ES2563643T3 - Método de secuenciación de ácido nucleico - Google Patents

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Abstract

Un método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico que comprende: a. utilizar una primera colonia para proporcionar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia y que hibridan con cebadores de una manera que permite la extensión de cebadores; b. utilizar una segunda colonia para proporcionar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia y que hibridan con cebadores de una manera que permite la extensión de cebadores; c. proporcionar a cada colonia una polimerasa de ácido nucleico y un nucleótido marcado en condiciones que permitan la extensión de los cebadores si una base o una pluralidad de bases complementarias están presentes en la posición apropiada en las moléculas de ácido nucleico monocatenario en las colonias; d. detectar si el nucleótido marcado se ha incorporado o no en los cebadores extendidos; y e. repetir las etapas c. y d. una o más veces de manera que se proporcionen cebadores extendidos que comprendan una pluralidad de marcadores.

Description

DESCRIPCION
Metodo de secuenciacion de acido nucleico
5 [0001] La presente invencion se refiere, entre otras cosas, a la amplificacion de acidos nucleicos.
[0002] El desarrollo de la biologfa molecular y de la farmacologfa utiliza ahora exhaustivamente el analisis de acidos nucleicos (Friedrich, G.A. Moving beyond the genome projects, Nature Biotechnology 14, 1234 (1996)). Las areas mas desafiantes son la secuenciacion de todo el genoma, la deteccion de polimorfismos mononucleotfdicos y
10 la exploracion y monitorizacion de la expresion genica. Actualmente, solo en proyectos de secuenciacion de ADN, se han manejado hasta cientos de miles de muestras (Venter, J.C., H.O Smith, L. Hood, A new strategy for genome sequencing, Nature 381, 364 (1996)). Esta capacidad esta limitada por la tecnologfa disponible. Proyectos tales como el “proyecto del genoma humano” (mapeo genetico y secuenciacion de ADN) e identificacion de todos los polimorfismos en genes expresados que intervienen en enfermedades comunes, implican la secuenciacion de 15 millones de muestras de ADN.
[0003] Con la mayona de las tecnologfas de secuenciacion de ADN actuales, simplemente no es posible disminuir indefinidamente el tiempo que se necesita para procesar una sola muestra. Una forma de aumentar el rendimiento es realizar muchos procesos en paralelo. La introduccion de preparaciones y el suministro de muestras roboticas, de
20 placas de 96 y 384 pocillos, de aparatos con rejilla de alta densidad (Maier, E., S. Meierewer, A.R. Ahmadi, J. Curtis, H. Lehrach, Application of robotic technology to automated sequence fingerprint analysis by oligonucleotide hybridization, Journal Of Biotechnology 35,191 (1994)) y recientemente el desarrollo de matrices oligonucleotidicas de alta densidad (Chee, M., R.Yang, E. Hubbell, A. Berno, X.C. Huang, D. Stern,J. Winkler, D.J. Lockhart, M.S. Morris, y S.P.A. Fodor, Accessing genetic information with high-density DNA arrays, Science 274(5287): 610-614, 25 (1996)) estan comenzado a dar respuestas a exigencias cada vez con un mayor rendimiento. Dichas tecnologfas permiten procesar hasta 50.000-100.000 muestras a la vez, en el transcurso de dfas e incluso horas (Maier, E., Robotic technology in library screening, Laboratory Robotics and Automation 7, 123 (1995)).
[0004] En la mayona de los metodos conocidos para realizar analisis de acido nucleico, es necesario extraer 30 primero los acidos nucleicos de interes (por ejemplo, ADN genomico o mitocondrial o ARN mensajero (ARNm)) de
un organismo. Despues es necesario aislar los acidos nucleicos de interes de la mezcla de todos los acidos nucleicos y habitualmente, amplificar estos acidos nucleicos para obtener cantidades idoneas para su caracterizacion y/o deteccion. El aislamiento de fragmentos de acidos nucleicos se ha considerado necesario incluso cuando se esta interesado en un conjunto representativo, aunque aleatorio, de todos los diferentes acidos nucleicos, 35 por ejemplo, un conjunto representativo de todos los ARNm presentes en una celula o de todos los fragmentos obtenidos despues de haber cortado al azar el ADN genomico en trozos pequenos.
[0005] Para amplificar el ADN con medios biologicos se pueden utilizar diversos metodos que son muy conocidos por los expertos en la tecnica. Generalmente, los fragmentos de ADN se insertan primero en vectores utilizando
40 enzimas de restriccion y ADN ligasas. Un vector que contiene un fragmento de interes puede introducirse despues en un hospedador biologico y amplificarse mediante protocolos bien establecidos. Normalmente los hospedadores estan dispersos al azar sobre un medio de cultivo (por ejemplo, placas de agar). Despues pueden copiarse para proporcionar colonias que se originan de celulas hospedadoras individuales.
45 [0006] En dichos hospedadores se pueden realizar, de manera simultanea, hasta millones amplificaciones simultaneas de fragmentos de ADN clonados. La densidad de colonias es del orden de 1 colonia/mm2. Para obtener ADN de dichas colonias una opcion es transferir las colonias a una membrana, y despues inmovilizar el ADN desde dentro de los hospedadores biologicos directamente a la membrana (Grunstein, M. y D.S. Hogness, Colony Hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene, Proceedings of the National 50 Academy of Science, USA, 72: 3961 (1975)). Sin embargo, con estas opciones, la cantidad de ADN transferida esta limitada y a menudo es insuficiente para la deteccion no radioactiva.
[0007] Otra opcion es transferir, mediante tecnicas de esterilizacion, individualmente cada colonia a un envase (por ejemplo, a placas de 96 pocillos) donde ademas se pueda producir la replicacion de celulas las hospedadoras,
55 de tal manera que pueda obtenerse mas ADN de las colonias. Despues los acidos nucleicos amplificados pueden recuperarse de las celulas hospedadoras con un proceso de purificacion apropiado. Sin embargo dicho procedimiento es generalmente laborioso y requiere mucho tiempo, y es diffcil de automatizar.
[0008] La tecnica revolucionaria de la amplificacion de ADN utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa 60 (PCR) se propuso en 1985 por Mullis et al. (Saiki, R., S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich y N.
Arnheim, Science 230, 1350-1354 (1985) y ahora es muy conocida por los expertos en la tecnica. En este proceso de amplificacion, un fragmento de ADN de interes puede amplificarse utilizando dos oligonucleotidos cortos (generalmente de aproximadamente 20 bases de longitud) que flanquean una region a amplificar, y que habitualmente reciben el nombre de “cebadores”. La amplificacion se produce durante los tiempos de ciclado de la 65 PCR, que incluye una etapa durante la cual las moleculas de ADN bicatenarias se desnaturalizan (generalmente
calentando una mezcla de reaccion, por ejemplo, a 95 °C para separar las moleculas de ADN bicatenario en dos fragmentos monocatenarios), una etapa de apareamiento (en la que la mezcla de reaccion se lleva a una temperature de, por ejemplo, 45 °C para permitir que los cebadores se apareen con los moldes monocatenarios) y una etapa de alargamiento (el ADN complementario al fragmento monocatenario se sintetiza mediante incorporacion 5 de nucleotidos secuencial en los extremos de los cebadores con la enzima ADN polimerasa).
[0009] El procedimiento anterior se realiza normalmente en solucion, por lo cual no los cebadores ni el molde se ligan a ninguna matriz solida.
10 [0010] Sin embargo, mas recientemente, se ha propuesto el uso de un cebador injertado a una superficie junto con cebadores libres en solucion para amplificar e injertar de manera simultanea un producto PCR sobre la superficie (Oroskar, A.A., S.E. Rasmussen, H.N. Rasmussen, S.R. Rasmussen, B.M. Sullivan, y A. Johansson, Detection of immobilised amplicons by ELISA-like techniques, Clinical Chemistry 42: 1547 (1996)). (El termino “injerto” se usa en este documento para indicar que un resto comienza a unirse a una superficie y permanece afn, a menos que se
15 retire o se desee retirarlo). Generalmente la amplificacion se realiza en envases (por ejemplo, en placas de formato de 96 pocillos) de tal manera que cada envase contiene el producto (o los productos) de la PCR de una reaccion. Con dichos metodos, algunos de los productos de la PCR comienzan a injertarse sobre una superficie del envase que tiene cebadores en su interior que se han puesto en contacto con el reactante durante el ciclado de la PCR. El injerto en la superficie simplifica ensayos posteriores y permite realizar una automatizacion eficiente.
20
[0011] La disposicion de muestras de ADN se realiza mas clasicamente en membranas (por ejemplo, membranas de nylon o nitrocelulosa). Con el uso de robotica adecuada (por ejemplo, Q-bot™, Genetix Ltd, Dorset BH23 3TG UK) es posible alcanzar una densidad de hasta 10 muestras/mm2 En este caso, el ADN se liga por enlace covalente a una membrana por medios fisioqmmicos (por ejemplo, radiacion UV). Estas tecnologfas permiten la disposicion de
25 moleculas de ADN grandes (por ejemplo, moleculas de mas de 100 nucleotidos de longitud) asf como moleculas de ADN mas pequenas. Por tanto, pueden disponerse tanto moldes como sondas.
[0012] Nuevas estrategias basadas en portaobjetos de vidrio previamente dispuestos (disposiciones de areas reactivas obtenidas por tecnologfa de inyeccion (Blanchard, A.P. y L. Hood, Oligonucleotide array synthesis using ink
30 jets, Microbial and Comparative Genomics, 1: 225 (1996)) o matrices de geles de poliacrilamida reactivos (Yershov, G. et al., DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide micromicroplacas, Proceedings of the National Academy of Science, USA, 93: 4913-4918 (1996)) permiten la disposicion de hasta 100 muestras/mm2. Con estas tecnologfas, solo se ha descrito el injerto de sondas (oligonucleotidos). El numero indicado de muestras/mm2 sigue siendo muy bajo (de 25 a 64).
35
[0013] Pueden alcanzarse densidades de muestra mas altas utilizando microplacas de ADN, que pueden ser matrices de oligonucleotidos que se unen, mediante enlace covalente, a una superficie y que se pueden obtener utilizando tecnicas de microlitograffa (Fodor, S.P.A. et al., Light directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science 251: 767(1991)). Actualmente, en aplicaciones de biologfa molecular, se utilizan microplacas con
40 625 sondas/mm2 (Lockhart, D.J. et al., Expression monitoring by hybridisation to high-density oligonucleotide arrays, Nature Biotechnology 14: 1675 (1996)). Se reivindica que se pueden alcanzar densidades de sonda de hasta 250 000 muestras/cm2 (Chee, M. et al., Accessing genetic information with high-density DNA arrays, Science 274: 610 (1996)). Actualmente, en una sola microplaca de aproximadamente 2,5 cm2 se pueden disponer hasta 132 000 oligonucleotidos diferentes. En la actualidad, estas microplacas se fabrican mediante smtesis solida de
45 oligonucleotidos en fase solida con el extremo 3'OH del oligonucleotido unido a la superficie. Por tanto estas microplacas se han utilizado para proporcionar sondas oligonucleortdicas que no pueden actuar como cebadores en una etapa de alargamiento mediada por la ADN polimerasa.
[0014] Cuando los productos de la PCR se ligan en el recipiente en el que se realiza la amplificacion por PCR, esto
50 puede considerarse como un proceso de disposicion de matrices directo. La densidad de los productos resultantes
de la PCR en la matriz, esta por tanto limitada al recipiente que se dispone. Actualmente los recipientes de los que se dispone estan solo en un formato de placa de microtitulacion de 96 pocillos. Estos permiten obtener solo aproximadamente 0,02 muestras de productos PCR /mm2 de superficie.
55 [0015] Utilizando el sistema Nucleolink™ disponible en el comercio, que puede obtenerse en Nunc A/S (Roskilde, Dinamarca), es posible conseguir la amplificacion y disposicion simultaneas de muestras en envases en la superficie sobre la cual se han injertado los cebadores oligonucleortdicos. Sin embargo, en este caso, la densidad de la matriz de las muestras la fija el tamano del recipiente. En la actualidad se puede alcanzar una densidad de °,°2 muestras/mm para el formato de placa de 96 pocillos. Aumentar esta densidad es diflcil. Esto es apreciable ya que,
60 por ejemplo, la disponibilidad de las placas de 384 pocillos (0,08 muestras/mm2), adecuadas para la PCR, se ha demorado debido a problemas tecnicos (por ejemplo, transferencia de calor y efectos capilares durante el llenado). Por lo tanto, en un futuro previsible, con esta estrategia es poco probable poder conseguir mejoras en cuanto a los ordenes de magnitud en la densidad de las muestras dispuestas en una matriz.
65 [0016] La presente invencion tiene por objeto superar, o al menos aliviar, algunas de las desventajas de los
metodos de secuenciacion de acido nucleico de la tecnica anterior. La presente invencion se ocupa de un metodo de secuenciacion de una molecula de acido nucleico como se define en las reivindicaciones.
[0017] De acuerdo con la presente descripcion se desvela un metodo de amplificacion de acido nucleico que 5 comprende las etapas de:
A. proporcionar una pluralidad de cebadores que estan inmovilizados pero que tienen un extremo expuesto para permitir la extension del cebador;
B. permitir que una molecula de acido nucleico diana monocatenario se aparee con uno de dicha pluralidad de
10 cebadores sobre parte de la longitud de dicha molecula de acido nucleico monocatenario y despues extender ese
cebador utilizando, como molde, la molecula de acido nucleico monocatenario apareada, para proporcionar una cadena de acido nucleico inmovilizada extendida;
C. separar la molecula de acido nucleico diana de la cadena de acido nucleico inmovilizada extendida;
D. permitir que la cadena de acido nucleico inmovilizada extendida se aparee con uno de dicha pluralidad de
15 cebadores indicados en la etapa A) y despues extender ese cebador utilizando, como molde, la cadena de acido
nucleico inmovilizada extendida, para proporcionar otra cadena de acido nucleico inmovilizada extendida; y opcionalmente,
E. separar las cadenas de acido nucleico inmovilizadas extendidas apareadas entre sf.
20 [0018] Preferentemente el metodo tambien comprende la etapa de:
F. utilizar al menos una cadena de acido nucleico inmovilizada extendida para repetir las etapas D) y E), para proporcionar cadenas de acido nucleico inmovilizadas extendidas adicionales y, opcionalmente,
G. repetir la etapa F) una vez o mas.
25
[0019] A ser posible la secuencia de acido nucleico diana monocatenario se proporciona mediante un metodo en el cual dicho acido nucleico diana monocatenario se produce proporcionando una secuencia de acido nucleico determinada a amplificar (cuya secuencia puede ser conocida o no) y anadir a la misma una primera secuencia de acido nucleico y una segunda secuencia de acido nucleico; en el que dicha primera secuencia de acido nucleico se
30 hibrida con uno de dicha pluralidad de cebadores y dicha segunda secuencia de acido nucleico es complementaria a una secuencia que se hibrida a una de dicha pluralidad de cebadores.
[0020] La segunda secuencia de acido nucleico puede ser una secuencia que es igual que la secuencia de uno de la pluralidad de cebadores. Por tanto, la secuencia de acido nucleico diana monocatenario puede proporcionarse
35 mediante un metodo en el que dicho acido nucleico diana monocatenario se produzca proporcionando una secuencia de acido nucleico determinada a amplificar (cuya secuencia puede conocerse o no) y anadir a la misma una primera secuencia de acido nucleico y una segunda secuencia de acido nucleico; en el que dicha primera secuencia de acido nucleico se hibrida con uno de dicha pluralidad de cebadores y dicha segunda secuencia de acido nucleico es igual que la secuencia de uno de dicha pluralidad de cebadores.
40
[0021] La primera y segunda secuencias de acido nucleico pueden proporcionarse en el primer y segundo extremos de dicho acido nucleico diana monocatenario, aunque esto no es esencial.
[0022] Si se desea puede proporcionarse un marcador para permitir identificar los productos de amplificacion de 45 una secuencia de acido nucleico determinada.
Colonias
[0023] El metodo de la presente descripcion permite proporcionar una o mas areas distintas, comprendiendo cada 50 area distinta una pluralidad de cadenas de acido nucleico inmovilizadas (de ahora en adelante en el presente
documento denominadas “colonias”). Estas areas pueden contener grandes cantidades de moleculas de acido nucleico amplificado. Estas moleculas pueden ser moleculas de ADN y/o ARN y pueden proporcionarse en forma mono o bicatenaria. Tanto una cadena determinada como su cadena complementaria pueden proporcionarse en forma amplificada en una sola colonia.
55
[0024] Pueden proporcionarse colonias de cualquier tamano particular.
[0025] Sin embargo, en toda su dimension, el tamano de las colonias preferidas es de 10 nm a 100 |im, mas preferentemente de 100 nm a 10 |im. A ser posible, gran parte de las colonias presentes en una superficie (es decir,
60 al menos el 50 % de la misma) presentan tamanos con los intervalos indicados anteriormente.
[0026] Las colonias pueden disponerse de una manera predeterminada o al azar. Son posibles configuraciones de colonias bi o tridimensionales. Las configuraciones pueden ser regulares (por ejemplo, tener un diseno poligonal o generalmente circular) o pueden ser irregulares.
[0027] Las colonias pueden proporcionarse a altas densidades. Pueden alcanzarse densidades de mas de una colonia/mm2 de superficie. De hecho, utilizando la presente invencion, pueden alcanzarse densidades de mas de 102, mas de 103 o incluso mas de 104 colonias/mm2. En realizaciones preferidas, la presente invencion proporciona densidades de colonia de 104-5 colonias/mm2, mas preferentemente densidades de 106-7 colonias/mm2, por tanto se
5 ofrece una mejora de 3 a 4 ordenes de magnitud con respecto a las densidades que pueden alcanzarse utilizando muchos de los metodos de la tecnica anterior. Esta propiedad de la invencion es lo que permite una gran ventaja sobre la tecnica anterior, dado que la alta densidad de colonias de ADN permite disponer al azar y amplificar una gran cantidad de moldes de ADN (hasta 106-7 colonias/mm2).
10 Cebadores
[0028] Los cebadores inmovilizados para su uso en la presente invencion se pueden proporcionar mediante cualquier medio adecuado, siempre que su extremo 3'-OH libre este disponible para la extension del cebador. Cuando se van a amplificar muchas moleculas de acido nucleico diferentes, se pueden proporcionar muchos
15 cebadores diferentes. Como alternativa, se pueden utilizar cebadores “universales”, por lo cual solo se puede utilizar uno o dos tipos de cebadores diferentes (dependiendo de la realizacion de la invencion) para amplificar las moleculas de acido nucleico diferentes. Se puede utilizar cebadores universales cuando las moleculas que se van a amplificar comprenden una primera y segunda secuencias, como se describe anteriormente. La adquisicion de cebadores universales es ventajosa sobre metodos tales como los desvelados en el documento WO96/04404 20 (Mosaic Technologies, Inc.) en los que deben prepararse cebadores espedficos para cada secuencia particular que se va a amplificar.
[0029] Los cebadores oligodesoxinucleotidicos sinteticos estan disponibles en el comercio de muchos proveedores (por ejemplo, Microsynth, Suiza, Eurogentech, Belgica).
25
[0030] Se ha descrito el injerto de cebadores sobre vidrio o cuarzo silanizado y sobre obleas de silicio o superficies de oro (Maskos, U. y E.M Southern, Oligonucleotide hybridizations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridization properties of oligonucleotides synthesised in situ, Nucleic Acids Research 20(7): 1679-84, 1992; Lamture, J.B., et al. Direct-detection of nucleic-acid hybridization on the surface of a charge-
30 coupled-device, Nucleic Acids Research 22(11): 2121-2125, 1994; Chrisey, L.A., G.U. Lee, y C.E. Oferrall, Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayer films, Nucleic Acids Research 24(15): 3031-3039, 1996).
