JP2014526901A

JP2014526901A - 抗血管新生療法に伴う高血圧のリスクを予測する方法

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Publication number: JP2014526901A
Application number: JP2014527620A
Authority: JP
Inventors: ハース，ザンネリスベットデ; ポールデルマール，; ディーターランブレヒツ，; シュテファンシェラー，
Original assignee: エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト; ヴィアイビーヴィズィダブリュ; ライフサイエンシズリサーチパートナーズヴィズィダブリュ
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-10-09
Also published as: CA2845386A1; BR112014004763A2; NZ620343A; KR20140064924A; IL230783A0; AR087714A1; CN103946395A; MX2014002307A; EP2751280A1; ZA201400950B; EP3085793A1; EP2751280B1; SG2014008585A; AU2012300986A1; WO2013030168A1; US20140294811A1; RU2014110270A; ES2589455T3

Abstract

本発明は、ＫＤＲ遺伝子及び／又はＥＧＦ遺伝子の遺伝子型を決定することにより、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤に関連した高血圧の発症に対する患者の感受性を予測する方法に関する。本発明は、ＫＤＲ遺伝子及び／又はＥＧＦ遺伝子の遺伝子型に基づいて、癌に罹患している患者の治療のためにベバシズマブなどの血管新生阻害剤を含む薬学的組成物に更に関する。本方法は、ＫＤＲ遺伝子及び／又はＥＧＦ遺伝子の遺伝子型を決定することにより癌に罹患した患者において、ベバシズマブなどの抗血管新生療法と関連した高血圧のリスクを減らすための方法に関する。

Description

発明の分野
本発明は、ベバシズマブによる治療法を含む抗血管新生療法を受けている患者における高血圧のリスクを予測する方法に関する。

発明の背景
血管新生は、癌の発生など良性および悪性疾患に寄与し、特に癌において、原発性腫瘍増殖、侵襲性及び転移のために必要である。増殖のために、腫瘍は血管新生スイッチを受けねばならない。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、この血管新生スイッチを誘導するために必要とされる。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ経路内の遺伝子は、癌の進行の重要なメディエーターと考えられている。ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは、ＶＥＧＦＡとも称するＶＥＧＦ遺伝子、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤを含むＶＥＧＦホモログ、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２（それぞれＦＬＴ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲと称する）を含むＶＥＧＦ受容体、酸素誘導因子のＨＩＦ１α、ＨＩＦ２αを含むＶＥＧＦの誘導物質、酸素センサーのＰＨＤ１、ＰＨＤ２及びＰＨＤ３を含む。

癌細胞増殖及び転移におけるこの経路の重要性が、癌治療において使用するための抗血管新生剤の開発をもたらした。これらの治療法には、とりわけ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブとバタラニブが含まれている。ベバシズマブなどの血管新生阻害剤を用いて得られた著しく延長された生存にもかかわらず、患者はなお癌で死ぬ。更に、全ての患者が血管新生阻害剤治療に応答するわけではない。非応答性の根底にある機序は不明のままである。更に、血管新生阻害剤治療は、胃腸穿孔、血栓症、出血、高血圧及びタンパク尿などの副作用と関連する。

従って、どの患者が、血管新生阻害剤の治療に特に良く応答するか、及び／又はどの患者が抗血管新生治療に伴う副作用を受けやすいかを決定する方法が必要とされている。

本発明は、高血圧のリスク低下と関連している、ＥＤＲにおける遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）及び／又はＥＧＦにおけるｒｓ４４４４９０３（配列番号４）で遺伝子型を決定することにより、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤による治療に関連する高血圧の発症への患者の感受性を決定する方法に関する。本発明は、高血圧のリスク低下と関連している、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）及び／又はｒｓ４４４４９０３（配列番号４）で遺伝子型を有し、癌に罹患している患者の治療のためのベバシズマブなどの血管新生阻害剤を含む薬学的組成物に更に関する。本発明は、高血圧のリスク低下と関連している、ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）及び／又はｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を検出することにより、癌に罹患している患者において、抗血管新生療法に関連する高血圧のリスクを低下するための方法に更に関する。

本発明の一実施態様は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療法に関連する高血圧の発症に対する患者の感受性を決定する方法を提供する。本方法は、（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、及び、（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に多かれ少なかれ感受性がある患者を同定し、ここで遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＴ又はＴＴの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症により感受性であることを示し、又は遺伝子多型ｒｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症への感受性が小さいことを示す。幾つかの実施態様において、本方法は、インビトロの方法である。幾つかの実施態様において、この治療法は、化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む。幾つかの実施態様において、血管新生阻害剤は、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される。幾つかの実施態様において、癌は、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌または肺癌である。幾つかの実施態様において、サンプルは血液サンプルである。幾つかの実施態様において、遺伝子型は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される。幾つかの実施態様にて、本方法は患者へ治療薬を投与することを更に含む。

本発明の別の実施態様は、その必要のある患者の治療のために本明細書に記載の血管新生阻害剤を含む薬学的組成物を提供し、ここで前記患者は、本明細書に記載の方法に従って、血管新生阻害剤を含む治療法に関連する高血圧の発症への感受性が小さいと確定されている。

本発明の更なる実施態様は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の更に別の実施態様は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療法に関連した高血圧の発症のリスクを減らす方法を提供する。本方法は、（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、（ｂ）ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に感受性が小さい患者を同定し、ここで遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に感受性が小さいことを示し；及び（ｃ）（ｂ）に従って高血圧の発症に感受性が小さいとして同定された遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＴ又はＴＴを有する患者に前記血管新生阻害剤を投与すること幾つかの実施態様において、この治療法は、化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む。幾つかの実施態様において、血管新生阻害剤は、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される。幾つかの実施態様において、癌は、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌または肺癌である。幾つかの実施態様において、サンプルは血液サンプルである。幾つかの実施態様において、遺伝子型は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される。

本発明の更に別の実施態様は、患者を治療する方法を提供する。本方法は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療薬を患者に投与することを含み、ここで遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での患者の遺伝子型がＣＴ又はＴＴであることが確定されていることを特徴とする。

本発明の更に別の実施態様は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療法に関連する高血圧の発症に対する患者の感受性を決定する方法を提供する。本方法は、（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に多かれ少なかれ感受性がある患者を同定し、ここで遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症により感受性であることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症への感受性が小さいことを示す。幾つかの実施態様において、本方法は、インビトロの方法である。幾つかの実施態様において、この治療法は、化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む。幾つかの実施態様において、血管新生阻害剤は、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される。幾つかの実施態様において、癌は、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌または肺癌である。幾つかの実施態様において、サンプルは血液サンプルである。幾つかの実施態様において、遺伝子型は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される。幾つかの実施態様にて、本方法は患者へ治療薬を投与することを更に含む。

本発明の別の実施態様は、その必要のある患者の治療のために本明細書に記載の血管新生阻害剤を含む薬学的組成物を提供し、ここで前記患者は、本明細書に記載の方法に従って、血管新生阻害剤による治療法に関連する高血圧の発症への感受性が小さいと確定されている。

本発明の更に別の実施態様は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の更なる実施態様は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療法に関連した高血圧の発症のリスクを減らす方法を提供する。本方法は、（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、（ｂ）ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に感受性が小さい患者を同定し、ここで遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に感受性が小さいことを示し；及び（ｃ）（ｂ）に従って高血圧の発症に感受性が小さいとして同定された遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡを有する患者に前記血管新生阻害剤を投与すること幾つかの実施態様において、この治療法は、化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む。幾つかの実施態様において、血管新生阻害剤は、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される。幾つかの実施態様において、癌は、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌または肺癌である。幾つかの実施態様において、サンプルは血液サンプルである。幾つかの実施態様において、遺伝子型は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される。

本発明の別の実施態様は、患者を治療する方法を提供する。本方法は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療薬を患者に投与することを含み、ここで遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での患者の遺伝子型がＣＧ又はＡＡであることが確定されていることを特徴とする。

臨床データのエンドポイントの分布。無増悪生存期間（ＰＦＳ）のカプランマイヤープロット。臨床データのエンドポイントの分布。全生存期間（ＯＳ）のカプランマイヤープロット。臨床データのエンドポイントの分布。最良総合効果（ＢＯＲ）の棒グラフ。ＢＯＲの割合はＢＥＶで治療された被験者で４９％であり、ＰＢＯで治療された被験者で４６％であった。臨床データのエンドポイントの分布。治験薬と無関係でない高血圧の棒グラフ。高血圧の割合はＢＥＶで治療された被験者で１８％であり、ＰＢＯで治療された被験者で７％であった。ルーベン有効性パネル分析におけるＶＥＧＦＡとＰＦＳの関連性分析の結果。ＰＦＳに対する関連性について試験される場合のｒｓ６９９９４６（配列番号１）のフォレストプロット。ＢＥＶで処置された白人被験者におけるｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）のＯＳとの関連性についてのフォレストプロット。ｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）とＯＳの間の関連性のカプランマイヤープロット。ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）（ＫＤＲ）との相関における高血圧の頻度ＢＥＶで処置された白人被験者における高血圧の、ＫＤＲのｒｓ２３０５９４９（配列番号３）のフォレストプロット。ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）（ＥＧＦ）との相関における高血圧の頻度。ＰＧｘ−ＳＰ−ベバシズマブ−白人におけるＥＧＦのｒｓ４４４４９０３（配列番号４）及び高血圧のフォレストプロット。ＢＥＶで処置された白人被験者におけるｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）のＰＦＳとの関連性についてのフォレストプロット。メタ分析で遺伝子型を特定され、ベバシズマブ転帰と関連するＳＮＰの配列。配列番号１はｒｓ６９９９４６に対応し、位置５１はＡ又はＧである。配列番号２はｒｓ１２５０５７５８に対応し、位置５１はＣ又はＴである。配列番号３はｒｓ２３０５９４９に対応し、位置５１はＣ又はＴである。配列番号４はｒｓ４４４４９０３に対応し、位置５１はＡ又はＧである。配列番号５はｒｓ１１１３３３６０に対応し、位置５１はＣ又はＴである。

