JP2008526205A - Ｂｒ３に結合するポリペプチド及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、アンタゴニスト及びアゴニストポリペプチドを含む、新規のＢＲ３結合抗体及びポリペプチドに関する。また、本発明は、治療方法、スクリーニング方法、診断方法、アッセイ及びタンパク質精製方法などにおけるＢＲ３結合抗体及びポリペプチドの使用に関する。

Description

(発明の分野)
本発明は、ＢＲ３に結合する抗体及びポリペプチドとその使用に関する。
(発明の背景)
ＢＡＦＦ(ＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ-１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ又はｚＴＮＦ４としても知られる)は、Ｂ細胞生存および成熟に必須であるＴＮＦリガンドスーパーファミリのメンバーである(Mackay & Browning (2002) Nature Rev. Immunol. 2, 465-475に概説される)。トランスジェニックマウスのＢＡＦＦ過剰発現により、Ｂ細胞過形成と重篤な自己免疫性疾患が起こる(Mackay, 等 (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710；Gross, 等 (2000) Nature 404, 995-999；Khare, 等 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3370-33752-4)。ＢＡＦＦレベルは、様々な自己免疫性疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、ウェゲナー肉芽腫症及びシェーグレン症候群を有するヒト患者において上昇している(Cheema, G. S,等, (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319；Groom, J., 等, (2002) J. Clin. Invest. 109, 59-68；Zhang, J., 等, (2001) J. Immunol. 166, 6-10；Krumbholz 等, ANCA Workshop, Prague, Czech Republic, 2003)。さらに、ＢＡＦＦレベルは疾患の重症度と相関することから、ＢＡＦＦがこれらの疾病の病理発生において直接的な役割を果たしうることが示唆される。コラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)、狼瘡(例えばＢＷＦ１マウス)、多発性硬化症(例えば実験的自己免疫性脳脊髄炎(ＥＡＥ))の動物モデルにおけるＢＡＦＦ遮断によって疾患が寛解する。慢性移植片対宿主病(ｃＧＶＨＤ)モデルのＢＲ3：Ｆｃ治療は、Ｂ細胞活性化を阻止(ブロック)するのではなくＢ細胞生存を阻害することによって、ｃＧＶＨＤと関係している脾腫を有意に阻害した(Kalled, SL 等 (2005) Curr Dir Autoimmun.8: 206-42)。ゆえに、ＢＡＦＦ遮断は強いＢ細胞成分を有する自己免疫の他の動物モデルに有効であるようである。
さらに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞が、タイプＩおよびタイプＩＩサイトカインを生産して、ＣＤ２５発現を増やすように組換えたＢＡＦＦによって同時に刺激されうることが報告されている(Ng, LG, et al. 2004. J Immunol 173:807)。さらに、報告されることには、ＢＡＦＦ-Ｒ：ＦｃはＢＡＦＦ媒介性ヒトＴ細胞増殖を遮断した(Huard, B, 等, (2000) J Immunol 167:6225)。またさらに、Ｂリンパ球悪性腫瘍患者の中には、ＢＡＦＦのレベルが上昇しているものがいる (Kern, C 等, (2004) Blood 103(2): 679-88)。ある報告によると、可溶性ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬを加えると、Ｂ-ＣＬＬ細胞が自然発生的で薬剤誘発性アポトーシスから保護され、ＮＦ-κＢ活性化を刺激した。逆に、可溶性ＢＣＭＡ-Ｆｃ又は抗ＢＡＦＦ及び抗ＡＰＲＩＬ抗体を加えると、Ｂ-ＣＬＬアポトーシスが亢進された(Kern, C 等, 上掲)。ＢＡＦＦは、悪性Ｂ細胞に必須の自己分泌性生存因子として働きうる(Mackay F, 等, (2004) Curr Opin Pharmacol. 4(4): 347-54)。したがって、ＢＡＦＦは様々な疾患状態と関連していた。
ＢＡＦＦは、ＴＮＦレセプタスーパーファミリの３つのメンバーである、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＲ３(別名ＢＡＦＦ-Ｒ)と結合する (Gross, 等, 上掲；8. Thompson, J. S., 等, (2001) Science 293, 2108-2111. Yan, M., 等; (2001) Curr. Biol. 11,1547-1552；Yan, M., 等,. (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41. Schiemann, B., 等, (2001) Science 293, 2111-2114)。３つの中でＢＲ３だけはＢＡＦＦに特異的であり；他の２つは関連したＴＮＦファミリーメンバーであるＡＰＲＩＬも結合する。ＢＡＦＦ及びレセプターノックアウト又は突然変異体マウスの表現型を比較すると、ＢＲ３を介するシグナル伝達がＢＡＦＦのＢ細胞生存機能を媒介することが示された (Thompson, 等, 上掲；Yan, (2002), 上掲；Schiemann, 上掲)。対照的に、ＴＡＣＩは阻害レセプターとして働くようであるが(Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643)、ＢＣＭＡの役割はあまり明らかでない(Schiemann, 上掲)。
ＢＲ３は、Ｂ細胞の表面上に発現される１８４残基のタイプIII膜貫通型タンパク質である(Thompson, 等, 上掲；Yan, (2002), 上掲)。細胞内領域は、公知の構造的ドメイン又はタンパク質-タンパク相互作用のモチーフに配列類似性を持たない。様々な系統の研究から、ＢＲ３がＢ細胞がＢＡＦＦ媒介性生存シグナルを受け取る一次レセプターであるという強い所見が示されている(Kalled, S., 等, Curr Dir Autoimmun. 2005;8:206-42に概説される)。これは、近年作製されたＢＡＦＦ-Ｒ−／−マウスであるＢＡＦＦ-Ｒノックアウトマウスによって確認されている(Shulga-Morkskaya, S. 等, (2004) J Immunol. 15;173(4): 2331-41)。ＢＲ３は、多発性骨髄腫及び非ホジキン性リンパ腫を含む様々な疾患組織において発現している (Novak, AJ (2004) Blood 104:2247-2253；Novak, AJ (2004) Blood 103:689-694)。
(発明の概要)
本発明は、新規のＢＲ３結合ポリペプチド、例えばＢＲ３結合イムノアドヘシン、抗体及びＦｃ領域を欠く抗体と、本発明の方法におけるその予期しない有益な特性、例えばＢ細胞を枯渇するため、Ｂ細胞増殖及び生存を刺激するため、治療的使用のため又は診断や研究の使用のための潜在的な薬剤としての使用を提供する。
本発明は、本発明は、以下の何れか一、何れかの組合せ又はすべての特性を含むＢＲ３結合ポリペプチドを提供する：(１) ５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(２) ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でマウスＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(３) 特定の残基(一又は複数)を含有するヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有する；(４) ヒトＢＡＦＦへのヒトＢＲ３の結合を阻害する；(５) ヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞性障害(ＡＤＣＣ)を有するか、野生型ＩｇＧと比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを亢進しているか、野生型ＩｇＧ又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを減弱している；(６) 本明細書中で開示される抗体の何れか一に由来する；(７) 野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドないしは親ポリペプチドよりも高い親和性でヒトＦｃ新生児レセプター(ＦｃＲｎ)を結合する；(８) このような抗体で処理されていない適当なネガティブコントロール又は基準レベルと比較して好ましくは少なくとも２０％インビボ又はインビトロのＢ細胞を殺傷又は枯渇する。ＢＲ３結合ポリペプチドには、Ｆｃドメインに融合されたＢＲ３(例えばペプチボディ)を結合するペプチド(例えばファージディスプレイ由来)が含まれる。
一実施態様では、Ｂ細胞表面抗原に結合しないコントロール抗体による処置と比較して、又は処置前の基準レベルと比較して、本発明の抗体は、マウスの以下の何れか一、何れかの組合せ又はすべての細胞集団中のＢ細胞の少なくとも２０％を枯渇しうる：(１) 血液Ｂ細胞、(２) リンパ節Ｂ細胞、(３) 脾臓濾胞性Ｂ細胞、(４) 脾臓周辺帯Ｂ細胞。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上である。
また、本発明は、以下の何れか一、何れかの組合せ又はすべての特性を含むアゴニストＢＲ３結合ポリペプチドを提供する：(１) ５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(２) ヒトＢＲ３特異的残基に機能的なエピトープを有する；(３) インビトロでＢ細胞増殖を刺激する；(４) ヒトＢＡＦＦへのヒトＢＲ３の結合を阻害する；(５) 本明細書中で開示される抗体の何れか一に由来する；(６) 野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドないしは親ポリペプチドよりも高い親和性でヒトＦｃ新生児レセプター(ＦｃＲｎ)を結合する；(７) インビボでＢ細胞増殖又はＢ細胞生存を刺激する。一実施態様によると、野生型ＩｇＧ１又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃ配列又は９.１ＲＦ抗体と比較して、アゴニスト抗体はＡＤＣＣ機能が少ないかないしは存在しない。一実施態様によると、本発明のアゴニスト抗体はＦｃ領域内に少なくとも以下の置換Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ(ＥＵ番号付けシステム)を有する。一実施態様によると、アゴニスト抗体はヒトＩｇＧ４のＩｇＧ Ｆｃ配列を有する。
一実施態様では、本発明のＢＲ３結合ポリペプチドは残基Ｆ２５、Ｖ３３及びＡ３４を含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有し、該モノクローナル抗体は９.１抗体又は２.１抗体でない。更なる実施態様では、機能的なエピトープは残基Ｒ３０を更に含む。一実施態様では、本発明のＢＲ３結合ポリペプチドは、残基Ｐ２１及びＡ２２を含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有する。一実施態様では、本発明のＢＲ３結合ポリペプチドは残基Ｌ３８及びＲ３９を含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有し、該抗体は９.１抗体でない。一実施態様では、ＢＲ３結合ポリペプチドは残基Ｇ３６を含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有し、該抗体は２.１抗体でない。一実施態様では、本発明のＢＲ３結合ポリペプチドは、残基Ｖ２９及びＬ２８を含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有する。さらに他の実施態様では、機能的なエピトープはＬ２８及びＶ２９を更に含む。一実施態様では、Ｌ３８、Ｒ３９、Ｐ２１及びＡ２２の何れか一、何れかの組合せ又はすべてを含むヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有する抗ＢＲ３抗体は、アゴニストＢＲ３結合抗体である。他の実施態様では、Ｇ３６を含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有する抗ＢＲ３抗体は、アゴニストＢＲ３結合抗体である。
本発明は、ＢＲ３に結合し、図に記載した抗体配列の下線部位の何れか一又は配列一覧に記載したＣＤＲないしは高頻度可変領域に少なくとも７０％の相同性を有するＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３領域を有する抗体及びこれらの抗体に由来するＢＲ３結合抗体である表２の抗体を提供する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＢＲ３に結合し、表２に記載の抗体の何れか一のＨ１、Ｈ２及びＨ３領域のそれぞれに少なくとも７０％の相同性を有するＨ１、Ｈ２及びＨ３領域を有する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＢＲ３に結合し、表２に記載の抗体の何れか一のＬ１、Ｌ２及びＬ３領域のそれぞれに少なくとも７０％の相同性を有するＬ１、Ｌ２及びＬ３領域を有する。一実施態様では、抗体はＢＲ３に結合し、表２に記載の抗体の何れか一のＶＨドメインに少なくとも７０％の相同性を有するＶＨドメインを有する。
本発明は、残基QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)を含んでなるヒト化抗ＢＲ３抗体を提供する。他の実施態様では、ＢＲ３結合抗体は、(１) 残基QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と(２) 残基RDTSKNTF (配列番号２１０)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含んでなる。一実施態様では、ＢＲ３結合抗体は、さらに、配列番号３５−３６の何れか一の抗体配列の残基番号４９−６５(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ２と残基番号２６−３５を含有するＨＶＲ１とを含んでなる 。他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、さらに、Ｈ１高頻度可変領域(ＨＶＲ１)内に残基GFTVTAYYMS (配列番号２１４)とＨ２高頻度可変領域(ＨＶＲ２)内に残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (配列番号２１３)を含んでなる。他の実施態様では、抗体は、さらに、ＬＶＲ１内に残基KSSQSLLYSSNQNNYLA (配列番号２３２)、ＬＶＲ２内に残基WASTRES (配列番号２３３) 、ＬＶＲ３内に残基QQSQISPPT (配列番号２３１)を含んでなる。
他の実施態様では、抗ＢＲ３結合抗体は、(１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と(２) RDTSKNTL (配列番号２１１)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３結合抗体は、配列番号３７−７３の抗体配列の何れか一の残基番号２６−３５及び４９−６５(カバット番号付け)を含有してなる。一実施態様では、抗体は、ＬＶＲ１内に残基KSSQSLLYSSNQNNYLA (配列番号２３２)、ＬＶＲ２内に残基WASTRES (配列番号２３３) 、ＬＶＲ３内に残基QQSQISPPT (配列番号２３１)を含んでなる。
他の実施態様では、抗ＢＲ３結合抗体は以下の式I：
W-A-X3-X4-X5-X6-S (配列番号２１５) (式I)
を含有するＬ２高頻度可変領域(ＬＶＲ２)を含んでなり、このとき、Ｘ３がＱ又はＳであり；Ｘ４がＨ、Ｉ又はＴであり；Ｘ５がＬ又はＲであり、Ｘ６がＤ又はＥであり、式IがWASTRES (配列番号２３３)でない。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体はさらに、QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)を含んでなる。一実施態様では、ＬＶＲ２は配列番号２３及び２５からなる群から選択される抗体配列の残基番号５０−５６(カバット番号付け)を含有してなる。一実施態様では、抗体はさらに、ＨＶＲ１内に残基GFTVTAYYMS (配列番号２１４)とＨＶＲ２内に残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (配列番号２１３)を含んでなる。一実施態様では、抗体はさらに、ＬＶＲ１内に残基KSSQSLLYSSNQNNYLA (配列番号２３２)と、ＬＶＲ３内に残基QQSQISPPT (配列番号２３１)を含んでなる。
他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体は以下の式II：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Y-X9-X10 (配列番号２１６) (式II)
を含有するＨ１高頻度可変領域(ＨＶＲ１)を含んでなり、このとき、X1がG又はD、S、A、V、E又はTであり；X2がL、S、W、P、F、A、V、I、R、Y又はDであり；X3がP、T、A、N、S、I、K、L又はQであり；X4がM、R、V、Y、G、E、A、T、L、W又はDであり；X5がA、S、T、G、I、R、P、N、D、Y又はHであり；X6がG、A、S、P又はTであり；X7がF、H、Y、R、S、V又はNであり；X9がT、I、M、F、W又はVであり；X10がT、G、S又はAであり、式IIがGFTVTAYYMS (配列番号２１４)でない。一実施態様では、抗体はさらに、QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)を含有してなる。一実施態様では、ＨＶＲ１は、配列番号２４、２６−３４、３６及び３８−７３からなる群から選択される抗体配列の残基番号２６−３５(カバット番号付け)を含有してなる。一実施態様では、抗体はさらに、ＬＶＲ２内に残基WASTRES (配列番号２３３)を含有してなる。一実施態様では、抗体はさらに、ＬＶＲ１内に残基KSSQSLLYSSNQNNYLA (配列番号２３２)、ＬＶＲ２内に残基WASTRES (配列番号２３３) 及びＬＶＲ３内に残基QQSQISPPT (配列番号２３１)を含んでなる。一実施態様では、抗体はさらに、ＨＶＲ２内に残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (配列番号２１３)を含んでなる。
他の実施態様では、本発明のＢＲ３結合抗体は、(１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と(２) Hu9.1-73、Hu9.1-70、Hu9.1-56、Hu9.1-51、Hu9.1-59、Hu9.1-61、Hu9.1-A、Hu9.1-B and Hu9.1-Cからなる群から選択される抗体のＨＶＲ１の残基番号２６−３５とＬＶＲ２の残基番号５０−５６を含んでなる抗体である。一実施態様では、抗体はさらに、ＨＶＲ２内に残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (配列番号２１３)を含んでなる。一実施態様では、抗体はさらに、ＬＶＲ１内に残基KSSQSLLYSSNQNNYLA (配列番号２３２)と、ＬＶＲ３内に残基QQSQISPPT (配列番号２３１)を含んでなる。
また、本発明は、配列番号７−１３及び１６−１８からなる群から選択される抗体配列の残基番号９４−１０２(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。一実施態様では、抗体はさらに、配列番号７−１３及び１６−１８の何れか一の抗体配列の残基番号２６−３５及び残基番号４９−６５(カバット番号付け)をそれぞれ含有するＨＶＲ１及びＨＶＲ２を含んでなる。一実施態様では、抗体のＬＶＲ１、ＬＶＲ２及びＬＶＲ３は、配列番号３の抗体配列のそれぞれ残基２４−３４、残基５０−５６及び残基８９−９７(カバット番号付け)を含有してなる。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号２２、２４及び２６−７３の何れか一の可変重鎖配列を含有する可変重鎖ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号２１、２３及び２５の何れか一の可変軽鎖配列を含有する可変軽鎖ドメインを含んでなる。他の実施態様では、抗体は配列番号７４の配列を含んでなる。他の実施態様では、抗体は配列番号７６の配列を含んでなり、ＸはA、W、H、Y、S又はFである。具体的な一実施態様では、抗体は配列番号７５の配列を含んでなる。
本発明は、以下の式III：
X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY (配列番号２１８) (式III)
を含有し、このとき、X1がN、T又はRであり；X2がA、S、T、L、N又はPであり；X3がN、H又はLであり；X4がP、Y、F、N、T又はLであり；X5がY、T又はDであり；X7がA又はEである、ＨＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。一実施態様では、式IIIはTPHTYGAMDY (配列番号235)でない。一実施態様では、式IIIはNSNFYGAMDY (配列番号219)である。一実施態様では、抗体はさらに、残基RDTSKNTF (配列番号２１０)又はRDTSKNTL (配列番号211)を含有するＨＣ-ＦＲ３を含んでなる。一実施態様では、抗体のＬＶＲ１、ＬＶＲ２及びＬＶＲ３は、配列番号３の抗体配列のそれぞれ残基２４−３４、残基５０−５６及び残基８９−９７(カバット番号付け)を含有してなる。一実施態様では、抗体のＨＶＲ１及びＨＶＲ２は、配列番号４の抗体配列のそれぞれ残基２６−３５及び残基４９−６５(カバット番号付け)を含有してなる。
あるいは、本発明は、以下の式III：
X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY (配列番号２１８) (式III)
を含有し、このとき、X1がN、T又はRであり；X2がA、S、T、L、N又はPであり；X3がN、H又はLであり；X4がP、Y、F、N、T又はLであり；X5がY、T又はDであり；X7がA又はEであるＨＶＲ３を含んでなり、さらに、残基RDTSKNTF (配列番号２１０)又はRDTSKNTL (配列番号211)を含有するＨＣ-ＦＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。一実施態様では、ＨＣ-ＦＲ３がRDTSKNTF (配列番号２１０)を含んでなるとき、抗体のＨＶＲ３は配列番号６−９及び１６−１７の何れか一の抗体配列の残基９４−１０２(カバット番号付け)を含んでなる。一実施態様では、ＨＣ-ＦＲ３がRDTSKNTL (配列番号211)を含んでなるとき、抗体のＨＶＲ３は配列番号５及び１０−１３の何れか一の抗体配列の残基９４−１０２(カバット番号付け)を含んでなる。一実施態様では、抗体のＬＶＲ１、ＬＶＲ２及びＬＶＲ３は、配列番号３の抗体配列の残基２４−３４、残基５０−５６及び残基８９−９７(カバット番号付け)をそれぞれ含有する。一実施態様では、抗体のＨＶＲ１及びＨＶＲ２は、配列番号４の抗体配列のそれぞれ残基２６−３５及び残基４９−６５(カバット番号付け)を含有してなる。
他の実施態様では、式IIIの配列は以下の式IV：
X1-X2-X3-X4-X5-GAMDY (配列番号218) (式IV)
であり、このときX1がN、T又はRであり；X2がS、T、L、N又はPであり；X3がN又はLであり；X4がP、Y、F、N又はLであり；X5がY又はDである。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、式IVの配列を含有するＨＶＲ３と配列番号２１０の配列を含有するＨＣ-ＦＲ３を含んでなる。更なる実施態様では、抗体は配列番号１４の軽鎖配列を含んでなる。更なる実施態様では、抗体は、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ(ＥＵ番号付け)変異を有するＦｃ領域を含んでなる。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号４−１３及び１６−１８の何れか一の可変重鎖配列を含有する可変重鎖ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号３の可変軽鎖配列を含有する可変軽鎖ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗体は配列番号１４の配列を含んでなる。他の実施態様では、抗体は配列番号１５の配列を含んでなる。
本発明は、可変軽鎖配列 配列番号７７と可変重鎖配列 配列番号７８、及びその変異体を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は配列番号７９の可変軽鎖配列を含んでなる。他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８０−８５の何れか一の可変重鎖配列を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８０又は８２の何れか一の抗体配列の残基番号２６−３５(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ１を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８０、８４又は８５の何れか一の抗体配列の残基番号４９−６５(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ２を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８０、８２又は８３の何れか一の抗体配列の残基番号９４−１０２(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ３を含んでなる。他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、(１) 配列番号８１−８５の何か一の抗体配列の残基９４−１０２(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ３と、(２) RDTSKNTF (配列番号 ２１０)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含有する。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８０−８５の何れか一の抗体配列の残基番号２６−３５、４９−６５及び９４−１０２を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、抗体配列 配列番号７９の残基番号２４−３４(カバット番号付け)を含有するＬＶＲ１を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、抗体配列 配列番号７９の残基番号５０−５６(カバット番号付け)を含有するＬＶＲ２を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、抗体配列 配列番号７９の残基番号８９−９７(カバット番号付け)を含有するＬＶＲ３を含んでなる。他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体のＬＶＲ１、ＬＶＲ２およびＬＶＲ３は、配列番号７９のぞれぞれ残基番号２４−３４、５０−５６及び８９−９７(カバット番号付け)を含有する。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号７８及び８０−８５の何れか一の可変重鎖配列を含有する可変重鎖ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は配列番号７７及び７９の可変軽鎖配列を含有する可変軽鎖ドメインを含んでなる。
本発明は、配列番号８７−９４の何れか一の抗体配列の残基番号９５−１０２を含有するＨＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。本発明は、配列番号８７−９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７、１２９及び１９３の何れか一の抗体配列の残基番号４９−５８を含有するＨＶＲ２を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。本発明は、配列番号８７−９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７、１２９及び１９３の何れか一の抗体配列の残基番号２４−３４を含有するＨＶＲ１を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。本発明は、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２８及び１９４−２０７の何れか一の抗体配列の残基番号２４−３４を含有するＬＶＲ１を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。本発明は、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２８及び１９４−２０７の何れか一の抗体配列の残基番号５０−５６を含有するＬＶＲ２を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。本発明は、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２８及び１９４−２０７の何れか一の抗体配列の残基番号８９−９７を含有するＬＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。一実施態様では、ＬＶＲ１、ＬＶＲ２及びＬＶＲ３が、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２８及び１９４−２０７の何れか一の抗体配列の残基番号２４−３４、５０−５６及び８９−９７を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２及びＨＶＲ３が、配列番号８７−９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７、１２９及び１９３の何れか一の抗体配列の残基番号２４−３４、４９−５８及び９５−１０２を含有する。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８７−９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７、１２９及び１９３の何れか一のＶＨ配列を含有する可変重鎖ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２８及び１９４−２０７の何れか一のＶＬ配列を含有する可変軽鎖ドメインを含んでなる。
本発明は、Ｘ６がＲ又はＨであるRVCYN-X6-LGVCAGGMDY (配列番号220) (式V)を含有するＨＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。
本発明は、以下の式VI：
RAS-X4-X5-X6-X7-X8-X9-VA (式VI)
を含有し、X4がQ又はEであり；X5がD又はEであり；X6がI又はEであり；X7がS又はAであり；X8がS又はTであり；X9がA又はSである、ＬＶＲ１を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。
本発明は、以下の式VII：
X1-X2-A-S-X5-L-X7-S (式VII)
を含有し、X1がY又はFであり；X2がS、A又はGであり；X5がN、F又はYであり；X7がF又はYである、ＬＶＲ２を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。
本発明は、以下の式VIII：
Q-X2-S-X4-X5-X6-PPT (式VIII)
を含有し、X2がQ又はHであり；X4がG、L、R、H、Y、Q又はEであり；X5がN、T、M、S、A、T、I又はVであり；X6がT又はSである、ＬＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体を提供する。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、式I、II及びIIIの配列を含有する軽鎖を含んでなる。他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、式I、II及びIIIの配列を含有する軽鎖を含んでなり、式V又は配列番号２２０の配列を含有するＨＶＲ３を含んでなる。
本発明は、残基RVCYNRLGVCAGGMDY (配列番号２２１)を含有するＨ３；残基SGFTISSNSIH (配列番号２２２)を含有するＨ１と、残基AWITPSDGNTD (配列番号２２３)を含有するＨ２を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を提供する。他の実施態様では、抗ＢＲ３結合抗体は、RVCYNRLGVCAGGMDY (配列番号２２１)を含有するＨ３；残基SGFTISSSSIH (配列番号２２４)を含有するＨ１と AWVLPSVGFTD (配列番号２２５)を含有するＨ２を含んでなる。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７、１２９及び１９３の何れか一の可変重鎖配列を含有する可変重鎖を含んでなる。一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２８及び１９４−２０７の何れか一の可変軽鎖配列を含有する可変軽鎖を含んでなる。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のヒトＢＲ３の細胞外ドメインへの結合を競合的に阻害することができる。更なる実施態様では、抗体は３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の可変領域配列を含有する。他の実施態様では、抗体は３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の高頻度可変領域配列を含有する。他の実施態様では、抗体は３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のヒト化型である。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は、３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のヒトＢＲ３への結合を競合的に阻害することができる。更なる実施態様では、抗体は３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の可変領域配列を含有する。他の実施態様では、抗体は３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の高頻度可変領域配列を含有する。他の実施態様では、抗体は３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のヒト化型である。
一実施態様では、本発明の抗体は、本明細書中にて具体的に記載する何れか一の抗体と同じエピトープに結合する。他の実施態様では、本発明の抗体は寄託された抗体の配列を含有する。
本発明は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＦｃＲｎ結合などの変更したＦｃエフェクター機能を有するＢＲ３結合抗体及びイムノアドヘシンを提供する。一実施態様では、野生型のヒトＩｇＧ１と比較して亢進したＡＤＣＣ活性を有する抗体及びイムノアドヘシンが包含される。他の実施態様では、野生型のヒトＩｇＧ１と比較して減弱したＡＤＣＣ活性を有する抗体及びイムノアドヘシンが包含される。更なる他の実施態様では、野生型のヒトＩｇＧ１と比較して亢進したＦｃＲｎ結合親和性を有する抗体及びイムノアドヘシンが包含される。一実施態様では、抗体又はイムノアドヘシンは、Ｆｃ領域内の残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムに従った場合、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８及び４３９からなる群から選択されるＦｃ領域内に少なくとも一の置換を有する。一実施態様では、残基４３４はＡ、Ｗ、Ｙ、Ｆ及びＨからなる群から選択される残基である。他の実施態様では、抗体又はイムノアドヘシンは以下の置換Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを有する。他の実施態様では、抗体又はイムノアドヘシンは以下の置換Ｋ３２２Ａを有する。他の実施態様では、抗体又はイムノアドヘシンは、配列番号１３４を含み、ＸがＡ、Ｗ、Ｈ、Ｙ及びＦからなる群から選択される何れかのアミノ酸である。他の実施態様では、抗体又はイムノアドヘシンは、置換Ｋ２４６Ｈ、Ｈ２６８Ｄ、Ｅ２８３Ｌ、Ｓ３２４Ｇ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅの少なくとも何れか一又は何れかの組合せを有する。更なる他の実施態様では、本発明の抗体又はイムノアドヘシンは、少なくとも以下の置換Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを有する。
本発明の一実施態様では、ＢＲ３結合ポリペプチドは細胞障害性剤又は化学療法剤にコンジュゲートされる。
他の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体はヒト化抗体である。他の実施態様では、抗体はヒト抗体である。他の実施態様では、抗体はキメラ抗体である。他の実施態様では、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ)'２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ断片；ダイアボディ及び線状抗体からなる群から選択されるものである。他の実施態様では、抗体は二特異性抗体などの多特異性抗体である。
また、前述の実施態様の何れか一の抗体又はポリペプチドと担体を含んでなる組成物が提供される。一実施態様では、担体は薬剤的に受容可能な担体である。これらの組成物は製造品やキットにおいて提供される。
また、本発明は、抗ＢＲ３抗体をヒスチジンバッファ中に含有する液体製剤を提供する。一実施態様では、バッファは酢酸ヒスチジンバッファである。他の実施態様では、本発明の製剤又は組成物は予めシリンジに充填されたものとしてパッケージ化される。
また、本発明は、抗体を発現するための発現ベクターなどを含む、本明細書中で開示された抗体配列の何れかをコードする単離された核酸を提供する。
本発明の他の態様は、前述の核酸を含む宿主細胞と、抗体を産生する宿主細胞である。後者の好適な一実施態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。抗体を産生する宿主細胞を培養し、細胞培養物から抗体を回収することを含む、これらの抗体の産生方法が提供される。
本発明の更なる他の態様は、容器と、容器に包含される組成物と、パッケージ挿入物とを具備し、該組成物が前述の実施態様の何れかの抗体を含んでなるものである、製造品である。一実施態様では、製造品は、本発明のＢＲ３結合抗体を含んでなる診断用キットである。
また、本発明は、ＢＲ３結合抗体、ポリペプチド又はその機能的な断片が、哺乳動物、例えば骨髄移植を有するヒトや、自己免疫性疾患、癌、Ｂ細胞腫瘍、ＢＲ３陽性癌又は免疫不全性疾患などの疾患に罹っているヒト患者に投与されることによって本明細書に開示される疾患が治療される方法を提供する。自己免疫性疾患、Ｂ細胞腫瘍又はＢＲ３陽性癌を治療するための好適な一実施態様では、投与されるＢＲ３結合ポリペプチドないし抗体は、アンタゴニストＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドであるか、アゴニストＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドでないことが好ましい。免疫不全性疾患の治療のための好適な一実施態様では、用いられるＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドは本発明のアゴニストＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドである。一実施態様では、本発明の治療される癌は、非ホジキン性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫(濾胞性リンパ腫、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、周辺帯Ｂ細胞リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫を含む)からなる群から選択される。
自己免疫性疾患、癌、Ｂ細胞腫瘍又はＢＲ３陽性癌の治療のための方法の一実施態様では、抗体は、本発明の９.１ＲＦ抗体と比較して、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎに結合する親和性を亢進するＢＲ３結合抗体である。自己免疫性疾患、Ｂ細胞腫瘍又はＢＲ３陽性癌の治療方法の一実施態様では、ＢＲ３結合抗体は、９.１ＲＦ抗体と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下においてＡＤＣＣエフェクター機能を亢進しているＢＲ３結合抗体である。
一実施態様では、ＢＲ３陽性癌は、Ｂ細胞リンパ腫又は白血病、例えば非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)又はリンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)又は小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)である。他の実施態様では、ＢＲ３陽性癌は多発性骨髄腫である。更なる実施態様では、治療方法はさらに、少なくとも一の化学療法剤が患者に投与されることを含み、非ホジキン性リンパ腫(ＮＨＬ)の場合、化学療法剤はドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニソロンからなる群から選択されるものである。
また、自己免疫性疾患に罹患した患者に、治療的有効量の本発明のＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドが投与されることを含む、自己免疫性疾患の治療方法が提供される。一実施態様では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、狼瘡、例えば全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少、多発性硬化症、乾癬、Ｉｇ神経障害、例えばＩｇＡネフロパシー、ＩｇＭ多発性神経炎及びＩｇＧ神経障害、重症筋無力症、血管炎、例えばＡＮＣＡ関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)、ペンフィグス、例えば新生物関連天疱瘡、天疱瘡尋常及び落葉性天疱瘡、多発性筋炎／皮膚筋炎及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである。自己免疫性疾患が関節リウマチである場合、抗体は第二治療剤と組み合わせて投与されうる。一実施態様では、第二治療剤はメトトレキセートである。
自己免疫性疾患、Ｂ細胞腫瘍、ＢＲ３陽性癌の治療方法では、ＢＲ３結合抗体は、単独又は第二治療剤、例えば第二抗体、他のＢ細胞枯渇薬剤、化学療法剤、免疫抑制剤又はヒト免疫応答を調節する他の生物製剤(例えば生物学的応答モディファイア)と組み合わせて投与されうる。第二抗体はＣＤ２０ないし異なるＢ細胞抗原に結合するもの又は、ＮＫないしＴ細胞抗原でありうる。一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ(RITUXAN(登録商標))、ｍ２Ｈ７(マウス２Ｈ７)、ｈｕ２Ｈ７(ヒト化２Ｈ７)及びすべての機能的変異体、ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６(ｖはバージョンを表す)、ｖ３１、ｖ９６、ｖ１１４及びｖ１１５、(例えば、国際公開公報2004/056312を参照)からなる群から選択されるものである。一実施態様では、第二抗体は放射性標識した抗ＣＤ２０抗体である。他の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は、毒素ないし放射性同位体を含む細胞障害性剤とコンジュゲートされる。他の実施態様では、第二治療剤は、インターロイキン(例えばＩＬ-２、ＩＬ-１２)、インターフェロン、フルダラビン、シクロホスファミド、ＴＮＦαを標的とする抗体(例えばEnbrel(登録商標)、Remicade(登録商標)及びHumira(登録商標))、コロニー刺激因子(例えばＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ)からなる群から選択されるものである。他の実施態様では、第二抗体ないし生物製剤は他のＢＡＦＦアンタゴニスト(例えばＢＲ３抗体、抗ＢＡＦＦ抗体、ＴＡＣＩ-Ｆｃ、ＢＣＭＡ-Ｆｃ及びＢＲ３-Ｆｃ)でありうる。一実施態様では、自己免疫性疾患又は癌のために第二治療剤として投与されるＢＡＦＦアンタゴニストはＡＤＣＣ活性を有さない。他の実施態様では、第二治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体(例えばアバスチンＴＭ抗体)、抗ＣＤ６４抗体、抗Ｃ３２ａ抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＩＮＦα抗体、抗ＣＤ７９ａ抗体、抗ＣＤ７０ｂ抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ４０抗体、ＣＴＬＡ４-Ｉｇ、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＨＬＡ-ＤＲ抗体、抗ＭＨＣＩＩ(ＩＡ)抗体、抗ＩＬ-７抗体、抗ＩＬ-２抗体、抗ＩＬ-４抗体、抗ＩＬ-２１抗体および抗ＩＬ-１０抗体からなる群から選択されるものである。Ｂ細胞枯渇薬剤の具体的な例には、限定するものではないが、前述の抗ＣＤ２０抗体、Alemtuzumab(抗ＣＤ５２抗体)及びEpratuzumab又はＣＭＣ-５４４(Wyeth)(抗ＣＤ２２抗体)などがある。他の実施態様では、第二治療剤は、Ｂ細胞を枯渇する小分子やＩＡＰインヒビターである。
他の態様では、本発明は、皮膚筋炎、ウェーグナー肉芽腫症、ＡＮＣＡ関連血管炎(ＡＡＶ)、再生不良性貧血症、自己免疫性溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、第VIII因子欠損、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)、ＩｇＭ媒介、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、リンパ系間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植性)対ＮＳＩＰ、ギラン-バレ症候群、大脈管血管炎、巨細胞(高安)動脈炎、中脈管血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎からなる群から選択される自己免疫性疾患の治療方法であって、この疾患に罹患する患者に、治療的有効量のＢＲ３結合抗体が投与されることを含む治療方法を提供する。
また、本発明は、治療的有効量の本発明のアゴニストＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが投与される工程を含む、哺乳動物の免疫不全性疾患の治療方法を提供する。
本発明は、本発明の抗体を用いてＢＲ３を単離する方法を提供する。また、本発明は、Ｂ細胞増殖のインヒビターのスクリーニング方法であって、(ａ) ＢＲ３アゴニスト抗体によりＢ細胞を刺激する；(ｂ) 候補化合物を投与する；そして、(ｃ) Ｂ細胞増殖などのＢＲ３活性を検出する工程を含む方法を提供する。また、本発明は、ＢＲ３経路の下流マーカを同定してモニタリングする方法であって、(ａ) ＢＲ３アゴニスト抗体によりＢ細胞を刺激する；そして(ｂ) 細胞のタンパク質活性及び／又は遺伝子発現における変化を検出する工程を含む方法を提供する。
また、本発明は、ＢＲ３結合治療アンタゴニストで治療される自己免疫性疾患又は癌の診断方法であって、(ａ) 本発明のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドと試験被検体からの生物学的試料を接触する；(ｂ) 生物学的試料中のＢＲ３ポリペプチドのレベルをアッセイする；そして(ｃ) ＢＲ３タンパク質の標準レベルと生物学的試料中のＢＲ３ポリペプチドのレベルを比較することを含み、ＢＲ３タンパク質の標準レベルと比較してＢＲ３タンパク質のレベルにおける存在又は増加によってＢＲ３結合治療によって治療される自己免疫性疾患又は癌が示唆される方法を提供する。
また、本発明は、試験試料又は被検体における本発明の抗ＢＲ３抗体ないしはイムノアドヘシンを結合する工程と、コントロール抗体又はイムノアドヘシンと比較して結合した抗体ないしはイムノアドヘシンを比較する工程を含む、ＢＲ３ポリペプチドの検出方法を提供する。一実施態様では、抗体ないしはイムノアドヘシンが、ＦＡＣＳ分析、免疫組織化学アッセイ(ＩＨＣ)及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群から選択されるアッセイに使用される。非ＢＡＦＦ阻止(ブロック)抗ＢＲ３抗体は、リガンドに結合するかどうか、ＢＲ３を検出する有用性があり、遊離及び結合したＢＲ３を測定する際に有用性がある。
(本発明の詳細な説明)
ここで用いられる「ＢＡＦＦ」、「ＢＡＦＦポリペプチド」、「ＴＡＬＬ-１」又は「ＴＡＬＬ-１ポリペプチド」、「ＢＬｙＳ」なる用語は、「天然配列ＢＡＦＦポリペプチド」及び「ＢＡＦＦ変異体」を包含する。「ＢＡＦＦ」は、配列番号１４３又は配列番号１４４のアミノ酸配列の何れか一によってコードされるポリペプチドと、それらのホモログ及び断片及び変異体であり、天然配列のＢＡＦＦの生物学的活性を有するものに対する名称である。ＢＡＦＦの生物学的活性は、Ｂ細胞生存を促進する、Ｂ細胞成熟を促進する、およびＢＲ３、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩに結合することからなる群から選択されうる。ＢＡＦＦの変異体は、天然配列のＢＡＦＦポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％ないし１００％までの連続的整数、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＢＡＦＦポリペプチドは、天然由来の対応するＢＡＦＦポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えば、ＢＡＦＦはフューリン型のプロテアーゼにより細胞表面から切断された後の可溶型で存在する。そのような天然配列のＢＡＦＦポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＡＦＦポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。「ＢＡＦＦ」なる用語は、Shu 等., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)；GenBank寄託番号 AF136293；1998年5月7日公開のW098/18921；1998年10月7日公開のEP 869,180；1998年6月25日公開のW098/27114；1999年3月18日公開のW099/12964；1999年7月8日公開のW099/33980；Moore 等., Science, 285:260-263 (1999)；Schneider 等., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay 等., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
ここで用いられる「ＢＡＦＦアンタゴニスト」なる用語は、広義の意味で用いられ、(１)天然配列ＢＡＦＦポリペプチドないし天然配列ＢＲ３ポリペプチドに結合してＢＡＦＦポリペプチドと相互作用するＢＲ３を部分的又は完全にブロック(阻止)する、および(２)天然配列ＢＡＦＦシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和(無効化)する任意の分子を含む。とりわけ、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドシグナル伝達はＢ細胞生存およびＢ細胞成熟を促進する。ＢＡＦＦシグナル伝達の阻害、ブロックまたは中和により、とりわけＢ細胞数が減少する。本発明によるＢＡＦＦアンタゴニストはインビトロ及び／又はインビボのＢＡＦＦポリペプチドの一以上の生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害ないし中和するであろう。一実施態様では、生物学的活性なＢＡＦＦはインビトロ又はインビボで以下の事象の何れか一またはそれらのいくつかを増強する：Ｂ細胞の生存促進、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭレベルの増加、又はＢ細胞増殖の刺激。
本明細書中で用いられる「ＴＡＣＩアンタゴニスト」なる用語は、広義の意味で用いられ、(１)天然配列のＢＡＦＦポリペプチドないしは天然配列のＴＡＣＩポリペプチドに結合してＢＡＦＦポリペプチドとのＴＡＣＩ相互作用を部分的又は完全にブロック(阻止)する、および(２)天然配列ＢＡＦＦシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和(無効化)する任意の分子を含む。
本明細書中で用いられる「ＢＣＭＡアンタゴニスト」なる用語は、広義の意味で用いられ、(１)天然配列のＢＡＦＦポリペプチドないしは天然配列のＢＣＭＡポリペプチドに結合してＢＡＦＦポリペプチドとのＢＣＭＡ相互作用を部分的又は完全にブロック(阻止)する、および(２)天然配列ＢＡＦＦシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和(無効化)する任意の分子を含む。
上記のように、ＢＡＦＦアンタゴニストは直接的または間接的な方法で、インビトロまたはインビボのＢＡＦＦシグナル伝達を部分的ないし完全にブロック、阻害又は中和する機能を持つ。例えば、ＢＡＦＦアンタゴニストは直接ＢＡＦＦに結合する。例えば、抗体がＢＡＦＦのＢＲ３への結合を立体的に妨げるようにヒトＢＡＦＦの１６２、１６３、２０６、２１１、２３１、２３３、２６４および２６５からなる群から選択した残基の近傍残基及び／又は残基１６２−２７５を含んでなるヒトＢＡＦＦの領域内で結合する抗ＢＡＦＦ抗体を包含する。他の実施例では、直接結合するものは、ＴＡＣＩ、ＢＲ３及びＢＣＭＡなどのＢＡＦＦレセプターの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド、又はＥＣＤの囲みの最少領域(ヒトＢＲ３の残基１９−３５に対応する)を含んでなるポリペプチドである。あるいは、ＢＡＦＦアンタゴニストは、ＢＡＦＦ結合領域で天然配列ＢＲ３の細胞外ドメインに結合して、インビトロ、インサイツ又はインビボでＢＲ３へのＢＡＦＦの結合を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和しうる。例えば、このような間接的アンタゴニストは、ＢＡＦＦへのヒトＢＲ３の結合が立体的に妨げられるように、これら残基の近傍残基又はヒトＢＲ３の残基２３−３８を含んでなるＢＲ３の領域に結合する抗ＢＲ３抗体である。ＢＡＦＦアンタゴニストでありうるＢＡＦＦ結合Ｆｃタンパク質の他の例には、国際公開公報02/66516、国際公開公報00/40716、国際公開公報01/87979、国際公開公報03/024991、国際公開公報02/16412、国際公開公報02/38766、国際公開公報02/092620及び国際公開公報01/12812にみられる。ＢＡＦＦアンタゴニストには、WO 02/24909の図２０に列挙されるＢＡＦＦ結合配列や国際公開公報2003/024991、国際公開公報02/092620に記載のもの、ＢＡＦＦを結合する配列の断片、及びこれら配列を含んでなる融合タンパク質(例えばＦｃ融合タンパク質)などがある。
