JPH1028585A - 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法 - Google Patents
耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法Info
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- JPH1028585A JPH1028585A JP8185918A JP18591896A JPH1028585A JP H1028585 A JPH1028585 A JP H1028585A JP 8185918 A JP8185918 A JP 8185918A JP 18591896 A JP18591896 A JP 18591896A JP H1028585 A JPH1028585 A JP H1028585A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来法に比べて、増幅サイクルがよく回転し、
検出感度を向上させる。 【解決手段】ＲＮＡ（＋）からなる標的核酸から１本鎖
ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ（−）のコピー
数を増大させる方法であって、耐熱性リボヌクレアーゼ
Ｈを非耐熱性のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメアー
ゼとともに使用することを特徴とする。また、該方法に
利用したＤＮＡの増幅法ならびにこれらの方法により増
幅した核酸を検出する方法およびこれらの方法に使用す
る試薬キットに関する。
検出感度を向上させる。 【解決手段】ＲＮＡ（＋）からなる標的核酸から１本鎖
ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ（−）のコピー
数を増大させる方法であって、耐熱性リボヌクレアーゼ
Ｈを非耐熱性のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメアー
ゼとともに使用することを特徴とする。また、該方法に
利用したＤＮＡの増幅法ならびにこれらの方法により増
幅した核酸を検出する方法およびこれらの方法に使用す
る試薬キットに関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は複製ベースの核酸配
列の増幅法、特に該増幅法に使用されるリボヌクレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈとして、耐熱リボヌクレアーゼＨを
使用する核酸配列の増幅法およびその増幅法により得ら
れた特定核酸配列のＲＮＡコピーから目的とする標的核
酸配列を検出する方法およびそれらの方法に用いる試薬
キットに関する。
列の増幅法、特に該増幅法に使用されるリボヌクレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈとして、耐熱リボヌクレアーゼＨを
使用する核酸配列の増幅法およびその増幅法により得ら
れた特定核酸配列のＲＮＡコピーから目的とする標的核
酸配列を検出する方法およびそれらの方法に用いる試薬
キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】細菌やウイルス等の遺伝子を検出するこ
とによる疾病の診断方法が、最近、開発されている。あ
る種の検体では、直接、検出するのに十分な量の核酸が
存在するが、他方、目的遺伝子が非常に少量であった
り、その存在比が非常に小さい場合、直接、目的遺伝子
を検出することは非常に困難である。従来は、細胞培養
法や細菌培養法によりその目的遺伝子を増加させること
が行われてきたが、これらの方法では長時間を要すると
いう欠点があった。また、他の核酸増幅法としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が知られている。この方法
では、標的核酸の増幅の程度はサイクル数によって調製
される。増幅率は２n （ｎはサイクル数）で求められ
る。実際に検出可能な量まで標的核酸を増幅するには２
５〜３０サイクルが必要であった。
とによる疾病の診断方法が、最近、開発されている。あ
る種の検体では、直接、検出するのに十分な量の核酸が
存在するが、他方、目的遺伝子が非常に少量であった
り、その存在比が非常に小さい場合、直接、目的遺伝子
を検出することは非常に困難である。従来は、細胞培養
法や細菌培養法によりその目的遺伝子を増加させること
が行われてきたが、これらの方法では長時間を要すると
いう欠点があった。また、他の核酸増幅法としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が知られている。この方法
では、標的核酸の増幅の程度はサイクル数によって調製
される。増幅率は２n （ｎはサイクル数）で求められ
る。実際に検出可能な量まで標的核酸を増幅するには２
５〜３０サイクルが必要であった。
【０００３】また、別の核酸増幅法として、複製ＲＮＡ
ベースの増幅法が知られている（特開平2-5864号、特開
平2-500565号、特開平2-501532号）。これらの方法は、
標的核酸から２本鎖ＤＮＡを合成する際に用いるプライ
マーに、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を含有させることにより、２本鎖ＤＮＡ合成に引き
続き、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼによって、標的核酸に相当するＲＮ
Ａが合成される。さらに、合成されたＲＮＡからＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ／ＲＮＡ鎖が
合成され、次いでＲＮＡ鎖を分離し、１本鎖のＤＮＡを
得る。ＤＮＡの分離の方法としては加熱変性による方法
（特開平2-500565号、特開平2-501532号）またはリボヌ
レアーゼＨを用いる方法（特開平2-5864号）が知られて
いる。
ベースの増幅法が知られている（特開平2-5864号、特開
平2-500565号、特開平2-501532号）。これらの方法は、
標的核酸から２本鎖ＤＮＡを合成する際に用いるプライ
マーに、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を含有させることにより、２本鎖ＤＮＡ合成に引き
続き、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼによって、標的核酸に相当するＲＮ
Ａが合成される。さらに、合成されたＲＮＡからＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ／ＲＮＡ鎖が
合成され、次いでＲＮＡ鎖を分離し、１本鎖のＤＮＡを
得る。ＤＮＡの分離の方法としては加熱変性による方法
（特開平2-500565号、特開平2-501532号）またはリボヌ
レアーゼＨを用いる方法（特開平2-5864号）が知られて
いる。
【０００４】このようにして得た１本鎖ＤＮＡと別なプ
ライマーによって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成を行い、ＲＮＡ
転写反応を行う。この方法によれば、ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより、１分子の２本鎖核酸から数十から
数千分子のＲＮＡを転写でき、ＰＣＲ法に比べ１サイク
ルあたりの増幅効率が高い。またリボヌクレアーゼＨを
用いた場合、ＰＣＲ法の際、必要であった温度サイクル
が不要であり、より簡便に増幅が可能である。
ライマーによって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成を行い、ＲＮＡ
転写反応を行う。この方法によれば、ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより、１分子の２本鎖核酸から数十から
数千分子のＲＮＡを転写でき、ＰＣＲ法に比べ１サイク
ルあたりの増幅効率が高い。またリボヌクレアーゼＨを
用いた場合、ＰＣＲ法の際、必要であった温度サイクル
が不要であり、より簡便に増幅が可能である。
【０００５】しかし、複製ＲＮＡベースの増幅法では増
幅効率が高いが、各反応で使用する従来の酵素、すなわ
ちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼは一般
に、非耐熱性の酵素である。これらの酵素は熱安定性が
低いため、増幅反応時の温度を高くすることができず、
鋳型となる核酸とプライマー間での非特異ハイブリダイ
ゼーションを避けることが出来ず、特異性の低下に伴
い、検出感度の低下を生じる場合がある。この問題を解
決すべく、これらの発明に使用される酵素として、サー
マス・サーモフィルス由来の耐熱性酵素を用いる方法が
開発された（特開平 7-203999 号) 。この方法では耐熱
酵素を用いて、一定高温度で増幅反応を実施することに
より、非特異的ハイブリダイゼーションを回避すること
を可能としている。
幅効率が高いが、各反応で使用する従来の酵素、すなわ
ちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼは一般
に、非耐熱性の酵素である。これらの酵素は熱安定性が
低いため、増幅反応時の温度を高くすることができず、
鋳型となる核酸とプライマー間での非特異ハイブリダイ
ゼーションを避けることが出来ず、特異性の低下に伴
い、検出感度の低下を生じる場合がある。この問題を解
決すべく、これらの発明に使用される酵素として、サー
マス・サーモフィルス由来の耐熱性酵素を用いる方法が
開発された（特開平 7-203999 号) 。この方法では耐熱
酵素を用いて、一定高温度で増幅反応を実施することに
より、非特異的ハイブリダイゼーションを回避すること
を可能としている。
【０００６】
【発明が解決しようする課題】本発明の目的は、複製ベ
ースの増幅法において、全酵素を耐熱性酵素に置換する
ことなく、また、反応温度を上げることなく、増幅反応
を行い、検出感度を向上させることにある。
ースの増幅法において、全酵素を耐熱性酵素に置換する
ことなく、また、反応温度を上げることなく、増幅反応
を行い、検出感度を向上させることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はＲＮ
Ａ（＋）から１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖Ｒ
ＮＡ（−）のコピー数を増加させる方法であって、非耐
熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼおよび耐熱性ＲＮａｓｅＨを使用することを特
徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法
である。
Ａ（＋）から１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖Ｒ
ＮＡ（−）のコピー数を増加させる方法であって、非耐
熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼおよび耐熱性ＲＮａｓｅＨを使用することを特
徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法
である。
【０００８】また、本発明はＲＮＡ（＋）からなる標的
核酸から１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ
（−）のコピー数を増加させる方法であって、下記工程
を含むことを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨを用
いる核酸増幅法である。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行う； （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）に相
補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、ＲＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッド伸長生成物を得る； （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列を有する第２プライマーをハイブリダイズ
させ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤ
ＮＡ伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロ
モーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る；（ここで、第１プライマーの核酸配列は標的核酸、
ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的であり、第２プ
ライマーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対
して十分に相同であり、第１プライマーの３’末端は相
補的な鎖上の第２プライマーの３’末端に向けられてい
る） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、該１本鎖ＲＮＡ（−）に相補的な配列を有する第
２プライマー（ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同で
ある配列を有する上記第２プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列および５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマー（前記ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的で
ある配列を有する上記第１プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）から（９）を繰り返す。
核酸から１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ
（−）のコピー数を増加させる方法であって、下記工程
を含むことを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨを用
いる核酸増幅法である。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行う； （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）に相
補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、ＲＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッド伸長生成物を得る； （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列を有する第２プライマーをハイブリダイズ
させ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤ
ＮＡ伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロ
モーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る；（ここで、第１プライマーの核酸配列は標的核酸、
ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的であり、第２プ
ライマーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対
して十分に相同であり、第１プライマーの３’末端は相
補的な鎖上の第２プライマーの３’末端に向けられてい
る） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、該１本鎖ＲＮＡ（−）に相補的な配列を有する第
２プライマー（ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同で
ある配列を有する上記第２プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列および５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマー（前記ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的で
ある配列を有する上記第１プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）から（９）を繰り返す。
【０００９】また、本発明はＲＮＡ（＋）からなる標的
核酸から１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）を生成し、該
１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコピー数を増加させ
る方法であって、下記工程を含むことを特徴とする耐熱
性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法である。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行う； （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）に相
補的な配列およびその５’末端側にＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列を有する第１プライマー
をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長反応させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッド伸長生成物を得る； （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第２
プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、
５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（ここで、第１プライ
マーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して
十分に相補的であり、第２プライマーの核酸配列は標的
核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同であり、第
１プライマーの３’末端は相補的な鎖上の第２プライマ
ーの３’末端に向けられている） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）および
（−）を鋳型として、上記第１プライマーおよび第２プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記第１プライマ
ーおよび第２プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応
を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）およ
び（−）を鋳型とし
核酸から１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）を生成し、該