実施態様の詳細な説明
１．定義
「投与する」という用語は、患者に対して、血管新生阻害剤などの薬学的組成物の投与を意味する。例えば、体重の２．５ｍｇ／ｋｇから体重の１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を、治療される癌のタイプに応じて、毎週、２週間ごと、又は３週間ごとに投与することができる。特定の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び１５ｍｇ／ｋｇである。より特定の投与量は、５ｍｇ／ｋｇを２週間毎に、１０ｍｇ／ｋｇを２週間毎に及び１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとにである。

本発明との関連で、用語「血管新生阻害剤」は、血管新生（例えば、血管を形成するプロセス）を変化させる全ての薬剤を指し、限定されないが、腫瘍血管新生を含む血管新生を阻害する薬剤を含む。これに関連して、阻害とは、血管の形成を阻止及び血管の成長を停止又は遅くすることをを指すことができる。血管新生阻害剤の例としては、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）としても知られている）、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブ及びバタラニブが含まれる。ベバシズマブは、インビトロ及びインビボでのアッセイ系においてヒトＶＥＧＦＡに結合し、その生物学的活性を阻害する組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。用語「ベバシズマブ」は、米国、ヨーロッパ、及び日本からなる国のグループから選択された国または地域において、同一又はバイオシミラー製品として販売承認を得るために必要な要件を満たした対応する全ての抗ＶＥＧＦ抗体を包含する。本発明との関連において、血管新生阻害剤は、ベバシズマブなどＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体、より具体的には、ベバシズマブとＶＥＧＦ上の同じエピトープに結合する抗体を含む。抗体は、２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識するとき、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一又は立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための最も広く使用される迅速な方法は、標識抗原又は標識抗体の何れかを使用して、異なる形態の全ての数で構成することができる競合アッセイである。通常、抗原は９６ウェルプレート上に固定化され、標識抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力は、放射性又は酵素標識を用いて測定される。

用語「癌」は、未制御の細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌（例えば、消化器癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝癌、乳癌（局所的進行型、再発性又は転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに、母斑症と関係する異常な血管性増殖、浮腫（脳腫瘍と関係するものなど）、メイグス症候群が含まれる。

用語「化学療法剤」又は「化学療法レジメン」は、抗癌治療効果を提供することができる任意の活性剤を含み、特に、癌細胞又は腫瘍細胞に干渉することができる化学薬剤又は生物学的薬剤であってもよい。特定の活性薬剤は、悪性細胞の発生、成熟又は増殖を阻害又は防止する抗新生物（化学毒性(chemotoxic)又は化学安定性(chemostatic)）剤として作用するものである。化学療法剤の例は、ナイトロジェンマスタード等のアルキル化剤（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））、エチレンイミン／メチルメラミン（例えば、トリエチレンメラミン(thriethylenemelamine)（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、及びトリアジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；葉酸アナログ等の代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２′−ジフルオロデオキシシチジン）、及びプリンアナログ（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２′−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））；天然物に由来する有糸***阻害剤（例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビン）、ドセタキセル、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、及び生体応答修飾物質（例えば、インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）；白金錯体複合体を含む混合剤(miscellaneous agents)（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、置換尿素（すなわちヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ′−ＤＤＤ）、アミノグルテチミド）；副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモン及びアンタゴニスト（例えば、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン、アミノグルテチミド）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール及びその等価物）；抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン及びその等価物）、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ、リュープロリド）及び非ステロイド性抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド）、上皮成長因子阻害剤（例えば、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ）抗体（例えば、トラスツズマブ）、イリノテカン、及びロイコボリンなどの他の薬剤を含む。転移性膵臓癌の治療のために、ベバシズマブ投与のための化学療法剤は、ゲムシタビン及びエルロチニブおよびそれらの組合せが挙げられる（本明細書で提供される実施例も参照）。腎細胞癌の治療のために、ベバシズマブ投与のための化学療法剤は、インターフェロンアルファが挙げられる（本明細書で提供される実施例も参照）。

用語「対立遺伝子」は、目的の遺伝子のヌクレオチド配列変異体を指す。

用語「遺伝子型」は、個体またはサンプル中に含まれる遺伝子の対立遺伝子の記述を言及する。本発明との関連において、個々の遺伝子型と個体由来のサンプルの遺伝子型との間に区別はなされていない。典型的には、遺伝子型は二倍体細胞のサンプルから決定されるが、遺伝子型は、***細胞など半数体細胞のサンプルから決定することができる。

用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上からなる分子を指す。その正確な大きさは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存して、多くの要因に依存するであろう。オリゴヌクレオチドは、合成又はクローニングによって誘導することができる。デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのキメラ体も本発明の範囲内にあり得る。

用語「多型性」は、集団中の遺伝子の２つ又はそれ以上の遺伝的に決定される代替順序の発生を言う。典型的には、最初に同定された対立遺伝子型が参照型として任意に指定され、他の対立遺伝子型は、代替又は変異体対立遺伝子として指定される。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子型は、時には野生型と呼ばれる。

用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、対立遺伝子間で変化する一つのヌクレオチドの部位である。一塩基多型は、遺伝子の任意の領域で生じ得る。幾つかの例において多型性は、タンパク質配列の変化をもたらすことができる。タンパク質配列の変化は、タンパク質機能に影響し得るか又は影響しない場合がある。

用語「高血圧」は、高い血圧を指す。「治療に関連する高血圧」とは、有害事象（ＣＴＣＡＥバージョン２−３）のための国立癌研究所の共通用語規準に従って異なる等級で測定することができる。当業者は理解するように、患者が、患者の他のサブグループと比較して高血圧を発症する統計学的に有意な可能性を有する患者のサブグループに属している場合、患者は高血圧の発症により感受性がある。同様に、患者が、患者の他のサブグループと比較して、高血圧を発症しない統計学的に有意な可能性を有する患者のサブグループに属している場合、患者は高血圧の発症に感受性が小さい。

「患者」という用語は任意の単一動物、より具体的には治療が所望される哺乳動物（例えば、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類を含む）を意味する。更により具体的には、本明細書の患者はヒトである。本発明との関連において、患者は、白人被験者であり得る。

用語「被験者」は、本明細書において、血管新生障害の一以上の徴候、症状、又は他の指標を経験している、治療の対象患者を含む任意の単一のヒト被験者である。被験者として含まれることが意図されるのは、疾患の臨床的兆候を示していない、臨床研究試験に関与する任意の被験者、又は疫学的研究に関与する被験者、又は一度対照として用いられた被験者である。被験者は、以前に抗癌剤で治療されているか、又はそのように治療されていないなくてもよい。被験者は、治療が開始されるときに、本明細書に使用される追加の薬剤に対してナイーブであってもよく、すなわち、被験者は、「ベースライン」で（すなわち、治療が開始される前に被験者をスクリーニングする日など、本明細書における治療法における抗癌の最初の用量の投与前の時点における設定点において）、例えば、抗腫瘍剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤で以前に治療されていない可能性がある。そのような「ナイーブ」被験者は、一般に、そのような追加の薬剤を用いた治療の候補者であると考えられる。

用語「罹患している患者」とは、例えば癌、生理学的および病理学的血管新生及び／又は腫瘍性疾患を含む疾患などの特定の悪性疾患に対する臨床徴候を示す患者を指す。

本明細書で用いられるように、「治療法」又は「治療」は、治療されている個体又は細胞の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。

用語「全生存期間」は、治療の最中又は後に患者が生存する時間の長さを指す。

用語「無増悪生存期間」とは、治療の間及びその後に、治療担当医師または治験責任医師の評価によると、患者の病気は悪化しない、すなわち進行しない時間の長さを指す。

用語「薬学的組成物」は、医薬の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である追加成分を含まない無菌調製物を指す。

２．詳細な実施態様
本発明においては、ＫＤＲ及びＥＧＦの遺伝子の変異は、驚くべきことに、血管新生阻害剤による治療に関連する高血圧の発症に対する感受性のマーカー／予測因子として同定された。用語「マーカー」と「予測因子」は、交換可能に使用され、遺伝子の特定の対立遺伝子改変体を指すことができる。変異またはマーカーはまた、一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる場合がある。

本発明の方法に従って、ＳＮＰのメタ分析は、ベバシズマブによる５つのフェーズＩＩ及びフェーズＩＩＩ試験から得られたサンプル、すなわちＮＯ１６９６６を用いて行った（進行型原発性結腸直腸癌、Saltz et al., 2008, J. Clin. Oncol. 26:2013-2019 and Hurwitz et al., 2004, N. Engl. J. Med. 350:2335-2342を参照）、ＡＶＩＴＡ（膵臓癌、Van Cutsem, J. Clin. Oncol. 2009 27:2231-2237を参照），ＡＶＡｉＬ（非小細胞肺癌、Reck et al., J. Clin. Oncol. 2009 27:1227を参照）、ＡＶＯＲＥＮ（腎臓癌、Escudier et al., J. Clin. Oncol. 2010 28:2144を参照）及びＡＶＡＤＯ（乳癌、Miles, J. Clin. Oncol. 2010 28:3239を参照）。

