JP2014158481A - 抗her抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体であって、抗体の毒性がEGFRアンタゴニストの毒性より少ない抗体。また、伝統的なEFGRアンタゴニストよりも皮膚科学的毒性が少ないEGFR/HER3多重特異性抗体。抗体がEGFR及びHER3の少なくとも一方の生物学的活性を阻外する抗体。抗体が腫瘍細胞増殖を阻外する抗体。
【選択図】図21
Description
この出願は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される2009年3月20日に出願された米国仮出願第61/210562号の米国特許法119条(e)項に基づく優先権の利益を主張する。
本発明は、少なくとも二の異なるHERレセプターに対して結合特異性を有する多重特異的抗HER抗体を含む抗HER抗体と、疾病又は疾患を治療するための該抗体の使用に関する。
従って、HER経路を標的とする改良された治療剤を開発する必要性が存在している。
他に定義されていない限り、ここで使用される全ての技術専門用語、表記及び他の科学的用語は、この発明に関連する当業者に共通して理解される意味を持つものである。幾つかの場合には、共通して理解される意味を持つ用語を明確化のため及び/又は参照を容易にするためにここで定義するが、ここにそのような定義を含めることが、当該分野で一般的に理解されることに対して実質的な差異を表すものと必ずしも解釈されるものではない。ここに記載され又は参照される技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当業者による一般的な方法論を用いて通常行われるものである。適切ならば、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、製造者が定めたプロトコール及び/又はパラメータに従って一般的に実施される。
本明細書及び特許請求の範囲を通して、「comprise」なる語、又は「comprises」又は「comprising」等の変形語は、記載された整数又は整数群を含むことを意味するが、如何なる他の整数又は整数群も除外するものではないことが理解されるであろう。
ループ カバット AbM Chothia 接触
---- ----- --- ------- -------
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ここで、「HER3細胞外ドメイン」又は「HER3ECD」は、細胞の外にあるHER3の細胞外ドメインを意味し、細胞膜に固定されるかもしくは循環し、その断片を含む。一実施態様では、HER3の細胞外ドメインは4つのドメイン:ドメインI、ドメインII、ドメインIII、及びドメインIVを含みうる。一実施態様では、HER3ECDはアミノ酸1−636を含む(シグナルペプチドを含む番号付け)。一実施態様では、HER3ドメインIIIはアミノ酸328−532を含む(シグナルペプチドを含む番号付け)。
HER2上の「ヘテロ二量体結合部位」は、それとの二量体形成の際にEGFR、HER3、又はHER4の細胞外ドメイン中の領域と接触又は干渉するHER2の細胞外ドメイン中の領域を意味する。該領域はHER2のドメインIIに見出される。Franklin等Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
HER2の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」HER2抗体は、ドメインIIの残基に結合し(また場合によってはHER2細胞外ドメインの他のドメイン、例えばドメインI及びIIIの残基にも付加的に結合し)、HER2−EGFR,HER2−HER3、又はHER2−HER4ヘテロ二量体の形成を、少なくともある程度は立体的に妨げることが可能である。Franklin等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、RCSBタンパク質データバンク(IDコードIS78)に寄託されたHER2−ペルツズマブ結晶構造を特性化しており、HER2のヘテロ二量体結合部位に結合する例示的な抗体を示している。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合しているDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、一般的な手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に別の定義がなされない限り、ここで使用される全ての%アミノ酸配列同一性は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して直ぐ前の段落に記載されたようにして得られる。
「前癌性」なる用語は、典型的には癌に先行又は発展する状態又は増殖を意味する。
「非転移」とは、良性であるか、又は原発部位にとどまっており、かつリンパ管系又は血管系、又は原発部位以外の組織中に侵入していない癌を意味する。一般的に、非転移癌は、ステージ0、I、又はIIの癌の何れのか癌、及び場合によってはステージIIIの癌である。
「薬学的に許容可能な担体」とは、活性成分以外の、被験者に非毒性である薬学的製剤中の成分を意味する。薬学的に許容可能な担体は、限定しないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
本発明は、少なくとも二の異なるHERレセプター、特にEGFR及びHER2、EGFR及びHER3、又はEGFR及びHER4に対して結合特異性を有する少なくとも一の抗原結合ドメインを含んでなる抗体、及び機能的抗体断片を提供する。これらの多重特異性抗体は、異なる結合特異性を有する(通常は二の)抗原結合ドメインを持つ伝統的な多重特異性抗体とは異なる。ある実施態様では、ここで記載される多重特異性抗体は、IgG(又はFab)の分子構造を持ち、よって治療法の開発のためのIgGの好ましい属性、例えば、予想可能な薬物動態特性、十分に確立された製造プロトコル、Fc媒介エフェクター機能の選択、及び二価又は一価の価数を保持している。これらの好ましい属性は、二の異なる抗体断片を一分子に組立てることにより得られる伝統的な多重特異性抗体ではしばしば欠如する。
一実施態様は、各抗原結合ドメインが同じ特異性を持ち、二の異なるHERレセプターに特異的に結合する、二の抗原結合ドメインからなる多重特異性抗体を提供する。特定の一実施態様では、各抗原結合ドメインはEGFR及びHER3双方に特異的に結合する。他の実施態様では、各抗原結合ドメインはEGFR及びHER2双方に特異的に結合する。他の実施態様では、各抗原結合ドメインはEGFR及びHER4双方に特異的に結合する。更に他の実施態様では、各抗原結合ドメインはEGFRのドメインIIIに特異的に結合する。他の実施態様では、各抗原結合ドメインはHER3のドメインIIIに特異的に結合する。更に他の実施態様では、各抗原結合ドメインはEGFRのドメインIII及びHER3のドメインIIIに結合することが可能である。
ある実施態様では、各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一実施態様では、VHVLユニットは、二の異なるHERレセプターに特異的に結合する。特定の一実施態様では、VHVLユニットは、EGFR及びHER3に特異的に結合する。他の実施態様では、VHVLユニットは、EGFR及びHER2に特異的に結合する。他の実施態様では、VHVLユニットは、EGFR及びHER4に特異的に結合する。
一実施態様では、多重特異性抗体はヒトEGFR及びヒトHER3に特異的に結合し、少なくともEGFRの生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、多重特異性抗体はヒトEGFR及びヒトHER3に特異的に結合し、少なくともHER3の生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、多重特異性抗体はヒトEGFR及びヒトHER3に特異的に結合し、EGFR及びHER3双方の生物学的活性を阻害する。
別の実施態様では、抗体はヒトEGFR及びヒトHER4に特異的に結合し、少なくともEGFRの生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、抗体はヒトEGFR及びヒトHER4に特異的に結合し、少なくともHER4の生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、抗体はヒトEGFR及びヒトHE4に特異的に結合し、EGFR及びHER4双方の生物学的活性を阻害する。
ある実施態様では、ここに記載される抗体は、少なくとも部分的には、それらが結合しないHERレセプターに動因される生物学的活性を阻害する。例えば、EGFR及びHER3に結合する抗体はHER2動因の生物学的活性を阻害することができるかも知れない。
EGFRのリン酸化を受けて活性化される二の主要な下流のシグナル伝達経路はRas/MAPK及びホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)/Akt経路である。従って、HERレセプターの生物学的活性を阻害するここでの抗体の能力は、例えばNR6細胞で、これらの経路の活性を遮断可能かどうか評価することによって測定することができる。このように、該抗体が、リガンド誘導によるp44/42MAPK、pAKT、又は他の下流のシグナル伝達分子のリン酸化をブロックする能力を測定することが可能である。HER3シグナル伝達は、c−met及びFGFRを含む幾つかの他の経路にも関与している。ここでの抗体のHERレセプターの生物学的活性を阻害する能力は、これらの経路の活性化を遮断可能かどうかを評価することにより測定することができる。
単一特異性抗体は、更なる多様化のために鋳型抗体として使用されることが可能であり、他のHERレセプター又は他の標的抗原に対する結合特異性を付与する。
EGFRアンタゴニストの毒性は、前臨床及び臨床試験双方において十分に文献化されている。例えば、抗EGFR抗体セツキシマブは治療上有効なレベルで様々な形態の毒性を示す。セツキシマブ(ERBITUX(登録商標), Imclone)に伴う最も一般的な副作用は(発生率≧25%)、皮膚副作用(発疹、掻痒、及び爪の変化を含む)、頭痛、下痢、及び感染症である。セツキシマブ治療に伴う最も深刻な副作用は、注入反応、心肺停止、皮膚科学的毒性及び放射線皮膚障害、敗血症、腎不全、間質性肺疾患、及び肺動脈塞栓である。Biologics License Agreement (BLA) for cetuximab (出願番号:125084) (出典明示によりここに援用)を参照。同様の毒性問題がパニツムマブ (VECTIBIX(登録商標) Amgen)に観察され、該抗体を投与された患者の89%に皮膚科学的毒性が生じた。これらの毒性は深刻であり、CTCグレード3以上であった。(VECTIBIX(登録商標) FDA label.)
