KR102259232B1

KR102259232B1 - 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체

Info

Publication number: KR102259232B1
Application number: KR1020140110868A
Authority: KR
Inventors: 오승자; 김경아; 김보규; 이승현; 이지민
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2014-08-25
Publication date: 2021-05-31
Also published as: US9808507B2; US20160053025A1; KR20160024253A

Abstract

항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

Description

항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체{Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody}

안지오포이에틴2(Angiopoietin2, Ang2)는 혈관내피세포에 존재하는 수용체 Tie2의 길항적인 (antagonistic) 리간드로서(Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar;10(3):165-77), Tie2의 작용물질 (agonist)인 Angiopoietin1 (Ang1)과 Tie2 결합에 대해 경쟁함으로써 Tie2에 의한 신호전달을 억제하는 기능이 있음이 알려져 있다 (Science. 1997 Jul 4;277(5322):55-60). 따라서 Ang2는 혈관내피세포의 안정성을 유지하는 Ang1-Tie2 신호전달을 저해하게 되고, 결과적으로 혈관의 역동적인 재배열 (dynamic rearrangement)을 통한 신생혈관형성을 촉진할 수 있다 (Science. 1997 Jul 4;277(5322):48-50). 신생혈관형성과정은 암의 성장에 필수적인 요소이므로 위와 같은 Tie2 의존적인 Ang2의 기능을 저해하여 신생혈관형성을 억제함으로써 암의 추가적인 성장을 막을 수 있음은 여러 전임상 모델의 연구에 의해 알려져 있고 (J Natl Cancer Inst. 2012 Mar 21;104(6):461-75), 실제로 Ang2 특이적 항체를 이용하여 암의 진행을 막으려는 시도가 Regeneron사, Astrazeneca사, Armgen 사등의 여러 글로벌 제약 회사에 의해 이루어지고 있다. 그러나 최근 연구들에 의하면, 이러한 신생혈관억제제 투입시 암세포는 급격한 산소결핍상태를 회피하는 기작의 작동으로 인하여 오히려 전이를 촉진할 수 있음이 제시되었다 (Nat Rev Clin Oncol. 2011 Mar 1;8(4):210-21). 따라서 신생혈관억제의 이러한 심각한 부작용을 막기 위해서는, 암전이 관련 단백질의 기능 또한 동시에 억제하는 것이 필수적이다.

한편,　c-Met 은 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK (Receptor Tyrosine Kinase)로써, 그 리간드인 HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scattering Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 많은 종류의 암세포에 과 발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. 또한 리간드의 이름이 의미하듯, HGF/SF를 통한 c-Met signaling은 거의 모든 종류의 epithelial tumor의 cell-cell contact를 약화시켜 scattering을 야기하는 대표적인 암 전이 초기단계의 단백질이다 (Nat Rev Cancer. 2012 Jan 24;12(2):89-103). 특히, c-Met 유전자의 upstream에는 hypoxia-response element들이 존재하여, 산소결핍 상황에서 그 유전자의 발현이 증가함은 잘 알려져 있다 (Oral Oncol. 2006 Jul; 42(6):593-8).

따라서, Ang2와 c-Met을 동시에 표적한다면, 암세포의 성장과 전이를 보다 효과적으로 억제할 수 있을 것이며, 이러한 이유로 Ang2와 c-Met을 동시에 표적하는 약물의 개발이 요구된다.

일 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 제공한다.

상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하지만, Ang2와 Tie2 수용체 간 결합을 방해하지 않고, Ang2를 통하여 Tie2에 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 c-Met 및/또는 Ang2의 과생산(예컨대, 과발현) 및/또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

다른 예는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, c-Met 및/또는 Ang2의 과생산(예컨대, 과발현) 및/또는 비정상적 활성화와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

암세포에서 많이 발현되어 있는 대표적인 타겟인 Ang2만 인지하는 기존의 표적치료제는 c-Met의 과발현과 돌연변이를 유도하여 암세포가 약물에 대한 내성을 획득하게 함으로써 그 치료 효과를 감소시키는 경우가 있었다. 본 발명자들은 c-Met과 Ang2을 동시에 인지하는 이중 특이 항체가 약물에 대한 내성의 원인이 되는 c-Met에 의한 암세포의 신호전달을 사전에 차단함으로써 내성의 발생을 방지하고, 내성이 생긴 암세포에서도 우수한 암세포의 억제 효과를 보임을 확인하였다.

본 발명의 일 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 제공한다. 상기 이중 특이 항체는 c-Met과 Ang2을 동시에 인지하고 결합하여 기능을 저해함으로써 상승된 항암 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 생체 내에서 생성된 것, 재조합적으로 생성된 것, 또는 인공적으로 합성된 것일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함한다. 　한편, "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. "항원 결합 단편"은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

하기하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 설명에서, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 이중 특이 항체의 하나의 표적인 "c-Met"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

본 발명에서 제공되는 이중 특이 항체의 또 다른 표적인 "Ang2"는 신생혈관 형성과 밀접한 관련이 있으며 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래의 Human Ang2 (Accession # O15123), 원숭이 유래의 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 유래의 Mouse Ang2 (Accession # NP_031452, Accession # O35608 등), 래트 유래의 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있다.

상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하지만 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않으며 Ang2를 통하여 Tie2 수용체에 결합하여 복합체(항체/Ang2/Tie2)를 형성하고, 항체의 이합체화(dimerization)를 유도하는 특성을 가지며, 이를 통하여 여기에 복합체화되어 있는 Tie2 수용체를 효과적으로 클러스터링(clustering)시킴으로써, Tie2 수용체 및 이의 하류 신호화 (downstream signaling)의 활성화를 유도한다. 이러한 작용 기작을 갖는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해를 유도함으로써 Ang2 기능을 저해하여 circulating Ang2 level을 낮추는 역할을 함과 동시에, Ang2와 함께 Tie2 수용체와 결합하여 Ang1처럼 Tie2 수용체를 활성화시켜 Tie2 downstream signaling을 유도하고 혈관내피세포의 안정화를 유도하는 이중 작용(dual function)을 갖는 것을 특징으로 한다.

즉, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 신생혈관형성 유도인자인 Ang2를 표적으로 하는 치료용 항체로서, Ang2에 특이적으로 결합함으로써 Ang2의 기능을 저해할 뿐 아니라, Ang2와 함께 (Ang2를 통하여) Tie2에 결합하여 Tie2의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 한다. 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암, 패혈증, 안구질환 등 혈관의 비정상적 활성화 및 기능이상(dysfunction)과 관련된 질병에서 Ang2의 하향조절(downregulation)과 함께, Ang2와 함께 Tei2 수용체에 결합하여 Tei2 수용체를 활성화 시킴으로써 혈관의 구조적/기능적 정상화(normalization)를 유도함으로써 질병을 치료하는 효과를 갖는다.

구체적으로, 본 발명의 일 예는 신생혈관형성 유도인자인 Ang2(Angiopoietin-2)에 특이적으로 결합(인식)하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하는, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 즉, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2를 특이적으로 인식하고, Ang2와 Tie2 수용체 모두에 결합하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것일 수 있다. 이와 같은 Tie2 수용체의 활성화는 Tie2 수용체의 인산화 증가 및/또는 그 하부 신호 경로와 관련된 단백질, 예컨대 Akt(NM_005163), eNOS(NM_000603), 42/44(NM_002745) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 인산화에 의하여 유도될 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Tie2 수용체의 세포 내부로의 이동 (internalization)을 유도하는 것일 수 있다. 즉, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2에 특이적으로 결합하면서도, 기존의 항 Ang2 항체와 달리, Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않음으로써, Ang2와 함께 (Ang2를 통하여) Tie2 수용체에 결합하여 복합체를 형성하고 (이 때, 항 Ang2 항체는 Tie2 수용체와 직접 결합하지 않지만 Ang2를 통하여 Tie2 수용체에 결합하여 복합체를 형성할 수 있음), Tie2 수용체의 활성화를 유도하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 Ang2 단백질은 신생혈관 형성과 밀접한 관련이 있으며 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O15123 등), 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35608 등), 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

Tie2 수용체(TEK tyrosine kinase)는 안지오포이에틴-1 수용체로, 마우스(NM_013690; NP_038718), 인간(NM_000459; NP_000450) 등의 다양한 포유동물의 혈관내피세포(endothelial cell)에서 발현되며, 다양한 downstream signaling에 관여한다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2 특이적으로 결합하지만 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하지 않으며 Ang2와 Tie2 수용체와 함께 복합체(항체/Ang2/Tie2)를 이루는 항체는, 항체의 이합체화(dimerization)를 유도하는 특성을 가지며, 이를 통하여 여기에 복합체화되어 있는 Tie2 수용체를 효과적으로 클러스터링(clustering)시킴으로써, Tie2 수용체 및 이의 하류 신호화 (downstream signaling)의 활성화를 유도할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이러한 작용 기작으로 인하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해를 유도함으로써 Ang2 기능을 저해하여 circulating Ang2 level을 낮추는 역할을 함과 동시에, Ang2와 함께 Tie2 수용체와 결합하여 Ang1처럼 Tie2 수용체를 활성화시켜 혈관내피세포의 안정화를 유도하는 이중 작용(dual function)을 가짐으로써, Ang2 과발현에 의한 증상(질환)뿐 아니라 혈관내피세포의 안정화 저하, 즉 혈관 침투성 증가로 인한 증상(질환)의 치료 및/또는 혈관의 구조적/기능적 비정상화와 관련된 증상(질환)의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2 (hAng2; 서열번호 119; Accession # O15123) 의 루프 1 (서열번호 119 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위)의 전부 또는 일부(예컨대, 루프 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기) 또는 서열번호 119 중에서 루프 1의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 연속하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로서 인식하거나, 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

Ang2 (서열번호 119)

MWQIVFFTLS CDLVLAAAYN NFRKSMDSIG KKQYQVQHGS CSYTFLLPEM DNCRSSSSPY

VSNAVQRDAP LEYDDSVQRL QVLENIMENN TQWLMKLENY IQDNMKKEMV EIQQNAVQNQ

TAVMIEIGTN LLNQTAEQTR KLTDVEAQVL NQTTRLELQL LEHSLSTNKL EKQILDQTSE

INKLQDKNSF LEKKVLAMED KHIIQLQSIK EEKDQLQVLV SKQNSIIEEL EKKIVTATVN

NSVLQKQQHD LMETVNNLLT MMSTSNSAKD PTVAKEEQIS FRDCAEVFKS GHTTNGIYTL

TFPNSTEEIK AYCDMEAGGG GWTIIQRRED GSVDFQRTWK EYKVGFGNPS GEYWLGNEFV

SQLTNQQRYV LKIHLKDWEG NEAYSLYEHF YLSSEELNYR IHLKGLTGTA GKISSISQPG

NDFSTKDGDN DKCICKCSQM LTGGWWFDAC GPSNLNGMYY PQRQNTNKFN GIKWYYWKGS

GYSLKATTMM IRPADF

예컨대, 상기 항 Ang2 항체는 서열번호 119의 루프 1에 위치하는 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합, 또는 서열번호 119 중에서 Q418, P419, Q418과 P419와의 조합의 아미노산 잔기를 포함하는 연속하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 항 Ang2 항체는 서열번호 119의 Q418 및 P419의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부분에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

상기 항 Ang2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위는 Ang2의 3차원 구조의 루프 1에 위치하는 노출된 아미노산 잔기로서, Ang2와 Tie2 수용체 간의 결합에 직접 관여하거나, 이를 조절하는 부위인 것으로 여겨진다.

상기 항 Ang2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위에 있어서, "연속하는 아미노산"은 단백질의 1차 구조상 인접하는 아미노산, 또는 단백질의 1차 구조상에서는 인접하지 않지만 2차 또는 3차 구조상에서 서로 인접하는 아미노산을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "연속하는 아미노산 잔기"는 단백질의 1차, 2차 또는 3차 구조 상에서 연속하는 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다.

또한, 상기 부위를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항 Ang2 항체뿐 아니라, 상기 항 Ang2 항체와 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 역시 Ang2를 저해하면서 동시에 Ang2 및 Tie2 수용체와 복합체를 형성하여(즉, 항체-Ang2 복합체가 Ang2를 통하여 Tie2 수용체에 결합하여), Tie2를 활성화시킬 수 있다. 이와 같이 경쟁적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 부위와 3차원 구조상의 인접한 부위를 에피토프 및/또는 특이적 결합 부위로 인식하는 항체일 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 항체는 Ang2와의 결합 친화도가 0.1pM 내지 50nM, 구체적으로 1pM 내지 30nM, 2pM 내지 20nM 또는 1nM 내지 10nM인 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 부위를 에피토프로서 인식하거나 여기에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄(Heavy chain) 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역:

서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄(Light chain) 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다:

보다 구체적으로, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위; 및/또는

서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위

를 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
SDYAWN(서열번호109)	YINYSGNTDYNPSLKS(서열번호 110)	GNFEGAMDY(서열번호111)

또한 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
KASQSVSNDVA(서열번호112)	YASNRYP(서열번호 113)	QQDYSSPWT(서열번호 114)

일 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YINYSGNTDYNPSLKS RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WGQGTLVTVSS (서열번호 115)

(상기 서열번호 115에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3 임)

일 구체예에 따른 항체의 경쇄는 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPWT FGGGTKLEIK (서열번호 117)

(상기 서열번호 117에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDRL1, CDRL2, CDRL3 임)

따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 서열번호 109, 서열번호 111, 서열번호 112, 및 서열번호 113로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아닐 수 있다.

상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR-H2, CDR-L1 및 CFR-L3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 일부 치환에 의하여, 항체 고유의 활성은 유지하면서, Ang2에 대한 친화도가 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

일 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 치환 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

(1) CDR-H2의 아미노산 서열(YINYSGNTDYNPSLKS; 서열번호 110) 중 1번째 아미노산 잔기 Tyr (Y)가 Lys (K)으로 치환;

(2) CDR-H2의 아미노산 서열 중 3번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Ser (S)으로 치환;

(3) CDR-H2의 아미노산 서열 중 5번째 아미노산 잔기 Ser (S)이 Ala (A)로 치환;

(4) CDR-H2의 아미노산 서열 중 7번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Lys (K)으로 치환;

(5) CDR-L1의 아미노산 서열(KASQSVSNDVA; 서열번호 112) 중 11번째 (마지막) 아미노산 잔기 Ala (A)가 His (H)로 치환;

(6) CDR-L1의 아미노산 서열(KASQSVSNDVA; 서열번호 112) 중 5번째 아미노산 잔기 Ser (S)이 Phe (F)로 치환;

(7) CDR-L1의 아미노산 서열(KASQSVSNDVA; 서열번호 112) 중 8번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Thr (T)로 치환;

(8) CDR-L2의 아미노산 서열(YASNRYP; 서열번호 113) 중 4번째 아미노산 잔기 Asn (N)이 Ile (I)로 치환;

(9) CDR-L2의 아미노산 서열(YASNRYP; 서열번호 113) 중 5번째 아미노산 잔기 Arg (R)이 Pro (P)로 치환;(10) CDR-L3의 아미노산 서열(QQDYSSPWT; 서열번호 114) 중 2번째 서열 Gln (Q)이 His (H)로 치환; 및

(11) CDR-L3의 아미노산 서열 중 8번째 서열 Trp (W)이 Phe (F)로 치환.