ここで用いられる「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」または「ＢＲ３レセプター」なる用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」および「ＢＲ３変異体」を包含する(ここでさらに定義する)。「ＢＲ３」は配列番号１４５−１４９の何れか一を含んでなるポリペプチド及びその変異体又は断片の名称である。本発明のＢＲ３は、ヒト組織型又は他の供給源などの様々な供給源から単離されるか、組み換え法及び／又は合成法によって調整されうる。ＢＲ３なる用語には、国際公開公報02/24909及び国際公開公報03/14294に記載のＢＲ３ポリペプチドが含まれる。
「天然配列」ＢＲ３ポリペプチドは、天然由来の対応するＢＲ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＲ３ポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型、可溶型ないし分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。本発明のＢＲ３ポリペプチドには、ヒトＢＲ３のアミノ酸残基１−１８４の近接した配列からなるかまたはそれらを含有するＢＲ３ポリペプチドが含まれる。
ＢＲ３「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを実質的に含まないＢＲ３ポリペプチド型を意味する。ＢＲ３のＥＣＤ型には、ＢＲ３のアミノ酸１−７７、２−６２、２−７１、１−６１、８−７１、１７−４２、１９−３５又は２−６３の何れかを含んでなるポリペプチドを包含する。
「ＢＲ３変異体(変異型)」は、ＢＲ３ ＥＣＤの残基１９−３５と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＲ３ポリペプチドを意味し、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドを結合する。Gordon, N.C., 等, (2003) Biochemistry 42:5977-5983を参照。場合によっては、ＢＲ３変異体は単一システイン豊富なドメインを含む。そのようなＢＲ３変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一以上のアミノ酸残基がＮ末端および／またはＣ末端で、並びに一以上の内部ドメイン内で付加または欠損しているＢＲ３ポリペプチドが含まれる。天然配列ＢＡＦＦポリペプチドを結合するＢＲ３ ＥＣＤの断片もまた包含される。一実施態様では、ＢＲ３変異型ポリペプチドは、ヒトＢＲ３の残基１９−３５に対応する部位と、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。
ヒトＢＲ３ポリペプチドないしはその特定の断片の、ＢＲ３変異体ポリペプチドは天然ＢＲ３ポリペプチド配列を包含しない。通常、ＢＲ３変異体ポリペプチドは少なくともおよそ１７アミノ酸長又はそれ以上である。
「抗体」なる用語は、広義な意味で用いられ、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体、一本鎖抗体、多特異性抗体および抗体の断片を具体的に包含する。いくつかの実施態様によると、本発明のポリペプチドは抗体フレームワーク内、例えば可変領域内ないしはＣＤＲ内に融合して、抗体が結合してＢＡＦＦのＢＲ３への結合またはＢＡＦＦシグナル伝達を阻害しうる。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトのものでありうる。本発明のポリペプチドを含む抗体は抗体断片でありうる。そのような抗体およびそれらを生成する方法は以下に詳細に記載する。あるいは、本発明の抗体は動物を本発明のポリペプチドで免疫化することによって生成することができる。ゆえに、本発明のポリペプチドに直接関係する抗体を包含する。
本明細書中の「抗ＢＲ３」及び「ＢＲ３結合」なる用語は、交換可能に用いられ、抗体ないしはポリペプチドがＢＲ３ポリペプチドを結合することを意味する。好ましくは、抗ＢＲ３抗体は配列番号１４５−１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＢＲ３ポリペプチド上のエピトープに結合し、ヒトＴＡＣＩ又はヒトＢＣＭＡに結合しない。好ましくは、抗ＢＲ３抗体は、ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に、２５℃でのＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるＦａｂとして５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値で結合する。一実施態様では、抗体ないしポリペプチドは０．００１ｐＭから５００ｎＭの見かけのＫｄでＢＲ３に結合する。
本発明の「アンタゴニスト抗ＢＲ３抗体」は、ＢＲ３ポリペプチドを結合して、ＢＲ３シグナル伝達を阻害する(例えば、ＢＲ３関連のＢ細胞増殖、Ｂ細胞生存又はＢ細胞増殖及び生存の両方を阻害する)抗体を意味する。
本発明の「アゴニスト抗ＢＲ３抗体」は、ＢＲ３ポリペプチドに結合して、ＢＲ３シグナル伝達(例えばＢＲ３関連のＢ細胞増殖、Ｂ細胞生存又はＢ細胞増殖及び生存の両方)を刺激する抗体を意味する。
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の９０％以上のＢ細胞の表面で見出される分子量およそ３５ｋＤの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞(プロジェニタ)または正常血漿細胞にはみられない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞及び悪性のＢ細胞の双方に存在する。文献でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球限局性分化抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、ClarkおよびLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)、およびValentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
ＣＤ２０結合抗体および抗ＣＤ２０抗体はここで交換可能に用いられ、抗体が抗原を発現する細胞を標的とした治療薬剤として有効な程度に親和性を持ってＣＤ２０を結合するすべての抗体を包含し、以下に記載のアッセイのネガティブコントロールタンパク質などの他のタンパク質と顕著な交差反応を示さない。また、抗体の一アームがＣＤ２０を結合する二重特異性抗体を包含する。このＣＤ２０結合抗体の定義によって前述の抗体の機能的断片(フラグメント)も包含する。ＣＤ２０結合抗体は１０ｎＭより小さいＫｄでＣＤ２０を結合するであろう。好ましい実施態様では、該結合は７．５ｎＭより小さい、より好ましくは５ｎＭより小さい、さらにより好ましくは１−５ｎＭの間、最も好ましくは１ｎＭより小さいＫｄである。
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には：現在「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)」)と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第5,736,137号、出典明記によりここに特別に組み込まれる)；「Ｙ２Ｂ８」または「イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab Tiuxetan)」ゼバリン(登録商標)と呼称されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体(米国特許第5,736,137号、出典明記によりここに特別に組み込まれる)；「トシツモマブ(Beckman Coulter)とも呼称され場合によっては１３１Ｉで標識して「１３１Ｉ−Ｂ１」抗体となるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(ヨードＩ１３１トシツモマブ、 BEXXARTM) 米国特許第5,595,721号、出典明記によりここに特別に組み込まれる)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press 等. Blood 69(2):584-591 (1987)および「フレームワーク部分」またはヒト化１Ｆ５を含む変異体(国際公開公報03/002607, Leung, S.)；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０)；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第5,677,180号、出典明記によりここに特別に組み込まれる)；ヒト化２Ｈ７；huMax-CD20 (Genmab, Denmark)；ＡＭＥ-１３３(Applied Molecular Evolution)；Ａ２０抗体又はその変異体、例えばキメラＡ２０抗体ないしヒト化Ａ２０抗体(それぞれcA20、hA20) (US 2003/0219433、Immunomedics)；およびInternational Leukocyte Typing Workshopより入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-ＣｌまたはＮＵ-Ｂ２(Valentine 等., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))が含まれる。
本明細書中の「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝的に操作したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、出典明記によって本明細書中に組み込まれる米国特許第5,736,137号に記載の「Ｃ２Ｂ８」を表すものであり、ＣＤ２０を結合する能力を有するその断片を含む。
具体的な実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はヒトおよび霊長類のＣＤ２０を結合する。具体的な実施態様では、ＣＤ２０を結合する抗体はヒト化またはキメラである。ＣＤ２０結合抗体には、リツキシマブ(リツキサン(登録商標))、ｍ２Ｈ７(マウス２Ｈ７)、ｈｕ２Ｈ７(ヒト化２Ｈ７)、およびそのすべての機能的変異体、限定するものではないがｈｕ２Ｈ７．ｖ１６(ｖはバージョンを表す)、ｖ３１、ｖ７３、ｖ７５並びにフコース欠乏性変異体、及び国際公開公報2004/056312に記載の他の２Ｈ７変異体が含まれる。特に明記しない場合、本明細書中に開示するヒト化２Ｈ７ｖ.１６の配列及びその変異体は成熟ポリペプチド、すなわちリーダー配列を有さないものである。
ＣＤ２０抗体に関する特許および特許文献には、米国特許第5,776,456号、同第5,736,137号、同第5,843,439号、同第6,399,061号、および同第6,682,734号、並びに米国特許出願公開 US 2002/0197255Al、US 2003/0021781A1、US 2003/0082172 Al、US 2003/0095963 Al、US 2003/0147885 Al (Anderson 等.)；米国特許第6,455,043B 1およびW000/09160 (Grillo-Lopez, A.)；W000/27428 (Grillo-LopezおよびWhite)；W000/27433 (Grillo-LopezおよびLeonard)；W000/44788 (Braslawsky 等)；W001/10462 (Rastetter, W.)；WO01/10461 (RastetterおよびWhite)；W001/10460 (WhiteおよびGrillo-Lopez)；US2001/0018041A1、US2003/0180292A1、WO01/34194 (HannaおよびHariharan)；米国出願公開 US2002/0006404およびW002/04021 (HannaおよびHariharan)；米国出願公開 US2002/0012665 AlおよびWO01/74388 (Hanna, N.)；米国出願公開 US 2002/0058029 Al (Hanna, N.)；米国出願公開 US 2003/0103971 Al (HariharanおよびHanna)；米国出願公開 US2002/0009444A1,およびWO01/80884 (Grillo-Lopez, A.)；W001/97858 (White, C.)；米国出願公開 US2002/0128488A1およびW002/34790 (Reff, M.);WO02/060955 (Braslawsky 等);W02/096948 (Braslawsky 等);WO02/079255 (ReffおよびDavies)；米国特許第6,171,586B1,およびW098/56418 (Lam 等)；W098/58964 (Raju, S.)；W099/22764 (Raju, S.);W099/51642、米国特許第6,194,551B 1、米国特許第6,242,195B 1、米国特許第6,528,624B 1および米国特許第6,538,124 (Idusogie 等)；W000/42072 (Presta, L.)；W000/67796 (Curd 等)；W001/03734 (Grillo-Lopez 等)；米国出願公開 US 2002/0004587A1およびWO01/77342 (MillerおよびPresta)；米国出願公開 US2002/0197256 (Grewal, I.)；米国出願公開 US 2003/0157108 Al (Presta, L.)；米国特許第6,565,827号B 1、同第6,090,365号B 1、同第6,287,537号B 1、同第6,015,542号、同第5,843,398号、および同第5,595,721号、(Kaminski 等)；米国特許第5,500,362号、同第5,677,180号、同第5,721,108号、同第6,120,767号、同第6,652,852号B1 (Robinson 等)；米国特許第6,410,391号B1 (Raubitschek 等)；米国特許第6,224,866B1およびW000/20864 (Barbera-Guillem, E.)；W001/13945 (Barbera-Guillem, E.)；W000/67795 (Goldenberg)；米国出願公開 US 2003/0133930 AlおよびW000/74718 (GoldenbergおよびHansen)；W000/76542 (Golay 等.)；WO01/72333 (WolinおよびRosenblatt)；米国特許第6,368,596B 1 (Ghetie 等)；米国特許第6,306,393および米国出願公開 US2002/0041847 Al、(Goldenberg, D.)；米国出願公開 US2003/0026801A1 (WeinerおよびHartmann)；W002/102312 (Engleman, E.)；米国特許出願公開 2003/0068664 (Albitar 等)；W003/002607 (Leung, S.)；WO 03/049694、US2002/0009427A1,およびUS 2003/0185796 Al (Wolin 等) ；W003/061694 (SingおよびSiegall)；US 2003/0219818 Al (Bohen 等)；US 2003/0219433 AlおよびWO 03/068821 (Hansen 等)；US2003/0219818A1 (Bohen 等)；US2002/0136719A1 (Shenoy 等)；W02004/032828 (Wahl 等)が含まれ、これらは出典明記により特別に組み込まれる。また、米国特許第5,849,898および欧州出願番号330,191 (Seed 等)；米国特許第4,861,579およびEP332,865A2 (MeyerおよびWeiss)；USP 4,861,579 (Meyer 等)；W095/03770 (Bhat 等)；US 2003/0219433 Al (Hansen 等)を参照のこと。
ＣＤ２０抗体は、そのままの抗体または細胞障害性合成物、例えば放射性同位元素又は毒素などに抱合したものでありうる。このような抗体には、放射性同位元素、イットリウム-９０に連結した抗体ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)、とＩ-131を抱合したBexxarTM(Corixa, WA)とが含まれる。ヒト化２Ｈ７変異体には、ＦＲのアミノ酸置換と移植されたＣＤＲに変異を持つ親和性成熟変異体を有するものが含まれる。ＣＤＲ又はＦＲの置換されたアミノ酸は、ドナー又はアクセプタ抗体にあるものに限らない。他の実施態様では、さらに本発明の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ機能およびＢ細胞殺傷(またここではＢ細胞枯渇とも称する)の亢進を含むエフェクター機能の改善を導くＦｃ領域のアミノ酸残基変化を含む。記載のように(Idusogie 等., 上掲(2001)；Shields 等., 上掲)、特に、３つの突然変異はＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を改良することが同定された：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ(またここでは３つのＡｌａ突然変異または変異体として示す；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う；Kabat 等., 上掲)。
本発明の他の抗ＣＤ２０抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。一実施態様では、キメラ抗ＣＤ２０抗体はマウスＶ領域およびヒトＣ領域を有する。そのようなある特定のキメラ抗ＣＤ２０抗体はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ(登録商標)；Genentech, Inc.)である。リツキシマブおよびｈｕ２Ｈ７は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)および抗体依存性細胞性細胞障害(ＡＤＣＣ)の両方を介してＢ細胞の溶解を媒介しうる。改変したＦｃ領域アミノ酸配列および亢進または減弱したＣ１ｑ結合能を有する抗体変異体は、米国特許第6,194,551号および国際公開公報99/51642に記載されている。それら特許公報の内容は出典明記によって特別にここに組み込まれる。また、Idusogie 等. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
アポトーシスのインヒビター(IAP)は、アポトーシスを抑制するタンパク質のファミリーを指す(Deveraux, 等, (1999) Genes Dev 13(3):239-252)。ＩＡＰの例には、メラノーマIAP (ML-IAP)及びヒトX染色体連鎖IAP (XIAP)細胞性IAP 1 (cIAP-1)、及び細胞性IAP 2 (cIAP-2)などがあり、これらはカスパーゼ３、カスパーゼ７及びカスパーゼ９活性を抑制する(Deveraux 等, J Clin Immunol (1999), 19:388-398；Deveraux 等, (1998) EMBO J. 17, 2215-2223；Vucic 等, (2000) Current Bio 10:1359-1366)。
ＩＡＰのインヒビター(ＩＡＰインヒビター)の例には、XIAP、cIAP-1、cIAP-2又はML-IAPに関するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Smac/DIABLO由来ペプチド又は、ＩＡＰとそのカスパーゼとの相互作用を阻止する他の分子、及びカスパーゼ活性のＩＡＰ媒介性抑制を阻害する分子などがある(Sasaki 等, Cancer Res., 2000, 60(20):5659；Lin 等, Biochem J., 2001, 353:299；Hu 等, Clin. Cancer Res., 2003, 9(7):2826；Arnt 等, J. Biol. Chem., 2002, 277(46):44236；Fulda 等, Nature Med., 2002, 8(8):808；Guo 等, Blood,2002, 99(9):3419；Vucic 等, J. Biol. Chem.,2002, 277(14):12275；Yang 等, Cancer Res., 2003, 63(4):831)；国際公開公報2005/097791、国際公開公報2005/094818、US 2005/0197403及びUS 6,673,917)。
本明細書中で「Ｂ細胞表面マーカー」又は「Ｂ細胞表面抗原」とは、Ｂ細胞の表面上に発現する抗原であり、結合すべきアンタゴニストの標的となることができる。例示的Ｂ細胞表面上マーカーには、限定するものではないが、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD52、D53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD180 (RP105)、FcRH2 (IRTA4)、CD79A、C79B、CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5 (BLR1)、FCER2、BR3 (aka BAFF-R)、TACI、BTLA、NAG14 (aka LRRC4)、SLGC16270 (ala LOC283663)、FcRH1 (IRTA5)、FcRH5 (IRTA2)、ATWD578 (aka MGC15619)、FcRH3 (IRTA3)、FcRH4 (IRTA1)、FcRH6 (aka LOC343413)及びBCMA (aka TNFRSF17)、HLA-DO、HLA-Dr10及びMHCクラスIIが含まれる。
好適な実施態様では、本発明の抗体は、寄託されて、国際公開公報02/24909に記載される９.１抗体及び２.１抗体を含まない。
好適な実施態様では、本明細書中で用いる「見かけのＫｄ」又は「見かけのＫｄ値」は、一実施態様では、ＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)アッセイを行うなどして表面プラスモン共鳴法によって測定される。ある好適な実施態様では、本発明のＢＲ３結合抗体の見かけのＫｄ値は表面プラスモン共鳴法によって測定されるものであり、この方法では、例えば本明細書中の実施例８に記載のように、ＢＲ３ ＥＣＤをセンサーチップに固定して、Ｆａｂ型の抗ＢＲ３抗体をＢＲ３ ＥＣＤ固定チップに流すか、ＩｇＧ型の抗ＢＲ３抗体をセンサーチップ上に固定して、ＢＲ３ ＥＣＤをＩｇＧ固定センサーチップに流すかのいずれかである。ある好適な実施態様では、センサーチップをタンパク質とともに固定して、チップ上の結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０となるようにした。他の好適な実施態様では、本発明のＦｃＲｎ結合抗体の見かけのＫｄ値は、表面プラスモン共鳴法を行って測定されるものであり、この方法では、実施例１６に記載のように、ＦｃＲｎポリペプチドをセンサーチップに固定して、抗体をチップに流す。
本発明の「機能的エピトープ」は、抗体の結合にエネルギー的に関与する抗原のアミノ酸残基を意味する。エネルギー的に関与している抗原の残基の何れか一の変異(例えば、アラニン又はホモログ突然変異による野生型ＢＲ３の突然変異)により、抗体の抗原への結合が破壊される。本発明の好適な実施態様では、抗ＢＲ３抗体寿の機能的なエピトープ内に包含される残基は、ＢＲ３のａｌａ突然変異ないしはその部位(例えば細胞外ドメイン又は研究中の所望領域の残基１７−４２)を表出するファージを用いたショットガンアラニンスキャニングによって決定することができる。一実施態様では、機能的なエピトープは実施例９に記載の手順に従って決定する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Ｖ領域は抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定するものである。しかし、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸長を通して均一に分布しているわけではない。それどころか、Ｖドメインは、各々９−１２アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性短領域により区分される１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる相対的不可変伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは主にβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、β-シート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域の直近に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、ＶＬの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)の周辺及びＶＨの３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)の周辺(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」の残基(例えば、ＶＬの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及びＶＨの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)(Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
高頻度可変領域は以下のような「延長した高頻度可変領域」を含む：ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及びＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２(Ｈ３)。可変ドメイン残基は、それぞれを定義するために上掲のKabat 等に従って番号付けする。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。例えば、軽鎖フレームワーク１(ＬＣ-ＦＲ１)、フレームワーク２(ＬＣ-ＦＲ２)、フレームワーク３(ＬＣ-ＦＲ３)及びフレームワーク４(ＬＣ-ＦＲ４)領域は、それぞれ抗体の残基番号１−２３、３５−４９、５７−８８及び９８−１０７(カバット番号付けシステム)を含む。他の例では、重鎖フレームワーク１(ＨＣ-ＦＲ１)、重鎖フレームワーク２(ＨＣ-ＦＲ２)、重鎖フレームワーク３(ＨＣ-ＦＲ３)及び重鎖フレームワーク４(ＨＣ-ＦＲ４)は、それぞれ抗体の残基１−２５、３６−４８、６６−９２及び１０３−１１３(カバット番号付けシステム)を含む。
一実施態様に従って、９.１、２.１及び１１Ｇ９抗体由来の抗体の軽鎖のＣＤＲ領域内の大半の残基に対応する残基を図１−３に下線で示す。他の実施態様に従って、Ｖ３抗体由来の抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域内の大半の残基に対応する残基を図１５に下線で示す。
ここで示すように、「コンセンサス配列」または定常Ｖドメイン配列は、公知のヒト免疫グロブリン可変領域配列の比較したアミノ酸配列由来の人工の配列である。この比較に基づいて、ヒトおよびヒトＨ鎖サブグループＩＩＩＶドメイン由来のコンセンサス配列であるＶドメインアミノ酸をコードする組み換え核酸配列を調製した。コンセンサスＶ配列は公知の抗体結合特異性も親和性も持たない。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、一般的に少量で存在しうる突然変異などの、モノクローナル抗体の生成中に生じる可能性のある突然変異体を除いて、集団を含む個々の抗体が同一及び／又は同じエピトープに結合する。このようなモノクローナル抗体には典型的には、標的を結合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれ、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって入手されたものである。例えば、選別方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組み換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの特定のクローンの選別でもよい。選別した標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物内での産生を改善するため、インビボの免疫原性を低減するため、多特異性抗体を作製するなどのためにさらに変更することができること、並びに変更した標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることは理解されるであろう。一般に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体調整物のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調整物は、典型的に他のイムノグロブリンが混入することがない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の性質を示すものであり、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体は、様々な技術、例えばハイブリドーマ法(例えばKohler 等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow 等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling 等, : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)、組み換えＤＮＡ法(例えば米国特許第4,816,567号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えばClackson 等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks 等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu 等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee 等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee 等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)を参照)、及び一部ないしはすべてのヒトイムノグロブリン遺伝子座又はヒトイムノグロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物からヒトないしはヒト様抗体を生成するための技術(例えば、国際公開公報98/24893、国際公開公報/9634096、国際公開公報/9633735、及び国際公開公報/91 10741、Jakobovits 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits 等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann 等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,591,669号 (すべてGenPharm)；同第5,545,807号；国際公開公報97/17852米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016、及びMarks 等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg 等, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild 等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995))によって作製してもよい。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体の作製方法は当分野で公知である。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２又は抗体の他の抗原結合サブ配列)である。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギなどの所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種のＣＤＲの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくは導入したＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、その可変ドメインは、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンに由来し、ＦＲ領域が結合親和性を改善しうる一ないし複数のアミノ酸置換を含みうるが、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである。ＦＲ内のアミノ酸置換の数は典型的には、Ｈ鎖内のたった６個と、Ｌ鎖内のたった３個である。ある好適な実施態様では、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、一般的にはヒト免疫グロブリンのもの又はヒトコンセンサス定常配列の少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol., 2:593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば対象の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生した抗体由来のものであるPRIMATIZED(登録商標)抗体が含まれる。ヒト化抗体の作製方法は当分野において公知である。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含む従来技術に既知の様々な技術を用いて作成することができる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等、J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等及びBoerner等の技術が、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner等、J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)。また、Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照のこと。PCT国際公開公報98/24893；国際公開公報92/01047；国際公開公報96/34096；国際公開公報96/33735；欧州特許第0 598 877号；米国特許第5,413,923号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,569,825号；同第5,661,016号；同第5,545,806号；同第5,814,318号；同第5,885,793号；同第5,916,771号；及び同第5,939,598号。
「抗体断片」には、全長の抗体の一部、一般的にその抗体の抗原結合領域又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体よりなる。この２つのドメインのフォールディングから６つの高頻度可変性ループ(Ｈ鎖およびＬ鎖のそれぞれから３ループずつ)が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与して抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単鎖可変ドメイン(または抗原特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
本発明のＢＲ３結合抗体の「機能的断片」は、断片が由来する完全鎖分子と実質的に同じ親和性でＢＲ３へに結合し、本明細書中で記載されるインビトロ又はインビボアッセイによって測定されるような、Ｂ細胞枯渇、Ｂ細胞増殖の抑制又はＢＲ３へのＢＡＦＦの結合の抑制からなる群から選択される少なくとも一のアッセイにおいて活性である、断片である。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。Ｆｃ配列の例は、配列番号１３３、１３５−１４１に記載され、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域(非Ａ及びＡアロタイプ、それぞれ配列番号１３３及び１３５)；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域(配列番号１３６)；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域(配列番号１３７)；及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域(配列番号１３８)並びに天然に生じるこれらの変異体が含まれる。天然配列マウスＦｃ領域は配列番号１３９−１４２(それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３)に記載される。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一つの「アミノ酸修飾」によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較し、少なくとも一つの一アミノ酸置換を有する、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０アミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５アミノ酸置換である。一実施態様では、本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域(例えば配列番号１３３)と少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９５％同一性、又は少なくとも約９９％同一性を有する。他の実施態様では、本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９５％同一性、又は少なくとも約９９％同一性を有する。
本明細書中で定義する抗体配列及びポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」又は「同一性(相同性)」は、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えて、配列を整列させ、比較するポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
「Ｆｃ領域を含んだポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシン(下記記載の定義を参照)などのポリペプチドのことを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有する、抗体などのポリペプチドを含んでなる組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去されたポリペプチド集団、除去されるＫ４４７残基のないポリペプチド集団又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７を有さないポリペプチドが混合しているポリペプチド集団を包含する。
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる(ＥＵインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願番号60/640,323、ＥＵ番号付けについての図を参照)。
「Ｆｃレセプター」もしくは「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。一実施態様では、本発明のＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマ受容体)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスを含み、これらレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされたものも含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型受容体」)、ＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型受容体」)が含まれ、主として細胞質領域は異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ；ITAM)を含んでいる。阻害型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫受容体阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ；ITIM)を含んでいる(M. in Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997))。この用語には、FcγRIIIAアロタイプ：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及び／又はFcγRIIA-H131などのアロタイプが含まれる。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)；Capel 等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；de Haas 等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に総説されている。他のＦｃＲs、ここでは、将来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、「ＦｃＲ」という言葉は、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性受容体「ＦｃＲｎ」(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)および Kim 等, J. Immunol.24:249 (1994)も含まれる。
「ＦｃＲｎ」なる用語は、新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)を意味する。ＦｃＲｎは主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)と構造的に類似しており、β２ミクログロブリンに非共有的に結合したα鎖からなる。新生児ＦｃレセプターＦｃＲｎの複数の機能は、Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766に概説される。ＦｃＲｎは母親から子へのイムノグロブリンＩｇＧの受動的な運搬と、血清ＩｇＧレベルの調節を担う。ＦｃＲｎは、細胞内及び細胞間でピノサイトーシスされた完全な形のＩｇＧを結合して運搬し、標準の分解系経路からＩｇＧをレスキューするサルベージレセプターとして働くことができる。
国際公開公報00/42072(Presta)及びShieldsら, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)には、ＦｃＲとの結合が改良又は消滅した抗体変異体が記載されている。これらの文献は出典明記によって特別に本明細書中に組み込まれる。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」(「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも称される)は、通常およそアミノ酸１１８からおよそアミノ酸２１５(ＥＵ番号付けシステム)に伸展している。
「ヒンジ領域」はヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と整合させられうる。
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常、カルボキシル末端からヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３から２３９までの伸展として定義されている。本発明に先立ち、ＦｃＲの結合には、一般に、ＩｇＧ Ｆｃ領域の低ヒンジ領域内のアミノ酸残基が寄与しているとされていた。
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも呼ばれる)は通常およそアミノ酸２３１からおよそアミノ酸３４０まで伸展する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、２つのＮ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在されている。炭水化物はドメイン-ドメイン対形成に対する代替物を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立つと推測されてきた。Burton, Molec. Immunol. 22：161-206 (1985)。
「ＣＨ３ドメイン」(「Ｈ３」ドメイン又は「Ｃ２」とも呼ばれる)は、残基Ｃ末端からＦｃ領域のＣＨ２ドメインへの伸長を含む(すなわち、およそアミノ酸残基３４１から抗体配列のＣ末端まで、典型的にはＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７)。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。模範的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介障害活性；ファゴサイトーシス；細胞表層レセプターの下方制御(例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)等を含む。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメインと結合するＦｃ領域(例えば、抗体可変ドメイン)を必要とし、例えば本明細書中に記載の種々のアッセイを使用して評価することができる。
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは二つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは例えばQuidel, San Diego, CAから市販されている。
「結合ドメイン」なる用語は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合には、結合ドメインはＦｃ領域の結合の原因であるそのポリペプチド鎖の一部(例えばそのα鎖)を含みうる。一つの有用な結合ドメインはＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
「改変された」ＦｃＲ結合親和性またはＡＤＣＣ活性を有するポリペプチド変異体を含むポリペプチドとは、親ポリペプチドもしくは天然配列Ｆｃ領域を有するポリペプチドと比較して強化または減弱化されたＦｃＲ結合活性(例えばＦｃγＲまたはＦｃＲｎ)及び／又はＡＤＣＣ活性を持つものである。
ＦｃＲに対して「亢進した結合能を示す」変異形Ｆｃは、親ポリペプチド又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃよりは高い親和性(例えば低い見かけのＫｄ値又はＩＣ５０値)を有する少なくとも一のＦｃＲを結合する。いくつかの実施態様では、親ポリペプチドと比較したときの結合の改善はおよそ３倍、好ましくはおよそ５、１０、２５、５０、６０、１００、１５０、２００、５００倍まで、またはおよそ２５％から１０００％の結合の改善である。ＦｃＲに対して「減弱した結合能を示す」ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりは弱い親和性で少なくとも一のＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較したときの結合の減弱は、およそ４０％またはそれ以上の結合の減弱であってもよい。一実施態様では、ＦｃＲに対して減弱化した結合能を示すＦｃ変異体は、ほとんどあるいは全く感知できないくらいの弱いＦｃＲへの結合能、例えば、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して０−２０％のＦｃＲ結合能、または、ここで示される実施例のような結合能しか有していない可能性がある
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)に結合した分泌型Ｉｇが細胞障害性エフェクター細胞を抗原保持標的細胞に特異的に結合させ、続いて標的細胞を細胞障害性によって標的細胞を殺傷する細胞障害性の形態を指す。抗体は細胞障害性細胞「に対するものであり」、必ず細胞の殺傷に必要である。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表3に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第5500362号又は第5821337号、又は以下の実施例に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
ヒトエフェクター細胞存在下において、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドないし親ポリペプチドよりも効果的に「抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を媒介する」または「亢進したＡＤＣＣを示す」変異形Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、アッセイに用いる野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチド(ないし親ポリペプチド)と変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドの量を実質的に同じにした場合、インビトロもしくはインビボにおいて実質的により効果的にＡＤＣＣを媒介する変異体のことである。一般にそのような変異体は、ここで開示するインビトロでのＡＤＣＣアッセイを用いる事で同定する事ができるであろう。しかし、ＡＤＣＣを測定するその他のアッセイもしくは方法(例えば、動物モデルによるアッセイ)なども考慮すべき方法である。ある実施態様では、好適な変異体は、野生型ＦｃよりもＡＤＣＣの媒介において約５倍から約１００倍、例えば約２５倍から約５０倍の有効性である。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(好適なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
変更したＦｃ領域アミノ酸配列と亢進したないしは減弱したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第6,194,551号B1及び国際公開公報99/51642に記載される。これらの特許文献の内容は、出典明記によって特別に本明細書中に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又はそれ以上のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球のことである。一実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、が含まれるが、ＰＢＭＣｓとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然の材料(例えば、ここで述べるように、血液やＰＭＢＣｓ)から単離してもよい。
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知のもの(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)並びに、以下の実施例に記載のものである。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異体を投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。一実施態様では、変異体ＩｇＧ Ｆｃを有する本発明の具体的な抗体及びポリペプチドは、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。具体的な実施態様では、ヒトＦｃＲｎに対する結合親和性はおよそ１７０倍亢進している。
ＦｃＲｎへの結合親和性について、一実施態様では、ポリペプチドのＥＣ５０又は見かけのＫｄ(ｐＨ６．０での)は、１ｕＭより小さい、より好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下である。一実施態様では、ＦｃγＲIII(Ｆ１５８；すなわち低親和性アイソタイプ)への亢進した結合親和性について、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは１０ｎＭ以下であり、ＦｃγＲIII(Ｖ１５８；高親和性アイソタイプ)について、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは３ｎＭ以下である。他の実施態様では、試験抗体とコントロール抗体の結合曲線の中間点における吸光度の値の比(例えばA450 nm(抗体)/A450 nm(コントロールAb) )が４０％以下である場合に、コントロール抗体(例えばハーセプチン(登録商標)抗体)との相対的なＦｃレセプターに対する抗体結合の減少は、コントロール抗体と有意に相関しているとみなしうる。他の実施態様では、試験抗体とコントロール抗体の結合曲線の中間点における吸光度の値の比(例えばA450 nm(抗体)/A450 nm(コントロールAb) )が１２５％以上である場合に、コントロール抗体(例えばハーセプチン(登録商標)抗体)との相対的なＦｃレセプターに対する抗体結合の増加は、コントロール抗体と有意に相関しているとみなしうる。例として実施例１６を参照。
「親ポリペプチド」又は「親抗体」は、変異体ポリペプチドないし抗体が生じるアミノ酸配列及び変異体ポリペプチドないし抗体が比較されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドないし抗体である。典型的には、親ポリペプチドないし親抗体は、ここに開示した一又は複数のＦｃ領域修飾を欠き、ここに開示したポリペプチド変異体と比較してエフェクター機能が異なる。親ポリペプチドは天然配列のＦｃ領域又は(例えば付加、欠失及び／又は置換のような)本来存在するアミノ酸配列の修飾を有するＦｃ領域を含みうる。
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した２つの部分を持つポリペプチドを指す。ほとんどの実施態様では、各部位は、典型的には天然では互いに結合しないポリペプチド配列であり、及び／又は異なる特性を有する。この特性は、例えばインビトロまたはインビボ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象分子との結合、反応の触媒などかもしれない。この２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを介して結合していてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。