「毒」又は「毒性」とは、被験者に投与された場合に薬剤によって引き起こされる副作用を意味する。毒性の基準は、死亡率、体重減少、臓器不全、臓器機能の変化、中枢神経系毒性、胃腸毒性(例えば下痢に現れる)、皮膚科学的毒性(例えば、発疹、皮膚病変、落屑、又は掻痒の出現に現れる)、心毒性、感染症、敗血症、細胞毒性を含むが、これに限られない。
毒性は、臨床症状観察、体重、食事量、呼吸数、パルスオキシメータ測定、身体検査、眼科評価、神経学的評価、代謝パラメーター、循環器系パラメーター、臨床病理学(臨床化学、血液学、尿及び凝固パラメーター)、及び巨視的及び微視的病変のような当該分野において知られている方法によって判定することができる。
毒性は、全毒性事象又は毒性事象の重症度によって評価される。事象の重症度は、CTCAEにて設定されたグレーディング方式を使用して記載することが可能である。グレードは、一般的なガイドラインに基づいて重症度の独特の臨床記述を使用して各有害事象が割り当てられ、グレード1は軽度の事象、グレード2は中等度の事象、グレード3は高度の事象、グレード4は生命を脅かす又は活動不能に至る事象、及びグレード5は事象による死亡を意味する。CTCAEは、毒性事象に対して特定の臨床記述を提供する。皮膚科学的毒性に対する記述は、CTCAE,v.3のページ14の冒頭部に提供されている。例として、図32は、発疹/落屑及び挫瘡/挫瘡様発疹に関するグレーディングを示す(CTCAE、v.3)。毒性の潜在指標を監視するために使用される当該分野で知られたモデルは多くあり、インビトロ細胞ベースモデル及びインビボ非ヒト動物モデルを含むがこれに限定されない。毒性は臨床治験においてヒト被験者でもまたモニターされる。
セツキシマブの臨床研究において、挫瘡様発疹、皮膚の乾燥及び亀裂、及び続発性炎症及び感染症を含む皮膚科学的毒性が観察された。報告された皮膚科学的毒性の発生は89%と高かった(進行した結腸直腸癌を持つ患者に対して)。
EGFR経路を標的とする低毒性抗体を提供することが望まれる。セツキシマブなどのEGFRアンタゴニストの投与は、毒性(主に皮膚科学的毒性及び注入反応)により制限される。低毒性抗体は、増大した抗腫瘍効果を生じうるより毒性のEGFRアンタゴニストより高用量で投与できるであろう。従って、本発明の一態様は、EGFR及び少なくとも一の他のHERレセプター(HER2、HER3、及び/又はHER4)に特異的に結合する多重特異性抗体を提供し、ここで、該抗体及びEGFRアンタゴニストが等量で投与された場合に、抗体がEGFRアンタゴニストより低毒性である。一実施態様では、抗体はEGFR及びHER3に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体はEGFR及びHER2に特異的に結合する。更に別の実施態様では、抗体はEGFR及びHER4に特異的に結合する。
他の実施態様では、抗体を投与された被験者における毒性の発生率は、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、又は1%未満である。
他の実施態様では、抗体を投与された被験者での全皮膚学的毒性発生の割合は80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、又は1%未満である。
他の実施態様では、多重特異性抗体を投与された被験者でのグレード3又はそれ以上の毒性発生の割合は、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%未満である。
他の実施態様では、多重特異性抗体を投与された被験者でのグレード3又はそれ以上の皮膚科学的毒性発生の割合は、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%未満である。
幾つかの実施態様では、EGFRアンタゴニストは抗EGFR抗体である。一実施態様では、EGFRアンタゴニストはセツキシマブである。別の実施態様では、EGFRアンタゴニストはパニツムマブである。別の実施態様では、EGFRアンタゴニストは小分子である。一実施態様では、EGFRアンタゴニストはエルロチニブである。一実施態様では、インビボモデルはサルであり、例えばカニクイザルである。別の実施態様では、インビボモデルはヒトである。
幾つかの実施態様では、本発明は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗原結合ドメインは、他のHERレセプターを含む、他の標的に特異的には結合しない。
一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号:25のアミノ酸配列を含んでなるVH(重鎖可変ドメイン)を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号:40のアミノ酸配列を含んでなるVL(軽鎖可変ドメイン)を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号:25のアミノ酸配列を含んでなるVH、及び配列番号:40のアミノ酸配列を含んでなるVLを含む。
一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:40、41、42、43、44、45、又は46のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVLを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVH、及び配列番号:40、41、42、43、44、45、又は46のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVLを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列の全3HVRを含んでなるVH、及び配列番号:40、41、42、43、44、45、又は46のアミノ酸配列の全3HVRを含んでなるVLを含む。幾つかの実施態様では、HERは伸張HVRである。
一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER2に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVHを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER2に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:36、37、又は38のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVLを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER2に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVH、及び配列番号:36、37、又は38のアミノ酸配列のHVRの1、2、及び/又は3を含んでなるVLを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER2に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列の全3HVRを含んでなるVH、及び配列番号:36、37、又は38のアミノ酸配列の全3HVRを含んでなるVLを含む。幾つかの実施態様では、HERは伸張HVRである。
一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:40のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するVLを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するVH、及び配列番号:40のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するVL及びを含む。
一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号:64のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するVH、及び配列番号:26のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するVL及びを含む。
本発明の別の態様は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体を提供し、ここで、抗体は、配列番号:25のアミノ酸配列を含んでなるVHを含み、ここで、配列番号:25のVHは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、F29(VH)、T30(VH)、N32(VH)、V48(VH)、P52a(VH)、S53(VH)、T57(VH)、S96(VH)、又はY100(VH)にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、抗体は、一を越えるこれらの置換を含む。一実施態様では、抗体はこれらの置換の全てを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号:25のアミノ酸配列を含んでなるVHを含み、配列番号:25のVHは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、F29(VH)L;T30(VH)S;N32(VH)D、V48(VH)L、P52a(VH)A、S53(VH)A、T57(VH)S、S96(VH)A、及びY100(VH)Fからなる群から選択される一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、多重特異性抗体はEGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号:25のアミノ酸配列を含んでなるVHを含み、配列番号:25のVHは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、アミノ酸置換F29(VH)L、T30(VH)S、N32(VH)D、P52a(VH)A、及びS53(VH)A、及びY100(VH)を含む。
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはN結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。Xがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。よって、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列の何れかの存在は潜在的なグリコシル化部位を作り出す。O結合グリコシル化は、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられるが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへのN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの糖の結合を意味する。
抗体がFc領域を含む場合、そこに結合される炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297に対するN結合により一般的に結合される分枝状、二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 (1997) TIBTECH 15:26-32を参照。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えばマンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸を含み得、並びにフコースが二分岐オリゴ糖構造の「幹」のGlcNAcに結合される。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある種の改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、なされうる。
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が、ここに提供される抗体のFc領域に導入されてもよく、これによりFc領域変異体が生成される。Fc領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含んでなるヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4Fc領域)を含みうる。
FcRへの改良又は縮小された結合を有するある種の抗体変異体が記載されている(米国特許第6737056号;国際公開第2004/056312号、及びShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。
ある実施態様では、抗体変異体は、ADCCを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の位置298、333、及び/又は334での置換(残基のEU番号付け)を有するFc領域を含む。
増加した半減期及び胎児への母性IgGsの移動に関与する新生児Fcレセプター(FcRn)(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合性を有する抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934A1(Hinton等)に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434の一又は複数での置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するものを含む(米国特許第7371826号)。
Fc領域変異体の他の例に関しては、Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5648260号;米国特許第5624821号;及び国際公開第94/29351号も参照のこと。
ある実施態様では、システイン操作抗体、例えば抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換される「thioMAbs」を作ることが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置させられ、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー薬剤部分に結合させ、ここで更に説明されるようにイムノコンジュゲートを作るために使用されうる。ある実施態様では、以下の残基の任意の一又は複数がシステインと置換されうる:軽鎖のV205(カバット番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン操作抗体は、例えば米国特許第7521541号に記載されるようにして、産生されうる。
