JP3425830B2

JP3425830B2 - 新規化合物とその用途

Info

Publication number: JP3425830B2
Application number: JP26034695A
Authority: JP
Inventors: 保正赤井; 公徳宮崎; 孝坂田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2003-07-14
Anticipated expiration: 2015-10-06
Also published as: EP0767382A3; KR970021075A; KR100463129B1; DE69628257T2; TW438795B; DE69628257D1; US5821127A; EP0767382B1; CN1083839C; CN1154966A; EP0767382A2; JPH09104683A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規化合物とその
用途に関する。より詳細には、臨床検査分野における網
状赤血球及び網状赤血球成熟指数測定用のための蛍光色
素として使用可能な新規化合物、該化合物を含む試薬及
び網状赤血球の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】網状赤
血球は、骨髄中で造血幹細胞から分化成熟した赤芽球系
細胞が脱核し、骨髄から抹消血液中に放出された直後の
若い赤血球であり、細胞分化成熟のなごりとして、その
網状赤血球中に成熟赤血球に含まれない少量のＲＮＡ、
リボソームあるいはミトコンドリアなどの細胞内小器官
が残存している。

【０００３】臨床検査分野において、網状赤血球を分類
計数することは、患者の骨髄での造血状態を把握するう
えで極めて重要な検査である。例えば、正常な人の網状
赤血球は全赤血球の０．５〜２．０％を占めているのに
対し、骨髄造血が抑制された状態では減少し、骨髄造血
が亢進した状態では増加する。具体的には、再生不良性
貧血、悪性腫瘍の化学療法時等では網状赤血球は減少
し、溶血性貧血などでは増加する。

【０００４】さて、一般に臨床検査の分野において網状
赤血球を測定するために、ニューメチレンブルー（ＮＭ
Ｂ）、ブリリアントクレシルブルー（ＢＣＢ）などの塩
基性色素を含有する染色液と血液試料とを混合すること
によって、網状赤血球中に含まれる上記残存物質を網状
に析出させ、個々の細胞を顕微鏡で観察して、成熟赤血
球と網状赤血球とに弁別し、計数する方法（用手法）が
ある。

【０００５】また、網状析出物の量に応じて網状赤血球
を分類する方法が、ハイルマイヤー分類として知られて
おり、骨髄の造血動態を把握する上で極めて有用であ
る。しかしながら、上述の用手法は、試料作製操作が
煩雑であり、細胞判別の検査技師間に差が生じ、細
胞計測数が少ないために統計学的誤差が大きくなってし
まう等の問題が知られている。

【０００６】また、ハイルマイヤー分類は極めて煩雑で
あることから、有用な診断情報を与えるにも関わらず、
ほとんど行われていないのが現状である。これらの問題
を解決するために、上述の塩基性色素の代わりに、網状
赤血球中に含まれるＲＮＡを特異的に染色する蛍光性の
塩基性色素で網状赤血球を染色し、フローサイトメータ
ーで細胞の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定すること
により、主に蛍光強度の差に基づいて赤血球と網状赤血
球を弁別し、網状赤血球を分類計数する方法が提案され
ている。

【０００７】この方法においては、塩基性色素として実
質的に３０秒以内で網状赤血球を染色可能なオーラミン
Ｏが良く使用されている。また、オーラミンＯを用いた
網状赤血球測定用の試薬及び全自動測定装置は、各々東
亜医用電子株式会社よりレットサーチ、Ｒシリーズ（Ｒ
−１０００、Ｒ−２０００、Ｒ−３０００）として販売
されているものを使用することができる。このような測
定装置を用いることにより、試料調製からデータ出力ま
での全工程を自動的に、簡便、かつ測定者による差がな
く、上述の統計学的誤差も低減され、精度の高い測定が
実現される。

【０００８】また、網状赤血球の蛍光強度は、網状赤血
球中に残存するＲＮＡ量と比例する、すなわち網状赤血
球の成熟度に反比例することが知られており、蛍光強度
によってＲＭＩ（Reticulocyte Maturation Index ：網
状赤血球成熟指数）を算出することも可能である。例え
ば、図１０に、上述のＲシリーズの測定装置で網状赤血
球を測定した場合のスキャッタグラムを示す。図１０に
おいては、網状赤血球のうち蛍光強度の低いものすなわ
ちＲＮＡ量が少なく、成熟度の高いものからＬＦＲ、Ｍ
ＦＲ、ＨＦＲの３つに分画されている。このように、Ｒ
ＭＩを測定することにより、ハイルマイヤー分類に類似
した診断情報を得ることができ、特に、最も若い網状赤
血球（ＨＦＲ）の比率は、骨髄造血能を鋭敏に示す指標
として有用であることが知られていることから、例え
ば、骨髄移植後あるいは化学療法後の骨髄造血能の回復
の指標として有用である。

【０００９】しかし、上述のようなフローサイトメータ
ー法は、極めて有用な方法であるにも関わらず、蛍光色
素の蛍光を励起するための光源として、非常に高価なア
ルゴンレーザを必要とするため、装置が非常に高価で、
大きなものになってしまうという問題があった。また、
フローサイトメーター法に使用することができる蛍光色
素としては、オーラミンＯ以外にも、チアゾールオレン
ジ、エチジウムブロマイドなどがあるが、これらの色素
では、網状赤血球を染色するために５分以上の染色時間
が必要となる。特にチアゾールオレンジでは、６０分の
染色時間が必要であることが LeeL.G. et al:cytometr
y;7:508-517(1986）に報告されている。このため、試料
調製を自動化することは困難であり、結局、試料調製を
人手に頼らざるを得ないため、省力化の観点から問題が
あるのみならず、その手技あるいは作製者の違いによっ
て測定データがばらつき、同一試料を複数の施設で測定
した場合に、施設間で測定データが一致しないという問
題が生じる。特に、網状赤血球の成熟指数（ＲＭＩ）は
施設間で大きなータの乖離があることが Davis B. H.ら
によって AmJ Pathol Vol. 102, (4), 468-477 に報告
されている。

