WO2024095648A1 - 測定方法、測定システムおよび検査用試薬キット - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a measurement method and measurement system for measuring the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells contained in a blood sample, and a test reagent kit used to measure the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells.
- Reticulocytes are immature red blood cells that have just entered the peripheral blood from the bone marrow and become mature red blood cells within one day. Erythroblasts in the bone marrow have a nucleus, but as they mature, they are enucleated and lose their nucleus. In immature reticulocytes, RNA (ribonucleic acid), a remnant of this nuclear component, is observed as a reticulated granular substance.
- An increase in reticulocytes is an indicator of increased red blood cell production in the bone marrow, and can be seen, for example, when treating anemia with the administration of iron.
- aplastic anemia the hematopoietic function is reduced and the number of reticulocytes does not increase. Therefore, measuring the number (concentration) of reticulocytes is useful for diagnosing various types of anemia and observing the progress of treatment.
- reticulocytes are stained with a staining reagent ( K3EDTA , NMB (new methylene blue), NaCl) and then hemoglobin is eluted from the red blood cells using a red blood cell hemolysis reagent (KSCN, 1N H2SO4 ).
- KSCN red blood cell hemolysis reagent
- the osmotic pressure of the red blood cell hemolysate is set to 75 to 110 mOsm, preferably 82 to 105 mOsm. This is for the following reason. If the osmotic pressure of the red blood cell hemolysate is low, the red blood cells are damaged, resulting in a decrease in the reliability of the reticulocyte count. On the other hand, if the osmotic pressure is insufficient, the red blood cells do not elute hemoglobin, which makes it difficult to distinguish reticulocytes.
- the pH of the red blood cell hemolyzing reagent is adjusted to a range of about 1.0 to 3.0, preferably 1.0 to 2.0. This is because it is believed that an acidic red blood cell hemolyzing reagent dissolves hemoglobin, facilitating its removal from red blood cells.
- nucleated red blood cells contain nucleic acids such as RNA, their concentration can be measured in the same way as that of reticulocytes. Because nucleated red blood cells, like reticulocytes, are immature red blood cells, when nucleated red blood cells are detected in the peripheral blood of an adult, it is believed that some form of hyperhematopoiesis is occurring.
- the present invention has been made to solve the above problems, and its purpose is to provide a measurement method, measurement system, and test reagent kit that can measure the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells with simple pretreatment.
- a measurement method is a method for measuring the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells contained in a blood sample, and includes a staining step of staining the reticulocytes or nucleated red blood cells among the red blood cells contained in the blood sample using a staining reagent, a removal step of extracting hemoglobin from the red blood cells by adding a surfactant to the blood sample, and a measurement step of measuring the concentration of the reticulocytes or the concentration of the nucleated red blood cells contained in the blood sample using the blood sample after the staining step and the removal step.
- a test reagent kit includes a staining reagent for staining reticulocytes or nucleated red blood cells among the red blood cells contained in a blood sample, and a surfactant for extracting hemoglobin from the red blood cells.
- a measurement system is a measurement system for measuring the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells contained in a blood sample, and includes a container for housing a staining reagent for staining the reticulocytes or nucleated red blood cells and a surfactant that is added to the blood sample to extract hemoglobin from the red blood cells contained in the blood sample, a flow cell into which the blood sample, the staining reagent, and the surfactant are introduced, a blood cell volume size measurement unit for measuring the change in the volume of blood cells in the blood sample introduced into the flow cell, an optical measurement unit for measuring the light transmittance of the blood cells in the blood sample introduced into the flow cell, and a concentration calculation unit for calculating the concentration of the reticulocytes or the concentration of the nucleated red blood cells contained in the blood sample based on the measurement results of the blood cell volume size measurement unit and the optical measurement unit.
- the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells can be measured with simple pretreatment.
- FIG. 1 is a perspective view showing the external configuration of a blood analyzer constituting a measurement system according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 2 is an explanatory diagram illustrating a schematic internal configuration of the blood analyzer.
- FIG. 4 is a block diagram illustrating another configuration of the measurement system.
- 10 is a flowchart showing a process flow when measuring the concentration of reticulocytes by the first measurement method.
- FIG. 1 is an explanatory diagram that shows a schematic diagram of a red blood cell model before and after ghosting using a surfactant.
- FIG. 2 is an explanatory diagram showing a schematic configuration of an LMNE chamber. 1 is a graph plotting the results obtained by the electrical resistance measurement unit and the optical measurement unit for the same blood cells when no surfactant was added to the blood sample.
- FIG. 1 is a graph plotting the results obtained by the electrical resistance measurement unit and the optical measurement unit for the same blood cells when a surfactant is added to a blood sample.
- 10 is a flowchart showing a process flow when measuring the concentration of reticulocytes by a second measurement method.
- 13 is a flowchart showing a process flow when measuring the concentration of reticulocytes by the third measurement method.
- 13 is a flowchart showing a process flow when measuring the concentration of reticulocytes by a fourth measurement method.
- FIG. 1 is a perspective view showing an example of a reticulocyte test reagent kit.
- FIG. 11 is a perspective view showing another example of a reticulocyte test reagent kit.
- FIG. 1 is an explanatory diagram showing a schematic configuration of an optical device for detecting reticulocytes using a fluorescent dye.
- FIG. 1 is a perspective view showing the external configuration of a blood analyzer 1 constituting a measurement system 80 (see Fig. 2) of the present embodiment.
- Blood analyzer 1 has a display unit 3 on the upper front side of an apparatus main body 2.
- Display unit 3 is configured, for example, as a liquid crystal display device with a touch panel, and displays blood analysis results, etc., and accepts input of various information by an operator (for example, a medical professional).
- a specimen container loading section 4 is provided at the bottom of the device main body 2.
- the specimen container 10 can be loaded into the device main body 2 by opening the cover 4a of the specimen container loading section 4, setting a specimen container 10 containing a blood specimen, and closing the cover 4a.
- a reagent container loading section 5 is provided on the side of the device main body 2. By opening the door 5a of the reagent container loading section 5, containers containing reagents used in blood analysis (e.g., immunoassay reagents, reticulocyte staining reagents), surfactants, diluents, etc. can be loaded.
- reagents used in blood analysis e.g., immunoassay reagents, reticulocyte staining reagents
- surfactants e.g., reticulocyte staining reagents
- diluents e.g., etc.
- the above containers may, for example, contain the staining reagent, surfactant, and diluent as an integrated unit, as described below, or may be prepared for each reagent used.
- the above reagents may also be stored in a storage section 320 that is connected to the chamber 31 (see FIG. 2) via a conduit 321, as described below.
- Blood analyzer 2 Internal configuration of the blood analyzer 2 is an explanatory diagram showing a schematic diagram of the internal configuration of blood analyzer 1.
- Blood analyzer 1 includes needle 20, blood analysis unit 30, and controller 40.
- Controller 40 is formed of a central processing unit (computer), for example, called a CPU (Central Processing Unit), and controls the operation of each unit of blood analyzer 1.
- CPU Central Processing Unit
- the needle 20 aspirates and discharges the blood sample contained in the sample container 10. If necessary, the needle 20 pierces the lid of the sample container 10 to aspirate and discharge the blood sample.
- the rear end of the needle 20 is connected to a fixed-dose syringe 22 via a pipe 21 shown by dashed lines and an electromagnetic valve device (not shown).
- the control unit 40 drives the fixed-dose syringe 22 and the electromagnetic valve device, causing the needle 20 to aspirate and discharge the blood sample.
- the needle 20 is moved horizontally and vertically by the probe unit 23.
- the probe unit 23 includes a horizontal movement mechanism 24 and a vertical movement mechanism 25.
- the horizontal movement mechanism 24 and the vertical movement mechanism 25 include, for example, an endless belt, and a drive roller and a driven roller that move the endless belt.
- the control unit 40 drives each drive roller of the horizontal movement mechanism 24 and the vertical movement mechanism 25, the endless belt of the horizontal movement mechanism 24 moves horizontally and the endless belt of the vertical movement mechanism 25 moves vertically. This allows the needle 20 supported by the vertical movement mechanism 25 to move horizontally and vertically.
- the horizontal movement mechanism 24 and the vertical movement mechanism 25 may be configured with a feed screw mechanism.
- the feed screw mechanism rotates the feed screw with a stepping motor, thereby moving an engagement portion that engages with the feed screw in the horizontal or vertical direction. Therefore, by connecting the vertical movement mechanism 25 to the engagement portion of the horizontal movement mechanism 24 and holding the needle 20 in the engagement portion of the vertical movement mechanism 25, the needle 20 can be moved in the horizontal and vertical directions.
- the blood analysis unit 30 performs blood analysis, such as counting blood cells and measuring immunity.
- the blood analysis unit 30 has a chamber 31 (container) that receives blood samples aspirated and discharged from the specimen container 10 by the needle 20.
- a counting device 310 is provided in the chamber 31 for blood cell counting.
- the counting device 310 can perform measurement methods such as impedance method, flow cytometry, and focusing flow impedance method depending on the blood cells to be counted.
- the control unit 40 can create a frequency distribution, etc. by processing the measurement data acquired by the counting device 310.
- the counting device 310 may be provided outside the chamber 31 and connected to the chamber 31.
- the chambers 31 are provided according to the blood cells to be counted.
- a BASO chamber is provided for counting basophils contained in white blood cells.
- the LMNE chamber is provided for counting lymphocytes, monocytes, neutrophils, and eosinophils contained in white blood cells.
- the "LMNE" in the LMNE chamber is an acronym for lymphocyte, monocyte, neutrophil, and eosinophil.
- the RBC chamber is provided for counting red blood cells.
- the WBC chamber is provided for counting white blood cells and analyzing HGB (hemoglobin).
- a CRP measurement chamber may be further provided as chamber 31.
- the CRP measurement chamber is configured so that the CRP value can be optically measured according to the latex agglutination method.
- CRP is an abbreviation for C-reactive protein.
- the CRP measurement chamber is provided with a light irradiation unit and a light detection unit for CRP measurement on the lower wall surface of the chamber, and is configured so that the liquid contained therein can be appropriately stirred.
- a number of reagent containers are provided near the CRP measurement chamber.
- Each reagent container contains a hemolysis reagent, a diluent, an anti-human CRP sensitized latex immunoreagent, etc.
- the reagent is discharged from each reagent container at an appropriate time through a conduit (not shown) into the CRP measurement chamber.
- the blood analysis section 30 has a washing container 32.
- the washing container 32 is provided for washing the needle 20. By washing the needle 20 in the washing container 32, it is possible to remove unwanted substances such as blood or reagents adhering to the needle 20 and to discard excess blood sample in the needle 20.
- a discharge pipe 33 shown by a dashed line is connected to the lower end of the chamber 31 and the washing container 32.
- the waste liquid in the chamber 31 and the washing container 32 is sent to the waste liquid container 50 through an electromagnetic valve device (not shown) by driving a discharge part (not shown).
- the discharge part is composed of a discharge syringe or a discharge pump.
- the control section 40 drives the probe unit 23 to move the needle 20 horizontally and vertically. This allows the needle 20 to enter and exit the specimen container 10 and chamber 31.
- the control section 40 drives the fixed-volume syringe 22 to aspirate the blood specimen through the needle 20 and eject the blood specimen from the needle 20.
- blood analysis blood cell counting, immunoassay, etc. is performed in the blood analysis section 30.