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
(1)非極性:Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F),Trp(W),Met(M)
(2)未電荷極性:Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D),Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K),Arg(R),His(H)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明は、また化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はその断片)、又は放射性同位体、例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)などの一又は複数の細胞傷害剤にコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲート(交換可能に「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ADC」とも称される)を提供する。
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する***阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及びアナログは、例えば米国特許第4137230号;同4248870号;同4256746号;同4260608号;同4265814号;同4294757号;同4307016号;同4308268号;同4308269号;同4309428号;同4313946号;同4315929号;同4317821号;同4322348号;同4331598号;同4361650号;同4364866号;同4424219号;同4450254号;同4362663号;及び同4371533号に開示されている。
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号;同第5780588号)にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第02/088172号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、その開示の全体が明示的に出典明示により援用される「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、2004年11月5日に出願の米国特許出願第10/983340号に開示されるN末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分DE及びDFを含む。
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブピコモル濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1I、α2I、α3I、N-アセチル-γ1I、PSAG及びθI1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞傷害効果が大きく向上する。
抗体とコンジュゲートされうる他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として知られている薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP−S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、様々な放射性同位体が利用できる。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、mriとしても知られている)用のスピン標識、例えばヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射性又は他の標識が、既知の方法でコンジュゲートに導入されうる。例えば、ペプチドは生合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
該化合物は、限定するものではないが、架橋剤:(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)で調製されるADCが明示的に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467−498頁を参照。
抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)はリンカー(L)を介して、一又は複数の薬剤部分(D)、例えば1抗体につき約1から約20の薬剤部分にコンジュゲートされる。式IのADCは、(1)抗体の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してAb-Lを形成した後、薬剤部分Dと反応させること;及び(2)薬剤部分の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してD-Lを形成した後、抗体の求核基と反応させることを含み、当業者に知られている有機化学反応、状態及び試薬を用いる幾つかの手段によって調製されうる。ADCを調製するための更なる方法はここに記載される。
Ab−(L−D)p I
また他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートしてもよく、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与した後、清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
抗体は、組換え法及び組成物を使用して製造されてもよく、例えば米国特許第4816567号に記載されている。一実施態様では、ここに記載されている抗HER抗体をコードする単離核酸を提供する。このような核酸は、VLを含んでなるアミノ酸配列及び/又は抗体のVHを含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい(例えば、抗体の軽及び/重鎖)。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含んでなるアミノ酸配列及び抗体のVHを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクター、又は(2)抗体のVLを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第一ベクター、及び抗体のVHを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第2ベクターを含む(例えば、これらによって形質転換される)。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞であり、例えばチャイニーズハムスター(CHO)細胞、又はリンパ球細胞(例えばY0,NS0,Sp20細胞)である。一実施態様では、上述したように、抗HER抗体を作成する方法が提供され、該方法は、抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を培養することを含み、抗体の発現に適した状態で実施され、任意で宿主細胞(又は宿主細胞培養地)から抗体を回収する。
ここに記載される抗体及び抗体断片は、前癌性、非転移性、及び癌性の腫瘍(例えば、早期癌)を含む癌の治療のため、又は例えば乳癌など進行する危険性のある患者の治療のために使用できる。抗体及び抗体断片は、例えば神経変性疾患、精神障害、又は自己免疫疾患などの非悪性疾病を治療又は予防するために使用されうる。
上皮癌は一般的に良性腫瘍から前浸潤ステージ(例えば、上皮内癌)、基底膜を突き抜け上皮下間質に侵入した転移性癌に発展する。
多重特異性抗体はまたHER経路標的治療に対する耐性を低減又は防止するのにも有用である。HER経路を標的とする治療をする際に重大な制限は、治療の治療効果に多くの癌患者が見せる耐性である。ある患者はHER経路標的治療に何の反応も示さない。他の癌患者は初期反応は示すが、治療に対して耐性を持つようになる。癌が治療を受けている間に進行(不応)し、又は癌が治療計画を完了後12ヶ月以内に進行(再発)した場合、癌は治療に耐性である。
一実施態様では、HER経路標的治療は、HER経路を標的をした抗体(例えば、EGFR抗体、HER2抗体、HER3抗体、及び/又はHER4抗体)での治療を含む。別の実施態様では、HER経路標的治療は化学療法剤での治療を含む。
ここでの抗体又は抗体断片組成物は、良好な医療行為と一致した様式で、処方され、用量決定され、投与されるであろう。この文脈で考慮される要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の被験者、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、組合せられる薬剤の薬物-薬物相互作用、及び医師に知られている他の要因が含まれる。投与される抗体又は抗体断片の「治療的に有効な量」は、それらの考慮によって支配され、癌を予防し、寛解させ、又は治療するのに必要な最小量である。抗体又は抗体断片は、癌又は癌を発症するリスクを予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤する必要はないが、場合によってはそのようにされる。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体又は抗体断片の量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の因子に依存する。これらは、一般に、これまでに使用されるものと同じ用量及び投与経路で、又はこれまでに用いられた用量の約1から99%で、用いられる。一般に、癌の寛解又は治療は、癌に伴う一又は複数の症状又は医療的問題を減少させることを含む。治療的に有効な量の薬剤により、次のものの一つ又は組合せを達成することができる:癌細胞の数の減少(少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又はそれ以上);腫瘍サイズ又は腫瘍負荷の減少;癌細胞の周辺器官への浸潤の阻害(すなわち、ある程度に減少させ、及び/又は停止させる);腺腫の場合はホルモン分泌の減少;血管密度の減少;腫瘍転移の阻害;腫瘍増殖の減少又は阻害;及び/又は癌に関連する一又は複数の症状のある程度の緩和。幾つかの実施態様では、抗体又は抗体断片は、患者における癌の発症又は再発を予防するために使用される。
更に他の実施態様では、本発明の治療法は、様々な抗癌治療で治療される癌であると疑われるか診断された一群のヒト患者において奏効率を有意に増加させる。奏効率は治療に反応した治療された患者の割合と定義される。一態様では、抗体又は抗体断片と外科手術、放射線療法、又は一又は複数の化学療法剤を使用する本発明の併用治療法は、外科手術、放射線療法、又は化学療法単独で治療された群と比較して治療患者群において奏効率を有意に増大させ、該奏効率は0.005未満のχ二乗p値を有する。
癌の治療における治療効果の更なる測定法は米国特許出願公開第20050186208号に記載されている。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候に応じて、必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを更に含有可能である。このような分子は、意図する目的にとって効果的な量で組合せて、適切に存在する。
また、活性成分は、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されていてもよい。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
一例では、障害又は腫瘍の位置が許せば、抗体又は抗体断片は、例えば直接注入により局所投与され、注入は周期的に繰り返されうる。抗体又は抗体断片はまた患者に全身性に又は腫瘍細胞に例えば腫瘍の外科的切除後に局所再発又は転移を防止又は低減するために腫瘍又は腫瘍床に直接的に送達させることが可能である。
本発明の抗体は、抗癌性を有する第2の化合物と、併用治療法として、薬学的併用製剤又は投与レジメンで組合せることができる。薬学的併用製剤又は投与レジメンの第2の化合物は、互いに悪影響を及ぼさないように、組合せの抗体に対して相補活性を有しうる。一実施態様では、多重特異性抗体は他の抗HER抗体、例えばハーセプチン(登録商標)、ペルツズマブ、及び/又はセツキシマブと組合わせて使用される。本発明の抗体はまた放射線療法と組合わせて使用されうる。
他の治療レジメンは、この発明に従って同定された抗癌剤の投与と組合せることができる。併用療法は同時の又は逐次的レジメンとして投与されうる。逐次的に投与される場合、組合せは2又はそれ以上の投与で投与されうる。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の薬学的組成物を使用した同時投与、及び何れかの順序での連続投与が含まれ、ここで、双方(又は全ての)活性剤がその生物活性を同時に奏する期間がある。
併用療法は、併せて使用される活性成分が化合物を別個に使用して得られた効果の合計よりも大きい場合に「相乗効果」をもたらし、「相乗的」、つまり効果が達成されることが分かる。相乗効果は、活性成分が、(1)同時処方され、併用された単位投薬製剤として同時に投与又は送達され;(2)別個の製剤として交互に又は平行して送達される場合;又は(3)ある種の他のレジメンによって、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別個にシリンジで、異なった注射によって逐次的に投与され又は送達されるときに達成できる。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効用量が逐次的、つまり連続的に投与される一方、併用療法では二又はそれ以上の活性成分の有効用量が併せて投与される。
