JP2004536580A - Ｖｌａ−１に対する抗体 - Google Patents

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Abstract

ＶＬＡ−１インテグリンに特異的に結合する抗体、および免疫学的障害を処置するためにこれらの抗体を使用する方法が、開示される。また、ＶＬＡ−１抗体およびそれらのリガンドによって形成される複合体の結晶構造、ならびに、これらの構造の構造座標を使用することによって同定されるＶＬＡ−１アンタゴニストおよびＶＬＡ−１アゴニストが、含まれる。１つの局面において、本発明は、抗ＶＬＡ−１抗体であって、このＶＬＡ−１抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３３、４９〜５５および８８〜９６によって規定され、そしてこのＶＬＡ−１抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５および９８〜１０７によって規定される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＬＡ−１インテグリンに対する抗体、ならびに炎症性疾患および他の免疫学的障害を処置におけるこれらの抗体の使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、１つのこのような抗体とＶＬＡ−１のα１−Ｉドメインとの間の複合体の結晶構造、ならびにコンピューターを利用した薬物設計についてのこの構造情報の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
インテグリンは、細胞−細胞接着および細胞−マトリクス接着を媒介する細胞表面レセプターのスーパーファミリーである。これらのタンパク質は、発生および組織修復の間の、細胞の増殖、移動、および分化のための足場ならびにシグナルを提供することが公知である。これらは、免疫プロセスおよび炎症プロセスに関与している。
【０００４】
インテグリンは、２つの非共有的に連結したポリペプチド鎖（αおよびβ）から構成されるヘテロ二量体タンパク質である。各々の鎖のアミノ末端は、鎖間連結およびリガンド結合に寄与する球状ヘッド（ｈｅａｄ）を形成する。この球状ヘッドは、ストーク（ｓｔａｌｋ）により膜貫通セグメントに連結される。細胞質テール（ｔａｉｌ）は、通常、５０アミノ酸残基長未満である。インテグリンスーパーファミリーは、本来、βサブユニットがヘテロ二量体を形成させるために用いられたことに基づいて規定された。β１含有インテグリンはまた、「非常に遅い活性化（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」抗原のことをいう、ＶＬＡ分子と呼ばれる。ＶＬＡ−１〜ＶＬＡ−６は、それぞれ、α１〜α６（すなわち、ＣＤ４９ａ〜ＣＤ４９ｆ）を含むβ１スーパーファミリーのメンバーをいう。一般的な総説については、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｂｕｌ Ｋ．Ａｂｂａｓら編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００を参照のこと。
【０００５】
コラーゲン（Ｉ型およびＩＶ型の両方）およびラミニンは、α１β１インテグリン（すなわち、ＶＬＡ−１）のリガンドとして公知である。ＶＬＡ−１は、コラーゲンに対する細胞接着および細胞移動（Ｋｅｅｌｙら、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：５９５−６０７；およびＧｏｔｗａｌｓら、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２４６９−２４７７）；コラーゲンマトリクス（創傷治癒の重要な成分）の収縮および再構築を容易にすること（Ｇｏｔｗａｌｓら、前出；およびＣｈｉｒｏ，１９９１，Ｃｅｌｌ ６７：４０３−４１０）；ならびに細胞外マトリクス再モデリングに関与する遺伝子の発現を調節すること（Ｒｉｉｋｏｎｅｎら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１−５；およびＬａｎｇｈｏｌｚら、１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３１：１９０３−１９１５）に関与している。従って、ＶＬＡ−１の不適切な調節は、線維症のような特定の病理学的状態を生じ得る。
【０００６】
さらに、ＶＬＡ−１は、Ｔ細胞／単球誘導疾患において役割を果たし得ることが示唆されている。抗ＶＬＡ−１抗体は、Ｔ細胞依存サイトカイン発現をブロックする（Ｍｉｙａｋｅら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：８６３−８６８）。ＶＬＡ−１の発現は、持続的に活性化した、２〜４週齢の培養したＴ細胞において増加される（Ｈｅｍｌｅｒら、１９８５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：５０２−５０８）。ＶＬＡ−１はまた、慢性関節リウマチを有する患者の滑膜から単離されたＴ細胞の高い割合において発現される（Ｈｅｍｌｅｒら、１９８６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８：６９２−７０２）。
【０００７】
インテグリンαサブユニットのいくつかの結晶構造が決定されており、これらとしては、α２β１のα２−Ｉドメインの構造（ＰＤＢアクセッションコード１ａｏｘ；Ｅｍｓｌｅｙら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８５１２−２８５１７）；ラットα１β１のα１−Ｉドメイン（ＰＤＢアクセッション番号１ｃｋ４；Ｎｏｌｔｅら、１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３７９−３８５；ＷＯ００／２０４５９）；ヒトα１β１のα１サブユニット（ＰＤＢアクセッションコード１ｑｃ５；Ｒｉｃｈら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４９０６−２４９１３）；αＬ−ＩドメインおよびαＭ−Ｉドメイン；ならびにｖＷＦ−Ａ３（Ｌｅｅら、１９９５，Ｃｅｌｌ ８０：６３１−６３５；Ｌｅｅら、１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：１３３３−１３４０；Ｑｕら、１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０２７７−１０２８１；Ｑｕら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：９３１−９４２）が挙げられる。α２β１構造は、金属イオン結合部位でタンパク質の１つの表面上にトレンチ（ｔｒｅｎｃｈ）または溝を作製した螺旋（すなわち、Ｃ−螺旋）を示した（Ｅｍｓｌｅｙら、前出）。短いコラーゲンベースの３重螺旋ペプチドに複合体化したα２−Ｉドメインの結晶構造は、このコラーゲンベースのペプチドがトレンチに結合したことを示し、ここで、分子間接触または金属接触を起こすα２−Ｉアミノ酸は、Ａｓｐ１５１、Ａｓｎ１５４、Ｔｙｒ１５７、Ｇｌｎ２１５、Ａｓｐ２１９、Ｌｅｕ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｓｐ２５４、Ｇｌｕ２５６、Ｈｉｓ２５８、Ｔｙｒ２８５、Ｌｅｕ２８６、Ａｓｎ２８９、Ｌｅｕ２９１、Ａｓｎ２９５、およびＬｙｓ２９８（ＰＤＢアクセッションコード１ｄｚｉ；Ｅｍｓｌｅｙら、２０００，Ｃｅｌｌ １０１：４７−５６；ＷＯ０１／７３４４４）を含んでいた。直ぐ上のアミノ酸番号付けは、ＰＤＢアクセッションコード１ｄｚｉに基づき、そして本明細書中では、「結晶番号付け」と呼ぶ。ラットおよびヒトのα１−Ｉドメインの結晶構造は、類似のトレンチを示した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、抗ＶＬＡ−１抗体、ならびに種々の炎症障害および免疫学的障害を処置するためにこれらの抗体を使用する方法を提供する。
【０００９】
詳細には、本発明は、ＶＬＡ−１（例えば、ヒトＶＬＡ−１）に特異的に結合する抗体を包含する。この抗体は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３３、４９〜５５、および８８〜９６により規定される軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、ならびに／または配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５、および９８〜１０７により規定される重鎖相補性決定領域を含む。これらのＣＤＲは、抗体のＶＬＡ−１結合活性に影響することなく、本明細書中に開示される結晶構造から決定した場合、非抗原接触部分において変異（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。例示的変異は、軽鎖ＣＤＲ中のＳ２４Ｎ、Ｇ９２ＳおよびＤ１０１Ａ、ならびに重鎖ＣＤＲ２中のＧ５５Ｓである。１つの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１の軽鎖可変ドメイン配列、および／または配列番号２の重鎖可変ドメイン配列を含む。
【００１０】
関連する実施形態では、本発明の抗体は、ハイブリドーマＡＱＣ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に、２００１年４月１８日に寄託され、そしてＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ３２７３を有する）により生成される抗体と、同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む。（本明細書中で引用される全てのＡＴＣＣ寄託は、ブタペスト条約の下になされた）。この抗体は、例えば、ハイブリドーマｍＡＱＣ２、またはｍＡＱＣ２モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするハイブリドーマから単離された核酸配列を含む細胞により産生され得る。
【００１１】
別の実施形態では、抗体は、軽鎖中の以下の残基の少なくとも１個（例えば、２個、３個、４個、または５個）：Ｑ１、Ｌ４、Ｐ４６、Ｗ４７およびＹ７１；または重鎖中の以下の残基の少なくとも１個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個または７個）：Ｄ１、Ｖ１２、Ｓ２８、Ｆ２９、Ａ４９、Ｔ９３、Ｒ９４（Ｋａｂａｔ番号付け変換）を含むヒト化抗体である。例えば、軽鎖中にＱ１、Ｌ４およびＹ７１；および／または重鎖中に（ｉ）Ｆ２９、Ａ４９、Ｔ９３およびＲ９４、または（ｉｉ）Ａ４９およびＴ９３を含む。
【００１２】
本発明のヒト化抗体は、配列番号３のアミノ酸残基１〜１０６により規定される軽鎖可変ドメイン配列、および／または配列番号４のアミノ酸残基１〜１１８により規定される重鎖可変ドメイン配列を含み得る。ヒト化抗体は、細胞株ｈＡＱＣ２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ３２７５；２００１年４月１８日寄託）により産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および／または軽鎖ポリペプチド配列を含み得る。
【００１３】
別の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、重鎖の特定の位置の１個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個）に変異（例えば、欠失、置換または付加）を含み得、その結果、抗体のエフェクター機能（例えば、Ｆｃレセプターまたは補体因子に結合する抗体の能力）は、ＶＬＡ−１に結合する抗体の能力に影響することなく、変化される（米国特許第５，６４８，２６０号）。これらの重鎖位置としては、残基２３４、２３５、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２（ＥＵ番号付けシステム）が挙げられるが、これらに限定されない。このヒト化抗体は、例えば、重鎖中に変異Ｌ２３４Ａ（すなわち、未改変抗体の２３４位のロイシンをアラニンと交換する）および変異Ｌ２３５Ａ（ＥＵ番号付けシステム）を含む。１つの関連する実施形態では、この抗体は、細胞株ｈｓＡＱＣ２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ３３５６；２００１年５月４日に寄託）により産生される抗体と、同じ重鎖ポリペプチド配列を含む。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、グリコシル化のための部位であるアミノ酸残基の変異（例えば、欠失または置換）を含み得、その結果、グリコシル化部位が排除される。このような抗体は、ＶＬＡ−１結合アフィニティーを保持しながら、低下したエフェクター機能または他の望ましくない機能を有することに対して臨床的に有益であり得る。グリコシル化部位の変異はまた、プロセスの開発（例えば、タンパク質発現およびタンパク質精製）に対して有益であり得る。例えば、抗体の重鎖は、この重鎖がこの部位でもはやグリコシル化され得ないような、変異Ｎ２９７Ｑ（ＥＵ番号付けシステム）を含み得る。１つの関連する実施形態では、ヒト化抗体は、細胞株ｈａＡＱＣ２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ３２７４；２００１年４月１８日に寄託）により産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列を含み得る。
【００１５】
さらに他の実施形態では、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖は、ＶＬＡ−１に対する結合のアフィニティーを増大させ、それにより、ＶＬＡ−１媒介障害を処置する効力を増大させる変異を含む。
【００１６】
本発明の抗体および薬学的に受容可能なキャリア；配列番号１についてのコード配列を含む単離された核酸；配列番号２についてのコード配列を含む単離された核酸；ハイブリドーマｍＡＱＣ２により産生された抗体の軽鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；ハイブリドーマｍＡＱＣ２により産生された抗体の重鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；細胞株ｈＡＱＣ２により産生される抗体の軽鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；細胞株ｈＡＱＣ２により産生される抗体の重鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；細胞株ｈａＡＱＣ２により産生される抗体の重鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；細胞株ｈｓＡＱＣ２により産生される抗体の重鎖についてのコード配列を含む単離された核酸；配列番号３の残基１〜１０６についてのコード配列を含む単離された核酸；配列番号４の残基１〜１１８についてのコード配列を含む単離された核酸；ハイブリドーマｍＡＱＣ２の細胞；細胞株ｈＡＱＣ２由来の細胞；細胞株ｈａＡＱＣ２由来の細胞；ならびに細胞株ｈｓＡＱＣ２由来の細胞を含む組成物もまた本発明に包含される。
【００１７】
本発明はまた、有効量の本発明の抗体を被験体に投与する工程を包含する、ＶＬＡ−１により媒介される免疫学的障害を有する被験体を処置する方法を提供する。例えば、この方法を用いて、ヒト被験体を処置して、障害の進行を緩和するか、寛解させるか、静止させるか、逆転させるか、予防するか、遅くするか、または遅延させる。あるいは、この方法は、予防的に用いられて、この免疫学的障害を発症する危険のあるヒト被験体を処置して、障害の発症を予防または遅延させる。「有効量」の組成物は、１回以上の投薬で投与され得る。
【００１８】
ＶＬＡ−１媒介免疫学的障害としては、ＶＬＡ−１活性レベルが、正常な被験体と比較して、１つ以上の組織において上昇される障害が挙げられるが、これに限定されない。このような障害の例は、皮膚関連状態（例えば、乾癬、湿疹、熱傷、皮膚炎、および毛包細胞の異常な増殖）、線維症（例えば、腎臓線維症または肺線維症）、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、喘息、気管支炎、腱炎、滑液包炎、熱、片頭痛、胃腸状態（例えば、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、腸炎および結腸直腸の癌）、血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、リウマチ熱、変形性関節症、自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症）、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、腎不全、Ｂｅｃｈｅｔ症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症（例えば、遅発型過敏症または即時型過敏症）、移植片および移植組織の拒絶、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、結膜炎、損傷後に生じる腫脹、心筋虚血、および内毒素性ショック症候群である。
【００１９】
本発明はまた、組織を本発明の抗体と（例えば、インビボまたはインビトロで）接触させ、次いで、組織への抗体の結合を検出し、それにより、組織におけるＶＬＡ−１のレベルを決定する工程を包含する、組織（例えば、組織標本および体液）におけるＶＬＡ−１のレベルを決定する方法を提供する。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。これは、任意のイソタイプおよびサブタイプ（例えば、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかを有する、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ，ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の抗体全体（すなわち、２つの全長軽鎖および２つの全長重鎖を有する）であり得る。あるいは、本発明の抗体とは、抗体全体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、および単鎖Ｆｖ）をいう。
【００２１】
本発明はさらに、結晶化可能組成物およびラット−ヒトキメラα１−Ｉドメイン（変異体ＲΔＨ）およびｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントにより形成される複合体の結晶、ならびにこのような組成物および結晶を用いるための方法を提供する。本発明はまた、キメラドメインおよびｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの構造座標ならびに結合部位を提供する。本明細書中に記載される結晶構造に由来する原子座標は、ｈＡＱＣ２の生物学的活性についての構造的基礎および予想される生物学的活性を有するＶＬＡ−１のアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、ｈＡＱＣ２改変体のような低分子化合物または抗体）の合理的設計のための基礎を提供する。
【００２２】
本明細書中に開示される結晶構造は、α１β１インテグリン／Ｆａｂ複合体のα１−Ｉドメインの第１の結晶構造である。この構造は、α１−ＩドメインによるＦａｂ結合に重要である残基を示す。さらに、Ｆａｂは、推定のコラーゲン結合部位に結合し、そしてコラーゲン結合を阻害する。α１−Ｉドメイン上の結合部位において見出されるアミノ酸残基としては、Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｕ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１、およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）が挙げられる。α１−Ｉドメインに結合することが見出されたＦａｂフラグメント上の残基としては、軽鎖残基、Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）が挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、分子複合体（ここで、この分子複合体は、図１９に従う、α１β１インテグリンＲΔＨおよびヒト化抗体ｈＡＱＣ２のキメラＩドメインの複合体の構造座標のセットにより規定される）；またはこの分子複合体のホモログ（このホモログは、０．６５Åを超えないアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する）の三次元構造表示を作成するためのコンピューターを提供する。このコンピューターは、機械読み取り可能なデータをエンコードしたデータ記憶材料を備える機械読み取り可能なデータ記憶媒体（ここで、データは、図１９に従う複合体の構造座標の少なくとも一部を含む）；機械読み取り可能なデータを処理するための記憶装置のための作業メモリ；機械読み取り可能なデータを三次元表示へと処理するための、作業メモリおよび機械読み取り可能な記憶媒体に接続された中央演算処理ユニット；ならびに三次元表示を表示するための中央演算処理ユニットに接続されたディスプレイを備える。
【００２４】
本発明はさらに、図１９に従う軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）の少なくとも７個（例えば、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個）を含むｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標により規定される結合部位を含む分子または分子複合体；あるいは分子または分子複合体のホモログ（ここで、このホモログは、１．１０Åを超えないｈＡＱＣ２アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合部位を含む）の三次元表示を作成するためのコンピューターを提供する。本発明はまた、以下の三次元表示を作成するコンピューターを提供する：図１９に従う軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）の少なくとも７個（例えば、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個）を含むｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標により規定される結合部位；１．１０Åを超えないｈＡＱＣ２アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有するホモログの結合部位。
【００２５】
本発明はまた、インテグリンのＩドメインのインヒビターを同定するための方法を提供し、この方法は、図１９に従う軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）の少なくとも７個（例えば、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個）を含むｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標、あるいは１．１０Åを超えないｈＡＱＣ２アミノ酸の骨格原子からの±根平均二乗偏差を用いて、結合部位の三次元構造を作成する工程；この三次元構造を用いて潜在的アンタゴニストを設計または選択する工程；この潜在的アンタゴニストを合成する工程；ならびに、この潜在的アンタゴニストをｈＡＱＣ２と接触させて、ｈＡＱＣ２と相互作用する潜在的アンタゴニストの能力を決定する工程を包含し、ここで、ｈＡＱＣ２と相互作用する潜在的アンタゴニストの能力は、この潜在的アンタゴニストが、Ｉドメインのインヒビターであることを示す。本発明はさらに、この方法により同定されたインテグリンのＩドメインのインヒビターを提供する。
【００２６】
本発明はまた、図１９に従うＩドメインアミノ酸残基Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１，およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）の構造座標により規定される結合部位を含む分子または分子複合体；あるいは、この分子または分子複合体のホモログ（このホモログは、０．６５Åを超えないＩドメインアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する第２の結合部位を含む）の三次元表示を作成するためのコンピューターを提供する。本発明はまた、図１９に従うＩドメインアミノ酸残基Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１，およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）の構造座標により規定される第１の結合部位；または０．６５Åを超えないＩドメインアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有するホモログの結合部位の三次元表示を作成するコンピューターを提供する。
【００２７】
本発明はまた、図１９に従う、残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶番号付け）の少なくとも３個を含むＩドメインアミノ酸の構造座標により規定される結合部位を含む分子または分子複合体；あるいは、この分子または分子複合体のホモログ（このホモログは、１．０Åを超えないＩドメインアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する第２の結合部位を含む）の三次元表示を作成するためのコンピューターを提供する。本発明はさらに、図１９に従う、残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶番号付け）の少なくとも３個を含むＩドメインアミノ酸の構造座標により規定される結合部位；または１．０Åを超えないＩドメインアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有するホモログの結合部位の三次元表示を作成するコンピューターを提供する。
【００２８】
本発明はさらに、キメラドメインもしくはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント、またはその一部と会合する化学実体を設計し；キメラドメインもしくはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント、またはその一部の潜在的インヒビターとして作用させるために、これらの三次元表示を用いる方法を提供する。本発明はまた、キメラドメインのインヒビターおよび改変体、またはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの改変体のような化学実体を含む組成物に関し、ここで、このような化学実体および改変体は、キメラドメインもしくはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント、または結合部位の構造座標により、合理的に設計される。本発明はさらに、被験体における不適切なまたは異常なα１β１活性に関係した状態を処置または予防するための、上記の化学実体の使用に関する。
【００２９】
本発明はさらに、インテグリンのＩドメインのインヒビターを同定する方法を提供し、この方法は、図１９に従うＩドメインアミノ酸残基Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１，およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）の構造座標を用いて、結合部位の三次元構造を作成する工程；この三次元構造を用いて潜在的アンタゴニストを設計または選択する工程；この潜在的アンタゴニストを合成する工程；ならびに、この潜在的アンタゴニストをＩドメインと接触させて、Ｉドメインと相互作用する潜在的アンタゴニストの能力を決定する工程を包含し、ここで、Ｉドメインと相互作用する潜在的アンタゴニストの能力は、この潜在的アンタゴニストが、Ｉドメインのインヒビターであることを示す。
【００３０】
本発明はまた、インテグリンのＩドメインのインヒビターを同定する方法を提供し、この方法は、図１９に従う、残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶番号付け）を含む少なくとも３個のＩドメインアミノ酸の構造座標、または０．６５Åを超えないＩドメインアミノ酸の骨格原子からの±根平均二乗偏差を用いて、結合部位の三次元構造を作成する工程；この三次元構造を用いて潜在的アンタゴニストを設計または選択する工程；この潜在的アンタゴニストを合成する工程；ならびに、この潜在的アンタゴニストをＩドメインと接触させて、インテグリンのＩドメインと相互作用する潜在的アンタゴニストの能力を決定する工程を包含し、ここで、Ｉドメインと相互作用する潜在的アンタゴニストの能力は、この潜在的アンタゴニストが、Ｉドメインのインヒビターであることを示す。本発明はまた、この方法により同定されたインテグリンのＩドメインのインヒビターを提供する。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
インテグリン（例えば、ＶＬＡ−１）およびそのフラグメント（特に、α１−インテグリンサブユニット）に対する抗体が、炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）白血球と、細胞外マトリックスの構成成分（コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンが挙げられるが、これらに限定されない）との相互作用をブロックし得ることが、本発明の発見である。この発見は、このインテグリンファミリー（特に、α１β１）の接着分子が、炎症に関連する状態の間の末梢組織環境において重要であることを示す。この発見はまた、炎症におけるインテグリンファミリーおよびそのフラグメントの役割を、免疫応答に対するマトリックスが豊富な末梢組織環境の重要性を強調することによって、内皮界面での白血球の接着および管外遊出を越えて拡張する。この発見は、接着に基づく治療のための新規な介入点としての末梢組織を明らかにする。
