JPH03182562A - 全血中の網状赤血球の定量測定における化合物、試薬組成物及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）発明の技術分野 本発明は全血試料中の細胞を計量するための化合物と試
薬、特に、アクリジンオレンジの４級化誘導体とそのよ
うな誘導体を組込んだ試薬並に全血試料中の網状赤血球
水準の螢光流通血球計算技術による定量測定への使用に
関する。

（２）先行技術の説明 すべての高等動物にかいては、血液は種種な小球、即ち
、赤色血液細胞（赤血球）と白色血液細胞（白血球）と
血小板とが懸濁している水性流体部分（血漿）からなっ
ている。血漿は大約９０％の水と９優の蛋白質と０．９
％の塩と痕跡量の他材料例えば糖、尿素、尿酸などから
なる組成物を持っている。

末梢血液（即ち骨髄外の血液）は２つの主要な群、即ち
、主要な目的が酸素の輸送にある赤色血液細胞（赤血球
）と主要な機能が免疫システム生体には異質の材料の破
壊とに関する白色血液細胞（白血球）とに分けられる。

この２つの主要な群のほかに、血液は止血に釦いて重要
な所謂血小板を含有する。

赤血球成熟の最終段階は、これらの細胞が末梢血液中に
循環する一万で、骨髄から放出された後で起る。これら
の若い赤色細胞、即ち“網状赤血球”はその核を失い、
そして***する能力、即ちＲＮＡを合成する能力を失う
。これらの機能は停止するが、網状赤血球は新陳代謝面
では尚活性で、蛋白質を合成し、ヘムの合成のため鉄を
取込み、富エネルギー状態を維持するために要求される
必要な代謝反応を行うことはできる。これらの細胞は、
それに名を与えたものである網状質の存在を通じて成熟
赤血球と一般には見分けられるこの網状質はブリリアン
トクレゾールブルー、硫酸ナイルブルーまたは新しいメ
チレンブルーのような試薬によって染色されてもよく、
その後で網状赤血球の計量を顕微鏡下で手動観測の方法
によう行ってもよい。

網状赤血球は正常では全赤色細胞数の約０．５〜２％で
あり１この百分率は異常条件の下では劇的に変シ得る。

例えば、網状赤血球数は成る種の悪性疾病の化学療法に
かける早期の毒性の監視するためと共に、長年血液障害
症研究に釦ける診断補助として、そして出血に引続く赤
血細胞再生の指標として用いられて来た。

血液細胞の分析に螢光スティン即ち染料の使用は長年知
られていることである。特に核酸の染色のための螢光染
料としてアクリジンオレンジの使用は４０年以上にも亘
って知られている。Ｓ。

Ｓｔｒｕｇｇｅｒ、　”Ｆ’１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ工ｎ　Ｋｘａｍｉ−ｎａｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ　　工ｎ　　５ｏｉｌ　
　”　　　　０ａｎａｄ、Ｊ、Ｒｅｓ。

Ｃ！２６　　：１　８８−１　９３（１９４８）、　、
Ｔ、Ｂ。

Ｖａｕｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、Ｌａｂ、Ｇ１１
ｎ、Ｍｅｄ　６２．１３２（１９６３）は螢光顕微鏡検
査による網状赤血球の同定のためのアクリジンオレンジ
の使用を記述している。しかし、この技術は試料の袂覚
検査を要求していて、手動の光学検査法の固有の不利さ
をもっている。

４級化されているアクリジンオレンジ誘導体およびその
ＤＮＡとの相互作用については、“工ｎＶｉｔｒｏ　Ｅ
ｆｔｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎ　Ｏｎ　ＲＮＡＰｏｌｙｍｅａｓｅ　Ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎｓ　Ｗｉｔｈ　５ｕｐｅｒｃｏｉｌｅ
ｄ　ＤＮＡ”。

Ｒｏｂｅｒｔ　Ｓ、Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、■ｎｔ
、、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、第１５巻、１０号、１２
３１−１２３９頁（１９８３）に記述されている。この
研究は原系列のＥ、Ｃｏ１１染色体を含有する組換えプ
ラスミドをもつ同種の１ｉ：、０Ｏ１１ＲＮＡポリメラ
ーゼの相互作用について行われた。これらの相互作用は
、介在染料アクリジンオレンジとアクリジンオレンジの
Ｎ−１０−ペンシル誘導体を用いてＤＮＡ鋳型即ち細胞
外ＤＮＡとその超コイルコンホーメーションの摂動によ
シ分析された。酵素ＤＮＡ相互作用の薬剤の仲介する摂
動の特性づけはＲＮＡポリメラーゼ−鋳型結合と開始と
転写とのために特定の条件の下での、動力学的、電気泳
動並にオートラフォグラフイーの方法によシ達成された
。これらの研究に基き、著者等は、アクリジンオレンジ
はＮ−１０−ペンシル置換アクリジンオレンジよう非常
に効果的にＲＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ鋳型相互作用を
妨げると結論した。実際、著者等はアクリジンオレンジ
がアクリジンオレンジ誘導体よう非常に効果的な介在者
であることを見出した。螢光流動式血液計算法を用いる
細胞分析のための染料としであるいは一般的に、細胞内
ＲＮＡ　樟示物として特定のアクリジンオレンジ誘導体
が用い得るかもしれないと云う議論はなされていない。