[0031] El injerto de cebadores marcados con biotina en soportes cubiertos con estreptavidina es otra alternativa. Ese metodo de injerto se usa normalmente para bio macromoleculas en general.
35
[0032] En la presente invencion tambien es posible el injerto no covalente de cebadores en la interfaz entre una fase acuosa y una fase hidrofoba a traves de un anclaje hidrofobo. Dicho anclaje se usa normalmente para bio macromoleculas en general (S. Terrettaz et al.: Protein binding to supported lipid membranes, Langmuir 9,1361 (1993)). Formas preferidas de dichas interfases senan liposomas, vesfculas lipfdicas, emulsiones, biocapas con
40 diseno, pelfculas de Langmuir o de Langmuir-Blodgett. Los disenos se pueden obtener disenando directamente en moldes, por ejemplo, en microplacas de silicio disenadas a traves de metodos microlitograficos (Goves, J.T. et al., Micropatterning Fluid Bilayers on Solid Supports, in Science 275,651 (1997)). Los disenos tambien se pueden obtener debido a las propiedades de auto ensamblaje de los “coloides”, por ejemplo, emulsiones o partfculas de latex (Larsen, A.E. y D.G. Grier, Like charge attractions in metastable colloidal crystallites, Nature 385,230 (1997)).
45
[0033] En los metodos anteriores, en una superficie se pueden injertar dos o mas cebadores diferentes. Los cebadores se pueden injertar de manera homogenea y simultanea sobre la superficie.
[0034] Utilizando metodos microlitograficos es posible proporcionar cebadores inmovilizados de una manera 50 controlada. Si se desea la smtesis directa de oligonucleotidos sobre un soporte solido con un extremo 3'-OH libre,
entonces se pueden utilizar metodos microlitograficos para sintetizar de manera simultanea muchos cebadores oligonucleotfdicos diferentes (Pirrung, M.C. y Bradley, J.C. Comparison of methods for photochemical phosphoramidite-based DNA- synthesis. Journal of Organic Chemistry 60(20): 6270-6276, 1995). Estos se pueden proporcionar en distintas areas cuya configuracion puede corresponder con la de las colonias que se van a formar 55 (por ejemplo, puede ser a traves de varios nanometros o micrometros). Dentro de cada area, es necesario proporcionar solo un unico tipo de cebador oligonucleotfdico. Como alternativa se puede proporcionar una mezcla que comprenda una pluralidad de cebadores diferentes. En cualquier caso, dentro de cada area, los cebadores se deben distribuir de manera homogenea. Estos se pueden proporcionar en forma de una matriz regular.
60 [0035] Cuando las areas comprenden inicialmente un solo tipo de cebador inmovilizado, estas pueden modificarse, si se desea, para llevar dos o mas tipos de cebadores diferentes. Una manera de conseguir esto es utilizar moleculas como moldes para la extension del cebador que tenga extremos 3' que se hibriden con un solo tipo de cebador inicialmente presente y que tengan extremos 5' que se extiendan mas alla de los extremos 3' de dichos cebadores. Proporcionando una mezcla de moldes con diferentes secuencias entre sf, la extension del cebador de 65 un tipo de cebador utilizando la mezcla de dichos moldes seguido por la separacion de cadenas dara como resultado
cebadores modificados diferentes. (en el presente documento los cebadores modificados se denominan cebadores “extendidos” para diferenciarlos de los cebadores “primarios” inicialmente presentes en una superficie).
[0036] De esta manera, se pueden proporcionar uno, dos o mas tipos de cebadores diferentes extendidos en 5 cualquier area donde se localicen inicialmente cebadores primarios. Si se desea, se pueden utilizar partes
sustancialmente iguales de moldes diferentes para dar proporciones sustancialmente iguales de diferentes tipos de cebadores extendidos inmovilizados sobre un area determinada. Por consiguiente entonces, si se desean diferentes proporciones de diferentes cebadores extendidos inmovilizados, esto puede conseguirse ajustando las proporciones de las diferentes moleculas molde inicialmente utilizadas.
10
[0037] Dentro del cebador puede haber un sitio de escision de endonucleasas de restriccion. Tambien se puede proporcionar un cebador con un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restriccion que dirijan la escision del ADN con una distancia de varias bases (endonucleasas de restriccion de Tipo II). (Para evitar dudas, se considera que dichos sitios estan presentes incluso si se requiere que, tanto el cebador como su complemento, esten
15 presentes en una molecula bicatenaria para que se produzca el reconocimiento y/o la escision). Como alternativa, cuando se extiende un cebador, puede producirse un sitio de escision y/o de reconocimiento. En cualquier caso, las endonucleasas de restriccion pueden ser utiles permitiendo que una molecula de acido nucleico, inmovilizada en una colonia, se escinda para liberar al menos una parte de la misma. Como una alternativa al uso de otras endonucleasas de restriccion, se pueden utilizar ribozimas para liberar al menos partes de las moleculas de acido 20 nucleico de una superficie (cuando dichas moleculas son moleculas de ARN). Son posibles otros metodos. Por ejemplo, si se utiliza un enlace covalente para ligar un cebador a una superficie, este enlace se puede degradar (por ejemplo, por medios qrnmicos, ffsicos o enzimaticos).
[0038] Los cebadores para su uso en la presente invencion tienen preferentemente una longitud de al menos cinco 25 bases. Normalmente, tendran una longitud menor de 100 o menor de 50 bases. Sin embargo esto no es esencial. En
los cebadores puede haber bases de origen natural y/o no natural.
Moleculas de acido nucleico diana
30 [0039] Volviendo ahora a las moleculas de acido nucleico diana (denominadas tambien en el presente documento “moldes”) para su uso en el metodo de la presente invencion, estas pueden proporcionarse mediante cualquier medio apropiado. Una molecula diana (cuando esta en forma monocatenaria) comprende una primera parte que tiene una secuencia que se puede aparear con un primer cebador y una segunda parte que tiene una secuencia complementaria a una secuencia que se puede aparear con un segundo cebador. En una realizacion preferida la 35 segunda parte tiene la misma secuencia que el segundo cebador.
[0040] El segundo cebador puede tener una secuencia que sea igual que, o diferente de, la secuencia del primer cebador.
40 [0041] La primera y segunda partes de las moleculas de acido nucleico diana se localizan preferentemente en sus extremos 3' y 5' respectivamente. Sin embargo esto no es esencial. La molecula diana tambien comprendera normalmente una tercera parte localizada entre la primera y segunda partes. Esta parte de la molecula comprende una secuencia particular que se va a copiar. Esta puede ser, si se desea, de cualquier fuente y puede tener una secuencia conocida o desconocida (algunas veces denominada “anonima”). Esta puede proceder, por ejemplo, de 45 fraccionamiento al azar por medios mecanicos o por digestion con enzimas de restriccion limitada de una muestra de acido nucleico.
[0042] Si se desea se pueden proporcionar otras partes de las moleculas diana. Por ejemplo, se pueden proporcionar partes disenadas que actuan como etiquetas. Una “etiqueta” se define por su funcion de permitir
50 identificar una molecula de acido nucleico (o su complemento) particular.
[0043] Independientemente de que esten presentes las partes, las moleculas de acido nucleico diana pueden proporcionarse mediante tecnicas conocidas por los expertos en la materia de manipulacion de acidos nucleicos. Por ejemplo, dos o mas partes pueden unirse entre sf por ligamiento. Si es necesario, antes del ligamiento se pueden
55 realizar modificaciones apropiadas para proporcionar moleculas en una forma lista para el ligamiento. Por ejemplo, si se desea un ligamiento de extremos romos entonces se puede utilizar una exonucleasa espedfica monocatenaria, tal como la nucleasa S1, para retirar las partes monocatenarias de las moleculas antes del ligamiento. Tambien se pueden utilizar enlazadores y/o adaptadores en la manipulacion de acido nucleico. (Se desvelan tecnicas utiles de manipulacion de acido nucleico, por ejemplo, en Sambrook et al, Molecular Cloning, 2a edicion, Cold Spring Harbor 60 Laboratory Press (1989)).
[0044] Una vez que se ha sintetizado una molecula molde, esta puede clonarse en un vector y puede amplificarse en un hospedador adecuado antes de utilizarse en la presente invencion. Como alternativa, esta puede amplificarse por PCR. Como una alternativa adicional, pueden sintetizarse qmmicamente lotes de moleculas molde utilizando
65 sintetizadores de ADN automaticos (por ejemplo, de Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA).
[0045] Sin embargo es importante observar que la presente invencion permite proporcionar grandes cantidades de moleculas de acido nucleico de identica secuencia en una colonia que se origina de una sola molecula molde. Adicionalmente, el molde se puede volver a utilizar para generar otras colonias. Por tanto, para su uso en la formacion de colonias, no es esencial proporcionar grandes cantidades de moleculas molde.
5
[0046] El molde puede tener cualquier longitud que se desee, siempre que pueda participar en el metodo de la presente invencion. Preferentemente tiene una longitud de al menos 10, mas preferentemente de al menos 20 bases. Mas preferentemente tiene una longitud de al menos 100 o de al menos 1000 bases. Como es el caso de los cebadores para su uso en la presente invencion, los moldes pueden comprender bases de origen natural y/o no
10 natural.
Condiciones de reaccion
[0047] Volviendo ahora a las condiciones de reaccion adecuadas para el metodo de la presente invencion, se 15 apreciara que la presente invencion utiliza etapas repetitivas de apareamiento de cebadores con moldes, extension
de cebadores y separacion de cebadores extendidos de moldes. Estas etapas se pueden realizar generalmente utilizando reactivos y condiciones que conocen los expertos en tecnicas de pCr (o transcriptasa inversa mas PCR). Se desvelan tecnicas de PCR, por ejemplo, en “PCR: Clinical Diagnostics and Research”, publicado en 1992 por Springer-Verlag.
20
[0048] Por tanto puede utilizarse una polimerasa de acido nucleico junto con un aporte de moleculas de nucleosido trifosfato (u otras moleculas que actuan como precursores de nucleotidos presentes en ADN/ARN, tales como nucleosido trifosfatos modificados) para extender cebadores en presencia de un molde adecuado.
25 [0049] De manera deseable, se proporciona un exceso de desoxirrubonucleosido trifosfatos. Los desoxirribonucleosido trifosfatos preferidos se abrevian de la siguiente manera: dTTP (desoxitimidina nucleosido trifosfato), dATP (desoxiadenosina nucleosido trifosfato), dCTP (desoxicitosina nucleosido trifosfato) y dGTP (desoxiguanosina nucleosido trifosfato). Los ribonucleotido trifosfatos preferidos son UTP, ATP, CTP y GTP. Sin embargo son posibles alternativas. Pueden ser de origen natural o no natural. Tambien puede proporcionarse un 30 tampon del tipo generalmente usado en las reacciones de la PCR.
[0050] Para incorporar nucleotidos durante la extension de los cebadores se usa una polimerasa de acido nucleico que es preferentemente estable en las condiciones de reaccion pertinentes para que pueda utilizarse varias veces. (Esto es particularmente util en procedimientos de amplificacion automaticos). Por tanto, cuando se usa
35 calentamiento para separar de su molde una cadena de acido nucleico recien sintetizada, es preferible que la polimerasa de acido nucleico sea termoestable a la temperatura utilizada. Los expertos en la tecnica conocen dichas polimerasas termoestables. Estas polimerasas pueden obtenerse de microorganismo termofilos y se incluye la ADN polimerasa dependiente de ADN conocida como Taq polimerasa y tambien sus derivados termoestables. (Sin embargo, no es necesario que la polimerasa de acido nucleico sea dependiente de ADN y puede ser dependiente de 40 ARN. Por tanto puede ser una transcriptasa inversa, es decir, una ADN polimerasa dependiente de ARN).
[0051] Generalmente, el apareamiento de un cebador con su molde tiene lugar a una temperatura de 25 a 90 °C. Dicho intervalo de temperatura normalmente se mantendra durante la extension del cebador. Una vez transcurrido un tiempo suficiente como para permitir el apareamiento y tambien para permitir un grado de extension del cebador
45 deseado, la temperatura puede aumentarse, si se desea, para permitir la separacion de la cadena. En esta fase la temperatura se aumentara generalmente a una temperatura de 60 a 100°C. (Tambien se pueden utilizar temperaturas elevadas para reducir problemas de cebado no espedficos antes del apareamiento). Estas se pueden utilizar para controlar el tiempo de inicio de la colonia, por ejemplo, para sincronizar el inicio de la colonia para diversas muestras. Como alternativa, las cadenas pueden separarse por tratamiento con una solucion de baja 50 salinidad y alto pH (>12) o utilizando una sal caotropica (por ejemplo clorhidrato de guanidio) o mediante un disolvente organico (por ejemplo formamida).
[0052] Despues de la separacion de la cadena (por ejemplo, por calentamiento), se realizara preferentemente una etapa de lavado. La etapa de lavado puede omitirse entre rondas de apareamiento iniciales, extension del cebador y
55 separacion de la cadena, y si se desea, para mantener los mismos moldes cerca de los cebadores inmovilizados. Esto permite utilizar los moldes varias veces para iniciar la formacion de la colonia. (Es preferible proporcionar una alta concentracion de moleculas molde inicialmente para que se inicien muchas colonias en una fase).
[0053] El tamano de las colonias puede controlarse, por ejemplo, controlando el numero de ciclos de 60 apareamiento, extension de cebador y separacion de cadenas que se producen. Tambien pueden controlarse otros
factores que afectan al tamano de las colonias. Estos incluyen el numero y la disposicion sobre una superficie de cebadores inmovilizados, la conformacion de un soporte sobre el cual se inmovilizan los cebadores, la longitud y rigidez del molde y/o de las moleculas cebadoras, la temperatura y la fuerza ionica y la viscosidad de un fluido en el que se pueden realizar los ciclos mencionados anteriormente.
Usos de las colonias
[0054] Una vez que se han formado las colonias estas se pueden utilizar para cualquier proposito deseado.
5 [0055] Por ejemplo, se pueden utilizar en la secuenciacion de acido nucleico (ya sea parcial o completa), en diagnostico, en exploracion, como soportes para otros componentes y/o con fines de investigacion (los usos preferidos se describiran con detalle mas adelante). Si se desea, las colonias pueden modificarse para proporcionar diferentes colonias (denominadas en el presente documento “colonias secundarias” para diferenciarlas de las “colonias primarias” inicialmente formadas).
10
Superficies que comprenden cadenas de acido nucleico inmovilizadas
[0056] Una superficie que comprende cadenas de acido nucleico inmovilizadas en forma de colonias de moleculas de acido nucleico monocatenario tambien se incluye en el ambito de la presente invencion.
15
[0057] Normalmente cada cadena de acido nucleico inmovilizada dentro de una colonia se localizara en la superficie de tal manera que una cadena de acido nucleico inmovilizada y complementaria a la misma se localiza en la superficie a una distancia de la longitud de dicha cadena de acido nucleico inmovilizada (es decir, en la longitud de la molecula). Esto permite proporcionar cadenas de acido nucleico y sus complementarias a muy alta densidad
20 en forma inmovilizada. Preferentemente seran proporciones sustancialmente iguales a las de una cadena de acido nucleico determinada y su complementaria dentro de una colonia. Preferentemente, dentro de la colonia, una cadena de acido nucleico y su complementaria se distribuiran sustancialmente de manera homogenea.
[0058] Tambien es posible proporcionar una superficie que comprenda cadenas de acido nucleico monocatenario 25 en forma de colonias, en las que, en cada colonia, las cadenas sencillas codificantes y no codificantes se
proporcionen en una forma tal que las dos cadenas ya no son en absoluto complementarias, o sean simplemente en parte complementarias. Dichas superficies tambien se incluyen en el ambito de la presente invencion. Normalmente, dichas superficies se obtienen despues de tratar colonias primarias, por ejemplo, por digestion parcial con enzimas de restriccion o por digestion parcial despues de la separacion de las cadenas (por ejemplo, despues de 30 calentamiento) mediante una enzima que digiere ADN monocatenario, o por medios qmmicos o ffsicos (por ejemplo, irradiando con luz colonias que se han tenido con un colorante intercalante, por ejemplo, bromuro de etidio).
[0059] Una vez proporcionadas las colonias monocatenarias, estas se pueden utilizar para proporcionar moleculas bicatenarias. Esto se puede realizar, por ejemplo, proporcionando un cebador adecuado (preferentemente en
35 solucion) que se hibrida a los extremos 3' de moleculas monocatenarias inmovilizadas y despues extendiendo ese cebador utilizando una polimerasa de acido nucleico y un aporte de nucleosido trifosfatos (u otros precursores nucleotidicos).
[0060] Por tanto, las superficies que comprenden colonias de moleculas de acido nucleico monocatenario que no 40 tienen puente tambien se encuentran dentro del ambito de la presente invencion. (La expresion “que no tienen
puente” se utiliza en el presente documento para indicar que las moleculas no tienen forma de estructuras de tipo puente como las mostradas, por ejemplo, en la figura 1h).
[0061] Utilizando la presente invencion, se pueden proporcionar pequenas colonias que contienen grandes 45 cantidades de moleculas de acido nucleico (bien mono o bicatenario). Por lo tanto, muchas colonias pueden
localizarse sobre una superficie que tenga un area pequena. Por tanto, las densidades de colonias que se pueden obtener pueden ser muy altas, como se ha indicado anteriormente.
[0062] Generalmente, diferentes colonias comprenderan diferentes cadenas de acido nucleico amplificadas y 50 cadenas complementarias amplificadas de las mismas. Por tanto, la presente invencion permite colocar muchas
poblaciones de moleculas de acido nucleico amplificado diferentes y sus complementos en una sola superficie que tenga un area de superficie relativamente pequena. La superficie sera normalmente plana, aunque esto no es esencial.
55 Aparatos
[0063] La presente invencion tambien proporciona un aparato para proporcionar una superficie que comprende colonias de las moleculas de acido nucleico inmovilizadas indicadas anteriormente.
60 [0064] Dicho aparato puede incluir uno o mas de lo siguiente:
a) medios para inmovilizar cebadores en una superficie (aunque esto no es necesario si ya se han proporcionado cebadores inmovilizados);
65 b) un aporte de una polimerasa de acido nucleico;
c) un aporte de precursores de los nucleotidos a incorporar en un acido nucleico (por ejemplo, un aporte de nucleosido trifosfatos);
d) medios para separar acidos nucleicos apareados (por ejemplo, medios de calentamiento);
5 y
e) medios de control para coordinar las diferentes etapas requeridas para el metodo de la presente invencion.
[0065] Otros aparatos se encuentran dentro del ambito de la presente descripcion. Estos permiten analizar los 10 acidos nucleicos inmovilizados producidos mediante el metodo de la presente invencion. Esto puede incluir una
fuente de reactantes y medios de deteccion para detectar una senal que pueda generarse una vez que uno o mas reactantes se han aplicado a las moleculas de acido nucleico inmovilizadas. Esto tambien puede proporcionarse con una superficie que comprenda moleculas de acido nucleico inmovilizadas en forma de colonias, como se describe anteriormente.
15
[0066] A ser posible el medio para detectar una senal tiene suficiente resolucion para permitir que diferencie entre senales generadas de diferentes colonias.
[0067] Los aparatos de la presente descripcion (de cualquiera naturaleza) se proporcionan preferentemente en 20 forma automatizada de tal manera que una vez que se han activado, puedan repetirse etapas de procesos
individuales automaticamente.
[0068] La presente invencion se describira ahora sin limitacion de la misma en las siguientes secciones A a I con referencia a los dibujos acompanantes.
25
[0069] Debe apreciarse que los procedimientos que utilizan las moleculas de ADN referidas en estas secciones son aplicables, con los cambios debidos, a moleculas de ARN, a menos que el contexto indique otra cosa.
[0070] Tambien debe apreciarse que cuando se proporcionan secuencias en la siguiente descripcion, estas se 30 escriben en direccion 5' a 3' (de izquierda a derecha), a menos que el contexto indique otra cosa.