- the blood analysis unit 30 further includes a storage unit 320.
- the storage unit 320 stores the staining reagent, surfactant, and diluent, which will be described later.
- the storage unit 320 stores the staining reagent, surfactant, and diluent together in a mixed state, but multiple storage spaces may be provided to store them separately.
- the storage unit 320 is connected to the chamber 31 (e.g., the LMNE chamber) via a conduit 321. This allows the staining reagent, surfactant, and diluent stored in the storage unit 320 to be supplied to the chamber 31 (e.g., the LMNE chamber) via the conduit 321.
- two LMNE chambers are provided. This is to clearly distinguish between the chambers used for counting lymphocytes, monocytes, neutrophils, and eosinophils, and the chamber used for measuring the concentration of reticulocytes, which will be described later. Note that one LMNE chamber may be configured to serve both as a chamber for counting lymphocytes, etc., and as a chamber for measuring the concentration of reticulocytes.
- the blood analyzer 1 further includes a temperature adjustment unit 41.
- the temperature adjustment unit 41 is, for example, a heater, and heats the chamber 31 and the washing container 32 to a desired temperature (for example, 37°C). This makes it possible to prevent blood samples that tend to aggregate in cold weather from agglutinating.
- FIG. 2 illustrates a configuration in which the temperature adjustment unit 41 is provided corresponding to each of the chamber 31 and the washing container 32 and heats them separately, the temperature adjustment unit 41 may be provided so as to surround the chamber 31 and the washing container 32 together, and heat them simultaneously.
- the temperature adjustment unit 41 may be configured as a tank (also called a buffer tank) wrapped around a heater.
- the tank contains, for example, a diluent.
- Such a temperature adjustment unit 41 is connected to, for example, another pipe (not shown) branching off from the pipe 21 via a switching valve (not shown).
- the diluent warmed by the heater merges with the pipe 21 via the other pipe and the switching valve, and is discharged into the chamber 31 via the needle 20.
- the blood sample previously sucked by the needle 20 from the sample container 10 is also discharged into the chamber 31 at the same time as the warmed diluent.
- the blood sample is heated to an arbitrary temperature in the chamber 31 by mixing with the warmed diluent, so that aggregation of the blood sample can be prevented.
- the temperature adjustment unit 41 is configured to heat reagents other than the diluent (for example, surfactants) to the arbitrary temperature (for example, 37° C.) from the viewpoint of promoting an appropriate reaction.
- the blood analyzer 1 also includes a concentration calculation unit 42.
- the concentration calculation unit 42 calculates the concentration of reticulocytes contained in the blood sample based on the counting results (e.g., the number of reticulocytes described below) from the counting device 310 of the blood analysis unit 30 and the amount of blood sample used for the counting.
- Such a concentration calculation unit 42 may be configured with the same or a separate CPU as the control unit 40, or may be configured with a processing circuit dedicated to concentration calculation.
- FIG. 3 is a block diagram showing a schematic configuration of another measurement system 80.
- the measurement system 80 shown in the figure is composed of the blood analysis device 1 and a terminal device 70.
- the terminal device 70 is communicatively connected to the blood analysis device 1 via a communication line.
- the communication line may be wired or wireless.
- the terminal device 70 is, for example, a personal computer, and includes an input unit such as a keyboard, a display unit, and a concentration calculation unit 42.
- the concentration calculation unit 42 is, for example, a CPU included in the terminal device 70, and calculates the concentration of reticulocytes contained in the blood sample based on the measurement results (e.g., the number of reticulocytes) output from the counting device 310 of the blood analyzer 1 and the amount (volume) of the blood sample input on the terminal device 70 side.
- FIG. 4 is a flow chart showing a process flow when measuring the concentration of reticulocytes by the first measurement method.
- the first measurement method includes a staining step (S1), a removing step (S2), a diluting step (S3), a loading step (S4), and a measurement step (S5).
- steps S1 to S3 are also called pre-steps because they are performed before the measurement step S5.
- the first measurement method does not use reagents (such as staining reagents) contained in the storage section 320, but uses a blood sample to which reagents have been added outside the device. A detailed description will be given below.
- reticulocytes which are red blood cells contained in a blood sample collected in a sample container 10 (see FIG. 1), are stained.
- a staining reagent called NMB New Methylene Blue: C 18 H 22 ClN 3 S
- NMB is a non-fluorescent staining agent and a cationic (+) molecule.
- Reticulocytes contain RNA (ribonucleic acid)-ribosome complexes.
- the staining reagent used in the staining step is not limited to the above-mentioned NMB.
- Azure B (:C 15 H 16 ClN 3 S), Chromophore, and Fluorophore can also be used as the staining reagent.
- NMB, Azure B, and Chromophore are suitable as the staining reagent.
- S2 Removal step
- a surfactant is added to all or a part of the blood sample stained with S1 to remove hemoglobin from the red blood cells.
- This step of removing hemoglobin from the red blood cells is also called ghosting. From the viewpoint of achieving a good balance between the amount of blood sample and the amount of surfactant, it is desirable to add the surfactant to a part of the blood sample stained with S1.
- a cationic (positively charged), zwitterionic or nonionic surfactant as the above surfactant.
- nucleic acids such as RNA are negatively charged, and NMB is positively charged.
- the surfactant is anionic (negatively charged), there is a risk that the surfactant will bind to NMB before it binds to the RNA, inhibiting staining with NMB.
- a cationic surfactant for example, a quarternary ammonium ion surfactant (quarternary ammonium salt; QAS) can be used.
- QAS quarternary ammonium salt
- quaternary ammonium ion surfactants include DTAB (dodecyltrimethylammonium bromide) and HTAC (hexadecyltrimethylammonium chloride).
- a zwitterionic surfactant is a surfactant that has functional groups of both positive and negative polarity.
- an ammoniopropanesulfonate surfactant can be used as an ammoniopropanesulfonate surfactant.
- DDAPS N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate
- ammoniopropanesulfonate surfactant can be used as an ammoniopropanesulfonate surfactant.
- non-ionic surfactants include Tergitol (registered trademark of Union Carbide Corporation), Triton X-100 ("Triton” is a registered trademark of Union Carbide Corporation), and sugar fatty acid esters.
- sugar fatty acid esters include sucrose fatty acid esters (sugar esters) such as DK Ester SS (registered trademark of Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.).
- Figure 5 shows a schematic model of a red blood cell before and after ghosting using a surfactant.
- the action of the surfactant creates holes in the membrane M of the red blood cell. This allows soluble proteins, including hemoglobin (Hgb), to escape from the red blood cell.
- Hgb hemoglobin
- red blood cells other than reticulocytes (Ghost RBC) appear transparent.
- the membrane M of the red blood cell does not disappear and remains.
- reticulocytes (Ghost RET) appear blue because the RNA of the aggregated complex is stained blue by NMB, as described above.
- the osmotic pressure and pH of the surfactant are not particularly limited, and can be, for example, close to those of blood.
- the blood sample after hemoglobin has been extracted from the red blood cells is diluted with a diluent, such as phosphate-buffered saline (PBS).
- a diluent such as phosphate-buffered saline (PBS).
- the specimen container 10 containing the blood specimen diluted in S3 is set in the specimen container loading section 4 of the blood analyzer 1 shown in Fig. 1.
- the diluted blood specimen may be aspirated from the blood specimen 10 with a pipette, and the aspirated blood specimen may be directly injected into the chamber 31 (particularly the LMNE chamber) by opening a panel (not shown) of the blood analyzer 1.
- the loading step of setting the specimen container 10 in the specimen container loading section 4 is not necessary.
- the concentration of reticulocytes contained in the blood sample is measured using the blood sample that has been stained, ghosted, and diluted.
- the blood analyzer 1 is provided with an LMNE chamber as the chamber 31 of the blood analysis unit 30.
- the concentration of reticulocytes can be measured by using the LMNE chamber.
- the concentration of reticulocytes can be measured by using any of the LMNE chambers.
- the blood sample used in the measurement step may be a blood sample contained in the sample container 10 set in the sample container loading unit 4 in S4, or may be a blood sample directly injected into the LMNE chamber with a pipette.
- FIG. 6 is an explanatory diagram showing the general configuration of the LMNE chamber 31A as the chamber 31.
- the LMNE chamber 31A has a flow cell 311, an electrical resistance measuring unit 312, an optical measuring unit 313, and the above-mentioned counting device 310 (see FIG. 2).
- a blood sample containing a staining reagent (NMB), surfactant, and diluent is introduced into the flow cell 311 (S5-1; introduction step).
- the blood sample is introduced into the flow cell 311 by aspirating it from the sample container 10 using the needle 20 (see Figure 2) and discharging it into the flow cell 311.
- the blood sample introduced into the flow cell 311 is also referred to here as the "sample SA.” Note that in S5-1, the blood sample may also be injected directly into the flow cell 311 using a pipette.
- the sample SA is surrounded by sheath liquid S-1 and forms a thin stream as it passes through aperture 312a in electrical resistance measurement unit 312.
- platinum electrodes installed on both ends of aperture 312a detect the change in electrical resistance as a pulse.
- the electrical resistance measurement unit 312 measures the size of the cells (blood cells) that have passed through aperture 312a (S5-2; electrical resistance measurement process).
- the optical measurement unit 313 has a light source unit 313a (e.g., a halogen lamp), a detection unit 313b (photocell), and an optical system 313c.
- the optical system 313c is located between the light source unit 313a and the detection unit 313b.
- the optical system 313c is configured to include a lens and an optical filter.
- the detection unit 313b detects the light transmittance (light transmittance) of the blood cells (S5-3; optical measurement process).
- the counting device 310 counts the reticulocytes contained in the sample SA (blood specimen) based on the measurement results of the electrical resistance measurement unit 312 and the optical measurement unit 313.
- the concentration calculation unit 42 then calculates the reticulocyte concentration from the reticulocyte count result and the amount of the blood sample (S5-4; concentration calculation step). Note that it is assumed that the amount (volume) of the blood sample is known in advance.
- FIG. 7 plots the results obtained by the electrical resistance measurement unit 312 and the optical measurement unit 313 for the same blood cells when the concentration of Tergitol as a surfactant is 0 g/L, i.e., when Tergitol was not added to the blood sample in S2.
- FIG. 8 plots the results obtained by the electrical resistance measurement unit 312 and the optical measurement unit 313 for the same blood cells when the concentration of Tergitol as a surfactant added in S2 is 0.6 g/L.
- the horizontal axis indicates the measurement results (particle diameter of blood cells) by the electrical resistance measurement unit 312, with larger particle diameters toward the right.
- the vertical axis indicates the measurement results (light transmittance of blood cells) by the optical measurement unit 313, with greater light absorption (lower light transmittance) toward the top.
- the LMNE chamber 31A is used to measure the concentration of reticulocytes, the boundaries between the five types of white blood cells that can be detected by the LMNE chamber 31A are shown as they are in Figures 7 and 8, but these boundaries can be ignored here.
- the optical measurement unit 313 optically detects not only reticulocytes but also mature red blood cells. For this reason, as shown in FIG. 7, a distribution of the detected amounts of light absorption is obtained for blood cells of various particle sizes, including reticulocytes and mature red blood cells. Therefore, it is difficult for the counting device 310 to accurately count only reticulocytes based on the measurement results of the electrical resistance measurement unit 312 and the optical measurement unit 313.