本発明の他の実施態様は、癌の治療に有用な物質を含む製造品である。製造品は、容器と容器上の又は容器に付随されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に効果的な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の多重特異性抗体又は抗体断片抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状を治療するために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与するための注意書きを更に含む。ここに記載された併用療法剤を含む製造品及びキットもまた考えられる。
加えて、製造品は、更に、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第2の容器を更に具備しうる。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含むこともできる。
ヒトEGFRに結合する抗体の単離及び特徴付け
材料
酵素及びM13−KO7ヘルパーファージはNew England Biolabsから購入した。大腸菌XL1−BlueはStratageneからである。ウシ血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン、及びTween20はSigmaから購入した。ニュートラアビジン、カゼイン及びSuperblockはPierceから購入した。抗M13コンジュゲート西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)はAmersham Pharmaciaから購入した。マキシソープイムノプレートはNUNC(Roskilde, Denmark)から購入した。テトラメチルベンジジン(TMB)基質はKirkegaard及びPerry Laboratories(Gaithersburg, MD)から購入した。
ファージディスプレイ抗体ライブラリーを、ヒト化4D5(h4D5,トラスツズマブ)からのヒト抗体フレームワークに基づいて生成させ、そこで、側鎖及び鎖長多様性を、第一ライブラリー(ライブラリー1)中の重鎖相補性決定領域(CDR1,CDR2,CDR3)中に、また第二ライブラリー(ライブラリー2)中の重鎖CDRs及び軽鎖CDR3中に導入し、記載されたように(Lee等, J. Mol. Biol, 340:1073-1093 (2004))、重鎖中の多様化になお焦点を当てた。ライブラリーは、使用した縮重オリゴヌクレオチドを適度に修飾した点を除いて、記載されたようにして(Lee等, J. Mol. Biol, 340:1073-1093 (2004))構築した。
ライブラリー1及びライブラリー2に、標的(hEGFR−ECD−Fc(ヒトIgG1のFc領域に融合したヒトEGFR細胞外ドメイン)及びEGFRvIII−Fc)結合選別を直接施した。GFRvIII−Fcタンパク質は、hIgG1のFc領域に融合した(E1−P353(シグナルペプチドは含まない))殆どのドメインIIを失ったEGFRの変異体である。Kuan, C-T等, Endocrine-Related Canc. 8:83-96 (2001);Bigner, S H等, Cancer Research , 50:8017-8022 (1990)を参照。96ウェルNuncマキシソーププレートにPBS(0.05Mの炭酸ナトリウムバッファー,pH9.6)中の100μl/ウェルの標的抗原(hEGFR−ECD−Fc,EGFRvIII−Fc)(5μg/ml)を、4℃で一晩又は室温で2時間、コートした。プレートを交替遮断薬でブロックした。選別の第一ラウンドでは、1013ファージ/ml(3−5OD/ml)のファージ溶液を、コートされた抗体と共に18時間インキュベートした。ファージの投入は、以下のように、各選別ラウンドで減少させた:第一ラウンド3〜5OD/ml、第二ラウンド3OD/ml、第三ラウンド0.5〜1OD/ml及び第四ラウンド投入0.1〜0.5OD/ml。希釈したファージを氷上で30分間インキュベートした。1μMのFc融合タンパク質を、Fc結合剤を除去するために第三ラウンドから遮断ファージに加えた。イムノプレート上で固定化抗体結合させるためファージ溶液をインキュベートした後(8の標的抗原コートウェル及び2つの未コートウェルに対して100μl/ウェル)、イムノプレートをPBS及び0.05%のTween20で少なくとも10回連続的に洗浄した。結合ファージを、20分間室温で100ul/ウェルの100mMHCLで溶出させた。(コートウェルからの)溶出ファージ及び(未コートウェルからの)バックグラウンドファージを、1/10体積の1MのTris,pH11.0及びBSAを最終0.1%まで加えることにより中和させた。標的抗原に特異的に結合したFabをディスプレイするファージクローンの豊富化を研究するために、抗原コートイムノプレートウェル当たりのファージの回収を算出し、コート抗原無しのブロックされたウェルのものと比較した。溶出されたファージは、大腸菌で増殖させ、選別のさらなるラウンドに使用した。
スクリーニングのためにラウンド4からランダムクローンを選別し、ファージELISAを使用してアッセイし、標的及び抗gDへの結合を、無関係のタンパク質(BSA、HER2,抗EGFR抗体、トラスツマブ)の結合と比較した。
384ウェル型イムノプレートに、4℃で一晩又は室温で2時間、1μg/mlの標的抗gD及び無関係タンパク質をコートし、PBS中1%のBSAで1時間ブロックした。大腸菌XL1−Blue中のファージミドクローンを、カルベニシリン及びM13−KO7ヘルパーファージが添加された150μlの2YT中で増殖させた;培養物は96ウェル型中で37℃で一晩振とうさせながら増殖させた。ファージを含む培養上清を、PBST(0.05%のTween20及び0.5%(w/v)のBSAを含むPBS)で5倍に希釈した。30μlの混合物を384ウェルのコートプレートの4ウェル毎に加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBT(0.05%のTween20を含むPBS)で洗浄し、PBST中に1nMまで5000倍希釈した抗M13抗体西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートと共に30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、およそ5分間TMB基質と反応させ、1.0MのH3PO4でクエンチし、450nmで分光光度計により読み取った。
抗gD抗体及び標的に結合するが非特定タンパク質には結合しないクローンが特異性陽性であると考えられた。VHライブラリーは、EGFR−ECD−Fc及びEGFRvIII−Fc双方のための特異性結合剤の単離を可能にした。
選択された結合クローンの結合親和性を、溶液結合競合ELISAによって決定した。
大腸菌XL1−Blue中の選択されたファージミドクローンを、カルベニシリン、カナマイシン、及びXL1−Blueヘルパーファージが添加された20mlの2YT培養液で培養され、培養は30℃で一晩培養された。ファージの上清は、20%PEG/2.5MNaClでダブルの沈殿によって精製し、PBSに再懸濁させ、濃度決定(OD/ml)のために分光光度計によって268nMで読み取った。
精製ファージを溶液競合ELISAの最適濃度を決定するために1mg/mlのhEGFR−ECD−Fcでコーティングされたイムノプレートでタイターした。
450nMで1OD/mlのシグナルを与えた希釈を溶液結合アッセイにおいて使用し、ファージを1時間、増加濃度の抗原(hEGFR−ECD)と共に最初にインキュベートし、ついで15分間、抗原被覆免疫プレートに移し、未結合ファージを捕捉した。IC50を、50%のファージが固定化抗原へ結合するのを阻害した溶液結合段階における抗原濃度として計算した。溶液結合競合ELISAを室温で実施した。選択されたクローンに対するIC50値は36.2nMから>1000nMの範囲であった。
親和性、特異性及び他の特性を精確に決定するために、選択されたクローンを遊離のhIgGとして発現させた。
軽鎖及び重鎖の可変ドメインを、哺乳動物細胞中における一過性のヒトIgG発現のために過去に設計されたベクター中にクローニングした。(Leet等, J. Mol. Biol. 23:340:1073-1093 (2004))。
ファージミドDNAのVL領域を制限酵素で消化し、DNAを、CDR L1(EcoRV)をコードする領域の上流とCDR L3(KpnI)をコードする領域の下流で切断した。ファージミドDNAのVH領域を制限酵素で消化し、DNAを、CDR H1(ApaI)をコードする領域の上流とCDR H3(BsiwI)をコードする領域の下流で切断した。
分泌された遊離のIgGをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製し、hEGFR被覆免疫プレートでの直接結合ELISAで試験した。
EGFRのドメインIIIに結合することが知られている他の抗hEGFR抗体と競合する単離抗EGFR抗体の能力を、抗hEGFR抗体により認識されるエピトープを決定するために研究した。
アッセイを競合ELISA形式で実施した。競合的ELISAでは、EGFR−ECD−Fcを2μg/mlでマキシソープ免疫プレートで固定化した。固定濃度の抗EGFR抗体(又は非特異的抗体コントロール)を被覆EGFR−ECD−Fcによって捕捉し、精製した選択抗EGFRファージ−Fabsを添加し、α−M13−コンジュゲートHRPを用いて検出した。EGFR−ECD−Fc被覆プレートへの結合をブロックされた抗体はオーバーラップするエピトープを共有する可能性が高い。
TGF−α競合ELISAでは、被覆抗ヒトFc抗体によってEGFR−ECD−Fcを最初に捕捉し、ついで固定濃度のTGF−αをEGFR−ECD−Fcによって捕捉した。精製されたファージ−Fabsを加え、α−M13コンジュゲートHRPで検出した。
最後に、EGFRの露出し欠失されたドメインを持つコンストラクトへの選択クローンの結合を評価して過去の競合ELISAを確認した。D1と標記されたクローンは抗EGFR抗体と競合し、ドメインIIIでEGFRと結合する可能性が高い。
ヒト上皮増殖因子レセプターに対する抗体の特徴付け
リガンド結合の阻害
選択された抗EGFR抗体D1が、H1666細胞(ATCC CRL-5885, Manassas, Va.)への125I−EGF結合を阻害するかどうかを決定するために、D1の精製されたIgGs型を次のようにリガンド結合アッセイにおいて試験した。H1666細胞を12ウェルプレートに播種した。次の日に増殖培地を取り除き、細胞を室温で2時間、200nMの抗体で予め処理した。20μl/ウェルの放射標識EGFを加え(細胞株のKd以下の濃度を使用)、細胞を室温で更なる2時間処理した。細胞を結合バッファーで洗浄し、可溶化し、移し、試料をアイソデータγカウンターを使用して計数した。未標識EGFを非放射性競合体として使用した。該結果は、D1がH1666細胞への125I−EGFリガンド結合を阻害することを証明している。
抗EGFR抗体D1がTGF−α誘導EGFRリン酸化を選択的にブロックするかどうかを決定するために、安定に形質移入されたEGFR−NR6細胞について2−3時間、血清を枯渇させ、様々な濃度のD1で2時間プレインキュベートした。細胞を1nMのTGF−αで刺激した。全細胞可溶化物をSDS−PAGE分析に供し、免疫ブロットを、抗ホスホチロシン及び抗EGFRを負荷コントロールとして用いてプロービングした。市販の抗EGFR抗体をポジティブコントロールとして使用した。データは、D1が細胞ベースアッセイにおいてTGF-α誘導EGFRリン酸化を阻害することを証明している。
D1の親和性成熟化
ライブラリー構築
記載されたようにして(Lee等, Blood, 108, 3103-3111, 2006)オリゴヌクレオチド指定突然変異を使用して二つのファージディスプレイライブラリー(L3/H3及びL3/H1H2ライブラリー)を作製した。ライブラリー鋳型ベクターはCDR−L3に埋め込まれた停止コドン(TAA)を含み、これは、CDR−L3(全ライブラリー)、CDR−H3(L3/H3ライブラリー)、CDR−H2及びCDR H1(L3/H1H2ライブラリー)をコードする配列に対してアニールされた縮重オリゴヌクレオチドを使用して突然変異誘発反応中に修復された。ライブラリー突然変異誘発反応はKunkel 等(Methods Enzymol. 1987;154:367-82)の方法に従って実施した。オリゴヌクレオチドは、選択された位置における天然レパートリーにおけるアミノ酸頻度を反映する多様性を微細に調整するために様々な比率で組合せた。突然変異誘発産物を、ライブラリー当たり一反応にプール化し、大腸菌SS320細胞中に電気穿孔し、記載されたように(上掲のLee等, 2004)KO7ヘルパーファージを補填して増殖させた。
アフィニティー改善選別に対しては、ファージライブラリーに第一ラウンドではhEGFR−ECD−Fcに対してプレートソーティングし、続いて3ラウンドの溶液選別を続けた。
3ラウンドの溶液選別を、選別のストリンジェンシーを増加させて実施した。免疫プレートに4℃で一晩、5ug/mlのニュートラアビジンを被覆し、Superblock (Pierce)及びPBSTでブロックした。3−5OD/mlの増殖したファージを、Superblock中の100nMのビオチン化EGFR−ECDと共にプレインキュベートし、ついで、10×希釈し、5−10分、ブロックされた免疫プレートに加えた。 プレートを8回洗浄し、ファージを溶出させ、次の溶液選別ラウンドのために増殖させ、ファージ入力(0.5OD/ml)及びビオチン化EGFR−ECDの濃度を1nMまで減少させた。
溶液選別の最終ラウンドからの無作為なクローンをスクリーニングのために拾い上げ、hEGFR−ECDと共にプレインキュベートした(又はしなかった)ファージ上清の標的に対する結合を比較するファージ単一ポイント競合ELISAを使用してアッセイした。
大腸菌XL1−Blue中のファージミドクローンを、カルベニシリン及びM13−KO7ヘルパーファージを補填した150ulの2YTブロス中で増殖させ;培養物を96ウェル形式で37℃にて一晩振とうしながら増殖させた。ファージを含む培養上清をPBST(5nMのEGFR−ECを伴うか又は伴わないで0.05%のTween20及び0.5%(w/v)のBSAを含むPBS)に5倍希釈した。OD減少(%)は次の式によって計算した:
OD450nm減少(%)=(競合体を含むウェルのOD450nm)/(競合体を含まないウェルのOD450nm)*100
25%より大きいOD減少のクローンを、溶液結合競合ELISAのために選択した。
単一スポットELISAによる選択された結合クローンの結合親和性は上述のように溶液結合競合ELISAによって定量した。
D1親クローン親和性成熟から選択された一つのクローン(D1.5)のファージIC50を上述のようにして定量した。D1.5のIC50は0.39nMであった。上述のものと同じ制限部位及び哺乳動物細胞中における一過性マウスIgG発現のために設計されたベクターを使用して、更なる特徴付けのために、D1.5をmIgG2A中に再編成した。
