JP2003329668A - 骨髄液有核細胞自動分析方法 - Google Patents

骨髄液有核細胞自動分析方法

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】簡便に高い赤芽球糸細胞に対する骨髄系細胞の
比（Ｍ／Ｅ比）を求めるための求めるための方法を提供
する。 【解決手段】 （１）骨髄液試料を２試料に分配し、
（２）一方試料を、第一溶血剤と混合して赤血球を溶解
し、蛍光色素を含む第１染色液と混合して染色し、他方
試料を第二溶血剤と混合した骨髄系幼若球以外の細胞を
損傷させ、蛍光色素を含む第２染色液と混合して染色
し、（３）（２）で染色した各試料をフローサイトメー
タに導入し、散乱光と蛍光を測定し、（４）工程（２）
の第１染色液で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を
用いて、白血球系、赤芽球系細胞及び脂質粒子を分類計
数し、工程（２）の第２染色液で染色した試料の散乱光
と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球お
よび骨髄系幼若球を分類計数し、骨髄系成熟白血球と骨
髄系幼若球とから骨髄系細胞数を算出し、（５）赤芽球
系細胞数と骨髄系細胞数とからＭ／Ｅ比を算出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は骨髄液有核細胞自動
分析方法に関し、より詳細には、フローサイトメータを
利用した骨髄液有核細胞の分類計数方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床検査の分野において、骨髄有核細胞
の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上で極めて
有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な
骨髄では白血球系細胞、赤芽球系細胞などの骨髄有核細
胞が一定の比率で存在するが、ある種の疾患が原因とな
り、骨髄有核細胞数、赤芽球系細胞数、白血球系細胞
数、骨髄系細胞数等が変化し、結果として骨髄系細胞と
赤芽球系細胞の比率（Myeloid/Erythroid比、以下M/E
比）が変動することがある。例えば、骨髄有核細胞数が
増加する疾患として、各種急性白血病、骨髄異形成症候
群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などが挙げ
られ、骨髄有核細胞数が減少する疾患として、再生不良
性貧血や低形成性白血病などが挙げられる。また、赤芽
球系細胞数が低下するものとしては、赤芽球癆などが挙
げられ、白血球系細胞数が増加する疾患として、各種白
血病や悪性リンパ腫の白血化などが挙げられる。さら
に、貧血の場合には、赤芽球系細胞が増加する。また、
Ｍ／Ｅ比が増加する疾患として、各種白血病や悪性リン
パ腫の白血化などが挙げられ、Ｍ／Ｅ比が減少する疾患
としては、無顆粒症や各種貧血などが挙げられる。特に
急性白血病では、ＦＡＢ分類に従って判定が行われてお
り、骨髄有核細胞数、Ｍ／Ｅ比が使われている。このよ
うに骨髄有核細胞、骨髄系細胞、赤芽球系細胞を分類計
数し、Ｍ／Ｅ比を求めることは、疾患同定、造血器細胞
産生能などを調べる上で極めて有用である。
【０００３】従来、骨髄に含まれる各種の成分の分類計
数を行うには、骨髄の塗抹標本を作製し、適当な染色を
施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般
的であった。一方、近年、フローサイトメータの原理を
応用した種々の全自動血球分類計数装置が提供されてい
る。例えばリンパ系白血球、骨髄系成熟白血球および脊
髄系幼若球を分類計数する方法として、幼若白血球以外
に損傷を与えた後に幼若白血球以外の損傷された成熟白
血球を選択的に染色する蛍光色素を利用する方法が特開
平１０−２０６４２３号に開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法で
は、骨髄系細胞を分類計数することはできるが、赤芽球
系細胞を分類計数することができないので、別の方法で
赤芽球系細胞を測定し、その結果を用いて、Ｍ／Ｅ比を
求めることが必要であった。従って、Ｍ／Ｅ比を求める
ための簡便で精度の高い方法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、同一の骨髄液
試料を少なくとも２つに分配し、それぞれ試料を溶血処
理および染色して、赤芽球系細胞数および骨髄系細胞数
を同時に測定し、その結果を用いることにより高精度で
簡便にＭ／Ｅ比を得ることが可能な骨髄液有核細胞自動
分析方法を提供する。詳細には、（１） 骨髄液試料を
２つの試料に分配し、（２）（ｉ）分配した一方の試料
を、第一の溶血剤と混合して、前記試料中の赤血球を溶
解するとともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂
質粒子を染色に好適な状態し、少なくとも白血球系細
胞、赤芽球系細胞および脂質粒子の間に蛍光強度の差異
を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第１の染色液と
混合して染色し、および（ｉｉ） 分配した他方の試料
を、第二の溶血剤と混合し、前記試料中の骨髄系幼若球
以外の細胞を損傷させるとともに、骨髄系成熟白血球、
リンパ系白血球および骨髄系幼若球を染色に好適な状態
にし、少なくとも、骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球
を含む第1グループと、骨髄系幼若球を含む第2グループ
の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１
つ含む第２の染色液と混合して染色し、（３） （２）
で染色した試料のそれぞれをフローサイトメータに導入
して、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光
を測定し、（４）（ｉ） 工程（２）（ｉ）で染色した
試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、白血球系細胞、
赤芽球系細胞および脂質粒子を分類計数し、（ｉｉ）
工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用
いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系
幼若球を分類計数し、（ｉｉｉ）前記骨髄系成熟白血球
と骨髄系幼若球とから、骨髄系細胞数を算出し、（５）
赤芽球系細胞数と骨髄系細胞数とから、赤芽球系細胞
に対する骨髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）を算出することか
らなる骨髄液有核細胞自動分析方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明でいう骨髄液は、骨髄穿刺
液など、骨髄系細胞、赤芽球系細胞を含む試料をいう。
本発明では、骨髄液試料の前処理は特に必要としない
が、骨片、血球細胞凝集などの存在により、白血球系細
胞及び赤芽球系細胞の測定に障害が発生するようであれ
ば、必要に応じて、フィルタレーションを行ってもよ
い。また、緩衝剤、キレート剤、抗凝固剤等を含む水溶
液で希釈してもよい。ここで使用することができる緩衝
剤としては、後述するような緩衝剤を使用することがで
きる。また、キレート剤としては、ＥＤＴＡ塩等を使用
することができる。抗凝固剤としては、特に限定されな
いが、例えば、ヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩等を
使用することができる。水溶液で希釈する場合の希釈倍
率は、５〜１００倍程度（容量）が適当であり、好まし
くは１０〜５０倍程度である。
【０００７】本発明では、まず、工程（１）において、
骨髄液試料を２つの試料に分配し、それぞれを反応チャ
ンバに導入する。反応チャンバは別々のものでもよい
し、同一でもよい。反応チャンバ毎に異なる処理を行
い、同一試料から赤芽球系細胞数および骨髄系細胞数を
それぞれ得るためである。
【０００８】本発明では、工程（２）において、それぞ
れの試料を溶血処理および染色する。工程（２）（ｉ）
において、骨髄液試料に第１の溶血剤を混合する。これ
によって、骨髄液試料中に含有される赤血球を、後述す