[0071] Las figuras proporcionadas se resumen a continuacion:
La FIGURA 1 ilustra un metodo de amplificacion e inmovilizacion simultanea de moleculas de acido nucleico 35 utilizando un solo tipo de cebador.
La FIGURA 2 ilustra como puede producirse el crecimiento de colonias utilizando un metodo de la presente invencion.
40 La FIGURA 3 ilustra el principio del metodo utilizado para producir colonias de ADN utilizando la presente invencion. Tambien ilustra las etapas de apareamiento, alargamiento y desnaturalizacion que se utilizan para proporcionar dichas colonias.
La FIGURA 4 es un ejemplo de colonias de ADN formadas por amplificacion de un molde espedfico con 45 cebadores sencillos injertados en una superficie.
La FIGURA 5 ilustra un metodo de amplificacion e inmovilizacion simultanea de moleculas de acido nucleico utilizando dos tipos de cebadores.
50 La FIGURA 6 muestra colonias de ADN reales producidas mediante la presente invencion.
La FIGURA 7 ilustra un metodo de amplificacion e inmovilizacion simultanea de moleculas de acido nucleico cuando se utiliza, como molde, una molecula diana que tiene secuencias internas que se aparean con cebadores.
55
La FIGURA 8 ilustra un metodo para sintetizar copias adicionales de las cadenas de acido nucleico originales utilizando cadenas de acido nucleico presentes en colonias. Las cadenas recien sintetizadas se muestran en solucion pero si se desea pueden proporcionarse en forma inmovilizada.
60 La FIGURA 9 muestra la amplificacion por PCR de ADN de ADN encontrado en colonias de ADN previamente formadas.
La FIGURA 10 ilustra como pueden generarse cebadores secundarios a partir de colonias de ADN.
65 La FIGURA 11 ilustra como pueden generarse colonias de ADN secundarias a partir de cebadores secundarios.
9
La FIGURA 12 ilustra como pueden generarse cebadores con diferentes secuencias a partir de una superficie funcionalizada con cebadores existentes.
La FIGURA 13 representa metodos de preparacion de fragmented de ADN adecuados para la generacion de 5 colonias de ADN.
La FIGURA 14 ilustra un metodo para sintetizar ARNc utilizando la colonia de ADN como un sustrato para la ARN polimerasa.
10 La FIGURA 15 ilustra un metodo preferible para determinar la secuencia de ADN de ADN presente en colonias individuales.
La FIGURA 16 ilustra un metodo de determinacion de la secuencia de una colonia de ADN, de novo.
15 La FIGURA 17 ilustra la utilidad de colonias de ADN secundarias en el ensayo de niveles de expresion de ARNm.
Las FIGURAS 18 y 19 ilustran el uso de colonias de ADN secundarias en el aislamiento e identificacion de genes expresados nuevos y poco frecuentes.
20
A) Esquema que muestra la amplificacion e inmovilizacion simultanea de moleculas de acido nucleico utilizando un solo tipo de cebador
[0072] En relacion ahora con la Figura 1a), se proporciona una superficie que tiene unida a la misma una 25 pluralidad de cebadores (para simplificar solo se muestra un cebador). Cada cebador (1) esta unido a la superficie
mediante un enlace indicado por un bloque de color oscuro. Este enlace puede ser covalente o no covalente pero debe ser suficientemente fuerte como para mantener un cebador en su sitio en la superficie. Se muestran cebadores que tienen una secuencia de nucleotidos corta (5'-ATT). Sin embargo, en la practica podnan proporcionarse generalmente secuencias mas largas.
30
[0073] La Figura 1b) muestra una molecula diana (II) que se ha apareado con un cebador. La molecula diana comprende en su extremo 3' una secuencia (5'-ATT) que es complementaria a la secuencia cebadora (5'-ATT). En su extremo 5' la molecula diana comprende una secuencia (5'-ATT) que es igual que la secuencia cebadora (aunque no se requiere una identidad exacta).
35
[0074] Entre los dos extremos puede proporcionarse cualquier secuencia a amplificar (o la complementaria de cualquier secuencia a amplificar). Como ejemplo, parte de la secuencia a amplificar se muestra como 5'-CCG.
[0075] En la Figura 1c) se muestra una extension de cebador. En este caso se utiliza una ADN polimerasa junto 40 con dATP, dTTP, dGTP y dCTP para extender el cebador (5'-ATT) desde su extremo 3', utilizando como molde la
molecula diana.
[0076] Cuando la extension del cebador es completa, como se muestra en la Figura 1d), puede observarse que se proporciona una cadena extendida inmovilizada (III) que es complementaria a la molecula diana. Despues, la
45 molecula diana puede separarse de la cadena inmovilizada extendida (por ejemplo, por calentamiento, como se muestra en la Figura 1e)). Esta etapa de separacion libera la cadena extendida, inmovilizada, de tal manera que despues se pueda utilizar para iniciar una ronda posterior de extension de cebador, como se muestra en las figuras 1f) y 1g). En este caso, la cadena extendida inmovilizada se dobla de tal manera que un extremo de esta cadena (que tiene la secuencia terminal 5'-AAT) se aparea con otro cebador (2, 5'-ATT), como se muestra en la Figura 1f). 50 Este cebador proporciona un extremo 3' a partir del cual puede producirse la extension del cebador, esta vez utilizando como molde la cadena inmovilizada, extendida. En la Figura 1g) se muestra que se esta produciendo la extension del cebador y en la Figura 1h) que esta esta finalizando.
[0077] La Figura 1i) muestra las dos cadenas inmovilizadas extendidas que se mostraron en la Figura 1h) despues 55 de su separacion (por ejemplo, por calentamiento). Despues, cada una de estas cadenas puede en sf misma
utilizarse como moldes en rondas posteriores de extension de cebador iniciada a partir de nuevos cebadores (3 y 4), como se muestra en las Figuras 1j) y 1k). Despues de dos rondas de amplificacion se pueden proporcionar cuatro cadenas inmovilizadas monocatenarias seguido de una etapa de separacion de cadenas (por ejemplo, por calentamiento), como muestra en la Figura 11). Dos de estas tienen secuencias correspondientes a la secuencia de 60 la molecula diana originalmente utilizada como un molde. Las otras dos tienen secuencias complementarias a la secuencia de la molecula diana originalmente utilizada como un molde. (En la practica una cadena inmovilizada determinada y su complementaria inmovilizada pueden aparearse a la vez).
[0078] Se apreciara por tanto que una secuencia determinada y su complementaria pueden proporcionarse en las 65 mismas cantidades en forma inmovilizada y que pueden distribuirse sustancialmente de manera homogenea dentro
de una colonia.
[0079] Por supuesto, se pueden realizar rondas de amplificacion posteriores ademas de las mostradas en la Figura 1, de tal manera que puedan proporcionarse colonias que comprendan grandes cantidades de una molecula
5 de acido nucleico monocatenario determinada y una cadena complementaria a la misma. Unicamente es necesario utilizar un solo molde para iniciar cada colonia, aunque, si se desea, se puede volver a utilizar un molde para iniciar varias colonias.
[0080] Se apreciara que la presente invencion permite proporcionar densidades muy altas de moleculas de acido 10 nucleico extendidas, inmovilizadas. Dentro de una colonia cada molecula extendida, inmovilizada se localizara en
una superficie dentro de una longitud de molecula de otra molecula inmovilizada extendida. Por tanto, la posicion 3 mostrada en la Figura 11) esta dentro de una longitud de molecula de posicion 1; la posicion 1 esta dentro de una longitud de molecula de posicion 2; y la posicion 2 esta dentro de una longitud de molecula de posicion 4.
15 [0081] La Figura 2 se proporciona para ilustrar como puede producirse el crecimiento de colonias (utilizando el metodo descrito con referencia a la figura 1 y a la figura 6 o a cualquier metodo de la presente invencion para proporcionar moleculas de acido nucleico inmovilizadas).
[0082] Se muestra una vista esquematica en planta de una placa plana que tiene cebadores inmovilizados sobre la 20 misma en un diseno de rejilla cuadrada (los cebadores se indican mediante puntos pequenos). Se utiliza una rejilla
regular exclusivamente por una cuestion de sencillez: en muchos casos reales, las posiciones de los cebadores debenan de hecho estar menos ordenadas o al azar.
[0083] En la posicion indicada con una flecha X una molecula molde se ha apareado con un cebador y se ha 25 producido un trozo inicial de extension de cebador para proporcionar una cadena de acido nucleico extendida,
inmovilizada. Despues de la separacion de las cadenas, un extremo de esta cadena se queda libre para aparearse con cebadores adicionales de tal manera que pueden producirse otras cadenas de acido nucleico extendidas, inmovilizadas. Se muestra que esto se ha producido secuencialmente en las posiciones indicadas por la letra Y. Por una cuestion de sencillez, el cebador seleccionado para el apareamiento esta ubicado cerca del cebador que lleva la 30 cadena de acido nucleico: en casos reales, la cadena de acido nucleico se apareana con un cebador que no es el vecino mas cercano. Sin embargo, es obvio que este cebador estara a una distancia igual a la longitud de la cadena de acido nucleico.
[0084] Se apreciara que, para que se produzca el crecimiento celular de la colonia, solo se requiere el 35 apareamiento en una de estas posiciones (en lugar de en todas).
[0085] Despues de haberse proporcionado otras moleculas de acido nucleico monocatenario, extendidas, inmovilizadas, en las posiciones indicadas con la letra Y, las moleculas resultantes pueden de por sf aparearse con otros cebadores y el proceso puede continuar para proporcionar una colonia que comprenda una gran cantidad de
40 moleculas de acido nucleico inmovilizadas en un area relativamente pequena.
[0086] La Figura 3 muestra una version simplificada del ciclo de apareamiento, alargamiento y desnaturalizacion. Tambien representa las observaciones tfpicas que se pueden hacer, como se puede observar en los ejemplos mostrados en las figuras 4 y 6. La amplificacion e inmovilizacion simultanea de los acidos nucleicos utilizando
45 cebadores en fase solida se ha realizado satisfactoriamente utilizando el procedimiento descrito en los Ejemplos 1, 2 y 3 mas adelante:
EJEMPLO 1
50 [0087] Se injertaron oligonucleotidos, fosforilados en su extremo 5' (Microsynth GmbH, Suiza), en pocillos de microtitulacion de plastico Nucleolink (Nunc, Roskilde, Dinamarca). La secuencia del oligonucleotido p57 corresponde a la secuencia 5'-TTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC y la de p58 corresponde a la secuencia 5'-TTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG. Los pocillos de microtitulacion con p57 o p58 se prepararon de la siguiente manera. A cada pocillo Nucleolink, se anadieron 30 |il de una solucion del oligonucleotido 160nM en 155 metil-imidazol 10 mM (pH 7,0) (Sigma Chemicals, St.Louis, MO). A cada pocillo, se anadieron 10 |il de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida 40 mM (pH 7,0) (Sigma Chemicals) en 1-metil-imidazol 10 mM a la solucion de oligonucleotidos. Despues, los pocillos se cerraron y se incubaron a 50 °C durante una noche. Despues de la incubacion; los pocillos se lavaron dos veces con 200 |il de RS (NaOH 0,4 N, Tween 20 al 0,25 % (Fluka Chemicals, Suiza)), se incubaron durante 15 minutos con RS 200 |il RS, se lavaron dos veces con RS 200 |il y dos veces con 60 TNT (TrisHCl 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1 %) 200 |il. Los tubos se secaron a 50 °C y se guardaron en una bolsa de plastico cerrada a una temperatura de 4 °C.
[0088] La generacion de las colonias se inicio en cada pocillo con 15 |il de mezcla de cebado; 1 nanogramo de AdN molde (en el que el ADN molde comienza con la secuencia 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG y finaliza
en el extremo 3' con la secuencia CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT-3'), los cuatro dNTP (0,2 mM), BSA (albumina de suero bovino, Boehringer-Mannheim, Alemania) al 0,1 %, Tween 20 al 0,1 %, DMSO (dimetilsulfoxido, Fluka Chemicals, Suiza) al 8 %, tampon para PCR 1X Amplitaq y 0,025 unidades/|il de ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA). La reaccion de cebado fue una sola ronda de PCR en las siguientes condiciones: 94 °C 5 durante 4 minutos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 45 segundos en un termociclador (PTC 200, MJ Research, Watertown, MA). Despues se utilizo tampon TE (trisHCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) 100 |il en tres lavados sucesivos de un minuto de duracion a 94 °C. Despues, las colonias de ADN se formaron anadiendo a cada pocillo, 20 |il de mezcla de polimerizacion, que era identica a la mezcla de cebado pero que carecfa de ADN molde. Despues, los pocillos se colocaron en el termociclador PTC 200 y el crecimiento de las colonias se realizo mediante 10 incubacion de los pocillos cerrados durante 4 minutos a 94 °C y ciclado durante 50 repeticiones a las siguientes condiciones: 94 °C durante 45 segundos, 65 °C durante 2 minutos, 72 °C durante 45 segundos. Despues de finalizar este programa, los pocillos se mantuvieron a 8° C hasta su uso posterior.
[0089] Se amplifico por PCR un fragmento de 640 pares de bases correspondiente a la secuencia central del 15 molde (pero que no inclrna la secuencia 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG). PCR. El fragmento aislado se
marco con biotina-N4-dCTP (NEN Life Sciences, Boston, MA) y una traza de [a-32P]dCTP (Amersham, UK) utilizando el kit de marcaje Primet-it II (Stratagene, San Diego, CA) para generar una sonda marcada con biotina.
[0090] La sonda marcada con biotina se diluyo en una concentracion de 2,5 nM en EasyHyb (Boehringer- 20 Mannheim, Alemania) y 15 |il se hibridaron en cada muestra con el siguiente esquema de temperatura
(termociclador PTC 200): 94 °C durante 5 minutos, seguido de 500 etapas de disminucion de 0,1 °C de temperatura cada 12 segundos (en otras palabras, la temperatura e redujo a 45 °C en 100 minutos). Despues, las muestras se lavaron de la siguiente manera; 1 vez con 2X SSC/SDS al 0,1 % (2X SSC; Na-Cl 0,3 M/citrato de sodio 0,03 M pH 7,0/dodecil sulfato sodico 0,001 mg/ml) a temperatura ambiente, una vez con 2X SSC/SDS al 0,1 % a 37 °C y una 25 vez con 0,2X SSC/SDS al 0,1 % a 50 °C. Despues, los pocillos se incubaron durante 30 minutos con 50 |il de fluorescente rojo, se cubrieron con Neutravidina, FluoSpheres(R) 40 nm (excitacion a 580 nm y emision a 605 nm, Molecular Probes Inc., Eugene, OR) en TNT/BSA al 0,1 %. (La solucion de microesferas se preparo a partir de una dilucion de 2 |il de la solucion de reserva de microesferas en 1 ml de TNT/BSA al 0,1 %, que despues se sometio a ultrasonidos durante 5 minutos en un bano de agua ultrasonido a 50 W (Elgasonic, Suiza), seguido por filtracion a 30 traves de un filtro de 0,22 |im (Millex GV4). Despues, los pocillos se contaron (Cherenkov) en un contador de centelleo de placa Microbeta (WALLAC, Turku, Finlandia).
[0091] Las FluoSpheres(R) sobrantes se retiraron mediante lavado durante 30 min en TNT/BSA al 0,1 % a temperatura ambiente. Se observaron imagenes de las muestras tenidas utilizando un objetivo de 20X en un
35 microscopio invertido (Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania) equipado con una camara CCD Micromax512x768 (Princeton instruments, Trenton, NJ) a traves de un conjunto de filtros XF43 (PB546/FT580/LP590, Omega Optical, Brattleboro, VT) con una exposicion de 5 segundos.
[0092] La Figura 4 muestra los resultados de hibridacion de la generacion de colonias en tubos funcionalizados 40 con cualquiera de: (a) el oligonucleotido p57 o (b) el oligonucleotido p58. La reaccion de control muestra manchas
muy poco fluorescentes, ya que la secuencia de las regiones flanqueantes en el molde no corresponden a las secuencias cebadoras injertadas sobre el pocillo. En cambio, la figura 4b muestra el numero de manchas fluorescentes detectado cuando los cebadores injertados en los pocillos se corresponden con las secuencias flanqueantes en el molde iniciador de ADN. Calculando el numero de manchas fluorescentes detectado y teniendo 45 en cuenta el aumento, se puede estimar que hay entre 3 y 5 x 107 colonias/cm2. Las fotograffas se generaron con el programa Winview 1.6.2 (Princeton Instruments, Trenton, NJ) con fondos e intensidades normalizados a los mismos valores.
B) Esquema que muestra la amplificacion e inmovilizacion simultanea de moleculas de acido nucleico 50 utilizando dos tipos diferentes de cebadores
[0093] Referente ahora a la Figura 5, se ilustra otra realizacion de la presente invencion. En esta realizacion, se utilizaron dos cebadores diferentes inmovilizados para proporcionar la extension del cebador.
55 [0094] En esta realizacion la molecula diana mostrada se proporciona con una secuencia de nucleotidos en su extremo 3' (AAT-3') que es complementaria a la secuencia de un primer cebador, (5'-ATT, I), que se injerta en la superficie, de manera que puede producirse el apareamiento con ese cebador. La secuencia (5'-GgT) en el extremo 5' de la molecula diana, III, corresponde a la secuencia (5'-GGT) de un segundo cebador, II, que tambien se injerta en la superficie, de tal manera que la secuencia que es complementaria a la secuencia en el extremo 5' puede 60 aparearse con este dicho segundo cebador. Generalmente dicha secuencia complementaria (5'-ACC) se selecciona de tal manera que no se aparee con el primer cebador (5'-ATT). A pesar de la situacion descrita en el apartado A, una vez que el extremo 3' de una cadena recien sintetizada se aparea con un cebador en la superficie, tendra que encontrar un cebador cuya secuencia sea diferente de la de la secuencia que lleva en su extremo 5' (vease la diferente entre las figuras 1f y 5f).
[0095] La realizacion mostrada en la figura 5 tiene una ventaja sobre la realizacion ilustrada en la figura 1 ya que la posibilidad de que un extremo de una molecula diana monocatenaria se aparee con otro extremo de la misma molecula en solucion puede evitarse y por lo tanto la amplificacion puede seguir adelante. La posibilidad de que se produzca el apareamiento entre ambos extremos de un complemento inmovilizado a una molecula diana tambien
5 puede evitarse.
EJEMPLO 2
[0096] Una mezcla de dos oligonucleotidos que estaban fosforilados en el extremo 5' ((Microsynth GmbH, 10 Balgach, Suiza) se injerto en placas Nucleolink de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) segun recomendaciones del
fabricante. Las placas resultantes se conservaron en seco a una temperatura de 4 °C. La secuencia del cebador, P1, era 5'-GCGCGTAATACGACTCACTA, la secuencia del otro cegador, P2, era 5'-CGCAATTAACCCTCACTAAA. Estas placas se formularon especialmente en Nunc, y permiten el injerto covalente de fragmentos de ADN fosforilados en el extremo 5' a traves de un procedimiento estandar.
15
[0097] Se clono un molde en un vector (pBlueScript Skminus, Stratagene Inc, San Diego, CA) con la secuencia de ADN apropiada en el sitio de clonacion (es decir, correspondiente a P1 y P2 en la posicion 621 y 794 respectivamente) y se obtuvo un molde de ADN bicatenario lineal de 174 pb de longitud mediante amplificacion por PCR, utilizando P1 y P2. El producto PCR molde se purifico en columnas Qiagen Qia-quick (Qiagen GmbH, Hilden,
20 Alemania) para retirar los nucleotidos y los cebadores utilizados durante la amplificacion PCR.
[0098] El molde purificado (en una solucion de 50 |il que contema tampon 1X PCR (Perkin Elmer, Foster City, CA) con los cuatro desoxirrubonucleosido trifosfatos (dNTP) a 0,2 mM (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y 2,5 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Foster City, CA)) se disperso en el soporte, es decir, sobre las placas
25 Nucleolink injertadas con P1 y P2 (las placas se habfan lavado con una solucion que contema TRIS-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,1 % (Fluka, Suiza) a temperatura ambiente durante 15 min). Esta solucion se incubo a 93 °C durante 9 minutos para activar la ADN polimerasa y despues se realizaron 60 ciclos (94 °C/30 s; 48 °C/ 30 s; 72 °C/30 s) en un termociclador PTC 200. Se analizaron diversas concentraciones diferentes de molde PCR (aproximadamente 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 ng/|il) y para cada muestra se realizo una reaccion de control 30 efectuada sin Taq polimerasa (las mismas condiciones que las anteriores pero sin ADN polimerasa).