【００３３】
（Ｉ．抗インテグリン抗体）
本発明の方法は、インテグリンに対する抗体の使用を企図し、この企図されるインテグリンは、α鎖（α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、αＩＩｂが挙げられるが、これらに限定されない）に非共有結合したβ鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８が挙げられるが、これらに限定されない）を含む分子を包含する。本発明における使用のために企図される種々のインテグリンの例としては、
【００３４】
【化１】
Figure 2004536580
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の方法はまた、インテグリンフラグメントに対する抗体（例えば、β鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８が挙げられるが、これらに限定されない）単独に対する抗体、ならびにα鎖（α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１０、αＶ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ、αＩＩｂが挙げられるが、これらに限定されない）単独に対する抗体が挙げられる）の使用を企図する。さらに、本発明の方法は、インテグリンフラグメントに対する抗体（例えば、α鎖のＩドメインに対する抗体が挙げられる）の使用をさらに企図し、このα鎖のＩドメインとしては、α１β１（Ｂｒｉｅｓｅｗｉｔｚら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８９）由来のＩドメイン；α２β１（ＴａｋａｄａおよびＨｅｍｌｅｒ，１９８９，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０９：３９７）由来のＩドメイン、αＬβ２（Ｌａｒｓｏｎら、１９８９、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８：７０３）由来のＩドメイン、αＭβ２（Ｃｏｒｂｉら、１９８８、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：１２４０３）由来のＩドメイン、αＸβ２（Ｃｏｒｂｉら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ ６：４０２３）由来のＩドメイン、αＤβ２（Ｇｒａｙｓｏｎら、１９８８、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：２１８７）由来のＩドメイン、αＥβ７（Ｓｈａｗら、１９９４、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：６０１６）由来のＩドメインが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、α１−Ｉドメイン抗原決定基は、少なくとも６個連続するアミノ酸のアミノ酸配列を含み、この連続する配列は、図１２の配列内で見出される。関連する実施形態において、この連続する配列は、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号６４の残基９１〜９７）である。
【００３６】
本発明における使用のためのインテグリンを生成するための方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５−４３４を参照のこと）。
【００３７】
本発明の実施形態は、抗インテグリンポリクローナル抗体および抗インテグリンモノクローナル抗体をさらに包含する。本発明の実施形態は、モノクローナル抗体（例えば、抗α１モノクローナル抗体）を包含する。処置（特に、ヒト処置）のための抗体としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗体全体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆａｂ’抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、およびＦ（ｖ）抗体フラグメント）が挙げられる。本発明のいくつかの抗体はまた、１つ以上の免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖（例えば、これらの鎖のモノマーおよびホモマルチマーまたはヘテロマルチマー（例えば、ダイマーまたはトリマー））を含むタンパク質を包含し得、これらの鎖は、必要に応じてジスルフィド結合しているか、または他の方法で架橋している。これらの抗体は、１つ以上の抗原（例えば、α１含有インテグリンサブユニット、α２含有インテグリンサブユニット、α６含有インテグリンサブユニット、またはα−Ｉドメイン含有インテグリンサブユニット）に結合可能であり得る。
【００３８】
本明細書中で使用されるα１β１機能ブロック抗体とは、α１−Ｉドメイン（例えば、図１２の残基９２〜９７）に結合し、かつ（例えば、コラーゲンＩＶへのＫ５６２−α１依存性接着をその抗体が阻害する能力によって）試験した場合にα１β１機能をブロックする抗体を指す（実施例１５を参照）。
【００３９】
以下は、本発明の抗体を生成する種々の方法を記載する。当該分野で公知であるが本明細書中に特には記載されない方法もまた、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の抗体はまた、ファージディスプレイ抗体ライブラリー（例えば、Ｓｍｉｔｈ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−７；米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７３３，７４３号、同第６，２９１，６５０号、および同第６，３０３，３１３号に記載されるファージディスプレイ抗体ライブラリー）を使用して同定され得る。本発明のさらなる抗体は、本明細書中で同定される重鎖を、非同族軽鎖（例えば、ファージディスプレイ技術により同定される軽鎖）と結合することによって生成され得る。
【００４０】
（ＩＩ．非ヒトハイブリドーマ抗体）
本発明のモノクローナル抗体は、周知のハイブリドーマ技術によって生成され得る。例えば、β１−／−動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）が、精製α１β１調製物または粗α１β１調製物；α１抗原をコードするｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた細胞、β１抗原をコードするｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた細胞、またはその両方の抗原をコードするｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた細胞；α１β１などを構成的に発現する細胞など；を用いて免疫され得る。この抗原は、精製タンパク質としてか、細胞上で発現されたタンパク質としてか、タンパク質フラグメントもしくはそのペプチドとしてか、またはそのタンパク質、タンパク質フラグメントもしくはそのペプチドをコードする、裸のＤＮＡベクターもしくはウイルスベクターとして、送達され得る。その後、免疫動物の血清は、抗α１β１抗体の存在について試験される。Ｂ細胞が、ポジティブであると試験される動物から単離され、そしてハイブリドーマが、これらのＢ細胞内で生成される。
【００４１】
このハイブリドーマにより分泌される抗体は、それらの抗体がＶＬＡ−１に特異的に結合する能力（例えば、α１でトランスフェクトされた細胞へ結合し、非トランスフェクト親細胞へ結合しないこと）について、そして他の任意の望ましい特徴（例えば、所望のＣＤＲコンセンサス配列を有すること、コラーゲンとＶＬＡ−１との間の結合を阻害すること（または非ブロッカーの場合には阻害しないこと））について、スクリーニングされる。
【００４２】
スクリーニングアッセイにおいてポジティブであると試験されたハイブリドーマ細胞が、その細胞が培養培地中にモノクローナル抗体を分泌するのを可能にする条件下で、栄養培地中で培養される。その後、馴化されたハイブリドーマ培養上清が、収集され、そしてその上清中に含まれる抗体が、精製される。あるいは、免疫されていない動物（例えば、マウス）の腹腔中にハイブリドーマ細胞を注入することによって、所望の抗体が生成され得る。ハイブリドーマ細胞が、その腹腔中で増殖し、抗体を分泌し、その抗体が、腹水として蓄積する。その後、シリンジを用いてその腹腔から腹水を回収することによって、その抗体が採取され得る。
【００４３】
そのモノクローナル抗体はまた、抗体をコードするｃＤＮＡを所望のハイブリドーマから単離すること、そのｃＤＮＡを用いて哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）をトランスフェクトすること、そのトランスフェクトされた宿主細胞を培養すること、およびその培養培地からその抗体を回収することによって、生成され得る。
【００４４】
（ＩＩＩ．キメラ抗体）
本発明のモノクローナル抗体はまた、同族ハイブリドーマ（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）抗体を操作することによって、生成され得る。例えば、同族抗体が、重鎖ならびに／または軽鎖のヒンジ領域および／もしくは定常領域の一部またはすべてが、別の種（例えば、ヒト）由来の抗体の対応成分で置換されるような組換えＤＮＡ技術によって変化され得る。一般的に、操作された抗体の可変ドメインは、その同族抗体の可変ドメインと同一または実質的に同一のままである。そのような操作された抗体は、キメラ抗体と呼ばれ、そしてその抗体は、そのヒンジ領域および／または定常領域が由来する種（例えば、ヒト）の個体に投与された場合に、その同族抗体よりも抗原性が低い。キメラ抗体を生成する方法が、当該分野で周知である。ヒト定常領域は、ＩｇＧ１に由来するヒト定常領域およびＩｇＧ４に由来するヒト定常領域を包含する。
【００４５】
（ＩＶ．完全ヒト抗体）
本発明のモノクローナル抗体はまた、完全ヒト抗体を包含する。これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５により記載されるように、インビトロでプライムされたヒト脾細胞を使用してか、または例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されるように、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用して、調製され得る。
【００４６】
あるいは、完全ヒト抗体は、Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４３２−２４３６；ならびにＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：２２７〜２３６により記載される、レパートリークローニングにより調製され得る。さらに、米国特許第５，７９８，２３０号（１９９８年８月２５日）は、ヒトＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記載し、この調製において、ヒト抗体産生Ｂ細胞が、エプスタイン−バーウイルスまたはその誘導体での感染によって不死化され、このエプスタイン−バーウイルスまたはその誘導体は、不死化のために必要なタンパク質であるエプスタイン−バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現する。このＥＢＮＡ２機能は、その後止まり、抗体産生を増加を生じる。
【００４７】
完全ヒト抗体を産生するための他のいくつかの方法は、不活化された内因性Ｉｇ遺伝子座を有しかつ再配列されていないヒト抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子についてトランスジェニックである、非ヒト動物の使用を包含する。そのようなトランスジェニック動物が、α１β１で免疫され得、その後、ハイブリドーマが、その動物由来のＢ細胞から作製され得る。これらの方法は、例えば、ヒトＩｇミニ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスに関する種々のＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の刊行物／特許（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇの米国特許第５，７８９，６５０号）；ＸＥＮＯＭＩＣＥに関する種々のＡｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の刊行物／特許（例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉの米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，１５０，５８４号および同第６，１６２，９６３号；Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１；およびＭｅｎｄｅｚら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５（２）：１４６−５６）；ならびに「トランソニック（ｔｒａｎｓｏｍｉｃ）」マウスに関する種々のＫｉｒｉｎ（Ｊａｐａｎ）の刊行物／特許（例えば、ＥＰ ８４３ ９６１、およびＴｏｍｉｚｕｋａら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１３３〜１４４３）に記載される。
【００４８】
（Ｖ．ヒト化抗体）
本発明のモノクローナル抗体はまた、他の種由来の同族抗α１β１抗体のヒト化バージョンを包含する。ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術により生成された抗体であり、この抗体は、抗原結合のために必要ではないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖（例えば、可変ドメインの定常領域およびフレームワーク領域）のアミノ酸のいくつかまたはすべてが、同族の非ヒト抗体の軽鎖または重鎖に由来する対応アミノ酸に置換するために使用される。例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化バージョンは、その重鎖および軽鎖の両方上に、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；および（３）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要な場合、ヒトフレームワーク領域中の１つ以上の残基が、その抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を保存するように、マウス抗体中の対応する位置の残基へと変化され得る。この変化は、時には、「戻し変異」と呼ばれる。ヒト化抗体は、一般的に、ヒトにおいて免疫応答を惹起する可能性がキメラヒト抗体と比較して低い。なぜなら、前者は、後者よりもかなり少ない非ヒト成分しか含まないからである。
【００４９】
ヒト化抗体を生成するための方法は、例えば、ＷｉｎｔｅｒのＥＰ ２３９ ４００；Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｅｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９；米国特許第６，１８０，３７０号；ならびにＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３に記載される。一般的に、ヒト抗体上へのマウス（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は、以下のように達成される。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡが、ハイブリドーマから単離される。可変ドメイン（ＣＤＲを含む）のＤＮＡ配列が、配列決定法により決定される。このＣＤＲをコードするＤＮＡが、部位特異的変異誘発により、ヒト抗体重鎖可変ドメインコード配列もしくは軽鎖可変ドメインコード配列の対応する領域へと移される。次いで、所望のアイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメント（例えば、ＣＨについてのγ１およびＣＬについてのκ）が、付加される。このヒト化重鎖遺伝子およびヒト化軽鎖遺伝子が、可溶性ヒト化抗体を生成するために哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）中で同時発現される。抗体の大規模産生を容易にするために、そのようなヒト化抗体を、その抗体を発現する細胞を含むバイオリアクター中で産生すること、または乳汁中にその抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を作製すること（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと）が、しばしば望ましい。
【００５０】
時々、ヒトフレームワークにＣＤＲを直接移すことは、生じる抗体の抗原結合親和性の損失を生じる。これは、いくつかの同族抗体において、そのフレームワーク領域内の特定のアミノ酸がそのＣＤＲと相互作用し、従って、その抗体の全体的抗原結合親和性に影響するからである。このような場合、同族抗体の抗原結合活性を保持するために、アクセプター抗体のフレームワーク領域中に「戻し変異（上記）」を導入することが重要である。
【００５１】
戻し変異を作製する一般的アプローチは、当該分野で公知である。例えば、Ｑｕｅｅｎら（上記）、Ｃｏら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９〜２８７３、およびＷＯ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）は、２つの重要な工程を包含するアプローチを記載する。まず、ヒトＶフレームワーク領域が、同族マウス抗体のＶ領域フレームワークとの最適なタンパク質配列ホモロジーについてのコンピューター分析によって選択される。その後、マウスＶ領域の３次構造は、マウスＣＤＲと相互作用する可能性があるフレームワークアミノ酸残基を可視化するためにコンピューターによってモデル化され、その後、これらのマウスアミノ酸残基が、相同なヒトフレームワーク上に重ね合わされる。
【００５２】
この２工程アプローチの下で、ヒト化抗体を設計するためのいくつかの基準が存在する。第１の基準は、通常は非ヒトドナー免疫グロブリンと相同である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを、ヒトアクセプターとして使用すること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することである。第２の基準は、そのヒトアクセプター残基が独特である場合にそのアクセプターではなくドナーのアミノ酸を使用することであり、そのドナー残基は、そのフレームワークの特定の残基でヒト配列を代表する。第３の基準は、ＣＤＲとすぐに隣接する位置でアクセプターではなくドナーのフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【００５３】
例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−２７１に記載される、異なるアプローチもまた使用し得る。このアプローチの下で、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの重鎖および軽鎖由来のＶ領域フレームワークが、それぞれ、マウス残基を根本的に導入することなく、ＣＤＲグラフティングのために使用される。このアプローチを使用することの利点は、ＮＥＷＭ可変領域およびＲＥＩ可変領域の３次元構造がＸ線結晶学から知られ、従って、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用が、容易にモデル化され得ることである。
【００５４】
（ＶＩ．他の部分）
本発明のモノクローナル抗体は、他の部分をさらに含んで、所望の機能をもたらし得る。例えば、この抗体は、この抗体により標的化された細胞を殺傷するための毒素部分（例えば、破傷風毒素またはリシン）または放射性核種（例えば、１１１Ｉｎまたは９０Ｙ）を含み得る（例えば、米国特許第６，３０７，０２６号を参照のこと）。この抗体は、単離または検出を容易にするための部分（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射活性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ）を含み得る。これらの抗体はまた、それらの血清半減期を長期化させ得る部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）、および免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーもしくはそれらのフラグメント（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の一部（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域））を含み得る。
【００５５】
（ＶＩＩ．結晶化可能な組成物および結晶）
本発明はまた、以下の複合体を含む結晶化可能な組成物を提供する：（１）ラット−ヒトキメラα１−Ｉドメイン（例えば、変異ＲＡＨ）、またはその一部（例えば、ラット−ヒトキメラα１−Ｉドメインの１３５〜３３６アミノ酸を含むポリペプチド）；および（２）ｈＡＱＣ２のＦａｂフラグメント、またはその一部（例えば、軽鎖の３〜２１３アミノ酸を含むポリペプチドおよび／または重鎖の３〜２１９アミノ酸を含むポリペプチド）。例示的な複合体は、図２０に示される。そのＲＡＨ α１−Ｉドメインは、例えば、ラットα１サブユニットのアミノ酸残基１４５〜３３６（結晶番号付け）（配列番号５９、下記）を含み得る。ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントは、配列番号３の軽鎖アミノ酸残基１〜１０６（例えば、１〜２１３）および配列番号４の重鎖アミノ酸残基１〜１１８（例えば、１〜２１９）を含み得る。ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントは、完全抗体のパパイン消化により得られるか、または組換え法により作製され得る。Ｆａｂフラグメントは、ｈＡＱＣ２の軽鎖および／または重鎖の可変ドメインの少なくとも抗原結合部分を含み得る。
【００５６】
【化２】
Figure 2004536580
本発明のいくつかの結晶可能な組成物および結晶は、アミノ酸配列もしくは三次元構造がα１−Ｉドメインおよび／またはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントに相同な分子または分子複合体を含み得る。ホモログの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：変異（例えば、保存的置換、付加、欠失またはそれらの組み合わせ）を有するα１−Ｉドメインおよび／またはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント。「保存的置換」とは、サイズ、形状、疎水性、電荷、および／または化学的特性が対応する参照残基に物理的に類似する置換残基をいう。「対応する」アミノ酸を同定するための方法は、当該分野で公知であり、本発明において解明される結晶構造と比較した、配列、構造的整列、その機能的位置またはこれらの組み合わせに基づく。例えば、対応するアミノ酸は、周知のソフトウェアアプリケーション（例えば、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（（著作権）１９９８，２０００））を使用して、α１−Ｉドメイン／ｈＡＱＣ２複合体中のアミノ酸の骨格原子とα１−Ｉドメインおよび／またはｈＡＱＣ２ホモログ中のアミノ酸の骨格原子を重ね合わせることにより同定され得る。対応するアミノ酸はまた、配列整列プログラム（例えば、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）においてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎにより記載される局所的相同性アルゴリズムを使用する、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能な「ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラム）を使用して同定され得る。
【００５７】
本発明の結晶化可能な組成物は、結晶化を促進するか、そして／または結晶化条件と適合する１以上の成分をさらに含み得る。このような成分としては、緩衝液、塩、沈殿剤、および他の試薬が挙げられるが、これらに限定されない。１つの成分は、３０％ 重量／容量のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００）であり得る。
【００５８】
本発明はまた、α１−ＩドメインとｈＡＱＣ２の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または他のフラグメント（前出））の複合体を含む結晶化可能な組成物から結晶を作製する方法を提供する。種々の結晶化技術は、本願発明において使用され得、これらの方法としては、拡散蒸着、透析、マイクロバッチ（ｍｉｃｒｏｂａｔｃｈ）、バッチ、および液体−液体拡散が挙げられるが、これらに限定されない。拡散蒸着法としては、シッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）、ハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ）およびサンドイッチドロップ（ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｄｒｏｐ）技術が挙げられるが、これらに限定されない。拡散蒸着法は、結晶化の速度を制御するための技術（例えば、ドロップまたはレザバ溶液に対する油の添加）を使用し得る。結晶化法は、沈殿剤を含むレザバ溶液を、α１−ＩドメインとｈＡＱＣ２の抗原結合部分の複合体の水溶液と混合して、結晶化可能な組成物を生成する工程を包含し得る。次いで、この混合物または結晶化可能な組成物は、種々の上記の技術を使用して結晶化され得る。本発明の結晶化可能な組成物は、α１−ＩドメインとｈＡＱＣ２の抗原結合部分の複合体の水溶液であり得、この水溶液は、約１〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度（例えば、約５〜１５ｍｇ／ｍＬ（例えば、１１ｍｇ／ｍＬ）の濃度）にてこの複合体を含有する。
【００５９】
（ＶＩＩＩ．結晶構造および構造座標）
本発明は、２．８Å解像度にて、変異ＲＡＨとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの複合体を含む結晶の三次元構造をさらに提供する（以下の実施例２４）。他の関連する結晶の三次元構造もまた、本明細書中に記載の技術および当該分野で公知の技術を使用して決定され得る。この複合体の三次元構造は、図１９に示される１セットの構造座標により規定される。これらの構造座標は、α１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの結晶複合体の原子または散乱中心により、Ｘ線の単色ビームの回折から得られたパターンに関連した数式から導出されるデカルト原子座標（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ ａｔｏｍｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）である。回折データが最初に使用されて、結晶の反復ユニットの電子密度マップが計算される。次いで、電子密度マップは、その複合体の個々の原子の位置を確立するために使用される。
【００６０】
本発明は、図１９に示される全てのアミノ酸の構造座標の全てまたえは一部により規定される分子または分子複合体、ならびにその分子または分子複合体のホモログを提供する。ここで、そのホモログは、０．００Åと０．６５Åとの間（例えば、０．００Åと０．６０Å（例えば、０．００Åと０．５０Åとの間））の、これらアミノ酸の骨格原子に由来する二乗平均平方根偏差を有する。用語「二乗平均平方根偏差」または「ｒ．ｍ．ｓ．偏差」とは、平均からの偏差の平方の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向または物体（ｏｂｊｅｃｔ）の偏差または変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を表す方法である。本発明の目的については、「二乗平均平方根偏差」または「ｒ．ｍ．ｓ．位置偏差」は、本明細書中に記載の構造座標により規定されるポリペプチドの骨格の関連部分からの、タンパク質の骨格における偏差を規定する。
【００６１】
本発明の分子または分子複合体はまた、図１９に従って、軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）；またはその分子もしくは分子複合体のホモログを含む群より選択されるｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの少なくとも７つのアミノ酸の構造座標により規定される結合部位を含み得る。ここで、このホモログは、０．００Åと１．１０Åとの間（例えば、０．００Åと１．００Åとの間（例えば、０．００Åと０．５０Åとの間））の、１以上のこれらアミノ酸の骨格原子からの平方二乗偏差を有する結合部位を含む。本明細書中で使用される場合、用語「結合部位」とは、その形状および電荷の結果として、別の化学物質と有利に関連する分子または分子複合体の領域をいう。用語「部位」は、溝、くぼみ（ｃｌｅｆｔ）、チャネルまたはポケットを含むが、これらに限定されない。例えば、α１−Ｉドメイン上の結合部位は、コラーゲン結合部位（Ｅｍｓｌｅｙら，１９９７，前出）、抗体結合部位、およびアロステリック部位（またはＩＤＡＳ）結合部位（Ｈｕｔｈら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：５２３１−５２３６）を含み得る。用語「化学物質」は、任意の分子、分子複合体、化合物またはそれらのフラグメントを含むが、これらに限定されない。用語「〜と会合する」とは、化学物質またはその一部と、タンパク質上の結合ポケットまたは結合部位との間が接近した状態での会合または結合をいう。会合は、非共有結合（このその並置は、水素結合またはファンデルワールス相互作用もしくは静電相互作用によってエネルギー的に都合がよい）であってもよいし、共有結合であってもよい。