【００１０】一方、比較的安価な光源としてＨｅ−Ｎｅ
レーザ、色素としてオキサジン７５０を用いて散乱光強
度と吸光度あるいは蛍光強度を測定することによって網
状赤血球測定を行うフローサイトメーター法が米国特許
第5,360,739 号に開示されている。また、この方法とは
別に、WO94/271,46 号公報には、赤血球をＮＭＢで染色
した後に血球を溶血し、レチカラムの析出した網状赤血
球と赤血球とを、主に散乱光強度で弁別する方法が記載
されている。

【００１１】しかしながら、これらの方法は試料調製に
時間がかかり、特にWO94/271,46 号公報では、試料調製
が２ステップと煩雑であるため自動化装置に適さないば
かりか、網状赤血球のＲＮＡを特異的に検出するのでは
ないため、赤血球の散乱光の影響を受け易いといった種
々の問題がある。さらに、これらの方法においては、網
状赤血球成熟指数に関しては全く開示がない。

【００１２】また、網状赤血球を特徴付ける物質の１つ
であるＲＮＡと特異的に結合して蛍光強度を増加する色
素が特公昭６３−６１６２２号公報、米国特許第 4,95
7,870号に開示されているが、これらには、従来のアル
ゴンレーザを光源とするフローサイトメーターで測定す
る方法が示されているのみで、励起光源として赤色領域
の波長の光源を用いた網状赤血球計数方法、網状赤血球
成熟指数測定法及び試薬は全く開示されていない。

【００１３】なお、米国特許第 5,360,739号には、ＲＮ
Ａと色素との被結合恒数、色素の浸透速度等は色素によ
って異なり、どのような条件のもとで網状赤血球の測定
が可能か予見することは不可能であることが明確に記載
されている。以上のように、これまで、安価で小型の光
源を用いることによって、迅速かつ正確に網状赤血球及
び成熟指数を測定するという全ての利点を兼ね備えた網
状赤血球測定用の試薬及びその測定方法は存在していな
い。従って、本発明は網状赤血球測定技術の低価格化、
つまり装置における低価格化、光源としての小型赤色半
導体レーザーの使用等を実現すべく、赤色波長を用いて
網状赤血球を精度よく測定することができる新規な化合
物とその用途である網状赤血球測定用の試薬及びその測
定方法を提供することを目的としている。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、式
（Ｉ）

【００１５】

【化５】

【００１６】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル
基；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級
アルコキシ基；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アル
キル基；Ｒ₅は水素原子、置換されていてもよい低級ア
ルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基
が置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオン
である）で表される新規な化合物が提供される。

【００１７】また、上記式（Ｉ）で表される化合物と、
赤血球の非特異染色を抑制するための多価アニオンと、
緩衝剤とからなる網状赤血球染色用試薬が提供される。
さらに、(i) 上記網状赤血球染色用試薬と血液学的試料
とを混合することによって測定試料を調製し、(ii)前記
測定用試料を、赤色波長の光源を有するフローサイトメ
ータの流体系に導入し、(iii) シースフローの中を流れ
る血液学的試料の細胞に赤色波長の光を照射し、(iv)細
胞から発する散乱光と蛍光とを測定し、(v) 散乱光強度
あるいは散乱光強度と蛍光強度とによって血小板と赤血
球系細胞とを弁別し、(vi)蛍光強度あるいは蛍光強度と
散乱光強度によって赤血球、網状赤血球及び白血球を弁
別し、(vii) 血小板、赤血球、網状赤血球及び白血球を
分類計数して細胞数及び細胞比率を算出する網状赤血球
測定方法が提供される。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明における新規な化合物は、
網状赤血球を染色し、赤色波長の光で励起可能な化合物
であり、蛍光色素として使用することができる。式
（Ｉ）のＲ₁における低級アルキル基とは、炭素数１〜
６の直鎖又は分枝のアルキル基を意味し、例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−
ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙
げられ、中でもメチル基、エチル基が好ましい。

【００１９】Ｒ₂及びＲ₃における低級アルキル基は上
記と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数１
〜６のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エト
キシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ、エト
キシが好ましい。なお、Ｒ₂及びＲ₃は、水素原子であ
ることがより好ましい。Ｒ₄におけるアシル基とは、脂
肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例
えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもア
セチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同
様である。

【００２０】Ｒ₅における低級アルキル基は上記と同様
であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、１
〜３個の水酸基、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基
を示し、なかでも、１個の水酸基で置換されたメチル
基、エチル基が好ましい。Ｚにおける低級アルキル基と
は上記と同様であり、Ｚとしては硫黄原子であることが
好ましい。

【００２１】Ｘ^-におけるアニオンは、ハロゲンイオン
（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化
ホウ素イオン（ＢＦ₄ ^-、ＢＣｌ₄ ^-、ＢＢｒ
₄ ^-等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、
フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロ
ゲンあるいはハロゲンを持つアルキル基を置換基として
有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられ
る。中でも、臭素イオン又はＢＦ₄ ^-が好ましい。

【００２２】式（Ｉ）の具体的な化合物の例を、以下に
示す。

【００２３】

【化６】

【００２４】式（Ｉ）の化合物のうち、ｎ＝１の化合物
は、例えば、式（II）

【００２５】

【化７】

【００２６】で表される化合物と、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホル
ムアミジンとを反応させ、その生成物に式(III)