遊離mIgGとしての抗EGFR改善抗体の特徴付け
バイアコア測定
バイアコア(BIAcore)TM-2000での表面プラズモン共鳴アッセイを抗EGFRmIgG2Aの親和性を決定するために使用した。〜150応答単位(RU)でCM5チップ上に固定されたmIgGD1.5をバイアコアアッセイで使用した。12.5nMから200nMの増加濃度のEGFR−ECDを25℃で30μl/分で注入した。結合応答を、ブランクフローセルからのRUを減算することにより修正した。動態解析のために、kon及びkoffの同時フィッティングの1:1ラングミュアモデルを使用した。この方法で決定されたD1.5に対するKDは1.2nMであった。
親抗体からの遺伝結合エピトープを確認するために、EGFRの露出及び欠失ドメインを有するコンストラクトに対する選択クローンの結合を評価した。D1ソーティングから選択された親和性改善クローンであるD1.5は、EGFRのドメインIIIに結合した。
TGF−α誘導EGFRリン酸化を親抗体と比較してより高い効力で阻害したかどうかを決定するためにD1.5を試験した。抗体をEGFR−NR6細胞で試験し、アッセイを、実施例2において上述されたようにして実施した。市販の抗EGFR抗体をポジティブコントロールとして使用した。
結果は、D1.5が親クローンD1と比較した場合、リガンド誘導EGFRリン酸化のより高い阻害を示すことを実証した。
中等度レベルで、EGFR、HER2、及びHER3を発現するNHCLC癌細胞株H1666の細胞増殖をD1.5が阻害するか決定するために、アッセイが実施された。H1666細胞(ATCC CRL-5885, Manassas, Va.) は、96ウェルプレートに5000細胞の密度でシードされた。翌日、細胞は1%血清含有培地で、様々な濃度の抗体(50ug/mlまで)で同時に処理された。3日後、アラマーブルーが添加され、蛍光光度計を使用して蛍光性が検出された。結果はRFUに表されている。
結果は、D1.5はD1より細胞成長のより大きい阻害を示すことを実証した。
親和性成熟抗EGFR抗体D1.5のインビボ効果を立証するために、A431異種移植片モデルが使用された。A431細胞は増幅型EGFRであり、抗EGFR抗体に非常によく反応する。該研究は、nu/nuマウスでなされ、市販の抗EGFR抗体が基準として使用された。
第一行程では、マウスEGFRを有するD1.5の交差反応が競合ELISAで査定された。イムノプレートは、hEGFR−ECD−Fcでコートされた。mEGFR−ECD−Fcの連続希釈が一定濃度のD1.5で培養された。結果は、D1.5はマウスEGFRと交差反応したことを示した。インビボでの有効性研究のために必要な投与を査定するために、D1.5が単回投与(50mg/kg)で注入され、血清IgG濃度はELISあで測定された。D1.5は、より早く消え、濃度の減少が注入7日後に見られた。有効性研究(A431異種移植片モデル)は、D1.5が腫瘍増殖を完全に阻害したことを示した。D1.5は、50mg/kgで、抗EGFR抗体と同じ程度に有効であった。低用量群(25mg/kg)での減少有効性は、抗体のより早いクリアランスに起因する(図1)。
軽鎖ライブラリー設計及び二重特異性抗体のスクリーニング
ライブラリー設計及び構築
D1.5鋳型に基づくライブラリは、アミノ酸構成及び抗体軽鎖のCDR長を多様化するために設計された。ランダム位置のサブセットは、これらの部位で天然のレパートリーの一部であるアミノ酸を表すように調節されたが、残りの部位は天然に生じる全20アミノ酸含むようランダム化された。更に、CDRはD1.5の結合に重要であるとかんがえられるため、CDRL3のランダム化位置は鋳型の天然配列に偏るよう調節された。CDRL1のために、各長さは位置28−33のコドンを含む3オリゴヌクレオチドの混合であった。長L1のために、NNKが位置30及び31の間に挿入された。
CDR-L1 G70A70C70 RTT NNK NNK TAC STA
G70A70C70 RTT NNK NNK DGG STA
G70A70C70 RTT NNK NNK NMT STA
CDR L2に対しては、4つのオリゴヌクレオチドを1:1:2:10で混合した。
50 51 52 53
CDR-L2 NKK GST TCC NNK
TGG GST TCC NNK
KGG GST TCC TMT
NKK GST TCC TMT
N=A/C/G/T, D=A/G/T, V=A/C/G, B=C/G/T, H=A/C/T, K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=G/C, W=A/T, Y=C/T。
* G70A70C70 は標記されたヌクレオチドの70%及びそれぞれ10%の他の3つがおよそ50%のGlu及び50%の他のアミノ酸をコードすることを許容する。米国特許出願公開第20080069820号及びBostrom, J.等, Science 323:1610-1614(2009)を参照のこと。
F693 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 70)
F694 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 TAC 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 71)
F695 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 72)
F696 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 73)
F697 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 NNK CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 74)
F698 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 75)
F699 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号: 76)
5=70%A, 6=70%G, 7=70%C, 8=70%T (残りの3つのヌクレオチドに対して10%)
CDRL1、L2、及びL3のための3組のオリゴヌクレオチドとアニールするために、停止コドンを含む一本鎖DNA鋳型を使用してライブリは突然変異生成法(Kunkel mutagenesis)により構築された。突然変異生成法からのライブラリDNAは、エレクトロポレーションによって細菌細胞株SS320に変形導入され、ヘルパーファージKO7で成長された。構築されたライブラリーからの単一コロニーを、軽鎖のc末端におけるgDタグの検出によってディスプレイレベルについて、また単一ポットELISA形式での一次抗原(EGFR)げの結合性の保持について評価した。D1.5ライブラリーからの評価された単一コロニーの平均35%が高レベルのディスプレイを示しEGFR結合特性を保持していた。
ライブラリーを、Fab遺伝子が欠失されているか又は発現されていないクローンを除去するための捕捉標的として抗gD抗体を用いて結合選択し、hEGFR−ECD−Fcを用いて結合選択する最初のラウンドと、続いて4ラウンドの播種された抗原選択(HER2−ECD、HER2−ECD−Fc、HER2−I−III−Fc、HER3−ECD−Fc、HER4−ECD−Fc(それぞれの場合、融合コンストラクト中のFcはhIgG1の相補鎖結合断片である)に供した。別法では、それらを、t抗gD及びhEGFR−ECD−Fcでの事前の選択なしに標的結合選択に直接供した。
二重活性を有する9つのクローンがその同族の標的に対して特異的であるかどうかを決定するために、直接的プレートELISA形式における抗原パネルへのその結合を評価した。
2μg/mlの幾つかのタンパク質を4℃で一晩免疫プレート上にコートした。プレートをPBST中の1%BSAでブロックし、実施例1に記載されたようにして増殖させたファージ−Fab上清の希釈物を30分間プレートに適用した。
そのプレートを洗浄し、結合シグナルを記録し、実施例1に記載されたようにして分析した。結果は、二重特異性を有する全てのクローンがその同族標的に特異的であったことを示している。クローンD1.5−4及び親クローンD1.5をコントロールとして使用した。(図2。)
遊離mIgGとしての二重特異性を有する抗体の特徴付け
二重特異性を有する全てのクローンを、上述したものと同じ制限部位と、哺乳動物細胞中における一過性のマウスIgG発現のために過去に設計されたベクターを使用して、更なる特徴付けのためにmIgG2A中に再編成した。
二重特異性を有する7つの選択された抗体がTGF−α誘導EGFRリン酸化をブロックするかどうかを決定するために、安定に形質移入したEGFR−NR6細胞を実施例2に記載されているようにして処理した。図3のデータは、EGFR/HER3及びEGFR/HER2抗体が高濃度でTGF−α誘導EGFRリン酸化を阻害したことを実証している。市販の抗EGFR抗体をポジティブコントロールとして使用した。
クローンD1.5−100及びD1.5−103に対する用量応答は、クローンD1.5−100がEFGRリン酸化を阻害するその親クローン(D1.5)の高い効力を失ったことを示している。しかしながら、D1.5−103はこのアッセイにおいてD1.5に対して類似の効力を有していた。
分泌された抗EGFR/HER3抗体がHER3−ECD−Fcタンパク質へのヘレグリンの結合を阻害しうるかどうかを決定するために、精製したIgGsを放射標識リガンド結合アッセイにおいて試験した。
結合アッセイをNunc分解式ストリップウェルにおいて実施した。プレートを4℃で一晩、50mMのカーボネートバッファー(pH9.6)中の100μlの5mg/mLのヤギ抗ヒトAbで被覆した。プレートを洗浄バッファー(PBS/0.005%Tween20)で二回すすぎ、100μlの1%BSA/PBSで30分間ブロックした。バッファーを取り除き、各ウェルを1.5時間、1%のBSA/PBS中200ngのHER3−ECD−Fcと共にインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで3回すすぎ、1%のBSA/PBS中の抗体を4℃で一晩、HER3−IgGに予め結合させた。125I−HRGを添加し、プレートを室温で2時間、インキュベートした。プレートを3回すすぎ、個々のウェルを、100SeriesのIsoデータγ−カウンターを使用して計数した。(図4。)結果は、EGFR及びHER3に対して二重特異性を有する7つの抗体全てがHER3−ECD−Fcへのヘレグリンの結合を阻害できることを証明している。
分泌された抗EGFR/HER4抗体D1.5−400がHER4−ECD−Fcへのヘレグリンの結合を阻害しうるかどうかを決定するために、上述のリガンド結合アッセイを実施した。25ngのHER4−ECD−FcをHER3−ECD−Fcの代わりに使用した。結果は、D1.5−400がHER4へのヘレグリンの結合を阻害したことを証明している。
EGFR及びHER3に対して二重特異性を有する7つの選択された抗体がMCF7細胞においてヘレグリン誘導HER2/HER3リン酸化を阻害できたかどうかを決定するために、それらをレセプターリン酸化アッセイにおいて試験した:MCF−7細胞(ATTC HTB22, Manassas, Va.)を12のウェルプレートに播種した。血清枯渇後に、細胞を標示の抗体(75ug/ml又は150ug/ml)と共に2時間インキュベートした。細胞を0.5nMのHRGで8分間刺激し、全細胞可溶化液をSDS−PAGEに流し、ウェスタンブロットを、抗ホスホ−HER3、抗−pTyr又は抗チューブリンを負荷コントロールとして用いてプロービングした。(図5。)結果は、全ての抗EGFR/HER3抗体が高濃度でヘレグリン誘導HER2/HER3リン酸化を阻害したことを実証している。ペルツズマブ(Pmab)をポジティブコントロールとして使用した。
HRG作動性細胞増殖に対する抗EGFR/HER3抗体の増殖阻害性潜在性を決定するために、MDA−175細胞(ATCC HTB25, Manassas, Va.)(20000細胞/ウェル)を96ウェルプレートに播種した。次の日に細胞を、1%の血清を含有する培地中の様々な濃度の抗体(50ug/mlまで)で同時に処理した。4日か又は5日後に、アラマーブルーを添加し、蛍光を、蛍光光度計を使用して検出した。結果をRFUsで表した。その増殖がHRGによる自己分泌刺激の結果であるのでMDA−175細胞を選択した。抗EGFR/HER3抗体D1.5−100、及びクローンD1.5−122がMDA−175細胞増殖の阻害を示した。ペルツズマブ(Pmab)をポジティブコントロールとして使用した。(図6。)
抗hEGFR/HER3二重特異性抗体D1.5−100及びD1.5−103の変異誘発マッピング実験
アラニン及びホモログショットガンスキャニング分析を、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを使用して実施し(Vajdos等, J. Biol. Biol. 320:415-28 (2002))、 各抗体とその二つの抗原、つまりEGFR及びHER3との間の相互作用を研究した。
機能的クローンを単離するために抗原(hEGFR及びHER3)に対しての結合選別と続くDNA配列決定により、それぞれの変化する位置での野生型/変異体比の計算が可能になった。ついで、これらの比を使用して、各スキャンされた側鎖のEGFR及びHER3結合への寄与を決定した。
該結果はEGFR及びHER3に結合するための機能的なパラトープのマッピングを可能にした。
CDRs中の溶媒露出残基を、ファージディスプレイライブラリーを使用してスキャンし、野生型残基をアラニンか又は野生型(アラニンスキャン)としてあるいはホモログ残基又は野生型(ホモログスキャン)として変化させた。遺伝コードの性質から、Wt/アラニン又はWt/ホモログ残基に加えて、幾つかの他の置換がライブラリーに含められることが必要となった。別個の重鎖及び軽鎖アラニン及びホモ路津スキャニングライブラリーを構築した。縮重は1.3×105から7.5×107の範囲であった。
kunkel突然変異誘発による元々のプラスミドからのロシシンジッパーの除去後に、M13遺伝子−3マイナーコートタンパク質のC末端ドメインに融合したバクテリオファージの表面に単一Fabを発現させたことを除いて、過去に記載されたようにしてライブラリーを構築した(オリゴF220:TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT)。(配列番号:77)