일 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 1(서열번호 128)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함하는 것일 수 있다:

X1-I-X2-Y-X3-G-X4-T-D-Y-N-P-S-L-K-S (일반식 1: 서열번호 128)

상기 일반식 1 중, X1는 Tyr (Y) 또는 Lys (K)이고, X2는 Asn (N) 또는 Ser (S)이며, X3는 Ser (S) 또는 Ala (A)이고, X4는 Asn (N) 또는 Lys (K)이다.

일 구체예에서, 상기 서열번호 128의 아미노산 서열은 서열번호 122 또는 서열번호 123의 아미노산 서열일 수 있다.

다른 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 2(서열번호 129)로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1을 포함하는 것일 수 있다:

K-A-S-Q-X5-V-S-X6-D-V-X7 (일반식 2: 서열번호 129)

상기 일반식 2 중, X5는 Ser (S) 또는 Phe (F)이고, X6은 Asn (N) 또는 Thr (T)이며, X7은 Ala (A) 또는 His (H)이다.

일 구체예에서, 상기 서열번호 129의 아미노산 서열은 서열번호 124 또는 서열번호 125의 아미노산 서열일 수 있다.

다른 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 3(서열번호 130)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2을 포함하는 것일 수 있다:

Y-A-S-X8-X9-Y-P (일반식 3: 서열번호 130)

상기 일반식 3 중, X8은 Asn (N) 또는 Ile (I)이고, X9는 Arg (R) 또는 Pro (P)이다.

일 구체예에서, 상기 서열번호 130의 아미노산 서열은 서열번호 126의 아미노산 서열일 수 있다.

다른 예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은 다음의 일반식 4(서열번호 131)으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것일 수 있다:

Q-X10-D-Y-S-S-P-X11-T (일반식 4: 서열번호 131)

상기 일반식 3 중, X10은 Gln (Q) 또는 His (H)이고, X11은 Trp (W) 또는 Phe (F)이다.

일 구체예에서, 상기 서열번호 128의 아미노산 서열은 서열번호 127의 아미노산 서열일 수 있다.

따라서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:

서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위;

상기 중쇄 상보성 결정부위 및 상기 경쇄 상보성 결정부위의 조합; 또는

상기 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 110, 서열번호 122, 및 서열번호 123로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위:

서열번호 112, 서열번호 124, 또는 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 113 또는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 114 또는 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위;

상기 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 모두 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위: 및

서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 모두 포함하는 경쇄 상보성 결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위

를 포함하는 것이 아닐 수 있다.

구체적으로, 상기 설명한 주형 및 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 상보성 결정 부위 및 경쇄 상보성 결정 부위를 아래의 표 3에 정리하였다.

중쇄 CDR 아미노산 서열
	CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
주형	SDYAWN(서열번호 109)	YINYSGNTDYNPSLKS(서열번호 110)	GNFEGAMDY(서열번호 111)
친화도개선	-	KISYSGKTDYNPSLKS(서열번호 122)	-
친화도개선	-	KINYAGNTDYNPSLKS(서열번호 123)	-
경쇄 CDR 아미노산 서열
	CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
주형	KASQSVSNDVA(서열번호 112)	YASNRYP(서열번호 113)	QQDYSSPWT(서열번호 114)
친화도개선	KASQSVSNDVH(서열번호 124)	YASIPYP(서열번호 126)	QHDYSSPFT(서열번호 127)
친화도개선	KASQFVSTDVH(서열번호 125)

일 구체예에서, 상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:

(a) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 122의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 112의 CDR-L1, 서열번호 113의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(b) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 122의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 124의 CDR-L1, 서열번호 113의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(c) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 123의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 112의 CDR-L1, 서열번호 113의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(d) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 123의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 124의 CDR-L1, 서열번호 113의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(e) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 110의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 124의 CDRL1, 서열번호 113의 CDR-L2, 및 서열번호 127의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(f) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 122의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 125의 CDRL1, 서열번호 113의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(g) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 122의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 112의 CDRL1, 서열번호 126의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(h) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 122의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 124의 CDRL1, 서열번호 126의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및

(i) 서열번호 109의 CDR-H1, 서열번호 122의 CDR-H2, 및 서열번호 111의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 125의 CDRL1, 서열번호 126의 CDR-L2, 및 서열번호 114의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

상기 친화도 개선된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 10nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하, 예컨대, 0.01 내지 10nM, 0.01 내지 5nM, 0.01 내지 2nM, 또는 0.01 내지 1nM의 Ang2에 대한 친화도 (KD)를 갖는 것일 수 있다. 이는 주형 항 Ang2 항체의 Ang2에 대한 친화도 (KD)가 약 8nM인 것과 비교하여 현저하게 증가된 것이라 할 수 있다.

또한, 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변부위(서열번호 115) 중 상보성 결정부위 이외의 골격 부위의 일부 아미노산 치환에 의하여 제작될 수 있다. 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제작에 사용 가능한 중쇄 골격의 아미노산 서열을 아래의 표 4에 나타내었다:

(중쇄 인간화)

	FR1 (CDR-H1의 N말단쪽 골격 부위)	FR2 (CDR-H1과 CDR-H2 사이의 골격 부위)	FR3 (CDR-H2와 CDR-H3 사이의 골격 부위)	FR4 (CDR-H3의 C말단쪽 골격 부위)
주형(서열번호 115)	DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT(서열번호 132)	WIRQFPGNKLEWMG(서열번호 137)	RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR(서열번호 142)	WGQGTLVTVSS(서열번호 147)
인간화 (VH-hu1)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSIS(서열번호 133)	WIRQPPGKGLEWIG(서열번호 138)	RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호 143)	WGQGTLVTVSS(서열번호 148)
인간화 (VH-hu2)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSIT(서열번호 134)	WIRQPPGKGLEWMG(서열번호 139)	RSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호 144)	WGQGTLVTVSS(서열번호 149)
인간화 (VH-hu5)	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSIT(서열번호 135)	WIRQPPGKGLEWIG(서열번호 140)	RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호 145)	WGQGTLVTVSS(서열번호 150)
인간화 (VH-hu3)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSIT(서열번호 136)	WVRQAPGKGLEWMG(서열번호 141)	RSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 146)	WGQGTLVTVSS(서열번호 151)

또한, 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변부위(서열번호 117) 중 상보성 결정부위 이외의 골격 부위의 일부 아미노산 치환에 의하여 제작될 수 있다. 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제작에 사용 가능한 경쇄 골격의 아미노산 서열을 아래의 표 3에 나타내었다:

(경쇄 인간화)

	FR1 (CDR-L1의 N말단쪽 골격 부위)	FR2 (CDR-L1과 CDR-L2 사이의 골격 부위)	FR3 (CDR-L2와 CDR-L3 사이의 골격 부위)	FR4 (CDR-L3의 C말단쪽 골격 부위)
주형(서열번호 117)	SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC(서열번호 152)	WYQQKPGQSPKLLIY(서열번호 154)	GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC(서열번호 156)	FGGGTKLEIK(서열번호 158)
인간화 (VL-hu1)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호 153)	WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호 155)	GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호 157)	FGQGTKVEIK(서열번호 159)

따라서, 일 예는 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며,

상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 부위는 CDR-H1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 132 내지 서열번호 136, 예컨대 서열번호 133 내지 서열번호 136로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-H1과 CDR-H2 사이의 골격 부위로서 서열번호 137 내지 서열번호 141, 예컨대, 서열번호 138 내지 서열번호 141으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-H2와 CDR-H3 사이의 골격 부위로서 서열번호 142 내지 서열번호 146, 예컨대, 서열번호 143 내지 서열번호 146로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 CDR-H3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 147 내지 서열번호 151, 예컨대, 서열번호 148 내지 서열번호 151으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며;

경쇄 가변 부위는 CDR-L1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 152 또는 서열번호 153, 예컨대, 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-L1과 CDR-L2 사이의 골격 부위로서 서열번호 154 또는 서열번호 155, 예컨대, 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, CDR-L2와 CDR-L3 사이의 골격 부위로서 서열번호 156 또는 서열번호 157, 예컨대, 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 CDR-L3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 158 또는 서열번호 159, 예컨대, 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

이 때, 상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 중쇄 가변 부위가 CDR-H1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 132의 아미노산 서열을, CDR-H1과 CDR-H2 사이의 골격 부위로서 서열번호 137의 아미노산 서열을, CDR-H2와 CDR-H3 사이의 골격 부위로서 서열번호 142의 아미노산 서열을, 및 CDR-H3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 147의 아미노산 서열을 모두 포함하는 경우; 및 경쇄 가변 부위가 CDR-L1의 N말단쪽 골격 부위로서 서열번호 152의 아미노산 서열을, CDR-L1과 CDR-L2 사이의 골격 부위로서 서열번호 154의 아미노산 서열을, CDR-L2와 CDR-L3 사이의 골격 부위로서 서열번호 156의 아미노산 서열을, 및 CDR-L3의 C말단쪽 골격 부위로서 서열번호 158의 아미노산 서열을 모두 포함하는 경우는 제외될 수 있다.

구체예에서, 상기 인간화된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 160 내지 서열번호 164으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 165 내지 서열번호 171으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).

상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부위, 예컨대 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.

이하, 상기 항 c-Met 항체와 항 Ang2 항체에 공통된 설명을 기재한다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. scFv-Fc는 단쇄 Fv와 불변 영역이 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결되어 있는 구조이다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 아미노산 길이와 종류를 적절하게 선택할 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

항 Ang2　항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다

한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 Ang2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.

일 예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단, 예컨대 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다.

이 때, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질이 세포 내로 이동하고 분해되는 것을 매개하는 역할을 하므로, 이러한 역할을 온전히 수행하기 위하여 완전한 항체 구조를 갖는 것이 유리할 수 있고, 항 Ang2 항체는 Ang2에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하므로, Ang2를 인식하는 항원 결합 단편을 포함하여도 무방할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met에 대한 완전한 항체 (예컨대 IgG형 항체) 및 상기 항체의 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 또는 scFv-Fc)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂는 서열번호 160 내지 164로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 165 내지 171로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 서열번호 160 내지 164로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 165 내지 171로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 중쇄는 N 말단 쪽에 앞서 설명한 항 c-Met 항체의 중쇄를, C 말단 쪽에 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂를, 링커를 통하거나 통하지 않고 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 194의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 경쇄는 앞서 설명한 항 c-Met 항체의 경쇄와 같을 수 있으며, 예컨대, 서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체의 세포 내재화 (internalization) 및 분해 (degradation) 활성에 의하여, c-Met 및 Ang2의 활성 저해뿐 아니라 c-Met 및 Ang2를 분해시켜 총량(total level)을 감소시킴으로써 보다 근본적인 차단을 가능하게 한다. 따라서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 기존의 Ang2 표적 치료제, 예컨대 항 Ang2 항체, 또는 항 c-Met 항체에 대하여 내성이 생긴 환자에 적용시에도 유효한 효과를 얻을 수 있다.

또한, 상기한 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 결합하면서도, Ang2가 Tie2 수용체와 결합하는 것을 저해하지 않고, Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 유도하는 것을 특징으로 한다. 또한, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 Ang2가 결합하여 형성된 복합체(anti-Ang2 antibody/Ang2 conjugate)는, Ang1과 같이 작용하여, Tie2 수용체에 결합하고(상기 복합체 중 Ang2 부분이 결합함), Tie2 수용체를 활성화시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2의 기능을 저해함으로써 비정상적 혈관신생을 저해하는 기능을 가지므로, 비정상적 혈관신생과 관련된 다양한 질병(예컨대, 암)의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료 효과를 갖는다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 Tie2 간의 결합은 저해하지 않고 Tie2를 활성화시킴으로써 Tie2 신호전달을 활성화시키고, 혈관 내피 또는 림프관 내피의 생성을 촉진하고 이동성을 증가시켜 혈관 투과성 증가를 억제함으로써, 혈관 투과성과 관련된 다양한 질병(예컨대, 패혈증, 안구질환, 등)의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료 효과 또한 발휘할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 혈관 내피 또는 림프관 내피의 생성을 촉진하여 건강한 혈관의 형성을 증가 및 혈관을 정상화시키므로, 상처 치유 또는 허혈성 질환 등과 같이 건강한 혈관의 형성을 필요로 하는 다양한 질병 또는 증상의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료 효과를 가지며, 비정상적으로 형성된 암 혈관을 구조 및 기능적으로 정상적인 상태로 변화시켜 암의 성장 및 전이 가능성을 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 염증 반응을 억제하는 효과를 가짐으로써, 다양한 염증 질환의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료에도 적용 가능하다. 또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암혈관을 정상화(normalization)시키는 효과를 가짐으로써, 상기 정상화된 혈관을 통한 항암제의 Ang2 발현 세포로의 전달 효능을 증진시켜, 항암 치료에 있어서, 항암제와 병용 투여되어 항암제에 대한 민감성 (sensitiveness)을 증진시키고 항암제의 효능 증진시키기 위한 항암 보조제로서도 적용 가능하다.

따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병은 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가 및/또는 Ang2 및/또는 c-Met 과발현과 관련된 질병을 의미할 수 있으며, 예컨대, 암; 암전이; 미숙아 망막병증, 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성 녹내장 등의 안구혈관질환; 건선, 천식, 류마티스성 관절염, 폐렴, 만성 염증 등의 염증 질환; 감염성질환(감염); 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관질환; 신장질환; 패혈증; 천식; 부종; 유전성 출혈성 모세혈관 확장증 (Hereditary hemorrhagic telangiectasia; HHT) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 암은 상기 암의 예방 및/또는 치료는 암 및/또는 암전이의 예방 및/또는 치료를 의미할 수 있다.

