JP2008111717A - 網状赤血球及び血小板測定用試薬、網状赤血球及び血小板測定用試薬キット並びに網状赤血球及び血小板測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】、網状赤血球及び血小板を、他の血球成分や血液中の夾雑物からより明確に区別して測定することができる網状赤血球及び血小板測定用試薬を提供することを課題とする。
【解決手段】網状赤血球を染色するための第１色素と、血小板を染色するための第２色素とを含有してなり、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬により、上記の課題を解決する。
【選択図】なし

Description

本発明は、網状赤血球及び血小板測定用試薬、試薬キット並びに測定方法に関する。

ヒトの血液は、赤血球、白血球及び血小板の各種血球成分を含む。このうち血小板は、直径２〜３μｍの無核の細胞であり、正常なヒトの血液中には１５万〜３５万個／μｌが存在する。
しかし、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの血小板減少症や急性白血病などの疾患に罹患すると、検体中の血小板数が減少することが知られている。一般に、血液中の血小板数が１００００個／μｌより低くなると、輸血の必要性があると判断される。したがって、血小板数を迅速にかつ正確に測定することは、臨床現場において重要である。

また、血液には網状赤血球が含まれる。網状赤血球は、骨髄中の赤芽球系細胞が脱核し、末梢血液中に放出された直後の若い赤血球である。網状赤血球は、細胞成熟過程の名残として、成熟赤血球には含まれていない少量のＲＮＡ又はリボソーム、ミトコンドリアなどの細胞小器官をその細胞内に有していることがその特徴として挙げられる。

臨床検査分野において、網状赤血球を分類計数することは、患者の骨髄内の造血状態を把握する上で極めて重要である。骨髄造血が正常である健常人においては、網状赤血球数は全赤血球の０．５〜３．０％を占めているのに対して、骨髄造血に異常をきたしている状態、例えば骨髄造血が抑制された状態では網状赤血球数は減少し、骨髄造血が亢進した状態では増加する。具体的には、再生不良性貧血、悪性腫瘍の化学療法時等では減少し、溶血性貧血等では増加する。

血液中の細胞、すなわち白血球、網状赤血球、赤血球などの血球をフローサイトメトリの原理を用いて迅速に測定する方法が、従来知られている。このような測定方法として、例えば、特開平１０−２８２０９４号（特許文献１）には、全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血小板の計数及び同定の方法、並びにその方法に用いる試薬組成物が開示されている。この特許文献１の方法では、カチオン性色素、特にオキサジン７５０を含む試薬混合物で網状赤血球を染色し、フローサイトメトリを用いて散乱光及び吸収光を測定し、これらの散乱光及び蛍光をパラメータとして網状赤血球を計数し、赤血球及び血小板と区別している。

また、特許第２６１３２５０号（特許文献２）には、赤色光を吸収する蛍光染料を含む試薬を未溶解の全血と接触させることを含む、未溶解の全血中の白血球を赤血球及び血小板から識別する方法が開示されている。赤色光を吸収する蛍光染料としてオキサジン染料を用い、これが白血球を染色するので、フローサイトメトリを用いた測定により、赤血球及び血小板から白血球を区別できることが記載されている。

さらに、特許第３４８５４３６号（特許文献３）には、少なくとも１つの網状赤血球を特異的に染色する色素と、白血球を特異的に染色する色素とからなる網状赤血球測定用試薬が開示されている。この特許文献にも、オキサジン系色素が白血球を特異的に染色できることが記載されている。

血小板の測定においては、血液中に出現する破砕赤血球や脂質などが、そのサイズが血小板と類似しているために、測定上の夾雑物として影響を与えることが知られている。特に、輸血の必要性があるような血小板数が低い検体での測定は、これらの夾雑物の影響がより大きくなる。しかしながら、上述した特許文献１〜３には、このような夾雑物の影響を抑えて、網状赤血球及び血小板をより高い精度で測定することについては記載されていない。

特開平１０−２８２０９４号公報 特許第２６１３２５０号公報 特許第３４８５４３６号公報

上記の現状に鑑み、本発明は、フローサイトメトリを用いる測定方法において、網状赤血球及び血小板を、他の血球成分や脂質粒子などの血液中の夾雑物からより明確に区別して測定することができる網状赤血球及び血小板測定用試薬を提供することを目的とする。

本発明は、網状赤血球を染色するための第１色素と、血小板を染色するための第２色素とを含有してなり、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬である。