１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコピー数を増加させ
る方法であって、下記工程を含むことを特徴とする耐熱
性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法である。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行う； （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）に相
補的な配列およびその５’末端側にＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列を有する第１プライマー
をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長反応させて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッド伸長生成物を得る； （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第２
プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、
５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（ここで、第１プライ
マーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して
十分に相補的であり、第２プライマーの核酸配列は標的
核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同であり、第
１プライマーの３’末端は相補的な鎖上の第２プライマ
ーの３’末端に向けられている） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）および
（−）を鋳型として、上記第１プライマーおよび第２プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記第１プライマ
ーおよび第２プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応
を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）およ
び（−）を鋳型とし
【００１０】さらに、本発明はＤＮＡからなる標的核酸
配列（＋）から１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖
ＲＮＡ（−）のコピー数を増加させる方法であって、下
記工程を含むことを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼ
Ｈを用いる核酸増幅法である。 （１）検体から、必要により標的核酸配列、ＤＮＡの抽
出操作を行う； （２）得られたＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有し、標
的核酸配列、ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマー
（第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、２
本鎖ＤＮＡを得る； （３）変性処理により、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡ
を分離し； （４）該１本鎖ＤＮＡに、標的核酸配列、ＤＮＡに相同
な配列を有するプライマー（第２プライマー）をハイブ
リダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長反応させて、上流に機能可能なプロモーター
配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （５）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、該２本鎖ＤＮＡ中間体から複数の１本鎖ＲＮＡ
（−）を合成する； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、該１本鎖ＲＮＡ（−）に相補的な配列を有する第
２プライマー（ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同で
ある上記第２プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐
熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反
応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を
得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列および５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマー（前記ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的で
ある上記第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐
熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反
応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配
列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）から（９）を繰り返す。
配列（＋）から１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖
ＲＮＡ（−）のコピー数を増加させる方法であって、下
記工程を含むことを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼ
Ｈを用いる核酸増幅法である。 （１）検体から、必要により標的核酸配列、ＤＮＡの抽
出操作を行う； （２）得られたＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有し、標
的核酸配列、ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマー
（第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、２
本鎖ＤＮＡを得る； （３）変性処理により、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡ
を分離し； （４）該１本鎖ＤＮＡに、標的核酸配列、ＤＮＡに相同
な配列を有するプライマー（第２プライマー）をハイブ
リダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長反応させて、上流に機能可能なプロモーター
配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （５）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、該２本鎖ＤＮＡ中間体から複数の１本鎖ＲＮＡ
（−）を合成する； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、該１本鎖ＲＮＡ（−）に相補的な配列を有する第
２プライマー（ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同で
ある上記第２プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐
熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反
応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を
得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列および５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマー（前記ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的で
ある上記第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐
熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反
応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配
列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）から（９）を繰り返す。
【００１１】本発明はＤＮＡからなる標的核酸配列
（＋）から１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）を生成し、
該１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコピー数を増加さ
せる方法であって、下記工程を含むことを特徴とする耐
熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 （１）検体から、必要により標的核酸配列、ＤＮＡの抽
出操作を行う； （２）得られたＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および標的
核酸配列、ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマー
（第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、２
本鎖ＤＮＡを得る； （３）変性処理により、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡ
を分離し； （４）該１本鎖ＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および標的
核酸配列、ＤＮＡに相同な配列を有するプライマー（第
２プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、上流に
機能可能なプロモーター配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中
間体を生成させる； （５）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、該２本鎖ＤＮＡ中間体から複数の１本鎖ＲＮＡ
（＋）および（−）を合成する； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）および
（−）を鋳型として、上記第１プライマーおよび第２プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記第１プライマ
ーおよび第２プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応
を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）およ
び（−）を鋳型として、前記（６）から（９）を繰り返
す。
（＋）から１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）を生成し、
該１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコピー数を増加さ
せる方法であって、下記工程を含むことを特徴とする耐
熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 （１）検体から、必要により標的核酸配列、ＤＮＡの抽
出操作を行う； （２）得られたＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および標的
核酸配列、ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマー
（第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、２
本鎖ＤＮＡを得る； （３）変性処理により、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡ
を分離し； （４）該１本鎖ＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および標的
核酸配列、ＤＮＡに相同な配列を有するプライマー（第
２プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、上流に
機能可能なプロモーター配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中
間体を生成させる； （５）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、該２本鎖ＤＮＡ中間体から複数の１本鎖ＲＮＡ
（＋）および（−）を合成する； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）および
（−）を鋳型として、上記第１プライマーおよび第２プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記第１プライマ
ーおよび第２プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応
を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）およ
び（−）を鋳型として、前記（６）から（９）を繰り返
す。
【００１２】また、本発明は試料中の標的核酸を上記核
酸増幅法により増幅させ、増幅された核酸を検出プロー
ブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を検
出することを特徴とする試料中の標的核酸の検出法であ
る。
酸増幅法により増幅させ、増幅された核酸を検出プロー
ブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした核酸を検
出することを特徴とする試料中の標的核酸の検出法であ
る。
【００１３】本発明は下記試薬を含むことを特徴とする
特定の核酸配列を増幅するための試薬キットである。 （ａ）ＲＮＡ（＋）に相補的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第１プライマー、（ｂ）ＲＮＡ（＋）
に相同的な配列を有する第２プライマー、（ｃ）耐熱性
リボヌクレアーゼＨ、（ｄ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼ、（ｅ）非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ、（ｆ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ、（ｇ）リボヌクレオシドトリフォスフェート、
（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェートお
よび（ｉ）緩衝液
特定の核酸配列を増幅するための試薬キットである。 （ａ）ＲＮＡ（＋）に相補的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第１プライマー、（ｂ）ＲＮＡ（＋）
に相同的な配列を有する第２プライマー、（ｃ）耐熱性
リボヌクレアーゼＨ、（ｄ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼ、（ｅ）非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ、（ｆ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ、（ｇ）リボヌクレオシドトリフォスフェート、
（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェートお
よび（ｉ）緩衝液
【００１４】また、本発明は下記試薬を含むことを特徴
とする特定の核酸配列を増幅するための試薬キットであ
る。 （ａ）ＲＮＡ（＋）に相補的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第１プライマー、（ｂ）ＲＮＡ（＋）
に相同的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
２プライマー、（ｃ）耐熱性リボヌクレアーゼＨ、
（ｄ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、（ｅ）
非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｆ）非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）リボヌクレオ
シドトリフォスフェート、（ｈ）デオキシリボヌクレオ
シドトリフォスフェートおよび（ｉ）緩衝液
とする特定の核酸配列を増幅するための試薬キットであ
る。 （ａ）ＲＮＡ（＋）に相補的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第１プライマー、（ｂ）ＲＮＡ（＋）
に相同的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
２プライマー、（ｃ）耐熱性リボヌクレアーゼＨ、
（ｄ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、（ｅ）
非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｆ）非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）リボヌクレオ
シドトリフォスフェート、（ｈ）デオキシリボヌクレオ
シドトリフォスフェートおよび（ｉ）緩衝液
【００１５】
【発明の実施態様】本発明の標的核酸はＤＮＡであって
もＲＮＡであってもよい。２本鎖の場合や１本鎖の場合
であっても、高次構造をとっているような場合は、予め
加熱、酸、アルカリ等の変性処理により１本鎖として増
幅反応に供する。標的核酸がタンパク質、脂質や糖質等
の混合物中または生体試料中に存在する場合、常法に従
い標的核酸を抽出した後、本発明の核酸増幅法あるいは
検出法に利用できる。具体的な抽出方法としては、プロ
テイナーゼや界面活性剤等を含む溶液を加え約３０分間
インキュベート後、得られる溶液をフェノールやクロロ
ホルム等で抽出し、エタノール沈殿して核酸を得ればよ
い。また、別の方法としてカオトロピックス剤およびシ
リカ粒子担体を用いても良い。本発明においてＲＮＡ
（＋）とＲＮＡ（−）とは互いに相補的な配列を有する
ＲＮＡである。ＤＮＡ（＋）に対してもＲＮＡ（−）は
相補的な配列を意味する。
もＲＮＡであってもよい。２本鎖の場合や１本鎖の場合
であっても、高次構造をとっているような場合は、予め
加熱、酸、アルカリ等の変性処理により１本鎖として増
幅反応に供する。標的核酸がタンパク質、脂質や糖質等
の混合物中または生体試料中に存在する場合、常法に従
い標的核酸を抽出した後、本発明の核酸増幅法あるいは
検出法に利用できる。具体的な抽出方法としては、プロ
テイナーゼや界面活性剤等を含む溶液を加え約３０分間
インキュベート後、得られる溶液をフェノールやクロロ