상기 암은 Ang2 및/또는 c-Met의 과발현 및/또는 비정상적인 활성화와 관련된 것일 수 있다. 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다 특히, 상기 암은 기존의 항암제, 예컨대 c-Met에 대한 길항제 (예컨대, 항 c-Met 항체) 또는 Ang2에 대한 길항제 (예컨대, 항 Ang2 항체)에 대하여 내성이 생긴 암일 수 있다. 상기 암은 원발성 암과 전이성 암을 모두 포함한다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 정상 혈관 생성 유도를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 정상 혈관 생성 유도를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 정상 혈관 생성 증가 방법을 제공한다. 상기 정상 혈관 생성 증가 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 정상 혈관 생성 유도를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병은 정상 혈관 생성의 유도를 필요로 하는 질병으로서, 심근경색, 협심증, 뇌경색, 뇌졸중(뇌허혈) 등의 허혈성 질환, 버거씨병(폐색성 혈전 혈관염), 무혈관 괴사 (avascular necrosis), 족부궤양 (예컨대, 당뇨병성 족부궤양 등), 발기부전 (erectile dysfunction), 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 조직 재생 및/또는 상처 치유(wound healing)용 약학적 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 조직 재생 및/또는 상처 치유를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 조직 재생 및/또는 상처 치유 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 조직 재생 및/또는 상처 치유를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유효성분의 투여 대상 환자는 예컨대 피부 조직 또는 장기 조직의 손상이 있거나, 피부 이식을 받은 환자일 수 있다.

상기 약학적 조성물 또는 방법에 있어서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제와 함께 제공될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 ㎎/kg 범위 내이다. 예컨대, 상기 약학적 조성물, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체)이 소망하는 효과, 즉 암을 예방 및/또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 유효성분인 상기 이중특이 항체에 포함된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와의 결합에 의하여 기능이 활성화되므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 기능을 보다 증진시키기 위하여, 상기 약학적 조성물은 Ang2을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 Ang2의 약학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

한편, 상기 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 대상 또는 상기 예방 및/또는 치료 방법의 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등의 영장류 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 상기 포유류로부터 분리된 세포 또는 조직 또는 이의 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 기존의 항암제, 예컨대 상기 암관련 표적 단백질(예컨대, c-Met, Ang2 등)에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암환자일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 항 c-Met/항 Ang2 항체는 Ang2/Tie2 신호전달의 저해제와 c-Met/HGF 신호전달의 저해제의 두 성질을 모두 갖춘 물질로써, 다음과 같은 이점을 갖는다:

1. Ang2/Tie2 저해제와 HGF/c-Met 저해제 단독 투여 및 병용 투여 시보다 효능 증진 및 투여 농도 감소.

2. 암 성장 억제뿐 아니라 암 전이 억제에도 효능을 가짐.

3. 기존의 항 c-Met 항체 또는 항 Ang2 항체에 대하여 저항성을 가지는 암에도 항암 효과를 발휘함.

4. 암 이외의 Ang2/Tie2 신호전달체계와 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 다른 질병에의 응용 가능함.

도 1은 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2은 항 Ang2 항체 처리 농도에 따른 Tie2 수용체와 Ang2간의 결합을 억제하는 정도를 보여주는 Ang2-Tie2 competition ELISA 결과이다.
도 3a는 항 Ang2 항체가 처리 농도에 따른 Tie2 수용체와 인산화된 Tie2 수용체의 수준 변화를 보여주는 면역 블라팅 결과이다.
도 3b는 항 Ang2 항체에 의한 Tie2 수용체와 인산화된 Tie2 수용체의 수준 변화를 대조항체 (RG)와 비교하여 보여주는 면역 블라팅 결과이며, 도 3c는 Tie2 내의 인산화된 Tyr 비율을 보여주는 그래프이다.
도 4a는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시의 Tie2 수용체의 Downstream signaling에 관여하는 단백질의 인산화 정도를 보여주는 면역 블라팅 결과이다.
도 4b는 동물모델에서의 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리시의 Tie2 수용체 인산화 및 이의 Downstream signaling에 관여하는 단백질(Akt)의 인산화 정도를 보여주는 면역 블라팅 결과이고, 도 4c는 도 4b의 결과를 수치화하여 보여주는 그래프이다.
도 5는 항 Ang2 항체가 Ang2, 및 Tie2와 결합하여 Complex를 형성하는 정도를 보여주는 ELISA 결과이다.
도 6은 일 실시예에서 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 10D6　항체의 scFv 라이브러리 유전자 확보를 위한 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 과정을 모식적으로 보여준다.
도 7은 인간화 및 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 처리에 따른 Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 Akt의 인산화 정도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 일 실시예에서 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 10D6　항체의 scFv 라이브러리 유전자 확보를 위한 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 과정을 모식적으로 보여준다.
도 9는 인간화 및 친화도 개선된 항 Ang2 항체의 처리에 따른 Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 Akt의 인산화 정도를 보여주는 그래프이다.
도 10는 위암 세포주 MKN45에서의 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 세포 성장 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 폐암 세포주 EBC1에서의 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 세포 성장 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12은 위암 세포주 MKN45에서의 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 세포 성장 신호 저해 효과를 보여주는 면역 블로팅 결과이다.
도 13은 폐암 세포주 EBC1에서의 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 세포 성장 신호 저해 효과를 보여주는 면역 블로팅 결과이다.
도 14는 폐암 세포주 EBC1에서의 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 apoptosis 효과를 보여주는 그래프이다.
도 15은 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 폐암 세포주 EBC1의 전이 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 c-Met 저해제에 대하여 저항성을 갖는 세포에서의 항 c-Met/항 Ang2 이중특이항체의 세포 성장 저해 효과를 보여주는 그래프이다.

이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작

1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산

1.1.1. 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.

1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.

상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).

1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.

1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 참고예 1.1.4에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 Freestyle^TM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. Freestyle^TM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 Freestyle^TM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO₂ _,130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작

1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.

1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.

1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작

huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.

이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.

1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 6과 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3	DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2	WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3	QQSYSAPLT(서열번호 12)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.

이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 7과 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
H11-4	CDR-H1	PEYYMS(서열번호 22)
YC151	CDR-H1	PDYYMS(서열번호 23)
YC193	CDR-H1	SDYYMS(서열번호 24)
YC244	CDR-H2	RNNANGNT(서열번호 25)
YC321	CDR-H2	RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354	CDR-H3	DNWLSY(서열번호 27)
YC374	CDR-H3	DNWLTY(서열번호 28)
L1-1	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3	CDR-L1	KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4	CDR-L1	KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12	CDR-L1	KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22	CDR-L1	KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9	CDR-L2	WASKRVS(서열번호 34)
L2-12	CDR-L2	WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16	CDR-L2	WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1	CDR-L3	QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2	CDR-L3	GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3	CDR-L3	AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5	CDR-L3	QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32	CDR-L3	QQSYSKPFT(서열번호 37)

1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환

선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.

1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조

상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.

huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.

상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2로 명명하였다.

참고예 2. 항 Ang2 항체 제조

2.1. 하이브리도마 제조

　항 Ang2 항체는 5주령의 BALB/c 마우스에 인간 Ang2 단백질 (R&D systems; 623-AN-025/CF)를 adjuvant와 함께 투여하여 면역반응을 유도한 후 Schwaber 등의 논문에 기재된 공지된 방법에 의해 개별 항체를 생산하는 하이브리도마들을 제조하였다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).

보다 구체적으로, 하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 5주령의 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)에 한 마리당 100 ug 의 인간의 Ang2 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 Ang2을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.

세포융합 실험 3일 전에 50 ug의 PBS에 인간 Ang2 단백질 (R&D systems) 100 ug을 혼합한 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM, Hyclon)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x10⁸ 개와 골수종세포(Sp2/0) 1x10⁷ 개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 1500) 1 ㎖을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.

2.2. 항- Ang2 항체의 생산 클론　선별 및 항체 정제

상기 얻어진 항체 생산 하이브리도마들로부터 전형적인 ELISA 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 모　하이브리도마로부터 분화시킨 하이브리도마 중 95개의 항 Ang2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.

보다 구체적으로, 상기 참고예 2.1에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 Ang2 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 Ang2 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 Ang2 단백질을 한 웰당 각각 100 ng씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 상기 참고예 2.1에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Ang2 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 58개의 클론을 최종적으로 얻었다. 상기 제작된 하이브리도마는 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주은행에 2013년 4월 23일자로 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00295를 부여받았다.

상기 얻어진 각각의 하이브리도마를 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에서 배양한 후 배양액을 모아 프로테인 G-친화성 크로마토그래피법으로 각각의 하이브리도마에서 생산되는 항 Ang2 단클론 항체를 정제하였다.

먼저 10% (v/v) FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다. 상기 각각의 하이브리도마로부터 얻어진 항체 중 하나를 10D6으로 명명하였다.

상기 항체의 인간 Ang-2 단백질에 대한 결합 친화도를BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한SPR 방식으로 측정하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리면 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 Kd 값을 계산한다.

먼저 pH 5.0 아세테이트 용액과 아민 커플링 키트(amine coupling kit; GE Healthcare)를 이용하여 anti-His 항체를 8,000 RU 레벨까지 CM5 센서칩(GE Healthcare)에 고정화시켰다. 여기에 6 ug/ml 농도의 재조합 hAng-2 (C-His, R&D Systems) 단백질을 흘려 보내 100 ~ 200 RU 레벨로 capture시켰다. 여기에 상기 참고예 2에서 얻어진 항체를 100 nM 농도로부터 순차적으로 2배씩 희석시킨 후, 각각 흘려 보내는 방법으로 센서칩에 capture된 항원과 결합 (on), 분리 (off), 해리 (regeneration, 10 mM NaOH 용액 사용)시키며 항원-항체간 친화도를 측정하였다. hAng1에 대하여 위와 같은 방법으로 실험하였으며, 그 결과는 하기 표 8과 같다.　　　

항체 명칭	hAng2 (Kd)
SAIT-ANG2-AB-m10D6	8.0 nM

2.3. 항 Ang2 항체의 유전자 클로닝

상기 참고예 2.2에서 얻어진 항체생산 하이브리도마(2x10⁶ 세포)로부터 RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 얻었다. 그런 다음, 이를 주형(template)으로 하여, OneStep RT-PCR kit (Qiagen)과 Mouse Ig-Primer Set (Novagen)과 써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 하기 조건으로 각 하이브리도마에서 생산되는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열만 증폭시켰다: 94℃에서 5분간; [50℃에서 30분, 95℃에서 15분], [94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 35 사이클; 72℃에서 6분간; 4℃로 냉각.

각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 직접 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하여, 각 항체의 CDR, 중쇄 가변부 (103번째 아미노산 S를 L로 치환함) 및 경쇄 가변부 및 이들을 암호화하는 염기서열을 얻었으며, 상기 얻어진 결과를 아래의 표 9 내지 12에 정리하였다:

항체 명칭	중쇄 CDR 서열
항체 명칭	CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-m10D6	SDYAWN (서열번호109)	YINYSGNTDYNPSLKS (서열번호 110)	GNFEGAMDY (서열번호111)

항체 명칭	경쇄 CDR 아미노산 서열
항체 명칭	CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-m10D6	KASQSVSNDVA (서열번호112)	YASNRYP (서열번호 113)	QQDYSSPWT (서열번호 114)

항체 명칭	중쇄 가변부 서열
SAIT-ANG2-AB-m10D6	DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT SDYAWN WIRQFPGNKLEWMG YINYSGNTDYNPSLKS RSSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WGQGTLVTVSS(서열번호 115)
SAIT-ANG2-AB-m10D6	GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAACTACAGTGGTAACACTGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAAGCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGGGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGGTAACTTCGAAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 116)

항체 명칭	경쇄 가변부 서열
SAIT-ANG2-AB-m10D6	SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPWT FGGGTKLEIK(서열번호 117)
SAIT-ANG2-AB-m10D6	agtattgtgatgacccagactcccaaattcctgcttgtatcagcaggagacagggttaccataacctgcaaggccagtcagagtgtgagtaatgatgtagcttggtaccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctaccctggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcaccatcagcactgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaggattatagctctccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa(서열번호 118)

(상기 표 11 및 12에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)

2.4. Ang2 - Tie2 결합에 대한 10 D6 항체의 competition ELISA assay

상기 참고예 2.3에서 제작된 Ang-2에 결합하는 항체를 이용하여 Ang2-Tie2 binding competition ELISA를 수행하였다.

보다 구체적으로, 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 4 ug(microgram)/ml의 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

Ang2-Tie2 competition ELISA를 위해, 상기 참고예 2에서 제작된 각각의 항 Ang2 항체를 400nM ~ 0.001nM의 다양한 농도로 1% (v/v)의 BSA와 400 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hAng-2과 함께　상기 hTie-2/Fc 융합 단백질이 코팅된 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 후,　상기 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG 항체 (Sigma)를 1% (v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 100 ul 의 양으로 각각의 웰에 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (Cell Signaling)을 첨가하여 3분간 발색반응을 유도시켰으며, 이후, Stop 용액 (Cell Signaling) 100 ul를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 plate 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다.

비교를 위하여 Ang2-Tie2 결합을 저해하는 anti-Ang2항체인 4H10를 사용하여 상기와 동일한 시험을 수행하였다. 상기 4H10은 다음과 같은 중쇄가변영역과 경쇄가변영역을 갖는 항체이다:

중쇄가변영역 (서열번호 120):

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISPDSSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLISFWRGGFDYWGQGTLVTVSS

경쇄가변영역 (서열번호 121)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG

Ang-Tie2결합을 저해하는 정도(%)를 도2에 나타내었다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, Ang2-Tie2 결합을 저해하는 anti-Ang2항체인 4H10과는 달리 10D6항체의 경우에는 Ang2-Tie2 수용체간 결합을 저해하지 않는 것이 확인되었다.

2.5. Ang2 항체의 항원인지부위 ( epitope ) 확인

상기 참고예 2.3에서 제작된 항 Ang2 항체의 에피토프(또는 특이적 결합 부위)를 확인하기 위하여 Flag이 tagging된 형태의 Ang2 단백질의 수용체 결합 부위(receptor binding domain, RBD)를 인위적으로 돌연변이를 일으킨 재조합 단백질을 이용하여 ELISA를 수행하였다.

96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)의 각 웰을 1000nM의 항체 50 ul(microliter)로 코팅하였다.　그 후, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS (PBST)로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.　 FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang2 단백질(R&D Systems)의 S417, Q418, P419, N421, I434, D448, A449, P452, Y460, N467, K468, 또는 F469 잔기를 알라닌으로 치환(mutation)시켜 얻어진 각각의 변이단백질(Mutant Ang2)을 상기 플레이트의 각각의 웰에 각각 250ng씩 넣어준 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.

0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체 (SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다.