- the counting device 310 can count only the reticulocytes by counting each point plotted in FIG. 8, that is, each point corresponding to each measurement result by the electrical resistance measurement unit 312 and the optical measurement unit 313. This allows the concentration calculation unit 42 to accurately calculate the concentration of reticulocytes.
- a surfactant is used to remove hemoglobin from red blood cells.
- a surfactant with an osmotic pressure and pH close to those of blood can be used as the surfactant. Therefore, hemoglobin can be easily removed from red blood cells by simply adding a surfactant to the stained blood sample. Therefore, pretreatment for appropriately adjusting the osmotic pressure and pH of the red blood cell hemolyzing reagent, as in the conventional method using a red blood cell hemolyzing reagent, is not required. As a result, the pretreatment before measuring the reticulocyte concentration can be simplified. In other words, the reticulocyte concentration can be measured with simple pretreatment.
- the surfactant is cationic, zwitterionic or nonionic.
- NMB positively charged
- RNA negatively charged
- the pretreatment can be carried out reliably one step at a time.
- the dilution step is not essential for measuring the reticulocyte concentration. For example, if the concentration of surfactant is low, it is possible to omit (skip) the dilution step and measure the reticulocyte concentration. This also applies to the measurement methods below.
- the measurement step S5 includes an introduction step (S5-1), an electrical resistance measurement step (S5-2), an optical measurement step (S5-3), and a concentration calculation step (S5-4). This allows for semi-automation, in which steps S1 to S4 are performed manually and S5 is performed by the blood analyzer 1 (and the terminal device 70).
- the above describes a method of measuring the concentration of reticulocytes by introducing a blood sample into the LMNE chamber 31A as the chamber 31.
- the blood analyzer 1 is equipped with a chamber dedicated to measuring the concentration of reticulocytes in addition to the LMNE chamber 31A, the blood sample may be introduced into the dedicated chamber to measure the concentration of reticulocytes.
- the size of blood cells in other words, the change in the volume of blood cells
- the size of blood cells may also be measured by optical methods.
- the electrical resistance measurement process of S5-2 can be said to be an example of a blood cell volume size measurement process that measures the change in the volume of blood cells in a blood sample flowing through flow cell 311.
- electrical resistance measurement unit 312 is an example of blood cell volume size measurement unit 312V (see FIG. 6) that measures the change in the volume of blood cells by measuring the change in electrical resistance of blood cells in a blood sample flowing through flow cell 311.
- Fig. 9 is a flowchart showing the flow of the process when measuring the concentration of reticulocytes by the second measurement method.
- step S1-1 a mixture of a staining reagent (NMB), a surfactant, and a diluent is simultaneously added to the blood sample (S1-1: mixture adding step).
- NMB staining reagent
- surfactant a surfactant
- a diluent is simultaneously added to the blood sample.
- step S1-1 corresponds to the step of simultaneously performing the above-mentioned staining step (S1), removal step (S2), and dilution step (S3).
- S5 is performed as in FIG. 3.
- the diluted blood sample is aspirated from the blood sample 10 with a pipette, and the aspirated blood sample is directly injected into the LMNE chamber of the blood analyzer 1, but the blood sample inside the sample container 10 may be aspirated by the needle 20 after the sample container 10 is loaded into the sample container loading section 4, and then discharged into the LMNE chamber.
- the staining process, removal process, and dilution process are performed simultaneously (in one step), so that the drug (reagent, etc.) only needs to be added to the blood sample once. Therefore, compared to the first measurement method, which performs pretreatment in three steps, the pretreatment process before concentration measurement can be further simplified.
- reticulocyte concentration can also be measured based on the results of visual measurement.
- a method of visually counting reticulocytes to measure the concentration will be described below as a third measurement method.
- Fig. 10 is a flow chart showing the process flow when measuring the reticulocyte concentration by the third measurement method.
- step S11 is exactly the same as step S1-1 in Figure 9.
- a predetermined amount of the blood sample after the mixture was added in S1-1 is dropped onto a glass slide (S12: Dropping step).
- the glass slide is then set under a microscope, the stained reticulocytes are visually counted, and the number of reticulocytes counted per predetermined amount is calculated as the reticulocyte concentration (S13: Concentration calculation step).
- the pretreatment may be performed in three steps (staining, removal, and dilution) in order, and then the processing from S12 onward in FIG. 10 may be performed.
- a predetermined amount of the diluted blood sample may be dropped onto a slide glass (S12), and the number of stained reticulocytes may be visually counted using a microscope, and the concentration of reticulocytes may be calculated based on the measurement results.
- pretreatment is performed in three steps or in one step, by subsequently performing steps S12 and S13, it is possible to visually count reticulocytes and measure the reticulocyte concentration.
- the field of view observed under the microscope can be photographed with a camera, the photographed image can be processed, and reticulocytes can be identified and counted from the shape of the red blood cells obtained in the final image processing, thereby measuring the concentration of reticulocytes.
- the measurement of the reticulocyte concentration can also be performed fully automatically using the measurement system 80.
- a fully automatic method for measuring the reticulocyte concentration will be described below as a fourth measurement method.
- the reagents a mixture of a dye reagent, a surfactant, and a diluent contained in the container 320 shown in Fig. 2 are used. This will be described in detail below.
- FIG. 11 is a flowchart showing the process flow when measuring the concentration of reticulocytes using the fourth measurement method.
- the fourth measurement method includes a loading step (S21), a mixture introduction step (S22), and a measurement step (S23).
- the sample container 10 containing the blood sample is set in the sample container loading section 4 (see Figure 1) of the blood analyzer 1.
- the mixture introduction step S22 a mixture of the staining reagent, surfactant, and diluent is supplied from the storage section 320 to the chamber 31 (particularly the LMNE chamber) via the conduit 321.
- the mixture introduction step S22 corresponds to the process of performing the three steps S1 (staining step), S2 (removal step), and S3 (dilution step) in FIG. 4 in one step (simultaneously).
- the measurement step of S23 includes an introduction step (S23-1), an electrical resistance measurement step (S23-2), an optical measurement step (S23-3), and a concentration calculation step (S23-4).
- the measurement step of S23 corresponds to the measurement step (S5) of FIG. 4. Therefore, the introduction step (S23-1), electrical resistance measurement step (S23-2), optical measurement step (S23-3), and concentration calculation step (S23-4) included in the measurement step of S23 correspond to the introduction step (S5-1), electrical resistance measurement step (S5-2), optical measurement step (S5-3), and concentration calculation step (S5-4) shown in FIG. 4, respectively.
- the measurement step of S23 measures the concentration of reticulocytes contained in the blood sample in the same manner as the first measurement method.
- the blood sample is aspirated by the needle 20 from the sample container 10 loaded in the sample container loading section 4 and discharged into the chamber 31 (particularly the LMNE chamber). Then, after a predetermined time (at least the time required for staining and hemoglobin removal) has elapsed between the mixture of dyeing reagents etc. supplied to the chamber 31 via the conduit 321 and the blood sample, the reactants in the chamber 31 move to the flow cell 311.
- the staining step, removal step, and dilution step are performed by the blood analyzer 1 equipped with the flow cell 311 (S22). This allows the measurement system 80 to perform the processes from staining reticulocytes to measuring their concentration in a fully automated manner.
- the storage unit 320 of the blood analyzer 1 when configured to store the staining reagent, surfactant, and diluent separately, the storage unit 320 can be configured to supply the staining reagent, surfactant, and diluent in sequence to the chamber 31. In this case, it is possible to realize a concentration measurement method in which the staining process, removal process, and dilution process are performed in three stages with a time lag, and in a fully automated manner.
- Reticulocyte test reagent kit] 12 is a perspective view showing an example of a reticulocyte test reagent kit 100.
- the above-mentioned staining reagent, surfactant, and diluent can be provided to a user (e.g., a medical professional) as a reticulocyte test reagent kit 100.
- a container 11 containing a mixture of the staining reagent, surfactant, and diluent is packaged in a package 100a. That is, the reticulocyte test reagent kit 100 includes a staining reagent, a surfactant, and a diluent.
- the user removes the storage container 11 from the packaging 100a of the reticulocyte test reagent kit 100.
- the user can then aspirate the mixture from the storage container 11 with a pipette or the like, and inject it into the sample container 10 containing the blood sample outside the blood analyzer 1.
- the user can also drip the mixture aspirated with a pipette or the like onto a glass slide, or directly inject it into the chamber 31 inside the blood analyzer 1. In this case, it becomes possible to carry out the third and fourth measurement methods described above.
- FIG. 13 is a perspective view showing another example of a reticulocyte test reagent kit 100.
- the reticulocyte test reagent kit 100 may include, as the storage containers 10, a first container 11a containing a staining reagent, a second container 11b containing a surfactant, and a third container 11c containing a diluent.
- the dyeing reagent, surfactant, and diluent are contained in individual containers (first container 11a, second container 11b, and third container 11c), so that the user can remove the individual containers from the packaging 100a of the reticulocyte testing reagent kit 100, and then, outside the blood analyzer 1, sequentially inject the dyeing reagent, surfactant, and diluent into the sample container 10 containing the blood sample using a pipette or the like. This makes it possible to carry out the first measurement method described above.
- the reticulocyte test reagent kit 100 may contain at least the staining reagent and the surfactant among the staining reagent, the surfactant, and the diluent.
- the diluent is generally used as a liquid for diluting blood samples, and therefore the user may have already secured it. Therefore, by including the staining reagent and the surfactant in the reticulocyte test reagent kit 100, the minimum materials required for measuring the reticulocyte concentration can be provided to the user, and the user can carry out the reticulocyte concentration measurement of this embodiment.
- the reticulocyte test reagent kit 100 further includes a diluent, all materials required for measuring the reticulocyte concentration can be provided to the user, and the user can reliably carry out the reticulocyte concentration measurement of this embodiment.
- FIG. 14 is an explanatory diagram showing a schematic configuration of an optical device 200 for detecting reticulocytes using a fluorescent dye.
- the optical device 200 is applicable to the above-mentioned measurement system 80.
- the optical device 200 includes a laser light source 201, a detection optical system 202, and a detector 203.
- the laser light source 201 emits laser light of an arbitrary wavelength (e.g., 488 nm).
- the detection optical system 202 includes three condenser lenses 211, 212, and 213, optical filters 214a and 214b, and a spatial filter 215.
- Optical filter 214a is a filter that cuts light of the same wavelength as the laser light.
- Optical filter 214b is a filter that cuts Raman scattered light (particularly the Raman wavelength of water).
- Optical filters 214a and 214b are arranged in this order from the laser light source 201 side between the two focusing lenses 211, 212 closest to the laser light source 201.
- Spatial filter 215 is arranged between the two focusing lenses 212, 213, and has an aperture (pinhole).
- Detector 203 is composed of, for example, a Si-PMT (photomultiplier tube).
- the blood sample is placed in the flow cell 311.
- the laser light from the laser light source 201 is applied to the cells (fluorescently stained reticulocytes) flowing through the flow cell 311, light excited by the irradiation of the laser light (fluorescence) and elastically scattered light of the same wavelength as the laser light from the cells are generated.
- the elastically scattered light from the cells is cut by the optical filter 214a of the detection optical system 202, and only the fluorescence is guided to the detector 203.
- the liquid e.g., water
- Raman scattered light (inelastic scattered light) with a longer wavelength than the laser light.
- the generated Raman scattered light is cut by the optical filter 214b of the detection optical system 202.
- the detector 203 detects the fluorescence with the influence of the Raman scattered light reduced.