実施例に示すように、１０のＳＮＰがベバシズマブ誘導性高血圧症と関連していたが（ｐ＜０．０５）、しかし、これらは何れも多重検定のしきい値を超えていなかった（ｐ＜０．０００３）。最も強い関連を示す２つのＳＮＰ（ｐ＜０．０１）は、ＫＤＲにあるｒｓ２３０５９４９（配列番号３）（対立遺伝子のＯＲ０．９３，９５％ＣＩ０．８８−０．９８，ｐ＝０．００６７）、及びＥＧＦにあるｒｓ４４４４９０３（配列番号４）（対立遺伝子のＯＲ１．０６，９５％ＣＩ１．０２−１．１１，ｐ＝０．００５２）であった。ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）（ＫＤＲ）では、ＣＣキャリア（野生型）は、ＢＥＶで治療されると高血圧発症のより高い頻度を示し、一方プラセボで処置された白人患者は、むしろ逆の結果を示し、ＴＴを保有する患者において最も高い高血圧の頻度を示している。ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）（ＥＧＦ）では、ヘテロ接合体ＧＡキャリアは、異なる遺伝子型の間で違いは見られなかったように、プラセボで治療を受けた患者では見られなかった効果である、高血圧の最高頻度を示した。興味深いことに、ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）及びｒｓ４４４４９０３（配列番号４）は、ＫＤＲとＥＧＦの位置２７３及び７０８上で生じるアミノ酸変化と密接に関連しており、これらの変化は、機能的に両方の遺伝子に影響を及ぼし、それによって高血圧の一因となり得ることを示唆している。

従って、本発明は、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法と関連した高血圧の発症への患者の感受性を決定するインビトロでの方法を提供し、前記方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に多かれ少なかれ感受性がある患者を同定することを含み、ここで遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＴ又はＴＴの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に感受性があることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対して感受性が小さいことを示す。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌および肺癌、より具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌及び肺癌、更により具体的には結腸直腸癌、腎臓癌及び肺癌からなる群から選択される。

本発明はさらに、必要とする患者を治療するために、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む薬学的組成物を提供し、ここで前記患者は、インビトロでの方法で、血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に対して感受性が小さいことが決定されており、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に多かれ少なかれ感受性がある患者を同定することを含み、ここで遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＴ又はＴＴの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に感受性があることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対して感受性が小さいことを示す。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌および肺癌、より具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌及び肺癌、更により具体的には結腸直腸癌、腎臓癌及び肺癌からなる群から選択される。

本発明はまた、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧を発症するリスクを減らす方法を更に提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に感受性が小さい患者を同定し、ここで遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対する感受性が小さいことを示し、及び
（ｃ）（ｂ）に従って高血圧の発症に対する感受性が小さいとして同定された、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でＣＴ又はＴＴ遺伝子型を持つ患者に対して、前記血管新生阻害剤を投与すること一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌および肺癌、より具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌及び肺癌、更により具体的には結腸直腸癌、腎臓癌及び肺癌からなる群から選択されることを含む。

本発明はまた、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法と関連した高血圧の発症に対する患者の感受性を決定するインビトロでの方法を提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法と関連した高血圧の発症に対して多かれ少なかれ感受性がある患者を同定することを含み、ここで遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡの遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療されることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対して感受性が小さいことを示す。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌および肺癌、より具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌及び肺癌、更により具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、及び乳癌からなる群から選択される。

本発明はさらに、必要とする患者を治療するために、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む薬学的組成物を提供し、ここで前記患者は、インビトロでの方法で、血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に対して感受性が小さいことが決定されており、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法と関連した高血圧の発症に対して多かれ少なかれ感受性がある患者を同定することを含み、ここで遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡの遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療されることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対して感受性が小さいことを示す。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌および肺癌、より具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌及び肺癌、更により具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、及び乳癌からなる群から選択される。

本発明はまた、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧を発症するリスクを減らす方法を更に提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に感受性が小さい患者を同定し、ここで遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対する感受性が小さいことを示し、及び
（ｃ）（ｂ）に従って高血圧の発症に対する感受性が小さいとして同定された、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡ遺伝子型を持つ患者に対して、前記血管新生阻害剤を投与することを含む。一実施態様において、癌は、結腸直腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌および肺癌、より具体的には結腸直腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌及び肺癌、更により具体的には結腸直腸癌、腎臓癌及び肺癌からなる群から選択される。

一実施態様において、血管新生阻害剤は化学療法剤又は化学療法レジメンとの併用処置として投与される。更なる実施態様において、血管新生阻害剤は、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及びカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなど白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される。更に、血管新生阻害剤は、放射線療法との併用処置として投与され得る。

本発明との関連において、サンプルは生物学的サンプルであり、血液及び／又は組織試料であってもよい。一実施態様において、試料は血液サンプルであり、具体的には、末梢血サンプルである。本発明との関連において、サンプルはＤＮＡサンプルである。ＤＮＡサンプルは、生殖細胞系列ＤＮＡ又は体細胞ＤＮＡ、具体的には生殖細胞のＤＮＡでありうる。

一実施態様において、遺伝子型は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される。以下のＳＮＰの検出の詳細な説明に加えて、以下の参考文献は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ベースのＳＮＰ遺伝子型判定のための指針を提供する；例えば、Storm et al., Methods Mol. Biol. 212:241-62, 2003。

３．核酸多型の検出
ＳＮＰの存在について核酸を評価するための検出技術は、分子遺伝学の分野で公知の手順を含む。すべてではないが、多くの方法は、核酸の増幅を含む。増幅を行うための十分な指針が当該分野で提供される。典型的な参照文献には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, including supplemental updates through April 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001)などのマニュアルを含む。一塩基多型の検出のための一般的な方法は、Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols, Pui-Yan Kwok, ed., 2003, Humana Pressに開示されている。

方法は、典型的には、ＰＣＲ工程を利用するが、他の増幅プロトコールを使用することもできる。好適な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（例えば、Wu & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988を参照）；鎖置換アッセイ（例えば、Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; 米国特許第５，４５５，１６６号を参照）；及び米国特許第５，４３７，９９０号；第５，４０９，８１８号；及び第５，３９９，４９１号に記載の方法を用いた転写に基づく増幅系；転写増幅システム（ＴＡＳ）(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989)；及び自立配列複製（３ＳＲ）(Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990；国際公開第９２／０８８００号）を含む。あるいは、検出可能なレベルにプローブを増幅する方法は、Ｑβ−レプリカーゼ増幅など使用することができる (Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989)。公知の増幅方法の総説は、例えば、AbramsonとMyerによりCurrent Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993に提供される。

遺伝子型、ハプロタイプ、ＳＮＰ、マイクロサテライト又は個々の他の多型性の検出は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを用いて行うことができる。オリゴヌクレオチドは、任意の適切な方法、通常、化学合成によって調製することができる。オリゴヌクレオチドは、市販の試薬および器具を用いて合成することができる。あるいは、それらは商業的供給源から購入することができる。オリゴヌクレオチドの合成方法は当分野で周知である（例えば、Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法）。加えて、上記合成方法の修飾も、合成されたオリゴヌクレオチドに関して酵素作用に望ましく影響を与えるために使用することができる。例えば、修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミデート、またはボラノホスフェート）、又はリン酸誘導体以外の結合のオリゴヌクレオチドへの取り込みが選択された部位での切断を防ぐために使用されてもよい。さらに、２’−アミノ修飾糖の使用は、新しい核酸鎖の合成のための鋳型である核酸にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドの消化において置換を好む傾向がある。

個体の遺伝子型は、当技術分野において周知である多くの検出方法を用いて決定することができる。ほとんどのアッセイは、いくつかの一般的なプロトコル：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション、プライマー伸長、対立遺伝子特異的ライゲーション、シークエンシング、又は電気泳動分離技術、例えば、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）及びヘテロ二本鎖分析のいずれかを必要とする。例示的なアッセイは、５’−ヌクレアーゼアッセイ、鋳型指向ダイターミネーターの取り込み、分子ビーコン対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基伸長アッセイ及びリアルタイムのピロリン酸塩配列によるＳＮＰスコアリングが挙げられる。増幅配列の解析は、マイクロチップ、蛍光偏光アッセイ、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）質量分析などの様々な技術を用いて行うことができる。使用することができる２つの方法は、フラップヌクレアーゼによる侵襲的切断及びｐａｄｌｏｃｋプローブを採用した方法論に基づくアッセイである。

特定の対立遺伝子の存在又は非存在の決定は、一般に、分析される個体から得られる核酸試料を分析することによって行われる。多くの場合、核酸試料はゲノムＤＮＡを含む。ゲノムＤＮＡは、典型的には、血液サンプルから得られるが、他の細胞または組織から得ることもできる。

多型性対立遺伝子の存在についてＲＮＡサンプルを分析することも可能である。例えば、ｍＲＮＡは、一以上の多型性部位での個体の遺伝子型を決定するために使用することができる。この場合には、核酸サンプルは、標的核酸が発現される細胞、例えば脂肪細胞から得られる。このような分析は、例えば、ウイルス逆転写酵素を用いて標的ＲＮＡを最初に逆転写し、次いで得られたｃＤＮＡを増幅することによって、又は米国特許第５３１０６５２号；第５３２２７７０号；第５５６１０５８号；第５６４１８６４号；及び第５６９３５１７号に記載されるように、複合高温逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて行うことができる。

ＳＮＰを検出するための核酸サンプルの分析のための頻繁に使用される方法論を簡潔に説明する。しかしながら、当該分野で公知の任意の方法を、単一のヌクレオチド置換の存在を検出するために、本発明において使用することができる。

ａ．対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション
この手法は、また、一般的に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションと呼ばれ（ＡＳＯ）（例えば、Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991; Saiki et al., Nature 324, 163-166, 1986; 欧州特許２３５７２６号; 及び国際公開第８９／１１５４８号）、核酸サンプルの増幅から得られた増幅産物に変異体の一つに特異的なオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることによって一つの塩基だけ異なる２つのＤＮＡ分子間を区別することに依存している。この方法は通常、短いオリゴヌクレオチド、例えば１５−２０塩基長を用いる。プローブは、差次的に別の対一変形にハイブリダイズするように設計されている。そのようなプローブを設計するための原理と指針は、当該分野で、例えば本明細書に引用された参考文献において利用可能である。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度に有意差があるように十分にストリンジェントであるべきで、本質的に二値応答を生成し、それによりプローブは対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする。幾つかのプローブは、多型部位がプローブの中央位置と合致するように（例えば、７位に１５塩基のオリゴヌクレオチド中；８又は９位のいずれかで１６塩基のオリゴヌクレオチド中）、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計されているが、しかしこの設計は必要ではない。