る各種細胞成分の測定の障害とならない程度に溶解する
とともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞及び／又は脂質
粒子を染色に好適な状態にすることができる。ここで、
染色に好適な状態とは、各細胞膜にはダメージとならな
い程度の損傷を与えるが、実質的に生きた細胞と同様の
機能、形状等を維持しうる状態を意味する。また、赤芽
球系細胞の細胞膜も赤血球と同様に細孔を生じ、溶血す
るが、赤芽球系細胞の細胞核の状態は、ほぼ生きた細胞
と同様に保たれる。白血球系細胞の細胞膜への傷害は明
確ではないが、光学的顕微鏡による観察では、生きた細
胞と顕著な差は認められず、実質的に生きた細胞と同様
に保つことができる。
【０００９】第１の溶血剤は、このような作用を示すも
のであれば、その組成は特に限定されない。赤血球は、
若干の個体差があるが、通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下
の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、細胞内部のヘモグロビ
ンを流出し、光学的に透明となる（溶血する）。光学的
に透明となった赤血球は、後述する各種細胞成分測定の
障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低いほ
ど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。したがって、本
発明における第１の溶血剤では、個体差を考慮して、１
００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧であることが好まし
く、３０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度がより好ましい。
また、ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、白血球
系細胞及び赤芽球系細胞にも過度の障害を与えることと
なり、後述する両者の間の蛍光強度の差異が得にくくな
るため、酸性側、特に２．０〜５．０程度のｐＨが適当
であり、より好ましくは２．５〜４．５程度である。
【００１０】このような浸透圧及びｐＨを実現するため
に、第１の溶血剤は、例えば、電解質、糖類、緩衝剤等
を含有する水溶液であることが好ましく、さらに、分子
内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩
を含有している場合には、より効果的に（短時間に）赤
血球を溶血ことができるため好ましい。また、第１の溶
血剤は、界面活性剤を含むことが好ましい。電解質とし
ては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等が挙げられる。糖質として
は、単糖類、多糖類、オリゴ糖糖が挙げられ、具体的に
は、グルコース、ラクトース、スクロース糖が挙げられ
る。緩衝剤としては、設定するｐＨ±２．０の付近にｐ
Ｋａを有する緩衝剤が挙げられ、具体的には、クエン
酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロン酸
等が挙げられる。有機酸又はその塩としては、例えばサ
リチル酸、フタル酸等又はこれらのアルカリ金属塩（ナ
トリウム塩、カリウム塩等）等が挙げられる。これら
は、緩衝剤としても作用する。これらの濃度は、例え
ば、０．１〜１００ｍＭ程度が適当であり、１〜３０ｍ
Ｍ程度が好ましい。
【００１１】第１の溶血剤中の界面活性剤は、難溶性の
色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集防止、血小板凝集
防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進等を行うこ
とができるものであればよく、例えば、以下の界面活性
剤を単独又は２種以上で使用することが好ましい。
【００１２】式（ＶＩ）：
【化１１】 （式中、Ｒ1VI、Ｒ2VI及びＲ3VIは同一又は異なって、
水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；
Ｒ4VIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又
はＣ6-18のアラルキル基；ＸVI-はアニオンである。）
の化合物、
【００１３】式（ＶＩＩ）：
【化１２】 （式中、Ｒ1VIIはＣ8-18のアルキル基；ＸVII-はアニオ
ンである。）の化合物、
【００１４】式（ＶＩＩＩ）：
【化１３】 （式中、Ｒ1VIIIおよびＲ2VIIIは同一又は異なって、水
素原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；
Ｒ3VIIIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基
又はＣ6-18のアラルキル基；ｎＶＩＩＩは１又は２であ
る。）の化合物、
【００１５】式（ＩＸ）：Ｒ1IX−Ｒ2IX−（ＣＨ2ＣＨ2
Ｏ）nIX−Ｈ （ＩＸ）（式中、Ｒ1IXはＣ9-25のア
ルキル基、アルケニル基又はアルキニル基；Ｒ2IXは
式：
【化１４】 で表される基または−ＣＯＯ−；ｎＩＸは１０〜４０で
ある。）の化合物、および以下の式；
【００１６】
【化１５】
【００１７】
【化１６】 で表される化合物。
【００１８】式中、Ｃ1-8のアルキル基としては、メチ
ル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、イソ
ペンチル、ネオペンチル、ｔ−ペンチル、イソヘキシ
ル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。好ましくは、
Ｃ1-3のアルキル基である。Ｃ6 -8のアラルキル基として
は、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。
【００１９】Ｃ8-18のアルキル基としては、オクチル、
デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げら
れる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシルなど
のＣ 10-18の直鎖のアルキル基である。Ｃ8-18のアルケ
ニル基としては、オクテニル、デセニル、ドデセニル、
テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ6-18のアラルキル基
としては、フェニルプロピレン、フェニルブテン、ナフ
チルメチレン、ナフチルエチレン、ナフチルプロピレ
ン、ビフェニルメチレン、ビフェニルエチレン等が挙げ
られる。
【００２０】また、Ｃ9-25のアルキル基としては、上記
アルキル基の他、イコシル、ヘンイコシル、トコシル、
トリコシル等が挙げられる。Ｃ9-25のアルケニル基とし
ては、上記アルケニル基の他、イコセニル、ヘンイコセ
ニル等が挙げられる。Ｃ9-25のアルキニル基としては、
上記アルキニル基の他、イコシニル、ヘンイコシニル等
が挙げられる。アニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、
塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオ
ン（ＢＦ4 -、ＢＣｌ4 -、ＢＢｒ4 -等）、リン化合物イオ
ン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチ
ル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをも
つアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ
素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオン又は
ＢＦ4 -が好ましい。上記に記載した界面活性剤のうち、
ＭＥＧＡ−８からＣＨＡＰＳＯまでは株式会社同仁化学
研究所より購入することができる。
【００２１】界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤
の種類、併用する赤血球溶解剤の成分及び濃度等により
適宜調整することができる。通常、界面活性剤の濃度が
高すぎる場合、赤血球のみならず、白血球系細胞及び赤
芽球系細胞にも過度の傷害を与え、特に赤芽球系細胞の
