CN104447995A - 双特异性抗-her抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗HER抗体，包括多特异性抗HER抗体，包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。本文还提供比传统EGFR拮抗剂更低毒性的EGFR/HER3多特异性抗体。

Description

双特异性抗-HER抗体
本申请是申请日为2010年3月19日、发明名称为“双特异性抗-HER抗体”的中国专利申请No.201080012374.5的分案申请。
相关申请
本申请根据35 USC 119(e)要求2009年3月20日提交的美国临时申请号61/210562的优先权的权益，其公开的全文通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及抗HER抗体，包括多特异性抗HER抗体，其具有对于至少两种不同HER受体的结合特异性，以及所述抗体治疗疾病或病症的用途。
发明背景
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包括四个独特的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因编码的EGFR已被认为是人类恶性肿瘤的病因。具体而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中已经观察到EGFR表达的升高。EGFR受体表达的升高常常与由同样的肿瘤细胞的EGFR配体，转化生长因子α(TGF-α)的产量增加有关，其通过自分泌刺激途径导致受体活化。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.(药学理论)64:127-154(1994)。针对EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体已经作为治疗此类恶性肿瘤的治疗剂进行了评估。参见例如Baselga和Mendelsohn，见上文；Masui等,Cancer Research(癌症研究)44:1002-1007(1984)；和Wu等,J.Clin.Invest.(临床研究杂志)95:1897-1905(1995)。
HER家族的第二个成员HER2(p185neu)最初被鉴定成转化基因的产物，来自经化学处理的大鼠的成神经细胞瘤。neu原癌基因的活化形式产生自所编码蛋白质跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同系物的扩增，而且这与预后不良有关(Slamon等,Science(科学),235:177-182(1987)；Slamon等,Science(科学),244:707-712(1989)；和美国专利4,968,603)。在其它癌瘤中也已观察到HER2的过表达(频繁但不均一，原因在于基因扩增)，所述癌瘤包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱的癌瘤。参见King等,Science(科学),229:974(1985)；Yokota等,Lancet(柳叶刀):1:765-767(1986)；Fukushige等,Mol Cell Biol.(分子细胞生物学),6:955-958(1986)；Guerin等,Oncogene Res.(癌基因研究),3:21-31(1988)；Cohen等,Oncogene(癌基因),4:81-88(1989)；Yonemura等,Cancer Res.(癌症研究),51:1034(1991)；Borst等,Gynecol.Oncol.,38:364(1990)；Weiner等,Cancer Res.(癌症研究),50:421-425(1990)；Kern等,Cancer Res.(癌症研究),50:5184(1990)；Park等,Cancer Res.(癌症研究),49:6605(1989)；Zhau等,Mol.Carcinog.(分子致癌作用),3:254-257(1990)；Aasland等,Br.J.Cancer(英国癌症杂志)57:358-363(1988)；Williams等,Pathobiology(病理学)59:46-52(1991)；和McCann等,Cancer(癌症),65:88-92(1990)等。HER2可在***癌中过表达(Gu等,Cancer Lett.(癌症通讯)99:185-9(1996)；Ross等,Hum.Pathol.(人类病理学)28:827-33(1997)；Ross等,Cancer(癌症)79:2162-70(1997)；和Sadasivan等,J.Urol.(泌尿学杂志)150:126-31(1993))。
已经描述了针对大鼠p185neu和人HER2蛋白质产物的抗体。Drebin及其同事制备了针对大鼠neu基因产物，p185neu的抗体。参见例如Drebin等,Cell(细胞)41:695-706(1985)；Myers等,Meth.Enzym.(酶学方法)198:277-290(1991)；和WO94/22478。Drebin等,Oncogene(癌基因)2:273-277(1988)报道了与p185neu的两个独特区域有反应性的抗体混合物对植入裸鼠的neu转化NIH-3T3细胞产生协同的抗肿瘤作用。还可参见1998年10月20日颁发的美国专利5,824,311。
Hudziak等,Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)9(3):1165-1172(1989)描述了一组HER2抗体的生成，并利用人***肿瘤细胞系SK-BR-3鉴定。通过72小时后单层细胞的结晶紫染色测定了暴露于抗体后SK-BR-3细胞的相对细胞增殖。利用此测定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56％。该组其它抗体在此测定法中将细胞增殖降低至较低程度。还发现抗体4D5使过表达HER2的***肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用变得敏感。还可参见1997年10月14日颁发的美国专利5,677,171。Hudziak等人的文章中讨论的HER2抗体还在以下文献中进行了表征：Fendly等,Cancer Research(癌症研究)50:1550-1558(1990)；Kotts等,In Vitro(体外)26(3):59A(1990)；Sarup等,Growth Regulation(生长调节)1:72-82(1991)；Shepard等,J.Clin.Immunol.(临床免疫学)11(3):117-127(1991)；Kumar等,Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)11(2):979-986(1991)；Lewis等,Cancer Immunol.Immunother.(癌症免疫学和免疫疗法)37:255-263(1993)；Pietras等,Oncogene(癌基因)9:1829-1838(1994)；Vitetta等,Cancer Research(癌症研究)54:5301-5309(1994)；Sliwkowski等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)269(20):14661-14665(1994)；Scott等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266:14300-5(1991)；D'souza等,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)91:7202-7206(1994)；Lewis等,CancerResearch(癌症研究)56:1457-1465(1996)；和Schaefer等,Oncogene(癌基因)15:1385-1394(1997)。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式((huMAb4D5-8,rhuMAb HER2,曲妥珠单抗(trastuzumab)或美国专利5,821,337)在临床上对患有HER2过表达的转移性乳腺癌并已接受广泛的早期抗癌疗法的患者起作用(Baselga等,J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)14:737-744(1996))。曲妥珠单抗在1998年9月25日得到了食品和药品管理局的销售许可，可用于治疗所患肿瘤过表达HER2蛋白质的转移性乳腺癌患者。
以下文献中描述了具有各种特性的其它HER2抗体：Tagliabue等,Int.J.Cancer(国际癌症杂志)47:933-937(1991)；McKenzie等,Oncogene(癌基因)4:543-548(1989)；Maier等,Cancer Res.(癌症研究)51:5361-5369(1991)；Bacus等,Molecular Carcinogenesis(分子致癌作用)3:350-362(1990)；Stancovski等,PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacus等,CancerResearch(癌症研究)52:2580-2589(1992)；Xu等,Int.J.Cancer(国际癌症杂志)53:401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等,Cancer Research(癌症研究)52:2771-2776(1992)；Hancock等,Cancer Res.(癌症研究)51:4575-4580(1991)；Shawver等,Cancer Res.(癌症研究)54:1367-1373(1994)；Arteaga等,Cancer Res.(癌症研究)54:3758-3765(1994)；Harwerth等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)267:15160-15167(1992)；美国专利5,783,186；和Klapper等,Oncogene(癌基因)14:2099-2109(1997)。
同源性筛选使得HER受体家族的两个其它成员得以鉴定：HER3(美国专利5,968,511,5,183,884和5,480,968以及Kraus等,PNAS(USA)86:9193-9197(1989))和HER4(欧洲专利申请599,274；Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(美国国家科学院学报),90:1746-1750(1993)；和Plowman等,Nature(自然),366:473-475(1993))。这两种受体均在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
通常发现HER受体在细胞中有多种组合，而且认为它的异二聚化增加了对各种HER配体的细胞应答的多样性(Earp等,Breast CancerResearch and Treatment(乳腺癌研究和治疗)35:115-132(1995))。EGFR受到6种不同配体的结合：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、β动物纤维素和epiregulin(Groenen等,Growth Factors(生长因子)11:235-257(1994))。由单一基因的可变剪接产生的一个调蛋白蛋白质家族是HER3和HER4的配体。调蛋白(heregulin)家族包括α、β和γ调蛋白(Holmes等,Science(科学),256:1205-1210(1992)；美国专利5,641,869；和Schaefer等,Oncogene(癌基因)15:1385-1394(1997))；neu分化因子(NDFs)；神经胶质生长因子(GGFs)：乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。有关综述参见Groenen等,Growth Factors(生长因子)11:235-257(1994)；Lemke,G.Molec.&Cell.Neurosci.(分子和细胞神经科学)7:247-262(1996)和Lee等,Pharm.Rev.(药学综述)47:51-85(1995)。还鉴定了另外三种HER配体：神经调节蛋白-2(NRG-2)，据报道它结合HER3或HER4(Chang等,Nature(自然)387509-512(1997)；和Carraway等,Nature(自然)387:512-516(1997))；神经调节蛋白-3，它结合HER4(Zhang等,PNAS(USA)94(18):9562-7(1997))；和神经调节蛋白-4，它结合HER4(Harari等,Oncogene(癌基因)18:2681-89(1999))。HB-EGF、β动物纤维素和epiregulin也结合HER4。
尽管EGF和TGFα不结合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成异二聚体，它活化EGFR并导致异二聚体中HER2的转磷酸作用。二聚化作用和/或转磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。参见Earp等,见上文。同样，当HER3与HER2共表达时，形成有活性的信号复合物，而针对HER2的抗体能破坏此复合物(Sliwkowski等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),269(20):14661-14665(1994))。此外，在与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和力提高到了更高的亲和力状态。关于HER2-HER3蛋白质复合物还可参见Levi等,Journal of Neuroscience(神经科学杂志)15:1329-1340(1995)；Morrissey等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)92:1431-1435(1995)；和Lewis等,Cancer Res.(癌症研究),56:1457-1465(1996)。HER4，与HER3类似，与HER2形成有活性的信号复合物(Carraway和Cantley,Cell(细胞)78:5-8(1994))。
目前靶向HER途径的治疗剂用于治疗疾病诸如乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、头和颈癌和胰腺癌。尽管这些治疗剂具有一些成功，存在涉及天然和诱导抗性和毒性的问题。Arteaga CL.J Clin Oncol(临床肿瘤学杂志)21:289–91s(2003)；Hoshi S,等,Gan To Kagaku Ryoho 31:1209–13(2004)；Viloria-Petit AM,和Kerbel RS.Int J Radiat Oncol Biol Phys58:914–26(2004)；Bianco R，等,Endocr Relat Cancer 12:S159–71(2005)；Engelman JA,和Janne PA.,Clin Cancer Res(临床癌症研究)14:2895–9(2008)；Davoli A,等,Cancer Chemother Pharmacol.(癌症化疗药学)65(4):611-23(2010)；Pohlmann PR,等,Clin Cancer Res(临床癌症研究).15(24):7479-7491(2009)。具体地，靶向HER1(EGFR)的治疗剂常常与不希望的副作用相关，诸如显著水平的皮肤毒性。Robert,等,Lancet Oncology(柳叶刀肿瘤学)6:491-500(2005).
因此，存在开发靶向HER途径的改善的治疗剂的需要。
发明概述
本发明提供多特异性抗体，其包含特异性结合至少两个HER受体的抗原结合结构域，所述HER受体选自由(a)EGFR和HER2,(b)EGFR和HER3,和(c)EGFR和HER4组成的组。所述抗体抑制至少一个所述HER受体的生物学活性。在具体的实施方案中，所述多特异性抗体特异性结合其靶标HER受体并且不特异性结合非靶标HER受体。因此，在一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR和HER3但是不特异性结合HER2或HER4。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR和HER2但是不特异性结合HER3或HER4。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR和HER4但是不特异性结合HER2或HER3。本发明也提供特异性结合靶标HER受体的单特异性抗体。
本发明一方面提供能够特异性结合EGFR和另一个HER受体的多特异性抗体，其比传统EGFR拮抗剂，诸如西妥昔单抗(cetuximab)毒性更低。在一个实施方案中，所述毒性是皮肤病学毒性。在一个实施方案中，多特异性HER抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。
一方面，本发明提供多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述多特异性抗体比EGFR拮抗剂毒性更低。在一个实施方案中，所述多特异性抗体抑制EGFR和HER3中至少一个的生物学活性。在一个实施方案中，所述抗体抑制EGF结合EGFR。在另一个实施方案中，所述抗体抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化。在一些实施方案中，所述抗体抑制肿瘤细胞生长。在一个实施方案中，所述多特异性抗体特异性结合EGFR和HER3但是不特异性结合HER2或HER4。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含以低于10-6M的Kd特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含以低于10-6M的Kd特异性结合EGFR并且以低于10-7M的Kd特异性结合HER3的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQID NO:48)；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ IDNO:51)；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ IDNO:53)；和(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:55)；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含(a)重链可变结构域，其与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少95％的序列同一性；(b)轻链可变结构域，其与氨基酸序列SEQID NO:29具有至少95％的序列同一性；或(c)如(a)中的重链可变结构域序列和如(b)中的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含SEQ ID NO:30的重链可变结构域序列。在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含SEQ ID NO:29的轻链可变结构域序列。在另一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含SEQ ID NO:30的重链可变结构域序列和SEQID NO:29的轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体是全长IgG1抗体。
本发明的一方面提供编码所述多特异性HER抗体的分离的核酸。另一方面提供包含编码所述多特异性HER抗体的核酸的宿主细胞。还一方面提供产生多特异性HER抗体的方法，包括培养包含编码所述多特异性HER抗体的核酸的宿主细胞，从而产生所述的抗体。
本发明一方面提供包含多特异性HER抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物。另一方面提供包含多特异性HER抗体和药用载体的药物制剂。
本发明一方面提供治疗患有癌症的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的多特异性HER抗体。在一个实施方案中，所述多特异性HER抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。在一个实施方案中，通过所述多特异性HER抗体治疗的癌症包含表达EGFR和HER3的细胞。在一个实施方案中，通过所述多特异性HER抗体治疗的癌症是乳腺癌(breast cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、头和颈癌(head and neck cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovariancancer)、***癌(prostate cancer)或非小细胞肺癌(non-small lung cellcancer)。
本发明另一方面提供抑制个体中HER受体生物学活性的方法，包括向所述个体施用有效量的多特异性HER抗体。在一个实施方案中，所述多特异性HER抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。
本发明一方面提供用作药物的多特异性HER抗体。另一方面提供用于治疗癌症，诸如乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、***癌或非小细胞肺癌的多特异性HER抗体。另一方面提供用于抑制HER受体的生物学活性的多特异性HER抗体。在一个实施方案中，所述多特异性HER抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。
本发明另一方面提供用于制备药物的多特异性HER抗体。在一个实施方案中，所述药物可用于治疗癌症，诸如乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、***癌或非小细胞肺癌。在一个实施方案中，所述药物用于抑制HER受体的生物学活性。在一个实施方案中，所述多特异性HER抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述多特异性HER抗体比传统EGFR拮抗剂，诸如西妥昔单抗毒性更低。
附图简述
图1显示在A431异种移植模型中通过抗EGFR抗体D1.5抑制肿瘤生长。
图2显示具有双重特异性的克隆的结合特异性。
图3显示使用选择的具有双重特异性(抗EGFR/HER3和抗EGFR/HER2抗体)的抗体抑制TGF-α-诱导的EGFR磷酸化。
图4显示抗-EGFR/HER3抗体阻断调蛋白结合HER3-ECD-Fc。
图5显示在MCF7细胞中通过抗EGFR/HER3双特异性抗体抑制HRG诱导的受体磷酸化。
图6显示通过抗EGFR/HER3抗体抑制MDA-175细胞的细胞增殖。
图7是显示在4D5-Fv结构上定位的D1.5-100热点的图。
图8概述了使用鸟枪文库对于D1.5-100EGFR-HER3抗体亲和力成熟的策略。
图9显示两个选择的亲和力成熟的抗体(DL7和DL11)对于EGFR和HER3两者是特异性的。
图10:A)显示亲和力成熟的抗体DL7和DL11与母体抗体D1.5对于EGFR的抑制功能的比较。B)显示亲和力成熟的抗体DL7和DL11与单特异性抗HER3抗体DL3.6对于HER3反式激活的抑制功能的比较。
图11A)提供图显示DL11与培妥珠单抗(pertuzumab)，抗EGFR抗体，和抗HER3抗体，或DL3.6，D1.5，或D1.5+DL3.6的组合相比对于H1666细胞生长抑制功能的比较，所述细胞是NSCLC细胞系，表达HER2,HER3,EGFR和EGFR配体，生长用HRG刺激。B)提供图显示DL11与培妥珠单抗，抗EGFR抗体和抗HER3抗体，或DL3.6，D1.5或D1.5+DL3.6的组合相比对于H1666HSCLC系生长抑制功能的比较，生长用HRG和TGFα刺激。
图12A)提供图显示通过DL11与pMab，抗EGFR抗体，和抗HER3抗体相比较抑制HCA-7细胞的增殖，该细胞是结肠直肠癌细胞系，表达HER2,HER3和EGFR。细胞生长用HRG刺激。B)提供图显示如图12A中的HCA-7细胞生长的抑制，除了细胞生长用HRG+TGFα刺激。
图13显示Calu-3细胞增殖的抑制，所述细胞是NSCLC系，过表达HER2并且具有正常水平的HER3和EGFR。细胞生长用HRG刺激，抗体以剂量依赖方式测试。
图14概述了对于D1.5-201亲和力成熟的分选策略。
图15显示通过DL11，DL11b和DL11f抑制MDA-175细胞增殖。
图16显示DL11f抑制调蛋白诱导的HER3磷酸化和TGF-α诱导的EGFR磷酸化。
图17是显示在HCA-7肿瘤移植模型中通过DL11和DL11f抑制肿瘤生长的图。
图18是显示在H358NSCLC异种移植模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图19显示通过DL3-11b,DL3.6b和DL3.6抑制HRG诱导的HER3磷酸化。
图20:通过DL3-11b,DL3.6b和DL3.6抑制MDA-175细胞增殖。
图21是显示在FaDu癌症模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图22是显示在BxPC3胰腺癌模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图23是显示在Calu-3非小细胞肺癌模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图24是显示在A431上皮癌模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图25是显示在MAXF44乳腺癌模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图26是显示在DU145***癌模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图27是显示在OVXF550卵巢癌模型中通过DL11f抑制肿瘤生长的图。
图28显示在数个细胞系中DL11f诱导ADCC。
图29显示DL11f-N297A缺少ADCC活性。
图30显示在H292NSCLC癌症模型中通过DL11f和DL11f-N297A抑制肿瘤生长。
图31A-C是提供关于EGFR拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性信息的表。
图32是提供关于疹/脱屑和痤疮/痤疮样疹分级信息的表。
图33提供具有Kabat编号的数个抗HER抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸比对。图33A显示下述抗体的轻链可变结构域:D1(SEQ ID NO:58)；D1.5(SEQ ID NO:24)；D1.5-100(SEQ ID NO:40)；DL11(SEQ ID NO:27)；DL11b(SEQ ID NO:29)；DL11f(SEQ ID NO:29)。图33B显示下述抗体的重链可变结构域:D1(SEQ ID NO:25)；D1.5(SEQ ID NO:25)；D1.5-100(SEQ ID NO:25)；DL11(SEQ ID NO:28)；DL11b(SEQ IDNO:28)；DL11f(SEQ ID NO:30)。
发明详述
I.定义
除非另有定义，本文使用的所有专门术语、符号和其它科学术语意图具有本发明所属领域技术人员普遍理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或易于引用，本文定义了具有普遍理解含义的术语，并且本文包含此类定义没有必要解释为其代表了与本领域通常理解的实质上的差异。本文中描述或提到的技术和程序一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且利用常规方法得以普遍采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的分子克隆的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.。如果合适，涉及使用市售的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的方案和/或参数进行，除非另有说明。
在描述本发明的方法、试剂盒及其用途之前，应当理解本发明不限于所述具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建物和试剂，因为它们当然可以变化。还应当理解本文所用术语只是为了描述具体实施方案，并非意图限制本发明的范围，只有所附权利要求才对本发明范围进行了限制。
必须注意的是，在用于本文及所附权利要求时，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“所述"包括复数所指物。
在本说明书和权利要求书全文中，词语“包括”或变体诸如“包含”或“含有”，应当理解为意指包括所述的整数(整体)或整数(整体)的组，但是不排除任何其它整数(整体)或整数(整体)的组。
本文中术语“抗体”以其最广义使用，特别是涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出所希望的生物学活性。术语“多特异性抗体”以最广义使用，具体涵盖包含这样的抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域具有多表位特异性(即，能够特异性结合一种生物分子上的两个或多个不同表位或能够特异性结合在两种或多种不同生物分子上的表位)。抗原结合结构域的一个具体实例是VHVL单元，其由重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)构成。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三链抗体(triabodies)、已被共价或非共价连接的抗体片段。“双特异性抗体”是包含这样的抗原结合结构域的多特异性抗体，所述抗原结合结构域能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位，或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也称为具有“双特异性”或是“双特异性的”。
在某些实施方案中，本发明的抗体对于其靶标HER或HERs具有的解离常数(Kd)≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M以下,例如10-8M至10-13M,例如,10-9M至10-13M)。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而取决于重链的同种型，通过一个或多个二硫键彼此连接两条重链。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有一个可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链)和四个(对于μ和ε同种型)恒定结构域(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变结构域(VL)，接着是其另一端的一个恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology(基本和临 床酶学),第八版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、γ、ε和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的110个氨基酸。而V区由15-30个氨基酸，称作构架区(FR)的相对不变异的区段及将构架区分开的称作“高变区”或HVR的极度变异的较短区域组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRs，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),第五版.PublicHealth Service(公共卫生署),National Institutes of Health(国立卫生研究所),Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)，三个在VL中(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等,免疫性(Immunity)13:37-45(2000)；Johnson和Wu于：分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)248:1-25(Lo，编辑，Human出版社，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼科动物(camelid)抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等,自然(Nature)363:446-448(1993)；Sheriff等,自然结构生物学(Nature Struct.Biol.)3:733-736(1996)。
HVRs一般包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDRs)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补性决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公共卫生署(Public Health Service)，国立卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“contact”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或47-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
“构架”或“FR”残基指除本文中所定义的HVR残基之外的那些可变结构域残基。
术语“依照Kabat的可变结构域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，见上文中的用于抗体编制的重链可变结构域或轻链可变结构域编辑的编号***。使用此编号***，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变结构域FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变结构域可包含H2的残基52后的单一氨基酸***(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的***残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的残基Kabat编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Kabat编号***一般在提及可变结构域中的残基(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时使用(例如Kabat等，免疫学感兴趣的序列(Sequences of Immunological Interest).第5版.公共卫生署(Public Health Service)，国立卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号***”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如在Kabat等中报道的EU索引，见上文)。“如在Kabat中所述的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文中另有说明，提及抗体可变结构域中的残基编号指根据Kabat编号***的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据EU编号***的残基编号方式(例如参见WO 2006/073941)。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。
“亲和力成熟的”抗体指这样的抗体，在该抗体的一个或多个HVRs或构架区中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的母体抗体相比有所提高。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些方法来生成。例如，Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或构架残基的随机诱变：例如：Barbas等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91:3809-3813(1994)；Schier等，基因(Gene)169：147-155(1995)；Yelton等，免疫学杂志(J.Immunol.)155：1994-2004(1995)；Jackson等，免疫学杂志(J.Immunol.)154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226：889-896(1992)。
抗体的“种类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要种类的抗体：IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α,δ,ε,γ和μ。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体(该变体可在产生单克隆抗体的过程中出现，此类变体通常少量存在)之外，构成群体的各个抗体基本上相似并结合相同的表位。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶标的可变区的抗体，其中该抗体是通过包括从众多抗体中选择该抗体在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的抗体可进一步改变，例如为了提高对靶标的亲和力、将抗体人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的可变区序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。除它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括杂交瘤法(例如,Kohler等,Nature(自然),256:495(1975)；Harlow等,抗体:A Laboratory Manual(抗体：实验室指南),(Cold SpringHarbor Laboratory Press,第二版.1988)；Hammerling等,在：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)563-681,(Elsevier,N.Y.,1981)中、重组DNA法(参见例如，美国专利4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如,Clackson等,Nature(自然),352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志),222:581-597(1991)；Sidhu等,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)101(34):12467-12472(2004)；和Lee等J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2):119-132(2004)、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(参见例如，WO98/24893，WO/9634096，WO/9633735和WO/9110741，Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报),90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature(自然),362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immuno.(免疫学年鉴),7:33(1993)；美国专利5,545,806、5,569,825、5,591,669(均为GenPharm的)；5,545,807；WO97/17852、美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016,和Marks等,Bio/Technology(生物/技术),10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature(自然),368:856-859(1994)；Morrison,Nature(自然),368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnology(自然：生物技术),14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology(自然：生物技术),14:826(1996)；和Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.(国际免疫学综述),13:65-93(1995)。
“完整”抗体是包含抗原结合位点和CL以及至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。该恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，该完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fab’-SH；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.(蛋白质工程)8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如scFv)。在本说明书中以及在说明书全文中，提及抗体和抗体的多种性质，同样的内容也适用于功能性抗体片段，例如双重作用Fab片段。