「単離された」抗体ないしポリペプチドは、それが産生される環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。一実施態様においては、抗体ないしポリペプチドは、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％の抗体より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体ないしポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツの抗体ないしポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ポリペプチドコード化核酸ないし他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドコード化核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在する特定のポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色***置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるポリペプチドコード化核酸分子を含む。
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「ベクター」はシャトルおよび発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドコンストラクトも複製起源(例として、ＣｏｌＥ１複製起源)および選択マーカー(例として、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性)をそれぞれ細菌内のプラスミドの複製および選択を目的として含むであろう。「発現ベクター」は必要なコントロール配列または本発明の抗体断片を含む抗体の発現の調節因子を細菌または真核細胞内で含むベクターを表す。好適なベクターは以下に示す。
本発明のＢＲ３結合抗体を産生する細胞には、抗体をコードする核酸が導入されている細菌細胞及び真核細胞が含まれるであろう。好適な宿主細胞を以下に開示する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 1995)を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度なストリンジェンシー条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；(２)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ***ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液中で終夜ハイブリダイゼーションして、４２℃の０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中にて１０分間洗浄し、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を１０分間行うものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ)の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でフィルターを洗浄するといった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは理解されるであろう。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。エピトープタグ化された本発明の抗体及びポリペプチドが包含される。
本発明の抗ＢＲ３ポリペプチドないし抗体に関して「生物学的に活性」及び「生物学的な活性」及び「生物学的な特徴」とは、抗体ないしポリペプチドがＢＲ３を結合することを意味する。ある好適な実施態様では、抗体はヒトＢＲ３ポリペプチドを結合する。
更なる実施態様では、本発明の抗ＢＲ３ポリペプチドないし抗体は、以下の何れか一、何れかの組合せ又はすべての活性も有する：(１) ５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(２) ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でげっ歯動物のＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(３) ヒトＢＡＦＦへのヒトＢＲ３の結合を阻害する。抗体の望ましい使用に応じて、さらに、抗体は以下の何れか一の活性を含みうる：(１) 野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞性障害(ＡＤＣＣ)を有する；(２) 野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを亢進している；又は(３) 野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを減弱している。他の実施態様では、本発明の抗体は、野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドないし親ポリペプチドよりも高い親和性でヒトＦｃ新生児レセプター(ＦｃＲｎ)を結合する。
本発明のアンタゴニスト抗ＢＲ３ポリペプチドないし抗体に関して「生物学的に活性」及び「生物学的な活性」及び「生物学的な特徴」とは、抗体ないしポリペプチドが以下の何れか一、何れかの組合せ又はすべての活性を有することを意味する：(１) Ｂ細胞増殖を抑制する；(２) Ｂ細胞生存を抑制する；(３) インビボのＢ細胞を殺傷又は枯渇する。一実施態様では、このような抗ＢＲ３抗体ないしポリペプチドで処理されていない適当なネガティブコントロール又は基準レベルと比較した場合にＢ細胞の枯渇が少なくとも２０％である。他の実施態様では、アンタゴニスト抗体は、野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞性障害(ＡＤＣＣ)を有するか、野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを亢進している。
本発明のアゴニスト抗ＢＲ３ポリペプチドないし抗体に関して「生物学的に活性」及び「生物学的な活性」及び「生物学的な特徴」とは、抗体ないしポリペプチドが以下の何れか一、又は両方の活性を有することを意味する：(１) Ｂ細胞増殖を刺激する；(２) Ｂ細胞生存を刺激する。一実施態様では、アゴニスト抗体は、野生型ないし天然配列のＩｇＧ Ｆｃと比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを減弱している。
本明細書中で具体的に開示されるアミノ酸配列は、特に定めない限り、近接するアミノ酸配列である。
本明細書中に記載した本発明のポリペプチドの変異は、例えば、保存的及び非保存的な変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果としてポリペプチドのアミノ酸配列の変化を生じる、ポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンへの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化により、結果として生じるペプチドのアミノ酸構造又は機能が最小限に変化する。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。一般に、グループ内での置換は、構造及び機能に関して保存的であるとみなす。しかしながら、特定の残基の役割はそれが存在している分子の３次元構造を背景に決定されることを当業者は認識しているであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は、還元された(チオール)形態よりも極性の低い酸化された(ジスルフィド)形態に存在する。Arg側鎖の長い脂肪性部位は、その構造的又は機能的役割の重大な特徴を構成し、これは他の塩基性残基よりも非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族のグループ(Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ)を含む側鎖は、イオン性-芳香族又は「カチオン-π」相互作用に関与しうることが認識されるであろう。これらの場合、酸性又は荷電していない極性のグループのメンバーを有するこれら側鎖の１つの置換は、構造又は機能に関して保存的でありうる。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓ(ジスルフィド形態)のような残基は、主鎖の高次構造に直接的な影響力を有し、構造上の変形なしに置換されないことがある。
保存的置換には、側鎖の類似性に基づいた以下の具体的な置換と以下に列挙した例示的置換と好ましい置換が含まれる。アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(１) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(２) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(３) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(４) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(１) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(２) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(３) 酸性：Asp, Glu；
(４) 塩基性：His, Lys, Arg；
(５) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(６) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
表１
Figure 2008526205
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入され得る。
本発明の範囲内で用語「アミノ酸」とは、その最も広い意味で使用され、天然発生Ｌ α−アミノ酸または残基を意味する。天然発生アミノ酸に一般的に使用されている１文字及び３文字の略号がここでも使用される(Lehninger, A. L., Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92 (1975), Worth Publishers, New York)。この用語はＤ-アミノ酸並びにアミノ酸類似物などの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に組み込まれない天然発生アミノ酸、及びこの分野でアミノ酸の特徴であると知られた特性を持つ化学合成された化合物を含む。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同様のペプチド化合物のコンホメーション的制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物は、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物は、ここで、アミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、Roberts及びVellaccio (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology), Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に列挙されており、この文献を参考文献として本明細書に包含する。
本明細書に記載する標準固相合成技術により合成されたペプチドは、例えば、アミノ酸に関する置換を行う遺伝子によってコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝コードによってコードされていない一般的なアミノ酸には、例えば、国際公開WO 90/01940に記載のもの、並びに、例えばGlu及びAspの２−アミノアビジン酸(Aad)；Glu及びAspの２−アミノピメリン酸(Apm)；Met、Leu及びその他脂肪族アミノ酸の２−アミノブチル(Abu)酸；Met、Leu及びその他脂肪族アミノ酸の２−アミノヘプタン酸(Ahe)；Glyの２−アミノイソ酪酸(Aib)；Val、及びLeu及びIleのシクロヘクシルアラニン(Cha)；Arg及びLysのホモアルギニン(Har)；Lys、Arg及びHisの２，３−二アミノプロピオン酸(Dpr)；Gly、Pro、及びAlaのＮ−エチルグリシン(EtGly)；Gly、Pro、及びAlaのＮ−エチルグリシン(EtGly)；Asn、及びGlnのＮ−エチルアスパラギン(EtAsn)；Lysのヒドロキシリジン(Hyl)；Lysのアロヒドロキシリジン(AHyl)；Pro、Ser、及びThrの３−(及び４)ヒドロキシプロリン(3Hyp、４Hyp)；Ile、Leu、及びValのアロ−イソロイシン(AIle)；Alaのアミジノフェニルアラニン；Gly、Pro、及びAlaのＮ−メチルグリシン(MeGly、サルコシン)；IleのＮ−メチルイソロイシン(MeIle)；Met及びその他脂肪族のアミノ酸のノルバリン(Nva)；Met及びその他脂肪族のアミノ酸のノルロイシン(Nle)；Lys、Arg及びHisのオルニチン(Orn又はOr)；Thr、Asn及びGlnのシトルリン(Cit)及びメチオニンスルホキシド(MSO)；Pheの−メチルフェニルアラニン(MePhe)、トリメチルフェニルアラニン、ハロ(F、Cl、Br、及びI)フェニルアラニン、トリflourylフェニルアラニンが含まれる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)；Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。更に、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
「検出する」という用語は、分子の有無又は分子の定性的及び定量的量を測定することを包含することを意図する。ゆえに、この用語は、量的及び質的測定のための本発明の材料、組成物及び方法の使用を意味する。一般的に、検出のために使用される特定の技術は本発明の実施のうえで重要ではない。
例えば、本発明の「検出」には、分子の有無、ポリペプチドを発現する細胞数、標的に結合した分子又は分子に結合した標的の量又は分子レベルの変化；分子の生物学的機能／活性の変化(例えば、リガンド又はレセプター結合活性、細胞内シグナル伝達(ＮＦ-ｋＢ活性化など)、腫瘍細胞増殖、Ｂ細胞増殖ないし生存など)を、例えば当分野で公知の方法を用いるなどして検出することが含まれうる。いくつかの実施態様では、「検出する」には、野生型分子(例えばｍＲＮＡやポリペプチドレベル)のレベルを検出することが含まれる。検出には、コントロールと比較して、１０％から９０％の何れかの値、又は３０％から６０％の何れかの値、又は１００％以上の変化(亢進又は減弱)を数量化することが含まれうる。検出には、２倍から１０倍のいずれかの値、包括的にはそれ以上、例えば１００倍の変化を数量化することが含まれうる。したがって、例えば、ＢＲ３分子を指す用語はそのｍＲＮＡ又はタンパク質などを意味する。
本明細書中で用いる「ＢＲ３分子」は、ＢＲ３ポリペプチド；ＢＲ３ポリペプチドをコードする核酸分子；並びにポリペプチド又は核酸分子のアイソフォーム、断片、アナログ(類似体)又は変異体と実質的に同一な分子を意味する。例えば、ＢＲ３分子には、哺乳動物に由来するＢＲ３ポリペプチドのアイソフォーム、断片、アナログ又は変異体が含まれ、ＢＲ３分子はＢＡＦＦを結合する能力を有する。
本明細書中で用いる「ＢＡＦＦ分子」は、ＢＡＦＦポリペプチド；ＢＡＦＦポリペプチドをコードする核酸分子；並びにポリペプチド又は核酸分子のアイソフォーム、断片、アナログ(類似体)又は変異体と実質的に同一な分子を意味する。例えば、ＢＡＦＦ分子には、哺乳動物に由来するＢＡＦＦポリペプチドのアイソフォーム、断片、アナログ又は変異体が含まれ、ＢＡＦＦ分子はＢＲ３を結合する能力を有する。
本明細書中で用いる処置される被検体は哺乳動物(例えばヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど)である。被検体は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などであってもよい。被検体は、癌ないし免疫系疾患に罹ることが予測されるか、罹るリスクを有する、癌ないし免疫系疾患と診断された、あるいは、癌を持たないことが確認されているコントロール被検体でありうる。癌ないし免疫系疾患の多くの診断方法及び癌ないし免疫系疾患の臨床像は当分野で公知である。ある好適な実施態様では、本発明の処置される被検体はヒトである。
「治療すること」または「処置」または「寛解」は、この目的は標的とした病態または疾患を予防または衰退(減少)するか、ないしは疾患の症状をいくらか軽減することである。処置を必要とするものには、既に疾患を有するもの並びに疾患に罹りやすいもの、又は予防すべき疾患を有するものが含まれる。本発明のポリペプチドないし抗体の治療的有効量を取り込んだ後、患者が以下の項目の一又は複数において観察可能及び／又は測定可能な程度の減少を示すか、消失を示す：癌細胞数の減少または癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟組織及び骨への癌の播種を含む、周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害(すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止)；腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止)；ある程度の腫瘍成長の阻害；および／または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の軽減；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。本発明のポリペプチドが成長を阻害する及び／又は、存在する癌細胞を殺傷することができる点で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞障害性であるといえる。また、兆候又は症状の減少は患者が感じるものでもよい。
「治療的有効量」という用語は、被検体の疾患又は疾病を「寛解」又は「治療」するのに効果的な本発明の抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺臓器への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。薬剤が存在する癌細胞の成長を阻害するおよび／または癌細胞を殺傷する点において、細胞増殖抑制性および／または細胞障害性であるといえる。
「慢性」投与は、長期間初期治療効果(活性)を維持するために、急性の状態とは対照的に連続的状態での薬剤投与を表す。「間欠的」投与は中断せずに継続して行わずむしろ自然的周期で行う治療である。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列(即ち「異種」)と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。例えば、本発明に有用なイムノアドヘシンは、ポリペプチドのＢＡＦＦ結合部位又はポリペプチドのＢＲ３結合部位(例えば、ＴＡＣＩレセプター細胞外ドメイン-Ｆｃ又はＢＣＭＡ細胞外ドメイン-Ｆｃ又はＢＲ３細胞外ドメイン-Ｆｃ、Ｆｃ領域に融合した膜貫通配列又は細胞質配列を除くＢＡＦＦレセプターの一部)を含んでなるポリペプチドでありうる。一実施態様では、本発明のポリペプチド配列はイムノグロブリン配列の定常ドメインに融合している。
「免疫不全性疾患」は、免疫応答が減少する疾患又は症状(例えば、重症複合免疫不全症(ＳＣＩＤ)-Ｘ染色体連鎖、ＳＣＩＤ-常染色体の、アデノシンデアミナーゼ欠損(ＡＤＡ欠損症)、Ｘ染色体連鎖の無γグロブリン血症(ＸＬＡ)、ブラットン病、先天性無γグロブリン血症、Ｘ染色体連鎖幼児の無γグロブリン血症、後天性無γグロブリン血症、成人発症無γグロブリン血症、遅発性無γグロブリン血症、異常γグロブリン血症、低γグロブリン血症、乳児期の一過性低γグロブリン血症、詳細不明の低γグロブリン血症、無γグロブリン血症、一般的な可変性免疫不全症(ＣＶＩＤ)(後天性)、ウィスコット-オールドリッチ症候群(ＷＡＳ)、過剰ＩｇＭを有するＸ染色体連鎖免疫不全症、過剰ＩｇＭを有する非Ｘ染色体連鎖免疫不全症、選択的なＩｇＡ欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症(ＩｇＡ欠損の有無にかかわらず)、通常であるか高い免疫グロブリンを有する抗体欠損症、胸腺腫を有する免疫不全症、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖性疾患(ＢＬＰＤ)、選択的なＩｇＭ免疫不全症、劣性無γグロブリン血症(スイスタイプ)、細網異形成症、新生児期好中球減少症、重症先天性白血球減少症、免疫不全を有する胸腺リンパ形成不全症-形成不全又は形成異常、運動失調-毛細管拡張症毛細管拡張症(小脳性運動失調、眼皮膚の毛細管拡張症及び免疫不全)、短い手足の低身長症、Ｘ染色体連鎖リンパ組織増殖性症候群(ＸＬＰ)、免疫グロブリンを有するネゼロフ症候群混合性免疫不全(Nezelof syndrome-cumbined immunodeficiency with Igs)、ないしは、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症(ＰＮＰ)、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症(裸リンパ球症候群)及び重症複合免疫欠損症)、免疫不全に関連する症状、ヤヌス関連キナーゼ３(ＪＡＫ３)欠損症、ディジョージ症候群(単離性Ｔ細胞欠損症)及び関連の症候群、例えば、ダウン症候群、慢性皮膚粘膜カンジダ症、過剰ＩｇＥ徴候、慢性肉芽腫症、部分的な白化およびＷＨＩＭ症候群(疣、低γグロブリン血症、感染、及びmyelokathexis[過剰細胞性髄中の白血球の保持])である。
本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性動脈周囲炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間隙肺線維形成、割込み肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性***性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗***抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、
心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
ここで用いる「Ｂ細胞枯渇」は、処置前のＢ細胞レベルと比較して薬剤または抗体処置後に動物またはヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを表す。Ｂ細胞レベルは、実験的実施例に示した方法などの公知のアッセイを用いて測定可能である。Ｂ細胞枯渇は完全または部分的なものであり得る。一実施態様では、ＢＲ３発現Ｂ細胞の枯渇は少なくとも２５％である。何れか一のメカニズムに限定されるものではなく、Ｂ細胞枯渇の考えられうるメカニズムには、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、カルシウム流動の調整又は前述の２以上の組合せが含まれる。
本明細書中の「Ｂ細胞表面マーカ」又は「Ｂ細胞表面抗原」はＢ細胞表面上に発現される抗原である。
「Ｂ細胞枯渇薬剤」は、末梢のＢ細胞を少なくとも２５％減少する薬剤を指す。他の実施態様では、末梢のＢ細胞の枯渇は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である。ある好適な実施態様では、Ｂ細胞枯渇薬剤は白血球に特異的に結合し、他の細胞型には結合しない。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇薬剤はＢ細胞に特異的に結合して、他の細胞型には結合しない。ある実施態様では、Ｂ細胞枯渇薬剤は抗体である。ある好適な実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体は化学療法剤又は細胞障害性剤にコンジュゲートしている。Ｂ細胞枯渇薬剤の具体的な例には、限定するものではないが、前述の抗ＣＤ２０抗体が含まれる。
Ｂ細胞悪性腫瘍には、リンパ球支配的ホジキン病(ＬＰＨＤ)を含むホジキン病；非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；濾胞性中心細胞(ＦＣＣ)リンパ腫；急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；毛様細胞白血病及びＢＲ３陽性腫瘍が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、軽度の／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ、中程度の／濾胞性ＮＨＬ、中程度の拡散性ＮＨＬ、重度の免疫芽細胞ＮＨＬ、重度のリンパ芽球ＮＨＬ、重度の非正円形細胞でない小細胞性ＮＨＬ、バルキー疾患(bulky disease)性ＮＨＬ、形質細胞様リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。これら癌再発の治療も包含する。ＬＰＨＤは、放射線照射や化学療法にも関わらずたびたび再発するホジキン疾患のタイプであえ、ＢＲ３陽性悪性腫瘍細胞に特徴があるものである。ＣＬＬは白血病の主要な４タイプのうちの一つである。リンパ球と呼称される成熟したＢ細胞の癌であるＣＬＬは、血液、骨髄およびリンパ系組織での細胞の蓄積によって確認される。無痛性リンパ腫は、低成長性で難治性であり、多くの緩解と再発を繰り返して患者の平均生存率は６〜１０年となる。
本明細書で使用する「非ホジキンリンパ腫」又は「ＮＨＬ」という用語は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を意味する。通常、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とは、ホジキンリンパ腫にはリードシュテルンベルク細胞が存在し、非ホジキンリンパ腫には前記細胞が不在であることにより区別することができる。本明細書で使用する用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例は、従来技術に既知の分類方式、例えばColor Atlas of Clinical Hematology第３版; A. Victor Hoffbrand及びJohn E. Pettit(編)(Harcourt Publishers Limited 2000)(特に図11.57、11.58及び／又は11.59参照)に記載の改訂版European-American Lymphoma (REAL)方式に従って当業者(腫瘍学者または病理学者)によって認識されるあらゆるものを含む。より具体的な例としては、限定するものではないが、再発性又は抵抗性ＮＨＬ、前線低悪性度ＮＨＬ、第III／IV期ＮＨＬ、化学療法に抵抗性のＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び／又は前リンパ球性白血病及び／又は小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、immunocytoma及び／又はリンパ形質細胞性リンパ腫、周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、脾周辺帯リンパ腫、結節外周辺帯−ＭＡＬＴリンパ腫、結節周辺帯リンパ腫、有毛細胞白血病、プラズマ細胞腫及び／又は形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞性中心リンパ腫(濾胞性)、中悪性度拡散性ＮＨＬ、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度ＮＨＬ(高悪性度前線ＮＨＬ及び高悪性度再発性ＮＨＬを含む)、自己幹細胞移植後の又は自己肝細胞移植に抵抗性のＮＨＬ再発、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体(周辺性)Ｔ細胞リンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫及び／又は白血病、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病及び／又は前リンパ球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／又はセザリー症候群、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞(鼻腔型)リンパ腫、超疾患型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、皮膚(皮膚性)リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管動原体リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞(特に断らない限り)リンパ腫及び血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む)、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌(胃腸癌を含む)、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌及び様々なタイプの頭部及び頸部の癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ；中級／濾胞性ＮＨＬ；中級びまん性ＮＨＬ；高級免疫芽細胞性ＮＨＬ；高級リンパ芽球性ＮＨＬ；高級小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；外套細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む)；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)を含む。ある好適な実施態様では、癌はＢＲ３ポリペプチドをその表面に発現する腫瘍(ＢＲ３陽性(ポジティブ))を含む。他の実施態様では、ＢＲ３発現癌はＣＬＬ癌である。
具体的な実施態様では、本発明の抗ＢＲ３抗体ないしポリペプチドは、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)、ろ胞性リンパ腫、これれは非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)の種類である、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、ループス腎炎を含む全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎及び多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患の何れか一ないし複数を治療するために用いられる。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｂｉ２１３、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、及び小分子毒素などの毒素、又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含むものを含むことを意図する。ある実施態様では、細胞障害性剤は内部移行することができる。他の実施態様では、細胞障害性剤の活性部位は１１００ｋＤ以下である。ある実施態様では、化学療法剤は、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び小分子毒素などの毒素、又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、例えばモノメチルオーリスタチン(ＭＭＡＥ)、その断片及び／又は変異体を含むもの、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤又は成長阻害剤からなる群から選択される。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む)；エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、FEMARA(登録商標)レトロゾールおよびARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ-ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ-Ｒａｓ；ＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビターなどのリボザイム；遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン)；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)rmRH並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞の成長をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期の細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)パクリタキセル、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止するこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「細胞死を誘発」する抗体は、生存している細胞を生存不能とさせるものである。該細胞は一般に、抗体が結合する抗原を発現するもので、特に該細胞は該抗原を過剰発現する。好ましくは細胞は癌細胞、例えば***、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。インビトロでの細胞死は、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)又は補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)により誘発される細胞死と区別される。よって、細胞死に対するアッセイは、熱不活性化血清(すなわち補体の不在下)を使用し、免疫エフェクター細胞の不在下で行うことができる。抗体が細胞死を誘発可能であるか否かを決定するために、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)、トリパンブルー(Mooreら, Cytotechnology 17:1-11(1995)を参照)又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜インテグリティの損失を未処理細胞と比較して評価される。
「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化及び／又は膜小胞(アポトーシス体と称する)の形成によって測定されるプログラムされた細胞死を誘発するものである。細胞は、抗体が結合する抗原を過剰発現するものであり、抗原を過剰発現するものであってもよい。細胞は、腫瘍細胞、例として***、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱の細胞である。インビトロでは、細胞は、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でもよい。アポトーシスを伴う細胞性現象を評価するために様々な方法が有用である。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転座は、アネキシン結合によって測定することができる；本明細書中の実施例に開示されるように、ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダリングで評価することができる；そして、ＤＮＡ断片化とともに核／クロマチン凝集は、低二倍体細胞における任意の増加によって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて無処置の細胞と比較してアネキシン結合の誘導が約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍及び最も好ましくは約１０〜５０倍誘導されるものである。
アポトーシスを誘導する抗体の例には、抗ＤＲ５抗体３Ｆ１ １.３９.７(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２４５６)；３Ｈ３.１４.５(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２５３４)；３Ｄ５.１.１０(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２５３６)；及び、３Ｈ３.１４.５(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２５３４)、そのヒト化及び／又は親和性成熟変異体を含む；ヒト抗ＤＲ５レセプター抗体１６Ｅ２及び２０Ｅ６、その親和性成熟変異体を含む(国際公開公報98/51793、出典明記により特別に本明細書中に組み込まれる)；抗ＤＲ４抗体４Ｅ７.２４.３(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２４５４)；４Ｈ６.１７.８(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２４５５)；１Ｈ５.２５.９(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２６９５)；４Ｇ７.１８.８(ＡＴＣＣ ＰＴＡ-９９)；及び、５ＧＩ １.１７.１(ＡＴＣＣ ＨＢ-１２６９４)、そのヒト化及び／又は親和性成熟変異体を含む；が含まれる。
対象とする抗体に結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, eds. Harlow and Lane (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)に記載のような慣例的な交差ブロックアッセイを行うことができる。
「抱合(コンジュゲート)」は、融合タンパク質、並びにアミノ酸ないしタンパク質部位と非タンパク質部位の両方を含む分子を含む任意のハイブリッド分子(例えば、毒素-抗体コンジュゲート又はペグ化-抗体コンジュゲート)を意味する。抱合は、例えば組み換えＤＮＡ技術、固相合成法、液層合成法、有機化学的合成技術またはこれら技術を組み合わせるなどの、当分野の公知の様々な技術により合成又は操作してもよい。生成する特定の分子に応じて合成法を選択するであろう。例えば、天然では完全な「タンパク質」ではないハイブリッド分子は、組み換え技術と液層合成法を組み合わせて合成してもよい。
ある実施態様では、例えば米国特許第5739277号に記載のように、コンジュゲートは、サルベージレセプター結合エピトープ(特に抗体断片)に結合した所望の抗体ないしポリペプチドである。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させるために有用なＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する(例えば、Ghetie, Vら., (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１)。
他の実施態様では、コンジュゲートは、血清アルブミンないしＦｃＲｎレセプターに結合する血清アルブミンの一部、又は血清アルブミン結合ペプチド又は非タンパク質ポリマー(例えばポリエチレングリコール分子)に(特に抗体断片を)結合することによって形成することができる。例としてこのようなポリペプチド配列は国際公開公報01/45746に開示されている。一実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLWを含む。他の実施態様では、本発明によるＦａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
ここで使用される「標識」なる語句は、抗体に直接的に又は間接的に抱合した検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
Ａ．本発明の組成物及び方法
本発明は、ヒトＢＲ３、場合によっては、同様に他の霊長類のＢＲ３を結合する抗体を提供する。ある実施態様では、Ｈ鎖は、非ヒト種抗ヒトＢＲ３抗体(ドナー抗体)の少なくとも１、２又はすべてのＨ鎖ＣＤＲと、レシピエント抗体としてヒトコンセンサス抗体のフレームワーク残基の実質的にすべてを有する。ドナー抗体は、様々な非ヒト種、例えばマウス、ラット、モルモット、ヤギ、ウサギ、ウマ、霊長類由来のものでありうるが、典型的にはマウスの抗体である。ここでの「実質的にすべて」とは、ヒト化抗体のレシピエントＦＲ領域がヒトコンセンサスＦＲ配列に元もと存在しない一ないし複数のアミノ酸置換を含んでいてもよいことを意味する。これらのＦＲ変化は、レシピエントないしドナーの抗体にみられない残基を含有してもよい。
ある実施態様では、ドナー抗体はマウス９.１抗体であり、ＣＤＲを含むＶ領域とそのＶＨ及びＶＬ鎖のそれぞれのＦＲ配列は配列番号１９と配列番号２０に示す。ある実施態様では、ヒトＦａｂフレームワークの残基は、ヒトＶκサブグループI及びＶＨサブグループIIIのコンセンサス配列に対応するか、由来する。ある実施態様では、本発明のヒト化ＢＲ３抗体は、マウスドナー抗体のＨ鎖内に少なくとも一のＣＤＲを有する。ある実施態様では、ヒトＢＲ３を結合するヒト化ＢＲ３抗体は、ドナー抗体のＨ鎖の重鎖ＣＤＲを含有する。
完全長抗体では、本発明のヒト化ＢＲ３結合抗体は、ヒトイムノグロブリンのＣドメインに結合するＶドメイン、例えば配列番号１３２を含有する。好適な実施態様では、Ｈ鎖Ｃ領域はヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ３由来である。ある実施態様では、Ｌ鎖Ｃドメインはヒトκ鎖由来である。他の実施態様では、完全長ＢＲ３結合抗体のＦｃ配列は配列番号１３４であり、ＸはＮ、Ａ、Ｙ、Ｆ及びＨからなる群から選択されるものである。
ＢＲ３結合抗体は少なくともヒトＢＲ３を結合するであろう。ある実施態様では、ＢＲ３結合抗体は、他の霊長類ＢＲ３、例えばカニクイザル及びアカゲザルを含むサルやチンパンジーのＢＲ３を結合するであろう。他の実施態様では、ＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドは齧歯類のＢＲ３タンパク質及びヒトＢＲ３タンパク質を結合する。他の実施態様では、ＢＲ３ポリペプチドはマウスＢＲ３ポリペプチド配列とヒトＢＲ３ポリペプチド配列を結合する。
他の実施態様では、アンタゴニストＢＲ３結合抗体の生物学的活性は、(１) ５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(２) ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でマウスＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(３) 残基Ｆ２５、Ｖ３３及びＡ３４を含有するヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有する、このときのモノクローナル抗体が；(４) ヒトＢＡＦＦ及びヒトＢＲ３結合を阻害する；(５) ヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞性障害(ＡＤＣＣ)を有するか、ヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを亢進している；(６) 野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドないしは親ポリペプチドよりも高い親和性でヒトＦｃ新生児レセプター(ＦｃＲｎ)を結合する；(９) このような抗体で処理されていない適当なネガティブコントロール又は基準レベルと比較して好ましくは少なくとも２０％インビボ又はインビトロのＢ細胞を殺傷又は枯渇する；(１０) インビトロ又はインビボのＢ細胞増殖を阻害する；及び(１１) インビトロ又はインビボのＢ細胞生存を阻害する：からなる群から選択される何れか一、何れかの組合せ又はすべての活性である。本発明のポリペプチドないし抗体のある実施態様では、さらに、機能的エピトープは残基Ｒ３０を含有する。本発明の更なる他の実施態様では、さらに、機能的エピトープは残基Ｌ２８及びＶ２９を含有する。
一実施態様では、Ｂ細胞表面抗原に結合しないコントロール抗体による処置と比較して、又は処置前の基準レベルと比較して、ｍＩｇＧ２ＡのＦｃ領域に融合する本発明の抗体の可変ドメインは、マウスの以下の何れか一、何れかの組合せ又はすべての細胞集団中のＢ細胞の少なくとも２０％を枯渇しうる：(１) 血液Ｂ細胞、(２) リンパ節Ｂ細胞、(３) 脾臓濾胞性Ｂ細胞、(４) 脾臓周辺帯Ｂ細胞。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上である。ある好適な実施態様では、枯渇は抗体で処理してから１５日後に測定する。他の好適な実施態様では、枯渇アッセイは本明細書中の実施例１８又は１９に記載のように行う。他の好適な実施態様では、枯渇は処置の１５日後のマウス中の末梢Ｂ細胞の集団を測定する。
他の実施態様では、本発明のアゴニストＢＲ３結合抗体の生物学的活性は、(１) ５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値でヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合する；(２) 残基Ｆ２５、Ｖ３３及びＡ３４を含有するを含有するヒトＢＲ３に機能的なエピトープを有する、このときモノクローナル抗体は９.１抗体や２.１抗体ではない；(３) インビトロでＢ細胞増殖や生存を刺激する；(４) ヒトＢＡＦＦ及びヒトＢＲ３結合を阻害する；(５) インビボでＢ細胞増殖や生存を刺激する；(６) 野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドないしは親ポリペプチドよりも高い親和性でヒトＦｃ新生児レセプター(ＦｃＲｎ)を結合する：からなる群から選択される何れか一、何れかの組合せ又はすべての活性である。
Ｂ細胞枯渇の所望のレベルは疾患に依存するであろう。ＢＲ３陽性癌の治療では、本発明の抗ＢＲ３抗体及びポリペプチドの標的であるＢ細胞の枯渇を最大限にすることが望まれうる。したがって、ＢＲ３陽性Ｂ細胞腫瘍の治療では、Ｂ細胞枯渇が、例えば腫瘍成長(大きさ)、癌細胞型の増殖、転移、他の兆候及び特定の癌の症状をモニタリングすることによって、当分野の技術者によって評価されうる疾患の進行を少なくとも予防するために十分であることが望ましい。ある好適な実施態様では、Ｂ細胞枯渇は、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、さらにより好ましくは４か月、より好ましくは５か月、さらにより好ましくは６か月以上の間、疾患の進行を予防するために十分である。さらにより好適な実施態様では、Ｂ細胞枯渇は、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、さらにより好ましくは５年以上、寛解期を増やすために十分である。最も好適な実施態様では、Ｂ細胞枯渇は、疾患を治癒するために十分である。好適な実施態様では、癌患者のＢ細胞枯渇は、治療前の基準レベルの少なくともおよそ７５％、及びより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％及びさらに１００％である。
自己免疫性疾患の治療では、ＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドの用量を調整することによって、個々の患者の症状の重症度及び／又は疾患に応じてＢ細胞枯渇の程度を調節することが望ましい。したがって、Ｂ細胞枯渇は完全でなくてはならないことはない。総Ｂ細胞枯渇は、その後の処置でなく初回処置において望まれるが、用量を調節して部分的な枯渇のみを達成するようにしてもよい。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％、すなわち処置前の基準レベルと比較してＢＲ３陽性Ｂ細胞の８０％以下が残っている。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上である。ある好適な実施態様では、Ｂ細胞枯渇は疾患の進行を中断するため、より好ましくは治療下にある特定の疾患の兆候及び症状を寛解するため、さらにより好ましくは疾患を治癒するために十分である。
また、本発明は、抗体の一アームが本発明のＢＲ３結合抗体のヒト化Ｈ鎖及びＬ鎖を有し、他のアームが第二抗原に対してＶ領域結合特異性を有する、二特異性ＢＲ３結合抗体を提供する。具体的な実施態様では、第二抗原は、ＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ又は他のＮＫ活性化リガンドからなる群から選択されるものである。
抗ＢＲ３抗体の適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な交差を防いでもよい。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特にこの場合、抗体はＦｖ断片などの抗体断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＢＲ３の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗ＢＲ３抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗ＢＲ３抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能***差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第5739277号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを表す。
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に)、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。例えば、ＢＲ３を結合する抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイでのＢＲ３への結合、又はより好ましくは、細胞(例えばＢＪＡＢ細胞株)の表面上に発現されるＢＲ３への結合によって選択することができる。例として実施例５を参照のこと。
本発明の抗ＢＲ３抗体の成長阻害効果は、実施例又は当業者に知られた方法、例として、ＢＲ３遺伝子を内因性または形質移入してＢＲ３を発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、ある好適な実施態様では、ＢＲ３を発現する一次Ｂ細胞を増殖アッセイ及び生存アッセイに用いることができる(例えば実施例７)。他の例では、腫瘍細胞株およびＢＲ３形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗ＢＲ３モノクローナル抗体で２、３(例として２−７)日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはＭＴＴで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗ＢＲ３抗体存在または非存在下にて処理した細胞による３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、ＤＮＡ内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性対照とする。
細胞死を誘導する抗体を選択するために、プロピジウムヨウ素化物(ＰＩ)、トリファンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みなどにより表される膜の完全性の欠損を対照と相対的に評価した。補体および免疫エフェクター細胞非存在下でＰＩ取り込みアッセイを行う。ＢＲ３発現腫瘍細胞を単独培地または例として約１０μｇ／ｍｌの適当なモノクローナル抗体を含む培地で培養する。それぞれの処理後、細胞を洗浄して、細胞塊を除去するために３５ｍｍ濾過器をかぶせた１２×７５チューブ(１チューブ当たり１ｍｌ、各処理群につき３チューブ)に分注する。その後、ＰＩ(１０μｇ／ｍｌ)をチューブに加える。試料をFACSCANＴＭフローサイトメーターおよびFACSCONVERTＴＭCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析しうる。ＰＩ取り込みにより決定されるような統計学上有意なレベルの細胞死を引き起こす抗体を細胞死誘導抗体として選択しうる。
対象の抗体により結合されるＢＲ３上のエピトープに結合する抗体を検索するために、例としてAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に示されているように平凡なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗ＢＲ３抗体として同じ部位に結合するかエピトープに結合するかを決定するのに用いられる。代わりにまたは加えて、エピトープマッピングはこの分野でよく知られた方法によって行うことができる。例えば、接触する残基を同定するためにアラニンスキャニングによるように抗体の配列に突然変異が誘発される。変異した抗体は確実にフォールディングされるように初めにポリクローナル抗体との結合を試験する。異なる方法では、ＢＲ３の異なる領域に一致するペプチドを用いて、試験抗体の競合アッセイ、または試験抗体と特徴のあるまたは既知のエピトープを持つ抗体の競合アッセイを行うことができる。
具体的な抗ＢＲ３抗体の例
本発明の抗体は、具体的に、表２(下記)に開示される何れか一の抗体の可変重鎖配列を含んでなる抗体と、ハイブリドーマ細胞によって産生されないそのＢＲ３結合断片を包含する。本発明の抗体は、具体的には、配列番号４−１３、１５−１８、２２、２４、２６−７３、７５−７６、７８、８０−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６−１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６及び１２７の何れか一の配列を含有する可変重鎖配列を含んでなる抗体と、そのＢＲ３結合断片を包含する。更なる実施態様では、本発明の抗体は、表２に開示される何れか一の抗体の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域配列を含んでなる抗体と、そのＢＲ３結合断片を包含する。一実施態様では、抗体はさらに、排列番号１３４の配列を含有するＦｃ領域を含んでなり、Ｘは、Ｎ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｆ及びＨからなる群から選択されるアミノ酸である。他の実施態様では、抗体は、配列番号７６又は配列番号１３１の配列を含んでなり、Ｘは、Ｎ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｆ及びＨからなる群から選択されるアミノ酸である。
表２ 抗体配列の例
Figure 2008526205
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本発明の抗体は、配列番号４−１３、１５−１８、２２、２４、２６−７３、７５−７６、７８、８０−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６−１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６及び１２７の何れか一の配列のＨ３配列に、少なくともおよそ７０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性があるＨ３配列を有するＢＲ３結合抗体と、これら抗体のＢＲ３結合断片が包含される。
