JPH09104683A - 新規化合物とその用途 - Google Patents
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Abstract
R3 は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基;R4 は水素原子、アシル基又は低級アルキル基;R
5 は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基;
Zは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換され
た炭素原子;nは1又は2;X- はアニオンである)で
表される化合物。 【効果】 網状赤血球測定技術の低価格化、つまり装置
における低価格化、光源としての小型赤色半導体レーザ
ーの使用等を実現するとともに、赤色波長を用いて網状
赤血球を精度よく測定することが可能となる。
Description
用途に関する。より詳細には、臨床検査分野における網
状赤血球及び網状赤血球成熟指数測定用のための蛍光色
素として使用可能な新規化合物、該化合物を含む試薬及
び網状赤血球の測定方法に関する。
血球は、骨髄中で造血幹細胞から分化成熟した赤芽球系
細胞が脱核し、骨髄から抹消血液中に放出された直後の
若い赤血球であり、細胞分化成熟のなごりとして、その
網状赤血球中に成熟赤血球に含まれない少量のRNA、
リボソームあるいはミトコンドリアなどの細胞内小器官
が残存している。
計数することは、患者の骨髄での造血状態を把握するう
えで極めて重要な検査である。例えば、正常な人の網状
赤血球は全赤血球の0.5〜2.0%を占めているのに
対し、骨髄造血が抑制された状態では減少し、骨髄造血
が亢進した状態では増加する。具体的には、再生不良性
貧血、悪性腫瘍の化学療法時等では網状赤血球は減少
し、溶血性貧血などでは増加する。
赤血球を測定するために、ニューメチレンブルー(NM
B)、ブリリアントクレシルブルー(BCB)などの塩
基性色素を含有する染色液と血液試料とを混合すること
によって、網状赤血球中に含まれる上記残存物質を網状
に析出させ、個々の細胞を顕微鏡で観察して、成熟赤血
球と網状赤血球とに弁別し、計数する方法(用手法)が
ある。
を分類する方法が、ハイルマイヤー分類として知られて
おり、骨髄の造血動態を把握する上で極めて有用であ
る。しかしながら、上述の用手法は、試料作製操作が
煩雑であり、細胞判別の検査技師間に差が生じ、細
胞計測数が少ないために統計学的誤差が大きくなってし
まう等の問題が知られている。
あることから、有用な診断情報を与えるにも関わらず、
ほとんど行われていないのが現状である。これらの問題
を解決するために、上述の塩基性色素の代わりに、網状
赤血球中に含まれるRNAを特異的に染色する蛍光性の
塩基性色素で網状赤血球を染色し、フローサイトメータ
ーで細胞の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定すること
により、主に蛍光強度の差に基づいて赤血球と網状赤血
球を弁別し、網状赤血球を分類計数する方法が提案され
ている。
質的に30秒以内で網状赤血球を染色可能なオーラミン
Oが良く使用されている。また、オーラミンOを用いた
網状赤血球測定用の試薬及び全自動測定装置は、各々東
亜医用電子株式会社よりレットサーチ、Rシリーズ(R
−1000、R−2000、R−3000)として販売
されているものを使用することができる。このような測
定装置を用いることにより、試料調製からデータ出力ま
での全工程を自動的に、簡便、かつ測定者による差がな
く、上述の統計学的誤差も低減され、精度の高い測定が
実現される。
球中に残存するRNA量と比例する、すなわち網状赤血
球の成熟度に反比例することが知られており、蛍光強度
によってRMI(Reticulocyte Maturation Index :網
状赤血球成熟指数)を算出することも可能である。例え
ば、図10に、上述のRシリーズの測定装置で網状赤血
球を測定した場合のスキャッタグラムを示す。図10に
おいては、網状赤血球のうち蛍光強度の低いものすなわ
ちRNA量が少なく、成熟度の高いものからLFR、M
FR、HFRの3つに分画されている。このように、R
MIを測定することにより、ハイルマイヤー分類に類似
した診断情報を得ることができ、特に、最も若い網状赤
血球(HFR)の比率は、骨髄造血能を鋭敏に示す指標
として有用であることが知られていることから、例え
ば、骨髄移植後あるいは化学療法後の骨髄造血能の回復
の指標として有用である。
ー法は、極めて有用な方法であるにも関わらず、蛍光色
素の蛍光を励起するための光源として、非常に高価なア
ルゴンレーザを必要とするため、装置が非常に高価で、
大きなものになってしまうという問題があった。また、