“线性抗体”的表述通常是指Zapata等,Protein Eng.(蛋白质工程),8(10):1057-1062(1995)描述的抗体。这些抗体包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。在优选实施方案中，所述片段是“功能性的”，即在性质上保留相应完整抗体结合靶标HER受体的能力，并且如果完整抗体还抑制HER的活化或功能，在性质上也保留此类抑制特性。在性质上保留意指以同样的方法活性被保留，但是结合亲和力和/或活性的程度可能不同。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”由紧密、非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力通常低于完整结合位点。
“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的抗体VH和VL结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。关于sFv的综述参见Pluckthun于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),vol.113,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995。
术语“双抗体(diabodies)”是指如下制备的小抗体片段，通过使用短接头(大约5-10个残基)在VH和VL结构域之间构建sFv片段(见前段)从而获得该V结构域的链间而非链内配对而产生二价片段，即具有两种抗原结合位点的片段。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报),90:6444-6448(1993)中有更充分的描述。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和/或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同来源或物种。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列),第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的受体的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的人免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个如下可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,Nature(自然)321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature(自然)332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)2:593-596(1992)。
“结合”目的抗原的本发明的抗体是这样的抗体，其与抗原以足够的亲和力结合，从而该抗体可用作靶向蛋白质或表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂。关于抗体与靶标分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位指可测量出不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来确定。例如，特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶标相似，例如与过量的未标记靶标竞争。在这种情况中，若经标记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制，则指示特异性结合。在一个具体实施方案中，“特异性”结合是指抗体与其特定的靶标HER受体的结合，并且不与其它特定的非-靶标HER受体结合。例如，抗体特异性结合EGFR和HER3但是不特异性结合HER2或HER4，或抗体特异性结合EGFR和HER2但是不特异性结合HER3或HER4，或抗体特异性结合EGFR和HER4但是不特异性结合HER2或HER3。
“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1,HER1),HER2(ErbB2),HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)受体。HER受体通常将包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一个HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和含有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。优选的，HER受体是天然序列人HER受体。
“HER途径”是指由HER受体家族介导的信号传导网络。
术语“ErbBl”、“HERl”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，指例如Carpenter等,Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)公开的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(如Ullrich等,Nature(自然)(1984)309:418425和Humphrey等,PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的缺失突变体EGFR)及其变体，诸如EGFRvIII。EGFR的变体也包括缺失的、置换的和***的变体，例如在Lynch等,(New England Journal of Medicine(新英格兰医学杂志)2004,350:2129),Paez等,(Science(科学)2004,304:1497),和Pao等,(PNAS 2004,101:13306)中描述的那些。
在本文中，“EGFR胞外结构域”或“EGFR ECD”是指EGFR在细胞外的结构域，锚定到细胞膜或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，EGFR的胞外结构域可包括四个结构域：“结构域I”(氨基酸残基从约1-158),“结构域II”(氨基酸残基159-336),“结构域III”(氨基酸残基337-470),和“结构域IV”(氨基酸残基471-645)，其中边界是近似的，可有大约1-3个氨基酸的变化。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Semba等,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等,Nature(自然)319:230-234(1986)中描述的人HER2蛋白(GenBank编号X03363)。术语“erbB2”指编码人HER2的基因，“neu”指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
在本文中，“HER2胞外结构域”或“HER2ECD”是指HER2在细胞外的结构域，锚定到细胞膜或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER2的胞外结构域可包含四个结构域：“结构域I”(氨基酸残基从约1-195,“结构域II”(氨基酸残基从约196-319),“结构域III”(氨基酸残基从约320-488),和“结构域IV”(氨基酸残基从约489-630)(残基编号不含信号肽)。参见Garrett等,Mol.Cell.(分子细胞).11:495-505(2003),Cho等,Nature(自然)421:756-760(2003),Franklin等,Cancer Cell(癌细胞)5:317-328(2004),和Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)90:1746-1750(1993)。
“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利5,183,884和5,480,968以及Kraus等,PNAS(USA)86:9193-9197(1989)中公开的受体多肽。
在本文中，“HER3胞外结构域”或“HER3ECD”是指HER3在细胞外的结构域，锚定到细胞膜或在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER3的胞外结构域可包含四个结构域：结构域I,结构域II,结构域III,和结构域IV。在一个实施方案中，HER3ECD包含氨基酸1-636(编号包括信号肽)。在一个实施方案中，HER3结构域III包含氨基酸328-532(编号包括信号肽)。
术语“ErbB4"和“HER4”在本文中是指例如在欧洲专利申请599,274；Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报),90:1746-1750(1993)；和Plowman等,Nature(自然),366:473-475(1993)中公开的受体多肽，包括其同种型，例如在1999年4月22日公布的WO99/19488中所公开的。
“HER配体”指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等,Science(科学)223:1079-1082(1984))；双调蛋白，又称为神经鞘瘤(schwanoma)或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyab等,Science(科学)243:1074-1076(1989)；Kimura等,Nature(自然)348:257-260(1990)；和Cook等,Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)11:2547-2557(1991))；β动物纤维素(Shing等,Science(科学)259:1604-1607(1993)；和Sasada等,Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等,Science(科学)251:936-939(1991))；epiregulin(Toyoda等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)270:7495-7500(1995)；和Komurasaki等,Oncogene(癌基因)15:2841-2848(1997))；调蛋白(见下文)；神经调节蛋白-2(NRG-2)(Carraway等,Nature(自然)387:512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)94:9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等,Oncogene(癌基因)18:2681-89(1999))；和cripto(CR-1)(Kannan等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(6):3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF,TGF-α,双调蛋白,β动物纤维素,HB-EGF和epiregulin。结合HER3的HER配体包括调蛋白和NRG-2。能够结合HER4的HER配体包括β动物纤维素,epiregulin,HB-EGF,NRG-2,NRG-3,NRG-4,和调蛋白。
“调蛋白”(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因产物编码的多肽，如美国专利5,641,869,或Marchionni等,Nature(自然),362:312-318(1993)所公开的。调蛋白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等,Science(科学),256:1205-1210(1992)；及美国专利5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles等,Cell(细胞)69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等,Cell(细胞)72:801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGFs)(Marchionni等,Nature(自然),362:312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)270:14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等,Oncogene(癌基因)15:1385-1394(1997))。
“HER二聚体”在本文中指包含至少两个HER受体的非共价结合二聚体。当表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可形成此类复合物，可通过免疫沉淀进行分离并通过SDS-PAGE进行分析，如例如Sliwkowski等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),269(20):14661-14665(1994)所述。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基(如gp130)可与所述二聚体结合。
“HER异二聚体”在本文中是指包含至少两个不同HER受体的非共价结合异二聚体，诸如EGFR-HER2,EGFR-HER3,EGFR-HER4,HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体。
“HER抑制剂”是干扰HER活化或功能的试剂。HER抑制剂的实例包括HER抗体(例如EGFR,HER2,HER3,或HER4抗体)；EGFR-靶向药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼(lapatinib)/GW572016；反义分子(参见例如WO2004/87207)；和/或结合下游信号传导分子诸如MAPK或AKt或干扰它们的功能的试剂。优选地，HER抑制剂是结合HER受体的抗体。
“HER二聚化抑制剂”或“HDI”是抑制HER同二聚体或HER异二聚体形成的试剂。优选地，HER二聚化抑制剂是抗体。然而，HER二聚化抑制剂也包括肽和非肽小分子，和抑制HER同二聚体或异二聚体形成的其它化学实体。
“抑制HER二聚化”的抗体是这样的抗体，其抑制或干扰HER二聚体的形成，而不论其根本机制。在一个实施方案中，此类抗体在HER2的异二聚化结合位点结合HER2。二聚化抑制抗体的一个特别实例是培妥珠单抗(Pmab)或MAb 2C4。HER二聚化抑制剂的其它实例包括结合EGFR并抑制其与一个或多个其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806,MAb 806,其结合活化的或“未束缚的”EGFR，参见Johns等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)279(29):30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一个或多个其它HER受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一个或多个其它HER受体二聚化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利6,417,168)；反义二聚化抑制剂等。
用于本文中时，“EGFR拮抗剂”或“EGFR抑制剂”是指特异性结合EGFR并阻止或降低其信号传导活性，并且不特异性结合HER2,HER3,或HER4的那些化合物。这类试剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506),MAb 455(ATCC CRL HB8507),MAb 225(ATCC CRL 8508),MAb 528(ATCC CRL8509)(参见，美国专利4,943,533,Mendelsohn等)及其变体，如嵌合化225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab)；)和改型的人225(H225)(参见，WO 96/40210,Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8,一种全长人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利5,891,996中所描述的；及结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(参见WO98/50433,Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等Eur.J.Cancer(欧洲癌症杂志)32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗(matuzumab))，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合；(EMD/Merck)；人EGFR抗体,HuMax-EGFR(GenMab)；已知为E1.1,E2.4,E2.5,E6.2,E6.4,E2.11,E6.3和E7.6.3并且在US 6,235,883中描述的完整人抗体；MDX-447(Medarex Inc)；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279(29):30375-30384(2004))。抗-EGFR抗体可缀合细胞毒性剂，从而产生免疫缀合物(参见，例如EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，诸如在下述各项中描述的化合物：美国专利5,616,582,5,457,105,5,475,001,5,654,307,5,679,683,6,084,095,6,265,410,6,455,534,6,521,620,6,596,726,6,713,484,5,770,599,6,140,332,5,866,572,6,399,602,6,344,459,6,602,863,6,391,874,6,344,455,5,760,041,6,002,008,和5,747,498,以及下述PCT公布:WO98/14451,WO98/50038,WO99/09016,和WO99/24037。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774,厄洛替尼(erlotinib),)Genentech/OSI制药公司(OSIPharmaceuticals))；PD 183805(CI 1033,2-丙烯酰胺,N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-,二盐酸盐,辉瑞公司(PfizerInc.))；ZD1839,吉非替尼(gefitinib)易瑞沙4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉,阿斯利康(AstraZeneca))；ZM105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺(butynamide))；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Sugen)；和AG1571(SU 5271；Sugen).
“HER抗体”是结合HER受体的抗体。任选地，HER抗体还干扰HER活化或功能。具体的HER2抗体包括培妥珠单抗和曲妥珠单抗。具体EGFR抗体的实例包括西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)。
涉及HER抗体的专利公开包括：US 5,677,171，US 5,720,937，US 5,720,954，US 5,725,856，US 5,770,195，US 5,772,997，US 6,165,464，US 6,387,371，US 6,399,063，US2002/0192211A 1，US 6,015,567，US 6,333,169，US 4,968,603，US5,821,337，US 6,054,297，US 6,407,213，US 6,719,971，US 6,800,738，US2004/0236078A 1，US 5,648,237，US 6,267,958，US 6,685,940，US 6,821,515，WO98/17797，US 6,333,398，US6,797,814，US 6,339,142，US 6,417,335，US 6,489,447，WO99/31140，US2003/0147884A 1，US2003/0170234A 1，US2005/0002928A 1，US 6,573,043，US2003/0152987A 1，WO99/48527，US2002/0141993A 1，WO01/00245，US2003/0086924，US2004/0013667A 1，WO00/69460，WO01/00238，WO01/15730，US 6,627,196B1，US 6,632,979B1，WO01/00244，US2002/0090662A 1，WO01/89566，US2002/0064785，US2003/0134344，WO04/24866，US2004/0082047，US2003/0175845A1，WO03/087131，US2003/0228663，WO2004/008099A2，US2004/0106161，WO2004/048525，US2004/0258685A 1，US5,985,553，US 5,747,261，US 4,935,341，US 5,401,638，US 5,604,107，WO 87/07646，WO89/10412，WO 91/05264，EP 412,116B1，EP 494,135B1，US 5,824,311，EP 444,181B1，EP1,006,194A2，US 2002/0155527A1，WO 91/02062，US 5,571,894，US 5,939,531，EP502,812 B1，WO 93/03741，EP 554,441 B1，EP 656,367 A1，US 5,288,477，US 5,514,554，US 5,587,458，WO 93/12220，WO 93/16185，US 5,877,305，WO 93/21319，WO 93/21232，US 5,856,089，WO 94/22478，US 5,910,486，US 6,028,059，WO 96/07321，US 5,804,396，US 5,846,749，EP 711,565，WO 96/16673，US 5,783,404，US 5,977,322，US 6,512,097，WO97/00271，US 6,270,765，US 6,395,272，US 5,837,243，WO 96/40789，US 5,783,186，US6,458,356，WO 97/20858，WO 97/38731，US 6,214,388，US 5,925,519，WO 98/02463，US5,922,845，WO 98/18489，WO 98/33914，US 5,994,071，WO 98/45479，US 6,358,682B1，US 2003/0059790，WO 99/55367，WO 01/20033，US 2002/0076695A1，WO 00/78347，WO01/09187，WO 01/21192，WO 01/32155，WO 01/53354，WO 01/56604，WO 01/76630，WO02/05791，WO 02/11677，US 6,582,919，US2002/0192652A 1，US 2003/0211530A 1，WO02/44413，US 2002/0142328，US 6,602,670B2，WO 02/45653，WO 02/055106，US2003/0152572，US 2003/0165840，WO 02/087619，WO 03/006509，WO03/012072，WO03/028638，US 2003/0068318，WO 03/041736，EP 1,357,132，US 2003/0202973，US2004/0138160，US 5,705,157，US 6,123,939，EP 616,812 B1，US 2003/0103973，US2003/0108545，US 6,403,630B1，WO 00/61145，WO 00/61185，US 6,333,348B1，WO01/05425，WO 01/64246，US 2003/0022918，US 2002/0051785A1，US 6,767,541，WO01/76586，US 2003/0144252，WO 01/87336，US 2002/0031515A1，WO 01/87334，WO02/05791，WO 02/09754，US 2003/0157097，US 2002/0076408，WO02/055106，WO 02/070008，WO 02/089842和WO 03/86467。
“HER活化”是指任一种或多种HER受体的活化或磷酸化。一般而言，HER活化导致信号转导(例如由HER受体胞内激酶结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。HER活化可由HER配体结合包含目的HER受体的HER二聚体介导。结合HER二聚体的HER配体可活化二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域，从而导致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或另外的底物多肽(诸如Akt或MAPK胞内激酶)中酪氨酸残基的磷酸化。
“磷酸化”是指向蛋白质(诸如HER受体或其底物)添加一个或多个磷酸基。
HER2上的“异二聚化结合位点”是指HER2的胞外结构域中的区，其在与EGFR，HER3或HER4形成二聚体时接触EGFR，HER3或HER4的胞外结构域中的区或与其相互作用。发现所述区在HER2的结构域II中。Franklin等，Cancer Cell(癌细胞)5：317-328(2004)。
“结合HER2的异二聚化结合位点”的HER2抗体与结构域II中的残基结合(并且任选地也结合HER2胞外结构域的其它结构域如结构域I和III中的残基)，能够至少在一定程度上在空间上阻碍HER2-EGFR，HER2-HER3，或HER2-HER4异二聚体的形成。Franklin等，Cancer Cell(癌细胞)5：317-328(2004)表征了HER2-培妥珠单抗晶体结构，其存放在RCSB蛋白质数据库(RCSB Protein Data Bank)(ID编号IS78)中，描述了结合HER2的异二聚化结合位点的示例性抗体。
“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基，并且任选地结合HER2的其它结构域如结构域I和III中的残基。
在用于描述本文中所公开的各种抗体时，“分离的”指已经鉴定且从其表达所在的细胞或细胞培养物中分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将该抗体纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝(或优选银染)非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE达到同质。由于多肽天然环境的至少一种成分不会存在，因此分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。在一些实施方案中，多特异性抗HER抗体是分离的抗体。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中，则该核酸是“可操作连接”的。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接"指相连的DNA序列是邻接的，而且在分泌前导序列的情况中指邻接且处于阅读框中。然而，增强子不必邻接。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为将候选序列与参照多肽序列在进行序列比对(并在必要时导入空隙)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比对计算机程序的作者是Genentech,Inc.,该源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.,20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech,Inc.(South San Francisco,加利福尼亚)得到ALIGN-2程序，或者可以从该源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作***，包括在数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。
在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：
X/Y比值乘以100，
其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指出，如在紧前面的段落中所述，使用ALIGN-2计算机程序获得在本文中所用的所有的％氨基酸序列同一性的值。
杂交反应的“严格性”可以容易地由本领域普通技术人员确定，而且通常凭经验根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度来计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。因此可以认为，较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方 案),Wiley Interscience Publishers,(1995)。
本文中所定义的“严格条件”或“高严格性条件”可如下确定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，其含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在采用50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt氏溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过夜，并在42℃于0.2XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在含EDTA的0.1XSSC中于55℃进行10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件"可以如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南),New York:Cold Spring Harbor Press,1989所述来鉴定，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含20％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷、和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1XSSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要来调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
抗体“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指如下细胞毒性形式，其中某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcRs)所结合的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死该靶细胞。所述抗体“武装”细胞毒性细胞，而且绝对是这类杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)9:457-92(1991)的464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院学报))95:652-656(1998)所披露的。
“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，而且其包括FcγRI,FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.inAnnu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)9:457-492(1991)；Capel等,Immunomethods(免疫方法)4:25-34(1994)；和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.(实验室临床医学杂志)126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体(FcRn)，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等,J.Immunol.(免疫学杂志)117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.(免疫学杂志)24:249(1994))。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMc)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源，例如从血液分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时靶细胞的溶解作用。经典补体途径的激活是由补体***第一组分(C1q)结合与其同族抗原结合的(适当子类的)抗体起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202:163(1996)所记载的。
用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“treat”或“treating”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进展。
术语“治疗有效量”指治疗受试者中疾病或病症的抗体或抗体片段的量。对于肿瘤(例如癌性肿瘤)，抗体或抗体片段的治疗有效量可减少癌细胞数量；减小原发性肿瘤大小；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移；在一定程度抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与病症相关的症状。抗体或抗体片段在达到可以预防现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度时，其可为细胞生长抑制性和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，体内效力可以通过，例如评价存活期、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、应答期、和/或生活质量来测量。
“减小或抑制”的意思是导致优选地20％或更高、更优选地50％或更高、并且最优选地75％、85％、90％、95％、或更高的总体降低。减小或抑制可以涉及在治疗的病症的症状、转移灶的存在或大小、原发性肿瘤的大小、或血管源性病症中血管的大小或数目。
术语“癌症”和“癌性”是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长不受调控的生理学状态。这种定义包含良性和恶性癌症。“癌症早期”的意思是无侵袭性或转移性的癌症，或分类为0、I、或II期的癌症。
术语“癌前”是指一般在癌症之前或发展成癌症的状态或生长。
“非转移性”是指癌症是良性的，或保持在原发位点并且未侵入淋巴或血管***或原发位点以外的其它组织。一般而言，非转移性癌症是0、I、或II期癌症中的任何癌症，并且有时是III期癌症。
“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“抗癌治疗”是指有效用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括，但不限于，例如，化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放射性治疗中所用的试剂、抗血管发生剂、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂，抗-CD20抗体,血小板来源的生长因子抑制剂(例如,GleevecTM(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))),COX-2抑制剂(例如,塞来考昔(celecoxib)),干扰素,细胞因子,结合下述一种或多种靶标的拮抗剂(例如,中和抗体)：EGFR,ErbB2,ErbB3,ErbB4,PDGFR-beta,BlyS,APRIL,BCMA或VEGF受体,TRAIL/Apo2,和其它生物活性和有机化学剂等。它们的组合也包含在本发明中。
“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；聚乙酸类(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；△-9-四氢***酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)、)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan))、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、scopolectin和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosoureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou等，Angew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；CDP323(一种口服α-4整合素抑制剂)；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99聚乙二醇化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)epothilone和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products(JHS天然产品),Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2’-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类化合物(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)和多西他塞(docetaxel))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂药剂如顺铂(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)(例如,),和卡铂(carboplatin)；防止微管蛋白聚合形成微管的vincas，包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)vindesine和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；leucovorin；诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates)如氯膦酸盐(clodronate)(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)阿仑膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，诸如例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如疫苗和基因治疗疫苗、例如，疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如，)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib),Pfizer)；哌立福辛(perifosine),COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib)CCI-779；替匹法尼(tipifarnib)(R11577)；orafenib,ABT510；Bcl-2抑制剂诸如奥利美生钠(oblimersensodium)匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus),)；法尼基转移酶抑制剂诸如氯那法尼(lonafarnib)(SCH 6636,SARASARTM)；和以上任一种的药用盐、酸或衍生物；以及以上两种以上的组合，诸如CHOP,即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、和***龙(prednisolone)的组合疗法的缩写；和FOLFOX,即关于与5-FU和亚叶酸(leucovorin)组合的奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)的治疗方案的缩写。