本発明の抗体は、図に記載の何れか一の抗体配列の下線部又は配列表に記載の高頻度可変領域のＣＤＲに、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性があるＨ１、Ｈ２及びＨ３配列を有するＢＲ３結合抗体が包含される。
本発明の抗体は、図に記載の何れか一の抗体配列の下線部又は配列表に記載の高頻度可変領域ないしはＣＤＲに、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性があるＬ１、Ｌ２及びＬ３配列を有するＢＲ３結合抗体が包含される。
本発明の抗体は、表２の何れか一の抗体のＶＨドメインに、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するＶＨドメインを有するＢＲ３結合抗体が包含される。
本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生されていない表２に記載の抗体配列の重鎖ＣＤＲ３配列を含んでなる任意のＢＲ３結合抗体を包含する。本発明の抗体は、配列番号７−１３、１５−１８、３６、３８−７３、７８、８２−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６−１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６及び１２７の何れか一の重鎖ＣＤＲ３配列を含んでなるか、配列番号７−１３、１５−１８、３６、３８−７３、７８、８２−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６−１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６及び１２７の何れか一のＨ３配列に由来するＨ３配列を含んでなる任意のＢＲ３結合抗体を包含する。他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号７−１３、１５−１８、３６、３８−７３、７８、８２−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６−１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６及び１２７からなる群から選択される何れか一の配列のＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる任意のＢＲ３結合抗体を包含するか、ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３配列を含んでなる抗体由来のものである。本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生されていない表２の抗体の重鎖Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列を含んでなる任意のＢＲ３結合抗体を包含する。
本発明の抗体は、2004年11月17日にＡＴＣＣ寄託番号PTA-6315として寄託されるHu9.1-RF-H-IgG核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含んでなる抗体及び、Hu9.1-RF-H-IgGポリペプチド配列の何れか一の可変領域配列に、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を包含する。本発明の抗体は、2004年11月17日にＡＴＣＣ寄託番号PTA-6316として寄託されるHu9.1-RF-L-IgG核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含んでなる抗体及び、Hu9.1-RF-L-IgGポリペプチド配列の可変領域配列に、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を包含する。
本発明の抗体は、2004年11月17日にＡＴＣＣ寄託番号PTA-6313として寄託されるHu2.1-46.DANA-H-IgG核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含んでなる抗体及び、Hu2.1-46.DANA-H-IgGポリペプチド配列の可変領域配列に、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を包含する。本発明の抗体は、2004年11月17日にＡＴＣＣ寄託番号PTA-6314として寄託されるHu2.1-46.DANA-L-IgG核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含んでなる抗体及び、Hu2.1-46.DANA-L-IgGポリペプチド配列の可変領域配列に、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を包含する。
本発明の抗体は、2004年11月17日にＡＴＣＣ寄託番号PTA-6317として寄託されるHuV3-46s-H-IgG核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含んでなる抗体及び、HuV3-46s-H-IgGポリペプチド配列の可変領域配列に、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を包含する。本発明の抗体は、2004年11月17日にＡＴＣＣ寄託番号PTA-6318として寄託されるHuV3-46s-L-IgG核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含んでなる抗体及び、HuV3-46s-L-IgGポリペプチド配列の可変領域配列に、少なくとも７０％の同一性、あるいは少なくともおよそ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる抗ＢＲ３結合抗体を包含する。
本発明の抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号PTA-6315の重鎖配列とＡＴＣＣ寄託番号PTA-6316の軽鎖配列を含んでなるHu9.1-RF-IgG抗体を包含する。本発明の抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号PTA-6313の重鎖配列とＡＴＣＣ寄託番号PTA-6314の軽鎖配列を含んでなるHu2.1-46.DANA-IgG抗体を包含する。本発明の抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号PTA-6317の重鎖配列とＡＴＣＣ寄託番号PTA-6318の軽鎖配列を含んでなるHuV3-46s-IgG抗体を包含する。
ある好適な実施態様では、本発明の抗体は、天然のヒトＢＲ３ポリペプチドの配列に特異的に結合する。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、9.1-RF Igとして公知の抗体と比較してｐＨ６．０でのＦｃＲｎレセプターへの結合を改善している。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、9.1-RF Igとして公知の抗体と比較してヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ機能を改善している。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、9.1-RF Igとして公知の抗体と比較してヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ機能を減弱している。
本発明のすべての抗体は、シグナル配列を欠く抗体及びＦｃ領域のＫ４４７残基を欠く抗体を包含することは理解されるであろう。
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明はまたＢＲ３結合抗体をコードしている単離された核酸又はＢＲ３結合ポリペプチド、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
ＢＲ３結合抗体及びポリペプチドの組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体ないしポリペプチドをコードするＤＮＡは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
(i) シグナル配列成分
この発明の抗体ないしポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ＢＲ３結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、ＢＲ３結合抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
(ii) 複製開始点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ＢＲ３結合抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-９０９６)。
あるいは、ＢＲ３結合抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されＢＲ３結合抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたＢＲ３結合抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、サルウィルス４０(ＳＶ４０)などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
(vi) 転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能は必要でない、例として、治療的抗体が細胞障害性剤(例として、毒素)にコンジュゲートして、その免疫コンジュゲートが腫瘍細胞破壊に効果的である場合など。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。大腸菌における抗体断片およびポリペプチドの発現方法について、発現および分泌を最適化する転写開始領域(ＴＩＲ)およびシグナル配列を記載している米国特許第5,648,237号 (Carterら.)、同第5,789,199号(Jolyら)、および同第5,840,523号 (Simmonsら)を参照のこと。これらの特許文献はここ文献として組み込まれる。発現後、可溶性分画の大腸菌ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインＡまたはＧカラムにより精製しうる。例としてＣＨＯ細胞での発現抗体精製工程と同様にして最終的精製を行う。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＢＲ３結合抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化ＢＲ３結合抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス***腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(viii) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(ix) 精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、とりわけアフィニティクロマトグラフィが好ましい精製工程である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
抗体コンジュゲート
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、5フルオロウラシルの、そして、6メルカプトプリンのシトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、N(5、5-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、1(2-クロエチル)-1、2-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、N8-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてＤＭ-１、メイタンシン、メイタンシノール、 N-デスメチル-4,5-デセポキシメイタンシノイド、C-19-デクロロメイタンシノイド、C-20-ヒドロキシメイタンシノール、 C-20-デメトキシメイタンシノール、C-9-SH メイタンシノール、C-14-アルコキシメチルメイタンシノール、C-14-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、C-15-ヒドロキシ／アセチルオキシメイタンシノール、C-15-メトキシメイタンシノール、 C-18-N-デメチルメイタンシノールおよび4,5-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンE、M、PHEおよびPE；ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチン A、ドロスタチン B、 ドロスタチン C、 ドロスタチン D、 ドロスタチン E (20-epi and 11-epi)、 ドロスタチン G、 ドロスタチン H、 ドロスタチン I、 ドロスタチン 1、 ドロスタチン 2、 ドロスタチン 3、 ドロスタチン 4、 ドロスタチン 5、 ドロスタチン 6、 ドロスタチン 7、 ドロスタチン 8、 ドロスタチン 9、 ドロスタチン 10、 deo-ドロスタチン 10、 ドロスタチン 11、 ドロスタチン 12、 ドロスタチン 13、 ドロスタチン 14、 ドロスタチン 15、 ドロスタチン 16、 ドロスタチン 17、 and ドロスタチン 18；セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン 1、 セファロスタチン 2、 セファロスタチン 3、 セファロスタチン 4、 セファロスタチン 5、 セファロスタチン 6、 セファロスタチン 7、 25'-epi-セファロスタチン 7、 20-epi-セファロスタチン 7、 セファロスタチン 8、 セファロスタチン 9、 セファロスタチン 10、 セファロスタチン 11、セファロスタチン 12、セファロスタチン 13、セファロスタチン 14、 セファロスタチン 15、セファロスタチン 16、セファロスタチン 17、 セファロスタチン 18、およびセファロスタチン 19を含む。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する***阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３，８９６，１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４，１５１，０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；同４，２４８，８７０号；同４，２５６，７４６号；同４，２６０，６０８号；同４，２６５，８１４号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３０８，２６８号；同４，３０８，２６９号；同４，３０９，４２８号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３１７，８２１号；同４，３２２，３４８号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６４，８６６号；同４，４２４，２１９号；同４，４５０，２５４号；同４，３６２，６６３号；及び同４，３７１，５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235号B1、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能価性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能価性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])およびジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、１つ又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートしたＢＲ３結合抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
放射性同位元素
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＢＲ３抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
ＢＲ３結合抗体の医薬使用
本発明のＢＲ３結合抗体は、自己免疫疾患および関連症状、Ｂ細胞リンパ腫および白血病を含むＢＲ３陽性癌を含む悪性および非悪性疾患の治療に有用である。骨髄中の幹細胞(Ｂ細胞前駆細胞)はＢＲ３抗原を欠き、治療後健康なＢ細胞が生成され、数か月で正常レベルに戻る。
自己免疫疾患又は自己免疫関連症状には、関節炎(リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎)、乾癬、アトピーを含む皮膚炎；慢性の自己免疫性蕁麻疹、多発筋炎/皮膚筋炎、毒性の表皮壊死症、全身性硬皮症、および硬化症、炎症性腸疾患(IBD)(クローン病、潰瘍性大腸炎)関連反応、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、腎炎、アレルギー症状、湿疹、喘息、Ｔ細胞および慢性炎症性応答の浸潤に伴う症状、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ループス(腎炎、非腎臓性、円形脱毛症)、若年型糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴリンパ球媒介性急性および遅延性過敏症に関連する免疫反応、結核、サルコイドーシス、ヴェグナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎(ANCAを含む)、再生不良性貧血、クームス積極的な貧血、ダイアモンド-ブラックファン(Diamond Blackfan)貧血、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆(PRCA)、第VIII因子欠乏、血友病A、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少症、白血球血管外遊出に伴う病気、CNS炎症性疾病、複数の器官傷害症候群、重症筋無力症、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜病、抗りん脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、カースルマン症候群、グッドパスチュア症候群、ランバート-イートン筋無力症症候群、レーノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス-ジョンソン症候群、固形器官移植臓器拒絶反応(高パネルの反応抗体力価のための前処理、組織におけるIgA沈着症等を含む)、移植片対宿主病(GVHD)、類天疱瘡、天疱瘡(尋常性、落葉状をすべて含む)、自己免疫性多腺性内分泌障害、レイター病、スティフマン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体性腎炎、IgA腎障害、IgM多発性神経炎又はIgM関連神経障害、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性***と卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)を含む自己免疫性内分泌疾患、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群(または、多腺性内分泌疾患症候群)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)とも言われるI型糖尿病およびシーハン症候群；自己免疫性肝炎、リンパ様間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植性)対NSIP、ギラン・バレー症候群、大血管脈管炎(リウマチ性多発筋痛と巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中血管血管炎(川崎病および結節性多発性動脈炎を含む)、強直性脊椎炎、バーガー病(IgA腎症)、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、複腔熱帯性下痢(グルテン性腸症)、クリオグロブリン血症、ALS、冠動脈疾患が含まれる。
ＢＲ３陽性癌は細胞表面上にＢＲ３を発現する細胞の異常増幅を含むものである。ＢＲ３陽性Ｂ細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むＢＲ３陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫(NHL)；濾胞性中心細胞リンパ腫(FCC)；急性リンパ性白血病(ALL)；慢性リンパ球性白血病(CLL)；ヘアリー細胞白血病が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、低程度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、中程度／濾胞性NHL、中程度びまん性NHL、高程度免疫芽細胞NHL、高程度リンパ芽球性NHL、高程度小正円形細胞(non-cleaved cell)NHL、厖大な病気のNHL、プラズマ細胞様リンパ球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫およびワルデンストロームマクログロブリン血症が含まれる。これらの癌の再発治療を含む。LPHDは頻回の放射線又は化学療法にもかかわらず再発する傾向にあるホジキン型の疾患であり、ＢＲ３陽性悪性細胞の特徴がある。CLLはリンパ球といわれる成熟B細胞の４つの主要な白血病Ａ癌のうちの一つである。CLLは血液、骨髄およびリンパ球組織における細胞の進行性蓄積が顕在化する。
特定の実施態様では、ＢＲ３結合抗体およびその機能的断片は、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性リンパ球性白血病、リウマチ様関節炎、および若年性関節リウマチ、ループス腎炎を含む全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、脈管炎、糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群、および腎炎の治療に使用される。
ＢＲ３結合抗体またはその機能的断片は、例として再発または難治性低程度または濾胞性、ＢＲ３陽性、Ｂ細胞NHLのための単剤治療に有用であり、多剤療法の多剤と組み合わせて患者に投与可能である。
治癒の遅いリンパ腫は成長が遅い難病であり、患者は緩解と再発を繰返し６から１０年生存するものである。一実施態様では、ヒト化ＢＲ３結合抗体またはその機能的断片は治癒の遅いNHLの治療に用いられる。
腫瘍治療の効率または効果を評価するパラメータが適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。パラメータは疾患の進行の中央値時間、緩解、疾患の安定時間を含む。
以下に示す文献は、リンパ腫およびCLL、その診断、治療および治療効果を評価するための標準的な医療手順について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998、van Besien KおよびCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, 1293-1338頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman 等. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000、およびRai, KおよびPatel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, 1350-1362頁, in: Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffmanら(editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫または自己免疫関連疾患の治療の効率および成功率を評価するためのパラメータは、適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の失陥の徴候および症状の減弱を求めるであろう。以下は、実施例の方法による。
一実施態様では、本発明の抗体は、関節リウマチの治療に有用である。RAは多関節の炎症、軟骨の減少、骨侵食により関節の破壊および最終的に関節機能の減退をもたらす特徴がある。加えて、RAは全身性疾患であるため、他の組織、例として肺、眼および骨髄に影響しうる。１０年以上患っているRA患者の５０％弱は日常を基準として仕事を続けるまたは正常に機能し続けている。
初期RA(すなわち、メトトレキセート(MTX)未処理)患者の一次治療および単剤治療、または例としてMTXもしくはシクロフォスファミドとの組合せとして抗体が利用可能である。もしくは、DMARDおよび／またはMTX抵抗性患者の二次療法、および単剤療法および例としてMTXとの組合せとして治療に抗体が利用できる。ヒト化ＢＲ３結合抗体は関節傷害の予防と調節、機能傷害の遅延、RAの炎症に伴う痛みの軽減に有用である。RA治療に用いる多剤での処置の前、後、または同時にRA患者をヒト化ＢＲ３抗体で治療する(以下の混合治療参照)。一実施態様では、以前に病気を調整する抗リウマチ薬に失敗した患者および／またはメトトレキセート単独では効果が不十分な患者は本発明のヒト化ＢＲ３結合抗体で治療する。この治療の一実施態様では、ヒト化ＢＲ３結合抗体単独を１７日間の投与計画(第１および１５日目に１ｇを静脈注射)；ＢＲ３結合抗体＋シクロフォスファミド(第３および１７日目に７５０ｍｇ静脈投与)、またはＢＲ３結合抗体＋メトトレキセートで患者を治療する。
ＲＡの治療効果を評価するある方法は、American College of Rheumatology (ACR)診断基準に基づくものであり、圧痛および腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療(例として、治療前の基準)またはプラセボ治療と比較して例としてＡＣＲ２０(２０パーセントの改善)でスコア付けをする。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例として骨の侵食および関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられる鋭Ｘ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中または治療後にHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防または改善の評価をすることができる。ＡＣＲ２０診断基準は、圧痛(痛み)関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含む。
１．視覚的類似尺度(ＶＡＳ)による患者の痛み評価
２．疾患活動性の患者の全体評価(ＶＡＳ)
３．疾患活動性の医師の全体評価(ＶＡＳ)
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、および
５．急性期反応、ＣＲＰまたはＥＳＲ
ＡＣＲ５０および７０も同様に定義する。好ましくは本発明のＢＲ３結合抗体を少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量を患者に投与する。
乾癬性関節炎は特異的で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の関節侵食および関節腔狭小化も同様にシャープ(sharp)スコアにより評価しうる。本発明のヒト化ＢＲ３結合抗体は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候および疾病の症状の減弱に利用可能である。
さらに、本発明の他の側面では、本発明のＢＲ３結合抗体の治療的有効量をＳＬＥ患者に投与することによるループスまたはＳＬＥの治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアでは疾患の活動性を数量で表す。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床および治験の荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk & John Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は、血清クレアチニン、尿蛋白、または尿中の血液で顕著に生成され増加することで定義される腎性発赤および他のループスの症状を引き起こすと信じられている。代わりに、または加えて、抗核抗体および二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルで患者をモニターする。ＳＬＥ治療は高用量の副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロホスファミド(HDCC)を含む。
脊椎関節症は関節疾患のグループであり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者および医師の全体的評価測定方法によって決定しうる。
様々な医薬が乾癬治療に用いられる；疾患重症度に関連して治療が異なる。より軽度な感染患者は一般的に局所治療、例として局所ステロイド、アンスラリン(anthralin)、カルシポトリエン(calcipotriene)、クロベタゾール(clobetasol)、およびタザロテン(tazarotene)が、全身的(メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ)治療を行うと思われる中度および重症乾癬患者では疾患の管理に有効である。タールも利用される。これらの治療は、安全性の考慮、時間のかかる投与計画、または不便な治療過程を複合して有する。さらに、いくつかは高価な設備および設置のための場所を必要とする。全身性医薬は、高血圧、高脂血症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、および消化器系不調を含む様々な副作用を引き起こしうる。また、光線療法の使用は皮膚癌の発症を増加させうる。局所療法の使用に伴う不便および不快感に加え、光線療法および全身性治療は患者を処置および非処置の周期におき、その副作用のために生涯曝露をモニターする必要がある。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(PGA)変化、および乾癬領域および重症度指数(PASI)スコア、乾癬症状評価(PSA)を含む臨床兆候および疾患の症状の変化をモニターし、基礎となる症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的類似尺度の処置を通して定期的に患者を測定する。
患者は治療的抗体の初期注入時に注入反応または注入関連症状を経験するかもしれない。これらの症状は重症度が様々であり、一般的に医療処置に可逆的なものである。これらの症状はここに限るものではないが、インフルエンザのような熱、寒気/硬直、吐き気、蕁麻疹、頭痛、気管支けいれん、血管性水腫が含まれる。本発明の疾患治療方法には注入反応を最小限にすることが望まれる。ゆえに、本発明の他の側面では、ＢＲ３結合抗体を投与することによるここに開示された疾患の治療方法であり、ここでの抗体は補体依存性の細胞傷害性を減弱または全く持たないものである。
用量
当業の医師によく知られた治療効能および用量に関する因子次第で、毒素および副作用を最小限にする一方で治療効能を有効にする用量で本発明の抗体を投与するであろう。癌、自己免疫疾患又は免疫不全性疾患の治療のための治療的有効量は、５０ｍｇ／用量〜２．５ｇ／ｍ２の範囲でありうる。一実施態様では、投与される用量は約２５０ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２または５００ｍｇ／ｍ２である。他の実施態様では、用量は約２５０〜３７５ｍｇ／ｍ２の範囲とする。更なる他の実施態様では、用量範囲は２７５−３７５ｍｇ／ｍ２である。
本明細書中に記載のＢＲ３陽性Ｂ細胞腫瘍(例えば、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、濾胞性リンパ腫(ＦＬ)又は多発性骨髄腫)の治療の一実施態様では、抗体は５０ｍｇ／用量〜２．５ｇ／ｍ２の範囲で投与する。Ｂ細胞リンパ腫、例として非ホジキンリンパ腫患者の治療のための特定の実施態様では、本発明の抗ＢＲ３抗体およびヒト化抗ＢＲ３抗体は１０ｍｇ／ｋｇまたは３７５ｍｇ／ｍ２の用量で患者に投与するであろう。ＮＨＬの治療のある用量投与計画では、治療の初めの１週間は10mg/kgの用量当たり抗体組成物一用量で投与し、２週間の間隔の後、同量の第二用量抗体を投与する。一般に、ＮＨＬ患者は１年に１度リンパ腫の再発によってこのような治療を受けるが、このような治療は繰り返される。他の用量投与計画では、低程度ＮＨＬ患者は４週間の抗ＢＲ３抗体(週当たり３７５ｍｇ／ｍ２)の後、５週目には、３追加投与過程の抗体＋ＣＨＯＰ(シクロフォスファミド、ドキソルビシン(doxorubicin)、ビンクリスチンおよびプレドニゾン)またはＣＶＰ(シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン)化学療法を３週ごとに３周期で投与する。
関節リウマチ治療の一実施態様では、抗ＢＲ３抗体の用量範囲は２回の用量で１２５ｍｇ／ｍ２(約２００ｍｇ／用量と当量)〜６００ｍｇ／ｍ２、例として第１日目に初期用量２００ｍｇ、その後第１５日目には２００ｍｇの第二用量を投与する。異なる実施態様では、用量は１用量当たり２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、 ５７５ｍｇ、６００ｍｇからなる群から選択される。
疾患の治療において、本発明のＢＲ３結合抗体は疾患において医師によって決定されるように慢性的または間欠的に患者に投与する。
静脈注入または皮下中により薬剤を投与している患者は有害事象、例として熱、寒気、灼熱感、無力症、および頭痛を経験する。このような有害事象を軽減または最大限小さくするために、治療的用量に続いて初期調整用量の抗体を患者に投与する。調整用量はより多くの用量に耐えるように治療用量より少ないであろう。
(１) ＡＤＣＣ機能を欠くか野生型のヒトＩｇＧ Ｆｃを含んでなる抗体と比較してＡＤＣＣ機能を減弱している；(２) ＢＡＦＦのＢＲ３への結合を部分的にないしは完全に阻害する能力を欠く、又は(３) ＡＤＣＣ機能を欠くか野生型のヒトＩｇＧ Ｆｃを含んでなる抗体と比較してＡＤＣＣ機能を減弱しており、ＢＡＦＦのＢＲ３への結合を部分的にないしは完全に阻害する能力を欠いている、本発明のＢＲ３結合抗体は、例えば、ＢＡＦＦ及びＢＲ３結合を阻害してＡＤＣＣ機能を有する抗ＢＲ３抗体による治療に有意な副作用を示すないしは示すことが予測される患者の置き換え療法、選択療法ないしは維持療法において有用であることが考慮される。例えば、患者は、ＢＡＦＦ及びＢＲ３結合を阻害してＡＤＣＣ機能を有する抗ＢＲ３抗体にて始め治療され、その後(１) ＡＤＣＣ機能を欠くか野生型のヒトＩｇＧ Ｆｃを含んでなる抗体と比較してＡＤＣＣ機能を減弱している；(２) ＢＡＦＦのＢＲ３への結合を部分的にないしは完全に阻害する能力を欠く、又は(３) ＡＤＣＣ機能を欠くか野生型のヒトＩｇＧ Ｆｃを含んでなる抗体と比較してＡＤＣＣ機能を減弱しており、ＢＡＦＦのＢＲ３への結合を部分的にないしは完全に阻害する能力を欠いている抗ＢＲ３抗体で治療されうることが考慮される。
投与経路
ＢＲ３結合抗体は、公知の方法、例えば静脈内投与、例としてボーラスまたは一定期間中の継続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、または吸入、一般的には静脈内または皮下的投与によりヒト患者に投与される。
一実施態様では、抗ＢＲ３抗体は注入溶媒として０．９％塩化ナトリウム溶液の静脈注入により投与される。他の実施態様では、抗ＢＲ３抗体は予めシリンジに充填させて投与される。
併用療法
この発明のＢＲ３-結合抗体ないしポリペプチドは、疾患を治療するために、第二治療薬と組み合わせて用いられうる。第二治療薬なる用語は他の付加的な療法で被検体を治療することを除外するものではない。第二治療薬に対する用語は、用いられる特定のＢＲ３-結合抗体ないしポリペプチドと薬剤を区別するためのものである。一実施態様では、自己免疫性疾患又は癌のためにＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドによって処置される患者は、生物学的応答調節剤(ＢＲＭ)により同時に、連続的(前又は後)に、あるいは交互に処置して、多薬剤投与計画において疾患及び／又は感染と戦うための免疫系の能力を刺激するか回復することができる。ＢＲＭには、モノクローナル抗体、例として、ＴＮＦα又はＩＬ-1を標的とする抗体(例えばEnbrel(登録商標)、Remicade(登録商標)及びHumira(登録商標))、インターフェロン、インターロイキン(例えば、ＩＬ-２、ＩＬ-１２)および様々なタイプのコロニー刺激因子(ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ)が含まれる。例えば、ＢＲＭは炎症性活動性を阻害して、関節損傷を減少させうる。
一実施態様では、第二治療剤はＩＡＰインヒビターである。
他の実施態様では、自己免疫性疾患又は癌のためにＢＲ３結合抗体ないしポリペプチドによって処置される患者は、Ｂ細胞枯渇薬剤により同時に、連続的(前又は後)に、あるいは選択的に処置されうる。
一実施態様では、自己免疫性疾患又は癌のためにＢＲ３結合抗体によって処置される患者は、ＢＡＦＦアンタゴニストにより同時に、連続的(前又は後)に、あるいは選択的に処置されうる。
他の実施態様では、前述の癌及び腫瘍では、患者は、多薬剤投与計画において化学療法剤などの一又は複数の治療剤と組み合わせて本発明のＢＲ３結合抗体で治療されうる。ＢＲ３結合抗体は、化学療法剤と同時に、連続的(前又は後)に、あるいは交互に、又は他の療法で反応がないときに投与されうる。標準的なリンパ腫治療の化学療法は、シクロホスファミド、シタラビン(cytarabine)、メルファラン、ミトキサントロン(mitoxantrone)＋メルファランを含む。ＣＨＯＰは非ホジキンリンパ腫治療の最も一般的な化学療法投与の一つである。ＣＨＯＰ投与に用いられる薬剤は以下のとおりである：シクロホスファミド(ブランド名シトキサン(cytoxan)、ネオサル(neosar)); アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン); ビンクリスチン(オンコビン); および、プレドニゾロン(時々デルタゾン(Deltasone)またはオラソン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は以下の化学療法剤、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの一またはそれ以上を組み合わせて必要とする患者に投与する。特定の実施態様では、リンパ腫患者(例として非ホジキンリンパ腫)は本発明の抗ＢＲ３抗体をＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)療法と組み合わせて治療する。他の実施態様では、患者の癌又は腫瘍は本発明のＢＲ３結合抗体をＣＶＰ(シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)化学療法と組み合わせて治療する。特定の実施態様では、ＢＲ３陽性ＮＨＬ患者は、ヒト化抗ＢＲ３抗体をＣＶＰと組み合わせて治療する。慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)治療の具体的な実施態様では、ＢＲ３結合抗体は、一又は複数のヌクレオシド類似体、例えば、フルダラビン、Cladribine(２-クロロデオキシアデノシン、２-ＣｄＡ[ロイスタチン])、ペントスタチン(Nipent)とシクロホスファミドによる化学療法と組み合わせて投与される。
上述の自己免疫疾患または自己免疫関連症状の治療に、本発明のＢＲ３結合抗体を第二治療剤、例として免疫抑制剤と組み合わせて、例として多剤投与計画で患者を処置する。ＢＲ３結合抗体は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。免疫抑制剤は分野常用と同じまたはより少ない用量で投与することが可能である。好適な免疫抑制剤は治療する疾患の型だけでなく患者の病歴を含めて多くの因子によるであろう。
補助剤療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」は、患者の免疫系を抑制又はマスクするために作用する物質を意味する。このような薬剤には、サイトカイン生成を抑制する、自己抗原発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。このような薬剤の例は、グルココルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニソロン、及びデキサメタゾンなどのステロイド；２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照)；アザチオプリン(アザチオプリンに抵抗性の場合はシクロホスファミド)、ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド(米国特許第4120649号に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、抗腫瘍壊死因子-α抗体、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン-２抗体及び；抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；全Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを持つ可溶性ペプチド(1990年7月26日に公開された国際公開90/08187)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシイン(rapamycin)；Ｔ細胞レセプター(米国特許第5114721号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開90/11294；及び国際公開91/01133)；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体(欧州特許第340109号)を含む。
関節リウマチ治療に、本発明のＢＲ３結合抗体を以下の薬剤のうちの一またはそれ以上と組み合わせて患者を治療する：ＤＭＡＲＤＳ(疾患変更姓抗リウマチ薬(例として、メトトレキセート))、ＮＳＡＩまたはＮＳＡＩＤ(非ステロイド性抗炎症薬)、HUMIRAＴＭ(アダリムマブ(adalimumab)；Abbott Laboratories)、ARAVA(登録商標)(レフノミド(leflunomide))、REMICADE(登録商標)(インフリキシマブ(infliximab)；Centocor Inc., of Malvern, Pa)、ENBREL(登録商標)(エターナルセプト(etanercept)；Immunex, WA)、COX-2阻害剤。一般にＲＡに用いられるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロクイン(hydroxycloroquine)、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エターナルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄペニシラミン、ゴールド(Gold)(経口)、ゴールド(筋注)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着である。アダリムマブ(adalimumab)はＴＮＦαに結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブはＴＮＦαに結合するキメラモノクローナル抗体である。エターナルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合するヒト７５ｋＤ(p75)腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)の細胞外リガンド結合部位からなる「免疫吸着」融合タンパク質である。ＲＡの従来治療は、例として“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡ患者を本発明のＢＲ３抗体をメトトレキセート(MTX)と組み合わせて治療する。ＭＴＸの例示的用量は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／ｗｋである。ＭＴＸは経口および皮下的ににより投与される。
硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病の治療には、本発明のＢＲ３結合抗体を、例としてRemicade(登録商標)(インフリキシマブ； Centocor Inc., of Malvern, Paより)、ENBREL(登録商標) (エターナルセプト；Immunex, WA)と組み合わせて患者を治療する。
ＳＬＥの治療には高用量副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロスファミド(HDCC)を含む。
乾癬治療には、ＢＲ３結合抗体を局所的治療、例として局所的ステロイド、アンスラリン、カルシポトリエン、およびタザロテン、またはメトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ治療と組み合わせて患者を治療する。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに続いてまたはシクロスポリンと同時にＢＲ３結合抗体を用いて治療する。
治療的剤形
本発明に使用されるＢＲ３結合抗体の治療的剤形は、所望の純度を有する抗体を選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形または液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
例示的抗ＢＲ３抗体の剤形は国際公開公報98/56418に記載されており、参考としてここに組み込まれる。他の剤形は液状の多用量剤形であり、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように抗ＢＲ３抗体 ４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ 酢酸塩、１５０ｍＭ ロレハロース、０．９％ ベンジルアルコール、ｐＨ５．０の０．０２％ ポリソルベート２０を含むものである。目的の他の抗ＢＲ３剤形は、１０ｍｇ／ｍＬの抗体、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬ クエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬ ポリソルベート８０、および注入用の滅菌水を含むｐＨ６．５のものである。さらに、他の液状医薬剤形は、約ｐＨ４．８〜約ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、約０．０１−０．１％ｖ／ｖ量の界面活性剤としてのポリソルベート、約２−１０％ｗ／ｖ量のトレハロース、保存剤としてのベンジルアルコール(米国特許第6171586号)を含む。凍結乾燥剤形は国際公開公報97/04801に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
ヒト化抗ＢＲ３抗体の一剤形は、ｐＨ５．８の１０ｍＭ ヒスチジン、６％ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０中の抗体１２−１４ｍｇ／ｍＬである。
特定の実施態様では、抗ＢＲ３抗体および特に９.１ＲＦ、９.１ＲＦ(Ｎ４３４変異体)、又はＶ３-４６は、ｐＨ５．８の１０ｍＭ ヒスチジン硫酸塩、６０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、および注入用の滅菌水中の抗体２０ｍｇ／ｍＬである。
また、ここでの剤形は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤(例として、シクロスポリンまたはＴ細胞結合抗体、例としてＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの)を提供することが望まれる。そのような多剤の有効量は剤形が存在する抗体量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の１〜９９％量で用いられる。
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム(例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許3773919), L-グルタミン酸およびエチルＬグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリD-(-)-3ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる剤形は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
製造品およびキット
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患および関連症状およびＢＲ３陽性癌、例えば非ホジキンリンパ腫の治療に有用な材料を含む製造品である。本発明の更なる他の実施態様は、免疫不全性疾患の治療に有用な材料を含んでなる製造品である。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のＢＲ３結合抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。さらに、ラベルまたはパッケージ挿入物は抗体組成物の患者への投与についての説明を含むであろう。本明細書中に記載の併用用治療法を含む製造品及びキットも包含される。
パッケージ挿入物は治療的製造品の商用パッケージに含まれる慣例的な説明書を示しており、効能、使用法、用量、投与法、禁忌および／または医薬製品に関する警告についての情報を含む。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に有用である。
加えて、さらに製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例として注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液を含む第二容器を含みうる。さらに、商業的および消費者視点で望まれる他の材料、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含みうる。
キットもまた様々な目的、例としてＢ細胞死滅分析に、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのＢＲ３の精製または免疫沈降に有用である。ＢＲ３を単離および精製するために、キットにビーズ(例としてセファロースビーズ)に結合した抗ＢＲ３抗体を含めることができる。インビトロでＢＲ３を検出および定量する、例としてＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット法のための抗体を含むキットが提供される。製造品として、キットは容器およびラベルまたは容器上または容器に付随したパッケージ挿入物を含む。容器は本発明の少なくとも一の抗ＢＲ３抗体を含む組成物を有する。付加的容器には、例として希釈剤および緩衝液、対照抗体を包含しうる。ラベルまたはパッケージ挿入物は組成物の解説と同様にインビトロまたは診断的使用を意図した指示書も含みうる。
モノクローナル抗体
抗ＢＲ３抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を用いるなどして調製する、又は組み換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)により作製する、又は実施例の項目に記載の方法によって生成することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＢＲ３ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, New York, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＢＲ３ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、或いは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、或いは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製には、同じくインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成が可能である。
ヒトおよびヒト化抗体
抗ＢＲ３抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖或いはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２或いは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法には当分野及び以下の実施例に記載されるものがある。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。一実施態様では、ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、原型のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換された抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5545806号、同5569825号、同5591669号(全てジェンファーム(GenPharm))；同5545807号；及び国際公開第97/17852号を参照。あるいは、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術の一実施態様によれば、抗体Ｖドメイン配列を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えば、以下の実施例の項目に記載のもの、又はJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第5565332号及び同5573905号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第5567610号及び同5229275号)。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリを含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作製することもできる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77 (1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991) 。
多特異性抗ＢＲ３抗体
多特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体(例えば、少なくとも２つの抗原に対して結合特異性を有する二重特異性抗体)である。例えば、結合特異性の一方はＢＲ３ポリペプチドに対するものあり、他方は任意の他の抗原に対するものである。好適な一実施態様では、他の抗原は、細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットである。例えば、細胞表面タンパク質はナチュラルキラー(ＮＫ)細胞レセプターでありうる。そして、一実施態様によると、本発明の二重特異性抗体はＢＲ３に結合して、ＮＫ細胞に結合し、場合によってはＮＫ細胞を活性化することができる。