対立遺伝子の量及び／又は存在は、サンプルにハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの量を測定することによって決定される。一般的に、オリゴヌクレオチドは、蛍光標識などの標識で標識されている。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ配列を表す固定化されたオリゴヌクレオチドに適用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件の後、蛍光強度が、各ＳＮＰオリゴヌクレオチドについて測定される。

一実施態様において、多型部位に存在するヌクレオチドは、または多型部位を含む領域における多型性対立遺伝子の一つに正確に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーとの配列特異的ハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションによって同定される。プローブ又はプライマーのハイブリダイズ配列と配列特異的なハイブリダイゼーション条件が、多型部位での単一のミスマッチがそれが効率的に形成されないように十分にハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化させるように選択される。従って、配列特異的なハイブリダイゼーション条件下で、安定な二本鎖は、プローブ又はプライマーと完全に相補的な対立遺伝子配列との間に形成される。従って、多型部位を含む領域における対立遺伝子配列と完全に相補的である、長さが約１０から約３５ヌクレオチド、通常は、長さが１５から約３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが本発明の範囲内にある。

代わりの実施態様では、多型部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を含む領域内のＳＮＰ対立遺伝子の一つに実質的に相補的で、及び多型部位での対立遺伝子に正確に相補的であるオリゴヌクレオチドと十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションによって同定される。非多型部位で生じるミスマッチが対立遺伝子配列の両方とミスマッチであるため、標的対立遺伝子配列と形成される二本鎖及び対応する非標的対立遺伝子配列と形成される二本鎖におけるミスマッチの数の差は、標的対立遺伝子配列に厳密に相補的なオリゴヌクレオチドを用いた場合と同様である。この実施態様では、非標的配列との安定な二重鎖の形成を排除するのに十分なストリンジェンシーを維持しつつ、ハイブリダイゼーション条件は、標的配列と安定な二重鎖の形成を可能にするのに十分に緩和される。そのように十分ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、安定な二本鎖は、プローブ又はプライマーと標的対立遺伝子との間に形成されるであろう。従って、多型部位を含む領域における対立遺伝子配列と実質的に相補的であり、多型部位で対立遺伝子配列と厳密に相補的である、長さが約１０から約３５ヌクレオチド、通常は、長さが１５から約３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが本発明の範囲内にある。

厳密というよりも実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用が、ハイブリダイゼーション条件の最適化が制限されるアッセイ形式において望まれうる。例えば、典型的な多標的固定化オリゴヌクレオチドアッセイ形式では、各標的のためのプローブ又はプライマーが、単一の固体支持体上に固定化される。ハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡを含む溶液と固体支持体を接触させることによって同時に行われる。全てのハイブリダイゼーションが同一の条件下で実施されるので、ハイブリダイゼーション条件は各プローブまたはプライマーのために別個に最適化することができない。プローブ又はプライマーへのミスマッチの組み込みは、アッセイ形式がハイブリダイゼーション条件の調整を妨げる場合、二本鎖の安定性を調節するために使用することができる。二本鎖の安定性に対する特別に導入されたミスマッチの影響はよく知られており、二本鎖の安定性は、上述のように、常に推定され経験的に決定することができる。正確なサイズおよびプローブ又はプライマーの配列に依存する適切なハイブリダイゼーション条件は、本明細書に提供され当技術分野で公知の指針を用いて経験的に選択することができる。配列中の一塩基対の相違を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの使用は、例えば、Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282、及び米国特許第５，４６８，６１３号及び第５，６０４，０９９号に記載され、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。

完全に一致及び一塩基がミスマッチであるハイブリダイゼーション二本鎖間の安定性の比例変化は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。短いプローブ配列で形成された二本鎖は、ミスマッチの存在によって比例的に不安定にされる。長さが約１５から約３５ヌクレオチドの間のオリゴヌクレオチドは、しばしば、配列特異的検出に使用される。更に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端は、連続ランダム解離および熱エネルギーによる再アニーリングを受けるため、どちらかの末端でのミスマッチが、内部で発生するミスマッチよりも小さく、ハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化する。標的配列における単一塩基対の変化を識別するために、多型部位がプローブの内部領域に生じるように、標的配列にハイブリダイズするプローブ配列が選択される。

特定の対立遺伝子にハイブリダイズするプローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリダイズ領域、すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションに関与するプローブの部分に適用される。プローブは、プローブのハイブリダイゼーション特性を著しく変化させることなく、プローブを固定化するために使用されるポリＴ尾部などの付加的核酸配列に結合することができる。当業者は、本発明の方法における使用のために、標的配列に相補的でない、従って、ハイブリダイゼーションに関与しない付加ｅｔ記核酸配列に結合したプローブが、本質的に非結合プローブと等価であることを認識するであろう。

プローブ及びサンプル中の標的核酸配列との間に形成されたハイブリッドを検出するための適切なアッセイ形式は、当技術分野で知られており、固定化標的（ドットブロット）形式及び固定化プローブ（リバースドットブロットまたはラインブロット）アッセイ形式が含まれる。ドットブロットおよびリバースドットブロットアッセイ形式は、米国特許第５，３１０，８９３号；第５，４５１，５１２号；第５，４６８，６１３号；及び第５，６０４，０９９号に記載され、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

ドットブロット形式では、増幅された標的ＤＮＡは、例えば、ナイロン膜などの固体支持体上に固定化される。膜−標的複合体は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、標識されたプローブとインキュベートされ、ハイブリダイズしなかったプローブは、適切にストリンジェントな条件下で洗浄することによって除去し、膜は結合したプローブの存在について監視される。

リバースドットブロット（又はラインブロット）形式では、プローブは、ナイロン膜またはマイクロタイタープレートなどの固体支持体上に固定化される。標的ＤＮＡは、典型的には標識プライマーの取り込みによる増幅中に、標識される。プライマーの一方または両方を標識することができる。膜−プローブ複合体は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、標識された増幅された標的ＤＮＡとインキュベートされ、ハイブリダイズしなかった標的ＤＮＡは、適切にストリンジェントな条件下で洗浄することによって除去し、膜は結合した標的ＤＮＡの存在について監視される。リバースラインブロット検出アッセイは実施例に記載される。

多型変異体の一つに特異的である対立遺伝子特異的プローブは、しばしば、他の多型変異体の対立遺伝子特異的プローブと組み合わせて使用される。幾つかの実施態様において、プローブは固体支持体上に固定化され、個体の標的配列が同時に両方のプローブを使用して分析される。核酸アレイの例は国際公開第９５／１１９９５号に記載されている。同じアレイ又は別のアレイを特徴付けられた多型性の分析に使用することができる。国際公開第９５／１１９９５号はまた、事前に特徴付けられた多型性の変異型を検出するために最適化されたサブアレイを説明している。そのようなサブアレイは、本明細書に記載の多型性の存在を検出するのに用いることができる。

ｂ．対立遺伝子特異的プライマー
多型性はまた、一般的に対立遺伝子特異的増幅またはプライマー伸長法を用いて検出される。これらの反応は、プライマーの３’末端のミスマッチを介して多型性を特異的に標的とするように設計されたプライマーの使用を典型的に含む。ミスマッチの存在は、ポリメラーゼが、誤りを訂正する活性を欠いているときプライマーを伸長するポリメラーゼの能力に影響を与える。例えば、対立遺伝子特異的増幅又は伸長に基づく方法を用いて対立遺伝子配列を検出するために、多型性の一つの対立遺伝子に相補的なプライマーは、３’末端ヌクレオチドが多型位置でハイブリダイズするように設計される。特定の対立遺伝子の存在は、伸長を開始するプライマーの能力によって決定することができる。３’末端がミスマッチである場合、伸長が妨げられる。

幾つかの実施態様において、プライマーは増幅反応において第二のプライマーと組み合わせて使用される。第二のプライマーは多型位置に関係のない部位でハイブリダイズする。特定の対立遺伝子型を示す検出可能な生成物をもたらす二つのプライマーから開始する増幅が存在している。対立遺伝子特異的増幅又は伸長に基づく方法は、例えば、国際公開第９３／２２４５６号；米国特許第５，１３７，８０６号；第５，５９５，８９０号；第５，６３９，６１１号；及び米国特許第４，８５１，３３１号に記載されている。

対立遺伝子特異的増幅に基づく遺伝子型決定を用いて、対立遺伝子の同定は、増幅された標的配列の存在又は非存在の検出のみを必要とする。増幅された標的配列の検出のための方法は当該分野で周知である。例えば、記載されるゲル電気泳動及びプローブハイブリダイゼーションアッセイは、しばしば、核酸の存在を検出するために使用される。

別法のプローブレス方式では、増幅された核酸は、反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの全量の増加をモニターすることにより検出され、例えば、米国特許第５，９９４，０５６号；及び欧州特許公開番号４８７，２１８及び５１２，３３４に説明される。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、二本鎖ＤＮＡに結合したときに呈する、蛍光性の様々なＤＮＡ結合色素、例えば、ＳＹＢＲグリーンに依存する。

当業者によって理解されるように、対立遺伝子特異的な増幅方法は、特定の対立遺伝子を標的化するために複数の対立遺伝子特異的プライマーを用いる反応で行うことができる。このような多重アプリケーション用のプライマーは、一般的に識別可能な標識で標識されているか又は、対立遺伝子から産生される増幅産物がサイズによって識別可能であるように選択される。従って、例えば、単一サンプル中の両方の対立遺伝子は、増幅産物のゲル分析により単一増幅を用いて同定することができる。

対立遺伝子特異的プローブの場合と同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイズ領域における多型性対立遺伝子の一つに厳密に相補的であり得るか、又はミスマッチが両方の対立遺伝子配列内の非多型部位で生じる、オリゴヌクレオチドの３’末端以外の位置で幾つかのミスマッチを有していてもよい。