ホルム等で抽出し、エタノール沈殿して核酸を得ればよ
い。また、別の方法としてカオトロピックス剤およびシ
リカ粒子担体を用いても良い。本発明においてＲＮＡ
（＋）とＲＮＡ（−）とは互いに相補的な配列を有する
ＲＮＡである。ＤＮＡ（＋）に対してもＲＮＡ（−）は
相補的な配列を意味する。
【００１６】本発明において、「伸長反応」とは核酸配
列に十分に相補的な配列を持つプライマーを鋳型である
核酸配列にハイブリダイズした後、ＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼとデオキシアデノシン５’−三リン酸(dAT
P)、デオキシシチジン５’−三リン酸(dCTP)、デオキシ
グアノシン５’−三リン酸(dGTP)、デオキシチミジン
５’−三リン酸(dTTP)の存在下、プライマーのデオキシ
ヌクレオチドを共有結合し、核酸配列に相補的なＤＮＡ
配列を順次、合成する反応である。
列に十分に相補的な配列を持つプライマーを鋳型である
核酸配列にハイブリダイズした後、ＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼとデオキシアデノシン５’−三リン酸(dAT
P)、デオキシシチジン５’−三リン酸(dCTP)、デオキシ
グアノシン５’−三リン酸(dGTP)、デオキシチミジン
５’−三リン酸(dTTP)の存在下、プライマーのデオキシ
ヌクレオチドを共有結合し、核酸配列に相補的なＤＮＡ
配列を順次、合成する反応である。
【００１７】本発明において、「プロモーター配列」と
は非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結
合して作用する配列であり、例えばＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列などがある。非耐熱性ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼは、該プロモーター配列に特異的
に結合して、該プロモーター配列よりも下流のＤＮＡ配
列と相同なＲＮＡを合成する。
は非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結
合して作用する配列であり、例えばＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモーター配列などがある。非耐熱性ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼは、該プロモーター配列に特異的
に結合して、該プロモーター配列よりも下流のＤＮＡ配
列と相同なＲＮＡを合成する。
【００１８】本発明において、「耐熱性リボヌクレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈ」とは大腸菌由来のＲＮａｓｅＨよ
りも熱安定性が優れている酵素をいう。耐熱性細菌より
分離精製されたＲＮａｓｅＨや耐熱性を有するよう改変
された大腸菌由来のＲＮａｓｅＨなどが含まれる。これ
らの酵素は、通常、５０〜９０℃で１０分間処理しても
５０％以上の残存活性を有する酵素がある。本発明では
耐熱性細菌より分離精製されたＲＮａｓｅＨが好まし
く、さらに好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ther
mus thermophilus) 由来のＴｔｈＲＮａｓｅＨが有用で
ある。
ゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈ」とは大腸菌由来のＲＮａｓｅＨよ
りも熱安定性が優れている酵素をいう。耐熱性細菌より
分離精製されたＲＮａｓｅＨや耐熱性を有するよう改変
された大腸菌由来のＲＮａｓｅＨなどが含まれる。これ
らの酵素は、通常、５０〜９０℃で１０分間処理しても
５０％以上の残存活性を有する酵素がある。本発明では
耐熱性細菌より分離精製されたＲＮａｓｅＨが好まし
く、さらに好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ther
mus thermophilus) 由来のＴｔｈＲＮａｓｅＨが有用で
ある。
【００１９】耐熱性ＲＮａｓｅＨの最適な濃度は２０μ
ｌの反応系に、０．００１Ｕから０．１Ｕ添加すればよ
い。０．１Ｕより多いと、１本鎖ＲＮＡにプライマーが
結合した瞬間に、１本鎖ＲＮＡが分解され、増幅反応が
生じない。また、０．００１Ｕより少ない場合には、１
本鎖ＲＮＡと第１プライマー伸長物との分離が生じにく
くなり、検出感度の低下を導く。このように、高感度を
目的とするならば、上記の濃度範囲の耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを用いれば良い。
ｌの反応系に、０．００１Ｕから０．１Ｕ添加すればよ
い。０．１Ｕより多いと、１本鎖ＲＮＡにプライマーが
結合した瞬間に、１本鎖ＲＮＡが分解され、増幅反応が
生じない。また、０．００１Ｕより少ない場合には、１
本鎖ＲＮＡと第１プライマー伸長物との分離が生じにく
くなり、検出感度の低下を導く。このように、高感度を
目的とするならば、上記の濃度範囲の耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを用いれば良い。
【００２０】本発明において、「非耐熱性酵素」とは、
常温付近に至適温度を有する酵素を意味し、非耐熱性Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとは、オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドプライマーおよびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを
合成する酵素であって、この酵素はさらにＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を含んでいてもよい。例えばトリ
筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵
素）、モロニー(Maloney)マウス白血病ウイルス（ＭＭ
ＬＶ逆転写酵素）などが挙げられる。また、別の真核細
胞由来のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよ
い。
常温付近に至適温度を有する酵素を意味し、非耐熱性Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとは、オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドプライマーおよびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを
合成する酵素であって、この酵素はさらにＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を含んでいてもよい。例えばトリ
筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵
素）、モロニー(Maloney)マウス白血病ウイルス（ＭＭ
ＬＶ逆転写酵素）などが挙げられる。また、別の真核細
胞由来のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよ
い。
【００２１】非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼと
は、プロモーター配列に結合でき、かつプロモーターに
極めて接近した所定の開始部位でＲＮＡのin vitro合成
を特異的に開始する酵素であって、例えば、バクテリオ
ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラ
ーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、ファージφＩＩ、Sa
lmonellaファージsp6 または Pseudomonasファージgh-1
などが例示されるが、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ
３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが好
ましい。
は、プロモーター配列に結合でき、かつプロモーターに
極めて接近した所定の開始部位でＲＮＡのin vitro合成
を特異的に開始する酵素であって、例えば、バクテリオ
ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラ
ーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、ファージφＩＩ、Sa
lmonellaファージsp6 または Pseudomonasファージgh-1
などが例示されるが、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ
３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが好
ましい。
【００２２】非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと
は、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとＤＮ
Ａ鋳型からＤＮＡを合成する酵素であって、真核細胞由
来のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼαまたは
βなど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離される
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー
断片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼな
ど、多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。５’−ま
たは３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素、例えば
ＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。５’−または３’−エキ
ソヌクレアーゼ活性が本来欠如した別のＤＮＡ依存ＤＮ
Ａポリメラーゼも使用できる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の
双方を同じ酵素によって与えられるものが特に好まし
い。
は、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとＤＮ
Ａ鋳型からＤＮＡを合成する酵素であって、真核細胞由
来のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼαまたは
βなど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離される
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー
断片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼな
ど、多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。５’−ま
たは３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素、例えば
ＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。５’−または３’−エキ
ソヌクレアーゼ活性が本来欠如した別のＤＮＡ依存ＤＮ
Ａポリメラーゼも使用できる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の
双方を同じ酵素によって与えられるものが特に好まし
い。
【００２３】本発明において使用する第１プライマー
は、標的核酸配列、ＲＮＡまたはＤＮＡに対して十分に
相補的な核酸配列およびその５’末端側に上記プロモー
ター配列を有する。該プライマーの３’末端は相補的鎖
上の別なプライマーの３’末端に向けられている。
は、標的核酸配列、ＲＮＡまたはＤＮＡに対して十分に
相補的な核酸配列およびその５’末端側に上記プロモー
ター配列を有する。該プライマーの３’末端は相補的鎖
上の別なプライマーの３’末端に向けられている。
【００２４】本発明に用いるプロモーター配列は特に制
限はないが、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼならば、 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' が知られている。
限はないが、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼならば、 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' が知られている。
【００２５】プロモーター配列としては、その他に、下
記のものがある。例えば、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼなら
ば、 5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' 例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼならば、 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TA-3'
記のものがある。例えば、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼなら
ば、 5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' 例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼならば、 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TA-3'
【００２６】本発明に用いる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼと併用するプロモーター配列は上記の３種
のいずれかが好ましいが、これらに限定はされない。特
に好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとそのプロモー
ター配列を使用するのが好ましい。
ポリメラーゼと併用するプロモーター配列は上記の３種
のいずれかが好ましいが、これらに限定はされない。特
に好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとそのプロモー
ター配列を使用するのが好ましい。
【００２７】一般的にプロモーター配列には、その後に
続く複製開始点までのスペーサーを含んでいても良い。
必要により任意の配列をプロモーター配列の３’末端に
結合すれば良い。増幅領域によっては、スペーサー配列
を挿入することで、増幅効率の向上が可能である。
続く複製開始点までのスペーサーを含んでいても良い。
必要により任意の配列をプロモーター配列の３’末端に
結合すれば良い。増幅領域によっては、スペーサー配列
を挿入することで、増幅効率の向上が可能である。
【００２８】本発明において使用する第２プライマー
は、第１プライマー伸長物の核酸配列に対して相補的な
核酸配列を有し、標的核酸配列、ＲＮＡまたはＤＮＡに
対して十分に相同的な核酸配列を有する。必要によりさ
らに、その５’末端側にプロモーター配列を有する。該
プライマーの３’末端は相補的鎖上の別なプライマーの
３’末端に向けられている。
は、第１プライマー伸長物の核酸配列に対して相補的な
核酸配列を有し、標的核酸配列、ＲＮＡまたはＤＮＡに
対して十分に相同的な核酸配列を有する。必要によりさ
らに、その５’末端側にプロモーター配列を有する。該
プライマーの３’末端は相補的鎖上の別なプライマーの
３’末端に向けられている。
【００２９】第２プライマーがプロモーター配列を有し
ている場合、第１プライマーのプロモーター配列と異な
っていても同一であっても良い。異なる場合には、それ
ぞれのプロモーターに作用する非耐熱性ＤＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼを必要により複数用いる。例えば、第
２プライマーのプロモーター配列にＴ７プロモーターを
用いる場合にはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ３プロモ
ーターを用いる場合にはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを、Ｓ
Ｐ６プロモーターを用いる場合にはＳＰ６ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いる。用いる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼと付随するプロモーター配列は上記の３種が好
ましいが、これらに限定されない。特に好ましくは、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼとそのプロモーター配列を使用す
るのが好ましい。
ている場合、第１プライマーのプロモーター配列と異な
っていても同一であっても良い。異なる場合には、それ
ぞれのプロモーターに作用する非耐熱性ＤＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼを必要により複数用いる。例えば、第
２プライマーのプロモーター配列にＴ７プロモーターを
用いる場合にはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ３プロモ
ーターを用いる場合にはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを、Ｓ
Ｐ６プロモーターを用いる場合にはＳＰ６ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いる。用いる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼと付随するプロモーター配列は上記の３種が好
ましいが、これらに限定されない。特に好ましくは、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼとそのプロモーター配列を使用す
るのが好ましい。
【００３０】第２プライマーがプロモーター配列を有し
ている場合、第１プライマーも第２プライマーもＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を結合させ、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いてコピー数を増幅させること
が好ましい。
ている場合、第１プライマーも第２プライマーもＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を結合させ、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いてコピー数を増幅させること
が好ましい。
【００３１】第１プライマーまたは第２プライマーの標
的核酸配列とハイブリダイズする領域の長さは特に制限
はなく、好ましくは１０〜１００ｂｐ、さらに好ましく
は１０〜５０ｂｐ、特に好ましくは１８〜３０ｂｐであ
