FR2650839A1 - Procede de detection en phase homogene liquide de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications - Google Patents

Procede de detection en phase homogene liquide de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications Download PDF

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Abstract

Procédé de détection en solution de séquences spécifiques d'acides nucléiques. On met en contact des acides nucléiques double brin obtenus après forte dilution et amplification, avec un composé qui interagit avec un acide nucléique double brin, notamment une matière colorante ou un agent intercalant apte à produire des modifications spectrales après liaison avec l'ADN double brin, la détection étant réalisée par tout moyen approprié. Applications à la détection de maladies infectieuses ou tumorales, au contrôle d'échantillons biologiques, au typage cellulaire, etc.

Description

La présente invention est relative à un procédé de détection en phase homogène liquide de séquences spécifiques d'acides nucléiques double brin, obtenus par amplification, ainsi qu'a ses applications.
La réaction de polymérisation en-chaSne (PCR) a été développée par SAIKI R. et al. (Science, 1985, 230, 1350). Cette technique permet notamment d'amplifier des séquences d'ADN double brin et est basée sur le fonctionnement cyclique d'une ADN polymérase, laquelle enzyme est capable de copier un brin d1ADN, utilisé comme matrice, en un brin complémentaire par élongation à partir de l'extrémité 3' OH libre d'une amorce oligonucléotidique.
La technique PCR consiste à effectuer n cycles successifs d'amplification, au cours desquels deux amorces dirigent l'amplification de la séquence d'ADN double brin qu'elles encadrent.
Un cycle d'amplification est composé de trois étapes permettant de réaliser successivement la dénaturation de l'ADN (95'C), l'hybridation des -amorces (37-55 C) et l'extension des brins d'ADN par une ADN polymérase.
Cette technique d'amplification est plus particulièrement décrite dans la Demande de Brevet européen
CETUS 201 184, qui spécifie notamment que les deux amorces oligonucléotidiques mises en oeuvre dans la PCR sont de préférence simple brin et doivent être suffisamment longues pour amorcer la synthèse du produit d'extension en présence de 1'ADN polymérase.
Pour éviter l'addition d'enzymes a chaque cycle, une ADN polymérase pouvant résister à 100'C, la
Taq ADN polymérase, décrite dans la Demande de Brevet européen CETUS 258 017, est ajoutée dès le début du procédé et permet de réaliser jusqu'à 40 cycles d'amplification consécutifs. La Taq polymérase a permis d'une part d'automatiser le procédé d'amplification et d'autre part d'augmenter la spécificité de l'amplification.
Les séquences amplifiées sont ensuite détectées. Plusieurs techniques de détection ont été proposées, elles font notamment appel à des sondes de détection qui s'hybrident avec l'un des brins de la séquence d'acide nucléique amplifiée. Une telle hybridation peut être réalisée soit sur support solide, soit en solution..
L'hybridation entre une sonde de détection et la séquence d'acide nucléique cible amplifiée, réalisée sur support solide (dot blot, Southern blot), est notamment décrite dans la Demande de Brevet européen CETUS 200 362 qui décrit la technique d'amplification, associée à une méthode d'hybridation, pour la détection d'une séquence d'acide nucléique.
La Demande de Brevet européen MOLECULAR DIA
GNOSIS Inc., n 297 379 décrit une méthode d'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible spécifique dans un échantillon, dans laquelle on utilise des amorces oligonucléotidiques fixées sur un support solide pour l'amplification d'une séquence et le produit amplifié est ainsi directement prêt à être détecté.
D'autres Demandes de Brevet décrivent des méthodes de détection d'acides nucléiques par amplification qui ont pour but de simplifier l'étape de détection proprement dite, située en aval de l'amplification des séquences d'acide nucléique ; il s'agit notamment d'une hybridation entre la sonde et la séquence d'acide nucléique, réalisée en solution.
Cette hybridation en solution présente, en effet, des avantages d'efficacité et de rapidité.
Plusieurs procédés d'hybridation en solution ont été décrits dans l'Art antérieur
- la méthode d'hybridation en solution est plus particulièrement décrite dans le Brevet britannique 2 169 403 et le Brevet français 85 19394.
Dans cette méthode on utilise deux sondes différentes (S1 et Sz) qui sont dans la même phase en solution. La sonde de détection (Si) est marquée avec un marqueur détectable et un fragment ayant une affinité pour un autre composant est fixée à la sonde de capture (si).
Après hybridation, l'hybride formé entre S2, la séquence d'acide nucléique cible et Si peut être séparé de la solution d'hybridation à l'aide de l'autre partie de la paire d'affinité.