二重特異性抗体を作製する方法の例は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開公報93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作製するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作製し分離する様々な方法が記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60 (1991)。
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、二つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO91/00360；WO92/200373；EP03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作製することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されたものが含まれる。
エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。或いは、抗体は、二つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
Ｆｃ配列内を変異又は変更して、ＦｃＲ結合を改善することができる(例えばＦｃγＲ、ＦｃＲｎ)。ある実施態様では、本発明の抗体は、天然のＩｇＧ又は親抗体と比較して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び改善したＦｃＲｎ結合からなる群から選択される少なくとも一のエフェクター機能を変更している。いくつかの有用な特定の変異の例は、例えばShields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604；Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490；及び国際公開公報00/42072に記載される。
ある実施態様では、Ｆｃレセプター変異は、Ｆｃ領域内の残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムに従った場合、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８及び４３９からなる群から選択される何れか一の位置の置換である。ある特定の実施態様では、置換が、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｙ、Ｎ４３４Ｈからなる群から選択される４３４残基の置換である。他の実施態様では、置換は、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ変異である。他の実施態様では、置換は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ又はＳ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａである。他の実施態様では、置換はＫ３２２Ａである。
天然配列のヒトＩｇＧＦｃ領域配列の例である、humIgG1 (非Ａ及びＡアロタイプ) (それぞれ配列番号133及び135)、humIgG2 (配列番号136)、humIgG3 (配列番号137)及びhumIgG4 (配列番号138)が既に記載されている。天然配列のマウスＩｇＧＦｃ領域配列の例である、murIgG1 (配列番号139)、murIgG2A (配列番号140)、murIgG2B (配列番号141)及びmurIgG3 (配列番号142)も既に記載されている。
免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性薬、或いは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。
抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238:1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞障害性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
抗体およびポリペプチドの製薬的組成物
ここに記載のＢＲ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記載のような様々な疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
また、リポフェクション又はリポソームを、本発明のポリペプチド及び抗体又は組成物を細胞に導入するために利用することができる。抗体断片が用いられる場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成でき及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に一つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。或いは、又はそれに加えて、組成物は、例えば細胞障害性剤、化学療法剤又は成長阻害剤などのその機能を亢進する薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 、上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア)等の分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に亘って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
診断への使用と画像法
ＢＲ３に特異的に結合する標識した抗体、及びその誘導体及び類似体を、本発明のポリペプチドの発現、異常な発現及び／又は活性に関する疾患及び／又は疾病を検出、診断ないしモニターするための診断用の目的に用いることができる。ある好適な実施態様では、被検体へ抗ＢＲ３抗体を注入することを伴う診断用アッセイ又は画像アッセイに用いられる抗ＢＲ３抗体は、ＢＡＦＦとＢＲ３との相互作用をブロックしないか、ＢＡＦＦとＢＲ３との相互作用を部分的にしかブロックしない抗体である。本発明は、(ａ)本発明の一又は複数の抗体を用いて、個体の細胞ないし体液中におけるＢＲ３ポリペプチドの発現をアッセイすること及び(ｂ)標準の遺伝子発現レベルと遺伝子発現のレベルを比較することを含み、これによって標準の発現レベルと比較してアッセイした遺伝子の発現が増加しているか減少しているかによって異常な発現が示される、ＢＲ３ポリペプチドの異常な発現の検出方法を提供する。
本発明は、(ａ)本発明の抗体を用いて、個体の細胞ないし体液中におけるＢＲ３ポリペプチドの発現をアッセイすること、(ｂ)個体の細胞ないし体液中におけるＢＡＦＦポリペプチドの発現をアッセイすること、及び(c)標準の遺伝子発現レベルとＢＡＦＦ遺伝子発現のレベルを比較することを含み、これによって標準の発現レベルと比較してアッセイしたＢＡＦＦ遺伝子の発現が増加しているないしは減少していることと、体液ないし患部組織中にＢＲ３ポリペプチドが存在することから、抗ＢＲ３抗体ないしポリペプチドで治療されるべき疾患が示される、本発明の抗ＢＲ３抗体ないしポリペプチドで治療されるべき疾患を診断するための診断用アッセイを提供する。癌に関して、個体の生検組織におけるＢＲ３の存在ないし相対的に高い量のＢＲ３転写から、疾患を起こしうる素因が示されうるか、ないしは実際の臨床症状の出現に先立って疾患を検出する方法が提供されうる。保健専門家は、この種のより信頼のおける診断により早期の予防対策や積極的な治療を行って、癌の発達ないしは更なる進行を予防することができうる。
本発明の抗体を、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて生体試料中のタンパク質のレベルをアッセイするために用いることができる(例として、Jalkanen, 等, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985)；Jalkanen, 等, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照)。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法には、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)及び放射性免疫測定法(ＲＩＡ)が含まれる。好適な抗体アッセイ標識は当分野で公知であり、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えばヨウ素(131 I、125 I、123 I、121 I)、炭素(14 C)、イオウ(35 S)、トリチウム(3 H)、インジウム(115m In、113m In、112 In、111 In)、及びテクネチウム(99 Tc、99m Tc)、タリウム(201 Ti)、ガリウム(68 Ga、67 Ga)、パラジウム(103 Pd)、モリブデン(99 Mo)、キセノン(133 Xe)、フッ素(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru；ルミノール；及び蛍光標識、例えばフルオレセイン、ローダミン及びビオチンが含まれる。
当分野で公知の技術は、本発明の抗体を標識するために応用してもよい。このような技術には、限定するものではないが、二官能性のコンジュゲート剤の使用が含まれる(例として、米国特許第5,756,065号；同第5,714,631号；同第5,696,239号；同第5,652,361号；同第5,505,931号；同第5,489,425号；同第5,435,990号；同第5,428,139号；同第5,342,604号；同第5,274,119号；同第4,994,560号；及び同第5,808,003号；この各々の内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる)。
動物、好ましくは哺乳動物及び最も好ましくはヒトにおいてＢＲ３分子の発現又は異常な発現が関与する疾患ないし疾病の診断は、哺乳動物においてＢＲ３分子を検出する工程を含みうる。ある実施態様では、診断は、(ａ)それぞれ、ＢＲ３分子に特異的に結合する標識した抗ＢＲ３抗体ないしポリペプチドの有効量を哺乳動物に(例えば非経口的、皮下的、腹膜内)投与すること；(ｂ)ＢＲ３分子が発現される被検体内の部位に標識した分子が優先的に濃縮するように(また、結合していない標識分子がバックグラウンドレベルにまで除去されるように)、投与後一定期間をおくこと；(ｃ)バックグラウンドレベルを測定すること；及び(ｄ)被検体内の標識した分子を検出することを含み、バックグラウンドレベル以上に標識した分子が検出されれば、該被検体がＢＲ３の発現ないし異常発現に関する特定の疾患ないし疾病を有することが示される。バックグラウンドレベルは、様々な方法、例えば特定のシステムについて既に測定された標準値と検出された標識分子との量を比較することによって決定することができる。具体的な実施態様では、本発明の抗体を用いて、Ｂ細胞系統の細胞又は単核細胞系統の細胞の濃度を定量又は定性化する。
ある具体的な実施態様では、ＢＲ３ポリペプチド発現又は過剰発現は、細胞の表面上に存在するかないしは細胞から分泌されるＢＲ３のレベルを(例えば、抗ＢＲ３抗体ないし抗ＢＡＦＦ抗体を用いた免疫組織学的アッセイ；ＦＡＣＳアッセイなどをによって)評価することによる診断用アッセイないし予後アッセイにおいて測定される。あるいは又は加えて、ＢＲ３コード核酸ないしその相補体に対応する核酸ベースのプローブを用いた蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH；1998年10月に公開の国際公開公報98/45479)、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)などのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によるなどして、細胞中のＢＲ３ポリペプチドコード核酸ないしｍＲＮＡのレベルを測定することができる。また、例えば抗体ベースのアッセイを用いて血清などの体液中にある抗原を測定することによってＢＲ３分子又はＢＡＦＦ分子の過剰発現を研究することもできる(例として、1990年6月12日発行の米国特許第4,933,294号；1991年4月18日公開の国際公開公報91/05264；1995年3月28日発行の米国特許第5,401,638号；及びSias 等, J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)も参照のこと)。上記のアッセイの他に、当業者には様々なインビボアッセイが有用である。例えば、場合によっては放射性同位体などの検出可能な標識で標識した抗体に哺乳動物の身体の中の細胞を曝し、例えば、放射性活性について外部をスキャニングすることによって、又は予め抗体に曝した哺乳動物の生検組織を分析することによって、哺乳動物の細胞への抗体の結合を評価することができる。
アッセイ
本発明のアゴニスト抗ＢＲ３抗体は、ＴＡＣＩないしＢＣＭＡレセプター経路でなくＢＲ３生物学的経路を直接刺激するために用いられる(すなわち、「ＢＲ３特異的」)。このようなアゴニスト抗体を用いて、ＢＲ３特異的シグナル伝達経路の下流マーカを同定することができる。したがって、ＢＲ３経路の下流マーカを同定するためのアッセイは、その細胞表面上にＢＲ３を発現する細胞に、アゴニストＢＲ３結合のＢＲ３特異的抗体ないしポリペプチドを投与する工程と、細胞中のタンパク質活性ないし遺伝子発現(例えば、マイクロアレイ又はＥＬＩＳＡアッセイ)の変化を検出する工程を含みうる。本発明の他の実施態様では、アゴニスト抗体を用いて、ＢＲ３経路特異的なインヒビターをスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は、その細胞表面上にＢＲ３を発現する細胞に、アゴニストＢＲ３結合のＢＲ３特異的抗体ないしポリペプチドを投与する工程、該細胞に候補化合物を投与する工程、及び該候補化合物が細胞の増殖又は細胞の生存又はその両方を阻害したかどうかを決定する工程を含みうる。
2004年12月31日に出願の米国特許仮出願60/640,323を含め、本明細書中で引用するすべての文献(特許及び特許文献を含む)は、出典明記によってその全体を本明細書中に組み込まれる。
ブダペスト条約の下に、以下のＤＮＡ配列をアメリカ培養細胞系統保存機関(ＡＴＣＣ)に寄託した。ＡＴＣＣの所在地は、米国20110-2209ヴァージニア州マナッサス、ユニバーシティブールバード10801である。寄託の詳細は以下の通りである
材料 寄託番号 寄託日
Hu9.1-RF-H-IgG PTA-6315 2004年11月17日
Hu9.1-RF-L-IgG PTA-6316 2004年11月17日
Hu2.1-46.DANA-H-IgG PTA-6313 2004年11月17日
Hu2.1-46.DANA-L-IgG PTA-6314 2004年11月17日
HuV3-46s-H-IgG PTA-6317 2004年11月17日
HuV3-46s-L-IgG PTA-6318 2004年11月17日
マウスB細胞: 12B12.1 PTA-6624 2005年 4月 8日
マウスB細胞: 3.1 PTA-6622 2005年 4月 8日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、関連の米国特許の発行及び任意の米国又は外国特許出願の公開のうち、いずれか早く行なわれた方の時点で、寄託培養物の子孫を永久且つ非制限的に入手可能とすることを保証し、35USC122条及びそれに従う特許商標庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス、ＶＡである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：上掲のSambrook等；Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)；Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Inc.; N.Y.., 1990)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor 1988)；Gait, Oligonucleotide synthesis(IRL Press, Oxford, 1984)；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる語彙、又は「含む」ないし「含んでいる」の変形型は、定めた完全体又は完全体の群を包含するもので、任意の他の完全体又は完全体の群を除外するものではない。
前記の明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。以下の実施例は例示的目的のためのみに示すのであり、本発明の範囲が多少なりとも限定されるものではない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
実施例１ 材料
ＢＲ３に結合するマウスモノクローナル抗体は凝集したヒトＢＲ３-Ｆｃで免疫化したマウスから生成した。これらの抗体には、11G9、8G4、7B2、1E9、12B12、1E9、1A11、8E4、10E2及び12B12と称されるハイブリドーマから産生されたものが含まれる。２.１及び９.１と称されるマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは既に記載されており(国際特許出願PCT/US01/28006 (国際公開公報02/24909))、アメリカ培養細胞系統保存機関にそれぞれATCC番号3689及びATCC番号3688として寄託される(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA)。ヒトＢＲ３を結合せずマウスＢＲ３に特異的であるハムスター抗マウスＢＲ３抗体であるＢ９Ｃ１１抗体、並びにハイブリドーマ３.１由来の抗体は、Biogen Idec, Incから入手した。
標準のＦｍｏｃ化学法を用いてパイオニアペピチド合成機(PE Biosystems)にて、ミニＢＲ３ペプチド(TPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR (配列番号150)をＣ末端のアミドとして合成した。ペプチドを、５％トリイソプロピルシランを含むＴＦＡで１．５−４時間、室温で処理することによって、樹脂から切断した。回転式蒸発によってＴＦＡを除去した後、ペプチドをエチルエーテルの添加によって沈殿させ、次いで逆相ＨＰＬＣ(アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ)にて精製した。エレクトロスプレー質量分析によって確実にペプチドを同定した。凍結乾燥の後、酸化型ペプチドをＨＰＬＣにて精製した。還元型ミニＢＲ３を含むＨＰＬＣ分画を、ＮＨ４ＯＨにてｐＨ９以下に調整した；ついで、Ｋ３Ｆｅ(ＣＮ)６を少し過剰に添加することによってシステイン２４と３５間をジスルフィド結合し、酸化型ペプチドをＨＰＬＣによって精製した。少し過剰なＩ２を用いて４時間以下にわたってＨＰＬＣ溶出処理をすることによってＡｃｍ基を除去した(第２のジスルフィドが付随的に形成される)。分析的ＨＰＬＣによって酸化経過をモニタし、終末産物をＨＰＬＣによって再び精製した。ミニＢＲ３のアミノ末端を樹脂上でビオチン化して、その後切断し、修飾されなかったペプチドについて上記のように厳密に精製した。
ヒトＢＲ３細胞外ドメイン(ｈＢＲ３-ＥＣＤ)とマウスＢＲ３細胞外ドメイン(ｍＢＲ３-ＥＣＤ)コンストラクトをｐＥＴ３２ａ発現ベクター(Novagen)にサブクローニングすることによって細菌内で産生し、Ｎ末端基チオレドキシン(ＴＲＸ)−Ｈｉｓ−タグの後にエンテロキナーゼプロテアーゼ部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞(Novagen)を３０℃で生育し、ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘発した。ＴＲＸ−ＢＲ３は、Ｎｉ-ＮＴＡカラム(Qiagen)を通じて精製し、イミダゾール勾配にて溶出し、エンテロキナーゼ(Novagen)によって切断した。ついで、ＢＲ３をＳ-セファロースカラムで精製し、３ｍＭ酸化グルタチオンと１ｍＭ還元グルタチオンを含有するＰＢＳ,ｐＨ７．８にて終夜リフォールドさせ、ＰＢＳに対して透析し、ＭｏｎｏＳカラムにて再精製し、濃縮してＰＢＳに透析した。用いたヒトＢＲ３細胞外配列：MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQE (配列番号151)。マウス細胞外配列：MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGS (配列番号152)。
既に記載されているように(Pelletier, M., 等, (2003) J. Biol. Chem. 278, 33127-33133)、ヒト及びマウスＢＲ３-Ｆｃタンパク質はチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)内で産生した。マウスＢＲ３-Ｆｃ配列(ｍＢＲ３-Ｆｃ)はYan 等, (2001) Current Biology 11, 1547-1552にて最初に記載された。マウスＢＲ３-Ｆｃ配列は以下の通りである：
MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (配列番号153)。一般的に、変異体ヒトＢＲ３-Ｆｃ融合(ｖＢＲ３-Ｆｃ)は、天然に生じるヒトＢＲ３配列のＥＣＤ配列の変異体配列を含んでなるＦｃ融合タンパク質に関係しており、この変異体はＢＡＦＦを結合し、天然のヒトＢＲ３配列より少なく凝集する傾向にある。
既に記載されるように(Gordon, N. C., 等, (2003) Biochemistry 42, 5977-5983)、本明細書中で用いられるヒトＢＡＦＦを発現させ、精製することができる。ＢＡＦＦ残基８２−２８５をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂ(Novagen)発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端基Ｈｉｓ−タグの後ろにトロンビン切断部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Novagen)培養物を、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＬＢ培地にて３７℃で対数中間期(mid-log phase)まで生育し、ついで１６℃に冷却し、１．０ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。さらに１２時間生育した後細胞を遠心分離によって回収し、−８０℃に保存した。細胞ペレットを５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および５００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁して、氷上で超音波破壊した。遠心分離後、上清を、Ｎｉ―ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen)に流した。カラムを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールにて洗浄し、次いで、２５０ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液にて段階的に希釈して溶出した。ＢＡＦＦを含有する分画を貯留し、トロンビンを添加して、試料を２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および５ｍＭ ＣａＣｌ２にて４℃で終夜透析した。さらに、タンパク質を、ｍｏｎｏＱ(Pharmacia)カラムにて、最後に２０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２のＳ−２００サイズ排斥カラムにて精製した。
実験によって、ハイブリッドＢＡＦＦ分子を用いた。ハイブリッドＢＡＦＦ分子は、マウスＢＡＦＦのＮ末端の残基１２８−３０９に組み換えて融合させたヒトＢＡＦＦの残基８２−１３４を含んだ。上記のように組み換えタンパク質は細菌内で発現させ、精製した。ヒト配列の添加によりｍＢＡＦＦタンパク質の発現が促された。他の実験では、ＣＨＯ細胞内で発現されるヒトＢＡＦＦをＢ細胞増殖アッセイに用いた。
実施例２ 競合的ＥＬＩＳＡアッセイ
競合的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトＢＲ３及びミニＢＲ３の細胞外ドメインについて抗ＢＲ３抗体の相対的な親和性を測定した。この実験において、マイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp)ウェル上に吸着した抗体に対するビオチン化ＢＲ３-ＥＣＤの結合を非標識のＢＲ３-ＥＣＤ又はミニＢＲ３と競合させた。ＢＲ３-ＥＣＤを１０倍モル過剰のスルホ-ＮＨＳ-ビオチン(Pierce)と外気温度で２時間反応させることによってビオチン化した。５μｇ／ｍｌの抗体をコーティングバッファ(５０ｍＭ 炭酸ナトリウム ｐＨ９．６)中で室温で２時間おいてコートした後、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ-２０／２．５％ (wt/vol)粉末スキムミルクにて１時間おいて反応を止めた。ストレプトアビジン-ＨＲＰで検出した後、４９２ｎｍの吸光度がおよそ１．０になるために必要なビオチン-ＢＲ３-ＥＣＤの量を測定した。Ｍａｂ３.１及び１２Ｂ１２について、必要なビオチン-ＢＲ３-ＥＣＤの濃度は５ｎＭであり、８Ｇ４及び１１Ｇ９では２ｎＭであり、２.１及び９.１ではビオチン-ＢＲ３-ＥＣＤ濃度は２００ｐＭであった。これらの濃度のビオチン-ＢＲ３-ＥＣＤを含有する溶液と様々な濃度の非標識ＢＲ３-ＥＣＤ又はミニＢＲ３を調整して、抗体でコートしたマイクロタイタープレートの個々のウェルに添加した。振とうしながら２時間インキュベートした後、溶液を移して、ウェルをＰＢＳ／．０５％ Ｔｗｅｅｎ-２０にて６回すすいだ。ストレプトアビジン-ＨＲＰ(０．５μｇ／ｍｌ)を添加して、振とうしながら３０分間インキュベートし、次いでウェルをからにして上記のようにすすいだ。結合したＨＲＰを、ＰＢＳ、０．０１％過酸化水素及び０．８ｍｇ／ｍｌ Ｏ-フェニレンジアミドを含有する溶液を添加することによって検出した。２０分間置いて発色させ、次いで等量の１Ｍ リン酸を添加することによって消光した。４９２ｎｍの吸光度をプレート読み取り機(Thermo LabSystems)にて測定した。ビオチン-ＢＲ３-ＥＣＤ結合阻害のＩＣ５０を測定するために、４-パラメータ方程式(１)を用いて、競合物質の濃度に対する吸光度を分析した。
(１) ((ｍ１−ｍ４)／(１＋(ｍ０／ｍ３)＾ｍ２))＋ｍ４
ここで、ｍ１は競合物質のないときの吸光度、ｍ４は無限のインヒビター濃度の吸光度、ｍ０は競合物質の濃度、ｍ３はＩＣ５０値である。
表３
Figure 2008526205
２.１、９.１、８.Ｇ４及び１１Ｇ９は、完全長ＢＲ３細胞外ドメインの親和性と同じ親和性で２６残基ミニＢＲ３を結合した(表３)。また以下に示すように、これらの抗体はＢＡＦＦへのＢＲ３結合を阻止(ブロック)した。また、ミニＢＲ３へ同様に結合しない３.１及び１２Ｂ１２抗体はＢＡＦＦ-ＢＲ３相互作用をブロックしなかった。
実施例３ ヒト化抗体
(ａ) 材料および方法
以下の残基番号はカバットに従う(Kabat 等, Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。一文字アミノ酸表記を用いる。ＤＮＡ縮重はＩＵＢコードを用いて表す(Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ)。
アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接的な高頻度可変領域の融合
マウスの２.１、１１Ｇ９及び９.１由来のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、ヒトコンセンサスκI(ｈｕＫＩ)およびヒトサブグループIIIコンセンサスＶＨ(ｈｕIII)ドメインと整列配置した。ＣＤＲ移植片を作るために、３つの位置：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３ＴおよびＬ７８Ａ (Carter 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992))がヒトサブグループIIIコンセンサスＶＨドメインと異なるアクセプターＶＨフレームワークとｈｕＫＩを用いた。図１−３の太字を参照のこと。マウスの２.１(ｍｕ２.１)、１１Ｇ９(ｍｕ１１Ｇ９)及び９.１(ｍｕ９.１)抗体の高頻度可変領域は、直接のＣＤＲ-移植片(２.１移植片、１１Ｇ９移植片及び９.１移植片)を生成するために、アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク内に操作した(図１−３)。ＶＬドメインでは、以下の領域をヒトコンセンサスアクセプター：位置２４-３４(Ｌ１)、５０-５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)に融合した(カバット番号付けシステム)。ＶＨドメインでは、位置２６-３５(Ｈ１)、４９-６５(Ｈ２)及び９４-１０２(Ｈ３)を移植した(図１−３)。MacCallum 等(MacCallum 等 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))は、抗体と抗原複合体結晶構造を分析して、重鎖の位置９３と９４が接触領域の一部であることを発見したため、抗体をヒト化する際にＣＤＲ-Ｈ３の定義においては当然これらの位置が含まれるようである。ファジミドは移植したＣＤＲ-ヒトフレームワーク配列をコードする核酸配列を含んだ。ファジミドは一価性のＦａｂ-ｇ３表出ベクターであり、ｐｈｏＡプロモータの制御下に２つのオープンリーディングフレームを含有した。第一のオープンリーディングフレームはアクセプター軽鎖のＣＨ１ドメインとＶＬに融合するｓｔIIシグナル配列からなり、第二のオープンリーディングフレームはアクセプター重鎖のＣＨ１ドメインとＶＬに融合するｓｔIIシグナル配列とその後の微量ファージコートタンパク質Ｐ３からなる。
直接の移植片変異体は、各々の高頻度可変領域の異なるオリゴヌクレオチドを用いたキュンケル突然変異誘発法によって生成した。適切なクローンをＤＮＡ塩基配列決定によって、評価した。
高頻度可変領域の穏やかなランダム化(Soft randomization)−
各々の移植抗体について、配列多様性は、マウスの高頻度可変領域配列に対するバイアスを維持する穏やかなランダム化法を用いて、各々の高頻度可変領域に導入した。これは、Gallop 等, J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994)に記述されるように、毒性オリゴヌクレオチド合成法を用いて行った。変異させる高頻度可変領域内の位置を特定するために、野生型アミノ酸をコードするコドンの各々の位置に、平均５０パーセントの突然変異率となるようにヌクレオチドの７０-１０-１０-１０混合物にて毒性を与えた。
穏やかにランダム化されたオリゴヌクレオチドを、マウスの高頻度可変領域配列に従ってパターン化し、直接的な高頻度可変領域移植片によって定められる同じ領域を包含させた。ＶＨドメインのＨ２の初めのアミノ酸位(位置４９)は、コドンＲＧＣを用いてＡ、Ｇ、Ｓ又はＴに配列多様性を限定した。
ファージライブラリの生成−
各々の高頻度可変領域について設定したランダム化オリゴヌクレオチドプールを、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭ トリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび、５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含む２０μｌの６つの反応溶液中で、３７℃で１時間によって別々にリン酸化した。次いで、６つのリン酸化オリゴヌクレオチドプールを、オリゴヌクレオチド対鋳型比が３となるように、２０μｇのキュンケル鋳型と、終容量５００μｌの５０ｍＭ トリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中で混合させた。混合物を９０℃で４分間、５０℃で５分間アニールさせ、氷上で冷ました。過剰な、アニールされていないオリゴヌクレオチドは、アニールされたＤＮＡの過剰な変性を避けるために変更したプロトコールを用いてＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ精製キット(Qiagenキット２８１０６)により除去した。５００μｌのアニールされた混合物に、１５０μｌのＰＢを添加し、混合物を２つの二酸化ケイ素カラムに分割した。それぞれのカラムを７５０μｌのＰＥで洗浄し、カラムを乾燥させるために余計に回転させた後、各々のカラムを、１１０μｌの１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８にて溶出した。次いで、アニールして精製した鋳型(２２０μｌ)を、１μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、１０μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ(各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ)、１５μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２５μｌの１０×ＴＭバッファ(０．５Ｍ トリスｐＨ７.５、０.１Ｍ ＭｇＣｌ２)、２４００ＵのＴ４リガーゼ、および３０ＵのＴ７ポリメラーゼを充填して、室温で３時間置いた。
充填した生成物を、トリス-酢酸塩-ＥＤＴＡ／アガロースゲルにて分析した(Sidhu 等, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000))。３つのバンドが正常に観察された：下部バンドは正常に充填されてライゲーションされた生成物であり、真ん中のバンドは充填されたがライゲーションされなかった生成物であり、上部バンドは鎖置換された生成物である。上部バンドは、Ｔ７ポリメラーゼの内因性の副活性により生産されるものであり、避けるのは難しい(Lechner 等, J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983))、しかしながら、このバンドは、上部バンドの３０分の１より低い効率で形質転換するもので、通常ライブラリにほとんど関与しない。真ん中のバンドは、最終ライゲーション反応のための５'リン酸塩がないことによる、このバンドは効率よく形質転換するものであり、主に野生型配列を示す。
Sidhu 等, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)に記述されるように、充填された生成物を精製し、ＳＳ３２０細胞に電気穿孔して、Ｍ１３／ＫＯ７ヘルパーファージ存在下にて広げた。ライブラリサイズは、１− ２×１０９の独立クローン の範囲とした。最初のライブラリからのランダムなクローンを配列決定して、ライブラリの質を評価した。
ファージ選別−
ヒトＢＲ３ｅｃｄ又は変異体ＢＲ３-Ｆｃ融合(ｖＢＲ３-Ｆｃ)をファージ選別のための標的として用いた(Kayagaki 等. Immunity 17:515-524 (2002)及びPelletier 等 J. Biol. Chem. 278:33127-33133 (2003))。１０μｇ／ｍｌのＢＲ３ｅｃｄ又はｖＢＲ３-Ｆｃを含むＰＢＳにてMaxiSorpマイクロタイタープレート(Nunc)上をコートした。最初の選別ラウンドでは、標的として８ウェルを用いた、標的の単一ウェルを選別の連続ラウンドに用いた。ウェルを、カゼインブロッカー(Pierce)を用いて１時間、反応を停止した。ファージを培養液上清から回収し、１％ＢＳＡおよび０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＢＴ)に懸濁した。２時間、ウェルに結合させた後、結合していないファージは、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)にてさらに洗浄することによって、除去した。結合したファージは、５０ｍＭ ＨＣｌ、０．５Ｍ ＫＣｌにて３０分間インキュベートすることによって、溶出させた。ファージは、Ｔｏｐ10細胞およびＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅させ、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌカルバネシリン(carbanecillin)中で終夜、３７℃生育させた。標的のコートしたウェルから溶出されるファージの力価は、非標的のコートウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。
また、ファージライブラリを溶液分類法を用いて分類した(Lee, C.V., 等 (2004) J. Mol. Biol 340(5):1073-93)。スルホ-ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチン(Pierce)(ｂ-ｖＢＲ３-Ｆｃ)を用いてｖＢＲ３-Ｆｃをビオチン化した。マイクロタイタウェルを、１０μｇ／ｍｌニュートラビジンを含むＰＢＳにて終夜、４℃でコートして、カゼインブロッカー(Pierce)を用いて１時間反応を止めた。最初のパニングは固定したｖＢＲ３-Ｆｃによる標準的なプレート分類法を用いて行った。第二のパニングでは、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)に懸濁した２００μｌのファージを、１００ｎＭ ｂ-ｖＢＲ３-Ｆｃと２時間混合した。ｂ-ｖＢＲ３-Ｆｃに結合したファージは５分間でニュートラアビジンコートウェルに捕獲され、結合していないファージはＰＢＳＴによって、洗い流した。ファージは、１００ｍＭ ＨＣｌを用いて３０分間溶出し、中和して、ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs)の存在下にてＸＬ1ブルー細胞(Stratagene)中で増殖させた。その後の分類ラウンドは、以下を除き、同様に行った：ラウンド３での最終的なｂ-ｖＢＲ３-Ｆｃ濃度は２０ｎＭ、ラウンド４及び５での最終的なｂ-ｖＢＲ３-Ｆｃ濃度は１ｎＭとした。ラウンド５で１時間ファージ結合を行った後、１μＭ非ビオチン化ｖＢＲ３-Ｆｃを混合物に添加して６４時間置き、ニュートラビジンに捕獲させた。
ファージＥＬＩＳＡ−
MaxiSorpマイクロタイタープレートを１０μｇ／ｍｌのヒトｖＢＲ３-Ｆｃを含有するＰＢＳにて終夜コートして、カゼインブロッカーにて反応を停止させた。８０μｌの混合物を標的コートウェルに１５分間移して結合しなかったファージを捕獲した後、培養物上清からのファージを組織培養マイクロタイタープレート中で、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて段階的に希釈したｖＢＲ３-Ｆｃとともに１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３(Amersham Pharmacia Biotech)を添加して４０分間置いた(１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて１:５０００)。プレートをＰＢＳＴにて洗浄して、テトラメチルベンジジン基質(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を添加して反応させた。４０５ｎｍの吸光度を溶液の標的濃度の関数としてプロットして、ＩＣ５０を測定した。これは、ファージの表面上に表出されるＦａｂクローンの親和性評価として用いた。
Ｆａｂ産生および親和性決定−
親和性測定のためにＦａｂタンパク質を発現させるため、停止コドンを、ファージディスプレイベクターの重鎖とｇ３の間に導入した。クローンを大腸菌３４Ｂ８細胞内に形質移入して、ＡＰ５培地にて３０℃で生育させた (Presta 等 Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997))。細胞を遠心分離によって回収して、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８に懸濁して、マイクロフルイダイザーを用いて破壊した。ＦａｂはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィにて精製した。
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００を用いた表面プラスモン共鳴によって、親和性分析を行った。ｖＢＲ３-Ｆｃ又はｈＢＲ３ｅｃｄを、１０ｍＭ 酢酸塩 ｐＨ４．５ (それぞれ２２０又は１００応答単位(ＲＵ))にてＣＭ５センサーチップに固定し、ＰＢＳＴにて２倍に希釈したＦａｂ(６．２５から１００ｎＭ)を注入した。２分間の結合と２０分間の解離を行って各試料を分析した。各注入後、１０ｍＭ グリシン ｐＨ１．５を用いてチップを再生成した。結合応答は、ＲＵを空のフローセルから減算することによって補正した。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルを動態分析のために用いた。
(ｂ) 結果および考察
２.１、１１Ｇ９及び９.１のヒト化−
ヒト化のために使用するヒトアクセプターフレームワークはハーセプチン(登録商標)抗体に用いるフレームワークに基づくものであり、コンセンサスヒトκIＶＬドメインおよびヒトサブグループIIIコンセンサスＶＨドメインの変異体からなる。変異体ＶＨドメインには、ヒトコンセンサスからの３つの変異：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３ＴおよびＬ７８Ａがある。マウス２.１、１１Ｇ９及び９.１のＶＬドメインおよびＶＨドメインを、ヒトκIおよびサブグループIIIドメインとそれぞれ整列配置し、各々の相補性領域(ＣＤＲ)を特定し、次いで、ファージ上でＦａｂとして表出されうるＣＤＲ移植片を生成するためにヒトアクセプターフレームワークに融合した。２.１、１１Ｇ９又は９.１のＣＤＲ移植片を表出するファージを固定したｖＢＲ３-Ｆｃへの結合について試験したところ、結合親和性はわずかであった。
各ＣＤＲ移植片のＣＤＲ領域が穏やかにランダム化されている各抗体についてＣＤＲ修復ライブラリを作製した。各ＣＤＲ移植片ライブラリは、４ラウンドの選別のために固定されたｖＢＲ3-Ｆｃに対してパンした。濃縮(enrichment)は、９.１に対応するＣＤＲ移植片について観察されるだけであった。ＤＮＡ配列分析のためにクローンを選択して、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｈ１に標的とした配列変化を示した(図４)。ｖＢＲ３-ＦｃファージＥＬＩＳＡを使用してクローンをスクリーニングし、選択されたクローンを発現されたＦａｂタンパク質を用いたＢｉａｃｏｒｅによって、さらに分析した。９.１-７０及び９.１-７３の２つのクローンは、キメラ９.１Ｆａｂに比例してｖＢＲ３-Ｆｃへの結合の改善を示した(図１０)。
ＣＤＲ修復により２.１-移植片及び１１Ｇ９-移植片に結合が集まらなかったので、我々はマウスとアクセプタフレームワークとの相違を調べた。面白いことに、２.１及び１１Ｇ９ 並びに９.１は、我々がまず最初に使用したアクセプタフレームワークより位置７１および７８のヒトコンセンサスサブグループIII配列により密接に似ていた(図５)。このことから、我々は、「ＲＬ」及び「ＲＦ」の２つの新規のフレームワークを用いてＣＤＲ修復を調べた。これらのフレームワークは、Ｒ７１がコンセンサス内に存在し、修復される点でアクセプタフレームワークと異なり、位置７８は、ロイシンとしてコンセンサスに変化されている(ＲＬ)か、フェニルアラニンを挿入することによって、この位置でマウスのフレームワークと似るように修飾されている(ＲＦ)。これらのフレームワーク変化により、ｖＢＲ３-Ｆｃへの２.１及び１１Ｇ９ファージ結合が適度に改善された。ＲＬ又はＲＦのフレームワーク(９.１-ＲＬ又は９.１-ＲＦ)に移植された９.１ＣＤＲの結合は、大いに向上した(図６)。
各々の抗体／フレームワーク移植片：２.１-ＲＬ、２.１-ＲＦ、１１Ｇ９-ＲＬ、１１Ｇ９-ＲＦ、９.１-ＲＬ及び９.１-ＲＦの各々の６つのＣＤＲにおいて、同時に穏やかにランダム化して、前述の通りＣＤＲ修復ライブラリを生成した。これらの選別のために、溶液分類方法を用いて、親和性ベースのファージ選択方法の効率を上げた。ビオチン化した標的濃縮物を操作して、ファージ捕獲時間を少なくしてバックグラウンドを下げ、そして非ビオチン化標的物を付加して解離速度の速いクローンを取り除くことによって、高親和性クローンをうまく選択できる(Lee, C.V., 等 J. Mol. Biol. (2004) 340(5): 1073-93)。方法の段落で述べたように、ｂ-ｖＢＲ３-Ｆｃを利用して別々に１２のライブラリを分類した。
５ラウンドの選別後、各々のライブラリの個々のクローンのＤＮＡ配列を分析した。ｖＢＲ3-ＦｃファージＥＬＩＳＡを用いてクローンをスクリーニングし、発現されたＦａｂタンパク質を用いたＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)によって、選択したクローンをさらに分析した。いくつかのクローンは、キメラ抗体の単量体親和性に達しているかそれを上回るＢＲ３結合親和性を有することが同定された。
９.１-ＲＬ及び９.１-ＲＦライブラリ配列について、再びＣＤＲ-Ｈ１に変異を濃縮すると、このＣＤＲの再設計が抗原結合の修復に重要であることが示された(図８)。特に、突然変異Ｍ３４Ｉは様々なクローンに含まれることが多い。ＣＤＲ-Ｈ１の他の頻繁にみられる変化にＡ３１Ｇ及びＴ２８Ｐがあるが、ＣＤＲ-Ｈ１の全体にわたって多くの他の置換が含まれているようである。これらの結果から、ヒトフレームワークに移植された９.１の親和性を修復できる複数の配列変化があること、及びこの抗体がフレームワーク変化(例えば９.１-ＲＦ)又はＣＤＲ-修復(例えば９.１-７０及び９.１-７３)によって、ヒト化して初めのマウス抗体の親和性を上回る親和性が生成できることが明らかである。
１１Ｇ９ライブラリについて、ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３に配列変化が観察されたＣＤＲ修復ライブラリの鋳型として１１Ｇ９-ＲＦを使用する場合にのみ濃縮が観察された(図８)。しかしながら、２つの最も高い親和性クローンの各々はＣＤＲ-Ｈ3に類似の変化を有し、両クローンは、変化Ｄ９６Ｎ、Ｇ９７Ｄ及びＷ１００Ｌを含有した。これらのクローンの親和性は、単量体マウス１１Ｇ９親和性の１０倍よりも大きかった。
濃縮は、２.１-ＲＬ及び２.１-ＲＦライブラリの両方に観察された(図７)。面白いことに、ＣＤＲ-Ｈ３を標的とする同様な配列変化が両ライブラリに観察された。実際に、２例において、ＣＤＲ-Ｈ３に対する変化は、ライブラリ(９４-９７ＮＳＮＦ及び９５-９７ＴＬＰ)の間で同一であった。驚くことに、これは、ライブラリ設定のために導入される配列多様性となりうる。両ライブラリにおいて、観察される配列の一般的な種類には、位置９５及び９７の他の変化とＴ９４Ｎ及びＨ９６Ｎとの組合せ(例えば９４-９７ＮＳＮＦ、９４-９７ＮＬＮＹ及び９４-９７ＮＡＮＹ)が含まれていた。これらの変異体は、ｖＢＲ３-Ｆｃ又はｈＢＲ３ｅｃｄに対して最も高い親和性を有する傾向にあった。実際に、クローン２.１-３０(９４-９７ＮＬＮＹ)の親和性は、単量体マウス２.１の親和性を上回るものであった。
ヒト化のための変化の概要
抗体のヒト化のために、６つのマウス９.１ＣＤＲの移植片(位置２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)、８９−９７(Ｌ３)、２６−３５(Ｈ１)、４９−６５(Ｈ２)及び９４−１０２(Ｈ３)と定める)を根幹としたヒトのコンセンサスκI ＶＬ及びサブグループIII ＶＨドメイン内に、２つの方法が同定されている。一つは、新規のＣＤＲ-Ｈ１配列の選別及びＣＤＲ-Ｌ２内の２つの変化に加えて、ハーセプチン(商標登録)抗体内に存在する３つのフレームワーク変化(Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ａ)を利用したものである。これによって、キメラ９.１Ｆａｂの親和性よりほぼ２倍高い親和性を有するヒト化変異体(９.１-７０)となる。二つめの方法は、フレームワーク内に２つの変化(Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ｆ)を加えて、ＣＤＲに変化を加えない(９.１-ＲＦ)ことによって、やはりキメラ９.１Ｆａｂの親和性よりほぼ２倍高い親和性とするものである。
６つのマウス１１Ｇ９ ＣＤＲの移植片(位置２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)、８９−９７(Ｌ３)、２６−３５(Ｈ１)、４９−６５(Ｈ２)及び９４−１０２(Ｈ３)と定める)を根幹としたヒトコンセンサスκI ＶＬ及びサブグループIII ＶＨドメイン内の、フレームワークに２つの変化(Ｎ７３ＴおよびＬ７８Ｆ)とＣＤＲ-Ｈ３に３つの変化(Ｄ９６Ｎ、Ｇ９７Ｄ及びＷ１００Ｌ)を加えることにより、キメラ１１Ｇ９Ｆａｂ親和性と比例して１０倍より大きく改善した親和性を有する完全なヒト１１Ｇ９抗体(１１Ｇ９-４６)となる。
６つのマウス２.１ＣＤＲの移植片(位置２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)、８９−９７(Ｌ３)、２６−３５(Ｈ１)、４９−６５(Ｈ２)及び９４−１０２(Ｈ３)と定める)を根幹としたヒトコンセンサスκI ＶＬ及びサブグループIII ＶＨドメイン内に、フレームワークに１つの変化(Ｎ７３Ｔ)とＣＤＲ-Ｈ３に４つの変化(Ｔ９４Ｎ、Ｐ９５Ｌ、Ｈ９６Ｎ及びＴ９７Ｙ)を加えることによって、キメラ２.１Ｆａｂ親和性と比例して改善した親和性を有する完全なヒト２.１抗体(２.１-３０)となる。
選択されたクローンを用いたｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイの結果は図１０に示す。
実施例４ ナイーブファージライブラリ由来の抗ＢＲ３抗体
ＢＲ３を結合する更なる抗体は、まず最初にファージディスプレイ合成抗体ライブラリから選択した。このライブラリは、後述するように、重鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)内の溶解性の露出した位置に合成多様性を導入することによって、単一のヒトフレームワークに構築されたものである。
(ａ) ライブラリ構築のためのファジミドベクター
ファジミドｐＶ０３５０-２ｂ及びｐＶ０３５０-４は、Ｍ１３ファージ粒子の表面上に、一価性又は二価性に、それぞれＦａｂ鋳型を表出するように設計した。
Ｆａｂ鋳型はｈ４Ｄ５抗体に基づいており、この抗体はＨｅｒ-２(ｅｒｂＢ２)として知られている癌関連抗原を特異的に認識するヒト化抗体である。ｈ４Ｄ５配列は、ｈｕｍＡｂ４Ｄ５バージョン８(「ｈｕｍＡｂ４Ｄ５-８」)配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、得られた(Carter 等, (1992) PNAS 89:4285-4289)。ｈ４Ｄ５核酸配列は、ヒトコンセンサス配列Ｆａｂフレームワーク内に、Ｈｅｒ-２に特異的なマウスモノクローナル抗体を修飾したＣＤＲ領域をコードする。具体的には、配列は、ＶＨドメイン及びＣＨ1ドメイン(ＨＣ領域)の上流にκ軽鎖(ＬＣ領域)を含有する。抗Ｈｅｒ-２抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同定方法は、米国特許第5,821,337号及び同第6,054,297号に示されている。
ｐｈｏＡプロモータの制御下に、ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)のファージディスプレイのために使われる先に述べたファジミド(ｐＨＧＨａｍ-ｇIII)を修飾することによって、ベクターｐＶ０３５０-２ｂを構築した。Ｍ１３微量コートタンパク質Ｐ３(ｃＰ３)のＣ末端ドメインに融合したｈＧＨとｓｔII分泌シグナル配列をコードするｐｈＧＨａｍ-ｇIIIのオープンリーディングフレームを、２つのオープンリーディングフレームを含有するＤＮＡ断片に置き換えた。第一のオープンリーディングフレームはｈ４Ｄ５軽鎖(バージョン８)をコードし、第二のオープンリーディングフレームはｃＰ３に融合したｈ４Ｄ５重鎖の第一定常(ＣＨ１)ドメインと可変(ＶＨ)ドメインをコードした。各々のタンパク質は、Ｎ末端ｓｔIIシグナル配列により分泌された。重鎖断片とｃＰ３間のアンバー停止コドンを欠失させると、ファージ上に表出されるＦａｂのレベルが増えることが示されている。エピトープタグをｈ４Ｄ５軽鎖のＣ末端に加えた(ｇＤタグ)。記載されるように、重鎖ＣＨ１ドメインとｃＰ３間のＧＣＮ４ロイシンジッパーをコードするＤＮＡ断片の挿入を除いて、二価性ディスプレイのためのベクター(ｐＶ０３５０-４)はｐＶ０３５０-２ｂと同一であった。さらに、軽鎖遺伝子は、天然の抗体配列のカバットデータベースにおいて、最も共通してみられるアミノ酸をコードするために、両ファジミドの３つの位置を修飾した、具体的には、Ａｒｇ６６はＧｌｙに変え、Ａｓｎ３０及びＨｉｓ９１はＳｅｒに変えた。これらの変化は、ファージ上のＦａｂ発現及びディスプレイを増やすためのものである。Kunkel 等の方法を用いて部位特異的突然変異を行った(Kunkel, J. D., 等, (1987) Methods Enzymol 154:367-82)。
(ｂ) ライブラリ構築
記載されるように(Lee, C.V., 等, (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132、Lee, C.V., 等, (2004) JMB 340:1073-1093)、ｐＶ０３５０-２ｂ又はｐＶ０３５０-４の「停止鋳型」バージョンとオリゴヌクレオチド誘導性突然変異誘発を用いてファージディスプレイライブラリを作製した。停止コドン(ＴＡＡ)を３つすべての重鎖ＣＤＲに埋め込んだ。ＣＤＲ-Ｈ１、-Ｈ２及び-Ｈ３をコードする配列に対してアニールし、ランダム化のために選択した位置のコドンをあつらえた変性コドンに置き換える変性オリゴヌクレオチドの混合によって、この停止コドンは突然変異誘発反応の間に修復された。突然変異誘発反応物を大腸菌ＳＳ３２０細胞内に電気穿孔し、培養物をＫＯ７ヘルパーファージ、５０ｇ／ｍｌのカルベニシリン及びび５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した２ＹＴ培養液中で３０℃で終夜培養した。記載されるように(Sidhu, S.S. 等, (2000), Methods Enzymol. 328:333-363)、ＰＥＧ／ＮａＣｌを用いた沈殿法によって、ファージを培養物から回収した。各々の電気穿孔反応物には１０１１以下の大腸菌細胞と１０ｕｇ以下のＤＮＡを使用し、１×１０９−５×１０９の形質転換体を生じさせた。
ＣＤＲ-Ｈ１及びＣＤＲ-Ｈ２(上掲のLee, C.V, 等, (2004), JMBの表１)の天然の多様性と類似するようにあつらえた変性オリゴヌクレオチドによって、異なるライブラリを作製した：Ｆａｂ.ｚｉｐ鋳型を有するライブラリ３(Ｌｉｂ-３)。上掲のLee, C.V, 等, (2004)に記載のＬｉｂ-３を参照のこと。ＣＤＲ-Ｈ１及びＣＤＲ-Ｈ２の２ないし４のオリゴヌクレオチドを結合して、天然の多様性の範囲を増やした。Ｌｉｂ-３には、ＣＤＲ-Ｈ1及びＣＤＲ-Ｈ２それぞれについて、オリゴヌクレオチドＨ１ａ及びＨ１ｂ(比２:１)及びＨ２ａ-ｃ(比１:２：０．１)を使用した(オリゴヌクレオチドの記載について、上掲のLee, C.V. 等 (2004), JMBの表１を参照のこと)。
ＣＤＲ-Ｈ３の位置９５-１００について、Ｌｉｂ-３は、ＮＮＳコドン(又はＮＮＫコドン)又はトリプレットコドンの各々の位置で不均一なヌクレオチド比を含有するＮＮＳコドン(ＸＹＺコドン)の修飾バージョンの何れかを含んでなる伸展したＣＤＲ-Ｈ３長を有する一組のライブラリからなる。ＮＮＳコドンは３２のコドンを包含し、２０すべてのアミノ酸をコードする。Ｘは、３８％のＧ、１９％のＡ、２６％のＴ及び１７％のＣを含有した、Ｙは、３１％のＧ、３４％のＡ、１７％のＴ及び１８％のＣを含有した、そして、Ｚは、２４％のＧ及び７６％のＣを含有した。Ｌｉｂ-３のＣＤＲ-Ｈ3設定は、上掲のLee, C.V. 等, (2004)の表５に記述される。別々に突然変異誘発反応を行い、共に電気穿孔する長さ７及び８の残基を除いて、各ＣＤＲ-Ｈ３長を電気穿孔した。
