JPS6179163A - 血球測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はフローサイトメトリーを応用した血液の光学的
測定技術において使用するに好適な赤血球特に網状赤血
球、血／Ｊ％板などの血球測定用試薬に関する。

従来の技術 従来の技術としては、例えば、１９８２年６月２２日発
行の米国特許第４．５３６．０２９号明細書に示されて
いるように、アクリジンオレンジを螢光染料として用い
て全血液試料を染色しレーザ光による散乱光強度及び赤
色螢光強度信号をフローサイトメトリー装置によって検
出処理し、赤血球と血小板を弁別すると共に赤血球群か
ら網状赤血球を弁別するものがある。

上記フローサイトメトリー装置では、第２図に示すよう
に、アクリジンオレンジ螢光染料を含む染色液で染色さ
れた全血液試料がシース状のフローチャンネル３内を流
れ、光学的刺激域を大体１個ずつ通過する血球に対して
レンズ２で集光したレーザ光＃１からの光を照射してい
る。血球の通過毎に発生する散乱光は光検出器Ａ５及び
増幅器】１を経て解析装置１２に入力される。また、血
球の通過毎に発生する赤色領域の螢光はコンデンサーレ
ンズ４で集光されアバ−チャープＸ　ｃ、、ダイク。イ
ックミ、−７゜フィルター８を経て光検出器Ｂ９により
検出され、増幅された後解析装ｒＩｔ、１２に入力され
、解析に必要な波長成分のみの強度信号が測定されるの
である。

測定された散乱光強度信号と赤色螢光強度信号とは第７
図に示すような分布図にプロットされ、統計的処理によ
り血小板群による信号を除去したかたちで赤血球と網状
赤血球とが弁別される。

発明が解決しようとする問題点 正常人の赤血球は中央部が陥凹した円盤状（Ｄｉｓｃｏ
ｃｙｔｅ　）の形態をもち、このためフローサイトメト
リー装置の光学的刺激域における進入または通過の角度
によって散乱光強度が変動することが避けられない。す
なわち、散乱光強度信号のスペクトラムを描いた第６図
に示すように、赤血球と血小板とは相互に明確に区別で
きない信号領域を共有しており、散乱光強度のみの情報
では両者の弁別は不可能である。そこで、散乱光と螢光
の２つのパラメータを用いて弁別するのであるが、螢光
強度信号についても先ず第３図に見るように、通常の赤
血球群と血小板及び網状赤血球群とは交差しており、各
群の弁別は不可能である。このことは、散乱光強度信号
によって統計的に血小板群を除去した螢光強度スペクト
ラムについても、第４図に示すごとく相互の交差は殆ん
ど変らないので、螢光強度のみＫよって赤血球と網状赤
血球とを正確に弁別することはできない。

網状赤血球は、赤血球そのものの産生能力や貧血を判断
するための指標となるもので、その正確な測定は医学的
に重要なファクタを与えるものであろが、上述の如〈従
来のフローサイトメ）　ＩＪ−技術においては散乱光と
螢光の両パラメータを用いても誤差が無視し難いもので
あった。そこで、血球の通過角度の変化によって散乱光
強度に変動が生ずることを予め防止するため、ラウリル
硫酸ナトリウム塩なとアニオン系界面活性剤を用いて赤
血球を球状化する試みがなされた。

しかしながら、フローサイトメトリー装置によって網状
赤血球群を測定する場合、通常あ赤血球群との螢光強度
差を観測するためにアクリジンオレンジ、ビロニンＧな
どの塩基性螢光色素を含む染色液で血液細胞全体を染色
する必要がある、塩基性螢光色素を含む染色液にアニオ
ン系界面活性剤を添加し、た場合、この活性剤は色素及
び血球に作用して、染色液中及び一旦は染色された血球
中での色素の析出をひき起こすだけでなく、血球そのも
のの染色な抑止する状態をひき起こし、このため従来の
染色液によっては、染色された赤血球群、網状赤血球群
を明確に染色しそれぞれの正確な測定を可能にすること
ができなかった。

問題点を解決するための手段 本発明は、上記の問題点を解決し、全血液試料中のすべ
ての血球細胞すなわち、網状赤血球群、赤血球群、白血
球群。血小板群のそれぞれの細胞容積と染色感度を正確
に反映しかつ染色と光散乱に寄与する細胞容積を維持し
ながらフローサイトメトリー装置を用いてこれらすべて
の血液細胞群についてその種類別の正確な測定を可能な
らしめるものである。そのために本発明は、赤血球を球
状化するための球状化剤としてカチオン性または非イオ
ン性界面活性剤と、球状化した血球の形態を保持させる
ための固定剤と、血球を染色するための塩基性螢光色素
と、溶液全体を等張にするための緩衝剤とを含有する水
溶液から成ろ血球測定用試薬を提供する。