Dans cette méthode, les hybridations sandwich de type ADN-ADN sont peu efficaces, l'hybride dérivé de la séquence cible ayant tendance à se reformer et a reje- ter les sondes, plus courtes, de capture et de détec tion ;
- KOHNE D. (American Clin. Review, nov. 1986) décrit une méthode de détection des Legionella et des By- coplasma pneumoniae par hybridation avec des sondes radioactives d'ADN. Les séquences cibles répétitives des
ARN ribosomaux appartenant aux microorganismes présents dans les échantillons biologiques sont hybridées à des sondes radioactives de l'ADN. Les duplex ADN-ARN sont séparés par fixation sur hydroxyapatite. La méthode est limitée aux organismes présentant des séquences naturelles répétitives et les bruits de fond sont relativement importants.Le principal inconvénient du système est qu'il repose sur la discrimination des simples chaînes par rapport aux doubles chaînes et non sur la séparation des hybrides spécifiques de la séquence par rapport à l'excès de sonde
- le Brevet US 4 486 539 décrit une méthode d'hybridation de type sandwich en une seule étape, dans laquelle on a une sonde de détection (Si) marquée et une sonde de capture (S2) immobilisée sur un support solide, pour la séparation de l'acide nucléique cible, du mélange réactionnel. Dans une telle méthode on n'obtient pas une hybridation suffisante en moins de 12 heures
- les Demandes de Brevets européens 70685 et 70687 proposent une méthode qui dispenserait de séparer physiquement la sonde hybridée de la sonde non hybridée.
Ils proposent l'utilisation d'une paire de sondes qui s'hybrident dans des positions contiguës sur une séquence cible, l'une porte un catalyseur de chimiluminescence (peroxydase, luminol), l'autre une molécule absorbant l'émission chimiluminescente (rhodamine par exemple). La lumière absorbée est émise à une longueur d'onde différente. Il n'y a plus de support solide et la mesure s'effectue directement en solution. Cf. HELLER M. et
MORRISON L. (Rapid Detection of Infectious Agents,
Kingsbury D. et Falkow S. Ed. pp. 245-256, Academic Press
New-York)
- on peut également citer la Demande de Brevet européen CETUS 229 701 qui décrit un procédé de détection de virus par amplification et hybridation soit sur support solide, soit en solution.Dans ce dernier cas, la séquence d'acide nucléique amplifiée et hybridée en solution à une sonde oligonucléotidique marquée, s'hybride spécifiquement à la séquence cible, ladite sonde étant détectée par la technique de restriction oligomérique. Le fragment de sonde marquée obtenu par clivage par l'enzyme de restriction appropriée est séparé sur gel d'électrophorèse et le gel est autoradiographié.
- la Demande de Brevet français 88 03107 décrit pour sa part une méthode de dosage d'acides nucléiques dans laquelle les sondes de capture jouent le r8le d'amorces modifiées, lesdites amorces étant incorporées dans des copies de l'acide nucléique cible dont la présence est ensuite détectée par au moins une sonde de détection sélective.
Les systèmes de capture sont insérés par PCR aux deux extrémités d'une double chaîne de DNA dérivée de la cible à l'aide d'amorces modifiées. Le duplex est dénaturé et une sonde oligonucléotidique de grande longueur marquée est hybridée a l'un des deux simples brins obtenus.
Dans ce procédé le duplex final, dérivé de la séquence biologique recherchée et portant à chacune de ses extrémités un système de capture par un support so- lide, doit être dénaturé. Il est ensuite mis en présence d'une sonde oligonucléotidique de détection qui est plus courte. Il existe une réaction de compétition entre les simples brins de la cible qui ont tendance à se renaturer rapidement et l'hybridation de la sonde avec un simple brin du duplex. La sonde étant plus courte, l'association (sonde)-(chaine de la cible) est beaucoup plus instable que l'association (charnue de la cible)-(chaine de la cible). Il faut utiliser une sonde oligonucléotidique de grande longueur ou de grandes quantités de chaînes courtes pour jouer sur la loi d'action de masse.
Il en résulte nécessairement une augmentation du bruit de fond et une consommation importante de réactifs.
Dans une variante, les systèmes de détection sont insérés aux deux extrémités du duplex par PCR à l'aide d'amorces modifiées. Une sonde de capture pour le support est hybridée sur l'une des deux chaînes du support après dénaturation du duplex obtenu. Les problèmes de compétition mentionnés ci-dessus sont les mêmes.