また、本発明は、網状赤血球を染色するための第１色素を含有する第１試薬と、血小板を染色するための第２色素を含有する第２試薬とを含み、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬キットでもある。

さらに、本発明は、測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第１試薬と、網状赤血球を染色するための第１色素及び血小板を染色するための第２色素を含有する第２試薬とを含み、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬キットでもある。

本発明は、網状赤血球を染色するための第１色素と、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種である血小板を染色するための第２色素と、検体とを混合して測定用試料を調製し、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて網状赤血球及び血小板を検出する
ことを含む網状赤血球及び血小板測定方法でもある。

今回、血小板染色用として見出された特定のオキサジン色素が、血小板と脂質粒子などの夾雑物とを区別可能な程度に血小板を特異的に染色できることは、今まで知られていなかった。このオキサジン色素は、血小板を蛍光染色することにより、フローサイトメトリで測定する際に血小板の蛍光強度を強くすることができる。これにより、血小板と脂質粒子などの夾雑物とを区別することができる。
なお、本明細書において、血液中の「夾雑物」とは、網状赤血球及び血小板の測定に影響を与え得る血液中の成分のことであり、脂質粒子、破砕赤血球などを含む。

本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いることにより、血小板の検出を妨げ得る夾雑物を含む検体であっても、このような夾雑物や血液中の他の血球成分の影響を抑えて、網状赤血球及び血小板をより高い精度でかつ迅速に測定することができる。

本発明者らは、フローサイトメトリを用いる測定方法において、網状赤血球及び血小板を、他の血球成分や脂質粒子などの血液中の夾雑物からより明確に区別して測定することができる網状赤血球及び血小板測定用試薬を得るために１００種類以上の色素を用いて研究を重ねた結果、ある特定のオキサジン色素が血小板を特異的に染色できることを見出した。さらに、網状赤血球を特異的に染色できる色素を、この特定のオキサジン色素と共に含む試薬を用いることにより、網状赤血球及び血小板を、他の血球成分や血液中の夾雑物からより明確に区別することができることを見出して、本発明を完成した。本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬は、網状赤血球を染色するための第１色素を含む。該第１色素は、網状赤血球を他の血球又は夾雑物から識別可能なように染色することができる色素であればよく、核酸染色性シアニン色素が好ましい。核酸染色性シアニン色素としては、従来公知のものを用いることができ、例えば、特許第３４８５４３６号に開示される色素、特表２００１−５０６６８６号に開示される色素、特表２００３−５３２７９０号に開示される色素、米国特許第４，９５７，８７０号に開示される色素などを挙げることができる。なかでも、次の式：

（式中、Ｒ₁は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は−ＣＨ₂（ＣＨＲ₅）_xＯＲ₆であり；
Ｒ₂及びＲ₃は同一又は異なって、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アリール基またはアラルキル基であり；
Ｒ₄は、炭素数１〜６のアルキル基、−ＣＨ₂（ＣＨＲ₇）_yＯＲ₈、アリール基又はアラルキル基であり；
Ｒ₅及びＲ₇は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基であり；
Ｒ₆及びＲ₈は、それぞれ水素原子、アシル基または炭素数１〜３のアルキル基であり；
Ｚは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はＣＲ₉Ｒ₁₀であり；
Ｒ₉及びＲ₁₀は互いに同一又は異なって、それぞれ炭素数１〜３のアルキル基であり；
ｎは１又は２の整数であり；
ｘ及びｙは、それぞれ０〜３の整数であり；
Ｘ^-はアニオンである）
で表される色素が好ましく用いられる。

上記の式（Ｉ）のＲ₁における炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル及びヘキシル基が挙げられる。なかでも、メチル又はエチル基が好ましい。

上記の式（Ｉ）のＲ₂及びＲ₃で表される基は、オルト、メタ及びパラ位のいずれに置換されていてもよい。Ｒ₂及びＲ₃における炭素数１〜６のアルキル基としては、上記と同様のものを挙げることができる。炭素数１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ基などを挙げることができ、なかでもメトキシ又はエトキシ基が好ましい。アリール基としては、フェニル基などを挙げることができる。アラルキル基としては、ベンジル基などを挙げることができる。
式（Ｉ）のＲ₂及びＲ₃で表される基は、水素がより好ましい。

式（Ｉ）のＲ₄における炭素数１〜６のアルキル基、アリール基及びアラルキル基としては、上記と同様のものを挙げることができる。

Ｒ₅及びＲ₇における炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル及びヒドロキシプロピル基を挙げることができ、なかでも、ヒドロキシメチル又はヒドロキシエチル基が好ましい。

