第1の産物
Exonuclease I 0.5μL;
Exonuclease III 0.5μL;
37℃で40分間インキュベーションし、95℃で5分間インキュベーションし;
さらに以下の試薬を加え:
2I iProof HF Master Mix 50μL;
精製水 29μL;
20μMのタグ付き上流プライマー 2μL;
20μMのタグ付き下流プライマー 2μL;
USER酵素 1μL;
インキュベーション37℃15分間、予備変性98℃30秒間、変性98℃10秒間、アニーリング58℃30秒間、伸長72℃30秒間を1サイクルとして26サイクルを行い;72℃で2分間伸長し、4℃で保温し;
又はエキソヌクレアーゼ、タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーを同時に添加し、酵素切断・消化、線形化及びPCR増幅を同時に行って第2の産物を得;
前記タグ付き上流プライマー及びタグ付き下流プライマーの3’末端にホスホロチオエートを修飾し、5’末端にホスホロチオエート、アミノ或いはスペンサーアームを修飾することで、エキソヌクレアーゼによって切断されることを防止し;
好ましくは、テンプレートがDNAの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第1の産物 18μL;
Exonuclease Lambda 0.5μL;
Exonuclease III 1μL;
2I iProof HF Master Mix 50μL;
H2O 29.5μL;
20μMのタグ付き上流プライマー 2μL;
20μMのタグ付き下流プライマー 2μL;
反応プロセスは、インキュベーション37℃40分間、インキュベーション95℃5分間、予備変性98℃30秒間、変性98℃10秒間、アニーリング58℃30秒間、伸長72℃30秒間を1サイクルとして26サイクルを行い;72℃で2分間伸長し、4℃で保温することであり;
又はテンプレートがRNAの場合の反応系及び反応プロセスは、次の通りであり、
第1の産物 10.1μL;
Exonuclease I 1μL;
RNase A 0.1μL;
RNase H 0.1μL;
2I iProof HF Master Mix 50μL;
H2O 24.8μL;
20μMのタグ付き上流プライマー 2μL;
20μMのタグ付き下流プライマー 2μL;
インキュベーション37℃60分間、インキュベーション95℃5分間、予備変性98℃30秒間、変性98℃10秒間、アニーリング60℃30秒間、伸長72℃30秒間を1サイクルとして27サイクルを行い;72℃で2分間伸長し、4℃で保温する、
ことを特徴とする、請求項7に記載の方法。 - 前記タグ付きプライマー内の上流プライマー構造は、5’末端から開始し、Illuminaシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、index配列領域及びIllumina Tag1配列に逆相補的なペア全長配列領域であり;
タグ付きプライマー内の下流プライマー構造は、5’末端から開始し、Illuminaシーケンシング時にクラスター生成に用いられる配列領域、index配列領域及びIllumina Tag2全長配列領域である、
ことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
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