Il a par ailleurs été proposé de visualiser les quantités d'ADN amplifié par la méthode PCR, et notamment de les visualiser directement sous ultraviolet après électrophorèse et coloration au bromure d'éthidium -qui est un agent intercalant de 1'ADN qui fluoresce sous
UV- cf BIOFUTUR, janvier 1989, p 45-49.
Toutefois, aucune des méthodes d'amplification et/ou de détection de séquences spécifiques d'acides nucléiques de l'Art antérieur, qui sont les seules à être aisément automatisables, ne permet la réalisation d'une détection d'acide nucléique en phase homogène, c'est à dire ne nécessitant ni fixation sur un support solide de capture, ni utilisation d'amorces nucléotidiques modifiées, ni une étape d'hybridation avec une sonde de détection.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir å un procédé de détection en phase homogène de séquences spécifiques d'acides nucléiques obtenus par amplification, en solution, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés de l'Art antérieur, notamment en ce qu'il est facile & automatiser, rapide, simple et économique.
La présente invention a pour objet un procédé de détection en solution de séquences spécifiques d'acide(s) nucléique(s) (séquence unique et/ou mélange de séquences d'acides nucléiques) présente(s) dans un échantillon biologique, mises en solution, par au moins une amplification enzymatique en présence d'au moins une paire d'amorces appropriées (étape 1), pour amplifier au moins un fragment de ladite/desdites séquences d'acide nucléique cible, lesdites amorces délimitant.le fragment de la/les séquences cibles à détecter, s!hybridant à ladite/auxdites séquence(s) cible(s) et permettant d'obtenir un nombre important de séquences cibles amplifiées, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la détection directe en phase homogène liquide desdites séquences cibles amplifiées, par mise en contact des acides nucléiques double brin, obtenus après forte dilution et amplification, avec un composé qui interagit avec un acide nucléique double brin, notamment une matière colorante ou un agent intercalant apte & produire des modifications spectrales, ladite détection étant réalisée par tout moyen approprié (étape 2).
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, ledit composé est choisi parmi les substances présentant une modification physico-chimique après liaison avec 1'ADN double brin.
On peut citer à titre d'exemples non limitatifs de tels composés, le 4',6-diamidino-2-phénylindole-2 (DAPI), le bisbenzimide, l'éthidium, la 9-aminoacridine, la proflavine, la quinacrine, la chloroquine, la lucanthone, l'hycanthone, la tilorone, le mAMSA-, la daunomycine, l'adriamycine, l'actinomycine D, la 9-OH Nméthyl-ellipticine, la mithoxanthrone, la bleomycine, ltéchinomycine, la ditercaline et les dérivés de ces composés, ainsi que les nucléotides modifiés de manière appropriée.
Le procédé conforme à l'invention a l'avantage de ne nécessiter qu'une mesure directe de l'acide nucléique double brin marqué total présent dans la solution pour caractériser la séquence recherchée
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, le procédé comprend après l'amplification enzymatique (étape 1) et préalablement à la mise en contact avec ledit composé apte-à produire des modifications spectrales (étape 2)
- au moins une dilution appropriée de la so- lution d'amplification enzymatique obtenue au cours de l'étape 1, permettant d'obtenir une solution d'amplification d'enrichissement en séquences cibles et,
- suivie d'une amplification des séquences cibles présentes dans ladite solution d'amplification d'enrichissement, par mise en contact d'une fraction de cette solution avec au moins une paire d'amorces dont l'une au moins est différente de celles de l'étape 1.
On désignera ci-après cette dernière amplification sous le nom de "deuxième série d'amplifications".
Ce mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention a notamment pour avantage d'augmenter la spécificité du dosage en abaissant la quantité d'acide nucléique résiduaire et des contaminants divers provenant du prélèvement biologique , car les séquences d'acide nucléique double brin formées de façon exponentielle au cours de l'étape d'amplification d'enrichissement prédominent très largement.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la dilution est comprise entre 1/200* et 1/100 000'.
Cette dilution permet d'initialiser la deuxième amplification de détection à partir d'un matériel biologique purifié et enrichi en séquences cibles
Cet enrichissement en séquences cibles de la solution d'amplification de l'étape 1, suivie de la dilution, permet de mettre les séquences contaminantes dans des conditions peu propices à leur amplification lors de la deuxième série d'amplifications et lors de la détection.
Le nombre de cycles de la deuxième série d'amplifications est notamment choisi en fonction de la dilution et de la nature de l'échantillon, de façon à conférer à cette deuxième série d'amplifications, un caractère exponentiel.
