KR101936799B1 - 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구강 백반증 또는 점막하 섬유증 조직 샘플에서 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 확인하는 것을 특징으로 하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 화합물을 이용하여 전암 병소 및 재발성 구강암의 진행을 지연하거나 억제할 수 있는 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 구강 내에 백색의 병변이 나타나는 구강 백반증 또는 점막하 섬유증에서 구강암으로의 악성화 가능성을 예측 및 진단할 수 있어, 아직까지 효과적인 치료방법이 없는 구강전암 및 구강암으로의 발전 가능성을 조기에 예측하여 구강암의 잠재적인 위험성을 제거하는데 유용하다.

Description

구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법{Pharmaceutical Composition for Treating Oral Precancer and Method for Predicting or Detecting of Oral Precancer or Oral Cancer}
본 발명은 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 구강 백반증 또는 점막하 섬유증 조직 샘플에서 Axin2 유전자 또는 Snail (SNAI1) 유전자의 발현을 확인하는 것을 특징으로 하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 억제하는 화합물을 유효성분으로 함유하는 이용하여 구강전암 병소 및 재발성 구강암의 진행의 지연 또는 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
구강 내에 백색의 병변이 나타나는 구강 백반증은 점막하 섬유증을 포함하고 이는 악성으로 발전될 가능성이 있는 것으로 잘 알려져 있다(van der Waal I., Med Oral Patol Oral Cir Bucal.,19:e386, 2014; Holmstrup P et al., Oral Oncol, 42:461,2006; Holmstrup P., Oral Oncol 45:549, 2009). 구강 백반증은 모든 연령층에서 약 1%로 발명하고, 치료되지 않은 병변의 악성화 비율은 연간 2-3%로 보고되고 있다(van der Waal I., Med Oral Patol Oral Cir Bucal.,19:e386, 2014). 한편, 비 동종의 백반증의 외과 치료 후에 재발의 위험성은 20%까지 추정되어 왔고, 백반증으로부터 발전된 편평상피암은 낮은 생존률을 보인다(Holmstrup P et al., Oral Oncol, 42:461,2006). 구강 백반증의 진단을 위하여는 일반적인 병리조직학 검사, 임상의 매개변수 및 바이오 마커를 포함하는 악성화의 예상 마커를 찾기 위한 많은 연구가 진행되고 있지만, 예측 비율은 여전히 한계가 있다.
구강 백반증의 악성화의 알려진 위험 요소는 나이, 여성, 백반증의 오랜 지속기간, 큰 사이즈, 머리, 목암의 과거 병력, 비 동종의 임상적 외관, 형성이상의 조직학적 특징의 존재 및 혀 가장자리 또는 입바닥에 백반증 병변이다. 추가적으로, 칸디다 알비칸스의 존재, 톨루이딘 블루로 백반증 병변의 염색 가능성, p16INK4a와 Ki-67를 포함하는 수많은 분자 마커의 비정상적인 발현, 염색체 불안정성, 9p와 돌연변이된 TP53에서 이형접합성의 손실도 예상 요인이다(Abdulrahim MH et al., PLoS One, 8:e73738, 2013; Zhang L et al., Cancer Res, 65:8017, 2005; Nasser W et al., J Oral Pathol Med, 40:629, 2011; Siebers TJ et al., Oral Oncology 49:1121, 2013; Graveland AP et al., Oral Oncol, 49:1129, 2013). 그러나, 예상 마커는 높은 재현 가능성과 확실성을 가지고 구강편평세포암(oral squamous cell carcinoma (OSCC))을 발전시키는 잠재적인 위험요소를 제대로 추정하는 것은 아직까지 어려운 실정이다.
상피간엽이행(Epithelial-to-mesenchymal transition(EMT))은 상피세포 특성을 침묵시키고, 중간엽의 특성을 보임으로써 세포상태를 침습성의 표현형으로 바꾸는 것으로(Dang TT et al., Cancer Res, 75:3925, 2015), Zinc- finger 전사 억제자인 Snail1은 암에서 상보적 형태형성을 수반하는 EMT에서 중요한 역할을 한다. Snail1 단백질은 GSK-3의 연쇄적인 인산화의 억제를 통한 Wnt 신호의 활성에 의해 안정화된다. TCF/LEF 복합체의 대표적인 전사 타겟인 Axin2 스캐폴딩 단백질은 GSK-3의 핵 세포질 셔틀을 조절하여, 핵의 Snail을 안정화시킨다. 급성 유방암과 대장암에서 Axin2과 Snail1이 동시 발현되는 것은 잘 알려져 있는 반면, Wnt 유전자의 임상적 중요성과 발현은 잘 알려지지 않았다.
비록 초기 EMT 연구는 주로 전이 과정에 초점을 두고 있었지만, 지금은 종양전의 병변과 비 침습성 종양에서 EMT 관련 유전자의 초기 활성화에 관심이 있다. 예를 들어, 인간 위의 Helicobactor pylori의 주요 병원체는 위 상피세포에서 Snail-매개 EMT를 강력히 일으키고, Snail1은 비 침습성의 자궁 내막 상피암에서 증가된다. 게다가, 구강 백반증에서 EMT는 악성화의 과정 동안에 중증도 형성이상에서 E-cadherin이 감소되는 것으로 나타났으며, 이는 악성화 위험이 높은 것으로 판단될 수 있다(von Zeidler SV et al., BMC Cancer, 14:972, 2014). 이러한 결과는 구강 전암에서 EMT 유전자의 발현은 암을 진행시키는 역할을 할 가능성을 가능성을 제시하고 있다.