軽鎖アラニン及びホモログスキャニングライブラリーは、HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3に停止コドンを有しており、重鎖アラニン及びホモログライブラリーは各重鎖HVRsに停止コドンを含んでいた。ライブラリーは、過去に記載された方法(Sidhu等, J. Mol. Biol. 338:299-310 (2004))によって、各停止鋳型についてKunkel突然変異誘発(上掲のKunkel等, 1987)を使用して構築した。アラニンスキャニングライブラリーは、選択された側鎖を野生型又はアラニンとして変化させることを可能にするファージディスプレイライブラリーである。ホモログスキャンは、そのファージディスプレイライブラリーが選択された側鎖を野生型又は類似のアミノ酸として変化させることを可能にすることを意味する。
NUNC96ウェルマキシソープ免疫プレートを5μmg/mlの捕捉標的(EGFR−ECD−Fc,HER3−ECD−Fc又はプロテイン−L)で被覆し、PBS中1%のBSA(w/v)でブロックした。上述のライブラリーからのファージを、記載されたようにして(上掲のLee等, 2004)KO7ヘルパーファージ(NEB)を用いて増幅させた。ライブラリーファージ溶液を1013ファージ粒子/mlの濃度で被覆プレートに加え、RTで1−2時間インキュベートした。プレートをPBSTで8回洗浄した後、0.1MのHClを用いて30分、結合ファージを溶出させた。各選別ラウンド後の濃縮は過去に記載されたようにして決定した。2ラウンドの標的選別後、各ライブラリーからの多くの無作為なクローンを、記載されたようにして(上掲のSidhu等, 2004)配列決定のために選択した。
図8は、上述のショットガンライブラリーを使用するD1.5−100の親和性成熟化を例証している。この親和性成熟化では、D1.5−100重鎖ホモログライブラリーを先に記載されたようにして選別した。2ラウンドのプレート選別をHER3−ECD−Fc被覆プレートにおいて実施した後、3ラウンドの溶液交替標的を、増加するストリンジェンシー下で選別した(EGFR−ECD及びHER3−ECD−Fc)。単一クローンを取り上げ、単一スポットELISAで評価して、二重結合活性を保持していたクローンを単離した。評価したクローンのなかで、94のうち79が、EGFR/HER3双方に対する結合性を示す一方、11がEGFR結合性を失い、HER3に対して特異的結合性を示す。
選別の最終ラウンドからの単一コロニーを取り上げ、実施例1に記載されたようにしてファージを増殖させた。384ウェルを1μl/mlでEGFR−ECD−Fcを被覆した。増殖させた各コロニーに対して、25μlのファージ上清又はELISAバッファーを25μlのEGFR−ECD(50nM)及びHER3−ECD−Fc(10nM)と共にインキュベートした。4μlのインキュベーションをEGFR−ECD−Fc被覆プレートに加え、プレートを8回洗浄した。60μlの1/5000の抗M13−HRPコンジュゲート抗体を加え、プレートを8回洗浄し、TMB+H3PO4を用いて反応させた。
1. 最終選別ラウンドからの単一コロニーを取り上げ、ファージを先に記載のようにして増殖させた;
2. 384ウェルプレートを1μg/mlでEGFR−ECD−Fcで被覆した;
3. 増殖させた各クローンに対して、25μlのファージ上清又はELISAバッファーを25μlのEGFR−ECD(50nM)及びHER3−ECD−Fc(10nM)と共にインキュベートした;
4. 4μlのインキュベーションをEGFR−ECD−Fc被覆プレートに加えた;
5. プレートを8回洗浄した;
6. 60μlの1/5000抗M13−HRPコンジュゲート抗体を加えた;
7. プレートを8回洗浄した;
8. プレートをTMB+H3PO4と反応させた。
EGFRとHER3の双方に対してD1.5−100よりも大なる阻害性を示す8つの独特なクローン(DL6,配列番号:63;DL7,配列番号:64;DL8,配列番号:65;DL9,配列番号:66;DL10,配列番号:67;DL11,配列番号:28;DL12,配列番号:68;DL13,配列番号:69)を選択した。抗HER3抗体に対しては、HER3に対してD1.5−100よりも大なる阻害性を示す7つのクローンを選択した。
選択された親和性成熟化二重特異性抗体の結合特異性を、実施例5に記載されたようにして様々なタンパク質のパネルへの直接の結合によって評価した。図9に示されるように、選択された抗体はEGFRとHER3の双方に対して結合特異性を示した。
IC50値を、実施例1に記載されたようにして二つの選択された二重特異性抗体(DL7及びDL11)に対して計算し、D1.5−100親クローンと比較した。双方の選択された二重特異性抗体は、HER3−ECD−Fcに対して類似の親和性を、EGFRに対して増加した親和性を示している。DL1.5−100はEGFR−ECDに対して44nMの、HER3−FCに対して0.1nMのIC50を有していた;DL7はEGFR−ECDに対して6.1nMの、HER3−FCに対して0.25nMのIC50を有していた;DL11はEGFR−ECDに対して5.7nMの、HER3−FCに対して0.43nMのIC50を有していた。
選択された抗HER3抗体の結合特異性を、先に記載されたようにして様々なタンパク質のパネルへの直接の結合によって評価した。選択された抗体(DL3.5,DL3.6,DL3.7)はHER3に対してだけ結合特異性を示す。
選択された二重特異性抗体及び抗HER3抗体の結合を、上述の競合ELISAを使用してHER3ドメインIIIタンパク質(N末端Hisタグ)の結合と比較した。EGFR/HER3及び単一特異的抗HER3抗体はHER3 ECD−Fc及びHER3ドメインIIIコンストラクトに対して類似の親和性を有している(ファージIC50)。
選択された親和性成熟化二重特異性抗体及び抗HER3抗体を、上述のように、mIgG2Aに再編成し、競合ELISAで検証した。mIgG2A二重特異性抗体は、D1.5−100親クローンと比較して、EGFR−ECD及びHER3ドメインIII双方に対して増加した親和性を示している。
EGFRに対する親和性成熟抗体DL7、DL11及び親抗体D1.5の阻害機能を評価するために、EGFRだけを発現するEGFR−NR6細胞を1時間、様々な量の抗体(20ug/mlまで)で前処理し、続いてEGFRのリン酸化をTGFα(5nM)によって誘導した。抗体によるレセプターリン酸化の阻害を、抗ホスホチロシン抗体を使用して検出した。MAPK活性化の阻害はまた用量依存的な形で見られた。抗体DL11は、EGFR及びERK1/2リン酸化の阻害においてDL7より強力であった。(図10A。)
DL11の増殖阻害機能を、市販の抗EGFR抗体、ペルツズマブ、及び抗HER3抗体のもの、又はDL3.6、D1.5、又はD1.5+DL3.6の組合せのものと比較した。H1666細胞(ATCC CRL−5885,Manassas,Va.)(HER2、HER3、EGFR及びEGFRリガンドを発現するNSCLC細胞株)(6000細胞/ウェル)をHRG(3nM)で増殖刺激した。抗体を用量依存的な形で試験し、増殖阻害特性を他の全ての単一特異的抗体と比較した。図11Aに示されるように、DL11は単一特異的抗体又はその組合せよりも大なる度合いで細胞増殖を阻害した。
DL11の増殖阻害機能を、HCA−7細胞中においてペルツズマブ、抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体、又はDL3.6、D1.5又はD1.5+DL3.6の組合せと比較した。HCA−7はHER2、HER3及びEGFRを発現する結腸直腸細胞株である。細胞増殖を1%の血清の存在下でHRG(3nM)で刺激した。抗体を用量依存的な形で試験し、アラマーブルー試薬を使用して、3日後に細胞生存率を検出した。図12Aに示されるように、DL11は他の全ての処置と比較して優れた増殖阻害特性を示した。
抗EGFR抗体、ペルツズマブ、及び抗HER3抗体と比較したDL11によるCalu−3増殖の阻害を調査した。NSCLC細胞株Calu−3(ATCC HTB−55, Manassas, Va.)は HER2を過剰発現し、通常のレベルのHER3及びEGFRを有している。細胞増殖(10000細胞/ウェル)を1%の血清の存在下でHRG(3nM)で刺激し、抗体を用量依存的な形で試験した。図13に示されるように、DL11は単一特異性抗体と比較して優れた活性を示した。
抗hEGFR/HER2二重特異性抗体のD1.5−201及びD1.5−201−2の変異誘発マッピング実験
D1.5−201の親和性成熟のために、軽鎖ソフト/ホモログライブラリーを、選択されたアミノ酸でデザインした。幾つかのソフト残基をソフト無作為化し、そこでは野生型残基頻度は50%であった。幾つかの残基は、野生型残基又はホモログ残基をコードするコドンを使用して無作為化した。幾つかのホモログ無作為化は野生型及びホモログの他に1又は2の余分な残基を許容している。最後に、幾つかの残基は変わらなかった。
図14はD1.5−201の親和性成熟のための他の選別ストラテジーを示している。このストラテジーでは、D1.5−201軽鎖ソフト/ホモログライブラリーを過去に記載されたようにして選別した。ストリンジェンシーを増加させてHER2/ECDについて3ラウンドの交互プレート/溶液選別を実施した後、単一のクローンを取り上げ、単一スポットELISAにおいて評価して、EGFR及びHER2に対して二重の結合活性を保持していたクローンを単離した。評価したクローンのなかで、77/192はEGFRとHER2の双方に対して結合性を示している。
選択された親和性成熟化EGFR/HER2二重特異性抗体に対する軽鎖可変領域の配列を決定した(D1.5−201(配列番号:36,D1.5−201−2(配列番号:37,D1.5−201−3配列番号:38)。ファージIC50を、過去に記載されたようにして、2つの選択された親和性成熟化二重特異性抗体(D1.5−201−2,D1.5−201−3)に対して計算し、D1.5−201親クローンと比較した。親和性成熟された両二重特異性抗体はHER2−ECD及びEGFR−ECDに対して増加した親和性を示している。
DL11アフィニティ成熟
DL11を上述のように更にアフィニティ成熟させて、EGFR及びHER3に対して特性を有する二つの更なる二重特異性抗体(DL11b及びDL11f)及びHER3に特異的な2つの抗体(DL3−11fb及びDL3−11f)を得た。DL11bの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号:12及び13に示す。DL11fの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号:14及び13に示す。DL3−11bの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号:19及び13に示し、DL3−11faの重鎖及び軽鎖アミノ酸をそれぞれ配列番号:20及び13に示す。
そのEGFR及びHER3標的に対するDL11b及びDL11fの結合親和性を次のバイアコアアッセイにおいて決定した。DL11bとDL11fの双方がDL11と比較してその標的に対して改善された親和性を示した。
測定は、バイアコア(BIAcore)TM 2000機器(GE Healthcare, BIAcore Life Sciences, Piscataway, NJ)での表面プラズモン共鳴を使用して行った。ヒトEGFR(アミノ酸1−637)及びヒトHER3(アミノ酸1−640)の細胞外ドメイン(ECDs)をコードするcDNAsを、ヒトFc融合タンパク質を産生させるためにヒトIgG1のFc領域をコードする配列を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。組換えヒトEGFR−IgG1(2.65mg/ml)、ヒトHER3−IgG1(3.35mg/ml)を、チャイニーズハムスター卵巣細胞を一過性に形質移入することによって製造し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを介して精製した。ヒトEGFRの細胞外ドメインをコードするcDNA(アミノ酸1−637)を、N末端フラグ配列を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。
Fab及びIgG抗体双方のDL11fに対する結合親和性を決定した。Fabアッセイでは、DL11f Fabが分析物であり、CM5チップの上に流したが、そこでは、異なったリガンド−ヒトEGFR−Fc及びヒトHER3−Fc−が、バイアコア・ヒト抗体捕捉キット(BR−1008−39,ロット10020611)を使用して最初に捕捉された。2倍希釈系列のDL11f Fabを、25℃で30ml/分の流量で、0.05%のTween20、PBS中0.244−250nMの範囲で注入した。Fc融合リガンド及び分析物の各注入間に、3Mの塩化マグネシウムを使用してセンサーチップを再生した(10μl/分の流量で5μl)。ヒトEGFR及びヒトHER3 Fc融合タンパク質へのDL11f Fabの親和性定数を決定するために、基準細胞からのシグナルを観察された試験センサーグラムから減算した。速度定数は、製造者によって供給されたバイアコア評価ソフトウェア(GE Healthcare)バージョン4.1を使用して1:1のラングミュア結合モデルに従ってダー他の非線形回帰フィッティングによって計算した。DL11f Fabの代表的な濃度(125nM)の2回の再現は全てのFc融合タンパク質に対して非常に類似したフィッティングと速度定数を与えた。DL11f Fabは、1.92nMのKD値でヒトEGFR−Fcに、かつ0.39nMのKD値でヒトHER3−Fcに結合した。
DL11bは別個のバイアコア分析において類似の条件下でEGFR及びDL11fのようなHER3に対して類似の結合親和性を示した。
DL3−11b及びDL3−11fは、HER3に特異的に結合する能力を保持しながらEGFRに特異的に結合する能力を失った。
DL11b及びDL11fによるMDA−175細胞増殖の阻害を、上述のようにして研究した。DL11bとDL11fの双方がDL11抗体と同様の度合いでMDA−175細胞の増殖を阻害した。図15。DL11、DL11f、及びDL11bのIC50は全ておよそ0.8−1.0ug/mlであった。
DL11fがMCF7細胞におけるヘレグリン誘導HER3リン酸化を阻害することができるかどうかを決定するために、実施例6に記載されたようにして、レセプターリン酸化アッセイを実施した。該結果は、DL11fが用量依存的な形でヘレグリン誘導HER3リン酸化を阻害したことを証明している。図16。
DL11fがTGF−α誘導EGFRリン酸化を選択的にブロックするかどうかを決定するために、実施例2に記載されたようにして、レセプターリン酸化アッセイを実施した。図16のデータは、DL11fがこの細胞ベースアッセイにおいて用量依存的な形でTGF−α誘導EGFRリン酸化を阻害することを証明している。
HCA−7腫瘍移植モデルを使用して、インビボ腫瘍増殖に対するDL11及びDL11fの効果を決定した。該アッセイは次の通りに実施した。