更に、多くの異った型の自動装置が血液細胞の検出と計
量とのために公開されている。その方法の代表例（それ
らの内の幾つかはアクリ７ンオレンジｔたは他の螢光染
料を用いる）は米国特許第３．４９７．６９０号、ろ、
９１６．２０５号、３，８６４，５７１号および４．０
２７．９７１号である。

これらの文献は一般に流通式血液計算器を含む種種な装
置に釦いての螢光染料の使用を公開してはいるが、螢光
による網赤血球の計量のための方法璽たは組成物は提供
していない。

ＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙとの米国特許第３．６
８４．３７７号とＡｄａｍｓの第３．８８３．２４７号
とは特に関心がある。これらの特許は異訓染色性の螢光
染料例えばアクリジンオレンジを用いる細胞（特に白色
血液細胞）の計量のための方法と染料組成物とに関する
。

ＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙとの特許は、本質的ニ
濃度１０−７〜１０”−５９／　ｍｅをもつアクリジン
オレンジようなシ、そのアクリジンオレンジ溶液は人血
漿の正常な生理学的範囲の一値と浸透性とを持つ、生白
色細胞の示差血液分析用の生体染料組成物の使用を記述
している。特許はこの組成物が種種な型の白色血液細胞
の同定と、血液中の他のものとそれらとの区別とに有用
であると教えてはいるが、この組成物が網状赤血球の計
量において何らかの有用性をもつとは教えていない。

Ａｄａｍｓの特許は、細胞染色の間に非生理学的媒質に
曝すことによジショックを与える”条件の下で白色血液
細胞を処理すると云う、ＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋ
ｙとの教えの変形を示している。即ち、Ａｄａｍｓの特
許中で用いた染色組成物は低張にされていて、その浸透
性は一般に人血液中で正常に見出されるものよう低い。

Ａｄａｍｓの特許の教えは、この低張条件は種種な型の
白色血液細胞によるアクリジンオレンジの取り込みに関
し差異のある速度を作り出し、今１での技術におけるよ
シ他とはよシ明瞭に区別し得ると云うことである。Ａｄ
ａｍｓの特許は網状赤血球検出法の公開を意図している
が、そこで公開されている方法はＮａｔａｌｅの米国特
許第４．３３６．０２９号にかいて、網状赤血球の計量
には実際上役に立たないと批判された。

白色血液細胞の豆類型の弁別をアクリジンオレンジ染料
の取シ込み速度に依存するＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓ
ｋｙ　ｋよびＡｄａｍｓの特許とは反対に、Ｎａｔａｌ
ｅ の特許は、動力学的要素を除去し、網状赤血球がアクリ
ジンオレンジ染料の最大量吸収するよう染料の取込み度
を増加させることによっている。先行技術の染色試薬を
用いると、網状赤血球は染料をほんの僅の量しか吸収せ
ず、従ってどんな螢光検出法においても低水準の螢光し
か得られない。

この低水準の螢光では背景の螢光を越えては一般によく
検出され得ないし、その結果試料中の網状赤血球のほん
の１部分しか検出され得ないであろう。

Ｎａｔａｌｅの特許の染料組成物は本質的には異質染色
性の螢光色素染料アクリジンオレンジの水性溶液とキレ
ート剤（クエン酸塩）とアミノ基と反応する試薬と（若
し必要ならば）この溶液の最終−を約７．４に維持する
ための緩衝剤とからなっている。その溶液の浸透性はキ
レート剤または必要量の塩化ナトリウムの添加の何れか
にょｂ１正常の生理学的水準である約０．２６浸透単位
に保たれる。Ｎａｔａｌｅの教えの主な目的は網状赤血
球と血小板とを同時に同定することである。事実、Ｎａ
ｔａｌｅ試薬は血小板染色を最小限にするためクエン酸
イオンを含有している。

Ｎａｔａｌｅ試薬は非常に高濃度のアクリジンオレンジ
（１０−２９７１３）を含有し、それは、流動細胞を含
む、器機内の流体導管も染色し、それが白色細胞に関し
て間違った過大の読みをもたらすことが判った。この染
色はまたシステムの広範な洗浄が必要であると云う別の
問題を発生させ、それが検査手続きに時間のかかる段階
を加えることになる。

更に、アクリジンオレンジに関する先行技術のこの開示
は、アクリジンオレンジの最大限の取シ込みがこれらの
先行技術の方法の主要な目的である、白色血液細胞の種
種な亜綱の差別をなくしてし筐う故に最大限の取り込み
には特に反対して教えている。それ故先行技術のＡｄａ
ｍｓ並にＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙとの特許は主
題の組成物または方法を教えているとは云えない。

従って、螢光流通式血液計算技術による網状赤血球の計
量に有用な改良されたアクリゾンオレンゾ染料と試薬と
の必要性が存在する。そのような染料と試薬とを提供す
るのが本発明の主な目的である。