또한 구강암은 다른 암과는 달리 field cancerization 이론에 의해 백반증이나 홍반증과 같은 전암병소가 다발성으로 존재하여 외과적 제거가 무척 어려운 경우도 많으며, 구강암으로 진행된 이후에도 전암병소와 진행성 암이 지속적으로 재발하는 특징을 가진다 (Slaughter DP et al, Cancer 1953, 6, 963-968; Mohan M & Jagannathan N, Oncology Rev 2014, 8:244, 13-19). 이러한 경우 전암 병소와 진행성 암의 적절한 치료 물질은 아직까지 잘 알려져 있지 않으며 대부분 외과적 절제에 의존하고 있지만 반복적인 외과적 술식은 여전히 많은 한계를 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 구강 백반증의 악성화 진행여부를 진단하고 이를 치료하는 방법을 개발하고 자 예의 노력한 결과, Axin2과 Snail의 발현패턴을 분석함으로써, 구강상피암 진행 위험여부를 진단할 수 있고, 상기 Axin2과 Snail을 억제하는 물질을 처리하는 경우, 구강백반증을 치료할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 구강 전암 또는 구강암의 진행을 억제할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구강 백반증 또는 점막하 섬유증 조직 샘플에서 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 확인하는 것을 특징으로 하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 확인할 수 있는 수단을 포함하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 확인할 수 있는 수단을 포함하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 억제하는 화합물을 유효성분으로 함유하는 이용하여 구강전암 병소 및 재발성 구강암의 진행의 지연 또는 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 구강 내에 백색의 병변이 나타나는 구강 백반증 또는 점막하 섬유증에서 구강암으로의 악성화 가능성을 예측 및 진단할 수 있어, 아직까지 효과적인 치료방법이 없는 구강전암 및 구강암으로의 발전 가능성을 조기에 예측하여 구강암의 잠재적인 위험성을 제거하는데 유용하다. 본 발명은 또한, 구강암 악성화에 기여하는 암 유전자를 효과적으로 제어할 수 있는 약물정보과 효과를 제공함으로써 전암병소의 진행, 재발, 구강암 재발을 제어할 수 있는 구강치료제를 제공함으로써 환자에게 임상적인 이익을 제공할 수 있다.
도 1은 구강 백반증과 점막하 섬유증 환자 조직에서 Axin2와 Snail 발현의 특성 분석을 위한 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 구강 백반증과 점막하 섬유증 환자 조직에서의 Axin2와 Snail 발현을 면역조직화학 염색을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 구강 백반증과 점막하 섬유증 환자 조직에서의 Axin2와 Snail 발현과 임상 인자의 기본 정보와의 관계를 나타낸 것이다.
도 4는 Snail 양성 구강 백반증 환자들 사이에서 무암성 생존 가능성과 연관된 위험 요소를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 임상 매개변수와 Axin2와 Snail의 발현을 사용하여 5년, 10년, 15년 무암성 생존률을 예측하기 위한 노모그램(nomogram)을 나타낸 것이다.
도 6은 임상병리학적 변수를 분석하여 작성한 무암성 생존 가능성을 예측한 노모그램을 나타낸 것이다.
도 7은 임상병리학적 변수를 분석하여 작성한 무암성 생존 가능성을 예측한 노모그램을 나타낸 것이다.
도 8은 환자 독성이 거의 없고 FDA 허가 약물인 niclosamide를 이용하여 nM 수준에서 Axin2 발현과 Snail 발현이 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 니클로사마이드에 의하여 Axin-GSK3 복합체 형성이 억제되는 지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 AB는 니클로사마이드가 GSK3에 직접적으로 결합하는지를 확인하기 위한 표면 플라즈마 공명(SPR) 분석결과를 나타낸 것이고, C는 GSK3의 Axin 결합 부분과 니클로사마이드의 구조분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 계피의 주성분인 HCA (2′-Hydroxycinnamaldehyde)와 그 유도체인 BCA (2′-benzoyloxycinnamaldehyde)에 의한 Snail 발현 감소를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 구강 백반증의 악성화에서 Axin2와 Snail 발현 패턴이 변화한다는 것을 확인하고, Axin2 및 Snail 를 구강 백반증 악성화를 예측하기 위한 바이오마커로 사용가능한 지를 확인하였다. Axin2와 Snail의 면역 조직 화학적 염색은 병리학적으로 확인된 구강 백반증과 점막하 섬유증의 구강 점막 샘플을 사용하고, Axin2와 Snail 발현의 조직학 패턴을 분석하고 분류하였다. 구강백반증의 임상병리학적 인자와 악성화 사이의 연관은 17년, 10개월 동안 그래픽 표현의 계산 도표(nomogram)를 작성하여 확인하였다.
일 관점에서, 본 발명은 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현 수준을 확인하는 것을 특징으로 하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현 수준은 구강 백반증 또는 점막하 섬유증 병변 조직 샘플에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현수준의 확인은 구강 백반증 또는 점막하 섬유증 환자 유래 병변 조직의 발현수준과 건강인의 조직의 발현수준을 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현은 RT-PCR, 면역조직화학 염색 및 효소면역진단법(ELISA)으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 구강 전암성 손상의 장기 추적 집단에서 Axin2와 Snail 발현을 평가하였다.
본 발명에서 "구강전암"은 구강암으로 발전할 수 있는 병증을 의미하는 것으로 구강백반증, 구강 홍반증, 점막하 섬유증등을 포함하며, Field cancerization 개변에 따라 이미 구강암으로 외과적 수술을 수행하고 수년간에 걸쳐 지속적인 전암 병소와 진행성 암이 재발 하는 환자를 포함한다.