形状を変化させ、後述する赤芽球系細胞と脂質粒子と白
血球系細胞との蛍光強度の差異を小さくする問題があ
る。したがって、例えば、１０〜１００００ｍｇ／Ｌ程
度が好ましく、１００〜５０００ｍｇ／Ｌ程度であるこ
とがより好ましく、１０００〜３０００ｍｇ／Ｌがさら
に好ましい。なお、この濃度は第１溶血剤における界面
活性剤の濃度である。骨髄液試料と、第１溶血剤との混
合は、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜
１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間行うことが適当で
ある。
【００２２】次いで、骨髄液試料を、蛍光色素で染色す
る。この際、少なくとも脂質粒子、白血球系細胞及び赤
芽球系細胞の間に蛍光強度の差異を生じさせる蛍光色素
を少なくとも１つ含む第１の染色液を用いることが必要
である。このような蛍光色素は、例えば、以下の群から
選択することができる。
【００２３】式（Ｉ）：
【化１７】 （式中、Ｒ1IおよびＲ2Iは同一または異なって、水素原
子、水酸基で置換されていてもよい低級アルキルまたは
低級アルキニル基；ＹIおよびＺIは同一または異なっ
て、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、又は低級アルキル
基を有する炭素原子；ｎＩは０、１又は２；ＸI-はアニ
オンである。）の化合物、
【００２４】式（ＩＩ）：
【化１８】 （式中、Ｒ1IIは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IIお
よびＲ3IIは同一または異なって、水素原子、低級アル
キル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4IIは水素原子、アシ
ル基または低級アルキル基；ＺIIは硫黄原子、酸素原
子、または低級アルキル基を有する炭素原子；ｎＩＩは
０、１又は２；ＸII-はアニオンである。）の化合物、
【００２５】式（ＩＩＩ）：
【化１９】 （式中、Ｒ1IIIは水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ
2IIIは低級アルキル基、Ｒ 3IIIは水素原子又はジメチル
アミノ基；ｎIIIは１又は２；ＸIII-はアニオンであ
る。）の化合物、
【００２６】式（ＩＶ）：
【化２０】 （式中、Ｒ1IVは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IVは
ジメチルアミノ基；Ｒ3I Vは水素原子又はアミノ基；Ｒ
4IVは水素原子、低級アルキル基又はアミノ基；Ｒ 5IVは
水素原子又はジメチルアミノ基；ＸIV-はアニオン；Ｙ
IVは硫黄又は酸素原子である。）の化合物、
【００２７】式（Ｖ）：
【化２１】 （式中、Ｒ1Vは水素原子又は水酸基；Ｒ2Vは水素原子又
はスルホン酸基；Ｒ3Vは水素原子又はスルホン酸基；Ｙ
V+はアルカリ金属イオンである。）の化合物、および以
下の式：
【００２８】
【化２２】
【００２９】
【化２３】
【００３０】
【化２４】
【００３１】式中、ヘテロ環の窒素原子又は炭素原子に
結合するアルキル基は、炭素数１〜２０、好ましくは、
１〜１０、より好ましくは１〜６の直鎖又は分岐のアル
キル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｔ
−ブチル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等
が挙げられる。
【００３２】低級アルキル基とは炭素数１〜８の直鎖又
は分岐アルキル基であり、例えば、メチル、エチル等が
挙げられる。低級アルコキシル基とは炭素数１〜８の直
鎖又は分岐アルコキシル基であり、例えば、メトキシ、
エトキシ等が挙げられる。低級アルキニル基とは炭素数
２〜５のアルキニル基であり、例えば、エチニル、プロ
ピニル、ブチニル、ペンチニル等が挙げられる。アシル
基としては炭素数１〜３のもの、例えば、ホルミル、ア
セチル、プロピオニルが挙げられる。アニオンとして
は、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-などのハロゲンイオン及び
ＣＦ3ＳＯ3 -、ＢＦ4 -、ＣｌＯ4 -等が挙げられる。アル
カリ金属イオンとは、リチウム、ナトリウム、カリウム
イオン等が挙げられる。
【００３３】上記に記載した色素のうちＮＫシリーズ
は、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ７３０、Ｌ
Ｄ７００はＥｘｃｉｔｏｎ社より、その他のものは市販
品を購入することができる。
【００３４】蛍光色素は、第１の溶血剤による赤血球の
溶解等の工程を経た後、適当な溶媒（水、低級アルコー
ル、エチレングリコール、ＤＭＳＯ等）に溶解して作用
させてもよいし、また、第１の溶血剤に溶解して、これ
らを骨髄液試料に混合すると同時に作用（混合）させて
もよい。
【００３５】本発明の骨髄液試料を第１の溶血剤および
第１の染料液と混合して染色する工程の好ましい具体的
態様としては、サリチル酸などの有機酸、色素、及び界
面活性剤を精製水に溶解し、ＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用
いてｐＨを調整して得られる試薬を骨髄液試料と混合
し、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜１
２０秒間、好ましくは５〜４０秒間反応させるものであ
る。
【００３６】色素の濃度は使用する色素の種類により異
なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは
０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜３．０
ｍｇ／Ｌである。なお、この濃度は骨髄液試料と、第１
の溶血剤及び蛍光色素とを混合した状態での濃度であ
る。
【００３７】これにより、白血球系細胞は強く染色さ
れ、強い蛍光を発する。赤芽球系細胞は弱く染色され、
弱い蛍光を発する。また、脂質粒子も弱く染色され、弱
い蛍光を発する。白血球系細胞と赤芽球系細胞との蛍光
強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそら
く赤芽球系細胞の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、
色素の細胞核への取り込みが阻害されるからであると考
えられる。
【００３８】工程（２）（ｉｉ）において、工程（２）
（ｉ）とは別に、骨髄液試料に第２の溶血剤と混合す
る。これによって、骨髄液試料中に含有される骨髄系幼
若白血球以外の白血球を損傷させる。通常の白血球は、
細胞内に不要な物質（例えば色素）を排除する物質排除
機能を有している。白血球の損傷とは、通常、生きた白
血球の細胞膜を通過しない色素がその細胞膜を透過可能
にするような操作である。具体的には、特定の組成の溶
血剤を細胞に作用させた場合、作用機序は明確ではない
が、特定の細胞（例えば、正常白血球）の細胞膜脂質構
成成分の一部を抽出（引き抜く）することにより、細胞
膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける。この
細孔を通じて、細胞膜を透過可能にし、その結果、特定
の細胞内に色素分子が入り込み染色することができる。
一方、骨髄系幼若球は、色素の透過を可能とするだけの
細孔があけられないために、色素で染色されない。
【００３９】なお、本発明でいう白血球系細胞は、リン
パ系白血球、骨髄系成熟白血球および骨髄系幼若球に分
類される。そのうち、リンパ系白血球とは、成熟リンパ
球、未成熟リンパ球、異型リンパ球のことをいう。骨髄
系成熟白血球とは、成熟した単球、顆粒球のことをい
う。骨髄系幼若球とは、通常骨髄に存在し、末梢血に存
在しない未成熟な骨髄系白血球をいう。例えば、骨髄系
芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球をいう。骨髄系芽球
とは、骨髄芽球（Myeloblast）と単芽球（Monoblast）
のことをいう。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球について
は、まとめて顆粒球系幼若球とすることもある。また骨
髄系芽球と顆粒球系幼若球をまとめて骨髄系幼若球とす
ることもある。さらには、芽球以前の分化段階の細胞で