本文定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果。它们自身可以是激素。包括，但不限于具有混合的激动剂/拮抗剂模式的抗***类，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫西芬,托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene),屈洛昔芬(droloxifene),雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene，和选择性***受体调控物类(SERM)如SERM3，不具有激动剂性质的纯的抗***类，如氟维司群(fulvestrant)和EM800(所述药剂可以阻断***受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，增加ER更新和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂包括类固醇芳香酶抑制剂如福美坦(formestane)和益西美坦(exemestane)和非类固醇芳香酶抑制剂如阿那曲唑(anastrazole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide),和其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)法倔唑(fadrozole),和4(5)-咪唑；***释放激素激动剂，包括亮丙立德(leuprolide)(和),戈舍瑞林(goserelin),布舍瑞林(buserelin),和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇,包括***(progestines)如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate),***如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普罗马林(premarin),和雄激素/类视黄醇如氟***(fluoxymesterone),所有的反式视黄酸(transretionicacid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗***(anti-progesterones)；***受体下调剂(ERDs)；抗雄激素如氟他胺(flutamide),尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；上述任一种的药用盐、酸或衍生物，以及上述两种以上的组合。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于人、非人高等灵长类动物、灵长类动物、家畜(如牛)、竞技动物、宠物(如猫、狗和马)和实验室动物(如小鼠和大鼠)。
II.详细描述
本发明提供抗体和功能性抗体片段，其包含至少一个抗原结合结构域，所述抗原结合结构域对至少两种不同HER受体，特别是EGFR和HER2,EGFR和HER3,或EGFR和HER4具有结合特异性。这些多特异性抗体不同于传统多特异性抗体，后者具有带有不同结合特异性的抗原结合结构域(通常两个)。在某些实施方案中，本文描述的多特异性抗体具有IgG(或Fab)的分子结构，因此保留了IgG对于治疗开发有利的属性，诸如可预测的药物代谢动力学性质，充分确立的制备方案，Fc介导的效应子功能的选择，和二价或单价。在通过组装两个不同抗体片段成一个分子获得的传统多特异性抗体中，这些有利属性常常是缺失的。
在本文中描述的多特异性抗体及其功能性抗体片段有效用于治疗与HER受体途径相关的疾病或病症，诸如癌症。在一个具体的实施方案中，多特异性抗体的抗原结合结构域特异性结合EGFR和HER3两者。在另一个实施方案中，抗原结合结构域特异性结合EGFR和HER2两者。在另一个实施方案中，抗原结合结构域特异性结合EGFR和HER4两者。
本发明的一个特别方面提供包含两个(或多个)抗原结合结构域的抗体，其中每个具有相同的结合特异性。
一个实施方案提供包含两个抗原结合结构域的多特异性抗体，其中每个抗原结合结构域具有相同的特异性，并且特异性结合两个不同HER受体。在一个具体的实施方案中，每个抗原结合结构域特异性结合EGFR和HER3两者。在另一个实施方案中，每个抗原结合结构域特异性结合EGFR和HER2两者。在另一个实施方案中，每个抗原结合结构域特异性结合EGFR和HER4两者。在又一个实施方案中，每个抗原结合结构域特异性结合EGFR的结构域III。在另一个实施方案中，每个抗原结合结构域特异性结合HER3的结构域III。在又一个实施方案中，每个抗原结合结构域能够结合EGFR的结构域III和HER3的结构域III。
在具体的实施方案中，多特异性抗体特异性结合其一个靶标HER受体或多个HER受体，并且不特异性结合非靶标HER受体。因此，在一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和HER3但是不特异性结合HER2或HER4。在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和HER2但是不特异性结合HER3或HER4。在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和HER4但是不特异性结合HER2或HER3。
在某些实施方案中，每个抗原结合结构域包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一个实施方案中，所述VHVL单元特异性结合两种不同HER受体。在一个具体的实施方案中，所述VHVL单元特异性结合EGFR和HER3。在另一个实施方案中，所述VHVL单元特异性结合EGFR和HER2。在另一个实施方案中，所述VHVL单元特异性结合EGFR和HER4。
在具体的实施方案中，多特异性抗体对于其一个靶标HER受体或多个受体的亲和力通过下述Kd表示，所述Kd低于10-5M,低于10-6M,低于10-7M,低于10-8M,低于10-9M,低于10-10M,低于10-11M,或低于10-12M。在一个实施方案中，抗体对于其靶标受体之一的Kd低于10-7M,低于10-8M,低于10-9M,低于10-10M,低于10-11M,或低于10-12M。在另一个实施方案中，多特异性抗体对于其所有靶标受体的Kd低于10-7M,低于10-8M,低于10-9M,低于10-10M,低于10-11M,或低于10-12M。
在一些实施方案中，多特异性抗体对于其靶标HER受体之一的亲和力大于对于其另外一个靶标HER受体或多个受体的亲和力。在一个实施方案中，多特异性抗体对于一个靶标HER受体的亲和力比其对于另一个靶标HER受体的亲和力高至少2,3,4,5,8,10,12,15,18,20,22,25,30,35,40,50,100–倍。在一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和另一个HER受体，并且其对于另一个HER受体的结合亲和力比其对于EGFR的亲和力高至少2,3,4,5,8,10,12,15,18,20,22,25,30,35,40,50,或100–倍。在一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和HER3，并且其对于HER3的结合亲和力比其对于EGFR的结合亲和力高至少2,3,4,5,8,10,12,15,18,20,22,25,30,35,40,50,或100–倍。在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和HER2，并且其对于HER2的结合亲和力比其对于EGFR的结合亲和力高至少2,3,4,5,8,10,12,15,18,20,22,25,30,35,40,50,或100–倍。在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和HER4，并且其对于HER4的结合亲和力比其对于EGFR的亲和力高至少2,3,4,5,8,10,12,15,18,20,22,25,30,35,40,50,或100–倍。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合的HER受体中的至少一个的生物学活性。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体抑制它们特异性结合的两个HER受体的生物学活性。因此，例如，本发明的多特异性抗体抑制EGFR和/或HER2和/或HER3和/或HER4受体的生物学活性。
在一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合人EGFR和人HER3，并且抑制至少EGFR的生物学活性。在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合人EGFR和人HER3，并且抑制至少HER3的生物学活性。在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合人EGFR和人HER3，并且抑制EGFR和HER3两者的生物学活性。
在另一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合人EGFR和人HER2，并且抑制至少EGFR的生物学活性。在又一个实施方案中，抗体特异性结合人EGFR和人HER2，并且抑制至少HER2的生物学活性。在又一个实施方案中，抗体特异性结合人EGFR和人HER2，并且抑制EGFR和HER2两者的生物学活性。
在另一个实施方案中，抗体特异性结合人EGFR和人HER4，并且抑制至少EGFR的生物学活性。在另一个实施方案中，抗体特异性结合人EGFR和人HER4，并且抑制至少HER4的生物学活性。在另一个实施方案中，抗体特异性结合人EGFR和人HER4，并且抑制EGFR和HER4两者的生物学活性。
在某些实施方案中，本文的抗体抑制至少部分地由它们不结合的HER受体驱动的生物学活性。例如，结合EGFR和HER3的抗体可能仍然能够抑制HER2驱动的生物学活性。
生物学活性的抑制可在本领域熟知的测定法中测量。因此，例如，本文的抗体可抑制一个或多个HER受体的磷酸化，和/或可抑制HER配体结合其受体，和/或可抑制配体诱导的HER受体表达细胞的增殖和/或可抑制通过HER受体活化的下游信号传导途径。
应答EGFR磷酸化活化的两个主要下游信号传导途径是Ras/MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径。因此，本文的抗体抑制HER受体的生物学活性的能力可通过，例如在NR6细胞中，评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。因此，可测量抗体阻断配体诱导的p44/42MAPK,pAKT或其它下游信号传导分子的磷酸化的能力。HER3信号传导也参与数个其它途径，包括c-met和FGFR。本文的抗体抑制HER受体的生物学活性的能力可通过评估其是否能够阻断这些途径的活化来测量。
本发明一方面提供多特异性抗体，其如下产生，即使对一个HER受体具有特异性的抗体多样化，从而该抗体对第二个HER受体产生特异性，同时保留对所述第一个HER受体的特异性。总体而言，这种方法包括步骤(1)使抗体的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列多样化，其中在所述多样化之前，所述抗体包含VL和能够结合第一HER受体上的表位的重链可变结构域(VH)，和(2)选择能够结合第一HER受体上的表位和第二HER受体上的表位的多样化的抗体。这些步骤可重复，以便产生多特异性抗体。在美国专利申请20080069820中提供了这种方法的详细描述，其全文通过引用明确并入本文。这种方法在实施例中进一步说明。在实施例中描述的方法中，抗EGFR抗体用作进行多样化的模板，并且因此用于制备多特异性抗HER抗体，然而，其它抗HER抗体，诸如抗HER2，抗HER3或抗HER4抗体也可用作模板。
本发明还提供单特异性抗体，其能够特异性结合一个HER受体但不特异性结合其它HER受体。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR的结构域III。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR并且抑制EGFR的生物学活性。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合HER3。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合HER3的结构域III。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合HER3并且抑制HER3的生物学活性。
所述单特异性抗体可用作模板抗体，用于进一步多样化，以便添加对其它HER受体或对其它靶抗原的结合特异性。
毒性
EGFR拮抗剂的毒性在临床前和临床研究中均有许多文件记载。例如，在治疗有效水平，抗EGFR抗体西妥昔单抗显示多种形式的毒性。西妥昔单抗(Imclone)最常见的副反应(发病率≥25％)是皮肤的副反应(包括疹，瘙痒和指甲改变)，头痛，腹泻和感染。西妥昔单抗治疗相关的最严重有害反应是输液反应(infusion reactions)，心肺功能停止(cardiopulmonary arrest)，皮肤病学毒性(dermatologic toxicity)和放射性皮炎(radiation dermatitis)，脓毒症(sepsis)，肾衰竭(renal failure)，间质性肺炎(interstitial lung disease)和肺栓子(pulmonary embolus)。参见，对于西妥昔单抗的生物制品许可协议(Biologics License Agreement(BLA))(申请号:125084)(通过引用并入本文)。对于帕尼单抗(Amgen)观察到类似的毒性问题，其中在89％的施用这种抗体的患者中发生皮肤病学毒性。这些毒性是严重的，CTC 3级以及更高。(FDA标签。)
已经报道在一些例子中抗EGFR化疗剂厄洛替尼(erlotinib)导致急性肾衰竭(acute renal failure)或肾机能不全(renal insufficiency)，肝衰竭(hepaticfailure)和/或肝肾综合征(hepatorenal syndrome)，胃肠穿孔(gastrointestinalperforations)，大疱(bullous)和表皮脱落皮肤病症(exfoliative skin disorders)和角膜溃疡形成和穿孔(corneal ulceration and perforation)。参见，FDA关于厄洛替尼(Genentech,OSI Pharmaceuticals)的警告和预防(Warnings and Precautions)安全标签(2009)。
“毒性的”或“毒性”是指施用给受试者的药剂导致的任何副作用。毒性的测量包括但不限于死亡率(mortality)、体重减轻(loss of body weight)、器官衰竭(organ failure)、改变器官功能(altered organ function)、中枢神经***毒性(central nervous system toxicity)、胃肠毒性(gastrointestinal toxicity)(例如，表现为腹泻(diarrhea))、皮肤病学毒性(dermatologic toxicity)(例如，表现为出现疹(rash)、皮肤损害(skin lesion)、脱屑(desquamation)或瘙痒(pruritus))，心脏毒性(cardiac toxicity)、感染(infection)、脓毒症(sepsis)和细胞毒性(cytotoxicity)。
毒性可通过本领域已知的方法确定，诸如监测临床护架旁观察(clinicalcageside observation)、体重、食物消耗、呼吸率、脉搏血氧定量法测量、体格检查、眼评价、神经病学评价、代谢参数、心血管参数、临床病理学(包括临床化学、血液学、尿分析和凝固参数)和肉眼检查病理学和显微镜病理学。
国家癌症研究所(National Cancer Institute)制作的不良事件常用术语标准(The Common Terminology Criteria for Adverse Events)v3.0(CTCAE)(其全文通过引用并入本文)提供了关于在人受试者中具体可接受的毒性指标的信息。图31提供了关于EGFR拮抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性的信息。
毒性可根据总毒性事件或一个毒性事件/多个毒性事件的严重性进行测量。事件的严重性可使用CTCAE中建立的分级***来描述。对每个不良事件使用唯一的严重性临床描述进行分级，这是基于下述一般准则：1级是指轻度事件。2级是指中度事件，3级是指严重事件，4级是指威胁生命或致残事件，5级是指死亡相关的事件。CTCAE提供了对于毒性事件的具体临床描述。对皮肤病学毒性的描述词从CTCAE,v.3第14页开始提供。作为实例，图32显示对于疹/脱屑和痤疮/痤疮样疹的分级。(CTCAE,v.3)。存在本领域已知的许多模型用于监测毒性的可能指标，包括但不限于体外基于细胞的模型和体内非人动物模型。毒性也在人受试者在临床试验研究中进行监测。
在一个具体实施方案中，毒性在食蟹猴(cynomolgus monkeys)中进行测量。EGFR拮抗剂在食蟹猴中的毒性效应有许多文件记载。如在关于西妥昔单抗的生物制品许可协议(Biologics License Agreement)(BLA)(申请号:125084)(通过引用并入本文)中所记载，所有接受西妥昔单抗的猴子显示在皮肤上的轻度至严重损害，由鳞屑形成(scale formation)、变红(reddening)、红斑(erythema)、皮炎(dermatitis)、裂隙(fissures)、伤口(wounds)和疹病(exanthema)和/或毛发稀疏或脱失(hair thinning or loss)组成。皮肤病学毒性在严重性和发生事件中均是剂量依赖的，其中对于高、中和低剂量的严重性分别为严重、中度和轻度，以及发病时间分别在研究的第15,22和64天。严重皮肤损伤的继发并发症是细菌感染或脓毒症，在高剂量组中50％的动物随后死亡或进行安乐死。其它剂量相关毒性包括在某些临床病理学参数中的改变，所述参数与肝、骨髓、脾和淋巴样器官中的细胞和组织损伤的肉眼检查和显微镜证据相关。
如实施例中所描述的，与用同样量的EGFR拮抗剂西妥昔单抗给药食蟹猴相比较，用特异性结合EGFR和HER3的双特异性抗体给药的食蟹猴显示更少的毒性发生率，如通过皮肤损害所显示的。用25mg/kg的双特异性抗体给药的三只食蟹猴中的一只发生皮肤损害，而用25mg/kg的西妥昔单抗给药的3只食蟹猴中的3只发生皮肤损害。在双特异性抗体给药的猴子中发生的损害比西妥昔单抗给药的猴子中的损害严重性更低，并且延缓了损害的发病。与其中在所有动物中皮肤损害的发病发生在第三次给药之后的用西妥昔单抗给药的猴子相比较，用双特异性抗体给药的动物在最后一次(第六次)给药之后的一周发生皮肤损害。
在西妥昔单抗的临床研究中，观察到了皮肤病学毒性，包括痤疮样疹、皮肤干燥和裂隙和炎症和感染性后遗症(infectious sequelae)。报道的皮肤病学毒性的发生率高达89％(对于患有晚期结肠直肠癌的那些患者)。
皮肤毒性的模型是已知的并且可用于确定抗体的皮肤病学毒性。此类模型的实例包括人表皮角质化细胞(NHEK(Clonetics,San Diego,CA；Lonza Bioscience,Walkersville,MD)；HEKa(Cascade Biologics,Portland,OR；Invitrogen,Carlsbad,CA)和重建人表皮(EpiDermTM cultures(MatTek,Ashland,MA)。这些模型可用于检查抗体对细胞增殖、基因表达、蛋白表达、受体磷酸化、细胞活力和组织病理学中改变的效应。Lacouture,M.E.,Nature Rev.Cancer(自然综述：癌症),6:803-812(2006)。
希望提供靶向EGFR途径的更低毒性的抗体。EGFR拮抗剂诸如西妥昔单抗的剂量被毒性(主要是皮肤病学毒性和输液反应)所限制。更低毒性的抗体可以比更高毒性的EGFR拮抗剂更高的剂量施用，这可产生增加的抗肿瘤效应。因此，本发明一方面提供多特异性抗体，其特异性结合EGFR和至少一个其它HER受体,(HER2,HER3,和/或HER4)，其中当所述抗体和EGFR拮抗剂以同等剂量施用时，所述抗体比EGFR拮抗剂毒性更低。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR和HER3。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR和HER2。在又一个实施方案中，所述抗体特异性结合EGFR和HER4。
在一些实施方案中，在体内模型中与EGFR拮抗剂相比较，所述多特异性抗体诱导更低的毒性发生率，更低严重性的毒性或延缓毒性的发病。本发明一方面提供多特异性抗体，其特异性结合EGFR和至少一个其它HER受体(HER2,HER3,和/或HER4)，其中与在施用EGFR拮抗剂的受试者中的毒性事件相比较，在施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的毒性事件。在具体实施方案中，在施用所述抗体的受试者中毒性事件的数目比施用EGFR拮抗剂的受试者中的毒性事件的数目低至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％。
在其它实施方案中，使用所述抗体的受试者中毒性事件的比率低于80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,5％,2％,或1％。
在具体实施方案中，与EGFR拮抗剂相比较，所述多特异性抗体在体内模型中诱发更低发生率的皮肤病学毒性、更低严重性的皮肤病学毒性或延缓皮肤病学毒性的发病。本发明一方面提供多特异性抗体，其特异性结合EGFR和至少一个其它HER受体(HER2,HER3,和/或HER4)，其中与施用EGFR拮抗剂的受试者中的总皮肤病学毒性事件相比较，在施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的总皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中，施用所述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的数目比施用EGFR拮抗剂的受试者中总皮肤病学毒性事件的数目低至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％。
在其它实施方案中，施用所述抗体的受试者中总皮肤病学毒性事件的比率低于80％,70％,60％,50％,40％,30％,20％,10％,5％,2％,或1％。
本发明另一方面提供多特异性抗体，其特异性结合EGFR和至少一个其它HER受体(HER2,HER3,和/或HER4)，其中与施用EGFR拮抗剂的受试者中的3级或更高等级的毒性事件相比较，施用所述抗体的受试者中所述抗体诱发更少的3级或更等级的毒性事件。在具体实施方案中，与施用EGFR拮抗剂的受试者中的3级或更高等级的毒性事件相比，施用所述抗体的受试者中3级或更高等级的毒性事件的数目低至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％。
在其它实施方案中，在施用所述多特异性抗体的受试者中3级或更高等级的毒性事件的比率低于70％,60％,50％,40％,30％,20％,15％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或1％。
在具体实施方案中，与施用EGFR拮抗剂的受试者中的3级或更高等级的皮肤病学毒性事件相比较，施用双特异性抗体的受试者中所述多特异性抗体诱发更少的3级或更高等级的皮肤病学毒性事件。在具体实施方案中，与施用EGFR拮抗剂的受试者中的3级或更高等级的皮肤病学毒性事件的数目相比，施用所述多特异性抗体的受试者中3级或更高等级的皮肤病学毒性事件的数目低至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,或90％。
在其它实施方案中，施用所述多特异性抗体的受试者中3级或更高等级的皮肤病学毒性事件的比率低于70％,60％,50％,40％,30％,20％,15％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,或1％。
在其它实施方案中，与EGFR拮抗剂相比较，所述抗体在体内模型中诱发更少发病率的改变的器官功能。在其它实施方案中，与EGFR拮抗剂相比较，所述抗体在体内模型中诱发更少或更低严重性的胃肠毒性。
在一些实施方案中，所述EGFR拮抗剂是抗EGFR抗体。在一个实施方案中，所述EGFR拮抗剂是西妥昔单抗。在另一个实施方案中，所述EGFR拮抗剂是帕尼单抗。在另一个实施方案中，所述EGFR拮抗剂是小分子。在一个实施方案中，所述EGFR拮抗剂是厄洛替尼。在一个实施方案中，所述体内模型是猴，诸如食蟹猴。在另一个实施方案中，所述体内模型是人。
抗体和抗体变体
在一些实施方案中，本发明提供包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域的多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标，包括其它HER受体。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH(重链可变结构域)，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL(轻链可变结构域)，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:64。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:26。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:64，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:26。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。在一个具体的实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:48)，HVR-H2包含氨基酸序列LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:50)，HVR-H3包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:53)，HVR-L1包含氨基酸序列DLATDVA(SEQ ID NO:54)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)和HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。在一个具体的实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:48)，HVR-H2包含氨基酸序列LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:50)，HVR-H3包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ IDNO:53)，HVR-L1包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:55)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)，和HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。在一个具体的实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO:48)，HVR-H2包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:51)，HVR-H3包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ IDNO:53)，HVR-L1包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:55)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)，和HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:40，41，42，43，44，45或46。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:40，41，42，43，44，45或46。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:40，41，42，43，44，45或46的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:40，41，42，43，44，45或46的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:25的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:40，41，42，43，44，45或46的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NOs:36，37或38。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，该重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ IDNOs:36，37或38。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:36，37或38的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:36，37或38的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQID NO:25的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:36，37或38的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:39。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，该重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:39。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:24。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。在一个具体的实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列FTGNWIH(SEQ ID NO:47)，HVR-H2包含氨基酸序列VGEISPSGGYTD(SEQ ID NO:49)，HVR-H3包含氨基酸序列ARESRVSYEAAMDY(SEQ IDNO:52)，HVR-L1包含氨基酸序列DVSTAVA(SEQ ID NO:78)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)，和HVR-L3包含氨基酸序列SYPTPYT(SEQ ID NO:79)。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:33，34或35。在一个实施方案中，单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:33，34或35。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:33，34或35的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:33，34或35的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:33，34或35的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。在一个具体的实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列FTGDWIH(SEQ ID NO:62)，HVR-H2包含氨基酸序列VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO:60)，HVR-H3包含氨基酸序列AREAKVSFEAAMDY(SEQ ID NO:61)，HVR-L1包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO:55)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)，和HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:32。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:31。在一个实施方案中，单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:31。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的一个、两个和/或三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的一个、两个和/或三个HVRs。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的所有三个HVRs，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的所有三个HVRs。在一些实施方案中，所述HVRs是扩展的HVRs。在一个具体的实施方案中，HVR-H1包含氨基酸序列FSGDWIH(SEQ ID NO:59)，HVR-H2包含氨基酸序列VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO:60)，HVR-H3包含氨基酸序列AREAKVSFEAAMDY(SEQID NO:61)，HVR-L1包含氨基酸序列DLATDVA(SEQ ID NO:54)，HVR-L2包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO:56)和HVR-L3包含氨基酸序列SEPEPYT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:2，12或14。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:4，5，6，7，8，9，10，11或13。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。
在一些实施方案中，本发明提供多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标，包括其它HER受体。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:21，22或23。
在一些实施方案中，本发明提供多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标，包括其它HER受体。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合EGFR的单特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标，包括其它HER受体。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1或3。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，所述轻链包含氨基酸序列SEQ IDNO:1。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合HER3的单特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域不特异性结合其它靶标，包括其它HER受体。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:16，17，19或20。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:13或15。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:16，17，19或20，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NOs:13或15。
在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。
在一些实施方案中，考虑了本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质。可以通过将适合的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括，例如在抗体的氨基酸序列中缺失残基和/或***残基，和/或置换残基。可以进行缺失、***和置换的任何组合从而得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有需要的特征。氨基酸改变可以在制备序列的时候引入主题抗体氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于参照序列具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、***或缺失，但是包含所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力。在一些实施方案中，相对于参照序列具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列含有置换、***或缺失，但是包含所述氨基酸序列的抗体保留了结合所述参照序列的最初一个靶标或多个靶标的能力，并且不特异性结合任何其它靶标，包括其它HER受体。在一些实施方案中，参照序列的氨基酸序列中总计1至10个氨基酸被置换、***或缺失。在一些实施方案中，所述置换、***或缺失发生在HVRs外部的区(即，在FRs中)。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:40具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:40具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:64具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQID NO:64具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL具有与SEQ IDNO:29至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NOs:40，41，42，43，44，45或46中的任意一条具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NOs:40，41，42，43，44，45或46具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:37具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH结构域和VL，所述VH结构域与氨基酸序列SEQID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL具有氨基酸序列SEQ ID NO:37。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL具有氨基酸序列SEQID NO:38。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER2的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:38具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:39具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER4的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:39具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合EGFR的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明提供单特异性抗体，其包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，所述VH与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述单特异性抗体包含特异性结合HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，所述VH与氨基酸序列SEQ IDNO:35具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，所述VL与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