본 발명에서 "구강암"은 편평세포암종, 악성림프종, 육종, 악성흑색종 등일 수 있으며, 바람직하게는 편평세포암종일 수 있다.
본 발명에서는 구강 전암의 악성 진행의 예상 역할로서 EMT 유전자를 연구하였다. 많은 유전자가 Canonical Wnt 신호를 포함하는 하지만, 우리는 GSK-3 스캐폴딩 단백질 Axin2와 이 바이오마커의 가능성을 평가하기 위해 E-cadgerin 전사 억제자 Snail을 연구하였다.
Wnt 신호의 부재에서, GSK3는 β-catenin을 분해하고, 상피의 표현형을 유지하면서 억제 역할을 한다. Snail은 중간엽 표현형을 발현시키기 위한 E-cadeherin 유전자의 전사를 억제한다. 그리고 Snail 활성은 GSK3의 선택적인 인산화에 의해 억제된다(Carver EA et al., Mol Cell Biol, 21:8184, 2001; Zhou BP et al., Nat Cell Biol, 6:931-40, 2004; 21. Bachelder RE et al., J Cell Biol, 168:29, 2005; Yook JI et al., J Biol Chem, 280:11740, 2005).
본 발명에서, Axin2 존재는 구강 전암성 병변의 악성 진행과 매우 관련이 있다. Axin2가 canonical Wnt 경로의 대표적인 다운스트림 인자임 고려하여, 우리의 결과는 증가된 Wnt 활성이 구강 백반증의 악성화에 중요한 역할을 할 것이라고 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에서는 정상 점막 상피는 세포질의 Axin2와 Snail 발현을 보이지만, 핵에서는 발현되지 않는 다는 것을 확인하였으며, 건강한 대조군과 비교했을 때 구강 백반증 병변에서 상피의 Snail가 핵과 세포질 둘 다에서 현저하게 발현되는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 추가적으로, 경구 점막하 섬유증의 생체검사시료를 검사하였다. 경구 점막하 섬유증은 구강의 만성 진행성 섬유성 점막 질병이고, 악성화의 잠재적인 위험성을 가지고 있다. 면역조직화학염색연구를 통해 구강 점막하 섬유증의 상피 병변에서 Axin2와 Snail 발현의 비슷한 패턴이 밝혀졌다.
그러나, Axin2는 암 진행 동안에 Snail-매개 EMT와 전이 활성을 증진시킴으로서 종양 유전자로서 역할을 하는 것이 드러났다(Klar M et al., Breast Cancer Res Treat, 112:523, 2008). 게다가, Axin2 발현을 줄이면 Snail 활성을 감소시키고 EMT를 복귀시킴으로서 침습성이고 전이의 종양 활성을 억제한다(Klar M et al., Breast Cancer Res Treat, 112:523, 2008).
본 발명에서는 임상병리학적 데이터가 구강 백반증의 조직 Axin2 발현과 임상의 변수 사이에 중요한 연관이 없다는 것을 확인하였으며, Snail-양성 구강백반증환자 그룹을 재평가 했을 때, 우수한 Axin2 발현은 악성화의 위험성과 상당히 연관되었다. 흥미롭게도, 구강 점막하 섬유증 환자는 악성화의 위험성에 관하여 임상병리학적 연관에 비슷한 패턴을 보였다. 더군다나, 우리 연구에서 단일변수, 다변수 분석은 성별, 나이 Snail 발현 및 Axin2 발현이 구강 백반증 환자의 악성화의 위험성과 상당히 연관되어 있다고 나타낸다. 특히, Axin2 과발현은 Snail-양성 구강백반증 환자에게 악성화의 위험성을 예측하기 위한 가장 중요한 인자로 확인되었다. 따라서, Snail 활성이 구강 백반증 환자에서 악성화 과정 동안에 스캐폴딩 단백질 Axin2의 기능 손실과 파괴 복합체의 불활성화로부터 생긴다고 판단된다.
본 발명에서는 단면적이고 후향적 코호트 연구 결과를 토대로, 구강 백반증의 악성화의 위험 요소를 평가하기 위하여 노모그램을 작성하였다. 도 6 및 도 7의 모노그램은 17년 10개월간의 추적조사를 통하여, 임상병리학적 변수를 분석하여 작성하였다. 병리학적으로 확정된 구강 백반증 환자에서 년, 10년, 15년 무암성 생존 가능성을 예측하는 모노그램을 작성하였고, Axin2와 Snail1 발현을 포함할 때, c-index는 0.790를 나타냈다. 상기 결과는 구강 백반증에서 악성 진행을 예측할 수 있는 중요한 바이오 마커로서 Axin2와 Snail 발현이 사용될 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.
본 발명은 구강 백반증 환자가 구강 편평상피 세포암으로 발전하는 것을 예측할 수 있는 Axin2와 Snail 발현의 예상치를 제공한다. 악성화에 효과적인 치료가 아직 없기 때문에, 위험 예측을 위한 바이오마커의 조사는 구강 백반증 환자에게 무암성 생존기간을 개선시키는 방법이며, 아울러, 구강 점막하 섬유증과 같은 악성화의 잠재적인 위험성을 가지는 다른 구강의 점막 손상에서의 악성화를 예측하기 위해 조직 Axin2와 Snail 발현의 패턴을 평가하는데 유용하다.