Ce mode de mise en oeuvre présente un certain nombre d'avantages sur les procédés de l'Art antérieur
- une spécificité accrue
- une diminution du bruit de fond
- une sensibilité accrue, dans la mesure où l'on dilue fortement l'échantillon après l'amplification d'enrichissement ; en effet, cette forte dilution permet
d'être toujours en phase exponentielle de l'amplification uniquement pour les séquences cibles, c'est- & dire lorsque la quantité Q de séquences cibles obtenues peut être reliée au facteur d'amplification x et au nombre des cycles n par la formule Q = Qo (1 + x)n
d'avoir un rapport séquences cibleslséquences non spécifiques nettement supérieur à 1 dès le début de l'amplification de détection
de diminuer les réactions de compétition liées aux produits d'extension des acides nucléiques contaminants et aux composants présents dans le milieu biologique (débris cellulaires, protéines, biotine natu relue...).
Il faut en outre souligner que la dilution effectuée après la première amplification permet de travailler avec une concentration en amorces assez faible pour éliminer l'incidence du phénomène de dimérisation et d'amplification des amorces qui conduirait à un signal parasite.
Le procédé conforme à l'invention a, en outre, l'avantage d'éliminer les réactions de compétition qui se produisent dans les procédés de l'Art antérieur nécessitant une fixation sur un support du produit d'extension double brin obtenu pour la détection de l'acide nucléique.
Le procédé conforme à l'invention est notamment applicable à la détection des maladies génétiques, des maladies infectieuses (virus, parasites, champignons, bactéries... )et des maladies tumorales tant humaines, animales que végétales, au contrôle des échantillons biologiques ainsi qu'au typage cellulaire.
La présente invention a, en outre, pour objet, un coffret, kit ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
- des doses appropriées d'au moins une première paire d'amorces appropriées, pour la réalisation de l'étape 1 dudit procédé ;
- des doses appropriées d'au moins un composé se liant de manière non covalente sur un acide nucléique double brin tel que, notamment, une matière colorante ou un agent intercalant, apte å produire des modifications spectrales lorsqu'il est fixé sur un acide nucléique ou lorsqu'il n'est pas fixé sur un acide nucléique.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Détection de l'ADH du virus de papillome humain de type 16 (HPV 16) à l'aide du procédé conforme à l'invention.
Les différentes solutions d'ADN à tester ont été soumises a une première amplification dans un milieu contenant en un volume total de 50 wl : 50 pmoles de chacune des deux amorces A1 et A2, 200 zM de chacun des quatre désoxyribonucléosides triphosphates (c'est-i-dire dATP, dCTP, dGTP et dTTP) ( Boehringer Nannheim), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl pH 8,3, 0,01 t (P/V) de gélatine et 2,5 unités de Taq DNA polymérase (Amersham).Trente cycles d'amplification sont effectués gracie à un appareil automatique (un cycle correspondant à 90 s de dénaturation à 94 C, 90 s d'hybridation å 50'C et 120 s de polymérisation à 72'C).
1 l de chaque échantillon préalablement amplifié est dilué dans 100 l d'eau. 1 jil de chaque solution (1/2 5009) est ensuite soumis à une deuxième série d'amplifications de 15 cycles en un volume total de 25 Lil dans le milieu d'amplification précédemment décrit et contenant 5 pmoles des deux amorces B1 et B2.
A 20 l de solution d'amplification, on ajoute 1 l de bromure d'éthidium à 5 g/ml (soit 5 ng) on agite, puis on observe les tubes sous U.V., à 254 nm.
Seules les solutions contenant de l'ADN viral de HPV16 émettent une fluorescence observable. Cela permet une discrimination rapide entre les échantillons positifs et négatifs.
Les résultats obtenus correspondent a ceux obtenus avec le gel de contrôle.
Exemple 2 : Détection d'ADN viral de HPV18 contenu dans un plasmide.
On prépare des dilutions successives d'ADN plasmidique de pBr322 contenant ou non 1'ADN viral de
HPV18. On obtient ainsi les concentrations de 20, 10, 1 et 0,1 ng d'ADN pour 1 pl.
Les huit solutions d'ADN ainsi obtenues sont soumises à amplification dans un volume de 25 ml contenant 3 pmoles de chacune des deux amorces Ai et A2, les quatre desoxyribonucléosides triphosphate (200 M), du MgCl2 1,5 SM, du Xci 50 ZM, du TRIS-HCl pH 8,3 10 mM, de la gélatine 0,01 % (p/v) et 0,25 unité de Taq DNA polymérase. Quinze cycles d'amplification sont effectués à l'aide d'un appareil automatique : dénaturation à 94 C pendant 1 minute 30, hybridation à 55 C pendant 1 minute 30 puis élongation à 72 C pendant 1 minute.