Ｒ₆及びＲ₈におけるアシル基は、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましい。そのようなアシル基としては、アセチル及びプロピオニル基が挙げられ、なかでもアセチル基が好ましい。炭素数１〜３のアルキル基としては、上記と同様のものを挙げることができる。

上記の式（Ｉ）のＺは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はＣＲ₉Ｒ₁₀であり、なかでも硫黄原子が好ましい。
上記のＲ₉及びＲ₁₀における炭素数１〜３のアルキル基は、上記と同様のものを挙げることができる。

上記の式（Ｉ）のＸ^-におけるアニオンとしては、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ₄ ^-、ＢＣｌ₄ ^-、ＢＢｒ₄ ^-など）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、フェニル環にハロゲン原子又はハロアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオンなどが挙げられる。なかでも、臭素イオン又はＢＦ₄ ^-が好ましい。

上記の式（Ｉ）の色素の例を、次に示す。

上記の式（Ｉ）の色素のうち、ｎ＝１の色素は、例えば、式：

で表される化合物と、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジンとを反応させ、その生成物に、式：

で表されるキノリン誘導体を反応させ、次いで、ホウフッ化ナトリウムと処理することにより合成することができる。
また、上記の式（Ｉ）においてｎ＝２の化合物は、上記のｎ＝１の色素を合成する反応において、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジンを用いる代わりに、例えばマロンジアルデヒド ビス（フェニルイミン）塩を用いることにより合成することができる。

なお、上記核酸染色性シアニン色素以外に、ニューメチレンブルーやオキサジン７５０といった色素も網状赤血球用の色素として知られており、これらを本発明の第１色素として使用してもよい。

上記の第１色素は、色素の種類によっても異なるが、検体と混合したときに０．１〜５０ｐｐｍとなる濃度で試薬に含まれることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ程度である。このような濃度範囲であれば、網状赤血球を、他の血球成分及び夾雑物から識別可能とすることができる。

上記の網状赤血球を染色するための色素は、本発明の試薬の組成中では網状赤血球中へ速やかに浸透し、細胞内のＲＮＡを染色することができる。

本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬は、血小板を染色するための第２色素を含む。該第２色素は、血小板を特異的に染色することができる色素であり、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である。該第２色素は、血小板を脂質粒子から識別可能に染色することができるものが好ましい。カプリブルーとしては、例えば次の式：

で表されるカプリブルーＧＯＮが挙げられる。ナイルブルーとしては、例えば次の式：

（式中、Ｘ^-はＣｌ^-又は１／２ＳＯ₄ ^2-を表す）
で表されるナイルブルーが挙げられる。ブリリアントクレシルブルーとしては、例えば次の式：

で表されるブリリアントクレシルブルーＡＬＤが挙げられる。これらの色素は、市販されており、例えば、カプリブルーＧＯＮはクロマ社から、ナイルブルーは東京化成、シグマ−アルドリッチ社から、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤはシグマ−アルドリッチ社からそれぞれ入手することができる。