图33中显示了示例性比对，该比对显示数个抗HER抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的Kabat编号。
本发明的另一方面提供多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，其中SEQ ID NO:25的VH包含在F29(VH)，T30(VH)，N32(VH)，V48(VH)，P52a(VH)，S53(VH)，T57(VH)，S96(VH)或Y100(VH)的氨基酸置换，根据Kabat编号***进行编号。在一个实施方案中，所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中，所述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，其中SEQ ID NO:25的VH包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换：F29(VH)L；T30(VH)S；N32(VH)D，V48(VH)L，P52a(VH)A，S53(VH)A，T57(VH)S，S96(VH)A和Y100(VH)F，根据Kabat编号***进行编号。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，其中SEQ ID NO:25的VH包含氨基酸置换F29(VH)L，T30(VH)S，N32(VH)D，P52a(VH)A和S53(VH)A和Y100(VH)F，根据Kabat编号***进行编号。
本发明的另一方面提供多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域。其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，其中SEQ ID NO:58的VL包含在D28(VL)，V29(VL)，S30(VL)，T31(VL)，A32(VL)，V33(VL)，S50(VL)，A51(VL)，F53(VL)，S91(VL),Y92(VL)，T93(VL)，T94(VL)或P96(VL)的氨基酸置换，根据Kabat编号***进行编号。在一个实施方案中，所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中，所述抗体包含所有这些置换。在一个实施方案中，所述抗体包含在氨基酸31和氨基酸32之间的氨基酸***。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，其中SEQ ID NO:58的VL包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换：D28(VL)N，V29(VL)I，V29(VL)L，S30(VL)A，A32(VL)D，Y92(VL)E，T93(VL)P，T94(VL)E和P96(VL)Y，根据Kabat编号***进行编号。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VL，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，其中SEQ ID NO:58的VL包含氨基酸置换D28(VL)N，V29(VL)I，S30(VL)A，A32(VL)D，Y92(VL)E，T93(VL)P，T94(VL)E和P96(VL)Y，根据Kabat编号***进行编号。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，其中SEQ IDNO:25的VH包含在F29(VH)，T30(VH)，N32(VH)，V48(VH)，P52a(VH)，S53(VH)，T57(VH)，S96(VH)或Y100(VH)的氨基酸置换，并且其中SEQ IDNO:58的VL包含在D28(VL)，V29(VL)，S30(VL)，T31(VL)，A32(VL)，V33(VL)，S50(VL)，A51(VL)，F53(VL)，S91(VL),Y92(VL)，T93(VL)，T94(VL)或P96(VL)的氨基酸置换，根据Kabat编号***进行编号。在一个实施方案中，所述抗体包含多于一个这些置换。在一个实施方案中，所述抗体包含所有这些置换。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，其中SEQ IDNO:25的VH包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换：F29(VH)L；T30(VH)S；N32(VH)D，V48(VH)L，P52a(VH)A，S53(VH)A，T57(VH)S，S96(VH)A和Y100(VH)F，SEQ ID NO:58的VL包含一个或多个选自由下述各项组成的组的氨基酸置换：D28(VL)N，V29(VL)I，V29(VL)L，S30(VL)A，A32(VL)D，Y92(VL)E，T93(VL)P，T94(VL)E和P96(VL)Y，根据Kabat编号***进行编号。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含VH和VL，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，其中SEQ ID NO:25的VH包含氨基酸置换F29(VH)L，T30(VH)S，N32(VH)D，P52a(VH)A和S53(VH)A和Y100(VH)F,该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，其中SEQ ID NO:58的VL包含氨基酸置换D28(VL)N，V29(VL)I，S30(VL)A，A32(VL)D，Y92(VL)E，T93(VL)P，T94(VL)E和P96(VL)Y，根据Kabat编号***进行编号。
用于鉴定对于突变发生是优选位置的抗体的某些残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸分区诱变法”，如Cunningham和Wells在科学(1989)(Science)，244:1081-1085中所述。在此处，鉴定了一种或一组靶残基(例如带电荷的残基如arg，asp，his，lys和glu)，并且用中性或带负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换从而影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在或关于置换位点引入另外的或其它变体来精选显示对置换的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，当预先确定引入氨基酸序列变化的位点时，突变本身的性质不需要被预先确定。例如，为了分析突变在给定位点的性能，在靶密码子或靶区进行丙氨酸分区诱变或随机诱变并且关于需要的活性筛选表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基端融合，长度范围在1个残基到包含一百以上残基的多肽，以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N端或C端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如关于ADEPT)或多肽的融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本发明的抗体从而增加或减少抗体被糖基化的程度。多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接指碳水化合物结构部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，是关于将碳水化合物结构部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列的存在产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸，最常见连接于丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
常规情况下，在抗体上加入或缺失糖基化位点通过改变氨基酸序列完成，从而产生或去除一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)。还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基在起始抗体序列加入、缺失或置换进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。
如果抗体包含Fc区，那么可以改变其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含支化的，双触角寡糖，其通常通过N-连接连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。见，例如，Wright等(1997)TIBTECH 15:26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角的寡糖结构的“茎”中连接于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本发明的抗体中修饰寡糖从而产生具有一定提高性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有这样的碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺乏连接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖。例如，在此类抗体中岩藻糖的量可以是从1％至80％，从1％至65％，从5％至65％或从20％至40％。岩藻糖的量通过MALDI-TOF质谱测定法如下确定：计算在Asn297的糖链内的岩藻糖相对于附着到Asn 297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖结构)的总和的平均量，例如，如在WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指Fc区中位于大约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可位于大约位置297的上游或下游±3个氨基酸，即在位置294和300之间。所述岩藻糖基化变体可以具有提高的ADCC功能。见例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基化(defucosylated)”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，生物技术生物工程(Biotech.Bioeng.)87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等生物化学生物物理进展(Arch.Biochem.Biophys.)249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312A1，Adams等，尤其在实施例11中)，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等生物技术生物工程(Biotech.Bioeng).87:614(2004)；Kanda，Y.等，生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)，94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
还提供具有等分寡糖的抗体变体，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。所述抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或可以具有提高的ADCC功能。所述抗体变体的实例例如在WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US2005/0123546(Umana等)中进行描述。还提供在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可以具有提高的CDC功能。例如在WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO1999/22764(Raju，S.)中描述所述抗体变体。
Fc区变体
在某些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但不是全部的效应子功能的抗体变体，所述效应子功能使所述抗体变体成为对于下述应用是理想的候选物，在所述应用中抗体在体内的半衰期是重要的，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法从而证实CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法从而确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是维持FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，即NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，免疫学年度综述(Annu.Rev.Immunol.)9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结在造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述在美国专利号5,500,362中(见例如Hellstrom，I.,等美国国家科学院学报(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA)83:7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，美国国家科学院学报(Proc.Nat’lAcad.Sci.USA)82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann，M.等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)166:1351-1361(1987))中。备选地，可以使用非放射性测定法(见，例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI)。用于所述测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如如在Clynes等美国国家科学院学报(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估。还可以进行C1q结合测定法从而证实抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如在WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(见，例如，Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)202:163(1996)；Cragg，M.S.等，血液(Blood)101:1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，血液(Blood)103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见，例如，Petkova，S.B.等，国际免疫学(Int’l.Immunol.)18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329的一个或多个置换的那些(美国专利6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个或多个具有置换的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297变为丙氨酸的置换(美国专利7,332,581)。
描述了某些具有提高或减少结合FcRs的抗体变体。(参见，例如，美国专利6,737,056；WO 2004/056312和Shields等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含提高ADCC的具有一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如，在Fc区的位置298，333和/或334(残基的EU编号)的置换。
在一些实施方案中，在Fc区进行改变，其导致改变的(即，提高的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如如在美国专利6,194,551，WO 99/51642和Idusogie等,免疫学杂志(J.Immunol.)164:4178-4184(2000)中所描述的。
在US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了具有增加的半衰期并且对于新生儿Fc受体(FcRn)具有提高的结合的抗体，所述FcRn负责将母体IgGs转移给胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J.Immunol.)117:587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24:249(1994))。那些抗体其中包含具有一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在下述一个或多个Fc区残基具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如Fc区残基434的置换(美国专利7,371,826)。
涉及Fc区变体的其它实例也参见Duncan & Winter，Nature(自然)322:738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；和WO94/29351。
半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，在抗体可及的位点存在置换的残基。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基由此定位在抗体的可及位点，并且可以用于将抗体缀合于其它结构部分，如药物结构部分或接头-药物结构部分，从而产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在某些实施方案中，下面的残基的任何一个或多个可以用半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以如，例如在美国专利7,521,541中所描述的产生。
抗体衍生物
在某些实施方案中，可以对本文提供的抗体进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的另外的非蛋白质性的结构部分。适合抗体的衍生作用的结构部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于：聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二噁烷，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇同聚物(propropylene glycolhomopolymers)，聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯化的多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在生产中具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般地，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于这样的考虑来确定，包括，但不限于，待提高的抗体的具体性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗中，等。
在另一个实施方案中，提供可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体和非蛋白质性结构部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性的结构部分是碳纳米管(nanotube)(Kam等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102:11600-11605(2005))。辐射可以以任何波长进行，并且包括，但不限于这样的波长，所述波长不伤害正常细胞，但是其将非蛋白质性结构部分加热到杀死接近抗体-非蛋白质性结构部分的细胞的温度。参见，例如Petkova，S.B.等,国际免疫学(Int’l.Immunol.)18(12):1759-1769(2006)).
提供具有一个或多个氨基酸置换的其它抗体变体。用于置换突变发生的目的位点包括高变区，但是也预期FR改变。保守性置换在“优选的置换”的标题下在表1中显示。更多实质性的改变，显示在表4中的“示例性置换”中，或在下面参照氨基酸类别进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体和例如关于需要的活性(如提高的抗原结合，减少的免疫原性，提高的ADCC或CDC等)筛选的产物中。
表1
在抗体的生物学性质中的修饰可以通过选择这样的置换来进行，所述置换影响(a)在置换区域中的多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。可以根据它们的侧链性质中的类似性对氨基酸进行分组(在A.L.Lehninger，在生物化学(Biochemistry)，第二版.，73-75页，Worth Publishers，纽约(1975)中):
(1)非极性:Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)
(2)不带电荷的极性:Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)，Glu(E)
(4)碱性:Lys(K)，Arg(R)，His(H)
备选地，可以将天然存在的残基基于常见的侧链性质分为数组：
(1)疏水:正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性:Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性:Asp，Glu；
(4)碱性:His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香:Trp，Tyr，Phe。
非保守性置换需要将这些类别中的之一的成员与另一类交换。所述置换的残基还可以被引入保守性置换位点，或引入保留(非保守)位点。
一种类型的置换变体包括置换母体抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，关于进一步开发所选择的得到的变体相对于它们产生自其中的母体抗体具有修饰的(例如提高的)生物学性质。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简言之，对一些高变区位点(例如，6-7个位点)突变从而在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。从丝状噬菌体颗粒展示由此产生的抗体，所述抗体作为与在每个颗粒中包装的噬菌体外壳蛋白(例如，M13的基因III产物)的至少一部分的融合物展示。接着关于噬菌体展示变体的生物学活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行分区诱变法(例如，丙氨酸分区)从而鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。备选地，或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构从而鉴定抗体和抗原之间的接触点可以是有益的。根据本领域已知的技术，所述接触残基和邻近残基是置换的候选物，包括在本文中阐释的那些。一旦产生了所述变体，变体组使用本领域中已知的技术进行筛选，包括在本文中所述的那些，并且可以对在一个或多个相关测定法中具有优越性质的变体进行选择以用于进一步开发。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法进行制备。这些方法包括，但不限于：从自然来源分离(在天然存在的氨基酸变体的情形中)或通过早期制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸-介导(或位点定向)诱变，PCR诱变和盒诱变进行制备。
免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADCs”)，其包含缀合至一种或多种细胞毒性剂的抗体，所述细胞毒性剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素，诸如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素(即放射缀合物)。
在癌症治疗中，免疫缀合物已经用于局部投递细胞毒性剂，即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物(Lambert,J.(2005)Curr.Opinion inPharmacology(药学新观点)5:543-549；Wu等,(2005)Nature Biotechnology(自然：生物技术)23(9):1137-1146；Payne，G.(2003)i 3:207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research(抗癌研究)19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26:151-172；美国专利4,975,278)。免疫缀合物允许将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而***施用未经缀合的药物可对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞导致不可接受的毒性水平(Baldwin等，Lancet(柳叶刀)(1986年3月15日)第603-05页；Thorpe，(1985)“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review(肿瘤治疗中细胞毒性剂的抗体载体：综述),”在Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(单克隆抗体84：生物学和临床应用)中，(A.Pinchera等编辑)，第475-506页)。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.(癌症免疫学和免疫疗法)，21:183-87)。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等，1986，见上文)。抗体-毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)J.Nat.Cancer Inst.(国家肿瘤研究所杂志)92(19):1573-1581；Mandler等，(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters(生物有机和医学化学通讯)10:1025-1028；Mandler等，(2002)Bioconjugate Chem.(生物缀合化学)13:786-791)，美登木素生物碱类(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)93:8618-8623)，和加利车霉素(calicheamicin)(Lode等，(1998)Cancer Res.(癌症研究)58:2928；Hinman等，(1993)Cancer Res.(癌症研究)53:3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。
已经显示曲妥珠单抗-DM1(或T-DM1)在曲妥珠单抗-敏感的和曲妥珠单抗-不敏感的HER2-过表达癌症模型中有效。(US 7097840)。(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素缀合物(Wiseman等，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77；Wiseman等，(2002)Blood(血液)99(12):4336-42；Witzig等，(2002)J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)20(10):2453-63；Witzig等，(2002)J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)20(15):3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM(吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，即由huCD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物缀合物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(未来药物)(2000)25(7):686；美国专利4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱类药物部分DM1连接而构成的抗体-药物缀合物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZLBiologics，Immunogen Inc.)，即由抗***特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱类药物部分DM1连接而构成的抗体-药物缀合物，正在进行用于***肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)缀合(Doronina等，(2003)Nature Biotechnol.(自然：生物技术)21(7):778-784)，且正在进行治疗性开发。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文(例如上文)描述了可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin proteins)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。多种放射性核素可用于生成放射缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y、和186Re。抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如己二亚氨盐酸二甲酯(dimethyladipimidate HCl))、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science(科学)238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
本文还意欲抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的缀合物。
美登素(Maytansine)和美登木素生物碱类
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至一个或多个美登木素生物碱类分子的抗体(全长或片段)。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533。
在抗体药物缀合物中美登木素生物碱类药物部分是有吸引力的药物部分，因为它们：(i)相对易于通过发酵或化学修饰、从发酵产物衍生而制备，(ii)易于用适于通过非二硫化物接头缀合至抗体的功能基团衍生化，(iii)在血浆中稳定，和(iv)针对多种肿瘤细胞系有效。
已经公开了含有美登木素生物碱类的免疫缀合物、其制备方法及其治疗用途，例如美国专利5,208,020，5,416,064及欧洲专利EP 0425235B1，明确将其公开内容通过引用并入本文。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱类的免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research(癌症研究)52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合的免疫缀合物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱类缀合物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱类药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱类分子数目来提高。A7-美登木素生物碱类缀合物在小鼠中显示低***性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱类缀合物通过将抗体与美登木素生物碱类分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性来制备。参见例如，美国专利5,208,020(其公开内容通过引用明确并入本文)。每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱类缀合物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1，Chari等，CancerResearch(癌症研究)52:127-131(1992)，和2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，其公开内容通过引用明确并入本文。可如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602所公开的制备包含接头成分SMCC的抗体-美登木素生物碱类缀合物。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，二硫化物和硫醚基团是优选的。另外的连接基团在本文进行了描述和例示。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱类的缀合物，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.(生物化学杂志)173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物和衍生物，auristatin缀合的抗体(美国专利5635483；5780588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞***(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物结构部分可经由肽药物结构部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO 02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物结构部分DE和DF，披露于2004年11月5日提交的“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands(能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物)”，美国序列号No.10/983,340，明确将其公开内容完整收入本文。
典型的是，基于肽的药物结构部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.和K.Lübke，“The Peptides(肽),”volume1，第.76-136页，1965，Academic Press)。Auristatin/多拉司他汀药物结构部分可依照以下文献中的方法来制备：US 5635483；US 5780588；Pettit等，(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等，(1998)Anti-Cancer DrugDesign(抗癌药物设计)13:243-277；Pettit，G.R.,等，Synthesis(合成)，1996，719-725；和Pettit等，(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15:859-863；也见Doronina(2003)Nat.Biotechnol.(自然：生物技术)21(7):778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands(能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物)”，美国序列号No.10/983,340，2004年11月5日提交，将其完整收入本文作为参考(披露了例如制备缀合至接头的诸如MMAE和MMAF的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法)。
加利车霉素
在其它实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀合物的制备参见美国专利5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296(都授予American Cyanamid Company)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I，α2I，α3I，N-乙酰基-γ1I，PSAG和θI1(Hinman等，Cancer Research(癌症研究)53:3336-3342(1993)，Lode等，Cancer Research(癌症研究)58:2925-2928(1998)；及上述授予American Cyanamid的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。
其它细胞毒性剂
可与抗体缀合的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还考虑了以下免疫缀合物，其在抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射缀合的抗体。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在将缀合物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如再次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入缀合物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123，Re186，Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于掺入碘123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(免疫闪烁成像中的单克隆抗体)”(Chatal，CRC Press 1989)详细记载了其它方法。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science(科学)238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research(癌症研究)52:127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,美国)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook andCatalog)第467-498页。
抗体药物缀合物的制备
在抗体-药物缀合物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物结构部分(D)缀合，例如每个抗体缀合约1个至约20个药物结构部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物结构部分D反应；和(2)药物结构部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本发明描述了制备ADC的另外的方法。
Ab-(L-D)p    I