【００６２】
本発明の分子または分子複合体は、図１９に従う残基Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒｌ５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒｌ５８、Ｔｙｒｌ６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｕ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１、およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）、またはその分子もしくは分子複合体のホモログからなる群より選択されるα１−Ｉドメインアミノ酸の構造座標により規定される結合部位を含み得る。ここでそのホモログは、α１−Ｉドメインアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．９２Åとの間の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む。
【００６３】
本発明の分子または分子複合体はまた、図１９に従う残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶番号付け）；または分子または分子複合体のホモログからなる群より選択されるα１−Ｉドメインアミノ酸の構造座標により規定される結合部位を含み得る。ここで、このホモログは、α１−Ｉドメインアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．３０Åとの間の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む。
【００６４】
当業者は、ポリペプチドについての１セットの構造座標が、三次元にて形状を規定する１つの比較セットの点であることを理解する。従って、類似または同一の形状を規定する全体的に異なるセットの座標は、図１９における構造座標の数学的操作を使用して生成され得ることがあり得る。例えば、構造座標は、構造座標の結晶学的置換、構造座標の分割（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、構造座標のセットの整数加算または整数減算、構造座標の反転、またはこれらの任意の組み合わせにより操作され得る。さらに、個々の座標におけるわずかな変動が、形状全体に対するわずかな効果を有する。
【００６５】
あるいは、結晶を作製するポリペプチド成分（例えば、ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントまたはα１−Ｉドメイン）のいずれかにおける変異（例えば、アミノ酸の付加、置換、および／または欠失）または他の変更に起因する、結晶構造における改変はまた、構造座標における変動を説明し得る。このような変動が、元来の座標と比較して、許容可能な標準誤差内である場合、得られた三次元形状は、非改変結晶の三次元形状と同じであるとみなされる。
【００６６】
従って、実体が、同じとみなされるためには、本明細書中に記載された構造の全てまたは一部に十分に類似するか否かを決定することが必要である。このような分析は、流通しているソフトウェアアプリケーション（例えば、ＱＵＡＮＴＡ （Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（著作権）１９９８，２０００）およびＯ（Ｊｏｎｅｓら，１９９１，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ４７：１１０−１１９）、ならびに付随のユーザーガイドを使用して行われ得る。ＱＵＡＮＴＡのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーション、およびＯのＬＳＱアプリケーションにより、異なる構造間、同じ構造の異なるコンホメーション間、および同じ構造の異なる部分の間の比較が可能になる。両方のアプリケーションにおいて使用される一般的手順は、比較する構造を入力すること、これらの構造における等価な原子位置を規定すること、フィッティング操作を行うこと、および結果を分析することである。
【００６７】
各構造が、アプリケーションに入力されると、名称が与えられ、固定構造または移動性構造（ｍｏｖｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）として同定される。原子当量は、通常、比較される２つの構造間で保存された全ての残基についての等価原子（例えば、タンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）により規定される。移動性構造は、平行移動および回転されて、固定構造との最適フィットまたは最小二乗フィットが得られる。等価な原子の特定の対に対するフィットの平方二乗平均差は、両方のプログラムによりÅ単位で報告される。
【００６８】
本発明の目的に関して、図１９に列挙された構造座標に記載される関連する骨格原子に対して重ね合わせた場合、０．００Åと１．５０Åとの間（例えば、０．００Åと１．００Åとの間（例えば、０．００Åと０．５０Åとの間）の、保存された残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の二乗平均平方根偏差を有する任意の分子複合体は、同一であるとみなされる。
【００６９】
（ＩＸ．他の結晶構造の決定）
図１９に示される構造座標はまた、別の結晶化分子実体（例えば、そのＣＤＲの１つにおけるアミノ酸置換を含む別のｈＡＱＣ２）についての構造情報を得る際の助けとするために使用され得る。このことは、任意の周知の技術により達成され得る。これらの技術としては、分子置換（α１−Ｉドメイン／Ｆａｂの変異体およびホモログの構造を決定するために特に有用な方法）が挙げられる。
【００７０】
図１９に示される構造座標はまた、α１−ＩドメインまたはｈＡＱＣ２ Ｆａｂの少なくとも一部に類似した少なくともいくつかの構造的特徴を含む分子実体の三次元構造の少なくとも一部を決定するために使用され得る。従って、本発明の別の実施形態は、分子置換を利用して、未知の構造を有する結晶化分子または分子複合体についての構造情報を得る方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）結晶化分子または分子複合体からＸ線回折パターンを生成する工程；および（ｂ）図１９に示される構造座標の少なくとも一部を、このＸ線回折パターンに適用して、未知の構造を有する分子または分子複合体三次元電子密度マップを生成する工程。
【００７１】
分子置換を使用することにより、図１９に記載される構造座標の全てまたは一部は、結晶化分子実体の未知の構造を、初めからこのような情報を決定しようとすることよりも、より迅速かつ効率的に決定するために使用され得る。分子置換は、未知の構造についての位相（ｐｈａｓｅ）の正確な見積を提供する。位相は、直接決定することができない結晶構造を解明するために使用される数式における要素である。分子置換以外の方法により位相についての正確な値を得ることは、しばしば、推定および細分の反復サイクルを含み、結晶構造の解明を大きく遅らせる、時間がかかるプロセスであり得る。しかし、少なくとも相同な部分を含むタンパク質の結晶構造が解明された場合、既知の構造からの位相は、しばしば、未知の構造についての位相の満足のいく見積を提供し得る。
【００７２】
従って、分子置換は、構造が未知の分子または分子複合体の結晶の観察されたＸ線回折パターンを最もよく説明するために、未知の分子または分子複合体の結晶単位セル内の、図１９に従う複合体の関連部分を配向し、位置づけることにより、構造座標が未知の分子または分子複合体予備モデルを生成することを包含する。次いで、位相は、このモデルから計算され得、観察されたＸ線回折パターンの触れ幅と組み合わされて、座標が未知の構造の電子密度マップが生成され得る。続いて、これは、任意の周知のモデル構築技術および構造細分技術に供されて、未知の結晶化分子または分子複合体の最終的な正確な構造が提供され得る（Ｌａｔｔｍａｎ，１９８５，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１５：５５−７７；Ｒｏｓｓｍａｎｎ編，「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ」，Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．，Ｎｏ．１３，Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７２）。α１−Ｉドメインおよび／またはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント（図１９に従う）の任意の部分に実質的に相同な任意の結晶化分子または分子複合体の任意の部分の構造は、この方法により解明され得る。
【００７３】
（Ｘ．コンピューターおよび格納媒体）
本発明の構造座標（例えば、図１９に示される構造座標）を使用するために、通常は、座標を三次元提示または形状へと変換することが必要である。市販のグラフ作成ソフトウェアプログラム（Ｏ（Ｊｏｎｅｓら，１９９１，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ４７：１１０−１１９）およびＩＮＳＩＧＨＴＩＩ（（著作権）Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）は、１セットの構造座標から分子もしくは分子複合体、またはその一部の三次元提示を生成することが可能である。
【００７４】
本発明に従って、本発明の分子実体の構造座標は、機械（例えば、コンピューター）により読み取り可能な格納媒体に格納される。コンピューターおよび適切なソフトウェアを使用すると、このようなデータは、種々の目的（例えば、薬物発見および他のタンパク質結晶のＸ線結晶学的分析）のために使用され得る。
【００７５】
従って、機械読み取り可能なデータ格納媒体は、図１９に示される構造座標の少なくとも一部を含む機械読み取り可能なデータによりコードされたデータ格納材料を含み得る。コンピューターは、本発明の機械読み取り可能なデータを処理することにより、α１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの分子複合体の三次元提示を生成するための指示をさらに含み得る。本発明のコンピューターはまた、ディスプレイ、提示するためのグラフィックインターフェース、または構造座標の三次元グラフィック提示を移動および操作するための入力デバイスを含み得る。
【００７６】
本発明はまた、α１β１インテグリンとｈＡＱＣ２抗体のＦａｂフラグメントとの分子複合体から得られたＸ線回折データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するためにコンピューターを提供する。ここで、このコンピューターは、機械読み取り可能なデータによりコードされたデータ格納材料を含む機械読み取り可能なデータ格納媒体を含む。ここで、このデータは、図１９に従う、α１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントとの分子複合体の構造座標の少なくとも一部または結晶分子複合体から得られたＸ線回折データを含む。このコンピューターは、機械読み取り可能な座標データのフーリエ変換を行うための指示、この機械読み取り可能な回折データを構造座標に処理するための指示をさらに含み得る。このコンピューターは、さらに以下を含み得る：機械読み取り可能なデータを処理するための指示を格納する作業メモリ；作業メモリおよび機械読み取り可能なデータと組み合わされた中央処理装置；ならびに必要に応じて、分子または分子複合体の構造座標の三次元グラフィック提示を提示するための中央処理装置に組み合わされたグラフィックインターフェースまたはディスプレイ。
【００７７】
本発明はさらに、以下の三次元提示を生成するためのコンピューターを提供する：図１９に示されるα１−ＩドメインおよびｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントアミノ酸の全ての構造座標の少なくとも一部または全てにより規定される分子または分子複合体、あるいはその分子または分子複合体のホモログ。ここで、そのホモログは、そのアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間（例えば、０．００Åと１．００Åとの間（例えば、０．００Åと０．５０Åとの間））の二乗平均平方根偏差を有する。さらに、本発明において、コンピューターは、以下を含む：機械読み取り可能なデータによりコードされたデータ格納材料を含む機械読み取り可能なデータ格納媒体（ここで、このデータは、図１９に示されるα１−ＩドメインおよびＦａｂ ｈＡＱＣ２フラグメントのアミノ酸の全ての構造座標の少なくとも一部または全てを含む）。
【００７８】
本発明のコンピューターはまた、結合部位を含む分子または分子複合体の三次元提示を生成し得る。結合部位は、以下の少なくとも７つのアミノ酸の構造座標により規定され得る：図１９に従う、軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）を含む群より選択されるｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント；あるいはその分子または分子複合体のホモログ（ここでこのホモログは、ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの少なくとも１つのアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．１０Åとの間（例えば、０．００Åと１．００Åとの間（例えば、０．００Åと０．５０Åとの間））の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む）。さらに、本発明のコンピューターは、以下を含む：機械読み取り可能なデータによりコードされたデータ格納材料を含む機械読み取り可能なデータ格納媒体（ここで、このデータは、図１９に従う、軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１（結晶番号付け）からなる群より選択される、ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの少なくとも７つのアミノ酸の構造座標を含む）。
【００７９】
本発明はまた、以下の三次元提示を生成するためのコンピューターを提供する：図１９に従う、残基Ａｓｐｌ５４、Ｓｅｒｌ５６、Ａｓｎｌ５７、Ｓｅｒｌ５８、Ｔｙｒｌ６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１、およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）からなる群より選択される構造座標Ｉドメインアミノ酸により規定される結合部位を含む分子もしくは分子複合体；またはその分子もしくは分子複合体のホモログ（ここで、このホモログは、Ｉドメインアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．９２Åとの間の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む）。さらに本発明において、このコンピューターは、以下を含む：機械読み取り可能なデータによりコードされたデータ格納材料を含む機械読み取り可能なデータ格納媒体（ここで、このデータは、図１９に従う、残基Ａｓｐｌ５４、Ｓｅｒｌ５６、Ａｓｎｌ５７、Ｓｅｒｌ５８、Ｔｙｒｌ６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１、およびＬｅｕ２９４（結晶番号付け）からなる群より選択されるＩドメイン アミノ酸の構造座標を含む）。
【００８０】
本発明はまた、図１９に従う、残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶番号付け）からなる群より選択されるＩドメインアミノ酸の構造座標により規定される結合部位を含む分子もしくは分子複合体；または分子もしくは分子複合体のホモログ（ここで、このホモログは、Ｉドメインアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．３０Åとの間の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む）の三次元提示を生成するためのコンピューターを提供する。さらに、本発明において、このコンピューターは、以下を含む：機械読み取り可能なデータによりコードされたデータ格納材料を含む機械読み取り可能なデータ格納媒体（ここで、このデータは、図１９に従う、残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶番号付け）からなる群より選択される構造座標Ｉドメインアミノ酸を含む）。
【００８１】
図２１は、１つのこのような実施形態を示す。システム１０は、中央処理装置（「ＣＰＵ」）２０、例えば、ＲＡＭ （ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得る作業メモリ２２、大容量メモリ２４（例えば、１以上のディスクもしくはテープデバイスまたはＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ）、１以上のカソード陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１以上のキーボード２８、１以上の入力ライン３０、および１以上の出力ライン４０を含むコンピューター１１を備える。これらの全ては、従来の双方向システムバス５０により一体化される。
【００８２】
入力ライン３０によりコンピューター１１に組み合わされた入力ハードウェア３６は、種々の方法にて実行され得る。本発明の機械読み取り可能なデータは、電話線または専用データ線３４により接続されたモデム３２の使用を介して入力され得る。あるいはまたはさらに、この入力ハードウェア３６は、ＣＤ−ＲＯＭもしくはＤＶＤ−ＲＯＭデバイスまたはテープもしくはディスクドライブ２４を含み得る。ディスプレイ端末２６とともに、キーボード２８はまた、入力デバイスとして使用され得る。
【００８３】
出力ライン４０によりコンピューター１１に組み合わされた出力ハードウェア４６は、従来のデバイスにより同様に実行され得る。例示により、出力ハードウェア４６は、プログラム（例えば、本明細書中に記載のＱＵＡＮＴＡ）を使用して、本発明の結合部位のグラフィック提示を提示するためのＣＲＴディスプレイ端末２６を含み得る。出力ハードウェアはまた、ハードコピー出力が生成され得るようにプリンタ４２、または後の使用のためのシステム出力を格納するディスクドライブ２４を含み得る。
【００８４】
操作の際に、ＣＰＵ ２０は、種々の入力デバイス３６および出力デバイス４６の使用を協働して働かせ、大容量記憶装置２４からのデータアクセスおよび作業メモリ２２への、および作業メモリ２２からのアクセスを協働して働かせ、データ処理工程の順番を決定する。多くのプログラムが、本発明の機械読み取り可能なデータを処理するために使用され得る。このようなプログラムは、本明細書中に記載の薬物発見のコンピューターによる方法を参照して議論される。ハードウェアシステム１０の要素に対する特定の参考文献が、適切な場合に、データ格納媒体の以下の記載全体を通して含められる。
【００８５】
図２２は、図２１のシステム１０のようなシステムにより行われ得る機械読み取り可能なデータによりコードされ得る磁性式データ格納媒体１００の断面を示す。媒体１００は、適切な基材１０１を有する従来のフロッピー（登録商標）ディスケットまたはハードディスクであり得る。この基材は、従来のかつ適切なコーティング１０２（これは、極性または配向が、磁性により変化され得る磁性ドメイン（眼に見えない）を含む、従来の片側または両側にあり得る）であり得る。媒体１００はまた、ディスクドライブまたは他のデータ格納デバイス２４のスピンドルを受容するための開口部（示さず）有し得る。
【００８６】
媒体１００のコーティング１０２の磁性ドメインは、従来の機械読み取り可能なデータ（例えば、図２１のシステム１０のようなシステムによる実行のための本明細書中に記載されるデータ）であり得る様式にて、コードされるように、極性化または配向している。
【００８７】
図２３は、光学読取可能データ記憶媒体１１０の断面図を示し、この媒体は、このようなの機械読取可能データまたは１セットの命令で符号化され得、これらの機械読取可能データまたは１セットの命令は図２１のシステム１０のようなシステムによって実行され得る。媒体１１０は、従来のコンパクトディスクまたはＤＶＤディスクの読取り専用記憶装置（ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ）または、再書込み可能媒体（例えば、光学的に読取り可能でありかつ光磁気的に書込み可能である、光磁気ディスク）であり得る。媒体１００は、（従来型であり得る）適切な基材１１１および、通常は基材１１１の一方の側に（従来型であり得る）適切なコーティング１１２を有する。
【００８８】
ＣＤ−ＲＯＭの場合、周知であるように、コーティング１１２は、反射性であって、機械読取り可能データを符号化するために複数のピット１１３で刻印されている。このピットの配置は、コーティング１１２の表面にレーザー光を反射させることよって読取られる。保護コーティング１１４（これは、実質的に透明である）が、コーティング１１２の上面に提供される。
【００８９】
光磁気ディスクの場合、周知のように、コーティング１１２は、ピット１１３を有さないが、例えば、レーザーで特定の温度を超えるように加熱されたときに極性と指向性が磁気的に変化され得る複数の磁気領域を有する（図示せず）。この領域の指向性は、コーティング１１２から反射したレーザー光の分極を測定することにより読取られ得る。この領域の配置が上記のようなデータを符号化する。
【００９０】
（ＸＩ．合理的薬物設計）
本発明は、α１−Ｉドメインのインヒビターのような化学的実体を設計、選択、および合成または単離するため、そして、このドメインの既知のインヒビターを改善するための、構造に基づき、かつ合理的である薬物設計技術の使用を可能にする。これらのインヒビターは、ＶＬＡ−１のコラーゲン結合部位をブロック（遮蔽）することが可能であり得る。本発明はまた、コラーゲン結合のインヒビターとして作用し得る改変体を設計するための、構造に基づき、かつ合理的な薬物設計技術の使用を可能にする。
【００９１】
本発明の３次元表示は、潜在的なインヒビター、他の化学的実体、Ｆａｂフラグメントの改変体または化学的実体の組み合わせを、実験的または計算的に設計するために使用し得、ここで、この化学的実体は、本発明のｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントまたはキメラα１−Ｉドメインに結合し得、そしてそれらの生物学的機能に影響を与え得る。
【００９２】
当業者は、本発明の、ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントまたはキメラα１−Ｉドメインの複合体と、そして、より具体的には、ＩドメインまたはＦａｂフラグメントのいずれかの結合部位と結合する化学的実体の能力について、化学的実体をスクリーニングするためのいくつかの方法を使用し得る。このプロセスは、図１９の複合体の座標に基づいて、コンピュータスクリーン上で、例えば、ＩドメインまたはＦａｂフラグメントのいずれかの結合部位を視覚的に調べることによって開始され得る。次いで、選択された化学的実体は、ＩドメインまたはＦａｂフラグメントのいずれかの結合部位の中で、種々の方向に位置付けられるか、またはドッキングされる得る。ドッキングは、ＱＵＡＮＴＡのようなソフトウェアを使用して達成され得、その後、標準的な分子力学の力場（例えば、ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ（ｃ）１９９４）およびＡＭＢＥＲ（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，（ｃ）１９９４））を用いる、エネルギー極小化および分子動力学法が続く。
【００９３】
専門化したコンピュータプログラムがまた、化学的実体を選択するプロセスにおいて助けとなり得る。これらとしては、特に、以下が挙げられる：
【００９４】
【化３】
Figure 2004536580
。
【００９５】
一旦、適切な化学的実体が選択されると、それらを組み合わせて単一の化合物に作製され得る。アセンブリは、ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントおよびキメラα１−Ｉドメインの複合体の構造座標に関して、コンピュータスクリーン上に表示された３次元画像において互いに対する実体の関係を視覚的に調べることに先行し得る。この後に、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを使用して手動によるモデル構築が続く。
【００９６】
化学的実体についての上述した評価プロセスは、化合物にとって、またはα１−Ｉドメインに結合し得る改変体にとって、類似の様式で実行され得る。
【００９７】
別個の化学的実体を結合する際に、当業者を支援するために有用なプログラムとしては、以下が挙げられる：
【００９８】
【化４】
Figure 2004536580
。
【００９９】
段階的な様式でインヒビターまたは結合化合物を構築することを推し進める代わりに、上記のように、化合物に結合するときの化学的部分は、空の結合部位（例えば、α１−ＩドメインまたはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの結合部位）、または既知のα１−ＩドメインもしくはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメント結合化合物のいくつかの部分を必要に応じて含む結合部位のいずれかを使用する、全体または「デノボ」として示され得る。これらの方法としては、以下が挙げられる：
【０１００】
【化５】
Figure 2004536580
。
【０１０１】
他の分子モデリング技術はまた、本発明に適合するように使用され得る。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３〜８９４を参照ののこと。また、Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．およびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：２０２〜２１０を参照のこと。
【０１０２】
一旦、実体が上記の方法によって、設計されるか、または選択されると、その実体がα１−ＩドメインまたはｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントと結合し得る効率は、計算的評価法によって、試験されるか、または最適化され得る。例えば、α１−Ｉドメイン結合化合物として機能するために、設計されるか、または選択された化合物は、この化合物がキメラα１−Ｉドメインに結合するときに、結合部位によって占められている重なり合わない空間に交差する。有効なα１−Ｉドメイン結合化合物は、その結合状態と遊離状態との間のエネルギーにおける比較的小さい差異（すなわち、結合による小さな変形エネルギー）を実証する。従って、最も効率的なα１−Ｉドメイン結合化合物は、約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えない（例えば、７ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えない）結合による変形エネルギー設計されるべきである。α１−Ｉドメイン結合化合物は、全体の結合エネルギーが類似である１を超えるコンフォメーションでα１−Ｉドメインと相互作用し得る。これらの場合、結合による変形エネルギーは、遊離した化合物のエネルギーと化合物がこのタンパク質に結合したときに観察されるコンフォメーションの平均エネルギーとの間の差となる。
【０１０３】
α１−Ｉドメインに結合するとして設計されたか、または選択された化合物は、さらに、計算的に最適化され、その結果、その結合状態において、これは、標的タンパク質との反発性の静電相互作用を欠き得る。このような非補完的な（例えば、静電的）相互作用としては、反発性の電荷−電荷相互作用、反発性の双極子−双極子相互作用および反発性の電荷−双極子相互作用が挙げられる。具体的には、この化合物がα１−Ｉドメインに結合したときのこの化合物とタンパク質との間の全ての静電相互作用の総和は、中性なるか、または結合エンタルピーに対して好適な寄与をなし得る。
【０１０４】
化合物変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するための特定のコンピュータソフトウェアが、当該分野で利用可能である。このような用途のために設計されたプログラムの例としては、以下が挙げられる：
【０１０５】
【化６】
Figure 2004536580
。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーションを使用して実装され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが当業者に公知である。
【０１０６】