- the detection accuracy of reticulocytes can be improved by configuring an inexpensive and simple optical system in which an optical filter 214b that cuts Raman scattered light is arranged.
- the Si-PMT that constitutes the detector 203 has excellent sensitivity, which is extremely advantageous in terms of improving the detection accuracy of reticulocytes.
- an expensive optical system or optical adjustment mechanism that focuses light minutely and adjustment work are required because the APD is small.
- the Si-PMT not only has excellent sensitivity but can also have a large light receiving area, which makes it possible to eliminate the expensive optical system and adjustment work required for an APD, and to adopt a configuration that uses an inexpensive low-output laser light source 201.
- the reticulocyte concentration measuring method and measuring system 80 of this embodiment and the reticulocyte test reagent kit 100 used for measuring the reticulocyte concentration described above can also be used for measuring the concentration of nucleated red blood cells. That is, as described above, since nucleated red blood cells contain nucleic acids such as RNA, the concentration of nucleated red blood cells can be measured by staining the nucleic acids, removing hemoglobin by adding a surfactant, and the like, in the same manner as in measuring the reticulocyte concentration.
- the present invention can be used, for example, to measure the concentration of reticulocytes or nucleated red blood cells.
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Abstract
血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する測定方法は、染色工程と、除去工程と、測定工程と、を含む。染色工程では、血液検体に含まれる赤血球のうち、網状赤血球または有核赤血球を染色する。除去工程では、血液検体に界面活性剤を投入することにより、赤血球からヘモグロビンを取り出す。測定工程では、染色工程および除去工程を経た後の血液検体を用いて、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する。
Description
本発明は、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する測定方法および測定システムと、網状赤血球または有核赤血球の濃度測定に用いる検査用試薬キットと、に関する。
網状赤血球は、骨髄から末梢血に入ったばかりの幼弱赤血球であり、１日で成熟赤血球になる。骨髄中の赤芽球には核があり、成熟すると脱核して核がなくなる。完全に成熟していない網状赤血球は、この核成分の名残りであるＲＮＡ（リボ核酸）が網状の顆粒物質として観察される。網状赤血球の増加は、骨髄での赤血球産生の亢進の指標となり、例えば鉄材を投与する貧血治療の際にみられる。一方、再生不良性貧血では、造血能が低下しているため網状赤血球が増加しなくなる。したがって、網状赤血球の数（濃度）を測定することは、様々な貧血の診断および治療経過の観察に有用である。
網状赤血球の濃度を測定するにあたり、例えば特許文献１では、染色試薬（Ｋ3ＥＤＴＡ、ＮＭＢ（ニューメチレンブルー）、ＮａＣｌ）で網状赤血球を染色した後、赤血球溶血試薬（ＫＳＣＮ、１Ｎ Ｈ2ＳＯ4）を用いてヘモグロビンを赤血球から溶出させている。ヘモグロビン数の減少により、網状赤血球の特定を向上させ、フローサイトメトリーによる網状赤血球の計数を可能にしている。
ところで、特許文献１では、赤血球溶血液の浸透圧は、７５～１１０ミリオスモル、好ましくは８２～１０５ミリオスモルに設定されている。これは、以下の理由に基づく。すなわち、赤血球溶血試薬の浸透圧が低いと、赤血球細胞に損傷を与え、その結果、網状赤血球数の計数の信頼性が低下する。一方、浸透圧が十分でないと、赤血球細胞は網状赤血球の区別をしにくくするヘモグロビンを溶出しない。
また、特許文献１では、赤血球溶血試薬のＰＨは、約１．０～３．０の範囲、好ましくは、１．０～２．０の範囲に調整されている。これは、酸性の赤血球溶血試薬は、ヘモグロビンを溶解して、赤血球細胞からのヘモグロビンの除去を容易にすると考えられているためである。
特許文献１のように、赤血球からヘモグロビンを溶出させる赤血球溶血試薬を用いる手法では、ヘモグロビンを適切に溶出させるために、上記のように、赤血球溶血試薬の浸透圧およびｐＨを適切に調整しなければならない。その結果、網状赤血球の濃度測定前の前処理が複雑である。
なお、濃度測定前の前処理が複雑になる問題は、有核赤血球の濃度を測定する場合でも同様に起こり得る。有核赤血球の中にはＲＮＡ等の核酸が含まれているため、網状赤血球の濃度測定と同じ方法で有核赤血球の濃度を測定することができる。有核赤血球も網状赤血球と同様に未熟な赤血球であるため、成人の末梢血で有核赤血球が検出された場合は、何らかの造血亢進が生じている状態であると考えられる。
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、簡単な前処理で網状赤血球または有核赤血球の濃度測定を行うことができる測定方法、測定システムおよび検査用試薬キットを提供することにある。
本発明の一側面に係る測定方法は、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する測定方法であって、染色試薬を用いて、前記血液検体に含まれる赤血球のうち、前記網状赤血球または前記有核赤血球を染色する染色工程と、前記血液検体に界面活性剤を投入することにより、前記赤血球からヘモグロビンを取り出す除去工程と、前記染色工程および前記除去工程を経た後の前記血液検体を用いて、前記血液検体に含まれる前記網状赤血球の濃度または前記有核赤血球の濃度を測定する測定工程と、を含む。
本発明の他の側面に係る検査用試薬キットは、血液検体に含まれる赤血球のうち、網状赤血球または有核赤血球を染色する染色試薬と、前記赤血球からヘモグロビンを取り出す界面活性剤と、を備える。
本発明のさらに他の側面に係る測定システムは、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する測定システムであって、前記網状赤血球または有核赤血球を染色する染色試薬と、前記血液検体に含まれる赤血球からヘモグロビンを取り出すために前記血液検体に投入される界面活性剤と、を収容する収容部と、前記血液検体と、前記染色試薬および前記界面活性剤とが導入されるフローセルと、前記フローセルに導入された前記血液検体中の血球の体積の変化を測定する血球体積サイズ測定部と、前記フローセルに導入された前記血液検体中の前記血球の光透過度を測定する光学測定部と、前記血球体積サイズ測定部および前記光学測定部での各測定結果に基づいて、前記血液検体に含まれる前記網状赤血球の濃度または前記有核赤血球の濃度を算出する濃度算出部と、を備える。
本発明によれば、簡単な前処理で網状赤血球または有核赤血球の濃度測定を行うことができる。
以下、本発明の例示的な実施形態について、図面を参照しながら説明する。
〔１．血液分析装置の概要〕
図１は、本実施形態の測定システム８０（図２参照）を構成する血液分析装置１の外観構成を示す斜視図である。血液分析装置１は、装置本体２の正面上部に表示部３を備える。表示部３は、例えばタッチパネル付きの液晶表示装置で構成されており、血液の分析結果等を表示するとともに、操作者（例えば医療従事者）による各種の情報の入力を受け付ける。
図１は、本実施形態の測定システム８０（図２参照）を構成する血液分析装置１の外観構成を示す斜視図である。血液分析装置１は、装置本体２の正面上部に表示部３を備える。表示部３は、例えばタッチパネル付きの液晶表示装置で構成されており、血液の分析結果等を表示するとともに、操作者（例えば医療従事者）による各種の情報の入力を受け付ける。
装置本体２の下部には、検体容器装填部４が設けられる。検体容器装填部４のカバー４ａを開けて、血液検体を収容した検体容器１０をセットし、カバー４ａを閉めることにより、検体容器１０を装置本体２に装填することができる。
装置本体２の側部には、試薬容器装填部５が設けられる。試薬容器装填部５の開閉扉５ａを開けることにより、血液の分析で用いる試薬類（例えば免疫測定用の試薬、網状赤血球の染色試薬）、界面活性剤、希釈液等を収容した容器を装填することができる。なお、上記容器は、例えば後述する染色試薬、界面活性剤および希釈液を一体的に含むものであってもよいし、用いる試薬ごとに用意されてもよい。また、上記試薬類は、後述するように、チャンバー３１（図２参照）と導管３２１を介して繋がる収容部３２０に収容されていてもよい。
〔２．血液分析装置の内部構成〕
図２は、血液分析装置１の内部構成を模式的に示す説明図である。血液分析装置１は、ニードル２０と、血液分析部３０と、制御部４０と、を備える。制御部４０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）と呼ばれる中央演算処理装置（コンピュータ）で構成され、血液分析装置１の各部の動作を制御する。
図２は、血液分析装置１の内部構成を模式的に示す説明図である。血液分析装置１は、ニードル２０と、血液分析部３０と、制御部４０と、を備える。制御部４０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）と呼ばれる中央演算処理装置（コンピュータ）で構成され、血液分析装置１の各部の動作を制御する。
ニードル２０は、検体容器１０に収容された血液検体の吸引および吐出を行う。ニードル２０は、必要に応じて、検体容器１０の蓋を突き刺して、血液検体の吸引および吐出を行う。ニードル２０の後端部は、破線で示す配管２１および電磁弁装置（図示せず）を介して定量シリンジ２２に接続されている。制御部４０が定量シリンジ２２および電磁弁装置を駆動することにより、ニードル２０による血液検体の吸引および吐出が行われる。