（３）本発明の要約 本発明は全血中の網状赤血球の定量測定のための改良さ
れた染料組成物とその様な組成物を含む試薬とを提供す
る。

本発明の染料は以前に用いられていた染料と比較して、
化学的によう安定であり、網状赤血球の計量でよシ大き
い再現性を提供するアクリジンオレンジの４級化誘導体
の特殊な構成よりなる。本発明の４級化アクリジンオレ
ンジ誘導体は次の構造式（１） ％式％ 前記の構造式で、 又は構造式 〔この式で、Ｒ１は水素原子または弗素原子の何れかで
あり、Ｒ２は弗素原子、トリフルオロメチル基（ＯＦ３
）　’！た水素原子である〕で表わされる、Ｒ１＞よび
（または） ンゾル基であって、構造式〇） Ｒ２置換のべ で表わされる化合物を形成してもよい。また別に、又は
ヒドロキシルエチレン［：（ＧＨ２）２０Ｈ〕基であっ
て、構造式（１） で表わされる化合物を形成してもよい。Ｙ−は臭素又は
沃素イオンである。

本発明の試薬は新規の緩衝剤中に構造式（ＩＩ）および
０）で表わされる染料組成物を含有している。

特にその試薬はバラホルムアルデヒド１．２５．！ｉ’
／ｌと蓚酸カリウム９ｇ／ｌ３とからなる緩衝剤溶液中
に主題の誘導体染料組成物３〜９μｇ／ｍｅを含む。

主題誘導体染料組成物を含有する試薬は流通式血液計算
法の技術を用い、全血中の網状赤血球の計量に用いても
よい。流通式血液計算法の基礎曲者えは本質的には特定
の検知区域を１時に１つの細胞を通過させることである
。水力学的焦点合せの方法によシ、細胞は、焦点を合せ
たレーザー光源と、散乱した螢光測定のための検知シス
テムとからなる検知区域を通過する。

従って、最も広い適用に釦ける主題の方法は、（ａ）　
　検査すべき血液を、主題の誘導体染料組成物を含む主
題の試薬組成物と混合して懸濁物を形成し、 （旬　その懸濁物を、アクリジンオレンジ染料が網状赤
血球によシ最大限に取り込筐れるよう短時間、例えば３
分間またはそれ以下室温で反応させ、 （ｃ）　　その懸濁物を青色レーデ−光源からの放射線
に曝し、 （ｄ）　　その懸濁物からの赤色螢光の強度を測定し、
（ｅ）　　その測定値から試料中の網状赤血球の量また
は百分率を決定する、 段階から々る。

（４）本発明の詳細な説明 我我はここに公開したアクリジンオレンジの４級化誘導
体の特殊な群が以前に用いられていた方法および染料に
比較して化学的によシ安定であシ、網状赤血球の計測に
関してよシ大きい再現性を提供することを見出した。更
にそれに加えて、その特殊な群の極性によシ、これらの
誘導体は赤血球細胞膜に速に侵入し、細胞内Ｒ’ＮＡに
特異的に結合し、それでより低い染料濃度で網状赤血球
を染色し、器機導管の染色の問題を実質的に減少する。

以下の実施例は本発明のアクリジンオレンジの４級化誘
導体調製の合成段階と、螢光流通式血液計算法技術を用
いる網状赤血球の計測のための、同じものを含有する試
薬並それを組込んだ方法とを説明する。可能な場合はい
つでも、市場で入手し得る試薬級材料を用いた。以下の
処方釦よび操作はほんの説明の目的のためにのみ提供し
たものであシ、他の成分、割合および操作がこの発明の
公開に従って採用できることは理解されよう。

実施例１　臭化６．６−ビス（ジメチルアミノ）１０−
ペンシルアクリゾニウムの合成 構造式 で表わされるアクリジンオレンジ塩基０．５１４　ｇ（
または１．４５　×１０−３モル）を撹拌棒と還流冷却
器とをつけた２頚の１００−丸型ノラスコ中に秤量する
。このフラスコに乾燥トルエン（ナトリウム球上で乾燥
し新に開栓したトルエン）１０〜Ｎを加える。全量で０
．１７５ｄ（又は１．４５　×１０−３モル）のアルキ
ル化剤、純ペンシルプロミドを緩に攪拌されているフラ
スコ中の混合物に加え混合物を静に一夜１００−１１０
℃に加熱する。トルエンの沸点１１１℃以下に温度を保
つよう注意する。その混合物を室温に冷却し、濾過板付
分液ロトを用い固形沈澱物を集める。その固形ケーキを
完全にトルエンですすぎ、真空の下で乾燥する。

煉瓦色固形材料（約０．３８１　、！ｉ＋　）を得る。

粗生成物の１部（約０．２７９　）をフラッシュクロマ
トグラフィー（シリカ１８．５　ｇに希釈溶剤として（
１（ＣＪ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２０−７，５／　２．５　／
　０．３モル比を用いる）によシ精製する。次の構造式 で表わされる精製化合物約０．１８ｇを得る。

実施例２３，６−ビス（ジメチルアミノ）１０〜Ｎ−ペ
ンシルアクリゾニウム誘導体の合成異るアルキル化剤を
同モル濃度で用い実施例１の操作に従う。２または４位
ベンゼン核水素原子のところで弗素化ペンシル基に置換
する。アルキル化剤には次のものが包含される。

２−フルオロ−ペンシルプロミド ４−フルオロ−ペンシルプロミド ４−トリフルオロ−メチル−ペンシルプロミド構造式（
０ 〔この式で、Ｒ１は弗素原子または水素原子であす、Ｒ
２はトリフルオロメチル（ＣＦ３）基または水素原子で
ある〕 で表わされる化合物を得る。