本発明によって実行可能となる１つの他の有用な薬物設計技術は、反復薬物設計である。反復薬物設計は、タンパク質／化合物複合体の連続的なセットの３次元構造を決定および評価することによって、タンパク質と化合物（その化合物は抗体を含む）との間の結合を最適化するための方法である。反復薬物設計において、タンパク質と結合する実体と複合体化したタンパク質の一連の結晶が得られ、次いで、各々の分子複合体の３次元構造が解かれている。このようなアプローチは、各複合体の、タンパク質と他の実体との間の結合に対しての洞察を与える。これは、阻害活性を有する化学的実体を選択し、これらの新規の結晶を取得し、これらの複合体の３次元構造を解き、そして新規の複合体と以前に解かれた複合体との間の結合を比較することによって達成される。複合体の結合は、複合体の構成要素の変化が結合にどのように影響を与えるかを観察することにより最適化される、
いくつかの場合、反復薬物設計が、連続的な複合体を形成し、次いで、新規の複合体の各々を結晶化することによって実行され得る。あるいは、事前に形成されたタンパク質結晶を別の化学的実体の存在下にて浸漬し、それによって、複合体を形成して、そして、各々の個々の複合体を結晶化する必要性を取り除く。
【０１０７】
（ＸＩＩ．薬学的組成物）
本発明の薬学的組成物は、本発明の１以上のＶＬＡ−１アンタゴニスト（例えば、上記の合理的薬物設計法によって同定された抗ＶＬＡ−１抗体および低分子ＶＬＡ−１アンタゴニスト）、またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体を含む。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、アジュバント、ビヒクル、緩衝液、および安定剤）さらに含み得る。
【０１０８】
本発明の薬学的組成物は、所望される場合、経口的、局所的、静脈内、皮下、腹腔内、筋内、髄内、動脈内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、脊髄内、頭蓋内、または炎症または腫瘍増殖の部位に単に局所的に投与される。本発明の薬学的組成物は、例えば、ネブライザー、乾燥散剤吸入器もしくは定量噴霧式吸入器の使用を介する吸入、または被験体に対する注入ポンプまたは生分解徐放性移植物を移植することによって、投与され得る。
【０１０９】
薬学的組成物は、滅菌注射可能調製物（例えば、滅菌注射可能水性懸濁物または滅菌油注射可能油性懸濁物）の形態であり得る。この懸濁物が、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方され得る。経口で与えられた場合、この薬学的組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または水溶液の形態で投与されえる。局所的適用として、これらの薬学的組成物は。適切な軟膏として投与され得る。
【０１１０】
所望の効果を与えるために効果的な本発明のＶＬＡ−１アンタゴニストの投薬量および投与速度は。種々の要因（例えば、処置されるべき疾患の性質、被験体のサイズ、処置の目的、使用される具体的な薬学的組成物、および処置する内科医の判断）に依存する。活性成分化合物の、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の投薬レベル、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の投薬レベルが、有用である。例えば、本発明の抗体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲で、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲で、かつ、１〜１４日ごとの間隔で投与される。別の実施形態において、投与される場合、この抗体は、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、腹腔内に投与される。なお別の実施形態において、この抗体は、静脈内に投与される場合、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。１つの実施形態において、抗体組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの抗体の血漿レベルで提供されるのに十分な量で投与される。
【０１１１】
（ＸＩＩＩ．疾患状態および動物モデル）
本発明のＶＬＡ−１アンタゴニストは、上記に列挙されるような、α１β１媒介疾患の予防を含む処置に有用である。本発明の処置は、これらの状態に罹患したヒト被験体および動物被験体の両方に対して有効である。本発明が適用可能である動物被験体は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）動物および家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）動物の両方にわたり、ペットとしてか、または市販目的のいずれかで飼育される。例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギである。
【０１１２】
本発明のＶＬＡ−１アンタゴニストの効力は、種々の動物モデルにおいて試験され得る。例えば、有用な乾癬および関節炎モデルとしては、ＷＯ００／７２８８１に記載されるものが挙げられる。腎線維症モデルとしては、ＷＯ９９／６１０４０に記載されるもの、Ｃｏｓｇｒｏｖｅら、２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５７：１６４９−１６５９に記載される、アルポート症候群腎臓モデル、およびＫａｌｌｅｄら、２００１，Ｌｕｐｕｓ １０：９−２２に記載されるループス腎炎のＳＮＦ１マウスモデルが挙げられる。再狭窄についての血管線維症モデルとしては、Ｓｍｉｔｈら、１９９９，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：１２１２−１２２２に記載されるラット頸動脈バルーン損傷モデルが挙げられる。特発性肺線維症および強皮症関連肺線維症についての肺線維症モデルとしては、Ｗａｎｇら、１９９９，Ｔｈｏｒａｘ ５４：８０５−８１２に記載されるブレオマイシン誘導肺線維症モデルが挙げられる。Ｃ型肝炎誘導肝硬変またはアルコール誘導肝硬変についての肝硬変モデルとしては、Ｇｅｏｒｇｅら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１２７１９−１２７２４に記載される胆管結紮モデル、およびＳｈｉら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０６６３−１０６６８に記載されるＣＣＬ−４誘導肝線維症モデルが挙げられる。
【０１１３】
本発明の処置の効力は、理学的検査、血液試験、蛋白尿測定、クレアチニンレベルおよびクレアチニンクリアランス、肺機能試験、胸部Ｘ線、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄、肺生検、血漿血液尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、瘢痕または線維症の病変の観察およびスコアリング、コラーゲン、平滑筋アクチンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリクスの沈着、腎機能試験、超音波、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、およびＣＴスキャンを含む、多数の利用可能な診断ツールにより、測定さえ得る。
【０１１４】
（ＸＩＶ．診断方法）
本発明の抗体は、変化したα１β１発現レベルと関連する疾患状態を診断するために用いられ得る。被験体由来の組織サンプル（例えば、組織生検、体液サンプルまたは洗浄（例えば、肺胞洗浄））は、抗体を用いる、抗原捕捉アッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的アッセイなどにおいて試験され得る。正常な個体由来の組織サンプルは、コントロールとして用いられる。
【０１１５】
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を用いる。このような技術は文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編）、１９８９；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編），１９８４；Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編），１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編），１９８７；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編），１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編），１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，１９８６を参照のこと。
【０１１６】
他で定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を、以下に記載するが、本明細書中に記載されるものに類似するかまたは等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書中で言及した全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書に従う。材料、方法、および例は、例示するのみであり、限定されることを意図しない。本明細書および特許請求の範囲の全体を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または語尾変化、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、規定された整数または整数の群の包含を意図するが、それ以外の整数または整数の群の除外ではないことが理解される。
【０１１７】
以下の実施例は、本明細書中を例示するために提供され、そしてその限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１８】
（化学薬品）
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ハズ油を、ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）から購入した。アルゼバー液中のヒツジ全血を、Ｅａｓｔ Ａｃｒｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓｏｕｔｈｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。ラット尾のＩ型コラーゲンおよびマウスのＩＶ型コラーゲンを、それぞれ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）およびＧｉｂｃｏ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。
【０１１９】
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入し、そしてＢａｌｂ／ｃバックグラウンドに対するα１β１インテグリン−欠損マウスは、以前に（３）に記載される通りであった。
【０１２０】
（実施例１）
モノクローナル抗体。マウス抗原に対する機能ブロックｍＡｂを、アジドを含まずかつ低内毒素形式で調製した：Ｈａ３１／８（ハムスター抗ＣＤ４９ａ；インテグリンα１）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２：３６７−３７５）、Ｈａ１／２９（ハムスター抗ＣＤ４９ｂ；インテグリンα２）（β１）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２：３６７−３７５；Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．およびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：６９０−７０２）、ハムスター群ＩＩコントロールｍＡｂ Ｈａ４／８（ハムスター抗ＫＬＨ）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．およびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：６９０−７０２）、ならびにＰＳ／２（ラット抗ＣＤ４９ｄ；インテグリンα４β１鎖）（Ｍｉｙａｋｅら、１９９１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５９９−６０７）。さらに、マウス抗原に対する以下の機能的ブロックｍＡｂを、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からアジドを含まない／低内毒素調製物として購入した：ＨＭβ１−１（ハムスター抗ＣＤ−２９；インテグリンβ１鎖）（Ｎｏｔｏら、１９９５ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：８３５−８４２）、Ｈａ２／５（ハムスター抗ＣＤ２９；インテグリンβ１鎖）（Ｍｅｎｄｒｉｃｋ，Ｄ．Ｌ．およびＤ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ １９９３ Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：６９０−７０２）、３Ｅ２（ハムスター抗ＣＤ５４、ＩＣＡＭ−１）（Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓら、１９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：６５５−６６３）、５Ｈ１０−２７（ラット抗ＣＤ４９ｅ；インテグリンα５）（Ｋｉｎａｓｈｉ，Ｔ．，およびＴ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．１９９４．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ．２０：２５−４４）、ＧｏＨ３（ラット抗ＣＤ４９ｆ；インテグリンα６）（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０３７６−１０３８３）、ならびにラットイソタイプコントロールｍＡｂ Ｒ３５−９５（ラットＩｇＧ２ａ）およびＲ３５−３８（ラットＩｇＧ２ｂ）。
【０１２１】
接着アッセイ。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２で７〜１２日間培養した。Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンに対する細胞の接着は、以前に（Ｇｏｔｗａｌｓら、１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２４６９−２４７７）に記載される通りであった。簡単には、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、１０μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンまたは５μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンのいずれかでコートし、そして非特異的部位を１％ＢＳＡでブロックした。ＩＬ−２で活性化した脾細胞を、２μＭのＢＣＥＣＦ［２’，７’−ビス（カルボキシエチル）−５（６）カルボキシフルオレセインペンタアセトキシメチルエステル］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識し、そして１０μｇ／ｍｌの示したｍＡｂと共に１５分間インキュベートした。次いで、ＲＰＭＩ中の０．２５％ＢＳＡ中の１０５細胞を、コートしたウェルに添加し、そして３７℃にて６０分間インキュベートした。未結合細胞を、ＲＰＭＩ中の０．２５％ＢＳＡで３回洗浄することにより除去した。接着をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ２３５０蛍光プレートリーダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて定量した。投入した細胞に対する結合細胞の割合を、測定し、そしてコントロールｍＡｂ処理細胞（１００％に基準化される）に対する接着の百分率を計算した。ＢＳＡ単独でコーティングしたウェル上の細胞接着に起因するバックグラウンドの値を減算した。
【０１２２】
活性化白血球に対するα１β１およびα２β１の発現および機能的妨害物。白血球が炎症において重要な役割を果たすので、本発明者らは、抗α１ｍＡｂおよび抗α２ｍＡｂが、コラーゲンに対する白血球結合をブロックし得るか否かを試験して決定した。高レベルのα１およびα２を発現する白血球を得るために、マウスＴ細胞を、７〜１２日間、ＩＬ−２と共にインビトロで刺激した。これらの細胞は、高レベルのα１およびα２の両方を発現し（図１Ａ）、そしてＩＶ型コラーゲンをコーティングした表面およびコラーゲンＩ型をコーティングした表面の両方に十分に結合した（図１Ｂ）。ＩＶ型コラーゲンに対する接着は、抗α１ｍＡｂのみによって部分的に阻害され、そして抗α２ ｍＡｂのみによって阻害されない。対照的に、Ｉ型コラーゲンに対する接着は、抗α２ ｍＡｂにより、完全に阻害され、そして抗α１ ｍＡｂのみでは、部分的な阻害のみを示した。抗β１ ｍＡｂならびに抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの組み合わせの両方は、Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンに対する接着を完全に阻害した。α１β１インテグリンおよびα２β１インテグリンは、活性化Ｔ細胞上で発現され、そして抗α１ ｍＡｂおよびα２ ｍＡｂは、コラーゲンに対する白血球の接着を機能的にブロックし得ることを実証したので、本発明者らは、これらのｍＡｂを用いて、炎症障害の動物モデルにおけるこれらのインテグリンのインビボでの役割を調査した。
【０１２３】
（実施例２）
抗インテグリンｍＡｂによるＤＴＨ応答の阻害。ＳＲＢＣ誘導遅発型過敏症（ＤＴＨ）応答に、以前に公開されたプロトコル（Ｈｕｒｔｒｅｌら、１９９２，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２５２−２６３）を適用した。簡単には、マウスに、０日目に、１００μｌ ＰＢＳ中の２×１０７ＳＲＢＣを背中にｓ．ｃ．免疫した。このマウスを、５日目に、２５μｌ ＰＢＳ中の１×１０８ＳＲＢＣを、右後の足蹠へとｓ．ｃ．注射することにより、チャレンジした。足蹠の厚さを、抗原チャレンジの２０時間後に、技術者用カリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ／ＭＴＩ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）を用いて測定し、そして足蹠の腫脹の程度を計算した。結果を、足蹠の厚さ±ＳＥＭの平均の増加％として報告し、そして増加％＝［１−（抗原チャレンジの２０時間後の右足蹠の厚さ／抗原チャレンジの２０時間後の非注射左足蹠の厚さ）］×１００として計算した。ＳＲＢＣ誘導ＤＴＨ応答のエフェクターフェーズをブロックするために、治療用ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂ（１００μｇ）（これらは、実施例１に記載される方法に従って調製された）を、５日目の抗原チャレンジの１時間前にｉ．ｐ．に投与した。
【０１２４】
ＳＲＢＣ−誘導ＤＴＨは、炎症（特に乾癬）の十分に特徴付けられたモデルであり、炎症における種々のサイトカインおよび接着分子の重要性を実証するために用いられている（Ｔｅｄｄｅｒら、１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２２５９−２２６４，Ｔｅｒａｓｈｉｔａら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４６３８−４６４３）。ＳＲＢＣ−感作マウスは、足蹠抗原チャレンジの１時間前に抗インテグリンｍＡｂを受け、そして炎症を、２０時間後に、増加した足蹠の厚さを測定して評価した。ＰＢＳおよびコントロールハムスターＩｇ処置マウスは、抗原チャレンジの２０時間後に足蹠の厚さにおいて６０〜７０％の増加を示した（図２）。コントロールハムスターＩｇ処置と比較して、抗α１ｍＡｂまたは抗α２ｍＡｂは、足蹠の厚さにおいて、それぞれ、６８％および６０％の阻害を生じた。抗α１ｍＡｂおよび抗α２ｍＡｂの組み合わせは、７１％の阻害を生じ、これは、抗α１ｍＡｂのみまたは抗α２ｍＡｂのみをわずかに超える相加作用を実証する。他の抗インテグリンｍＡｂでの処置もまた、ＤＴＨエフェクター応答の阻害に効果的であった。種々のｍＡｂ処置で見られる阻害の程度は、４９％（抗α４）、２３％（抗α５）、および５７％（抗α６）であった。最後に、一般的なβ１インテグリンサブユニット（ｍＡｂ ＨＭＢＩ−１）のｍＡｂ妨害物は、エフェクターＤＴＨ応答を６７％まで阻害した。
【０１２５】
（実施例３）
抗インテグリンｍＡｂによるＣＨＳエフェクター応答の阻害。ＦＩＴＣに対する接触型過敏症（ＣＨＳ）を、以前に記載されるようにアッセイした（Ｇａｓｐａｒｉら、１９９１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、およびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．第４：２：１節）。簡単には、マウスを、０日目に剃毛した背中に１：１アセトン／ジブチルフタレート中０．５％ＦＩＴＣ（１００μｌ）を塗布することにより感作した。１０日後に、動物を、各耳の両方の側面に０．５％ＦＩＴＣ（５μｌ）を塗布することによりチャレンジした。耳の腫脹応答を、抗原チャレンジ（１０日目）および２４時間後の時点で、技術者用のカリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ／ＭＴＩ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）を用いて測定した耳の厚さにより決定し、そしてその結果を、ベースラインの耳の厚さ±ＳＥＭの増加％の平均として報告した。耳の厚さの増加を、増加％＝［１−（抗原チャレンジの２４時間後の耳の厚さ／抗原チャレンジ時の耳の厚さ）］×１００として計算した。ＣＨＳ応答のエフェクターフェーズをブロックするために、治療用ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂ（２５０μｇ）を、１０日目の抗原チャレンジの４時間前にｉ．ｐ．投与した。ビヒクルのみで抗原感作および耳チャレンジしたマウス（ビヒクルコントロール）、または事前の感作なしで耳チャレンジしたマウス（刺激コントロール）は、ネガティブコントロール（耳の厚さにおいて２％の増加を決して超えない）として働く。
【０１２６】
ＣＨＳが機械的にＤＴＨと離れており、そして、異なるエフェクター細胞に関連する場合、本発明者らは、何がＣＨＳ応答のエフェクター期を有する抗インテグリンｍＡｂに影響するかを解析した。マウスを、ＦＩＴＣ（マウスの剃毛した背部に塗布した）を使用してハプテン感受性にし、１０日後、耳へのＦＩＴＣチャレンジを用いて、翌日炎症性応答を生じた。ＦＩＴＣ感受性マウスは、抗原チャレンジの２４時間後、６０〜７０％の厚さの増加を示した（図３）。公表された結果（Ｓｃｈｅｙｎｉｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：６５５〜６６３）と一致して、抗ＩＣＡＭ−１ ｍＡｂ処置は、耳腫脹の５１％の阻害を生じた。コントロールハムスターｍＡｂと比較して、抗原チャレンジの４時間前の抗α１ ｍＡｂまたは抗α２ ｍＡｂを用いたマウスの処置は、各々、耳腫脹において３７％および５７％の阻害を生じた（図３）。抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの組合せは、わずかに高い耳腫脹の阻害（６５％）を生じた。β１インテグリンに対する他のｍＡｂを用いた処置は、抗α４ ｍＡｂおよび抗α５ ｍＡｂが、コントロールラットｍＡｂと比較した場合に、ＦＩＴＣ誘導ＣＨＳエフェクター応答の阻害を生じなかった一方、抗α６ ｍＡｂを用いた処置は、８６％のエフェクター阻害を生じた。最後に、共通のβ１インテグリンサブユニットのｍＡｂ遮断は、７４％までＣＨＳエフェクター応答を阻害した。類似のＣＨＳ結果が、マウスの異なる株（Ｃ５７／ＢＬ６、１２９／Ｓｖ）および異なる感受性薬剤（オキサゾロン）から得られた（データは示さず）。ＳＲＢＣ誘導ＤＴＨモデルで見られる結果と類似して、炎症した耳の組織学的分析は、水腫形成および白血球湿潤の両方が、抗α１ ｍＡｂ処置および抗α２ ｍＡｂ処置によって阻害されたことを示した。
【０１２７】
α１β１およびα２β１が、ＩＬ−２活性化脾細胞で発現され得るという事実と一致して、抗原感受性マウス由来のリンパ節の分析（ＦＩＴＣまたはオキサゾロン）は、ＣＤ４
４ｈｉＬＦＡ−１ｈｉ活性化ＣＤ４＋およびＣＤ４４ｈｉＬＦＡ−１ｈｉ活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞で、α１β１およびα２β１が排他的に発現されるということを示した（データは示さず）。抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの処置は、これらの細胞の欠失を生じなかった。なぜならば、ＣＨＳモデル中の抗原感作に応答して見られる、脾臓およびリンパ節の両方における活性化Ｔ細胞の数が、影響を受けなかったからである。さらに、抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂを用いた抗原感作化マウスの長期処置（１０日〜１６日）が、２０日で抗原を用いてチャレンジされたマウスの炎症性応答に影響しなかった（データは示さず）ので、エフェクター細胞は機能的に欠失されなかった。
【０１２８】
（実施例４、ＣＨＳエフェクター応答は、α１β１欠損マウスで減少した）
ＦＩＴＣ媒介ＣＨＳのエフェクター応答におけるα１β１の阻害的役割が、ｍＡｂ媒介である可能性を除外するために、野生型およびα１β１−インテグリン欠損マウスで、実験を実行した（図４）。野生型マウスにおけるエフェクター期のｍＡｂ阻害は、以前の結果と一致し、抗α１では５６％、抗α２では５６％、ならびに、抗α１および抗α２の組合せでは６２％の耳厚の阻害が見られた。ＣＨＳのエフェクター期は、未処置の野生型マウスと比較すると、未処置α１β１欠損マウスにおいて有意に減少した（それぞれ、耳厚の３０％ 対 ７１％の増加）。予想されたとおり、未処置α１β１欠損マウスにおける耳腫脹のレベルは、抗α１ ｍＡｂ処置野生型マウスで見られた耳腫脹のレベルと同じであった。最後に、α１β１欠損マウスにおけるα２β１のｍＡｂ遮断は、耳腫脹の僅かに増加した阻害のみを生じ、抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの組合せで処置した野生型マウスにおいて見られる結果と一致した。
【０１２９】
（実施例５）
炎症のＤＴＨモデルおよびＣＨＳモデルの両方で見られる抗インテグリンｍＡｂの阻害効果が、抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂによって媒介される一般的な抗炎症性効果によって引き起こされる可能性をさらに除外するために、刺激性皮膚炎に対するこれらのｍＡｂの効果を研究した。
【０１３０】
刺激性皮膚炎を評価するために、マウスを、各耳の両側に、アセトン中の０．８％のハズ油、５μｌを塗布した。治療的抗体またはコントロール抗体を、刺激塗布の４時間前に与えた。耳腫脹を、上記の２４時間語に測定し、そして、ハズ油塗布の前の耳厚と比較した。結果を、上記のとおりに、ベースライン耳厚±ＳＥＭにおける平均パーセント増加として報告した。アセトンのみを塗布したマウス（ビヒクルコントロール）は、ネガティブコントロールとした。
【０１３１】
２４時間後、ハズ油で処置したマウスの耳は、ビヒクルのみ（アセトン）を受けたマウスと比較して、有意な耳厚の増加（４８％）を示した。抗α１または抗α２で予備処置したマウスにおいて、ハズ油により引き起こした毒性耳腫脹は、ＰＢＳ処置動物またはコントロールｍＡｂ処置動物のいずれかと比較した場合、有意に影響されなかった（図５）。ハズ油処置耳の組織学的試験は、コントロールｍＡｂ処置マウスまたはＰＢＳ処置マウスと比較した場合、抗α１ ｍＡｂまたは抗α２ ｍＡｂで処置したマウス中の炎症細胞の数もしくは型、または水腫形成において、差異は示さなかった（データは示さず）。
【０１３２】
（実施例６、α１β１およびα２β１による関節炎の阻害）
α１β１が、関節炎患者の滑膜における炎症細胞で非常に発現したので、本発明者らは、抗α１ ｍＡｂまたは抗α２ ｍＡｂが、以前に記載された関節炎の促進したモデル（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２１０３−２１０８；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：１３７−１４７）において阻害性であるか否かを試験することを決定した。
【０１３３】
Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ Ａｎｔｉｂｏｄｙキットを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入し、そして、良く確立されたプロトコルを使用して関節炎を誘導した（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２１０３−２１０８；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：１３７−１４７）。簡単に言えば、関節炎を、０日目に４回の抗コラーゲンＩＩ型ｍＡｂのカクテル（各々１ｍｇ）を腹腔内注射し、続いて、３日目に、５０μｇのＬＰＳを腹腔内注射することを介して、誘導した。続く３〜４日の経過の間、マウスは、腫大した手根、足首および指を発症した。治療的ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂ（２５０μｇ）を、０日目で抗コラーゲン ｍＡｂの注射の４時間前に、そして、再び、３日目のＬＰＳ投与の４時間前に、次いで、実験の期間中３日目ごとに続けて、腹腔内投与した。３日目の始め、マウスを関節炎の発症について評価した。各肢における関節炎の重篤度を、４つのポイントシステムを使用してスコアリングした。０＝正常；１＝軽いの赤み、足首または手根の僅かな腫脹；２＝足首または手根の中程度の腫脹；３＝いくつかの指、足首および足を含む重篤な腫脹；４＝最大の炎症。