フローサイトメーター法に使用することができる蛍光色
素としては、オーラミンO以外にも、チアゾールオレン
ジ、エチジウムブロマイドなどがあるが、これらの色素
では、網状赤血球を染色するために5分以上の染色時間
が必要となる。特にチアゾールオレンジでは、60分の
染色時間が必要であることが LeeL.G. et al:cytometr
y;7:508-517(1986)に報告されている。このため、試料
調製を自動化することは困難であり、結局、試料調製を
人手に頼らざるを得ないため、省力化の観点から問題が
あるのみならず、その手技あるいは作製者の違いによっ
て測定データがばらつき、同一試料を複数の施設で測定
した場合に、施設間で測定データが一致しないという問
題が生じる。特に、網状赤血球の成熟指数(RMI)は
施設間で大きなータの乖離があることが Davis B. H.ら
によって AmJ Pathol Vol. 102, (4), 468-477 に報告
されている。
レーザ、色素としてオキサジン750を用いて散乱光強
度と吸光度あるいは蛍光強度を測定することによって網
状赤血球測定を行うフローサイトメーター法が米国特許
第5,360,739 号に開示されている。また、この方法とは
別に、WO94/271,46 号公報には、赤血球をNMBで染色
した後に血球を溶血し、レチカラムの析出した網状赤血
球と赤血球とを、主に散乱光強度で弁別する方法が記載
されている。
時間がかかり、特にWO94/271,46 号公報では、試料調製
が2ステップと煩雑であるため自動化装置に適さないば
かりか、網状赤血球のRNAを特異的に検出するのでは
ないため、赤血球の散乱光の影響を受け易いといった種
々の問題がある。さらに、これらの方法においては、網
状赤血球成熟指数に関しては全く開示がない。
であるRNAと特異的に結合して蛍光強度を増加する色
素が特公昭63−61622号公報、米国特許第 4,95
7,870号に開示されているが、これらには、従来のアル
ゴンレーザを光源とするフローサイトメーターで測定す
る方法が示されているのみで、励起光源として赤色領域
の波長の光源を用いた網状赤血球計数方法、網状赤血球
成熟指数測定法及び試薬は全く開示されていない。
Aと色素との被結合恒数、色素の浸透速度等は色素によ
って異なり、どのような条件のもとで網状赤血球の測定
が可能か予見することは不可能であることが明確に記載
されている。以上のように、これまで、安価で小型の光
源を用いることによって、迅速かつ正確に網状赤血球及
び成熟指数を測定するという全ての利点を兼ね備えた網
状赤血球測定用の試薬及びその測定方法は存在していな
い。従って、本発明は網状赤血球測定技術の低価格化、
つまり装置における低価格化、光源としての小型赤色半
導体レーザーの使用等を実現すべく、赤色波長を用いて
網状赤血球を精度よく測定することができる新規な化合
物とその用途である網状赤血球測定用の試薬及びその測
定方法を提供することを目的としている。
(I)
基;R2 及びR3 は水素原子、低級アルキル基又は低級
アルコキシ基;R4 は水素原子、アシル基又は低級アル
キル基;R5 は水素原子、置換されていてもよい低級ア
ルキル基;Zは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基
が置換された炭素原子;nは1又は2;X- はアニオン
である)で表される新規な化合物が提供される。
赤血球の非特異染色を抑制するための多価アニオンと、
緩衝剤とからなる網状赤血球染色用試薬が提供される。
さらに、(i) 上記網状赤血球染色用試薬と血液学的試料
とを混合することによって測定試料を調製し、(ii)前記
測定用試料を、赤色波長の光源を有するフローサイトメ
ータの流体系に導入し、(iii) シースフローの中を流れ
る血液学的試料の細胞に赤色波長の光を照射し、(iv)細
胞から発する散乱光と蛍光とを測定し、(v) 散乱光強度
あるいは散乱光強度と蛍光強度とによって血小板と赤血
球系細胞とを弁別し、(vi)蛍光強度あるいは蛍光強度と
散乱光強度によって赤血球、網状赤血球及び白血球を弁
別し、(vii) 血小板、赤血球、網状赤血球及び白血球を
分類計数して細胞数及び細胞比率を算出する網状赤血球
測定方法が提供される。
網状赤血球を染色し、赤色波長の光で励起可能な化合物
であり、蛍光色素として使用することができる。式
(I)のR1 における低級アルキル基とは、炭素数1〜
6の直鎖又は分枝のアルキル基を意味し、例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、sec−
ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙
げられ、中でもメチル基、エチル基が好ましい。
