JP2007327879A - 試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】一般式(I)及び(II)で表される蛍光色素の少なくとも1種を含む、好塩基球及び/又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬により上記の課題を解決する。
【選択図】なし
Description
近年、フローサイトメトリの原理を応用した種々の自動血球計数装置が市販されており、血球細胞の分類・計数は、一般検査室で行なわれている。これらの自動血球計数装置を用いると、試料中の白血球の分類・計数を自動で行うことができる。
本発明の目的は、試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球からより明確に弁別し、計数することができる試料測定用試薬及び試料測定方法を提供することである。
一般式(I):
R1及びR2は互いに同一又は異なってアルキル基であり;
但し、
R3、R4、R5及びR6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり;
X-はアニオンである)
の蛍光色素、及び一般式(II):
R7及びR8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり;
R9、R10、R11及びR12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、R7〜R12のいずれか1つには酸性基が存在し;
R7〜R12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、R7〜R12に存在し得る酸性基のうちいずれか1つは、プロトンを放出した遊離の基である)
の蛍光色素から選択される少なくとも1種の蛍光色素を含む試料分析用試薬である。
本明細書において、「試料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取された血液、骨髄液、尿、アフェレーシスなどで採取した試料などの体液試料をいう。
本明細書において、一般式(I)及び(II)における「アルキル基」は、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は、通常、1〜20、好ましくは1〜10であるが、蛍光色素の水溶性の観点から、炭素数1〜6がより好ましい。該アルキル基の好ましい例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
上記の蛍光色素は、株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。
赤血球は、通常、約150mOsm/kg以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、赤血球内部のヘモグロビンを溶出し光学的に透明になる(溶血する)。光学的に透明になった赤血球は実質的にフローサイトメトリを用いる測定の障害とはならない。赤血球の溶血には、低い浸透圧条件及び低いpH条件が好ましい。この二つの条件を満足する浸透圧は、20mOsm/kg〜150mOsm/kgである。
本発明の試料分析用試薬中の上記の緩衝剤の濃度は、pHを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
上記の界面活性剤としては、次の式:
で表される四級アンモニウム塩、及び次の式:
で表されるピリジニウム塩が好ましく例示される。
このような界面活性剤は知られており、例えば特開2002−148261号に開示されたものを用いることができる。
本発明の試料分析用試薬中の上記の芳香族有機酸又はその塩の濃度は、試料分析用試薬のpHが上記の範囲となる濃度であれば特に限定されないが、0.1〜100mMが好ましく、1〜50mMがより好ましい。
あるいは、本発明のキットは、第一試薬及び第二試薬とは別に芳香族有機酸又はその塩を含む第三試薬をさらに含んでもよい。
該染色工程において、界面活性剤を用いる場合、界面活性剤と蛍光色素と試料とを混合する順序としては特に限定されない。界面活性剤と蛍光色素とを先に混合し、この混合液と試料とを混合してもよいし、界面活性剤と試料とを先に混合し、この混合液と蛍光色素とを混合してもよい。いずれの順序で混合しても同等の測定結果を得ることができる。
上記の染色工程では、本発明の試料分析用試薬を試料と混合するか、又は本発明の試料分析用試薬キットの各構成成分を試料と混合することもできる。
被験者2名からそれぞれ採取された血液試料2検体に含まれる好塩基球を、自動血球計数装置XE−2100(シスメックス製:赤半導体レーザ(633nm)を搭載)を用いて測定し、好塩基球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザーFBII(シスメックス製)を用いた。
測定の結果、これら試料は好塩基球の含量が高いことが認められた(以下、この試料をBaso試料1及びBaso試料2とする)。Baso試料1の好塩基球比率は2.3%、Baso試料2の好塩基球比率は1.7%であった。これらの結果を実施例1の対照とした。
次に、上記とは別の被験者2名からそれぞれ採取された血液試料2検体に含まれる有核赤血球を、自動血球計数装置XE−2100を用いて測定し、有核赤血球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザーNR(シスメックス製)を用いた。
測定の結果、これらの試料は有核赤血球が出現していることが認められた(以下、この試料をNRBC試料1及びNRBC試料2とする)。NRBC試料1の有核赤血球比率は3.0個/100WBC、NRBC試料2の有核赤血球比率は5.9個/100WBCであった。これらの結果を実施例1の対照とした。
サリチル酸10mM(pH:3.0)及びデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)3000ppmを含有する水溶液1mLを、35℃の恒温槽に入れた。ここに、図2及び3に記載の各色素(NK−1840 2ppm、NK−2929 6ppm、NK−3375 6ppm、NK−3662 6ppm、NK−5056 6ppm、NK−3620 6ppm、NK−9001 2ppm、NK−9002 2ppm、NK−9003 2ppm、NK−4249 2ppm、及びNK−3606 2ppm)を、それぞれ上記の濃度になるように加えて溶解させて、試料分析用試薬を得た。