るが、これらに限定されるものではない。
的核酸配列とハイブリダイズする領域の長さは特に制限
はなく、好ましくは１０〜１００ｂｐ、さらに好ましく
は１０〜５０ｂｐ、特に好ましくは１８〜３０ｂｐであ
るが、これらに限定されるものではない。
【００３２】第１プライマーおよび第２プライマーとな
るオリゴヌクレオチドは、例えばパーキン・エルマー社
のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホアミダ
イト法により合成できる。各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で実施する。生成はＦＰＬＣで逆相
カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸
トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイ
ト法等がある。また生物学的起源、例えば、制限エンド
ヌクレアーゼ消化物から単離してもしても構わない。
るオリゴヌクレオチドは、例えばパーキン・エルマー社
のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いてホスホアミダ
イト法により合成できる。各種オリゴヌクレオチドの脱
保護はアンモニア水で実施する。生成はＦＰＬＣで逆相
カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸
トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイ
ト法等がある。また生物学的起源、例えば、制限エンド
ヌクレアーゼ消化物から単離してもしても構わない。
【００３３】本発明の反応条件は、上記酵素反応が速や
かに反応する条件であればよい。具体的にはそれぞれの
反応に適した緩衝液中で、３７〜４５℃付近の温度で反
応を行う。本発明では耐熱性ＲＮａｓｅＨを３７〜４５
℃付近の温度で反応させることにより、従来の非耐熱性
ＲＮａｓｅＨを使用した場合に比べて、反応性が高いこ
とが特徴的である。本発明の増幅サイクルは、これらの
酵素が失活するまで続けられるが、ＲＮａｓｅＨのみを
耐熱性酵素に置換するだけで、増幅サイクルがよく回転
し、検出感度が向上する。
かに反応する条件であればよい。具体的にはそれぞれの
反応に適した緩衝液中で、３７〜４５℃付近の温度で反
応を行う。本発明では耐熱性ＲＮａｓｅＨを３７〜４５
℃付近の温度で反応させることにより、従来の非耐熱性
ＲＮａｓｅＨを使用した場合に比べて、反応性が高いこ
とが特徴的である。本発明の増幅サイクルは、これらの
酵素が失活するまで続けられるが、ＲＮａｓｅＨのみを
耐熱性酵素に置換するだけで、増幅サイクルがよく回転
し、検出感度が向上する。
【００３４】以下に、本発明を図面を用いて説明する。
本発明は図１に示す増幅サイクルが基本となる。 第１工程：まず、１本鎖ＲＮＡ（−，ａ）を鋳型とし
て、該ＲＮＡの３’領域に，該１本鎖ＲＮＡ（−）に相
補的な配列を有する第２プライマー（ＲＮＡ（＋）に対
して相同である）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行っ
て、第２プライマー伸長生成物（＋，ｂ）を合成し、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る。ここで使
用される非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼはＡＭ
Ｖ逆転写酵素が好ましい。 第２工程：次いでＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物から、１本鎖ＤＮＡ（＋，ｂ）を分離するために、耐
熱性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを用いて、第２
プライマー伸長物（＋，ｂ）と結合している１重鎖ＲＮ
Ａ（−，ａ）のみを特異的に分解する。耐熱性ＲＮａｓ
ｅＨはＤＮＡと結合しているＲＮＡのみを分解するとい
う性質を有しているので、単独の１本鎖ＲＮＡ（−，
ａ）は分解される。
本発明は図１に示す増幅サイクルが基本となる。 第１工程：まず、１本鎖ＲＮＡ（−，ａ）を鋳型とし
て、該ＲＮＡの３’領域に，該１本鎖ＲＮＡ（−）に相
補的な配列を有する第２プライマー（ＲＮＡ（＋）に対
して相同である）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行っ
て、第２プライマー伸長生成物（＋，ｂ）を合成し、Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る。ここで使
用される非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼはＡＭ
Ｖ逆転写酵素が好ましい。 第２工程：次いでＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成
物から、１本鎖ＤＮＡ（＋，ｂ）を分離するために、耐
熱性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを用いて、第２
プライマー伸長物（＋，ｂ）と結合している１重鎖ＲＮ
Ａ（−，ａ）のみを特異的に分解する。耐熱性ＲＮａｓ
ｅＨはＤＮＡと結合しているＲＮＡのみを分解するとい
う性質を有しているので、単独の１本鎖ＲＮＡ（−，
ａ）は分解される。
【００３５】第３工程：次いで、分離された第２プライ
マー伸長物（＋，ｂ）を鋳型として、該ＤＮＡの３’領
域に対して、該１本鎖ＤＮＡ（＋）に相補的な配列（Ｒ
ＮＡ（−）に相同な配列、ＲＮＡ（−）に対して相補的
な配列）およびその５’末端に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターを有する第１プライマー
をハイブリダイズさせる。次いで非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより第１プライマー伸長物（−，
ｃ）を合成して、５’末端上流に機能可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる。 第４工程：次いで、上流に機能可能なプロモーター配列
に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター
配列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−，ａ）のコピーを
増加させる。ここでは、ＡＭＶ逆転写酵素が所有するＤ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を利用することで十分
であり、別途、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを添加す
る必要性はない。非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼは１つの鋳型から５０〜１０００コピーの１本鎖ＲＮ
Ａ（−，ａ）を合成できる。従って、このサイクルを少
なくとも５回繰り返せば、１コピーの１本鎖ＲＮＡ
（−，ａ）から少なくとも数億コピーの増幅産物ＲＮＡ
（−，ａ）が得られる。
マー伸長物（＋，ｂ）を鋳型として、該ＤＮＡの３’領
域に対して、該１本鎖ＤＮＡ（＋）に相補的な配列（Ｒ
ＮＡ（−）に相同な配列、ＲＮＡ（−）に対して相補的
な配列）およびその５’末端に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターを有する第１プライマー
をハイブリダイズさせる。次いで非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより第１プライマー伸長物（−，
ｃ）を合成して、５’末端上流に機能可能なプロモータ
ー配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる。 第４工程：次いで、上流に機能可能なプロモーター配列
に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター
配列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−，ａ）のコピーを
増加させる。ここでは、ＡＭＶ逆転写酵素が所有するＤ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を利用することで十分
であり、別途、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを添加す
る必要性はない。非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼは１つの鋳型から５０〜１０００コピーの１本鎖ＲＮ
Ａ（−，ａ）を合成できる。従って、このサイクルを少
なくとも５回繰り返せば、１コピーの１本鎖ＲＮＡ
（−，ａ）から少なくとも数億コピーの増幅産物ＲＮＡ
（−，ａ）が得られる。
【００３６】図１の増幅サイクルを基本として生体試料
からの核酸増幅を行うには、試料中の核酸から１本鎖Ｒ
ＮＡを得る必要がある。生体試料から得た１本鎖ＲＮＡ
の増幅の程度を知ることで、試料中の標的核酸配列の有
無や濃度がわかる。
からの核酸増幅を行うには、試料中の核酸から１本鎖Ｒ
ＮＡを得る必要がある。生体試料から得た１本鎖ＲＮＡ
の増幅の程度を知ることで、試料中の標的核酸配列の有
無や濃度がわかる。
【００３７】図２では標的核酸配列がＲＮＡの場合の増
幅法を、図３ではＤＮＡの場合の増幅法を示す。試料か
らの核酸の調製方法は、前記に示したような前処理方法
を行えなばよい。
幅法を、図３ではＤＮＡの場合の増幅法を示す。試料か
らの核酸の調製方法は、前記に示したような前処理方法
を行えなばよい。
【００３８】次に標的核酸配列がＲＮＡ（＋）の場合に
ついて説明する（図２）。 第１工程：ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）
に相補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
１プライマーをハイブリダイズさせる。プライマーを添
加するだけでハイブリダイズする場合もあるが、ハイブ
リダイゼーション効率を上げるために６５℃で５分間程
度処理すればよい。９５℃で処理しても構わないが、Ｒ
ＮＡが分解する恐れがある。この時、使用される非耐熱
性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼとプロモーター配列は
図１で使用される酵素および塩基配列と同じものを用い
る。続いて、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼに
より第１プライマーを伸長反応させて、標的核酸配列Ｒ
ＮＡ（＋）に相補的な第１プライマー伸長物（−，ｄ）
を合成させ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を
得る。 第２工程：第１プライマー伸長物（−，ｄ）をＲＮＡ／
ＤＮＡハイブリッド伸長生成物から分離するため、耐熱
性ＲＮａｓｅＨを用いて標的核酸配列ＲＮＡ（＋）を消
化し、第１プライマー伸長物ＤＮＡ（−，ｄ）を分離す
る。
ついて説明する（図２）。 第１工程：ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）
に相補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
１プライマーをハイブリダイズさせる。プライマーを添
加するだけでハイブリダイズする場合もあるが、ハイブ
リダイゼーション効率を上げるために６５℃で５分間程
度処理すればよい。９５℃で処理しても構わないが、Ｒ
ＮＡが分解する恐れがある。この時、使用される非耐熱
性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼとプロモーター配列は
図１で使用される酵素および塩基配列と同じものを用い
る。続いて、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼに
より第１プライマーを伸長反応させて、標的核酸配列Ｒ
ＮＡ（＋）に相補的な第１プライマー伸長物（−，ｄ）
を合成させ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を
得る。 第２工程：第１プライマー伸長物（−，ｄ）をＲＮＡ／
ＤＮＡハイブリッド伸長生成物から分離するため、耐熱
性ＲＮａｓｅＨを用いて標的核酸配列ＲＮＡ（＋）を消
化し、第１プライマー伸長物ＤＮＡ（−，ｄ）を分離す
る。
【００３９】第３工程：該１本鎖ＤＮＡ（−，ｄ）を鋳
型として、該１本鎖ＤＮＡ（−，ｄ）に相補的な配列
（ＲＮＡ（＋）に相同な配列）を有する第２プライマー
を第１プライマー伸長物（−，ｄ）の３’領域にハイブ
リダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体（ｅ）を生
成させる。ここで、第１プライマーの核酸配列は標的核
酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して充分に相補的であり、第
２プライマーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列
に対して充分に相同であり、第１プライマーの３’末端
は相補的な鎖上の第２プライマーノ３’末端に向けられ
ている。 第４工程：得られた２本鎖ＤＮＡ中間体（ｅ）から、前
記プロモーター配列を認識することができる非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、複数の１本鎖Ｒ
ＮＡ（−）を合成して、図１の増幅サイクルに供し、１
本鎖ＲＮＡコピー数を増幅させる。必要により、増幅さ
れた１本鎖ＲＮＡ（−）をプローブにより検出すること
で検体中の標的核酸配列の存在の有無を知ることができ
る。
型として、該１本鎖ＤＮＡ（−，ｄ）に相補的な配列
（ＲＮＡ（＋）に相同な配列）を有する第２プライマー
を第１プライマー伸長物（−，ｄ）の３’領域にハイブ
リダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体（ｅ）を生
成させる。ここで、第１プライマーの核酸配列は標的核
酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して充分に相補的であり、第
２プライマーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列
に対して充分に相同であり、第１プライマーの３’末端
は相補的な鎖上の第２プライマーノ３’末端に向けられ
ている。 第４工程：得られた２本鎖ＤＮＡ中間体（ｅ）から、前
記プロモーター配列を認識することができる非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、複数の１本鎖Ｒ
ＮＡ（−）を合成して、図１の増幅サイクルに供し、１
本鎖ＲＮＡコピー数を増幅させる。必要により、増幅さ
れた１本鎖ＲＮＡ（−）をプローブにより検出すること
で検体中の標的核酸配列の存在の有無を知ることができ
る。
【００４０】標的核酸配列がＤＮＡの場合について説明
する（図３、左端）。 第１工程：標的核酸が２本鎖ＤＮＡである場合は１本鎖
ＤＮＡとする。 第２工程：該１本鎖ＤＮＡ（＋）に、その５’末端側に
非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有し、かつ該１本鎖ＤＮＡ（＋）に相補的な配列
を有する第１プライマーをハイブリダイズさせる。プラ
イマーを添加するだけで結合する場合もあるが、結合効
率を上げるために９５℃で５分間程度処理すればよい。
この時、使用される非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼとプロモーターは図１で使用される酵素および塩基
配列と同じものを用いる。続いて、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、１本鎖ＤＮ
Ａに相補的な第１プライマー伸長物（−）を合成して、
２本鎖ＤＮＡ（ｆ）を得る。 第３工程：次いで、２本鎖ＤＮＡ（ｆ）から第１プライ
マー伸長物ＤＮＡ（−）を分離するため変性処理を行
う。変性操作は加熱、酸、アルカリ処理等を行えばよい
が、加熱処理が簡単に実施できる。
する（図３、左端）。 第１工程：標的核酸が２本鎖ＤＮＡである場合は１本鎖
ＤＮＡとする。 第２工程：該１本鎖ＤＮＡ（＋）に、その５’末端側に
非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有し、かつ該１本鎖ＤＮＡ（＋）に相補的な配列
を有する第１プライマーをハイブリダイズさせる。プラ
イマーを添加するだけで結合する場合もあるが、結合効
率を上げるために９５℃で５分間程度処理すればよい。
この時、使用される非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼとプロモーターは図１で使用される酵素および塩基
配列と同じものを用いる。続いて、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、１本鎖ＤＮ
Ａに相補的な第１プライマー伸長物（−）を合成して、
２本鎖ＤＮＡ（ｆ）を得る。 第３工程：次いで、２本鎖ＤＮＡ（ｆ）から第１プライ
マー伸長物ＤＮＡ（−）を分離するため変性処理を行
う。変性操作は加熱、酸、アルカリ処理等を行えばよい
が、加熱処理が簡単に実施できる。
【００４１】第４工程：分離した１本鎖ＤＮＡ（−）に
ＤＮＡ（＋）に相同な配列を有するプライマー（第２プ
ライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、上流に機能
可能なプロモーター配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体
（ｇ）を生成させる。 第５工程：続いて、得られた２本鎖ＤＮＡ中間体（ｇ）
から非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて複
数の１本鎖ＲＮＡ（−）を合成する。 第６工程：上記工程から得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を
鋳型として、図１の増幅サイクルに供し、１本鎖ＲＮＡ
コピー数を増幅させる。必要により、１本鎖ＲＮＡの存
在をプローブにより検出することで検体中の標的核酸配
列の存在の有無を知ることが出来る。
ＤＮＡ（＋）に相同な配列を有するプライマー（第２プ
ライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、上流に機能
可能なプロモーター配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体
（ｇ）を生成させる。 第５工程：続いて、得られた２本鎖ＤＮＡ中間体（ｇ）
から非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて複
数の１本鎖ＲＮＡ（−）を合成する。 第６工程：上記工程から得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を
鋳型として、図１の増幅サイクルに供し、１本鎖ＲＮＡ
コピー数を増幅させる。必要により、１本鎖ＲＮＡの存
在をプローブにより検出することで検体中の標的核酸配
列の存在の有無を知ることが出来る。
【００４２】図１〜図３では、第１プライマーのみが、
非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有する場合を説明した。次に、第１プライマーお