다른 관점에서, 본 발명은 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 확인할 수 있는 수단을 포함하는 구강전암 또는 구강암 예측 또는 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현을 확인할 수 있는 수단은 Axin2 단백질 또는 Snail 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머, Axin2 유전자 또는 Snail 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 및 상기 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법에서 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단에 유용한 정보를 제공하기 위해 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 바람직하게는 유전적 분석(genetic analysis)방법으로 실시할 수 있다.
유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, 상기 나열된 표적 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다. 본 발명에서 프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 표적 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 세포 또는 조직)에서 표적 유전자의 mRNA 발현량을 조사하여 유전자의 발현 정도를 결정한다. 따라사 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시할 수 있다. mRNA를 얻기 위하여, 먼저 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포 내 의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
Mg2+ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 본 발명의 프라이머는 표적유전자의 mRNA (즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 표적 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.
이렇게 증폭된 표적 유전자의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 각 유전자의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 각 유전자의 발현이 정상인의 발현 수준과 비교하여 높은 수준으로 나오는 경우에는 구강암 또는 구강전암으로 발전가능성을 예측할 수 있다.
또한, 상기 표적 유전자 또는 이의 cDNA에 혼성화되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 구강암 또는 구강전암으로 발전가능성을 예측할 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 유전자 cDNA에 혼성화되는 본 발명의 프로브는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀 룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이로 제조될 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 본 발명의 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다. 각 표적 유전자의 cDNA는 상술한 과정에 의해 얻을 수 있다. 프로브 대신에 유전자의 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다. 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스옥시다아제와 t- NBT(nitroblue tetrazolium)등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 상술한 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 구강전암 또는 구강암으로의 진행 가능성을 예측할 수 있다. 즉, 시료에서 각 표적 유전자 cDNA에 대한 시그널이 정상인에서의 발현수준의 것보다 강하게 나오는 경우에는 구강전암 또는 구강암으로의 진행 가능성을 예측할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 비대칭 PCR 수행을 위한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있으며, 액상형 어레이를 이용한 융해곡선 분석을 위한 람다 엑소뉴클라아제, 다양한 버퍼 및 시약, 마이크로웰 플레이트를 포함할 수 있다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명에서는 또한 전암병소의 암 진행을 촉진하는 Axin2 및 Snail 발현을 억제 할 수 있는 저분자 화합물을 정보를 제공하여 반복적인 재발과 Field cancerization을 특징으로 하는 구강 전암병소와 재발성 구강암을 효과적으로 치료 하고 예방할 수 있다.
따라서, 또 다른 관점에서, 본 발명은 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 억제하는 화합물을 유효성분으로 함유하는 이용하여 구강전암 병소 및 재발성 구강암의 진행의 지연 또는 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 Axin2 유전자 또는 Snail 유전자의 발현을 억제하는 화합물은 니클로사미드, HCA (2′-Hydroxycinnamaldehyde), 그 유도체인 BCA (2′-benzoyloxycinnamaldehyde) 및 그의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 용액, 분말, 젤, 패치 형태로 제작되어 환자에게 공급되어 부작용은 거의 없으면서 전암병소와 재발성 구강암을 효과적으로 제어할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용된 담체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.
본 발명에 따른 의약 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
경구 및 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 경구 투여는 목적하는 치료가 국소 적용으로 접근이 용이한 부위 또는 기관과 관련이 있을 때 특히 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 약제학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 약제학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은 통상적인 항염증제와 혼합하거나 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 리폭시게나제 억제제 및 IL-1β외의 사이토킨의 억제제와 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 염증과 같은 IL-1 매개된 질환 증세를 예방 또는 퇴치하기 위해 면역조절제(예, 브로피리민, 항-사람 알파 인터페론 항체, IL-2, GM-CSF, 메티오닌 엔케팔린, 인터페론 알파, 디에틸디티오카바메이트, 종양 괴사 인자, 날트렉손 및 rEPO) 또는 프로스타글란딘과 배합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물이 다른 치료 제제와 배합하여 투여될 때 이들은 환자에게 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
용어 “치료학적 유효량”은 사람의 경우 상기 증세의 치료에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 1 mg 내지 약 100 mg의 용량 수준(전형적으로 약 60 mg 내지 약 6g/환자/일)을 가리킨다.
용어 “예방학적 유효량”은 사람의 경우 상기 증세의 예방에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 용량 수준(전형적으로 약 6 mg 내지 약 6g/환자/일)을 가리킨다.
그러나, 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.
바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 구강 백반증에서 Axin2와 Snail 발현의 특성 분석
본 발명의 실시예에서 사용되는 구강 백반증 조직샘플은 연세의료원 치과병원 병리학교실에서 제공받아 사용하였으며, 점막하 섬유증 조직샘플은 스리랑카의 Peradeniya 치과대학의 구강병리학교실에서 제공받아 사용하였다. 1995년과 2010년사이에, 조직검사 표본은 잠재적 악성 구강 질병(potentially malignant oral disorders (PMOD))을 가진 223명의 환자로부터 얻었다. 이전에 또는 부수적으로 OSCC 진단을 받은 환자 (n=16) 또는 분석에 부적당한 조직을 가진 환자 (n=17) 는 분석에서 제외하였다. 구강 백반증 (평균 추적기간: 11.9 년) 을 가진 총 154명의 환자 (남자 96명 및 여자 59명; 평균연령 55세; 연령범위 13-89 세)와 구강 점막하 섬유증 (평균 추적기간: 6.4 년)을 가진 36명의 환자 (남자 24명 및 여자 12명; 평균연령 45세; 연령범위 21~75 세)유래 샘플을 대상으로 분석을 수행하였다(도 1).