ｃ．検出可能なプローブ
ｉ）５’−ヌクレアーゼアッセイプローブ
遺伝子型決定はまた、米国特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２号；及び第５，８０４，３７５号；及び Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載のように「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」又は「５’−ヌクレアーゼアッセイ」を用いて行うことができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて、増幅された領域内でハイブリダイズする標識検出プローブが増幅反応中に添加される。プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのを防止するようにプローブが修飾される。増幅は、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。増幅の各合成ステップの間、伸長されたプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新規標的鎖の合成は、プローブの分解をももたらし、分解産物の蓄積は標的配列の合成の程度を提供する。

ハイブリダイゼーションプローブは、ＳＮＰ対立遺伝子間を識別する対立遺伝子特異的プローブであり得る。あるいは、この方法は、対立遺伝子特異的プライマー及び増幅産物に結合する標識プローブを用いて行うことができる。

分解産物を検出するのに適した任意の方法は、５’−ヌクレアーゼアッセイにおいて使用することができる。しばしば、検出プローブは、一方が他の色素の蛍光を消光することが可能である２つの蛍光色素で標識される。プローブがハイブリダイズしていない状態にあるとき消光が起き、そしてＤＮＡポリメラーゼの５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの開裂が２つの色素間で起こるように、色素がプローブに結合され、通常、一方が５’末端に、他方が内側部位に結合される。増幅は、消光の同時消失及び最初に消光される色素からの観察可能な蛍光の増加を伴う色素間のプローブの切断を生じる。分解産物の蓄積は、反応蛍光の増加を測定することによって監視される。米国特許第５，４９１，０６３号及び第５，５７１，６７３号は、両方とも本明細書中に参考として援用され、増幅に同時に起きるプローブの分解の代替的検出方法を記載している。

ｉｉ）二次構造プローブ
二次構造変化の際に検出可能なプローブは、ＳＮＰを含む多型性の検出に適している。例示した二次構造またはステム−ループ構造プローブは、分子ビーコン又はＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマー／プローブを含む。分子ビーコンプローブは、フルオロフォアとクエンチャーが通常、オリゴヌクレオチドの両端に配置される、ヘアピン構造を形成できる一本鎖オリゴ核酸プローブである。プローブの両端で、短い相補的な配列は、フルオロフォアとクエンチャーが近接状態になることを可能にする分子内ステムの形成を可能にする。分子ビーコンのループ部分は、目的の標的核酸に対して相補的である。目的とするその標的核酸に対するこのプローブの結合は、ステムを強制的に離すハイブリッドを形成している。これは、フルオロフォアとクエンチャーを動かして互いに離し、より強い蛍光シグナルをもたらすコンフォメーション変化を引き起こす。しかしながら、分子ビーコンプローブは、プローブ標的の小さな配列変異に非常に敏感である(Tyagi S. and Kramer F. R., Nature Biotechnology, Vol. 14, pages 303-308 (1996); Tyagi et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 49-53(1998); Piatek et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 359-363 (1998); Marras S. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 14, pages 151-156 (1999); Tpp I. et al, BioTechniques, Vol 28, pages 732-738 (2000))。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマー／プローブは、共有結合したプライマーに連結されたステム−ループ構造プローブを含む。

ｄ．ＤＮＡ配列と一塩基伸長
ＳＮＰはまた、直接配列決定によって検出することができる。方法としては、例えば、ジデオキシ配列決定に基づく方法や、マクサムとギルバート配列などの他の方法が挙げられる（例えば、Sambrook and Russell，上掲を参照）。

他の検出方法は、オリゴヌクレオチドの長さの産物のパイロシークエンシング^ＴＭが挙げられる。そのような方法は、多くの場合、ＰＣＲのような増幅技術を使用する。例えば、パイロシーケンシングでは、配列決定プライマーは、一本鎖、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされ；酵素であるＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ及びアピラーゼ及び基質であるアデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）及びルシフェリンと共にインキュベートされる。４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の第一番目を反応に加える。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖に（それが鋳型鎖中の塩基に相補的である場合に）デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒する。各取り込み事象は、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量のピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を伴う。ＡＴＰスルフリラーゼはアデノシン５’ホスホ硫酸の存在下で定量的にＰＰｉをＡＴＰに変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生み出すルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介性変換を駆動する。ルシフェラーゼ触媒反応において生成された光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、パイログラム^ＴＭにおいてピークとして見られる。各光シグナルは、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。ヌクレオチド分解酵素のアピラーゼは、取り込まれていないｄＮＴＰ及び過剰のＡＴＰを継続的に分解する。分解が完了すると、別のｄＮＴＰが添加される。

ＳＮＰを特徴付けるための別の類似の方法は、完全ＰＣＲの使用を必要としないが、通常、検討するヌクレオチドに相補的である、単一の蛍光標識されたジデオキシリボ核酸分子（ｄｄＮＴＰ）によるプライマーの伸長だけを使用する。多型部位の塩基は、一塩基だけ伸長されており、蛍光標識されたプライマーの検出を介して同定することができる（例えば、Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995を参照）。

ｅ．電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された増幅産物は、変性勾配ゲル電気泳動を用いて分析することができる。異なる対立遺伝子は異なる配列依存性融解特性及び溶液中のＤＮＡの電気泳動移動に基づいて同定することができる（例えば、Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, 7章を参照）。

マイクロサテライト多型性の区別は、キャピラリー電気泳動を用いて行うことができる。キャピラリー電気泳動は、好都合に、特定のマイクロサテライト対立遺伝子における反復の数を同定を可能とする。ＤＮＡ多型性の解析へのキャピラリー電気泳動の適用は、当業者によく知られている（例えば、Szantai, et al, J Chromatogr A. (2005) 1079(1-2):41-9; Bjorheim and Ekstrom, Electrophoresis (2005) 26(13):2520-30 and Mitchelson, Mol Biotechnol. (2003) 24(1):41-68を参照）。

ｆ．一本鎖高次構造多型解析
標的配列の対立遺伝子は、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度の変化により塩基の違いを識別する一本鎖高次構造多型解析を用いて区別することができ、例えば、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)に記載される。上記のように増幅されたＰＣＲ産物を生成することができ、そして加熱して又は他の方法で変性させて、一本鎖増幅産物を形成する。一本鎖核酸は、リフォールディングし又は塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成してもよい。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、標的の対立遺伝子間の塩基配列の差に関連しうる。

ＳＮＰ検出法は、しばしば、標識されたオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により検出可能な標識を組み込むことによって標識することができる。有用な標識は、蛍光色素、放射性標識、例えば３２Ｐ、電子密度試薬、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチン、又はハプテン、及び抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質を含む。標識技術は当技術分野で良く知られている（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上掲； Sambrook & Russell, 上掲）。

４．治療の方法
ＥＭＥＡによると、特定の癌の治療のためのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））の投与量は以下の通りである。結腸または直腸の転移性癌（ｍＣＲＣ）では、推奨投与量は２週間に１回与えられる体重の５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ、又は３週間に１回与えられる体重の７．５ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、転移性乳癌（ｍＢＣ）では、推奨投与量は、静脈内注入として２週間に１回与えられる体重の１０ｍｇ／ｋｇ又は３週間に１回与えられる体重の１５ｍｇ／ｋｇ、及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）では、推奨投与量は、静脈内注入として３週間に１回与えられる体重の７．５ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇである。ＮＳＣＬＣ患者における臨床的利益は７．５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの用量の両方で実証されている。詳細は、Pharmacodynamic Properties, Non-small cell lung cancer (NSCLC)のセクション５．１を参照。進行性及び／又は転移性腎細胞癌（ＭＲＣＣ）では、好ましい投与量は静脈内注入として２週間に１回与えられる体重の１０ｍｇ／ｋｇである（治療の最大６サイクルで白金に基づく化学療法、続いて疾患の進行まで単剤としてベバシズマブ（アバスチン（登録商標））に加えて）。グリオブラストーマでは特定の投与量は２週間毎に１０ｍｇ／ｋｇである。

本発明との関連において、血管新生阻害剤は、当該分野で公知の標準的な化学療法レジメンの一部として投与される一以上の化学療法剤による併用療法又は併用処置として又はそれらに加えて投与され得る。標準的な化学療法レジメンに含まれる薬剤の例としては、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン、エルロチニブ、カペシタビン、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン、インターフェロンα、ビノレルビン、及びパクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系化学療法剤が挙げられる。転移性膵臓癌の併用処置の例としては、２週間に１回与えられる体重の５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量でのゲムシタビンエルロチニブ＋ベバシズマブ、又は３週間に１回与えられる体重の７．５ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇが含まれる。腎細胞癌の併用処置の例としては、隔週に１回与えられる体重の１０ｍｇ／ｋｇでのインターフェロンアルファ＋ベバシズマブが含まれる。更に、患者は、ＩＦＬとも称する、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ロイコボリンの組み合わせで、例えば、ボーラスＩＦＬとして、ＦＯＬＦＯＸ４レジメンとも称するオキサリプラチン、ロイコボリン及び５−フルオロウラシルとの組合せで、又はＸＥＬＯＸとも称するカペシタビンとオキサリプラチンとの組み合わせで併用治療することができる。従って、本発明の更なる実施態様において、悪性疾患又は生理学的及び病理学的血管新生を伴う疾患に罹患している患者は、例えば、５フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビンエルロチニブ、カペシタビン、及び／又はパクリタキセル、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系化学療法剤のうち一以上の化学療法剤により治療されている。併用治療又は併用処置の例としては、ボーラスＩＦＬと共に２週間に１回の５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、または転移性結腸直腸癌についてはＦＯＬＦＯＸ４と共に２週ごとの１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、非扁平上皮非小細胞肺癌についてはカボプラチス（ｃａｂｏｐｌａｔｉｓ）／パクリタキセルと共に３週ごとの１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、および転移性乳癌についてはパクリタキセルと共に２週ごとの１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））が挙げられる。更に、投与対象の血管新生阻害剤は、放射線療法との併用治療又は併用処置として投与され得る。