마지막으로, 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 TMB 기질 (Cell signaling)을 첨가하여 상온에서 3분동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 50 ul의 Stop 용액 (Cell signaling) 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. Mutation 을 시킨 Ang2와의 결합력을 mutation 을 시키지 않은 Ang2와 비교함으로 Ang2 항체들에 대한　각각의 에피토프를 확인하였다. 상기 얻어진 native Ang2와의 결합력에 대한 Mutant Ang2 와의 결합력(%) 측정 결과를 하기 표 13에 나타내었다:　

	Loop 1					Loop 2			Loop 3			Loop4
	417	418	419	421	434	448	449	452	460	467	468	469
10D6	101.17	38.94	41.08	109.09	109.49	104.55	97.86	102.15	103.15	106.84	110.27	108.79

2.6. 10 D6 항체에 의한 Tie2 수용체의 인산화 유도 시험

Ang2는 혈관내피세포에 발현된 Tie2 수용체와 결합하여 수용체의 인산화를 유도하여 활성화함으로써 혈관내피세포의 변화를 유도하는 작용을 하므로, 세포기반 분석법을 이용하여 항 Ang2 항체의 Tie2 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.

이를 위하여, 100mm culture dish에서 HUVEC (ATCC) 세포 (1X10⁶개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지 (Lonza)로 바꾸어 6 내지 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, 1nM의 sodium orthovanadate (Sigma)가 혼합된 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 10분간 더 배양하였다. 　PBS로 한 번 세척한 뒤, 다양한 농도(600~0.06 nM)의 Ang2 항체(10D6)를 Ang2 단백질(R&D systems) 40nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 10분간 더 배양하였다. PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, 400ul의 lysis buffer (Roche) 를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 Nanodrop을 이용하여 정량하였다.

0.8 mg 세포용해물에 1ug의 Tie2 항체 (R&D system)를 넣고 4℃에서 밤새도록(overnight) 반응 시킨 후, protein A bead (GE Healthcare)를 넣어 면역침강(immunoprecipitation)시켰다. 상기 얻어진 반응물을 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 펠렛을 얻은 후, lysis buffer (Roche)로 2 내지 3회 세척하고, reducing agent가 혼합된 sample buffer (Invitrogen) 를 넣고 95℃에서 5분간 끓인 뒤, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel(Invitrogen) running하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Invitrogen)에 이동시켰다.

Tie2 인산화 여부의 확인을 위하여, 위의 멤브레인을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, HRP-conjugated anti-phospho tyrosine 항체 (Millipore)를 이용하여 확인하였다. Tie2 확인을 위하여, blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 Tie2 항체 (Santa Cruz)를 이용하여 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에서 보여지는 바와 같이, Ang2 단독 처리군 대비 Ang2와 함께 10D6 항체를 넣어준 경우에 시험된 모든 항체 농도 범위에서 Tie2의 인산화가 보다 강하게 유도됨 확인하였다.

또한, 상기한 방법을 참조하여, 10D6 항체 60 nM과 Ang2 처리시의 Tie2의 인산화 정도를 대조항체 (Regeneron 사의 항 Ang2 항체; Ang2-Tie2 결합을 저해하는 MOA를 갖는 control 항체; RG항체로 표시)와 비교한 면역 블라팅 결과를 도 3b에 나타내었다. 항체 처리 후, pTyr과Tie2의 blot의 band density를 ImageJ software를 이용하여 측정하고, pTyr/Tie2 비율을 계산하여 그 결과를 도 3c에 나타내었다.

도 3b 및 3c에서 NC로 표시된 부분은 항체와 Ang2를 처리하지 않은 군에서의 Tie2 인산과 결과이다. 도 3b 및 3c에서 확인되는 바와 같이, 10D6 항체 처리시 Tie2 수용체의 인산화 정도가 항체 처리 없이 Ang2만 처리한 경우와 비교하여 약 180% 증가하는 반면, 대조항체인 RG 항체 처리시에는 항체 처리 없이 Ang2만 처리한 경우와 비교하여 약 67% 감소하여, 10D6 항체의 Tie2 인산화 효과가 대조항체 대비 약 8.6배 높은 것으로 나타났다.

2.7. 10 D6 항체에 의한 Tie2 signaling 의 활성화 유도 시험

10D6항체가 Tie2뿐만 아니라 Tie2 수용체의 downstream signaling의 활성화를 유도하는지 확인하기 위하여, HUVEC (ATCC) 세포에 Ang2 단독 또는 Ang2와 10D6 항체를 처리시의 downstream signaling에 참여하는 단백질의 인산화 정도를 면역 블라팅으로 시험하였다. downstream signaling 활성화 정도를 비교하기 위하여, Ang1 (R&D systems), 및 Ang2(R&D systems)와 Regeneron 사의 항 Ang2 항체(RG항체; Ang2-Tie2 결합을 저해하는 MOA를 갖는 control 항체)를 함께 처리한 그룹에 대하여도 동일한 시험을 수행하였다.

구체적으로, 6 well culture dish에서 HUVEC (ATCC) 세포(1X105개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 6 내지 16시간동안 37℃에서 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, Ang2 항체(10D6) 60nM을 Ang2 단백질(R&D systems) 40nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 30분간 더 배양하였다. 비교를 위하여, Ang1(R&D systems) 4nM, Ang2 (R&D systems) 40nM, 및Ang2 (R&D systems) 40nM +항 Ang2 항체(Regeneron) 60nM을 각각 처리한 그룹을 준비하였다.

PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, lysis buffer (Roche) 를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 정량하였다. 25ug의 세포용해물에 reducing agent가 혼합된 sample buffer (Invitrogen)를 넣고 95℃에서 5분간 끓인 뒤, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) running하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Invitrogen)에 이동시켰다.

Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 Akt, eNOS, 42/44의 인산화 여부를 확인하기 위하여, 위의 blot을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, 항 pAkt 항체, 항 p-eNOS 항체, 항 p-42/44 항체 (이상 Cell signaling)를 처리하였다. Blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 항 Akt 항체, 항 eNOS 항체, 42/44 항체를 (이상 cell signaling) 이용하여 Akt, eNOS, 및 42/44를 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에서 보여지는 바와 같이, Ang2 단독 처리군 및 Ang2와 RG항체를 함께 처리한 군 대비, Ang1 단독 처리군 및 Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서 downstream signaling이 강하게 유도되며, Ang2와 10D6 항체를 함께 처리한 군에서의 효과가 Ang1 단독 처리군의 동등 이상임을 확인할 수 있다.

또한, 항 Ang2 항체 처리시의 Tie2 수용체 인산화 및 이의 Downstream signaling에 관여하는 단백질(Akt)의 인산화 정도를 동물모델(in vivo)에서 확인하였다. 구체적으로, 7-8주령의 C57BL6 생쥐에 항체 5 mg/kg를 단독 또는 20 ug의 Ang2와 함께 꼬리 정맥을 통해 주입한 뒤, 1시간 후에 생쥐로부터 폐조직을 얻었다. lysis buffer (Roche)와 FastPrep kit (MP biomedicals)를 이용하여 상기 준비된 폐조직을 homogenization lysis하여 얻어진 조직 용해물(tissue lysate)에서의 Tie2및 Akt의 활성 정도를 상기한 방법으로 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4b 및 4c에 나타내었다. 도 4b 및 4c에서 REGN 또는 RG로 표시된 것은 대조항체 ((Regeneron 사의 항 Ang2 항체)의 결과이다. 도 4b 및 4c에서 확인되는 바와 같이, 10D6 항체는 in vivo 시험에서도 대조항체와 비교하여 현저한 Tie2 및 이의 Downstream signaling에 관여하는 단백질(Akt)의 인산화 효과를 나타내었다.

2.8. 10 D6 - Ang2 - Tie2 complex 형성 확인을 위한 ELISA assay

10D6 anti-Ang2 항체가 Ang2-Tie2 결합을 저해하지 않고, Tie2 signaling을 활성화 시키는 것을 확인하였기 때문에, 항체와 Ang2 Tie2수용체 간의 complex가 형성되는지 여부를 확인하기 위하여 ELISA 를 수행하였다.

96-well MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)에 4ug/ml의 Tie2-Fc (R&D systems) 또는 BSA (Sigma)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 0.25 ug/ml의 Ang2와 2 ug/ml의 10D6 항체를 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 후,　상기 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. HRP 가 Conjugation 된 항-마우스 IgG 항체 (Sigma)를 1% (v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 100 ul 의 양으로 각각의 웰에 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (Cell Signaling)을 첨가하여 3분간 발색반응을 유도시켰으며, 이후, Stop 용액 (Cell Signaling) 100 ul를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 plate 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 것과 같이 10D6 항체가 Tie2에 결합된 Ang2에 결합하여 complex를 이루는 것을 확인 할 수 있었다.

2.9. 10 D6 　항체의 scFv 의 제작

상기 참고예 2.3에서 얻어진 마우스 10D6　항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 이용하여 10D6　항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 중쇄 가변부위(아미노산 서열: 서열번호 115; 코딩 염기서열: 8) 및 경쇄 가변부위(아미노산 서열: 서열번호 117; 코딩 염기서열: 서열번호 118)을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 184)'의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 'VH-링커-VL' (10D6　항체의 scFv)의 아미노산 서열과 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 188 (아미노산 서열) 및 서열번호 189 (뉴클레오타이드 서열)에 각각 나타내었다.

2.10. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

2.10.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

10D6　항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)을 상기 제작된 마우스 항체 10D6으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 14와 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-H1	SDYAWN(서열번호 109)
CDR-H2	YINYSGNTDYNPSLKS(서열번호 110)
CDR-H3	GNFEGAMDY(서열번호 111)
CDR-L1	KASQSVSNDVA(서열번호 112)
CDR-L2	YASNRYP(서열번호 113)
CDR-L3	QQDYSSPWT(서열번호 114)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 참고예에서는 10D6 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오티드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오티드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오티드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

2.10.2. 10 D6 　항체의 scFv 의 라이브러리 유전자 제작

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 4.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행되었다. 주형으로 10D6 scFv(서열번호 189)를 이용하여, 도 6에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 10D6　항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하였다. 이렇게 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들은 모두 10⁷~10⁸　개 범위 내에서 구축되었다.

각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 Ang2에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 Ang2에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.

2.11. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 참고예 2.10의 각 라이브러리 중 Ang-2에 강한 결합력을 보이는 상위 1.0%를 각각 분류하였으며, 이 과정은4회 반복하였다. 각각의 개별 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 15와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다 (중쇄 불변영역: 인간IgG1 불변영역, 경쇄불변영역: 인간 KAPPA CHAIN 의 불변영역). 하기 클론 중에서, VH-6.6, VH-6.7, VL-(6.11), VL-(6.17), 및 VL-HU1(6.22)으로부터 생산된 5종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.　

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
VH-6.6	CDR-H2	KISYSGKTDYNPSLKS(서열번호 122)
VH-6.7	CDR-H2	KINYAGNTDYNPSLKS(서열번호 123)
VL-(6.11)	CDR-L1	KASQSVSNDVH(서열번호 124)
VL-(6.17)	CDR-L3	QHDYSSPFT(서열번호 127)
VL-(6.22)	CDR-L1+ CDR-L3	KASQSVSNDVH(서열번호 124)+ QHDYSSPFT(서열번호 127)

2.12. 마우스 항체 10 D6 로부터 인간화 항체 10 D6 - HU1 , 10 D6 - HU2 , 10 D6 - HU3 , 및 10 D6 - HU5 의 제작

2.12.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )

10D6-HU1 Heavy, 10D6-HU2-heavy, 및 10D6-HU5-heavy 3종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 10D6의 VH 유전자와 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGHV4-b*01　(DP-67; accession number: Z12367)이 아미노산 레벨에서 72.2%의 상동성을 가짐을 확인하다. 마우스 항체 10D6의 CDR-H1(서열번호 109), CDR-H2(서열번호 110), 및 CDR-H3(서열번호 111)를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 10D6의 CDR 부분이 IGHV4-b*01의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다 (10D6-HU1로 명명; 서열번호 185; QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS). 여기서, 30번 아미노산을 원래 마우스 10D6 항체의 아미노산 서열로 back-mutation (S→T)하여, 10D6-HU5(서열번호 164)를 제작하였다. 10D6-HU5에서, 48번(I→M), 67번(V→S), 71번(V→R) 아미노산을 추가로 원래 마우스 10D6 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 함으로서 10D6-HU2(서열번호 186; QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYINYSGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS)를 구축하였다.

한편, 10D6-HU3-heavy의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 10D6 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사하고, 기존의 인간화 항체 중 약 0.1% 수준의 매우 낮은 면역원성 부작용을 보인 허셉틴의 백본(backbone)으로 선정하였다. 마찬가지로 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 10D6의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3를 허셉틴 항체의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 27번 (F-Y) 28번(N→S), 30번(K→T), 48번(V→M), 49번(A→G), 67번 (F→S), 71번(A→R), 78번(A→F),　93번(S→A)을 back-mutation 하여 10D6-HU3(서열번호 187; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGYINYSGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS)를 구축하였다.

2.12.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )

H1-light의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 10D6의 VL 유전자와 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, IGKV1-39*01(O12; accession number: X59315)이 아미노산 레벨에서 66%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 10D6의 CDR-L1(서열번호 112), CDR-L2(서열번호 113), 및 CDR-L3(서열번호 114)를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 10D6의 CDR부분이 IGKV1-39*01의 골격에 도입되도록 디자인하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTMAntibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(10D6-VHHU1, 10D6-VHHU2, 10D6-VHHU3, 및 10D6-VHHU5)을 EcoRI(NEB, R0101S)과 nheI(NEB, R0131) 제한효소를 사용하여 클로닝하고 pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(10D6-VLHU1(서열번호 165) 코딩: 서열번호 177)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 107)에 2M CaCl2를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 10D6-HU1, 10D6-HU2, 10D6-HU3, 및 10D6-HU5를 정제하였다.　

2.13. 선별된 CDR 의　 Humanization 항체로의 이식 및 IgG 로의 변환

상기 선별된 CDR 을 인간화된 항체의 중쇄와 경쇄에 각각 이식하였다. 중쇄는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(서열번호 172-176). 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를　바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(서열번호 177-179). Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 172-68), pcDNATM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 177-179)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 10⁷)에 2M CaCl2를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, h10D6-Opti-1,2,3,4로 명명함)를 정제하였다.