【００２７】

【化８】

【００２８】で表されるキノリン誘導体を反応させ、次
いで、ホウフッ化ナトリウムと処理することにより得る
ことができる。また、式（Ｉ）の化合物のうち、ｎ＝２
の化合物は、上記反応で、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジ
ンを用いる代わりに、例えば、マロンアルデヒドビス
（フェニルイミン）塩を反応させることによって得るこ
とができる。

【００２９】上記式（Ｉ）の化合物においては、その分
子内に水酸基、ヒドロキシエチル基、アセチル基等の極
性官能基が導入されることによって、化合物の極性が高
くなる。この結果、極性の低い赤血球細胞膜脂質二重層
又はヘモグロビンの疎水領域に対する結合能が低下し、
よって赤血球の非特異染色が抑制されるものと考えられ
る。

【００３０】本発明における試薬中の上記色素の量は、
網状赤血球を染色するのに十分な量であり、色素の種
類、試薬組成によって適宜調整することができる。例え
ば０．１〜１００ｍｇ／リットル程度、より好ましくは
０．３〜３０ｍｇ／リットルである。色素濃度が１００
ｍｇ／リットルを超えた場合、色素にもよるが、一般的
に赤血球の非特異蛍光が増加し、赤血球と網状赤血球と
の弁別が困難になり好ましくない。また、色素濃度が
０．１ｍｇ／リットルより低い場合、使用することは不
可能ではないが、色素の容器壁面等への吸着又は分解
等、色素濃度の減少が発生し易くなり、好ましくない。

【００３１】本発明の網状赤血球測定用試薬は、上記化
合物（色素）の他に、赤血球の非特異染色を抑制するた
めの多価アニオンの塩類と、ｐＨを保つための緩衝剤と
からなり、生理学的浸透圧（例えば、１５０〜６００mO
sm/kg 程度）を有するように調整されている。本願出願
人は、染色液組成の検討において、一般に使用されてい
る染色液中の浸透圧補償剤の主成分がNaCl（特にCl^-）
の場合、赤血球の非特異蛍光が大きく、かつ、網状赤血
球の特異蛍光が小さく、結果として赤血球と網状赤血球
との弁別が困難になることを見いだした。また、一方
で、染色液中のCl^-を多価アニオンに置換した場合に
は、著しく赤血球の非特異染色が抑制され、赤血球と網
状赤血球との弁別が容易になることを見いだした。従っ
て、本発明の試薬には、多価アニオンの塩類を含有させ
た。この目的に使用できる多価アニオンとしては、クエ
ン酸及びＥＤＴＡ等の多価カルボン酸イオン、燐酸及び
硫酸イオン、炭酸イオン等が特に好適であり、多価アニ
オンの含有濃度は、試薬中の全アニオン成分に占める割
合が５０％以上、好ましくは７０％以上である。作用機
序は明確ではないが、上記の範囲内で特異蛍光を増加す
る作用を有する。なお、多価アニオンの対イオンとして
は特に限定されるものではないが、アルカリ金属イオン
が好ましい。

【００３２】本発明の試薬中の緩衝剤は、網状赤血球の
安定した染色結果を得るために、ｐＨを一定に保つため
のもので、通常、数ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度が使用
される。緩衝剤の種類としては、通常使用されるもので
あれば特に限定されるものではなく、例えば、カルボン
酸類、燐酸、グッド緩衝剤、タウリン、トリエタノール
アミン等、好適なｐＨに応じて適宜選択することができ
る。好適なｐＨは色素によって異なるが、通常６．０〜
１１．０の範囲、より好ましくは７．０〜１０．０、さ
らに好ましくは８．０〜９．５の範囲である。ｐＨが
６．０よりも低すぎる場合又は１１．０よりも高すぎる
場合は、赤血球が溶血し易くなり、正確な測定ができな
くなるため好ましくない。さらに、ｐＨが高すぎる場合
には、赤血球細胞膜上のアニオン基が解離することとな
り、カチオン性である色素と結合し易くなるため赤血球
の非特異蛍光が増加し、赤血球と網状赤血球との弁別が
困難になる傾向があり好ましくない。なお、上述の多価
アニオンが、試薬中のｐＨを適当な範囲に調整すること
ができる場合には、緩衝剤として兼ねることができる。

【００３３】また、本発明の試薬は、赤血球の低張溶血
を防ぐために浸透圧が生理学的浸透圧に調整されている
ことが好ましい。赤血球の低張溶血を防止するために
は、通常１５０mOsm／ｋｇ以上の浸透圧があれば良い。
浸透圧が高すぎる場合には、特に弊害は認められない
が、通常６００mOsm／ｋｇ程度までに調整される。浸透
圧を上記範囲に調整するためには、浸透圧補償剤を含有
することができる。浸透圧補償剤としては、例えば、プ
ロピオン酸等の有機酸のアルカリ金属塩、グルコース、
マンノース等の糖類が好適に使用される。また、試薬中
の全アニオン成分に占める割合が５０％未満であれば、
塩化ナトリウムのようなアルカリ金属ハロゲン化物やア
ルカリ土類金属ハロゲン化物も使用できる。なお、上述
の多価アニオンが、試薬中の浸透圧を適当な範囲に調整
することができる場合には、さらに浸透圧補償剤を含有
させる必要はない。