A la fin de ces quinze cycles, on ajoute dans chacun des tubes 1 gl de solution de bromure d'éthidium à 5 mg/ml (soit 5 ng), on agite rapidement puis on observe les tubes sur une table lumineuse W 254 nm.
Les tubes contenant les solutions d'amplification de plasmide avec 1'ADN viral (20, 10 et 1 ng) fluorescent nettement, celui contenant 0,1 ng de plasmide avec ADN viral fluoresce légèrement et ceux contenant le plasmide seul ne donnent aucun signal.
La détection au bromure d'éthidium du produit de l'amplification d'un ADN très purifié et très dilué est réalisée immédiatement après l'amplification et donne un résultat très significatif.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (14)

REVENDICATIONS
1.) Procédé de détection en solution de séquences spécifiques d'acide(s) nucléique(s) (séquence unique et/ou mélange de séquences d'acides nucléiques) présente(s) dans un échantillon biologique, mises en solution, par au moins une amplification enzymatique en présence d'au moins une paire d'amorces appropriées (étape 1), pour amplifier au moins un fragment de ladite/desdites séquences d'acide nucléique cible, lesdites amorces délimitant le fragment de la/des séquences cibles à détecter, s'hybridant à ladite/auxdites séquence(s) cible(s) et permettant d'obtenir un nombre important de séquences cibles amplifiées, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la détection directe en phase homogène liquide desdites séquences cibles amplifiées, par mise en contact des acides nucléiques double brin obtenus après forte dilution et amplification, avec un composé qui interagit avec un acide nucléique double brin, notamment une matière colorante ou un agent intercalant apte à produire des modifications spectrales, puis détection desdites modifications spectrales du composé qui interagit avec l'acide nucléique double brin, par tout moyen approprié (étape 2).
2-) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les substances présentant une modification physico-chimique après liaison avec l'ADN double brin.
3 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit composé est le bromure d'éthidium.
- suivie d'une amplification des séquences cibles présentes dans ladite solution d'amplification d'enrichissement, par mise en contact d'une fraction de cette solution avec au moins une paire d'amorces comportant au moins une amorce différente de celles de l'étape 1.
- au moins une dilution appropriée de la so lution d'amplification enzymatique obtenue au -cours de l'étape 1, permettant d'obtenir une solution d'amplification d'enrichissement en séquences cibles et,
4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend après l'amplification enzymatique (étape 1) et préalablement à la mise en contact avec ledit composé apte à produire des modifications spectrales (étape 2)
5 ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la dilution est comprise entre 1/200e et 1/100 000e.
6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que des dilutions successives d'un ADN à tester, et notamment d'un ADN viral à tester, sont soumises à une première série d'amplifications dans un volume convenable contenant au moins deux séquences cibles propres à servir de matrices, les quatres désoxyribonucléosides triphosphates, une quantité appropriée de Taq DNA polymérase, dans une solution tampon appropriée à pH 8,3 contenant une faible quantité (de l'ordre de 0,01 % p/v) de gélatine, les produits de la première série d'amplifications étant ensuite soumis à une deuxième étape de dilution, puis à une deuxième série d'amplifications dans un milieu d'amplifications qui est avantageusement similaire à celui mis en oeuvre dans la première série d'amplifications et qui contient au moins deux séquences cibles propres à servir de matrices, après quoi le composé propre à produire des modifications spectrales est ajouté à la solution d'amplifications obtenue à la suite de la deuxième série d'amplifications pour révéler l'ADN viral double brin éventuellement présent dans les solutions.
7 ) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé propre à produire des modifications spectrales est un agent intercalant fluorescent tel que, notamment, le bromure d'éthidium.
8') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection des maladies génétiques tant humaines, animales que végétales.
9') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection des maladies infectieuses tant humaines, animales que végétales.
10') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection des maladies tumorales tant humaines, animales que végétales.
11') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, au contrôle des échantillons biologiques.
12') Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, au typage cellulaire.
- des doses appropriées d'au moins un composé qui interagit avec un acide nucléique double brin, notamment une matière colorante ou un agent intercalant apte à produire des modifications spectrales.
- des doses appropriées d'au moins une première paire d'amorces appropriées, pour la réalisation de l'étape 1 dudit procédé ;
13') Coffret, kit ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
14') Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce que le composé apte à produire des modifications spectrales est un agent intercalant fluorescent tel que, notamment, le bromure d'éthidium.
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