ニードル２０は、プローブユニット２３によって水平方向および垂直方向に移動する。プローブユニット２３は、水平移動機構２４と、垂直移動機構２５と、を含んで構成される。水平移動機構２４および垂直移動機構２５は、例えば無端ベルトと、無端ベルトを走行させる駆動ローラおよび従動ローラ等を含んで構成される。制御部４０が水平移動機構２４および垂直移動機構２５の各駆動ローラを駆動することにより、水平移動機構２４の無端ベルトが水平方向に走行し、また、垂直移動機構２５の無端ベルトが垂直方向に走行する。これにより、垂直移動機構２５に支持されたニードル２０を水平方向および垂直方向に移動させることができる。
なお、水平移動機構２４および垂直移動機構２５は、送りねじ機構で構成されてもよい。送りねじ機構は、送りねじをステッピングモータで回転させることにより、送りねじと係合する係合部を水平方向または垂直方向に移動させる。したがって、水平移動機構２４の係合部に垂直移動機構２５を連結し、垂直移動機構２５の係合部にニードル２０を保持させることにより、ニードル２０を水平方向および垂直方向に移動させることができる。
血液分析部３０は、血球の計数、免疫の測定など、血液の分析を行う。血液分析部３０は、ニードル２０によって検体容器１０から吸引され、吐出された血液検体を受け入れるチャンバー３１（容器）を有する。血球計数用のチャンバー３１には計数装置３１０が設けられる。計数装置３１０は、計数すべき血球に応じて、インピーダンス法、フローサイトメトリー、集光型フローインピーダンス法などの測定方法を実施し得る。制御部４０は、計数装置３１０において取得された測定データを処理することにより、度数分布などを作成することができる。なお、計数装置３１０はチャンバー３１の外部に設けられて、チャンバー３１と接続されてもよい。
チャンバー３１は、計数すべき血球に応じて設けられる。例えば、チャンバー３１として、ＢＡＳＯチャンバー、ＬＭＮＥチャンバー、ＲＢＣチャンバー、ＷＢＣチャンバー、が別々に設けられる。ＢＡＳＯチャンバーは、白血球に含まれる好塩基球（Basophil）の計数用に設けられる。ＬＭＮＥチャンバーは、白血球に含まれるリンパ球、単球、好中球、好酸球の計数用に設けられる。なお、ＬＭＮＥチャンバーの「ＬＭＮＥ」は、リンパ球（Lymphocyte）、単球（Monocyte）、好中球（Neutrophil）、好酸球（Eosinophil）の各頭文字をとったものである。ＲＢＣチャンバーは、赤血球（Red blood cell）の計数用に設けられる。ＷＢＣチャンバーは、白血球（White blood cell）の計数用およびＨＧＢ（ヘモグロビン）の分析用に設けられる。
チャンバー３１として、ＣＲＰ測定チャンバーがさらに設けられてもよい。ＣＲＰ測定チャンバーは、ラテックス凝集法に従ってＣＲＰ値を光学的に測定し得るように構成されたチャンバーである。なお、ＣＲＰは、Ｃ反応性蛋白（C-reactive protein）の略称である。ＣＲＰ測定チャンバーは、ＣＲＰ測定用の光照射部および光検出部をチャンバーの下部壁面に備えるとともに、内部に収容される液を適宜攪拌できるように構成されている。
ＣＲＰ測定チャンバーの近傍には、複数の試薬容器（図示せず）が設けられる。各試薬容器には、溶血試薬、希釈液、抗ヒトＣＲＰ感作ラテックス免疫試薬などが収容される。ＣＲＰ測定を行う場合、各試薬容器から適切なタイミングで試薬が導管（図示せず）を介してＣＲＰ測定チャンバーに吐出される。
血液分析部３０は、洗浄容器３２を有する。洗浄容器３２は、ニードル２０を洗浄するために設けられている。洗浄容器３２でのニードル２０の洗浄により、ニードル２０に付着した血液または試薬等の不要物を除去したり、ニードル２０内の余分な血液検体を捨てることができる。
上述したチャンバー３１および洗浄容器３２の下端部には、破線で示す排出管３３が接続される。チャンバー３１および洗浄容器３２内の廃液は、排出部（図示せず）の駆動により、電磁弁装置（図示せず）を通じて廃液容器５０に送られる。なお、上記の排出部は、排出シリンジまたは排出ポンプで構成される。
血液検体を収容した検体容器１０を、装置本体２の検体容器装填部４（図１参照）に装填すると、制御部４０がプローブユニット２３を駆動して、ニードル２０を水平方向および垂直方向に移動させる。これにより、検体容器１０およびチャンバー３１に対して、ニードル２０を内部に進入させたり、内部から脱出させることができる。併せて、制御部４０が定量シリンジ２２を駆動することにより、ニードル２０によって血液検体を吸引し、また、ニードル２０から血液検体を吐出させることができる。このような動作により、血液分析部３０にて血液の分析（血球計数、免疫測定など）が行われる。
また、血液分析部３０は、収容部３２０をさらに備える。収容部３２０は、後述する染色試薬、界面活性剤および希釈液を収容する。本実施形態では、収容部３２０は、上記染色試薬、上記界面活性剤および上記希釈液を、混合状態でまとめて収容しているが、複数の収容空間を設けて、これらを別々に収容していてもよい。収容部３２０は導管３２１を介してチャンバー３１（例えばＬＭＮＥチャンバー）と繋がっている。これにより、収容部３２０に収容された染色試薬、界面活性剤および希釈液を、導管３２１を介してチャンバー３１（例えばＬＭＮＥチャンバー）に供給することができる。
なお、本実施形態では、ＬＭＮＥチャンバーは２つ設けられている。これは、リンパ球、単球、好中球、好酸球の計数に用いるチャンバーと、後述する網状赤血球の濃度測定に用いるチャンバーとを明確に区別するためである。なお、１つのＬＭＮＥチャンバーが、リンパ球等の計数用のチャンバーと、網状赤血球の濃度測定用とのチャンバーとを兼用する構成であってもよい。
また、血液分析装置１は、温度調整部４１をさらに備える。温度調整部４１は、例えばヒータで構成されており、チャンバー３１、洗浄容器３２を任意の温度（例えば３７℃）に温める。これにより、寒冷時に凝集する血液検体については、その凝集を防ぐことができる。なお、図２では、温度調整部４１が、チャンバー３１、洗浄容器３２のそれぞれに対応して設けられて、これらを別々に温める構成を図示しているが、温度調整部４１が、チャンバー３１および洗浄容器３２をまとめて囲むように設けられて、これらを同時に温める構成であってもよい。
なお、温度調整部４１は、ヒータを巻き付けたタンク（バッファタンクとも呼ばれる）で構成されてもよい。上記タンク内には、例えば希釈液が収容される。このような温度調整部４１は、例えば、配管２１から切替バルブ（図示せず）を介して分岐する別の配管（図示せず）に接続される。上記ヒータによって温められた希釈液は、上記別の配管および上記切替バルブを介して配管２１に合流し、ニードル２０を介してチャンバー３１内に吐出される。このとき、予め検体容器１０からニードル２０によって吸引された血液検体も、温められた希釈液と同時にチャンバー３１に吐出される。したがって、この場合でも、チャンバー３１内では、血液検体が、温められた希釈液との混合により任意の温度に温められるため、血液検体の凝集を防ぐことができる。なお、温度調整部４１は、希釈液以外の試薬類（例えば界面活性剤）についても、適切な反応を促進する観点から、上記任意の温度（例えば３７℃）に温める構成であることが望ましい。
また、血液分析装置１は、濃度算出部４２を備える。濃度算出部４２は、血液分析部３０の計数装置３１０での計数結果（例えば後述する網状赤血球の数）と、計数に用いた血液検体の量とに基づいて、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度を算出する。このような濃度算出部４２は、制御部４０と同じ、または別個のＣＰＵで構成されてもよいし、濃度算出専用の処理回路で構成されてもよい。
また、濃度算出部４２は、血液分析装置１の外部に設けられて、血液分析装置１と通信可能に接続される構成であってもよい。図３は、測定システム８０の他の構成を模式的に示すブロック図である。同図に示す測定システム８０は、血液分析装置１と、端末装置７０と、で構成される。端末装置７０は、血液分析装置１と通信回線を介して通信可能に接続される。なお、通信回線は、有線であってもよいし、無線であってもよい。
端末装置７０は、例えばパーソナルコンピュータで構成され、キーボード等の入力部、表示部のほか、濃度算出部４２を備える。濃度算出部４２は、例えば端末装置７０が備えるＣＰＵで構成され、血液分析装置１の計数装置３１０から出力される測定結果（例えば網状赤血球の数）と、端末装置７０側で入力された血液検体の量（体積）とに基づいて、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度を算出する。
〔３．網状赤血球の濃度測定方法について〕
（３－１．第１測定方法）
次に、測定システム８０を用いて網状赤血球の濃度を測定する方法について説明する。図４は、第１測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。第１測定方法は、染色工程（Ｓ１）と、除去工程（Ｓ２）と、希釈工程（Ｓ３）と、装填工程（Ｓ４）と、測定工程（Ｓ５）と、を含む。このうち、Ｓ１～Ｓ３の工程は、Ｓ５の測定工程の前に行われるため、前工程とも呼ばれる。なお、第１測定方法では、収容部３２０に収容された試薬類（染色試薬等）を使用せず、装置外部で試薬類を添加した血液検体を用いる。以下、詳細に説明する。
（３－１．第１測定方法）
次に、測定システム８０を用いて網状赤血球の濃度を測定する方法について説明する。図４は、第１測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。第１測定方法は、染色工程（Ｓ１）と、除去工程（Ｓ２）と、希釈工程（Ｓ３）と、装填工程（Ｓ４）と、測定工程（Ｓ５）と、を含む。このうち、Ｓ１～Ｓ３の工程は、Ｓ５の測定工程の前に行われるため、前工程とも呼ばれる。なお、第１測定方法では、収容部３２０に収容された試薬類（染色試薬等）を使用せず、装置外部で試薬類を添加した血液検体を用いる。以下、詳細に説明する。
（Ｓ１；染色工程）
染色工程では、検体容器１０（図１参照）に採取された血液検体に含まれる赤血球のうち、網状赤血球を染色する。網状赤血球の染色には、ＮＭＢ（ニューメチレンブルー：Ｃ18Ｈ22ＣｌＮ3Ｓ）と呼ばれる染色試薬を用いる。ＮＭＢは、非蛍光染色剤でカチオン（＋）の分子である。網状赤血球には、ＲＮＡ（リボ核酸）－リボゾーム複合体が入っている。網状赤血球にＮＭＢを加えると、網状赤血球中の上記複合体がその他の細胞内小器官を巻き込みながら網状に凝集する。そして、凝集した上記複合体のＲＮＡが青く染まる。つまり、網状赤血球が染色される。
染色工程では、検体容器１０（図１参照）に採取された血液検体に含まれる赤血球のうち、網状赤血球を染色する。網状赤血球の染色には、ＮＭＢ（ニューメチレンブルー：Ｃ18Ｈ22ＣｌＮ3Ｓ）と呼ばれる染色試薬を用いる。ＮＭＢは、非蛍光染色剤でカチオン（＋）の分子である。網状赤血球には、ＲＮＡ（リボ核酸）－リボゾーム複合体が入っている。網状赤血球にＮＭＢを加えると、網状赤血球中の上記複合体がその他の細胞内小器官を巻き込みながら網状に凝集する。そして、凝集した上記複合体のＲＮＡが青く染まる。つまり、網状赤血球が染色される。
なお、染色工程で用いる染色試薬は、上記のＮＭＢには限定されない。例えば、Ａｚｕｒｅ Ｂ（：Ｃ15Ｈ16ＣｌＮ3Ｓ）、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ（発色団）、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ（蛍光体）を染色試薬として用いることもできる。特に、ＮＭＢ、Ａｚｕｒｅ Ｂ、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅが、染色試薬として適している。