【００３４】本発明の試薬においては、さらに染色促進
剤としてカチオン性界面活性剤を含むことができる。カ
チオン性界面活性剤としては、以下の構造の化合物

【００３５】

【化９】

【００３６】（式中、Ｒ₆は炭素数８〜１２のアルキル
基、Ｒ₇、Ｒ₈及びＲ₉は低級アルキル基、Ｘはハロゲ
ンから選ばれた少なくとも１つである）が挙げられる。
Ｒ₆における炭素数８〜１２のアルキル基としては、直
鎖又は分枝のアルキル基が包含され、例えば、オクチル
基、デシル基、ラウリル基等が挙げられる。なかでも、
オクチル基、デキル基等が好ましい。

【００３７】Ｒ₇、Ｒ₈及びＲ₉における低級アルキル
基としては、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基
が挙げられるが、なかでもメチル、エチル、プロピル基
が好ましい。ハロゲンとしてはフッ素、塩素、臭素、ヨ
ウ素が挙げられる。カチオン性界面活性剤の具体例とし
ては、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｏ
ＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド
（ＤＴＡＢ）又はラウリルトリメチルアンモニウムクロ
ライド（ＬＴＡＣ）が挙げられる。

【００３８】染色促進剤であるカチオン性界面活性剤の
使用量は、例えばＯＴＡＢで３０００〜２００００mg／
リットル、ＤＡＴＢで５００〜３０００mg／リットル、
ＬＴＡＣで５０〜２５０mg／リットルが好ましく、総炭
素数が増えるごとに少量で有効となる。染色促進剤を多
量に使用すると、赤血球を溶血するため好ましくない。
カチオン性界面活性剤の作用機序は明確ではないが、赤
血球細胞膜の色素透過性を亢進するものと考えられる。
さらに、カチオン性界面活性剤は、赤血球細胞を球状化
するため、赤血球集団の前方散乱光強度分布を収束させ
る作用がある。この結果、血小板と赤血球系細胞との弁
別を容易にする。また、予期せぬことに、例えば、鉄欠
乏症貧血などの小球性赤血球症の治療の結果出現する正
球性赤血球と疾患由来の小球性赤血球とを弁別すること
ができる。

【００３９】さらに、図２１及び２２に示すように、少
量出現する楕円赤血球を検出することもできる。このよ
うに、前方散乱光強度分布を収束させることにより、網
状赤血球を測定すると同時に、小球性赤血球や楕円赤血
球等の形態以上を赤血球を検出することができる。本発
明の試薬は、上述の構成要素以外にも、例えば、２−ピ
リジルチオ−１−オキシドナトリウム、β−フェネチル
アルコールなどの防腐剤を含有させることができる。

【００４０】さらに、本発明の化合物が水溶液中で不安
定な場合には、化合物を適当な非水溶媒、例えば、エタ
ノール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール等
に溶解して保存し、使用時に他の成分を含有する水溶液
と混合して使用することができる。本発明の試薬を用い
てフローサイトメーターで網状赤血球を測定するには、
まず、工程(i) において、上記網状赤血球測定試薬と血
液学的試料とを混合して測定用試料を調製する。ここ
で、血液学的試料とは、測定対象となる血液成分を含有
する試料の全てを包含するが、例えば、抗凝固剤処理し
た抹消血液あるいは骨髄液等を意味する。測定試料の調
製にあたって、網状赤血球測定試薬と血液学的試料とを
１００：１〜１０００：１の混合比で混合し、反応させ
ることが好ましい。この際の反応温度は２５〜５０℃程
度が好ましく、さらに好ましくは３５〜４５℃である。
また、反応時間は、試薬中に含まれる色素によって多少
異なるが、１０秒〜５分程度が好ましく、より好ましく
は２０秒〜２分程度、さらに好ましくは２０秒〜６０秒
程度である。

【００４１】次いで、工程(ii)において上記で得られた
測定用試料を、赤色波長の光源を有するフローサイトメ
ータの流体系に導入する。本発明で使用することができ
る赤色波長の光源としては、使用する色素の励起波長付
近の赤色波長の光、例えば６００〜６８０ｎｍ程度の光
を発する光源であれば特に限定されるものではなく、例
えばＨｅ−Ｎｅレーザ、赤色領域の半導体レーザ等を挙
げることができる。これらの赤色波長の光源を有するフ
ローサイトメーターの光学部分を図９に示す。半導体レ
ーザーの前方に集光レンズ系を介してフローセルが配置
しており、フローセルの前方にビームストッパーを介し
て前方散乱光用受光レンズ及びフォトダイオードが配置
している。また、フローセルの側方には側方蛍光用の受
光レンズを介してバンドパスフィルタ及び光電子増倍管
が配置されている。なお、流体部、データ処理部等の他
の装置構成部は、公知の構成、例えばＲ２０００等を改
良して用いることができる。

【００４２】さらに、工程(iii) において、シースフロ
ーの中を流れる細胞に上述した赤色波長の光源を用いて
赤色波長の光を照射し、工程(iv)において、細胞から発
する散乱光と蛍光とを測定する。この場合の散乱光は、
前方散乱光又は側方散乱光のいずれでもよく、前方散乱
光は、前方高角散乱光（６〜２０°）又は前方低角散乱
光（１〜５°）のいずれでもよい。ここで、散乱光は、
細胞の大きさ情報を反映するパラメータとなる。なお、
細胞の大きさ情報を測定する方法としては、他に電気抵
抗信号があげられ、必要に応じてこの電気抵抗信号を測
定する手法を組み合わせてもよい。

【００４３】工程(v) においては、散乱光強度あるいは
散乱光強度と蛍光強度とによって血小板と赤血球系細胞
とを弁別し、工程(vi)において、蛍光強度あるいは蛍光
強度と散乱光強度によって赤血球、網状赤血球及び白血
球を弁別し、工程(vii) において、各々の細胞を分類計
数して細胞数及び細胞比率を算出する。