클론 이름	항체서열 (VH)	항체서열(VL)
h10D6-OPTI-1	>HU2 -6.6: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 160)	>HU1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 165)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 172)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 177)
h10D6-OPTI-2	>HU2 -6.7: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 161)	>HU1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 165)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTAACTATGCCGGTAACACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 173)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 177)
h10D6-OPTI-43	>HU2 -6.6: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 160)	>HU1-6.11: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 166)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 172)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 178)
h10D6-OPTI-55	>HU2 -6.7: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 161)	HU1-6.11: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 166)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTAACTATGCCGGTAACACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 173)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 178)
h10D6-OPTI-3	>HU3-6.6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 162)	>HU1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 165)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 174)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 177)
h10D6-OPTI-4	>HU3-6.7: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 163)	>HU1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 165)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAACTGGTAGAGTCCGGGGGCGGCCTGGTCCAGCCAGGAGGAAGCCTGCGGCTCTCTTGTGCCGCCAGCGGGTATAGTATCACTTCAGATTATGCCTGGAATTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGGAAGGGCTTAGAGTGGATGGGTAAAATTAATTACGCAGGCAACACCGACTATAATCCTTCACTGAAATCTAGATCCACCATCTCTAGAGATACAAGTAAGAACACCTTTTACTTGCAGATGAATAGCCTCAGGGCTGAAGACACTGCTGTGTACTACTGCGCAAGAGGAAACTTCGAAGGAGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGTACGCTTGTGACAGTGTCCTCT(서열번호 175)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 177)
h10D6-OPTI-16	>HU3-6.6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 162)	>HU1-6.11: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 166)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 174)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 178)
h10D6-OPTI-17	>HU3-6.7: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKINYAGNTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 163)	>HU1-6.11: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 166)
	GAGGTTCAACTGGTAGAGTCCGGGGGCGGCCTGGTCCAGCCAGGAGGAAGCCTGCGGCTCTCTTGTGCCGCCAGCGGGTATAGTATCACTTCAGATTATGCCTGGAATTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGGAAGGGCTTAGAGTGGATGGGTAAAATTAATTACGCAGGCAACACCGACTATAATCCTTCACTGAAATCTAGATCCACCATCTCTAGAGATACAAGTAAGAACACCTTTTACTTGCAGATGAATAGCCTCAGGGCTGAAGACACTGCTGTGTACTACTGCGCAAGAGGAAACTTCGAAGGAGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGTACGCTTGTGACAGTGTCCTCT(서열번호 175)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 178)
h10D6-OPTI-42	>HU5: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYINYSGNTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 164)	>HU1-22: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHDYSSPFTFGQGTKLEIK(서열번호 167)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTACATAAACTACAGTGGTAACACTGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGTAACTTCGAAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACGCTTGTGACAGTGTCCTCT(서열번호 176)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCATGATTATAGCTCTCCGTTCACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 179)

(상기 표 16에서, 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)

2.14. 선별된 항체의 결합 친화도 분석　

표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방식을 이용한 항원 친화도 (KD values) 측정　Ang2 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한　SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다.　25 ug/ml 농도의 anti-His 항체를 pH 5.0 acetate 용액과 amine coupling kit (GE Healthcare)를 이용하여 CM5 센서칩 (GE Healthcare)에 고정화 시켰다. 여기에 재조합 hAng2(R&D Systems) 항원을 6 ug/ml 농도로 capture 시킨 후,　항체를 흘려 항원과 결합 및 해리시키며 항원-항체 친화도를 측정하였다. 　 상기 얻어진 결과를 아래의 표 17에 나타내었다. 표 17에서 KD 값은 kon값과 koff 값로부터 계산하였다.

항체	kon (1/Ms)	koff (1/s)	KD (nM)
m10D6	2.410x10⁴	1.932x10^-4	8
10D6-HU1	3.082x10⁴	0.002599	84
10D6-HU2	7.298x10⁴	0.003464	47
10D6-HU3	4.503x10⁴	0.001938	43
10D6-HU5	4.856x10⁴	0.003115	64
h10D6-OPTI-1	4.737x10⁵	3.209x10^-4	0.68
h10D6-OPTI-2	4.237x10⁵	1.488x10^-4	0.34
h10D6-OPTI-43	1.531x10⁶	5.760x10^-4	0.38
h10D6-OPTI-55	6.210x10⁵	8.489x10^-5	0.14
h10D6-OPTI-3	6.239x10⁵	3.070x10^-4	0.49
h10D6-OPTI-4	7.357x10⁵	2.460x10^-4	0.33
h10D6-OPTI-16	4.794x10⁵	4.434x10^-4	0.92
h10D6-OPTI-17	4.600x10⁵	3.503x10^-4	0.76
h10D6-OPTI-42	3.358x10⁵	2.862x10^-4	0.85

표 17에서와 같이, 마우스 항체 10D6은 Ang2 항원에 대하여 약 18　nM의 결합력을 보였으며, 친화도가 개선된 5종의 인간화 항체는0.14　nM 내지 0.85　nM범위의 결합력을 보였다. 이는 scFv 형태에서 친화도가 개선된 항체들이 IgG 변환 후에도 최소 5배에서 최대 약 37배까지 친화도가 향상되었음을 보여준다.

2.15. 선별된 친화도 개선 항체의 인 비트로( in vitro ) 생물학적 활성 분석

2.15.1. Akt 인산화　

상기 인간화 및/또는 친화도 성숙된 10D6항체가 Tie2 뿐 만 아니라 downstream signaling의 활성화를 유도하는지 확인하기 위하여, HUVEC (ATCC) 세포에서 Ang2 단독 또는 Ang2와 상기 참고예 2.13에서 얻어진 10D6 항체(표 11 참조)를 처리하여 Akt 인산화 정도를 비교하였다. 96 well plate에서 HUVEC (ATCC) 세포(2X10⁴개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 6 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상기 참고예 2.13에서 얻어진 Ang2 항체를 6nM 또는 1.2nM의 농도로 Ang2 단백질(R&D systems) 4nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 30분간 더 배양하였다.

Tie2 수용체의 downstream signaling에 관여하는 Akt의 인산화 여부를 확인하기 위하여, PathScan

Phospho-Akt Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit (Cell signaling, #7134)을 이용하였다. PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, lysis buffer (Roche) 30ul 를 처리하고 4℃에서 30분간 세포를 용해시켰다. 각 well에30ul의 diluent buffer(Cell signaling)를 넣어 pipet을 이용해 잘 섞어준 다음, 50ul를 phosphor-Akt Ab coated microwell로 옮겨 2시간 동안 상온에서 반응시켰킨다. 2시간 후, 1X washing buffer(Cell signaling)로 4번 세척 후, 50ul Akt1 detection antibody 용액(Cell signaling)을 넣어 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 동일한 방법으로 well을 세척한 뒤, 50ul HRP-conjugated secondary antibody(Cell signaling)를 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. 위와 동일한 방법으로 well을 세척한 후, luminol/enhancer solution(GE healthcare)과 stable peroxide buffer(GE healthcare)를 1:1(v/v)로 섞어준 용액을 50ul씩 분주하고, plate를 luminometer (Envision 2104 plate reader, Perkin Elmer)에 장착 후 relative lignt unit (RLU)를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 마우스 10D6 항체와 비교하여, 상기 참고예 2.13에서 얻어진 인간화 및/또는 친화도 성숙된 항체가 downstream signaling이 보다 강하게 유도됨을 확인할 수 있다.

2.16. 인간화 10 D6 　항체 ( Opti -1)의 scFv 를 제작하기 위한 폴리뉴클레오티드의 합성

인간화 10D6　항체(Opti-1)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 이용하여 10D6　항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 중쇄 가변부위(아미노산 서열: Hu2 6.6(서열번호 160); 코딩 염기서열: 서열번호 172) 및 경쇄 가변부위(아미노산 서열: Hu1(서열번호 165); 코딩 염기서열: 서열번호 서열번호 177)을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 184)'의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 10D6 opti-1　항체의 scFv('VH-링커-VL'; 서열번호 190)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 191)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다.

2.17.2차 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작

2.17.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작

10D6　opti-1 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 3개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)을 상기 제작된 10D6-Opti-1 항체로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 18과 같다.

CDR	아미노산 서열
CDR-L1	KASQSVSNDVA(서열번호 112)
CDR-L2	YASNRYP(서열번호 113)
CDR-L3	QQDYSSPWT(서열번호6)

항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 참고예에서는 10D6 opti-1 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오티드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오티드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오티드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.

2.17.2. 10 D6 opti -1　항체의 scFv 의 라이브러리 유전자 제작

CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 11.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행되었다. 주형으로 10D6 opti-1 scFv(서열번호 191)를 이용하여, 도 8에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 10D6　항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하였다. 이렇게 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들은 모두 10⁷~10⁸　개 범위 내에서 구축되었다.

2.18. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별

상기 참고예 2.17 에서 얻어진 라이브러리 중에서 Ang2에 강한 결합력을 보이는 상위 1.0%를 각각 분류하였고, 이를4회 반복하였다. 각각의 개별 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 14와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다 (중쇄불변영역: 인간IgG1 불변영역, 경쇄경쇄불변영역: 인간 KAPPA CHAIN 의 불변영역). 하기 클론 중에서, 10D6_VL-Hu1-2.1, 10D6_VL-Hu1-2.4, 10D6_VL-Hu1-2.7, 10D6_VL-Hu1-2.8 으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다

클론 이름	도출된 라이브러리	CDR 서열
10D6_VL-Hu1-2.1	CDR-L1	KASQFVSTDVH(서열번호 125)
10D6_VL-Hu1-2.4	CDR-L2	YASIPYP(서열번호 126)
10D6_VL-Hu1-2.7	CDR-L1+L2	KASQSVSNDVH(서열번호 124)+YASIPYP(서열번호 126)
10D6_VL-Hu1-2.8	CDR-L1+L2	KASQFVSTDVH(서열번호 XX)+YASIPYP(서열번호 126)

2.19. 선별된 CDR 의　 Humanization 항체로의 이식 및 IgG 로의 변환

상기 선별된 CDR 을 인간화된 항체의 경쇄에 각각 이식하였다. 중쇄는 Hu2-6.6 이나 Hu3-6.6 서열로 클로닝된 항체를 이용하고. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를　바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(표 20 참조). invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(표 20), pcDNATM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(표 20)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 8종의 항체(이하, h10D6-Opti-63, 65, 67, 71, 68, 70, 72, 및 73로 명명함)를 정제하였다.

클론 이름	항체서열 (VH)	항체서열(VL)
h10D6-OPTI-63	>HU2-6.6: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 160)	>10D6_VL-Hu1-2.1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 168)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 172)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 180)
h10D6-OPTI-65	>HU2-6.6: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 160)	>10D6_VL-Hu1-2.4: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 169)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 172)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 181)
h10D6-OPTI-67	>HU2-6.6: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 160)	>10D6_VL-Hu1-2.7: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 170)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 172)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 182)
h10D6-OPTI-71	>HU2-6.6: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 160)	10D6_VL-Hu1-2.8: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 171)
	(코딩 염기서열): CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTAAAACCTTCTGAAACGCTCTCACTTACCTGTGCCGTTAGTGGATACTCTATCACTTCCGACTACGCTTGGAATTGGATTCGGCAGCCTCCAGGCAAAGGGCTGGAATGGATGGGAAAGATTTCCTATTCCGGTAAGACTGACTACAATCCCAGTCTGAAGAGCAGGTCAACAATCTCCAGAGACACCAGCAAGAATCAGTTTTCCCTGAAATTGTCCTCGGTGACAGCAGCGGATACCGCAGTGTATTATTGCGCCCGCGGTAACTTCGAGGGAGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGTACTCTCGTCACTGTGAGCAGC(서열번호 172)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 183)
h10D6-OPTI-68	>HU3-6.6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 162)	>10D6_VL-Hu1-2.1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 168)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 174)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 180)
h10D6-OPTI-70	>HU3-6.6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 162)	>10D6_VL-Hu1-2.4: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 169)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 174)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 181)
h10D6-OPTI-72	>HU3-6.6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 162)	>10D6_VL-Hu1-2.7: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 170)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 174)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 182)
h10D6-OPTI-73	>HU3-6.6: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSDYAWNWVRQAPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 162)	10D6_VL-Hu1-2.8: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQFVSTDVHWYQQKPGKAPKLLIYYASIPYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK(서열번호 171)
	(코딩 염기서열): GAGGTTCAGCTGGTCGAAAGCGGTGGGGGACTCGTGCAGCCAGGCGGTTCTCTTAGATTATCATGTGCCGCATCCGGGTACTCCATCACCTCTGATTATGCATGGAACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGGAAGATCTCCTATTCAGGGAAGACAGATTATAATCCTTCGCTGAAAAGCAGATCAACAATTAGTAGAGACACTTCTAAAAATACTTTTTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGGGGAAATTTCGAGGGAGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACGTTGGTAACCGTGAGCAGC(서열번호 174)	(코딩 염기서열): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGTTCGTGAGTACTGATGTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCATCCCATACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA(서열번호 183)

(상기 표 20에서, 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)

2.20. 선별된 항체의 결합 친화도 분석　

표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방식을 이용한 항원 친화도 (KD values) 측정　Ang2 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한　SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다.　25 ug/ml 농도의 anti-His 항체를 pH 5.0 acetate 용액과 amine coupling kit (GE Healthcare)를 이용하여 CM5 센서칩 (GE Healthcare)에 고정화 시켰다. 여기에 재조합 hAng2(R&D Systems) 항원을 6 ug/ml 농도로 capture 시킨 후,　항체를 흘려 항원과 결합 및 해리시키며 항원-항체 친화도를 측정하였다. 　 상기 얻어진 결과를 아래의 표 21에 나타내었다. 표 21에서 KD 값은 kon값과 koff 값로부터 계산하였다.

항체	kon (1/Ms)	koff (1/s)	KD (M)
h10D6-OPTI-63	2.676x10⁶	7.421x10^-5	2.773x10^-11
h10D6-OPTI-65	4.960x16⁵	2.250x10^-5	4.536x10^-12
h10D6-OPTI-67	2.080x16⁶	2.684x10^-7	1.291x10^-13
h10D6-OPTI-68	5.355x10⁵	1.696x10^-4	3.168x10^-10
h10D6-OPTI-70	2.650x10⁵	1.159x10^-4	4.374x10^-10

표 21에서와 같이, 친화도가 개선된 8종의 인간화 항체는0.000129　nM 내지 0.43　nM범위의 결합력을 보였다.