次の実施例において、この式で表わされる化合物を誘導
体（厘）族、何個に特別な誘導体を次の如く誘導体（１
ａ）、（Ｉｌｂ）、（ｌｃ）または（Ｉａ）と呼ぶ。

誘導体（Ｉａ）ＡＯ−１０−ペンシル、ここでＲ１−Ｒ
２−Ｈ 誘導体（Ｉｂ）Ａｏ−１０−（２Ｆ）−ペンシル、ここ
でＲ１−１部％　Ｒ２鳳Ｈ 誘導体（Ｉｃ）Ａｏ−１０−（４Ｆ）−ベンゾル、ここ
でＲ１＝＝＝Ｈ、Ｒ２＝Ｆ 誘導体（ＩＩ　ｄ　）　Ａ　Ｏ−１０−（４ａｈ３）−
ベンシル、ここでＲＬ＝Ｈ％　Ｒ２膿ＣＦ３実施例３　
ろ、６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−エタノール−
アクリゾニウム誘導体の合成２頚１００＋＋＋（丸型フ
ラスコ中にアクリジンオレンジ塩基０．５０８９を秤量
する。還流冷却器と等圧化分液ロトとを設置しであるそ
のフラスコに乾燥トルエン（５１１／）とジメチルホル
ムアミド（２ａｇ　）とを加える。常に攪拌され、約１
１０℃に加熱されているその混合物に２＝沃化エタノー
ル（トルエン５−に溶解した０、２６１　ｇ）を滴下し
て加える。２−沃化エタノールの添加操作には約１時間
かかった。１夜還流させて反応を進行させる。還流混合
物を室温に冷却する。幾分橙色に着色した固形材料が析
出する。さらにトルエン１〇−をその混合物に加え混合
する。固形沈澱物を濾過板付分液ロトで集める。固形物
ケーキをよくトルエンですすぎ、その固形物材料を真空
の下で乾燥する。構造式（璽） で表わされる固形化合物的０．５５５．９を得る。以下
の実施例において、この構造式で表わされる化合物を誘
導体（１）　八〇−１０−ＯＨ２０ＨｚＯＨと呼ぶ。

実施例４　誘導体（１）族および誘導体（１）の特性づ
け Ａ、化合物の同定に薄層クロマトグラフィー−シリカゲ
ルＴＬＯを用いる。モル比７．５　／　２．５　／　０
．３Ｏ（）ＩＣ１３／ＭｅＯＨ／Ｈ２０よシなる混合溶
剤システムを用いる。アクリジンオレンジはＲｆ約０．
５０に現れるが、誘導体（１）族のすべてはＲｒ　Ｏ，
５７に現れる。誘導体（璽）も同様Ｒｆ０．５７を示す
。

Ｂ、誘導体（ｌａ）と誘導体（璽）との１ＨＮＭＲスペ
クトルは次の確立した手続きに従いＶａｒｉａｎＥＭ−
３６０ＭＨ２核磁気共鳴スペクトロメーターで測定され
た。そのスペクトルはそれぞれ第１ａ図（６０ＭＨｚ　
）と第１ｂ図（６０ＭＨ２）に示されている。ベンシル
プロトンとエチレンプロトンとの特性帯は明瞭に判る。

誘導体（Ｉｌｂ）、（Ｉｃ）および（Ｈａ）の同じスペ
クトルも得られた。

Ｃ１光学吸収スペクトルはＰｅｒｋｉｎ　Ｂｌｍｅｒ　
Ｌａｍｄａ３Ｂ　ＵＶ／ＶＩＳ分光分析器によう測定さ
れた。ＰＢＳ緩衝剤（ｓｉｇｍａ　Ｏａｔ、　＋１００
０−３　）中主題染料誘導体〔誘導体（Ｉａ））濃度３
μ９／−の３ｄで測定され、その染料紹酸物の吸収スペ
クトルがアクリジンオレンジのそれと比較された。両化
合物は４７０　ｎｍ近（Ｋダイマーのピークを示し、誘
導体（ｌａ）のモノマーのピークは４９６　ｎｍに、ア
クリジンオレンジのそれは４９０　ｎｍに現れた。

誘導体（１）　Ａ−よび他のベンシル誘導体の吸収スペ
クトルは誘導体（Ｉａ）のそれと非常によく似ている。

！１表は本発明のすべての誘導体の最大吸収をアクリジ
ンオレンジのそれと比較して要約したものである。

表 モノマー吸収 ダイマー吸収 誘導体（Ｉｌａ）　　　　　　　　４９６　　　　　　
　　４７０誘導体（Ｗｂ）　　　　　　　　４９５　　
　　　　　　４７０誘導体（璽ｃ）　　　　　　　　４
９７　　　　　　　　４７０誘導体（Ｉａ）　　　　　
　　　４９７　　　　　　　　４７０誘導体（１）　　
　　　　　　４９５　　　　　　　　４７０Ｄ、誘導体
（Ｉｌａ）の螢光スペクトル（第２ａ図）は、４８８Ｄ
ｍで励起した場合アクリジンオレンジのそれが（第２ｂ
図）　５３３　ｎｍに示されるのに比較し、５２７Ｄｍ
に発光ピークが示される。ＰＢＳ緩衝剤中主題染料誘導
体１μｆ／　／　ｄの５−についてＨｌｔａＣｈｉ　Ｆ
−４０１０螢光分光分析器を用いた。