【００４４】

【実施例】

（実施例１：色素化合物Ａの製造）

【００４５】

【化１０】

【００４６】２，３−ジメチルベンゾチアゾリウムメ
タンスルホン酸（2,3-Dimethylbenzothiazolium methan
esulfate）６．０ｇ（１当量）とN,N-ジフェニルホル
ムアミジン（N,N-Diphenyl formamidine）１２．８ｇ
（３当量）とを酢酸１２ｍｌ中で、９０℃の油浴上で
１．５時間加熱撹拌した。反応液をヘキサン１．８リッ
トルにあけ、赤色油状物をさらにヘキサン１．５リット
ルで懸濁洗浄し、酢酸を除いた。粗精製物を酢酸エチル
−ヘキサンで再結晶した。収量４．０ｇ（４８％）。こ
れに１−（２−ヒドロキシ）エチルレピジニウムブ
ロマイド３．１ｇ（１当量）とピリジン８０ｍｌを加
え、９０℃の油浴上で１．５時間加熱撹拌する。反応液
にホウフッ化ナトリウム１．２７ｇ（１．１当量）をＤ
ＭＦ９ｍｌに溶解したものを加え、さらに１５分間加熱
撹拌した後、反応液を酢酸エチル２リットルにあけ、生
じた沈澱を濾取する。収量５．０ｇ（１００％）。濃暗
紫色粉末を得た。

【００４７】ＴＬＣ（シリカゲル、エタノール−塩化メ
チレン）Ｒｆ＝０．２¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δｐｐｍ（ＴＭＳ） 3.73(s,3H), 3.82(t,2H), 4.64(t,2H), 5.10(s,1H), 6.
45(d,1H), 7.10(d,1H),7.31(t,1H), 7.50-8.51(m,10H) ＩＲ（ｃｍ^-1）：1625,1560,1520,1490,1450,1400,132
0,1260,1220,1150,760 MASS(FAB positive)： m/z=361 HPLC 95.9% (MeOH-35%SDSaq.soln. =80:20) 吸収極大：627nm（メタノール）

【００４８】（実施例２：色素化合物Ｂの製造）

【００４９】

【化１１】

【００５０】３−メチル−２−メチルベンゾチアゾリウ
ムメタンスルホン酸（3-Methyl-2-methylbenzothiazo
lium methanesulfate ）６．０ｇ（１当量）とN,N-ジフ
ェニルホルムアミジン（N,N-Diphenyl formamidine）
１２．８ｇ（３当量）とを酢酸中で、９０℃の油浴上で
１．５時間加熱攪拌した。反応液をヘキサンにあけ、赤
色油状物をさらにヘキサン１．５リットルで懸濁洗浄
し、酢酸を除いた。粗精製物を酢酸エチル−ヘキサンで
再結晶した。収率４８％。これに１−（２，３−ジヒド
ロキシ）プロピルレピジニウムブロマイド３．１ｇ
（１当量）とピリジン８０ｍｌを加え、９０℃の油浴上
で１．５時間加熱撹拌する。反応液にホウフッ化ナトリ
ウム１．２７ｇ（１．１当量）をＤＭＦ９ｍｌに溶解し
たものを加え、さらに１５分間加熱撹拌した後、反応液
を酢酸エチル２リットルにあけ、生じた沈澱を濾取す
る。収量１８０ｍｇ（３１％）。濃暗紫色粉末を得た。

【００５１】ＴＬＣ（シリカゲル、メタノール−塩化メ
チレン）Ｒｆ＝０．１５¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δｐｐｍ（ＴＭＳ） 3.73(s,3H), 3.88(m,2H), 4.80(m,1H), 5.36(d,2H), 6.
45(d,1H), 7.10(d,1H),7.31(t,1H), 7.50〜8.51(m.10
H), 9.27(s,2H) ＩＲ（ｃｍ^-1）：1620,1560,1520,1480,1450,1400,131
0,1250,1210,1150,740 MASS(FAB positive)： m/z＝391 吸収極大：628nm（メタノール）

【００５２】（実施例３：色素化合物Ｃの製造）

【００５３】

【化１２】

【００５４】１−ヒドロキシエチルレピジニウムブ
ロマイド５ｇ（１当量）、N,N-ジフェニルホルムアミ
ジン４．６ｇ（２当量）を無水酢酸１００ｍｌ中で、９
０℃の油浴上で１．５時間加熱撹拌した。反応液を濃縮
し、ヘキサン０．５リットルにあけ、無水酢酸を除い
た。粗精製物をシリカゲルカラム（メタノール−塩化メ
チレン）で精製した。収量８．４ｇ（１００％）。この
うち３．０ｇ（１当量）をピリジン１００ｍｌに入れ、
９０℃の油浴上で加熱懸濁し、これに２，３−ジメチル
ベンゾチアゾリウムメタンスルホン酸３．４ｇ（１当
量）を加え、９０℃で１．５時間加熱撹拌する。反応液
を濃縮後エテール、ヘキサンで洗浄しシリカゲルカラム
（メタノール−塩化メチレン）で精製した。収量は０．
５ｇ（１７％）、濃暗紫色粉末を得た。