接头可由一个或多个接头构件构成。示例性接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基(6-maleimidocaproyl，“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(maleimidopropanoyl，“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对-氨基苯甲氧基羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl，“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC’)、和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。另外的接头构件是本领域已知的，有些在本文进行了描述。也见“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands(能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物),”2004年11月5日提交，美国序列号No.10/983,340，其全文内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。示例性氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽、或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及稀有氨基酸(minor aminoacid)和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可设计和优化氨基酸接头构件的选择性以用于通过特定的酶(如肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶)进行酶切割。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。由此每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。通过引入一个、两个、三个、四个、或更多半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)可将反应性硫醇基引入抗体(或其片段)。
还可通过修饰抗体引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子结构部分来生成抗体-药物缀合物。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适当基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致代替第一个氨基酸而生成醛(Geoghegan &Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)3:138-146；US5362852)。此类醛可与药物结构部分或接头亲核体反应。
同样，药物结构部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码缀合物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏缀合物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)缀合从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体缀合物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(如亲合素)。
重组方法和组合物
抗体可以使用例如在美国专利4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗HER抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗HER抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
为了重组生产抗-HER抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并***一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana出版社，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致生产具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.(自然生物技术)24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等，遗传病毒学杂志(J.Gen Virol.)36:59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，生物繁殖(Biol.Reprod.)23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合生产抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，在分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
治疗用途
本文描述的抗体和抗体片段可用于治疗癌症，包括癌前的、非转移性的、转移性的和癌性肿瘤(例如，早期癌症)，或用于治疗有发生癌症(例如乳腺癌)风险的受试者。抗体和抗体片段也可用于治疗或预防非恶性疾病，诸如神经变性病症、精神病学病症或自身免疫性疾病。
术语癌症包括一组增殖性病症，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、侵袭或转移至远方位点的能力。恶性肿瘤将侵袭并破坏其周围的其它组织。它们也获得了从其起始处剥离并扩散至身体其它部分的能力(转移)，通常通过血流或通过***所在的淋巴***转移。原发肿瘤通过它们所发生的组织类型进行分类；转移瘤通过衍生癌细胞的组织类型进行分类。经过一段时间，恶性肿瘤的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级，并且癌细胞被描述为良好分化的、中度分化的、较差分化的或未分化的。良好分化的细胞显得非常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。未分化的细胞是变得如此异常的细胞以至于不能确定该细胞的来源。
肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(例如，慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myelogenousleukemia)、成熟急性B细胞型淋巴细胞性白血病(mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia)、前淋巴细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))、或淋巴瘤(lymphoma)(例如，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)、或霍奇森病(Hodgkin's disease)。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴***之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、***、***、肺、肾、肝、胰、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、***、胆囊、***、鼻咽、皮肤、子宫、***、泌尿器官、膀胱的肿瘤及皮肤的肿瘤(包括黑素瘤)。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤(sarcomas)、脑肿瘤(brain tumors)、和骨肿瘤(bone tumors)。
上皮癌(epithelial cancers)通常从良性肿瘤发展为前侵袭期(例如，原位癌)，至恶性癌症，其已经渗透基底膜并侵入上皮下基质。
在一个实施方案中，多特异性抗体特异性结合EGFR和至少一个其它HER受体，诸如HER2或HER3或HER4，并且在预防和/或治疗实体瘤，特别是结肠直肠肿瘤，肺肿瘤(诸如非小细胞肺癌和鳞状细胞癌)，头和颈肿瘤，卵巢肿瘤，皮肤肿瘤，胰肿瘤和/或***肿瘤中有用。
多特异性抗体也可用于减少或预防对靶向HER途径的治疗的抗性。在使用靶向HER途径的治疗中的显著限制是许多癌症患者显示的对所述治疗的治疗效果的抗性。一些癌症患者对靶向HER途径的治疗显示无反应。其他癌症患者可能显示初始反应，但是然后对所述治疗变成抗性的。癌症对治疗是抗性的，如果在接受治疗时癌症有进展(难治性的)，或如果在完成治疗方案的12个月内癌症有进展(复发)。
在一个实施方案中，靶向HER途径的治疗包括用靶向HER途径的抗体(例如，EGFR抗体，HER2抗体，HER3抗体和/或HER4抗体)进行治疗。在另一个实施方案中，靶向HER途径的治疗包括用化疗剂进行治疗。
剂量和制剂
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本文的抗体或抗体片段组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状态、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。确定待施用的抗体或抗体片段的“治疗有效量”需要考虑以上因素，这是预防、缓解或治疗癌症所需的最小量。抗体或抗体片段不是必需而是任选与目前用于预防或治疗癌症或发生癌症的风险的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用途径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。一般而言，对癌症的减轻或治疗涉及减少与癌症相关的一种或多种症状或医学问题。药物的治疗有效量可通过下述各项之一或其组合获得：减少(至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)癌细胞数量；减小或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷；抑制(即减慢到一定程度和/或停止)癌细胞浸润到周围器官中；在腺瘤的情况下减少激素的分泌；减小血管密度；抑制肿瘤转移；降低或抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与癌症相关的症状。在一些实施方案中，抗体或抗体片段用于预防受试者中癌症的发生或复发。
一个实施方案中，本发明可用于延长易患或被诊断患有癌症的人类患者的生存期。生存期定义为首次给予药物到死亡的时间。生存期可通过治疗组相对于对照组的分段危险率(stratified hazard ratio)(HR)来测定，其代表治疗过程中患者死亡的危险性。
另一实施方案中，本发明的治疗显著增加易患或被诊断患有癌症的人类患者组中的反应率，所述患者用多种抗癌疗法治疗。反应率定义为对所述治疗有反应的被治疗患者的百分比。一方面，与单独的手术、放疗、或化疗治疗的组相比，本发明利用抗体或抗体片段和手术、放疗、或一或多种化疗剂的联合治疗显著增加被治疗患者组中的反应率，该增加具有低于0.005的χ2(Chi-square)p-值。
在美国专利申请公开20050186208中描述了癌症治疗中疗效的另外的测量。
治疗制剂通过混合具有需要纯度的活性成分和任选的生理可接受的载体、赋形剂或稳定剂使用本领域已知的标准方法进行制备(雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(20.sup.th edition)，A.Gennaro编辑，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的平衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或PEG。
任选地，但优选地，所述制剂包含药用盐、优选地氯化钠并且优选地在约生理浓度包含药用盐。任选地，本发明的制剂可以包含药用防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的浓度范围是0.1到2.0％，典型地以v/v计。适合的防腐剂包括在药物领域中已知的那些。苄醇、苯酚、间甲苯酚、羟苯甲酯和羟苯丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以包含浓度为0.005到0.02％的药用表面活性剂。
本文制剂也可以包含超过一种活性化合物，如被治疗的特定适应症所需要，优选地是对彼此没有不良影响具有补充活性的那些。所述分子适当地以对于意欲目的有效的量组合存在。
活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊剂中，例如分别在胶状药物递送***(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶-微囊剂和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊剂。所述技术在雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)见上文中公开。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质以成形的制品的形式存在，例如薄膜或微囊剂。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和.γ.乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够释放分子超过100天，而某些水凝胶则在更短的时间阶段释放蛋白。当包封的抗体仍旧在体内较长时间时，它们可能由于在37℃暴露于水分而变性或聚集，导致生物学活性的损失和免疫原性的可能变化。根据涉及的机制，可以设计合理的策略来进行稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物交换的分子间S--S键形成，那么稳定可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冷冻干燥、控制水分含量、使用适合的添加剂并且开发特定的聚合物基质组合物来实现。
本文描述的抗体和抗体片段依照已知的方法施用给人类受试者，诸如，作为推注或通过一段时间的连续输注的静脉内施用，通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、口服的、局部的、或吸入途径。如果HER(例如EGFR，HER2，HER3，HER4等)的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关，局部施用可以是特别期望的。先体外后体内(ex vivo)策略也可在治疗性应用中使用。先体外后体内策略涉及通过编码抗体或抗体片段的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。该转染或转导的细胞然后回输至受试者。该细胞可以是许多类型，包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质细胞或肌细胞。
在一个实例中，当病症或肿瘤的位置允许时，抗体或抗体片段局部施用，例如通过直接注射，并且该注射可周期性地重复。抗体或抗体片段也可全身投递给受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床，以预防或降低局部复发或转移。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适合剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合)将取决于待治疗的疾病类型，抗体的类型，疾病的严重性和进程，而不管施用抗体是用于预防还是治疗目的、以前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应，以及主治医师的判断。将抗体以一次或以一系列治疗适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg到20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg)的抗体可以是施用于患者的起始候选剂量，而不管例如是通过一次或多次单独施用还是通过持续输注进行施用。一种典型的每日剂量范围可以在约1μg/kg到100mg/kg或更多，这取决于上述因素。对于在数日或更长时间内的重复施用，取决于病况，治疗通常将持续直到对疾病症状需要的抑制发生。抗体的一个示例性剂量是在约0.05mg/kg到约20mg/kg的范围内。因此，可以将约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg，10mg/kg，12mg/kg，15mg/kg或20mg/kg的一个或多个剂量(或其任何组合)施用于患者。可以将所述剂量间歇性地施用，例如每周、每两周、或每三周(例如，从而使所述患者接受约2到约20或例如约6个剂量的抗体)施用。可以开始施用更高的负载剂量，随后施用一剂或多剂更低的剂量。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的起始负载剂量，随后每周一次施用约2mg/kg抗体的维持剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。该疗法的进程容易通过常规技术和测定法进行监测。
组合疗法
本发明的抗体可以与具有抗癌性质的第二化合物组合在药物组合制剂中，或组合在给药方案中，作为组合疗法。药物组合制剂或给药方案的第二化合物可以对组合中的抗体具有补充活性从而使它们不会对彼此存在不利的影响。在一个实施方案中，多特异性抗体与另一个抗HER抗体(诸如培妥珠单抗和/或西妥昔单抗)组合使用。本发明的抗体也可与放射疗法组合使用。
第二化合物可以是化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或保心药。所述分子以对于意欲的目的是有效的量适当地组合存在。包含本发明抗体的药物组合物也可以含有治疗有效量的化疗剂如微管蛋白-形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂或DNA结合剂。
其它的治疗方案可以与根据本发明鉴定的抗癌剂的施用组合。所述组合疗法可以作为同时或顺序方案进行施用。当顺序施用时，组合可以以两次或更多次施用进行施用。所述组合的施用包括使用单独的制剂或单一药物制剂的共同施用，和以任意顺序的连续施用，其中存在两种(或全部)活性剂同时发挥它们的生物学活性时的时期。
此类组合疗法的实例包括与化疗剂的组合，所述化疗剂如厄洛替尼(erlotinib)Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(bortezomib)(Millenium Pharm.)、氟维斯群(fulvestrant)(AstraZeneca)、sutent(SU11248，Pfizer)、来曲唑(letrozole)(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(oxaliplatin)(Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil))、亚叶酸(leucovorin)、雷帕霉素(Rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus)、Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016，GlaxoSmithKline)、氯那法尼(lonafarnib)(SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，Bayer Labs.)和吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)，烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；抗叶酸剂(antifolate)抗肿瘤诸如培美曲塞(pemetrexed)(Eli Lilly),吖丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯硫代磷酸胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；聚乙酸类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素类，加利车霉素(calicheamicin)，加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A(dynemicin A)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉代-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；aldophosphamide glycoside；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS天然产物，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；紫杉烷类化合物(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)、无克列莫佛(Cremophor)的ABRAXANETM、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)、和多西他塞(doxetaxel)(Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；和上述任一种的药用盐，酸或衍生物。
所述组合疗法还包括：(i)抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用如抗-***和选择性***受体调节剂(SERMs)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON·托瑞米芬(toremifene)；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的***产生，如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、益西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)；(iii)抗-雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，如例如PKC-α，Ralf和H-Ras；(vii)核酶如VEGF表达抑制剂(例如，核酶)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗如基因治疗疫苗，例如疫苗，疫苗和疫苗；rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；(ix)抗生血管药剂如贝伐珠单抗(Genentech)；和(x)上述任一种的药用盐、酸或衍生物。
关于所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书使用或由熟练的从业者根据经验确定。关于所述化疗法的制备和给药时间表也在Chemotherapy Service，(1992)Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，Md中进行描述。
组合疗法可以提供“协同性”并证实“协同作用”，即一起使用活性成分时获得的作用大于由单独使用化合物获得的作用的总和。当活性成分(1)共同配制和施用或在组合的单位剂量制剂中同时递送；(2)交替地或平行地作为单独的制剂递送；或(3)通过一些其他方案时，获得协同作用。当在交替疗法中递送时，当顺序施用或递送所述化合物(例如通过在单独的注射器中不同的注射)时，获得协同作用。一般地，在交替疗法过程中，每种活性成分的有效剂量顺序地，即连续地进行施用，而在组合疗法中，将两种以上的活性成分的有效剂量一起施用。
制品和试剂盒
本发明另一个实施方案是制品，其含有在治疗癌症中有用的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(packageinsert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的多特异性抗体或抗体片段。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。标签或包装说明书还包括向患者施用抗体组合物的说明书。也考虑了包含本文描述的联合治疗的制品和试剂盒。
包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方案中，包装说明书标明该组合物是用于治疗实体瘤，如例如，结肠直肠癌、肺癌、和/或乳腺癌。
另外，制品可以进一步包括第二容器，其中装有制药学可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场出发所需的其它材料，包括其它的缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。
还提供多种目的中有用的试剂盒，例如从细胞中纯化或免疫沉淀HER受体。为分离和纯化EGFR和/或HER2和/或HER3和/或HER4，该试剂盒可含有偶联至珠子(例如珠子)的EGFR/HER2和/或EGFR/HER3和/或EGFR/HER4抗体。可提供试剂盒，其含有用于体外(例如在ELISA或蛋白质印迹中)检测和定量所需HER受体的抗体。如同制品中一样，该试剂盒包含容器和伴随该容器或在容器上的标签或说明书。该容器装有包含至少一种本发明的多特异性抗体或抗体片段的组合物。可包括另外的容器，该容器含有，例如，稀释剂和缓冲剂或对照抗体。标签或说明书可提供对组合物的描述以及对预期的体外或诊断用途的说明。
认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。提供下述实施例仅为了举例说明目的，无意以任何方式限制本发明的范围。事实上，根据前文描述，对本文显示和描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。
除非另有说明，实施例中提及的商业上可获得的试剂根据生产商的说明书使用。在以下实施例中及在整个说明书中以ATCC登记号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type CuIture Collection，Manassas，VA)。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，如上文描述的和下述教科书中的那些：Sambrook等人，见上文；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)(Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis等人，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案：方法和 应用指南)(Academic Press(学术出版社)，Inc.:N.Y.，1990)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)(冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press):冷泉港，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(寡核 苷酸合成)(IRL Press:Oxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture(动物 细胞培养)，1987；Coligan等人，Current Protocols in Immunology(现代免 疫学学实验方案)，1991。
实施例
实施例1
分离和表征结合人EGFR的抗体
材料
酶和M13-KO7辅助噬菌体购自New England Biolabs(新英格兰生物实验室)。大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue来自Stratagene。牛血清清蛋白(BSA)、卵清蛋白、和吐温20购自Sigma(西格玛)。Neutravidin、酪蛋白、和Superblock购自Pierce。抗M13缀合的辣根过氧化物酶(HRP)购自Amersham Pharmacia。Maxisorp免疫板购自NUNC(Roskilde，丹麦)。四甲基联苯胺(TMB)底物购自Kirkegaard和Perry实验室(Gaithersburg，MD)。
文库构建
噬菌体展示抗体文库基于来自人源化的4D5(h4D5，曲妥珠单抗)的人抗体构架产生，其中侧链和长度多样性在第一文库(文库1)中引入到重链互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)，在第二文库(文库2)中引入到重链CDRs和轻链CDR3中，仍然集中于重链中的多样化，如所描述的(Lee等,J.Mol.Biol(分子生物学杂志),340:1073-1093(2004))。文库如所描述的进行构建(Lee等,J.Mol.Biol(分子生物学杂志),340:1073-1093(2004))，除了所使用的简并寡核苷酸进行了适当修饰。
两个文库的分选
文库1和文库2直接进行靶标(hEGFR-ECD-Fc(人EGFR胞外结构域融合到人IgG1的Fc区)和EGFRvIII-Fc)结合选择。EGFRvIII-Fc蛋白是EGFR的变体，缺失大部分结构域II(E1-P353(不包括信号肽))，融合到hIgG1的Fc区。参见Kuan，C-T，等,Endocrine-Related Canc.8:83-96(2001)；Bigner，S H，等,Cancer Research(癌症研究),50:8017-8022(1990)。96孔Nunc Maxisorp板用PBS(0.05M Sodium Carbonate buffer，pH9.6)中100μl/孔的靶抗原(hEGFR-ECD-Fc，EGFRvIII-Fc)(5μg/ml)在4℃包被过夜或在室温包被2小时。该板用交替封闭试剂进行封闭。在第一轮选择中，1013噬菌体/ml(3-5OD/ml)的噬菌体溶液与包被的抗原温育18h。在每轮选择中噬菌体输入如下降低：第一轮3-5O.D/ml，第二轮3O.D/ml，第三轮0.5～1O.D/ml和第四轮输入0.1～0.5O.D/ml。稀释的噬菌体在冰上温育30分钟。1μM的Fc-融合蛋白添加到来自第三轮的封闭的噬菌体中以去除Fc结合物。噬菌体溶液(100μl/孔至8个靶抗原包被的孔和2个未包被的孔)在免疫板上温育以允许结合固定的抗原(对于第一轮过夜，对于剩余的轮次进行2小时)之后，用PBS和0.05％Tween 20连续洗涤免疫板至少10次。结合的噬菌体用100ul/孔的100mM HCl室温洗脱20分钟。洗脱的噬菌体(来自包被的孔)和背景噬菌体(来自未包被的孔)通过添加1/10体积的1M Tris pH11.0和BSA至最终0.1％进行中和。计算噬菌体回收/抗原包被免疫板孔，并与无包被抗原的封闭孔进行比较，以研究展示特异性结合靶抗原的Fabs的噬菌体克隆的富集。洗脱的噬菌体在大肠杆菌中扩增并用于下轮选择。
高通量表征hEGFR结合克隆
来自第4轮的随机克隆被选择以进行筛选，并利用噬菌体ELISA来测定，其中将与靶标和抗gD的结合与无关蛋白(BSA，HER2，抗EGFR抗体，曲妥珠单抗)的结合进行比较。
384孔形式的免疫板包被以1μg/ml的靶标，抗gD和无关蛋白质，4℃过夜或室温2小时，并用PBS中1％BSA封闭1h。大肠杆菌XL1-Blue中的噬菌粒克隆在增补了羧苄西林(carbenicillin)和M13-KO7辅助噬菌体的150μl的2YT肉汤中生长；该培养物在96孔形式中在37℃摇动生长过夜。包含噬菌体的培养物上清在PBST(具有0.05％吐温20和0.5％(w/v)BSA的PBS)中稀释5倍。30μl的混合物添加到384-孔包被板的每个象限并在室温下温育1小时。该板用PBT(具有0.05％吐温20的PBS)洗涤并与在PBST中稀释5000倍达到1nM的抗M13抗体辣根过氧化物酶缀合物一起温育30分钟。将该板洗涤，用TMB底物显色约5分钟，用1.0M H3PO4猝灭，并在450nm处通过分光光度法读数。
结合抗gD抗体和靶标但是不结合非特异性蛋白质的克隆被认为是特异性阳性。VH文库允许分离对于EGFR-ECD-Fc和EGFRvIII-Fc两者的特异性结合物。
溶液结合竞争ELISA
选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争ELISA确定。
在大肠杆菌XL1-Blue中选择的噬菌粒克隆在补充了羧苄青霉素(carbenicillin)、卡那霉素(kanamycin)和M13-KO7辅助噬菌体的20ml 2YT肉汤中生长；培养物在30℃振荡过夜生长。噬菌体的上清液在20％PEG/2.5M NaCl中两次沉淀进行纯化，在PBS中重新悬浮，在268nM分光光度计读数用于浓度确定(以OD/ml)。
纯化的噬菌体在用1μg/ml的hEGFR-ECD-Fc包被的免疫板上滴定，以确定溶液竞争ELISA的最优浓度。
提供在450nM处1OD/ml信号的稀释物用于溶液结合测定中，其中噬菌体首先与渐增浓度的抗原(hEGFR-ECD)一起温育一小时并然后转移至抗原包被的免疫板15分钟，以捕获未结合的噬菌体。IC50计算为抑制50％噬菌体结合固定抗原的溶液结合阶段中抗原的浓度。溶液结合竞争ELISA在室温进行。选择的克隆的IC50值范围为36.2nM至>1000nM。
噬菌体展示F(ab)zip转变为人IgG
为精确确定亲和力、特异性和其它性质，选择的克隆作为游离hIgG表达。
轻链和重链的可变结构域克隆到以前设计的用于在哺乳动物细胞中瞬时人IgG表达的载体中。(Leet等,J.Mol.Biol.(分子生物学)23:340:1073-1093(2004))。
噬菌粒DNA的VL区用限制酶消化，所述限制酶切割编码CDR L1的区的上游(EcoRV)和编码CDR L3的区的下游(KpnI)的DNA。
噬菌粒DNA的VH区用限制酶消化，所述限制酶切割编码CDR H1的区的上游(ApaI)和编码CDR H3的区的下游(BsiwI)的DNA。
分泌的游离IgG用蛋白质A亲和色谱纯化并在直接结合ELISA中在hEGFR包被的免疫板上测试。
抗hEGFR表位的比较
为了确定被抗hEGFR抗体识别的表位，研究了分离的抗EGFR抗体与另一个已知结合EGFR的结构域III的抗hEGFR抗体竞争的能力。
测定以竞争ELISA形式进行。对于竞争ELISA，EGFR-ECD-Fc以2μg/ml固定于Maxisorp免疫板上。固定浓度的抗EGFR抗体(或非特异性抗体对照)被包被的EGFR-ECD-Fc捕获，添加纯化的选择的抗EGFR噬菌体-Fabs，用α-M13-缀合的HRP检测。被阻断结合EGFR-ECD-Fc包被的板的抗体可能共享重叠的表位。
对于TGF-α竞争ELISA，EGFR-ECD-Fc首先被包被的抗人Fc抗体捕获，然后固定浓度的TGF-α被EGFR-ECD-Fc捕获。添加纯化的噬菌体-Fabs，用α-M13-缀合的HRP检测。
最后，评估选择的克隆与具有EGFR暴露和缺失的结构域的构建体的结合，以确认以前的竞争ELISA。指定为D1的克隆与抗EGFR抗体竞争，并且可能在结构域III结合EGFR。
实施例2
表征针对人表皮生长因子受体的抗体
抑制配体结合
为了确定选择的抗EGFR抗体D1是否抑制125I-EGF与H1666细胞(ATCC CRL-5885，Manassas，Va.)的结合，纯化的IgGs形式的D1在如下的配体结合测定中测试。H1666细胞在12孔板中铺板。次日去除生长培养基，用200nM抗体在室内RT预处理细胞2小时。添加20μl/孔放射性标记的EGF(使用浓度低于细胞系的Kd)，细胞在室温处理另外2小时。细胞用结合缓冲液洗涤并溶解、转移，样品使用iso Dataγ-计数器计数。未标记的EGF用作冷竞争剂(cold competitor)。结果证明D1抑制125I-EGF配体结合H1666细胞。
在稳定转染的EGFR-NR6细胞中抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化
为了确定抗EGFR抗体D1是否选择性阻断TGF-α诱导的EGFR磷酸化，对稳定转染的EGFR-NR6细胞血清饥饿2-3小时，并与多种浓度的D1预温育2小时。细胞用1nM TGF-α刺激。全细胞溶胞产物进行SDS-PAGE分析，免疫印迹用抗磷酸酪氨酸探测，抗EGFR作为装载对照。商购的抗EGFR抗体用作阳性对照。数据证明在基于细胞的测定中D1抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化。
实施例3
D1的亲和力成熟
文库构建
使用寡核苷酸定向诱变产生两个噬菌体展示文库(L3/H3和L3/H1H2文库)，如所描述的(Lee等,Blood(血液),108，3103-3111，2006)。文库模板载体含有植入CDR-L3中的终止密码子(TAA)，其在诱变反应中使用与编码CDR-L3(所有文库)，CDR-H3(L3/H3文库)，CDR-H2和CDR H1(L3/H1H2文库)的序列退火的简并寡核苷酸修复。文库诱变反应根据Kunkel等,(Methods Enzymol.(酶学方法)1987；154:367-82)的方法进行。寡核苷酸以不同比例组合以便精细调节多样性从而反应在所选择的位置天然库(natural repertoire)中氨基酸的频率。汇合诱变产物成一个反应/文库，电穿孔至大肠杆菌SS320细胞中，在补充了KO7辅助噬菌体中生长，如所描述的(Lee等,2004，见上文)。
文库分选和筛选
对于亲和力改善选择，噬菌体文库第一轮针对hEGFR-ECD-Fc进行板分选，随后进行三轮溶液分选。
进行三轮增加选择严格性的溶液分选。免疫板用5ug/ml的Neutravidin在4℃包被过夜，并用Superblock(Pierce)和PBST封闭。3-5OD/ml繁殖的噬菌体与100nM的生物素化的EGFR-ECD在Superblock中预温育，然后稀释10x并添加到封闭的免疫板中5-10分钟。洗涤板8次，洗脱噬菌体并繁殖，用于次轮溶液分选，降低噬菌体输入(0.5OD/ml)和生物素化的EGFR-ECD的浓度至1nM。
高通量亲和力筛选ELISA(单点竞争)
挑选来自溶液分选最后一轮的随机克隆用于筛选并使用噬菌体单点竞争ELISA测定，其中比较与hEGFR-ECD预温育(或不预温育)的噬菌体上清液和靶标的结合。
大肠杆菌XL1-Blue中的噬菌粒克隆在150ul补充了羧苄青霉素和M13-KO7辅助噬菌体的2YT肉汤中生长；培养物在96孔格式中在37℃振荡生长过夜。含有噬菌体的培养物上清液在PBST(具有0.05％Tween 20和0.5％(w/v)BSA的PBS)，伴有或不伴有5nM EGFR-EC中稀释五倍。通过下述方程计算OD降低(％)：
OD450nm降低(％)＝(具有竞争剂的孔的OD450nm)/(不具有竞争剂的孔的OD450nm)*100
OD降低大于25％的克隆选择用于溶液结合竞争ELISA。
溶液结合竞争ELISA
通过单点ELISA选择的结合克隆的结合亲和力通过溶液结合竞争ELISA确定，如上所述。
从D1母体克隆亲和力成熟(D1.5)选择的一个克隆的噬菌体IC50s如上所述进行确定。D1.5的IC50是0.39nM。D1.5重新格式化(reformatted)成mIgG2A用于进一个表征，使用上文描述的相同限制位点和设计用于哺乳动物中瞬时鼠IgG表达的载体。
实施例4
表征作为游离mIgG的抗EGFR改善抗体
BIAcore测量
在BIAcoreTM-2000上的表面等离子共振测定用于确定抗EGFRmIgG2A的亲和力。在BIAcore测定中使用在CM5芯片上～150反应单位(RU)的固定的mIgG D1.5。从12.5nM至200nM增加浓度的EGFR-ECD以30μl/min在25℃注射。结合反应通过从空白流动细胞中减去RU来校正。对于动力学分析，使用kon和koff同时拟合的1:1Languir模型。通过这种方法确定的D1.5的KD是1.2nM。
表位定位
评估选择的克隆对具有EGFR暴露和缺失的结构域的构建体的结合，以确认从母体克隆继承的结合表位。从D1分选中选择的亲和力改善克隆，D1.5，在结构域III结合EGFR。
在EGFR-NR6细胞中抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化
测试D1.5以确定其是否以与母体克隆相比更高的效力抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化。所述抗体在EGFR-NR6细胞上测试，该测定如上文实施例2中的描述进行。商购的抗EGFR抗体用作阳性对照。
结果证明，当与母体克隆D1相比时，D1.5显示对配体诱导的EGFR磷酸化更大的抑制。
在H1666细胞中抑制细胞增殖
进行测定以确定D1.5是否抑制NSCLC癌细胞系H1666的细胞增殖，该细胞系以中等水平表达EGFR、HER2和HER3。H1666细胞(ATCCCRL-5885，Manassas，Va.)以5000细胞的密度接种于96孔板中。次日，细胞用含1％血清培养基中不同浓度的抗体(多至50ug/ml)同时处理。3天后，添加Alamar Blue并使用荧光计检测荧光。结果以RFUs表达。
结果证明D1.5显示比D1更大的细胞生长抑制。
A431异种移植研究
A431异种移植模型用于验证亲和力成熟的抗EGFR抗体D1.5的体内功效。A431细胞是EGFR扩增的，对抗EGFR试剂反应非常好。研究在nu/nu小鼠中进行，商购的抗EGFR抗体用作参照。
在第一步中，D1.5与鼠EGFR的交叉反应性在竞争ELISA中评估。免疫板用hEGFR-ECD-Fc包被。连续稀释的mEGFR-ECD-Fc与固定浓度的D1.5温育。结果显示D1.5与鼠EGFR交叉反应。为了评估体内功效研究所需的剂量，D1.5首先以单剂量(50mg/kg)注射，并且通过ELISA测量血清IgG浓度。D1.5被更快清除，注射七天后见到降低的浓度。功效研究(A431异种移植模型)揭示D1.5完全抑制肿瘤生长。在50mg/kg D1.5与抗EGFR抗体一样有效。在更低剂量组(25mg/kg)其降低的效力是由于抗体的更快清除。(图1)
实施例5
轻链文库设计和筛选双特异性抗体
文库设计和构建
设计基于D1.5模板的文库用于多样化抗体轻链的氨基酸组成和CDR长度。定制一个亚组的随机化位置，用于代表这些位点天然库一部分的氨基酸，而剩余位点进行随机化以包括所有20种天然存在的氨基酸。此外，定制CDR L3中的随机化位置，并且使其偏向模板的天然序列，因为这一CDR被认为对于D1.5的结合是重要的。对于CDR L1，每个长度对于位置28-33是含三个寡核苷酸的密码子的混合物。对于更长的L1，NNK***在位置30和31之间。
对于CDR L2，1:1:2:10混合四种寡核苷酸。
N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T，H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T.