また、上記の血小板を染色するための色素は、さらに血小板を破砕赤血球から識別可能に染色できることがわかった。

上記の血小板を染色するための第２色素は、色素の種類によっても異なるが、検体と混合したときに０．０１〜１０ｐｐｍとなる濃度で試薬に含まれることが好ましく、より好ましくは０．１〜２．０ｐｐｍ程度である。特に、血小板を染色するための色素としてカプリブルーＧＯＮを用いて血小板を脂質粒子や破砕赤血球から識別する場合は０．２〜３．０ｐｐｍが好ましく、０．５〜２．０ｐｐｍがより好ましい。ナイルブルーを用いて血小板を脂質粒子や破砕赤血球から識別する場合は０．１〜２．０ｐｐｍが好ましい。ブリリアントクレシルブルーＡＬＤを用いて血小板を脂質粒子や破砕赤血球から識別する場合は０．５〜３．０ｐｐｍが好ましく、１．０〜２．０ｐｐｍがより好ましい。
このような濃度範囲であれば、血小板と、他の血球成分及び夾雑物との区別がより良好になるので好ましい。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、赤血球の非特異的染色を抑制するための多価アニオンをさらに含有するのが好ましい。多価アニオンとしては、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、多価カルボン酸イオンなどが挙げられる。これらのイオンを供給し得る化合物としては、クエン酸、硫酸、リン酸、ＥＤＴＡやこれらのアルカリ金属塩が挙げられる。本発明の試薬は、多価アニオンとして、これらの１種又は２種以上を含有することができる。
上記の多価アニオンは、本発明の試薬中の全アニオン成分に占める割合が５０％以上、好ましくは７０％以上となるように試薬中に含まれていることが好ましい。
上記の多価アニオンを含有することにより、赤血球の非特異的染色を抑えることができ、網状赤血球及び血小板と、赤血球との間の識別を容易にすることができる。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有することができる。緩衝剤は、数ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度で含有され得る。緩衝剤としては、通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えばカルボン酸塩類、リン酸塩、グッドバッファー、タウリン、トリエタノールアミンなどを所望のｐＨに応じて用いることができる。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、ｐＨが６．０〜１１．０が好ましく、より好ましくは７．０〜１０．０、さらに好ましくは８．０〜９．５の範囲である。ｐＨが上記の範囲より低すぎる場合、赤血球が脆弱化して溶血しやすくなり、夾雑物である破砕赤血球の量が増加する可能性がある。また、ｐＨが上記の範囲より高すぎる場合、赤血球膜上の酸性官能基が解離してカチオン性である色素と結合しやすくなり、赤血球や破砕赤血球の非特異的染色が増加する場合がある。なお、上記の多価アニオンを供給し得る化合物が緩衝能を有する場合は、このような化合物を緩衝剤としても用いることができる。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇが好ましく、より好ましくは２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。このような範囲の浸透圧であれば、生理的浸透圧により近いので、赤血球の低張溶血などを防ぐことができる。
上記の浸透圧を保つために、本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬は、浸透圧補償剤を含有することができる。浸透圧補償剤としては、通常用いられるものを用いることができ、例えばプロピオン酸などのアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの糖類を挙げることができる。また、試薬中の全アニオン成分に占める割合が５０％未満であるならば、ＮａＣｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物やアルカリ土類金属ハロゲン化物も用いることができる。上記の浸透圧補償剤は、１種又は２種以上を用いることができる。なお、上記の多価アニオン及び緩衝剤を用いて、試薬の浸透圧を上記の範囲に調整できる場合には、浸透圧補償剤は用いなくてもよい。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、色素の細胞への透過性を促進するための染色促進剤を含むことができる。染色促進剤としては、界面活性剤などが挙げられ、特にカチオン界面活性剤が好ましい。好ましいカチオン界面活性剤は、次の式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ₁₁は炭素数８〜１２のアルキル基であり；Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基であり；Ｙ^-はアニオンである）
で表されるものである。
上記の式（ＩＩ）において、炭素数８〜１２のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよく、例えばオクチル基、デシル基、ラウリル基、セチル基、ミリスチル基などが挙げられる。
炭素数１〜６のアルキル基としては、上記の式（Ｉ）について記載したのと同様のものを挙げることができる。
Ｙ^-のアニオンとしては、臭素イオン又は塩素イオンが好ましい。

上記の式（ＩＩ）の好ましいカチオン界面活性剤は、デシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＭＴＡＢ）などが挙げられる。これらのカチオン界面活性剤は、１種又は２種以上を用いてもよい。

上記のカチオン界面活性剤は、網状赤血球及び血小板測定用試薬を検体と混合したときに、網状赤血球及び血小板の染色を促進することができ、赤血球の溶血を引き起こさない程度の濃度で本発明の試薬中に含有されるのが好ましい。そのような濃度は、カチオン界面活性剤の種類により異なるが、通常、５０〜２００００ｐｐｍ程度である。例えば、ＤＴＡＢを用いる場合、本発明の試薬中の濃度は、５００〜３０００ｐｐｍ程度が好ましい。また、例えばＬＴＡＣを用いる場合、試薬中の濃度は１００〜５００ｐｐｍ程度が好ましい。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、上記の成分以外に、例えば、２−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウム、β−フェネチルアルコールなどの防腐剤を含んでいてもよい。