よび第２プライマーが非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を所有し、１本鎖ＲＮＡ
（−）と１本鎖ＲＮＡに相補的ＲＮＡ（＋）のコピー数
を増幅する方法（図４）を説明する。この方法は図４に
示すように、１本鎖ＲＮＡ（−）と１本鎖ＲＮＡに相補
的ＲＮＡ（＋）が、上流域と下流域に機能可能なプロモ
ーター配列に結合した共通の２本鎖ＤＮＡ中間体（ｌ）
を経て増幅されている。基本的には第１プライマーに非
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を結合させる以外は、前記反応機構と大差はない。第
１プライマーと第２プライマーのプロモーター配列は異
なっても良いが、その場合にはプロモーター配列に合う
非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを２種類添加す
る必要がある。最も効率的に行うには同じプロモーター
配列を用いればよい。好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼとプロモーターを使用する。試料中のＤＮＡから核
酸増幅させる場合も、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列を有している第１プライマーを使用す
ればよく、その原理は同じである。
非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を有する場合を説明した。次に、第１プライマーお
よび第２プライマーが非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を所有し、１本鎖ＲＮＡ
（−）と１本鎖ＲＮＡに相補的ＲＮＡ（＋）のコピー数
を増幅する方法（図４）を説明する。この方法は図４に
示すように、１本鎖ＲＮＡ（−）と１本鎖ＲＮＡに相補
的ＲＮＡ（＋）が、上流域と下流域に機能可能なプロモ
ーター配列に結合した共通の２本鎖ＤＮＡ中間体（ｌ）
を経て増幅されている。基本的には第１プライマーに非
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を結合させる以外は、前記反応機構と大差はない。第
１プライマーと第２プライマーのプロモーター配列は異
なっても良いが、その場合にはプロモーター配列に合う
非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを２種類添加す
る必要がある。最も効率的に行うには同じプロモーター
配列を用いればよい。好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼとプロモーターを使用する。試料中のＤＮＡから核
酸増幅させる場合も、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列を有している第１プライマーを使用す
ればよく、その原理は同じである。
【００４３】本発明方法において増幅される１本鎖ＲＮ
Ａを検出するためには、標的核酸に相補的な配列を有す
る検出プローブを用いて検出すればよい。例えば固相に
捕捉プローブを固定し、試料中の標的核酸から増幅され
た核酸をハイブリダイズさせ、さらに標識を有する検出
プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検
出プローブの標識を測定することにより、試料中の標的
核酸を検出する。また、増幅された核酸を含む反応溶液
数μｌをナイロン膜に滴下し、放射性プローブまたは酵
素標識プローブである検出プローブをハイブリダイズさ
せて、ハイブリダイズした検出プローブの放射線量また
は酵素活性を測定することにより、試料中の標的核酸を
検出する。
Ａを検出するためには、標的核酸に相補的な配列を有す
る検出プローブを用いて検出すればよい。例えば固相に
捕捉プローブを固定し、試料中の標的核酸から増幅され
た核酸をハイブリダイズさせ、さらに標識を有する検出
プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした検
出プローブの標識を測定することにより、試料中の標的
核酸を検出する。また、増幅された核酸を含む反応溶液
数μｌをナイロン膜に滴下し、放射性プローブまたは酵
素標識プローブである検出プローブをハイブリダイズさ
せて、ハイブリダイズした検出プローブの放射線量また
は酵素活性を測定することにより、試料中の標的核酸を
検出する。
【００４４】本発明の特定の核酸配列を増幅するための
試薬キットは、上記第１プロモーター、第２プロモータ
ー、耐熱性ＲＮａｓｅＨ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオ
シドトリホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび緩衝液を含む。耐熱性ＲＮａｓｅＨ
としては、Thermus thermophilus由来のＲＮａｓｅＨが
好ましい。その濃度は、２０μｌの反応系に、０．００
１Ｕから０．１Ｕであればよい。非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、例えばポリメラーゼαまたはβな
ど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離されるＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー断
片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼなど、
多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。５’−または
３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素、例えばＡＭ
Ｖ逆転写酵素が好ましい。５’−または３’−エキソヌ
クレアーゼ活性が本来欠如した別のＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼなどが例示されるが、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼ（逆転写酵素）であってもよい。例えばトリ筋
芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、
モロニー(Maloney) マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ逆
転写酵素）などが挙げられる。また、別の真核細胞由来
のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。そ
の濃度は、特に制限されない。
試薬キットは、上記第１プロモーター、第２プロモータ
ー、耐熱性ＲＮａｓｅＨ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオ
シドトリホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび緩衝液を含む。耐熱性ＲＮａｓｅＨ
としては、Thermus thermophilus由来のＲＮａｓｅＨが
好ましい。その濃度は、２０μｌの反応系に、０．００
１Ｕから０．１Ｕであればよい。非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、例えばポリメラーゼαまたはβな
ど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離されるＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー断
片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼなど、
多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。５’−または
３’−エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素、例えばＡＭ
Ｖ逆転写酵素が好ましい。５’−または３’−エキソヌ
クレアーゼ活性が本来欠如した別のＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼなどが例示されるが、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼ（逆転写酵素）であってもよい。例えばトリ筋
芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転写酵素）、
モロニー(Maloney) マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ逆
転写酵素）などが挙げられる。また、別の真核細胞由来
のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。そ
の濃度は、特に制限されない。
【００４５】非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼと
しては、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、
ファージφＩＩ、Salmonellaファージsp6 または Pseud
omonasファージgh-1などが例示されるが、特にＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮ
Ａポリメラーゼなどが挙げられる。その濃度は、特に制
限されない。緩衝液としては、それぞれの酵素に応じて
適当な緩衝液が選択される。
しては、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、
ファージφＩＩ、Salmonellaファージsp6 または Pseud
omonasファージgh-1などが例示されるが、特にＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮ
Ａポリメラーゼなどが挙げられる。その濃度は、特に制
限されない。緩衝液としては、それぞれの酵素に応じて
適当な緩衝液が選択される。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、複製ベースの増幅法に耐熱性
ＲＮａｓｅＨを用いることにより、非耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを使用する場合に比べて、３７〜４５℃付近にて増幅
サイクルがよく回転し、検出感度を従来より向上させる
ことができる。
ＲＮａｓｅＨを用いることにより、非耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを使用する場合に比べて、３７〜４５℃付近にて増幅
サイクルがよく回転し、検出感度を従来より向上させる
ことができる。
【００４７】
【実施例】実施例１ （オリゴヌクレオチドの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサ
イザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列
表に示される配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列およびサイトメガロウイルスのｍＲ
ＮＡに相補的な配列を有する第１プライマー（配列番号
２）とサイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を
有する第２プライマー（配列番号１）を合成した。具体
的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２Ｍスケー
ルで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアン
モニア水で、５５℃で一夜実施した。精製はファルマシ
ア社製、ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
イザー３９１型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列
表に示される配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列およびサイトメガロウイルスのｍＲ
ＮＡに相補的な配列を有する第１プライマー（配列番号
２）とサイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を
有する第２プライマー（配列番号１）を合成した。具体
的な手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２Ｍスケー
ルで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアン
モニア水で、５５℃で一夜実施した。精製はファルマシ
ア社製、ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００４８】（ＣＭＶ培養液からＲＮＡの調製）Ｂｏｏ
ｍらの手法（J. Clin. Microbiol.,28:495-503, 1990）
に基づき、ＣＭＶ(AD169株）感染細胞からＲＮＡを調製
した。すなわち、培養細胞液を、トリトンＸ−１００と
グアニジウムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）を含む溶解
用緩衝液中で処理後、シリカを添加し、ｍＲＮＡを吸着
させた。ｍＲＮＡ吸着シリカをＧｕＳＣＮを含む洗浄用
緩衝液で２〜３回洗浄後、アセトンでＧｎＳＣＮを除去
し、乾燥させた。溶出はヌクレアーゼを含まない蒸留水
で行った。溶出液は、同じ蒸留水で段階希釈した。
ｍらの手法（J. Clin. Microbiol.,28:495-503, 1990）
に基づき、ＣＭＶ(AD169株）感染細胞からＲＮＡを調製
した。すなわち、培養細胞液を、トリトンＸ−１００と
グアニジウムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）を含む溶解
用緩衝液中で処理後、シリカを添加し、ｍＲＮＡを吸着
させた。ｍＲＮＡ吸着シリカをＧｕＳＣＮを含む洗浄用
緩衝液で２〜３回洗浄後、アセトンでＧｎＳＣＮを除去
し、乾燥させた。溶出はヌクレアーゼを含まない蒸留水
で行った。溶出液は、同じ蒸留水で段階希釈した。
【００４９】（検出用プローブの調製） （１）リンカーアームを有するＣＭＶ検出用オリゴヌク
レオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表に示される配列、すなわち、
検出用プローブ（配列番号３）を合成した。この際、特
表昭 60-500717号公報に掲載された合成法により、デオ
キシウリジンから化学合成した５位にリンカーアームを
有するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。
このウリジンはオリゴヌクレオチド内に任意のＴと置換
しうるが、この実施例においては、５’末端に結合し
た。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で、５５℃で一夜実施した。精製はファル
マシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
レオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表に示される配列、すなわち、
検出用プローブ（配列番号３）を合成した。この際、特
表昭 60-500717号公報に掲載された合成法により、デオ
キシウリジンから化学合成した５位にリンカーアームを
有するウリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。
このウリジンはオリゴヌクレオチド内に任意のＴと置換
しうるが、この実施例においては、５’末端に結合し
た。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で、５５℃で一夜実施した。精製はファル
マシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。
【００５０】（２）リンカーオリゴヌクレオチドのアル
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドのアルカリホスファタ
ーゼを介して、アルカリホスファターゼを文献（Nuclei
c Acids Research, vol.14, p.6114,1986)に従って結合
した。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3１２．５μｌに溶解し、ここへ１０ｍｇ
スベリン酸スクシニミジル（ＤＳＳ）２５μｌを加え
て、室温で２分間反応させた。反応液を１ｍＭ ＣＨ3
ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラムでゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去し
た。
カリホスファターゼによる標識化 上記リンカーオリゴヌクレオチドのアルカリホスファタ
ーゼを介して、アルカリホスファターゼを文献（Nuclei
c Acids Research, vol.14, p.6114,1986)に従って結合
した。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3１２．５μｌに溶解し、ここへ１０ｍｇ
スベリン酸スクシニミジル（ＤＳＳ）２５μｌを加え
て、室温で２分間反応させた。反応液を１ｍＭ ＣＨ3
ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックス
Ｇ−２５カラムでゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去し
た。
【００５１】末端のアミノ基が活性化されたリンカーオ
リゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリ
ホスファターゼ(100mM NaHCO3, 3M HCl に溶解したも
の）と室温で１６時間反応させることにより、アルカリ
ホスファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プロ
ーブはファルマシア製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを
用いて精製した標識プローブを含む画分を集め、セント
リコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾過法により
濃縮した。
リゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリ
ホスファターゼ(100mM NaHCO3, 3M HCl に溶解したも
の）と室温で１６時間反応させることにより、アルカリ
ホスファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プロ
ーブはファルマシア製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを
用いて精製した標識プローブを含む画分を集め、セント
リコン３０Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾過法により
濃縮した。
【００５２】（増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol.