【０１３４】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける重篤な関節炎は、ＬＰＳ注射後７２時間以内に発症し、そして、３週間より長い間持続した。抗コラーゲンｍＡｂ単独の注射でも、ＬＰＳ単独の注射でも、関節炎を誘導しなかった。コントロールｍＡｂ処置をうけたマウスは、ＰＢＳ処置マウスで見られるのと等しい重篤度の関節炎を示した（図６）。対照的に、抗α１ ｍＡｂ単独の処置は、関節炎において顕著な減少（７８％）を生じ、実験の期間中続いた。抗α２ ｍＡｂ単独での処置はまた、有利な効果を有し、コントロールｍＡｂ処置したマウスと比較して、関節炎スコアを３２％減少した。抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの組合せは、抗α１ ｍＡｂ単独で見られたのと類似の程度の阻害を生じた。
【０１３５】
（実施例７、炎症性細胞湿潤に対する抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂ処置の効果の組織学的分析）
ＳＲＢＣ誘導ＤＴＨ応答のさらなる組織学的分析は、抗α１ ｍＡｂ処置および抗α２ ｍＡｂ処置の誘発された炎症性応答を調節する能力を確認した。ＳＲＢＣ感受性マウスからのチャレンジされていない足蹠は、同じマウスのＳＲＢＣチャレンジ化細胞と比較した場合、実質的に炎症性細胞湿潤を示さなかった。抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂを単独でかまたは組合せて化のいずれかで用いたＳＲＢＣ感作したマウスは、コントロールｍＡｂ処置マウスと比較した場合、ＳＲＢＣチャレンジ化足蹠で見られるこれらの湿潤細胞の数を、減少した。湿潤細胞の類似の実験は、大多数の細胞が好中球からなり、いくつかの単球およびリンパ球が存在し、そして、抗α１ ｍＡｂ処置および抗α２ ｍＡｂ処置が、これらの細胞の数を大いに減少させたことを示した。
【０１３６】
（実施例８、炎症性細胞湿潤におけるα１発現細胞の免疫組織化学的証明）
免疫組織化学を、湿潤細胞の性質およびこの湿潤細胞がコラーゲン結合インテグリンを発現するか否かをより正確に決定するために、実施した。未処置マウスの炎症化足蹠由来の湿潤細胞を、α１β１インテグリンおよび細胞系統マーカーの発現について試験した。α１β１インテグリンは、多くの湿潤白血球上で発現されていることが見出された。二重免疫組織化学を利用して、湿潤細胞の性質およびα１β１発現の分布を同定した。細胞系統マーカーを利用して、湿潤物が、少数のＴ白血球（ＣＤ３＋）と共に、大半が顆粒球／単球（Ｍａｃ−１＋）からなることを見出し、これらの細胞の多くは、好中球（Ｇｒ１＋）であった。α１β１インテグリンの発現を、細胞の３つのサブセット全てで見出し、α１は、Ｍａｃ−１＋顆粒球／単球のサブセット、Ｇｒ１＋好中球のサブセットおよび、湿潤ＣＤ３＋ Ｔ白血球の大部分上で発現した。詳細な免疫組織化学分析は、抗α１ ｍＡｂ処置および抗α２ ｍＡｂ処置が湿潤細胞の数を減少させるが、湿潤物の細胞組成において、いかなる変化も見られなかったことを示した（データは示さず）。ＦＩＴＣ抗ハムスターｍＡｂを用いた免疫組織化学染色は、抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの炎症化足蹠を局在化する能力を確証した（データは示さず）。
【０１３７】
（実施例９、α１β１およびα２β１に対する、およびα１欠損マウスにおけるｍＡｂによる関節炎の阻害）
α１β１が、関節炎患者の滑膜中の湿潤細胞で非常に発現したので、本発明者らは、抗α１ ｍＡｂまたは抗α２ ｍＡｂが、以前記載した関節炎の促進されたモデル（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−２１０８；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：１３７−１４７）において阻害性であるか否かを試験することを決定した。このモデルは、抗コラーゲンＩＩ型ｍＡｂのカクテルのマウスへの注射、その後のＬＰＳ投与に関連し、３〜７日の間に関節炎の発症を生じる。マウスに、０日から開始し、３日ごとにｍＡｂを与え、そして、３日ごとに関節炎の発症についてスコアリングした。ＬＰＳ投与の７２時間後に、全てのマウスにおいて重篤な関節炎が発症し、そして、３週間よりも長く続いた。抗コラーゲン単独またはＬＰＳ単独の注射のいずれも、関節炎を誘導しなかった。コントロールｍＡｂ処置を受けたマウスは、ＰＢＳ処置マウスで見られるのと等しい重篤度の関節炎を示した（図７）。対照的に、抗α１ ｍＡｂ単独での処置により、関節炎における顕著な減少（７９％以上）を生じ、実験の期間中続いた。抗α２ ｍＡｂ単独での処置はまた、有利な効果を有し、コントロールｍＡｂ処置マウスと比較して、関節炎スコアの３７％の減少を生じた。抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの組み合わせは、抗α１ ｍＡｂ単独で見られるのと同様の程度の阻害を生じた。抗α１ ｍＡｂ処置を用いた関節炎スコアの減少が全てのマウスで見られ、そして、以下のような関節炎についての様々な他のｍＡｂベースの処置と都合良く比較する：可溶性ＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質（Ｍｏｒｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３１７８−３１８２）、抗Ｍａｃ−１（Ｔａｙｌｏｒら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８８：３１５−３２１）、抗α４（Ｓｅｉｆｆｇｅ、１９９６、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２３：２０８６−２０９１）、および抗ＩＣＡＭ−１（Ｋａｋｉｍｏｔｏら、１９９２、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３２６−３３７）。関節炎におけるα１β１について重要な役割を示すｍＡｂベースのデータと一致して、非処置のα１欠損マウスは、野生型マウスと比較した場合、関節炎スコアの有意な減少を示した。
【０１３８】
（実施例１０、関節炎性関節の免疫病理学に対する抗α１ ｍＡｂ処置の効果）
コントロールｍＡｂ処置または抗α１ ｍＡｂ処置のいずれかを受けた野生型関節炎マウス（８日齢）由来の関節を、正常な未処置マウス由来の関節と可視的に、そして組織学的に比較した。可視的に、コントロールｍＡｂ処置マウス由来の関節は、指を含む足全体の赤みおよび腫脹を証明した一方、抗α１ ｍＡｂ処置マウスは、関節または指のいずれかにおいて任意の炎症のサインがあったとしても、ほとんど示さなかった。組織学的試験は、プロテオグリカン損失によって証明されたとおり、ｍＡｂ処置関節炎性関節において、炎症性細胞を有する滑膜下（ｓｕｂｓｙｎｏｖｉａｌ）組織の広範な浸潤、細胞の関節表面への接着、および顕著な軟骨破壊を伴う重篤度の変化を示し（Ｔｅｒａｔｏら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−２１０８；Ｔｅｒａｔｏら、１９９５、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：１３７−１４７）、このモデルにおける湿潤細胞の大半が、好中球である。マウスの抗α１ ｍＡｂ処置は、炎症性湿潤の量および軟骨破壊の程度を劇的に減少した。
【０１３９】
（実施例１１、関節炎の発症は、リンパ球の非存在下で遅延し、そして、抗α１ ｍＡｂによる関節炎の阻害が、リンパ球非存在下で生じる）
どの細胞がコラーゲンｍＡｂ誘導関節炎モデルにおいて重要であるかを決定するために、本発明者らは、野生型Ｂ６−１２９マウスとＲＡＧ−１欠損Ｂ６−１２９マウスの関節炎を発症する能力を比較した（図８）。ＲＡＧ−１（組換え活性化遺伝子−１）遺伝子の遺伝的欠損は、成熟Ｔ白血球および成熟Ｂ白血球の完全な損失を生じる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６８：８６９−８７７）。野生型マウスおよびＲＡＧ−１欠損マウスの両方は、ＲＡＧ−１欠損マウスにおける誘導速度論が有意に遅くなったが、関節炎を発症した（図８）。これらの結果は、リンパ球がこの関節炎モデルにおいて関係する一方で、これらリンパ球は、疾患の発症および進行には必要ではない示唆する。関節炎の他のモデルにおけるＲＡＧ−１欠損マウスの効果を試験した公表された報告はまた、Ｔ白血球およびＢ白血球の損失が、関節炎の開始を遅延することを見出した（Ｐｌｏｗｓら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１０１８−１０２３）。抗α１ ｍＡｂを用いた野生型マウスまたはＲＡＧ−１欠損マウスのいずれかの処置は、関節炎を完全に阻害した（図８）。これらの結果は、このモデルにおける抗α１ ｍＡｂの有効性が、リンパ球の存在に依存しておらず、そして、以前の実験で示唆されるように（図７）、疾患を予防する際の抗α１ ｍＡｂの効力は、他のα１発現細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）に対するこの抗α１ｍＡｂの作用を介し得るということを証明した。
【０１４０】
（実施例１２、関節炎の抗α１ ｍＡｂ阻害の用量応答）
関節炎の防止に対する抗α１ ｍＡｂ処置の顕著な効果を考えると、本発明者らは、これらの研究を、用量応答分析にまで及ばせた（図９）。異なる用量のｍＡｂを、０日での開始から３日ごとに腹腔内投与した。先のデータと一致して、２５０μｇの抗α１ ｍＡｂの用量は、関節炎のほぼ完全な防止を生じた。１００μｇよりも低い用量の抗α１ ｍＡｂは、このモデルにおける関節炎の予防では部分的に有効である一方、より低い用量は、関節炎スコアに対して、いかなる識別可能な効果も有さなかった（図９）。
【０１４１】
（実施例１３、抗α１ ｍＡｂを用いた治療的処置は、関節炎スコアを減少し得る）
関節炎の防止における抗α１ ｍＡｂの有効性を考えると、本発明者らは、疾患を発症する過程にあるマウスの処置を試みた。マウスにおいて、０日目で抗コラーゲンＩＩ型ｍＡｂのカクテルを注入し、その後、３日目にＬＰＳ投与することによって、関節炎を誘導した。次いで、マウスを、開始から４日間、抗α１ ｍＡｂか、または、可溶性ＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質のいずれかを用いて処置した。関節炎の進行は、４日目のコントロールハムスターｍＡｂを受けるマウスと比較して、開始から４日目で抗α１ ｍＡｂを受けるマウスにおいて完全にブロックされた（図１０）。抗α１ ｍＡｂの治療的投与で見られた阻害の程度は完全であり、そして、抗α１ ｍＡｂの予防的処置（０日目で始められた）で見られたものと等しかった（図１０）。比較して、４日目以降のＴＮＦレセプターＩｇ融合タンパク質での処置は、コントロールＩｇ融合タンパク質と比較した場合、関節炎スコアにおいて６０〜７０％の阻害しか生じなかった（図１０）。抗α１ ｍＡｂおよびＴＮＦレセプターＩｇ融合の一緒になった合わせた処置は、完全な関節炎スコアの阻害に有効であり、これは、関節炎の抑制の際の、抗α１ ｍＡｂ処置の驚くべき所定のの完全な有効性ではない。要約すると、これらの結果は、抗α１ ｍＡｂを用いた治療的処置が、関節炎スコアの阻害に有効であり、そして、ＴＮＦアンタゴニストを用いた治療的処置と都合良く比較することを示す。
【０１４２】
（実施例１４、α１−Ｉドメインのクローニングおよび突然変異誘発）
ヒトα１β１インテグリンＩドメイン配列およびラットα１β１インテグリンＩドメイン配列を、以下のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＣＲ ＣＯＲＥ Ｋｉｔ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｍｂＨ Ｇｅｒｍａｎｙ）によって全長ｃＤＮＡから増幅した（Ｋｅｒｎら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２２８１１−２２８１６；Ｉｇｎａｔｉｕｓら、１９９０、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１、７０９−７２０）：以下のいずれかのヒト特異的プライマー、
【０１４３】
【化７】
Figure 2004536580
またはラット特異的プライマー
【０１４４】
【化８】
Figure 2004536580
。
【０１４５】
得られたＰＣＲ増幅産物を精製し、ｐＧＥＸ４ｔ−ｉ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結し、コンピテントＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを、約４５ｋＤａのグルタチオンＳトランスフェラーゼＩドメイン融合タンパク質の発現についてスクリーニングした。さらなる特徴づけのために選択したクローンのプラスミドＤＮＡのインサートからの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１４６】
ラット／ヒトキメラα１−Ｉドメイン（ＲΔＨ）を生成し（ＭＯＲＰＨ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット；５プライム−３プライム）、ラットのＧ９２残基、Ｒ９３残基、Ｑ９４残基およびＬ９７残基を、対応するヒトのＶ残基、Ｑ残基、Ｒ残基およびＲ残基に各々変換した。ＲΔＨ Ｉドメインを有するクローンを、診断的なＳｔｕ １制限酵素部位の欠失により同定して、インサートを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列を、図１２に示す。
【０１４７】
（実施例１５、α１−Ｉドメインに対して特異的なｍＡｂの生成）
モノクローナル抗体は、インテグリンサブユニットの構造と機能の間の関係を研究する際に非常に有用なプローブであることが証明されている。例えば、ｍＡｂを広範に使用して、活性化高次構造に関連するβ１サブユニットの領域を研究した（Ｑｕ，ＡおよびＬｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４，９３１−９４２）。従って、α１−Ｉドメインの高次構造変化についての可能なプローブを同定するために、本発明者らは、ヒトα１−ＩドメインについてのｍＡｂのパネルを生成した。
【０１４８】
（抗α１ Ｉドメインモノクローナル抗体の生成）雌性Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｉａｎマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、完全Ｆｒｕｅｎｄアジュバンド（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で乳化された、２５μｇの精製したヒトα１β１を用いて腹腔的に免疫化した（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１２６３５−１２６４０；Ｇｏｔｗａｌｓら、１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８２８０−８）。最高の抗α１−Ｉドメイン力価を有するマウスを、融合の３日前に１００μｇのα１β１で腹腔内に、そして、融合の１日前に５０μｇのα１β１で静脈内にブーストした。脾臓細胞を、１：６の比率でＦＬ６５３骨髄腫細胞と融合し、そして、９６ウェルの組織培養プレートに、レスあたり１００，０００および３３，０００をプレーティングした。
【０１４９】
上清を、単色ＦＡＣＳにより、α１β１インテグリンへの結合について評価した、ＦＡＣＳ分析の前に、上清を、非トランスフェクトＫ５６２細胞と共にインキュベートして、βサブユニットにだけ結合するＩｇＧを除外した。引き続いて、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＮａＮ３を含むＰＢＳ中の１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ））中に懸濁したα１インテグリンサブユニットでトランスフェクトした３〜５×１０４のＫ５６２細胞（Ｋ５６２−α１）を、４℃にて４５分間上清とインキュベートして、洗浄して、フィコエリトリンに結合体化された抗マウスＩｇＧとインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液での２回の洗浄後、細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。
【０１５０】
得られたハイブリドーマからの上清を、α１−Ｉドメインへの結合についてスクリーニングした。簡単に言えば、ＰＳＢ中の５０μｌの３０μｇ／ｍｌヒトα１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合を、４℃で一晩、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルをコーティングした。このプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡでブロックして、そして、ハイブリドーマ上清を、室温にて１時間、Ｉドメインとインキュベートした。０．０３％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで全面的に洗浄した後、アルカリホスファターゼ連結抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をさらに１時間添加した。最後の洗浄後、０．１Ｍグリシン中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、１ｍＭのＺｎＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を室温にて３０分間添加し、そして、このプレートを、Ｏ．Ｄ．４０５で読み取った。
【０１５１】
選択された上清を、コラーゲンＩＶへのＫ５６２−α１依存接着を阻害する能力について試験した。Ｋ５６２−α１細胞を、０．２５％のＢＳＡを含むＤＭＥＭ中の２ｍＭの２’，７’（ビス−２−カルボキシエチル−５および６）カルボキシフルオレセインペンタ汗と岸メチルエステル（ＢＣＥＣＦ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、３７℃にて３０分間標識した。標識した細胞を、結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）；０．９％のＮａＣｌ；および２％のグルコース）で洗浄し、そして、結合緩衝液＋５ｍＭのＭｇＣｌ２中に、１×１０６細胞／ｍｌの最終濃度にて再懸濁した。５０μｌの上清を、９６ウェルプレートのウェル中で、等容量の２×１０５のＫ５６２−α１細胞でインキュベートした。次いで、このプレートを遠心分離して、そして、上清を除去した。細胞を結合緩衝液中に債権諾して、そして、コラーゲンコート化プレートのウェルに移して、３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、非接着細胞を結合緩衝液を用いて３回洗浄することで除去した。結合細胞を、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で分析した。
【０１５２】
本発明者らは最初に、１９のハイブリドーマを同定し、それぞれの上清は、α１β１インテグリンを発現するヒト白血球Ｋ５６２（Ｋ５６２−α１）およびα１−Ｉドメインに結合した。免疫グロブリンを、これらのハイブリドーマのそれぞれから精製して、そして、Ｋ５６２−α１またはα１−ＩドメインのいずれかのコラーゲンＩＶへの結合をブロックする能力について試験した。ｍＡｂは、以下の２つのクラスに分類される：α１β１機能をブロックするｍＡｂおよびα１β１機能をブロックしないｍＡｂ。例えば、クローンＡＥＦ３、ＢＧＣ５、ＡＱＣ２およびＡＪＨ１０によって生成されるｍＡｂは、α１−Ｉドメインに結合し（図１３Ａ、ＢＧＣ５についてのデータは示さず）、ｍＡｂ ＡＪＨ１０およびｍＡｂ ＡＱＣ２のみが、α１−Ｉドメイン依存か（図１３Ｂ；図１６Ｂ）、またはＫ５６２−α１（図１３Ｃ；図１６Ｃ）のコラーゲンＩＶへの接着を阻害する。
【０１５３】
（相補性決定領域の配列決定）
このパネルのｍＡｂのクローン起源を確立するために、本発明者らは、ＰＣＲにより増幅し、１９個の抗体のうち１２個のＣＤＲを配列決定した（データは示さず）。
【０１５４】
１０７のハイブリドーマから単離された２μｇのｍＲＮＡ（ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、それぞれ２５ｐＭの以下のプライマーを使用して、逆転写させた（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；重鎖ＶＨ１ＦＯＲ−２（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａら、１９９３、Ｃｅｌｌ ７２；８５２−８６７）；軽鎖、ＶＫ４ＦＯＲ（これは、４つの別々のオリゴを規定する）（Ｋｅｒｎら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２８１１−２２８１６）。各ハイブリドーマについて、重鎖および軽鎖を、以下のオリゴの様々な組合せを使用して、４つの別々のＰＣＲ反応で増幅した：１）重鎖：ＶＨ１ＦＲ１Ｋ（Ｋａｍａｔａら、１９９５、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２５３１−１２５３５）、ＶＨ１ＢＡＣＫ、ＶＨ１ＢＡＣＫ（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６、９２３−９３５）、ＶＨｆｒ１ａ、ＶＨｆｒ１ｂ、ＶＨｆｒ１ｅ、ＶＨｆｒ１ｆ、ＶＨｆｒ１ｇ（Ｉｇｎａｔｉｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１、７０９−７２０）、またはＶＨ１ＦＯＲ−２（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａ，Ｍ．、Ｖｉｄｅｍ，Ｖ．、およびＡｒｎａｏｕｔ，Ｍ．Ａ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２、８５７−８６７）；２）軽鎖：ＶＫ１ＢＡＣＫ（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６、９２３−９３５）、ＶＫ４ＦＯＲ、ＶＫ２ＢＡＣＫオリゴ（Ｋｅｒｎら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２２８１１−２２８１６）またはＶｋｆｒ１ａ、ＶＨｆｒ１ｃ、ＶＨｆｒ１ｅ、ＶＨｆｒ１ｆ（Ｉｇｎａｔｉｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１、７０９−７２０）。産物を増幅し（９５℃で５分間、９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間を５０サイクル、および７２℃で１０分間の最終サイクル）、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ）、そして、ＡＢＩ３７７シーケンサーで、列挙された様々なオリゴを使用して直接配列決定した。
【０１５５】
機能ブロッキングｍＡｂを生成するクローンからの配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の全てにわたってほぼ同一であり、そして、この干渉フレームワーク（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域は、これらのハイブリドーマ学ローン的に関連していることを示唆する。
【０１５６】
（実施例１６、イムノブロッティングおよびＦＡＣＳ分析）
非ブロッキング抗体の可変領域の配列は、ブロッキング抗体で見出されたクローン的に関連するファミリーの配列とは顕著に異なった。ブロッキング抗体が単一のクローンに由来しそうなので、本発明者らは、さらなる特徴付けのために、２つ（ＡＪＨ１０およびＡＱＣ２）を選択した。
【０１５７】
（イムノブロッティング）
ヒツジ大動脈から解剖した平滑筋細胞層およびＫ５６２−α１細胞を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中の１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて抽出した。サンプルを、４〜２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして、ニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングした。ブロットを、ＴＢＳ中の５％のドライミルクを用いてブロックし；０．０３％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ中で洗浄し、そして、０．０５％ＮａＮ３を含むブロッキング緩衝液中で２時間、抗体とインキュベートした。次いで、ブロットを以前のように洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗マウスＩｇＧで１時間インキュベートし、再び洗浄し、次いで、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処置した。次いで、ブロットを３０〜６０秒間フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露し、そして現像した。
【０１５８】
イムノブロッティングおよびＦＡＣＳ分析（図１４）は、ＡＪＨ１０が、ヒト、ウサギ、およびヒツジと反応するが、ラットα１β１インテグリンと反応しないことを示し、このことは、ブロック性ｍＡｂが、進化的に保存された線状エピトープに結合することを示唆する。非ブロック性ｍＡｂは、イムノブロッティングにおいて効率的ではなく、ヒト以外の種とも反応しなかった。
【０１５９】
（実施例１７）
α１−Ｉドメインのコラーゲンへの結合は２価カチオン依存性である。
【０１６０】
Ａ．α１−Ｉドメインの精製
α１−Ｉドメインは、配列の接続部にトロンビン切断部位を含むＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現された。ＰＢＳ中で溶解された細胞からの清澄化上清液を、ＰＢＳで十分に洗浄されたグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に付与した。α１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭグルタチオン（還元型）で溶出した。変性研究には、このＩドメインを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中トロンビンで切断し、そしてＧＳＴ融合パートナーから精製した。ＤＴＴを２ｍＭまで添加し、そしてサンプルを、グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム上に付与した。通過フラクションおよび洗浄フラクションをプールし、そしてＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に付与した。α１−Ｉドメインは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、７５ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。精製されたＩドメインは、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる単一バンドとして、そしてＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のサイズ排除クロマトグラフィーによる適切なサイズの単一ピークとして溶出するタンパク質として移動する、その予想された質量を提示した（Ｌｅｅら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３、１３３３−１３４０、８７１Ｄａ）。
【０１６１】
Ｂ．機能的分析
９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）またはコラーゲンＴｙｐｅ Ｉ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用い、４℃で一晩コートし、Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１ｍＭ ＭｎＣｌ２；２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、そして２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。１ｍＭ ＭｎＣｌ２および３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中のα１−Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質の系列希釈を、室温で１時間、コートされたプレート上でインキュベートし、そしてＴｒｉｔｏｎ緩衝液中で洗浄した。結合したα１−Ｉドメインを、１ｍＭ ＭｎＣｌ２および３％ＢＳＡ、および１−Ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ（２，２’−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］；Ｐｉｅｒｃｅ）を含むＴＢＳ中で１：３０００に希釈される、１０μｇ／ｍｌビオチン化抗ＧＳＴポリクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）の系列添加により検出した。
【０１６２】
（結果）