【００５５】ＴＬＳ（シリカゲル、メタノール−塩化メ
チレン）Ｒｆ＝0.4¹ Ｈ-NMR(DMSO-d6) ：δppm(TMS) 1.93(s,3H), 3.77(s,3H), 4.45(t,2H), 4.80(t,2H), 6.
55(d,1H), 7.10(d,1H),7.37(t,1H), 7.53〜8.47(m,10H) ＩＲ（ｃｍ^-1）：1740,1620,1560,1520,1480,1450,140
0,1310,1250,1200,1150,1080,740 MASS(FAB positive)： m/z=403 吸収極大：631nm （メタノール）

【００５６】（実施例４：色素化合物Ｄの製造）

【００５７】

【化１３】

【００５８】３−メチル−２−メチルベンゾオキサゾリ
ウムメタンスルホン酸（3-Methyl-2-methylbenzooxaz
olium methanesulfate）２５０ｍｇ（１当量）とマロン
アルデヒドビス（フェニルイミン９ハイドロクロライ
ド（Malonaldehyde bis(phenylimine) hydrochloride）
２５０ｍｇ（１当量）とを無水酢酸中で、１２５℃の油
浴上で０．５時間加熱攪拌した。反応液を冷却した後、
エーテルを加え、生じた結晶をろ取した（収率４５
％）。これに、１−（２−ヒドロキシ）エチルレピジ
ニウムブロマイド１５０ｍｇ（１当量）とピリジン５
ｍｌを加え、１２５℃の油浴上で０．５時間加熱撹拌す
る。反応液に濃縮し、目的物を塩化メチレンで抽出した
（収率２０％）。濃暗紫色粉末を得た。

【００５９】ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール−
塩化メチレン）Ｒｆ＝０．２０¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δｐｐｍ（ＴＭＳ） 3.73(s,3H), 3.82(t,2H), 4.64(t,2H), 5.10(s,1H), 6.
45-7.31(m,5H), 7.50 〜8.51(m.10H) ＩＲ（ｃｍ^-1）：1625,1560,1520,1490,1450,1400,132
0,1260,1220,1150,760 ＭＡＳＳ（ＦＡＢ positive) m/z＝３７１吸収スペクトル６９３ｎｍ（メタノール）

【００６０】（実施例５）以下の組成の網状赤血球測定
用試薬を調製した。

【００６１】化合物Ａ（色素） 3.0 mg トリシン（緩衝剤） 1.79g クエン酸三ナトリウム二水和物（多価アニオン） 29.4g 精製水１リットル（NaOHでpH9.0に調整）

【００６２】試薬２mlに抗凝固剤処理した血液１０μｌ
を加え、４０℃で１２０秒間インキュベートして測定用
試料を調製し、この測定試料を、図９で示した光学部を
備えたＲ２０００の改造装置を用いて前方低角散乱光強
度及び蛍光強度とを測定し、図１に示すスキャッタグラ
ムを得た。ここで、網状赤血球（ＲＥＴ）の全赤血球に
対する比率は２．９０％であった。なお、この血液を従
来のＲ２０００（東亜医用電子（株）製）を用いて測定
したところ、ＲＥＴ％は２．７０％であった。

【００６３】（実施例６）以下の組成の網状赤血球測定
用試薬を調製した。化合物Ａ（色素） 3.0mg トリシン（緩衝剤） 1.79g クエン酸三ナトリウム二水和物（多価アニオン） 29.4g LTAC（カチオン性界面活性剤、染色促進剤） 150mg 精製水１リットル（NaOHでpH9.0に調整)

【００６４】試薬２mlに抗凝固剤処理した血液１０μｌ
を加え、４０℃で４０秒間インキュベートした後、実施
例５と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度と
を測定し、図２に示すスキャッタグラムを得た。ここ
で、網状赤血球（ＲＥＴ）の全赤血球に対する比率は
２．７２％であった。なお、この血液を従来のＲ２００
０（東亜医用電子（株）製）を用いて測定したところ、
ＲＥＴ％は２．７０％であった。

【００６５】本実施例では、実施例５に比べ短時間（１
／３の時間）で測定用試料の調製が可能であり、かつ赤
血球が球状化することによって前方散乱光強度分布が収
束し、赤血球と血小板の弁別が容易になる。

【００６６】（実施例７）以下の組成の網状赤血球測定
用試薬を調製した。

【００６７】化合物Ｂ（色素） 30.0mg タウリン（緩衝剤） 1.25g エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（多価アニオン） 26.9g DTAB（カチオン性界面活性剤、染色促進剤） 1.00g 精製水１リットル（NaOHでpH9.0に調整)

【００６８】試薬２ｍｌに抗凝固剤処理した血液１０μ
ｌを加え、４０℃で４０秒間インキュベートした後、実
施例５と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度
とを測定し、図３に示すスキャッタグラムを得た。ここ
で、網状赤血球（ＲＥＴ）の全赤血球に対する比率は
２．８２％であった。なお、この血液を従来のＲ２００
０（東亜医用電子（株）製）を用いて測定したところ、
ＲＥＴ％は２．７０％であった。

【００６９】（実施例８）以下の組成の網状赤血球測定
用試薬を調製した。

【００７０】化合物Ｃ（色素） 1.0mg ＴＡＰＳ（緩衝剤） 2.43g 燐酸水素二ナトリウム１２水和物（多価アニオン） 35.8g DTAB（カチオン性界面活性剤、染色促進剤） 1.00g 精製水１リットル（NaOHでpH8.5に調製）

【００７１】試薬２ｍｌに抗凝固剤処理した血液１０μ
ｌを加え４０℃で４０秒間インキュベートした後、実施
例５と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度と
を測定し、図４に示すスキャッタグラムを得た。ここ
で、網状赤血球（ＲＥＴ）の全赤血球に対する比率は
２．５０％であった。なお、この血液を従来のＲ２００
０（東亜医用電子（株）製）を用いて測定したところ、
ＲＥＴ％は２．７０％であった。