*G70A70C70允许70％的指定核苷酸和10％的其它三种中的每种，以编码大约50％Glu和50％的其它氨基酸。参见美国专利公开20080069820和Bostrom，J.等,Science(科学)323:1610-1614(2009)。
CDR L3的多样性源自下述寡核苷酸的混合物。D1.5CDR_L3寡核苷酸
F693 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQID：70)
F694 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 TAC 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID：71)
F695 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQID：72)
F696 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA(SEQID：73)
F697 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878NNK 776NNK CCT TAC ACG TTC GGA(SEQID：74)
F698 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID：75)
F699 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA(SEQ ID：76)
5＝70％A，6＝70％G，7＝70％C，8＝70％T(10％为剩余三种核苷酸)
在所有文库中，重链与母体克隆序列保持恒定。所有文库模板含有植入CDR L1的终止密码子，防止在噬菌体展示抗体文库成员中存在模板轻链。
文库通过诱变法(Kunkel诱变)构建，使用含有终止密码子的单链DNA模板，用于同时与三个CDR L1，L2和L3的寡核苷酸组退火。来自诱变的文库DNA通过电穿孔转化至细菌细胞株SS320并且与辅助噬菌体KO7一起生长。通过检测轻链C末端的gD标签评价来自构建文库的单集落关于展示水平和关于在单点ELISA形式中对初级抗原(EGFR)结合的保留。平均35％的来自D1.5文库的评价的单集落显示高水平的展示并保留EGFR结合性质。
文库分选和对双重特异性克隆分离的筛选
文库进行与作为捕获靶标的抗gD抗体的初轮结合选择，以去除其中Fab基因已经缺失或未表达的克隆，以及与hEGFR-ECD-Fc的结合选择，随后是4轮铺板抗原的选择(HER2-ECD，HER2-ECD-Fc，HER2-I-III-Fc，HER3-ECD-Fc，HER4-ECD-Fc(每种情况中融合构建体中的Fc是来自hIgG1的补体结合片段)。备选地，它们直接进行靶标结合选择，而不进行与抗gD和hEGFR-ECD-Fc的预选择。
每轮板选择如以前实施例3中描述的进行。选择来自第3轮和第4轮的随机克隆用于筛选并使用噬菌体ELISA测定，其中将对靶标和抗gD的结合与对不相关蛋白质(BSA)的结合进行比较用于检查非特异性结合。认为结合抗gD抗体和靶标但是不结合非靶标蛋白对照(诸如牛血清白蛋白，其它IgGs)的克隆是特异性阳性的。
阳性克隆的轻链可变结构域区通过PCR扩增并测序。阳性特异性结合物的DNA序列分析揭示对EGFR和HER2两者的1个独特结合物(D1.5-201(SEQ ID NO:36))，对EGFR和HER3两者的7个独特结合物，(D1.5-100(SEQ ID NO:40)，D1.5-103(SEQ ID NO:41)，D1.5-113(SEQ IDNO:42)，D1.5-115(SEQ ID NO:43)，D1.5-116(SEQ ID NO:44)，D1.5-121(SEQ ID NO:45)，D1.5-122(SEQ ID NO:46))，对EGFR和HER4两者的1个独特结合物(D1.5-400，(SEQ ID NO:39))。
九个双特异性克隆中的八个保留了HVR L3中位置93的脯氨酸，由于这一位置采用脯氨酸(与位置96的酪氨酸)与其母体克隆D1相比显著增加D1.5对EGFR的亲和力，可能它在保留对EGFR的结合中有贡献。
评价双特异性hEGFR/HER2，hEGFR/HER3，hEGFR/HER4噬菌体克隆的 特异性
为了确定具有双重活性的九个克隆是否特异于它们的同族靶标，评价了它们在直接板ELISA形式中对一组抗原的结合。
2μg/ml的数种蛋白在4℃过夜包被于免疫板上。板用PBST中1％BSA封闭，如在实施例1中的描述所生长的噬菌体-Fab上清液的稀释物施加到板上30分钟。
洗涤板，记录结合信号并分析，如实施例1所述。结果显示所有具有双重特异性的克隆特异于它们的同族靶标。克隆D1.5-4和母体克隆D1.5用作对照。(图2)
实施例6
表征作为游离mIgG的具有双重特异性的抗体
所有具有双重特异性的克隆重新格式化成mIgG 2A用于进一步表征，使用如上描述的相同限制位点，以及以前设计用于在哺乳动物细胞中瞬时鼠IgG表达的载体。
抑制EGFR-NR6细胞中TGF-αl诱导的EGFR磷酸化
为确定七个选择的具有双重特异性的抗体是否阻断TGF-α诱导的EGFR磷酸化，稳定转染的EGFR-NR6细胞如实施例2所述进行处理。图3中的数据证明EGFR/HER3和EGFR/HER2抗体在高浓度抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化。商购的抗EGFR抗体用作阳性对照。
对克隆D1.5-100和D1.5-103的剂量反应显示克隆D1.5-100丧失了其母体克隆(D1.5)抑制EGFR磷酸化的高效力。然而，D1.5-103在这个测定中具有与D1.5相似的效力。
通过抗EGFR/HER3抗体抑制调蛋白结合HER3
为确定选择的抗EGFR/HER3抗体是否能够抑制调蛋白结合HER3-ECD-Fc蛋白，纯化的IgGs在放射性标记的配体结合测定中进行测试。
结合测定在Nunc可拆条(break-apart strip)的孔中进行。板子在4℃用100μl的5mg/mL山羊抗人Ab在50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中包被过夜。板子用洗涤缓冲液(PBS/0.005％Tween20)冲洗两次并用100μl1％BSA/PBS封闭30min。去除缓冲液，每孔与200ng的HER3-ECD-Fc在1％BSA/PBS中温育1.5h。用洗涤缓冲液冲洗板子三次，在1％BSA/PBS中的抗体在4℃预结合HER3-IgG过夜。添加125I-HRG，板子在室温温育2小时。冲洗板子三次，单个孔用100系列Iso Dataγ-计数器计数。(图4)。结果证明所有七个对EGFR和HER3具有双重特异性的抗体能够抑制调蛋白结合HER3-ECD-Fc。
通过抗EGFR/HER4抗体抑制调蛋白结合HER4
为了确定选择的抗EGFR/HER4抗体D1.5-400是否能够抑制调蛋白结合HER4-ECD-Fc，进行如上所述的配体结合测定。使用25ngHER4-ECD-Fc，而不使用HER3-ECD-Fc。结果证明D1.5-400抑制调蛋白结合HER4。
抑制MCF7细胞中调蛋白诱导的HER2/HER3磷酸化
为了确定选择的七个对EGFR和HER3具有双重特异性的抗体是否能够抑制MCF7细胞中调蛋白诱导的HER2/HER3磷酸化，在受体磷酸化测定中对它们进行测试：MCF-7细胞(ATCC HTB 22，Manassas，Va.)在12孔板中铺板。血清饥饿之后，细胞与所示抗体(75ug/ml或150ug/ml)温育2小时。细胞用0.5nM HRG刺激8分钟，总细胞溶胞产物在SDS-PAGE上运行，蛋白质印迹用抗磷酸-HER3、抗pTyr或作为装载对照的抗微管蛋白探测。(图5)。结果证明所有抗EGFR/HER3抗体在高浓度抑制调蛋白诱导的HER2/HER3磷酸化。培妥珠单抗(Pmab)用作阳性对照。
抑制MDA-175细胞增殖
为了确定抗EGFR/HER3抗体对HRG驱动的细胞生长的生长抑制潜力，MDA-175细胞(ATCC HTB 25，Manassas，Va.)(20000细胞/孔)在96孔板中铺板。次日，细胞用含1％血清的培养基中不同浓度的抗体(多至50ug/ml)同时处理。4天或5天后，添加Alamar Blue，使用荧光计检测荧光。结果以RFUs表示。选择MDA-175细胞是因为它们的生长是HRG自分泌刺激的结果。抗EGFR/HER3抗体D1.5-100和克隆D1.5-122显示抑制MDA-175细胞生长。培妥珠单抗(Pmab)用作阳性对照。(图6)。
实施例7
D1.5-100和D1.5-103，抗hEGFR/HER3双特异性抗体的诱变定位研究
使用组合的噬菌体展示文库进行丙氨酸和同系物鸟枪法扫描分析(Vajdos等,J.Biol.Biol.320:415-28(2002))，以研究每种抗体与其两个抗原(EGFR和HER3)之间的相互作用。
对抗原(hEGFR和HER3)的结合选择用于分离功能性克隆，随后进行DNA测序，允许计算在每个改变的位置的野生型/突变比率。然后用这些比率确定每个扫描的侧链对EGFR和HER3结合的贡献。
该结果允许定位结合EGFR和HER3的功能性互补位。
D1.5-100和D1.5-103鸟枪文库设计
CDR中的溶剂暴露残基利用噬菌体-展示文库来筛选，其中允许野生型残基作为丙氨酸或野生型(丙氨酸扫描)或作为同系物残基或野生型(同系物扫描)变化。遗传密码的性质还需要使除Wt/丙氨酸或Wt/同系物残基以外一些其他置换包括在该文库中。构建单独的重链和轻链丙氨酸和同系物扫描文库。简并性范围为1.3x105至7.5x107。
构建鸟枪扫描文库
文库如前所述进行构建，除了单个Fab在细菌噬菌体表面上表达，该Fab融合到M13基因-3小外壳蛋白的C末端结构域，所述外壳蛋白通过kunkel诱变(寡聚F220:TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGTGGC TCT GGT)(SEQ ID NO:77)去除来自原始质粒的亮氨酸拉链。
轻链丙氨酸和同系物扫描文库在HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3中具有终止密码子，并且重链丙氨酸和同系物文库在各重链HVRs含有终止密码子。文库通过前述方法(Sidhu等,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338:299-310(2004))，利用Kunkel诱变(Kunkel等,1987，见上文)，在各自终止模板上构建。丙氨酸扫描文库是允许选择的侧链改变为野生型或丙氨酸的噬菌体展示文库。同系物扫描意指允许选择的侧链改变为野生型或类似氨基酸的噬菌体展示文库。
文库选择
NUNC 96孔Maxisorp免疫板用5μg/ml捕获靶标(EGFR-ECD-Fc，HER3-ECD-Fc或蛋白质-L)来包被并用处于PBS中的1％BSA(w/v)来封闭。如所述，来自上述文库的噬菌体与KO7辅助噬菌体(NEB)一起繁殖(Lee等,2004，见上文)。加入文库噬菌体溶液，从而以浓度1013个噬菌体颗粒/ml包被板并在RT温育1-2小时。该板用PBST洗涤8次，并随后用0.1MHCl洗脱结合的噬菌体30分钟。如前所述确定各轮选择后的富集。2轮靶标选择后，选择来自各文库的许多随机克隆来测序，如(Sidhu等,2004，见上文)所描述的。
结合克隆的DNA序列用于确定在各改变的位置的野生型/突变比率。该比率用于评估各选择的侧链对抗原的结合贡献。来自抗原选择的wt/mut比率除以来自展示选择的wt/mut比率提供了对于各突变对抗原结合亲和力效应的定量估计(功能比率Fwt/mut)。如果该比率大于1，突变是有害的。如果该比率小于1，突变是有益的。测序了2500个克隆。
基于丙氨酸和同系物扫描的结果，抗体D1.5-100用于结合EGFR和HER3的热点在已知抗HER2抗体4D5-Fv的结构上定位。如图7所示，定位表明对于EGFR结合，重链占优势，对于HER3的结合，重链和轻链一起作用。酸性(E，D)残基在结合EGFR和HER3两者中均起重要作用，尤其是结合HER3中。
亲和力成熟
图8图示了使用上述鸟枪文库的D1.5-100的亲和力成熟。在这种亲和力成熟策略中，D1.5-100重链同系物文库如前所述进行分选。在HER3-ECD-Fc包被的板上进行两轮板分选后，三轮溶液交替靶标在增加严格性下进行分选(EGFR-ECD和HER3-ECD-Fc)。挑选单克隆并在单点ELISA中评估，以便分离保留双重结合活性的克隆。在评估的克隆中，94个中的79个显示对EGFR/HER3两者的结合，而11个丧失EGFR结合并且显示对HER3的特异性结合。
通过单点竞争分离克隆
挑选来自最后一轮分选的单集落，噬菌体如实施例1中所述进行生长。384个孔用1μl/ml EGFR-ECD-Fc包被。对于各集落生长，25μl的噬菌体上清液或ELISA缓冲液与25μl的EGFR-ECD(50nM)和HER3-ECD-Fc(10nM)一起温育。4μl的温育物添加至EGFR-ECD-Fc包被的板中，所述板洗涤八次。添加60μl的1/5000抗M13-HRP缀合抗体，洗涤板八次，用TMB+H3PO4显影。
使用下述单点竞争方案，选择八个独特克隆，其对于EGFR和HER3显示比D1.5-100更大的抑制：
1.挑选来自最后一轮分选的单集落，噬菌体如前所述进行生长；
2.384孔板用1μg/ml EGFR-ECD-Fc包被；
3.对于各集落生长，25μl的噬菌体上清液或ELISA缓冲液与25μl的EGFR-ECD(50nM)和HER3-ECD-Fc(10nM)一起温育；
4.4μl的温育物添加至EGFR-ECD-Fc包被的板；
5.洗涤板8次；
6.添加60μl的1/5000抗M13-HRP缀合抗体；
7.洗涤板8次；
8.板用TMB+H3PO4显影。
选择8个独特克隆，其对于EGFR和HER3两者显示比D1.5-100更大的抑制(DL6，SEQ ID NO:63；DL7，SEQ ID NO:64；DL8，SEQ ID NO:65；DL9，SEQ ID NO:66；DL10，SEQ ID NO:67；DL11，SEQ ID NO:28；DL12，SEQ ID NO:68；DL13，SEQ ID NO:69)。对于抗HER3抗体，选择7个独特克隆，其对于HER3显示比D1.5-100更大的抑制。
表征亲和力成熟的双特异性和抗HER3抗体
选择的亲和力成熟的双特异性抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进行评估，如实施例5中所述。如图9中所示，选择的抗体显示对EGFR和HER3两者的结合特异性。
对于两个选择的双特异性抗体(DL7和DL11)如实施例1所述计算IC50值，并且与D1.5-100母体克隆相比较。两个选择的双特异性抗体显示对于HER3-ECD-Fc相似的亲和力，以及对于EGFR增加的亲和力。DL1.5-100具有对于EGFR-ECD 44nM的IC50，对于HER3-FC为0.1nM的IC50；DL7具有对于EGFR-ECD 6.1nM的IC50，对于HER3-FC为0.25nM的IC50；DL11具有对于EGFR-ECD 5.7nM的IC50，对于HER3-FC为0.43nM的IC50。
选择的抗HER3抗体的结合特异性通过直接结合一组不同蛋白进行评估，如前所述。选择的抗体(DL3.5，DL3.6，DL3.7)仅对HER3显示结合特异性。
对于选择的抗体的噬菌体IC50值如上所述进行计算并且与D1.5-100母体克隆进行比较。所有抗体(DL3.1-3.7)显示对于HER3-ECD-Fc增加的亲和力，具有1和3.8nM之间的IC50s。母体DL1.5-100具有4.6nM的IC50。
使用上文描述的竞争ELISA将选择的双特异性抗体和抗HER3抗体的结合与HER3结构域III蛋白(N-末端His标签)的结合进行比较。EGFR/HER3和单特异性抗HER3抗体对于HER3ECD-Fc和HER3结构域III构建体具有相似的亲和力(噬菌体IC50)。
选择的亲和力成熟的双特异性抗体和抗HER3抗体重新格式化成mIgG2A并在竞争ELISA中验证，如上所述。mIgG2A双特异性抗体显示对于EGFR-ECD和HER3结构域III两者与D1.5-100母体克隆相比增加的亲和力。
使用BIAcore 300对亲和力成熟的EGFR/HER3抗体DL7和DL11和抗HER3特异性抗体DL3.6和DL3.7进行动力学分析，各抗体(DL1.5-100，DL7，DL11，DL3.6，DL3.7)纯化的mIgG2A偶联到CM5芯片上，数种抗原(EGFR-ECD，HER3结构域III，HER3-ECD)的稀释液在实施例4所述的条件下流过包被的芯片。CM5芯片在抗原的每次注射之间进行再生。最后，使用1:1结合分析用质量转移确定KD。亲和力成熟的EGFR/HER3抗体DL7和DL11对于两种靶标均具有改善的KD(M)。
为了评估亲和力成熟的抗体DL7、DL11和母体抗体D1.5对EGFR的抑制功能，仅表达EGFR的EGFR-NR6细胞用不同量的抗体(多至20ug/ml)预处理一小时，随后，通过TGFα(5nM)诱导EGFR的磷酸化。抗体对受体的磷酸化的抑制使用抗磷酸酪氨酸抗体检测。也看到剂量依赖性方式的MAPK活化的抑制。抗体DL11在抑制EGFR和ERK1/2磷酸化中比DL7效力更大。(图10A)。
比较了DL7、DL11和单特异性抗HER3抗体DL3.6对HER3反式激活的抑制功能。(图10B)。表达HER2、HER3和EGFR的MCF-7细胞用标示量的抗体(多至50ug/ml)预处理一小时，HER3的活化和HER3的磷酸根转移通过HRG诱导。HER3磷酸化的抑制使用抗磷酸HER3抗体检测。看到剂量依赖性方式的下游信号传导分子ERK1/2以及Akt的抑制。DL11再次比DL7效力更大。
DL11的生长抑制功能与商购的抗EGFR抗体(培妥珠单抗)和抗HER3抗体的生长抑制功能相比较，或与DL3.6，D1.5或D1.5+DL3.6的组合的生长抑制功能相比较。H1666细胞(ATCC CRL-5885，Manassas，Va.)(NSCLC细胞系，其表达HER2，HER3，EGFR和EGFR配体)(6000细胞/孔)用HRG(3nM)刺激生长。抗体以剂量依赖性方式检测，生长抑制特性与所有其它单特异性抗体相比较。如图11A所示，DL11以比单特异性抗体或其组合更大的程度抑制细胞生长。
当用HRG(3nM)+TGFα(6nM)刺激H1666细胞生长重复所述测定时，获得了相似的结果。(图11B)。
DL11的生长抑制功能与培妥珠单抗(一种抗EGFR抗体)和抗HER3抗体，或DL3.6，D1.5或D1.5+DL3.6的组合在HCA-7细胞中进行比较。HCA-7是表达HER2，HER3和EGFR的结肠直肠细胞系。细胞生长用HRG(3nM)在1％血清的存在下进行刺激。抗体以剂量依赖性方式测试，在3天后使用Alamar Blue试剂检测细胞活力。如图12A所示，与所有其它处理相比，DL11显示优异的生长抑制特性。
HCA-7细胞生长的抑制如图12A相关描述进行研究，除了生长用HRG(3nM)+TGFα(5nM)刺激。如图12B所示，与所有其它处理相比，DL11显示优异的生长抑制特性。
研究了DL11对Calu-3生长的抑制与抗EGFR抗体培妥珠单抗和抗HER3抗体比较。NSCLC细胞系Calu-3(ATCC HTB-55，Manassas，Va.)过表达HER2，并且具有正常水平的HER3和EGFR。细胞生长(10,000细胞/孔)用HRG(3nM)在1％血清存在下进行刺激，抗体以剂量依赖性方式测试。如图13所示，与单特异性抗体相比，DL11显示优异的活性。
实施例8
D1.5-201和D1.5-201-2，抗hEGFR/HER2双特异性抗体的诱变定位研究
对于D1.5-201的亲和力成熟，对选择的氨基酸设计轻链软/同系物文库。一些软残基(soft residues)进行软随机化(soft randomized)，其中野生型残基频率为50％。一些残基使用编码野生型残基或同系物残基的密码子进行随机化。一些同系物随机化允许野生型和同系物残基以外1或2个额外残基。最后，一些残基未改变。
图14图示了对于D1.5-201的亲和力成熟的另一种分选策略。在这种策略中，D1.5-201轻链软/同系物文库如前所述进行分选。在HER2/ECD上进行增加的严格性的三轮交替板/溶液分选之后，挑选单克隆并且在单点ELISA中评估，以便分离保留对EGFR和HER2双重结合活性的克隆。在所评估的克隆中，77/192显示对EGFR和HER2两者的结合。
确定了选择的亲和力成熟的EGFR/HER2双特异性抗体的轻链可变区序列(D1.5-201(SEQ ID NO:36)，D1.5-201-2(SEQ ID NO:37)，D1.5-201-3(SEQ ID NO:38))。对于两个选择的亲和力成熟的双特异性抗体(D1.5-201-2，D1.5-201-3)如前所述计算噬菌体IC50并且与D1.5-201母体克隆进行比较。两种亲和力成熟的双特异性抗体均显示对于HER2-ECD和EGFR-ECD增加的亲和力。
实施例9
DL11亲和力成熟
DL11如上所述进一步亲和力成熟，产生对于EGFR和HER3具有特异性的两种另外的双特异性抗体(DL11b和DL11f)和特异于HER3的两种抗体(DL3-11fb和DL3-11f)。DL11b的重链和轻链氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs:12和13中。DL11f的重链和轻链氨基酸序列分别显示于SEQID NOs:14和13中。DL3-11b的重链和轻链氨基酸序列分别显示于SEQ IDNOs:19和13中，DL3-11f的重链和轻链氨基酸序列分别显示于SEQ IDNOs:20和13中。
Biacore亲和力测定
DL11b和DL11f对于它们的EGFR和HER3靶标的结合亲和力在下述Biocore测定中确定。DL11b和DL11f两者均显示与DL11相比对于它们的靶标改善的亲和力。
测量使用表面等离子共振在BIAcoreTM 2000仪器(GE Healthcare，BIAcore Life Sciences，Piscataway，NJ)上进行。编码人EGFR的胞外结构域(ECD)(氨基酸1-637)和人HER3的胞外结构域(ECD)(氨基酸1-640)的cDNAs克隆到含有编码人IgG1的Fc区的序列的哺乳动物表达载体中，从而产生人Fc融合蛋白。重组的人EGFR-IgG1(2.65mg/ml)，人HER3-IgG1(3.35mg/ml)通过瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞产生，并且通过蛋白质A亲和色谱法纯化。编码人EGFR胞外结构域(氨基酸1-637)的cDNA克隆到含有N末端标志序列的哺乳动物表达载体中。
确定作为Fab和IgG抗体的DL11f的结合亲和力。对于Fab测定，DL11f Fab是分析物，使其流过CM5芯片，其中不同配体-人EGFR-Fc和人HER3-Fc-首先使用BIAcore人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39，Lot10020611)捕获。2倍稀释系列的DL11f Fab以PBS、0.05％Tween20中0.244-250nM的范围以30μl/分的流速于25℃注射。Fc融合配体和分析物的各次注射之间，使用3M氯化镁再生传感器芯片(5μl，以10μl/min的流速)。为了确定DL11f Fab对人EGFR和人HER3Fc融合蛋白的亲和力常数，从观察的测试传感图(sensorgram)中减去来自参照细胞的信号。通过数据的非线性回归拟合根据1:1Langmuir结合模型使用BIAcore评价软件(GE Healthcare)4.1版(由制造商提供)计算动力学常数。DL11f Fab代表性浓度(125nM)的两个重复给出对于所有Fc融合蛋白的非常相似的拟合和动力学常数。DL11f Fab以1.92nM的KD值结合人EGFR-Fc，以0.39nM的KD值结合人HER3-Fc。
探索了第二个实验条件以获得作为IgG的来自DL11f的结合动力学。在此，DL11f人IgG1固定于传感器芯片CM5上，单体的人EGFR-ecd和人HER3-ecd用作分析物。2倍稀释系列的人EGFR-ecd和人HER3-ecd以PBS、0.05％Tween20中0.244-250nM的范围以30μl/分的流速于25℃注射。确定对于Fab的结合动力学。DL11f分别以19.9nM和2.63nM的KD值结合人EGFR-ecd和人HER3-Fc。在两个实验中，我们观察到DL11f抗体对于HER3比对于EGFR具有一致性地5-8倍更高的亲和力。与实验1相比时，在实验2中发现对于两种受体更低的亲和力，可能由于将EGFRecd或HER3 ecd作为溶液中的分析物和将受体作为Fc融合物固定于流动细胞芯片上之间的差别。可能作为游离的ECD的这些多-结构域受体在溶液中时可能遇到更多结合能的熵罚分(entropic penalty)，由此导致更弱的亲和力。
在相似条件下在单独的Biacore分析中，DL11b显示与DL11f相似的对EGFR和HER3的结合亲和力。
DL3-11b和DL3-11f丧失特异性结合EGFR的能力，而保留特异性结合HER3的能力。
抑制MDA-175细胞增殖
通过DL11b和DL11f抑制MDA-175细胞增殖如上所述进行研究。DL11b和DL11f两者均以与DL11抗体相似的程度抑制MDA-175细胞的增殖。图15。DL11，DL11f和DL11b的IC50s都是大约0.8–1.0ug/ml。
抑制MCF7细胞中调蛋白诱导的HER3磷酸化
为了确定DL11f是否能够抑制MCF7细胞中调蛋白诱导的HER3磷酸化，如实施例6所述进行受体磷酸化测定。结果证明DL11f以剂量依赖性方式抑制调蛋白诱导的HER3磷酸化。图16。
抑制稳定转染的EGFR-NR6细胞中TGF-α诱导的EGFR磷酸化
为了确定DL11f是否选择性阻断TGF-α诱导的EGFR磷酸化，如实施例2所述进行受体磷酸化测定。图16中的数据证明在这种基于细胞的测定中，DL11f以剂量依赖性方式抑制TGF-α诱导的EGFR磷酸化。
DL11和DL11f在体内模型中抑制肿瘤生长
HCA-7肿瘤移植模型测定用于确定DL11和DL11f对体内肿瘤生长的效应。测定如下进行。
SCID beige小鼠(Charles River Laboratories，San Diego，CA)皮下移植HCA-7肿瘤块。当肿瘤达到平均体积100至250mm3，具有相似大小肿瘤的小鼠随机分到如下处理组群(n＝9/组)：赋形剂(PBS)，培妥珠单抗(10mg/kg)，D1.5(25mg/kg)，D1.5+DL3.6(各25mg/kg)，DL11(25mg/kg)，或DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(20或50mg/kg)开始，每周继续，进行总计三次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。小鼠居住于标准啮齿动物微隔离笼(microisolatorcages)中。动物室的环境控制设定为维持温度大约70°F，相对湿度大约40％-60％，大约14-小时光/10-小时暗周期。小鼠根据实验室动物护理和使用(Care and Use of Laboratory Animals)的ILAR指南维持，研究经在Genentech的研究所动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee(IACUC))考查和批准。
在这种异种移植模型中，DL11和DL11f在降低平均肿瘤体积中同样有效。图17。
DL11f在非小肺细胞癌模型中有活性
在具有源自人NSCLC系H358(ATCC CRL-5807，Manassas，Va.)建立肿瘤的小鼠中测试抗体。5x106 H358细胞与基质胶皮下接种于CB17SCID小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝9/组)：赋形剂(DL11f制剂缓冲液)，D1.5(25mg/kg)，DL3.11b(25mg/kg)，DL11f(30mg/kg)，或D1.5+DL3.11b(各25mg/kg)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(50或60mg/kg)开始，每周继续，进行总计四次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
如图18所示，双特异性抗体DL11f在这种NSCLC模型中有活性，并且比抗EGFR特异性和抗HER3特异性抗体的组合(D1.5+DL3.11b)在抑制肿瘤生长中更有效。
实施例10
DL3.6亲和力成熟
DL3.6如上所述进一步亲和力成熟，产生另外的抗HER3抗体。DL3.6b显示与母体抗体DL3.6相比对于其靶标的亲和力的增加。DL3.6b的重链和轻链氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOs:17和13。
如图19和20所示，DL3-11b，DL3.6和DL3.6b抑制HRG诱导的HER3磷酸化和MDA-175细胞增殖。测定如上所述进行。
实施例11
在Fadu异种移植模型，头和颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)模型中的体内活性
在具有源自Fadu细胞(ATCC HTB-43，Manassas，Va.)建立肿瘤的小鼠中测试DL11f，商购抗EGFR抗体和抗HER3抗体。5x106 FaDu细胞皮下接种于CB17 SCID小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝9/组)：赋形剂(DL11f制剂缓冲液)，抗EGFR抗体(25mg/kg)，抗HER3抗体(50mg/kg)和DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(分别为50或100mg/kg)开始，每周继续，进行总计四次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
如图21所示，DL11f在FaDu头和颈癌模型中有活性，并且比抗EGFR特异性或抗HER3特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。
实施例12
在BxPC3异种移植模型，HER3驱动的胰腺模型(pancreatic model)中的体 内活性
在具有源自胰腺细胞系BxPC3(ATCC CRL-1687，Manassas，Va.)建立肿瘤的小鼠中测试DL11f，抗EGFR抗体，培妥珠单抗，和抗HER3抗体。10x106 BxPC3细胞皮下接种于CB17 SCID小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝8/组)：赋形剂(DL11f制剂缓冲液)，抗EGFR抗体(25mg/kg)，培妥珠单抗(25mg/kg)，抗HER3抗体(50mg/kg)，和DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(50或100mg/kg)开始，每周继续，进行总计四次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
DL11f在BxPC3胰腺癌模型中有活性，并且比抗EGFR特异性或抗HER3特异性抗体在延缓肿瘤生长中更有效。(图22)。
实施例13
在NSCLC Calu-3异种移植模型中的体内活性
在具有源自NSCLC系Calu-3(ATCC HTB-55，Manassas，Va.)建立肿瘤的小鼠中测试DL11f，商购抗EGFR抗体，和抗HER3抗体。5x106 Calu-3细胞皮下接种于SCID Beige小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝9/组)：赋形剂(DL11f制剂缓冲液)，抗EGFR抗体(25mg/kg)，抗HER3抗体(25mg/kg)，和DL11f(25mg/kg)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(50)开始，每周(抗HER3每两周)继续，进行总计四(八)次处理。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
DL11f在Calu-3非小细胞肺癌模型中有活性，并且比抗EGFR特异性或抗HER3特异性抗体在延缓肿瘤生长中更有效。(图23)。
实施例14
在表皮A431异种移植模型中的体内活性
在具有源自表皮样细胞系A431(ATCC CRL-2592，Manassas，Va.)建立肿瘤的小鼠中测试DL11f，商购抗EGFR抗体，和抗HER3抗体。5x106A431细胞皮下接种于SCID Beige小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝8/组)：赋形剂(DL11f制剂缓冲液)，抗EGFR抗体(12.5mg/kg)，抗HER3(50mg/kg)和DL11f(12.5和25mg/kg)。处理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。
由于在小鼠中与抗EGFR抗体相比DL11f更快的清除，DL11f以与抗EGFR抗体相比2x浓度给药，以便获得可比的暴露水平。总之，DL11f与抗EGFR抗体同样好地抑制A431表皮癌模型中的肿瘤生长。(图24)。
实施例15
在携带患者来源的乳腺癌MAXF449的异种移植物的裸鼠中的体内活性
DL11f，商购抗EGFR抗体和抗HER3抗体在Oncotest GmbH，Freiburg，Germany进行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后，Oncotest在裸鼠中作为皮下异种移植物传代患者肿瘤，像乳腺癌MAXF 449。根据Oncotest的方案，具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝10/组)：DL11f(30mg)，抗EGFR抗体(30mg/kg)，抗HER3(60mg/kg)和赋形剂(DL11f制剂缓冲液)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(分别为60或120mg/kg)开始，每周继续，进行总计四次处理。
DL11f和抗HER3抑制MAXF44乳腺癌模型中的肿瘤生长，而抗EGFR抗体无效应(图25)。
实施例16
在***DU145异种移植模型中的体内活性
