JP2006308574A - 巨核球の計数方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出し、検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数する。
【選択図】 図4
Description
(1)細胞の大きさを反映する前方散乱光に基づいて、巨核球を含む第1の細胞集団を特定し、
(2)細胞の内部情報を反映する側方散乱光及び核酸量を反映する蛍光に基づいて、巨核球を含む第2の細胞集団を特定し、
(3)第1の細胞集団に属し、且つ、第2の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別する。
(巨核球含有試料の調製)
骨髄穿刺液を孔径が100μmのナイロンメッシュでろ過し、骨片などの夾雑物を取り除き、巨核球含有試料を調製した。
HEPES(市販品) 10mM
フタル酸水素カリウム(市販品) 20mM
BC30TX(POE(30)セチルエーテル)(日光ケミカルズ) 1850ppm
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド(市販品) 650ppm
精製水 1L
NaOHでpHを7.0に調整
色素化合物A 27.5ppm
エチレングリコール 1L
溶血剤980μL及び上記の染色液20μLに対して巨核球含有試料20μLを加え、40℃で30秒間反応させた後、赤半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで、側方散乱光、前方散乱光、蛍光を測定した。
Claims (21)
- (1)巨核球を含む試料中の赤血球を溶解し、巨核球中の核酸を蛍光色素で染色して測定用試料を調製し、
(2)測定用試料中の細胞に励起光を照射し、
(3)細胞から発せられる前方散乱光、側方散乱光及び蛍光を検出し、
(4)検出された前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて巨核球を識別し、
(5)識別された巨核球を計数する、
ことからなる巨核球の計数方法。 - 前記(1)の工程において、巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び蛍光色素を混合することにより測定用試料を調製する請求項1記載の巨核球の計数方法。
- 前記(1)の工程において、巨核球を含む試料と溶血剤を混合し、その混合液に蛍光色素を添加することにより測定用試料を調製する請求項2記載の巨核球の計数方法。
- 前記(2)の工程において、測定用試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射する請求項1記載の巨核球の計数方法。
- 前記(4)の工程において、前方散乱光により、巨核球と大きさが巨核球と異なる細胞とが区別され、側方散乱光及び蛍光により、巨核球と大きさが巨核球と似ている細胞とが区別される請求項1記載の巨核球の計数方法。
- 前記(4)の工程において、検出された前方散乱光に基づいて巨核球を含む第1の細胞集団を特定し、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を含む第2の細胞集団を特定し、第1の細胞集団に属し、且つ、第2の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別する請求項1記載の巨核球の計数方法。
- 前記(4)の工程において、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第1の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光強度から取得される蛍光強度に基づいて2次元分布図を作成し、2次元分布図上で第2の巨核球領域を特定し、第1の巨核球領域内に出現し、かつ、第2の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項1記載の巨核球の計数方法。
- 前記第1の巨核球領域内に出現した細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて2次元分布図を作成し、2次元分布図上で第2の巨核球領域を特定し、第2の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項7記載の巨核球の計数方法。
- 前記第2の巨核球領域内に出現した細胞について、前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第1の巨核球領域を特定し、第1の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項7記載の巨核球の計数方法。
- 前記(4)の工程において、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度及び検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度に基づいて第1の2次元分布図を作成し、第1の2次元分布図上で第1の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて第2の2次元分布図を作成し、第2の2次元分布図上で第2の巨核球領域を特定し、第1の巨核球領域内に出現し、かつ、第2の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項1記載の巨核球の計数方法。
- 前記第1の巨核球領域内に出現した細胞について、側方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて第2の2次元分布図を作成し、第2の2次元分布図上で第2の巨核球領域を特定し、第2の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項10記載の巨核球の計数方法。
- 前記第2の巨核球領域内に出現した細胞について、前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づいて第1の2次元分布図を作成し、第1の2次元分布図上で第1の巨核球領域を特定し、第1の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球として識別する請求項10記載の巨核球の計数方法。
- さらに、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて有核細胞を識別する工程、及び、識別された有核細胞を計数する工程を含む請求項1記載の巨核球の計数方法。
- さらに、巨核球数と有核細胞数から巨核球比率を算出する工程を含む請求項13記載の巨核球の計数方法。
- 巨核球を含む試料、赤血球を溶解するための溶血剤及び巨核球を染色するための核酸蛍光色素を混合して測定用試料を調製するための測定用試料調製部、
測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源、
細胞から発せられる前方散乱光を検出するための第1の散乱光検出器、
細胞から発せられる側方散乱光を検出するための第2の散乱光検出器、
細胞から発せられる蛍光を検出するための蛍光検出器、及び
検出された前方散乱光、蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を識別し、識別された巨核球を計数するための解析部、
からなることを特徴とする巨核球計数装置。 - 前記測定用試料調製部が、巨核球を含む試料と溶血剤を混合し、その混合液に核酸蛍光色素を含有する溶液を添加することにより測定用試料を調製することを特徴とする請求項15記載の巨核球計数装置。
- さらに、測定用試料を導入するためのフローセルを含み、前記光源が、フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射することを特徴とする請求項15記載の巨核球計数装置。
- 前記解析部において、前方散乱光により、巨核球と大きさが巨核球と異なる細胞とが区別され、側方散乱光及び蛍光により、巨核球と大きさが巨核球と似ている細胞とが区別されることを特徴とする請求項15記載の巨核球計数装置。
- 前記解析部が、検出された前方散乱光に基づいて巨核球を含む第1の細胞集団を特定し、検出された蛍光及び側方散乱光に基づいて巨核球を含む第2の細胞集団を特定し、第1の細胞集団に属し、且つ、第2の細胞集団に属する細胞を巨核球として識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項15記載の巨核球計数装置。
- 前記解析部が、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度に基づいて粒度分布図を作成し、粒度分布図上で第1の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて2次元分布図を作成し、2次元分布図上で第2の巨核球領域を特定し、第1の巨核球領域内に出現し、かつ、第2の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球と識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項15記載の巨核球計数装置。
- 前記解析部が、検出された前方散乱光から取得される前方散乱光強度及び検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度に基づいて第1の2次元分布図を作成し、第1の2次元分布図上で第1の巨核球領域を特定し、検出された側方散乱光から取得される側方散乱光強度及び検出された蛍光から取得される蛍光強度に基づいて第2の2次元分布図を作成し、第2の2次元分布図上で第2の巨核球領域を特定し、第1の巨核球領域内に出現し、かつ、第2の巨核球領域内に出現する細胞を巨核球と識別し、識別された巨核球を計数することを特徴とする請求項15記載の巨核球計数装置。
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