【００７２】（実施例９）以下の組成の網状赤血球測定
用試薬を調製した。

【００７３】化合物Ａ（色素） 3.0 mg トリシン（緩衝剤） 1.79g クエン酸三ナトリウム二水和物（多価アニオン） 29.4g DTAB（カチオン性界面活性剤、染色促進剤） 1000mg 精製水１リットル（NaOHでpH9.0に調整）

【００７４】試薬２ｍｌに抗凝固剤処理した血液１０μ
ｌを加え４０℃で４０秒間インキュベートした後、実施
例５と同様の方法で前方低角散乱光強度及び蛍光強度と
を測定した。また、この血液を従来のＲ−２０００（東
亜医用電子（株）製）を用いて測定した。これらの測定
結果を比較し、図５〜図８に、それぞれＲＥＴ、ＬＦ
Ｒ、ＭＦＲ及びＨＦＲの相関図を示す。これら図５〜図
８によれば、本願発明の試薬及び小型赤色半導体レーザ
を用いて測定した網状赤血球の測定結果は、特に成熟赤
血球と網状赤血球との間に十分な蛍光強度の差が得られ
るため、従来のＲ２０００を用いて測定した場合に対し
て、良好な相関関係が得られている。よって、従来の装
置と同等の性能であり、網状赤血球を精度よく検出でき
るといえる。

【００７５】（実施例１０）実施例９に従って、抗凝固
剤処理した正常人血、鉄欠乏性貧血の治療中の患者血、
楕円赤血球の出現した貧血患者血を測定した。

【００７６】正常人血の測定例を図１１〜１４に示す。
図１１及び１２にＲ−２０００での測定結果を、図１３
及び１４に本実施例での測定結果を示す。図１２及び１
４は、前方散乱光強度分布図である。また、鉄欠乏性貧
血の治療中の患者血の測定例を図１５〜１８に示す。図
１５及び１６にＲ−２０００での測定結果を、図１７及
び１８に本実施例での測定結果を示す。図１６及び１８
は、前方散乱光強度分布図である。図１７及び図１８
で、特に図１８で、疾患由来の小球性低色素性の赤血球
と、治療の結果出現する正常赤血球を明確に弁別でき
る。図１５及び１６に示す従来法では、明確に弁別する
ことはできない。

【００７７】楕円赤血球の出現した貧血患者血の足定例
を図１９〜２３に示す。図１９及び２０にＲ−２０００
での測定結果を、図２１及び２２に本実施例での測定結
果を示す。図２０及び２２は、前方散乱光強度分布図で
ある。図２３に、電気インピーダンス検出法（東亜医用
電子（株）、ＳＥ−９０００）による赤血球粒度分布図
を示す。図２１及び図２２で、特に図２２で、明確に楕
円赤血球の集団を弁別することができる。図１９及び２
０に示す従来法では、明確に弁別することはできない。
さらに、図２３に示す従来の電気インピーダンス検出法
による赤血球粒度分布では、楕円赤血球の出現を検知で
きない。

【００７８】

【発明の効果】本発明によれば、網状赤血球測定技術の
低価格化、つまり装置における低価格化、光源としての
小型赤色半導体レーザーの使用等を実現するとともに、
赤色波長を用いて網状赤血球を精度よく測定することが
できる。すなわち、従来から使用されている上記装置で
あるＲシリーズにおける高価なアルゴンレーザの使用
（色素としてはオーラミンＯ）と同等以上の精度を得る
ことができる。

【００７９】また、本願発明の試薬において、染色促進
剤としてカチオン性界面活性剤を含有する場合には、網
状赤血球の測定と同様に鉄欠乏性貧血等の小球性赤血球
症の治療の結果出現する正球性赤血球（正常な赤血球）
と疾患由来の小球性赤血球とを弁別すること、楕円赤血
球等の形態以上を示す赤血球の検出を行うことが可能と
なる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の色素化合物Ａを含む網状赤血球測定用
試薬を用いて血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強
度を測定した場合のスキャッタグラムである。

【図２】本発明の色素化合物Ａを含む網状赤血球測定用
試薬にさらにカチオン性界面活性剤を含む試薬を用いて
血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した
場合のスキャッタグラムである。

【図３】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を用
いて血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定
した場合のスキャッタグラムである。

【図４】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を用
いて血液学的試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定
した場合のスキャッタグラムである。

【図５】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を用
いて、本発明の方法及び従来のＲ２０００を用いた方法
でＲＥＴを測定した場合の相関図である。

【図６】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を用
いて、本発明の方法及び従来のＲ２０００を用いた方法
でＬＦＲを測定した場合の相関図である。

【図７】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を用
いて、本発明の方法及び従来のＲ２０００を用いた方法
でＭＦＲを測定した場合の相関図である。

【図８】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を用
いて、本発明の方法及び従来のＲ２０００を用いた方法
でＨＦＲを測定した場合の相関図である。

【図９】本発明の測定方法において使用する赤色波長の
光源を有するフローサイトメーターの光学部分を示す概
略図である。

【図１０】従来のＲシリーズの測定装置で網状赤血球を
測定した場合のスキャッタグラムである。

【図１１】従来のＲ２０００を用いた方法で正常人血の
前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャッ
タグラムである。

【図１２】従来のＲ２０００を用いた方法で正常人血の
前方散乱光強度分布を測定した場合の前方散乱光強度分
布図である。

【図１３】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を
用いて、本発明の方法で正常人血の前方散乱光強度及び
蛍光強度を測定した場合のスキャッタグラムである。