SCIDベージュマウス(Charles River Laboratories, San Diego, CA)にHCA−7腫瘍片を皮下的に移植した。腫瘍が100から250mm3の平均体積に達したとき、類似したサイズの腫瘍を持つマウスを次の通り処置コホート(n=9/群)に無作為化した:ビヒクル(PBS)、ペルツズマブ(10mg/kg)、D1.5(25mg/kg)、D1.5+DL3.6(各25mg/kg)、DL11(25mg/kg)、又はDL11f(25mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(20又は50mg/kg)で始め、全体で3回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。マウスは標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージで飼育した。動物部屋の環境管理は、およそ70oFの温度、およそ40%−60%の相対湿度、及びおよそ14時間の明/10時間の暗サイクルを維持するように設定した。マウスは実験動物の管理及び使用のためのILARガイドに従って維持し、実験はジェネンテックの研究機関の動物管理使用委員会(IACUC)によってレビューされ承認された。
DL11及びDL11fはこの異種移植片モデルにおける平均腫瘍体積を減少させるのに等しく効果的であった。図17。
ヒトNSCLC株H358(ATCC CRL−5807,Manassas,Va.)から取り出した樹立された腫瘍を持つマウスにおいて抗体を試験した。5×106H358細胞をCB17SCIDマウスにマトリゲルと共に皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つマウスを次の通り処置コホート(n=9/群)に無作為化した:ビヒクル(DL11f製剤バッファー)、D1.5(25mg/kg)、DL3.11b(25mg/kg)、DL11f(30mg/kg)、又はD1.5+DL3.11b(各25mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(50又は60mg/kg)で始め、全体で4回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
図18に示されるように、二重特異性抗体DL11fはこのNSCLCモデルにおいて活性であり、抗EGFR特異的及び抗HER3特異的抗体の組合せ(D1.5+DL3.11b)よりも腫瘍増殖の阻害においてより効果的である。
DL3.6アフィニティ成熟
DL3.6を上述のように更にアフィニティ成熟させて、更なる抗HER3抗体を得た。DL3.6bは、親抗体DL3.6と比較してその標的に対して増加した親和性を示した。DL3.6bの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号:17及び13に示す。
図19及び20に示されるように、DL3−11b、DL3.6、及びDL3.6bは、HRG誘導HER3リン酸化及びMDA−175細胞増殖を示した。アッセイは上述のようにして実施した。
頭頸部扁平上皮細胞癌モデルであるFadu異種移植片モデルにおけるインビボ活性
DL11f、市販の抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体を、Fadu細胞(ATCC HTB−43,Manassas,Va.)から由来した樹立腫瘍を持つマウスにおいて試験した。5×106FaDu細胞にCB17SCIDマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つマウスを次の通り処置コホート(n=9/群)に無作為化した:ビヒクル(DL11f製剤バッファー)、抗EGFR抗体(25mg/kg)、抗HER3抗体(50mg/kg)、及びDL11f(25mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(それぞれ50又は100mg/kg)で始め、全体で4回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
図21に示されるように、DL11fはFaDu頭頸部癌モデルにおいて活性であり、抗EGFR特異的又は抗HER3特異的抗体の何れかよりも腫瘍増殖阻害においてより効果的である。
HER3推進膵臓モデルであるBxPC3異種移植片モデルにおけるインビボ活性
DL11f、抗EGFR抗体、ペルツズマブ、及び抗HER3抗体を、膵臓細胞株BxPC3(ATCC CRL−1687,Manassas,Va.)から由来する樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。10×106のBxPC3細胞をCB17SCIDマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=8/群)に無作為化した:ビヒクル(DL11f製剤バッファー)、抗EGFR抗体(25mg/kg)、ペルツズマブ(25mg/kg)、抗HER3抗体(50mg/kg)、及びDL11f(25mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(50又は100mg/kg)で始め、全体で4回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
DL11fはBxPC3膵臓癌モデルにおいて活性であり、抗EGFR特異的又は抗HER3特異的抗体の何れよりも腫瘍増殖の遅延化においてより効果的である(図22)。
NSCLC Calu−3異種移植片モデルにおけるインビボ活性
DL11f、市販の抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体を、NSCLC株Calu−3(ATCC HTB−55,Manassas,Va.)から取り出した樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。5×106のCalu−3細胞をSCIDベージュマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=9/群)に無作為化した:ビヒクル(DL11f製剤バッファー)、抗EGFR抗体(25mg/kg)、抗HER3抗体(25mg/kg)、及びDL11f(25mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(50)で始め、全体で4(8)回の処置の間、毎週続けて(抗HER3は週2回)、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
DL11fはCalu−3非小細胞肺癌モデルにおいて活性であり、抗EGFR特異的又は抗HER3特異的抗体の何れよりも腫瘍増殖の遅延化においてより効果的である(図23)。
上皮A431異種移植片モデルにおけるインビボ活性
DL11f、市販の抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体を、類表皮細胞株A431(ATTC CRL−2592,Manassas,Va.)から取り出した樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。5×106A431細胞をSCIDベージュマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=8/群)に無作為化した:ビヒクル(DL11f製剤バッファー)、抗EGFR抗体(12.5mg/kg)、抗HER3抗体(50mg/kg)、及びDL11f(12.5及び25mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に一回腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
マウス中における抗EGFR抗体と比較したDL11fのより速いクリアランスのため、DL11fは、比較できる曝露レベルを達成するために抗FGFR抗体と比較して2×濃度で投与した。総括すると、DL11fは、抗EGFR抗体と同様に、A431表皮癌モデルにおける腫瘍増殖を阻害する。(図24。)
患者由来乳癌MAXF449の異種移植片を持つヌードマウスにおけるインビボ活性
DL11f、市販の抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体をOncotest GmbH,Freiburg,Germanyで試験した。Oncotestは、ドナー患者からの腫瘍の直接の移植後にヌードマウス中の皮下異種移植片として乳腺癌MAXF449のような患者腫瘍を継代される。Oncotestのプロトコルに従って、類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=10/群)に無作為化した:DL11f(30mg)、抗EGFR抗体(30mg/kg)、抗HER3(60mg/kg)及びビヒクル(DL11f製剤バッファー)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(それぞれ60又は120mg/kg)で始め、全体で4回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。
DL11f及び抗HER3はMAXF44乳癌モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する一方、抗EGFR抗体は効果がない(図25)。
前立腺DU145異種移植片モデルにおけるインビボ活性
DL11f、市販の抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体を、Piedmontのプロトコルに従って、Piedmont Research Center,Morrisvilleにおいて試験した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=10/群)に無作為化した:DL11f(25mg)、抗EGFR抗体(25mg/kg)、抗HER3(50mg/kg)及びビヒクル(DL11f製剤バッファー)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(それぞれ50又は100mg/kg)で始め、全体で4回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。DL11fはDU145前立腺癌モデルにおいて活性であり、抗EGFR特異的又は抗HER3特異的抗体の何れかよりも腫瘍増殖の阻害においてより効果的である。(図26)。
患者由来卵巣癌OVXF550の異種移植片を持つヌードマウスにおけるインビボ活性
DL11f、市販の抗EGFR抗体、及び抗HER3抗体をOncotest GmbH,Freiburg,Germanyで試験した。Oncotestは、ドナー患者からの腫瘍の直接の移植後にヌードマウス中の皮下異種移植片として卵巣癌OVXF550のような患者腫瘍を継代される。Oncotestのプロトコルに従って、類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=10/群)に無作為化した:DL11f(30mg)、抗EGFR抗体(30mg/kg)、抗HER3(60mg/kg)及びビヒクル(DL11f製剤バッファー)。処置剤は、無作為化の日に2×負荷用量(それぞれ60又は120mg/kg)で始め、全体で5回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。
DL11fはOVFX550卵巣癌モデルにおいて活性である。(図27。)
DL11fは抗体依存性細胞傷害性(ADCC)をインビトロ及びインビボで媒介する
DL11fは、インビトロでADCCを媒介する。A431,H292(ATTC CRL−1848,Manassas,Va.),FaDu,BxPC3及びMDA468(ATCC HTB−132,Manassas,Va.)細胞(全てATCCから)を、標記された濃度の抗体の存在下で96ウェルプレートに播種した。37℃で30分のプレインキュベーション後、単離された末梢血単核細胞(PBMC)を加え、インキュベーションを37℃で更に4時間継続した。4時間後、プレートを遠心分離し、上清を集めた。上清中のLDH活性を、Promega CytoTox−One均一膜完全性アッセイ手順に従って決定した。細胞媒介細胞傷害性パーセントを決定するために、平均吸光係数を計算し、バックグラウンドを減算した。図28に示されるように、DL11fは用量依存的な形でEGFR発現細胞株においてADCCを緩和する。
N297Aのアミノ酸置換を、エフェクター機能を欠失させるためにDL11fに導入した。N297はFcRg及び/又は補体結合に必要とされる。DL11f−N297AはインビトロでのADCCの欠如を示す。予想されたように、インビトロでのDL11fの増殖阻害機能は変異に影響されない。(図29。)
DL11f及びDL11f−N297Aを、NSCLC細胞株H292(ATCC CRL−1848,Manassas,Va.)から取り出された樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。5×106A431細胞をC.B17−SCIDマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート(n=10/群)に無作為化した:ビヒクル(DL11f製剤バッファー)、DL11f(6mg/kg)及びDL11f−N297A(6mg/kg)。処置剤は、無作為化の日に一回腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。最初に、DL11f及びDL11f N297Aは、HER経路シグナル伝達を阻害することによって、腫瘍増殖を均等に阻害した。しかし、用量が減少するにつれて、DL11fは、そのADCC能のためDL11f N297Aと比較して延長された抗腫瘍活性を示した。(図30)。
DL11fはカニクイザルにおいてセツキシマブよりも毒性が少ない
DL11f及びセツキシマブの相対的毒性を決定するための実験を実施した。カニクイザルを3群に分け、次のように、6週間にわたって一週間に一回、DL11f又はセツキシマブ (Capital Wholesale Drug, Columbus, OH)の何れかを投与した:
グループ1: セツキシマブ 25mg/kg;
グループ2: DL11f 25mg/kg;
グループ3: DL11f 12.5mg/kg。
セツキシマブを投与した3匹の動物全てが、3回目及び4回目投薬の間に皮膚病変を発症し、毒性を示した。この結果は、セツキシマブのFDA承認中に実施された先のカニクイザルの実験に基づいて予想されていた。DL11fが投与された動物の何れも実験のこの時点で毒性の徴候を示さなかった。