[0099] Cada muestra se tino con YO-PRO (Molecular Probes, Portland OR), un tinte altamente sensible para el ADN bicatenario. Los productos resultantes se observaron con un microscopio confocal utilizando un objetivo de 40X (LSM 410, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania) con excitacion apropiada (un laser de argon 488) y filtros de
35 deteccion (un filtro de paso bajo 510) (nota: el fondo de cada pocillo es plano y permite la observacion con un microscopio de fluorescencia invertido).
[0100] En la Figura 6A, el pocillo de control (sin molde de ADN anadido, panel a) muestra unicamente objetos extranos que pueden observarse en una superficie de color blanco (estos objetos eran utiles en esta fase para
40 indicar que el foco era correcto). Estos objetos teman una forma irregular, un tamano de 20 a 100 micrometros y teman un grosor mucho mas grande que la profundidad del campo de observacion. En un pocillo donde habfa ADN polimerasa (figura 6A, panel ii), ademas de los objetos de forma irregular observados en el pocillo control, se observo una gran cantidad de manchas fluorescentes. Estas presentaban una forma circular, teman un tamano de 1 a 5 micrometros y no ocupaban el campo visual. El numero de manchas dependfa de la concentracion del molde 45 utilizado para iniciar la formacion de colonias. A partir del tamano observado de las colonias, se puede estimar que pueden disponerse mas de 10.000 colonias distintas dentro de 1 mm2 de soporte.
EJEMPLO3
50 [0101] Se injertaron oligonucleotidos (Microsynth GmbH, Suiza) en pocillos Nucleolink (Nunc, Dinamarca). El oligonucleotido P1 corresponde a la secuencia 5'-TTTTTTCTCACTATAGGGCGAATTGG y el oligonucleotido P2 corresponde a 5'-TTTTTTCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGG. A cada pocillo Nucleolink, se anadio una solucion de 45 |il de 1-metil-imidazol 10 mM (pH 7,0) (Sigma Chemicals, St.Louis, MO) que contema 360 fmol de P1 y 360 fmol de P2. A cada pocillo, a la solucion de oligonucleotidos, se anadieron 15 |il de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)- 55 carbodiimida 40 nM (pH 7,0) (Sigma Chemicals) en 1-metil-imidazol. Despues, los pocillos se cerraron y se incubaron a 50 °C durante 16 horas.
[0102] Despues de la incubacion, los pocillos se aclararon dos veces con RS 200 |il (NaOH 0,4 N, Tween 20 al 0,25 %), se incubaron durante 15 minutos con RS 200 |il, se lavaron dos veces con RS 200 |il, y dos veces con TNT
60 (Tris/HCl 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1 %) 200 |il, antes de ponerlos a secar a 50 °C en un horno. Los tubos secos se guardaron en una bolsa de plastico cerrada a una temperatura de 4 °C.
[0103] El crecimiento de las colonias se inicio en cada pocillo con 15 |il de mezcla de inicio (tampon PCR 1X, los dNTP 0,2 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold, 20 nanogramos de ADN molde, en el que el
molde de ADN era ADN S1 o ADN S2 o una mezcla de diferentes proporciones de ADN S1 y ADN S2, como se indica en el comentario de la figura 6B. S1 y S2 son fragmentos de 704 y 659 pares de bases, respectivamente, que se han clonado en los plasmidos pBlue-Script Skminus y posteriormente amplificados a traves de una PCR utilizando P1 y P2 como cebadores. Los fragmentos se purificaron en columnas Qia-quick de Qiagen (QIAGEN 5 GmbH, Alemania) para retirar los nucleotidos y los cebadores.
[0104] Cada pocillo se cerro con Cycleseal™ (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA), y se incubo a 93 °C durante 9 minutos, a 65 °C durante 5 minutos y a 72 °C durante 2 minutos y de nuevo a 93 °C. Despues, se utilizo una solucion de TNT 200 |il en tres lavados sucesivos un minuto de duracion a 93 °C. La mezcla de inicio se
10 reemplazo despues por mezcla de crecimiento 15 |il (la misma que la mezcla de inicio, pero sin ADN molde), y el crecimiento se realizo incubando los pocillos sellados durante 9 minutos a 93 °C y repitiendo 40 veces las siguientes condiciones: 93 °C durante 45 segundos, 65 °C durante 3 minutos, 72 °C durante 2 minutos. Despues de finalizar este programa, los pocillos se conservaron a 6 °C hasta su utilizacion. El control de la temperatura se realizo en un termociclador PTC 200, utilizando una almohadilla de silicio proporcionada en el kit Nucleolink y la placa se calento 15 (104 °C) en el termociclador PTC 200.
[0105] Por PCR se amplifico un fragmento de 640 pares de bases correspondiente a la secuencia central del fragmento S1, pero que no inclrna la secuencia P1 o P2, como se ha descrito anteriormente. La sonda se marco con biotina-16-dUTP (Boehringer-Mannheim, Alemania) utilizando el kit de marcaje de cebadores al azar Prime-it II
20 (Stratagene, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[0106] Las sondas marcadas con biotina se hibridaron con las muestras en tampon EasyHyb (Boehringer- Mannheim, Alemania), utilizando el siguiente esquema de temperatura (en el termociclador PTC 20): 94 °C durante 5 minutos, seguido de 68 etapas de disminucion de 0,5 °C de temperatura cada 30 segundos (en otras palabras, la
25 temperatura disminuyo a 60 °C en 34 minutos), utilizando pocillos cerrados. Despues, las muestras se lavaron 3 veces con 200 |il de TNT a temperatura ambiente. A continuacion, los pocillos se incubaron durante 30 minutos con TNT 50 |il que contema BSA 0,1 mg/ml. Despues, los pocillos se incubaron durante 5 minutos con 15 |il de solucion de fluorescente rojo, se cubrieron con Neutravidina, FluoSpheres(R) 40 nm (excitacion a 580nm y emision a 605 nm, Molecular Probes, Portland, OR). La solucion de microesferas se preparo a partir de una dilucion de 2 |il de la 30 solucion de reserva de microesferas, que se habfa sometido a ultrasonido durante 5 minutos en un bano de agua ultrasonido a 50 W (Elgasonic, Suiza), diluido en 1 ml de solucion TNT que contema BSA 0,1 mg/ml y se filtro con un filtro de tamano de poro de 0,22 |im Millex GV4 (Millipore, Bedford, MA).
[0107] Las muestras tenidas se observaron utilizando un microscopio Axiovert 10 invertido utilizando un objetivo 35 de 20X (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania) equipado con una camara Micromax 512x768 CCD (Princeton
Instruments, Trenton, NJ), utilizando un conjunto de filtros XF43 (PB546/FT580/LP590, Omega Optical, Brattleboro, VT), y 10 segundos de recogida de luz. Los archivos se convirtieron a formato TIFF y se procesaron en el programa informatico adecuado (PhotoPaint, Corel Corp., Ottawa, Canada). El procesamiento consistfa en una potenciacion de inversion y contraste lineal, para proporcionar una imagen adecuada para una impresion en blanco y negro en 40 una impresora laser.
[0108] La figura 6B muestra los resultados de 3 proporciones diferentes de los moldes S1/S2 utilizados en la
reaccion de inicio: i) la proporcion de S1/S2 es de 1/0, pueden observarse muchas manchas, ii) la proporcion de
S1/S2 es de 1/10, y el numero de manchas es de aproximadamente 1/10 del numero de manchas que se puede
45 observar en la imagen i), como se esperaba y iii) la proporcion S1/S2 es de 0/1, y solo pueden observarse algunas manchas poco frecuentes.
Esquema que muestra la amplificacion e inmovilizacion simultanea de moleculas de acido nucleico cuando la molecula diana contiene secuencias internas complementarias a los cebadores inmovilizados
50
[0109] La Figura 7 se proporciona para mostrar que no es necesario que las secuencias mostradas en los
extremos 5' y 3' de la molecula diana ilustrada en las Figuras 1 y 5 se localicen en los extremos de una molecula
diana.
55 [0110] Una molecula de acido nucleico diana (II) puede tener una secuencia en cada (o en cualquier) extremo que no este implicada en el apareamiento con un cebador ni actue como molde para proporcionar una secuencia complementaria que se aparee con un cebador (secuencia 5'-AAA y secuencia 5'-CCC). Una de las secuencias internas (5'-AAT) se utiliza como molde para sintetizar una secuencia complementaria, III, a la misma (5'-TTT) como se desprende de las figuras 7(a) a 7(e).
60
[0111] Sin embargo, la propia secuencia 5'-TTT no se utiliza para proporcionar una secuencia complementaria a la misma, como se desprende de las figuras 7(f) a 7(k). En la Figura 7(I) se puede observar que solo una de las cuatro cadenas inmovilizadas se muestran despues de dos rondas de extension con cebadores y que una etapa de separacion de cadenas comprende la secuencia adicional 5'-TTT y que no hay ninguna cadena que comprenda una
secuencia complementaria (5'-AAA) a esta secuencia (es dedr, solo hay una cadena que es significativamente mas larga que las otras). Despues de varias rondas de amplificacion la cadena que comprende la secuencia 5'-TTT representara una proporcion insignificativa del numero total de moleculas de acido nucleico extendidas, inmovilizadas presentes.
5
D) El uso de cadenas de acido nucleico presentes en colonias para sintetizar copias adicionales de cadenas de acido nucleico
[0112] Las moleculas de acido nucleico monocatenario, amplificadas, presentes en colonias proporcionadas por la 10 presente invencion se pueden en sf mismas utilizarse como moldes para sintetizar cadenas de acido nucleico
adicionales.
[0113] La Figura 8 ilustra un metodo para sintetizar acidos nucleicos adicionales utilizando acidos nucleicos inmovilizados como un punto de partida.
15
[0114] Las colonias normalmente comprenderan tanto una cadena de acido nucleico determinada como su complementaria en forma inmovilizada (figura 8a). Por tanto estas se pueden utilizar para proporcionar copias adicionales no solo en una cadena de acido nucleico determinada sino tambien de su complementaria.
20 [0115] Una manera de hacer esto es proporcionar uno o mas cebadores (cebadores TTA y TGG) en solucion que se apareen con cadenas de acido nucleico inmovilizadas, amplificadas, presentes en colonias (figura 8c) proporcionadas por la presente invencion. (Estos cebadores pueden ser los mismos que los cebadores inicialmente utilizados para proporcionar las colonias inmovilizadas, proporcionandose separados, en forma libre, en lugar de en forma inmovilizada). La colonia de ADN original esta desnaturalizada por calentamiento en su forma monocatenaria 25 (figura 8b), lo que permite que los cebadores TTA y TGG se apareen en el extremo 3' disponible de cada cadena de ADN. Despues, la extension con cebadores, utilizando ADN polimerasa AmpliTaq y los cuatro desoxirribonucleosido trifosfatos (marcados o no) se puede utilizar para sintetizar cadenas complementarias con cadenas de acido nucleico inmovilizadas o al menos con partes de las mismas (etapa (iii)).
[0116] Una vez sintetizadas las cadenas recien formadas (figura 8d) mediante el proceso descrito anteriormente, 30 estas pueden separarse de las cadenas inmovilizadas con las que estan hibridadas (por ejemplo, calentamiento). El
proceso puede repetirse si se desea utilizando la reaccion PCR, para proporcionar un gran numero de dichas cadenas en solucion (figura 8e).
[0117] Si se desea, las cadenas sintetizadas de esta manera, despues de la separacion de las cadenas 35 inmovilizadas, pueden aparearse entre sf (es decir una cadena determinada y su complementaria pueden aparearse
hibridarse) para proporcionar moleculas de acido nucleico bicatenarias en solucion. Como alternativa, pueden separarse entre sf para proporcionar poblaciones homogeneas de moleculas de acido nucleico monocatenario en solucion.
40 [0118] Tambien ha de observarse que, una vez proporcionadas las moleculas monocatenarias en solucion, estas se pueden utilizar como moldes para la PCR (o PCR inversa). Por lo tanto no es esencial continuar utilizando las cadenas de acido nucleico inmovilizadas para obtener una amplificacion adicional de cadenas determinadas o cadenas complementarias a las mismas.
45 [0119] Debe observarse que, cuando se proporciona una pluralidad de colonias y que las cadenas de acido nucleico en diferentes colonias tienen diferentes secuencias, es posible seleccionar solo determinadas colonias para su uso como moldes en la smtesis de moleculas de acido nucleico adicionales. Esto se puede realizar utilizando cebadores para la extension de cebadores que son espedficos para moleculas presentes en colonias seleccionadas.
50
[0120] Como alternativa pueden proporcionarse cebadores para permitir utilizar varias o todas las colonias como moldes. Dichos cebadores pueden ser una mezcla de muchos cebadores diferentes (por ejemplo, una mezcla de todos los cebadores originalmente utilizados para proporcionar todas las colonias, pero proporcionandose los cebadores en solucion en lugar de en forma inmovilizada).
55
EJEMPLO 4
[0121] Se injertaron oligonucleotidos Microsynth GmbH Balgach, Suiza) en pocillos Nucleolink (Nunc, Dinamarca). El oligonucleotido P1 corresponde a la secuencia 5'-TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC y el
60 oligonucleotido P2 corresponde a la 5-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG. En cada pocillo Nucleolink, se anadio una solucion de 45 |il de 1-metil-imidazol 10 mM (pH 7,0) (Sigma Chemicals) que contema 360 fmol de P1 y 360 fmol de P2. A cada pocillo, se anadieron 15 |il de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida 40 mM (pH 7,0) (Sigma Chemicals) en 1-metil-imidazol 10 mM a la solucion de oligonucleotidos. Despues los pocillos se cerraron y se incubaron a 50 °C durante 16 horas. Despues de la incubacion los pocillos se aclararon dos veces con 65 200 |il de RS (NaOH 0,4 N, Tween 20 al 0,25 %), se incubaron durante 15 minutos con RS 200 |il, se lavaron dos
15
veces con RS 200 |il, y dos veces con TNT (Tris 100 mM/HCl, pH 7,5, NaCI 150 mM, Tween 20 al 0,1 %) 200 |il, antes de ponerlos a secar en un horno a 50 °C. Los tubos secos se guardaron en una bolsa de plastico cerrada a una temperatura de 4 °C.
5 [0122] El crecimiento de las colonias se inicio en cada pocillo con 15 |il de mezcla de inicio (tampon PCR 1X, los dNTP 0,2 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq, 20 nanogramos de ADN molde, donde el ADN molde era ADN S1 o AdN S2 o una mezcla 1/1 de ADN S1 y AdN S2, como se indica en el comentario del Ejemplo 3. S1 y S2 son fragmentos de 658 y 704 pares de bases, respectivamente, que se han preparado como se describe en el Ejemplo 3.
10
[0123] Cada pocillo se sello con Cycleseal™ (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA), y se incubo a 93 °C durante 9 minutos, a 65 °C durante 5 minutos y a 72 °C durante 2 minutos y de nuevo a 93 °C. Despues, se utilizo una solucion de TNT 200 |il en tres lavados sucesivos de un minuto de duracion a 93 °C. La mezcla de inicio se reemplazo despues por 15 |il de mezcla de crecimiento (la misma que la mezcla de inicio, pero sin ADN molde), y el
15 crecimiento se realizo incubando los pocillos sellados durante 9 minutos a 93 °C y repitiendo 40 veces las siguientes condiciones: 93 °C durante 45 segundos, 65 °C durante 3 minutos, 72 °C durante 2 minutos. Despues de finalizar este programa, los pocillos se conservaron a 6 °C hasta su utilizacion posterior. El control de la temperatura se realizo en un termociclador PTC 200.
20 [0124] Se aplicaron diferentes tratamientos a 6 conjuntos (A,B,C,D,E y F) de 3 pocillos (1,2,3), uno preparado con molde S1, uno con molde S1 y molde S2 y uno preparado solo con molde S2 (lo que produce A1,A2,A3,..., F1,F2,F3). El conjunto A no se trato, el conjunto B se incubo durante 10 minutos con exonucleasa BAL-31 (New England Biolabs, Beverly, MA) a 37 °C en tampon BAL-31 (BAL-31 digiere esencialmente ADN bicatenario que tiene ambos extremos libres), el conjunto C se incubo durante 10 minutos con nucleasa S1 (Pharmacia Uppsala, Suecia)
25 a 37 °C en tampon S1 (la nucleasa S1 digiere esencialmente ADN monocatenario), el conjunto D, E y F se incubaron tanto con BAL-31 como con nucleasa S1. Las reacciones se detuvieron lavando los pocillos con tampon TNT.
[0125] La PCR (25 ciclos, 30 s a 94 °C, 45 s a 60 °C, 45 s a 72 °C) se realizo en los pocillos Nucleolink con los cebadores 0,25 |iM P70 (5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACCACGACTCACTATAGGGCGAA) y P71 (5'30 AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTAAAGGGAACAAAAGCTGGA) en solucion en los conjuntos A, B, C y D.
P70 y P71 eran idoneos para la amplificacion de S1 y S2, ya que el cebador P70 contiene la secuencia del cebador P1 y P71 contiene la de P2. En los pocillos del conjunto E, se realizo la PCR con un conjunto de cebadores directo (P150, 5'-GGTGCTGGTCCTCAGTCTGT) e inverso (P151, 5'-CCCGCTTACCAGTTTCCATT) que estan dentro de S1 y no dentro de S2 para producir un producto PCR de 321 pb, y en los pocillos del conjunto F, se realizo PCR con
35 un conjunto de cebadores directo (P152, 5'-CTgGcCTTATcCcTAACAGC) e inverso (P153, 5'-
CGATCTTGGCTCATCACAAT) que estan dentro de S2 y no dentro de S1 para producir un producto PCR de 390 pb. Para cada una de las 18 reacciones de PCR, se utilizaron 3 |il de solucion para electroforesis en gel en agarosa al 1 % en presencia de bromuro de etidio 0,1 |ig/ml. En la Figura 9 se muestran los dibujos de los geles que muestran que, en las colonias, el ADN esta protegido de la digestion por exonucleasas (conjuntos B, C y D en
40 comparacion con el conjunto A) y que tanto S1 como S2 pueden recuperarse de manera simultanea utilizando P1 y P2 (conjuntos A, B, C y D) o espedfica (conjunto E y F). En el conjunto E y F, donde los productos mas cortos de la PCR se amplificaban de un modo mas eficaz que los productos mas largos de la PCR en los conjuntos A, B, C, D, pudo detectarse una contaminacion cruzada entre los moldes S1 y S2 (veanse los carriles E2 y F1).
45 E) Suministro de colonias secundarias
[0126] Tambien es posible modificar colonias inicialmente formadas para proporcionar colonias diferentes (es decir, proporcionar colonias que comprendan moleculas de acido nucleico inmovilizadas con diferentes secuencias de aquellas moleculas presentes en las colonias inicialmente formadas). En este caso, las colonias inicialmente
50 formadas se denominan “colonias primarias” y las ultimas colonias formadas se denominan “colonias secundarias”. Para convertir las colonias primarias en “cebadores secundarios” es necesario un procedimiento preliminar que sera adecuado para la generacion de colonias secundarias.
[0127] La Figura 10 muestra como se generan 'cebadores secundarios' utilizando colonias primarias existentes.