【図１４】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を
用いて、本発明の方法で正常人血の前方散乱光強度分布
を測定した場合の前方散乱光強度分布図である。

【図１５】従来のＲ２０００を用いた方法で鉄欠乏性貧
血の治療中の患者血の前方散乱光強度及び蛍光強度を測
定した場合のスキャッタグラムである。

【図１６】従来のＲ２０００を用いた方法で鉄欠乏性貧
血の治療中の患者血の前方散乱光強度分布を測定した場
合の前方散乱光強度分布図である。

【図１７】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を
用いて、本発明の方法で鉄欠乏性貧血の治療中の患者血
の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャ
ッタグラムである。

【図１８】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を
用いて、本発明の方法で鉄欠乏性貧血の治療中の患者血
の前方散乱光強度分布を測定した場合の前方散乱光強度
分布図である。

【図１９】従来のＲ２０００を用いた方法で楕円赤血球
の出現した貧血患者血の前方散乱光強度及び蛍光強度を
測定した場合のスキャッタグラムである。

【図２０】従来のＲ２０００を用いた方法で楕円赤血球
の出現した貧血患者血の前方散乱光強度分布を測定した
場合の前方散乱光強度分布図である。

【図２１】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を
用いて、本発明の方法で楕円赤血球の出現した貧血患者
血の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキ
ャッタグラムである。

【図２２】本発明の色素を含む網状赤血球測定用試薬を
用いて、本発明の方法で楕円赤血球の出現した貧血患者
血の前方散乱光強度分布を測定した場合の前方散乱光強
度分布図である。

【図２３】従来の電気インピーダンス検出法による楕円
赤血球の出現した貧血患者血の赤血球粒度分布図であ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/49 Ｇ０１Ｎ 33/49 Ｘ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 417/06 C07D 413/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ₂及び
Ｒ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ
₅は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；
Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換され
た炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである）で
表される化合物。
【請求項２】式（Ｉ）の化合物において、Ｒ₂及びＲ
₃は水素原子；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アル
キル基；Ｒ₅は水素原子、置換されていてもよい低級ア
ルキル基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】式（Ｉ）の化合物において、Ｒ₁はメチル基；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子；Ｒ₄及びＲ
₅は水素原子；ｎ＝１；Ｚは硫黄原子、Ｒ₁はメチル基；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子；Ｒ₄は水素
原子；Ｒ₅はヒドロキシメチル基；ｎ＝１；Ｚは硫黄原
子、Ｒ₁はメチル基；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子；Ｒ₄はＣＯ
ＣＨ₃基；Ｒ₅は水素原子；ｎ＝１；Ｚは硫黄原子、又
はＲ₁はメチル基；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子；Ｒ₄及びＲ
₅は水素原子；ｎ＝２；Ｚは硫黄原子である請求項１記
載の化合物。
【請求項４】式（Ｉ）【化２】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ₂及び
Ｒ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ
₅は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；
Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基が置換され
た炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである）で
表される化合物を含む網状赤血球染色用試薬。
【請求項５】さらに、赤血球の非特異染色を抑制する
ための多価アニオンと、緩衝剤とを含む請求項４記載の
網状赤血球染色用試薬。
【請求項６】多価アニオンが、硫酸イオン、リン酸イ
オン、多価カルボン酸イオンから選ばれた少なくとも１
つである請求項５に記載の試薬。
【請求項７】試薬のｐＨが６．０〜１１．０である請
求項４〜６のいずれかに記載の試薬。
【請求項８】さらに、染色促進剤としてカチオン性界
面活性剤を含む請求項４〜７のいずれかに記載の試薬。
【請求項９】カチオン性界面活性剤が【化３】（式中、Ｒ₆は炭素数８〜１２のアルキル基、Ｒ₇、Ｒ
₈及びＲ₉は低級アルキル基、Ｘはハロゲンから選ばれ
た少なくとも１つである）である請求項８記載の試薬。
【請求項１０】カチオン性界面活性剤が、ラウリルト
リメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルア
ンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウ
ムブロマイドの少なくとも１つである請求項８記載の試
薬。
【請求項１１】式（Ｉ）【化４】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ₂及び
Ｒ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ
₅は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；
Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基が置換され
た炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである）で
表される化合物を含む試薬を用いることを特徴とする網
状赤血球測定方法。
【請求項１２】 (i) 式（Ｉ）【化１４】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ₂及び
Ｒ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ
基；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ
₅は水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；
Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換され
た炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである）で
表される化合物と、赤血球の非特異染色を抑制するため
の多価アニオンと、緩衝剤とからなる網状赤血球染色用
試薬と血液学的試料とを混合することによって測定試料
を調製し、 (ii)前記測定用試料を、赤色波長の光源を有するフロー
サイトメータの流体系に導入し、 (iii) シースフローの中を流れる血液学的試料の細胞に
赤色波長の光を照射し、 (iv)細胞から発する散乱光と蛍光とを測定し、 (v) 散乱光強度あるいは散乱光強度と蛍光強度とによっ
て血小板と赤血球系細胞とを弁別し、 (vi)蛍光強度あるいは蛍光強度と散乱光強度によって赤
血球、網状赤血球及び白血球を弁別し、 (vii) 網状赤血球を分類計数する請求項１１記載の網状
赤血球測定方法。
【請求項１３】赤色波長の光源が、Ｈｅ−Ｎｅレーザ
又は赤色半導体レーザである請求項１２記載の網状赤血
球測定方法。
【請求項１４】少なくとも１つの特定の範囲の蛍光強
度を有する網状赤血球の全網状赤血球に占める割合を求
めることからなる請求項１２記載の網状赤血球の測定方
法。