記と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数1
〜6のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エト
キシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ、エト
キシが好ましい。なお、R2及びR3 は、水素原子であ
ることがより好ましい。R4 におけるアシル基とは、脂
肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例
えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもア
セチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同
様である。
であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、1
〜3個の水酸基、ハロゲン原子(例、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素)等で置換されていてもよい低級アルキル基
を示し、なかでも、1個の水酸基で置換されたメチル
基、エチル基が好ましい。Zにおける低級アルキル基と
は上記と同様であり、Zとしては硫黄原子であることが
好ましい。
(フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン)、ハロゲン化
ホウ素イオン(BF4 - 、BCl4 - 、BBr
4 - 等)、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、
フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロ
ゲンあるいはハロゲンを持つアルキル基を置換基として
有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられ
る。中でも、臭素イオン又はBF4 - が好ましい。
示す。
は、例えば、式(II)
ムアミジンとを反応させ、その生成物に式(III)
いで、ホウフッ化ナトリウムと処理することにより得る
ことができる。また、式(I)の化合物のうち、n=2
の化合物は、上記反応で、N,N−ジ置換ホルムアミジ
ンを用いる代わりに、例えば、マロンアルデヒド ビス
(フェニルイミン)塩を反応させることによって得るこ
とができる。
子内に水酸基、ヒドロキシエチル基、アセチル基等の極
性官能基が導入されることによって、化合物の極性が高
くなる。この結果、極性の低い赤血球細胞膜脂質二重層
又はヘモグロビンの疎水領域に対する結合能が低下し、
よって赤血球の非特異染色が抑制されるものと考えられ
る。
網状赤血球を染色するのに十分な量であり、色素の種
類、試薬組成によって適宜調整することができる。例え
ば0.1〜100mg/リットル程度、より好ましくは
0.3〜30mg/リットルである。色素濃度が100
mg/リットルを超えた場合、色素にもよるが、一般的
に赤血球の非特異蛍光が増加し、赤血球と網状赤血球と
の弁別が困難になり好ましくない。また、色素濃度が
0.1mg/リットルより低い場合、使用することは不
可能ではないが、色素の容器壁面等への吸着又は分解
等、色素濃度の減少が発生し易くなり、好ましくない。
合物(色素)の他に、赤血球の非特異染色を抑制するた
めの多価アニオンの塩類と、pHを保つための緩衝剤と
からなり、生理学的浸透圧(例えば、150〜600mO
sm/kg 程度)を有するように調整されている。本願出願
人は、染色液組成の検討において、一般に使用されてい
る染色液中の浸透圧補償剤の主成分がNaCl(特にCl- )
の場合、赤血球の非特異蛍光が大きく、かつ、網状赤血
球の特異蛍光が小さく、結果として赤血球と網状赤血球
との弁別が困難になることを見いだした。また、一方
で、染色液中のCl- を多価アニオンに置換した場合に
は、著しく赤血球の非特異染色が抑制され、赤血球と網
状赤血球との弁別が容易になることを見いだした。従っ
て、本発明の試薬には、多価アニオンの塩類を含有させ
た。この目的に使用できる多価アニオンとしては、クエ
ン酸及びEDTA等の多価カルボン酸イオン、燐酸及び
硫酸イオン、炭酸イオン等が特に好適であり、多価アニ
オンの含有濃度は、試薬中の全アニオン成分に占める割
合が50%以上、好ましくは70%以上である。作用機
序は明確ではないが、上記の範囲内で特異蛍光を増加す
る作用を有する。なお、多価アニオンの対イオンとして
は特に限定されるものではないが、アルカリ金属イオン
が好ましい。
安定した染色結果を得るために、pHを一定に保つため
のもので、通常、数mM〜100mM程度の濃度が使用
される。緩衝剤の種類としては、通常使用されるもので