ある、骨髄系幹細胞（CFU-GEMN）、好中球・マクロファ
ージコロニー形成細胞（CFU-GM）、好酸球コロニー形成
細胞（CFU-EOS）等の白血球系の造血前駆細胞も本発明
の骨髄系幼若球の範囲に含む。骨髄系成熟白血球と成熟
リンパ球をあわせて成熟白血球とする。
【００４０】本発明で用いる第二の溶血剤は、界面活性
剤、可溶化剤、アミノ酸および緩衝液とからなるのが好
ましい。界面活性剤としては種々のものを使用すること
ができ、たとえば、以下の式（ＸＩ）：Ｒ1XI−Ｒ2XI−
（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎXI−Ｈ （ＸＩ）（式中、Ｒ
1XIはＣ10-25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニ
ル基；Ｒ2XIは
【化２５】 または−ＣＯＯ−；ｎXIは１０〜４０である。）を有す
るものが挙げられる。
【００４１】Ｃ10-25のアルキル基としては、デシル、
ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル等が
挙げられる。Ｃ10-25のアルケニル基としては、ドデセ
ニル、テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ10-25のアル
キニル基としては、ドデシニル、ウンデシニル、ドデシ
ニル等が挙げられる。具体的には、ポリオキシエチレン
（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１
５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オ
レイルエーテルが好適である。
【００４２】界面活性剤の濃度については、使用するも
のによって異なるが、ポリオキシエチレン系ノニオン性
界面活性剤の場合、疎水性基の炭素数が同じであれば、
ｎXIの数が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎ
XIが大きくなるほど弱くなる。また、ｎXIの数が同じで
あれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を
損傷する力が強くなる。その点を考慮し、必要な界面活
性剤濃度は実験により簡単に求めることができる。具体
的には、前述のポリオキシエチレン（２０）ラウリルエ
ーテルでは、０．１〜２．０ｇ／Ｌ（好ましくは０．５
〜１．５ｇ／Ｌ）、ポリオキシエチレン（１５）オレイ
ルエーテルでは、１〜９ｇ／Ｌ（好ましくは３〜７ｇ／
Ｌ）、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルで
は、５〜５０ｇ／Ｌ（好ましくは１５〜３５ｇ／Ｌ）の
範囲で使用できる。
【００４３】第２の溶血剤中の可溶化剤は以下のもの：
式（ＸＩＩ）：
【化２６】 （式中、Ｒ1XIIはＣ10-22のアルキル基；ｎXIIは１〜５
である。）のサルコシン誘導体あるいはその塩、
【００４４】式（ＸＩＩＩ）：
【化２７】 （式中、Ｒ1XIIIは水素原子または水酸基。）のコール
酸誘導体、および
【００４５】式（ＸＩＶ）：
【化２８】 （式中、ｎXIVは５〜７である。）メチルグルカンアミ
ドから選択される１またはそれ以上を用いることができ
る。
【００４６】C10-22のアルキル基としては、デシル、ド
デシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。具体
的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウ
ロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサル
コシン、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネー
ト）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）
ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン
スルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナイノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド）等が好適に使用できる。
【００４７】可溶化剤の濃度は、サルコシン酸誘導体あ
るいはその塩では、０．２〜２．０ｇ／Ｌ、コール酸誘
導体では、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、メチルグルカンアミ
ドでは、１．０〜８．０ｇ／Ｌが好ましい。その他に、
可溶化剤としては、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュ
ークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシ
ルアラニン等が使用でき、０．０１〜５０．０ｇ／Ｌの
濃度で用いるのが好ましい。
【００４８】第２の溶血剤中のアミノ酸としては、タン
パク質を構成するアミノ酸を使用でき、グルタミン酸、
バリンや、特にメチオニン、シスチン及びシステイン等
のような含硫アミノ酸が好適であり、メチオニンが最も
好適である。使用量は、１〜５０ｇ／Ｌの範囲で使用で
き、グルタミン酸の場合は８〜１２ｇ／Ｌが好適であ
り、メチオニンの場合には、１６〜２４ｇ／Ｌが好適で
ある。
【００４９】第２の溶血剤中の緩衝液は、ＨＥＰＥＳ等
のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等に水酸化ナトリウム
等のようなｐＨ調整剤を加え、必要があれば、塩化ナト
リウムのような浸透圧調整剤をさらに加え、ｐＨを５．
０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇと
するものが好ましい。特に、（１）骨髄系幼若球の細胞
質及び細胞膜を固定化するためのポリオキシエチレン系
ノニオン界面活性剤；（２）血球の細胞膜に損傷を与え
縮小化するための可溶化剤；（３）骨髄系幼若球の細胞
質及び細胞膜を固定化するためのアミノ酸；および
（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６
００ｍＯｓｍ／ｋｇにする緩衝液からなる、特開平６−
２７３４１３号に記載の溶血剤が好ましい。
【００５０】本発明の第２の染色液中の、骨髄系成熟白
血球とリンパ系白血球を含む第1グループと、骨髄系幼
若球を含む第2グループの間に蛍光強度の差異を生じる
蛍光色素は、損傷を与えた細胞又は骨髄系幼若球のうち
いずれか一方を染色できるものであればよい。損傷を与
えた細胞を染色するための色素とは、細胞核、特にＤＮ
Ａに対して特異性を有する色素あるいはＲＮＡに特異性
を有する色素が挙げられる。この目的には、いくつかの
カチオン性色素が好適である。一般的にカチオン性色素
は、生きた細胞の細胞膜を通過し、細胞内構成成分を染
色する。しかしながら、特定のカチオン性色素（例え
ば、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド
等）は、生細胞を通過せず、損傷細胞のみを染色するこ
とがよく知られている。
【００５１】第２の染色液中の蛍光色素は、具体的に
は、前述のエチジウムブロマイド、プロピジウムアイオ
ダイド、さらにモレキュラープローブ社より販売されて
いるエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウ
ムアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホ
モダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−
１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−
３等が挙げられる。さらに光源としてＨｅ−Ｎｅ、赤色
半導体レーザを使用する場合に好適な色素として、式
（Ｘ）：
【００５２】
【化２９】 （式中、Ｒ1Xは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2X及び
Ｒ3Xは水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基；Ｒ4Xは水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ
5Xは水素原子、置換されてもよい低級アルキル基；ＺX
は硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された
炭素原子；ｎXは１又は２；ＸX-はアニオンである。）
で示される色素が使用できる。
【００５３】上記構造式のＲ1X、Ｒ2X、Ｒ3X、Ｒ4X、Ｒ
5XおよびＺXにおける低級アルキル基は、Ｃ1-6の直鎖又
は分岐のアルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピ
ル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でもメチル
基、エチル基が好ましい。Ｒ2X及びＲ3Xにおける低級ア
ルコキシ基は、Ｃ1-6のアルコキシ基を意味し、例えば
メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でも
メトキシ基、エトキシ基が好ましい。Ｒ4Xにおけるアシ
ル基は、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好
ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げら
れ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル
基は上記と同様である。Ｒ5Xにおける置換されてもよい
低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子
（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されてもよ
い低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換
されたメチル基、エチル基が好ましい。ＺXとしては硫
黄原子が好ましい。ＸX-におけるアニオンは、ハロゲン
イオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロ
ゲン化ホウ素イオン（ＢＦ4 -、ＢＣｌ4 -、ＢＢｒ
4 -等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フ
ルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲ
ンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有
するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられ
る。中でも臭素イオン又はＢＦ4 -が好ましい。
【００５４】上記色素の具体的な例としては、好ましく
は以下のような色素が挙げられるが、これにより本発明
が制限されるものではない。
【００５５】
【化３０】
【００５６】本発明の骨髄液試料を第２の溶血剤および
第２の染料液と混合して染色する工程の好ましい具体的
態様としては、色素を含む第二の溶血剤を骨髄液と混合
するものである。色素を含む第二の溶血剤は、あらかじ
め色素を第２の溶血剤に溶解させて調製するか、または
エチレングリコール等の水溶性有機溶媒中の色素の溶液
を使用時に第二の溶血剤と混合して調製する。この場
合、使用時に混合すると、色素の保存安定性を高めるこ
とができるので好ましい。色素の濃度は、使用する色素
に応じて適宜決定できる。例えば、エチジウムブロマイ
ドの場合、０．０１〜１００ｍｇ／Ｌであり、０．１〜
３０ｍｇ／Ｌが好ましい。骨髄液試料と色素を含む第二
の溶血剤の混合は、骨髄液試料と色素を含む第２の溶血
剤の比が１：１０〜１：１０００、反応温度が２０〜４
０℃、反応時間が５秒〜５分間で好適に実施できる。反
応温度が高いときは反応時間を短くすることが好まし
い。
【００５７】工程（３）において、工程（２）（ｉ）ま
たは（ｉｉ）で調製したそれぞれの試料をフローサイト
メータに導入して、少なくとも１つの散乱光と少なくと
も１つの蛍光を測定する。フローサイトメータは市販の
いずれのものでも使用することができる。本発明でいう
散乱光は、一般に市販されるフローサイトメータで測定
できる散乱光をさし、前方低角散乱光（受光角度の例と
して、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例
として、５〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度は９
０度付近）等をいい、好ましくは、側方散乱光が選ば
れ、この散乱光は細胞の核形態などのような内部情報を
反映する。蛍光とは、前述の細胞成分を染色した色素か
ら発せられるもので、使用する色素によって好適な受光
波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映
するものである。フローサイトメータの光源は、特に限
定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。
例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤
色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは
気体レーザに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅
に下げることができる。
【００５８】工程（４）において、工程（２）（ｉ）ま
たは（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を
用いて、細胞を分類計数する。具体的には、工程（４）
（ｉ）として、工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱
光と蛍光の強度差を用いて、脂質粒子、赤芽球系細胞及
び白血球系細胞を、それぞれ分類計数する。「測定した
散乱光と蛍光の強度差を用いて、脂質粒子、赤芽球系細
胞及び白血球系細胞を、それぞれ分類計数する」には、
まず、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に側方散乱光をとって
スキャッタグラムを描く。この場合、図１に示すよう
に、赤芽球系細胞及び白血球系細胞、脂質粒子及びゴー
スト化した細胞の各細胞が、集団（クラスター）を形成
して分布する。次いで、適当な解析ソフトを用いて、各
集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解
析する。これにより、脂質粒子、赤芽球系細胞及び白血
球系細胞を分類計数することができる。また、赤芽球系
細胞数と白血球系細胞数とから、赤芽球系細胞と白血球
系細胞数との割合を算出することができる。また、白血
球系細胞数と赤芽球系細胞数とを合わせることにより、
骨髄有核細胞数を算出することができる。
【００５９】工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱光
と蛍光との強度差を用いて、赤芽球系細胞を成熟度ごと
に少なくとも２つに分類計数することができる。赤芽球
系細胞を成熟度ごとに分類計数するには、実質的に上記
と同様にスキャッタグラムを描き、図１に示すように、
赤芽球系細胞の成熟度ごとの集団の領域を設定し、その
領域内に含まれる細胞数を解析する。これにより、赤芽
球系細胞数と、成熟度ごとの赤芽球系細胞数とから、全
赤芽球系細胞に対する各成熟度の赤芽球の割合を算出す
ることができる。白血球系細胞と赤芽球系細胞との比
は、通常２：１〜５：１である。白血病などの疾患によ
り、これらの比率は変化する。また、これらの比率は、
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）や骨髄異形成症候群（ＭＤ
Ｓ）の診断に有用である。したがって、経日的に測定す
ることにより、各種白血病の病態把握、治療モニタリン
グなどが可能である。さらに骨髄有核細胞中の赤芽球系
細胞数から、骨髄中のエリスロポエーシスの状態を把握
することもできる。
【００６０】また、工程（４）（ｉｉ）として、工程
（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用い
て、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼
若球を、それぞれ分類計数する。「測定した散乱光と蛍