25mg/kg用量のDL11fを投与された動物の一匹は6回目の投薬後の一週間で皮膚病変を発症した。この病変部はおよそ4cm×7cmと測定され、非常に穏やかで、セツキシマブ処置動物において観察される病変部と比較して小領域に限られていた。
この毒性学研究における毒物動態パラメータの分析に基づくと、セツキシマブ及びDL11fの曝露は、25mg/kgの各試験化合物を投与した動物において同様であった。
カニクイザルを6群に分け、次のように、12週間にわたって毎週一回、DL11f又はビヒクルコントロールの何れかを、静脈内投与によって投与した。
グループ1: 10匹のサル(5匹の雄/5匹の雌)−ビヒクルコントロール
グループ2: 10匹のサル(5匹の雄/5匹の雌)DL11f 5mg/kg
グループ3: 10匹のサル(5匹の雄/5匹の雌)DL11f 15mg/kg
グループ4: 10匹のサル(5匹の雄/5匹の雌)DL11f 30mg/kg
グループ5: 4匹のサル(2匹の雄/2匹の雌)ビヒクルコントロール
グループ6: 4匹のサル(2匹の雄/2匹の雌)DL11f 30mg/kg
単一用量のIV投与PK実験をまたカニクイザルにおいて実施した。この実験では、一群当たり3匹のサルに1、10、又は30mg/kgのDL11fを静脈内投与した。調査した用量範囲に対するPKは非線形で、他のEGFR標的化抗体に見られた飽和クリアランスと一致していた。
実施態様
1.EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体であって、抗体の毒性がEGFRアンタゴニストの毒性より少ない抗体。
2.毒性が皮膚科学的毒性である実施態様1に記載の抗体。
3.EGFRアンタゴニストがセツキシマブである実施態様1に記載の抗体。
4.抗体がEGFR及びHER3の少なくとも一方の生物学的活性を阻害する実施態様1に記載の抗体。
5.抗体がEGFのEGFRへの結合を阻害する実施態様2に記載の抗体。
6.抗体がTGF-α誘導EGFRリン酸化を阻害する実施態様2に記載の抗体。
7.抗体が腫瘍細胞増殖を阻害する実施態様1に記載の抗体。
8.抗体はEGFRのドメインIIIに結合する実施態様1に記載の抗体。
9.抗体が10 −6 M未満のKdでEGFR及びHER3に結合する実施態様1に記載の抗体。
10.抗体が10 −6 M未満のKdでEGFRに結合し、10 −7 M未満のKdでHER3に結合する実施態様9に記載の抗体。
11.抗体が、
(a)LSGDWIH(配列番号:48)のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)VGEISAAGGYTD(配列番号:51)のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)ARESRVSFEAAMDY(配列番号:53)のアミノ酸配列を含むHVR−H3;及び
(d)NIATDVA(配列番号:55)のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)SASF(配列番号:56)のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)SEPEPYT(配列番号:57)のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む実施態様1に記載の抗体。
12.(a)配列番号:30のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン;
(b)配列番号:29のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン;又は
(c)(a)の重鎖可変ドメインと(b)の軽鎖可変ドメイン
を含んでなる実施態様1に記載の抗体。
13.配列番号:30の重鎖可変ドメインを含んでなる実施態様12に記載の抗体。
14.配列番号:29の軽鎖可変ドメインを含んでなる実施態様12に記載の抗体。
15.配列番号:30の重鎖可変ドメイン配列と配列番号:29の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる多重特異性抗体。
16.抗体は完全長IgG1抗体である実施態様1に記載の抗体。
17.実施態様1に記載の抗体をコードする単離された核酸。
18.実施態様17に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
19.EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体であって、
(a)LSGDWIH(配列番号:48)のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)VGEISAAGGYTD(配列番号:51)のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)ARESRVSFEAAMDY(配列番号:53)のアミノ酸配列を含むHVR−H3;及び
(d)NIATDVA(配列番号:55)のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)SASF(配列番号:56)のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)SEPEPYT(配列番号:57)のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む抗体。
20.EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体であって、
(a)配列番号:30のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン;
(b)配列番号:29のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、又は
(c)(a)の重鎖可変ドメイン配列と(b)の軽鎖可変ドメイン
を含む抗体。
21.配列番号:30の重鎖可変ドメイン配列を含んでなる実施態様20に記載の抗体。
22.配列番号:29の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる実施態様20に記載の抗体。
23.実施態様18に記載の宿主細胞を、抗体が生産されるように培養することを含んでなる抗体の生産方法。
24.実施態様1に記載の抗体と細胞傷害性剤を含んでなるイムノコンジュゲート。
25.実施態様1に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的製剤。
26.癌の個体を治療する方法において、実施態様1に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含んでなる方法。
27.癌が、EGFR及びHER3を発現する細胞を含む実施態様26に記載の抗体。
28.癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、及び非小肺細胞癌からなる群から選択される実施態様26に記載の抗体。
29.個体におけるHERレセプターの生物学的活性を阻害する方法において、実施態様1に記載の抗体の有効量を個体に投与してHERレセプターの生物学的活性を阻害することを含んでなる方法。
30.医薬として使用するための実施態様1に記載の抗体。
31.癌の治療に使用するための実施態様1に記載の抗体。
32.癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌である実施態様31に記載の抗体。
33.HERレセプターの生物学的活性の阻害に使用するための実施態様1に記載の抗体。
34.医薬の製造における実施態様1に記載の抗体の使用。
35.医薬が癌の治療のためのものである実施態様34に記載の使用。
36.癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌である実施態様35に記載の抗体。
37.医薬がHERレセプターの生物学的活性を阻害するためのものである実施態様34に記載の使用。
Claims (37)
- EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体であって、抗体の毒性がEGFRアンタゴニストの毒性より少ない抗体。
- 毒性が皮膚科学的毒性である請求項1に記載の抗体。
- EGFRアンタゴニストがセツキシマブである請求項1に記載の抗体。
- 抗体がEGFR及びHER3の少なくとも一方の生物学的活性を阻害する請求項1に記載の抗体。
- 抗体がEGFのEGFRへの結合を阻害する請求項2に記載の抗体。
- 抗体がTGF-α誘導EGFRリン酸化を阻害する請求項2に記載の抗体。
- 抗体が腫瘍細胞増殖を阻害する請求項1に記載の抗体。
- 抗体はEGFRのドメインIIIに結合する請求項1に記載の抗体。
- 抗体が10−6M未満のKdでEGFR及びHER3に結合する請求項1に記載の抗体。
- 抗体が10−6M未満のKdでEGFRに結合し、10−7M未満のKdでHER3に結合する請求項9に記載の抗体。
- 抗体が、
(a)LSGDWIH(配列番号:48)のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)VGEISAAGGYTD(配列番号:51)のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)ARESRVSFEAAMDY(配列番号:53)のアミノ酸配列を含むHVR−H3;及び
(d)NIATDVA(配列番号:55)のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)SASF(配列番号:56)のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)SEPEPYT(配列番号:57)のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む請求項1に記載の抗体。 - (a)配列番号:30のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン;
(b)配列番号:29のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン;又は
(c)(a)の重鎖可変ドメインと(b)の軽鎖可変ドメイン
を含んでなる請求項1に記載の抗体。 - 配列番号:30の重鎖可変ドメインを含んでなる請求項12に記載の抗体。
- 配列番号:29の軽鎖可変ドメインを含んでなる請求項12に記載の抗体。
- 配列番号:30の重鎖可変ドメイン配列と配列番号:29の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる多重特異性抗体。
- 抗体は完全長IgG1抗体である請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項17に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
- EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体であって、
(a)LSGDWIH(配列番号:48)のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)VGEISAAGGYTD(配列番号:51)のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)ARESRVSFEAAMDY(配列番号:53)のアミノ酸配列を含むHVR−H3;及び
(d)NIATDVA(配列番号:55)のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)SASF(配列番号:56)のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)SEPEPYT(配列番号:57)のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む抗体。 - EGFR及びHER3に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体であって、
(a)配列番号:30のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン;
(b)配列番号:29のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、又は
(c)(a)の重鎖可変ドメイン配列と(b)の軽鎖可変ドメイン
を含む抗体。 - 配列番号:30の重鎖可変ドメイン配列を含んでなる請求項20に記載の抗体。
- 配列番号:29の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる請求項20に記載の抗体。
- 請求項18に記載の宿主細胞を、抗体が生産されるように培養することを含んでなる抗体の生産方法。
- 請求項1に記載の抗体と細胞傷害性剤を含んでなるイムノコンジュゲート。
- 請求項1に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的製剤。
- 癌の個体を治療する方法において、請求項1に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含んでなる方法。
- 癌が、EGFR及びHER3を発現する細胞を含む請求項26に記載の抗体。
- 癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、及び非小肺細胞癌からなる群から選択される請求項26に記載の抗体。
- 個体におけるHERレセプターの生物学的活性を阻害する方法において、請求項1に記載の抗体の有効量を個体に投与してHERレセプターの生物学的活性を阻害することを含んでなる方法。
- 医薬として使用するための請求項1に記載の抗体。
- 癌の治療に使用するための請求項1に記載の抗体。
- 癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌である請求項31に記載の抗体。
- HERレセプターの生物学的活性の阻害に使用するための請求項1に記載の抗体。
- 医薬の製造における請求項1に記載の抗体の使用。
- 医薬が癌の治療のためのものである請求項34に記載の使用。
- 癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌である請求項35に記載の抗体。
- 医薬がHERレセプターの生物学的活性を阻害するためのものである請求項34に記載の使用。
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