網状赤血球及び血小板測定用試薬は、上記の第１色素及び第２色素、並びに任意成分である多価アニオン、緩衝剤、浸透圧補償剤、染色促進剤、防腐剤などを適切な溶媒に上記の適切な濃度で溶解することにより製造することができる。溶媒としては、これらの成分を安定に溶解することができるものであれば特に限定されず、水、水溶性有機溶媒などが挙げられる。水溶性有機溶媒としては、例えば、エタノール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール又はこれらの混液を用いることができる。
上記の各成分を溶媒に溶解する順序としては特に限定されず、任意の順序で溶解させることができる。また、上記の各成分をそれぞれ別々に適切な溶媒にあらかじめ溶解させておき、用時に各溶液を混合して使用することもできる。このような形態も、本発明の範囲内である。例えば、上記の第１色素及び第２色素が水溶液中で不安定な場合には、色素を水溶性有機溶媒に溶解しておき、使用時に他の成分を含有する水溶液と混合して使用することができる。また、第１色素と第２色素は、同一の水溶性有機溶媒に溶解することも可能であるし、別の水溶性有機溶媒に溶解することも可能である。

このようにして製造した網状赤血球及び血小板測定用試薬は、検体と混合して反応させて測定用試料を調製することにより、検体に含まれる可能性がある網状赤血球及び血小板を染色することができる。本明細書において、検体とは、生体、特にヒトを含む哺乳動物から採取した血液（全血など）、骨髄液、また、これらを緩衝液などの適当な溶液で希釈することにより得られる試料などを意味する。

網状赤血球及び血小板測定用試薬と検体との混合比（容量比）は、試薬：検体＝１００：１〜１０００：１が好ましい。また、該試薬と検体との反応温度は、２５〜５０℃程度が好ましく、より好ましくは３５〜４５℃程度であり、反応時間は、色素の種類により異なるが、１０秒〜５分程度が好ましく、より好ましくは２０秒〜２分程度、さらに好ましくは２０秒〜６０秒程度である。

次いで、上記のようにして調製した測定用試料に光を照射して、測定用試料中の細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定する。光を照射するための装置としては、フローサイトメータが好ましい。フローサイトメータを用いる場合、該測定用試料は、フローサイトメータのフローセルに導入され、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に光が照射されることとなる。
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、上記の第１及び第２色素の励起に好適な波長（例えば６００〜６８０ｎｍ付近）の光源を用いることができる。光源としては、例えば、赤半導体レーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが挙げられる。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。

上記のようなフローサイトメータにおいて光を照射することにより細胞から発せられる散乱光は、前方散乱光（受光角度０〜２０°付近）又は側方散乱光（受光角度９０°付近）のいずれでもよい。また、前方散乱光としては、前方低角散乱光（受光角度１〜５°付近）又は前方高角散乱光（受光角度６〜２０°付近）のいずれでもよい。散乱光は、細胞の大きさに関する情報を反映するパラメータであることが知られている。

上記のようなフローサイトメータにおいて光を照射することにより細胞から発せられる蛍光については、使用する色素に応じて適当な受光波長を選択することができる。

上記のようにして得られた散乱光及び蛍光に基づいて、スキャッタグラムを作成することにより、網状赤血球及び血小板と、その他の血球成分及び脂肪粒子などの夾雑物とを区別して、網状赤血球及び血小板を検出することができる。このようにして検出された網状赤血球及び血小板を計数することもできる。網状赤血球及び血小板の検出及び／又は計数には、適切な解析用ソフトウェアを用いることが好ましい。

本発明の別の観点において、上記の網状赤血球を染色するための第１色素を含有する第１試薬と、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の血小板を染色するための第２色素を含有する第２試薬とを含む、網状赤血球及び血小板測定用試薬キットが提供される。該キットは、測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第３試薬をさらに含有することができる。
該緩衝剤は、上記と同様のものを用いることができる。
これらの第１試薬、第２試薬及び第３試薬は、適切な溶媒に第１色素、第２色素及び緩衝剤をそれぞれ溶解したものであってよい。

本発明のさらに別の観点において、測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第１試薬と、網状赤血球を染色するための第１色素及びカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の血小板を染色するための第２色素を含有する第２試薬とを含む網状赤血球及び血小板測定用試薬キットが提供される。
該緩衝剤は、上記と同様のものを用いることができる。
これらの第１試薬及び第２試薬は、上記の緩衝剤、並びに第１色素及び第２色素をそれぞれ適切な溶媒に溶解したものであってよい。

上記の網状赤血球及び血小板測定用試薬キットは、本発明の測定用試薬に任意に含有され得る成分である多価アニオン、浸透圧補償剤、染色促進剤、防腐剤などをさらに含有していてもよい。これらの成分は、上記の第１試薬、第２試薬又は第３試薬に含有されていてもよいし、これら以外の試薬成分としてキットに含有されていてもよい。