Methods 35:273-286,1991)に基づき実施した。２５μｌ
の反応系において、酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ; ４０ｍ
Ｍ ＫＣｌ；５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ ＤＭＳＯ；１ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ；４．１ｍＭ ｒＮＴＰ；０．２μＭ第２
プライマー（配列番号１）; ０．２μＭ第１プライマー
（配列番号２）になるよう設定し、抽出ＲＮＡと混ぜ
て、６５℃で５分間加熱した。２．５μｇ ＢＳＡ、１
２ＵＲＮＡ Ｇｕａｒｄ（ファルマシア）、２０Ｕ Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼ、４ＵＡＭＶ逆転写酵素; および
０．０３Ｕ Thermus thermophilus由来の耐熱性ＲＮａ
ｓｅＨを添加し、２５μｌとし、４１℃で３時間インキ
ュベートした。
Methods 35:273-286,1991)に基づき実施した。２５μｌ
の反応系において、酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ; ４０ｍ
Ｍ ＫＣｌ；５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ ＤＭＳＯ；１ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ；４．１ｍＭ ｒＮＴＰ；０．２μＭ第２
プライマー（配列番号１）; ０．２μＭ第１プライマー
（配列番号２）になるよう設定し、抽出ＲＮＡと混ぜ
て、６５℃で５分間加熱した。２．５μｇ ＢＳＡ、１
２ＵＲＮＡ Ｇｕａｒｄ（ファルマシア）、２０Ｕ Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼ、４ＵＡＭＶ逆転写酵素; および
０．０３Ｕ Thermus thermophilus由来の耐熱性ＲＮａ
ｓｅＨを添加し、２５μｌとし、４１℃で３時間インキ
ュベートした。
【００５３】（検出）反応溶液１μｌをナイロン膜に滴
下後、アルカリ性条件下で核酸を固定した。この膜を中
和後、アルカリ性条件下で固定した。この膜を中和後、
ハイブリダイゼーションバックに移し、上記アルカリフ
ォスファターゼ標識核酸プローブを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー（５ｘＳＳＣ、０．５％ＢＳＡ、
０．５％ＰＶＰ、１％ＳＤＳ）を加えて、５０℃で１５
分間ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜をポ
リバックから取り出し、洗浄液１（１ｘＳＳＣ，１％Ｓ
ＤＳ）で５０℃、１０分間浸透洗浄した。さらに洗浄液
２（１ｘＳＳＣ）で室温１０分間浸透洗浄した。膜を新
しいハイブリダイゼーションバックに移し、基質液（0.
1M Tris, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3M MgCl2, ニトロ
ブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロフェリー
ルホスフェート pH7.5）を入れ、シール後、３７℃で３
０分間インキュベートした。 （結果）図５に示すように抽出ＲＮＡの１０7 倍希釈ま
で検出できた。
下後、アルカリ性条件下で核酸を固定した。この膜を中
和後、アルカリ性条件下で固定した。この膜を中和後、
ハイブリダイゼーションバックに移し、上記アルカリフ
ォスファターゼ標識核酸プローブを含むハイブリダイゼ
ーションバッファー（５ｘＳＳＣ、０．５％ＢＳＡ、
０．５％ＰＶＰ、１％ＳＤＳ）を加えて、５０℃で１５
分間ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜をポ
リバックから取り出し、洗浄液１（１ｘＳＳＣ，１％Ｓ
ＤＳ）で５０℃、１０分間浸透洗浄した。さらに洗浄液
２（１ｘＳＳＣ）で室温１０分間浸透洗浄した。膜を新
しいハイブリダイゼーションバックに移し、基質液（0.
1M Tris, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3M MgCl2, ニトロ
ブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロフェリー
ルホスフェート pH7.5）を入れ、シール後、３７℃で３
０分間インキュベートした。 （結果）図５に示すように抽出ＲＮＡの１０7 倍希釈ま
で検出できた。
【００５４】比較例１ （増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol. Methods 35:2
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ＤＭＳＯ；１ｍＭｄＮＴＰ；
４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー（配列
番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号２）に
なるよう設定し、抽出ＲＮＡと混ぜて、６５℃で５分間
加熱した。２．５μｇ ＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡＧｕａ
ｒｄ、２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ
逆転写酵素および０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを添
加し、２５μｌとし、４１℃で３時間インキュベートし
た。
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ＤＭＳＯ；１ｍＭｄＮＴＰ；
４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー（配列
番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号２）に
なるよう設定し、抽出ＲＮＡと混ぜて、６５℃で５分間
加熱した。２．５μｇ ＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡＧｕａ
ｒｄ、２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ
逆転写酵素および０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを添
加し、２５μｌとし、４１℃で３時間インキュベートし
た。
【００５５】（検出）実施例１と同様の方法で実施し
た。 （結果）図６に示すように抽出ＲＮＡの１０6 倍希釈ま
で検出できた。増幅は実施例１と同時に行ったが、文献
（J. Virol. Methods 35:273-286）で使用される大腸菌
由来ＲＮａｓｅＨ（ファルマシア製）を使用するより
も、耐熱性ＲＮａｓｅＨを使用した方が検出感度が良か
った。
た。 （結果）図６に示すように抽出ＲＮＡの１０6 倍希釈ま
で検出できた。増幅は実施例１と同時に行ったが、文献
（J. Virol. Methods 35:273-286）で使用される大腸菌
由来ＲＮａｓｅＨ（ファルマシア製）を使用するより
も、耐熱性ＲＮａｓｅＨを使用した方が検出感度が良か
った。
【００５６】実施例２ （オリゴヌクレオチドの合成）実施例１と同様に行っ
た。
た。
【００５７】（ＣＭＶ培養液からＤＮＡの調製）培養細
胞を３００μｌの０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７．
０）の緩衝液に懸濁後、プロテイナーゼＫ０．６ｍｇ、
溶解液（８Ｍ尿素、０．２５％ ＳＤＳ、０．２５％ラ
ウリルサルコシンナトリウム、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．６）６００μｌを加えて撹拌し、６０℃一晩反応
させた。
胞を３００μｌの０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７．
０）の緩衝液に懸濁後、プロテイナーゼＫ０．６ｍｇ、
溶解液（８Ｍ尿素、０．２５％ ＳＤＳ、０．２５％ラ
ウリルサルコシンナトリウム、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．６）６００μｌを加えて撹拌し、６０℃一晩反応
させた。
【００５８】得られた溶解物をフェノールで２回、クロ
ロホルムで１回抽出後、エタノール沈殿した。再溶解
後、ＲＮａｓｅＡ処理でＲＮＡを完全に分解し、フェノ
ールで２回、クロロホルムで１回抽出後、エタノール沈
殿した。再溶解はＲＮａｓｅやＤＮａｓｅを含まない蒸
留水で行い、同蒸留水で段階希釈した。
ロホルムで１回抽出後、エタノール沈殿した。再溶解
後、ＲＮａｓｅＡ処理でＲＮＡを完全に分解し、フェノ
ールで２回、クロロホルムで１回抽出後、エタノール沈
殿した。再溶解はＲＮａｓｅやＤＮａｓｅを含まない蒸
留水で行い、同蒸留水で段階希釈した。
【００５９】（検出用プローブの調製）実施例１と同様
に行った。 （増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol. Methods 35:2
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて、酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ ＤＭＳＯ；１ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ；４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー
（配列番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号
２）になるよう設定し、抽出ＤＮＡと混ぜて、９５℃で
５分間加熱した。４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素を添加し、４
１℃１０分間処理した。再び、９５℃で５分間加熱した
後、２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ、
２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ逆転写
酵素、および０．０３Ｕ Thermus thermophilus由来の
耐熱性ＲＮａｓｅＨを添加し、２５μｌとし、４１℃で
３時間インキュベートした。
に行った。 （増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol. Methods 35:2
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて、酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ ＤＭＳＯ；１ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ；４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー
（配列番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号
２）になるよう設定し、抽出ＤＮＡと混ぜて、９５℃で
５分間加熱した。４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素を添加し、４
１℃１０分間処理した。再び、９５℃で５分間加熱した
後、２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ、
２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ逆転写
酵素、および０．０３Ｕ Thermus thermophilus由来の
耐熱性ＲＮａｓｅＨを添加し、２５μｌとし、４１℃で
３時間インキュベートした。
【００６０】（検出）実施例１と同様の方法で実施し
た。 （結果）図７に示すように抽出ＤＮＡの１０4 倍希釈ま
で検出できた。
た。 （結果）図７に示すように抽出ＤＮＡの１０4 倍希釈ま
で検出できた。
【００６１】比較例２ （増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol. Methods 35:2
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ＤＭＳＯ；１ｍＭｄＮＴＰ；
４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー（配列
番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号２）に
なるよう設定し、抽出ＤＮＡと混ぜて、９５℃で５分間
加熱した。４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素を添加し、４１℃１
０分間処理した。再び、９５℃で５分間加熱した後、
２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ ｇｕａｒｄ、２０
Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵
素、０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを添加し、２５μ
ｌとし、○○℃で３時間インキュベートした。
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ＤＭＳＯ；１ｍＭｄＮＴＰ；
４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー（配列
番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号２）に
なるよう設定し、抽出ＤＮＡと混ぜて、９５℃で５分間
加熱した。４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素を添加し、４１℃１
０分間処理した。再び、９５℃で５分間加熱した後、
２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ ｇｕａｒｄ、２０
Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵
素、０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを添加し、２５μ
ｌとし、○○℃で３時間インキュベートした。
【００６２】（検出）実施例１と同様の方法で実施し
た。 （結果）図８に示すように抽出ＤＮＡの１０3 倍希釈ま
で検出できた。増幅は実施例１と同時に行ったが文献
（J. Virol. Methods 35:273-286）で使用される大腸菌
由来ＲＮａｓｅＨを使用するよりも、耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを使用した方が検出感度が良かった。
た。 （結果）図８に示すように抽出ＤＮＡの１０3 倍希釈ま
で検出できた。増幅は実施例１と同時に行ったが文献
（J. Virol. Methods 35:273-286）で使用される大腸菌
由来ＲＮａｓｅＨを使用するよりも、耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを使用した方が検出感度が良かった。
【００６３】実施例３ （オリゴヌクレオチドの合成）ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサ
イザー 391型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列表
に示される配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列及びサイトメガロウイルスのｍＲＮＡ
に相補的な配列を有する第１プライマー（配列番号２）
とＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列及びサイ
トメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する第２
プライマー（配列番号４）を合成した。具体的な手法は
ＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２Ｍスケールで実施し
た。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で
５５℃で一夜実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬ
Ｃで逆相カラムにて実施した。
イザー 391型を用いて、ホスホアミダイト法にて配列表
に示される配列、すなわち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列及びサイトメガロウイルスのｍＲＮＡ
に相補的な配列を有する第１プライマー（配列番号２）
とＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列及びサイ
トメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する第２
プライマー（配列番号４）を合成した。具体的な手法は
ＡＢＩ社マニュアルに従い、０．２Ｍスケールで実施し
た。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で
５５℃で一夜実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬ
Ｃで逆相カラムにて実施した。