（Ｓ２；除去工程）
除去工程では、Ｓ１で染色した血液検体の全部または一部に界面活性剤を投入することにより、赤血球からヘモグロビンを取り出す。このように、赤血球からヘモグロビンを取り出す工程は、Ghostingとも呼ばれる。なお、血液検体の量と界面活性剤の量とのバランスを良好にする観点では、Ｓ１で染色した血液検体の一部に界面活性剤を投入することが望ましい。
除去工程では、Ｓ１で染色した血液検体の全部または一部に界面活性剤を投入することにより、赤血球からヘモグロビンを取り出す。このように、赤血球からヘモグロビンを取り出す工程は、Ghostingとも呼ばれる。なお、血液検体の量と界面活性剤の量とのバランスを良好にする観点では、Ｓ１で染色した血液検体の一部に界面活性剤を投入することが望ましい。
ここで、上記の界面活性剤としては、カチオン系（プラスチャージ）、両性イオン系または非イオン系の界面活性剤を用いることが望ましい。これは、以下の理由に基づく。すなわち、ＲＮＡなどの核酸はマイナスチャージであり、ＮＭＢはプラスチャージである。界面活性剤がアニオン系（マイナスチャージ）であると、ＲＮＡにＮＭＢが結合する前に、界面活性剤がＮＭＢと結合し、ＮＭＢによる染色が阻害される虞がある。
カチオン系の界面活性剤としては、例えば、第４級アンモニウムイオン系（quarternary ammonium salt；QAS）の界面活性剤を用いることができる。第４級アンモニウムイオン系の界面活性剤としては、例えば、ＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＨＴＡＣ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド）が挙げられる。
両性イオン系の界面活性剤とは、プラスおよびマイナスのどちらの極性の官能基も有する界面活性剤である。両性イオン系の界面活性剤としては、例えば、アンモニオプロパンスルホナート系の界面活性剤を用いることができる。アンモニオプロパンスルホナート系の界面活性剤としては、例えば、ＤＤＡＰＳ（Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート）が挙げられる。
非イオン系の界面活性剤としては、例えばTergitol（ユニオン・カーバイド・コーポレーション社の登録商標）、Triton X-100（“Triton”はユニオン・カーバイド・コーポレーション社の登録商標）、糖類脂肪酸エステルが挙げられる。糖類脂肪酸エステルとしては、例えばＤＫ Ｅｓｔｅｒ（第一工業製薬株式会社の登録商標）ＳＳなどのショ糖脂肪酸エステル（シュガーエステル）が挙げられる。
図５は、界面活性剤を用いたGhostingの前後における赤血球のモデルを模式的に示している。界面活性剤の作用により、赤血球の膜Ｍに穴が開けられる。これにより、赤血球から、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）を含む可溶性タンパク質などが抜け出す。この状態では、赤血球に光を当てたときにヘモグロビンでの吸光が減るため、網状赤血球以外の赤血球（Ghost ＲＢＣ）は、透明に見える。ただし、赤血球の膜Ｍは消失せず、存在している。一方、網状赤血球（Ghost ＲＥＴ）は、上述のように、凝集した上記複合体のＲＮＡがＮＭＢによって青く染められているため、青色に見える。なお、界面活性剤の浸透圧およびｐＨは、特に制限されず、例えば血液に近い浸透圧およびｐＨとすることができる。
（Ｓ３；希釈工程）
希釈工程では、赤血球からヘモグロビンを取り出した後の血液検体を、希釈液を用いて希釈する。上記の希釈液としては、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Phosphate-buffered saline）を用いることができる。
希釈工程では、赤血球からヘモグロビンを取り出した後の血液検体を、希釈液を用いて希釈する。上記の希釈液としては、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Phosphate-buffered saline）を用いることができる。
（Ｓ４；装填工程）
装填工程では、Ｓ３で希釈した後の血液検体を収容した検体容器１０を、図１で示した血液分析装置１の検体容器装填部４にセットする。なお、検体容器１０を検体容器装填部４にセットする代わりに、血液検体１０から希釈後の血液検体をピペットで吸引し、吸引した血液検体を、血液分析装置１のパネル（図示せず）を開けて、チャンバー３１（特にＬＭＮＥチャンバー）に直接注入するようにしてもよい。この場合、検体容器１０を検体容器装填部４にセットする装填工程は不要となる。
装填工程では、Ｓ３で希釈した後の血液検体を収容した検体容器１０を、図１で示した血液分析装置１の検体容器装填部４にセットする。なお、検体容器１０を検体容器装填部４にセットする代わりに、血液検体１０から希釈後の血液検体をピペットで吸引し、吸引した血液検体を、血液分析装置１のパネル（図示せず）を開けて、チャンバー３１（特にＬＭＮＥチャンバー）に直接注入するようにしてもよい。この場合、検体容器１０を検体容器装填部４にセットする装填工程は不要となる。
（Ｓ５；測定工程）
測定工程では、染色、Ghosting、希釈が行われた血液検体を用いて、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度を測定する。本実施形態では、血液分析装置１は、血液分析部３０のチャンバー３１として、ＬＭＮＥチャンバーを備えている。網状赤血球の濃度測定は、ＬＭＮＥチャンバーを利用することによって行うことができる。特に、本実施形態のように、血液分析装置１が複数のＬＭＮＥチャンバーを備える場合は、いずれかのＬＭＮＥチャンバーを利用することにより、網状赤血球の濃度を測定することができる。なお、測定工程で用いる上記血液検体は、Ｓ４で検体容器装填部４にセットされた検体容器１０に含まれる血液検体であってもよいし、ピペットでＬＭＮＥチャンバーに直接注入された血液検体であってもよい。
測定工程では、染色、Ghosting、希釈が行われた血液検体を用いて、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度を測定する。本実施形態では、血液分析装置１は、血液分析部３０のチャンバー３１として、ＬＭＮＥチャンバーを備えている。網状赤血球の濃度測定は、ＬＭＮＥチャンバーを利用することによって行うことができる。特に、本実施形態のように、血液分析装置１が複数のＬＭＮＥチャンバーを備える場合は、いずれかのＬＭＮＥチャンバーを利用することにより、網状赤血球の濃度を測定することができる。なお、測定工程で用いる上記血液検体は、Ｓ４で検体容器装填部４にセットされた検体容器１０に含まれる血液検体であってもよいし、ピペットでＬＭＮＥチャンバーに直接注入された血液検体であってもよい。
図６は、チャンバー３１としてのＬＭＮＥチャンバー３１Ａの概略の構成を示す説明図である。ＬＭＮＥチャンバー３１Ａは、フローセル３１１と、電気抵抗測定部３１２と、光学測定部３１３と、上記した計数装置３１０（図２参照）と、を有する。
フローセル３１１には、染色試薬（ＮＭＢ）、界面活性剤および希釈液が投入された血液検体が導入される（Ｓ５－１；導入工程）。上記血液検体のフローセル３１１への導入は、ニードル２０（図２参照）による検体容器１０からの吸引およびフローセル３１１への吐出によって行われる。フローセル３１１に導入される血液検体を、ここでは「サンプルＳＡ」とも称する。なお、Ｓ５－１では、ピペットによって血液検体をフローセル３１１に直接注入してもよい。
サンプルＳＡは、シース液Ｓ－１に囲まれて細い流れを形成しながら、電気抵抗測定部３１２に設けられたアパーチャ３１２ａを通過する。この際に、アパーチャ３１２ａの両端に設置された白金電極（図示せず）で電気抵抗の変化をパルスとして検出する。これにより、電気抵抗測定部３１２では、アパーチャ３１２ａを通過した細胞（血球）の大きさが測定される（Ｓ５－２；電気抵抗測定工程）。
続いて、サンプルＳＡは、シース液Ｓ－２に囲まれて光学測定部３１３に導かれる。光学測定部３１３は、光源部３１３ａ（例えばハロゲンランプ）と、検出部３１３ｂ（フォトセル）と、光学系３１３ｃと、を有する。光学系３１３ｃは、光源部３１３ａと検出部３１３ｂとの間に位置する。光学系３１３ｃは、レンズおよび光学フィルタを含んで構成される。光源部３１３ａから、フローセル３１１を流れるサンプルＳＡ（血液検体）に向かって光が照射されると、サンプルＳＡの血球（赤血球、白血球）を通過した光が検出部３１３ｂに到達する。これにより、検出部３１３ｂでは、血球の光透過度（光透過率）が検出される（Ｓ５－３；光学測定工程）。計数装置３１０は、電気抵抗測定部３１２および光学測定部３１３での各測定結果に基づいて、サンプルＳＡ（血液検体）に含まれる網状赤血球を計数する。そして、濃度算出部４２は、網状赤血球の計数結果と、血液検体の量とから、網状赤血球の濃度を算出する（Ｓ５－４；濃度算出工程）。なお、血液検体の量（体積）は予めわかっているとする。
例えば、図７は、界面活性剤としてのTergitolの濃度が０ｇ／Ｌである場合に、つまり、Ｓ２で血液検体にTergitolを添加しなかったときに、同じ血球について、電気抵抗測定部３１２および光学測定部３１３で得られた結果をプロットしたものである。また、図８は、Ｓ２で添加した界面活性剤としてのTergitolの濃度が０．６ｇ／Ｌである場合に、同じ血球について、電気抵抗測定部３１２および光学測定部３１３で得られた結果をプロットしたものである。なお、これらの図中、横軸は、電気抵抗測定部３１２での測定結果（血球の粒子径）を示し、右に向かうほど粒径が大きいことを示す。また、縦軸は、光学測定部３１３での測定結果（血球の光透過度）を示し、上方に向かうほど光の吸収が大きい（光透過度が低い）ことを示す。
なお、フローセル３１１を流れるサンプルＳＡの流速を一定とし、電気抵抗を測定するタイミングと光透過度を測定するタイミングとの時間的なズレを一定にすることにより、同じ血球について、電気抵抗測定による測定結果（粒子径）と光透過度測定による測定結果（吸光量）とを得ることが可能である。
なお、本実施形態では、網状赤血球の濃度測定にあたり、ＬＭＮＥチャンバー３１Ａを利用しているため、図７および図８では、ＬＭＮＥチャンバー３１Ａで検出可能な白血球５分類の境界をそのまま残して図示しているが、ここでは上記境界を無視することができる。
血液検体に界面活性剤を添加しなかった場合、赤血球からヘモグロビンが除去されていないため、様々な粒径の血球を含む血液検体に光を照射したときに、赤血球中のヘモグロビンでの吸光が大きい。この影響により、光学測定部３１３は、網状赤血球のみならず、成熟赤血球も光学的に検出する。このため、図７に示すように、網状赤血球および成熟赤血球を含む様々な粒子径の血球について、吸光量を検出した分布が得られている。したがって、計数装置３１０は、網状赤血球のみの計数を、電気抵抗測定部３１２および光学測定部３１３での各測定結果に基づいて精度よく行うことは困難となる。
これに対して、血液検体に界面活性剤を添加した場合、赤血球からヘモグロビンが除去されるため、赤血球での吸光を減らすことができる。これにより、光学測定部３１３は、網状赤血球のみを光学的に検出することができる。したがって、計数装置３１０は、図８でプロットされた各点、つまり、電気抵抗測定部３１２および光学測定部３１３での各測定結果に対応する各点をカウントすることにより、網状赤血球のみを計数することができる。これにより、濃度算出部４２は、網状赤血球の濃度を精度よく算出することが可能となる。