網状赤血球及び血小板測定用試薬キットの各試薬と、検体とを混合することにより、測定用試料を調製することができる。本発明の測定用試薬キットの各試薬と検体とを混合する順序としては、特に限定されない。これらの混合比（容量比）は、試薬キットの各試薬の合計：検体＝１００：１〜１０００：１が好ましい。
測定用試料を調製し、散乱光及び蛍光を測定し、これらに基づいて網状赤血球及び血小板を検出する方法については、上記と同様のことが当てはまる。

本発明は、さらに、網状赤血球を染色するための第１色素と、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種である血小板を染色するための第２色素と、検体とを混合して測定用試料を調製し、
得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
検出された散乱光及び蛍光に基づいて網状赤血球及び血小板を検出する
ことを含む網状赤血球及び血小板測定方法でもある。

本発明を、以下の実施例に従ってより詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１〜１５
ここでは、様々な色素を用いて試薬を調製し、各色素の血小板染色能を確認した。試薬の組成は以下の通りである。
（１）色素液
血小板を染色するための色素 以下に記載の濃度
エチレングリコール １Ｌ
（２）希釈液
トリシン（緩衝剤） １．８ｇ
クエン酸３ナトリウム２水和物（多価アニオン） ２９ｇ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ） ０．１５ｇ
精製水 １Ｌ
（ｐＨ９．０、浸透圧２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ・Ｈ₂Ｏに調整）

血小板を染色するための色素としては、次に示す色素を次に示す濃度で用いた。括弧内には、試薬と検体とが混合された時の最終濃度を示した。これらの色素の化学式は、図１に示すとおりである。
参考例
１ カプリブルーＧＯＮ（クロマ社製） ２０．５ｐｐｍ（０．４ｐｐｍ）
２ ナイルブルークロリド（東京化成社製） ２０．５ｐｐｍ（０．４ｐｐｍ）
３ ブリリアントクレシルブルーＡＬＤ（シグマ社製） ５１．２５ｐｐｍ（１ｐｐｍ）
４ アズールＡ（シグマ社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
５ アズールＤ（シグマ社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
６ アズールＣ（シグマ社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
７ メチレンブルーＮＮＸ（シグマ社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
８ クレシルバイオレットアセテート（シグマ社製） １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
９ ベーシックグリーン５（東京化成社製） １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
１０ メチレンブルー（シグマ社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
１１ ニューメチレンブルー（Ｃｒｏｍａ社製） １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
１２ トルイジンブルー（東京化成社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
１３ オキサジン７５０（ナカライ社製） １０２．５ｐｐｍ（２ｐｐｍ）
１４ オキサジン１（Ｅｘｃｉｔｏｎ社製） １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）
１５ オキサジン４（Ｅｘｃｉｔｏｎ社製） １０２５ｐｐｍ（２０ｐｐｍ）

得られた希釈液１ｍＬをチューブに分注して４０℃の水槽で加温した。
これに、得られた色素液２０μＬ及び検体として健康なヒトの全血５μＬを添加して４０℃で２５秒間反応させ、６３３ｎｍの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、該細胞から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の血小板を測定した。

これらの測定により得られたスキャッタグラムを、図１−１、１−２及び１−３に示す。スキャッタグラム１は、縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものである。スキャッタグラム２において血小板が出現する領域を実線で示した。
図１の結果から、血小板を染色するための第２色素としてカプリブルー、ナイルブルー又はブリリアントクレシルブルーを用いる場合、他の色素を用いた場合と比べて、血小板の蛍光強度が強く、他の血球成分とより良好に区別できることがわかる。また、血液中に脂質粒子などの夾雑物が混入している場合、スキャッタグラム上では蛍光強度の低い位置に夾雑物の集団が出現することから、血小板を染色するための色素としてカプリブルー、ナイルブルー又はブリリアントクレシルブルーを用いることにより、血小板と夾雑物とを区別できることがわかる。

実施例１
ここでは、網状赤血球を染色するための第１色素及び血小板を染色するための第２色素を用いて網状赤血球及び血小板測定用試薬を調製し、網状赤血球及び血小板を測定した。試薬の組成は以下の通りである。
（１）色素液
網状赤血球を染色するための第１色素 以下に記載の濃度
血小板を染色するための第２色素 以下に記載の濃度
（２）希釈液
トリシン（緩衝剤） １．８ｇ
クエン酸３ナトリウム２水和物（多価アニオン） ２９ｇ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ） ０．１５ｇ
精製水 １Ｌ
（ｐＨ９．０、浸透圧２００ｍＯｓｍ／Ｋｇ・Ｈ₂Ｏに調整）