５．キット
本発明はまた、上述のオリゴヌクレオチドのいずれか、及び適切な検出手段を任意で含む診断組成物またはキットに関する。

本発明のキットは、本発明の方法を実行するために有利に使用され得、とりわけ種々の適用、例えば診断分野においてまたは研究ツールとして使用され得る。本発明のキットの一部は、バイアル中、または容器中もしくは複数の容器単位中の組合せ中の個々のパッケージであり得る。そのキットの製造は、好ましくは当業者に公知の標準的な手順に従う。キットまたは診断組成物は、例えば本明細書に記載の増幅技術を使用して、本発明の本明細書に記載される方法により一以上のバリアント対立遺伝子の検出のために使用され得る。

したがって、本発明の更なる実施態様において、本発明は、一以上のＳＮＰの遺伝子型の存在を決定し得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の方法を実施するために有用なキットを提供する。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブを含むことができる。

本発明は以下の限定されない図面及び実施例を参照して更に説明される。

実施例１：
遺伝的決定は、ＶＥＧＦに対する内皮細胞の感受性に影響を与えることができる。これに従って、本発明との関連で、我々は、この治療レジメンの下での抗血管新生治療および高血圧の発生のための予測パターンを発見するために、基礎となるシグナル伝達経路における遺伝的変異性を調査した。この分析では、異なる進行性原発性癌を有する患者の臨床転帰とＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達経路における遺伝的変異の相関関係を、５つの異なる試験で評価した。５つ全ては、転移性結腸直腸癌（ＮＯ１６９６６試験）、転移性膵臓癌（ＡＶＩＴＡ）、進行性又は再発性非扁平上皮非小細胞肺癌（ＡＶＡＩＬ）、転移性腎癌（ＡＶＯＲＥＮ）及びＨＥＲ２陰性転移性乳癌（ＡＶＡＤＯ）の被験者でＢＥＶ（ベバシズマブ）の有効性と安全性を調査するための無作為化並列試験であった。

５試験全てにおいて、オプションのＤＮＡバイオマーカーサンプリングがＳＮＰ解析のために含られた。合計では、生殖細胞ＤＮＡは、１３４６人の患者から入手可能であった。低酸素誘導因子−１α及び−２α、ＶＥＧＦ−Ａ、その受容体（ＶＥＧＦＲ−１及び−２）及びその他の関連する遺伝子の中に位置する共通の単一塩基多型（ＳＮＰ）は、文献に基づき、ＳＮＰタグ付けアプローチ（ｆ≧０．１とＲ^２≦０．８）を使用して選択した。１５７のＳＮＰは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて首尾良く遺伝子型を同定された。リスク及び生存の推定値はＣｏｘ回帰分析を用いて計算した。
二つのタイプの分析を実施した。
１．ＰＦＳ及びＯＳへの遺伝子マーカーの相関関係。
２．「治験薬とは無関係」として分類されていない高血圧症に対する遺伝子マーカーの相関関係

ＶＥＧＦ−Ａプロモーターに位置するｒｓ６９９９４６（配列番号１）ＳＮＰは、対立遺伝子のＨＲが１．２６（９５％ＣＩ１．０７−１．４８，ｐ＝０．００５）であるｂｅｖ治療被験者における改善されたＰＦＳと関連していた。プラセボ被験者においては全く効果が見られず、ｒｓ６９９９４６（配列番号１）がベバシズマブ治療による良好な転帰の予測マーカーであり得ることを示唆している。ＶＥＧＦＲ２に位置するｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）ＳＮＰは、対立遺伝子のＨＲが１．１５（９５％ＣＩ１．０２−１．３０，ｐ＝０．０２）であるベバシズマブ治療被験者における改善されたＰＦＳと関連していた。ＯＳの観点から、ＶＥＧＦＲ２のｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）ＳＮＰは、ベバシズマブ治療被験者（対立遺伝子のＨＲ１．５０，９５％ＣＩ１．２１−１．８６，ｐ＝０．０００２）における改善されたＯＳと関連していた。プラセボ被験者においてはｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）の効果は全く見られなかった。

１０のＳＮＰがベバシズマブ誘導性高血圧症と関連していたが（ｐ＜０．０５）、しかし、これらは何れも多重検定のしきい値を超えていなかった（ｐ＜０．０００３）。最も強い関連を示す２つのＳＮＰ（ｐ＜０．０１）は、ＫＤＲにあるｒｓ２３０５９４９（配列番号３）（対立遺伝子のＯＲ０．９３，９５％ＣＩ０．８８−０．９８，ｐ＝０．００６７）、及びＥＧＦにあるｒｓ４４４４９０３（配列番号４）（対立遺伝子のＯＲ１．０６，９５％ＣＩ１．０２−１．１１，ｐ＝０．００５２）であった。興味深いことに、ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）及びｒｓ４４４４９０３（配列番号４）は、ＫＤＲとＥＧＦの位置２７３及び７０８上で生じるアミノ酸変化と密接に関連しており、これらの変化は、機能的に両方の遺伝子に影響を及ぼし、それによって高血圧の一因となり得ることを示唆している。特記すべきは、ＷＮＫ１にあるｒｓ１１０６４５６０はまたベバシズマブ誘導性高血圧と関連しており（対立遺伝子のＯＲ１．０６，９５％ＣＩ１．０１−１．１０，ｐ＝０．０２）、それにより限られた数の患者で以前の観察を裏付けている[Frey et al. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 11003)]。

患者及び方法
サンプル
全５試験のプロトコルは、各場所の施設内倫理委員会によって承認され、かつヘルシンキ宣言、現在の米国食品医薬品局の医薬品の臨床試験の実施の基準及び地域の倫理的法的要件に従って行った。合計では、１３４６年の被験者が遺伝子型を同定した。これらの被験者の中で、１２２５人が白人及び１２１人が非白人であった。非白人の患者は白人患者から遺伝的に区別され、ＳＮＰの頻度は両方の民族グループの間で異なる場会があるため、非白人の患者は更なる分析から除外された。全ての患者は、遺伝的バイオマーカーテストのため別の書面によるインフォームドコンセントを提供した。

評価
患者は、以下の参考文献に記載の研究プロトコルに従って評価した：
− ＡＶＩＴＡ：Van Cutsem et al., J. Clinc.Oncol.27, 2231-7 (2009)
− ＡＶＡＩＬ：Reck M, von Pawel J, Zatloukal P, et al.非扁平上皮非小細胞肺癌の一次治療としてプラセボ又はベバシズマブのいずれかを伴うシスプラチンとゲムシタビンの第ＩＩＩ相試験:AVAiL.J Clin Oncol 2009;27(8):1227-34
− ＡＶＯＲＥＮ：Escudier B, Pluzanska A, Koralewski P, Ravaud A, Bracarda S, Szczylik C, et al.転移性腎細胞癌の治療のためのベバシズマブとインターフェロンアルファ−２ａ：無作為化、二重盲検第ＩＩＩ相試験、Lancet.2007;370(9605):2103-2111
− ＡＶＡＤＯ：Miles DW, et al., J Clin Oncol 2010a;28(20):3239-47
− ＮＯ１６９６６：Saltz LB, Clarke S, Diaz-Rubio E, et al.転移性結腸直腸癌における一次治療としてのオキサリプラチンに基づく化学療法との組み合わせにおけるベバシズマブ：無作為化第ＩＩＩ相試験、J Clin Oncol 2008;26(12):2013-2019

一塩基多型の選択
２つのマーカーパネルが分析のために考慮された。ロシュパネル及びルーベンパネル。ロシュパネルはＢＥＶ治療への潜在的関連性について文献調査によって選択された３５の遺伝子多型で構成される。パネルはＳＮＰ及び以下の遺伝子：ＶＥＧＦＡ，ＮＯＳ３，ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１），ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２），ＷＮＫ１，ＩＬ８，ＩＬ８Ｒ及びＩＦＮＡＲ２内にある反復多型で構成される。ルーベンパネルは、ＶＥＧＦのシグナル伝達カスケードから、又は既知の副作用、高血圧症又は血栓症の候補遺伝子からの１８６タグＳＮＰからなり、以下の遺伝子：ＶＥＧＦリガンド、ＶＥＧＦホモログ（胎盤成長因子又はＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ及び−Ｃ；並びにＶＥＧＦ−Ｄ又はＦｌＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ又はＶＥＧＦＲ−２）及びＶＥＧＦ受容体−１（ＦＬＴ１又はＶＥＧＦＲ−１）が含まれる。各遺伝子の３’ポリＡアデニル化部位までの翻訳開始部位の５ｋｂ上流が、ＨａｐＭａｐデータベース（HapMap Data Rel 24/phaseII Nov08, on NCBI B36 assembly, dbSNP b126）からのＳＮＰを選択するために使用された。タグ付きＳＮＰは、ＨＡＰＬＯＶＩＥＷソフトウェアパッケージ(Barrett, J.C., et al., Bioinformatics. 21, 263-5 (2005))で提供されるＴａｇｇｅｒ(Pe'er, I., et al., Nat. Genet. 38, 663-7 (2006))を用いて選択した。一般的に発生するＳＮＰのみが、即ち少数の対立遺伝子頻度ｆ≧０．１及び最小のｒ^２閾値≧０．８が考慮された。これらの基準に従って合計１６７のタグ付きＳＮＰが選択された。更に、エキソン配列に位置し、頻度ｆ≧０．１で非同義アミノ酸の変化を誘導する１１のＳＮＰ、並びにＶＥＧＦにある４つのＳＮＰ（ｒｓ６９９９４７、ｒｓ８３３０６１、ｒｓ２０１０９６３及びｒｓ３０２５０３９）、ＶＥＧＦＲ−１にある１つのＳＮＰ（ｒｓＴＰ５３＿Ｒ−１）、及びＶＥＧＦＲ−２にある１つのＳＮＰ（ｒｓ２０７１５５９）（これらは以前は、これらの遺伝子の機能または発現に影響することが報告されている）がｄｂＳＮＰデータベースから選択された。