各ライブラリの完全なＦａｂのファージディスプレイレベルは、４８のランダムに選択されたクローンの抗ｇＤ抗体への結合を測定することによって、調べた。Ｌｉｂ-３について、最も長いＣＤＲ-Ｈ３(１５−１９残基)を組み込むライブラリがＦａｂディスプレイクローンの割合を減少する(１５−３０％)ことを除いて、異なるＣＤＲ-Ｈ３長のディスプレイが同じレベルであった。これは、非常に長い合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、突然変異誘発効率が下がることを示しているようである。
ファージ選別
Ｆ(ａｂ)'２(ＣＤＲ-Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ランダム化)合成ファージ抗体ライブラリを用いて、ＢＲ３のマウス細胞外ドメイン(ｍＢＲ３-ＥＣＤ)、ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したマウスＢＲ３細胞外ドメイン(ｍＢＲ３-Ｆｃ)、ヒトＢＲ３細胞外ドメイン(ｈＢＲ３-ＥＣＤ)及びＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＢＲ３の細胞外ドメイン(ｖＢＲ３-Ｆｃ)をプレート上で分類した。９６ウェルNunc Maxisorpプレートを１００μｌ／ウェルの標的抗原(ｍＢＲ３-ＥＣＤ、ｍＢＲ３-Ｆｃ、ｈＢＲ３-ＥＣＤ及びｖＢＲ３-Ｆｃ) (５ｕｇ／ｍｌ)を含むコートバッファ(０．０５Ｍ 炭酸ナトリウムバッファ, ｐＨ９．６)にて４℃で終夜、又は室温で２時間かけてコートした。プレートは、６５μｌの１％ブロッキングタンパク質にて３０分間、４０μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０にてさらに３０分間かけてブロックした(ブロッキングタンパク質：第一ラウンド−ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、第２ラウンド−オバルブミン、第３ラウンド−ミルク、第４ラウンド−ＢＳＡ)。次に、ファージライブラリを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を有する１％ＢＳＡにて３〜５ Ｏ．Ｄ／ｍｌに希釈した(１Ｏ．Ｄ＝１．１３×１０１３ファージ／ｍｌ)。一般に、ファージインプットは、第１ラウンド ３−５Ｏ．Ｄ／ｍｌ、第２ラウンド ３Ｏ．Ｄ／ｍｌ、第３ラウンド ０．５−１Ｏ．Ｄ／ｍｌ、及び第４ラウンドインプット ０．１〜０．５Ｏ．Ｄ／ｍｌであった。希釈したファージを室温で３０分間インキュベートした。ウェルを、少なくとも５回連続的にＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。８つの標的抗原コートウェルと２つのコートしていないウェルにブロックしたファージライブラリを１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間置いた。プレートを、少なくとも１０回連続的にＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。ファージを、室温にて２０分間、１００μｌ／ウェルの１００ｍＭ ＨＣｌで溶出した。溶出したファージ(コートウェルから)及びバックグラウンドファージ(コートしていないウェルから)は、別々のチューブに回収した。溶出した回収物を、両方のチューブに１／１０量の１Ｍトリス ｐＨ１１．０を加えることによって中和した。溶出したファージのチューブに最終濃度０．１%となるようにＢＳＡを加えた。溶出したファージを６２℃で２０分間熱した。ファージを滴定するために、９０μｌの対数期ＸＬ−１(ＯＤ６００ｎｍ ０．１−０．３)を１０μｌの溶出したファージ又はバックグラウンドファージに、３７℃で３０分間感染させた。次に、感染した細胞を９０μｌの２ＹＴにて連続的に１０倍数増加希釈を行った。１カルベニシリンプレート当たり感染した細胞分量１０μｌを播いた。
ファージを繁殖させるために、およそ４００μｌの溶出ファージを用いて、４ｍｌ以下の対数期ＸＬ−１ｓｏｕｐ(ＯＤ６００ｎｍ〜０．１−０．３)を３７℃で３０−４５分間感染させた。ヘルパーファージＫＯ７及びカルベニシリンを、最終濃度１×１０１０のｐｆｕ／ｍｌ ＫＯ７及び５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンとなるように、３７℃で更に１時間感染溶液に加えた。培養物を、最終量２０−２５ｍｌになるように、カルベニシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２ＹＴ培養液中にて３７℃で一晩(又は少なくとも１７時間)成育させた。ファージ回収率を増やすために、翌日、培養をさらに３０℃で２時間成育させた。
ファージは、８０００ｒｐｍで１０分間細胞を遠心沈殿することによって精製した。上清を回収した。上清の１／５量の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを加え、混合し、５分間氷上に置いた。ファージは、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を回収して、再び５０００ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットを、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、透明になるように１２０００ｒｐｍで１５分間遠心した。ＰＥＧ／ＮａＣｌ添加から始めた工程を、再懸濁したペレットで繰り返した。再懸濁ファージペレットのＯＤを２７０ｎｍで読んだ。ファージ選別の第２、第３及び第４のラウンドは、上記のファージ選別を繰り返して完了した。
ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ
３〜４ラウンドで得たクローンをＥＬＩＳＡアッセイによって特性及び親和性についてスクリーニングした。ポジティブクローン(結合体(binders))は、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング(阻止)タンパク質には結合せず、標的抗原(ｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤ)に対してバックグラウンド以上に結合するクローンである。
最初に、３８４ウェルマイクロタイタプレートのウェルを、１ウェルあたり２０μｌ(コーティングバッファ中に１μｇ／ｍｌ)のｍＢＲ３-ＥＣＤ、ｈＢＲ３-ＥＣＤ及び抗ｇＤにて、４℃で一晩又は室温で２時間でコートした。
Figure 2008526205
他の９６ウェルプレートに、３及び４ラウンドで得たクローンを５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリン及びヘルパーファージＫ０７を含む１５０μｌの２ＹＴ培養液１５０μｌにて３７℃で一晩成育した。プレートを２５００ｒｐｍで２０分間遠心沈殿した。５０μｌの上清をコートしたウェルプレート中の１２０μｌのＥＬＩＳＡバッファー(０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)に加えた。３０μｌの混合液を４分の１の３８４ウェルコーティングプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。結合は、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに７５μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗Ｍ１３抗体を加えて室温で３０分間置いて定量した(Sidhu等、上掲)。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回ウェルを洗浄した。次に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ(H２O２)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。各ウェルに１００μlの１Ｍリン酸(Ｈ３ＰＯ４)((Kirkegaard Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を加えることによって反応を止め、室温で５分間インキュベートした。各ウェルの黄色の４５０ｎｍのＯＤを、標準のＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。ＢＳＡへの結合よりも３倍良好にｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤに結合したクローンを選別した(図１１)。
選別した結合体の配列を決定した。１５の異なるクローンが見つかった(ｍＢＲ３-ＥＣＤの分類から１クローン、ｍＢＲ３-ＥＣＤの分類から６クローン、ｈＢＲ３-ＥＣＤの分類から８クローン、ｈＢＲ３-Ｆｃの分類から０クローン)(図１２)。
溶液結合競合的ＥＬＩＳＡ
選択されたＦ(ａｂ)'２ファージの結合親和性を測定するために、競合的ＥＬＩＳＡ法を行った。
最初に、ファージを繁殖させ、精製した。３７℃で３０分間にて１つのクローンに感染させた１０μｌのＸＬ−１バクテリアをカルベニシリンプレートに播いた。コロニーをピックアップし、３７℃で３−４時間、２ｍｌ(２ＹＴ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン)中で成育させた。ヘルパーファージＫＯ７を最終濃度１０１０ｐｆｕ／ｍｌで培養物に加えて３７℃でさらに１時間置いた。２０ｍｌの培養液(５０μｇ／ｍｌカルベニシリンと５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ＹＴ)を培養物に加えて、３７℃で一晩成育させた。ファージは上記の通りに精製した。
第二に、以下の競合的ＥＬＩＳＡアッセイの使用に最適となる精製したファージの濃度を決定した(すなわち、コートしたプレート上でのおよそ９０%の最大結合能)。９６ウェルNunc Maxisorpプレートを２μｇ／ｍｌのｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｍＢＲ３-Ｆｃを含むコーティングバッファにて、４℃で一晩又は室温で２時間コートした。ウェルに、６５μｌの１％ＢＳＡを加えて３０分間、その後４０μｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えて更に３０分間おいてブロックした。次に、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にてウェルを５回洗浄した。Ｆ(ａｂ)'２ファージを０．１Ｏ.Ｄ.／ｍｌまでＥＬＩＳＡバッファー(ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０)で希釈し、ウェルに加えて室温にて１５分間置いた。ついで、ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも３回洗浄した。１ウェルあたり７５μｌのＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体(Amersham、ＥＬＩＳＡバッファにて１／５０００希釈)を加えて、室温にて３０分間インキュベートした。再び、ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回洗浄した。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ(Ｈ２Ｏ２)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。各ウェルの４５０ｎｍの最適密度ＯＤを、標準のＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。ファージの希釈をＯ.Ｄ.値に対してプロットした。
第三に、競合的ＥＬＩＳＡ法を行った。９６ウェルNunc Maxisorpプレートを２μｇ／ｍｌのｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｍＢＲ３-Ｆｃを含むコーティングバッファにて、４℃で一晩又は室温で２時間コートした。ウェルを、６５μｌの１％ＢＳＡを加えて３０分間、その後４０μｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えて更に３０分間おいてブロックした。次に、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にてウェルを５回洗浄した。上記の結合アッセイに基づいて、１ウェルに、コートプレートに対して約９０%の最大結合を生じるファージ希釈液５０μｌを、５０μｌの様々な濃度のｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｍＢＲ３-Ｆｃ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ(０．１から１０００ｎＭ)を含むＥＬＩＳＡバッファー溶液と共に室温で２時間インキュベートした。結合していないファージは、７５μｌのウェル混合液をｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｍＢＲ３-Ｆｃにてプレコートした２つ目の９６ウェルプレートに移し、室温にて１５分間インキュベートすることによってアッセイを行った。２つ目のプレートのウェルをＰＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも３回洗浄した。１ウェル当たり７５μｌのＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体(ＥＬＩＳＡバッファにて１／５０００に希釈)を加えて、室温にて３０分間インキュベートした。再び、ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回洗浄した。次に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ(Ｈ２Ｏ２)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌの１Ｍ リン酸(Ｈ３ＰＯ４)を加えることによって反応を止め、室温で５分間インキュベートした。各ウェルの４５０ｎｍの最適密度ＯＤを、標準のＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。競合物質であるｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｍＢＲ３-Ｆｃ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-Ｆｃの濃度をＯ.Ｄ.読み取り値に対してプロットした。Ｆ(ａｂ)'２−ファージを５０%阻害するｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｍＢＲ３-Ｆｃ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-Ｆｃの濃度であるＩＣ５０は親和性を表す(表１３)。Ｖ３クローンはマウス及びヒトのＢＲ３の両方に対して高い親和性で結合した。
ｍＢＡＦＦブロッキングＥＬＩＳＡ
これら個々のクローンがリガンド(ＢＡＦＦ)として同様な結合エピトープを有するかを調べるために、ｍＢＡＦＦブロッキングＥＬＩＳＡを以下の通りに行った：９６ウェルNunc Maxisorpプレートを２μｇ／ｍｌのｍＢＲ３-Ｆｃを含むコーティングバッファにて、４℃で一晩又は室温で２時間コートした。ウェルを、６５μｌの１％ＢＳＡを加えて３０分間、その後４０μｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えて更に３０分間おいてブロックした。次に、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にてウェルを５回洗浄した。様々な濃度のｍＢＡＦＦ-Ｆｌａｇタンパク質を含むＥＬＩＳＡバッファをウェル中で室温で３０分間インキュベートした。そして、個々の配列のＦ(ａｂ)'２ファージを、通常ｍＢＡＦＦ-Ｆｌａｇタンパク質がない条件下で９０％の結合能を示す濃度で各ウェルに加えて１０分間置いた。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にてウェルを５回洗浄した。
０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに７５μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗Ｍ１３抗体を加えて室温で３０分間置いて結合を定量した(Sidhu等、上掲)。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回ウェルを洗浄した。次に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ(Ｈ２Ｏ２)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えた。各ウェルに１００μlの１Ｍ リン酸(Ｈ３ＰＯ４)を加えることによって反応を止め、室温で５分間インキュベートした。各ウェルの４５０ｎｍのＯＤを、標準のＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。結果を図１３及び図１４に示す。
さらに、一価形式のＢＡＦＦブロッキングＥＬＩＳＡを同様に行った。ｍＢＲ３-ＥＣＤコートプレートを用いることによって、様々な濃度のハイブリッドＢＡＦＦタンパク質を含むＥＬＩＳＡバッファをウェル中で室温で３０分間インキュベートした。次いで、個々の配列のＦ(ａｂ)'２ファージを、通常ハイブリッドＢＡＦＦタンパク質がない条件下で９０％の結合能を示す濃度で各ウェルに加えて１０分間置いた。以下の工程を前述に記載の通りに行った。結果を図１３に示す。
図１４は、クローン３(Ｖ３)が容易にＢＡＦＦ-ＢＲ３結合をブロックしたことを示す。Ｖ３の可変領域配列を図１５に示す。
Ｖ３バックボーンのＦ(ａｂ)'２形式のＦａｂ形式への変更
Ｖ３はＢＡＦＦによるブロッキング活性を最も有し、ｍＢＲ３及びｈＢＲ３の両方に対する異種間結合活性も有するので、Ｖ３は、更なる親和性改善の候補となる抗体である。今後の親和性改善のために一価性の親和性を確認するために、Ｆ２２０オリゴ(5’- TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT-3’) (配列番号154)を用いたＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発によってロイシンジッパーを除去した。さらに、ランダム化体系においてＣＤＲ-Ｌ３の取り込みを確実にするために、ＣＤＲ-Ｌ３内で多様化したい位置に停止コドン(ＴＡＡ)を取り込んだ。Ｆ９オリゴ(5’-TAT TAC TGT CAG CAA CAT TAA TAA AGG CCT TAA CCT CCC ACG TTC GGA-3’) (配列番号155)を用いて、ＣＤＲ-Ｌ３領域内に停止コドンを加えた。
親和性改善のためのＶ３バックボーンにおけるライブラリの構築
親和性改善のために高度(hard)及び低度(soft)のランダム化を設定した。高度ランダム化とは、限定した位置が２０アミノ酸すべてにランダム化されていることを意味する。低度ランダム化とは、特定の位置で、５０％は親のアミノ酸であり、５０％は１９の他のアミノ酸ないしは停止コドンにランダム化されていることを意味する。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発によって、Ｖ３バックボーンをベースとして４つのライブラリを構築した。
V0902-1：CDR-L1(F111+F202=1:1) /L2( F201+F203=1:1)/L3
(F133a:133b:133c:133d=1:1:1:1)
V0902-2：CDR-L3 低度(F232)/ H1 低度(F226) / L2 (F201+F203=1:1)
V0902-3：CDR-H3 soft(F228+F229+F230+F231=1:1:0.5:0.5)/ L3 低度(F232)
V0902-4：CDR-L3 低度(F232)/ H1 低度(F226)/ H2 低度(F227)
オリゴ：
L1 F111 (5’- ACC TGC CGT GCC AGT CAG RDT RKT RVW ANW THT GTA
GCC TGG TAT CAA CAG AAA C -3’) (配列番号156)
F202 (5’-ACC TGC CGT GCC AGT CAG RDT RKT RVW ANW THT CTG
GCC TGG TAT CAA CAG AAA C- 3’) (配列番号157)
L2 F201 (5’-CCG AAG CCT CTG ATT TAC KBG GCA TCC AVC CTC TAC TCT
GGA GTC CCT -3’) (配列番号158)
F203 (5’-CCG AAG CTT CTG ATT TAC KBG GCA TCC AVC CTC GMA
TCT GGA GTC CCT TCT CGC- 3’) (配列番号159)
L3 F133a (5’-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA TMT DMC RVT NHT CCT
YKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC - 3’) (配列番号160)
F133b (5’-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA TMT DMC RVT NHT CCT
TWT ACG TTC GGA CAG GGT ACC - 3’) (配列番号161)
F133c (5’-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA SRT DMC RVT NHT CCT
YKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC - 3’) (配列番号162)
F133d (5’-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA SRT DMC RVT NHT CCT
TWT ACG TTC GGA CAG GGT ACC - 3’) (配列番号163)
低度ランダム化オリゴ記号：5 (70% A, 10% G, 10% C, 10% T)
6 (70% G, 10% A, 10% C, 10% T)
7 (70% C, 10% A, 10% G, 10% T)
8 (70% T, 10% A, 10% G, 10% C)
L3 低度 F232 (5’-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA 567 857 577 577 CCG 776
ACG TTC GGA CAG GGT ACC- 3’) (配列番号164)
H1 低度 F226 (5’-TGT GCA GCT TCT GGC TTC WCC NTT 567 567 557 567 587
757 TGG GTG CGT CAG GCC- 3’) (配列番号165)
H2 低度 F227 (5’-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST 866 ATC 577 776 567 658
668 557 577 658 TAT GCC GAT AGC GTC AAG- 3’) (配列番号166)
H3 低度 F228 (5’-GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT 768 686 TGC 857 567 567
686 768 668 TGC 676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G- 3’)
(配列番号167)
F229 (5’-GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT 768 686 867 857 567 567
686 768 668 867 676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G- 3’)
(配列番号168)
F230 (5’-GCC GTC TAT TAT TGT GCT 768 768 686 TGC 857 567 567
686 768 GGC TGC GCG GGG GCA ATG -3’) (配列番号169)
F231 (5’-GCT CGT CGG GTC TGC TAC 567 567 686 768 668 TGC 676
668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G- 3’) (配列番号170)
ファージの発現
電気穿孔法によって前述の突然変異誘発したＤＮＡにて大腸菌株ＳＳ３２０／ＫＯ７(ＫＯ７感染)を形質転換した。形質転換した細菌細胞を、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンと５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む２ＹＴ培地中で３０℃で２０時間生育させた。記載されているように(Sidhu 等., Methods Enzymol. (2000), 328:333-363)ファージを回収した。簡単に言うと、ファージは、ポリエチレングリコールを用いて終夜培養液からまず沈殿させることによって精製し、ＰＢＳに再懸濁した。ファージは、２６８ｎｍ（１ＯＤ＝１．１３×１０１３／ｍｌ）の測定値の分光光度計によって定量化した。
Ｖ３よりも親和性を改善するためのファージ分類法
親和性改善選別のために、第１ラウンドでのプレート分類にファージライブラリを対象とし、その後第３ラウンドまで溶液分類を行った。プレート分類の第１ラウンドでは、４つのライブラリをｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤのコートプレート(NUNC Maxisorpプレート)に対して別々に分類した。ファージインプットは、１％ ＢＳＡおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中でおよそ３Ｏ.Ｄ／ｍｌであった。以下の工程は、前述のファージ分類セクションの通りである。ｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤに対してライブラリＶ０９０２-２、Ｖ０９０２-３及びＶ９０２-４からファージを溶出して、増殖のためにプールした。
プレート分類の第１ラウンドの後、溶液分類を３回行って、選別のストリンジェンシーを増やした。
Ａ) ｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤのビオチン化
ビオチン化の前に、理想としてはｐＨ７．０以上のアミンフリーバッファにて、標的タンパク質を０．５ｍｇ／ｍｌより多い濃度にした。第一に、ｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤを含有するバッファを、Amicon Ultra 5Kチューブを用いてＰＢＳに交換した。第二に、ＰＢＳ(１００×)にてＮＨＳ-ビオチン試薬の貯蔵物を新しく作製した。およそ３:１モル比の標的タンパク質に対するＮＨＳ-ビオチン試薬を室温で３０分間インキュベートした。次いで、０．１Ｍ トリスｐＨ７．５を加えて、室温で３０分間おいて反応していないＮＨＳを失活させた。
Ｂ) ９６ウェルのNunc Maxisorpプレートを、１００μｌ／ウェルのニュートラビジン(５μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳにて４℃で終夜又は室温で２時間おいてコートした。６５ｕｌのSuperblock(Pierce)にて３０分間、４０μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０にてさらに３０分間置いて、プレートをブロックした。
Ｃ) プレート分類の第１ラウンドにて増殖した１Ｏ.Ｄ.／ｍｌのファージを、１００ｎＭのビオチン化ｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤを含む、１５０〜２００μｌのSuperblock ０．５％及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有バッファとともに室温で少なくとも１時間インキュベートした。さらに、混合物をSuperblock ０．５％にて５〜１０倍に希釈して、１００μｌ／ウェルをニュートラビジンコートウェルに添加し、室温で５分間、ゆっくりと撹拌して、ビオチン化標的をファージに結合させた。ウェルをＰＢＳ-０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて８回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化していない標的を有する対照ウェル含有ファージをニュートラビジンコートプレートに捕獲した。他のコントロール(ニュートラビジン結合コントロール)として、ビオチン化した標的をファージと混合し、ニュートラビジンでコートしていないウェル中でインキュベートした。結合したファージを０．１Ｎ ＨＣｌにて２０分間溶出し、１／１０量の１Ｍ トリスｐＨ１１にて中和し、力価を測定して、次のラウンドのために増殖させた。次に、２回目以降のラウンドの溶液分類は、２５ｎＭおよび１ｎＭにまでビオチン化したｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ濃度を減少して行い、ストリンジェンシーを高めた。また、ファージインプットは、バックグラウンドのファージ結合を低下させるために、０．５Ｏ.Ｄ／ｍｌおよび０．１Ｏ.Ｄ／ｍｌに下げた。
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ(単一スポット競合)
第３および第４ラウンドのスクリーニング物からコロニーを拾い、９６ウェルプレート(Falcon)中の５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび1ｅ １０／ｍｌのＫＯ７を含む２ＹＴ培地 １５０ｕｌ／ウェルにて３７℃で終夜生育させた。同じプレートから得たＸＬ-１感染Ｖ３ファージのコロニーをコントロールとした。
９６ウェルNunc Maxisorpプレートを、１００μｌ／ウェルのｍＢＲ３-ＥＣＤ(２ｕｇ／ｍｌ)を含むコーティングバッファにて、４℃で終夜又は室温で２時間かけてコートした。６５ｕｌの１％ ＢＳＡにて３０分間、４０μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０にてさらに３０分間置いて、プレートをブロックした。
ファージ上清を、１００ｎＭのｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤを含む又は含まないＥＬＩＳＡバッファ(０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)にて１:１０に希釈して全量を１００μｌとし、Ｆプレート(NUNC)にて室温(ＲＴ)で少なくとも１時間インキュベートした。ｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤを含む又は含まない７５ｕｌの混合物を、ｍＢＲ３-ＥＣＤコートプレートに並んで移した。プレートに穏やかに１０〜１５分間ショックを与えて、ｍＢＲ３-ＥＣＤコートプレートに結合していないファージを捕獲した。プレートを、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡバッファ(１：５０００)に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗Ｍ１３抗体を加えて定量して、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回ウェルを洗浄した。次に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ(Ｈ２Ｏ２)((Kirkegaard Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。各ウェルに１００μlの１Ｍリン酸(Ｈ３ＰＯ４)((Kirkegaard Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を加えることによって反応を止め、室温で５分間インキュベートした。各ウェルの黄色の４５０ｎｍのＯＤを、標準のＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。ＯＤ減少(％)は、以下の方程式によって、算出した。
ＯＤ４５０ｎｍ減少(％)＝(競合物質を含むウェルのＯＤ４５０ｎｍ)／(競合物質を含まないウェルのＯＤ４５０ｎｍ)＊１００
Ｖ３ファージのウェルのＯＤ４５０ｎｍ減少(％)(１００％)と比較して、ｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤに対してともに５０％より低いＯＤ４５０ｎｍ減少(％)を有するクローンを選択した。ｍＢＲ３-ＥＣＤに対して分類したＶ０９０２-２、３、４プールライブラリのみから１４のクローンを選択した。ｍＢＲ３-ＥＣＤに対して分類したＶ０９０２-１ ＬＣ高度ランダム化ライブラリ及びｈＢＲ-ＥＣＤに対して分類した両ライブラリからは条件に合うクローンはなかった。これらの１４のクローンの配列決定を行った。最終的に、４つの異なる配列(Ｖ３-１、Ｖ３-１１、Ｖ３-１２ Ｖ３-１３)があった。４つすべての異なるクローンは、Ｖ３クローンと同じＣＤＲ-Ｌ１及びＣＤＲ-Ｈ２を有しており、このＣＤＲ-Ｌ１及びＣＤＲ-Ｈ２は４Ｄ５ライブラリテンプレートと同一のものである。Ｖ３-１、Ｖ３-１１及びＶ３-１２がライブラリＶ０９０２-３からのものであるのに対して、Ｖ３-１３はライブラリＶ０９０２-２からのものである。図１６Ａは、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ３領域の配列の一部を示す。
新規のクローンＢＡＦＦの機能的な特徴づけ
Ｖ３クローンと比較したときのＢＡＦＦブロッキング活性を試験するために、Ｖ３由来のクローンについてブロッキングＥＬＩＳＡを行った。４つすべてのクローンはハイブリッドＢＡＦＦに対して競合するブロック活性を示した。これは、４つすべてのクローンがＢＡＦＦと同様なＢＲ３に対する結合エピトープを有することを示す。
さらに、競合ＥＬＩＳＡを行って、ｍＢＲ３-ＥＣＤ、ｈＢＲ３-ＥＣＤおよびミニＢＲ３に対するこれらのファージクローンの親和性を測定した。ミニＢＲ３は、ＢＡＦＦに対する親和性を満たす２６残基のペプチド断片である。ブロッキングＥＬＩＳＡおよびファージ競合ＥＬＩＳＡの結果は、図１６Ｂにまとめる。
細菌細胞中での発現のためのＦａｂコンストラクト
Ｖ３、Ｖ３-１、Ｖ３-１１、Ｖ３-１２およびＶ３-１３ファジミドは、ウイルスｃＰ3配列を取り除き、5'-GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATG-3' (配列番号：１７１)を含有している転写終結区配列にて置き換え、そして、ｇＤタグをコートする配列を取り除くことによって、修飾した(それぞれｐｗ0276-Ｖ3、ｐｗ0276-Ｖ3-１、ｐｗ0276-Ｖ3-11およびｐｗ0276-Ｖ3-12)。すべてのコンストラクトにて、大腸菌34Ｂ8細胞を形質転換した。単一のコロニーを拾い、２５ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む完全なＣＲＡＰメディウム中で３０℃で少なくとも２２時間生育させた。発現タンパク質は、プロテインＧハイトラップカラム(Amersham Pharmacia)にて精製した。
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００によるＢｉａｃｏｒｅ測定表面プラスモン共鳴アッセイを行って、抗ＢＲ３ Ｆａｂの親和性を決定した。ｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤを１５０応答単位(ＲＵ)以下でＣＭ５チップ上に固定した。３ｎＭから５００ｎＭに濃度を増やしたＦａｂ試料を２０ｕｌ／分で注入し、空のフローセルのＲＵを減算することによって、ｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ上の結合応答を補正した。動態分析のために、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルの同時フィッティングを用いた。見かけのｋＤ値は表４に示す。
表４
Figure 2008526205
更なる親和性改善のためにＶ３-１を用いたライブラリの構築
更なる親和性改善のために低度(soft)及びより低度(softer)のランダム化を設定した。低度ランダム化とは、特定の位置で、５０％は親のアミノ酸であり、５０％は１９の他のアミノ酸ないしは停止コドンにランダム化されていることを意味する。より低度のランダム化とは、特定の位置で、７５％は親のアミノ酸であり、２５％は１９の他のアミノ酸ないしは停止コドンにランダム化されていることを意味する。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発によって、Ｖ３-１バックボーンをベースとして４つのライブラリを構築した。
V1008-1： L3 ( F279+F280+F293=1:1:0.2) / H3 (F285+F286=1:1)
V1008-2： L3 (F279)/ H3 (F283+F284=1:1)
V1008-3： H1(F281)/ H2 (F282)/ L3 (F279)
V1008-4： L3(F280+F293=1:4)/ H3 (F283+F284+F266+F267=1:1:1:1)
オリゴ:
L3 低度
F279 (5'- ACT TAT TAC TGT CAG CAA 568 767 587 577 CCG 777 ACG
TTC GGA CAG GGT - 3') (配列番号:172)
F280 (5'- ACT TAT TAC TGT CAG CAA 568 767 587 577 568 CCG 777 ACG
TTC GGA CAG GGT - 3') (配列番号:173)
F293 (5'- ACT TAT TAC TGT CAG CAA 878 NNK NNK NNK 878 CCG CCC
ACG TTC GGA CAG GGT - 3') (配列番号:174)
H1 低度
F281 (5'- GCA GCT TCT GGC TTC WCC ATT 568 568 568 878 ATA CAC
TGG GTG CGT C -3') (配列番号:175)
H2 低度
F282 (5'- CTG GAA TGG GTT GCT TGG RTT 578 CCT 878 657 GGT 878
ACT 657 TAT GCC GAT AGC GTC AAG- 3') (配列番号:176)
H3 低度
F283 (5'- GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767 788 668
688 TGC GCT GGT GGG ATG- 3') (配列番号:177)
F284 (5'- GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767 CTT GGT
GTT TGC 678 668 668 ATG GAC TAC TGG GGT CAA- 3') (配列番号:178)
F285 (5'- GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 RST 857 557 767 788 668
688 RST GST GST GSG ATG GAC TAC TGG GGT- 3') (配列番号:179)
F286 (5'- TAT TAT TGT GCT CGT CGG 687 RST 857 557 767 788 668
688 RST 678 668 668 ATG GAC TAC TGG GGT C- 3') (配列番号:180)
H3 より低度
F266 (5'- GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767 788 668
688 TGC GCT GGT GGG ATG- 3') (配列番号:181)
F267 (5'- GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767 CTT
GGT GTT TGC 678 688 668 ATG GAC TAC TGG GGT CAA- 3') (配列番号:182)
より低度にランダム化したオリゴの記号： 5 ( 85% A, 5% G, 5% C, 5% T)
6 ( 85% G, 5% A, 5% C, 5% T)
7 ( 85% C, 5% A, 5% G, 5% T)
8 ( 85% T, 5% A, 5% G, 5% C)
Ｖ３-１の親和性を改善するためのファージ分類法
ビオチン化したｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤ濃度を減少することによって、４つのライブラリ(Ｖ１００８-１、Ｖ１００８-２、Ｖ１００８-３ Ｖ１００８-４)において、４ラウンドの溶液分類を行った。ファージインプットは、第１ラウンドでは３Ｏ.Ｄ／ｍｌ、以降の３回のラウンドでは、１、０．５、０．１Ｏ.Ｄ／ｍｌであった。ライブラリＶ１００８-１について、第１ラウンドでは１００ｎＭのビオチン化標的を用いた。次いで、以降の３回のラウンドでは１０ｎＭ、１０ｎＭおよび２ｎＭのビオチン化標的を用いた。他の３つのライブラリ(Ｖ１００８-２、Ｖ１００８-３及びＶ１００８-４)に関しては、第１ラウンドでは２０ｎＭのビオチン化標的を用いた。次いで、以降の３回のラウンドでは１ｎＭ、１ｎＭおよび０．５ｎＭのビオチン化標的を用いた。使用する分類法は上記の通りであった。ストリンジェンシーを上げるために、第４ラウンドで、ビオチン化標的およびファージライブラリを、３７℃で３時間インキュベートした。つぎに、１０００倍過剰量の非ビオチン化標的を加え、混合物を室温で３０分間インキュベートして、ビオチン化された物質を高い解離速度の結合体を競合するニュートラビジンプレート上に捕獲した。
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ(単一スポット競合)
この方法は上記の通りに行った。１０ｎＭのｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤを単一スポット競合に用いた。
Ｖ３-１ファージのウェルのＯＤ４５０ｎｍ減少(％)(８０％)と比較して、ｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤに対してともに５０％より低いＯＤ４５０ｎｍ減少(％)を有するクローンを選択した。１２のクローンを選択して、配列決定し、検定した(図１７)。結果を図１７にまとめた。
クローン４１およびクローン４６は、最も良く改善した２つのＶ３-１変異体であった。クローン４１がより多くのアスパラギン残基(Ｎ)有するので、更なる特徴付けのためにクローン４６を選択した。クローン４６のＣＤＲ-Ｈ１領域に、グリコシル化されうる部位(Ｎ-Ｓ-Ｓ／Ｔ)がある。このグリコシル化されうる部位を取り除くために、ＣＤＲ-Ｈ1の位置３１で３つの単一の突然変異(Ｎ３１Ａ、Ｎ３１ＳおよびＮ３１Ｑ)を加え、ｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤに対する結合活性を試験した。競合ＥＬＩＳＡを行って、ｍＢＲ３-ＥＣＤおよびｈＢＲ３-ＥＣＤに対する親和性を決定した。結果を以下に示す。これらの３つの突然変異の中で、Ｎ３１Ｓの親和性は、Ｖ３-４６親クローンに最も近かった(表５)。
表５
Figure 2008526205
Ｖ３-４６のＮ３１Ｓ突然変異体をＶ３-４６ｓと称した。Ｖ３-４６ｓのＦａｂを、上記の方法によって、作製した。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００による表面プラスモン共鳴アッセイを用いて、Ｖ３-４６ｓ Ｆａｂの親和性を決定した。結果を下記の表にまとめた(表６および表７)。Ｖ３-１ Ｆａｂと比較して、ｍＢＲ３-ＥＣＤに対するＶ３-４６ｓ Ｆａｂの結合速度は改善していた。さらに、ｈＢＲ３-ＥＣＤに対するＶ３-４６ｓ Ｆａｂの結合速度及び解離速度はＶ３-１よりも有意に改善した。
ｍＢＲ３-ＥＣＤ
表６
Figure 2008526205
ｈＢＲ３-ＥＣＤ
表７
Figure 2008526205
更なる親和性改善のためのＶ３-４６ｓバックボーンにおけるホモログショットガンライブラリの構築
更なる親和性改善のために、Ｖ３-４６ｓファジミドを鋳型として用いてホモログショットガンライブラリを作製した。３つすべての軽鎖ＣＤＲ内にＴＡＡコドンを導入することによって停止テンプレートを構築した。変異原性のオリゴヌクレオチドを設定して、所望の位置に野生型アミノ酸と類似のアミノ酸のみをコードする二項性コドンを用いた(JMB 2002: 320 [415-418])。Kunkel突然変異誘発法によって停止コドンを修復し、所望の位置に突然変異を誘導した(Kunkel 等 1987)。
以下に記載の６つすべてのＣＤＲホモログショットガンオリゴを混合してライブラリ１１０９-３を作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、Ｈ２及びＨ３について、元のホモログショットガンオリゴに加えて、ＢＲ３への初期の結合活性が破壊されていないことを確認するために、すべての他の位置を変異誘発するオリゴ(a及びb)も包含した。
V1109-3:
L1:L2:L3:H1:H2:H3=1:1:1:0.5:1:1.5
L1(F349)/L2(F350)/L3(F351)/H1(F352+F352a+F352b=1:1:1)/H2(F355+F355a+F355b=1:1:1)/H3(F356+F356a+F356b=1:1:1)
オリゴ
Figure 2008526205
ｗｔ残基及びそのホモログ残基の両方をコードするためのコドン使用法の説明については、Vajdos, 等, (2002) J. Mol. Biol. 320:415-418の表１を参照のこと。
Ｖ３-４６ｓの親和性選択についてのファージ分類法
ビオチン化したｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤ濃度を減少することによってＶ１１０９-３において３回の溶液分類を行った。ファージインプットは、第１ラウンドでは２Ｏ.Ｄ／ｍｌ、以下の２回のラウンドでは０．５、０．１Ｏ.Ｄ／ｍｌであった。第１ラウンドでは１ｎＭのビオチン化標的を用いた。次いで、以下の２回のラウンドのビオチン化標的は０．２及び０．１ｎＭとした。分類方法は上記の通りである。ストリンジェンシーを上げるために、第３ラウンドでは、ファージライブラリとともにビオチン化標的を３７℃で３時間インキュベートした。次いで、１０００倍過剰な非ビオチン化標的を加え、混合物を室温で３０分間インキュベートして、高い解離速度の結合体と競合させるためにニュートラビジンプレート上に結合させた。
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ(単一スポット競合)
１ｎＭのｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤを用いて、上記のように単一スポット競合を行った。試験ウェルのＯＤ４５０ｎｍ減少(％)をＶ３-４６ｓファージのウェル(９０％)と比較した。ｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤの両方が存在する条件下で５０％のＯＤ４５０ｎｍ減少(％)を示すクローンを選択した。１４クローンが選択され、配列決定及び分析を行った。
図１８は、ＷＴ Ｖ３-４６ｓと比較したときの、ｍＢＲ３-ＥＣＤ又はｈＢＲ３-ＥＣＤについて親和性選択したＶ３-４６ｓクローンのファージＩＣ５０を示す。１４すべてのクローンは、ｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤに対してＶ３-４６ｓ(ＷＴ)よりも良好に結合するようである。ほとんどのクローンは、ＣＤＲ-Ｈ１内に変異を有する点でＷＴとは異なるクローンであるＶ３-４６ｓ-１２を除いてＷＴ Ｖ３-４６ｓと同じＣＤＲ-ＨＣ配列を有する。図１８及び配列番号１９３を参照のこと。クローンはすべて図１８に記載のＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３内に変異を有する。ほとんどの親和性改善変異体は、Ｖ３-４６ｓの親クローンと比較して２〜５倍の親和性の改善がみられた。ｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤに結合するＶ３-４６ｓ-４２はｐＭの範囲にまで６〜８倍増加した。
親和性改善したクローンのタンパク質親和性を確認するために、上記の方法によってＶ３-４６ｓ-９及びＶ３-４６ｓ-４２ Ｆａｂを作製した。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００による表面プラスモン共鳴アッセイを用いて、Ｆａｂの親和性を決定した。その結果を以下の上に示す。Ｖ３-４６ｓ Ｆａｂと比較して、ｍＢＲ３-ＥＣＤ及びｈＢＲ３-ＥＣＤへのＶ３-４６ｓ-４２ Ｆａｂの結合速度は改善していた。ＫｄはファージＩＣ５０値と一致して良好であった。以下の表を参照のこと。
Figure 2008526205
Figure 2008526205
実施例５ ＢＪＡＢ細胞結合実験
ヒトのバーキットリンパ腫細胞株であるＢＪＡＢ細胞を、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン(１００Ｕ／ｍｌ、Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ、Gibco)及びＬ-グルタミン(１０ｍＭ)を添加したＲＰＭＩ培地中で培養した。フローサイトメトリによるレセプター発現の分析により、ＢＪＡＢ細胞がＢＲ３を高レベルに、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを検出不可能なレベルに発現することが示された。結合アッセイのために、１％ ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を含有するコールドアッセイバッファ(リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)、ｐＨ７．４)にて細胞を洗浄した。細胞密度を１．２５×１０６／ｍｌに調整し、２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェル丸底ポリプロピレンプレートのウェルに等分した(NUNC, Neptune, NJ、２５００００細胞／ウェル)。細胞を含有するプレートを１２００回転数／分で４℃で５分間遠心分離し、上清を細胞ペレットから慎重に吸引した。Ｖ３-１ｍ(又はｍＶ３-１)及びＶ３-１ｈは、マウスＩｇＧ２ａ又はヒトＩｇＧ1それぞれの定常領域に融合するＶ３-１抗体の可変領域を指す。キメラ１１Ｇ９、キメラ２.１又はキメラ９.１なる用語は、ヒトＩｇＧ１の定常領域への１１Ｇ９、２.１又は９.１それぞれの可変領域の融合体を指す。これらの実験のために、完全長抗体(ＩｇＧ)を用いた。
以下のように直接的かつ競合的結合アッセイを行った。直接的結合実験のために、ＩｇＧ抗体試料をコールドアッセイバッファにて段階的に希釈して３００〜 ０．０２ｎＭの濃度にした。試料(１００μｌ)をペレット状の細胞に加え、プレートは氷上に４５分間インキュベートした。更なる１００μｌアッセイバッファを各ウェルに添加して、プレートを１２００回転数／分で４℃で５分間遠心分離した。慎重に上清を吸引した後、２００μｌのアッセイバッファにてさらに２回細胞を洗浄した。適宜、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ-ＨＲＰ又はヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ-ＨＲＰを、コールドアッセイバッファにて１／１００００に希釈して、加え(１００μｌ／ウェル、Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、プレートを氷上で４５分間インキュベートした。２００μｌのコールドアッセイバッファにて２回洗浄した後、テトラメチルベンジジン(TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を添加して、１０分間置いて発色させた。１００μｌの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を添加して反応を止めた。次いで、６２０ｎｍを参照して４５０ｎｍのマイクロプレート読み取り機にてプレートを読み取った。直接的結合アッセイでは、示した濃度のｍＡｂをＢＪＡＢ細胞に加え、結合したｍＡｂを検出した。
競合的結合アッセイでは、抗ＢＲ３ ｍＡｂは細胞表面のＢＲ３に対する結合についてビオチン化したＢＡＦＦと競合した。以前に記載されているように(Rodriguez, C.F., 等, (1998) J. Immunol. Methods 219:45-55)、発現させて、ジェネンテクで精製されるヒトＢＡＦＦを、ＮＨＳ-Ｘ-ビオチン(Research Organics, Cleveland, OH)を用いてビオチン化した。抗ＢＲ３抗体を段階的に希釈して、等量のビオチン-ＢＡＦＦと混合して、終濃度３３３−０．１５ｎＭ ｍＡｂ及び１０ｎｇ／ｍｌ ビオチン-ＢＡＦＦとした。上記のように、希釈した試料を９６ウェルプレートのペレット状のＢＪＡＢ細胞に加えた。氷上で４５分間インキュベーションした後、２００μｌのコールドアッセイバッファにて２回洗浄し、ストレプトアビジン-ＨＲＰ (AMDEX, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)をアッセイバッファにて１／５０００に希釈して添加した(１００μｌ／ウェル)。最後にプレートを氷上で４５分間インキュベートした。コールドアッセイバッファにて２回洗浄した後、ＴＭＢを用いて発色させ、Ｈ３ＰＯ４にて反応を止めて、上記のようにプレートを読み取った。
図１９は、抗体がＢＪＡＢ細胞上のＢＲ３を結合することを示す。図２０は、Ｖ３-１ｍがＢＪＡＢ細胞上に発現するヒトＢＲ３に対するＢＡＦＦの結合を競合して置換すること(パネルＡ)、さらにＢＪＡＢに直接結合すること(パネルＢ)ができたのに対して、Ｂ９Ｃ１１はいずれのアッセイにおいてもヒトＢＲ３に結合できなかったことを示した(それぞれパネルＡ及びＢ)。対照的に、Ｖ３-１ｍ及びＢ９Ｃ１１は、ＢＨＫ細胞に発現されるマウスＢＲ３に対するＢＡＦＦの結合を完全にブロックし(パネルＣ)、さらに細胞に直接結合することができた(パネルＤ)。Ｖ３-１ｍ(マウスＩｇＧ)及びＢ９Ｃ１１(ハムスターＩｇＧ)による直接的結合アッセイのためには異なる検出抗体が必要であった。
ＢＪＡＢ結合アッセイの結果をもとに、ブロッキング又は非ブロッキングのいずれかに抗体を分類した。競合アッセイでは、４つのｍＡｂ(１１Ｇ９、２.１、９.１及びＶ３-１)はビオチン-ＢＡＦＦの結合を完全にブロックするのに対して、他の３つ(１Ｅ９、７Ｂ２及び８Ｇ４)は部分的に阻害するのみであった(図１９及び２０、表８)。ＭＡｂ １Ａ１１、８Ｅ４、１０Ｅ２、１２Ｂ１２及び３.１は、非ブロッキングであることが示された(図１９)。直接的結合アッセイでは、これら非ブロッキング抗体の中で１Ａ１１及び８Ｅ４は相対的にＢＪＡＢに対してほとんど結合しないのに対して、１０Ｅ１２及び１２Ｂ１２の結合は他のｍＡｂよりも最大のシグナルがやや高かった。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプのコントロールは、ＢＪＡＢに対して検出可能な結合を示さず、ＨＲＰ-コンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ検出抗体はこれらのアイソタイプと等しく結合することを示した。ＭＡｂ Ｖ３-１ｍ及びＢ９Ｃ１１は、ＢＪＡＢ及びＢＨＫの両結合アッセイにおいて、評価した(図２０)。これらの両ブロッキング抗体は、マウスＢＲ３と結合するが、Ｖ３-１ｍだけはヒトＢＲ３に結合する。Ｖ３-１ｈの結果は、Ｖ３-１ｍで観察される結果と同じであった。