あれば特に限定されるものではなく、例えば、カルボン
酸類、燐酸、グッド緩衝剤、タウリン、トリエタノール
アミン等、好適なpHに応じて適宜選択することができ
る。好適なpHは色素によって異なるが、通常6.0〜
11.0の範囲、より好ましくは7.0〜10.0、さ
らに好ましくは8.0〜9.5の範囲である。pHが
6.0よりも低すぎる場合又は11.0よりも高すぎる
場合は、赤血球が溶血し易くなり、正確な測定ができな
くなるため好ましくない。さらに、pHが高すぎる場合
には、赤血球細胞膜上のアニオン基が解離することとな
り、カチオン性である色素と結合し易くなるため赤血球
の非特異蛍光が増加し、赤血球と網状赤血球との弁別が
困難になる傾向があり好ましくない。なお、上述の多価
アニオンが、試薬中のpHを適当な範囲に調整すること
ができる場合には、緩衝剤として兼ねることができる。
を防ぐために浸透圧が生理学的浸透圧に調整されている
ことが好ましい。赤血球の低張溶血を防止するために
は、通常150mOsm/kg以上の浸透圧があれば良い。
浸透圧が高すぎる場合には、特に弊害は認められない
が、通常600mOsm/kg程度までに調整される。浸透
圧を上記範囲に調整するためには、浸透圧補償剤を含有
することができる。浸透圧補償剤としては、例えば、プ
ロピオン酸等の有機酸のアルカリ金属塩、グルコース、
マンノース等の糖類が好適に使用される。また、試薬中
の全アニオン成分に占める割合が50%未満であれば、
塩化ナトリウムのようなアルカリ金属ハロゲン化物やア
ルカリ土類金属ハロゲン化物も使用できる。なお、上述
の多価アニオンが、試薬中の浸透圧を適当な範囲に調整
することができる場合には、さらに浸透圧補償剤を含有
させる必要はない。
剤としてカチオン性界面活性剤を含むことができる。カ
チオン性界面活性剤としては、以下の構造の化合物
基、R7 、R8 及びR9 は低級アルキル基、Xはハロゲ
ンから選ばれた少なくとも1つである)が挙げられる。
R6 における炭素数8〜12のアルキル基としては、直
鎖又は分枝のアルキル基が包含され、例えば、オクチル
基、デシル基、ラウリル基等が挙げられる。なかでも、
オクチル基、デキル基等が好ましい。
基としては、炭素数1〜6の直鎖又は分枝のアルキル基
が挙げられるが、なかでもメチル、エチル、プロピル基
が好ましい。ハロゲンとしてはフッ素、塩素、臭素、ヨ
ウ素が挙げられる。カチオン性界面活性剤の具体例とし
ては、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド(O
TAB)、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド
(DTAB)又はラウリルトリメチルアンモニウムクロ
ライド(LTAC)が挙げられる。
使用量は、例えばOTABで3000〜20000mg/
リットル、DATBで500〜3000mg/リットル、
LTACで50〜250mg/リットルが好ましく、総炭
素数が増えるごとに少量で有効となる。染色促進剤を多
量に使用すると、赤血球を溶血するため好ましくない。
カチオン性界面活性剤の作用機序は明確ではないが、赤
血球細胞膜の色素透過性を亢進するものと考えられる。
さらに、カチオン性界面活性剤は、赤血球細胞を球状化
するため、赤血球集団の前方散乱光強度分布を収束させ
る作用がある。この結果、血小板と赤血球系細胞との弁
別を容易にする。また、予期せぬことに、例えば、鉄欠
乏症貧血などの小球性赤血球症の治療の結果出現する正
球性赤血球と疾患由来の小球性赤血球とを弁別すること
ができる。
量出現する楕円赤血球を検出することもできる。このよ
うに、前方散乱光強度分布を収束させることにより、網
状赤血球を測定すると同時に、小球性赤血球や楕円赤血
球等の形態以上を赤血球を検出することができる。本発
明の試薬は、上述の構成要素以外にも、例えば、2−ピ
リジルチオ−1−オキシドナトリウム、β−フェネチル
アルコールなどの防腐剤を含有させることができる。
定な場合には、化合物を適当な非水溶媒、例えば、エタ
ノール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール等
に溶解して保存し、使用時に他の成分を含有する水溶液
と混合して使用することができる。本発明の試薬を用い
てフローサイトメーターで網状赤血球を測定するには、
まず、工程(i) において、上記網状赤血球測定試薬と血
液学的試料とを混合して測定用試料を調製する。ここ
で、血液学的試料とは、測定対象となる血液成分を含有
する試料の全てを包含するが、例えば、抗凝固剤処理し
た抹消血液あるいは骨髄液等を意味する。測定試料の調
製にあたって、網状赤血球測定試薬と血液学的試料とを
100:1〜1000:1の混合比で混合し、反応させ
ることが好ましい。この際の反応温度は25〜50℃程