2.21. 선별된 친화도 개선 항체의 인 비트로( in vitro ) 생물학적 활성 분석

2.21.1. Akt 인산화　

상기 인간화 및/또는 친화도 성숙된 10D6항체가 Tie2 뿐 만 아니라 downstream signaling의 활성화를 유도하는지 확인하기 위하여, HUVEC (ATCC) 세포에서 Ang2 단독 또는 Ang2와 상기 참고예 2.19에서 얻어진 10D6 항체(표 20 참조)를 처리하여 Akt 인산화 정도를 비교하였다. 96 well plate에서 HUVEC (ATCC) 세포(2X10⁴개)를 EGM-2 (Lonza) 배지를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 배지(Lonza)로 바꾸어 6 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상기 참고예 2.13에서 얻어진 Ang2 항체를 6nM 또는 1.2nM의 농도로 Ang2 단백질(R&D systems) 4nM과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 30분간 더 배양하였다.

Phospho-Akt Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit (Cell signaling, #7134)을 이용하였다. PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, lysis buffer (Roche) 30ul 를 처리하고 4℃에서 30분간 세포를 용해시켰다. 각 well에30ul의 diluent buffer(Cell signaling)를 넣어 pipet을 이용해 잘 섞어준 다음, 50ul를 phosphor-Akt Ab coated microwell로 옮겨 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 2시간 후, 1X washing buffer(Cell signaling)로 4번 세척 후, 50ul Akt1 detection antibody 용액(Cell signaling)을 넣어 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 동일한 방법으로 well을 세척한 뒤, 50ul HRP-conjugated secondary antibody(Cell signaling)를 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. 위와 동일한 방법으로 well을 세척한 후, luminol/enhancer solution(GE Healthcare)과 stable peroxide buffer(GE Healthcare)를 1:1(v/v)로 섞어준 용액을 50ul씩 분주하고, plate를 luminometer (Envision 2104 plate reader, Perkin Elmer)에 장착 후 relative lignt unit (RLU)를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 마우스 10D6 항체와 비교하여, 상기 참고예 2.19에서 얻어진 인간화 및/또는 친화도 성숙된 항체가 downstream signaling이 보다 강하게 유도됨을 확인할 수 있다.

실시예 1: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 제작

상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 참고예 2.16에서 제작된 항 Ang2 항체의 scFv[(중쇄 가변부위 (아미노산 서열: Hu2 6.6(서열번호 160); 코딩 염기서열: 서열번호 172))-(링커: 서열번호 184)-(경쇄 가변부위 (아미노산 서열: 서열번호 Hu1-1(서열번호 192; Hu1(서열번호 165)의 100번째 아미노산 Q가 G로 치환됨(Q100G)); 코딩 염기서열: 서열번호 서열번호 193))]를 융합한 이중 특이 항체를 제작하였다. 그 제작 과정은 아래와 같다.

우선, 상기 이중 특이 항체 클로닝에 이용된 L3-1Y-IgG2 항체의 중쇄 부분은 다음과 같이 제작하였다. 항 c-Met 항체의 중쇄 코딩 염기서열은 서열번호 67의 position 1396부터의 C-terminal 쪽 서열을 삭제하고, 그 대신 ggcggtggtggttccggaggcggcggatcc을 삽입하여 합성하였다 (바이오니아).

이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning vector에 상기 DNA 절편을 ligate하였다.

한편, 항 Ang2 항체 10D6의 중쇄 가변 영역(서열번호 115) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 117)이 펩타이드 링커 (G₄S)₂로 연결된 항 Ang2 scFv를 제작하였다. 구체적으로, 항 Ang2 항체 4-H10의 중쇄 가변 영역 코딩 염기서열 (서열번호 116; 바이오니아에 의뢰하여 합성), 경쇄 가변 영역 코딩 염기서열 (서열번호 118; 바이오니아에 의뢰하여 합성), 및 상기 펩타이드 링커의 코딩 염기서열을 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다 (N-terminal BamHI 제한 효소 인식부위 및 C-terminal XhoI 제한 효소 인식 부위 포함 형태).

그 후, BamHI 제한 효소와 XhoI 제한 효소를 사용하여 상기 제작된 항 Ang2 scFv을 앞서 준비된 L3-1Y-IgG2 부분이 포함되어 있는 벡터에 클로닝하여, 상기 이중 특이 항체의 중쇄를 포함하는 발현 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 이중 특이 항체의 중쇄(c-Met 항체의 중쇄부분과 anti-Ang2 scFv이 펩타이드 링커로 연결됨)의 아미노산 서열 (서열번호 194; 코딩 염기서열: 서열번호 195)의 각 부위를 아래의 표 22에 정리하였다:

서열번호 194

N-말단 --> C-말단
Signal peptide 서열	MEWSWVFLVTLLNGIQC
항 c-Met 항체의 중쇄 가변부위	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWLGFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWFAYWGQGTLVTVSS
Fc (IgG2)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
링커 (Fc의 C-말단과 항-Ang2 scFv 연결)	GGGGSGGGGS
항-Ang2 scFv의 중쇄 가변부위	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS
링커 (항-Ang2 scFv의 중쇄가변부위와 경쇄가변부위 연결)	GGGGSGGGGSGGGGS
항-Ang2 scFv의 경쇄가변부위	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGGGTKLEIK (코딩 염기서열: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCATCCAATCGCTACCCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (서열번호 193))

(밑줄 그은 부분은 CDR을 나타냄)

또한, 항 c-Met 항체의 경쇄 코딩 염기서열은 서열번호 69의 염기서열을 갖도록 합성하였다 (바이오니아). Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning vector(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 이중 특이 항체의 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하였다. 상기 염기서열에 의하여 합성되는 항 c-Met 항체의 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 68)의 각 부위를 아래의 표 14에 정리하였다:

서열번호 68

N-말단 --> C-말단
항 c-Met 항체의 중쇄 가변부위	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLASGNQNNYLAWYQQKPGKAPKMLIIWASTRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSRPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(밑줄 그은 부분은 CDR을 나타냄)

상기 구축된 중쇄 발현 벡터와 경쇄 발현 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x10⁵cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x10⁶cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2, 130 rpm incubator에서 4일간 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(GE healthcare, 11-0034-95)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시킨 다음, 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하였다.

상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 c-말단에 항 Ang2 scFv가 융합된 항체를 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체 MA01로 명명하였다.

실시예 2: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 c- Met 에 대한 결합 친화도

상기 실시예 1 에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 c-Met에 대한 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. 이를 위하여, 인간 Fab 결합제(#28-9583-25, GE Healthcare)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90~120 RU의 이중 특이 항체 MA01를 포획하고, 다양한 농도의 c-Met-Fc(#358-MT/CF, R&D Systems)를 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 24에 나타내었다:

R_max (RU)	K_D (nM)	k_a (1/Ms)	k_d (1/s)	Chi²	U-Value	T(k_a)	T(k_d)
96.74	0.07	6.2x10⁶	4.7x10^-5	1.46	12	1.9x10³	69

표 24에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체 MA01은 c-Met에 대하여 0.07nM 정도의 친화력을 보이는 것으로 확인되었으며, 이는 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체인 L3-1Y/IgG2의 c-Met에 대한 친화력과 유사한 정도이다.

실시예 3: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 Ang2 에 대한 결합력

상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 Ang2에 대한 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. 이를 위하여, Anti-histidine antibody (R&D Systems)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. C-terminal histidine-tagged human Ang2 (R&D Systems)를 포획하고, 다양한 농도의 이중 특이 항체 MA01를 상기 포획된 항원(Ang2)에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 25에 나타내었다:

ka(1/Ms)	kd(1/s)	K_D(M)	Chi²(RU²)	U-value	T(ka)	T(kd)
9.049x10⁴	0.006481	7.162x10^-8	2.61	2	95	1.8x10²

표 25에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체는 Ang2에 대하여 약 7x10^-8M 정도의 친화력을 보이는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 암세포 성장 저해 효과

상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 암세포 사멸 효과를 위암 세포주 MKN45 및 폐암 세포주 EBC1를 대상으로 시험하였다.

구체적으로, MKN45 세포 (JCRB0254) 5000개와 폐암 세포주 EBC1 (JCRB0820) 5000개를 (GIBCO RPMI 1640, 100ul/well) 배지를 포함하는 각 웰에 분주하고, 여기에 이중 특이 항체 MA01을 60nM(1 treatment for 6 days)의 양으로 6일동안 처리하였다. 세포수 변화는 CellTiter Glo (CTG) assay를 통해 측정하였다. 구체적으로, 6일동안 인큐베이팅 후 CTG 용액(Promega) 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분간 인큐베이팅하였다. 상기 얻어진 발광 신호를 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 기록하였다.

비교를 위하여, 항체 무처리군 (None), 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 단독 처리군 (60nM), 상기 참고예 2.3에서 제작된 항 Ang2 항체 10D6 단독 처리군 (60nM), 상기 참고예 2.4 에서 제작된 항 Ang2 항체 4H10 단독 처리군 (60nM), 상기 L3-1Y/IgG2와 10D6의 병용 처리군 (60nM each), 상기 L3-1Y/IgG2와 4H10의 병용 처리군 (60nM each), 및 L3-1Y/IgG2와 4H10 scFv를 포함하는 이중특이항체 (BsAb) (실시예 1을 참조하여 제작함; 60nM each) 에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 10 (MKN45) 및 도 11 (EBC1)에 나타내었다. 도 10 및 11에 나타난 바와 같이, 이중특이항체 MA01은 항 c-Met 항체 단독 투여 및 항 Ang2 항체 단독 투여시는 물론 이들의 병용 투여시보다 우수한 항암 세포 성장 저해 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다.

한편, 이중 특이 항체 MA01의 신호전달 관여 물질의 인산화 저해 효과를 확인하기 위하여, 이중 특이 항체 MA01 처리에 따른 위암 세포주 MKN45 또는 폐암 세포주 EBC1에서의 Erk 인산화 정도를 시험하였다. 구체적으로, MKN45 세포 및 EBC1 세포를 각각 2 x 10⁵ 세포/ml의 양으로 60mm plate에 분주하고, 24시간 후에 무혈청 상태에서 준비된 각각의 항체를 5 ug/ml의 양으로 30분 동안 처리한 후, Erk인산화 효소의 인산화 정도를 웨스턴 블라팅으로 측정하였다.

비교를 위하여, 항체 무처리군, 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 단독 처리군 (5ug/ml), 상기 참고예 2.3에서 제작된 항 Ang2 항체 10D6 단독 처리군 (5ug/ml, m10D6), 상기 참고예 2.4 에서 제작된 항 Ang2 항체 4H10 단독 처리군 (5ug/ml), 상기 L3-1Y/IgG2와 10D6의 병용 처리군 (각 5ug/ml), 상기 L3-1Y/IgG2와 4H10의 병용 처리군 (각 5ug/ml), 및 L3-1Y/IgG2와 4H10 scFv를 포함하는 이중특이항체 (BsAb) (실시예 1을 참조하여 제작함; 5ug/ml) 에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 12 (MKN45) 및 도 13 (EBC1)에 나타내었다. 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 이중특이항체 MA01은, 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체의 단독 투여시뿐 아니라 병용 투여시와 L3-1Y/IgG2와 4H10의 이중 특이 항체와 비교하여, Erk의 인산화를 현저히 억제하는 것이 확인되었으며, 이와 같은 이중특이항체 MA01의 Erk와 같은 세포 성장과 관련된 신호 전달 관여 물질의 인산화 저해 효과가 앞서 살펴본 우수한 암세포 성장 저해 효과에 기여할 것으로 생각된다.

실시예 5: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체에 의한 Apoptosis

실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 암세포(EBC1)의 apoptosis 정도를 시험하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 암세포 사멸 효과를 위암 세포주 MKN45 및 폐암 세포주 EBC1를 대상으로 시험하였다.

구체적으로, 폐암 세포주 EBC1 (JCRB0820) 5000개를 (GIBCO RPMI 1640, 100ul/well) 배지를 포함하는 각 웰에 분주하고, 여기에 이중 특이 항체 MA01을 60nM의 양으로 6일동안 처리하였다. 세포수 변화는 Caspase 3/7 Glo assay를 통해 측정하였다. 구체적으로, 6일동안 인큐베이팅 후 Caspase 3/7 Glo 용액(Promega) 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분간 인큐베이팅하였다. 상기 얻어진 발광 신호를 Envision 2104 Multi-label Reader (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 기록하였다

비교를 위하여, 항체 무처리군, 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 단독 처리군 (60nM), 상기 참고예 2.3에서 제작된 항 Ang2 항체 10D6 단독 처리군 (m10D6; 60nM), 상기 참고예 2.4 에서 제작된 항 Ang2 항체 4H10 단독 처리군 (60nM), 상기 L3-1Y/IgG2와 10D6의 병용 처리군 (60nM each), 상기 L3-1Y/IgG2와 4H10의 병용 처리군 (60nM each), 및 L3-1Y/IgG2와 4H10 scFv를 포함하는 이중특이항체 (BsAb) (실시예 1을 참조하여 제작함; 60nM) 에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타난 바와 같이, 이중특이항체 MA01은, 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체의 단독 투여시뿐 아니라 병용 투여시와 L3-1Y/IgG2와 4H10의 이중 특이 항체와 비교하여, 암세포의 apoptosis 효과가 우수함이 확인되었다.

실시예 6: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체에 의한 암세포 전이 억제

Ang2와 c-Met은 모두 암세포 성장뿐 아니라 암의 전이에도 관련된 인자이므로, 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체가 세포 움직임 (motility)에 주는 영향을 관찰하였다. 상기 이중특이항체의 Ang2+HGF에 의한 migration에 대한 억제 효과를 다음과 같이 시험하였다.

항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체에 의해 HGF 및 Ang2에 의해 유도된 세포 이동이 억제되는지 여부를 확인하기 위해 xCelligence system(Roche)을 이용한 세포 이동 어세이(migration assay)를 수행하였다. 세포 이동 어세이에 사용된 기기는 xCelligence-RTCA DP system으로서, gold microelectrode array 위에 세포가 부착될 때 발생하는 임피던스(impedence)를 측정함으로서 세포의 숫자를 측정하는 기기이다. 세포 이동 어세이는 CIM-plate 16(Roche)을 사용하며 Boyden chamber와 같이 upper chamber와 lower chamber가 나뉘어 있어, upper chamber에 존재하는 세포가 lower chamber에 존재하는 화학유인물질(chemoattractant)을 따라 8 um 포어를 통과하여 바닥에 부탁될 때 발생하는 임피던스를 측정하여 기록하는 방식이다. 화학유인물질로는 10% FBS를 첨가한 RPMI1640 medium에 100 ng/ml HGF(R&D systems)와 200 ng/ml Ang2를 첨가하여 사용하고, 전이억제 효능을 확인하고자 하는 항체는 1 ug/ml 농도로 upper chamber에 세포와 함께 넣고 실험하였다. 사용한 세포주는 EBC1 폐암 세포주로서 각 웰당 10000개 세포를 분주하였다. 비교를 위하여, 항체 무처리군 (Medium), 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 단독 처리군(1 ug/ml), 및 상기 참고예 2.3에서 제작된 항 Ang2 항체 10D6 단독 처리군(1 ug/ml)에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보여지는 바와 같이, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 L3-1Y-IgG2와 10D6를 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여, Ang2+HGF에 의한 이동(migration)의 억제 효과에 있어서 현저한 상승을 보였다.