ヒトおよびラット（ヒトに対して９５％同一）α１−Ｉドメインを、ＧＳＴ−融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、そしてグルタチオンセファロース上で精製した。両方のタンパク質を、先に記載のＥＬＩＳＡを基礎にしたアッセイの変法（Ｑｕ，Ａ．、およびＬｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、１０２７７−１０２８１）を用い、コラーゲンＩおよびＩＶへの結合について調べた。ヒトα１−Ｉドメインは、コラーゲンＩよりも良好な効率でコラーゲンＩＶに結合する（図１５Ａ）。α２−Ｉドメインに特異的な抗体ではなく、α１−Ｉドメインに特異的である抗体が（図１５Ｂ）、両方のリガンドへの結合をなくした（コラーゲンＩに対するデータは示さず）。Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋の両方は、結合を刺激し、そしてＥＤＴＡは、結合をバックグラウンドレベルまで低減させた（図１５Ｃ）。ヒトα１−Ｉドメインとラットα１−Ｉドメイン間では、リガンド結合における測定可能な差異は検出されず、種間の配列の差異は、機能的に関係がないことを示唆した（データは示さず）。従って、α１−Ｉドメインは、特異的に、効率的なリガンド結合のためにカチオンを必要とする。
【０１６３】
（実施例１８）
ＭＩＤＡＳモチーフ近傍のカチオン依存性エピトープ残基。
【０１６４】
本発明者らは、α１β１機能−ブロック性ｍＡｂに対するエピトープをマップするために、ＡＪＨ１０が、ラットα１−Ｉドメイン配列ではなく、ヒトα１−Ｉドメイン配列を認識するという観察を利用した。ヒトおよびラット配列は、１２アミノ酸のみが異なり、そのうち４つは、ＭＩＤＡＳモチーフ内の重要なスレオニン（図１１Ａ、ａａ９８）に隣接する６アミノ酸（ａａ９２−９７、図１１Ａ）のストレッチ中にある。６アミノ酸残基Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号６４の残基９１〜９７）がこのブロックｍＡｂに対するエピトープを含むという仮説を試験するために、本発明者らは、ラット残基Ｇ９２、Ｒ９３、Ｑ９４およびＬ９７で、対応するヒト残基Ｖ、Ｑ、Ｒ、およびＲをそれぞれ交換するキメラＩドメイン（ＲΔＨ）を構築した。ＡＪＨ１０は、すべての機能ブロック性ｍＡｂとともに、キメラＩドメインを認識する（ＲΔＨ；図１１Ｂ）。
【０１６５】
これらの残基を、α１−Ｉドメインの三次構造中のＭＩＤＡＳドメインに対して配置するために、本発明者らは、α２Ｉドメインの結晶構造の座標を用いてα１−Ｉドメインをモデリングした。
【０１６６】
ヒトα１−Ｉドメインの相同性モデルを、ヒトα２Ｉ−ドメインのＸ線結晶構造（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４−５４６）を用いて構築した。このモデルは、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３．５；Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の相同性モデリングモジュールを用いて構築した。プログラムＣＨＡＲＭＭ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２、６２４−６２８）を、原子分離距離の２倍の距離依存性誘電定数を用い、すべての水素パラメーターセット２２とともに用いた。本発明者らは、最初、α１−Ｉドメインのすべての原子に対し、１ｋｃａｌ／（モルÅ２）の質量重み付け調和位置制約で、最も急勾配の下降最小化の１０００ステップを行った。この最小化の後に、α１−ＩドメインのＣ−α原子に対し、最も急勾配の下降の別の１０００ステップおよび０．１ｋｃａｌ／（モルÅ２）制約でのＡｄｏｐｔｅｄ−Ｂａｓｉｓ Ｎｅｗｔｏｎ Ｒａｐｈｓｏｎの５０００ステップを行い、α２−ＩドメインＸ線結晶構造からの有意な偏差を避けた。
【０１６７】
α１β１およびα２β１インテグリン配列は、挿入も欠失も無く５１％の同一性を示し、このことは、２つのＩドメインの全体構造が、類似していることを示唆する。金属配位部位は、α１−Ｉドメインにおいてα２−Ｉドメインと同じであると推測され、そしてブロックｍＡｂについてのエピトープを含む残基は、らせんα３とらせんα４との間のループ上にあり、このループは、カチオン結合に重要なＭＩＤＡＳモチーフ内にスレオニンを含有する。このα１−Ｉドメインモデルにより、Ｑ９２のアミド窒素（図１１Ａ）がＩ３３のカルボニル基（Ｓ３２と隣接した残基）と水素結合することが推測される。従って、このエピトープを含むループは、ＭＩＤＡＳ領域を安定化する際に機能的役割を果たし得る。
【０１６８】
（実施例１９）
モノクローナル抗体ＡＱＣ２（すなわち、ｍＡＱＣ２；マウスについては「ｍ」）（実施例１５、前出）は、ＩｇＧ１κ抗体である。この抗体の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を同定するために、ＡＱＣ２マウスハイブリドーマ細胞由来の全細胞ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＥＡＳＹ ｍｉｄｉキットを使用することにより得た。次いで、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、製造者の推奨プロトコールに従って、Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓのためのＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、全細胞ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。ランダムヘキサマーを、プライミングのために使用した。
【０１６９】
ｍＡＱＣ２の重鎖可変ドメインを、プライマー：５’ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＧＴ ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＣＣ Ｃ ３’（配列番号１１）および５’ＡＧＧ ＴＳＭ ＡＲＣ ＴＧＣ ＡＧＳ ＡＧＴ ＣＷＧ Ｇ ３’（Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、およびＷ＝Ａ／Ｔ）（配列番号１２）を用いる第１鎖ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲを、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＡｄｖａｎｔａｇｅ Ｔａｑポリメラーゼを使用する３０サイクルに供した：９４℃で３０秒変性、５０℃で１分アニール、そして６８℃で１．５分伸長。そのシグナル配列を有するｍＡＱＣ２軽鎖を、プライマー：５’ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＴＴ ＷＣＡ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＷＴ ＣＡＧ ＣＴＴ Ｃ ３’（Ｗ＝Ａ／Ｔ）（配列番号１３）および５’ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ３’（配列番号１４）を使用するＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのｃｌｏｎｅｄ Ｐｆｕポリメラーゼを使用して３０サイクルに供した：９４℃で１分変性、５０℃で１分アニール、そして７２℃で２分伸長。重鎖および軽鎖についてのＰＣＲ産物を、製造者の推奨プロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キットを使用してゲル精製した。
【０１７０】
精製した重鎖産物を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットを使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクターにサブクローン化した。精製した軽鎖を、製造者の推奨プロトコルに従ってそのＺｅｒｏ ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯクローニングキットを使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯベクターにサブクローン化した。複数の独立したサブクローンからのインサートを、配列決定した。ＰＣＲプライマー内の縮重位置を除いて、独立したクローンのインサート配列は同一であった。
【０１７１】
ｍＡＱＣ２のポリペプチド配列を、そのコード配列から推定した。シグナル配列を用いて増幅されたＰＣＲ産物由来のｃＤＮＡ配列により推定される成熟軽鎖についてのＮ末端アミノ酸配列は、Ｅｄｍａｎ分解由来の精製されたｍＡＱＣ２軽鎖のＮ末端配列と正確に一致した（ＤＶＫＶＶＥＳＧＧ；配列番号１５）。この可変ドメイン配列のＢＬＡＳＴ分析は、それらの免疫グロブリン同一性を確認した。
【０１７２】
ｍＡＱＣ２の軽鎖可変ドメインのポリペプチド配列を以下に示す：
【０１７３】
【化９】
Figure 2004536580
ＣＤＲを、太字で示す。このＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ、１９９１にしたがって規定される。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、配列番号１は、以下のように表され、ここでダッシュは、アミノ酸が存在しないことを示す：
【０１７４】
【化１０】
Figure 2004536580
ｍＡＱＣ２の重鎖可変ドメインのポリペプチド配列は、以下である：
【０１７５】
【化１１】
Figure 2004536580
ＣＤＲを、太字で示す。Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用して、配列番号２は、以下のように表され、ここでタンパク質の番号は、他に示されなければ連続した数字である：
【０１７６】
【化１２】
Figure 2004536580
本明細書中で使用される場合、可変ドメインの残基位置番号は、他に示されなければＫａｂａｔ番号付けシステムに従って指定される。
【０１７７】
（実施例２０）
この実施例は、マウス−ヒトキメラ抗体ｃｈＡＱＣ２の生成を記載する。
【０１７８】
ｍＡＱＣ２の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ｃｈＡＱＣ２発現ベクターを構築するために使用した。ここでｍＡＱＣ２可変領域は、ヒトＩｇＧ１領域およびκ定常領域に連結された。
【０１７９】
重鎖キメラを、以下のように構築した。マウス重鎖シグナルコード配列およびマウススプライスドナー部位を、ｍＡＱＣ２重鎖可変領域のｃＤＮＡに付加させるように、ｍＡＱＣ２重鎖プラスミドｐＡＮＤ０８３由来の０．３３ ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを、５ａ８重鎖プラスミドｐＬＣＢ７由来のホスファターゼ処理した（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｄ）２．８２ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩベクターフラグメント中にサブクローン化した。５ａ８は、分子クローン化されたＣＤ４特異的ｍＡｂである（例えば、Ｂｏｏｎら、２００２，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １７２：１９１−２０３を参照のこと）。得られたプラスミド（ｐＡＮＤ０９２）によりコードされる成熟重鎖において、Ｎ末端は、同種のｍＡＱＣ２重鎖のＮ末端（ＤＶＫＶＶＥ；配列番号１６）と５残基だけ異なっていた。
【０１８０】
この重鎖Ｎ末端を修正するために、ｐＡＮＤ０９２を、製造者の推奨プロトコルに従って固有部位削除（ＵＳＥ）変異誘発キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用するＵＳＥ変異誘発に供した。Ｑ１Ｄ置換，Ｑ３Ｋ置換、Ｌ４Ｖ置換、Ｑ５Ｖ置換、Ｑ６Ｅ置換は、変異誘発プライマー５’ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ３’（配列番号１７）によりコードされていた。変異したプラスミドクローンを、それらの新しいＡａｔＩＩ部位およびＨｉｎｆｌ部位ならびに削除されたＰｓｔＩ部位により同定した。次いで、重鎖コード配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。正確に変異したプラスミドを、ｐＡＮＤ０９４と称した。ｐＡＮＤ０９４由来の０．４３ｋｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびプラスミドｐＥＡＧ９６４由来の１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメント（ヒトＩｇＧ１定常領域のコード配列を含む）を、ｐＣＨ２６９（ｐＣＥＰ４ ＥＢＶ発現ベクター （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のプラスミド）のＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。得られたプラスミドを、ｐＡＮＤ０９９と名付けた。
【０１８１】
軽鎖キメラを、以下のように作製した。ｍＡＱＣ２軽鎖可変性ドメインプラスミドｐＡＮＤ０８１由来の０．４６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＵＣ由来ｐＮＮ０９クローニングベクターのリン酸化された２．７ｋｂのベクターフラグメントにサブクローニングして、５’ＮｏｔＩ部位を付加した。この得られたプラスミドであるｐＡＮＤ０９１を、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＳＥキット（前出）を使用して変異誘発に供し、コード配列の３’末端にＢｇ１ＩＩを導入した。この変異誘発性プライマーは、配列５’ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＣＧＧ ＧＣＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＣ３’（配列番号１８）を有した。この正確に変異されたプラスミドを、そのＢｇ１ＩＩ部位の変化およびＢｓｔＹＩ部位の変化により同定した。得られたプラスミドｐＡＮＤ０９３の軽鎖コード配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。次いで、ｐＡＮＤ０９３由来の０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−Ｂｇ１ＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメントおよびプラスミドｐＥＡＧ９６３由来の０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメント（ヒトκ軽鎖定常ドメインのコード配列を含む）を、ｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位（前出）にサブクローニングして、プラスミドｐＡＮＤ１０２を生成した。ブロックされていないκ軽鎖（Ｑ１Ｅ）を作製するために、ｐＡＮＤ０９３を、変異プライマー５’ＣＡＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＧＡ ＡＡＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＣＣＡ Ｇ３’（配列番号１９）を用いてＵＳＥ突然変異に供し、ＸｍｎＩ部位を導入した。この変異したプラスミドを、ＸｍｎＩ部位の変化についてスクリーニングすることによって同定した。得られたプラスミドｐＡＮＤ０９７中の軽鎖配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐＡＮＤ０９７由来の０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−Ｂｇ１ＩＩ軽鎖可変性ドメインフラグメントおよびプラスミドｐＥＡＧ９６３由来の０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメント（ヒトκ軽鎖定常ドメインを含む）を、ｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローニングして、プラスミドｐＡＮＤ０９８を生成した。
【０１８２】
ｃｈＡＱＣ２抗体を作製するために、発現ベクター（ｃｈＡＱＣ２重鎖ベクターｐＡＮＤ０９９＋ｃｈＡＱＣ２軽鎖ベクターｐＡＮＤ１０２、およびｃｈＡＱＣ２重鎖ベクターｐＡＮＤ０９９＋ｃｈＡＱＣ２非ブロック軽鎖ベクターｐＡＮＤ０９８）を、２９３ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトした。このトランスフェクト体を、抗体分泌および特異性について試験した。コントロールは、挿入物を有さない対応するベクター、またはｃｈ５ｃ８（分子クローニングされたＣＤ１５４特異的ｍＡｂ（例えば、Ｅｌｓｔｅｒら、２００１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７２：１４７３−１４７８に記載））もしくはｃｈＣＢＥ１１（分子クローニングされたＬＴβＲ特異的ｍＡｂ（例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４９３４−２４９３８に記載））をコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた細胞であった。
【０１８３】
次いで、所望の抗体分泌を有するトランスフェクト体を溶解し、そしてプロテインＡ免疫沈降を、この溶解物および馴化培地について行った。抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体を用いて実施した沈降のウエスタンブロット分析は、ｃｈＡＱＣ２でトランスフェクトされた細胞が、ｃｈ５ｃ８でトランスフェクトされた細胞およびｃｈＣＢＥ１１でトランスフェクトされた細胞と類似のレベルで、重鎖および軽鎖を合成し、そして効率的に分泌することを示した。さらにｈｕＶＬＡ−１を発現するＫ５６２α１細胞を、このトランスフェクトされた細胞由来の馴化培地で染色し、そしてＦＡＣＳ分析を、この染色した細胞について行った。その結果は、ｃｈＡＱＣ２抗体が、ｍＡＱＣ２と類似の染色パターンを生じ、一方、モックトランスフェクトした細胞およびｃｈ５ｃ８でトランスフェクトした細胞由来の馴化培地は、Ｋ５６２α１細胞を染色しないことを示した。大規模の一過性トランスフェクションにより生成したキメラＡＱＣ２を精製し、そしてＦＡＣＳ滴定によって、ＶＬＡ−１に結合することを示した。野生形軽鎖または遺伝的にブロックされていない軽鎖のいずれかを有するキメラＡＱＣ２は、ＶＬＡ−１に結合した。図１６Ａ〜Ｄもまた参照のこと（以下で考察される）。
【０１８４】
（実施例２１）
この実施例は、ｍＡＱＣ２モノクローナル抗体をヒト化する方法を記載する。
【０１８５】
（ｍＡＱＣ２可変性ドメインの分析）ｍＡＱＣ２の軽鎖および重鎖中の可変性ドメインを、ソフトウエアプログラムＦＡＳＴＡを使用して、マウス亜群およびヒト亜群（Ｋａｂａｔら、前出）のコンセンサス配列と比較した。この軽鎖可変性領域は、１０９アミノ酸重複において８９％の同一性を有するマウス亜群ＶＩのメンバーであることが見出された。このドメインはまた、１１３アミノ酸重複において７２％の同一性を有するヒト亜群Ｉに対応した。重鎖可変性ドメインは、１２９アミノ酸重複において８６％の同一性を有するマウス亜群ＩＩＩｄのメンバーであることが見出された。この重鎖可変性ドメインもまた、１３０アミノ酸重複において７９％の同一性を有するヒト亜群ＩＩＩに対応した。
【０１８６】
ＣＤＲを、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２，ｐｐ．８７７−８８３（１９８９）に従って、正準クラスに分類した。各正準クラスを規定する重要な残基は、ＣＤＲループの構造コンフォメーションを大部分決定し、従って、再成形された抗体に保持されるはずである。ｍＡＱＣ２のＬ１ループは、正準クラス１（１０残基ループ）に含まれ、Ｌ２ループはクラス１（７残基ループ）に含まれ、そしてＬ３ループはクラス１（９残基ループ）に含まれた。Ｈ１ループは、クラス１（５残基ループ）に含まれ、そしてＨ２ループは、クラス１（１６残基ループ）残基に含まれた。Ｈ３ループは、どの正準クラスにも属さないようであった。これらのクラスに重要な正準残基の全ては、ヒト化抗体に含まれた。
【０１８７】
ｍＡＱＣ２中の異常なフレームワーク残基を、Ｋａｂａｔデータベースの１９９９年９月のバージョンにおいて、マウス可変性鎖配列およびヒト可変性鎖配列の全てを分析することによって、決定した。ｍＡＱＣ２特異的な差異は、これらの差異が結合部位に近い場合、結合親和性を増大する体性変異を示し得ると考えられた。この結合部位からさらに離れた異常なｍＡＱＣ２残基および異常なヒトフレームワーク残基を、これらがヒト化抗体中の免疫原性エピトープを生成する場合に、除去した。ｍＡＱＣ２中に見出される異常なフレームワーク残基は、軽鎖中の７（Ｆ）、１０（Ｌ）および４１（Ｋ）；ならびに重鎖中の４（Ｖ）、２１（Ａ）および４０（Ｉ）であった。これらの異常なマウスフレームワーク残基のいずれも、ヒト化抗体に保持されなかった。
【０１８８】
（可変領域の構造のモデル化）ｍＡＱＣ２の軽鎖および重鎖を、どの構造フレームを使用してｍＡＱＣ２の軽鎖および重鎖の三次元モデルを構築するかを決定するために、非余剰データベースに対して整列させた。ＦＡＳＴＡを使用して、この軽鎖は、マウスのモノクローナル抗体ａｂ５７（１ＣＬＯＬ）に対して８２％の配列同一性を有することが見出され、一方で重鎖はマウス６ｄ９Ｆａｂフラグメント（１ＨＹＹ）と７６％の配列同一性を有することが見出された。分子モデル化ソフトウェアパッケージＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．）を使用して、ｍＡＱＣ２の軽鎖および重鎖のおおよその三次元構造を、それぞれ、ａｂ５７の軽鎖および６ｄ９の重鎖を使用して構築した。これらモデルの構造完全性を、コンソールで評価し、そして妥当であることを見出した。
【０１８９】
（新形態の可変領域の設計）２つのアプローチを使用して、ｍＡＱＣ２のＣＤＲを「受容する」ヒトのアクセプターのフレームワークを選択した。第１のアプローチは、相同性マッチングであり、そして他のアプローチは、コンセンサスなヒトＩｇの配列を使用することである。相同性のアプローチの下で、Ｋａｂａｔデータベース、ＮＣＢＩ、ＥＮＴＲＥＺ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）由来の非余剰データベース、およびＩｎｃｙｔｅデータベースを、ソフトウェアプログラムのＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴを使用して検索した。ｍＡＱＣ２フレームワークとヒトのフレームワークとの間の配列同一性（これまでにヒト化された抗体由来のフレームワークを除く）および抗体の供給源に基づいて、ヒトのアクセプターのフレームワークを選択した。
【０１９０】
ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ｇｉ：５８７３３０（ヒトκサブグループＩＶκ−１ｃ１４７）を有する免疫グロブリン可変領域遺伝子由来のフレームワークを、ヒト化された抗体の軽鎖（Ｗｅｌｓｃｈｏｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７９：２０３−１４（１９９５））について、その都度選択した。Ａｍｕｌｃ１１（Ｋａｂａｔ ＩＤ０４４４６９；ヒトサブグループＩＩＩ）由来のフレームワークを、ヒト化された抗体の重鎖（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５２９０−３００（１９９３））について選択した。
【０１９１】
（ヒトフレームワークの復帰変異）ミラーされるｕｒｌ：ｈｔｔｐ：／／ｍａｔｈｂｉｏ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｊｓａｌｄａｎおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓの下で、どの復帰変異変異を作製するかを決定するためのストラテジーは、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂＹ Ｄｅｓｉｇｎのウェブサイト上で利用可能である。以前の実験は、正準残基、インターフェースパッケージング残基および結合部位に隣接した、異常なマウス残基を保持することが、重要であることを示している。さらに、ＣＤＲが休止する（Ｆｏｏｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４，４８７頁（１９９２））プラットフォームを形成する「Ｖｅｒｎｉｅｒ Ｚｏｎｅ」ＣＤＲ Ｈ３に近いＣＤＲが検討されるべきである。
【０１９２】
４つの新形態のバージョンを、表１に示すように、各々の可変軽鎖および可変重鎖について設計した。４つの各々の鎖のバージョンのうちの２つを、ホモロジーマッチングによって設計し（ｈｕＡＱＣ２−ｈ１およびｈｕＡＱＣ２−ｈ２と称する）、そして他の２つのバージョンをコンセンサスマッチングによって設計した（ｈｕＡＱＣ２−ｃ１およびｈｕＡＱＣ２−ｃ２）。ｈｕＡＱＣ−ｈ１重鎖の配列およびｈｕＡＱＣ−ｃ１重鎖の配列が同一であることに注意するべきである。
【０１９３】
（表１．ｍＡＱＣ２、ｈｕＡＱＣ２およびヒトのフレームワークの配列）
【０１９４】
【表１−１】
Figure 2004536580
【０１９５】
【表１−２】
Figure 2004536580
いくつかの復帰変異を、以下に説明する。
【０１９６】
（１）軽鎖：
１Ｄ−＞Ｑ この変異は、これまでの新形態を作る実験（例えば、Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６，９７１頁（１９９３））が抗原結合に対するその重要性を示唆したので、全てのバージョンにおいて作製された。
【０１９７】
４Ｍ−＞Ｌ これは、バーニア（ｖｅｒｎｉｅｒ）残基であって、全てのバージョンにおいて保持された。
【０１９８】
４６Ｌ−＞Ｐ この残基は、界面残基かつバーニア残基の両方であり、そしてｈ１およびｃ１においてのみ保持された。
【０１９９】
４７Ｌ−＞Ｗ これは、バーニア残基であり、そしてｈ１およびｃ１においてのみ保持された。
【０２００】
７１Ｆ−＞Ｙ この残基は、重要な基準位置にあり、そして全てのバージョンにおいて保持された。
【０２０１】
（２）重鎖：
１Ｅ−＞Ｄ この復帰変異は、ｈ１（すなわち、ｃ１）においてのみ作製された。
【０２０２】
１２Ｉ−＞Ｖ この残基Ｉは、ヒトにおいては異常であり、そしてｈ２においてのみ保持された。
【０２０３】
２８Ｔ−＞Ｓ これは、バーニア残基であり、そしてｈ１においてのみ保持された。
【０２０４】
２９Ｖ−＞Ｆ これは、正準残基であり、そして全てのバージョンにおいて保持された。
【０２０５】
４９Ｓ−＞Ａ これは、バーニア残基であり、そして全てのバージョンにおいて保持された。
【０２０６】
９３Ａ−＞Ｔ これは、バーニア残基および界面残基のであり、そして全てのバージョンにおいて保持された。
【０２０７】
９４Ｓ−＞Ｒ これは、正準残基であり、そして両方のバージョンにおいて保持された。
【０２０８】
ｈｕＡＱＣ２可変領域を、開始テンプレートとしてｃｈＡＱＣ２可変ドメインプラスミドを用いて、上記のようにＵＳＥ変異誘発によって作製した。ヒト受容体フレームワーク（「ＦＲ」）ｃＤＮＡ配列は、軽鎖についてＫａｂａｔ ＃Ｚ３７３３４、および重鎖についてＫａｂａｔ ＃Ｕ００４９０であった。変異プラスミドの同定を容易にするために、非表現突然変異を、制限部位を変更するように導入した。変異プラスミドを、この制限部位変化によって同定した。得られたプラスミドにおける可変領域ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２０９】
重鎖のｈ１バージョンおよびｃ１バージョン（これらは、同一である）を、テンプレートとしてプラスミドｐＡＮＤ０９４を使用することによって作製した。変異原性プライマーは、以下であった：ＦＲ１プライマー５’ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＣ３’（配列番号２０）（これは、ＴａｑＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位を導入され、そしてＤｄｅＩ部位を除去されている）；ＦＲ２プライマー５’ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ ＣＣＧ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＣＡ ＡＣＣ３’（配列番号２１）（これは、ＮｃｉＩ部位を導入され、そしてＢｓｐＥＩ部位およびＥａｒＩ部位を除去されている）；ＦＲ３プライマー５’ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＡＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＡ ＧＣＣ ＧＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＣＡ ＡＧＡ３’（配列番号２２）（これは、ＰｓｔＩ部位およびＤｄｅＩ部位を導入される）；およびＦＲ４プライマー５’ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＡＧ３’（配列番号２３）（これは、ＫｐｎＩ部位およびＥｃｏ０１０９Ｉ部位を導入される）。得られたｈ１（すなわち、ｃ１）重鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１０４と命名した。
【０２１０】
重鎖のｃ２バージョンを、以下の変異原性プライマーとともにテンプレートとしてｐＡＮＤ１０４を使用することによって作製した：ＦＲ１プライマー５’ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＴＡＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ３’（配列番号２４）（これは、ＡｃｃＩ部位を導入される）；およびＦＲ１プライマー５’ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ３’（配列番号２５）（これは、ＦｓｐＩ部位を導入され、そしてＡａｔＩＩ部位を除去されている）。得られたｃ２重鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１１５と命名した。