조직샘플 기증자의 특징은 표 1에 기술하였다.
Clinical variables NOM (%) OL (%) SMF (%)
총 샘플 18 154 36
평균연령(세) 55 45
성별
남자 6 (33.3) 96(62.3) 24(66.7)
여자 12 (66.7) 58(37.7) 12(33.3)
위치
구강점막 0(0) 44(28.6) 32(88.9)
혀 0(0) 42(27.3) 1(2.8)
잇몸 18(100) 68(44.2) 0(0)
입술 0(0) 0(0) 2(5.6)
미확인 0(0) 0(0) 1(2.8)
샘플 슬라이드의 구강 백반증과 구강 점막하 섬유증은 병리학자가 검토하고 진단하였다. 정상 대조군으로 사용할, 정상 구강 점막 조직은 세번째 어금니 발치 중인 18명 (남자 6명 및 여자 12명; 평균연령 45세; 연령범위 11~53세) 으로 부터 제공받아 사용하였다. 본 분석은 연세대학교 치과대학의 연구심사위원회(IRB 2-2013-0045)의 승인하에 수행하였다.
Axin2 및 Snail의 발현을 확인하기 위하여, 다음과 같이 면역조직학적 염색을 실시하였다.
조직 샘플은 자일렌을 탈파라핀하고 알콜을 다시 수화시킨 후에, 조직 부분(tissue sections)은 내인성 페록시다아제 활성을 블랏킹하기 위해 10분간 상온에서 1:40의 비율로 희석된 H2O2와 메탄올의 혼합물에서 반응시켰다. Antigen retrieval은 Antigen retrieval 버퍼(Dako, Glostrup, Denmark)에서 pressure-cooking(연속증자법) 방법을 사용하여 수행하였다. 5분 동안 상온에서 5% 소혈청알부민으로 블랏킹시킨 후에, 섹션을 1:200의 비율로 희석된 단일 클론성 rabbit anti-human Axin2 IgG (Abcam, Cambridge, UK)와 1:500의 비율로 단일 클론성 mouse anti-human Snail1 IgG (Abcam)을 가지고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 2차 항체는 Real Envision HRP Rabbit/Mouse detection system (Dako)를 사용하였다. 3,3'-diaminobenzidine을 처리한 후, 헤마톡실린으로 염색하였다. 음성 대조군은 1차 항체로서 rabbit anti-human IgG (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 또는 mouse anti-human IgG (Dako) 항체를 처리했고, 양성 세포가 없는 부분(sections)은 음성으로 간주하였다. SW480의 세포 블랏은 Axin2와 Snail1 둘다를 위한 양성 조절로 사용하였다. 특히, 스캐폴딩 단백질 Axin2와 전사 인자 Snail1은 각각 세포질, 핵에서 발견되었다. Axin2와 Snail의 면역 반응성 둘 다는 구강 점막에서 표피의 윗쪽 2/3의 부재때문에, Axin2와 Snail의 발현 패턴은 낮은 발현 그룹과 높은 발현 그룹으로 나뉘었으며, 낮은 발현은 표피의 아랫쪽1/3에서 제한된 양성 염색 세포를 발현하는 표본 또는 양성세포가 아닌 세포를 나타내고, 높은 발현은 표피의 윗쪽 2/3의 양성 세포를 발현하는 표본을 나타낸다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 정상적인 구강 점막에서, 세포질의 Axin2 발현은 건강한 대조군 18개 표본 중 3개에서 점막의 상피 세포에서 발견되었고(16.7%), 세포질 Snail1 발현은 5개의 표본(27.8%)에서 발견되었다(도 2의 a 및 d). 반면에, 건강한 대조군과 비교하여 154명의 구강 백반증 환자 중 107명 (69.5%; P < 0.001)과 36명의 점막하 섬유증 환자 중 25명(69.4%; P < 0.001)의 상피세포에서 상당히 증가된 세포질 Axin2 발현이 확인되었다(도 2의 b 및 e). Axin2에 대하여 종합적인 조직 면역반응성은 19개의 백반증 샘플(12.3%)에서 높았고, 135개(30.6%)는 낮았다(표 2 및 표 3).
추가적으로, 구강 백반증과 점막하 섬유증은 Snail 발현에 있어서, 서로 다른 세포 내 발현 위치를 나타내었다. 상피의 Snail 발현은 건강한 대조군은 세포질에서만 Snail1 발현되는 반면, 154명의 백반증 환자 환자 중 58명(37.7%; P = 0.001)과 36명의 점막하 섬유증 환자 중 13명(36.1%; P = 0.001)의 경우는 핵과 세포질 둘 다에서 발현되었다(도 2의 c 및 f). Snail에 대한 전체 조직 면역 반응성은 27개의 백반증 샘플(17.5%)에서 높았고, 127개는(82.5%) 낮았다. 반면에, 5개의 점막하 섬유증 샘플에서는 높았고, 31개(86.1%)는 낮았다(표 2 및 표 3).
Figure 112017002386348-pat00001
Figure 112017002386348-pat00002
실시예 2: 구강 백반증에서 Axin2와 Snail 발현의 임상 병리학적 중요성 확인
실시예 1에서 확인된 조직 샘플의 각 그룹에서 Axin2와 Snail의 점막 조직 발현은 Fisher's exact 테스트와 Chi-square 테스트를 사용하여 비교하였다.