実施例５　誘導体（１）族と誘導体（１）の−滴種種な
−における、化合物の光学吸収釦よび螢光スペクトルを
測定した。新規の緩衝剤はこれら誘導体と共に用いるた
めに開発され、パラホルムアルデヒド１．２５　ｍ９／
　＊ｌと蓚酸カリウム９１／／１とを含有している。そ
の緩衝剤は少量の１．０ＮＨＪまたは１．０　Ｎ　ＮＩ
ＩＬＯＨ溶液のいずれかを添加することにより、−値３
．０．５．０．７．０．９．０釦よび１２．０が得られ
るように−を調節される。第４ａ図で説明されるように
、誘導体（Ｉｌａ）の吸収スペクトルはｐｉ−１１２，
０で少し減少するもののｐＨ３，０〜９．０で一定であ
るが、アクリジンオレンジの吸収スペクトルは（第３ｂ
図）第３アミンと４級アミンとの差から期待される如く
、明らかに−１２で実質的に変化している。同様の結果
は両化合物の螢光スペクトル（それぞれ第２ａ＞よび２
ｂ図）でも観察される。第４ｂ図は誘導体（Ｉｂ）と（
１）との−滴定曲線を示す。これもまたアクリジンオレ
ンジに比較した場合高−値にｐいても誘導体（１）族と
誘導体（１）とはよい安定性を示している。

実施例６　誘導体（１）族と誘導体（璽）とのＲＮＡ　
（飽和溶液）への螢光結合 ＰＢＳ緩衝剤中濃度１００　ＷＩｇ／　ｗｅの、種種な
体積のＲＮＡ溶液（Ｏａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｏａｔ、ｌ
ｔ＋　５５７１１２　）に主題染料誘導体溶液（染料濃
度１μｇ／ｍｌ）５ｔｔを加え、混合する。訃のかのの
螢光スペクトルを染料溶液がＲＮＡで飽和するまで記録
する。その飽和は４０μｌまたはそれ以上の体積のＲＮ
Ａ溶液が染料溶液に添加された場合おこることが見出さ
れた。

表２はアクリジンオレンジと比較して主題染料の異訓染
色性螢光シフトと螢光強化係数とを示している。これら
のデータはＲＮＡと結合した場合、アクリジンオレンジ
より本発明の化合物についてよシ大きいシフトがあるこ
と、釦よび螢光信号が同じかまたはよう大きく増大する
ことを示している。溶液中の遊離の染料の螢光信号に対
する結合染料の螢光信号の比を螢光強化係数と呼ぶ。

表 誘導体（Ｉｆ　ａ　）　　　　　　　３．６　　　　　
　　２．２ｐ　　（Ｊｌｂ）　　　　　　　３．２　　
　　　　　２．３”　　（ｉｌｃ）　　　　　　　５．
０　　　　　　　２．７ｔｔ　　（Ｉｌａ）　　　　　
　　：５．８　　　　　　　２．５実施例７　誘導体（
１）族と誘導体（１）とを用いる網状赤血球染色の顕微
鏡観察 試料調製の手続き：主題染料溶液（１００％メタノール
中０．３〜０．９　ｍ９／　ｌの原液）約２０ｔｔｌを
０．９％蓚酸カリウムと１．２５■／−ノくラホルムア
ルデヒドとを含有する緩衝溶液２＊ｖｃｍえ、よく混合
する。この溶液に正常または患者の血液２０μｌを加え
、ゆり動かし、３分間室温に保つ。それでこの網状赤血
球検出の用意ができる。濃厚な網状赤血球試料には、試
薬２ｄ中に血液１０μｌを！濁させる。アクリジンオレ
ンジ染色溶液（比較に使用）については、原液はアクリ
ジンオレンジ３　”９　／　ａｔ金含有る。

ＮＭＢ　（新メチレンブルー）で染色された試料に関し
ては、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｏｏｍｍｉｔｌｅｅ　ｆｏｒ
　Ｃ１１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｔａｕｄ
ａｖｄｓ　（ＮＯＯＬＳ）の手続きに従う。

ベンクル環構造およびペンシル環置換基の性質にかける
変更の影響を調べた。各化合物に関して、０ｒｔｈＯＤ
ｉａｇｎＯｓｔｉｃｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｓ、で販
売しているＳｐｅｃｔｒｕｍ　Ｉ流通式血液計器を用い
、製造者の手続きに従った網状赤血球数の百分率を、顕
微鏡観察によう測定した百分率網状赤血球数と比較した
。以下の第６表はその結果を１とめである。

更に他の実験は本発明の誘導体が、７μ西の濃度では強
い染色が見られるものの２μＭの低い濃度でも効果があ
ることを示している。

顕微鏡下で、誘導体（Ｉｌａ）、（Ｉｌｂ）、（ＩＩＣ
）、（Ｉ　ａ　）　ｉ−よび（璽）で染色した血液試料
に関し、ＲＮＡの赤色の沈澱を示す網状赤血球が明瞭に
観察される。しかし、アクリシンオレンシー１０−２−
二トローベンシルおよびアクリシンオレンシー１０−２
−クロロ−ペンシルとハ網状赤血球を特別には染色しな
い。この研究においては、アクリジンオレンジはベンシ
ル水素におけるすべての置換基が網状赤血球を染色する
ことが出来るわけではないことを示すことの参照として
用いた。