【０２１１】
重鎖のｈ２バージョンを、以下のプライマーとともにテンプレートとしてｐＡＮＤ１１５を使用することによって作製した：ＦＲ１プライマー５’ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ３’（配列番号２６）（これは、ＤｄｅＩ部位を除去されている）。得られたｈ２重鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１１３と命名した。
【０２１２】
ｈｕＡＱＣ２重鎖についての発現ベクターを作製するために、ｐＡＮＤ１０４、ｐＡＮＤ１１５、またはｐＡＮＤ１１３由来の０．４３ｋｂのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ重鎖可変ドメインフラグメント、およびｐＥＡＧ９６４（前出）由来の１．２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＨ２６９（前出）のＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。得られた重鎖発現プラスミドを、それぞれ、ｐＡＮＤ１１４（ｈ１）、ｐＡＮＤ１２１（ｃ２）およびｐＡＮＤ１２４（ｈ２）と命名した。
【０２１３】
軽鎖のｈ１バージョンを、テンプレートとしてプラスミドｐＡＮＤ０９３を使用することによって作製した。変異原性プライマーは、以下であった：ＦＲ１プライマー５’ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＴＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＡ３’（配列番号２７）（これは、ＢｓｔＥＩＩ部位およびＰｓｔＩ部位を除去されている）；ＦＲ２プライマー５’ＴＴＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＴＴ３’（配列番号２８）（これは、ＮｃｉＩ部位を導入されている）；ＦＲ３プライマー５’ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＣＡ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＣＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＡＧ３’（配列番号２９）（これは、ＤｄｅＩ部位を導入され、そしてＥｃｏＯ１０９１部位およびＡｖａＩＩ部位を除去されている）および；ＦＲ４プライマー５’ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＣＧＧ ＧＣＴ３’（配列番号３０）（これは、ＤｄｅＩ部位およびＳｔｙＩ部位を導入されている）。得られたｈ１軽鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１０３と命名した。
【０２１４】
軽鎖のｈ２バージョンを、以下のプライマーとともにテンプレートとしてｐＡＮＤ１０３を使用することによって作製した：ＦＲ２プライマー５’ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＡＣＡ ＴＣＣ３’（配列番号３１）（これは、ＨｈａＩ部位およびＨａｅＩＩ部位を導入されている）。得られたｈ２軽鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１１６と命名した。
【０２１５】
軽鎖のｃ１バージョンは、以下のプライマーとともにプラスミドｐＡＮＤ１０３テンプレートを使用した：ＦＲ１プライマー５’ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＣ３’（配列番号３２）（これは、ＳｍａＩ部位、ＮｃｉＩ部位、およびＨｐａＩＩ部位を導入されている）；ＦＲ４プライマー５’ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＣＧ ＴＧＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＣＧＧ ＧＣＴ３’（配列番号３３）（これは、Ｂｓｐ１２８６Ｉ部位を導入されている）。得られたｃ１軽鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１１８と命名した。
【０２１６】
軽鎖のｃ２バージョンを、以下のプライマーとともにプラスミドｐＡＮＤ１１６テンプレートを使用することによって作製した：ＦＲ１プライマー５’ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＣ３’（配列番号３４）（これは、ＳｍａＩ部位、ＮｃｉＩ部位、およびＨｐａＩＩ部位を導入されている）；ＦＲ４プライマー５’ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＣＧ ＴＧＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＡ ＣＧＧ ＧＣＴ３’（配列番号３５）（これは、Ｂｓｐ１２８６Ｉ部位を導入されている）。得られたｃ２軽鎖プラスミドを、ｐＡＮＤ１１９と命名した。
【０２１７】
ｈｕＡＱＣ２軽鎖についての発現ベクターを作製するために、ｐＡＮＤ１０３、ｐＡＮＤ１１６、ｐＡＮＤ１１８、またはｐＡＮＤ１１９由来の０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメント、およびｐＥＡＧ９６３（前出）由来の０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＨ２６９（前出）のＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。得られた軽鎖発現ベクターを、それぞれ、ｐＡＮＤ１１７（ｈ１）、ｐＡＮＤ１２０（ｈ２）、ｐＡＮＤ１２２（ｃ１）、およびｐＡＮＤ１２３（ｃ２）と命名した。
【０２１８】
発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトし、そしてトランスフェクトした細胞を、抗体の分泌および特異性について試験した。空のベクターでトランスフェクトした細胞は、ネガティブコントロールとして役立った。細胞全体の溶解物および馴化培地を、プロテインＡで免疫沈降させた。沈澱物のウエスタンブロット分析（抗ヒト重鎖抗体および軽鎖抗体で展開した）は、ｈｕＡＱＣ２でトランスフェクトされた細胞が、ｃｈＡＱＣ２でトランスフェクトされた細胞と同様なレベルで、重鎖および軽鎖を合成し、そしてこれらを効率的に分泌したことを示唆した。
【０２１９】
次いで、トランスフェクトした細胞からの馴化培地で染色したＶＬＡ−１を発現するＫ５６２α１細胞のＦＡＣＳ分析を、実施した。実施するために、Ｋ５６２α１細胞を、氷上で馴化培地とともに１２０分間インキュベートした。次いで、この細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。洗浄した細胞を、緩衝液に再懸濁し、そしてＰＥ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、そして分析のためにＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。データを、表２に示す。ここで、ＨｕＡＱＣ２−ｈ１とは、ｈｕＡＱＣ２重鎖（ＨＣ）のｈ１バージョンおよびｈｕＡＱＣ２軽鎖（ＬＣ）のｈ１バージョンから構成されるｍＡｂをいう（表１を参照のこと）。同様に、ｈｕＡＱＣ−ｈ２は、重鎖および軽鎖のｈ２バージョンから構成されるｍＡｂであり、ｈｕＡＱＣ−ｃ１は、ｃ１バージョンであり、そしてｈｕＡＱＣ−ｃ２は、ｃ２バージョンである。表において、相対ＭＦＩとは、ブロックされたｃｈＡＱＣ２について観察されたＭＦＩに対して規格化した平均ＭＦＩをいう。示されるデータは、２つの独立したトランスフェクションからの平均を表す。これらのデータは、ｈｕＡＱＣ２−ｈ２ ｍＡｂおよびｈｕＡＱＣ２−ｃ２ ｍＡｂが、ｃｈＡＱＣ２と比較して、ｈｕＡＱＣ２−ｈ１およびｈｕＡＱＣ２−ｃ１よりも、あまりよく結合しないことを示した。
【０２２０】
（表２．ｃｈＡＱＣ２およびｈｕＡＱＣ２によるＫ５６２α１細胞のＦＡＣＳ染色）
【０２２１】
【表２】
Figure 2004536580
ｃｈＡＱＣ２ならびにｈｕＡＱＣ２のｈ１、ｈ２、ｃ１およびｃ２を用いる２９３−ＥＢＮＡ細胞の同時トランスフェクションを、スケールアップした。馴化培地中の抗体を、プロテインＡ−セファロースで精製した。精製したｍＡｂを、活性についてＦＡＣＳによってアッセイした。このプロトコルは、以下の通りである。
１．アッセイの前に当日に１：４に分割したフラスコから細胞を計数する。
２．細胞をペレット化し、そしてＦＡＣＳ緩衝液（０．０２％ Ｎａアジドを含むＰＢＳ中の５％ ＦＢＳ）中２．５ｅ５細胞／ｍｌで再懸濁する。
３．１００μｌの細胞を、９６ウェルＶ底面プレートのウェルにピペッティングする。
４．ＦＡＣＳ緩衝液中３μｇ／ｍｌで開始するＡＱＣ２の１：３の段階希釈物を調製する。
５．細胞を、８００×ｇで５分間ペレット化し、そして緩衝液を除去するためにプレートを弾く（ｆｌｉｃｋ）。
６．細胞を、１００μｌの希釈した抗体系列中に再懸濁する。
７．氷上で２時間インキュベートする。
８．プレートを洗浄する。細胞を、８００×ｇで３分間ペレット化し、そして緩衝液を除去するためにプレートを弾く。
９．細胞を、１００μｌの二次抗体（ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１００に希釈されている）に再懸濁する。
１０．氷上で３０分間インキュベートする。
１１．プレートを洗浄する（上記を参照のこと）。
１２．細胞を、２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。
１３．ＦＡＣＳチューブを短時間遠心分離して、５０μｌが、このチューブの底面にあることを確実にする。
１４．各々のチューブを激しくボルテックスし、５０００の事象（ｅｖｅｎｔ）を収集する。
【０２２２】
データを図１７に示す。これらのデータは、ｈｕＡＱＣ２−ｈ２およびｈｕＡＱＣ２−ｃ２が、ｃｈＡＱＣ２と比較して、ｈｕＡＱＣ２−ｈ１およびｈｕＡＱＣ２−ｃ１よりも、あまりよく結合しないことを確実にした。
【０２２３】
ｈｕＡＱＣ２のコンセンサスバージョンを、さらに研究した。なぜなら、これらは、長期の適用で患者を処置するために使用される場合、低い免疫原性であるからである。混合して組み合わせた（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍａｔｃｈ）同時トランスフェクションを実施して、単鎖が、ｈｕＡＱＣ−ｃ２で観察される結合の明らかな減少の原因であるか否かを同定した。この同時トランスフェクションは、この減少が、ｃ２軽鎖（ｐＡＮＤ１２３によってコードされ、ｃ２軽鎖は、ＦＲ２領域における２残基（Ｐ４６ＬおよびＷ４７Ｌ）のみがｃ１軽鎖（ｐＡＮＤ１２２によってコードされる）と異なる）に起因し得ることを示唆した。
【０２２４】
これらの２つの変化のそれぞれの個々の寄与を試験するために、新たなｃ２軽鎖発現ベクターを構築した。プラスミドｐＡＮＤ１２５（ｃ２軽鎖のＬ４７Ｗ改変体）を、以下の変異原性プライマーとともにテンプレートとしてｐＡＮＤ１１９を使用して作製した：ＦＲ２プライマー５’ＧＧＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＡＴ ＣＴＣ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＡＣ３’（配列番号３６）（これは、ＨｈａＩ部位およびＨａｅＩＩ部位を導入されている）。プラスミドｐＡＮＤ１２６（ｃ２軽鎖のＬ４６Ｐ改変体）を、以下の変異原性プライマーとともにテンプレートとしてｐＡＮＤ１１９を使用することによって作製した：ＦＲ２プライマー５’ＡＡＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＣＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＡＣ３’（配列番号３７）（これは、ＢｓａＨＩ部位、ＢａｎＩ部位、およびＮａｒＩ部位を導入されている）。これらの新しいｈｕＡＱＣ２軽鎖についての発現ベクターを、ｐＡＮＤ１２５またはｐＡＮＤ１２６由来の０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメント、およびｐＥＡＧ９６３（前出）由来の０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＨ２６９（前出）のＮｏｔＩ部位にサブクローン化することによって作製した。得られたプラスミドを、それぞれ、ｐＡＮＤ１３２（Ｌ４７Ｗを有するｃ２）、およびｐＡＮＤ１３３（Ｌ４６Ｐを有するｃ２）と命名した。
【０２２５】
各々のｈｕＡＱＣ２重鎖プラスミドと新たな軽鎖プラスミドとの同時トランスフェクションを実施した。ＶＬＡ−１結合を、ＦＡＣＳによって試験した。このデータは、Ｌ４７Ｗの復帰変異が、結合の改善に失敗することを実証した。Ｌ４６Ｐの変異は、結合曲線のピークを改善したが、ＥＣ５０は、ｈｕＡＱＣ２バージョン１の挙動と比較して、なお右にシフトしたままであった（表２、前出）。これらの結果は、両方の復帰変異が、完全な結合活性に対して必要とされることを示唆した。
【０２２６】
遺伝的にブロックされていないｃ１軽鎖もまた作製した。なぜなら、Ｑ１Ｄ改変体は、より「ヒト化」した残基の１つであるからである。このＱ１Ｄ変異体（ｐＡＮＤ１４８と命名する）を、以下の変異原性プライマーとともにテンプレートｐＡＮＤ１１８を用いて作製した：ＦＲ１プライマー５’ＧＴＣ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ３’（配列番号３８）（これは、新たなＥｃｏＲＩ部位を導入され、そしてＡｐｏＩ部位を除去されている）。このｈｕＡＱＣ２軽鎖の最後の改変体についての発現ベクターを、ｐＡＮＤ１４８由来の０．４４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメント、およびｐＥＡＧ９６３由来の０．６８ｋｂのＢｃｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位にサブクローン化することによって作製した（これは、軽鎖発現ベクターｐＡＮＤ１５０（ブロックしていないＮ末端Ｑ１Ｄを有するｃ１）を産生する）。遺伝的にブロックされてない軽鎖とｃ２重鎖との同時発現（すなわち、「ブロックされていないｈｕＡＱＣ２ ＬＣ ｃ１／ＨＣ ｃ２」；ｈｕＡＱＣ２−ｃ４と命名する）は、「ｈｕＡＱＣ２ ＬＣ ｃ１／ＨＣ ｃ２」（ｈｕＡＱＣ２−ｃ３として命名される）の同時発現と等価であった。ＶＬＡ−１結合を、ＶＬＡ１を発現するＫ５６２α１細胞に対してＦＡＣＳにより確認した（表２）。
【０２２７】
ｃｈＡＱＣ２ならびにｈｕＡＱＣ２−ｈ１、ｈｕＡＱＣ２−ｈ２、ｈｕＡＱＣ２−ｃ１、ｈｕＡＱＣ２−ｃ２、ｈｕＡＱＣ２−ｃ３、およびｈｕＡＱＣ２−ｃ４を用いる２９３−ＥＢＮＡ細胞の同時トランスフェクション。馴化培地中の抗体を、プロテインＡ−セファロース上で精製した。精製したｍＡｂを、活性についてアッセイした（図１７および図１８）。ＨｕＡＱＣ２−ｃ３を、薬物候補として選択した。なぜなら、ＨｕＡＱＣ２−ｃ３の特性が、ｃｈＡＱＣ２により似ていたからである。次いで、ＣＨＯ細胞におけるｈｕＡＱＣ２−ｃ３の安定な発現のためにベクターを設計した。このベクターは、産物の均一性を確実にするために、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを除去し、そして重鎖Ｃ末端リジンを遺伝的に欠損した、ｈｕＡＱＣ２ ｃ１ ＬＣまたはｃ２ ＨＣについてのｃＤＮＡを含んだ。この最終的なベクターは、ｐＡＮＤ１６２（軽鎖）、ｐＡＮＤ１６０（重鎖）であった。本明細書中で使用される場合、ｈｕＡＱＣ２−ｃ３はまた、ｈＡＱＣ２と呼ばれる。
【０２２８】
ｈＡＱＣ２の完全なポリペプチド配列は、以下の通りである。
軽鎖（プラスミド：ｐＡＮＤ１６２）
【０２２９】
【化１３】
Figure 2004536580
（配列番号３）
重鎖（プラスミド：ｐＡＮＤ１６０）
【０２３０】
【化１４】
Figure 2004536580
【０２３１】
【化１５】
Figure 2004536580
（配列番号４）
他の重鎖ならびに軽鎖のポリペプチド配列およびヌクレオチド配列を、以下に示す。
Ａ．ｃｈＡＱＣ２重鎖（Ｐａｎｄ０９９）（配列番号３９および４０）（前者の番号は、ヌクレオチド配列について言及し、そして後者は、ポリペプチド配列について言及する。同様の順序を、以下の番号付けで使用する）。
【０２３２】
【化１６】
Figure 2004536580
【０２３３】
【化１７】
Figure 2004536580
Ｂ．ｈＡＱＣ２ ＨＣ ｈ１およびｃ１（ｐＡＮＤ１１４）（配列番号４１および４２）
【０２３４】
【化１８】
Figure 2004536580
【０２３５】
【化１９】
Figure 2004536580
Ｃ．ｈＡＱＣ２ ｈ２重鎖（ｐＡＮＤ１２４）（配列番号４３および４４）
【０２３６】
【化２０】
Figure 2004536580
【０２３７】
【化２１】
Figure 2004536580
Ｄ．ｈＡＱＣ２ ｃ２重鎖（ｐＡＮＤ１２１）（配列番号４５および６９）
【０２３８】
【化２２】
Figure 2004536580
【０２３９】
【化２３】
Figure 2004536580
Ｅ．ｃｈＡＱＣ２ブロックされた軽鎖（Ｐａｎｄ１０２）（配列番号４６および４７）
【０２４０】
【化２４】
Figure 2004536580
Ｆ．ｈＡＱＣ２ ｈ１軽鎖（ｐＡＮＤ１１７）（配列番号４８および４９）
【０２４１】
【化２５】
Figure 2004536580
Ｇ．ｈＡＱＣ２ ｈ２軽鎖（ｐＡＮＤ１２０）（配列番号５０および５１）
【０２４２】
【化２６】
Figure 2004536580
Ｈ．ｈＡＱＣ２ ｃ１軽鎖（ｐＡＮＤ１２２）（配列番号５２および７０）
【０２４３】
【化２７】
Figure 2004536580
Ｉ．ｈＡＱＣ２ ｃ２軽鎖（ｐＡＮＤ１２３）（配列番号５３および５４）
【０２４４】
【化２８】
Figure 2004536580
Ｊ．ｃｈＡＱＣ２ブロックされていない軽鎖（ｐＡＮＤ０９８）（配列番号５５および５６）
【０２４５】
【化２９】
Figure 2004536580
Ｋ．ｈｕＡＱＣ２ブロックされていないｃ１軽鎖（ｐＡＮＤ１５０）（配列番号５７および５８）
【０２４６】
【化３０】
Figure 2004536580
【０２４７】
【化３１】
Figure 2004536580
（実施例２２）
この実施例は、本発明の種々のＡＱＣ２抗体の特徴付けを記載する。
【０２４８】
（α１ Ｉドメイン結合についての固相アッセイ）
１０ｍｇ／ｍｌのα１ Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質（５０μｌ）を、ＣＯＲＮＩＮＧ ＣＯＳＴＡＲ ＥＡＳＹ ＷＡＳＨポリスチレン９６ウェルプレート（Ｇｏｔｗａｌｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，８２８０−８（１９９９））に加えた。４℃での１６時間のインキュベーションに続いて、このプレートを、プレート洗浄機中で、ＰＢＳ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（３５０μｌ）で４回洗浄した。このプレートをＴＢＳ中の３％ ＢＳＡ（１８０μｌ）の添加によって、２５℃で６０分間ブロッキングし、次いで上記のように洗浄した。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ（アッセイ緩衝液）への抗体の希釈（５０μｌ／ウェル）によって、９６ウェルの円型底プレート中に調製し、α１ Ｉドメインコーティングプレートに移し、そして２５℃で６０分間インキューベーションした。最終の洗浄に続いて、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。１０分後、１００μｌの１Ｍ硫酸を添加し、そして４５０ｎｍでの吸光度を、ＵＶ−Ｖｉｓ９６ウェル分光光度計で読み取った。
【０２４９】
（α１ β１インテグリンまたはα１ Ｉドメインのコラーゲンへの結合についての電気化学的発光アッセイ）
Ｔｏｓｙｌ活性化ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）を、製造業者の指示書に従って、１００μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングした。α１トランスフェクトＫ５６２細胞由来の細胞溶解物を、以下のように調製した。細胞を、遠心分離によって回収し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２％ ＢＳＡ、および１ｍＭ ＰＭＳＦを含む溶解緩衝液中に１０８細胞／ｍｌになるように再懸濁し、そして４℃で６０分間インキュベーションした。細胞の破片を、１２，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって除去し、得られた上清を、以下の実験で使用した、抗β１活性化抗体ＴＳ２／１６およびポリクローナル抗ＧＳＴ抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、製造業者の指示書に従って、ＴＡＧ−ＮＨＳエステル（ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して標識した。標識された抗体を、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ２５Ｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。
【０２５０】
結合アッセイを実施するために、コラーゲンコーティングビーズ（１ｍｇ／ｍｌ）を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むアッセイ緩衝液中、８％Ｌｅｗｉｓラット血漿を用いて、５分間ブロッキングした。α１β１結合アッセイのために、抗体の連続希釈液を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２を含むアッセイ緩衝液中、１０μｇのビーズ、１０５個のα１でトランスフェクトしたＫ５６２細胞（上述）から調製した細胞溶解物、および０．１μｇ／ｍｌのＴＡＧ−ＴＳ２／１６と共にインキュベートした。α１ Ｉドメイン結合アッセイのために、この抗体を、１ｍＭ ＭｎＣｌ２を含むアッセイ緩衝液中、１０μｇのビーズ、０．１μｇ／ｍｌのα１ ＩドメインＧＳＴ融合タンパク質、および１μｇ／ｍｌのＴＡＧ抗ＧＳＴと共にインキュベートした。室温で１〜２時間攪拌した後、２００μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そしてこのサンプルをＯＲＩＧＥＮ １．５電気化学発光検出器（ＩＧＥＮ）上で読み取った、プロットを、縦軸上に任意の電気化学発光単位（ＥＣＬ）を用いて示す。
【０２５１】
（ビオチン化されたｍＡＱＣ２競合アッセイ）
９６ウェルプレートを、上に記載のとおりに、５μｇ／ｍｌのα１ ＩドメインＧＳＴ融合タンパク質（５０μｌ）を用いてコーティングし、そしてＴＢＳ中、３％ＢＳＡでブロッキングした。アッセイ緩衝液による抗体の希釈（６０μｌ／ウェル）を、９６ウェル円型底プレートにおいて調製し、そしてアッセイ緩衝液中、０．１μｇ／ｍｌのビオチン化マウスＡＱＣ２（６０μｌ）に添加した。各ウェルからの５０μｌを、コードされたプレートに移し、２５℃で３時間インキュベートした。次いで、このプレートを上記のように洗浄し、５０μｌの１μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ結合ＥＸＴＲＡＶＩＤＩＮ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そしてこのプレートを２５℃でさらに２時間インキュベートした。最終の洗浄後、１ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。１０分後、１００μｌの１Ｍ硫酸を添加し、そして４５０ｎｍの吸光度を、ＵＶ−Ｖｉｓ９６ウェル分光光度計で読み取った。
【０２５２】
（実験結果）
実験結果を、図１６Ａ〜１６Ｄおよび表３に示す。（１）ヒトα１でトランスフェクトしたＫ５６２細胞に結合するため（ＦＡＣＳによる）；（２）固定化されたα１−Ｉドメインに結合するため（ＥＬＩＳＡによる）；（３）α１−Ｉドメインへの結合についてｍＡＱＣ２と競合するため（ＥＬＩＳＡ）；（４）α１−Ｉドメインのコラーゲンへの結合をブロッキングするため（電気化学発光アッセイ）；（５）またはα１β１インテグリンのコラーゲンへの結合をブロッキングするため（電気化学発光アッセイ）のｍＡＱＣ２、ｃｈＡＱＣ２、ｈＡＱＣ２、およびｈＡＱＣ２’（すなわち、ｈｕＡＱＣ２−ｃ４；ｈＡＱＣ２’軽鎖の残基１がＱの代わりにＤであったという点のみでｈＡＱＣ２と異なる）の能力を決定した。この結果を、図１６Ａ〜１６Ｄに示し、そして計算された（阻害に対する）ＩＣ５０値または（結合に対する）ＥＣ５０値を、表３に示す。各アッセイにおいて、各ヒト化されたＡＱＣ２の形態は、ＶＬＡ１（またはα１ドメイン）を結合するか、またはコラーゲンへの結合をブロックするかのいずれかに類似する能力を示した（パネルＣにおいて、ｍＡＱＣ２とヒト化された形態との間での観測された強度の違いは、抗ヒトＩｇＧの代わりに抗マウスＩｇＧ二次抗体を使用したことに由来することに留意されたい）。
【０２５３】
【表３】
Figure 2004536580
本発明者らは、次にＣＤＲ中の特定の保存された残基での変化が、ｈＡＱＣ２のＶＬＡ−１結合活性を保存し得るかどうかを試験した。以下の変異を有するｈＡＱＣ２の改変体をコードするＤＮＡ構築物を、部位特異的突然変異誘発によって作製した：（１）重鎖ＣＤＲ２中のＧ５５Ｓ；（２）軽鎖ＣＤＲ１中のＳ２４Ｎ（これは、占有されたＮ結合グリコシル化部位を導入する）；（３）軽鎖ＣＤＲ３中のＧ９２Ｓ；（４）（１）と（２）との組合せ；および（５）（１）と（３）との組合せ。次いで、重鎖および軽鎖の両方をコードするＤＮＡ構築物を、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトし、そしてトランスフェクト体の条件培地を、ウエスタンブロットおよｌびＥＬＩＳＡによって、抗体発現について、アッセイした。この結果は、ｈＡＱＣ２改変体が、同源のｈＡＱＣ２と同程度に効率的に発現されたことを示した。ＶＬＡ−１を発現するＫ５６２細胞を使用するＦＡＣＳアッセイは、これらの改変体のＶＬＡ−１結合活性がｈＡＱＣ２それ自身に類似したことをさらに示した。要するに、このアミノ酸置換は、ｈＡＱＣ２のＶＬＡ−１結合活性を変更しなかった。実際に、ＲΔＨ／ｈＡＱＣ２ Ｆａｂ複合体のＸ線結晶構造（下記）は、軽鎖のＳ２４およびＧ９２ならびに重鎖のＧ５５が、α１−Ｉドメインと接触する結合ポケット中に存在しないことを示す。
【０２５４】
（実施例２３）
免疫グロブリンのエフェクター機能は、免疫系の炎症性アーム、細胞傷害性アームおよび刺激性アームへの、免疫グロブリンの抗原結合活性と共役する。エフェクター機能は、免疫グロブリン治療生成物の安全性および効力を損ない得る。ｈＡＱＣ２の潜在的なエフェクター機能を減少させるために、ｈＡＱＣ２の重鎖のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの変異させ、ｈｓＡＱＣ２を作製する。同じ理由のために、Ｎ２９７Ｑの単一の変異を、ｈＡＱＣ２の重鎖に導入し、ｈＡＱＣ２のグリコシル化されない形態を作製し、ｈａＡＱＣ２と名づけた。研究は、効力、残存エフェクター機能、安定性および同源のｈＡＱＣ２に対する免疫原性を比較するために実施され得る。他に示さない限り、本明細書で使用される場合、定常領域の残基位置番号は、ＥＵ番号規約に従って番号付けされる。
【０２５５】
ｈａＡＱＣ２の重鎖ポリペプチド配列は、以下のとおりである（プラスミド：ｐＡＮＤ１６１）：
【０２５６】
【化３２】
Figure 2004536580
【０２５７】
【化３３】
Figure 2004536580
ｈｓＡＱＣ２の重鎖ポリペプチド配列は、以下のとおりである（プラスミド：ｐＡＮＤ１７１）：
【０２５８】
【化３４】
Figure 2004536580
（実施例２４）
この実施例は、ラット／ヒトキメラのα１β１インテグリンのα１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントとの複合体の結晶構造を決定するための方法を記載する。
【０２５９】
（タンパク質複合体の調製）
ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントを、ＩＭＭＵＮＯＰＵＲＥＯ（登録商標）Ｆａｂ調製キット（カタログ番号４４８８５，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の手順のバリエーションを使用して、ｈＡＱＣ２抗体から調製した。インタクトなｈＡＱＣ２抗体を、２０ｍＭホスフェート、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２５ｍＭシステイン（ｐＨ７．０）を含む緩衝液中で、１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。固定化パパインを、１：５０の酵素対基質比で添加し、そして３７℃で一晩消化した。この固定化パパインを除去し、そして粗消化物を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析した。Ｆａｂフラグメントを、低い塩濃度勾配でＳカラム（Ｐｏｒｏｓ ＨＳ／Ｍ，ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ 番号ＰＯ４２Ｍ２６）を使用したカチオン交換クロマトグラフィーによって、残存するインタクトな抗体、残存するダイマーＦａｂフラグメント、および残存するＦｃフラグメントから分離した。次いで、このＦａｂフラグメントを、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中に交換した。
【０２６０】