실시예 7: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체에 의한 저항성 극복 효과

항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 Met 치료제에 대한 저항성 극복 가능성을 확인하기 위하여, 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2에 저항성을 가지는 난소암 세포인 SKOV3 (ATCC, HTB77)를 사용하였다. 실시예 4를 참조하여, 상기 세포 5000개에 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체 MA01를 60nM의 농도로 처리하고 6일 이후에 CellTiter Glo assay를 통해 세포수 변화를 측정하였다.

비교를 위하여, 항체 무처리군 (None), 상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 단독 처리군 (60nM), 상기 참고예 2.3에서 제작된 항 Ang2 항체 10D6 단독 처리군 (m10D6, 60nM), 및 L3-1Y/IgG2와 10D6의 병용 투여군 (60nM each )에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 보여지는 바와 같이, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 L3-1Y-IgG2와 10D6를 각각 단독으로 처리한 경우 및 이를 병용 투여한 경우와 비교하여, c-Met 치료제에 대한 저항성 극복 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00220

20091006

한국세포주연구재단

KCLRFBP00295

20130423

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody <130> DPP20143075KR <160> 195 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Ala or Val <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> X is Asn or Thr <400> 5 Arg Asn Xaa Xaa Asn Gly Xaa Thr 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> X is Ser or Thr <400> 6 Asp Asn Trp Leu Xaa Tyr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is His, Arg, Gln or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> X is His or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> X is Lys or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> X is Ser or Trp <400> 7 Lys Ser Ser Xaa Ser Leu Leu Ala Xaa Gly Asn Xaa Xaa Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> X is Ser or Pro <400> 8 Trp Xaa Ser Xaa Arg Val Xaa 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Gly, Ala or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> X is Arg, His, Ser, Ala, Gly or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> X is Leu, Tyr, Phe or Met <400> 9 Xaa Gln Ser Tyr Ser Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of AbF46 <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of AbF46 <400> 11 Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of AbF46 <400> 12 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 13 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 14 Gly Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 15 Ala Gln Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 16 Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 19 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 20 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser His Pro Phe Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 21 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 derived from H11-4 clone <400> 22 Pro Glu Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 derived from YC151 clone <400> 23 Pro Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 derived from YC193 clone <400> 24 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 derived from YC244 clone <400> 25 Arg Asn Asn Ala Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 derived from YC321 clone <400> 26 Arg Asn Lys Val Asn Gly Tyr Thr 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 derived from YC354 clone <400> 27 Asp Asn Trp Leu Ser Tyr 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 derived from YC374 clone <400> 28 Asp Asn Trp Leu Thr Tyr 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 derived from L1-1 clone <400> 29 Lys Ser Ser His Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 derived from L1-3 clone <400> 30 Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Ser Ser Gly Asn His Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 derived from L1-4 clone <400> 31 Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 derived from L1-12 clone <400> 32 Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 derived from L1-22 clone <400> 33 Lys Ser Ser His Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 derived from L2-9 clone <400> 34 Trp Ala Ser Lys Arg Val Ser 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 derived from L2-12 clone <400> 35 Trp Gly Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 derived from L2-16 clone <400> 36 Trp Gly Ser Thr Arg Val Pro 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 derived from L3-32 clone <400> 37 Gln Gln Ser Tyr Ser Lys Pro Phe Thr 1 5 <210> 38 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of heavy chain of chAbF46 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (7)..(66) <223> signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (67)..(417) <223> VH - heavy chain variable region <220> <221> misc_feature <222> (418)..(423) <223> NdeI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (418)..(1407) <223> CH - heavy chain constant region <220> <221> misc_feature <222> (1408)..(1410) <223> TGA - stop codon <220> <221> misc_feature <222> (1411)..(1416) <223> XhoI restriction site <400> 38 gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg tgaagctggt ggagtctgga ggaggcttgg tacagcctgg gggttctctg 120 agactctcct gtgcaacttc tgggttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtccgc 180 cagcctccag gaaaggcact tgagtggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300 agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360 gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 39 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of chAbF46 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 39 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 40 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H1-heavy <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 41 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H3-heavy <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 42 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H4-heavy <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 43 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H1-light <400> 43 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 44 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H2-light <400> 44 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 45 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H3-light <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 46 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H4-light <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 210 215 <210> 47 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H1-heavy <400> 47 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcact gactactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gttgggcttt attagaaaca aagctaacgg ttacaccaca 180 gaatacagtg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagataattc aaagaactca 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 48 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-heavy <400> 48 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcact gactactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gttgggcttt attagaaaca aagctaacgg ttacaccaca 180 gaatacagtg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagataattc aaagaactca 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 49 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-heavy <400> 49 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca tgagctgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcgtttc actataagca gagataattc caaaaacaca 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 50 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H1-light <400> 50 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggcaccagc agaaaccagg acagcctcct aagatgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 51 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H2-light <400> 51 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcacctgc agaagccagg gcagtctcca cagatgctga tcatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa 240 atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gccagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaagctg gagctcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 52 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-light <400> 52 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 53 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-light <400> 53 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg aaaatgctga ttatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccttctcg cttctctgga tccgggtctg ggacggattt cactctgacc 240 atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca acttattact gtcagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker between VH and VL <400> 54 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser 20 <210> 55 <211> 1088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding scFv of huAbF46 antibody <400> 55 gctagcgttt tagcagaagt tcaattggtt gaatctggtg gtggtttggt tcaaccaggt 60 ggttctttga gattgtcttg tgctgcttct ggttttactt tcaccgatta ttacatgtcc 120 tgggttagac aagctccagg taaaggtttg gaatggttgg gtttcattag aaacaaggct 180 aacggttaca ctaccgaata ttctgcttct gttaagggta gattcaccat ttctagagac 240 aactctaaga acaccttgta cttgcaaatg aactccttga gagctgaaga tactgctgtt 300 tattactgcg ctagagataa ttggtttgct tattggggtc aaggtacttt ggttactgtt 360 tcttctggcc tcgggggcct cggaggagga ggtagtggcg gaggaggctc cggtggatcc 420 agcggtgtgg gttccgatat tcaaatgacc caatctccat cttctttgtc tgcttcagtt 480 ggtgatagag ttaccattac ttgtaagtcc tcccaatctt tgttggcttc tggtaatcag 540 aacaattact tggcttggca tcaacaaaaa ccaggtaaag ctccaaagat gttgattatt 600 tgggcttcta ccagagtttc tggtgttcca tctagatttt ctggttctgg ttccggtact 660 gattttactt tgaccatttc atccttgcaa ccagaagatt tcgctactta ctactgtcaa 720 caatcttact ctgctccatt gacttttggt caaggtacaa aggtcgaaat caagagagaa 780 ttcggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgggtgg tggtggatct 840 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct caggaactga caactatatg cgagcaaatc 900 ccctcaccaa ctttagaatc gacgccgtac tctttgtcaa cgactactat tttggccaac 960 gggaaggcaa tgcaaggagt ttttgaatat tacaaatcag taacgtttgt cagtaattgc 1020 ggttctcacc cctcaacaac tagcaaaggc agccccataa acacacagta tgttttttga 1080 gtttaaac 1088 <210> 56 <211> 5597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression vector including polynucleotide encoding scFv of huAbF46 antibody <220> <221> misc_difference <222> (573)..(578) <223> NheI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (588)..(938) <223> huAbF46 VH <220> <221> misc_difference <222> (939)..(1007) <223> linker <220> <221> misc_difference <222> (1008)..(1349) <223> huAbF46 VL <220> <221> misc_difference <222> (1350)..(1355) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (1356)..(1397) <223> V5 epitope <220> <221> misc_difference <222> (1398)..(1442) <223> (G4S)3 linker <220> <221> misc_difference <222> (1443)..(1649) <223> Aga2 <220> <221> misc_difference <222> (1650)..(1652) <223> TGA(stop codon) <220> <221> misc_difference <222> (1653)..(1660) <223> PmeI restriction site <400> 56 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480 gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540 tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgctagcgt tttagcagaa gttcaattgg 600 ttgaatctgg tggtggtttg gttcaaccag gtggttcttt gagattgtct tgtgctgctt 660 ctggttttac tttcaccgat tattacatgt cctgggttag acaagctcca ggtaaaggtt 720 tggaatggtt gggtttcatt agaaacaagg ctaacggtta cactaccgaa tattctgctt 780 ctgttaaggg tagattcacc atttctagag acaactctaa gaacaccttg tacttgcaaa 840 tgaactcctt gagagctgaa gatactgctg tttattactg cgctagagat aattggtttg 900 cttattgggg tcaaggtact ttggttactg tttcttctgg cctcgggggc ctcggaggag 960 gaggtagtgg cggaggaggc tccggtggat ccagcggtgt gggttccgat attcaaatga 1020 cccaatctcc atcttctttg tctgcttcag ttggtgatag agttaccatt acttgtaagt 1080 cctcccaatc tttgttggct tctggtaatc agaacaatta cttggcttgg catcaacaaa 1140 aaccaggtaa agctccaaag atgttgatta tttgggcttc taccagagtt tctggtgttc 1200 catctagatt ttctggttct ggttccggta ctgattttac tttgaccatt tcatccttgc 1260 aaccagaaga tttcgctact tactactgtc aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3840 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 3900 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 3960 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4020 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4080 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4140 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4200 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4260 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta 4320 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4380 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4440 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4500 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4560 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4620 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgcacagtc ctacagccat ccgttctctt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 61 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 61 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtttacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 62 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 63 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 63 gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120 cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180 caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 65 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 65 gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120 cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180 caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 67 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 67 gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120 cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180 caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 69 <211> 758 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 <210> 70 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1 and human kappa constant region <400> 70 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 71 Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 72 Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro 1 5 10 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 73 Glu Glu Pro Ser Gln 1 5 <210> 74 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 75 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <400> 75 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 76 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of heavy chain of nti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (7)..(66) <223> signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (67)..(417) <223> VH - heavy chain variable region <220> <221> misc_feature <222> (418)..(423) <223> NdeI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (418)..(1407) <223> CH - heavy chain constant region <220> <221> misc_feature <222> (1408)..(1410) <223> TGA - stop codon <220> <221> misc_feature <222> (1411)..(1416) <223> XhoI restriction site <400> 76 gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg tgaagctggt ggagtctgga ggaggcttgg tacagcctgg gggttctctg 120 agactctcct gtgcaacttc tgggttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtccgc 180 cagcctccag gaaaggcact tgagtggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300 agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360 gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata acgctgatga tgaggtggac 4140 acacgaccag cctccttctg ggagacatca 4170 <210> 79 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEMA domain of c-Met <400> 79 Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro 20 25 30 Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu 50 55 60 Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val 65 70 75 80 Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val 115 120 125 Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr 130 135 140 Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln 165 170 175 Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys 180 185 190 Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val 195 200 205 Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg 210 215 220 Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu 225 230 235 240 Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu 245 250 255 Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln 260 265 270 Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly 275 280 285 Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser 290 295 300 Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys 305 310 315 320 Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro 325 330 335 Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly 340 345 350 Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu 355 360 365 Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr 370 375 380 Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly 385 390 395 400 Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro 405 410 415 Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro 420 425 430 Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly 435 440 <210> 80 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSI-IPT domain of c-Met <400> 80 Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn 1 5 10 15 Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala 20 25 30 Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser 35 40 45 Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala 50 55 60 Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe 85 90 95 Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu 100 105 110 Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro 115 120 125 Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His 130 135 140 Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr 145 150 155 160 Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr 165 170 175 Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile 180 185 190 Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu 195 200 205 Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu 210 215 220 Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu 225 230 235 240 Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Thr 245 250 255 Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Ile Val Ser Phe Leu Phe Cys Phe Ala 260 265 270 Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val 275 280 285 Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe 290 295 300 Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr 305 310 315 320 Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys 325 330 335 Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile 340 345 350 Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile 355 360 365 Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp 370 375 380 Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys 385 390 395 400 Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn 405 410 415 Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala 420 425 430 Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn 435 440 445 Phe Thr Gly 450 <210> 81 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TyrKc domain of c-Met <400> 81 Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr 1 5 10 15 His Gly Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val 20 25 30 Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu 35 40 45 Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser 50 55 60 Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu 65 70 75 80 Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr 85 90 95 His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val Ala 100 105 110 Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu 115 120 125 Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys Val Ala 130 135 140 Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val 145 150 155 160 His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Leu Glu 165 170 175 Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe 180 185 190 Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro 195 200 205 Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg 210 215 220 Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu 225 230 235 240 Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu 245 250 255 Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr 260 265 270 Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr 275 280 285 Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr 290 295 300 Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 305 310 <210> 82 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding SEMA domain of c-Met <400> 82 ctacatgagc atcacatttt ccttggtgcc actaactaca tttatgtttt aaatgaggaa 60 gaccttcaga aggttgctga gtacaagact gggcctgtgc tggaacaccc agattgtttc 120 ccatgtcagg actgcagcag caaagccaat ttatcaggag gtgtttggaa agataacatc 180 aacatggctc tagttgtcga cacctactat gatgatcaac tcattagctg tggcagcgtc 240 aacagaggga cctgccagcg acatgtcttt ccccacaatc atactgctga catacagtcg 300 gaggttcact gcatattctc cccacagata gaagagccca gccagtgtcc tgactgtgtg 360 gtgagcgccc tgggagccaa agtcctttca tctgtaaagg accggttcat caacttcttt 420 gtaggcaata ccataaattc ttcttatttc ccagatcatc cattgcattc gatatcagtg 480 agaaggctaa aggaaacgaa agatggtttt atgtttttga cggaccagtc ctacattgat 540 gttttacctg agttcagaga ttcttacccc attaagtatg tccatgcctt tgaaagcaac 600 aattttattt acttcttgac ggtccaaagg gaaactctag atgctcagac ttttcacaca 660 agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 60 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 120 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 180 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 240 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 300 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 360 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 420 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 480 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 540 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 600 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 660 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 720 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 780 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 840 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 900 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 1 5 10 <210> 87 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of monoclonal antibody AbF46 <400> 87 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asp Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 88 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti-c-Met antibody <400> 88 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 89 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 1 5 10 15 Glu <210> 90 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH1 <400> 90 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH2 <400> 91 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH3 <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 93 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH4 <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 94 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH5 <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 95 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 95 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 96 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk1 <400> 96 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 97 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk2 <400> 97 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 98 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk3 <400> 98 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 99 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk4 <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 100 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U7-HC6) <400> 100 Glu Pro Ser Cys Asp Lys His Cys Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U6-HC7) <400> 101 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U3-HC9) <400> 102 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U6-HC8) <400> 103 Glu Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U8-HC5) <400> 104 Glu Lys Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human hinge region <400> 105 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of antibody L3-11Y <400> 106 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 107 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of antibody L3-11Y <400> 107 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 108 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain of antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 109 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 109 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <400> 110 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of anti-Ang2 antibody <400> 111 Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <400> 112 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of anti-Ang2 antibody <400> 113 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <400> 114 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 115 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region <400> 115 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 116 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding heavy chain variable region <400> 116 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataaact acagtggtaa cactgactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aagctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactggggac acagccacat attactgtgc aagaggtaac 300 ttcgaaggtg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 117 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region <400> 117 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 118 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence emcoding light chain variable region <400> 118 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctaccctgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 119 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Ang2 <400> 119 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285 Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 325 330 335 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg 355 360 365 Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 <210> 120 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable region (4H10) <400> 120 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Ile Ser Phe Trp Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 121 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable region (4H10) <400> 121 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <400> 122 Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <400> 123 Lys Ile Asn Tyr Ala Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <400> 124 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val His 1 5 10 <210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <400> 125 Lys Ala Ser Gln Phe Val Ser Thr Asp Val His 1 5 10 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of anti-Ang2 antibody <400> 126 Tyr Ala Ser Ile Pro Tyr Pro 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <400> 127 Gln His Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Tyr (Y) or Lys (K) <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn (N) or Ser (S) <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> X is Ser (S) or Ala (A) <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> X is Asn (N) or Lys (K) <400> 128 Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Gly Xaa Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> X is Ser (S) or Phe (F) <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> X is Asn (N) or Thr (T) <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> X is Ala (A) or His (H) <400> 129 Lys Ala Ser Gln Xaa Val Ser Xaa Asp Val Xaa 1 5 10 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of anti-Ang2 antibody <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Asn (N) or Ile (I) <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> X is Arg (R) or Pro (P) <400> 130 Tyr Ala Ser Xaa Xaa Tyr Pro 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Gln (Q) or His (H) <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> X is Trp (W) or Phe (F) <400> 131 Gln Xaa Asp Tyr Ser Ser Pro Xaa Thr 1 5 <210> 132 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-H1 of 10D6) <400> 132 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 <210> 133 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-H1 of VH-hu1) <400> 133 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser 20 25 30 <210> 134 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-H1 of VH-hu2) <400> 134 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 <210> 135 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-H1 of VH-hu5) <400> 135 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 <210> 136 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-H1 of VH-hu3) <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 <210> 137 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-H1 and CDR-H2 of 10D6) <400> 137 Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 138 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-H1 and CDR-H2 of VH-hu1) <400> 138 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 139 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-H1 and CDR-H2 of VH-hu2) <400> 139 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 140 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-H1 and CDR-H2 of VH-hu5) <400> 140 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 141 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-H1 and CDR-H2 of VH-hu3) <400> 141 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 142 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-H2 and CDR-H3 of 10D6) <400> 142 Arg Ser Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 143 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-H2 and CDR-H3 of VH-hu1) <400> 143 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 144 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-H2 and CDR-H3 of VH-hu2) <400> 144 Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 145 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-H2 and CDR-H3 of VH-hu5) <400> 145 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 146 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-H2 and CDR-H3 of VH-hu3) <400> 146 Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 147 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-H3 of 10D6) <400> 147 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 148 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-H3 of VH-hu1) <400> 148 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-H3 of VH-hu2) <400> 149 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-H3 of VH-hu5) <400> 150 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-H3 of VH-hu3) <400> 151 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 152 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-L1 of 10D6) <400> 152 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 153 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 (N-terminal frame region of CDR-L1 of VL-hu1) <400> 153 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 154 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-L1 and CDR-L2 of 10D6) <400> 154 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 155 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 (frame region between CDR-L1 and CDR-L2 of VL-hu1) <400> 155 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 156 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-L2 and CDR-L3 of 10D6) <400> 156 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 157 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 (frame region between CDR-L2 and CDR-L3 of VL-hu1) <400> 157 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-L3 of 10D6) <400> 158 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 (C-terminal frame region of CDR-L3 of VL-hu1) <400> 159 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 160 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 160 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 161 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 161 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Lys Ile Asn Tyr Ala Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 162 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 162 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 163 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Lys Ile Asn Tyr Ala Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 164 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 164 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 165 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 165 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 166 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 166 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 167 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 167 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asp Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 168 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 168 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Phe Val Ser Thr Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 169 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 169 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ile Pro Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 170 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 170 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ile Pro Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 171 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion <400> 171 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Phe Val Ser Thr Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ile Pro Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 172 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of heavy chain variable region(SEQ ID NO: 160) <400> 172 caggtgcaac tgcaggagtc aggccccggc ctggtaaaac cttctgaaac gctctcactt 60 acctgtgccg ttagtggata ctctatcact tccgactacg cttggaattg gattcggcag 120 cctccaggca aagggctgga atggatggga aagatttcct attccggtaa gactgactac 180 aatcccagtc tgaagagcag gtcaacaatc tccagagaca ccagcaagaa tcagttttcc 240 ctgaaattgt cctcggtgac agcagcggat accgcagtgt attattgcgc ccgcggtaac 300 ttcgagggag ctatggatta ctgggggcag ggtactctcg tcactgtgag cagc 354 <210> 173 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of heavy chain variable region(SEQ ID NO: 161) <400> 173 caggtgcaac tgcaggagtc aggccccggc ctggtaaaac cttctgaaac gctctcactt 60 acctgtgccg ttagtggata ctctatcact tccgactacg cttggaattg gattcggcag 120 cctccaggca aagggctgga atggatggga aagattaact atgccggtaa cactgactac 180 aatcccagtc tgaagagcag gtcaacaatc tccagagaca ccagcaagaa tcagttttcc 240 ctgaaattgt cctcggtgac agcagcggat accgcagtgt attattgcgc ccgcggtaac 300 ttcgagggag ctatggatta ctgggggcag ggtactctcg tcactgtgag cagc 354 <210> 174 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of heavy chain variable region(SEQ ID NO: 162) <400> 174 gaggttcagc tggtcgaaag cggtggggga ctcgtgcagc caggcggttc tcttagatta 60 tcatgtgccg catccgggta ctccatcacc tctgattatg catggaactg ggtcagacaa 120 gcccccggaa agggcctgga gtggatgggg aagatctcct attcagggaa gacagattat 180 aatccttcgc tgaaaagcag atcaacaatt agtagagaca cttctaaaaa tactttttac 240 ctccagatga acagtctgcg cgccgaagac accgccgtgt actactgcgc taggggaaat 300 ttcgagggag ctatggacta ttggggccag ggcacgttgg taaccgtgag cagc 354 <210> 175 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of heavy chain variable region(SEQ ID NO: 163) <400> 175 gaggttcaac tggtagagtc cgggggcggc ctggtccagc caggaggaag cctgcggctc 60 tcttgtgccg ccagcgggta tagtatcact tcagattatg cctggaattg ggtccgccag 120 gcccccggga agggcttaga gtggatgggt aaaattaatt acgcaggcaa caccgactat 180 aatccttcac tgaaatctag atccaccatc tctagagata caagtaagaa caccttttac 240 ttgcagatga atagcctcag ggctgaagac actgctgtgt actactgcgc aagaggaaac 300 ttcgaaggag cgatggatta ttggggccag ggtacgcttg tgacagtgtc ctct 354 <210> 176 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of heavy chain variable region(SEQ ID NO: 164) <400> 176 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtta ctccatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg tacataaact acagtggtaa cactgactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gagaggtaac 300 ttcgaaggtg ctatggacta ctggggtcaa ggaacgcttg tgacagtgtc ctct 354 <210> 177 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 165) <400> 177 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 178 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 166) <400> 178 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 179 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 167) <400> 179 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcat gattatagct ctccgttcac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 180 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 168) <400> 180 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gttcgtgagt actgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 181 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 169) <400> 181 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccatcc cataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 182 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 170) <400> 182 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccatcc cataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 183 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 171) <400> 183 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gttcgtgagt actgatgtac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccatcc cataccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 184 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 185 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D6-HU1 <400> 185 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 186 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D6-HU2 <400> 186 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 187 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10D6-HU3 <400> 187 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 188 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-linker-VL (scFv) of 10D6 <400> 188 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu 130 135 140 Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 195 200 205 Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp 210 215 220 Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 <210> 189 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of VH-linker-VL (scFv) of 10D6 <400> 189 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataaact acagtggtaa cactgactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aagctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactggggac acagccacat attactgtgc aagaggtaac 300 ttcgaaggtg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcaggcggc 360 ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca gtattgtgat gacccagact 420 cccaaattcc tgcttgtatc agcaggagac agggttacca taacctgcaa ggccagtcag 480 agtgtgagta atgatgtagc ttggtaccaa cagaagccag ggcagtctcc taaactgctg 540 atatactatg catccaatcg ctaccctgga gtccctgatc gcttcactgg cagtggatat 600 gggacggatt tcactttcac catcagcact gtgcaggctg aagacctggc agtttatttc 660 tgtcagcagg attatagctc tccgtggacg ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 720 720 <210> 190 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-linker-VL (scFv) of10D6 opti-1 <400> 190 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp 210 215 220 Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 <210> 191 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of VH-linker-VL (scFv) of10D6 opti-1 <400> 191 caggtgcaac tgcaggagtc aggccccggc ctggtaaaac cttctgaaac gctctcactt 60 acctgtgccg ttagtggata ctctatcact tccgactacg cttggaattg gattcggcag 120 cctccaggca aagggctgga atggatggga aagatttcct attccggtaa gactgactac 180 aatcccagtc tgaagagcag gtcaacaatc tccagagaca ccagcaagaa tcagttttcc 240 ctgaaattgt cctcggtgac agcagcggat accgcagtgt attattgcgc ccgcggtaac 300 ttcgagggag ctatggatta ctgggggcag ggtactctcg tcactgtgag cagcggcggc 360 ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg acatccagat gacccagtct 420 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgcaa ggccagtcag 480 agtgtgagta atgatgtagc ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg 540 atctattatg catccaatcg ctaccctggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 600 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 660 tgtcagcagg attatagctc tccgtggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatcaaa 720 720 <210> 192 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable resion (Hu1-1) <400> 192 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 193 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of light chain variable region(SEQ ID NO: 192) <400> 193 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat gcatccaatc gctaccctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gattatagct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 194 <211> 710 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody <400> 194 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 465 470 475 480 Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly 485 490 495 Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro 500 505 510 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr 515 520 525 Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr 530 535 540 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 545 550 555 560 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp 565 570 575 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 580 585 590 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 595 600 605 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 610 615 620 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln 625 630 635 640 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn 645 650 655 Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 660 665 670 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 675 680 685 Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly 690 695 700 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 705 710 <210> 195 <211> 2130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence of heavy chain (SEQ ID NO: 194) <400> 195 atggaatgga gctgggtttt tctcgtaaca cttttaaatg gtatccagtg tgaggttcag 60 ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca 120 gcttctggct tcaccttcac tgattactac atgagctggg tgcgtcaggc cccgggtaag 180 ggcctggaat ggttgggttt tattagaaac aaagctaatg gttacacaac agagtacagt 240 gcatctgtga agggtcgttt cactataagc agagataatt ccaaaaacac actgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgtgc tgaggacact gccgtctatt attgtgctag agataactgg 360 tttgcttact ggggccaagg gactctggtc accgtctcct cggctagcac caagggccca 420 tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc ggccctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg 540 accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc ggcacccaga cctacacctg caacgtagat 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc 720 ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 780 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc 840 cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 900 aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc 960 gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200 gagaacaact acaagaccac gcctcccatg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380 ggcggtggtg gttccggagg cggcggatcc caggtccagc tgcaggagag tggtcctggc 1440 ctggtgaaac ccagcgaaac actgtccctg acatgcgccg tatcagggta ctctatcacc 1500 agcgattatg cttggaattg gatccggcag ccacctggaa agggattgga atggatgggc 1560 aagatttcat acagtggcaa gacagactat aacccctctc tgaaaagcag aagtaccatt 1620 tcccgcgaca cctctaagaa tcaattttct ctcaaactta gctcggttac tgccgcagac 1680 actgcagtct actattgtgc caggggcaac ttcgaggggg ctatggatta ctgggggcag 1740 ggtactctcg tgacggtgtc atccggtggt ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 1800 ggcggatcgg acatccagat gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac 1860 agagtcacca tcacttgcaa ggccagtcag agtgtgagta atgatgtagc ttggtatcag 1920 cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg atctattatg catccaatcg ctaccctggg 1980 gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt 2040 ctgcaacctg aagattttgc aacttactac tgtcagcagg attatagctc tccgtggacg 2100 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 2130