DL11f，商购抗EGFR抗体和抗HER3抗体在Piedmont ResearchCenter，Morrisville根据Piedmont的方案进行测试。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝10/组)：DL11f(25mg)，抗EGFR抗体(25mg/kg)，抗HER3(50mg/kg)和赋形剂(DL11f制剂缓冲液)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(分别为50或100mg/kg)开始，每周继续，进行总计四次处理。DL11f在DU145***癌模型中有活性，并且比抗EGFR特异性或抗HER3特异性抗体在抑制肿瘤生长中更有效。(图26)。
实施例17
在携带患者来源的卵巢癌OVXF550异种移植物的裸鼠中的体内活性
DL11f，商购抗EGFR抗体和抗HER3抗体在Oncotest GmbH，Freiburg，Germany进行测试。在直接移植来自供体患者的肿瘤后，Oncotest在裸鼠中作为皮下异种移植物传代患者肿瘤，像卵巢癌OVXF550。根据Oncotest的方案，具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝10/组)：DL11f(30mg)，抗EGFR抗体(30mg/kg)，抗HER3抗体(60mg/kg)和赋形剂(DL11f制剂缓冲液)。处理通过腹膜内施用，在随机化当天以2x负荷剂量(分别为60或120mg/kg)开始，每周继续，进行总计五次处理。
DL11f在OVFX550卵巢癌模型中有活性。(图27)。
实施例18
DL11f在体外和体内介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)
DL11f在体外介导ADCC。A431，H292(ATCC CRL-1848，Manassas，Va.)，FaDu，BxPC3和MDA 468(ATCC HTB-132，Manassas，Va.)细胞(均来自ATCC)在存在标示浓度的抗体时在96孔板中铺板。在37℃预温育30分钟后，添加分离的外周血单核细胞(PBMC)，在37℃继续温育另外4小时。4小时后，离心板并且收获上清液。上清液中的LDH活性根据Promega CytoTox-One同质膜完整性测定程序确定。为了确定百分数细胞介导的细胞毒性，计算平均吸光度并且减去背景。如图28所示，DL11f以剂量依赖性方式减轻在EGFR表达细胞系中的ADCC。
向DL11f引入氨基酸置换N297A以缺失效应子功能。N297是FcRγ和/或补体结合必需的。DL11f-N297A在体外显示丧失ADCC。如所预期的，DL11f体外生长抑制功能未受该突变的影响。(图29)。
在具有源自NSCLC细胞系H292(ATCC CRL-1848，Manassas，Va.)建立肿瘤的小鼠中测试DL11f和DL11f-N297A。5x106 A431细胞皮下接种于C.B17-SCID小鼠中。具有相似大小肿瘤的动物随机分到如下处理组群(n＝10/组)：赋形剂(DL11f制剂缓冲液)，DL11f(6mg/kg)和DL11f-N297A(6mg/kg)。处理在随机化当天通过腹膜内施用一次。在研究期间每周两次用测径器测量肿瘤。最初，DL11f和DL11f N297A通过抑制HER途径信号传导等价地抑制肿瘤生长。但当剂量减少时，与DL11f N297A相比，DL11f由于其ADCC能力显示延长的抗肿瘤活性。(图30)。
实施例19
在食蟹猴中DL11f比西妥昔单抗毒性更低
进行研究以确定DL11f和西妥昔单抗的相对毒性。食蟹猴分为三组并且给药DL11f或西妥昔单抗(Capital Wholesale Drug，Columbus，OH)，每周一次进行六周，如下所述：
组1:西妥昔单抗25mg/kg；
组2:DL11f 25mg/kg；
组3:DL11f 12.5mg/kg。
所有3组西妥昔单抗给药的动物在第3和第4次给药之间发生皮肤损害，表明毒性。这种结果基于以前FDA批准西妥昔单抗过程中所做的食蟹猴研究是预料到的。在所述研究中在这一点没有DL11f给药的动物显示毒性体征。
接受25mg/kg剂量DL11f的动物中的一个在第6次给药后一周发生皮肤损害。这一损害测量为大约4cm x 7cm，当与西妥昔单抗处理的动物中观察到的损害相比时，是非常轻度的并且限制在更小的区域。
基于在这种毒理学研究中的毒性动力学参数分析，在以25mg/kg给药各测试化合物的动物中，西妥昔单抗和DL11f的暴露是相似的。
在下述条件下进行第二个、更大规模的研究。
食蟹猴分为六组，通过静脉内施用DL11f或赋形剂对照来给药，每周一次进行十二周，如下所述：
组1:10只猴(5雄性/5雌性)-  赋形剂对照
组2:10只猴(5雄性/5雌性)   DL11f 5mg/kg
组3:10只猴(5雄性/5雌性)   DL11f 15mg/kg
组4:10只猴(5雄性/5雌性)   DL11f 30mg/kg
组5:4只猴(2雄性/2雌性)    赋形剂对照
组6:4只猴(2雄性/2雌性)    DL11f 30mg/kg
在研究过程中或在DL11f最后一次给药之后的恢复期间，没有动物显示任何明显的皮肤毒性。
也在食蟹猴中进行了单次剂量、IV施用PK研究。在这种研究中，每组3只猴用1、10或30mg/kg的DL11f静脉内给药。所探索的剂量范围中的PK是非线性的，与已经在其它靶向EGFR的抗体中看到的可饱和的清除一致。
将在本说明书中引用或提及的所有的专利、专利申请、专利申请公开物和其它公开物的全文通过引用并入本文，其程度如同将每个独立专利、专利申请、专利申请公开物或公开物特别地和单独地指定通过引用并入本文中的程度一样。

Claims (22)

1.多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含
(a)LSGDWIH(SEQ ID NO:48)的HVR-H1；
(b)LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:50)的HVR-H2；和
(c)ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:53)的HVR-H3；和
(d)DLATDVA(SEQ ID NO:54)的HVR-L1；
(e)SASF(SEQ ID NO:56)的HVR-L2；和
(f)SEPEPYT(SEQ ID NO:57)的HVR-L3。
2.权利要求1的抗体，包含：
(a)SEQ ID NO:28的重链可变结构域；
(b)SEQ ID NO:27的轻链可变结构域序列；或
(c)SEQ ID NO:28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:27的轻链可变结构域序列。
3.权利要求2的抗体，包含SEQ ID NO:28的重链可变结构域。
4.权利要求2的抗体，包含SEQ ID NO:27的轻链可变结构域序列。
5.多特异性抗体，其包含SEQ ID NO:28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:27的轻链可变结构域序列，其中所述抗体特异性结合EGFR和HER3。
6.权利要求1或5的抗体，其中所述抗体是全长IgG1抗体。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体显示ADCC活性。
8.多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包含
(a)LSGDWIH(SEQ ID NO:48)的HVR-H1；
(b)LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO:50)的HVR-H2；和
(c)ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO:53)的HVR-H3；和
(d)NIATDVA(SEQ ID NO:55)的HVR-L1；
(e)SASF(SEQ ID NO:56)的HVR-L2；和
(f)SEPEPYT(SEQ ID NO:57)的HVR-L3。
9.权利要求8的抗体，包含：
(a)SEQ ID NO:28的重链可变结构域；
(b)SEQ ID NO:29的轻链可变结构域序列；或
(c)SEQ ID NO:28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:29的轻链可变结构域序列。
10.权利要求9的抗体，包含SEQ ID NO:28的重链可变结构域。
11.权利要求9的抗体，包含SEQ ID NO:29的轻链可变结构域序列。
12.多特异性抗体，其包含SEQ ID NO:28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:29的轻链可变结构域序列，其中所述抗体特异性结合EGFR和HER3。
13.权利要求8或12的抗体，其中所述抗体是全长IgG1抗体。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体显示ADCC活性。
15.核酸，其编码权利要求1、5、8或12的抗体。
16.宿主细胞，其包含权利要求15的核酸。
17.产生抗体的方法，其包括培养权利要求16的宿主细胞从而产生所述抗体。
18.免疫缀合物，其包含权利要求1、5、8或12的抗体和细胞毒性剂。
19.药物制剂，其包含权利要求1、5、8或12的抗体和药用载体。
20.有效量的权利要求1、5、8或12的抗体在制备用于治疗患有癌症的个体的药物中的应用，其中所述有效量的所述抗体用于向所述个体施用，其中所述癌症选自由乳腺癌，结肠直肠癌，胰腺癌，头和颈癌，黑素瘤，卵巢癌，***癌和非小细胞肺癌组成的组。
21.权利要求20的应用，其中所述癌症包含表达EGFR和HER3的细胞。
22.有效量的权利要求1、5、8或12的抗体在制备用于抑制个体中EGFR和HER3的生物学活性的药物中的应用，其中所述有效量的所述抗体用于向所述个体施用以抑制EGFR和HER3的生物学活性。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110036028A (zh) * 2016-10-16 2019-07-19 塞勒兰特治疗公司 抗il1-rap抗体

Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
JP5779350B2 (ja) 2007-03-27 2015-09-16 シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー 抗体代替軽鎖配列を含む構築物およびライブラリー
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US20090226443A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-10 Genentech, Inc. Combination therapy with c-met and egfr antagonists
ES2572728T3 (es) 2009-03-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-HER biespecíficos
US20120128671A1 (en) 2009-05-13 2012-05-24 Lawrence Horowitz Neutralizing molecules to influenza viruses
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2507381A4 (en) 2009-12-04 2016-07-20 Hoffmann La Roche PLURISPECIFIC ANTIBODIES, ANTIBODY ANALOGUES, COMPOSITIONS AND METHODS
DK2516469T3 (en) 2009-12-22 2016-05-02 Roche Glycart Ag ANTI-HER3 antibodies and uses thereof
JP5981853B2 (ja) 2010-02-18 2016-08-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド ニューレグリンアンタゴニスト及び癌の治療におけるそれらの使用
ES2617777T5 (es) 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US9217039B2 (en) * 2010-11-01 2015-12-22 Symphogen A/S Anti-HER3 antibodies and compositions
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
US20130230581A1 (en) * 2010-11-30 2013-09-05 Qingping Feng Egfr antagonist for the treatment of heart disease
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
EA201300996A1 (ru) 2011-03-11 2014-01-30 Мерримак Фармасьютикалс, Инк. Использование ингибиторов рецепторов семейства egfr в лечении гормонорезистентного рака молочной железы
SG192775A1 (en) 2011-03-15 2013-09-30 Merrimack Pharmaceuticals Inc Overcoming resistance to erbb pathway inhibitors
US9127065B2 (en) 2011-05-19 2015-09-08 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Anti-human HER3 antibodies and uses thereof
EP2736928B1 (en) * 2011-07-28 2019-01-09 i2 Pharmaceuticals, Inc. Sur-binding proteins against erbb3
MX2014001766A (es) 2011-08-17 2014-05-01 Genentech Inc Anticuerpos de neuregulina y sus usos.
JP6297490B2 (ja) 2011-08-31 2018-03-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 診断マーカー
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
WO2013055530A1 (en) 2011-09-30 2013-04-18 Genentech, Inc. Diagnostic methylation markers of epithelial or mesenchymal phenotype and response to egfr kinase inhibitor in tumours or tumour cells
JP6271432B2 (ja) 2011-09-30 2018-01-31 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ＥｒｂＢ３抗体およびその使用
US9220775B2 (en) 2011-11-23 2015-12-29 Medimmune Llc Binding molecules specific for HER3 and uses thereof
CA2857114A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Genentech, Inc. Erbb3 mutations in cancer
CN104159924B (zh) * 2011-12-05 2018-03-16 诺华股份有限公司 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
EP2793940B1 (en) 2011-12-22 2018-11-14 i2 Pharmaceuticals, Inc. Surrogate binding proteins
JP2015514710A (ja) * 2012-03-27 2015-05-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｈｅｒ３阻害剤に関する診断及び治療
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
BR112014027291A2 (pt) * 2012-05-02 2017-08-08 Symphogen As composições de anticorpos pan-her humanizados
JP6267689B2 (ja) 2012-05-10 2018-01-24 バイオアトラ、エルエルシー 多重特異性モノクローナル抗体
BR112014028600B1 (pt) 2012-05-18 2022-11-22 Genentech, Inc Formulações de suspensão compreendendo anticorpo monoclonal de alta concentração, seu método de preparação, seu uso e dispositivo para sua administração subcutânea, e método para produção de um artigo de fabricação
MX2014014162A (es) 2012-05-24 2015-02-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecificos.
TW201843172A (zh) * 2012-06-25 2018-12-16 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
AU2013322710A1 (en) 2012-09-25 2015-04-16 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
SI2900694T1 (sl) 2012-09-27 2018-12-31 Merus N.V. Bispecifična IGG protitelesa kot vključitelji T-celic
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2914629A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
PE20150955A1 (es) 2012-11-08 2015-06-20 Hoffmann La Roche Proteinas ligantes de antigeno anti-her3/her4 de union a la horquilla beta de her3 y a la horquilla beta de her4
WO2014089570A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 The General Hospital Corporation Combinations of a pi3k/akt inhibitor compound with an her3/egfr inhibitor compound and use thereof in the treatment of a hyperproliferative disorder
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
WO2014124326A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Stem Centrx, Inc. Novel multispecific constructs
EP2968540A2 (en) * 2013-03-14 2016-01-20 Genentech, Inc. Combinations of a mek inhibitor compound with an her3/egfr inhibitor compound and methods of use
KR102238226B1 (ko) 2013-05-14 2021-04-09 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 가공된 키메라 항원 수용체 (ｃａｒ) ｔ-세포의 인간 적용
EP3004168A4 (en) 2013-05-24 2017-03-01 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
KR102190220B1 (ko) * 2013-05-29 2020-12-14 삼성전자주식회사 타겟 특이적 세포막 단백질 제거용 조성물
EP2821071A1 (en) 2013-07-04 2015-01-07 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Compounds for breast cancer treatment
KR102089591B1 (ko) 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
PE20160724A1 (es) 2013-11-04 2016-08-04 Glenmark Pharmaceuticals Sa Produccion de inmunoglobulinas heterodimericas de redireccionamiento de celulas t
CN105849125B (zh) 2013-11-07 2020-05-15 国家医疗保健研究所 神经调节蛋白变构抗her3抗体
CN105849124B (zh) 2013-12-20 2022-04-12 豪夫迈·罗氏有限公司 双重特异性抗体
NZ724013A (en) * 2014-02-28 2019-11-29 Merus Nv Antibodies that bind egfr and erbb3
IL301147A (en) 2014-02-28 2023-05-01 Merus Nv An antibody that binds to ErbB-2 and ErbB-3
PL3126388T3 (pl) 2014-03-11 2019-10-31 Regeneron Pharma Przeciwciała anty-egfrviii i ich zastosowania
BR112016021383A2 (pt) 2014-03-24 2017-10-03 Genentech Inc Método para identificar um paciente com câncer que é susceptível ou menos susceptível a responder ao tratamento com um antagonista de cmet, método para identificar um paciente apresentando câncer previamente tratado, método para determinar a expressão do biomarcador hgf, antagonista anti-c-met e seu uso, kit de diagnóstico e seu método de preparo
DK3126384T3 (da) * 2014-04-01 2021-01-18 Adimab Llc Multispecifikke antistofanaloger omfattende en fælles letkæde, og fremgangsmåder til deres fremstilling og anvendelse
WO2015157634A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb antibodies and methods of use thereof
FR3020063A1 (fr) 2014-04-16 2015-10-23 Gamamabs Pharma Anticorps humain anti-her4
KR102223502B1 (ko) * 2014-05-09 2021-03-05 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR/항 Her3 다중 특이 항체 및 이의 이용
BR112016025056A2 (pt) 2014-05-14 2018-02-20 F. Hoffmann-La Roche Ag uso de pelo menos um polipeptídeo, anticorpo biespecífico, anticorpo biespecífico isolado, anticorpo her3/her2 biespecífico, célula hospedeira, método de produção do anticorpo biespecífico her3/her2, imunoconjugado e formulação farmacêutica
CN113549153A (zh) 2014-05-29 2021-10-26 宏观基因有限公司 三特异性结合分子和其使用方法
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
MX2017000821A (es) * 2014-07-21 2017-08-18 Delinia Inc Moleculas que activan selectivamente celulas t reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
KR102259232B1 (ko) * 2014-08-25 2021-05-31 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
NZ730348A (en) 2014-09-26 2024-03-22 Macrogenics Inc Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
CA2964785A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells
WO2016073629A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) to selectively target protein complexes
CN113150165A (zh) * 2014-12-22 2021-07-23 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制造和使用方法
AU2015380455A1 (en) 2015-01-26 2017-08-03 Macrogenics, Inc. Multivalent molecules comprising DR5-binding domains
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
CN115505042A (zh) 2015-06-26 2022-12-23 赛诺菲生物技术公司 单克隆抗il-1racp抗体
CN108026174B (zh) 2015-07-10 2023-02-17 美勒斯公司 人cd3结合抗体
TW201716439A (zh) 2015-07-20 2017-05-16 美國禮來大藥廠 Ｈｅｒ３抗體
KR20180034588A (ko) 2015-07-30 2018-04-04 마크로제닉스, 인크. Pd-1-결합 분자 및 그것의 사용 방법
WO2017062619A2 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Macrogenics, Inc. Combination therapy for the treatment of cancer
AU2016340764B2 (en) 2015-10-23 2023-06-01 Fundació lnstitut de Recerca Biomèdica (IRB Barcelona) Binding molecules that inhibit cancer growth
CN106729743B (zh) 2015-11-23 2021-09-21 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗ErbB2抗体-药物偶联物及其组合物、制备方法和应用
WO2017100642A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to egfr and/or erbb3 blockade
CR20180318A (es) 2015-12-14 2018-09-19 Macrogenics Inc Moléculas biespecíficas que tienen inmunorreactividad con pd-1 y ctla-4, y métodos de uso de las mismas
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
UY37127A (es) 2016-02-17 2017-08-31 Macrogenics Inc Moléculas de unión a ror1, y métodos de uso de las mismas
JP2019508428A (ja) 2016-03-15 2019-03-28 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 抗ｅｒｂｂ３抗体を含む組み合わせ療法を用いて、ｅｒ＋、ｈｅｒ２−、ｈｒｇ＋乳癌を治療するための方法
MY198114A (en) 2016-04-15 2023-08-04 Macrogenics Inc Novel b7-h3-binding molecules, antibody drug conjugates thereof and methods of use thereof
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
US10167342B2 (en) 2016-08-29 2019-01-01 Fazel Shokri Production of hersintuzumab: a new humanized antibody against HER2 for cancer treatment
BR112019005895A2 (pt) 2016-09-23 2019-06-11 Merus N.V. moléculas de ligação que modulam uma atividade biológica expressa por uma célula
EA201991142A1 (ru) 2016-11-08 2019-10-31 Варианты il-2 для лечения аутоиммунных заболеваний
EP3558368A4 (en) 2016-12-23 2020-12-30 MacroGenics, Inc. ADAM9 BINDING MOLECULES AND THEIR METHODS FOR USE
US11459394B2 (en) 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
EP3590534A4 (en) 2017-02-28 2020-12-23 Kinki University METHOD OF TREATMENT OF EGFR-TKI RESISTANT NON-SMALL CELL LUNG CANCER BY ADMINISTRATION OF ANTI-3-ANTIBODY ACTIVE CONJUGATE
EP3600413A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Merus N.V. Erbb-2 and erbb3 binding bispecific antibodies for use in the treatment f cells that have an nrg1 fusion gene
KR20190140944A (ko) 2017-03-31 2019-12-20 메뤼스 엔.페. ErbB-2, ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 개체의 치료를 위한, ErbB-2 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합하는 항원-결합 부위를 가진 이중특이적 항체 및 ErbB-2 표적화제
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
CN111148764A (zh) 2017-05-17 2020-05-12 美勒斯公司 用于乳腺癌的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体与内分泌治疗的组合
MX2020001432A (es) 2017-08-09 2020-03-20 Merus Nv Anticuerpos que se unen al receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) y tirosina-proteina cinasa met (cmet).