55 Como un punto de partida, la colonia primaria (figura 10a) se deja en forma bicatenaria, hibridada por completo. Se
podna utilizar una ADN exonucleasa espedfica monocatenaria para retirar todos los cebadores que no se hayan alargado. Tambien se podna optar por proteger todos los extremos 3'-OH de los cebadores con didesoxirribunucleotido trifosfatos utilizando una ADN terminal transferasa (etapa (i), figura 10b).
60 [0128] En segundo lugar e independientemente, las moleculas de ADN que forman las colonias pueden escindirse utilizando endonucleasas. Por ejemplo, una enzima de restriccion que reconozca un sitio espedfico dentro de la colonia (representado por la flecha 'RE' en la figura 10c) y escinda la colonia de ADN (etapa (ii), figura 10). Si se desea, la colonia escindida con enzimas (figura 10d) puede despues digerirse parcialmente con una exonucleasa II espedfica bicatenaria en direccion 3' a 5' (por ejemplo, exonucleasa de E. coli III, representada por 'N', etapa (iii),
figura inferior). En cualquier caso, los cebadores secundarios se encuentran disponibles despues de la desnaturalizacion (por ejemplo, por calor) y lavado (figura 10e).
[0129] Como alternativa, el ADN bicatenario que forma las colonias (figura 10f) puede digerirse con la exonucleasa 5 3'-5' espedfica de cadena doble, que solo digiere una cadena del ADN bicatenario. Un caso importante es cuando la
exonucleasa digiere solo algunas bases de la molecula de ADN antes de liberarse en solucion y cuando la digestion se puede realizar cuando otra enzima se une a la molecula de ADN (figura 10g). En este caso la digestion con exonucleasa continuara hasta que solo queden moleculas monocatenarias que, por termino medio, tienen la mitad de la longitud del material de partida, y no tienen partes complementarias (que podnan formar duplex parciales) que 10 quedan en las moleculas de cadena sencilla en una colonia (figura 10h).
[0130] En todos los casos, estos tratamientos dan lugar a fragmentos monocatenarios injertados sobre un soporte que corresponde a la secuencia del molde original y que se pueden utilizar para el crecimiento de nuevas colonias de ADN si se proporciona un molde nuevo apropiado para el inicio de la colonia (figuras 10e y 10h).
15
[0131] El resultado de dicho tratamiento, por tanto un soporte de sujecion de cebadores secundarios, se denominara “soporte para el crecimiento de colonias secundarias”. Los moldes utiles para el crecimiento de colonias secundarias pueden incluir moleculas que tengan secuencias conocidas (o complementarias de dichas secuencias). Como alternativa los moldes pueden proceder de moleculas no secuenciadas (por ejemplo, fragmentos al azar). En
20 ningun caso los moldes deben proporcionarse con una o mas regiones para el apareamiento con cadenas de acido nucleico presentes en las colonias primarias.
[0132] La Figura 11 a-e muestra como puede generarse una colonia secundaria cuando se proporciona un molde (TP, Figura 11a) adecuado para una segunda ronda de generacion de colonias de ADN sobre un soporte para el
25 crecimiento de colonias secundarias, que sujeta cebadores secundarios. En este ejemplo, el tratamiento de la colonia primaria, como se describe anteriormente, ha generado los cebadores secundarios, SP1 y SP2 (figura 11a). El molde TP, se hibridara con su cebador secundario complementario, SP1, y despues de una reaccion en extension utilizando una ADN polimerasa, como se describe, extendera como se representa (figura 12b). Despues de una desnaturalizacion (etapa ii), reapareaminento (etapa iii) y de un ciclo de ADN polimerasa (etapa iv), se formara una 30 copia de la colonia primaria original (figura 11e).
[0133] El tamano maximo de una colonia secundaria proporcionada por esta realizacion de la presente invencion esta limitado por el tamano de la colonia primaria sobre la cual se desarrolla. Se pueden utilizar diversos procesos de crecimiento secundarios secuencialmente para crear colonias para aplicaciones espedficas (es decir, una
35 primera colonia puede reemplazarse por una segunda colonia, la segunda colonia puede reemplazarse por una tercera colonia, etc.).
F) Suministro de cebadores extendidos
40 [0134] La Figura 12 muestra como se pueden generar cebadores extendidos en una matriz de oligonucleotidos. Se puede aplicar el mismo procedimiento a un soporte cubierto con colonias o cebadores secundarios como se describe en el apartado E.
[0135] En la Figura 12a) se proporciona un soporte que tiene una pluralidad de cebadores inmovilizados 45 mostrados sobre el mismo. Se muestran diferentes cebadores inmovilizados presentes en diferentes regiones del
soporte (representado por cuadrados). Los cebadores que tienen la secuencia 5'-AAA se muestran en un cuadrado y los cebadores que tienen la secuencia 5'-GGG se muestran en otro cuadrado.
[0136] Las Figuras 12b) a 12d) muestran como se modifican los cebadores iniciales presentes (cebadores 50 iniciales) para dar diferentes cebadores (cebadores extendidos). En este ejemplo, los cebadores iniciales que tienen
la secuencia 5'-AAA se modifican para producir dos tipos diferentes de cebadores extendidos, que tienen las secuencias 5'-AAAGCC y 5'-AAATAc respectivamente. Esto se consigue a traves de la hibridacion de moldes oligonucleotfdicos 5'-GTATTT y 5'-GGCTTT con los cebadores primarios inmovilizados sobre la superficie (figura 12b), seguido por reaccion de ADN polimerasa. Los cebadores iniciales que tienen la secuencia 5'-GGG se 55 modifican para producir dos tipos diferentes de cebadores extendidos, que tienen las secuencias 5'-GGGTAT y 5'- GGGTAA (figura 12d) de una manera similar.
[0137] La tecnica de producir cebadores extendidos es util para transformar oligonucleotidos inmovilizados proporcionados en una microplaca de ADN o en otra superficie en cebadores inmovilizados utiles en la amplificacion
60 de una secuencia de acido nucleico diana particular y/o amplificando una cadena complementaria a la misma.
G) Preparacion de fragmentos de acido nucleico
[0138] Los aparatos de la presente invencion se pueden utilizar para diversos procedimientos, algunos de los 65 cuales se describiran mas adelante. Los fragmentos de acido nucleico para su utilizacion en la generacion de
colonias se pueden preparar de diferente manera para los procedimientos diferentes (en el presente documento denominados “acidos nucleicos preparados”). A continuacion se describen diversos procedimientos de preparacion:
(i) Preparacion de fragmentos de ADN al azar
5
[0139] Aqu se describe un metodo para preparar ADN que se origina de una muestra (o de una pluralidad de muestras) biologica por amplificacion en el caso en el que no sea necesario rastrear el origen del ADN cuando este se incorpora en una colonia.
10 [0140] El ADN de interes se extrae primero de la muestra biologica y se corta al azar en trozos “pequenos” (por ejemplo, de 50 a 10.000 bases de longitud, pero preferentemente de 500 a 1000 pares de bases de longitud, representado por la barra “I”, figura 13a). (Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante una extraccion con fenol- cloroformo seguido de tratamiento con ultrasonido, cizalla mecanica, digestion parcial con endonucleasas de restriccion cortadoras frecuentes y otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica). Para normalizar las 15 condiciones experimentales, los fragmentos de ADN extrafdos y cortados pueden fraccionarse segun su tamano, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de agarosa, centrifugacion en gradiente de sacarosa o cromatograffa en gel. Los fragmentos obtenidos dentro de una sola fraccion se pueden utilizar para proporcionar moldes para reducir la variabilidad del tamano de los moldes.
20 [0141] En segundo lugar, los fragmentos de ADN molde extrafdos, cortados y (opcionalmente) clasificados, pueden estar ligados con enlazadores oligonucleotidicos (IIa y IIb, figura 13a) que contienen la secuencia de uno o mas cebadores que previamente se han injertado sobre un soporte. Esto se puede realizar, por ejemplo, utilizando ligamiento del “extremo romo”. Como alternativa, los fragmentos de ADN molde pueden insertarse en un vector biologico en un sitio que esta flanqueado por la secuencia de los cebadores que estan injertados sobre el soporte. 25 Este ADN clonado puede amplificarse dentro de un hospedador biologico y extraerse. Obviamente, si se esta trabajando con un solo cebador injertado en el soporte solido para la formacion de colonias de ADN, la purificacion de los fragmentos que contienen ambos cebadores P1 y P2 no supone ningun problema.
[0142] A continuacion, los fragmentos de ADN obtenidos despues de dicho proceso adecuado se denominan con 30 la expresion: “ADN genomico preparado” (III, figura 13a).
(ii) Preparacion de fragmentos de ADN al azar que se originan a partir de una pluralidad de muestras
[0143] Aqu se describe como preparar ADN que se origina de una pluralidad de muestras biologicas en el caso en 35 el que sea necesario rastrear el origen del ADN cuando este se incorpora en una colonia.
[0144] El procedimiento es el mismo que el descrito en el apartado anterior, excepto que en este caso, los enlazadores oligonucleortdicos que se utilizan para encolar los fragmentos de ADN genomicos cortados al azar estan constituidos ahora por dos partes; la secuencia de los cebadores injertados sobre la superficie (P1 y P2, figura
40 13b) y una secuencia “etiqueta” que es diferente para cada muestra y que se utilizara para identificar el origen de la colonia de ADN. Observese que, para cada muestra, la etiqueta puede no ser exclusiva, pero que se puede utilizar una pluralidad de etiquetas. En adelante, los fragmentos de ADN obtenidos despues de dicho proceso adecuado se denominaran con la expresion “ADN genomico etiquetado” (III, Figura 13b).
45 [0145] Este procedimiento de etiquetado se puede utilizar para proporcionar colonias que llevan un medio de identificacion que es independiente de la secuencia llevada por el propio molde. Esto tambien puede ser util cuando algunas colonias van a recuperarse espedficamente (utilizando el procedimiento dado en el apartado D). Esto tambien podna ser util en el caso en el que las colonias recuperadas se procesen tambien, por ejemplo, creando nuevas colonias primarias y si se desea una referencia cruzada entre las colonias originales y las nuevas colonias.
50
(iii) Preparacion de fragmentos de ADN correspondientes a una pluralidad de secuencias de ADN que se originan de una muestra
[0146] El ADN de interes puede extraerse primero de una muestra biologica mediante cualquier medio conocido 55 por los expertos en la tecnica (como se ha mencionado anteriormente). Despues, las secuencias espedficas de
interes pueden amplificarse con PCR (etapa (i), figura 13c) utilizando cebadores de PCR (IIa y IIb) constituidos por dos partes; 1) en el extremo 5', las secuencias corresponden a las secuencias de uno o mas oligonucleotidos cebadores que se han injertado sobre una superficie (P1 y P2) y 2) en el extremo 3', a secuencias cebadoras espedficas para la secuencia de interes (S1 y S2). En adelante, los fragmentos de ADN obtenidos despues de dicho 60 proceso adecuado se denominaran con la expresion: “ADN preparado” (III, figura 13c).
(iv) Preparacion de una pluralidad de fragmentos de ADN que se originan de una pluralidad de muestras
[0147] El procedimiento es el mismo que el indicado en el aparato anterior excepto que en este caso los 65 cebadores de ADN (IIa y IIb) utilizados para realizar la amplificacion por PCR (etapa (i), figura 13d) estan
constituidos ahora por tres partes; 1) la secuencia de los cebadores injertados sobre la superficie (P1 y P2), 2) una secuencia “etiqueta” que es diferente para cada muestra y que se utilizara para la identificacion del origen de la colonia de ADN y 3) secuencias cebadoras que rodean la secuencia espedfica de interes (S1 y S2). Observese que para cada muestra, se podna utilizar una pluralidad de etiquetas, como en el (ii), anterior.
5
[0148] En adelante, los fragmentos de ADN obtenidos despues de dicho proceso adecuado se denominaran con la expresion: “ADN etiquetado” (III, figura 13d). Los usos posibles de las etiquetas son los mismos que los indicados en el punto (ii) anterior.
10 (v) Preparacion de ARNm
[0149] El procedimiento es similar a los procedimientos descritos para preparar fragmentos de ADN en los apartados anteriores, excepto que el punto de partida es extraer ARNm mediante cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica (por ejemplo, mediante la utilizacion de kits de preparacion de ARNm disponibles en el
15 comercio). El ARNm puede copiarse en ADNc bicatenario mediante cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica (por ejemplo utilizando una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa). Ciertamente, las etiquetas y los cebadores descritos anteriormente se pueden utilizar junto con los procesos de smtesis de ADNc bicatenario para permitir su incorporacion en los moldes. En lo sucesivo, los fragmentos de ARNm obtenidos despues de dichos procesos adecuados se denominaran con las expresiones: “ARNm total preparado” (cf. “ADN genomico preparado”,
20 como se describe en el apartado (I) anteriormente), “ARNm total etiquetado”, (cf. “ADN genomico etiquetado”, como se describe en el apartado (ii) anteriormente), “ARNm preparado” (cf. “ADN preparado”, como se describe en el apartado (iii) anteriormente) y “ARNm etiquetado” (cf. “aDn etiquetado”, como se describe en el apartado (iv) anteriormente).
25 H) Ensayos de deteccion preferidos
[0150] En los procedimientos de ensayo de la presente invencion se pueden utilizar marcadores para proporcionar senales detectables. Los ejemplos incluyen:
30 a) un grupo fluorescente o un sistema de fluorescencia basado en transferencia de energfa.
b) un sistema basado en biotina. En este caso las colonias pueden incubarse con estreptavidina marcada con un grupo fluorescente o una enzima (por ejemplo perlas de latex fluorescentes cubiertas con estreptavidina; estreptavidina marcada con grupos fluorescentes; enzimas para su uso con el ensayo de fluorescencia
35 correspondiente).
c) un sistema basado en la deteccion de un antfgeno o su fragmento, por ejemplo, un hapteno (incluyendo biotina y grupos fluorescentes). En este caso, las colonias pueden incubarse con anticuerpos (por ejemplo espedficos para un hapteno). Los anticuerpos pueden marcarse con un grupo fluorescente o con una enzima (por ejemplo
40 perlas de latex fluorescentes cubiertas con el anticuerpo; anticuerpos marcados con grupos fluorescentes; anticuerpos ligados a una enzima para su uso con un ensayo de fluorescencia o luminiscencia correspondiente, etc.).
d) un radiomarcador (por ejemplo, incorporado utilizando una 5'-polinucleotido quinasa y [y-32P]adenosina
45 trifosfato o una ADN polimerasa y [a-32P o a-33P] desoxirribonucleosido trifosfatos para anadir uno o mas grupos
fosfato radioactivos a un acido nucleico). En este caso las colonias pueden incubarse con un lfquido de centelleo.
e) un colorante u otro agente de tincion.
50 [0151] Los marcadores para su uso en la presente invencion estan preferentemente unidos a
a) acidos nucleicos
b) protemas que se unen espedficamente a ADN bicatenario (por ejemplo, histonas, represores, potenciadores)
55 y/o
c) protemas que se unen espedficamente a ADN monocatenario (por ejemplo, protema de union a acido nucleico monocatenario).
60 [0152] Las colonias marcadas se detectan preferentemente mediante:
a) medicion de la fluorescencia
b) medicion de la luminiscencia.
c) medicion de la radioactividad.
d) medicion del flujo o de la anisotropfa fluorescente inducida por el campo electrico y/o 5 e) medicion del grosor de la capa polimerica.
[0153] En la presente invencion se pueden utilizar agentes de tincion. Por tanto las colonias de ADN pueden incubarse con un agente de tincion espedfico de ADN adecuado, tal como colorantes intercalantes, bromuro de etidio, YO-YO, YO-PRO (Molecular Probes, Eugene, OR).
10
[0154] Con determinados ejemplos de tincion el resultado puede observarse con un aparato adecuado de formacion de imagenes fluorescentes.
[0155] A continuacion se describiran ejemplos de ensayos/procedimientos particulares con mas detalle 15
I) Realizaciones preferidas de ensayos de la presente invencion i) Ensayo de hibridacion de sondas de acido nucleico
20 [0156] Las colonias de ADN se preparan primero para la hibridacion. Despues, se hibridan con una sonda (marcada o no). Si se requiere, la sonda hibridada se somete a ensayo, y se observa el resultado. Esto se puede realizar con un aparato de la presente invencion (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente).
Preparacion para la hibridacion 25
[0157] En una realizacion preferida de la presente descripcion, las colonias se tratan con una endonucleasa de restriccion de ADN que es espedfica de una secuencia proporcionada por una forma monocatenaria de uno de los cebadores originalmente injertados sobre la superficie donde se forman las colonias o de otra secuencia presente en una molecula de ADN molde (vease, por ejemplo, la figura 16c).
30
[0158] Despues de la digestion con la enzima de restriccion, las colonias pueden calentarse a una temperatura lo suficientemente alta como para separar las moleculas de ADN bicatenarias. Despues de esta etapa de desnaturalizacion termica, las colonias se lavan para retirar las cadenas de ADN monocatenario separadas, no hibridadas, dejando un ADN monocatenario restante unido.
35
[0159] En otra realizacion las colonias pueden digerirse parcialmente con una exonucleasa de ADN bicatenario de 3' a 5' (vease el apartado E, figura 10f) que retira una cadena de los duplex de ADN comenzando desde el extremo 3', por tanto dejando una parte de una molecula de ADN en una forma monocatenaria.
40 [0160] Como alternativa, el ADN en las colonias puede primero desnaturalizarse con calor y despues digerirse parcialmente con una exonucleasa de ADN monocatenario espedfica de 3' a 5' que digiere ADN monocatenario comenzando desde el extremo 3'.
[0161] Una alternativa adicional es simplemente desnaturalizar con calor el ADN en las colonias.
45
Hibridacion de la sonda
[0162] Las sondas de acido nucleico monocatenario (marcadas o no) pueden hibridarse con ADN monocatenario en las colonias en condiciones de temperatura y tampon apropiadas (que depende de la secuencia de cada sonda, y
50 que se puede determinar utilizando protocolos conocidos por los expertos en la tecnica).
Ensayo de sondas hibridas no marcadas
[0163] Una sonda hibridada proporcionada inicialmente en una forma no marcada se puede utilizar con un cebador 55 para la incorporacion de los diferentes (o un subconjunto de los diferentes) desoxirribonucleosido trifosfatos
marcados (o una mezcla de marcados y no marcados) con una ADN polimerasa. Los nucleotidos marcados incorporados pueden despues detectarse como se ha descrito anteriormente.
Ensayo ciclico de sondas marcadas o no marcadas
60
[0164] En primer lugar, las colonias de ADN pueden prepararse para la hibridacion mediante los metodos descritos anteriormente. Despues pueden hibridarse con una sonda (marcada o inicialmente no marcada). Si se desea, las sondas marcadas hibridadas se someten a ensayo y los resultados se observan con un aparato como se ha descrito anteriormente. Despues, la sonda puede retirarse mediante desnaturalizacion con calor y puede hibridarse y
65 detectarse una sonda espedfica para una secuencia de ADN. Estas etapas pueden repetirse con nuevas sondas
20
tantas veces como se desee.
[0165] En segundo lugar, las sondas pueden someterse a ensayo como se ha descrito anteriormente para sondas no marcadas, excepto que en cada ciclo se utiliza unicamente un subconjunto (preferentemente 1 solo) de los
5 diferentes nucleotidos (marcados o no). Despues, las colonias pueden someterse a ensayo para monitorizar la incorporacion de los nucleotidos. Este segundo proceso puede repetirse hasta que se determine una secuencia de una longitud deseada.