度が好ましく、さらに好ましくは35〜45℃である。
また、反応時間は、試薬中に含まれる色素によって多少
異なるが、10秒〜5分程度が好ましく、より好ましく
は20秒〜2分程度、さらに好ましくは20秒〜60秒
程度である。
測定用試料を、赤色波長の光源を有するフローサイトメ
ータの流体系に導入する。本発明で使用することができ
る赤色波長の光源としては、使用する色素の励起波長付
近の赤色波長の光、例えば600〜680nm程度の光
を発する光源であれば特に限定されるものではなく、例
えばHe−Neレーザ、赤色領域の半導体レーザ等を挙
げることができる。これらの赤色波長の光源を有するフ
ローサイトメーターの光学部分を図9に示す。半導体レ
ーザーの前方に集光レンズ系を介してフローセルが配置
しており、フローセルの前方にビームストッパーを介し
て前方散乱光用受光レンズ及びフォトダイオードが配置
している。また、フローセルの側方には側方蛍光用の受
光レンズを介してバンドパスフィルタ及び光電子増倍管
が配置されている。なお、流体部、データ処理部等の他
の装置構成部は、公知の構成、例えばR2000等を改
良して用いることができる。
ーの中を流れる細胞に上述した赤色波長の光源を用いて
赤色波長の光を照射し、工程(iv)において、細胞から発
する散乱光と蛍光とを測定する。この場合の散乱光は、
前方散乱光又は側方散乱光のいずれでもよく、前方散乱
光は、前方高角散乱光(6〜20°)又は前方低角散乱
光(1〜5°)のいずれでもよい。ここで、散乱光は、
細胞の大きさ情報を反映するパラメータとなる。なお、
細胞の大きさ情報を測定する方法としては、他に電気抵
抗信号があげられ、必要に応じてこの電気抵抗信号を測
定する手法を組み合わせてもよい。
散乱光強度と蛍光強度とによって血小板と赤血球系細胞
とを弁別し、工程(vi)において、蛍光強度あるいは蛍光
強度と散乱光強度によって赤血球、網状赤血球及び白血
球を弁別し、工程(vii) において、各々の細胞を分類計
数して細胞数及び細胞比率を算出する。
タンスルホン酸(2,3-Dimethylbenzothiazolium methan
esulfate)6.0g(1当量)とN,N-ジフェニル ホル
ムアミジン(N,N-Diphenyl formamidine)12.8g
(3当量)とを酢酸12ml中で、90℃の油浴上で
1.5時間加熱撹拌した。反応液をヘキサン1.8リッ
トルにあけ、赤色油状物をさらにヘキサン1.5リット
ルで懸濁洗浄し、酢酸を除いた。粗精製物を酢酸エチル
−ヘキサンで再結晶した。収量4.0g(48%)。こ
れに1−(2−ヒドロキシ)エチル レピジニウム ブ
ロマイド3.1g(1当量)とピリジン80mlを加
え、90℃の油浴上で1.5時間加熱撹拌する。反応液
にホウフッ化ナトリウム1.27g(1.1当量)をD
MF9mlに溶解したものを加え、さらに15分間加熱
撹拌した後、反応液を酢酸エチル2リットルにあけ、生
じた沈澱を濾取する。収量5.0g(100%)。濃暗
紫色粉末を得た。
チレン) Rf=0.21 H−NMR(DMSO−d6):δppm(TMS) 3.73(s,3H), 3.82(t,2H), 4.64(t,2H), 5.10(s,1H), 6.
45(d,1H), 7.10(d,1H),7.31(t,1H), 7.50-8.51(m,10H) IR(cm-1):1625,1560,1520,1490,1450,1400,132
0,1260,1220,1150,760 MASS(FAB positive): m/z=361 HPLC 95.9% (MeOH-35%SDSaq.soln. =80:20) 吸収極大:627nm(メタノール)
ム メタンスルホン酸(3-Methyl-2-methylbenzothiazo
lium methanesulfate )6.0g(1当量)とN,N-ジフ
ェニル ホルムアミジン(N,N-Diphenyl formamidine)
12.8g(3当量)とを酢酸中で、90℃の油浴上で
1.5時間加熱攪拌した。反応液をヘキサンにあけ、赤
色油状物をさらにヘキサン1.5リットルで懸濁洗浄
し、酢酸を除いた。粗精製物を酢酸エチル−ヘキサンで
再結晶した。収率48%。これに1−(2,3−ジヒド
ロキシ)プロピル レピジニウム ブロマイド3.1g
(1当量)とピリジン80mlを加え、90℃の油浴上
で1.5時間加熱撹拌する。反応液にホウフッ化ナトリ
ウム1.27g(1.1当量)をDMF9mlに溶解し
たものを加え、さらに15分間加熱撹拌した後、反応液
を酢酸エチル2リットルにあけ、生じた沈澱を濾取す
る。収量180mg(31%)。濃暗紫色粉末を得た。
チレン) Rf=0.151 H−NMR(DMSO−d6):δppm(TMS) 3.73(s,3H), 3.88(m,2H), 4.80(m,1H), 5.36(d,2H), 6.