【００６４】（増幅反応）実施例１の手法を用いた。 （検出）実施例１と同様の方法で実施した。
【００６５】（結果）図９に示すように、抽出ＲＮＡの
１０7 倍希釈まで検出できた。検出感度は実施例１と同
じであったが、検出量は実施例１の場合と比較し、１０
7 倍希釈が濃くなった一重鎖ＲＮＡと一重鎖ＲＮＡに相
補的な配列の両方を増幅するため、検出量が高くなると
考えられる。
１０7 倍希釈まで検出できた。検出感度は実施例１と同
じであったが、検出量は実施例１の場合と比較し、１０
7 倍希釈が濃くなった一重鎖ＲＮＡと一重鎖ＲＮＡに相
補的な配列の両方を増幅するため、検出量が高くなると
考えられる。
【００６６】
配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な
配列 配列 ACTGTCTGCA GGACGCCGTA 20
配列 配列 ACTGTCTGCA GGACGCCGTA 20
【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴： 1〜27: Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列 28〜47: サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相補的な配
列 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGAG GTGTAGATAC GGATCTG 47
列 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGAG GTGTAGATAC GGATCTG 47
【００６８】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴：ＣＭＶ配列に相同な配列 配列： ATTCCGTTGC GGCGTGTCAT CTTT 24
【００６９】配列番号：４ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の特徴： 1〜27：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列 28〜47：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACT GTCTGCAGGA CGCCGTA 47
【図１】 本発明の１本鎖ＲＮＡの増幅サイクル系を示
す。
す。
【図２】 標的核酸配列がＲＮＡの場合の１本鎖ＲＮＡ
増幅方法を示す。
増幅方法を示す。
【図３】 標的核酸配列がＤＮＡの場合の１本鎖ＲＮＡ
増幅方法を示す。
増幅方法を示す。
【図４】 第１プライマーおよび第２プライマーがプロ
モーター配列を有する場合のＲＮＡの増幅サイクル系を
示す。
モーター配列を有する場合のＲＮＡの増幅サイクル系を
示す。
【図５】 実施例１のハイブリダイゼーションの結果を
示す。
示す。
【図６】 比較例１のハイブリダイゼーションの結果を
示す。
示す。
【図７】 実施例２のハイブリダイゼーションの結果を
示す。
示す。
【図８】 比較例２のハイブリダイゼーションの結果を
示す。
示す。
【図９】 実施例３のハイブリダイゼーションの結果を
示す。
示す。
【手続補正書】
【提出日】平成９年７月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと
は、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとＤＮ
Ａ鋳型からＤＮＡを合成する酵素であって、真核細胞由
来のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼαまたは
βなど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離される
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー
断片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼな
ど、多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。好ましい
酵素としては、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素などがある。
特に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の双方を同じ酵素によって
与えられるものが好ましい。
は、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーとＤＮ
Ａ鋳型からＤＮＡを合成する酵素であって、真核細胞由
来のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼαまたは
βなど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離される
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー
断片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼな
ど、多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。好ましい
酵素としては、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素などがある。
特に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の双方を同じ酵素によって
与えられるものが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】第３工程：次いで、分離された第２プライ
マー伸長物（＋，ｂ）を鋳型として、該ＤＮＡの３’領
域に対して、該１本鎖ＤＮＡ（＋）に相補的な配列（Ｒ
ＮＡ（−）に相同な配列、ＲＮＡ（−）に対して相補的
な配列）およびその５’末端に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターを有する第１プライマー
をハイブリダイズさせる。次いで非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより第１プライマー伸長物を合成し
て、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有す
る２本鎖ＤＮＡ中間体（ｃ）を生成させる。ここでは、
ＡＭＶ逆転写酵素が所有するＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を利用することで十分であり、別途、ＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼを添加する必要性はない。 第４工程：次いで、上流に機能可能なプロモーター配列
に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター
配列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−，ａ）のコピーを
増加させる。非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは
１つの鋳型から５０〜１０００コピーの１本鎖ＲＮＡ
（−，ａ）を合成できる。従って、このサイクルを少な
くとも５回繰り返せば、１コピーの１本鎖ＲＮＡ（−，
ａ）から少なくとも数億コピーの増幅産物ＲＮＡ（−，
ａ）が得られる。
マー伸長物（＋，ｂ）を鋳型として、該ＤＮＡの３’領
域に対して、該１本鎖ＤＮＡ（＋）に相補的な配列（Ｒ
ＮＡ（−）に相同な配列、ＲＮＡ（−）に対して相補的
な配列）およびその５’末端に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターを有する第１プライマー
をハイブリダイズさせる。次いで非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより第１プライマー伸長物を合成し
て、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有す
る２本鎖ＤＮＡ中間体（ｃ）を生成させる。ここでは、
ＡＭＶ逆転写酵素が所有するＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を利用することで十分であり、別途、ＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼを添加する必要性はない。 第４工程：次いで、上流に機能可能なプロモーター配列
に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター
配列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−，ａ）のコピーを
増加させる。非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは
１つの鋳型から５０〜１０００コピーの１本鎖ＲＮＡ
（−，ａ）を合成できる。従って、このサイクルを少な
くとも５回繰り返せば、１コピーの１本鎖ＲＮＡ（−，
ａ）から少なくとも数億コピーの増幅産物ＲＮＡ（−，
ａ）が得られる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】本発明の特定の核酸配列を増幅するための
試薬キットは、上記第１プロモーター、第２プロモータ
ー、耐熱性ＲＮａｓｅＨ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオ
シドトリホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび緩衝液を含む。耐熱性ＲＮａｓｅＨ
としては、Thermus thermophilus由来のＲＮａｓｅＨが
好ましい。その濃度は、２０μｌの反応系に、０．００
１Ｕから０．１Ｕであればよい。非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、例えばポリメラーゼαまたはβな
ど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離されるＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー断
片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼなど、
多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、ＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）が所有するＤＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を利用してもよく、例え
ば、トリ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転
写酵素）、モロニー(Maloney) マウス白血病ウイルス
（ＭＭＬＶ逆転写酵素）などが挙げられる。また、ＤＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する別の真核細胞由
来のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。
その濃度は、特に制限されない。
試薬キットは、上記第１プロモーター、第２プロモータ
ー、耐熱性ＲＮａｓｅＨ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオ
シドトリホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび緩衝液を含む。耐熱性ＲＮａｓｅＨ
としては、Thermus thermophilus由来のＲＮａｓｅＨが
好ましい。その濃度は、２０μｌの反応系に、０．００
１Ｕから０．１Ｕであればよい。非耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、例えばポリメラーゼαまたはβな
ど、子ウシ胸線のごとき哺乳類組織から単離されるＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー断
片、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼなど、
多くのＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、ＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）が所有するＤＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を利用してもよく、例え
ば、トリ筋芽細胞腫ウイルスポリメラーゼ（ＡＭＶ逆転
写酵素）、モロニー(Maloney) マウス白血病ウイルス
（ＭＭＬＶ逆転写酵素）などが挙げられる。また、ＤＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する別の真核細胞由
来のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。
その濃度は、特に制限されない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６１】比較例２ （増幅反応）増幅反応は文献（J. Virol. Methods 35:2
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ＤＭＳＯ；１ｍＭｄＮＴＰ；
４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー（配列
番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号２）に
なるよう設定し、抽出ＤＮＡと混ぜて、９５℃で５分間
加熱した。４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素を添加し、４１℃１
０分間処理した。再び、９５℃で５分間加熱した後、４
１℃に温度を下げ、２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ
ｇｕａｒｄ、２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素、０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ
を添加し、２５μｌとし、４１℃で３時間インキュベー
トした。
73-286,1991)に基づき実施した。２５μｌの反応系にお
いて酵素添加後の終濃度が４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８．５）；２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；４０ｍＭ ＫＣｌ；
５ｍＭ ＤＴＴ；１５％ＤＭＳＯ；１ｍＭｄＮＴＰ；
４．１ｍＭｒＮＴＰ；０．２μＭ第２プライマー（配列
番号１）; ０．２μＭ第１プライマー（配列番号２）に
なるよう設定し、抽出ＤＮＡと混ぜて、９５℃で５分間
加熱した。４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素を添加し、４１℃１
０分間処理した。再び、９５℃で５分間加熱した後、４
１℃に温度を下げ、２．５μｇＢＳＡ、１２Ｕ ＲＮＡ
ｇｕａｒｄ、２０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素、０．２Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ
を添加し、２５μｌとし、４１℃で３時間インキュベー
トした。
Claims (23)
- 【請求項１】 ＲＮＡ（＋）から１本鎖ＲＮＡ（−）を
生成し、該１本鎖ＲＮＡ（−）のコピー数を増加させる
方法であって、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼおよび耐熱性ＲＮａｓｅ
Ｈを使用すること特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨ
を用いる核酸増幅法。 - 【請求項２】 ＲＮＡ（＋）からなる標的核酸から１本
鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ（−）のコピ
ー数を増加させる方法であって、下記工程を含むことを
特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅
法。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行う； （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）に相
補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、ＲＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッド伸長生成物を得る； （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列を有する第２プライマーをハイブリダイズ
させ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤ
ＮＡ伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプロ
モーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る；（ここで、第１プライマーの核酸配列は標的核酸、
ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的であり、第２プ
ライマーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対
して十分に相同であり、第１プライマーの３’末端は相
補的な鎖上の第２プライマーの３’末端に向けられてい
る） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、該１本鎖ＲＮＡ（−）に相補的な配列を有する第
２プライマー（ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同で
ある配列を有する上記第２プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列および５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマー（前記ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的で
ある上記第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐
熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反
応を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配
列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）から（９）を繰り返す。 - 【請求項３】 ＲＮＡ（＋）からなる標的核酸から１本
鎖ＲＮＡ（＋）および（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ
（＋）および（−）のコピー数を増加させる方法であっ
て、下記工程を含むことを特徴とする耐熱性リボヌクレ
アーゼＨを用いる核酸増幅法。 （１）検体から必要によりＲＮＡ（＋）からなる標的核
酸の抽出操作を行う； （２）ＲＮＡ（＋）を鋳型として、該ＲＮＡ（＋）に相
補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、ＲＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッド伸長生成物を得る； （３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （４）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列およびその５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第２
プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、
５’末端上流に機能可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（ここで、第１プライ
マーの核酸配列は標的核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して
十分に相補的であり、第２プライマーの核酸配列は標的
核酸、ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同であり、第
１プライマーの３’末端は相補的な鎖上の第２プライマ
ーの３’末端に向けられている） （５）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）および
（−）を鋳型として、上記第１プライマーおよび第２プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記第１プライマ
ーおよび第２プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応
を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）およ
び（−）を鋳型として、前記（６）から（９）を繰り返
す。 - 【請求項４】 ＤＮＡからなる標的核酸配列（＋）から
１本鎖ＲＮＡ（−）を生成し、該１本鎖ＲＮＡ（−）の
コピー数を増加させる方法であって、下記工程を含むこ
とを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸
増幅法。 （１）検体から、必要により標的核酸配列、ＤＮＡの抽
出操作を行う； （２）得られたＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有し、標
的核酸配列、ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマー
（第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、２
本鎖ＤＮＡを得る； （３）変性処理により、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡ
を分離し； （４）該１本鎖ＤＮＡに、標的核酸配列、ＤＮＡに相同
な配列を有するプライマー（第２プライマー）をハイブ
リダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長反応させて、上流に機能可能なプロモーター
配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （５）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、該２本鎖ＤＮＡ中間体から複数の１本鎖ＲＮＡ
（−）を合成する； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳型と
して、該１本鎖ＲＮＡ（−）に相補的な配列を有する第
２プライマー（ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相同で
ある配列を有する上記第２プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、該１本鎖ＤＮＡに
相補的な配列および５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第１プラ
イマー（前記ＲＮＡ（＋）配列に対して十分に相補的で
ある配列を有する上記第１プライマー）をハイブリダイ
ズさせ、非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
ＤＮＡ伸長反応を行って、５’末端上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（−）のコピーを増加さ
せる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（−）を鋳
型として、前記（６）から（９）を繰り返す。 - 【請求項５】 ＤＮＡからなる標的核酸配列（＋）から
１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）を生成し、該１本鎖Ｒ
ＮＡ（＋）および（−）のコピー数を増加させる方法で
あって、下記工程を含むことを特徴とする耐熱性リボヌ
クレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 （１）検体から、必要により標的核酸配列、ＤＮＡの抽
出操作を行う； （２）得られたＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および標的
核酸配列、ＤＮＡに相補的な配列を有するプライマー
（第１プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、２
本鎖ＤＮＡを得る； （３）変性処理により、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡ
を分離し； （４）該１本鎖ＤＮＡに、５’末端側に非耐熱性ＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および標的
核酸配列、ＤＮＡに相同な配列を有するプライマー（第
２プライマー）をハイブリダイズさせ、非耐熱性ＤＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応させて、上流に
機能可能なプロモーター配列に結合した２本鎖ＤＮＡ中
間体を生成させる； （５）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、該２本鎖ＤＮＡ中間体から複数の１本鎖ＲＮＡ
（＋）および（−）を合成する； （６）上記工程で得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）および
（−）を鋳型として、上記第１プライマーおよび第２プ
ライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応を行って、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物を得る； （７）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物のＲＮＡ
のみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨによ
り、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド伸長生成物からＲＮＡ
を分解して、１本鎖ＤＮＡを得る； （８）該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記第１プライマ
ーおよび第２プライマーをハイブリダイズさせ、非耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ伸長反応
を行って、５’末端上流に機能可能なプロモーター配列
を有する２本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （９）該２本鎖ＤＮＡ中間体から、前記プロモーター配
列を認識することができる非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼにより１本鎖ＲＮＡ（＋）および（−）のコ
ピーを増加させる；そして （１０）必要により、得られた１本鎖ＲＮＡ（＋）およ
び（−）を鋳型として、前記（６）から（９）を繰り返
す。 - 【請求項６】 変性処理が加熱、酸またはアルカリ処理
である請求項４または５記載の耐熱性リボヌクレアーゼ
Ｈを用いる核酸増幅法。 - 【請求項７】 耐熱性リボヌクレアーゼＨが、Thermus
thermophilus由来のリボヌクレアーゼＨである請求項１
〜５のいずれか１項記載の耐熱性リボヌクレアーゼＨを
用いる核酸増幅法。 - 【請求項８】 非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
が逆転写酵素である請求項１〜５のいずれか１項記載の
耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 - 【請求項９】 非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
が逆転写酵素である請求項１〜５のいずれか１項記載の
耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 - 【請求項１０】 逆転写酵素がＡＭＶ(Avian myeloblas
tsis virus) 由来の逆転写酵素である請求項８記載の耐
熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 - 【請求項１１】 逆転写酵素がＡＭＶ(Avian myeloblas
tsis virus) 由来の逆転写酵素である請求項９記載の耐
熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法 - 【請求項１２】 非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである請求項１〜５の
いずれか１項記載の耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる
核酸増幅法。 - 【請求項１３】 非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３
ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列である請求項１〜５のいずれか１項記
載の耐熱性リボヌクレアーゼＨを用いる核酸増幅法。 - 【請求項１４】 試料中の標的核酸を請求項１〜５のい
ずれか１項に記載される核酸増幅法により増幅させ、増
幅された核酸を検出プローブとハイブリダイズさせ、ハ
イブリダイズした核酸を検出することを特徴とする試料
中の標的核酸の検出法。 - 【請求項１５】 下記試薬を含むことを特徴とする特定
の核酸配列を増幅するための試薬キット。 （ａ）ＲＮＡ（＋）に相補的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第１プライマー、 （ｂ）ＲＮＡ（＋）に相同的な配列を有する第２プライ
マー、 （ｃ）耐熱性リボヌクレアーゼＨ、 （ｄ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、 （ｅ）非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、 （ｆ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、 （ｇ）リボヌクレオシドトリフォスフェート、 （ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェートお
よび （ｉ）緩衝液 - 【請求項１６】 下記試薬を含むことを特徴とする特定
の核酸配列を増幅するための試薬キット。 （ａ）ＲＮＡ（＋）に相補的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第１プライマー、 （ｂ）ＲＮＡ（＋）に相同的な配列およびその５’末端
側に非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのプロモー
ター配列を有する第２プライマー、 （ｃ）耐熱性リボヌクレアーゼＨ、 （ｄ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、 （ｅ）非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、 （ｆ）非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、 （ｇ）リボヌクレオシドトリフォスフェート、 （ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェートお
よび （ｉ）緩衝液 - 【請求項１７】 耐熱性リボヌクレアーゼＨが、Thermu
s thermophilus由来のリボヌクレアーゼＨである請求項
１５または１６項記載の特定の核酸配列を増幅するため
の試薬キット。 - 【請求項１８】 非耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼが逆転写酵素である請求項１５または１６項記載の特
定の核酸配列を増幅するための試薬キット。 - 【請求項１９】 非耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼが逆転写酵素である請求項１５または１６項記載の特
定の核酸配列を増幅するための試薬キット。 - 【請求項２０】 逆転写酵素がＡＭＶ(Avian myeloblas
tsis virus) 由来の逆転写酵素である請求項１８項記載
の特定の核酸配列を増幅するための試薬キット。 - 【請求項２１】 逆転写酵素がＡＭＶ(Avian myeloblas
tsis virus) 由来の逆転写酵素である請求項１９項記載
の特定の核酸配列を増幅するための試薬キット。 - 【請求項２２】 非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである請求項１５また
は１６記載の特定の核酸配列を増幅するための試薬キッ
ト。 - 【請求項２３】 非耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３
ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列である請求項１４または１５記載の特
定の核酸配列を増幅するための試薬キット。
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| JP8185918A JPH1028585A (ja) | 1996-07-16 | 1996-07-16 | 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8185918A JPH1028585A (ja) | 1996-07-16 | 1996-07-16 | 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法 |
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| JPH1028585A true JPH1028585A (ja) | 1998-02-03 |
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Family Applications (1)
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