以上、上記した第１測定方法によれば、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度を測定する前に、界面活性剤を用いて赤血球からヘモグロビンを除去する。界面活性剤としては、上述したように、浸透圧およびｐＨが血液に近いものを用いることができる。このため、染色後の血液検体に界面活性剤を投入するだけで、赤血球からヘモグロビンを簡単に除去することができる。したがって、赤血球溶血試薬を用いる従来の方法のように、赤血球溶血試薬の浸透圧およびｐＨを適切に調整する前処理は不要である。その結果、網状赤血球の濃度測定前の前処理を簡素化することができる。つまり、簡単な前処理で網状赤血球の濃度測定を行うことができる。
特に、界面活性剤は、カチオン系、両性イオン系または非イオン系である。この場合、網状赤血球に含まれるＲＮＡ（マイナスチャージ）にＮＭＢ（プラスチャージ）が結合する前に、界面活性剤がＮＭＢと結合することを抑制することができる。その結果、ＮＭＢによってＲＮＡを確実に染色することができる。
また、上記した染色工程（Ｓ１）と、除去工程（Ｓ２）と、希釈工程（Ｓ３）と、をこの順で（３ステップで）行うことにより、前処理を一工程ずつ確実に進めることができる。
また、例えば界面活性剤の濃度が濃い場合、赤血球からヘモグロビンを取り出した後、フローセル３１１への移動中に、赤血球の膜が破れて網状赤血球の濃度測定を行うことができなくなる可能性がある。上記のように希釈工程（Ｓ３）を行うことにより、界面活性剤の濃度が薄くなるため、上記の可能性を減らすことができる。なお、網状赤血球の濃度測定を行うにあたって、希釈工程は必須ではない。例えば、界面活性剤の濃度が薄い場合、希釈工程を省略（スキップ）して、網状赤血球の濃度測定を行うことも可能である。この点は、以下の測定方法でも同様である。
また、Ｓ５の測定工程は、導入工程（Ｓ５－１）と、電気抵抗測定工程（Ｓ５－２）と、光学測定工程（Ｓ５－３）と、濃度算出工程（Ｓ５－４）と、を含む。これにより、Ｓ１～Ｓ４までを手動で行い、Ｓ５を血液分析装置１（および端末装置７０）で行う、セミ自動化を実現することができる。
なお、以上では、チャンバー３１としてのＬＭＮＥチャンバー３１Ａに血液検体を導入して網状赤血球の濃度を測定する方法について説明したが、血液分析装置１が、ＬＭＮＥチャンバー３１Ａ以外に、網状赤血球の濃度測定専用のチャンバーを備えている場合には、上記専用のチャンバーに血液検体を導入して、網状赤血球の濃度を測定するようにしてもよい。
上述したＳ５－２では、血球がアパーチャ３１２ａ（図６参照）を通過するときの電気抵抗の変化に基づいて、血球の大きさ（言い換えれば、血球の体積の変化）を測定する例について説明したが、光学的な手法によって血球の大きさを測定してもよい。例えば、発光部および受光部の間を血球が通過するときの、上記受光部での受光量に基づいて、血球の大きさを測定することは可能である。したがって、Ｓ５－２の電気抵抗測定工程は、フローセル３１１を流れる血液検体中の血球の体積の変化を測定する血球体積サイズ測定工程の一例であると言うことができる。また、電気抵抗測定部３１２は、フローセル３１１を流れる血液検体中の血球の電気抵抗の変化を測定することにより、上記血球の体積の変化を測定する血球体積サイズ測定部３１２Ｖ（図６参照）の一例である、と言うこともできる。
（３－２．第２測定方法）
上記した第１測定方法において、Ｓ１～Ｓ３の３ステップは、まとめて１ステップとすることもできる。以下、網状赤血球の濃度測定方法の他の例である第２測定方法について説明する。図９は、第２測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。
上記した第１測定方法において、Ｓ１～Ｓ３の３ステップは、まとめて１ステップとすることもできる。以下、網状赤血球の濃度測定方法の他の例である第２測定方法について説明する。図９は、第２測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。
まず、血液検体に、染色試薬（ＮＭＢ）、界面活性剤および希釈液の混合物を同時に投入する（Ｓ１－１：混合物投入工程）。これにより、血液検体に含まれる網状赤血球の染色、界面活性剤によるヘモグロビンの赤血球からの除去、血液検体の希釈、とが同時に行われる。すなわち、Ｓ１－１の工程は、上記した染色工程（Ｓ１）と、除去工程（Ｓ２）と、希釈工程（Ｓ３）と、を同時に行う工程に対応する。Ｓ１－１の後は、図３と同様に、Ｓ５の工程が行われる。なお、Ｓ５のＳ５－１では、例えば血液検体１０から希釈後の血液検体をピペットで吸引し、吸引した血液検体を、血液分析装置１のＬＭＮＥチャンバーに直接注入するが、検体容器１０を検体容器装填部４に装填した後、検体容器１０の内部の血液検体をニードル２０によって吸引し、ＬＭＮＥチャンバーに吐出してもよい。
Ｓ１－１にて、染色工程と、除去工程と、希釈工程と、を同時に（１ステップで）行うことにより、血液検体への薬剤（試薬等）の投入が一度で済む。したがって、３ステップで前処理を行う第１測定方法に比べて、濃度測定前の前工程をさらに簡素化することができる。
（３－３．第３測定方法）
網状赤血球の濃度測定は、目視による測定結果に基づいて行うことも可能である。以下、目視で網状赤血球をカウントして濃度を測定する方法を、第３測定方法として説明する。図１０は、第３測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。
網状赤血球の濃度測定は、目視による測定結果に基づいて行うことも可能である。以下、目視で網状赤血球をカウントして濃度を測定する方法を、第３測定方法として説明する。図１０は、第３測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。
まず、血液検体に、染色試薬（ＮＭＢ）、界面活性剤および希釈液の混合物を同時に投入する（Ｓ１１：混合物投入工程）。なお、Ｓ１１の工程は、図９のＳ１－１の工程と全く同じである。
次に、Ｓ１－１で混合物を投入した後の血液検体をスライドガラスに所定量滴下する（Ｓ１２：滴下工程）。その後、スライドガラスを顕微鏡にセットし、染色された網状赤血球を目視でカウントし、上記所定量あたりの網状赤血球のカウント数を網状赤血球の濃度として算出する（Ｓ１３：濃度算出工程）。
なお、第１測定方法のように、前処理を３ステップ（染色工程、除去工程、希釈工程）で順に行った後、図１０のＳ１２以降の処理を行ってもよい。つまり、上記３ステップを行った後、希釈した血液検体をスライドガラスに所定量滴下し（Ｓ１２）、染色された網状赤血球の数を、顕微鏡を用いて目視で計測し、計測結果に基づいて、網状赤血球の濃度を算出してもよい。
前処理を３ステップで行う場合でも、１ステップで行う場合でも、その後、Ｓ１２およびＳ１３の工程を行うことにより、目視での網状赤血球を計測して網状赤血球の濃度を測定することができる。
なお、顕微鏡で観察される視野をカメラで撮影し、撮影された画像に対して画像処理を行い、最終の画像処理で得られる赤血球の形から網状赤血球を判断して計数を行い、これによって網状赤血球の濃度を測定してもよい。
（３－４．第４測定方法）
網状赤血球の濃度測定は、測定システム８０を用いて全自動で行うこともできる。以下、全自動による網状赤血球の濃度測定方法を第４測定方法として説明する。第４測定方法では、図２で示した収容部３２０に収容された試薬類（染色試薬、界面活性剤、希釈液の混合物）を使用する。以下、詳細に説明する。
網状赤血球の濃度測定は、測定システム８０を用いて全自動で行うこともできる。以下、全自動による網状赤血球の濃度測定方法を第４測定方法として説明する。第４測定方法では、図２で示した収容部３２０に収容された試薬類（染色試薬、界面活性剤、希釈液の混合物）を使用する。以下、詳細に説明する。
図１１は、第４測定方法によって網状赤血球の濃度を測定する際の処理の流れを示すフローチャートである。第４測定方法は、装填工程（Ｓ２１）と、混合物投入工程（Ｓ２２）と、測定工程（Ｓ２３）と、を含む。
Ｓ２１の装填工程では、血液検体を収容した検体容器１０を、血液分析装置１の検体容器装填部４（図１参照）にセットする。
Ｓ２２の混合物投入工程では、染色試薬、界面活性剤および希釈液の混合物が、収容部３２０から導管３２１を介してチャンバー３１（特にＬＭＮＥチャンバー）に供給される。なお、Ｓ２２の混合物投入工程は、図４のＳ１（染色工程）、Ｓ２（除去工程）、Ｓ３（希釈工程）の３ステップを１ステップで（同時に）行う工程に対応する。
Ｓ２３の測定工程は、導入工程（Ｓ２３－１）、電気抵抗測定工程（Ｓ２３－２）、光学測定工程（Ｓ２３－３）、および濃度算出工程（Ｓ２３－４）を含む。なお、Ｓ２３の測定工程は、図４の測定工程（Ｓ５）と対応する。したがって、Ｓ２３の測定工程に含まれる導入工程（Ｓ２３－１）、電気抵抗測定工程（Ｓ２３－２）、光学測定工程（Ｓ２３－３）、および濃度算出工程（Ｓ２３－４）は、図４で示した導入工程（Ｓ５－１）、電気抵抗測定工程（Ｓ５－２）、光学測定工程（Ｓ５－３）、濃度算出工程（Ｓ５－４）とそれぞれ対応する。Ｓ２３の測定工程により、第１測定方法と同様にして、血液検体に含まれる網状赤血球の濃度が測定される。
なお、Ｓ２３－１の導入工程では、検体容器装填部４に装填された検体容器１０から、血液検体がニードル２０によって吸引され、チャンバー３１（特にＬＭＮＥチャンバー）に吐出される。そして、導管３２１を介してチャンバー３１に供給される染色試薬等の混合物と、上記血液検体との反応が所定時間（少なくとも染色およびヘモグロビン除去に要する時間）経過した後、チャンバー３１内の反応物がフローセル３１１に移動する。
このように、第４測定方法では、染色工程と、除去工程と、希釈工程とを、フローセル３１１を備えた血液分析装置１で行う（Ｓ２２）。これにより、測定システム８０において、網状赤血球の染色から濃度測定までを全自動で行うことができる。
なお、血液分析装置１の収容部３２０は、染色試薬と、界面活性剤と、希釈液とを別々に収容する構成では、収容部３２０から、染色試薬、界面活性剤、および希釈液を順にチャンバー３１に供給する構成とすることもできる。この場合、染色工程と、除去工程と、希釈工程とを、時間をずらして３段階で、しかも、全自動で行う濃度測定方法を実現することができる。
〔４．網状赤血球検査用試薬キットについて〕
図１２は、網状赤血球検査用試薬キット１００の一例を示す斜視図である。上記した染色試薬、界面活性剤および希釈液は、網状赤血球検査用試薬キット１００としてユーザ（例えば医療従事者）に提供することもできる。網状赤血球検査用試薬キット１００には、染色試薬、界面活性剤、および希釈液の混合物を収容した収容容器１１が梱包体１００ａで梱包されている。すなわち、網状赤血球検査用試薬キット１００は、染色試薬と、界面活性剤と、希釈液と、を含む。
図１２は、網状赤血球検査用試薬キット１００の一例を示す斜視図である。上記した染色試薬、界面活性剤および希釈液は、網状赤血球検査用試薬キット１００としてユーザ（例えば医療従事者）に提供することもできる。網状赤血球検査用試薬キット１００には、染色試薬、界面活性剤、および希釈液の混合物を収容した収容容器１１が梱包体１００ａで梱包されている。すなわち、網状赤血球検査用試薬キット１００は、染色試薬と、界面活性剤と、希釈液と、を含む。
ユーザは、網状赤血球検査用試薬キット１００の梱包体１００ａから収容容器１１を取り出す。その後、ユーザは、収容容器１１から混合物をピペット等で吸引して、血液分析装置１の外部で、血液検体を収容した検体容器１０に注入することができる。これにより、上述した第２測定方法を実施することが可能となる。また、ユーザは、ピペット等で吸引した混合物を、スライドガラス上に滴下したり、血液分析装置１内のチャンバー３１内に直接注入することもできる。この場合、上述した第３測定方法および第４測定方法を実施することが可能となる。