45(d,1H), 7.10(d,1H),7.31(t,1H), 7.50〜8.51(m.10
H), 9.27(s,2H) IR(cm-1):1620,1560,1520,1480,1450,1400,131
0,1250,1210,1150,740 MASS(FAB positive): m/z=391 吸収極大:628nm(メタノール)
ロマイド5g(1当量)、N,N-ジフェニル ホルムアミ
ジン4.6g(2当量)を無水酢酸100ml中で、9
0℃の油浴上で1.5時間加熱撹拌した。反応液を濃縮
し、ヘキサン0.5リットルにあけ、無水酢酸を除い
た。粗精製物をシリカゲルカラム(メタノール−塩化メ
チレン)で精製した。収量8.4g(100%)。この
うち3.0g(1当量)をピリジン100mlに入れ、
90℃の油浴上で加熱懸濁し、これに2,3−ジメチル
ベンゾチアゾリウム メタンスルホン酸3.4g(1当
量)を加え、90℃で1.5時間加熱撹拌する。反応液
を濃縮後エテール、ヘキサンで洗浄しシリカゲルカラム
(メタノール−塩化メチレン)で精製した。収量は0.
5g(17%)、濃暗紫色粉末を得た。
チレン) Rf=0.41 H-NMR(DMSO-d6) :δppm(TMS) 1.93(s,3H), 3.77(s,3H), 4.45(t,2H), 4.80(t,2H), 6.
55(d,1H), 7.10(d,1H),7.37(t,1H), 7.53〜8.47(m,10H) IR(cm-1):1740,1620,1560,1520,1480,1450,140
0,1310,1250,1200,1150,1080,740 MASS(FAB positive): m/z=403 吸収極大:631nm (メタノール)
ウム メタンスルホン酸(3-Methyl-2-methylbenzooxaz
olium methanesulfate)250mg(1当量)とマロン
アルデヒド ビス(フェニルイミン9ハイドロクロライ
ド(Malonaldehyde bis(phenylimine) hydrochloride)
250mg(1当量)とを無水酢酸中で、125℃の油
浴上で0.5時間加熱攪拌した。反応液を冷却した後、
エーテルを加え、生じた結晶をろ取した(収率45
%)。これに、1−(2−ヒドロキシ)エチル レピジ
ニウム ブロマイド150mg(1当量)とピリジン5
mlを加え、125℃の油浴上で0.5時間加熱撹拌す
る。反応液に濃縮し、目的物を塩化メチレンで抽出した
(収率20%)。濃暗紫色粉末を得た。
塩化メチレン)Rf=0.201 H−NMR(DMSO−d6):δppm(TMS) 3.73(s,3H), 3.82(t,2H), 4.64(t,2H), 5.10(s,1H), 6.
45-7.31(m,5H), 7.50 〜8.51(m.10H) IR(cm-1):1625,1560,1520,1490,1450,1400,132
0,1260,1220,1150,760 MASS(FAB positive) m/z=371 吸収スペクトル 693nm(メタノール)
用試薬を調製した。
を加え、40℃で120秒間インキュベートして測定用
試料を調製し、この測定試料を、図9で示した光学部を
備えたR2000の改造装置を用いて前方低角散乱光強
度及び蛍光強度とを測定し、図1に示すスキャッタグラ
ムを得た。ここで、網状赤血球(RET)の全赤血球に
対する比率は2.90%であった。なお、この血液を従
来のR2000(東亜医用電子(株)製)を用いて測定
したところ、RET%は2.70%であった。
用試薬を調製した。 化合物A(色素) 3.0mg トリシン(緩衝剤) 1.79g クエン酸三ナトリウム二水和物(多価アニオン) 29.4g LTAC(カチオン性界面活性剤、染色促進剤) 150mg 精製水 1リットル (NaOHでpH9.0に調整)
を加え、40℃で40秒間インキュベートした後、実施
例5と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度と
を測定し、図2に示すスキャッタグラムを得た。ここ
で、網状赤血球(RET)の全赤血球に対する比率は
2.72%であった。なお、この血液を従来のR200
0(東亜医用電子(株)製)を用いて測定したところ、
RET%は2.70%であった。
/3の時間)で測定用試料の調製が可能であり、かつ赤
血球が球状化することによって前方散乱光強度分布が収
束し、赤血球と血小板の弁別が容易になる。
用試薬を調製した。
lを加え、40℃で40秒間インキュベートした後、実
施例5と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度
とを測定し、図3に示すスキャッタグラムを得た。ここ
で、網状赤血球(RET)の全赤血球に対する比率は
2.82%であった。なお、この血液を従来のR200
0(東亜医用電子(株)製)を用いて測定したところ、
RET%は2.70%であった。
用試薬を調製した。
lを加え40℃で40秒間インキュベートした後、実施
例5と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度と
を測定し、図4に示すスキャッタグラムを得た。ここ
で、網状赤血球(RET)の全赤血球に対する比率は
2.50%であった。なお、この血液を従来のR200
0(東亜医用電子(株)製)を用いて測定したところ、
RET%は2.70%であった。
用試薬を調製した。
lを加え40℃で40秒間インキュベートした後、実施