光の強度差を用いて、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血
球および骨髄系幼若球を、それぞれ分類計数する」に
は、まず、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に側方散乱光をと
ってスキャッタグラムを描く。この場合、図２に示すよ
うに、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系
幼若球が、集団（クラスター）を形成して分布する。次
いで、適当な解析ソフトを用いて、各集団の領域を設定
し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。これによ
り、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼
若球の数を計数することができる。
【００６１】さらに、工程（４）（ｉｉｉ）として、前
記骨髄系成熟白血球と骨髄系幼若球とを合わせることに
より、骨髄系細胞数を算出することができる。このよう
にして得られた赤芽球系細胞数と、骨髄系細胞数とか
ら、赤芽球系細胞に対する骨髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）
を算出することができる。
【００６２】工程（２）（ｉｉ）で染色した試料の散乱
光と蛍光との強度差を用いて、骨髄系成熟白血球を少な
くとも２つに分類計数することができる。骨髄系成熟白
血球を分類計数するには、実質的に上記と同様にスキャ
ッタグラムを描き、図２に示すように、単球および顆粒
球の集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数
を解析する。
【００６３】また、工程（２）（ｉｉ）で染色した試料
の散乱光と蛍光との強度差を用いて、骨髄系幼若球を少
なくとも２つに分類計数することができる。骨髄系幼若
球を分類計数するには、実質的に上記と同様にスキャッ
タグラムを描き、図２に示すように、骨髄系芽球および
顆粒球系幼若球の集団の領域を設定し、その領域内に含
まれる細胞数を解析する。
【００６４】なお、本発明の方法においては、工程
（２）（ｉ）および（ｉｉ）はいずれを先に行っても同
時に行ってもよく、工程（４）（ｉ）および（ｉｉ）も
いずれを先に行っても同時に行ってもよい。
【００６５】また、本発明に従えば、本発明の方法を実
現するための、骨髄液試料を分配するための分配手段
と、分配された骨髄液試料を試薬と反応させるための反
応チャンバと、フローサイトメータと、溶血剤および／
または染色液からなる試薬を反応チャンバに供給するた
めの試薬供給手段と、反応チャンバで調製された測定用
試料をフローサイトメータのフローセルに導入するため
の測定用試料導入手段とからなる骨髄液有核細胞自動分
析用システムが提供される。
【００６６】骨髄液有核細胞自動分析用システムは、概
略的に図５に示すことができる。分配手段は、吸引吐出
ポンプ（１）、サンプリングバルブ（２）、試料吸引ピ
ペット（３）からなる。反応チャンバは、第１の反応チ
ャンバ（１３）および第２の反応チャンバ（１４）から
なる。フローサイトメータは、フローセル（１５）、前
方（低角または高角）散乱光用検出器（１７）、側方散
乱光用検出器（１８）、蛍光用検出器（１９）および解
析部（２０）からなる。試薬供給手段は、第１溶血剤庫
（５）、第１染料庫（６）、第２溶血剤庫（７）、第２
染料庫（８）および各々にチューブを介して接続された
吸引吐出ポンプ（９）〜（１２）からなる。測定用試料
導入手段は、陰圧ポンプ（１６）を用いることができ
る。
【００６７】具体的には、試験管４中の骨髄液試料は試
料吸引ピペット（３）から吸引吐出ポンプ（１）により
チューブを介してサンプリングバルブ（２）に導入さ
れ、所定量採取される。採取された骨髄液試料は、サン
プリングバルブ（２）を経て第１の反応チャンバ（１
３）または第２の反応チャンバ（１４）に、吸引吐出ポ
ンプ（９）または（１１）によりチューブを介して導入
される。本発明でいうサンプリングバルブとは、セラミ
ック等の円形状板を３枚重ねたものをいう。サンプリン
グバルブは、2枚の固定素子の間に挟まれた可動素子か
らなり、固定素子には流入用通路及び／または流出用通
路が設けられ、可動素子には定量用通路が設けられてい
る。試料は流入用通路−定量用通路−流出用通路と流
れ、可動素子が回転することによって試料が定量され
る。また、固定素子には試薬流入用通路及び／または試
薬流出用通路が設けられており、試薬が試薬流入用通路
−定量用通路−試薬流出用通路と流れるように可動素子
が回転する。次いで、定量された試料が試薬によって反
応チャンバへ送出される。このようなサンプリングバル
ブは血液分析装置で使用されている。第１の反応チャン
バ（１３）には、第１溶血剤庫（５）から吸引吐出ポン
プ（９）により所定量採取された第１の溶血剤がサンプ
リングバルブ（２）を経て骨髄液試料とともにチューブ
を介して導入され、該チャンバ（１３）中で骨髄液試料
と混合される。その後、第１染色液庫（６）から吸引吐
出ポンプ（１０）により所定量採取された第１の染色液
を該チャンバ（１３）に導入して、白血球系細胞等を染
色する。このようにして得られた試料を、陰圧ポンプ
（１６）などによりチューブを介して該チャンバ（１
３）からフローセル（１５）に導入して、散乱光および
蛍光を測定する。測定後、前方（低角または高角）散乱
光用検出器（１７）、側方散乱光用検出器（１８）およ
び蛍光用検出器（１９）で検出した散乱光および蛍光の
データを解析部（２０）で解析し、骨髄液有核細胞を分
類計数する。第２の反応チャンバ（１４）にも、上記と
同様にして第２溶血剤庫（７）および第２染色剤庫
（８）から導入された溶血剤および染色剤で処理して、
フローセル（１５）にて測定され、得られたデータを解
析部（２０）で解析し、骨髄液有核細胞を分類計数して
Ｍ／Ｅ比を算出する。
【００６８】本発明を以下の実施例によってさらに詳し
く説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であ
り、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定
されるものではない。
【００６９】実施例 以下の組成の試薬を調製した。 第１の溶血剤 サリチル酸（市販品） １０ｍＭ ＬＴＡＣ（ト゛テ゛シルトリメチルアンモニウムクロライト゛）（市販品） ０．３ｇ／Ｌ 精製水 １Ｌ ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧 ４０ｍＯｓｍ／ｋｇ） 第１の染色液 ＮＫ−２８２５（日本感光色素研究所（株）） ０．３ｍｇ／Ｌ （エチレングリコール溶液）
【００７０】 第２の溶血剤 ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２４．０ｇ／Ｌ Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム １．５ｇ／Ｌ ＤＬ−メチオニン ２０．０ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ １２．０ｇ／Ｌ １Ｎ−ＮａＯＨ ０．３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ４．０ｇ／Ｌ 第２の染色液 式（ＸＶ）の色素 ３．０ｍｇ／Ｌ （エチレングリコール溶液）
【００７１】試験管（４）内の急性骨髄性白血病（ＡＭ
Ｌ）患者の骨髄液を試料吸引ピペット（３）用いて吸引
ポンプ（１）により吸引してチューブを介してサンプリ
ングバルブ（２）に導入し、３０μｌ(試料１)及び３３
μｌ(試料２)の骨髄液を定量した。試料１は、0.98ｍｌ
の第1の溶血剤とともに吸引吐出ポンプ（５）により第
１の反応チャンバ（１３）に導入した。試料２は、0.95
mlの第2の溶血剤とともに吸引吐出ポンプ（１１）によ
り第2の反応チャンバ（１４）に導入した。次に第1の反
応チャンバ（１３）に0.02mlの第1の染色液を吸引吐出
ポンプ（１０）により添加し、４０℃で５秒間反応後、
フローセル（１５）にて側方散乱光と蛍光を測定した。
また、第2の反応チャンバ（１４）には、0.05ｍｌの第2
の染色液を吸引吐出ポンプ（１２）により添加し、３３
℃で１０秒間反応後、フローセル（１５）にて側方散乱
光と蛍光を測定した。測定において、光源は、６３３ｎ
ｍの赤色半導体レーザを使用し、蛍光は６６０ｎｍ以上
の波長の蛍光を測定した。測定後、前方（低角または高