２つのパネル内のマーカーの間に一部重複があり、パネルの大きさは６つの試験の期間にわたってわずかに増加しており、前の試験ではかなり少数のマーカーが利用可能である。現在のメタ分析は、遺伝子型決定が研究中に少なくとも２つの試験で行われたマーカーに限定されている。

次の４つのマーカーセットが定義された：
「すべてのマーカー」は、少なくとも１の遺伝子型が得られたアッセイされたすべてのマーカーからなる。
「ロシュマーカー」は、品質チェックに合格し（下記参照）及び白人被験者中で１％を超える頻度を有するロシュパネルからのマーカーからなる。
「ルーベン有効性マーカー」は、ＶＥＧＦ経路に関係する遺伝子座にあり、品質チェックに合格し（下記参照）及び白人被験者中で１％を超える頻度を有するルーベンパネルからのマーカーからなる。
「ルーベン安全性マーカー」は、高血圧又は血栓症への関与についての候補遺伝子にあり、品質チェックに合格し（下記参照）及び白人被験者中で１％を超える頻度を有するルーベンパネルからのマーカーからなる。

遺伝子型判定
末梢血をＫ２ＥＤＴＡプラスチックバキュテナーチューブに採取した。遠心分離後、生殖細胞系ＤＮＡは、標準的な手順に従って、沈殿した白血球細胞画分から抽出した。

ロシュパネルのＳＮＰについては、遺伝子型決定は、ロシュトランスレーショナルリサーチ科学遺伝学研究所（バーゼル、スイス）で対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅、サンガー配列決定、及びフラグメント解析プラットフォームを用いて盲検法で実施した（ＡＶＡＩＬ、ＡＶＩＴＡ、ＡＶＯＲＥＮ、ＡＶＡＤＯ、ＮＯ１６９６６）。

ルーヴェンパネルのＳＮＰについては、遺伝子型決定は、シーケノムのｉＰＬＥＸプラットフォーム（シーケノム社、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてヴェサリウス研究センター（ルーベン、ベルギー）で盲検法で行った。最初の遺伝子型判定ラウンドで堅牢な遺伝子型を提供するのに失敗した全てのＳＮＰは、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーの異なる組を使用して再設計されて再試験した。全体的に、１５７（８５．３％）が、９８．５％の全体的な成功率を有し、成功裏に遺伝子型を同定した。また、２回目の設計に失敗した２７のＳＮＰは失敗とみなされた。

次の増幅プライマーが、ＳＮＰのｒｓ６９９９４６（配列番号１），ｒｓ１２５０５７５８（配列番号２），ｒｓ２３０５９４９（配列番号３），ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）及びｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）について設計された。ｒｓ６９９９４６（配列番号１）では、ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧ（配列番号６）及びＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣ（配列番号７）を用いた。ＳＮＰｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）では、ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＧ（配列番号８）及びＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＧ（配列番号９）を用いた。ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）では、ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＣＣＴＡＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号１０）及びＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＴＡＴＡＧＧＣ（配列番号１１）を用いた。ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）では、ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＴＣＣ（配列番号１２）及びＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧ（配列番号１３）を用いた。ｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）では、ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡ（配列番号１４）及びＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＧ（配列番号１５）を用いた。

次の増幅プライマーが、ＳＮＰのｒｓ６９９９４６（配列番号１），ｒｓ１２５０５７５８（配列番号２），ｒｓ２３０５９４９（配列番号３），ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）及びｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）について設計された。ｒｓ６９９９４６（配列番号１）では、ＡＴＴＡＧＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡ（配列番号１６）を用いた。ｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）では、ＴＴＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＡ（配列番号１７）を用いた。ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）では、ＣＴＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡ（配列番号１８）を用いた。ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）では、ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号１９）を用いた。ｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）では、ＣＡＣＡＴＴＧＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣ（配列番号２０）を用いた。

品質チェック
データは以下のように品質についてチェックした。
アッセイ鎖の均一性が確認された。
欠損データのレベルをまとめた。
マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ＜１％）を有するマーカーは除外された。
対立遺伝子頻度の均質性の試験が失敗したマーカーは除外された。
ハーディワインベルグ平衡（ＨＷＥ）の試験が解釈を支援するために実施された。

品質チェック後、２５のロシュマーカー、１３３のルーベン有効性マーカー及び２２のルーベン安全マーカーを、統合連関分析に付した。

統計分析
研究によって層別化された個々の患者データの統合解析は、均一頻度を有する全てのマーカーに適用された。有効性の候補マーカーを、コックス比例ハザード回帰を用いて、ＰＦＳとＯＳへの関連について試験した。安全性の候補マーカーを、ロジスティック回帰を用いて、高血圧への関連について試験した。一次解析は、ＩＴＴ（有効性エンドポイントの場合）からの白人のベバシズマブで治療された被験者及び必要に応じてＳＰを含んでいた。調整は以下の共変量について全ての連想検査で行われた：地域、研究及び用量及び背景の化学療法レジメン。後方ステップワイズ回帰を使用してエンドポイントによって選択された、次の変数のサブセットも同様に調整された：ＥＣＯＧ活動指標（０対１）、性別（女性対男性）、年齢、ＬＤＨ、アルカリホスファターゼレベル（正常範囲内対正常範囲以上）、血清アルブミン（＜２．９ｇ／ｄＬ対＞＝２．９ｇ／ｄＬ）、及び転移部位のベースライン数（＞２対＜＝２）。任意の検出された関連性が治療効果よりも一時的効果を反映したかどうかを調べるために、連想検査も白人のプラセボ処置被験者で実施した。更に、検出された任意の関連性を特徴付けるために、遺伝子型Ｘ処置の相互作用分析を白人被験者で実施した。

データ
２６のロシュマーカー、１３６のルーベン有効性マーカー及び２２のルーベン安全性マーカーが品質チェックに合格し、均質性分析に供された。表１は、メタ分析に組み込まれる被験者の数を示す。ＩＴＴ中３人の被験者は、ＳＰにはおらず、３人の被験者は無作為化週用量（ＲＮＤＷＤ）の欠測値を持っていた。

遺伝的患者集団の臨床的特徴
人口統計学的およびエンドポイント特性が臨床試験により、そしてＰＧｘ−ＩＴＴ−ＢＥＶ−の全民族の患者全体によって表２にまとめた。エンドポイントの分布が図１−４にグラフで描かれている。

臨床データは５試験から１３４８人の被験者で、治療群とプラセボで全体的に同数で利用可能であった。他の試験とは対照的に、男性は、進行性乳癌の試験であったＢＯ１７７０８（ＡＶＡＤＯ）に参加していない。白人の年齢分布及び割合は、最大の治験ＮＯ１６９６６で白人の被験者がわずかに低い割合であることを除いて、広く均質であった。ＯＳとＰＦＳの中央値の長さは、打ち切りの率と同様に、大きく異なっていた。予想されたように、ＯＳのための打ち切りは、ＰＦＳの場合よりもはるかに大きく、統計的項目において、その作用は、ＰＦＳに比べてＯＳへの関連性を検出する能力を低減することになる。ＢＯＲの割合はＢＥＶで治療された被験者で４９％であり、ＰＢＯで治療された被験者で４６％であった。高血圧症の割合はＢＥＶで治療された被験者で１８％であり、ＰＢＯで治療された被験者で７％であった（図４）。

ＰＧｘ−ＩＴＴにおいて、ベバシズマブで治療された６２９人の白人被験者のうち、ＰＳＦは５９２の事象、ＯＳは４３８の事象があった。高血圧症では、ＰＧｘ−ＳＰにおいてベバシズマブで治療された全６２９人の白人被験者のうち１１３の事象があった。表３は、メタ分析に組み込まれる白人被験者の数を示す。

結果の有効性
無増悪生存期間
ベバシズマブで治療を受けた患者のサブグループにおける分析
ＰＦＳとＶＥＧＦ−Ａの最も強い関連は、ｒｓ６９９９４６においてであった（配列番号１）（ｐ＝０．００５）。結果は複数のテストについて調整後に有意ではないであろうが、それはSchneider et al. J Clin Oncol 2008 26:4672により公表された、マーカーｒｓ６９９９４７と一致した上流のシグナルを提供する。遺伝子全体にわたる関連付けの散布図を図５に示す。

ＡＡキャリアに比べて、ｒｓ６９９９４６（配列番号１）ＡＧキャリアのＨＲは、１．２６（９５％ＣＩ１．０７−１．４８（ｐ＝０．００５）であった。これは、各追加のＧ対立遺伝子は、進行又は死亡のリスクの２７％の増加と関連していたことを意味する。プラセボ被験者においては全く効果が見られず、ｒｓ６９９９４６（配列番号１）がベバシズマブ治療による良好な転帰の予測マーカーであり得ることを示唆している。

図６に示すように、検討中の最小の研究であるＡＶＯＲＥＮ／ＢＯ１７７０５（腎臓癌）を除いて、ｒｓ６９９９４６（配列番号１）の一貫性のある作用は、全ての研究で見られた。

更に、ｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）はＰＦＳに対する関連性は弱かった（図１３）。

ＴＴキャリアに比べて、ｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）ＣＴキャリアのＨＲは、１．１５（９５％ＣＩ１．０２−１．３０（ｐ＝０．０２）であった。これは、各追加のＣ対立遺伝子は、進行又は死亡のリスクの１５％の増加と関連していたことを意味する。