例5と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度と
を測定した。また、この血液を従来のR−2000(東
亜医用電子(株)製)を用いて測定した。これらの測定
結果を比較し、図5〜図8に、それぞれRET、LF
R、MFR及びHFRの相関図を示す。これら図5〜図
8によれば、本願発明の試薬及び小型赤色半導体レーザ
を用いて測定した網状赤血球の測定結果は、特に成熟赤
血球と網状赤血球との間に十分な蛍光強度の差が得られ
るため、従来のR2000を用いて測定した場合に対し
て、良好な相関関係が得られている。よって、従来の装
置と同等の性能であり、網状赤血球を精度よく検出でき
るといえる。
剤処理した正常人血、鉄欠乏性貧血の治療中の患者血、
楕円赤血球の出現した貧血患者血を測定した。
図11及び12にR−2000での測定結果を、図13
及び14に本実施例での測定結果を示す。図12及び1
4は、前方散乱光強度分布図である。また、鉄欠乏性貧
血の治療中の患者血の測定例を図15〜18に示す。図
15及び16にR−2000での測定結果を、図17及
び18に本実施例での測定結果を示す。図16及び18
は、前方散乱光強度分布図である。図17及び図18
で、特に図18で、疾患由来の小球性低色素性の赤血球
と、治療の結果出現する正常赤血球を明確に弁別でき
る。図15及び16に示す従来法では、明確に弁別する
ことはできない。
を図19〜23に示す。図19及び20にR−2000
での測定結果を、図21及び22に本実施例での測定結
果を示す。図20及び22は、前方散乱光強度分布図で
ある。図23に、電気インピーダンス検出法(東亜医用
電子(株)、SE−9000)による赤血球粒度分布図
を示す。図21及び図22で、特に図22で、明確に楕
円赤血球の集団を弁別することができる。図19及び2
0に示す従来法では、明確に弁別することはできない。
さらに、図23に示す従来の電気インピーダンス検出法
による赤血球粒度分布では、楕円赤血球の出現を検知で
きない。
低価格化、つまり装置における低価格化、光源としての
小型赤色半導体レーザーの使用等を実現するとともに、
赤色波長を用いて網状赤血球を精度よく測定することが
できる。すなわち、従来から使用されている上記装置で
あるRシリーズにおける高価なアルゴンレーザの使用
(色素としてはオーラミンO)と同等以上の精度を得る
ことができる。
剤としてカチオン性界面活性剤を含有する場合には、網
状赤血球の測定と同様に鉄欠乏性貧血等の小球性赤血球
症の治療の結果出現する正球性赤血球(正常な赤血球)
と疾患由来の小球性赤血球とを弁別すること、楕円赤血
球等の形態以上を示す赤血球の検出を行うことが可能と
なる。
試薬を用いて血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強
度を測定した場合のスキャッタグラムである。
試薬にさらにカチオン性界面活性剤を含む試薬を用いて
血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した
場合のスキャッタグラムである。
いて血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定
した場合のスキャッタグラムである。
いて血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定
した場合のスキャッタグラムである。
いて、本発明の方法及び従来のR2000を用いた方法
でRETを測定した場合の相関図である。
いて、本発明の方法及び従来のR2000を用いた方法
でLFRを測定した場合の相関図である。
いて、本発明の方法及び従来のR2000を用いた方法
でMFRを測定した場合の相関図である。
いて、本発明の方法及び従来のR2000を用いた方法
でHFRを測定した場合の相関図である。
光源を有するフローサイトメーターの光学部分を示す概
略図である。
測定した場合のスキャッタグラムである。
前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャッ
タグラムである。
前方散乱光強度分布を測定した場合の前方散乱光強度分
布図である。
用いて、本発明の方法で正常人血の前方散乱光強度及び
蛍光強度を測定した場合のスキャッタグラムである。
用いて、本発明の方法で正常人血の前方散乱光強度分布
を測定した場合の前方散乱光強度分布図である。
血の治療中の患者血の前方散乱光強度及び蛍光強度を測
定した場合のスキャッタグラムである。
血の治療中の患者血の前方散乱光強度分布を測定した場
合の前方散乱光強度分布図である。
用いて、本発明の方法で鉄欠乏性貧血の治療中の患者血
の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャ
ッタグラムである。
用いて、本発明の方法で鉄欠乏性貧血の治療中の患者血
の前方散乱光強度分布を測定した場合の前方散乱光強度
分布図である。
の出現した貧血患者血の前方散乱光強度及び蛍光強度を
測定した場合のスキャッタグラムである。
の出現した貧血患者血の前方散乱光強度分布を測定した
場合の前方散乱光強度分布図である。
用いて、本発明の方法で楕円赤血球の出現した貧血患者
血の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキ
ャッタグラムである。
用いて、本発明の方法で楕円赤血球の出現した貧血患者
血の前方散乱光強度分布を測定した場合の前方散乱光強
度分布図である。