良好な網状赤血球染色に要するアクリジンオレンジの量
は誘導体（１）または（璽）の必要量よう約１０〜１４
倍多い。

実施例８　誘導体（Ｉｌａ）を用いた試薬の１日に釦け
る性能の安定性 網状赤血球計測のための血液計算法開発のためには、測
定に用いる試薬が１作業日中に釦いて再現性のある結果
を与えることが望プしい。評価のため、誘導体（Ｈａ）
を含有する試薬をアクリジンオレンジを含有する試薬と
比較した。１つの血液試料（正常の）を染料溶液で別別
に染色する。

試料調製手続きは実施例７に記載しである。この評価に
はＳｐｅｃｔｒｕｍ　Ｉ流通式血液計算器を用いた。

血液を染料溶液に加えた後、２つの異った混合物を室温
に放置し、雰囲気光線に曝す。２つの混合物の網状赤血
球計測を８時間に亘す異った時間間隔で行った。各時間
間隔にふ・いて測定を２回繰返した。以下の第４表はそ
の結果をまとめたものである。

表 室温にかける試薬の再現性 ５分 １０分 ５０分 ６０分 ２時間 ５　〃 １ ５　〃 １ １ １ 平均 Ｓ、Ｄ。

（１００ｕＭ） １．５　　、　１．２ １．５　　、　１．６ １．２　　、　１．２ １゜３，１．４ １．５　　、　１．３ １．２　　、　１．６ １．１　　、　１．（Ｓ １．９　　、　１．４ １．８　　、　１．４ １．４　　、　１．４ １．４多 ０．２３％ （７ｕＭ） １．１　　、　１．０ １．０　　、　１．１ １．２　　、　１．２ １．２　　、　１．０ １．１　　、　１．０ １．１　　、　１．１ １．１　　、　１．３ １．３　　、　１．１ １．０ １．０　　、　１．０　　。

１．０　　、　１．４ １．１２４ ０．１２１ １．２ 多　Ｃｖ １６蝿 １０．７優 誘導体（Ｕａ）が８時間の間でよシ再現性のある計測値
を与えることは明らかである。誘導体（ｌａ）の１０．
７％Ｃｖはアクリジンオレンジの１６多ＣＶに対比され
る。

他の誘導体（ＩＩ）族の間で化学構造が類似しているの
で、同様な安定結果が期待される。

実施例９　試薬の安定性（貯蔵期間） ２つの試薬の安定性を研究し、比較した。それぞれ実施
例７の緩衝剤溶液中の濃度５μｇ／−の誘導体（Ｉｌａ
）と３０μ９７　ｍｌアクリジンオレンジとを雰囲気光
線から防護せず１週間室温に放置する。染料溶液の吸収
並に螢光スペクトルを毎日記録する。アクリジンオレン
ジ（λ４９０　ｎｍ　）と誘導体（Ｈａ）（λ４９５　
ｎｍ　）との吸収最大点における強度と、アクリジンオ
レンジ（λ５６６ｎｍ　）と誘導体（Ｉｌａ）（λ５２
７　ｎｍ　）との螢光最大点にかける強度とを測定し、
経過日０の新に調製した誘導体（Ｉｌａ）及びアクリジ
ンオレンジを含有する溶液のそれらと比較した。各日に
釦ける強度減少優を時間（即ち日）を関数としてプロッ
トする。第５ａと５ｂ図とは吸収と螢光とにかける変化
を別別に示している。誘導体（ｎａ）を含有する試薬は
６口径螢光と吸収との強度が極く僅に低下を示すにすぎ
ないことが明らかである。

ベンシル誘導体に卦いては螢光と吸収とに釦いて約３０
傷、アクリジンオレンジに釦いては７０優の低下が見ら
れる。それ故誘導体（Ｉｌａ）はアクリジンオレンジよ
う安定であり、よシ再現性のある網状赤血球計測値を与
える。

他の誘導体（ＩＩ）族釦よび誘導体（１）においては化
学構造で類似性があるので同様の安定性結果がこれらの
誘導体には期待される。

実施例１ＯＮＣＣＬ手引き書による方法との相関研究 Ｎｏ（：！Ｌ手引き書による方法を用いた０働化されて
いる方法に訃ける染料試薬に用いた場合の、誘導体（ｌ
ａ）と誘導体（１）との性能を比較する研究を行った。

この研究にはＳｐｅｃｔｒｕｍ　＠システムを用い、Ｓ
ｐｅｃｔｒｕｍ　［機器のための、実施例７に記載の試
料手続きに従った。正常血液３１個、異常血液８個並に
網状赤血球濃縮試料４個を含む４３個の血液試料を主題
染料誘導体を含有する試薬で染色し、網状赤血球含有量
を検定した。同じ組の血液試料にかける網状赤血球はま
たＮ０ＯＬ承認手引き書法を用いても計測した。これら
２つの方法から得られた百分率網状赤血球計測値を第６
ａと６ｂ図に釦いて比較した。試薬に釦ける誘導体（Ｉ
ｌａ）の濃度３ｍｇ　７　ｍｇ　（即ち７μＭ）の低さ
でよい相関性、即ち相関係数０．９６、傾斜０．７１１
よび切片０優（第６ａ図）が得られた。９μｇ／−（即
ち２１μＭ）の濃度でも、本発明の試薬の参照方法に対
する相関性は非常に良好である（第６ｂ図）。相関係数
０．９７、傾斜０，８７および切片０％は５ｂｇ／ｍｅ
のそれらと同程度である。