Claims

항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하거나
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 것이고,
상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 112의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3;
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 123의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 112의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3;
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 124의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3;
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 123의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 124의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3;
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 125의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3;
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 112의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 126의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3; 또는
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 124의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 126의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3
를 포함하는 것인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 109의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 111의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 112의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3
를 포함하는 것인, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 165, 166, 168, 169, 또는 170의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
161의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 165 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
서열번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 165, 168, 또는 169의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역
을 포함하는 것인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 것인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
서열번호 18 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항, 제2항, 제5항, 제7항 내지 제9항, 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항, 제2항, 제5항, 제7항 내지 제9항, 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체는 각각 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인,
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항, 제2항, 제5항, 제7항 내지 제9항, 및 제12항 중 어느 한 항의 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는, c-Met 또는 Ang2의 과발현, 신생혈관 형성, 또는 혈관 투과성 증가와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 c-Met 또는 Ang2의 과발현, 신생혈관 형성, 또는 혈관 투과성 증가와 관련된 질병은 암, 암전이, 유전성 출혈성 모세혈관 확장증, 또는 천식인, 약학적 조성물.
삭제
제15항에 있어서, Ang2를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
제1항, 제2항, 제5항, 제7항 내지 제9항, 및 제12항 중 어느 한 항의 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는, 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 정상 혈관 생성 감소와 관련된 질병은 심근경색, 협심증, 뇌경색, 뇌졸중, 버거씨병, 무혈관 괴사, 족부궤양, 또는 발기부전인 약학적 조성물.
삭제
제18항에 있어서, Ang2를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
제1항, 제2항, 제5항, 제7항 내지 제9항, 및 제12항 중 어느 한 항의 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생 또는 상처 치유용 약학적 조성물.
제21항에 있어서, Ang2를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.