(ii) Ensayo de smtesis de ARN in situ
10
[0166] En esta realizacion, se pueden utilizar colonias de ADN como moldes para la sintesis de ARN in situ como se representa en la figura 14. Las colonias de ADN pueden generarse a partir de moldes y cebadores, de tal manera que un promotor de ARN polimerasa se coloca en un extremo del aDn bicatenario en la colonia. Despues, las colonias de ADN pueden incubarse con ARN polimerasa y el ARN recien sintetizado (ARNc) puede someterse a
15 ensayo segun se desee. La deteccion se puede realizar de manera no espedfica (por ejemplo, con tincion) o de una manera dependiente de secuencia (por ejemplo, hibridacion).
[0167] El molde de ADN (I, figura 14a) a amplificar en una colonia se genera mediante reaccion de PCR utilizando cebadores (IIa y IIb) que tienen las cuatro partes siguientes; 1) una secuencia identica a las secuencias de los
20 cebadores injertados sobre la superficie ('P1' y 'P2'), 2) una secuencia “etiqueta” que es diferente para cada muestra, 3) una secuencia correspondiente a un promotor de ARN polimerasa, es decir, los promotores T3, T7 y SP6 de ARN ('RPP', figura 14a) y 4) secuencias cebadoras que rodean la secuencia espedfica de interes ('S1' y 'S2'). En lo sucesivo, los fragmentos de ADN obtenidos despues de dicho proceso adecuado se denominaran con la expresion: “sintesis de ADN y ARN etiquetado” (III, figura 14b).
25
[0168] Despues de la amplificacion del molde de ADN a partir de la muestra de ADN original, estos moldes se utilizan para generar colonias de ADN. Las colonias de ADN (IV, figura 14c) se incuban despues con la ARN polimerasa espedfica para el promotor de la ARN polimerasa ('RPP', figura 14c). Esto generara una copia de ARN espedfico para el molde de la colonia de ADN (ARNc molde, V, figura 14d).
30
[0169] El ARNc asf sintetizado se puede aislar y utilizar como sondas de hibridacion, como moldes de ARN mensajero (ARNm) para la sintesis de protemas in vitro o como moldes para el analisis de secuencias de ARN in situ.
35 (iii) Metodos de secuenciacion
[0170] En otra realizacion de la presente invencion, las colonias pueden analizarse para determinar secuencias de moleculas de acido nucleico que forman las colonias. Dado que en cada colonia pueden proporcionarse cantidades muy grandes de las mismas moleculas de acido nucleico, es probable que la fiabilidad de los datos de secuenciacion
40 obtenidos sea muy alta.
[0171] Las secuencias determinadas pueden ser parciales o completas. Las secuencias de los acidos nucleicos presentes en una o mas colonias pueden determinarse. Al mismo tiempo, puede determinarse una pluralidad de secuencias.
45
[0172] En algunas realizaciones, inicialmente se puede obtener la secuencia de una cadena complementaria con una cadena de acido nucleico a secuenciar (o de una parte de la misma). Sin embargo esta secuencia puede convertirse utilizando normas de emparejamiento de bases para proporcionar la secuencia deseada (o aparte de la misma). Esta conversion la puede realizar un ordenador o una persona. Se puede realizar despues de cada etapa
50 de extension de cebadores o se puede realizar en una fase posterior.
[0173] La secuenciacion se puede realizar mediante diversos metodos. Por ejemplo, metodos basados en digestion con endonucleasas de restriccion secuencial y se puede utilizar ligamiento con enlazador. Un metodo de este tipo se desvela, por ejemplo, en el documento WO95/27080. Este metodo comprende las etapas de: ligar una
55 sonda con un extremo de un polinucleotido, teniendo la sonda un sitio de reconocimiento de nucleasas; identificar uno o mas nucleotidos en el extremo del polinucleotido; y escindiendo el polinucleotido con una nucleasa que reconozca el sitio de reconocimiento de nucleasas de la sonda, de tal manera que el polinucleotido se acorte en uno o mas nucleotidos.
60 [0174] Sin embargo en un metodo preferido de la presente invencion, las moleculas de acido nucleico amplificadas (preferentemente en forma de colonias, como se desvela en el presente documento) se secuencian permitiendo que los cebadores se hibriden con las moleculas de acido nucleico, extendiendo los cebadores y detectando los nucleotidos utilizados en la extension del cebador. Preferentemente, despues de la extension de un cebador mediante un solo nucleotido, el nucleotido se detecta antes de que se use un nucleotido adicional en una extension 65 de cebador (secuenciacion gradual).
[0175] Uno o mas de los nucleotidos que se utilizan en la extension de cebadores puede marcarse. La utilizacion de nucleotidos marcados durante la extension de cebadores facilita la deteccion. (El termino “marcador” se usa en un sentido general para indicar cualquier resto que pueda identificarse utilizando un sistema deteccion apropiado. Preferentemente el marcador no esta presente en nucleotidos de origen natural). En el mejor de los casos, los
5 marcadores son no radioactivos, tales como fluoroforos. Sin embargo se pueden utilizar marcadores radioactivos.
[0176] Cuando se proporcionan nucleotidos en forma marcada, los marcadores pueden ser los mismos para diferentes nucleotidos. Si se utiliza el mismo marcador, se puede utilizar cada incorporacion de nucleotido para proporcionar un aumento acumulativo de la misma senal (por ejemplo, de una senal detectada a una longitud de
10 onda particular). Como alternativa se pueden utilizar diferentes marcadores para cada tipo de nucleotido (que puede detectarse a diferentes longitudes de onda).
[0177] Por tanto, se pueden proporcionar cuatro marcadores diferentes para dATP, dTTP, dCTP y dGTP, o se puede proporcionarse el mismo marcador para todos ellos. De manera similar, se pueden proporcionar cuatro
15 marcadores diferentes para ATP, UTP, CTP y GTP, o se puede proporcionar el mismo marcador para todos ellos). En algunas realizaciones de la presente invencion se puede proporcionar una mezcla de nucleotidos marcados o no, como se describira mas adelante con mas detalle.
[0178] En una realizacion preferida de la presente invencion, la secuenciacion de las moleculas de acido nucleico 20 presentes en al menos 2 colonias diferentes, se realiza de manera simultanea. Mas preferentemente, la
secuenciacion de las moleculas de acido nucleico presentes en mas de 10, mas de 100, mas de 1000 o incluso mas de 1.000.000 de colonias diferentes se realiza de manera simultanea. Por lo tanto si se proporcionan colonias que tienen diferentes moleculas de acido nucleico, se pueden determinar muchas secuencias diferentes (completas o parciales) de manera simultanea, es decir, se pueden determinar mas de 10, mas de 100, mas de 1000 o incluso 25 mas de 1.000.000 secuencias diferentes de manera simultanea.
[0179] Si se desea, se pueden proporcionar controles, mediante los cuales se proporciona una pluralidad de colonias que comprenden las mismas moleculas de acido nucleico. Determinando si se obtienen o no las mismas secuencias para las moleculas de acido nucleico en estas colonias se puede confirmar si el procedimiento de
30 secuenciacion es o no fiable.
[0180] En la figura 17 se ilustra un metodo de secuenciacion de la presente invencion, que se titula “secuenciacion in situ”. En las colonias de ADN preparadas, hibridadas con un cebador de secuenciacion apropiado, la adicion dclica de los desoxirribonucleotido trifosfatos individuales y de la ADN polimerasa permitina la determinacion de la
35 secuencia de ADN inmediatamente en posicion 3' con respecto al cebador de secuenciacion. En el ejemplo indicado en la figura 17, la adicion de dGTP permite la determinacion de 1 colonia que contiene 'G'. En el segundo ciclo de adicion de dATP se detecta en ambas colonias, determinando que las dos colonias tienen 'A' en la siguiente posicion. Despues de diversas repeticiones de la adicion de desoxirribonucleosido trifosfatos sencillos, sera posible determinar cualquier secuencia. Por ejemplo, se pueden determinar secuencias de al menos 10, al menos 20, al 40 menos 50 o al menos 100 bases.
[0181] Si se proporcionan colonias inicialmente en una forma que comprenden moleculas bicatenarias, las colonias pueden procesarse para proporcionar moleculas monocatenarias para su uso en la secuenciacion, como se ha descrito anteriormente. (Sin embargo se debe observar que las moleculas bicatenarias se pueden utilizar para la
45 secuenciacion sin dicho procesamiento. Por ejemplo, una molecula de ADN bicatenaria se puede proporcionar con una secuencia promotora y la secuenciacion gradual se puede realizar despues utilizando una ARN polimerasa y ribonucleotidos marcados (cf Figura 16 d). (Otra alternativa es introducir una muesca en una molecula de ADN bicatenaria de tal manera que se pueda realizar la traduccion de la muesca utilizando desoxirribonucleotidos marcados y una ADN polimerasa con actividad exonucleasa de 5' a 3').
50
[0182] Una manera de procesar moleculas bicatenarias presentes en colonias para proporcionar colonias monocatenarias se describe mas adelante con referencia a la Figura 19. En este caso, moleculas inmovilizadas bicatenarias presentes en una colonia (que pueden estar en forma de estructuras de tipo puente) se escinden y despues de esto se realiza una etapa de desnaturalizacion. (Como alternativa, inicialmente se podna utilizar una
55 etapa de desnaturalizacion y despues se podna realizar una etapa de escision). Preferentemente, la escision se realiza enzimaticamente. Sin embargo, tambien son posibles otros medios de escision, tal como escision qmmica. (Se puede proporcionar un sitio de escision apropiado en dicha molecula). La desnaturalizacion se puede realizar mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se puede realizar calentando y/o cambiando la fuerza ionica de un medio en las proximidades de las moleculas de acido nucleico.
60
[0183] Una vez que se han proporcionado las moleculas monocatenarias a secuenciar, con las mismas se pueden hibridar cebadores adecuados para la extension de los cebadores. Como cebadores se prefieren oligonucleotidos que son moleculas de acido nucleico que tienen tfpicamente una longitud de 6 a 60, por ejemplo, de 15 a 25 nucleotidos. Estos pueden comprender nucleotidos de origen natural y/o no natural. (Sin embargo, como alternativa,
65 si se desea, se puede utilizar otras moleculas, por ejemplo, cadenas de acido nucleico mas largas, como
cebadores). Preferentemente, los cebadores para su uso en la secuenciacion se hibridan con las mismas secuencias presentes en las moleculas de acidos nucleicos amplificados as^ como lo hacen los cebadores que se utilizaron para proporcionar dichos acidos nucleicos amplificados. (Los cebadores que tienen las mismas/similares secuencias se pueden utilizar para fines tanto de amplificacion como de secuenciacion).
5
[0184] Cuando los cebadores se proporcionan en solucion y estan apareados (hibridados) con las moleculas de acido nucleico presentes en las colonias a secuenciar, aquellos cebadores que quedan en solucion o que no se pueden aparear espedficamente tienen que retirarse despues del apareamiento. Las condiciones de apareamiento preferidas (temperatura y composicion del tampon) impiden la hibridacion no espedfica. Estas condiciones pueden
10 ser rigurosas. Dichas condiciones seran tfpicamente temperaturas de apareamiento cercanas a la Tf (temperatura de fusion) del cebador a una concentracion salina determinada (por ejemplo, cebador 50 nM en tampon NaCl 200 mM a 55 °C para un oligonucleotido de 20 unidades monomericas (meros) con un contenido de GC del 50 %). (Un experto en la tecnica puede determinar las condiciones rigurosas para un sistema determinado. Estas dependeran de la composicion de bases, del contenido de GC, de la longitud del cebador que se utilice y de la concentracion salina.
15 Para un oligonucleotido de 20 bases de promedio calculado de GC al 50 %, la temperatura de apareamiento es de 55 a 60 °C, pero en la practica puede variar entre 35 a 70 °C).
[0185] No es preciso que los cebadores utilizados para la extension de cebadores tengan que proporcionarse en solucion, ya que pueden proporcionarse en forma inmovilizada. En esta realizacion los cebadores deben
20 proporcionarse cerca de las moleculas inmovilizadas con las que se van a aparear. (De hecho, dichos cebadores pueden estar ya presentes como cebadores inmovilizados en exceso que no se utilizaron en la amplificacion de las moleculas de acido nucleico durante la formacion de colonias).
[0186] Las moleculas de acido nucleico presentes en las colonias a secuenciar, incluiran una secuencia que se
25 hibrida con los cebadores que se van a utilizar en la secuenciacion (preferentemente en condiciones “rigurosas”).
Esta parte puede anadirse a una molecula determinada antes de la amplificacion (cuya molecula puede tener una secuencia total/parcialmente desconocida) utilizando tecnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo se puede sintetizar artificialmente y se puede anadir a una molecula determinada utilizando una ligasa.
30 [0187] Una vez que se proporciona una molecula de acido nucleico apareada con un cebador, se puede realizar el cebador de extension. Se pueden utilizar ARN o ADN polimerasas. Sin embargo, las ADN polimerasas son las enzimas de eleccion para las realizaciones preferidas. Algunas de estas se encuentran disponibles en el comercio. Se pueden utilizar polimerasas que no tengan actividad exonucleasa de 3' a 5', tales como la ADN polimerasa de T7 o se puede utilizar el fragmento pequeno (Klenow) de la ADN polimerasa I [por ejemplo la ADN polimerasa de T7
35 modificada Sequenase™ 2.0 (Amersham) o el fragmento Klenow (exo de 3' a 5', New England Biolabs)]. Sin embargo, no es esencial el uso de dichas polimerasas. De hecho, cuando se desee que las polimerasas tengan actividad correctora de errores, no se debena utilizar polimerasas que no tengan actividad exonucleasa de 3' a 5'. Determinadas aplicaciones pueden requerir el uso de polimerasas termoestables, tales como ThermoSequenase” (Amersham) o Taquenase™ (ScienTech, St Louis, MO). Para las reacciones de extension de cebadores se puede
40 utilizar cualquier nucleotido (de origen natural o no natural). Los nucleotidos preferidos son los desoxirribonucleotidos: dATP, dTTP, dGTP y dCTP (aunque en algunas aplicaciones se prefiere dUPT, el analogo de DTTP) o los ribonucleotidos ATP, UTP, GTP y CTP; al menos algunos de los cuales se proporcionan en forma marcada.
45 [0188] Preferentemente, despues de cada etapa de extension de cebador se incorpora una etapa de lavado para retirar los nucleotidos no incorporados que pueden interferir con las etapas posteriores. La solucion de lavado preferida debe ser compatible con la actividad polimerasa y tener una concentracion salina que no interfiera con el apareamiento de las moleculas cebadoras con las moleculas de acido nucleico a secuenciar. (En realizaciones menos preferidas, la solucion de lavado puede interferir con la actividad polimerasa. En este caso la solucion de
50 lavado no requiere retirarse antes de la extension del cebador adicional).
[0189] Considerando que en una colonia determinada se pueden proporcionar muchas copias de moleculas a secuenciar, se puede utilizar una combinacion de nucleotidos marcados y no marcados. En este caso, incluso si una pequena proporcion de los nucleotidos esta marcada (por ejemplo, marcada con fluorescencia), la cantidad de
55 marcadores incorporados en cada colonia durante la extension de cebadores puede ser suficiente para detectar con un dispositivo de deteccion. Por ejemplo, la proporcion de nucleotidos marcados con respecto a no marcados, puede seleccionarse de tal manera que, por termino medio, los nucleotidos marcados que se utilicen en la extension de cebadores, sea menor de 50 %, menor de 20 %, menor de 10 % o incluso menor de 1 % del momento (es decir, por termino medio, en una etapa de extension de cebadores determinada, un nucleotido se incorpora en forma marcada
60 en menos del 50 %, menos del 20 %, menos del 10 % o menos del 1 % de los cebadores extendidos).
[0190] Por tanto en una realizacion adicional de la presente descripcion se proporciona un metodo de secuenciacion de moleculas de acido nucleico presentes en una colonia de la presente invencion, comprendiendo el metodo las etapas de:
a) proporcionar al menos una colonia que comprenda una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tenga las mismas secuencias entre s^ y que se hibride con cebadores de una manera que se permita la extension de cebadores en presencia de nucleotidos y de una polimerasa de acido nucleico;
5 b) proporcionar dicha al menos una colonia con una polimerasa de acido nucleico y un nucleotido determinado en forma marcada o no marcada en condiciones que permitan la extension de los cebadores si una base complementaria o si una pluralidad de dichas bases esta presente en la posicion apropiada en las moleculas de acido nucleico monocatenario presentes en dicha al menos una colonia;
10 c) detectar si dicho nucleotido marcado se ha utilizado o no para la extension de cebadores determinando si el marcador presente en dicho nucleotido se ha incorporado o no en los cebadores extendidos.
[0191] Las etapas b) y c) pueden repetirse una o mas veces. Preferentemente, se proporciona una pluralidad de colonias diferentes y se determinan diversas secuencias diferentes de manera simultanea.
15
[0192] Esta realizacion adicional de la presente descripcion se puede utilizar para reducir costes, ya que se necesitan relativamente pocos nucleotidos marcados. Tambien se puede utilizar para reducir efectos de desactivacion.
20 [0193] Sin embargo tambien es posible utilizar nucleotidos unicamente marcados para la extension de cebadores o utilizar una mayor proporcion de los mismos (por ejemplo, mas del 50 %, mas del 70 % o mas del 90 % de los nucleotidos utilizados pueden estar marcados). Esto se puede realizar, por ejemplo, si se seleccionan marcadores para impedir o reducir efectos de desactivacion. Como alternativa, pueden retirarse o neutralizarse marcadores a diversas fases que se vuelven problematicos por efectos de desactivacion (por ejemplo se puede realizar 25 blanqueamiento laser de fluoroforos). Sin embargo, esto puede aumentar el numero de etapas necesarias y por lo tanto se prefiere no retirar los marcadores (o al menos no retirarlos despues de haberse incorporado cada nucleotido sino que unicamente se retiren periodicamente). En otras realizaciones menos preferidas, el propio cebador y su producto de extension se pueden retirar y reemplazar por otro cebador. Si se requiere, se pueden realizar diversas etapas secuenciales de adiciones de nucleotidos sin marcador antes de comenzar la secuenciacion real en 30 presencia de nucleotidos marcados. Una alternativa adicional es utilizar un tipo de marcador diferente al que se utiliza inicialmente (por ejemplo, cambiando de fluorescema a rodamina) que se vuelve problematico por efectos de desactivacion.
[0194] En realizaciones preferidas de la presente descripcion en un cebador extendido durante la secuenciacion 35 se incorpora una pluralidad de bases marcadas. Esto es ventajoso ya que puede aumentar la velocidad del procedimiento de secuenciacion con respecto a los metodos en los que, una vez incorporada una base marcada en un cebador extendido, el marcador debe retirarse antes de que pueda incorporarse una base marcada adicional. (La pluralidad de bases marcadas puede estar en forma de uno o mas tramos contiguos, aunque esto no es esencial).
40 [0195] Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para secuenciar moleculas de acido nucleico, que comprende las etapas de:
a) utilizar una primera colonia para proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tengan las mismas secuencias entre si y que se hibriden con cebadores de una manera que se permita la
45 extension de cebadores en presencia de nucleotidos y de una polimerasa de acido nucleico;
b) utilizar una segunda colonia para proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tengan las mismas secuencias entre sf, y que tambien se hibriden con cebadores de una manera que se permita la extension de cebadores en presencia de nucleotidos y de una polimerasa de acido nucleico;
50
c) proporcionar a cada colonia una polimerasa de acido nucleico y un nucleotido marcado determinado en condiciones que permitan la extension de los cebadores si una base complementaria o una pluralidad de dichas bases estan presentes en la posicion apropiada en las molecula de acido nucleico monocatenario;
55 d) detectar si dicho nucleotido marcado se ha utilizado o no para la extension de cebadores en cada colonia, determinando si el marcador presente en dicho nucleotido se ha incorporado o no en los cebadores extendidos;
e) repetir las etapas c) y d) una o mas veces de manera que se proporcionen cebadores extendidos que comprendan una pluralidad de marcadores.
60
[0196] Preferentemente las secuencias de las moleculas de acido nucleico presentes en dicha primera localizacion y en dichas localizaciones son diferentes entre sf, es decir, se secuencia una pluralidad de colonias que comprenden moleculas de acido nucleico diferentes.