Axin2와 Snail 사이의 연관은 Chi-square 테스트를 사용하여 분석하였다.
모튼 통계적인 분석은 the rms와 eha libraries의 R package version 3.1.1 (The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)를 사용하여 수행하였다.
그 결과, 구강 백반증과 점막하 섬유증 환자 조직의 Axin2와 Snail 발현에 있어서, 나이, 성별, 부위를 포함하는 임상 인자의 기본 정보 중 어느 것도 연관되어 있지 않는 것으로 확인되었다. 반면에, Snail 발현이 낮은 조직보다 높은 Snail 발현을 나타내는 조직의 구강 백반증 환자에서 악성화가 더 빈번하게 일어났다(40.7% versus 8.7%; P < 0.001; 도 3a). 게다가, 점막하 섬유증 환자 중 점막 상피세포에서 높은 Snail 발현을 나타내는 환자가 낮은 Snail 발현을 일으키는 환자보다 악성화 가능성이 더 높았다(60% versus 6.5%; P = 0.013; 도 3b).
구강 점막하 섬유증과 구강 백반증에서 임상 매개변수와 조직 Axin2 발현 사이에 중요한 연관은 발견되지 않았다. 그럼에도 불구하고, Axin2 발현은 구강 백반증(P = 0.038)과 점막하 섬유증(P = 0.033)에서 Snail1 발현과 상당히 연관되어 있다(도 3c, d). 특히, Snail1 양성 구강 백반증 환자 중에서 낮은 Axin2 구강 백반증 병변보다 높은 Axin2 구강 백반증 병변에서 악성화의 상당히 더 높은 비율이 나타났다(83.3% versus 17.3%; P = 0.002; 도 3e). 유사하게, Snail 양성 구강 점막하 섬유증 환자 중에서 높은 Axin2 그룹이 낮은 Axin2 그룹에 비해 구강 편평세포암이 더 빈번하게 발생하였다 (66.7% versus 0%; P = 0.045; 도 3f).
실시예 3: 구강 백반증에서 악성화를 일으키는 위험 요소들의 확인
Axin2와 Snail 발현과 관련된 Kaplan-Meier 생존 곡선을 그렸으며, 차이점은 구강 백반증 환자에서 무암성 생존의 평가를 위해 log-rank 테스트로 분석하였다. 추가적으로, 구강 백반증의 악성화와 다양한 요인간에 연관의 강도는 Cox 비례 위험 회귀 모델(Cox proportional hazards regression model) 을 이용한 단일변수, 다변수 분석을 사용하여 평가하였다. 단일변수 분석에서 P < 0.15인 변수들은 다변수 분석에 포함되고, 데이터들은 odds ratios (ORs)와 95% confidence intervals (CI)로 표현하였다.
Kaplan-Meier 분석은 구강 백반증 환자의 무암성 생존률을 추정하는데 사용하였다. 그 결과, 나이가 많은 환자 (생존기간 중앙치-저연령-4427.5일 : 고연령- 3452일; P=0.014) 또는 높은 Snail 발현은(생존기간 중앙치 저발현:4025일:고발현 3589일; P = 0.005)의 경우 생존률을 나타내었다(도 4a, 도 4b).
한편, 악성변이를 가지고 있는 환자나 악성변이가 없는 환자들의 단일변수 비교에서 P<0.15의 임상 병리학적 변수들은 다변수 분석을 포함하기 위해 고려하였다(표 4). 단일변수 분석에서 성별 (P = 0.086), 나이 (P = 0.019), Snail 발현 (P = 0.007) 및 Axin2 발현 (P = 0.066) 을 포함하는 요소 중에, Cox 회귀 분석은 성별 (OR = 3.13, 95% CI = 1.27-7.73; P = 0.014), 나이 (OR = 3.15, 95% CI = 1.19-8.28; P = 0.02), Snail 발현 (OR = 4.41, 95% CI = 1.78-10.93; P = 0.001) 및 Axin2 발현(OR = 7.47, 95% CI = 2.23-25.02; P = 0.001)이 구강 백반증 환자에서 악성화의 위험성과 상당히 연관이 되어 있는 것으로 나타났다.
추가적으로, Snail 양성 구강 백반증 환자들 사이에서 무암성 생존 가능성과 연관된 위험 요소를 분석하였다. Kaplan-Meier 분석에 따르면, 투병 기간 동안에 높은 Axin2 발현을 하는 환자는 생존률이 낮았다 (생존기간 중앙치 Axin2 고발현-374 일: Axin2 저발현-3758일; P < 0.001)(도 4c). 단일변수 분석에 의한 성별 (P = 0.104) 과 Axin2 발현 (P < 0.001) 의 임상 병리학적 변수 사이에서, 다변수 분석은 높은 Axin2 발현 (OR = 23.61, 95% CI = 4.98-111.96; P < 0.001) 이 양성 Snail 발현이 나타나는 구강 백반증 환자에서 악성변성과 상당히 연관되어 있다는 것으로 확인되었다(표 5).
Figure 112017002386348-pat00003
Figure 112017002386348-pat00004
실시예 4: 노모그램(nomogram) 분석
백반증 병변으로부터 구강 편평 상피 세포 암종 세포의 발전에서 위험 요소 예측을 위한 노모그램은 선택된 중요한 변수들을 이용하여 작성하였고, concordance index (c-index)와 눈금 측정 평면도(calibration plot)를 이용해서 평가했다. P-values < 0.05인 경우를 중요하게 고려하였다.