上記球状化剤のうちカチオン性界面活性剤としては一般
式 で表わされるものが用いられる。ここに、Ｒ８は炭素数
１０〜１６のアルキル基、Ｒｔ　、Ｒｓ　−Ｒ４は−Ｈ
１−ＣＨｓ−−Ｃｔ＆などの低級アルキル基、Ｘは塩素
、臭素などのハロゲンであってよい。

また、非イオン性界面活性剤としては一般式％式％ で表わされるもの（ここに、　Ｒ，は炭素数８〜１８の
アルキル基、ｎは８〜１８）または一般で表わされるも
の（ここに、Ｒｔは炭素数８〜１２のアルキル基、ｎは
８〜１８）が用いられる。

固定剤は、球状化剤えよる赤血球の最終的な溶血を防止
するものとしてグルタルアルデヒド。

ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどが用いら
れ、その用量は上記球状化剤による血球の球状化を阻害
せず形状保持に適した量すなわち、試薬１リツトル中に
０．３〜６グラムが好適である。

゛　網状赤血球を含む赤血球を螢光染色するためノ色素
としてフラボホスフィン−Ｒ，コリホスフィン−０，４
＋４’ジエチルアミノスチリル÷Ｎ−メチルピリジニウ
ムアイオダイド、アクリジンオレンジ、ピロニンＧなど
の塩基性螢光色素を用いる。

さらに、球状化した血球を安定化するために塩化ナトリ
ウム等のアルカリ金属塩を添加して染色液試薬の浸透圧
を等張とする。これと共にすべての血液細胞を効率よく
染色するために緩衝剤として水酸化ナトリウム等を添加
し、溶液のＰＨを６〜１１に保たせる。

上述した組成分を含有する等張ｇ：苦塩基性染料溶液は
抗凝固性全血液試料と混合するための血球測定用試薬と
なる。

作　　　　用 以上の措成による血球測定用試薬を抗凝固性全血液試料
に混合すると、その組成中のカチオン性界面活性剤また
は非イオン性界面活性剤は赤血球及び網状赤血球を効率
よく球状化し、塩基性螢光色素の血球に対する染色作用
を殆んど阻害することがない。

また、アルデヒドを中心とする固定剤は、血球の球状化
を阻害しない適ｔ）を用いれば、球状化剤の血球に対す
る溶血作用を防いで、球状化した血球の形態を長期ＩＩ
Ｉ安定に保つはたらきをする。こうした球状化剤の使用
により、赤血球は完全に球状化し、フローサイトメトリ
ー装Ｔ内の光学的刺激域への進入角贋または通過時の光
束との対向面の差に依存した散乱光の強度変化は解消す
る。すなわち、光検出器で受光される個々の血球からの
散乱光強度は、個々の血球の大きさく容積）を正確に反
映するものとなり、血小板と赤血球との散乱光強度の分
布は、両者のピークが比較的接近しているだけでなく赤
血球のピークが不明瞭にしか表われないため明確に分離
し難かった従来の場合（第６図参照”）Ｋ。

比し、第５図に見るごとく極めて明確に分離することが
でき、赤血球群と血小板群とは本発明試薬により事実上
散乱光強度のみによって弁別することも可能である。さ
らにまた、本発明による試薬を使用した場合の赤血球群
の弁別域は、第１図に見るごとく、球状に縮小して網状
赤血球群の弁別域と通常の赤血球群との弁別域との間も
明確に区別しやすくなっている点で、従来の第７図に示
す全体的に散開し弁別がしにくい状況と比べて、顕著な
差異をなすことが理解される筈である。

実　　施　　例 （１）　　ミリスチルトリメチルアンモニウムプロミド
５　ｍｇｒ、グルタルアルデヒド１　ｙｒ＋　　フラボ
ホスフィン−Ｒ３０ｍ９ｒ、リン酸ｉ　ｇｒ　を水１リ
ットルに溶解し水酸化す）　ＩＪウム溶液を添加してｐ
Ｈ８，０に調整しさらに塩化ナトリウムを添加し浸透圧
を２８０±１０　ｍ　Ｏｚｍ　／　Ｊ　　に調整して血
球測定用試薬を調製した。

上記試薬５００に対し抗凝固性全血液試料１の比率で混
合して血球の球状化及び螢光染色を完全かつ短時間で行
うことができた、 （２）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド
７−５　ｒｎｇ”　＊グルタルアルデヒド０．３ｑｙ。