65 [0197] A la vista de la descripcion anterior, se apreciara que se puede utilizar una gran cantidad de metodos de
secuenciacion diferentes utilizando colonias de la presente invencion. En estos metodos se pueden utilizar diversos sistemas de deteccion para detectar marcadores utilizados en secuenciacion (aunque en determinadas realizaciones la deteccion puede ser posible simplemente a ojo, de manera que no se necesite un sistema de deteccion). Un sistema de deteccion preferido para marcadores fluorescentes es una camara de dispositivo de carga acoplada 5 (CCD) que opcionalmente se puede acoplar a un dispositivo de aumento. Se puede utilizar cualquier otro dispositivo que permita la deteccion y, preferentemente, tambien la cuantificacion de fluorescencia en una superficie. Se pueden seleccionar dispositivos tales como dispositivos formadores de imagenes fluorescentes o microscopios confocales.
[0198] En realizaciones menos preferidas, los marcadores pueden ser radioactivos y por tanto podna ser 10 necesario un dispositivo de deteccion de radioactividad. En el mejor de los casos, dichos dispositivos senan sistemas de formacion de imagenes de radioactividad en tiempo real. Tambien, menos preferidos son otros dispositivos basados en pantallas de fosforo (Moleculal Dynamics) o en pelfculas de autorradiograffa para la deteccion.
15 [0199] Dependiendo de la cantidad de colonias a monitorizar, se puede preferir un sistema de escaneo para recoger datos. (Aunque una alternativa es proporcionar una pluralidad de detectores para permitir recuperar todas las colonias). Dicho sistema permite que un detector se desplace con respecto a una pluralidad de colonias a analizar. Esto es util cuando todas las colonias que proporcionan senales no estan dentro del campo visual de un detector. El detector puede mantenerse en una posicion fija y las colonias a analizar pueden desplazarse al campo 20 visual del detector (por ejemplo, mediante una plataforma movible). Como alternativa las colonias pueden mantenerse en una posicion fija y el dispositivo de deteccion puede desplazarse para llevarlas a su campo visual.
[0200] El sistema de deteccion se utiliza preferentemente en combinacion con un sistema de analisis para determinar la cantidad de bases (y preferentemente tambien la naturaleza) incorporada por la extension de 25 cebadores en cada colonia despues de cada etapa. Este analisis se puede realizar inmediatamente despues de cada etapa o mas adelante, utilizando datos registrados. La secuencia de las moleculas de acido nucleico presentes dentro de una colonia determinada puede despues deducirse a partir del numero y del tipo de nucleotidos anadidos despues de cada etapa.
30 [0201] Preferentemente el sistema de deteccion es parte de un aparato que comprende otros componentes. La presente invencion incluye un aparato que comprende una pluralidad de nucleotidos marcados, una polimerasa de acido nucleico y medios de deteccion para detectar nucleotidos marcados cuando se incorporan en una molecula de acido nucleico por extension de cebadores, adaptandose los medios de deteccion para diferenciar entre senales proporcionadas por los nucleotidos marcados incorporados en las diferentes colonias.
35
[0202] El aparato tambien puede incluir medios de control de temperatura, de suministro de disolventes y de lavado. Tambien puede ser automatico.
[0203] Los metodos y aparatos dentro del ambito de la presente invencion se pueden utilizar en la secuenciacion 40 de:
• moleculas de acido nucleico no identificadas (es decir secuenciacion de novo);
• y moleculas de acido nucleico que se van a secuenciar para verificar si estan presentes una o mas diferencias relativas a una secuencia conocida (por ejemplo, identificacion de polimorfismos). Algunas veces esto recibe el
45 nombre de “resecuenciacion”.
[0204] Tanto la secuenciacion de novo como la resecuenciacion se analizan mas adelante con mayor detalle (veanse los siguientes apartados (v) y (vi)).
50 [0205] Para las aplicaciones de secuenciacion de novo, el orden de los nucleotidos aplicados a una localizacion determinada puede seleccionarse segun se desee. Por ejemplo se puede seleccionar la adicion secuencial de los nucleotidos dATP, dTTP, dGTP, dCTP; dATP, dTTP, dGTP, dCTP; y asf sucesivamente. (Generalmente se repetira un solo orden de cuatro nucleotidos, aunque esto no es esencial). Para las aplicaciones de resecuenciacion, el orden de los nucleotidos a anadir en cada etapa se selecciona preferentemente de acuerdo con una secuencia 55 conocida.
[0206] La resecuenciacion puede ser de particular interes para el analisis de una gran cantidad de moleculas molde similares para detectar e identificar diferencias de secuencias (por ejemplo para el analisis de plasmidos recombinantes en clones candidatos despues de mutagenesis dirigida o, lo que es mas importante, para la 60 exploracion de polimorfismos en una poblacion). Las diferencias de una secuencia determinada pueden detectarse mediante la ausencia de incorporacion de uno o mas nucleotidos presentes en la secuencia determinada a fases particulares de extension de cebadores. A diferencia de las tecnicas mas habitualmente usadas, el metodo de la presente invencion permite la deteccion de cualquier tipo de mutacion, tal como mutaciones, inserciones, o deleciones puntuales. Ademas, no solo mutaciones existentes conocidas, sino tambien mutaciones previamente no 65 identificadas pueden caracterizarse con el suministro de informacion de secuencias.
25
[0207] En algunas realizaciones de la presente invencion, pueden haberse secuenciado moleculas de acido nucleico largas mediante diversas reacciones de secuenciacion, permitiendo cada una de ellas la determinacion de parte de la secuencia completa. Estas reacciones se pueden realizar en diferentes colonias (donde cada una de las diferentes colonias se proporciona con las mismas moleculas de acido nucleico a secuenciar pero con diferentes 5 cebadores), o en ciclos sucesivos aplicados a la misma colonia (donde entre cada uno de los ciclos, los cebadores y los productos de extension se retiran mediante lavado y se reemplazan por cebadores diferentes).
(iv) Huella de ADN
10 [0208] Esta realizacion de la presente invencion tiene por objeto resolver el problema de explorar una gran poblacion para la identificacion de caractensticas determinadas de genes determinados, tales como la deteccion de polimorfismos mononucleotfdicos.
[0209] En una realizacion preferida, esto consiste en generar ADN genomico etiquetado (vease el apartado G(ii) 15 anterior). (Por tanto cada muestra originada a partir de una muestra individual determinada se ha marcado con una
sola etiqueta). Este ADN etiquetado se puede utilizar para generar colonias primarias en una superficie apropiada que comprende cebadores inmovilizados. Despues se pueden realizar diversos ensayos de hibridacion de sondas sucesivos en las colonias. Entre cada ensayo la sonda precedente puede retirarse, por ejemplo, mediante desnaturalizacion termica y lavado.
20
[0210] Las ventajas de esta realizacion de la presente invencion sobre las estrategias para resolver este problema se ilustran en el siguiente ejemplo de una posible aplicacion practica.
[0211] Se pretende detectar que parte de un gen (de un tamano, por ejemplo, de 2000 bases), si hubiere, esta 25 relacionada con un fenotipo de enfermedad en una poblacion de tipicamente 1.000 a 10.000 individuos. Para cada
individuo, se puede realizar una amplificacion por PCR para amplificar espedficamente el gen de interes y ligar una etiqueta y un cebador que genere una colonia (en referencia al apartado G(iv), preparacion de “ADN etiquetado”).
[0212] Para obtener una matriz representativa de muestras, se podna querer disponer 500.000 colonias al azar (es 30 decir una redundancia de 10 veces, para tener solamente una pequena probabilidad de perder la deteccion de una
muestra. Con una densidad de colonia de 10.000 colonias por mm2, se puede utilizar una superficie de -7 mm x 7 mm. Esta es una superficie mucho mas pequena en comparacion con cualquier otra tecnologfa disponible hasta ahora (por ejemplo, la estrategia HySeq utiliza 220 mm x 220 mm para el mismo numero de muestras (50.000) sin redundancia). La cantidad de reactantes (una gran parte del coste) sera proporcional a la superficie ocupada por la 35 matriz de las muestras. Por tanto, la presente invencion puede ofrecer una mejora de 800 veces sobre la tecnologfa actualmente disponible.
[0213] La utilizacion de un aparato para monitorizar el resultado de la secuenciacion o de los ensayos de hibridacion con sonda 'in situ', conlleva un tiempo del orden de 1 a 10 segundos para formar imagenes de una senal
40 fluorescente de las colonias ensayadas utilizando florescencia presente en una superficie de -1 mm2. Por tanto, se asume que el cuello de botella del metodo es el tiempo que se necesita para la formacion de imagenes resultantes del ensayo, que lleva del orden de 10 minutos para la formacion de imagenes resultantes de un ensayo de 50.000 muestras (500.000 colonias). Para proporcionar 200 ensayos que incluyen la formacion de imagenes (en una o varias superficies de 7 mm x 8 mm), utilizando la presente invencion puede llevar menos de 36 horas. Esto 45 representa una mejora de 20 veces en comparacion con el mejor metodo conocido hasta ahora (HySeq presume de 30 dfas para conseguir una tarea comparable).
[0214] Las mejoras (densidades de colonias 10 veces mas altas y formacion de imagenes en un tiempo de 1 segundo) permitinan un rendimiento mucho mas alto y finalmente el rendimiento finalmente esperado podna ser de
50 aproximadamente 2000 veces mas rapido que la mejor tecnologfa, aunque no se ha demostrado del todo, disponible hasta ahora.
[0215] Otra ventaja de utilizar la presente invencion se basa en el hecho de que supera el problema que se plantea con individuos que tienen mutaciones heterocigotas para un gen determinado. Aunque este problema puede
55 abordarse mediante metodos de secuenciacion existentes para determinar polimorfismos alelicos, los metodos de deteccion de mutaciones de alto rendimiento actuales basados en hibridacion de sondas oligonucleotfdicas puede conducir a dificultades en la interpretacion de resultados debido a una hibridacion de sondas desigual en casos de polimorfismos alelicos y por lo tanto pueden producirse errores. En esta realizacion de la presente invencion, cada colonia surge de una sola copia de un gen de interes amplificado. Si se genera un promedio de 10 colonias para 60 cada locus individual, habra un promedio de 5 colonias correspondientes a una version de un gen y 5 colonias correspondientes a la otra version del gen. Por tanto pueden puntuarse mutaciones heterocigotas mediante el numero de veces que se detecta un solo alelo por muestra genomica individual.
(v) Resecuenciacion de ADN
[0216] Esta realizacion de la presente invencion proporciona una solucion al problema de identificar y caracterizar nuevos polimorfismos alelicos dentro de genes conocidos en una gran poblacion de muestras biologicas.
[0217] En su realizacion preferida esto consiste en obtener ADN etiquetado (cada muestra que se origina de un 5 individuo determinado se ha etiquetado con una etiqueta exclusiva - vease el apartado G(iv)). Este ADN codificado
puede despues utilizarse para generar colonias primarias en una superficie apropiada que comprende cebadores inmovilizados. Despues se pueden realizar diversos ensayos de hibridacion de sondas sucesivos con las colonias en los que entre cada ensayo dclico la sonda precedente se puede retirar mediante desnaturalizacion termica y lavado. Preferentemente, la secuencia de ADN en 3', con respecto a una sonda espedfica, se puede determinar 10 directamente por secuenciacion 'in situ' (apartado I(iii), Metodos de secuenciacion).
[0218] Las ventajas de la presente invencion sobre otras estrategias para resolver este problema se ilustran en el siguiente ejemplo de una posible aplicacion practica.
15 [0219] Se desea identificar la variabilidad de la secuencia de un gen (de un tamano, por ejemplo, de 2000 bases), si hubiera, en una poblacion de tfpicamente 4 000 individuos. Se supone que se conoce una secuencia de referencia del gen. Para cada individuo, se puede realizar una amplificacion por PCR para amplificar espedficamente el gen de interes y ligar una etiqueta y un cebador que genera colonias. Para obtener una matriz representativa de muestras, se podna querer disponer 40 000 colonias al azar (es decir una redundancia de 10 veces, para tener solamente una 20 pequena probabilidad de perder la deteccion de una muestra). Con una densidad de colonia de 10.000 colonias por mm2, se puede utilizar una superficie de ~2 mm x 2 mm.
[0220] La utilizacion de un aparato con una camara CCD (que tiene una placa de 2000 x 2000 pixeles) para monitorizar el resultado del ensayo, podna llevar del orden de 10 segundos para formar una imagen de una senal
25 fluorescente de colonias en una superficie de 4 mm2. Si se supone que es posible leer al menos 20 bases durante una ronda del ensayo, esto requiere 61 etapas de formacion de imagenes (se necesitan 3n+1 etapas de formacion de imagenes para leer n numeros de bases). Si se supone que el cuello de botella del metodo es el tiempo para formar las imagenes del resultado del ensayo, esto lleva del orden de 15 minutos para formar las imagenes del resultado de un ensayo de 4 000 muestras (40 000 colonias). Para realizar 100 ensayos (en una o varias superficies 30 de 2x2 mm2) para cubrir todo el gen de interes, la presente invencion puede permitir que todo el experimento de exploracion se realice en aproximadamente un dfa, con un aparato. Esto puede compararse con los sistemas operativos mas poderosos disponibles en la actualidad.
[0221] En esta realizacion de la presente invencion, con suposiciones conservativas (densidad de colonia, tiempo 35 de formacion de imagenes, tamano de la microplaca CCD), puede alcanzarse un rendimiento de 3,2x106 bases por
hora, es decir, una mejora de 400 veces cuando se compara con el sistema mas comunmente usado en la actualidad (los secuenciadores de ADN actuales tienen un rendimiento tfpico del orden de 8 000 bases de lectura/hora).
40 (vi) Secuenciacion de ADN de novo
[0222] Esta realizacion de la presente invencion se refiere a resolver el problema de secuenciacion de nuevos genomas (o partes de los mismos) con bajo coste y en un corto periodo de tiempo, en el que la secuencia de ADN se desconoce. Puede prepararse un ADN genotipo, bien directamente a partir de ADN total de un organismo de
45 interes o de un vector en el que se ha insertado ADN. El ADN genomico preparado (de cualquier fuente) se puede utilizar para generar colonias de ADN. Despues, las colonias de ADN pueden someterse a digestion con una enzima de restriccion cortadora poco frecuente, cuyo sitio esta incluido en el enlazador, desnaturalizarse y secuenciarse.
[0223] La figura 16 representa un ejemplo de secuenciacion de ADN de novo. En este ejemplo, el ADN genomico 50 esta fragmentado en trozos de 100 a 2 000 pares de bases (vease, preparacion de fragmentos de ADN al azar,
apartado G(i)). Estos fragmentos se ligaran a enlazadores oligonucleotfdicos (IIa y IIIb, figura 16a) que incluyen secuencias espedficas para los cebadores injertados sobre la superficie ('P1' y 'P2'), una secuencia que es reconocida por una nucleasa de restriccion cortadora poco frecuente ('RE') y una secuencia correspondiente a un cebador de secuenciacion ('SP'), produciendo moldes (III, figura 16b). Utilizando este ADN preparado como molde 55 para la formacion de colonias de ADN, se obtienen colonias primarias (IV, figura 16c). Esas colonias se someten despues a digestion con la correspondiente endonucleasa de restriccion y se desnaturalizan para retirar la cadena de ADN no unida (V, figura 16d). El cebador de secuenciacion (SP) se aparea despues con el molde monocatenario unido (figura 16e). La incorporacion y deteccion de nucleotidos marcados se puede realizar despues como se ha descrito anteriormente (vease el apartado I(iii), Metodos de Secuenciacion).
60
[0224] En esta realizacion, el rendimiento que se puede obtener puede ser como mmimo 400 veces mayor que el que se puede obtener con los metodos disponibles en la actualidad.
(vii) Monitorizacion de la expresion genica de ARNm
[0225] Esta realizacion de la invencion se refiere a resolver el problema de la monitorizacion de la expresion de una gran cantidad de genes de manera simultanea.
[0226] Su realizacion preferida se representa en la figura 17.
5
[0227] En primer lugar, se prepararon colonias primarias, como se representa en la figura 3. En esta forma preferida, el ADN utilizado para esta preparacion es 'ADN genomico preparado' o 'ADN genomico etiquetado', como se describe en los apartados G(i) y G(iii), respectivamente, y en el que el ADN es del genoma completo de uno (o varios) organismo(s) o de un subconjunto de los mismos (por ejemplo, de una biblioteca de genes previamente
10 aislados). En la figura 17, las letras mayusculas “A”, “B” y “D” representan colonias que han surgido de genes que presentan niveles de expresion alto, medio y bajo respectivamente, y “E” representa colonias que surgen de genes no expresados (en casos reales, todas estas situaciones pueden no estar necesariamente presentes de manera simultanea).
15 [0228] En segundo lugar, las colonias se trataron para cambiarlas en soportes (es decir cebadores secundarios) para el crecimiento de colonias secundarias (etapa i en la figura 17a), como se describe en el apartado E. En esta fase (figura 17b), las colonias tratadas se representan con caracteres subrayados (A, B, D o E).
[0229] En tercer lugar, (etapa ii en la figura 17b) este soporte para el crecimiento de colonias secundarias se usa 20 para regenerar colonias de moldes de ARNm (o ADNc) extrafdos de una muestra biologica, como se describe en el apartado C. Si el molde es ARNm, la etapa de cebado de regeneracion de colonias se realizara con una transcriptasa inversa. Despues de una cantidad de ciclos de amplificacion de colonias determinado, preferentemente de 1 a 50, la situacion sera como se representa en la figura 17c: las colonias correspondientes a genes altamente expresados (representados por la letra “A”) estan totalmente regeneradas, ya que su regeneracion se ha iniciado por 25 muchas copias del ARNm; las colonias correspondientes a genes con niveles de expresion medios (representados por las letras “b” y “B”), se han regenerado solo parcialmente; solo algunas de las colonias correspondientes a genes poco frecuentes (representados por la letra “d”) se han regenerado parcialmente; las colonias correspondientes a las secuencias no expresadas (representadas por la letra “E”), no se ha regenerado del todo.
30 [0230] Finalmente, (etapa iii en la figura 17c), se realizaron ciclos adicionales de crecimiento de colonias (preferentemente de 2 a 50), y las colonias que no se habfan regenerado totalmente durante las etapas previas finalmente se regeneraron por completo, “b” se convierte en “B”, “d” se convierte en “D” (figura 17d): las colonias correspondientes a genes con niveles de expresion altos y medios se regeneraron del todo “A” y “B” o “B”; las colonias correspondientes a genes con niveles de expresion bajos no se regeneraron del todo “D” y “D”; las colonias 35 correspondientes a secuencias no expresadas no se regeneran del todo “E”.
[0231] Los niveles de expresion relativos de los genes se pueden obtener mediante los siguientes metodos preferidos:
40 - En primer lugar, los niveles de expresion pueden monitorizarse siguiendo la tasa de regeneracion de las colonias (es decir, midiendo la cantidad de ADN dentro de una colonia despues de diferentes numeros de ciclos de crecimiento de colonias durante la etapa (iii)) asf como la tasa a la cual una colonia se regenera estara relacionada con el numero de moleculas de ARNm (o de ADNc) que iniciaron la regeneracion de esa colonia (en primera aproximacion, el numero de moleculas de ADN despues de n ciclos, indicado como M(n), en una colonia 45 que se somete a regeneracion debe darse mediante M(n) = M0r(n"1), en la que M0 es el numero de moleculas que inicia la regeneracion de colonia, r es la tasa de crecimiento y n es el numero de ciclos);
- En segundo lugar, los niveles de expresion pueden monitorizarse contando, para cada gen, el numero de colonias que se ha regenerado y comparando este numero con el numero total de colonias correspondientes 50 para ese gen. Estas mediciones generalmente daran acceso a los niveles de expresion relativos de los genes representados por las colonias. La identificacion de las colonias se realiza preferentemente mediante huella de identificacion, de una manera esencialmente similar a la de la realizacion, apartado I(iv). Observese que no se requiere la codificacion de las muestras de ADN, pero puede considerarse como una alternativa a la identificacion directa del ADN en las colonias. Esto puede ser de interes practico porque con la codificacion se 55 pueden utilizar los mismos codigos (por tanto los mismos oligonucleotidos implicados en el ensayo del codigo) para cualquiera de los conjuntos de genes, mientras que sin codigo, se debe utilizar un conjunto diferente de oligonucleotidos espedficos para cada uno de los conjuntos de genes.