角）散乱光用検出器（１７）、側方散乱光用検出器（１
８）および蛍光用検出器（１９）で検出したデータを解
析部（２０）で解析した。
【００７２】図３にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱
光強度をとったスキャッタグラム、図４にＸ軸に側方散
乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラム
を示す。図３では、白血球系細胞、赤芽球系細胞Stage
Ｉ、赤芽球系細胞StageII、赤芽球系細胞StageIII、脂
質粒子の５つの集団を形成する。図４では、リンパ系白
血球、単球、顆粒球、顆粒球系幼若球、骨髄系芽球の５
つの集団を形成する。
【００７３】上記の骨髄液にメイグリュンワルド染色を
施し、顕微鏡により目視を行った。白血球系細胞、赤芽
球系細胞を分類し、赤芽球系細胞を前赤芽球、好塩基性
赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分類した。ま
た、リンパ系白血球、単球、顆粒球系幼若球、骨髄系芽
球を分類した。また骨髄系細胞数と赤芽球系細胞数の比
を算出し、上記フローサイトメータで得られた結果と比
較した。表１にフローサイトメータと目視の結果を示
す。
【００７４】
【表１】
【００７５】なお、目視法において好塩基性赤芽球及び
前赤芽球は０％、多染性赤芽球は１８％、正染性赤芽球
は８２％であり、各々本発明による方法における赤芽球
系Stage I、赤芽球系Stage II、赤芽球系Stage IIIの分
類データとよく一致した。上記より、本発明と目視の結
果がよく一致していることが判明した。
【００７６】
【発明の効果】上記に示したように、本発明の方法によ
り簡便に高い精度でＭ／Ｅ比を求めるための方法が提供
された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の工程（３）で測定した工程（２）
（ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて
作成したスキャッタグラム中で分類計数される各細胞の
出現位置を示す概念図である。
【図２】本発明の工程（３）で測定した工程（２）（ｉ
ｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光の強度差を用いて作
成したスキャッタグラム中で分類計数される各細胞の出
現位置を示す概念図である。
【図３】本発明の実施例１の方法によって分類計数され
た各細胞のスキャッタグラムである。
【図４】本発明の実施例１の方法によって分類計数され
た各細胞のスキャッタグラムである。
【図５】本発明のシステムを示す概略図である。
【符号の説明】
１ 吸引吐出ポンプ ２ サンプリングバルブ ３ 試料吸引ピペット ４ 試験管 ５ 第１溶血剤庫 ６ 第１染色液庫 ７ 第２溶血剤庫 ８ 第２染色液庫 ９ 吸引吐出ポンプ １０ 吸引吐出ポンプ １１ 吸引吐出ポンプ １２ 吸引吐出ポンプ １３ 第１の反応チャンバ １４ 第２の反応チャンバ １５ フローセル １６ 陰圧ポンプ １７ 前方（低角または高角）散乱光用検出器 １８ 側方散乱光用検出器 １９ 蛍光用検出器 ２０ 解析部
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ 33/49 33/49 Ｋ (72)発明者 小西 綾 神戸市中央区脇浜海岸通１丁目５番１号 シスメックス株式会社内 Ｆターム(参考） 2G043 AA04 BA16 CA04 DA02 DA05 EA01 EA14 GA07 GB19 KA05 KA09 NA01 2G045 AA03 BB25 CA03 CA11 CA25 FA11 FA16 GC11 GC15 JA01 2G054 AA07 BB08 EA03 EA05 JA00 2G059 AA05 BB04 BB13 BB14 CC16 DD03 DD12 EE02 EE07 GG01 HH02 HH06 KK01 MM01

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１） 骨髄液試料を２つの試料に分配
    し、（２）（ｉ）分配した一方の試料を、第一の溶血剤
    と混合して、前記試料中の赤血球を溶解するとともに、
    白血球系細胞、赤芽球系細胞および脂質粒子を染色に好
    適な状態し、少なくとも白血球系細胞、赤芽球系細胞お
    よび脂質粒子の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素を
    少なくとも１つ含む第１の染色液と混合して染色し、お
    よび（ｉｉ） 分配した他方の試料を、第二の溶血剤と
    混合し、前記試料中の骨髄系幼若球以外の細胞を損傷さ
    せるとともに、骨髄系成熟白血球、リンパ系白血球およ
    び骨髄系幼若球を染色に好適な状態にし、少なくとも、
    骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を含む第1のグルー
    プと、骨髄系幼若球を含む第2のグループとの間に蛍光
    強度の差異を生じる蛍光色素を少なくとも１つ含む第２
    の染色液と混合して染色し、（３） （２）で染色した
    試料のそれぞれをフローサイトメータに導入して、少な
    くとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定し、
    （４）（ｉ） 工程（２）（ｉ）で染色した試料の散乱
    光と蛍光の強度差を用いて、白血球系細胞、赤芽球系細
    胞および脂質粒子を分類計数し、（ｉｉ） 工程（２）
    （ｉｉ）で染色した試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄
    系成熟白血球、リンパ系白血球および骨髄系幼若球を分
    類計数し、（ｉｉｉ）前記骨髄系成熟白血球と骨髄系幼
    若球とから、骨髄系細胞数を算出し、（５） 赤芽球系
    細胞数と骨髄系細胞数とから、赤芽球系細胞に対する骨
    髄系細胞の比（Ｍ／Ｅ比）を算出することからなる骨髄
    液有核細胞自動分析方法。
  2. 【請求項２】 さらに、工程（２）（ｉ）で染色した試
    料の散乱光と蛍光の強度差を用いて、赤芽球系細胞を成
    熟度ごとに少なくとも２つに分類計数し、かつ赤芽球系
    細胞数と、成熟度ごとの赤芽球系細胞数とから、全赤芽
    球系細胞に対する各成熟度の赤芽球の割合を算出するこ
    とからなる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 さらに、白血球系細胞数と赤芽球系細胞
    数とから、骨髄有核細胞数を算出することからなる請求
    項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 さらに、白血球系細胞数と赤芽球系細胞
    数とから、赤芽球系細胞に対する白血球系細胞の割合を
    算出することからなる請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 さらに、工程（２）（ｉｉ）で染色した
    試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系成熟白血球を少な
    くとも２つに分類計数することからなる請求項１に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 さらに、工程（２）（ｉｉ）で染色した
    試料の散乱光と蛍光を用いて、骨髄系幼若球を少なくと
    も２つに分類計数することからなる請求項１に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 少なくとも白血球系細胞、赤芽球系細胞
    および脂質粒子の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素
    が、以下の群：式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ1IおよびＲ2Iは同一または異なって、水素原
    子、水酸基で置換されていてもよい低級アルキルまたは
    低級アルキニル基；ＹIおよびＺIは同一または異なっ
    て、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、又は低級アルキル