赤血球の出現した貧血患者血の赤血球粒度分布図であ
る。
Claims (14)
- 【請求項1】 式(I) 【化1】 (式中、R1 は水素原子又は低級アルキル基;R2 及び
R3 は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基;R4 は水素原子、アシル基又は低級アルキル基;R
5 は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基;
Zは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換され
た炭素原子;nは1又は2;X- はアニオンである)で
表される化合物。 - 【請求項2】 式(I)の化合物において、R2 及びR
3 は水素原子;R4は水素原子、アシル基又は低級アル
キル基;R5 は水素原子、置換されていてもよい低級ア
ルキル基である請求項1記載の化合物。 - 【請求項3】 式(I)の化合物において、 R1 はメチル基;R2 及びR3 は水素原子;R4 及びR
5 は水素原子;n=1;Zは硫黄原子、 R1 はメチル基;R2 及びR3 は水素原子;R4 は水素
原子;R5 はヒドロキシメチル基;n=1;Zは硫黄原
子、 R1 はメチル基;R2 及びR3 は水素原子;R4 はCO
CH3 基;R5 は水素原子;n=1;Zは硫黄原子、又
は R1 はメチル基;R2 及びR3 は水素原子;R4 及びR
5 は水素原子;n=2;Zは硫黄原子である請求項1記
載の化合物。 - 【請求項4】 式(I) 【化2】 (式中、R1 は水素原子又は低級アルキル基;R2 及び
R3 は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基;R4 は水素原子、アシル基又は低級アルキル基;R
5 は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基;
Zは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基が置換され
た炭素原子;nは1又は2;X- はアニオンである)で
表される化合物を含む網状赤血球染色用試薬。 - 【請求項5】 さらに、赤血球の非特異染色を抑制する
ための多価アニオンと、緩衝剤とを含む請求項4記載の
網状赤血球染色用試薬。 - 【請求項6】 多価アニオンが、硫酸イオン、リン酸イ
オン、多価カルボン酸イオンから選ばれた少なくとも1
つである請求項5に記載の試薬。 - 【請求項7】 試薬のpHが6.0〜11.0である請
求項4〜6のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項8】 さらに、染色促進剤としてカチオン性界
面活性剤を含む請求項4〜7のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項9】 カチオン性界面活性剤が 【化3】 (式中、R6 は炭素数8〜12のアルキル基、R7 、R
8 及びR9 は低級アルキル基、Xはハロゲンから選ばれ
た少なくとも1つである)である請求項8記載の試薬。 - 【請求項10】 カチオン性界面活性剤が、ラウリルト
リメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルア
ンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウ
ムブロマイドの少なくとも1つである請求項8記載の試
薬。 - 【請求項11】 式(I) 【化4】 (式中、R1 は水素原子又は低級アルキル基;R2 及び
R3 は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基;R4 は水素原子、アシル基又は低級アルキル基;R
5 は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基;
Zは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基が置換され
た炭素原子;nは1又は2;X- はアニオンである)で
表される化合物を含む試薬を用いることを特徴とする網
状赤血球測定方法。 - 【請求項12】 (i) 式(I)で表される化合物と、赤
血球の非特異染色を抑制するための多価アニオンと、緩
衝剤とからなる網状赤血球染色用試薬と血液学的試料と
を混合することによって測定試料を調製し、(ii)前記測
定用試料を、赤色波長の光源を有するフローサイトメー
タの流体系に導入し、(iii) シースフローの中を流れる
血液学的試料の細胞に赤色波長の光を照射し、(iv)細胞
から発する散乱光と蛍光とを測定し、(v) 散乱光強度あ
るいは散乱光強度と蛍光強度とによって血小板と赤血球
系細胞とを弁別し、(vi)蛍光強度あるいは蛍光強度と散
乱光強度によって赤血球、網状赤血球及び白血球を弁別
し、(vii) 血小板、赤血球、網状赤血球及び白血球を分
類計数して細胞数及び細胞比率を算出する請求項11記
載の網状赤血球測定方法。 - 【請求項13】 赤色波長の光源が、He−Neレーザ
又は赤色半導体レーザである請求項12記載の網状赤血
球測定方法。 - 【請求項14】 少なくとも1つの特定の範囲の蛍光強
度を有する網状赤血球の全網状赤血球に占める割合を求
めることからなる請求項12記載の網状赤血球の測定方
法。
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