誘導体（１）については、第７図が９個の患者試料に基
き、相関係数０．９９、傾斜１．０６並に切片０．１３
優を示している。

実施例１１　商業的０働化血液計算法との相関Ｓｐｅｃ
ｔｒｕｍ　Ｉシステムを用い、すべての試料測定につい
ては実施例８の手続きに従った。

種種な患者より得られた１２の患者試料について、その
網状赤血球計測値を同時に２つの異った流通式血液計算
法を採用して測定した。誘導体（Ｉｌａ）の濃度６μｇ
／−の試薬を、チアゾールオレンジを用いるＢ−Ｄ　Ｆ
ＡＯ８ｃａｎ法［：　ＢＥ（：！ＴＯＮＤＩＯＫＩＮＳ
ＯＮ社のＦＡＯ８ｃａｎ　（商品名）フローサイトメー
タを使う方法〕に対比してＳｐｅｃｔｒｕｍ璽システム
に用いた。Ｂ−Ｄ法はチアブールオレンジ試薬と一緒に
した血液試料の、暗所に釦いて最低６０分間の培養を必
要とする。それに比較して、本発明の試薬は室内光中３
分間以内で正確な網状赤血球計測値を提供できる。各測
定は２回繰返された。よい相関が得られた。第８ａ図は
その結果を示す。即ち、相関係数０．８８、傾斜１．４
５並に切片−１，４蝿である。Ｂ−Ｄ　ＦＡＣ８ｃａｍ
法は市販されている血液計算法であるから、この結果は
本発明の試薬の、承認されている血液計測法に対しひけ
をとらないことを示している。

１２個の患者試料は前記の手続きに従い、６μｇ／ｄの
濃度の誘導体（璽）を含有する試薬に混合され、そのデ
ータは第８ｂ図に示されている。

実施例１２ 第９図は、細胞を誘導体（１）で染色し、Ｓｐｅｃｔｒ
ｕｍ　璽機器で測定された場合の、網状赤血球と赤血球
との間に釦ける高度の弁別度を説明している。試料調製
手続きは前記したものと同じである。明瞭な細胞個体群
がその特別な散乱および螢光信号に基いて明らかに観察
された。赤血球個体群は垂直軸と垂直線Ｘとの間の領域
Ａの中にある。これらの細胞は高い散乱信号と低い細胞
螢光信号とを示す。網状赤血球は領域Ｂ（ｘの右）にあ
る。これらの細胞は誘導体（１）で染色されたＲＮＡか
らの高い螢光信号により赤血球とは区別できる。血小板
個体群は線Ｙの下の領域Ｃにある。

これらの細胞は、網状赤血球と比較する場合、比較的低
い散乱信号と螢光信号とを持っている。領域Ｂにおける
放物状の境界線２は、もし誘導体（１）とは違ってアク
リジンオレンジを染料として用いた場合に得られる螢光
信号の程度を表わしている。それ数誌導体（璽）を用い
ることによシ、赤血球の螢光信号に対する網状赤血球の
螢光信号の比はアクリジンオレンジを用いて染色した細
胞よシ誘導体（１）で染色した細胞に関して高い故に、
よう大きい感度が達成されることは容易に明らかである
。

赤血球と網状赤血球との間の螢光分離に基いて。

患者試料の網状赤血球計測値は２．２％であると測定さ
れた。同じ試料がＮ０ＣＬＳ法でも分析された。

その結果は網状赤血球計測値２．６　％であった。

前記の説明から明らかな本発明の有利さには、全血中の
網状赤血球の定量測定のための、改良された染料組成物
訃よびそのような組成物を含有する試薬が包含されてい
る。その染料は、以前に用いられていた染料と比較して
、化学的により安定であり１網状赤血球計測値により再
現性を提供することが判った、アクリジンオレンジの４
級化誘導体の特別な構成ようなっている。