上記の網状赤血球を染色するための第１色素として、次の式に示す色素を用いた。第１色素は、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．５ｐｐｍ、６ｐｐｍ又は１０ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。

上記の血小板を染色するための第２色素として、カプリブルーＧＯＮ、ナイルブルークロリド及びブリリアントクレシルブルーＡＬＤを用いた。第２色素は、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が、それぞれカプリブルーＧＯＮ １ｐｐｍ、ナイルブルークロリド ０．５ｐｐｍ、及びブリリアントクレシルブルーＡＬＤ １．５ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。また、検体として健康なヒトの全血、破砕赤血球含有血液、及び脂質含有血液をそれぞれ用いた。測定は、参考例１〜１５と同様にして行った。

得られたスキャッタグラムを、図２−１、２−２及び２−３に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。スキャッタグラム１において網状赤血球が出現する領域を実線で示し、スキャッタグラム３において血小板が出現する領域を実線で示した。
比較として、色素液に血小板を染色するための第２色素を添加しない場合のスキャッタグラムも合わせて図２−１、２−２及び２−３に示す。

図２の結果から、網状赤血球を染色するための第１色素の濃度が０．５〜１０ｐｐｍの範囲において、試薬に血小板を染色するための第２色素を添加しない場合と比べて、血小板を染色するための第２に色素を含有することにより、破砕赤血球や脂質が存在していても、血小板及び網状赤血球をよりよく区別できることがわかる。

実施例２
ここでは、実施例１で用いた網状赤血球及び血小板測定用試薬において、網状赤血球を染色するための第１色素を、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．５ｐｐｍ、６ｐｐｍ又は１０ｐｐｍとなるように色素液に含有させ、血小板を染色するための第２色素を、試薬と検体とを混合した時の最終濃度がカプリブルーＧＯＮ ０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ又は２ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。また、検体は、実施例１と同様のものを用い、実施例１と同様にして測定を行った。

得られたスキャッタグラムを、図３−１、３−２及び３−３に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。スキャッタグラム１において網状赤血球が出現する領域を実線で示し、スキャッタグラム３において血小板が出現する領域を実線で示した。この結果から、実施例１で用いた網状赤血球を染色するための第１色素が０．５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍであり、カプリブルーＧＯＮが０．５〜２．０ｐｐｍである場合、夾雑物として脂質や破砕赤血球が存在しても、網状赤血球及び血小板を、夾雑物とより明確に区別できることがわかる。

実施例３
ここでは、実施例１で用いた網状赤血球及び血小板測定用試薬において、網状赤血球を染色するための第１色素を、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．５ｐｐｍ、６ｐｐｍ又は１０ｐｐｍとなるように色素液に含有させ、血小板を染色するための第２色素を、試薬と検体とを混合した時の最終濃度がナイルブルークロリド ０．１ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ又は２ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。また、検体は、実施例１と同様のものを用い、実施例１と同様にして測定を行った。

得られたスキャッタグラムを、図４−１、４−２及び４−３に示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。スキャッタグラム１において網状赤血球が出現する領域を実線で示し、スキャッタグラム３において血小板が出現する領域を実線で示した。この結果から、実施例１で用いた網状赤血球を染色するための第１色素が０．５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍであり、ナイルブルークロリドが０．５〜２．０ｐｐｍである場合、夾雑物として脂質や破砕赤血球が存在しても、網状赤血球及び血小板を、夾雑物とより明確に区別できることがわかる。

実施例４
ここでは、実施例１で用いた網状赤血球及び血小板測定用試薬において、網状赤血球を染色するための第１色素を、試薬と検体とを混合した時の最終濃度が０．５ｐｐｍ、６ｐｐｍ又は１０ｐｐｍとなるように色素液に含有させ、血小板を染色するための第２色素を、試薬と検体とを混合した時の最終濃度がブリリアントクレシルブルーＡＬＤ １ｐｐｍ、１．５ｐｐｍ又は２ｐｐｍとなるように色素液に含有させた。また、検体は、実施例１と同様のものを用い、実施例１と同様にして測定を行った。