実施例６ エピトープマッピングＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡによって、エピトープマッピング研究を行った。このＥＬＩＳＡでは、非標識のｍＡｂの希釈曲線がｖｈＢＲ３-Ｆｃに対する結合についてビオチン化した２.１、９.１、１１Ｇ９又は１Ｅ９と競合する(図２１)。完全なブロッキングｍＡｂｓ(１１Ｇ９、２.１及び９.１)についての結果から、２.１と９.１はともにビオチン化した１１Ｇ９の結合を効果的に置き換えるが、互いを置き換える最低限の能力しか示さないことを考えると、１１Ｇ９結合のエピトープがｍＡｂｓ ２.１と９.１のエピトープ間に空間的に配置することが示唆された。３つのｍＡｂ(１Ｅ９、７Ｂ２及び８Ｇ４)は、競合的ＢＪＡＢ結合実験の部分的なブロッカーとしての特徴を示す。エピトープマッピングＥＬＩＳＡでは、これらのｍＡｂが１１Ｇ９、２.１すると９.１との結合を部分的に阻害しただけであったことから、これらｍＡｂは中枢のＢＡＦＦブロッキング部位に対してより周辺に結合するようである。最後に、非ブロッキングｍＡｂである１２Ｂ１２は、部分的なブロッカーである１Ｅ９のみにより置き換わりうることから、ブロッキング抗体の領域からさらに離れて結合するようである。
また、マッピング研究を行って、マウスＢＲ３に対するＶ３-１ｍ、Ｂ９Ｃ１１及びＰ１Ｂ８の結合を評価した。この結果から、２つのブロッキングｍＡｂ(Ｖ３-１ｍ及びＢ9Ｃ11)がマウスＢＲ３への結合について交差競合しうるのに対して、非ブロッキング ｍＡｂ Ｐ１Ｂ８が異なるエピトープに結合するようであることが示された(図２２)。
以下の表は、競合的ＢＪＡＢ細胞結合実験の結果の概要である(表８)。数カ月の期間にわたって行ったアッセイの結果を編集した。平均ＩＣ５０は、実験の示された数「ｎ」から算出した。
表８
Figure 2008526205
ｎ／ａ＝阻害が検出されない、又はＩＣ５０を算出することが不可能である。
＋／−＝抗体がビオチン化ＢＡＦＦ結合を部分的に阻害した。
以下の表は、直接的ＢＪＡＢ細胞結合実験の結果の概要である(表９)。数カ月の期間にわたって行ったアッセイの結果を編集した。ほとんどの抗体がかなり用量依存的にシグナルを示すのに対して、３つのｍＡｂは部分的に結合するのみであるようであり、２つのｍＡｂは他のものより高い最大シグナルを再現的に示す。平均ＥＣ５０は、実験の示された数「ｎ」から算出された。
表９
Figure 2008526205
ｎ／ａ＝阻害が検出されない、又はＩＣ５０を算出することが不可能である。
＋／−＝部分的な結合。
また、ヒト化抗ＢＲ３抗体(ＩｇＧ)は、ＢＪＡＢ細胞上のＢＲ３に対するＢＡＦＦ結合をブロックして、ＢＪＡＢ細胞上のＢＲ３を結合した。下記の表１０を参照。
表１０
Figure 2008526205
「ｈ」はヒト化を表し、「ｃｈ」はキメラを表す。
実施例７ Ｂ細胞増殖に対する抗ＢＲ３抗体のアンタゴニスト効果及びアゴニスト効果
(a) ２.１、９.１及び１１Ｇ９のヒトＢ細胞増殖の阻害
ＣＤ１９ ＭＡＣＳビーズ(Miltenyi Biotec)を用いたポジティブセレクション法によって、末梢血液単核細胞からＢ細胞を単離した。増殖アッセイのために、Ｂ細胞を、平底９６ウェルプレートに２×１０５ｃ／ウェルで３通りセットした。細胞を、抗ＩｇＭ(１０ｍｇ／ｍｌ) (Jackson Immunoresearch)、ｍＢＡＦＦ(５ｕｇ／ｍｌ)及び示した抗ＢＲ３抗体ないしタンパク質とともに５日間培養した。使用した抗体は、ｈＩｇＧ１バックグラウンド中のキメラ抗体であって、組織培養物から精製した。次いで、１ｍＣｉ／ウェル トリチウムチミジンにて培養の最後の６時間、細胞にパルスを与え、フィルタで回収して、計数した。結果を図２３に示す。
(b) Ｖ３-１のマウスＢ細胞増殖の阻害
MiltenyiのＢ細胞単離キットを用いて、製造者の指示の通りに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、又は、２〜４か月齢の抗ＨＥＬ ＢＣＲトランスジェニックマウスから脾臓Ｂ細胞を調製した。９５％以上の純度を有するＢ細胞を確実に得た。１０％ 熱不活性ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ-グルタミン及び５×１０−２ｕＭ β-メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ-１６４０培地中でＢ細胞を培養した。
様々な濃度の抗ＢＲ３ ｍＡｂの存在下又は非存在下において、ＢＡＦＦ(２ｎｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌ)を含む場合又は含まない場合の抗マウスＩｇＭ Ａｂ ５ｕｇ／ｍｌ(ＩｇＧ、Ｆ(ａｂ')２) (Jackson ImmunoResearch Laboratories)又は雌ドリ卵白リゾチーム(Sigma)とともに、精製されたＢ細胞(２００ｕｌの終容量の１０５Ｂ細胞)を培養した。４８時間の刺激の最後の８時間の３Ｈ-チミジンの取り込み(１ｕＣｉ／ウェル)によって、増殖を測定した。いくつかの実験では、抗ＢＲ３ ｍＡｂ並びにＢＲ３-Ｆｃ融合タンパク質を、ＰＣＲ機を用いて予め５分間沸騰して不活性化した(コントロール)。
図２４は、ＢＲ３-Ｆｃと同様に、Ｂ９Ｃ１１及びＶ３-１ｍが、抗ＩｇＭ媒介性一次マウスＢ細胞の増殖の間に、ＢＡＦＦ共刺激活性を阻害しうることを示す。Ｂ９Ｃ１１及びＶ３-１ｍはいずれも、様々な用量の抗ＩｇＭ抗体の有無にかかわらず、Ｂ細胞増殖に対して直接的な効果を示さなかった(データは示さない)。また、Ｖ３-１ｍ及びＢ９Ｃ１１(沸騰していないＶ３-１ｍ又はＢ９Ｃ１１)によって、抗ＨＥＬ ＢＣＲトランスジェニックマウスのＢ細胞の増殖が阻害された(データは示さない)。両抗体は、単独で正常マウスＢ細胞増殖を引き起こさない点でアゴニスト性ではない。
(b) 他の抗体
製造業者のプロトコール(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)に従って、ＣＤ１９ ＭＡＣＳ磁気ビーズを用いたポジティブセレクション法によって、末梢血液単核細胞からヒトＢ細胞を単離した。細胞は、単離後すぐに用いるか、後の使用のために液体窒素で凍結した、新鮮な凍結細胞をアッセイに等しく用いた。透明で平底のウェルを有する黒色９６ウェルプレート(PE Biosystems, Foster City, CA)にて１×１０５細胞／ウェルのＢ細胞を培養した。
抗ＢＲ３抗体のアンタゴニスト効果を評価するために、１００ｎＭ〜１．３ｐＭ(１５μｇ／ｍｌ−１ｎｇ／ｍｌ)の範囲の様々な濃度の抗ＢＲ３抗体の存在下及び非存在下において、可溶性組み換えＢＡＦＦ(１０ｎｇ／ｍｌ)及びＦ(ａｂ')２ヤギ抗ヒトＩｇＭ(Ｆｃ特異的)抗体(４μｇ／ｍｌ)(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)とともに細胞をインキュベートした。第６日目に、Celltiter Glo (Promega, Madison,WI、製造者の指示に従って再構成する)を各アッセイウェルに添加することによって、Ｂ細胞増殖を評価した。次いで、室温で１０分間インキュベートした後、ルミノメーターにてプレートを読み取った。
抗ＩｇＭ抗体単独(４μｇ／ｍｌ)又は抗ＩｇＭ＋「交差結合」Ｆ(ａｂ')２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体(Pierce, Rockford, IL、３０μｇ／ｍｌ)の存在下かつＢＡＦＦ非存在下において、抗ＢＲ３抗体(１００ｎＭ〜１．３ｐＭ)をインキュベートすることによって、Ｂ細胞増殖を刺激する可能性のある抗ＢＲ３抗体のアゴニスト効果を評価した。上記の通りにCelltiter Gloを用いて第６日目に増殖を評価した。
図２５は、９.１-ＲＦがＢＡＦＦ依存性のＢ細胞増殖をブロックし、アゴニスト効果を示さないことを示す。図２６は、２.１-４６が抗ＩｇＭの存在下において、Ｂ細胞増殖を刺激することを示す。これよりアゴニストとしての作用が示唆される。
実施例８ ＢＩＡＣＯＲＥを用いた親和性測定
材料及び方法
ファルマシアＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)３０００ (BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を用いた表面プラスモン共鳴法によって、室温でリアルタイム生体分子特異的な相互作用を測定した(Karlsson, R., 等 (1994) Methods 6:97-108、Morton, T.A.及びMyszka, D.G. (1998) Methods in Enzymology 295: 268-294)。ヒトのＢＲ３ ＥＣＤ又はｖＢＲ３-Ｆｃを、一次アミン基を介してセンサチップ(ＣＭ５)に固定した。０．０２５Ｍ Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ Ｎ-メチル-Ｎ'(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの混合物 ２０μｌを５μｌ／分で注入することによって、カルボキシメチル化したセンサチップ表面基質を活性化した。１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中に５μｇ／ｍｌのＢＲ３ ＥＣＤ又はｖＢＲ３-Ｆｃを含む溶液 ５〜１０μｌを５μｌ／分で注入した。カップリングの後、チップ上のカップリングしなかった部位を、２０μｌの１Ｍ エタノールアミン（ｐＨ８．５）を注入してブロックした。ランニングバッファは、０．０５％ ポリソルベート２０を含有するＰＢＳとした。動態学的な測定値のために、ランニングバッファにて２倍に段階希釈した抗ＢＲ３抗体(６．２−１００ｎＭ又は１２．５−２００ｎＭ)を、フローセルに対して３０μｌ／分の流速で２分間注入し、結合した抗ＢＲ３抗体を２０分間解離させた。２０〜３０μｌの１０ｍＭ グリシン・ＨＣｌ(ｐＨ１．５)を注入することによって、結合表面を再生した。活性化されるが、固定したＢＲ３-ＥＣＤ又はＢＲ３-Ｆｃを有さないフローセル１を対照セルとして用いた。フローセル１に対する抗ＢＲ３抗体の有意な非特異的結合はなかった。データは、広域フィッティングを用いた１：１結合モデルによって、分析した。結合速度定数及び解離速度定数は、同時にフィッティングした(BIAevaluationソフトウェア)。試験する選択した抗体の濃度を順に漸増又は漸減して試料が動くかどうかについて、同様な結果が得られた。
ＢＩＡｃｏｒｅによりＢＲ３-ＥＣＤ又はＢＲ３-Ｆｃに対する抗ＢＲ３抗体の結合動態を測定した。ＢＲ３-ＥＣＤ又はｖＢＲ３-Ｆｃをセンサチップに固定し、抗体の階段希釈液をフローセルに対して注入した(表１１及び表１２)。あるいは、抗ＢＲ３抗体をセンサチップに固定し、ＢＲ３-ＥＣＤの階段希釈液をフローセルに対して注入した(表１３)。物質移動効果を最小限にするために速い流速を用いた。ヒト化Ｆａｂ及びヒト化ＩｇＧ抗体の結果を並べて比較した。溶液中のＩｇＧを用いて得た見かけの結合親和性は、溶液中のＦａｂを用いて得たものより高かった。これは、ＩｇＧが二価であるので、おそらく結合活性効果によるものである。抗体の９.１、２.１、１１Ｇ９及びＶ３-１シリーズの抗ＢＲ３抗体の見かけの動力学的パラメータを、表１１ないし表１３に示す。
Ａ．チップ上のＢＲ３ ＥＣＤ
表１１
Figure 2008526205
Figure 2008526205
チップ上のＢＲ３-Ｆｃ
表１２
Figure 2008526205
Figure 2008526205
Ｂ．チップ上の抗体(溶液中のＥＣＤ)
表１３
Figure 2008526205
実施例９ 機能的なエピトープマッピング
以下のアッセイを用いて、抗ＢＲ３抗体結合に重要なＢＲ３上のエピトープを機能的にマッピングした。
ミニＢＲ３ショットガンスキャニングのためのライブラリ構築。過去に記載されるように(Weiss, G.A., 等, (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:8950-4、Gordon, N. 等, (2003) Biochemistry 42:5977-83)、ファジミドｐＷ１２０５ａに連続的に突然変異を誘発して、Ｍ１３バクテリオファージ上にエピトープタグ付加ミニＢＲ３を表出するライブラリを構築した。このファジミドは、ヒト成長ホルモンのＮ末端に融合するペプチドエピトープタグ(MADPNRFRGKDLGG)の後にＭ１３ 遺伝子-８主要コートタンパク質をコードする。ｐＷ１２０５ａを、キュンケル突然変異誘発(Kunkel, J. D.,等, (1987) Methods Enzymol 154:367-82)のための鋳型として用いて、ミニＢＲ３ショットガンライブラリ構築のための好適な鋳型を生成した。オリゴヌクレオチドにより、ヒト成長ホルモンをコードするｐＷ１２０５ａの断片を、変異する領域の代わりにＴＡＡ停止コドンを含有するミニＢＲ３の部分配列をコードするＤＮＡ断片に置き換えた。過去に記載されるように(Sidhu, H. 等, Methods Enzymol 328:333-63)、生成した２つの新規の鋳型、鋳型１(残基３４−４２をコードする)と鋳型２(残基１７−２５をコードする)を用いてミニＢＲ３ライブラリを構築した。所望の位置に突然変異を同時に誘導しながら、鋳型停止コドンをミニＢＲ３の相補的な領域に置き換えるように設定した突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いたキュンケル突然変異誘発のために、各々の「部分的なミニＢＲ３」鋳型を鋳型として用いた。突然変異の部位で、野生型コドンを、対応するショットガンアラニンコドンに置換した(上掲のWeiss)。これら２つのライブラリの各々はミニＢＲ３内の１１の残基で突然変異が生じており、ライブラリ間で共通して変異されていない部位を有する。ライブラリ１は位置１７、１８、２０−２３、２５、２７、２８、３０及び３３にショットガンコドンをコードしており、ライブラリ２は位置２６、２９、３１、３４及び３６−４２にショットガンコドンをコードしている。各々のライブラリは２×１０９メンバーを含有しており、理論上完全に多様性を示すと言える(＞１０４倍過剰)。
ライブラリ分類及び分析。上記の２つのライブラリのそれぞれから得たファージを、９６ウェルNunc Maxisorpイムノプレートに固定したＶ３-１又は抗タグ抗体(３Ｃ８：２Ｆ４、Genentech, Inc.)(ディスプレイ選別)と中和抗体９.１、２.１、８Ｇ４、１１Ｇ９(機能的な選別)に対する結合選別の対象とした。ディスプレイ選別は、ライブラリメンバーの間の発現の差異についての抗ＢＲ３抗体結合選別を標準化するために行った。各々の標的から溶出されるファージを大腸菌ＸＬ1-ブルーにて繁殖させた、増殖したファージを、前のラウンドと同じ標的に対して選別するために用いた。２ラウンドの選別の後、各々のライブラリ及び選別から得た４８の個々のクローンを、カルベニシリン及びＫＯ7ヘルパーファージを添加した４００Ｌの２ＹＴ培地を含む９６ウェルフォーマットにて生育させた。これらの培養物の上清をファージＥＬＩＳＡに直接用いて、選択対象である抗体を結合できるミニＢＲ３のファージディスプレイ変異体を検出して、結合を確認した。
以下のように一般的にファージＥＬＩＳＡを行った。Maxisorpイムノプレート(９６ウェル)を、捕獲標的タンパク質(抗ＢＲ３抗体)にて、室温で２時間かけてコートした(５μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭ 炭酸塩バッファ(ｐＨ９．６) １００μｌ)。次いで、０．２％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)にて１時間、プレートをブロックして、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて８回洗浄した。ファージ粒子をＢＳＡブロッキングバッファにて連続的に希釈して、１００ｕｌをコートウェルへ移した。１時間後に、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にてプレートを８回洗浄して、１００ｕｌの１:３０００西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体複合体を含むＢＳＡブロッキングバッファとともに３０分間インキュベートして、ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０にて８回、ＰＢＳにて２回洗浄した。ｏ-フェニレンジアミン二塩化水素化物／Ｈ２Ｏ２溶液(１００ｕｌ)を用いてプレートを反応させ、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４(５０ｕｌ)にて反応を止め、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
試験したすべてのクローンは各々のＥＬＩＳＡにおいて、ポジティブであることが明らかとなり、次いで、過去に記載のあるように(上掲のWeiss)、配列決定した。許容範囲内の程度の配列を翻訳して、整列配置した。
ＢＡＦＦ結合及びディスプレイ選別のデータは既に測定した(上掲のGordon)。抗ＢＲ３結合及びディスプレイ選別のデータを同様に算出した。概して、抗ＢＲ３抗体又は抗タグ抗体への結合についての２ラウンドの選別の後に配列決定したクローン間でみられる野生型残基(ｗｔ)と各々のａｌａ突然変異(ｍｕｔ)の発生を表にした。野生型残基の発生を、突然変異の発生で除して、各々の位置の突然変異ごとにｗｔ／ｍｕｔ比を決定した(図示せず)。
過去に記載されるように(上掲のWeiss、上掲のGordon)、Ｆ-値を算出した。概して、標準化した頻度比率(Ｆ)を算出して、ＢＡＦＦ又は抗ＢＲ３抗体結合に対する各ＢＲ３突然変異の影響を定量する一方で、ディスプレイ効率を計算した：すなわち、Ｆ＝[ｗｔ／突然変異体(ＢＡＦＦ又は抗ＢＲ３抗体選別)]／[ｗｔ／突然変異体(ディスプレイ選別)]。比＞１を有害突然変異とし、比＜１を有利な突然変異とした、太字は１０倍より大きい影響であることを示す。１０倍以上の影響を示す突然変異(すなわち、Ｆ＞１０又はＦ＜０．１)を、特に有意であるとみなした。
表１４ Ｆ値
Figure 2008526205
データにより、１１Ｇ９、９.１及び２.１がヒトＢＲ３とマウスＢＲ３間の配列変化の領域を利用することが示された(表１４)。Ｖ３-１の機能的なエピトープは、ヒトＢＲ３とマウスＢＲ３間で高く保存されているＢＡＦＦの機能的なエピトープを模倣する。このデータの概略を図２７に示す。図２７の円で囲んだ残基は、ミニＢＲ３配列外でＯ-結合グリコシル化されうる残基を示す。１１Ｇ９、２.１、９.１及びＶ３-１抗体は、結合のためにＢＲ３グリコシル化を必要としない。９.１抗体の機能的なエピトープはＬ38及びＲ３９を含む。２.１の機能的なエピトープはＧ３６を含む。Ｖ３-１の機能的なエピトープはＬ２８及びＬ２９を含む。１１Ｇ９の機能的なエピトープはＰ２１及びＡ２２を含む。また、このアッセイにおいて、残基Ａ３４、Ｆ２５及びＶ３３のアラニンスキャニング突然変異は、ＢＲ３への９.１、２.１、１１Ｇ９及びＶ３-１結合を崩壊させた。これらの残基はファージのＢＲ３の構造的完全性を維持するために重要でありうる。
実施例１０ ＣＬＬ発現
慢性リンパ球白血病(ＣＬＬ)患者の末梢血液細胞を、Ｂ細胞マーカー(ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２０、ＣＤ５及びＢＲ３)に対する抗体を用いて染色した(図２８)。Ｖ３-１を用いてＢＲ３を染色した。ある患者では、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋左下)上にＣＤ２０を発現していないにもかかわらず、ＢＲ３は有意なレベルで発現していた(棒グラフのピークを参照−パネルＢ)。さらに１２人のＣＬＬ患者から得た１２の試料を評価した。１２すべての試料でＢＲ３が発現していた。これらのデータから、抗ＢＲ３抗体がこの症状の治療に値することが示唆された。
実施例１１ 抗体依存性細胞性細胞障害
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)読み取りを使用して、基本的に記載されているように(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))、ＣＤ２０発現バーキットリンパ腫株であるＢＪＡＢ細胞のナチュラルキラー細胞(NＫ細胞)溶解を媒介する、抗ＢＲ３キメラモノクローナル抗体の能力(ＡＤＣＣ活性)についてアッセイした。RosetteSep(登録商標)ヒトＮＫ細胞エンリッチメント混合液(StemCell Technologies, Vancouver, B.C.)を用いて、製造者の指示に従って、正常なヒトドナーの１００ｍＬのヘパリン処理血液からＮＫ細胞を調製した。血液を等量のリン酸緩衝食塩水にて希釈して、１５ｍｌのFicoll-PaqueTM(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)にて層状にして、１４５０ＲＰＭで２０分間、遠心分離した。層間界面の白血球を４本の清浄な５０ｍＬチューブに分配し、そのチューブを１５％ 胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地で満たした。チューブを１４５０ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を捨てた。ＮＫ細胞をアッセイ培地(グリシンなしのＦ１２／ＤＭＥＭ ５０:５０、１ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ ｐＨ７．２、ペニシリン／ストレプトマイシン(１００単位／ｍＬ；Gibco)、グルタミン、及び１％ 熱不活性化胎仔ウシ血清)にて２×１０６細胞／ｍＬに希釈した。
アッセイ培地で段階的に希釈した抗体 (０．０５ｍＬ)を、９６ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。ＢＪＡＢ細胞をアッセイバッファで４×１０５／ｍＬの濃度まで希釈した。ＢＪＡＢ細胞(ウェル当たり０．０５ｍＬ)を９６ウェルプレート中で希釈した抗体と混合し、室温で３０分間インキュベートして、ＢＲ３への抗体の結合を可能にした(オプソニン作用)。
各ウェルに０．０５ｍＬのＮＫ細胞を添加してＡＤＣＣ反応を開始させた。コントロールウェルでは、２％ ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を添加した。ついで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。細胞障害性(ＬＤＨ)検出キット(キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)を製造者のプロトコールに従って使用して、放出されたＬＤＨのレベルを測定した。０．１ｍＬのＬＤＨ展開液を各ウェルに加えた後、１０秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で１５分暗所でインキュベートした。ついで、４９０ｎｍでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全ＬＤＨで除することによって％溶解を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、４-パラメータ曲線フィッティング(KALEIDAGRAPH)を用いてＥＣ５０濃度を決定した。
すべてのヒト化抗ＢＲ３抗体は、ＢＪＡＢ細胞(ヒトバーキットリンパ腫)のＮＫ細胞媒介性の溶解に関して強い活性を示し、１ｎＭより小さい相対的な作用強度であった(図２９)。ＢＪＡＢ細胞の代わりに、Ｒａｍｏｓ細胞(ヒトバーキットリンパ腫)及びＷＩＬ２ｓ細胞(ヒトＢ細胞リンパ腫)を用いて同様なアッセイを行った。図２９Ａ及びＢのそれぞれは、抗Ｂ抗体によるＲａｍｏｓ細胞及びＷＩＬ２ｓ細胞のＡＤＣＣ殺傷を示す。抗Ｈｅｒ２抗体(４Ｄ５)をネガティブコントロールとして用いた。一般的に、ＢＲ３に対して親和性の高い抗体は抗体依存性細胞殺傷アッセイにおいてより有効であった。
実施例１２ ＢＲ３-Ｆｃ又は抗ＢＲ３抗体によるＢ細胞の枯渇
Ｂ細胞を枯渇させる抗ＢＲ３抗体の能力をＢＲ３-Ｆｃと比較した。第０日目に、５００μｇのコントロール(マウスＩｇＧ２ａ)、マウスＢＲ３-Ｆｃ又は抗ＢＲ３(Ｖ３-１)抗体を６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹膜投与した。第１、３、７及び１５日目に各グループのマウスを屠殺した。図３０は、処置の７日目の、血液、リンパ節及び脾臓のＢ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。血液、リンパ節及び脾臓のＢ細胞は、ＢＲ３-Ｆｃ及びコントロール処置動物よりＶ３-１処置マウス(ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋及びＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ)の方が少ないことを示した。ＢＲ３-Ｆｃ処置は、コントロールＦｃ処置動物と比較してＢ細胞の数を有意に稀釈することが既に示されている。円の隣の太字の数値は、特定の領域に含まれるリンパ球の割合を表す(円)。
同様の条件の更なる実験では、血液、リンパ節及び脾臓のＦＡＣＳ分析は、一般に、ＢＲ３-Ｆｃ及びコントロール処置動物よりＶ３-１処置マウスにおけるＢ細胞(ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋及びＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ)の方が少ないことを示した(図３１)。ＢＲ３-Ｆｃは、特に後の時点においてコントロール動物と比較してＢ細胞の数を有意に減少した。図３１は、第１、３、７及び１５日目での脾臓の濾胞性(ＦＯ−ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋)又は周辺帯(ＭＺ−ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ)の絶対数及びリンパ節のＢ細胞の％；１ｍｌの血液に含まれるＢ細胞の絶対数を示す。データを平均＋／−標準偏差(ｎ＝４)として表す。
同様の条件の更なる実験では、脾臓(top row−IgM+Syn+)及び胚中心細胞(middle row−B220+CD38low)の形質芽細胞のＦＡＣＳ分析は、抗ＢＲ３抗体(Ｖ３-１)がいくらかの形質芽細胞及び胚中心細胞を枯渇しうることを示した(図３２)。ＢＲ３-Ｆｃは、コントロール動物と比較して形質芽細胞の数を有意に減少した。パネルＡに示す数値は、特定の領域に含まれるリンパ球の割合を表す。グラフの線では、データを平均＋／−標準偏差(ｎ＝4)として表す。
データは、ＢＲ３へのＢＡＦＦ結合をブロックするがＡＤＣＣ機能を有さない融合タンパク質である、ＢＲ３-Ｆｃで処置するよりも抗ＢＲ３抗体で処置した後に、より広域なＢ細胞の枯渇がみられたことを示した。
実施例１３ Ｂ細胞減少を最大にするためのＦｃ依存性細胞殺傷及びＢＡＦＦブロック
単回用量１０ｍｇ／ｋｇの抗ＢＲ３抗体(ｍＶ３-１)、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ突然変異を有するｍＶ３-１、非ＢＡＦＦブロッキング抗ＢＲ３抗体ＰＩＨ１１又はＢＲ３-ＦｃでＢＡＬＢ／ｃマウスを処置した。処置後第６日目に脾臓又は末梢血液のＢ細胞を、フローサイトメトリーにて分析した。処置後の末梢血液Ｂ細胞(Ｂ２２０＋)及び脾臓濾胞性Ｂ細胞(ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋)の絶対数をそれぞれ図３３Ａ及び図３３Ｂに示した。データを平均＋／−標準偏差(ｎ＝４)として表す。Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ Ｆｃ突然変異により、インビトロＦｃγＲＩＩＩの結合が破壊された。結果により、非ブロッキング抗体である不完全なＦｃγレセプター結合を有する抗ＢＲ３抗体及びＢＲ３-Ｆｃの両方がＢ細胞集団数を減少することができたにもかかわらず、Ｆｃ依存性細胞殺傷活性とＢＡＦＦブロッキング活性を有する抗ＢＲ３抗体がより強力なＢ細胞減少／枯渇薬剤であることが示された。これは、一つの分子に、抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)とＢ細胞生存遮断の両活性が組み合わさっていることによるものである。
実施例１４ 狼瘡マウスモデル
抗ＢＲ３抗体を、狼瘡マウスモデルにおいて試験した。これらの研究のために、およそ８か月齢のＮＺＢ／Ｗの狼瘡傾向にある陽性マウスを、第０日目及び第７日目に、２００μｇのｍＩｇＧ２ａ(抗ｇｐ１２０)(コントロール)又はｍＢＲ３-Ｆｃ又はｍＶ３-１(抗ＢＲ３抗体)にて処置(ip)した。血液、リンパ節及び脾臓(濾胞性−ＦＯ及び周辺帯−ＭＺ)のＢ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。データを個々のマウスのデータポイント(ｎ＝４)として表した。ＢＲ３Ｆｃと同様に、抗ＢＲ３抗体は自己免疫系のマウスのＢ細胞を減少することができた(データは示さない)。
より長期の研究において、およそ１００ｍｇ／ｄｌのタンパク尿症を示す７か月齢のＮＺＢ×Ｗ Ｆ１マウス(ループス腎炎マウスモデル)を、およそ６か月の期間にわたって、３００ｕｇのｍＶ３-１、ｍＢＲ３-Ｆｃ又はコントロールｍＩｇＧ２ａ抗体(抗ｇｐ１２０)にて、1週に２回処置した。各々の処置コホートは２５匹のマウスを含む。疾患の進行に合わせて、すべてのマウスを改善について毎月評価した(図３４Ａ)。生存しているマウス、又は、３００ｍｇ／ｄｌのタンパク尿症レベルより低いマウスの割合を進行に期間に対して測定した。さらに、処置後およそ６か月で、生存しているマウスを屠殺し、ＦＡＣＳ分析で分析した。抗ＢＲ３抗体処置マウスの末梢Ｂ細胞(Ｂ２２０＋とする)の中央値は、ＢＲ３-Ｆｃ処置マウス及びコントロールマウスよりも低かった(図３４Ｂ)。抗ＢＲ３抗体処置マウス及びＢＲ３-Ｆｃ処置マウスの総脾臓Ｂ細胞(Ｂ２２０＋)の中央値は、コントロールマウスよりも低かった(図３４Ｃ)。抗ＢＲ３抗体処置マウス及びＢＲ３-Ｆｃ処置マウスの活性化された脾臓Ｂ細胞(Ｂ２２０＋ＣＤ６９＋)の中央値は、コントロールマウスよりも低かった(データは示さない)。また、抗ＢＲ３抗体(p＜０．００００１)処置マウス及びＢＲ３-Ｆｃ(p＜０．０２)処置マウスの脾臓形質細胞／形質芽細胞(ＣＤ１３８＋)の中央値は、コントロールマウスよりも低かった(データは示さない)。ＢＲ３-Ｆｃ(p＜０．０２)処置マウス及び抗ＢＲ３抗体(p＜０．００００１)処置マウスの脾臓胚中心Ｂ細胞(Ｂ２２０＋ＣＤ３８ｌｏｗ)の中央値は、コントロールマウスよりも有意に低かった(データは示さない)。
実施例１５ ＳＣＩＤモデル
また、抗ＢＲ３抗体のＢ細胞枯渇活性を重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)モデルにおいて試験した。Ｂ細胞及びＣＤ４Ｔ(＞９０％)細胞中で磁力的にエンリッチした４０００万個のヒト末梢血液単核細胞を、第０日目に亜致死的に放射線照射した(３５０ラド)６週齢ｓｃｉｄベージュマウスの脾臓内に導入した。第０日目に、５００ｕｇの抗ＢＲ３抗体(ヒトＩｇＧ２ａ定常領域を有するＶ３-１又は２.１)、ヒトＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール又はマウスＢＲ３-Ｆｃにてマウスを処置した。第４日目にマウスを屠殺し、それらの脾臓をヒトのＢ細胞についてフローサイトメトリによって分析した。抗ＢＲ３処置によって、活性化／胚中心(ＧＣ)Ｂ細胞(上段)と形質芽細胞(下段)はともに有意に減少したのに対して、ＢＲ３-Ｆｃによって、活性化／ＧＣ細胞だけが有意に減少した(図３５Ａ−Ｄ)。１グループ当たり１０匹のマウスとし、各グループの平均を表した。
次の実験では、ヒトＰＢＭＣをＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ１６／ＣＤ５６ NK細胞及びＣＤ１４単球から磁力的に枯渇させ、放射線照射したｓｃｉｄベージュマウスの脾臓内に投与した(４０×１０６／マウス)。同じ日に、３００μｇ／マウスのヒト抗ヒトＢＲ３(９.１ＲＦ)又はアイソタイプコントロール(ヒトＩｇＧ１)にてマウスを処置した。７日後、マウスを屠殺し、それぞれの脾臓におけるヒトＢ細胞活性化をフローサイトメトリーを用いて評価した。活性化した胚中心Ｂ細胞(ＣＤ１９ｈｉＣＤ３８＋)の％は、抗ＢＲ３で処置したグループにおいて有意に減少していた(図３５Ｅ)。
更なる実験では、標準的な方法を用いて、正常なヒトドナーのLeukopack (Blood Centers of the Pacific, San Francisco, CA)からヒトＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを４０×１０＾６／３０ｕｌ ＰＢＳに再懸濁して、脾臓内注入の工程の間中、氷上に置いた。セシウム１３７供与源を用いて３５０ラドの放射線をレシピエントマウスに亜致死的に照射した。照射の４時間後、４０×１０＾６のヒトＰＢＭＣを含む３０ｕｌのPBSを脾臓内(i.s.)投与によってすべてのマウスに投与した。麻酔下で、手術部位の毛を剃り、ベタジンと７０％アルコールにて準備をした。左の横腹の肋骨境界のちょうど下を１ｃｍ皮膚切開し、腹壁と腹膜の切開をした。脾臓を慎重に露出させ、３０ｕｌの細胞懸濁液を注射した。5-O Vicrylと外科用ステープルをそれぞれ用いて筋層と皮膚の切開を閉じた。第０日目の細胞導入の４時間前に、単回３００μｇ用量の２００μｌの生理食塩水のＡｂ溶液をすべてのマウスに静脈内投与した。照射の後の７日間、ポリミキシンＢ １１０ｍｇ／Ｌとネオマイシン １．１ｇ／Ｌを飲料水に加えた。
実験群：
グループ１：賦形剤(ｎ＝９)
グループ２：抗ＢＲ３(９.１ＲＦ)(ｎ＝９)
グループ３：抗ＢＲ３(９.１ＲＦ Ｎ４３４Ａ)(ｎ＝９)
第４日目にすべてのマウスを安楽死させた。それらの脾臓のＢリンパ球サブセットをフローサイトメトリー分析によって定量化した。第４日目に血清試料(１００ｕｌ)を回収して、最終時点でのＡｂの血清中濃度を確認した。
ヒトＰＢＭＣ由来Ｂ細胞は急速に拡大し、ｓｃｉｄ／ベージュマウスに導入された後に活性化された。細胞導入後４日までに、脾臓の主なＢ細胞群は、活性化されたＢ細胞ＣＤ１９ｈｉ／ＣＤ３８ｉｎｔ表現型(抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３８抗体)を示した。プラセボ治療グループの活性化されたＢ細胞の平均パーセンテージは１０．１％であったのに対して、９.１ＲＦ治療グループの活性化されたＢ細胞の平均パーセンテージは０．４６％であった。導入の４日後に、ＢＡＦＦ遮断によって活性化されたＢ細胞の拡大を阻害する能力、並びにＢ細胞前駆体を枯渇する能力について、９.１ＲＦと９.１ＲＦ Ｎ４３４Ａ抗体を比較すると、両方とも統計学的に有意な阻害効果を示した(９.１ＲＦ及び９.１ＲＦ Ｎ４３４Ａのｐ値はともに＜０．０００１であった。プラセボコントロールグループと比較するダネット試験を用いた)。下記を参照のこと。
結果：
平均と標準偏差
レベル 番号 平均 Std Dev 標準偏差平均 下限95% 上限95%
9.1RF 9 1.5206 1.6517 0.5506 0.251 2.790
9.1 N434A 9 1.004 0.7791 0.2597 0.406 1.603
プラセボ 9 30.2896 15.3760 5.1253 18.470 42.109
抗ＢＲ３ Ａｂ(９.１ＲＦ及び９.１ＲＦ Ｎ４３４Ａ)はともに、ヒトｓｃｉｄインビボモデルにおいて有意なＢ細胞生存の阻害と枯渇を示した。このモデルはインビボＡＤＣＣ及びＢＡＦＦ生存遮断を試験しているので、両Ａｂは、ヒトのＢ細胞成分を有する自己免疫性疾患及びＢ細胞悪性腫瘍を治療する際の十分な性質及び能力を有する。
実施例１６ ＦｃＲｎ結合
ＥＵ番号付けシステムに従って、９.１ＲＦ ＩｇＧ抗体(配列番号７４及び７５)の残基Ｎ４３４を変異させ、ヒトＦｃＲｎレセプターに対する結合を亢進させた。ＩｇＧ抗体はＣＨＯ細胞で生産された。
ＢＩＡｃｏｒｅ-３０００システム(BIAcore Inc.)を使用して、９．１ＲＦ及びその突然変異体の結合親和性を決定した。製造者の指示に従って、１０ｍM 酢酸ナトリウム, ｐＨ４を用いて、ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎをアミンカップリングを介してＣＭ５チップに固定した。カップリングは２５℃で行った。最終的な密度は７００−１０００ＲＵに達した。
２５℃で２０μｌ／分の流速を用いて、ｐＨ６のランニングバッファ(ＰＢＳ pＨ６, ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ-２０)に３倍に段階希釈した９．１ＲＦ又はその突然変異体を２分間注入することによって、動態学的な測定を行った。用いた最大濃度の抗体は１μＭであった。解離速度は１０分かけて測定した。結合活性を最小限にした１０ｍＭ トリスｐＨ９、１５０ｍＭ ＮａＣｌを２０μｌ注入して表面を再生した。結果をｋａ、ｋｃ及びＫＤａの値として表１５に示した。
２５℃で２μｌ／分の流速を用いて、ランニングバッファに３倍に段階希釈した９．１ＲＦ又はその突然変異体を６分間注入することによって、平衡結合実験を行った。解離は２分間続けた。用いた最大濃度の抗体は１μＭであった。平衡結合実験のランニングバッファは、ＰＢＳ ｐＨ６, ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ-２０又はＰＢＳ ｐＨ７．４, ０．０％ Ｔｗｅｅｎ-２０のいずれかとした。１０ｍＭ トリスｐＨ９、１５０ｍＭ ＮａＣｌを２０μｌ注入して表面を再生した。センサーグラムは、BIAevaluation v3.2ソフトウェアを用いて評価した。結果をＫＤ値(ＫＤｂ)として以下の表１５と図３６に示した。
まとめると、結果から、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４において、９.１ＲＦのＮ４３４Ａ及びＮ４３４Ｗ突然変異体が、９.１ＲＦよりヒトＦｃＲｎ及びカニクイザル(cyno)ＦｃＲｎに対する親和性が大きかったことが示された。さらに、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４において、Ｎ４３４Ｗ突然変異体は、Ｎ４３４Ａ突然変異体よりヒトＦｃＲｎ及びカニクイザル(cyno)ＦｃＲｎに対する親和性が大きかった。このデータから、いずれの突然変異体も、９.１ＲＦのＦｃ配列を有する抗体と比較して、インビボ半減期が長く、ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎレセプターに対する親和性が亢進していることが示唆された。
表１５
Figure 2008526205
実施例１７ Ｆｃγ受容体結合
過去に記載されているように(Shields, R.L. 等, (2001) JBC 276:6591-6604)、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを欠き、そのＣ末端にＨｉｓタググルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)を含有するヒトFcγRs (以降hFcgRとも称する)を調整した。
MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を、２ｕｇ／ｍｌの抗ＧＳＴ(クローン８Ｅ２.１.１、Genentech)を含む１００ｕｌ／ウェルの５０ｍＭ 炭酸塩バッファ、ｐＨ９．６にて、４℃で終夜コートした。０．０５％ ポリソルベート、ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ(洗浄バッファ)にてプレートを洗浄し、０．５％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ(１５０μｌ／ウェル)にてブロックした。プレートを室温で１時間インキュベートした後、洗浄バッファにて洗浄した。０．２５ｕｇ／ｍｌのヒトＦｃγレセプターを含む０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ ポリソルベート２０, ｐＨ７．４を含有するＰＢＳ(アッセイバッファ)をプレートに加えた(１００ ul/ウェル)。プレートを１時間インキュベートした後、洗浄バッファにて洗浄した。低親和性ＦｃγレセプターIIa、IIb、III (Ｆ１５８)及び高親和性III (Ｖ１５８)のために、抗体をヤギＦ(ａｂ')２抗κ(Cappel, ICN Pharmaceuticals, Inc., Aurora, Ohio)又は抗λ(BioSource, Camarillo, CA)抗体とともに、１：２ (w/w)の比で１時間インキュベートして、抗体複合体を形成させた。アッセイバッファで２倍に段階希釈した１１つの複合体ＩｇＧ抗体(３倍の段階希釈液中では１．１７−５００００ｎｇ／ｍｌ)をプレートに加えた。高親和性ＦｃγＲＩのために、アッセイバッファで２倍に段階希釈した１１つの非複合体ＩｇＧ抗体(３倍の段階希釈液中では０．０１７−１０００ｎｇ／ｍｌ)をプレートに加えた。プレートを２時間インキュベートした後、洗浄バッファにて洗浄した。結合したＩｇＧは、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２ (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を含むアッセイバッファを１００μｌ／ウェルで加えて検出した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファにて洗浄し、基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を１００μｌ／ウェルで添加した。１Ｍ リン酸を１００μｌ／ウェルで加えることによって反応を止めた。４５０ｎｍの吸光度をmultiskan Ascent読取り機(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて読み取った。
標準曲線(ｎｇ／ｍｌに対するmid-ＯＤ)の中央値の吸光度を算出した。mid-ＯＤの標準物質と試料の対応する濃度を、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質のmid-ＯＤ濃度を試料のmid-ＯＤ濃度で除することによって相対的な活性を算出した。ハーセプチン(登録商標)は既にＦｃγレセプターを結合することが示されているので、この実験ではポジティブコントロールとして用いた。
すべてのＦｃγＲについて、示された結合値は９.１ＲＦと比較した各９．１-ＲＦ変異体の結合であり、(Ａ４５０ｎｍ(変異体)／Ａ４５０ｎｍ(９／１ＲＦ))は、ＦｃＲII及びＦｃＲIIIＡに対しては０．３３又は１μｇ／ｍｌであり、ＦｃＲIに対しては２μｇ／ｍｌであった。１以上の値は、変異体の結合が９.１ＲＦと比較して改善されたことを意味し、１未満の比は９.１ＲＦと比較して結合が減少していることを意味する。ｈＦｃγＲIII(Ｆ１５８)及びｈＦｃγＲIII(Ｖ１５８)は、それぞれ、ヒトＩｇＧに対してより低い親和性及びより高い親和性のｈＦｃγＲIIIアイソタイプであることを意味する。
表１６及び図３７から、試験した９.１抗ＢＲ３抗体が複数のＦｃγＲを同様に結合して、ＡＤＣＣを促進することが示された。
表１６
Figure 2008526205
実施例１８ 抗ＣＤ２０及び抗ＢＲ３抗体によるＢ細胞枯渇
６週齢のヒトＣＤ２０トランスジェニック陽性マウスを、２００μｇのｍＩｇＧ２ａ(コントロール)、又はｍ２Ｈ７(マウス抗ヒトＣＤ２０抗体)又はｍＶ３-１にて処置した(ｉｐ)。抗体処置の１時間、１日、８日及び１５日後に血中のＢ細胞を分析した。血液、リンパ節のＢ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。データを平均＋／−標準偏差(ｎ＝４)として表した。
初期(１時間後)及び１日後では、抗ＣＤ２０抗体は抗ＢＲ３抗体よりも多くの細胞を枯渇したが、８日及び１５日後には、抗ＢＲ３抗体による枯渇は抗ＣＤ２０抗体による枯渇を上回った。図３８は血液及びリンパ節におけるＢ細胞レベルの処置後の分析を示す。
実施例１９ 濾胞性Ｂ細胞及び周辺帯Ｂ細胞の枯渇
６週齢のヒトＣＤ２０トランスジェニック陽性マウスを、２００μｇのｍＩｇＧ２ａ(コントロール)、又はｍ２Ｈ７(マウス抗ヒトＣＤ２０)又はｍＶ３-１にて処置した(ｉｐ)。ｍＡｂ処置の１日、８日及び１５日後に血中のＢ細胞を分析した。脾臓のＢ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。脾臓の濾胞性(ＦＯ−ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋)又は周辺帯(ＭＺ−ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ)の絶対数を３処置間で比較した。データを平均＋／−標準偏差(ｎ＝４)として表した。
濾胞性Ｂ細胞及び周辺帯Ｂ細胞のいずれにおいても、１日後では、抗ＣＤ２０抗体は抗ＢＲ３抗体よりも多くの細胞を枯渇したが、８日及び１５日後には、抗ＢＲ３抗体による枯渇は抗ＣＤ２０抗体による枯渇を上回った(図３９)。
実施例２０ カニクイザルにおける半減期
ＦｃＲｎに対して異なる結合能親和性を有する３つのヒト化モノクローナル抗-ＢＲ３抗体(９.１ＲＦ、９.１ＲＦ Ｎ４３４Ａ及び９.１ＲＦ Ｎ４３４Ｗ)の薬物動態を、カニクイザルにおいて比較した。１７匹の雄と１７匹の雌の４−５歳、体重２−４ｋｇのカニクイザル(Macaca fascicularis)を体重によって３つのグループにランダムに分けた。グループ１、２及び３の動物に、それぞれ野生型、Ｎ４３４Ａ変異体又はＮ４３４Ｗ変異体を２０ｍｇ／ｋｇ単回IV用量で投与した。実験構成は以下の通りである。
Figure 2008526205
ａ総用量容積(ｍｌ)は最も新しく測定した体重に基づいて算出した。用量容積はほぼ０．１ｍｌとした。
薬物動態の分析のために、以下の時間点で各動物の末梢静脈からおよそ１．０ｍｌの血液を採取した：
・プレ投与
・実験第１日目には、投与後３０分と６時間
・実験の第２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、７１、７８、８５、９２、９９、１０６、１１３、１２０、１２７及び１３４日目
抗治療的抗体の分析のために、以下の時間点で各動物の末梢静脈からおよそ１．０ｍｌの血液を採取した：
・プレ投与
・実験の第１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７及び１３４日目
薬物動態(ＰＫ)及び抗治療的抗体(ＡＴＡ)分析のための血液サンプルを血清分離器チューブに回集し、室温でおよそ３０−８０分間凝固させた。血清(およそ０．５ｍＬ)を遠心(２０００×ｇ、室温で１５分間)して得た。血清試料を予めラベリングした１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、分析までドライアイスに置くまで−６０℃〜−８０℃の温度を維持する冷凍庫に貯蔵した。
各々の血清試料中の各抗体の濃度をＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。血清中の定量化のアッセイ下限(ＬＬＯＱ)は０．０５ｕｇ／ｍＬである。この下限以下の値を検出可能以下(ＬＴＲ)と記録した。ブリッジングＥＣＬＡアッセイを用いて各試料中の抗治療的抗体を測定した。
投薬計画から大きく異ならない試料収集時間と予定通りの用量をデータ分析に用いた。雌雄カニクイザルの血清９.１ＲＦ、９.１ＲＦＮ４３４Ａ及び９.１ＲＦＮ４３４Ｗ濃度の平均とＳＤを、エクセル(バージョン2000, Microsoft Corporation, Redmond, WA,)を用いて算出して、SigmaPlot (バージョン9.0；Systat Software, Inc., Point Richmond, CA)を用いてプロットした。検出可能以下の血清濃度はすべてのデータ分析から除いた。ｎ≦２とき、ＳＤは算出しなかった。結果を３つの重要な図に示す。
1 over y hat weighting scheme (WinNonlin Version 3.2; Pharsight Corporation; Mountain View, CA)によるGauss-Newton (Levenberg and Hartley)２区画モデルを用いて各動物のＰＫパラメータを算出した。グループ１(野生型；９.１ＲＦ)の１０匹のカニクイザルのうちの８匹とグループ３(９.１ＲＦＮ４３４Ｗ)の１０匹のカニクイザルのうちの５匹は、第５７日目までにＡＴＡを示した。総じて、特定の時間でのＡＴＡの検出は、その時間又はその時間の後の血清濃度の明らかな下降と相関しており、その結果、最終的に半減期が短くなり、薬物曝露が減少した。ＰＫ上のＡＴＡ応答の効果の大きさを理解するために、２つの方法を用いて各グループの平均ＰＫパラメータを算出した。方法１では、各グループの１０匹すべてのカニクイザルのデータからＰＫパラメータ(平均±標準偏差)を算出した。方法２では、第５７日目までに抗治療的抗体を産生しないカニクイザルのみのデータを用いてＰＫパラメータを算出した(グループ１ではｎ＝２、グループ２ではｎ＝１０及びグループ３ではｎ＝５)。グループ１及びグループ３では、方法１は予測される最終的な半減期(ｔ１／２，β)はより低くなり、曝露(ＡＵＣ)は方法２に匹敵した。しかしながら、２つの方法を用いた全体の結果は類似していた。したがって、本実験で報告した平均ＰＫパラメータは方法１を用いて算出した(例えばすべてのカニクイザルのデータを含む)。
結果
２０ｍｇ／ｋｇの９.１ＲＦ(野生型抗体)、９.１ＲＦＮ４３４Ａ(Ｎ４３４Ａ変異体)及び９.１ＲＦＮ４３４Ｗ(Ｎ４３４Ｗ変異体)の単一のＩＶ食物塊ボーラス投与後に、血清濃度は、より遅い排出相(図１)が続く急速な初期分布相の後に遅延型の排出相が起こる二相性の傾向を示した(図１)。各グループの算定されたＰＫパラメータを表２に示し、各グループの１０匹すべてのカニクイザルのデータを含む。９.１ＲＦ(野生型抗体)の最終半減期(平均±ＳＤ)は６．１５±２．０１日であり、１０匹のカニクイザルでは４．２４から１１．０日の範囲であった。第５７日目までにＡＴＡを産生しなかった２匹のカニクイザルの9.1ＲＦの平均最終半減期(ｔ１／２，β)は、８．９５日であった。９.１ＲＦＮ４３４Ａ(Ｎ４３４Ａ変異体)について、平均最終半減期は１４．１±１．５５日であり、９.１ＲＦ(p＜０．０５)の平均最終半減期より大きい１．６−２．３倍であった。９.１ＲＦＮ４３４Ｗ(Ｎ４３４Ｗ変異体)について、１０匹のカニクイザルの平均±ＳＤ最終半減期は９．５５±２．４９日であった。この値は、１０匹のカニクイザル(ｐ＜０．０５)において、９.１ＲＦ(野生型抗体)の全体の平均ｔ１／２，βより有意に大きいが、検出可能なＡＴＡを産生しなかった２匹のカニクイザルにおいては９.１ＲＦの平均ｔ１／２，βに非常に近かった(８．９５日)。９.１ＲＦ(野生型抗体)と９.１ＲＦＮ４３４Ｗ(Ｎ４３４Ｗ変異体)との間で観察されたｔ１／２，βの相違はこれら２つのグループにおいてＡＴＡ応答により混乱されるようである。
９.１ＲＦ(野生型抗体)の無限に推定される濃度-時間曲線下の領域(ＡＵＣ)は２４４０±３９８日＊ｕｇ／ｍＬであり、１０匹のカニクイザルでは１７４０から３１４０日＊ｕｇ／ｍＬまで変動する。第５７日目までにＡＴＡを産生しなかった２匹のカニクイザルの９.１ＲＦの平均ＡＵＣは、２８５０日＊ｕｇ／ｍＬであった。９.１ＲＦＮ４３４Ａ(Ｎ４３４Ａ変異体)については、平均ＡＵＣは４４５０±６８５日＊ｕｇ／ｍＬであり、９.１ＲＦ(野生型抗体)(p＜０．０５)の平均ＡＵＣより１．６−１．８倍大きかった。９.１ＲＦ(野生型抗体)と９.１ＲＦＮ４３４ＷのＡＵＣに相違はなかった。
要約すると、９.１ＲＦ、９.１ＲＦＮ４３４Ａ及び９.１ＲＦＮ４３４Ｗの薬物動態は、カニクイザルに２０ｍｇ／ｋｇを単回IV投与した後に調べた。第５６日目までに１０匹のカニクイザルのうち８匹が９.１ＲＦに対する抗治療的抗体(ＡＴＡ)を産生したのに対して、第５６日目までに１０匹のカニクイザルのうちの５匹が９.１ＲＦＮ434Ｗに対するＡＴＡを産生した。第５６日目までに９.１ＲＦＮ４３４Ａに対するＡＴＡを産生したカニクイザルはいなかった。９.１ＲＦＮ４３４Ａは、９.１ＲＦ(野生型抗体)(p＜０．０５)と比較して、増加した最終半減期及び増加したＡＵＣを示した。９.１ＲＦＮ４３４Ｗは、９.１ＲＦと比較して最終半減期のわずかな増加を示した；しかしながら、この観察された相違は９.１ＲＦと９.１ＲＦＮ４３４Ｗの両方に対する抗治療的抗体応答により混乱されるようである。
Figure 2008526205
＊ ＷＴ及び９.１ＲＦＮ４３４Ｗグループの８／１０及び５／１０のカニクイザルにおける抗薬剤抗体の存在は、ＷＴ及び９.１ＲＦＮ４３４ＷのＰＫパラメータを混乱しうる(例えば、ＡＵＣを減少して、ｔ１／２，βを減少する)。
＊＊ ＷＴとの相違、p＜０．０５。
実施例２１ カニクイザルにおけるＢ細胞の枯渇
抗ＢＲ３(ＷＴと称する９.１ＲＦ)及びＦｃＲｎ変異体Ｎ434Ａ(９.１ＲＦ Ｎ434Ａと称する)。５１匹のカニクイザルに、以下の研究設定に従ってＷＴ又は９.１ＲＦＮ434Ａを投与した。
Figure 2008526205
すべてのグループにおいて、ＦＡＣＳにより末梢Ｂ細胞(総Ｂ細胞及びＢ細胞サブセット)枯渇を時間とともにモニターして、個々の動物標準のパーセンテージとして表した。標準の値は、各動物についてのプレ投与試料採取時間の平均とした。組織Ｂ細胞サブセットは、各死体解剖時間点でＦＡＣＳ分析によって分析した。Ｂ細胞枯渇について分析される組織は、脾臓、下顎軟骨リンパ節及び腸間膜リンパ節を含む(図４０Ａ及びＢ)。
投与後、すべての投与グループの血液において、有意なＢ細胞の枯渇が観察された。２０ｍｇ／ｋｇ×４用量を投与したＷＴ及び９.１ＲＦＮ４３４Ａグループにおいて、第２９日目(死体解剖時間点)には組織Ｂ細胞が枯渇していた。ＷＴ ２ｍｇ／ｋｇにおいては、組織のＢ細胞枯渇は明らかでなかった。図４１Ａ−Ｃは、処置後のＢ細胞の亜細胞集団を示す。
実施例２２ 亢進したＡＤＣＣ活性を有する抗ＢＲ３抗体
抗ＢＲ３抗体９.１ＲＦのＦｃ部分のアミノ酸置換は、Ｂ細胞腫瘍株に対して分子のＡＤＣＣ活性を上げるように設定した。部位特異的突然変異によって、抗体のＦｃ領域を以下の通りに変異させた：Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ又はＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ(ＥＵ番号付けシステム)。アミノ酸置換を特定するオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、Kunkel 等 (Methods in Enzymology (1987) 154, 367-382)のプロトコールに従って、９.１ＲＦをコードするプラスミドのオリゴヌクレオチド誘導性突然変異誘発に用いた。変異体配列をジデオキシヌクレオチドベースの配列決定法によって確認した。Qiagen, Inc.により記載されるgigaprepプロトコールを用いて、ＤＮＡを１Ｌの大腸菌ＸＬ-1 ブルー (Stratagene, Inc.)の培養物(５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンを含有する２ＹＴ培地)から精製して、適切なプラスミドを用いて形質転換して、２００ＲＰＭで振とうしながら３７℃で生育させた。タンパク質は、ＣＨＯ細胞を一過性に形質移入するための精製されたプラスミドＤＮＡを用いて発現した。プロテインＡセファロースのクロマトグラフィの後にＳＰ-セファロースのカチオン交換クロマトグラフィを用いて、１Ｌの培養物上清から抗体を精製した。精製したタンパク質は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥとアミノ末端配列決定法によって確認した。精製したすべての抗体は、分析用のゲル濾過クロマトグラフィで均一なピークを示し、このピークは静的光散乱(static light scattering)データからモル質量が１５００００±５０００、３％以下の凝集含量であると算出された。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ(表２)によるＮ結合オリゴ糖の分析から、炭水化物組成が典型的な組換え抗体であることが示された。
Ｆｃγレセプターに対する変異体抗体の結合は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて評価した。Shields 等 (J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))に記載のように、ヒトＦｃγレセプター I、IIa、IIb、IIIa(F158)、IIIa(V158)及びマウスＦｃγレセプターI、II及び IIIの細胞外ドメインをＣＨＯ細胞でＨｉｓ-タグ付加ＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製した。ＥＬＩＳＡアッセイのために、融合タンパク質を、抗ＧＳＴ抗体でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに結合(capture)させた。希釈した変異形抗体を加え、結合させた後にウェルを洗浄して結合していない抗体を除去した。弱い結合抗体の場合、試料を抗ｈｕκ鎖抗体のＦａｂ’２断片と複合体化した後に試料をウェルに添加した。結合した抗体は、ヤギ抗ｈｕＦａｂ’２抗体のＨＲＰ結合Ｆａｂ’２断片により検出した。４-パラメータ方程式を用いて結合曲線を評価して、飽和状態で観察されるシグナルの５０％を示す抗体の濃度であるＥＣ５０値を算出した。これらの実験ではハーセプチン(登録商標)をコントロール抗体として用いて、結合の倍数的な改善をＥＣ５０値の比(ＥＣ５０ハーセプチン／ＥＣ５０試料)から算出した。
Figure 2008526205
これらのデータから、すべての抗ＢＲ３変異体はヒトＦｃγＲＩＩＩａのＦ１５８及びＶ１５８アロタイプの両方に対する親和性が増加したことが示された。すべての変異体はヒトＦｃγＲＩに対する親和性にわずかな変化があった。
乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)読み取りを使用して、基本的には記載されているように(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))、ＢＲ３とＣＤ２０を発現するバーキットリンパ腫株であるＢＪＡＢ細胞のナチュラルキラー細胞(NＫ細胞)溶解を媒介する、抗ＢＲ３抗体の能力(ＡＤＣＣ活性)についてアッセイした。ＣＤ１６のＦ／Ｖ１５８アロタイプについて異種接合性であるドナーから単離したＮＫ細胞を、５：１のエフェクター：標的比でアッセイに用いた。RosetteSep(登録商標)ヒトＮＫ細胞エンリッチメント混合液(StemCell Technologies, Vancouver, B.C.)を用いて、製造者の指示に従って、１００ｍＬのヘパリン処理血液からＮＫ細胞を調製した。血液を等量のリン酸緩衝食塩水にて希釈して、１５ｍｌのFicoll-PaqueTM(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)にて層状にして、１４５０ＲＰＭで２０分間、遠心分離した。層間界面の白血球を４本の清浄な５０ｍＬチューブに分配し、そのチューブを１５％ 胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地で満たした。チューブを１４５０ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を捨てた。ＮＫ細胞をアッセイ培地(グリシンなしのＦ１２／ＤＭＥＭ ５０:５０、１ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ ｐＨ７．２、ペニシリン／ストレプトマイシン(１００単位／ｍＬ；Gibco)、グルタミン、及び１％ 熱不活性化胎仔ウシ血清)にて２×１０６細胞／ｍＬに希釈した。
アッセイ培地にて段階希釈した抗体 (０．０５ｍＬ)を、９６ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。ＢＪＡＢ細胞をアッセイバッファで４×１０５／ｍＬの濃度まで希釈した。ＢＪＡＢ細胞(ウェル当たり０．０５ｍＬ)を９６ウェルプレート中で希釈した抗体と混合し、室温で３０分間インキュベートして、ＢＲ３への抗体の結合を可能にした(オプソニン作用)。
各ウェルに０．０５ｍＬのＮＫ細胞を添加してＡＤＣＣ反応を開始させた。コントロールウェルでは、２％ Triton Ｘ-１００を添加した。ついで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。細胞障害性(ＬＤＨ)検出キット(キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)を製造者のプロトコールに従って使用して、放出されたＬＤＨのレベルを測定した。０．１ｍＬのＬＤＨ展開液を各ウェルに加えた後、１０秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で１５分暗所でインキュベートした。ついで、４９０ｎｍでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全ＬＤＨで除することによって％溶解を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、４-パラメータ曲線フィッティング(KALEIDAGRAPH)を用いてＥＣ５０濃度を決定した。
すべての抗ＢＲ３変異体はＡＤＣＣアッセイにおいて活性であり、１ｎＭ未満のＥＣ５０値(％殺害対抗体濃度)を示した。Ｆｃ置換により、ＥＣ５０の低下による９．１と相関した作用強度(データは示さない)と最大％殺害が増加した。Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ突然変異体は、９．１ｗｔ(相対的なＥＣ５０値)と関連して、このアッセイにおいては３倍以上のＡＤＣＣ活性を有した。Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ突然変異体は、９．１ｗｔ(相対的なＥＣ５０値)と関連して、このアッセイにおいては２．８倍以上のＡＤＣＣ活性を有した。
カバット番号付けシステムに従って番号付けした２.１移植抗ＢＲ３抗体の可変ドメイン配列。太字は、ヒトコンセンサスIII配列と比較したときのＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ａの変異を示す。下線部は、ＣＤＲ配列(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３)を含む領域を示す。 カバット番号付けシステムに従って番号付けした９.１移植抗ＢＲ３抗体の可変ドメイン配列。太字は、ヒトコンセンサスIII配列と比較したときのＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ａの変異を示す。下線部は、ＣＤＲ配列(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３)を含む領域を示す。 カバット番号付けシステムに従って番号付けした１１Ｇ９移植抗ＢＲ３抗体の可変ドメイン配列。下線部は、ＣＤＲ配列(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３)を含む領域を示す。太字は、ヒトコンセンサスIII配列と比較したときのＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及びＬ７８Ａの変異を示す。 ９.１移植抗ＢＲ３抗体のＣＤＲ領域をある程度ランダム化して選別した結果を示す。列挙した抗体の可変ドメインは、示したＬ２及びＨ１領域内の残基変異を除いて、９.１移植可変ドメイン配列と同じである。 マウスＶＨフレームワーク領域とヒト「ＲＦ」及び「ＲＬ」フレームワーク配列との比較。 修飾したフレームワークを有する移植Ｆａｂによる抗原結合を示す。 ラウンド５での２.１-ＲＬ及び２.１-ＲＦ ＣＤＲ修復ライブラリから選別した配列。列挙した抗体の可変ドメインは、示したＨ３領域内の残基変異を除いて、２.１-ＲＬ又は２.１-ＲＦ可変ドメイン配列と同じである。 ラウンド５での９.１-ＲＬ及び９.１-ＲＦ ＣＤＲ修復ライブラリから選別した配列。列挙した抗体の可変ドメインは、示したＨ１領域内の残基変異を除いて、９.１-ＲＬ又は９.１-ＲＦ可変ドメイン配列と同じである。 ラウンド５での１１Ｇ９-ＲＦ ＣＤＲ修復ライブラリから選別した配列。列挙した抗体の可変ドメインは、示したＨ１、Ｈ２及びＨ３領域内の残基変異を除いて、１１Ｇ９-ＲＦ可変ドメイン配列と同じである。 選別した抗ＢＲ３ヒト化ＭＡｂのＢＩＡｃｏｒｅ分析。 (Ａ)マウスＢＲ３ ＥＣＤを有するポリペプチド又は(Ｂ)ヒトＢＲ３ ＥＣＤを漸増した溶液中で結合した選別されたＦ(ａｂ)'２ファージクローンについての溶液結合競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。 カバット番号付けシステムに従って番号付けしたファージ由来抗ＢＲ３抗体のアミノ酸配列。「ＬＮ」は残基番号９５−１０２の間とそこに含まれる残基の番号を示す。「＃」はクローンがスクリーニングで選別された回数を示す。「クローン」は受託されたファージクローン番号を示す。ＣＤＲ-Ｈ２の残基Ｉ５１、Ｐ５２ａ、Ｇ５５、Ｔ５７は示さない。各抗体を含む残りの残基(１−２３、３５−４９、５７−８８及び９８−１０７)は図１５のＶ３に記載される通りである。「Ｘ」は配列が不明であることを示す。 溶液結合競合ＥＬＩＳＡを用いて選別したＦ(ａｂ)'２ファージのＩＣ５０値と、ＢＡＦＦ存在下でのｍＢＲ３又はｈＢＲ３の細胞外ドメインに結合したＦ(ａｂ)'２ファージの割合。 ＢＡＦＦの濃度を漸増したときのｍＢＲ３-ＦｃコートウェルへのＦ(ａｂ)'２ファージ結合の阻害を示すＥＬＩＳＡアッセイ。 カバット番号付けシステムに従って番号付けしたファージ由来Ｖ３抗ＢＲ３抗体の可変ドメイン配列。 (Ａ)Ｖ３由来クローンの配列、(Ｂ)Ｆ(ａｂ)'２ファージのＩＣ５０値とハイブリッドｍＢＡＦＦによるＢＲ３への結合ブロッキング。ＬＣ-ＣＤＲ２の残基５１(Ａ)、５２(Ｓ)及び５４(Ｌ)は示さない。 Ｖ３-１由来クローンの残基とそのＩＣ５０値を示す。 親和性改善Ｖ３-４６ｓファージクローンと、マウス及びヒトのＢＲ３への結合についてのファージＩＣ５０値を示す。示したアミノ酸は、カバット番号付けシステムに従って、配列番号１９４−２０７の残基番号２７−３２(「Ｌ１」)、４９−５５(「Ｌ２」)及び ８８−９４(「Ｌ３」)である。 ＢＪＡＢ細胞への抗ＢＲ３ｍＡｂの競合的及び直接的な結合を示す。(Ａ)ＢＡＦＦ競合的結合アッセイ。(Ｂ)直接的結合アッセイ。アイソタイプコントロールは結合を示さず、検出抗体はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂに等しく結合した。 ＢＪＡＢ細胞(ヒトＢＲ３)へのＶ３-１ｍ及びＢ９Ｃ１１結合による競合的及び直接的な結合アッセイの結果を示す(それぞれＡ及びＢ)。 ＢＨＫ細胞(マウスＢＲ３)へのＶ３-１ｍ及びＢ９Ｃ１１結合による競合的及び直接的な結合アッセイの結果を示す(それぞれＣ及びＤ)。 抗ヒトＢＲ３ｍＡｂ特徴付けについての競合的ＥＬＩＳＡを示す。示した濃度のｍＡｂを一定量のビオチン化ｍＡｂ９.１(Ａ)又は２.１(Ｂ)とともにインキュベートした。 抗ヒトＢＲ３ｍＡｂ特徴付けについての競合的ＥＬＩＳＡを示す。示した濃度のｍＡｂを一定量のビオチン化１１Ｇ９(Ｃ)又は１Ｅ９(Ｄ)とともにインキュベートした。 マウスＢＲ３へのV3-1m、B9C11及びP1B8の競合的結合を示す。ビオチン化Ｖ３-１ｍ(Ａ)とビオチン化Ｂ９Ｃ１１(Ｂ)を用いて競合的ＥＬＩＳＡを行った。 抗体２.１、１１Ｇ９及び９.１が２つの異なるドナーのＢ細胞の増殖を阻害したことを示す(それぞれＡ及びＢ)。 抗体Ｖ３-１ｍが(Ａ)抗ＩｇＭ(５ｕｇ／ｍｌ)＋ＢＡＦＦ(２ｎｇ／ｍｌ)又は(Ｂ)抗ＩｇＭ(５ｕｇ／ｍｌ)＋ＢＡＦＦ(１０ｎｇ／ｍｌ)により刺激されたＢ細胞増殖を阻害したことを示す。 ９.１-ＲＦがＢＡＦＦ依存性のヒトＢ細胞増殖をブロックし、アゴナイズしなかったことを示す。(Ａ)抗ＩｇＭ＋ＢＡＦＦ＋９.１-ＲＦにて処理したヒト一次Ｂ細胞。(Ｂ)抗ＩｇＭ＋９.１-ＲＦにて処理したヒト一次Ｂ細胞。 ２.１-４６がＢ細胞増殖を刺激したことを示す。(Ａ)抗ＩｇＭ＋ＢＡＦＦ＋２.１-４６にて処理した細胞。(Ｂ)抗ＩｇＭ＋２.１-４６にて処理した細胞。 ショットガンａｌａスキャニング結果に基づくＢＲ３と抗体１１Ｇ９、２.１、９.１及びＶ３-１との相互作用の様々な位置の図解を示す。丸で囲んだ残基はＯ結合グリコシル化の起こりうる部位を示す。 Ｂ細胞マーカに対する抗体を用いた、慢性リンパ急性白血病(ＣＬＬ)患者の末梢血におけるＢ細胞集団を示す。Ａ、Ｃ及びＤは、抗ＣＤ１９抗体と、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ５抗体の何れかを用いたＦＡＣＳ分析を示す。Ｂは、悪性の集団におけるＢＲ３発現を示す棒グラフである。囲みは悪性の集団を示す。 ヒト化抗ＢＲ３抗体と(Ａ)ＢＪＡＢ細胞及び(Ｂ)Ｒａｍｏｓ細胞を用いたＡＤＣＣ活性アッセイの結果を示す。 ヒト化抗ＢＲ３抗体と(Ｃ)ＷＩＬ２ｓ細胞を用いたＡＤＣＣ活性アッセイの結果を示す。 Ｖ３-１、ＢＲ３-Ｆｃ又はコントロール抗体による処理の７日後の血液(Ａ−Ｃ)、リンパ節(Ｄ−Ｆ)及び脾臓(Ｇ−Ｉ)中のマウスＢ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 Ｖ３-１、ＢＲ３-Ｆｃ又はコントロール抗体による処理後第１日目、第３日目、第７日目及び第１５日目の(Ａ)１ｍｌの血液に含有するマウスＢ細胞の絶対数；(Ｂ)リンパ節中のＢ細胞の％；(Ｃ)濾胞性Ｂ細胞(FO−CD21+CD23+)の絶対数又は(Ｄ)脾臓中の周辺帯Ｂ細胞(MZ−CD21high CD23low)を示す。 コントロール抗体、ＢＲ３-Ｆｃ又はＶ３-１による処理後第１５日目のマウスのＢ細胞集団を示す。(Ａ)処理後のマウスの脾臓又はパイエル板におけるＢ細胞集団のＦＡＣＳ分析。 コントロール抗体、ＢＲ３-Ｆｃ又はＶ３-１による処理後第１５日目のマウスのＢ細胞集団を示す。(Ｂ)処理後の脾臓における形質芽細胞の棒グラフ。 コントロール抗体、ＢＲ３-Ｆｃ又はＶ３-１による処理後第１５日目のマウスのＢ細胞集団を示す。(Ｃ)処理後のパイエル板における胚中心細胞の棒グラフ。 ＡＤＣＣ活性とＢＡＦＦブロッキング能を有する抗ＢＲ３抗体、非ブロッキング抗ＢＲ３抗体、Ｆｃ欠損変異体抗ＢＲ３抗体又はＢＲ３-Ｆｃを用いた処理後第６日目のＢＡＬＢ／ｃマウスの血液(Ａ)及び脾臓(Ｂ)におけるＢ細胞の減少を示す。 抗ＢＲ３抗体、ｍＶ３-１、ｍＢＲ３-Ｆｃ及びコントロール抗体によるＮＺＢ×Ｗ Ｆ１マウス(ループス腎炎モデル)の処置の結果を示す。(Ａ)コントロールマウスと比較したときの抗ＢＲ３抗体処置マウスとＢＲ３-Ｆｃ処置マウスの時間的減少経過を示す。(Ｂ)ＢＲ３-Ｆｃ(p<0.01)、コントロール(p<0.03)及びｍＶ３-１(p<0.001)で処置したマウスの血液１ｍｌ当たりのＢ細胞数を示す。(Ｃ)ＢＲ３-Ｆｃ、コントロール及びｍＣＢ１で処理したマウスの脾臓当たりのＢ細胞の総数を示す(p<0.00001)。(Ｂ)の横線と(Ｃ)はグループの平均レベルを示す。データは個々のマウスのデータポイント(ｎ＝２５)として表す。 示したように(第４日目)ヒトＰＢＭＣ及び抗ＢＲ３抗体又はｍＢＲ３-Ｆｃで処理したＳＣＩＤモデルマウスにおけるＢ細胞枯渇を示す。(Ａ)活性化／ＧＣ Ｂ細胞の割合(CD19hi/CD38int)、(Ｂ)活性化／ＧＣ Ｂ細胞の数、(Ｃ)形質芽細胞の割合(CD19lo/CD38hi/CD139neg)。 示したように(第４日目)ヒトＰＢＭＣ及び抗ＢＲ３抗体又はｍＢＲ３-Ｆｃで処理したＳＣＩＤモデルマウスにおけるＢ細胞枯渇を示す。(Ｄ)形質芽細胞の数、(Ｅ)活性化／ＧＣ細胞の割合(CD19hi/CD38+)。 平衡状態(ｐＨ６．０及びｐＨ７．４)のヒト又はカニクイザル(cyno)のＦｃＲｎへの９.１ＲＦ(Ａ)、９.１ＲＦ Ｎ４３４Ａ(Ｂ)及び９.１ＲＦ Ｎ４３４Ｗ(Ｃ)抗体の結合を示す。Ｒｅｑは平衡状態のチップからの反応単位の数である。 抗ＢＲ３抗体又はハーセプチン(登録商標)抗体(ポジティブコントロール)へ結合するＦｃγレセプターを用いたＥＬＩＳＡアッセイを示す。Ａ：ＦｃγＲＩ。Ｂ：ＦｃγＲＩＩＡ。 抗ＢＲ３抗体又はハーセプチン(登録商標)抗体(ポジティブコントロール)へ結合するＦｃγレセプターを用いたＥＬＩＳＡアッセイを示す。Ｃ：ＦｃγＲＩＩＢ。Ｄ：ＦｃγＲＩＩＩ (Ｆ１５８)。 抗ＢＲ３抗体又はハーセプチン(登録商標)抗体(ポジティブコントロール)へ結合するＦｃγレセプターを用いたＥＬＩＳＡアッセイを示す。Ｅ：ＦｃγＲＩＩＩ (Ｖ１５８)。 抗ＣＤ２０抗体(２Ｈ７)処置に対する抗ＢＲ３抗体(Ｖ３-１)処置の１時間後、第１日目、第８日目又は第１５日目の血液中のＢ細胞レベルの分析。 抗ＣＤ２０抗体(２Ｈ７)処置に対する抗ＢＲ３抗体(Ｖ３-１)処置の１時間後、第１日目、第８日目又は第１５日目のリンパ節中のＢ細胞レベルの分析。 抗ＣＤ２０抗体処置に対する抗ＢＲ３抗体(Ｖ３-１)処置の第１日目、第８日目又は第１５日目の濾胞性Ｂ細胞中のＢ細胞レベルの分析。 抗ＣＤ２０抗体処置に対する抗ＢＲ３抗体(Ｖ３-１)処置の第１日目、第８日目又は第１５日目の周辺帯Ｂ細胞中のＢ細胞レベルの分析。 ９.１ＲＦで処置したカニクイザルの血液(Ａ)及び組織(Ｂ)中のＢ細胞枯渇を示す。データはＡＴＡ-サルのものである(２０ｍｇ／ｋｇで処置した５匹のカニクイザル；２ｍｇ／ｋｇで処置した３匹のカニクイザル)。 ９.１ＲＦ又は９.１ＲＦ Ｎ４３４Ｗで処置したカニクイザルの血液中のＢ細胞集団のレベルを時間の経過とともに示す。(Ａ)CD20+/CD21+細胞、(Ｂ) CD21+/CD27+細胞及び(Ｃ)CD21+/CD27-細胞。

Claims (143)

  1. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、ヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を有するかないしは、ヒト野生型ＩｇＧ Ｆｃを含有する抗体と比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを亢進している抗体ないしはポリペプチド。
  2. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、ヒト野生型ＩｇＧ Ｆｃを含有する抗体と比較して、ヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞性障害(ＡＤＣＣ)を減弱している抗体ないしはポリペプチド。
  3. ヒトＢＲ３細胞外ドメインに結合し、インビボのＢ細胞を殺傷するか又は枯渇する抗体ないしはポリペプチド。
  4. 前記の抗体ないしはポリペプチドが、該抗体ないしはポリペプチドで処理されていないネガティブコントロール又は基準レベルと比較して少なくとも２０％インビボのＢ細胞を殺傷又は枯渇する、請求項３に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  5. 前記の抗体ないしはポリペプチドが、該抗体ないしはポリペプチドで処理されていないネガティブコントロール又は基準レベルと比較して少なくとも２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上のインビボの血中Ｂ細胞を殺傷又は枯渇する、請求項４に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  6. 前記抗体が、ヒト、カニクイザル及びアカゲザルのＢ細胞からなる群から選択される少なくとも一の霊長類Ｂ細胞を枯渇することができる、請求項４又は５に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  7. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを含有する抗体と比較して、インビボの半減期が増加している抗体ないしはポリペプチド。
  8. 前記抗体ないしはポリペプチドが、血清アルブミン、血清アルブミン結合ポリペプチド又は非タンパク質ポリマーにコンジュゲートされている、請求項３に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  9. 前記の抗体ないしはポリペプチドが、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して変更したＦｃ領域を含有する、請求項１ないし７の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  10. 前記の抗体ないしはポリペプチドが、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域を含有する抗体と比較して、ｐＨ６．０でのヒトＦｃ新生児レセプター(ＦｃＲｎ)に対する親和性が高く、変更したＦｃ領域を含有する、請求項７に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  11. 残基Ｌ３８及びＲ３９を含有する、ヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有するヒト化抗体又はヒト抗体。
  12. 残基Ｇ３６を含有する、ヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有するヒト化抗体又はヒト抗体。
  13. 残基Ｌ２８及びＶ２９を含有する、ヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有する抗体。
  14. 残基Ｐ２１及びＡ２２を含有する、ヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有する抗体。
  15. 残基Ｆ２５、Ｖ３３、Ａ３４を含有し、場合によって残基Ｒ３０をさらに含有する、ヒトＢＲ３上に機能的なエピトープを有するヒト化抗体又はヒト抗体。
  16. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、マウスＢＲ３細胞外ドメイン配列に５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値で結合する抗体ないしはポリペプチド。
  17. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に、２５℃でのＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるＦａｂとして１００ｕＭ以下、１ｕＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値で結合する請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  18. 表２に記載の抗体の何れか一に由来し、ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に、２５℃でのＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるＦａｂとして１００ｕＭ以下、１ｕＭ以下、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値で結合する抗体ないしはポリペプチド。
  19. ヒト細胞外ＢＲ３配列に結合し、表２に記載の抗体の何れか一のＨ１、Ｈ２及びＨ３領域のそれぞれに少なくとも７０％の相同性を有するＨ１、Ｈ２及びＨ３領域を有するヒト化抗体又はヒト抗体。
  20. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、表２に記載の抗体の何れか一のＬ１、Ｌ２及びＬ３領域のそれぞれに少なくとも７０％の相同性を有するＬ１、Ｌ２及びＬ３領域を有するヒト化抗体又はヒト抗体。
  21. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、表２に記載の抗体の何れか一のＶＨドメインに少なくとも７０％の相同性を有するヒト抗体又はヒト化抗体。
  22. ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に結合し、配列番号４−１３、１５、１６−１８、２０、２２、２４、２６、２８−７３、７５−７６、７８、８０−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７及び１２９−１３１の何れか一のＨ３配列を含有してなるヒト抗体又はヒト化抗体。
  23. さらに、表２に開示される抗体の何れか一のＨ１、Ｈ２及びＨ３の配列を含有してなる、請求項２２に記載の抗体。
  24. さらに、表２に開示される抗体の何れか一のＬ１、Ｌ２及びＬ３の配列を含有してなる、請求項２３に記載の抗体。
  25. (１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と(２) RDTSKNTF (配列番号２１０)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  26. さらに、Ｈ１高頻度可変領域(ＨＶＲ１)内に残基GFTVTAYYMS (配列番号２１４)とＨ２高頻度可変領域(ＨＶＲ２)内に残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (配列番号２１３)を含んでなる、請求項２５に記載の抗ＢＲ３抗体。
  27. さらに、配列番号６−９、１６−１８、３５−３６、７５−７６及び８１−８５の何れか一の抗体配列の残基番号４９−６５(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ２と残基番号２６−３５を含有するＨＶＲ１とを含んでなる、請求項２５に記載の抗ＢＲ３抗体。
  28. (１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と(２) RDTSKNTL (配列番号２１１)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  29. さらに、配列番号５、１１−１３及び３７−７３の抗体配列の何れか一の残基番号２６−３５及び４９−６５(カバット番号付け)を含有してなる、請求項２８に記載の抗ＢＲ３抗体。
  30. (１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と (２) W-A-X3-X4-X5-X6-S (配列番号２１５)を含有するＬ１高頻度可変領域(ＬＶＲ１)を含んでなり、X3がQ又はSであり、X4がH又はIであり、X5がL又はRであり、X6がD又はEである、抗ＢＲ３抗体。
  31. (１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；と(２) X1-X2-P-X4-X5-G-X7-Y-X9-S (配列番号２１6)を含有するＨ１高頻度可変領域(ＨＶＲ１) を含んでなり、X1がG又はDであり、X2がL又はSであり、X4がM、R又はVであり、X5がA又はSであり、X7がF、H又はYであり、X9がT又はIであり、抗ＢＲ３抗体。
  32. (１) QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３高頻度可変領域(ＨＶＲ３)；(２) 配列番号２１５の配列を含有するＬＶＲ１と、(３) 配列番号２１６の配列を含有するＨＶＲ１を含んでなるＢＲ３結合抗体。
  33. (１) 配列X1-X2-X3-X4-X5-G-A-M-D-Y (配列番号２１７)を含有し、X1がT、N又はRであり、X2がT、S、L、N又はPであり、X3がL又はNであり、X4がP、F、L、Y又はNであり、X5がD又はYである、ＨＶＲ３と、(２) RDTSKNTF (配列番号２１０)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)とを含んでなるＢＲ３抗体。
  34. 前記ＨＶＲ３が配列番号６−９及び１６−１８の何れか一の抗体の残基番号９４−１０２(カバット番号付け)を含有する、請求項３３に記載の抗ＢＲ３抗体。
  35. (１) 配列X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-M-D-Y (配列番号２１８)を含有し、X1がT又はNであり、X2がA、T又はSであり、X3がN、H又はLであり、X4がP、F、Y又はNであり、X5がT又はYであり、X7がA又はEである、ＨＶＲ３と、(２) RDTSKNTL (配列番号２１１)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  36. 前記ＨＶＲ３が配列番号５及び１０−１３の何れか一の抗体の残基番号９４−１０２(カバット番号付け)を含有する、請求項３５に記載の抗ＢＲ３抗体。
  37. 配列番号７−１３及び１６−１８の何れか一の抗体配列の残基番号９４−１０２(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ３を含んでなるＢＲ３結合抗体。
  38. (１) 配列番号８１−８３の何れか一の抗体配列の残基９４−１０２(カバット番号付け)を含有するＨＶＲ３と、(２) RDTSKNTF (配列番号２１０)を含有する重鎖フレームワーク３領域(ＨＣ-ＦＲ３)を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  39. RVCYN-X6-LGVCAGGMDY (配列番号２２０)を含有し、Ｘ６がＲ又はＨであるＨＶＲ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  40. さらに、配列番号８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３及び１９４−２０７の何れか一の抗体配列の残基２４−３４、残基４９−５５及び残基８９−９７(カバット番号付け)をそれぞれ含有するＬＶＲ１、ＬＶＲ２及びＬＶＲ３を含んでなる、請求項３９に記載の抗ＢＲ３抗体。
  41. 配列番号７−１３、１６−１８、２４、２６−７３、７５−７６、７８、８０−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７、１２９及び１９３の何れか一の抗体配列の残基番号２６−３５、４９−６５及び９４−１０２(カバット番号付け)をそれぞれ含有するＨ１、Ｈ２及びＨ３を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  42. 残基QVRRALDY (配列番号２１２)を含有するＨ３；残基GFTVTAYYMS (配列番号２１４)を含有するＨ１と、残基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (配列番号２１３)を含有するＨ２を含んでなる、ヒト化抗ＢＲ３抗体。
  43. 残基RVCYNRLGVCAGGMDY (配列番号２２１)を含有するＨ３；残基SGFTISSNSIH (配列番号２２２)を含有するＨ１と、残基AWITPSDGNTD (配列番号２２３)を含有するＨ２を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  44. RVCYNRLGVCAGGMDY (配列番号２２１)を含有するＨ３；残基SGFTISSSSIH (配列番号２２４)を含有するＨ１と AWVLPSVGFTD (配列番号２２３)を含有するＨ２を含んでなる抗ＢＲ３抗体。
  45. ３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のヒトＢＲ３の細胞外ドメインへの結合を競合的に阻害することができるＢＲ３結合抗体。
  46. 前記抗体が３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の可変領域配列を含有する、請求項４５に記載の抗ＢＲ３抗体。
  47. 前記抗体が３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体の高頻度可変領域配列を含有する、請求項４５に記載の抗ＢＲ３抗体。
  48. 前記抗体が３.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２２)又は１２Ｂ１２.１ (ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ-６６２４)として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のヒト化型である、請求項４５に記載の抗ＢＲ３抗体。
  49. 配列番号１３、１５、１６−１８、２２、２４、２６、２８−７３、７５−７６、７８、８０−８５、８７−９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０７、１０９−１１０、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４−１２７及び１２９−１３１の何れか一のＶＨ配列を含有してなる抗体。
  50. 配列番号３、１４、２１、２３、２５、２７、７４、７７、７９、８６、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０８、１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３及び１２８の何れか一のＶＬ配列を含有してなる抗体。
  51. 前記抗体が、ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に、２５℃でのＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるＦａｂとして、５００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の見かけのＫｄ値で結合する、請求項１９ないし２７の何れか一に記載の抗体。
  52. 前記抗体が、ヒトＢＲ３細胞外ドメイン配列に、２５℃でのＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるＦａｂとして、５００ｎＭ−０．００１ｐＭの間の見かけのＫｄ値で結合する、請求項１ないし２７の何れか一に記載の抗体。
  53. 前記抗体ないしはポリペプチドがヒトＩｇＧのＦｃ領域を含有する、請求項１ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  54. 前記抗体ないしはポリペプチドがヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含有する、請求項３ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはイムノアドヘシン。
  55. 前記抗体ないしはポリペプチドがヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含有する、請求項２ないし２７の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  56. 前記抗体ないしはポリペプチドが細胞表面上の天然のＢＲ３ポリペプチドへのＢＡＦＦの結合を阻害する、請求項１、３ないし２１、２５ないし４４及び４９ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  57. 前記抗体ないしはポリペプチドがＢ細胞増殖及びＢ細胞生存を阻害する、請求項１、３ないし２１及び２５ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  58. 前記抗体ないしはポリペプチドがインビボでＢ細胞を殺傷又は枯渇する、請求項１、７ないし２１及び２５ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  59. 前記抗体ないしはポリペプチドが、ヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を有するかないしは、ヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃを含有する抗ＢＲ３抗体と比較してヒトエフェクター細胞存在下にてＡＤＣＣを亢進している、請求項３ないし２１及び２５ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  60. 前記抗体ないしはポリペプチドが、ヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃを含有する抗ＢＲ３抗体と比較して、ヒトエフェクター細胞存在下にて抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を減弱している、請求項３ないし２１及び２５ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  61. Ｂ細胞増殖及びＢ細胞生存を刺激するＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド。
  62. 前記ポリペプチドがＡＤＣＣエフェクター機能を有さない、請求項６１に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド。
  63. 前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＦｃ領域を含有する、請求項６１に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド。
  64. 前記Ｆｃ領域がＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａの変異(ＥＵ番号システム)を有する、請求項６３に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド。
  65. 前記Ｆｃ領域がＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａの変異(ＥＵ番号システム)を有する、請求項２に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド。
  66. Ｆｃ領域内の残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムに従った場合、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１４、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８及び４３９からなる群から選択される位置の何れか一又は何れかの組合せのアミノ酸を置換することによって、野生型ＩｇＧ Ｆｃ配列と比較して、抗体ないしはポリペプチドの薬物動態学的性質及び／又はＣＤＣ、ＡＤＣＣを変化するために変更されているＦｃ領域を含有する、請求項１ないし６５の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  67. 前記置換がＮ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｙ、Ｎ３４３Ｆ、Ｎ４３４Ｈからなる群から選択される、請求項６６に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  68. 前記Ｆｃ領域が配列番号１３４であり、ＸがＡ、Ｗ、Ｈ、Ｙ及びＦからなる群から選択される何れかのアミノ酸である、請求項６６に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  69. 前記抗体ないしはイムノアドヘシンが、置換Ｋ２４６Ｈ、Ｈ２６８Ｄ、Ｅ２８３Ｌ、Ｓ３２４Ｇ、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅの少なくとも何れか一又は何れかの組合せを含有するヒトＩｇＧのＦｃ領域を含んでなる、請求項１及び３ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  70. 前記抗体ないしはイムノアドヘシンが、置換Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｅ３３３Ａ及びＫ３３４Ａの少なくとも何れか一又は何れかの組合せを含有するヒトＩｇＧのＦｃ領域を含んでなる、請求項１及び３ないし５２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  71. 細胞障害性剤又は化学療法剤にコンジュゲートされた、請求項１ないし７０の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  72. 前記細胞障害性剤が放射性同位体又は毒素である、請求項７１に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  73. 前記抗体がＣＨＯ細胞内で産生される、請求項１ないし７２の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  74. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１ないし７３の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  75. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１ないし７４の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  76. 前記抗体がヒト抗体である、請求項１ないし７５の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  77. 前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ)'２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ断片；ダイアボディ及び線状抗体からなる群から選択されるものである、請求項１ないし７６の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  78. 前記抗体が多特異的抗体である、請求項１ないし７７の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチド。
  79. 請求項１ないし７８の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
  80. 請求項１ないし７９の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチドをコードする発現ベクター。
  81. 請求項７９に記載の核酸分子又は該核酸分子を含有する発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
  82. 請求項１ないし８１の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチドを産生する請求項８１に記載の宿主細胞。
  83. ＣＨＯ細胞である、請求項８２に記載の宿主細胞。
  84. 請求項８１に記載の細胞を培養し、該細胞培養物から抗体ないしはポリペプチドを回収することを含む、請求項１ないし８３の何れか一に記載の抗体ないしはポリペプチドの産生方法。
  85. 請求項１ないし８４の何れか一に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドと担体を含有してなる組成物。
  86. さらに、細胞障害性剤、化学療法剤、生物学的応答モディファイア、免疫抑制剤及び抗ＣＤ２０抗体からなる群から選択される少なくとも一の付加的治療剤を含有する、請求項８５に記載の組成物。
  87. 容器と容器に包含される組成物を具備し、該組成物が請求項１ないし８６の何れか一に記載の抗体を含有するものである、製造品。
  88. さらに、前記組成物が疾患を治療するために使用することができることを指示するパッケージ挿入物を具備する、請求項８７に記載の製造品。
  89. 前記疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、シェーグレン症候群、多発性硬化症、非ホジキンリンパ腫、ＡＬＬ、ＣＬＬ、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択されるものである、請求項８８に記載の製造品。
  90. ＢＲ３陽性癌に罹患した患者に治療的有効量の本発明のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドを投与することを含む、ＢＲ３陽性癌の治療方法。
  91. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、請求項１ないし１８、２２ないし５２、６６ないし７８の何れか一に記載の抗体及びポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド；請求項１９ないし２４の何れか一に記載の何れかのアンタゴニストＢＲ３結合抗体又は表２に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体である、請求項９０に記載の方法。
  92. Ｂ細胞腫瘍に罹患した患者に、治療的有効量の本発明のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドを投与することを含む、Ｂ細胞腫瘍の治療方法。
  93. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、請求項１ないし１８、２５ないし５２及び６６ないし７８の何れか一に記載の抗体及びポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド；請求項１９ないし２４の何れか一に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体又は表２に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体である、請求項９２に記載の方法。
  94. 自己免疫性疾患に罹患した患者に、治療的有効量の本発明のＢＲ３結合抗体を投与することを含む、自己免疫性疾患の治療方法。
  95. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、請求項１ないし１８、２５ないし５２及び６６ないし７８の何れか一に記載の抗体及びポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド；請求項１９ないし２４の何れか一に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体又は表２に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体である、請求項６８に記載の方法。
  96. 癌に罹患した患者に、治療的有効量の本発明のＢＲ３結合抗体を投与することを含む、癌の治療方法。
  97. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、請求項１ないし１８、２５ないし５２及び６６ないし７８の何れか一に記載の抗体及びイムノアドヘシンからなる群から選択される少なくとも一のＢＲ３結合抗体ないしはイムノアドヘシン；請求項１９ないし２４の何れか一に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体又は表２に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体である、請求項９６に記載の方法。
  98. Ｂ細胞数を減少するために有効な量の請求項１ないし９７の何れか一に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドと、混合した細胞集団を接触させることを含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法。
  99. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、請求項１ないし１８、２５ないし５２及び６６ないし７８の何れか一に記載の抗体及びポリペプチドからなる群から選択される少なくとも一のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチド；請求項１９ないし２４の何れか一に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体又は表２に記載のアンタゴニストＢＲ３結合抗体である、請求項７２に記載の方法。
  100. Ｂ細胞数を減少するために有効な量の、ヒトエフェクター細胞の存在下にてＡＤＣＣエフェクター機能を有するかないしはＡＤＣＣエフェクター機能を亢進する請求項１ないし９９の何れか一に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドと、混合した細胞集団を接触させることを含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法。
  101. Ｂ細胞数を減少するために有効な量の、ヒトエフェクター細胞の存在下にてＡＤＣＣエフェクター機能を有するかないしはエフェクター機能を亢進し、細胞表面上のＢＲ３へのＢＡＦＦ結合をブロックする請求項１ないし１００の何れか一に記載のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドと、混合した細胞集団を接触させることを含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法。
  102. さらに、治療的有効量の抗ＣＤ２０抗体とＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドとが連続して又は同時に投与される工程を含む、請求項９０ないし９７の何れか一に記載の方法。
  103. さらに、混合した細胞集団に、抗ＣＤ２０抗体とＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドとを連続して又は同時に接触させる工程を含む、請求項９８ないし１０１の何れか一に記載の方法。
  104. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドがＡＤＣＣエフェクター機能を変更している、請求項９０ないし９７の何れか一に記載の方法。
  105. 前記抗ＢＲ３抗体が細胞表面上のＢＲ３へのＢＡＦＦ結合をブロックする、請求項１０１又は１０２に記載の方法。
  106. 前記ＣＤ２０結合抗体がリツキサン(登録商標)抗体である、請求項１０１又は１０２に記載の方法。
  107. さらに、ＢＡＦＦアンタゴニスト、生物学的応答モディファイア、Ｂ細胞枯渇薬剤、細胞障害性剤、化学療法剤及び免疫抑制剤からなる群の少なくとも一の治療的有効量が連続して又は同時に投与されることを含む、請求項９０ないし９７の何れか一に記載の治療方法。
  108. さらに、ＢＡＦＦアンタゴニスト、生物学的応答モディファイア、Ｂ細胞枯渇薬剤、細胞障害性剤、化学療法剤及び免疫抑制剤からなる群の少なくとも一の治療的有効量が連続して又は同時に投与されることを含む、請求項９８ないし１０１の何れか一に記載の方法。
  109. 前記ＢＡＦＦアンタゴニストが、ＢＲ３-Ｆｃ、ＴＡＣＩ-Ｆｃ、ＢＣＭＡ-Ｆｃ、抗ＢＡＦＦペプチボディ、抗ＢＡＦＦ抗体及び抗ＢＲ３抗体からなる群から選択されるものである、請求項１０７又は請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記癌が、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、ＡＬＬ、ＣＬＬ及び広汎性大Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択されるものである、請求項９０又は９２に記載の方法。
  111. 前記抗体が９.１抗体又はＶ３-１抗体由来である、請求項９０ないし１０１の何れか一に記載の方法。
  112. 前記抗体が９.１ＲＦの重鎖可変ドメイン(配列番号３５)を含有する、請求項９０ないし１０１の何れか一に記載の方法。
  113. 前記抗体がＶ３-４６ｓＲＦの重鎖可変ドメイン(配列番号１２７)を含有する、請求項９０ないし１０１の何れか一に記載の方法。
  114. 前記癌が非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)であり、化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニソロンからなる群から選択されるものである、請求項９２に記載の方法。
  115. 前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである、請求項９４に記載の方法。
  116. 前記自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項１０８に記載の方法。
  118. 前記抗体ないしはポリペプチドが細胞障害性剤又は化学療法剤にコンジュゲートされる、請求項９０ないし１１５の何れか一に記載の方法。
  119. 前記細胞障害性剤が放射性同位体又は毒素である、請求項１１９に記載の方法。
  120. 前記ＢＲ３結合抗体が、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体と比較して、ヒトＦｃＲｎに対する結合親和性を亢進している、請求項９０ないし１１５の何れか一に記載の方法。
  121. 免疫不全疾患に罹患している患者に、治療的有効量のアゴニストＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが投与されることを含む、自己免疫性疾患の治療方法。
  122. 前記抗体ないしはポリペプチドが２.１抗体に由来する、請求項９０ないし１０１及び１２１の何れか一に記載の方法。
  123. 前記抗体が２.１-４６の重鎖可変ドメインを含有する、請求項１２１に記載の方法。
  124. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが配列番号１３３及び１３５ないし１４２の何れか一のＩｇＧ Ｆｃ領域を含有する、請求項１２１に記載の方法。
  125. 前記ＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｙ及びＮ４３４Ｈからなる群から選択される少なくとも一の４３４での置換(ＥＵ番号付けシステム)を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含有する、請求項１２１に記載の方法。
  126. 前記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域が配列番号１３４であり、ＸがＡ、Ｗ、Ｆ、Ｙ又はＨである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記アゴニストＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドが、天然のヒトＩｇＧ野生型Ｆｃと比較して、ＡＤＣＣ活性を減弱している、請求項１２１に記載の方法。
  128. 前記抗体ないしはポリペプチドが、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ置換(ＥＵ番号付けシステム)を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列を含有する、請求項１２１に記載の方法。
  129. 前記アゴニストＢＲ３結合抗体がＨｕ２.１-４６又はＨｕ２.１-４６.ＤＡＮＡである、有効１２１に記載の方法。
  130. 前記ＢＲ３結合抗体がモノクローナル抗体である、請求項９０ないし１２９の何れか一に記載の方法。
  131. 前記ＢＲ３結合抗体がヒト化抗体である、請求項９０ないし１２９の何れか一に記載の方法。
  132. 前記ＢＲ３結合抗体がヒト抗体である、請求項９０ないし１２９の何れか一に記載の方法。
  133. 前記ＢＲ３結合抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ)'２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ断片；ダイアボディ及び線状抗体からなる群から選択されるものである、請求項９０ないし１２９の何れか一に記載の方法。
  134. 前記抗体が多特異的抗体である、請求項１ないし１３３の何れか一に記載の方法。
  135. 前記ＢＲ３結合抗体がさらに血清アルブミン結合ペプチドを含有する、請求項９０ないし１２９の何れか一に記載の方法。
  136. 請求項１ないし１３５の何れか一に記載の抗体をＢＲ３と接触させて抗体を回収する工程を含む、ＢＲ３を単離する方法。
  137. 請求項１ないし１３６の何れか一に記載のＢＲ３抗体をヒスチジンバッファ中に含有する液体製剤。
  138. 前記バッファが酢酸ヒスチジンバッファである、請求項１３７に記載の液体製剤。
  139. Ｂ細胞増殖のインヒビターのスクリーニング方法であって、
    (ａ) 請求項１ないし１３８の何れか一に記載のＢＲ３アゴニスト抗体によりＢ細胞を刺激する
    (ｂ) 候補化合物を投与する；そして、
    (ｃ) 細胞増殖を検出する
    工程を含む、方法。
  140. ＢＲ３経路の下流マーカを同定してモニタリングする方法であって、
    (ａ) 請求項１ないし１３９の何れか一に記載のＢＲ３アゴニスト抗体によりＢ細胞を刺激する；そして
    (ｂ) 細胞内での遺伝子発現における変化を検出する
    工程を含む、方法。
  141. 自己免疫性疾患又は癌の診断方法であって、
    (ａ) 本発明のＢＲ３結合抗体ないしはポリペプチドと試験被検体からの生物学的試料を接触する；
    (ｂ) 生物学的試料中のＢＲ３ポリペプチドのレベルをアッセイする；そして
    (ｃ) ＢＲ３タンパク質の標準レベルと生物学的試料中のＢＲ３ポリペプチドのレベルを比較する
    ことを含み、ＢＲ３タンパク質の標準レベルと比較してＢＲ３タンパク質のレベルにおける存在又は増加によってＢＲ３結合治療によって治療される自己免疫性疾患又は癌が示唆される、方法。
  142. 試験試料又は被検体における本発明の抗ＢＲ３抗体ないしはポリペプチドを結合する工程と、コントロール抗体又はポリペプチドと比較して結合した抗体ないしはポリペプチドを比較する工程を含む、ＢＲ３ポリペプチドの検出方法。
  143. 前記抗体ないしはポリペプチドが、ＦＡＣＳ分析、免疫組織化学アッセイ(ＩＨＣ)及びＥＬＩＳＡアッセイからなる群から選択されるアッセイに使用される、請求項１４２に記載の方法。
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