Baso試料2には、NK9001を含む試薬、NK9002を含む試薬、NK9003を含む試薬、NK4249を含む試薬、及びNK3606を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
NRBC試料1には、NK1840を含む試薬、NK2929を含む試薬、NK3375を含む試薬、NK3662を含む試薬、NK5056を含む試薬、及びNK3620を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
NRBC試料2には、NK9001を含む試薬、NK9002を含む試薬、NK9003を含む試薬、NK4249を含む試薬、及びNK3606を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
また、表1及び2より、実施例1で算出された比率と比較例1で算出された比率とは近似した値であった。従って、本発明の試料分析用試薬を用いると、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
比較例1で用いた試料の代わりに、好塩基球の含量が高くかつ有核赤血球が出現している試料(以下、BN試料とする)を用いた以外は比較例1と同様にして好塩基球を測定し、好塩基球比率を算出した。好塩基球比率は2.1%であった。また、好塩基球の測定とは別に、BN試料を用いて有核赤血球の測定も行い、有核赤血球比率を算出した。有核赤血球比率は3.6個/100WBCであった。これらの結果を実施例2の対照とした。なお、好塩基球の測定には、試薬としてストマトライザーFBII(シスメックス製)、装置として自動血球計数装置XE−2100(シスメックス製)を用い、有核赤血球の測定には、試薬としてストマトライザーNR(シスメックス製)、装置として自動血球計数装置XE−2100(シスメックス製)を用いた。
実施例1で用いた試料の代わりにBN試料を用い、色素としてNK−2929、NK−3375、NK−3662及びNK−5056を含有する試料分析用試薬を用いた以外は実施例1と同様にして好塩基球及び有核赤血球の測定を行い、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。試料分析用試薬中の色素の濃度は6ppmとなるよう調整した。これらの比率を表3に示す。また、本実施例で作成した前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを図4に示す。
Claims (12)
- 好塩基球及び/又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬であって、
一般式(I):
R1及びR2は互いに同一又は異なってアルキル基であり;
但し、
R3、R4、R5及びR6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり;
X-はアニオンである)
の蛍光色素、及び一般式(II):
R7及びR8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり;
R9、R10、R11及びR12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、R7〜R12のいずれか1つには酸性基が存在し;
R7〜R12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、R7〜R12に存在し得る酸性基のうちいずれか1つは、プロトンを放出した遊離の基である)
の蛍光色素から選択される少なくとも1種の蛍光色素を含む試料分析用試薬。 - 前記一般式(II)のR7〜R12に存在し得る酸性基が、カルボキシル基又はスルホン酸基である請求項1に記載の試料分析用試薬。
- 前記一般式(II)のR7〜R12に存在し得る塩を形成している酸性基が、アルカリ金属塩の基又はアルキルアンモニウム塩の基である請求項1又は2に記載の試料分析用試薬。
- 赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤をさらに含有する、請求項1〜3のいずれか1つに記載の試料分析用試薬。
- 前記界面活性剤が、カチオン界面活性剤である請求項4に記載の試料分析用試薬。
- 前記カチオン界面活性剤が、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型である請求項5に記載の試料分析用試薬。
- pHが2.0〜4.5である請求項1〜6のいずれか1つに記載の試料分析用試薬。
- 芳香族有機酸をさらに含む請求項1〜7のいずれか1つに記載の試料分析用試薬。
- 前記芳香族有機酸が、サリチル酸、フタル酸及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも1つである請求項8に記載の試料分析用試薬。
- 好塩基球及び/又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬キットであって、
赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤を含む溶液と、
請求項1の一般式(I)の蛍光色素及び請求項1の一般式(II)の蛍光色素の少なくとも1種の蛍光色素を含む溶液
とを含む試料分析用試薬キット。 - 請求項1の一般式(I)の蛍光色素及び請求項1の一般式(II)の蛍光色素の少なくとも1種の蛍光色素により、試料中の血球を染色する工程;
前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程;及び
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び/又は有核赤血球を計数する工程
を含む、試料分析方法。 - 前記染色工程において、赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、損傷を受けた血球を前記蛍光色素により染色する請求項11に記載の方法。
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