    基を有する炭素原子；ｎＩは０、１又は２；ＸI-はアニ
    オンである。）の化合物、式（ＩＩ）： 【化２】 （式中、Ｒ1IIは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IIお
    よびＲ3IIは同一または異なって、水素原子、低級アル
    キル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4IIは水素原子、アシ
    ル基または低級アルキル基；ＺIIは硫黄原子、酸素原
    子、または低級アルキル基を有する炭素原子；ｎＩＩは
    ０、１又は２；ＸII-はアニオンである。）の化合物、
    式（ＩＩＩ）： 【化３】 （式中、Ｒ1IIIは水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ
    2IIIは低級アルキル基、Ｒ 3IIIは水素原子又はジメチル
    アミノ基；ｎIIIは１又は２；ＸIII-はアニオンであ
    る。）の化合物、式（ＩＶ）： 【化４】 （式中、Ｒ1IVは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2IVは
    ジメチルアミノ基；Ｒ3I Vは水素原子又はアミノ基；Ｒ
    4IVは水素原子、低級アルキル基又はアミノ基；Ｒ 5IVは
    水素原子又はジメチルアミノ基；ＸIV-はアニオン；Ｙ
    IVは硫黄又は酸素原子である。）の化合物、式（Ｖ）： 【化５】 （式中、Ｒ1Vは水素原子又は水酸基；Ｒ2Vは水素原子又
    はスルホン酸基；Ｒ3Vは水素原子又はスルホン酸基；Ｙ
    V+はアルカリ金属イオンである。）の化合物、ならびに
    NK-2825、NK-1836、NK-1954、オキサジン750、クリプト
    シアニン、NK-376、NK-382、NK-2711、NK-138、オキサ
    ジン720、LDS730、LD700、ナイルブルー A、ブリリアン
    トグリーン、アイオダイドグリーンおよびマラカイトグ
    リーンからなる群から選択される１以上の色素である請
    求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
  8. 【請求項８】 第一の溶血剤に含まれる赤血球溶解剤
    が、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下のｐＨ２．０〜
    ５．０の水溶液である請求項１〜７のいずれか一つに記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 第一の溶血剤が、界面活性剤を含み、界
    面活性剤が、以下の群：式（ＶＩ）： 【化６】 （式中、Ｒ1VI、Ｒ2VI及びＲ3VIは同一又は異なって、
    水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；
    Ｒ4VIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又
    はＣ6-18のアラルキル基；ＸVI-はアニオンである。）
    の化合物、式（ＶＩＩ）： 【化７】 （式中、Ｒ1VIIはＣ8-18のアルキル基；ＸVII-はアニオ
    ンである。）の化合物、式（ＶＩＩＩ）： 【化８】 （式中、Ｒ1VIIIおよびＲ2VIIIは同一又は異なって、水
    素原子、Ｃ1-8のアルキル基又はＣ6-8のアラルキル基；
    Ｒ3VIIIはＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基
    又はＣ6-18のアラルキル基；ｎＶＩＩＩは１又は２であ
    る。）の化合物、式（ＩＸ）： Ｒ1IX−Ｒ2IX−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nIX−Ｈ （ＩＸ） （式中、Ｒ1IXはＣ9-25のアルキル基、アルケニル基又
    はアルキニル基；Ｒ2IXは式： 【化９】 で表される基または−ＣＯＯ−；ｎＩＸは１０〜４０で
    ある。）の化合物、ならびにMEGA-8、シュクロースモノ
    カプレート、デオキシ-BIGCHAP、ｎ−オクチル−β−D
    −チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシ
    ド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オク
    チル−β−Ｄ−チオグルコシド、CHAPSおよびCHAPSOか
    らなる群から選択される１種類以上の界面活性剤である
    請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 第一の溶血剤に含まれる界面活性剤濃
    度が１０〜１００００ｍｇ／Lである請求項９に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 第二の溶血剤が、以下の成分： （１）骨髄球系幼若球の細胞質及び細胞膜を固定化する
    ためのポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤、
    （２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶
    化剤、（３）骨髄系幼若球の細胞質及び細胞膜を固定化
    するためのアミノ酸および（４）液のｐＨを５．０〜
    ９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇにする
    緩衝液を含む請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 骨髄系成熟白血球とリンパ系白血球を
    含む第1のグループと、骨髄系幼若球を含む第2のグルー
    プとの間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素が、以下：
    式（Ｘ）： 【化１０】 （式中、Ｒ1Xは水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2X及び
    Ｒ3Xは同一または異なって、水素原子、低級アルキル基
    又は低級アルコキシ基；Ｒ4Xは水素原子、アシル基又は
    低級アルキル基；Ｒ5Xは水素原子、または置換されても
    よい低級アルキル基；ＺXは硫黄原子、酸素原子、又は
    低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎＸは１又は
    ２；ＸX-はアニオンである。）の化合物、エチジウムブ
    ロマイド、プロピジウムアイオダイド、エチジウム−ア
    クリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジ
    ウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、
    エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−
    １、ＴＯＴＯ−３およびＴＯ−ＰＲＯ−３からなる群か
    ら選択される１以上の色素である請求項１〜１１のいず
    れか一つに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 測定する散乱光が、側方散乱光、前方
    低角散乱光および前方高角散乱光から選択される少なく
    とも１つである請求項１〜１２のいずれか一つに記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか一つに記載
    の方法を実現するための、骨髄液試料を分配するための
    分配手段と、分配された骨髄液試料を試薬と反応させる
    ための反応チャンバと、フローサイトメータと、溶血剤
    および／または染色液からなる試薬を反応チャンバに供
    給するための試薬供給手段と、反応チャンバで調製され
    た測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入
    するための測定用試料導入手段とからなる骨髄液有核細
    胞自動分析用システム。
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