前記の見解において、本発明のａｉ種な目的が達成され
、他の有利な結果が得られることが判るであろう。

本発明の種種な％徴と有利さとは前記の説明から明らか
であると思われる。しかし、特に挙げていない種種な他
の特徴と有利さとは技術に熟達した人達には浮ぶであろ
うし、同様に説明した好ましい態様の多くの変更と修正
とも浮ぶであろうが、それらのすべては特許請求によう
定義される本発明の精神と分野とから離れること□く達
成されてもよい。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図及び第１ｂ図は本発明の２つの誘導体（Ｈａと
璽）のｌＨＮＭＲスペクトルを示す線図である。 第２ａ図及び第２ｂ図はそれぞれ本発明の誘導体（Ｈａ
）とアクリジンオレンジとの螢光スペクトルを示す線図
である。 第６ａ図及び第６ｂ図はそれぞれ本発明の誘導体（ｌａ
）とアクリジンオレンジとの吸収スペクトルを示す線図
でちる。 第４ａ図及び第４ｂ図は誘導体（Ｉｌａ）、（ｆｉｂ）
並に（１）の−滴定曲線を示す線図である。 第５ａ図及び第５ｂ図は本発明の誘導体（Ｉｌａ）の試
薬安定性（それぞれ吸収強度と螢光強度）を説明する説
明図である。 第６ａ図及び第６ｂ図はＮＣＣ！Ｌ承認手動法と比較し
た、市販の自動化法に種種な濃度で誘導体（Ｉ［ａ）を
用いての分析に関する相関データを示す線図である。 第７図は誘導体（１）の相関データを示す線図である。 第８ａ図及び第８ｂ図は、チアゾールオレンジを用いる
他の市販の自励法と比較して市販自動法に釦ける誘導体
（Ｉａ）と（璽）との相関データを示す線図である。 第９図は誘導体（１）で染色した網状赤血球に関する前
方散乱対螢光の細胞記録を示す線図である。 ＦＩＧ、６ａ □回帰線 Ｙの標準偏差ＩＩ　２．５１９ＳＯア　傾斜ｍＯ，７０
ａｌｓ！切片雪−０，０１７３５傾斜の標準偏差１１０
．０３２４２１切片ｔＤ標準（ｆｉｌｌ　１１０．１！
１２８０１　　　　補正係数ｍ（ＩＪ＠１４７３回帰の
標準偏差１１０．７０１５４５ ＦＩＧ、６ｂ □回帰線 試料数 ８４３Ｘの平均１１３．２１１８３７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔この式で、Ｘは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （この式で、Ｒ＿１は水素原子またはフッソ原子であり
   、Ｒ＿２はフッソ原子、トリフルオロメチル基または水
   素原子であるが、Ｒ＿１とＲ＿２とは共に水素原子では
   ないものとする） で表わされるＲ＿１および（または）Ｒ＿２で置換され
   たベンジル基であるか、あるいはＸはヒドロキシエチレ
   ンであり、Ｙ＾−は臭素又は沃素イオンである〕 で表わされるアクリジンオレンジの４級化誘導体。 （２）構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔この式で、Ｘは構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （この式で、Ｒ＿１は水素原子または弗素原子であり、
   Ｒ＿２は弗素原子、トリフルオロメチル基または水素原
   子である） で表わされるＲ＿１および（または）Ｒ＿２置換ベンジ
   ル基あるいはＸはヒドロキルエチレンであり、Ｙ＾−は
   臭素又は沃素イオンである〕 で表わされるアクリジンオレンジの４級化誘導体の水性
   溶液を包含する、全血試料中の網状赤血球計量のための
   染料組成物。 （３）その上、緩衝システムを包含する、前項（２）に
   記載の染料組成物。 （４）緩衝システムがそのｐＨを約７．０に維持する、
   前項（３）に記載の染料組成物。（５）緩衝システムが
   パラホルムアルデヒドと蓚酸カリウムとを含む、前項（
   ３）に記載の染料組成物。 （６）前記パラホルムアルデヒドが約１．２５ｇ／ｌの
   濃度で、前記蓚酸カリウムが約９ｇ／ｌの濃度で存在す
   る、前項（５）に記載の染料組成物。 （７）前記アクリジンオレンジの４級化誘導体が２〜２
   ０μＭの濃度で存在する、前記（２）に記載の染料組成
   物。 （８）前記アクリジンオレンジの４級化誘導体が約７μ
   Ｍの濃度で存在する、前記（７）に記載の染料組成物。 （９）（ａ）試験すべき血液試料を、構造式▲数式、化
   学式、表等があります▼ 〔この式で、Ｘは構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （この式で、Ｒ＿１は水素原子または弗素原子であり、
   Ｒ＿２は弗素原子、トリフルオロメチル基または水素原
   子である） で表わされるＲ＿１および（または）Ｒ＿２置換のベン
   ジル基であるか、あるいはＸはヒドロキシエチレンであ
   り、Ｙ＾−は臭素又は沃素イオンである〕で表わされる
   アクリジンオレンジの４級化誘導体の水性溶液を含む試
   薬と混合して懸濁液を形成し、 （ｂ）その懸濁液を、その誘導体が網状赤血球により完
   全に取り込まれるよう充分な時間反応させ、 （ｃ）その懸濁液を青色レーザー光線源からの放射線に
   曝し、 （ｄ）その懸濁液からのオレンジ螢光強度を測定し、 （ｅ）前記測定値から試料中の網状赤血球量または百分
   率を決定する、 段階からなる、流通式血球計算法による全血試料中の網
   状赤血球の計測方法。 （１０）段階（ｂ）での反応時間が約３分間である、前
   項（９）に記載の方法。 （１１）試薬が緩衝システムを含む、前項（９）に記載
   の方法。 （１２）緩衝システムがｐＨを約７．０に維持する、前
   項（１１）に記載の方法。 （１３）緩衝システムがパラホルムアルデヒドと蓚酸カ
   リウムとを含む、前項（１１）に記載の方法。 （１４）前記パラホルムアルデヒドが約１．２５ｇ／ｌ
   の濃度で、前記蓚酸カリウムが約９ｇ／ｌの濃度で存在
   する、前項（１３）に記載の方法。 （１５）前記のアクリジンオレンジの４級化誘導体が約
   ２〜２０μＭの濃度で存在する、前項（１３）に記載の
   方法。 （１６）前記アクリジンオレンジの４級化誘導体が約７
   μＭの濃度で存在する、前項（１５）に記載の方法。 （１７）パラホルムアルデヒドと蓚酸カリウムとを含む
   試薬緩衝システム。 （１８）前記パラホルムアルデヒドが約１．２５ｇ／ｌ
   の濃度で、前記蓚酸カリウムが約９ｇ／ｌの濃度で存在
   する、前項（１７）に記載の試薬緩衝システム。