アクリジンオレンジｌ　Ｑ　ｍｇｒ　、リン０１ｙγを
水１リットルに溶解し水散化ナトリウムでＰ）Ｉ７．０
に調整すると共に塩化ナトリウムで２８０±Ｉ　Ｑ　ｒ
ｎ　Ｏｓｍ　７ｋｇの浸透圧に調整して試薬とした、 （３）　　ミリスチルトリメチルアンモニウムプロミド
３　ｍｇｒ　、ホルムアルデヒド２１１．４÷４′ジエ
チルアミノスチリル＋Ｎ−メチルピリジニウムアイオダ
イド１０扉ダ丁、リン酸１１τを水１リットルに！解し
水酸化ナトリウムでｐＨ８５に調整すると共に塩化ナト
リウムを添加し浸透圧を２８０±１Ｑ　ｒＪＬＯｓｍ　
／　ｋｇ　　の試薬を調製した。

（４）　　ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテ
ル（ノニオンＮＳ−２１０，日本油脂製）３　Ｑ　ｍｇ
ｒ　、ホ／Ｉ／Ａアルデヒド３　！１−　、　４　＋　
４’ジメチルアミノスチリル＋Ｎ−メチルピリジニウム
アイオダイド３０ｍｇｒ、リン酸１ｙｒ　を水１リット
ルに溶解し水酸化ナトリウムでｐＨ１０，０に調整する
と共に塩化す）　ＩＪウムを添加して浸透圧２８０±１
Ｑｍｏｚｍ／に９　の試薬を調製した。

（Ｔｒｉｔｏｎ　−Ｘ　１００）　５０　ｍ、’ｌ”　
、　　グルタルアルデしド０．３ｙｙ、；ｙラボホスフ
ィ７−　Ｒ４０Ｆ’ＬＰ　。

リンＤ１ｙｒ　を水１リットルに溶解し水酸化ナトリウ
ムを添加してｐＨ８，５に調整すると共に塩化す）　Ｉ
Ｊウムを添加して浸透圧２８０±１゜ｍ０５ｍ／ゆ　の
試薬を調製した。

発明の効果 以上のような構成によれば、本発明試薬をフローサイト
メトリー装置に流す血液サンプルに使用すると、先ず赤
血球群と血小板との弁別が散乱光強度のみによって極め
て明確に実行できる（第５図参照）ので、これらの個別
計数が散乱光ファクターのみで可能となった。また、カ
チオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤が球状化剤
として用いられるため塩基性螢光色素の血球に対する染
色が完全に効率よく行われ、こうした良好な染色状態で
網状赤血球も球状化する結果、通常の赤血球との峻別も
正確かつ簡略な解析を通じてなし得ることとなり、血液
検査による診断等の精度の格段の向上を実現し得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明試薬を使用してフローサイトメトリー装
置ＶＣより測定した散乱光強度−螢光強度分布図、第２
図はフローサイトメトリー装置の基本構成図、第３図は
染色された血球の螢光強度分布図で血小板を分離する前
のもの、第４図は第３図と同様の分布図であるが血小板
を分離後のもの、第５図は本発明試薬を使用して散乱光
強度分布を描いた図であって赤血球群の示す散乱光強度
が鋭いピークをなすため血小板群との峻別が可能となる
ことを示し、第６図は従来の試薬による散乱光強度分布
図であって第５図と比較すると両者の差異が明らかなこ
とを示【７、第７図は従来の試薬による散乱光強度−螢
光強度分布図を示す。 特許出願人　東亜医用電子株式会社 （外５名） 襄／Ｉ２］ 尾２図 菓３図 算、４１’２］ 葬、５　凹 斂記売先多 算、ろ図 散乱光弛多

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カチオン性または非イオン性界面活性剤からなる球
   状化剤と、固定剤と、塩基性螢光色素とを含有する水溶
   液から成ることを特徴とする血球測定用試薬。 ２、前記球状化剤が一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿１：炭素数１０〜１６のアルキル基、Ｒ
   ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿４：−Ｈあるいは−ＣＨ＿３、−Ｃ
   ＿２Ｈ＿５等の低級アルキル基、Ｘ：ハロゲン）で表わ
   されるカチオン性界面活性剤であることを特徴とする特
   許請求の範囲１記載の血球測定用試薬。 ３、前記球状化剤が一般式 Ｒ＿１−〔ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２〕−＿ｎＯＨ（ただし、
   Ｒ＿１：炭素数８〜１８のアルキル基、ｎ＝８〜１８）
   で表わされる非イオン性界面活性剤であることを特徴と
   する特許請求の範囲１記載の血球測定用試薬。 ４、前記球状化剤が一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、Ｒ＿２：炭素数８〜１２のアルキル基、ｎ＝
   ８〜１８）で表わされる非イオン性界面活性剤であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲１記載の血球測定用試薬
   。