WO2019057792A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Mab Discovery Gmbh CD40 ANTIBODY AGONISTS
WO2019108065A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Merus N.V. Use of bispecific antibody and il-15 for combination therapy
RU2020122822A (ru) 2017-12-12 2022-01-13 Макродженикс, Инк. Биспецифичные связывающие cd16 молекулы и их применение при лечении заболеваний
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
US20220072144A1 (en) 2018-09-20 2022-03-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of her3-mutated cancer by administration of anti-her3 antibody-drug conjugate
TW202034952A (zh) 2018-12-20 2020-10-01 荷蘭商美勒斯公司 用於治療疾病之CLEC12AxCD3雙特異性抗體及方法
AU2019406712A1 (en) 2018-12-21 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to VEGF and IL-1beta and methods of use
EP3924377A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Merus N.V. Producing compositions comprising two or more antibodies
MA54944A (fr) 2019-02-14 2021-12-22 Merus Nv Combinaisons de fractions de liaison se liant à egfr, her2 et her3
TW202039578A (zh) 2019-03-29 2020-11-01 荷蘭商美勒斯公司 Cd3結合分子
MX2021013646A (es) 2019-05-09 2022-01-31 Merus Nv Dominios variantes para las proteínas multimerizantes y su separación.
JP2022545457A (ja) 2019-08-19 2022-10-27 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ Ｌｇｒ５及びｅｇｆｒに結合する抗体とトポイソメラーゼｉ阻害剤との組合せを用いる癌の治療
GB201913079D0 (en) * 2019-09-11 2019-10-23 Hummingbird Bioscience Holdings Pte Ltd Treatment and prevention of cancer using her3 antigen-binding molecules
US20220057383A1 (en) * 2019-12-19 2022-02-24 Johnson & Johnson Consumer Inc. Use of biomarkers to evaluate the efficacy of a composition in reducing the effects of cancer therapeutics on skin
CA3166407A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Merus N.V. Means and method for modulating fimmune cell engaging effects
CN115397850A (zh) 2020-03-30 2022-11-25 豪夫迈·罗氏有限公司 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法
MX2022013182A (es) 2020-04-24 2023-01-16 Merus Nv Tratamiento de cánceres con un anticuerpo que se une a lgr5 y egfr.
EP4175650A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Kiromic BioPharma, Inc. Mesothelin isoform binding molecules and chimeric pd1 receptor molecules, cells containing the same and uses thereof
KR20230061458A (ko) 2020-09-04 2023-05-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법
WO2022108627A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Kiromic Biopharma, Inc.Kiromic Biopharma, Inc. Gamma-delta t cell manufacturing processes and chimeric pd1 receptor molecules
CN116710472A (zh) 2020-12-15 2023-09-05 美勒斯公司 利用结合lgr5和egfr的抗体治疗癌症
US20240058444A1 (en) 2020-12-18 2024-02-22 Merus N.V. Antibody composition
WO2022255871A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Merus N.V. New nrg1 fusions, fusion junctions and methods for detecting them
AU2022359551A1 (en) 2021-10-06 2024-04-11 Merus N.V. Treatment of immune checkpoint inhibitor-treated cancers with high egfr expression using an antibody that binds at least egfr

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006091209A2 (en) * 2005-02-23 2006-08-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
WO2007042289A2 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Ablynx N.V. Nanobodies™ and polypeptides against egfr and igf-ir
CN101355966A (zh) * 2005-06-15 2009-01-28 加州大学评议会 双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法

Family Cites Families (277)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4935341A (en) 1986-06-04 1990-06-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Detection of point mutations in neu genes
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US7838216B1 (en) 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
JPH03505964A (ja) 1988-04-18 1991-12-26 アプライド・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド ｎｅｕ遺伝子の発現及び遺伝子産物の検出
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DK0474727T3 (da) 1989-05-19 1998-01-12 Genentech Inc HER2 ekstracellulært domæne
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5705157A (en) 1989-07-27 1998-01-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating cancerous cells with anti-receptor antibodies
US6884418B1 (en) 1989-08-04 2005-04-26 Berlex Laboratories, Inc. Use of ligand-mimicking agents and anti-neoplastic drugs in cancer therapy
EP0444181B2 (en) 1989-08-04 2010-11-24 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft C-erbb-2 external domain: gp75
CA2066428C (en) 1989-09-08 2000-11-28 Bert Vogelstein Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
DE68926248T2 (de) 1989-09-29 1996-12-19 Oncogene Science Inc p100 "neu" menschlisches Protein and Verwendung dieses Proteins zum Nachweis von preneoplasmatischen- oder neoplasmatischen beim Menschen
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU662311B2 (en) 1991-02-05 1995-08-31 Novartis Ag Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5939531A (en) 1991-07-15 1999-08-17 Novartis Corp. Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0656367A1 (en) 1991-08-22 1995-06-07 Becton, Dickinson and Company Method and composition for cancer therapy and for prognosticating responses to cancer theraphy
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5288477A (en) 1991-09-27 1994-02-22 Becton, Dickinson And Company Method for prognosticating response to cancer therapy
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
AU3236793A (en) 1991-12-12 1993-07-19 Berlex Laboratories, Inc. Recombinant and chimeric antibodies to c-erbB-2
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
AU687346B2 (en) 1992-06-30 1998-02-26 Oncologix, Inc. A combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies and method of using
WO1994009022A1 (en) 1992-10-09 1994-04-28 Oncor, Inc. Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by in situ hybridization to fixed tissue
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
ATE186219T1 (de) 1993-03-24 1999-11-15 Berlex Biosciences Kombination von antihormonale und bindende moleküle zur krebsbehandlung
AU6527894A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Prevention of tumors with monoclonal antibodies against (neu)
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
ATE207366T1 (de) 1993-12-24 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US5654307A (en) 1994-01-25 1997-08-05 Warner-Lambert Company Bicyclic compounds capable of inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
IL112249A (en) 1994-01-25 2001-11-25 Warner Lambert Co Pharmaceutical compositions containing di and tricyclic pyrimidine derivatives for inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family and some new such compounds
US6524832B1 (en) 1994-02-04 2003-02-25 Arch Development Corporation DNA damaging agents in combination with tyrosine kinase inhibitors
US6811779B2 (en) 1994-02-10 2004-11-02 Imclone Systems Incorporated Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy
US20030108545A1 (en) 1994-02-10 2003-06-12 Patricia Rockwell Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5846749A (en) 1994-10-12 1998-12-08 The Regents Of The University Of California Quantitative measurement of tissue protein identified by immunohistochemistry and standardized protein determination
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
EP0711565B1 (en) 1994-11-10 1998-08-26 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Inhibiting growth of leukemic cells by targeting HER-2 protein
AU4289496A (en) 1994-12-02 1996-06-19 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5783404A (en) 1995-04-13 1998-07-21 Amgen Inc. Methods and compositions for determining HER-2/neu expression using monoclonal antibodies
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US5977322A (en) 1995-06-14 1999-11-02 The Regents Of The University Of California High affinity human antibodies to tumor antigens
SI9620103A (sl) 1995-07-06 1998-10-31 Novartis Ag Pirolopirimidini in postopki za njihovo pripravo
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
GB9603095D0 (en) 1996-02-14 1996-04-10 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
PL190489B1 (pl) 1996-04-12 2005-12-30 Warner Lambert Co Nieodwracalne inhibitory kinaz tyrozyny, kompozycja farmaceutyczna je zawierająca i ich zastosowanie
US5925519A (en) 1996-06-03 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Genetic alterations associated with prostate cancer
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
ES2186908T3 (es) 1996-07-13 2003-05-16 Glaxo Group Ltd Compuestos heterociciclos condensados como inhibidores de pproteina-tirosina-quinasas.
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
NZ519191A (en) 1996-10-18 2005-04-29 Univ Texas Antibodies that bind to domain 1 of ErbB2 useful for inducing cell death via apoptosis, and nucleic acids encoding such antibodies
WO1998018489A1 (en) 1996-10-30 1998-05-07 The Uab Research Foundation Enhancement of tumor cell chemosensitivity and radiosensitivity using single chain intracellular antibodies
US6468547B1 (en) 1996-10-30 2002-10-22 Uab Research Foundation Enhancement of tumor cell chemosensitivity and radiosensitivity using single chain secretory antibodies
EP1864999B1 (en) 1996-11-27 2009-03-18 Genentech, Inc. Affinity purification of polypeptide on protein a matrix
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
CA2279547A1 (en) 1997-01-31 1998-08-06 University Of Rochester Chimeric antibody fusion proteins for the recruitment and stimulation of an antitumor immune response
US6002008A (en) 1997-04-03 1999-12-14 American Cyanamid Company Substituted 3-cyano quinolines
US20020076695A1 (en) 1997-04-04 2002-06-20 Jeffrey S. Ross Methods for treating prostate cancer
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1998050038A1 (en) 1997-05-06 1998-11-12 American Cyanamid Company Use of quinazoline compounds for the treatment of polycystic kidney disease
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU9805398A (en) 1997-10-15 1999-05-03 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
KR20010031813A (ko) 1997-11-06 2001-04-16 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 결장 폴립 치료용 티로신 키나제 억제제로서의 퀴나졸린유도체의 용도
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
US6358682B1 (en) 1998-01-26 2002-03-19 Ventana Medical Systems, Inc. Method and kit for the prognostication of breast cancer
US6417168B1 (en) 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
US20020192211A1 (en) 1998-03-17 2002-12-19 Hudziak Robert M. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
WO1999048527A1 (en) 1998-03-27 1999-09-30 Genentech, Inc. Apo-2 ligand-anti-her-2 antibody synergism
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
ATE321066T1 (de) 1998-05-06 2006-04-15 Genentech Inc Anti-her2 antikörperzusammensetzung
MXPA00011248A (es) 1998-05-15 2004-09-06 Imclone Systems Inc Tratamientos de tumores humanos con radiacion e inhibidores de tirosina cinasas de recptor de factor de crecimiento.
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
ES2188254T3 (es) 1998-11-19 2003-06-16 Warner Lambert Co N-(4-(3-chloro-4-fluoro-fenilamino)-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-quin azolin-6-il)-acrilamada, un inhibidor irreversible de tirosina quinasas.
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DE60041808D1 (de) 1999-01-27 2009-04-30 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-überexprimierung einhergehendem krebs
US6333348B1 (en) 1999-04-09 2001-12-25 Aventis Pharma S.A. Use of docetaxel for treating cancers
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6316462B1 (en) 1999-04-09 2001-11-13 Schering Corporation Methods of inducing cancer cell death and tumor regression
ES2320311T3 (es) 1999-05-14 2009-05-21 Genentech, Inc. Tratamiento con anticuerpos anti-erbb2.
BR0010524A (pt) 1999-05-14 2002-05-28 Imclone Systems Inc Tratamento de tumores humanos refratários com antagonistas de receptor de fator de crescimento epidérmico
AUPQ105799A0 (en) 1999-06-18 1999-07-08 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Cell growth inhibition
JP4579471B2 (ja) 1999-06-25 2010-11-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる前立腺癌の処置
DK2283866T3 (en) 1999-06-25 2015-05-18 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
EP1189641B1 (en) 1999-06-25 2009-07-29 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US20030086924A1 (en) 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
GB9917012D0 (en) 1999-07-20 1999-09-22 Pharmacia & Upjohn Spa Combined preparations comprising antitumor agents
MXPA02000962A (es) 1999-07-29 2002-07-02 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para her2/neu.
ES2330301T3 (es) 1999-08-27 2009-12-09 Genentech, Inc. Dosificaciones para tratamiento con anticuerpos anti-erbb2.
WO2001021192A2 (en) 1999-09-22 2001-03-29 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
GB9925958D0 (en) 1999-11-02 1999-12-29 Bundred Nigel J Therapeutic use
AU2001227966A1 (en) 2000-01-20 2001-07-31 Chiron Corporation Methods for treating tumors
US20030022918A1 (en) 2000-02-29 2003-01-30 Horak Ivan David Farnesyl protein transferase inhibitor combinations with an her2 antibody
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6632979B2 (en) 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US6767541B2 (en) 2000-03-20 2004-07-27 The Regents Of The University Of California HER-2/neu overexpression abrogates growth inhibitory pathways
GB0008368D0 (en) 2000-04-06 2000-05-24 Astrazeneca Ab Combination product
WO2001076630A1 (fr) 2000-04-06 2001-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Diagnostics et remedes contre la polyarthrite rhumatoide
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US7306801B2 (en) 2000-05-15 2007-12-11 Health Research, Inc. Methods of therapy for cancers characterized by overexpression of the HER2 receptor protein
CZ20023748A3 (cs) 2000-05-15 2003-04-16 Pharmacia Italia S.P.A. Inhibitory aromatasy a monoklonální anti-HER2 protilátky jako protitumorová činidla
CN102698265A (zh) 2000-05-19 2012-10-03 杰南技术公司 用于提高对ErbB 拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验
GB0017635D0 (en) 2000-07-18 2000-09-06 Pharmacia & Upjohn Spa Antitumor combined therapy
TWI317285B (en) 2000-07-28 2009-11-21 Dainippon Sumitomo Pharma Co New use and kit for remedies for cancer
JP2004527456A (ja) 2000-08-09 2004-09-09 イムクローン システムズ インコーポレイティド Ｅｇｆ受容体拮抗剤による過増殖性の疾患の治療
US6984494B2 (en) 2000-08-15 2006-01-10 Genentech, Inc. Analytical method
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2436910C (en) 2000-12-01 2014-06-17 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and her2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates
US6582919B2 (en) 2001-06-11 2003-06-24 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and HER2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates
US6602670B2 (en) 2000-12-01 2003-08-05 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
US20020142328A1 (en) 2000-12-01 2002-10-03 Danenberg Kathleen D. Method of determining a chemotherapeutic regimen by assaying gene expression in primary tumors
US7005278B2 (en) 2001-03-02 2006-02-28 Danenberg Kathleen D Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression
WO2002045653A2 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Uab Research Foundation Combination radiation therapy and chemotherapy in conjuction with administration of growth factor receptor antibody
EP1349574A2 (en) 2001-01-09 2003-10-08 MERCK PATENT GmbH Combination therapy using receptor tyrosine kinase inhibitors and angiogenesis inhibitors
EP1228766A1 (en) 2001-01-31 2002-08-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PYK2 phosphorylation by HER3 induces tumor invasion
JP4398644B2 (ja) * 2001-04-06 2010-01-13 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルベニア ＥｒｂＢ界面ペプチド擬態およびその使用方法
WO2002087619A1 (fr) 2001-04-27 2002-11-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Methode de prevention et de traitement du cancer
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
CA2449166A1 (en) 2001-05-08 2002-11-14 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Combination therapy using anti-egfr antibodies and anti-hormonal agents
ITRM20010408A1 (it) 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003012072A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies to activated erbb family members and methods of use thereof
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
US20030068318A1 (en) 2001-09-28 2003-04-10 O'brien Timothy Treatment of uterine serous papillary cancer
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20030096823A1 (en) 2001-11-16 2003-05-22 Beryl Asp Method for the treatment of cardiotoxicity induced by antitumor compounds
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20030175845A1 (en) 2002-03-13 2003-09-18 Kalbag Suresh M. Use of sulfitolysis in high performance peptide mapping
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
JP2005534623A (ja) 2002-04-08 2005-11-17 スミスクライン ビーチャム コーポレーション Ｅｒｂファミリーの阻害剤並びにｒａｆ及び／又はｒａｓ阻害剤を投与することを含む癌の治療法
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
CA2481515C (en) 2002-04-10 2013-10-01 Genentech, Inc. Anti-her2 antibody variants
ITTO20020340A1 (it) 2002-04-19 2003-10-20 Biother Di Contardi Gabriella Localizzazione del recettore her2 mediante anticorpo umanizzato biotinilato.
US20030202973A1 (en) 2002-04-29 2003-10-30 Dr. George Pieczenik Treatment of refractory human tumors with epidermal growth factor receptor and HER1 mitogenic ligand (EGFRML) antagonists
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
PT1517921E (pt) * 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
PT1585966E (pt) 2002-07-15 2012-02-20 Hoffmann La Roche Tratamento de cancro com o anticorpo anti-erbb2 rhumab 2c4
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
ES2629602T5 (es) 2002-09-11 2021-06-08 Genentech Inc Purificación de proteínas
EP1549345A1 (en) 2002-10-10 2005-07-06 MERCK PATENT GmbH Bispecific anti-erb-b antibodies and their use in tumor therapy
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004048525A2 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Genentech, Inc. Therapy of non-malignant diseases or disorders with anti-erbb2 antibodies
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
WO2004087207A2 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Georgetown University Method for inducing apoptosis and aneuploidy regression in cancer cells
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
KR20060037447A (ko) 2003-08-18 2006-05-03 화이자 프로덕츠 인크. ｅｒｂＢ２ 항암제에 대한 투약 스케쥴
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
BRPI0510716A (pt) 2004-05-05 2007-11-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc uso de um agente de ligação bi-especìfico, agente de ligação bi-especìfico, composição de um agente de ligação bi-especìfico, e, kit
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JP2008526205A (ja) 2004-12-31 2008-07-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂｒ３に結合するポリペプチド及びその使用
EP3698807A1 (en) 2005-01-21 2020-08-26 Genentech, Inc. Fixed dosing of her antibodies
PE20070207A1 (es) 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CA2670315A1 (en) 2006-11-21 2008-11-20 The Regents Of The University Of California Anti-egfr family antibodies, bispecific anti-egfr family antibodies and methods of use thereof
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
PL2716301T3 (pl) 2007-02-16 2017-10-31 Merrimack Pharmaceuticals Inc Przeciwciała przeciw ERBB3 i ich zastosowania
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
EP2138511A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. HER3 as a determinant for the prognosis of melanoma
ES2572728T3 (es) * 2009-03-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-HER biespecíficos
MX2011010166A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.
HUE035605T2 (en) 2009-11-13 2018-05-28 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Materials and Methods for the Treatment or Prevention of HER-3-Related Diseases
DK2516469T3 (en) 2009-12-22 2016-05-02 Roche Glycart Ag ANTI-HER3 antibodies and uses thereof
JP2012016491A (ja) 2010-07-08 2012-01-26 Panasonic Electric Works Co Ltd 往復式電気かみそり
JP2015514710A (ja) * 2012-03-27 2015-05-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｈｅｒ３阻害剤に関する診断及び治療
CN105074006A (zh) * 2013-03-14 2015-11-18 豪夫迈·罗氏有限公司 预测对egfr抑制剂的响应

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006091209A2 (en) * 2005-02-23 2006-08-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
CN101355966A (zh) * 2005-06-15 2009-01-28 加州大学评议会 双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法
WO2007042289A2 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Ablynx N.V. Nanobodies™ and polypeptides against egfr and igf-ir

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110036028A (zh) * 2016-10-16 2019-07-19 塞勒兰特治疗公司 抗il1-rap抗体
CN110036028B (zh) * 2016-10-16 2023-09-08 坎塔吉亚有限责任公司 抗il1-rap抗体

Also Published As

Publication number Publication date
JP5624114B2 (ja) 2014-11-12
EP3088420A1 (en) 2016-11-02
MY152068A (en) 2014-08-15
TW201438739A (zh) 2014-10-16
KR20110117256A (ko) 2011-10-26
JP2012521196A (ja) 2012-09-13
NZ594665A (en) 2013-08-30
SG174378A1 (en) 2011-10-28
US9327035B2 (en) 2016-05-03
US8597652B2 (en) 2013-12-03
US20100255010A1 (en) 2010-10-07
SG10201402742YA (en) 2014-08-28
RU2504553C2 (ru) 2014-01-20
JP2014158481A (ja) 2014-09-04
CA2755640C (en) 2018-05-22
RU2011142281A (ru) 2013-04-27
ZA201106127B (en) 2014-03-26
BRPI1006215A2 (pt) 2019-09-24
KR20150036824A (ko) 2015-04-07
CN102356092A (zh) 2012-02-15
CR20110496A (es) 2011-12-06
AU2010226453A1 (en) 2011-09-08
RU2013146469A (ru) 2015-04-27
UA106070C2 (uk) 2014-07-25
EP2408817B1 (en) 2016-03-16
HK1165809A1 (zh) 2012-10-12
US20140193414A1 (en) 2014-07-10
US20140056899A1 (en) 2014-02-27
US20120121596A1 (en) 2012-05-17
TW201544123A (zh) 2015-12-01
KR20130080871A (ko) 2013-07-15
AU2010226453B2 (en) 2013-11-21
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