得られたスキャッタグラムを、図５−１、５−２及び５−３に示す。これらの表において、「ＢＣＢ」はブリリアントクレシルブルーＡＬＤを示す。スキャッタグラム１は縦軸に前方散乱光強度、横軸に蛍光強度をとったものであり、スキャッタグラム２はスキャッタグラム１の縦軸をlogに変換したものであり、スキャッタグラム３はスキャッタグラム２の血小板出現領域の周辺を拡大したものである。スキャッタグラム１において網状赤血球が出現する領域を実線で示し、スキャッタグラム３において血小板が出現する領域を実線で示した。この結果から、実施例１で用いた網状赤血球を染色するための第１色素が０．５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍであり、ブリリアントクレシルブルーＡＬＤを１．０〜２．０ｐｐｍである場合、夾雑物として脂質や破砕赤血球が存在しても、網状赤血球及び血小板を、夾雑物とより明確に区別できることがわかる。

種々のオキサジン色素を含む試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 種々のオキサジン色素を含む試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 種々のオキサジン色素を含む試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのカプリブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのカプリブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのカプリブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのナイルブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのナイルブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのナイルブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのブリリアントクレシルブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのブリリアントクレシルブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。 網状赤血球を染色するための第１色素の濃度及び血小板を染色するための第２色素としてのブリリアントクレシルブルーの濃度を種々に変更した本発明の網状赤血球及び血小板測定用試薬を用いてヒトの血液を染色したときのスキャッタグラムを示す。

Claims (16)

1. 網状赤血球を染色するための第１色素と、血小板を染色するための第２色素とを含有してなり、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬。
2. 前記第１色素が、核酸染色性シアニン色素である請求項１に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
3. 前記第１色素が、次の式：
   

   

   （式中、Ｒ₁は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は−ＣＨ₂（ＣＨＲ₅）_xＯＲ₆であり；
   Ｒ₂及びＲ₃は同一又は異なって、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アリール基またはアラルキル基であり；
   Ｒ₄は、炭素数１〜６のアルキル基、−ＣＨ₂（ＣＨＲ₇）_yＯＲ₈、アリール基又はアラルキル基であり；
   Ｒ₅及びＲ₇は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基であり；
   Ｒ₆及びＲ₈は、それぞれ水素原子、アシル基または炭素数１〜３のアルキル基であり；
   Ｚは、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はＣＲ₉Ｒ₁₀であり；
   Ｒ₉及びＲ₁₀は互いに同一又は異なって、それぞれ炭素数１〜３のアルキル基であり；
   ｎは１又は２の整数であり；
   ｘ及びｙは、それぞれ０〜３の整数であり；
   Ｘ^-はアニオンである）
   で表される請求項２に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
4. 赤血球の非特異的染色を抑制するための多価アニオンをさらに含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
5. ｐＨが６．０〜１１．０である請求項１〜４のいずれか１項に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
6. 浸透圧が１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇである請求項１〜５のいずれか１項に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
7. 色素の透過性を促進するための染色促進剤を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
8. 前記染色促進剤がカチオン界面活性剤である請求項７に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
9. 前記第２色素が、血小板を脂質粒子から識別可能に染色する請求項１〜８のいずれか１項に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
10. 前記第２色素が、血小板を破砕赤血球から識別可能に染色する請求項１〜８のいずれか１項に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬。
11. 網状赤血球を染色するための第１色素を含有する第１試薬と、血小板を染色するための第２色素を含有する第２試薬とを含み、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬キット。
12. 測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第３試薬をさらに含有する請求項１１に記載の網状赤血球及び血小板測定用試薬キット。
13. 測定時のｐＨを一定に保つための緩衝剤を含有する第１試薬と、網状赤血球を染色するための第１色素及び血小板を染色するための第２色素を含有する第２試薬とを含み、該第２色素がカプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種の色素である網状赤血球及び血小板測定用試薬キット。
14. 網状赤血球を染色するための第１色素と、カプリブルー、ナイルブルー及びブリリアントクレシルブルーからなる群より選択される少なくとも１種である血小板を染色するための第２色素と、検体とを混合して測定用試料を調製し、
    得られた測定用試料中の細胞に光を照射して、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
    検出された散乱光及び蛍光に基づいて網状赤血球及び血小板を検出する
    ことを含む網状赤血球及び血小板測定方法。
15. 前記測定用試料が、フローサイトメータのフローセルに導入され、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に光が照射される請求項１４に記載の網状赤血球及び血小板測定方法。
16. 検出された網状赤血球及び血小板をさらに計数する請求項１４又は１５に記載の方法。

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