노모그램(nomogram)은 임상 매개변수와 Axin2와 Snail1의 발현을 사용하여 5년, 10년, 15년 무암성 생존률을 예측하기 위하여 작성하였다(도 5). Axin2와 Snail의 발현을 포함할 때, c-index는 계산 도표에서 0.760이고, 총 포인트는 감소하는 반면, 진행가능성은 증가하였다. 그것 때문에, 환자의 총 포인트가 100이라면, 진행 없는 5년, 10년, 15년의 가능성은 각각 73%, 60%, 50%으로 나타난다. 반면에, 만약 총 포인트가 236이라면 진행 없는 5년, 10년, 15년의 가능성은 각각 95%, 91.5%, 89%로 나타난다.
계산 도표의 측정은 구강 백반증 환자에서 계산 도표 예측과 실제 결과 사이의 상관 관계를 조사하기 위해 수행하였다. 이를 위하여, x축은 노모그램으로 계산된 예측 값을 나타내고, y축은 질병 진행의 실제 가능성을 나타낸다. 이상적인 노모그램은 예상 노모그램과 실제 임상 결과가 완벽하게 일치하는 것을 나타내는 y=x의 직선을 나타낼 것이다. 계산 도표 데이터를 그리면 높은 레벨의 예측된 가능성을 반영하는 실선이 된다(도 6).
추가적으로, 계산 도표로 계산되는 전체 포인트는 예측되는 악성화의 특징을 평가하기 위해 조사된다. 총 포인트의 범위는 0부터 365이고, 환자는 낮은 사분위점 값 193과 높은 사분위점 값 294를 이용하여 3그룹으로 나눴다. 그러고 나서, Kaplan-Meier 생존곡선을 그리고, log-rank test를 수행하였다(도 7). 중요한 다른 패턴이 계산도표로 측정된 총 포인트의 층상의 연쇄곡선에서 발견되었다(P < 0.001). 이는 Axin2와 Snail 발현이 구강 백반증에서 악성 진행을 예측하기 위한 중요한 마커로 사용될 수 있다는 것이다.
실시예 4: 저분자 화합물을 이용한 Axin2, Snail 억제 효과
Axin2 발현이 높은 대장암 세포주 HCT116, SW480, SW620 및 DLD-1 세포 (ATCC, American Type Culture collection)을 이용하여 Axin2 및 Snail 발현을 억제하는 저분자 화합물인 niclosamide를 nM 수준에서 처리하였을 때 전암 병소의 암 진행을 촉진하는 Axin2와 Snail 암유전자의 발현이 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, niclosamide를 nM 수준으로 처리하였을 때, Axin2 발현과 Snail 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 niclosamide를 가글, 용액, 젤, 패치등의 형태로 제작하여 국소적으로 사용하였을 때 환자의 전암병소가 구강암으로 진행 하는 것을 효과적으로 지연, 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: Axin-GSK3 복합체 형성이 억제
니클로사마이드가 Axin-GSK3 상호작용을 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, 니클로사마이드의 유무조건 하에서 면역침강 실험을 수행하고자 full-length Axin2를 가지는 세포 용해물을 조사하였다.
면역침강 어세이는 다음과 같이 수행하였다(Yook JI, et al. Nat Cell Biol.8:1398-1406, 2006).
독시사이클린-유도된 His-tagged Axin2 발현 벡터를 MCF-7 세포 ( ATCC, American Type Culture collection)로 형질전환하여 배양하고, 전체세포의 Triton X-100 용해물에 Ni-Ti 비드 (Invitrogen)와 각 농도의 니클로사마이드를 처리하여 반응시켰다. 비드에 회복된 단백질은 SDS-PAGE를 수행한 후, GSK3 용 면역블럿 분석을 수행하였으며, 1/20 부피의 대조군을 넣었다.
그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이,니클로사마이드가 전체 세포 용균액에서 Axin2와 결합하는 GSK3를 감소시키는 것을 확인하였다.
종래 발표된 Axin-GSK3 결합의 구조 분석 결과에서는 Axin의 알파 헬릭스의 소수성 잔기가 GSK3의 C-말단 루프에 의해 형성된 소수성 홈으로 쌓인다고 개시하고 있어(Dajani R et al., EMBO J. 22:494-501, 2003), 본 발명자들은 니클로사마이드가 GSK3의 소수성 홈에 결합하여 Axin의 기능을 방해할 것이라는 가설을 세우고, 이를 확인하기 위하여, 19-mer FITC-결합된 Axin 펩타이드와 결합하는 재조합 GSK3의 니클로사마이드에 의한 경쟁적인 저해를 확인하기 위한 시험관 내 분석을 디자인하였다.
His-tagged 재조합 GSK3베타는 알려진 방법으로 sf9 곤충세포로 부터 얻었다(Lee DG, et al. Nat Commun. 5:4423, 2014). 양친매성의 알파-helix로서 GSK3와 결합하는 것으로 알려진 FITC-결합 19-mer Axin 펩타이드(Axin1, 383-401,VEPQKFAEELIHRLEAVQR)는 화학적으로 합성하였다(Peptron). 합성된 Axin 펩타이드와 니클로사미이드의 경쟁적인 결합을 확인하기 위하여, His-tagged 재조합 GSK3와 Ni-Ti 비드를 니클로사마이드와 함께 2시간 동안 처리하고, PBS로 3번 세척한 후, Ni-Ti 비드를 사용하여, 정량적인 형광 측정을 수행하였다. 형광 강도는 3회 실험으로부터 음성대조군에서 획득한 형광 강도와 비례하여 나타내었다.