[0232] Esta realizacion de nuestra invencion tiene muchas ventajas si se compara con el estado actual de la 60 tecnica entre las que se incluyen: un rendimiento muy alto; no se requiere amplificacion previa del ARNm (aunque la
amplificacion previa es compatible con nuestra invencion); se requieren pequenas cantidades de muestras y reactantes debido a la alta densidad de las muestras con nuestra invencion; la presencia de genes altamente expresados no tiene incidencia sobre la capacidad de monitorizar genes con bajos niveles de expresion; la capacidad de monitorizar de manera simultanea niveles de expresion bajos y altos dentro del conjunto de genes de 65 interes.
[0233] Cuando el ADN inicial en la generacion de la colonia de ADN primario se realiza a partir del ADN de un genoma completo, esta realizacion tambien proporciona las siguientes caractensticas: no hay interferencia entre genes que se expresan a alto nivel y a bajo nivel aun cuando no se ha realizado una amplificacion espedfica de los genes de interes. Esta es una caractenstica exclusiva del uso de la presente invencion: la amplificacion espedfica
5 no es posible porque la suposicion inicial de esta realizacion es monitorizar los genes de expresion que pueden incluso no haberse aislado, por tanto que son desconocidos, y por tanto para los que no se conocen secuencias espedficas (exclusivas) y cuyas secuencias espedficas debenan haber sido necesarias para la amplificacion de genes espedficos. La capacidad de nuestra invencion para realizar este tipo de monitorizacion de la expresion de ARNm se debe a que cuando se preparan las colonias primarias, estadfsticamente, cada parte del genoma inicial se
10 representara mediante el mismo numero de colonias. Por tanto, el ADN frecuente y poco frecuente iniciara el mismo numero de colonias (por ejemplo, una colonia por molecula de genoma anadida). La informacion cuantitativa podna obtenerse a partir de ARNm frecuentes y poco frecuentes monitorizando la tasa de crecimiento de las colonias.
(viii) Aislamiento y caracterizacion de nuevos genes expresados
15
[0234] Esta realizacion de nuestra invencion se refiere a resolver el problema de aislar genes que estan inducidos espedficamente en condiciones determinadas, por ejemplo, en tejidos espedficos, cepas diferentes de una especie determinada o bajo una activacion espedfica. Un ejemplo practico es la identificacion de genes que se regulan positiva y negativamente despues de la administracion de un farmaco.
20
[0235] La realizacion preferida para el aislamiento de genes a partir de una muestra biologica espedfica o activada (en lo sucesivo en el presente documento denominada muestra diana) que se regula positivamente en comparacion con una muestra biologica de referencia (en lo sucesivo en el presente documento denominada muestra de referencia) se representa en la figura 18.
25
[0236] En primer lugar, se preparan colonias primarias (figura 18a). En esta forma preferida, el ADN que se utiliza para esta preparacion es ADN genomico preparado o ADN genomico etiquetado, como se describe en los apartados G(i) y G(ii), respectivamente, en el que el ADN es del genoma completo de uno (o varios) organismos o de un subconjunto de los mismos (por ejemplo de una biblioteca de genes previamente aislados), y en el que los dos
30 cebadores utilizados para la generacion de colonias (en lo sucesivo en el presente documento denominados P1 y P2) contienen un sitio de restriccion de endonucleasas. En la figura 18a, “A” representa colonias que han surgido de genes expresados en la muestra tanto de referencia como diana, “B” representa colonias que surgen de genes expresados unicamente en la muestra de referencia, “C” representa colonias que han surgido de genes expresados unicamente en la muestra diana, y “D” representa colonias que surgen de genes no expresados (en casos reales,
35 todas estas situaciones pueden no estar necesariamente presentes de manera simultanea).
[0237] En segundo lugar, las colonias primarias se anaden despues para generar cebadores secundarios como el soporte para el crecimiento de la colonia secundaria (etapa i en la figura 18a). En esta fase (b) las colonias se representan como caracteres subrayados (A,B,C,D).
40
[0238] En tercer lugar, (etapa ii en la figura 21b) los cebadores secundarios se utilizan para regenerar colonias utilizando ARNm o ADNc (representado por “mA + mB”) extrafdo de la muestra de referencia biologica como un molde, como se describe en G(v). Si el molde es ARNm, la primera etapa de alargamiento de la regeneracion de colonias se realizara con una transcriptasa inversa. Despues de suficientes ciclos de crecimiento de colonias,
45 preferentemente de 5 a 100, solamente se regeneraran las colonias correspondientes a genes expresados en la muestra de referencia (“A” y “B”), como se representa en la (figura 18c).
[0239] En la etapa (iii) las colonias se digieren con una enzima de restriccion (representada por RE) que reconoce un sitio en las secuencias cebadoras flanqueantes, P1 y P2, que se injertan sobre el soporte y que son la base de la
50 generacion de colonias primarias. Hay que destacar que, unicamente las colonias que se han regenerado durante la etapa (ii) se someteran a digestion. Esto es porque el soporte para el crecimiento de las colonias secundarias se realiza en moleculas de ADN monocatenario, que no pueden digerirse por la enzima de restriccion. Unicamente las colonias regeneradas estan presentes en una forma bicatenaria, y se someten a digestion. Despues de la digestion, la situacion es la que se representa en la figura 18d. Las colonias correspondientes a los genes expresados en la
55 muestra de referencia han desaparecido totalmente, es decir, ya no estan presentes como un soporte para el crecimiento de colonias secundarias, y las colonias correspondientes a los genes que se expresan unicamente en la muestra diana “C” y las colonias correspondientes a genes no expresados “D” aun estan presentes como un soporte para la generacion de colonias secundarias.
60 [0240] En la etapa (iv), el ARNm (o ADNc) (representado por “mA + mC”) extrafdo de la muestra diana, se usa para generar colonias secundarias. Dado que las colonias correspondientes a mA y mB ya no existen, unicamente las colonias correspondientes a mC pueden regenerarse (es decir unicamente el ARNm se expresa espedficamente en la muestra diana). Despues de suficientes ciclos de crecimiento de colonias (preferentemente de 5 a 100) la situacion es tal que unicamente se regeneran las colonias correspondientes a los genes expresados
65 espedficamente en la muestra diana (“C”, figura 18e).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0241] En la etapa (v), las colonias regeneradas “C” se usan para generar copias del ADN que contienen mediante la realizacion de diversos ciclos de crecimiento de colonias (preferentemente de 1 a 20) en presencia de los cebadores P1 y P2, como se describe en el apartado D de la presente invencion. Despues se realiza una amplificacion por PCR utilizando P1 y P2 en solucion (descrito en el apartado D) y el ADN amplificado se caracteriza mediante metodos clasicos.
[0242] La realizacion preferida para aislar genes de una muestra biologica espedfica o activada que se expresan menos que en una muestra biologica de referencia se representa en la figura 19. Las diferentes etapas implicadas en este procedimiento son muy similares a las implicadas en el aislamiento de genes que estan mas regulados que en la muestra de referencia, y la notacion es la misma que la de la figura 18. La unica diferencia es invertir el orden usado para regenerar las colonias: en la etapa (ii), el ARNm que se utiliza es el extrafdo de la muestra biologica diana (“mA + mC”) en lugar del ARNm extrafdo de la muestra biologica de referencia (“mA + mB”), y en la etapa (iv), el ARNm que se utiliza es el extrafdo de la muestra biologica de referencia (“mA + mB”) en lugar del extrafdo de la muestra diana (“mA + mC”). Como resultado, unicamente se recupera y amplifica el ADN procedente de las colonias correspondientes a los genes que se expresan en la muestra de referencia, pero no en la muestra diana (“B”, figura 19f).
[0243] Las realizaciones preferidas se indican en los siguientes parrafos:
Realizaciones
[0244]
1. Un metodo de secuenciacion de moleculas de acido nucleico amplificadas, inmovilizadas, que comprende:
(a) permitir que los cebadores se hibriden con las moleculas de acido nucleico amplificadas;
(b) extender los cebadores por adicion de un nucleotido; y
(c) detectar el nucleotido utilizado en la extension del cebador.
2. Un metodo de acuerdo con el parrafo I en el que el nucleotido anadido la etapa (b) se marca y la etapa (c) comprende detectar si el nucleotido marcado se ha utilizado o no para la extension del cebador determinando si el marcador presente en dicho nucleotido se ha incorporado o no en los cebadores extendidos.
3. Un metodo de acuerdo con el parrafo 1 o con el parrafo 2 en el que la etapa (b) comprende proporcionar a las moleculas de acido nucleico amplificadas una polimerasa de acido nucleico y un nucleotido determinado en forma marcada y no marcada o en forma marcada solo en condiciones que permitan la extension de los cebadores si una base complementaria o si una pluralidad de dichas bases esta presente en la posicion apropiada en las moleculas de acido nucleico amplificadas.
4. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior en el que las moleculas de acido nucleico amplificadas se proporcionan en forma de al menos una colonia de acido nucleico, comprendiendo la colonia una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia entre sf y que se hibridan con cebadores de manera que se permite la extension de cebadores en presencia del nucleotidos.
5. Un metodo de acuerdo con el parrafo 4 en el que las moleculas de acido nucleico amplificadas se proporcionan como una pluralidad de colonias comprendiendo cada una de ellas una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia entre sf y que se hibridan con cebadores de una manera que se permite la extension de cebadores en presencia de nucleotidos.
6. Un metodo de acuerdo con el parrafo 4 o con el parrafo 5 en el que la etapa (b) comprende proporcionar al menos una colonia con una polimerasa de acido nucleico y un nucleotido determinado en forma marcada y no marcada o en forma marcada solo en condiciones que permitan la extension de los cebadores si una base complementaria o si una pluralidad de dichas bases esta presente en una posicion apropiada en las moleculas de acido nucleico monocatenario presentes en la dicha al menos una colonia y la etapa (c) comprende detectar si el nucleotido marcado se ha utilizado o no para la extension de cebadores determinando si el marcador presente en dicho nucleotido se ha incorporado o no en los cebadores extendidos.
7. Un metodo para la secuenciacion de moleculas de acido nucleico presentes en una colonia que comprende una pluralidad de cadenas de acido nucleico inmovilizadas, comprendiendo el metodo las tapas de:
(a) proporcionar al menos una colonia que comprende una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia entre sf y que se hibridan con cebadores de una manera que se permite la extension de cebadores en presencia de nucleotidos y una polimerasa de acido nucleico;
(b) proporcionar dicha al menos una colonia con una polimerasa de acido nucleico y un nucleotido determinado en forma marcada y no marcada en condiciones que permitan la extension de los cebadores si una base complementaria o si una pluralidad de dichas bases esta presente en la posicion apropiada en las moleculas de acido nucleico monocatenario presentes en la dicha al menos una colonia;
(c) detectar si dicho nucleotido marcado se ha utilizado o no para la extension de cebadores determinando si el marcador presente en dicho nucleotido se ha incorporado o no en los cebadores extendidos.
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20
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30
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45
50
55
8. Un metodo de acuerdo con el parrafo 7 en el que en la etapa (a) se proporciona una pluralidad de colonias, comprendiendo cada una de ellas una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia entre s^ y que se hibridan con cebadores de una manera que se permite la extension de cebadores en presencia de nucleotidos.
9. Un metodo de acuerdo con el parrafo 7 o parrafo 8 en el que las moleculas de acido nucleico monocatenario estan presentes en forma amplificada en al menos una colonia.
10. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior en el que las etapas (b) y (c) se repiten una o mas veces.
11. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior en el que el marcador unido a cualquier nucleotido anadido por extension de cebador en la parte (b) y detectado en la etapa (c) se retira despues de la etapa (c).
12. Un metodo de acuerdo con el parrafo 11 en el que las etapas (b) y (c) se repiten una o mas veces y el marcador unido a cualquier nucleotido anadido por extension de cebador en la parte (b) y detectado en la etapa (c) se retira despues de cada etapa (c).
13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de los parrafos 4 a 8 en el que dichas moleculas de acido nucleico monocatenario y dichos cebadores estan inmovilizados.
14. Un metodo de acuerdo con el parrafo 5 o parrafo 8 que se usa para secuenciar, completa o parcialmente, de manera simultanea, las moleculas de acido nucleico amplificadas presentes en al menos 2 colonias diferentes que tienen diferentes moleculas de acido nucleico.
15. Un metodo de acuerdo con el parrafo 14 que se usa para secuenciar, completa o parcialmente, de manera simultanea, las moleculas de acido nucleico presentes en 10 o mas colonias diferentes que tienen diferentes moleculas de acido nucleico.
16. Un metodo de acuerdo con el parrafo 14 que se usa para secuenciar, completa o parcialmente, de manera simultanea, las moleculas de acido nucleico presentes en 100 o mas colonias diferentes que tienen diferentes moleculas de acido nucleico.
17. Un metodo de acuerdo con el parrafo 14 que se usa para secuenciar, completa o parcialmente, de manera simultanea, las moleculas de acido nucleico presentes en 1000 o mas colonias diferentes que tienen diferentes moleculas de acido nucleico .
18. Un metodo de acuerdo con el parrafo 14 que se usa para secuenciar, completa o parcialmente, de manera simultanea, las moleculas de acido nucleico presentes en 1.000.000 o mas colonias diferentes que tienen diferentes moleculas de acido nucleico.
19. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior, en el que despues de la etapa (b) el exceso de nucleotidos que no se ha usado en la extension de cebador se retira.
20. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior, en el que la etapa (c) utiliza una camara de dispositivo de carga acoplada, que se acopla a un dispositivo de aumento.
21. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior, en el que cada uno de los cuatro nucleotidos diferentes se usa en la extension de cebadores.
22. Un metodo de acuerdo con el parrafo 21, en el que dichos cuatro nucleotidos diferentes se utilizan en un orden predeterminado en ciclos repetidos.
23. Un metodo de acuerdo con el parrafo 21 o parrafo 22, en el que los nucleotidos son dATP, dTTP, dGTP y dCTP en forma marcada.
24. Un metodo de acuerdo con el parrafo 21 o parrafo 22, en el que los nucleotidos son ATP, UTP, GTP y CTP en forma marcada.
25. Un metodo como se describe en cualquier parrafo anterior con la excepcion de que las moleculas de acido nucleico bicatenario que tienen muescas en su interior se proporcionan en la etapa (a) en vez de moleculas de acido nucleico que se hibridan con cebadores.
26. El metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior en el que las moleculas de acido nucleico amplificadas o las moleculas de acido nucleico monocatenario son ADN o ARN.
27. Un metodo de acuerdo con cualquier parrafo anterior en el que las moleculas de acido nucleico amplificadas o las moleculas de acido nucleico monocatenario y/o los cebadores comprenden bases de origen natural y/o no natural.
28. Un metodo de acuerdo con uno cualquiera de los parrafos 1 a 27 en el que las moleculas de acido nucleico amplificadas o las moleculas de acido nucleico monocatenario se secuencian para determinar si en las moleculas de acido nucleico monocatenario hay una o mas diferencias de secuencia con respecto a una secuencia de referencia conocida.
29. Un metodo de acuerdo con el parrafo 28 para su uso en la identificacion de polimorfismos o mutaciones en las moleculas de acido nucleico amplificado o en las moleculas de acido nucleico monocatenario.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de secuenciacion de una molecula de acido nucleico que comprende:
    5 a. utilizar una primera colonia para proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia y que hibridan con cebadores de una manera que permite la extension de cebadores;
    b. utilizar una segunda colonia para proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico monocatenario que tienen la misma secuencia y que hibridan con cebadores de una manera que permite la extension de
    10 cebadores;
    c. proporcionar a cada colonia una polimerasa de acido nucleico y un nucleotido marcado en condiciones que permitan la extension de los cebadores si una base o una pluralidad de bases complementarias estan presentes en la posicion apropiada en las moleculas de acido nucleico monocatenario en las colonias;
    d. detectar si el nucleotido marcado se ha incorporado o no en los cebadores extendidos; y
    15 e. repetir las etapas c. y d. una o mas veces de manera que se proporcionen cebadores extendidos que comprendan una pluralidad de marcadores.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las moleculas de acido nucleico monocatenario comprenden una primera parte que tiene una secuencia que puede aparearse con un primer cebador de amplificacion y una segunda
    20 parte que tiene una secuencia complementaria a una secuencia que puede aparearse con un segundo cebador de amplificacion y, opcionalmente, una tercera parte que comprende una secuencia desconocida, estando la tercera parte situada entre la primera parte y la segunda parte.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que las colonias se forman por amplificacion de moleculas de acido 25 nucleico monocatenario en una superficie solida; o
    en el que las colonias se forman proporcionando una superficie solida, apareando moleculas de acido nucleico monocatenario en la superficie solida, y amplificando las moleculas de acido nucleico monocatenario.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las secuencias de las moleculas de acido nucleico presentes en la 30 primera y segunda colonias son diferentes entre sf
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que se secuencia una pluralidad de primera y segunda colonias que comprenden diferentes moleculas de acido nucleico.
    35 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que las colonias se monitorizan mediante un detector en una posicion fija y las colonias que van a analizarse se desplazan en el campo visual del detector; o
    en el que las colonias se monitorizan manteniendo las colonias en una posicion fija y desplazando el detector para llevar las colonias al campo visual del detector.
    40 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los nucleotidos marcados se detectan mediante un sistema de deteccion.
  6. 8. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el sistema de deteccion detecta marcadores fluorescentes.
    45 9. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el sistema de deteccion es una camara de dispositivo de carga acoplada (CCD, Charge Coupled Device), opcionalmente acoplada a un dispositivo de aumento.
  7. 10. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el sistema de deteccion se utiliza en combinacion con un sistema de analisis para determinar el numero y tipo de nucleotidos incorporados por extension de cebadores en cada colonia
    50 despues de cada etapa.
  8. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la secuencia de las moleculas de acido nucleico en cada colonia se deduce a partir del numero y tipo de nucleotidos anadidos despues de cada etapa.
    55 12. Una superficie que comprende distintas pluralidades de moleculas de acido nucleico inmovilizadas en forma de areas distintas, comprendiendo cada area una pluralidad de cadenas de acido nucleico identicas y una pluralidad de cadenas complementarias identicas a las mismas; en la que cada cadena de acido nucleico dentro de dicha area se localiza de tal manera que otra cadena de acido nucleico se localiza en la superficie a una distancia de la longitud de esa cadena; en la que diferentes areas estan constituidas por diferentes cadenas de acido nucleico amplificadas y 60 por cadenas complementarias a las mismas amplificadas, pero en la que se proporcionan secuencias identicas en el primer y segundo extremos de cada dichas cadenas de acido nucleico en cada area y se proporcionan secuencias identicas en el primer y segundo extremos de dichas cadenas de acido nucleico complementarias en cada area; y en la que cada molecula de acido nucleico amplificado inmovilizado comprende una primera parte que tiene una secuencia que puede aparearse con un primer cebador de amplificacion, una segunda parte que tiene una 65 secuencia complementaria a una secuencia que puede aparearse con un segundo cebador de amplificacion y una
    32
    tercera parte que comprende una secuencia desconocida localizada entre la primera y segunda partes.
  9. 13. La superficie de la reivindicacion 12, en la que las moleculas de acido nucleico amplificadas, inmovilizadas son moleculas de acido nucleico bicatenario que no tienen puente.
    5
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