全生存期間の解析
ベバシズマブで治療を受けた患者のサブグループにおける分析
ＯＳについての連関分析で、６／１３３のマーカーが白人治療患者でｐ＜０．０５を有していた。これらのうち、ｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）は、１５８試験についてボンフェローニ調整後に有意である。マーカーは、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体；ＶＥＧＦＲ２；ＦＬＫ１）中のイントロンのＳＮＰであり、そしてそれは、遺伝子中で他のイントロンのＳＮＰ、ｒｓ１５３１２８９とともにＬＤ（ｒ２＝０．３１）にある（出典：ＨａｐＭａｐリリース２２；ＨａｐＭａｐｖ３リリース２では利用できなかったマーカー）。マーカーは白人のプラセボ処置被験者では関連性がなく、従って予後性質とは対照的に、予測を有すると言われてもよい。フォレストプロット（図７）を調べると、効果はＮＯ１６９６６（結腸直腸癌）とＢＯ１７７０５（ＡＶＯＲＥＮ、腎癌）により主に駆動されることを示している。その効果は、他の３つの研究では弱いか、または存在しないのいずれかである。

ＴＴキャリアに比べて、ｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）ＴＣキャリアのＨＲは（対立遺伝子ＨＲ１．５０，９５％ＣＩ１．２１−１．８６（ｐ＝０．０００２）であった。これは、各追加のＣ対立遺伝子は、死亡のリスクの５０％の増加と関連していたことを意味する。プラセボ被験者においてはｒｓ１２５０５７５８（配列番号２）の効果は全く見られなかった。

カプラン・マイヤープロットは、少数の対立遺伝子のコピー数の増加とともに推定ハザード比を増加させることを示している（図８）。

ＳＮＰについての追加情報
ｒｓ６９９９４６（配列番号１）ＳＮＰはＶＥＧＦプロモーターにあるため、我々は、ヒト血漿サンプル中でＶＥＧＦ−Ａ発現に及ぼす作用を調べた。私たちは、ＧＧのキャリアはＡＧとＡＡ（野生型）のキャリアに比べて、ＶＥＧＦ発現の中央値が２７％増加していることを見いだした。ｒｓ６９９９４６（配列番号１）の少数対立遺伝子は、ベバシズマブ治療法に対する応答と関連していることが以前に示されている別のＶＥＧＦプロモーターのＳＮＰである、ｒｓ６９９９４７（Ｄ’０．９８；ｒ^２＝０．２３）の少数の対立遺伝子と連携していた[Schneider et al, J Clin Oncol 2008 26:4672]。更に、ｒｓ６９９９４６（配列番号１）はまた、メタ分析におけるＰＦＳについて、ＶＥＧＦの２番目のヒットとして現れた、ｒｓ８３３０５８（−６５８９Ｃ＞Ｔ）とも連携している。

追加研究の結論：我々は、ＶＥＧＦ−Ａプロモーター中のｒｓ６９９９４６（配列番号１）のＧ対立遺伝子は、血漿ＶＥＧＦ−Ａ発現の増加と関連しており、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらにより、ベバシズマブ治療法に対する応答と関連していることが以前に示されている別のＶＥＧＦ−ＡプロモーターのＳＮＰである、ｒｓ６９９９４７と連携していることを実証した。

ＶＥＧＦＲ２中のｒｓ１１１３３３６０（配列番号５）はＶＥＧＦＲ２タンパク質の細胞外ドメインをコードするエキソンの間に位置するイントロンＳＮＰである。我々は、少数のＣ対立遺伝子にホモ接合性のＨＵＶＥＣは、ＣＴ及びＴＴのキャリアに比べてＶＥＧＦ刺激により増殖を増加していることを見いだした。重要なのは、ｒｓ１１１３３３６０はまた、Ｖａｌ２９７Ｉｌｅ置換を誘導する非同義ＳＮＰであって、ＶＥＧＦＲ−２へのＶＥＧＦの結合に影響を与えることが報告されているｒｓ２３０５９４８（Ｄ’＝１）と強く連携携していることである。

高血圧症の結果
最も強い関連を示す２つのＳＮＰ（ｐ＜０．０１）は、ＫＤＲにあるｒｓ２３０５９４９（配列番号３）（対立遺伝子のＯＲ０．９３，９５％ＣＩ０．８８−０．９８，ｐ＝０．００６７）、ＥＧＦにあるｒｓ４４４４９０３（配列番号４）（対立遺伝子のＯＲ１．０６，９５％ＣＩ１．０２−１．１１，ｐ＝０．００５２）であった；表４を参照、しかしこれらはいずれも、多重検定のしきい値を超えなかった（ｐ＜０．０００３）。興味深いことに、ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）及びｒｓ４４４４９０３（配列番号４）は、ＫＤＲとＥＧＦの位置２７３及び７０８上で生じるアミノ酸変化と密接に関連しており、これらの変化は、機能的に両方の遺伝子に影響を及ぼし、それによって高血圧の一因となり得ることを示唆している。

ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）（ＫＤＲ）
図９に示すように、高血圧のより高い頻度が、ＣＣのキャリアで見られた。図１０は、３つの試験（ＮＯ１６９６６，ＡＶＡＩＬ／ＢＯ１７７０４及びＡＶＯＲＥＮ／ＢＯ１７７０５）は関連性を駆動することを示している。白人のプラセボで処置された被験者についてのフォレストプロット（非表示）は、研究間における平均作用は、逆方向に弱いことを示しており、このマーカーが予測特性を有すると結論付けることができる。

ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）（ＥＧＦ）
図１１に示すように、高血圧のより高い頻度は、ＧＡキャリアで見られ、ＡＡキャリアで最低頻度であったが、ＧＧキャリアの頻度は中間にあった。ＥＧＦにおけるマーカーｒｓ４４４４９０３（配列番号４）では、フォレストプロットの検討（図１２）は試験間で合理的な整合性を示し、最も弱い作用はｉｎＢＯ１７７０８／ＡＶＡＤＯ（乳癌）で観察された。プラセボ群における被験者のフォレストプロット（非表示）は、予後特性とは対照的に、予測マーカーであることを示している。

Claims

ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法と関連した高血圧の発症に対する患者の感受性を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に多かれ少なかれ感受性がある患者を同定することを含み、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に感受性があることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対して感受性が小さいことを示す方法。
治療法が化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む、請求項１に記載の方法。
血管新生阻害剤が、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される、請求項１又は２の何れか一項に記載の方法。
癌が、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌又は肺癌である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
サンプルが血液サンプルである、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
遺伝子型が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
患者に治療薬を投与することを更に含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
その必要のある患者の治療のための請求項１から７に記載される血管新生阻害剤を含む薬学的組成物であって、前記患者が、請求項１から７の何れか一項に記載の方法に従って、血管新生阻害剤を含む治療法と関連した高血圧の発症に対して感受性が小さいと確定される、薬学的組成物。
遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法を実施するためのキット。
ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療法に関連した高血圧を発症するリスクを減らす方法であって、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に感受性が小さい患者を同定し、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＣの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対する感受性が小さいことを示し、及び
（ｃ）（ｂ）に従って高血圧の発症に対する感受性が小さいとして同定された、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）でのＣＴ又はＴＴ遺伝子型を持つ患者に対して、前記血管新生阻害剤を投与することを含む方法。
治療が化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む、請求項１０に記載の方法。
血管新生阻害剤が、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される、請求項１０又は１１の何れか一項に記載の方法。
癌が、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌又は肺癌である、請求項１０から１２の何れか一項に記載の方法。
サンプルが血液サンプルである、請求項１０から１３の何れか一項に記載の方法。
遺伝子型が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される、請求項１０から１４の何れか一項に記載の方法。
ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療薬を患者に投与することを含み、遺伝子多型ｒｓ２３０５９４９（配列番号３）での患者の遺伝子型がＣＴ又はＴＴであることが確定される方法。
ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療法と関連した高血圧の発症に対する患者の感受性を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に多かれ少なかれ感受性がある患者を同定することを含み、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症により感受性であることを示し、又は遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症への感受性が小さいことを示す方法。
治療法が化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む、請求項１７に記載の方法。
血管新生阻害剤が、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される、請求項１７又は１８の何れか一項に記載の方法。
癌が、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌又は肺癌である、請求項１７から１９の何れか一項に記載の方法。
サンプルが血液サンプルである、請求項１７から２０の何れか一項に記載の方法。
遺伝子型が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される、請求項１７から２１の何れか一項に記載の方法。
患者に治療薬を投与することを更に含む、請求項１７から２２の何れか一項に記載の方法。
その必要のある患者の治療のための請求項１７から２３に記載される血管新生阻害剤を含む薬学的組成物であって、前記患者が、請求項１７から２３の何れか一項に記載の方法に従って血管新生阻害剤による治療法と関連した高血圧の発症に対して感受性が小さいと確定される、薬学的組成物。
遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１７から２３の何れか一項に記載の方法を実施するためのキット。
ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧を発症するリスクを減らす方法であって、該方法は、
（ａ）癌に罹患した患者由来のサンプルで、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での遺伝子型を決定し、
（ｂ）ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤による治療法に関連した高血圧の発症に感受性が小さい患者を同定し、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＧ又はＡＡ遺伝子型の存在は、前記患者が遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でのＧＡの遺伝子型を有する患者よりも高血圧の発症に対する感受性が小さいことを示し、及び
（ｃ）（ｂ）に従って高血圧の発症に対する感受性が小さいとして同定される、遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）でＧＧ又はＡＡ遺伝子型を持つ患者に対して、前記血管新生阻害剤を投与することを含む方法。
治療法が化学療法剤又は化学療法レジメンを更に含む、請求項２６に記載の方法。
血管新生阻害剤が、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン−エルロチニブ及び白金を用いた化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される、請求項２６又は２７の何れか一項に記載の方法。
癌が、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌又は肺癌である、請求項２６から２８の何れか一項に記載の方法。
サンプルが血液サンプルである、請求項２６から２９の何れか一項に記載の方法。
遺伝子型が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される、請求項２６から３０の何れか一項に記載の方法。
遺伝子多型ｒｓ４４４４９０３（配列番号４）での患者の遺伝子型がＧＧ又はＡＡであることが確定され、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む治療薬を患者に投与することを含む、患者を治療する方法。