図１３は、網状赤血球検査用試薬キット１００の他の例を示す斜視図である。網状赤血球検査用試薬キット１００は、収容容器１０として、染色試薬を収容した第１容器１１ａと、界面活性剤を収容した第２容器１１ｂと、希釈液を収容した第３容器１１ｃと、を含んでいてもよい。
同図に示すように、染色試薬、界面活性剤、希釈液が個々の容器（第１容器１１ａ、第２容器１１ｂ、第３容器１１ｃ）に収容されていることにより、ユーザは、網状赤血球検査用試薬キット１００の梱包体１００ａから個々の容器を取り出し、その後、血液分析装置１の外部で、血液検体が収容された検体容器１０に、染色試薬、界面活性剤、希釈液を順次、ピペット等で注入することができる。これにより、上述した第１測定方法を実施することが可能となる。
なお、網状赤血球検査用試薬キット１００は、染色試薬、界面活性剤および希釈液のうち、少なくとも染色試薬および界面活性剤を含んでいればよい。希釈液は、血液検体を希釈する液体として一般に用いられることから、ユーザが既に確保している可能性がある。したがって、網状赤血球検査用試薬キット１００が染色試薬および界面活性剤を含むことにより、網状赤血球の濃度測定に必要な最小限の材料をユーザに提供して、本実施形態の網状赤血球の濃度測定をユーザに実施させることができる。特に、網状赤血球検査用試薬キット１００が希釈液をさらに含んでいる場合は、網状赤血球の濃度測定に必要な全ての材料をユーザに提供して、本実施形態の網状赤血球の濃度測定を確実にユーザに実施させることができる。
〔５．蛍光色素を用いた網状赤血球の検出について〕
網状赤血球は、蛍光色素を用いて検出することも可能である。図１４は、蛍光色素を用いて網状赤血球を検出する光学装置２００の概略の構成を示す説明図である。光学装置２００は、上述した測定システム８０に適用可能である。光学装置２００は、レーザ光源２０１と、検出光学系２０２と、検出器２０３と、を含んで構成される。レーザ光源２０１は、任意の波長（例えば４８８ｎｍ）のレーザ光を出射する。検出光学系２０２は、３つの集光レンズ２１１、２１２、および２１３と、光学フィルタ２１４ａおよび２１４ｂと、空間フィルタ２１５と、を含んで構成される。
網状赤血球は、蛍光色素を用いて検出することも可能である。図１４は、蛍光色素を用いて網状赤血球を検出する光学装置２００の概略の構成を示す説明図である。光学装置２００は、上述した測定システム８０に適用可能である。光学装置２００は、レーザ光源２０１と、検出光学系２０２と、検出器２０３と、を含んで構成される。レーザ光源２０１は、任意の波長（例えば４８８ｎｍ）のレーザ光を出射する。検出光学系２０２は、３つの集光レンズ２１１、２１２、および２１３と、光学フィルタ２１４ａおよび２１４ｂと、空間フィルタ２１５と、を含んで構成される。
光学フィルタ２１４ａ（第１光学フィルタ）は、レーザ光と同じ波長の光をカットするフィルタである。光学フィルタ２１４ｂ（第２光学フィルタ）は、ラマン散乱光（特に水のラマン波長）をカットするフィルタである。光学フィルタ２１４ａおよび２１４ｂは、レーザ光源２０１に近い２つの集光レンズ２１１、２１２の間に、レーザ光源２０１側からこの順で配置されている。空間フィルタ２１５は、２つの集光レンズ２１２、２１３の間に配置されており、アパーチャ（ピンホール）を有している。検出器２０３は、例えばＳｉ－ＰＭＴ（photomultiplier tube）で構成される。
網状赤血球に含まれるＲＮＡを蛍光色素で染色した後、血液検体をフローセル３１１に投入する。フローセル３１１を流れる細胞（蛍光染色した網状赤血球）に、レーザ光源２０１からレーザ光を当てると、レーザ光の照射によって励起された光（蛍光）と、細胞からのレーザ光と同じ波長の弾性散乱光とが発生する。細胞からの弾性散乱光は、検出光学系２０２の光学フィルタ２１４ａでカットされ、蛍光のみが検出器２０３に導かれる。一方、フローセル３１１を流れる細胞にレーザ光を当てると、細胞の周囲の液体（例えば水）もレーザ光で散乱され、レーザ光よりも長波長のラマン散乱光（非弾性散乱光）が発生する。しかし、発生したラマン散乱光は、検出光学系２０２の光学フィルタ２１４ｂでカットされる。これにより、検出器２０３では、ラマン散乱光の影響を低減した状態で、蛍光が検出される。
このように、ラマン散乱光をカットする光学フィルタ２１４ｂを配置するという安価で簡単な光学系の構成により、網状赤血球の検出精度を向上させることができる。特に、検出器２０３を構成するＳｉ－ＰＭＴは、感度に優れており、網状赤血球の検出精度を向上させる点で非常に有利となる。また、検出器２０３として、例えばＡＰＤ（avalanche photodiode）を用いた構成では、ＡＰＤが小型であるため、光を微小に集光する高価な光学系または光学調整機構と調整作業とが必要となる。しかし、Ｓｉ－ＰＭＴは、ＡＰＤと比較して、感度に優れているだけでなく受光面積を広くすることができるため、ＡＰＤでは必要であった高価な光学系等および調整作業を不要にすることができるとともに、安価な低出力のレーザ光源２０１を用いる構成を採用することができる。
〔６．有核赤血球の濃度測定について〕
以上で説明した本実施形態の網状赤血球の濃度の測定方法および測定システム８０と、網状赤血球の濃度測定に用いる網状赤血球検査用試薬キット１００とは、有核赤血球の濃度測定にも利用することができる。つまり、前述したように、有核赤血球の中にはＲＮＡ等の核酸が含まれているため、網状赤血球の濃度測定の場合と同様に、核酸の染色、界面活性剤投入によるヘモグロビン除去等を行うことにより、有核赤血球の濃度を測定することができる。
以上で説明した本実施形態の網状赤血球の濃度の測定方法および測定システム８０と、網状赤血球の濃度測定に用いる網状赤血球検査用試薬キット１００とは、有核赤血球の濃度測定にも利用することができる。つまり、前述したように、有核赤血球の中にはＲＮＡ等の核酸が含まれているため、網状赤血球の濃度測定の場合と同様に、核酸の染色、界面活性剤投入によるヘモグロビン除去等を行うことにより、有核赤血球の濃度を測定することができる。
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明の範囲はこれに限定されるものではなく、発明の主旨を逸脱しない範囲で拡張または変更して実施することができる。
本発明は、例えば、網状赤血球または有核赤血球の濃度測定に利用可能である。
１ 血液分析装置
２０ ニードル
４２ 濃度算出部
８０ 測定システム
１００ 網状赤血球検査用試薬キット（検査用試薬キット）
２０１ レーザ光源（光源）
２０２ 検出光学系
２０３ 検出器
２１４ａ 光学フィルタ（第１光学フィルタ）
２１４ｂ 光学フィルタ（第２光学フィルタ）
３１０ 計数装置
３１１ フローセル
３１２ 電気抵抗測定部
３１２Ｖ 血球体積サイズ測定部
３１３ 光学測定部
３２０ 収容部
２０ ニードル
４２ 濃度算出部
８０ 測定システム
１００ 網状赤血球検査用試薬キット（検査用試薬キット）
２０１ レーザ光源（光源）
２０２ 検出光学系
２０３ 検出器
２１４ａ 光学フィルタ（第１光学フィルタ）
２１４ｂ 光学フィルタ（第２光学フィルタ）
３１０ 計数装置
３１１ フローセル
３１２ 電気抵抗測定部
３１２Ｖ 血球体積サイズ測定部
３１３ 光学測定部
３２０ 収容部
Claims (15)
- 血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する測定方法であって、
染色試薬を用いて、前記血液検体に含まれる赤血球のうち、前記網状赤血球または前記有核赤血球を染色する染色工程と、
前記血液検体に界面活性剤を投入することにより、前記赤血球からヘモグロビンを取り出す除去工程と、
前記染色工程および前記除去工程を経た後の前記血液検体を用いて、前記血液検体に含まれる前記網状赤血球の濃度または前記有核赤血球の濃度を測定する測定工程と、を含む、測定方法。 - 前記血液検体を希釈する希釈工程をさらに含む、請求項１に記載の測定方法。
- 前記染色工程と、前記除去工程と、前記希釈工程と、をこの順で行う、請求項２に記載の測定方法。
- 前記染色工程と、前記除去工程と、前記希釈工程と、を同時に行う、請求項２に記載の測定方法。
- 前記測定工程は、
前記血液検体をフローセルに導入する導入工程と、
前記フローセルを流れる前記血液検体中の血球の体積の変化を測定する血球体積サイズ測定工程と、
前記フローセルを流れる前記血液検体中の前記血球の光透過度を測定する光学測定工程と、
前記血球体積サイズ測定工程および前記光学測定工程での各測定結果に基づいて、前記血液検体に含まれる前記網状赤血球の濃度または前記有核赤血球の濃度を算出する濃度算出工程と、を含む、請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。 - 前記血球体積サイズ測定工程は、前記フローセルを流れる前記血液検体中の前記血球の電気抵抗の変化を測定することにより、前記血球の体積の変化を測定する電気抵抗測定工程を含む、請求項５に記載の測定方法。
- 前記染色工程と、前記除去工程とを、前記フローセルを備えた血液分析装置で行う、請求項５または６に記載の測定方法。
- 前記測定工程では、前記血液検体をスライドガラスに所定量滴下し、染色された前記網状赤血球または前記有核赤血球の数を、顕微鏡を用いて目視で計測し、計測結果に基づいて、前記網状赤血球の濃度または前記有核赤血球の濃度を算出する、請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
- 前記界面活性剤は、カチオン系、両性イオン系または非イオン系である、請求項１から８のいずれかに記載の測定方法。
- 血液検体に含まれる赤血球のうち、網状赤血球または有核赤血球を染色する染色試薬と、
前記赤血球からヘモグロビンを取り出す界面活性剤と、を備える、検査用試薬キット。 - 前記血液検体を希釈する希釈液をさらに含む、請求項１０に記載の検査用試薬キット。
- 血液検体に含まれる網状赤血球の濃度または有核赤血球の濃度を測定する測定システムであって、
前記網状赤血球または有核赤血球を染色する染色試薬と、前記血液検体に含まれる赤血球からヘモグロビンを取り出すために前記血液検体に投入される界面活性剤と、を収容する収容部と、
前記血液検体と、前記染色試薬および前記界面活性剤とが導入されるフローセルと、
前記フローセルに導入された前記血液検体中の血球の体積の変化を測定する血球体積サイズ測定部と、
前記フローセルに導入された前記血液検体中の前記血球の光透過度を測定する光学測定部と、
前記血球体積サイズ測定部および前記光学測定部での各測定結果に基づいて、前記血液検体に含まれる前記網状赤血球の濃度または前記有核赤血球の濃度を算出する濃度算出部と、を備える、測定システム。 - 前記血球体積サイズ測定部は、前記フローセルに導入された前記血液検体中の前記血球の電気抵抗の変化を測定することにより、前記血球の体積の変化を測定する電気抵抗測定部を含む、請求項１２に記載の測定システム。
- 前記収容部は、前記血液検体を希釈する希釈液をさらに収容し、
前記フローセルには、前記染色試薬および前記界面活性剤に加えて、前記希釈液が導入される、請求項１２または１３に記載の測定システム。 - 前記フローセルを流れる、蛍光染色した細胞に向かって光を出射する光源と、
検出光学系と、
前記細胞への前記光の照射によって励起された蛍光を、前記検出光学系を介して検出する検出器と、を備え、
前記検出光学系は、
前記光の照射によって発生する、前記細胞からの前記光と同じ波長の弾性散乱光をカットする第１光学フィルタと、
前記細胞の周囲の液体が前記光で散乱されることによって発生する、前記光よりも長波長のラマン散乱光をカットする第２光学フィルタと、を有する、請求項１２から１４のいずれかに記載の測定システム。
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