그 결과, 니클로사마이드의 투여 농도에 비례하여 재조합 GSK3와 합성된 Axin 펩타이드사이의 상호작용이 억제되는 것을 확인하였다 (도 9B). 이러한 결과를 통해 니클로사마이드는 GSK-3에 결합을 하여 Axin2 기능을 억제하고, 나아가 Snail 발현을 억제하는 것을 의미하는 것이다.
실시예 6: SPR 분석 및 구조분석
니클로사마이드가 GSK3에 직접적으로 결합하는지를 확인하기 위하여, 표면 플라즈마 공명(SPR) 분석을 실시하였다.
SPR은 ProteOnTM XPR36 Protein Interaction Array system (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA)을 사용하였으며, 정제된 재조합 GSK3 베타는 ProteOn GLH sensor chip에 고정하였다. 니클로사마이드 또는 19-mer 야생형 Axin 펩타이드 또는 변이된 펩타이드(VEPQKAAEEAIHRAEAVQR, mutation underlined)는 각각 다른 농도에서 phosphate-buffered saline + Tween 20 + 1% DMSO로 희석한 후, 100μl/min의 속도로 칩에 흘려보내었으며, 결과는 ProteOn Manager Software 2.0 using the standard Langmuir models for fitting kinetic data에 의해 분석하였다. 복합체 형성률은 결합상수(ka, in the unit of M-1s-1)로 표시하였고, 복합체 감쇄율은 해리상수(kd, in the unit of s-1)는 하기 평형식 1과 같이 표시하였다.
ka
A+B ⇔ AB (1)
kd
고친화도 상호작용은 낮은 해리상수로 나타나고, 점진적 인식과 상호작용체와의결합(rapid "on rate," or high ka), 복합체 형성의 안정도(slow "off rate," or low kd)는 식 KD = kd/ka 와 같다.
그 결과, 도 10A 및 10B에 나타난 바와 같이, 야생형 Axin 펩타이드나 니클로사마이드는 GSK3에 직접적으로 결합하였다. 평형해리상수는 SPR분석에서 각각 KD값이 35 μM, 34 μM이다. 센서 표면에서 GSK3 단백질에 고정시키는 소수성 잔기에 돌연변이를 가지는 변이된 Axin 펩타이드는 100마이크로몰까지 결합하지 못했다.
또한, GSK3의 Axin 결합 부분과 니클로사마이드의 상호작용을 구조적으로 분석하기 위해, 분자 도킹 분석을 수행하였다.
분자 도킹 측정은 Maestro 10.4 molecular docking suite를 사용하였다. Axin 펩타이드가 붙어있는 사람(pTyr216)-GSK3β의 결정구조는 RCSB Protein Data Bank (PDB ID: 3ZDI)로 측정하였다. 모든 물 분자들과 금속 이온들을 제거되고 수소 원자를 단백질에 추가하였으며, 샘플과 다른 리간드에 생리적인 pH에 양자를 부가하기 위해 Epik module을 사용하였다. 모든 화합물은 LigPrep를 사용하여 에너지를 최소화하고 standard precision (SP) module of the Glide docking module within the Schrodinger Suite을 사용하여 수용체 구조에 도킹시켰다. Glide 도킹 분석에 앞서, 공동 결정 리간드의 중심에 수용체 grid box를 생성시켰다. 기하학적 형태를 최적화하기 위하여 post-minimization을 수행하였다.
그 결과, 도 10C에 나타난 바와 같이, 니클로사마이드의 1-클로로-3-나이트로벤젠 그룹은 인간 GSK3베타의 Val 263, Leu 266, Val 267 및 Ile 270 잔기로부터 형성된 소수성 구멍에 들어가고, π-π 상호작용을 통하여 Phe 293 잔기에 쌓여졌다. 니클로사마이드는 추가적으로 Pro294, Thr275, Val 263와 수소결합을 형성하고, Axin-GSK3 표면에서 Tyr288와 할로겐 결합한다. 따라서, 니클로사마이드는 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 억제함으로서 Axin-GSK3 복합체를 방해하는 것으로 확인되었다.
실시예 7: HCA (2′-Hydroxycinnamaldehyde) 및 2′-benzoyloxycinnam- aldehyde (BCA)를 이용한 Snail 발현감소
종래의 연구 결과 계피의 주성분이 2'-Hydroxycinnamaldehyde (HCA)와 그 유도체인 2′-benzoyloxycinnamaldehyde (BCA)는 LRP-1 수용체를 억제하여 Snail 발현 억제를 통해 암 전이를 억제하는 것으로 알려져 있다 (Hwang H et al., J Neuroimmunol 2011, 230, 52-64; Ismail IA, et al., Breast Cancer Res Treat, 137, 697-708, 2013). 따라서 HCA와 BCA가 Axin2와 Snail 발현을 억제 할 수 있는 확인하기 위하여 대장암 세포에 HCA와 BCA를 처리하고, 세포 용해액에서 Axin2와 Snail 발현을 확인하였다. HCA와 BCA는 계피나무 껍질에서 분리하고 정제된 것을 사용하였다 (Hwang H et al., J Neuroimmunol 2011, 230, 52-64). 그 결과, 도 11A 및 11B에 나타난 바와 같이, nM 수준의 HCA와 BCA가 Axin2와 Snail 발현을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 HCA와 BCA가 구강 전암병소의 진행을 억제하거나 치료를 목적으로 사용될 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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  9. 니클로사미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 구강전암 병소 또는 재발성 구강암의 진행의 지연 또는 억제용 약학 조성물.

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