本発明において使用されるキメラのα１−Ｉドメインは、ラットα１インテグリン鎖の残基Ｔｈｒ１４５−Ｐｈｅ３３６を含むラット／ヒトキメラＩドメイン構築物（変異体ＲΔＨ）であり、ここで、残基Ｇｌｙ２１７、Ａｒｇ２１８、Ｇｌｎ２１９およびＬｅｕ２２２（結晶での番号づけ）は、抗体結合を回復するために、それぞれ等価なヒトの残基Ｖａｌ，Ｇｌｎ、ＡｒｇおよびＡｒｇで置換される。キメラのＲΔＨα１−Ｉドメイン、ラットα１−Ｉドメインおよびヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列を、それぞれ以下の配列番号５９、６０および６１に示す。組換えα１−Ｉドメインを、ＧＳＴ融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ内で発現させた。このＲΔＨα１−Ｉドメインを、トロンビンで切断し、そして以前に記載されるようにＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓクローンから精製した（Ｇｏｔｗａｌｓら、１９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８２８０−８２８８）。
【０２６１】
【化３５】
Figure 2004536580
【０２６２】
【化３６】
Figure 2004536580
ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントを、過剰のキメラのα１−Ｉドメインと混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。飽和したα１／Ｆａｂ複合体を、Ｓ２００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｇｉｂｃｏ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、複合体化していないα１−Ｉドメインから分離した。この複合体をさらに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、５ｍＭ β−メルカプトエタノール中で、１１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０２６３】
（結晶の調製）
結晶化条件を、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，ＣＡ）製のＣＲＹＳＴＡＬ ＳＣＲＥＥＮＴＭ ＫＩＴを使用して見出した。上記に記載される複合体の結晶は、２０℃で、等量のタンパク質複合体溶液と２０〜３０％のＰＥＧ１５００レザバ溶液とを使用した蒸気拡散法によって成長した。代表的には、２μＬのタンパク質複合体を、２μＬのウェル溶液に添加し、４μＬのドロップを得た。結晶は、０．８×０．０５×０．０５ｍｍ３の寸法を有する六角柱のロッドとして、２〜７日間で成長した。α１−ＩドメインおよびｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントの存在を、溶解した結晶のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。データ収集の間の固有の放射損傷を減少するために、Ｘ線回折データを、約１００Ｋで収集した。この低い温度でのデータ収集のための結晶を調製するために、結晶を、２５％ＰＥＧ４００および３０％ＰＥＧ１５００を含む凍結保護物質（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）溶液に、徐々に平衡化し、液体窒素中で瞬間冷却（ｆｌａｓｈ ｃｏｏｌ）した。
【０２６４】
（構造決定）
２．８Å分解能までのネイティブのＸ線回折データを、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢＮＬ）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＮＳＬＳ）のビームラインＸ４ＡでＡＤＳＣ Ｑｕａｎｔｕｍ ４電荷結合素子検出器を使用して、約１００Ｋで単一の結晶から収集した。データを、ソフトウェアプログラムＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ＆ Ｍｉｎｏｒ，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６）を使用して処理した。結晶は、空間群Ｐ６１またはその鏡像異性であるＰ６５に属し、単位格子定数（ｕｎｉｔ ｃｅｌｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）ａ＝ｂ＝２５５．０９Å、ｃ＝３８．６４Åを有した。このデータセットは、９６．６％完全であり、そして８．３％のＲマージを有した。Ｍａｔｔｈｅｗｓ係数（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９６８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：４９１−４９７）は、２．５９Å３Ｄａ−１であり、５２．１％の溶媒含量を有し、このことは、非対称単位中に２つの複合体が存在したことを示した。非対称単位中の２つの複合体は、非結晶学的２回対称によって関係付けられる。データ統計（ｄａｔａ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を、表４に示す。
【０２６５】
分子置換の検索を、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４．Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．１９９４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０：７６０−７６３）からのプログラムＡＭｏＲｅ（Ｎａｖａｚａ，１９９４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ５０：１５７−１６３）を使用して実施し、そして分子グラフィック操作を、プログラムＱＵＡＮＴＡを使用して実施した。ラットのα１β１インテグリンのα１−Ｉドメインの構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）登録番号ｌｃｋ４；Ｎｏｌｔｅら、１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３７９−３８５）からの単一のα１−Ｉドメインを、回転検索および並進検索のためのモデルまたはプローブとして使用した。並進関数検索は、非対称単位中の２つのα１−Ｉドメインに対する正しい解に対応する、回転関数における最大のピークの１番目および９番目を示し（相関係数（ｃｃ）＝２１．１％、Ｒ＝５３．１％）、そして空間群がＰ６５であることを示した。次に、ｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントについての検索を実行し、Ｉドメインの解を固定して、そして検索プローブとしてｈＡＱＣ２ ＦａｂのＦｖドメインのモデルを使用した。明瞭な解を、２つのＦｖドメインのうち１つについて見出した（ｃｃ＝２２．１％、Ｒ＝５２．６％）が、第２のＦｖを局在化できなかった。第２のＦｖの位置は、非結晶学的２回対称を使用して導出された。２つのＩドメインおよび２つのＦｖドメインの剛体精密化によって、Ｒ因子が４３．６％まで減少した（Ｒフリー＝４２．７％）。２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図は、第１のＦａｂフラグメントの定常ドメイン（Ｆｃｏｎｓｔ）について明瞭な電子密度を示したが、第２のＦａｂフラグメントのＦｃｏｎｓｔドメインについては、電子密度を示さなかった。第１のＦａｂのＦｃｏｎｓｔドメインのモデルを、手動で観測された電子密度に合わせた。続くソフトウェアプログラムＣＮＸ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（著作権）２０００；Ｂｒｕｎｇｅｒ，１９９８，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５４：９０５−９２１）を使用した剛体精密化は、５００〜２．８Å範囲のデータを使用して、全てのドメインの位置を最適化し、Ｒ因子を３９．７％にまで減少させた（Ｒフリー＝３８．９％）。
【０２６６】
続く全ての精密化工程を、ＣＮＸプログラムを用いて実施した。モデルのバイアスを減少するために、部分モデルを、２Ｆｏ−Ｆｃ図の計算およびモデル精密化に対して使用した。初期部分モデルを、非結晶学的対称拘束を使用して、シミュレーテッドアニーリングおよびグループ化された温度因子の精密化に供した。Ｒウォーキング（Ｒ−ｗｏｒｋｉｎｇ）因子およびＲフリー因子は、それぞれ２８．３％および３２．９％にまで減少した。繰り返しのモデル構築、最尤位置精密化および温度因子精密化からなるいくつかの周期が続いた。Ｒフリー因子を減少するモデル調整のみが許容された。バスク溶媒補正を、完全なモデルを構築した後に実施した。最終モデルのＲウォーキング因子およびＲフリー因子は、５００〜２．８Åの分解能範囲内でのデータ（Ｆ＞２σ）について、それぞれ２１．３％および２７．２％である。
【０２６７】
最終の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図は、弱い電子密度に関連し、そしてモデルに含まれていない、１つのＩドメインのフラグメント（図１９における分子Ａ）のアミノ酸残基２８８〜２９５を除いて、複合体のほとんどについて良質である。さらに、１つのＦａｂフラグメントの定常ドメイン全体は、可視の電子密度を有さず、このことは、この定常ドメイン全体が、ディスオーダーしていることを示す。これは、大きな溶媒チャネル内に位置することに起因して、Ｆａｂフラグメントの定常ドメインに対して結晶接触がないことの結果であるように見える。このドメインはまた、６のポリペプチド鎖を含む１０３０アミノ酸残基および２のマンガンイオンからなる第１のモデルに含まれない。非対称単位内の２つの複合体由来の等価な残基間のｒ．ｍ．ｓ．位置変位は小さい（１６６０の等価な主鎖原子について０．３７Å）。立体化学的な統計を、ソフトウェアプログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９９３，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２６：２８３−２９１；Ｍｏｒｒｉｓら、１９９２，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １２：３４５−３６４）およびＣＮＸを使用して計算した。水素結合（＜３．６Å）を、プログラムＣＯＮＴＡＣＴ（Ｔａｄｅｕｓｚ Ｓｋａｒｚｙｎｓｋｉ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，１．１２．８８；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４．Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．１９９４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）を使用して見出した。全ての非グリシン残基（以下に考察されるＬ鎖の残基Ｔｈｒ５０を除く）は、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ図の許容領域にあり、８６％の残基は、最も好ましい領域にある。主鎖原子の平均温度因子は、３８．５Å２である。結晶学的分析データを、表４に示す。
【０２６８】
【表４】
Figure 2004536580
（実施例２５）
本実施例は、ラット／ヒトキメラのα１β１インテグリンのα１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントとの複合体の結晶構造を記載する。
【０２６９】
（結晶構造の構成）
ラット／ヒトキメラのα１β１インテグリンのα１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントとの複合体の結晶構造は、細長い形態を有する（図２０）。この複合体の寸法は、１００Å×５０Å×３５Åである。
【０２７０】
Ｆａｂフラグメントは、代表的な免疫グロブリンフォールドを示す。Ｆａｂフラグメントの軽鎖および重鎖は、２つの広いシートの逆平行のβストランドをそれぞれ形成し、このβストランドは、共に堅くパッキングされ、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループに対する骨組みを形成し、このループは、パッキングされたシートから伸長する。軽鎖および重鎖の両方が３つのＣＤＲループを含む。軽鎖ループがＬ１、Ｌ２およびＬ３と呼ばれるのに対して、重鎖ループは、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３といわれる。相補性決定領域（ＣＤＲ）ループは、軽鎖Ｌ１ループ、軽鎖Ｌ２ループおよび軽鎖Ｌ３ループに対する標準構造１ならびに重鎖Ｈ１ループおよび重鎖Ｈ２ループに対する、標準構造１に対応する（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３）。重鎖Ｈ３ループは、堅いβヘアピン様コンフォメーションを有し、内部水素結合および軽鎖に対してパッキングされる２つの芳香族残基（Ｔｙｒ１０４およびＰｈｅ１０５）によって安定化される。Ｌ２の残基Ｔｈｒ５０は、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ図の非許容領域に入る主鎖二面角をとる。対応する残基についての同じ観察が、他の抗体に対してなされ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６，ｐｐ．ｌ１５３−１１５６７）、この観察が、Ｌ２ループの天然の特徴であることを示す。
【０２７１】
本発明のα１−Ｉドメインは、複合体化していないα１−Ｉドメインと非常に類似した構造を有する（ＰＤＢ登録コードｌｃｋ４；Ｎｏｌｔｅら、１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３７９−３８５；ＰＤＢ登録番号ｌｑｃ５；Ｒｉｃｈら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４９０６−２４９１３）。Ｉドメインの構造は、「二ヌクレオチド結合」または「Ｒｏｓｓｍａｎ」フォールド（Ｒａｏ＆Ｒｏｓｓｍａｎ，１９７３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６：２４１−２５６）を示し、このＩドメインは、５の平行βストランドおよび１つの小さい逆平行ストランドは、両側を７のαヘリックス全てによって囲まれている。本発明の構造の６のβストランドは、βＡ、βＢ、βＣ、βＤ、βＥ、およびβＦといわれ、７のαヘリックスは、α１、α２、α３、α４、α５、α６およびα７と呼ばれる。
【０２７２】
３つの特徴的な構造的特徴が、Ｉドメインに存在する。第１の特徴的な性質は、Ｃヘリックスと称されるβＥ−α６ループ間に挿入された小さなヘリックスの存在である。本発明における分子ＡのＣヘリックスループ（図１９）のほとんどは、弱い電子密度に関連し、このことはディスオーダーを示唆する。このことは、結晶接触またはループを安定化するＦａｂとの接触が存在しない結果であるように見える。しかし、本発明の分子Ｂの同じループ（図１９）は、良好に規定された電子密度を有し、そしてモデル中に含まれる。α１−Ｉドメインの第２の特徴的な性質は、ＭＩＤＡＳすなわちＭｅｔａｌ−Ｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ−Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｓｉｔｅであり、そこでは、金属イオンおよびリガンドが、ドメインへの結合に関与する。ＭＩＤＡＳの一部を形成する５つの主要な残基は、「ＤｘＳｘＳ−Ｔ−Ｄ」モチーフといわれる。これらの残基は、Ｉドメインの間で完全に保存されており、金属イオンを配位する（Ｇｏｔｗａｌｓら、１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：８２８０−８２８８）。本発明の結晶は、マンガンの存在下で成長し、この構造のＩドメインのＭＩＤＡＳ部位が、Ｍｎ＋２金属イオンを包含することが観察された。このマンガンイオンは、残基Ｓｅｒ１５６、Ｓｅｒ１５８およびＴｈｒ２２４の側鎖によって、直接配位される。２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図は、ＭＩＤＡＳ残基であるＡｓｐ１５４およびＡｓｐ２５７が金属イオンの水媒介性間接配位を形成する証拠がないことを示す（図２０）。しかし、水分子が明らかに存在しないことは、電子密度図の限定された分解能（２．８Å）の結果であり得る。Ｉドメインの第３の特徴は、Ｉドメインの決定された構造全てが、「オープン（ｏｐｅｎ）」および「クローズド（ｃｌｏｓｅｄ）」と呼ばれる２つのコンフォメーションの１つに属するということである。オープンコンフォメーションとクローズドコンフォメーションとの違いは、金属イオン配位の異なる様式およびＩドメインのＣ末端ヘリックスの有意な位置シフト（約１０Å）を含む。本発明の複合体中のＩドメインは、クローズドコンフォメーションである。
【０２７３】
本発明の複合体の構造において、Ｆａｂフラグメントは、フットプリント３５Åを有するＩドメインの前上面のエピトープに、３０Åまでに結合する。抗体−抗原界面における全埋没表面積は、１５３４Å２であり、他の抗体−抗原複合体の中で代表である（Ｄａｖｉｅｓら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７−１２；Ｊｏｎｅｓ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３−２０）。この表面は、特徴として２５％疎水性であり、７５％親水性である。重鎖は、複合体の埋没表面積の６５％に寄与する一方、残りの３５％は、軽鎖が寄与する。この抗体エピトープは、Ｉドメインの４のループに位置する残基からなる（Ｅｍｓｌｅｙら、２０００，Ｃｅｌｌ １０１：４７−５６）。３のループが、ＭＩＤＡＳ部位を形成する：保存されたＤＸＳＸＳ配列を含むループ１（βＡ−α１）、ＭＩＤＡＳ Ｔｈｒ２２４を含むループ２（α３−α４）およびＭＩＤＡＳ残基Ａｓｐ２５７を含むループ３（βＤ−α５）。第４のループは、Ｃヘリックスループであり、マイナーな接触にのみ関与する。
【０２７４】
抗原−抗体相互作用の重要な特徴は、抗体のＣＤＲ Ｈ３からのＡｓｐ１０１によるＭＩＤＡＳ部位金属イオンの配位である（図２０）。イオンとＡｓｐ１０１のＯδ１との間の距離は、２．４Åである。さらに、Ａｓｐ１０１のＯδ２原子は、ＩドメインのＨｉｓ２６１と相互作用する。興味深いことに、ＣＤＲ Ｈ３は、Ａｓｐ１０１に近接するいくつかのグリシン残基を含み（配列ＧＦＧＤＧＧＹ）（配列番号６２）、おそらく、金属イオンの適切な配位を許容するために十分なＣＤＲループの可撓性を可能にする。ＣＤＲ Ｈ３配列は、モノクローナル抗体中で本質的に不変であり、このモノクローナル抗体は、同じ抗原に対して惹起され、同じクラスに属することが見出された。抗体−抗原接触に関与するほとんどの抗体残基は、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３ ＣＤＲループに位置する。Ｌ１（Ａｓｎ３０）ループおよびＬ２（Ｔｙｒ４８）ループからのいくつかの残基は、マイナーなＶａｎ Ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触を形成するように見える。Ｌ３は、第１に２つの大きな疎水性残基（Ｔｒｐ９０およびＴｒｐ９５）を介して接触に寄与する。さらに、Ｌ３からのＡｓｎ９３は、ＩドメインのＧｌｎ２２３と水素結合を形成する。Ｈ２ループからのＨｉｓ５６およびＴｙｒ５８の側鎖は、Ｉドメインのループ２の主鎖原子と水素結合を形成する。Ｈ１のＡｒｇ３１は、Ｉドメインのループ４のＡｒｇ２９１と接触する。Ｉドメインのループ２からのＡｒｇ２２２は、Ｔｙｒ５８、Ｔｒｐ９５およびＡｓｎ９３を含むいくつかの抗体残基の間にはさまれる。このＡｒｇ２２２は、ＲΔＨＩドメイン中で変異された４つのうち唯一の残基であり、これは、Ｆａｂとの接触に関与する。従って、変異後の抗体の結合を回復するために働く唯一の残基である可能性がある。
【０２７５】
（ラット／ヒトキメラのα１−ＩドメインとｈＡＱＣ２ Ｆａｂフラグメントとの複合体の結晶構造と他のＩドメインの構造との比較）
キメラのＲΔＨ α１−Ｉドメインは、ラットα１−Ｉドメインと異なる４の配列を有し（ラット残基：２１７Ｇ、２１８Ｒ、２１９Ｑおよび２２２Ｌ）、ヒトα１−Ｉドメイン異なる８の配列を有し（ヒト残基：１６３Ｄ、１６６Ｔ，２１４Ｋ、２６４Ｈ，２６８Ｋ、２８８Ｓ、３２２Ｉおよび３８０Ｔ）、そしてヒトα１−Ｉドメインの結晶構造の研究において使用したクローンと異なる１０の配列を有する（クローン残基：１６３Ｄ、１６６Ｔ、１７４Ｅ，２１４Ｋ、２３０Ｉ、２６４Ｈ，２６８Ｋ、２８８Ｓ、３２２Ｉおよび３８０Ｔ）。ラットα１β１ α１−Ｉドメインのリガンド結合していない結晶構造（ＰＤＢ登録コードｌｃｋ４；Ｎｏｌｔｅら、１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５２：３７９−３８５）では、α１−Ｉドメインは、結合した金属イオンを含まず、「クローズド」コンフォメーションをとる。ヒトα１−Ｉドメインのリガンド結合していない結晶構造（登録コードｌｑｃ５；Ｒｉｃｈら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４９０６−２４９１３）では、α１−Ｉドメインは、結合したＭｇ＋２を含み、同様にクローズドコンフォメーションをとる。これら２つの構造と複合体化したキメラのα１−Ｉドメインとの重ね合わせによって、ｈＡＱＣ２抗体結合の際にマイナーなコンフォメーション変化のみが生じることを示す。ラットα１−Ｉドメインとキメラのα１−Ｉドメインとの間のｒ．ｍ．ｓ．位置偏位は、７６８の主鎖原子全てについて１．０４Åである。ヒトα１−Ｉドメインとキメラのα１−Ｉドメインとの間のｒ．ｍ．ｓ．位置偏位は、７６４の主鎖原子全てについて０．６９Åである。最大の違い（ヒトα１−Ｉドメインおよびキメラのα１−Ｉドメイン対）は、α１−Ｉドメインのループ１（残基１５４−１６１の主鎖原子についてｒ．ｍ．ｓ．偏位、１．２４Å）およびループ４（Ｃヘリックスループ）（残基２８８−２９６の主鎖原子についてｒ．ｍ．ｓ．偏位、１．５５Å）に見られる。しかし、これらの違いは、複合体のコンフォメーション変化よりむしろ二次構造エレメント全体のシフトとしてより正確に記載され得る。これらは、タンパク質の通常の範囲のコンフォメーション可撓性内に存在し得る。アミノ酸残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、およびＧｌｙ２２１（結晶での番号付け）の骨格原子についてのヒトα１−Ｉドメインとキメラのα１−Ｉドメインとの間のｒ．ｍ．ｓ．位置偏位は、０．３３Åである。アミノ酸残基Ａｓｐｌ５４、Ｓｅｒｌ５６、Ａｓｎｌ５７、Ｓｅｒｌ５８、Ｔｙｒｌ６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１、およびＬｅｕ２９４（結晶での番号付け）の骨格原子についてのラットα１−Ｉドメインとキメラのα１−Ｉドメインとの間のｒ．ｍ．ｓ．位置偏位は、０．９７Åである。
【０２７６】
Ｉドメインは、ＭＩＤＡＳ部位に結合するリガンドまたは偽リガンドの非存在下で、結晶化されたリガンド結合していないＩドメインについてのみ観察される、「クローズド」Ｉドメインコンフォメーションを維持する。ヒトＩドメインおよびキメラのＩドメインのＣ末端ヘリックス（残基３２１〜３３５の主鎖残基について計算された）のｒ．ｍ．ｓ．位置偏位は、０．６４Åである。最終精密化モデルについて計算されたシミュレーテッドアニーリングオミットマップ（ｏｍｉｔ ｍａｐ）によって、Ｃ末端ヘリックスおよび近接する構造エレメントの位置が、クローズドコンフォメーションと一致することが明確に確認される。
【０２７７】
金属イオン配位の様式へのリガンド結合の影響を調査するために、本発明の構造をリガンド結合されないα２−Ｉドメインの構造（ＰＤＢ登録コードｌａｏｘ；Ｅｍｓｌｅｙら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８５１２−２８５１７）およびコラーゲンペプチドと複合体化したα２−Ｉドメインの構造（ＰＤＢ登録コードｌｄｚｉ；Ｅｍｓｌｅｙら、２０００，Ｃｅｌｌ １０１：４７−５６）と重ね合わせた。抗体からのＡｓｐ１０１による金属イオンの配位は、コラーゲンペプチドからのグルタミン酸によるα２−Ｉドメインの金属イオンの配位に顕著に類似する。保存される別の性質は、酸性官能基とＨｉｓ２６１（α２−ＩドメインではＨｉｓ２５８）との同時相互作用である。Ｓｅｒ１５６およびＳｅｒ１５８を除くＩドメイン−Ｆａｂ複合体の全てのＭＩＤＡＳ残基は、リガンド結合されないＩドメインで観察されるコンフォメーションに非常に類似するコンフォメーションをとる。対照的に、Ｓｅｒ１５６およびＳｅｒ１５８の側鎖、ならびに金属は、リガンド結合したＩドメインの、コンフォメーションに類似するコンフォメーションをとる。Ａｓｐ１０１による金属イオンの配位によって、イオンが、リガンド結合されていない状態で観察される位置および配位距離を維持し得ないことは明らかである。従って、金属イオンは、Ａｓｐ２５７によって直接は配位されず、事実、イオンが高い電子親和性を維持することを可能にする。
【０２７８】
（生物学的推測）
本発明において、Ａｓｐ２５７による金属の直接の配位はなく、このことは、クローズドコンフォメーション（リガンド結合なし）とオープンコンフォメーション（リガンド結合あり）との間のエネルギー障壁を下げることによって、高い親和性の結合を可能にし得る。しかし、抗体からのアスパラギン酸による金属の配位は、本発明におけるＩドメインに、オープンコンフォメーションを誘導するのに十分ではない。Ｉドメイン−Ｆａｂ複合体構造は、クローズドコンフォメーションをとるＩドメインへの強い結合を有することが可能であること、およびリガンドからの酸性残基による金属イオンの配位が、必要であり得るが、オープン状態へのコンフォメーション変化を誘導するのに十分ではあり得ないことを示す。抗体の結合は、インテグリンの低親和性状態を安定化し、そしてコラーゲンに結合するインテグリンを伴ってアウトサイドインシグナル伝達を防ぐことが期待される。
【０２７９】
前述の発明は、理解を明瞭にする目的のための例示および実施例によっていくらか詳細に記載されるが、いくらかの変更および改変が実施されることは当業者に明らかである。従って、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１Ａ】図１は、活性化白血球におけるコラーゲン結合性インテグリンα１β１およびコラーゲン結合性インテグリンα２β１を示す。（Ａ）。ＩＬ−２活性化脾細胞（ｄ１１）におけるα１インテグリンおよびα２β１インテグリンの発現のフローサイトメトリー分析。細胞を、抗α１ ｍＡｂ、抗α２ ｍＡｂ、または非結合コントロールｍＡｂ（グレーの線）のいずれか、次いで、ＦＩＴＣ−抗ハムスター免疫グロブリンで標識した。
【図１Ｂ】図１は、活性化白血球におけるコラーゲン結合性インテグリンα１β１およびコラーゲン結合性インテグリンα２β１を示す。（Ｂ）コラーゲンへの白血球の接着に対する抗α１ ｍＡｂおよび抗α２−ｍＡｂの効果。１０５ＩＬ−２活性化脾細胞を、１５分間、示したｍＡｂで処理し、その後、ＩＶ型またはＩ型のいずれかのコラーゲンをコーティングしたウェル上に３７℃にて１時間プレートした。接着を実施例１に例示するように計算し、そしてコントロールｍＡｂ処理細胞に対する接着の％として表した。接着アッセイを三連で行い、そして、少なくとも３つの独立した実験を行った。１つの例示的な実験を示す。
【図２】図２は、遅発型過敏症のエフェクターフェーズ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｈａｓｅ）に対する抗インテグリンｍＡｂの効果を示す。ＳＲＢＣ感作マウスに、ＳＲＢＣチャレンジの１時間前に、示したｍＡｂをｉ．ｐ．注射した。足蹠の厚さを、抗原チャレンジの２０時間後に測定し、そして結果を、実施例２に示すように足蹠の厚さ±ＳＥＭの増加％として示した。これらのデータは、ｎ＝７９（ＰＢＳ）、６８（コントロールハムスターＩｇ）、６８（抗α１）。２９（抗α２）、１８（抗α１＋抗α２）、４５（抗α４）、１８（抗α５）、２０（抗α６）、および１０（抗β１）を用いた、８つの実験の概要を表す。用いたｍＡｂは、以下であった：Ｈａ４／８（コントロールハムスターＩｇグループ２）、Ｈａ３１／８（抗α１）、Ｈａｌ／２９（抗α２）、ＰＳ／２（抗α４）、５Ｈ１０−２７（抗α５）、ＧｏＨ３（抗α６）、およびＨＭβ１−１（抗β１）。
【図３】図３は、接触型過敏症のエフェクターフェーズに対する抗インテグリンｍＡｂの効果を示す。ＦＩＴＣ感作マウスに、ＦＩＴＣチャレンジの４時間前に、示したｍＡｂをｉ．ｐ．注射した。耳の厚さを、ベースラインおよび２４時間後に測定し、そして結果を、実施例３に示すように、耳の厚さ±ＳＥＭの増加％として示した。これらのデータは、ｎ＝７４（ＰＢＳ）、６０（コントロールハムスターＩｇ）、２６（抗ＩＣＡＭ−１）、４４（抗α１）、４４（抗α２）、３８（抗α１＋抗α２）、３６（抗α４）、１６（抗α５）、２６（抗α４＋抗α５）、２４（抗α６）、および２２（抗β１）を用いた、９つの実験の概要を表す。用いたハムスターｍＡｂは、以下であった：Ｈａ４／８（コントロールハムスターＩｇグループ２）、Ｈａ３１／８（抗α１）、Ｈａｌ／２９（抗α２）、ＨＭβ１−１（抗β１）、３Ｅ２（抗ＩＣＡＭ−１）。用いたラットｍＡｂは、以下であった：Ｒ３５−９５およびＲ３５−３８（それぞれ、コントロールラットＩｇＧ２ａおよびコントロールラットＩｇＧ２ｂ）、ＰＳ／２（抗α４）、５Ｈ１０−２７（抗α５）、ＧｏＨ３（抗α６）。
【図４】図４は、野生型マウスと比較したα１欠損マウスにおける接触過敏性応答を示す。ＦＩＴＣ感作マウスに、ＦＩＴＣチャレンジの４時間前に、示されるｍＡｂをｉ．ｐ．注射した。耳の厚さを、ベースラインおよび２４時間後で測定した。結果が、実施例４において示されるような耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示される。１条件当たり４〜５匹のマウスのグループを使用した。すべての実験は、最低限３回実施した。１つの代表的実験が示される。
【図５】図５は、ハズ油誘導性非特異的炎症に対する抗αＩ ｍＡＢおよび抗α２ ｍＡｂの効果を示す。マウスに、ハズ油を耳に塗布する４時間前に、示されるｍＡｂをｉ．ｐ．注射した。耳の厚さを、ベースラインおよび２４時間後で測定した。結果が、実施例５において示されるような耳の厚さの増加％±ＳＥＭとして示される。１条件当たり４〜５匹のマウスのグループを使用した。すべての実験は、最低限３回実施した。１つの代表的実験が示される。
【図６】図６は、コラーゲンｍＡｂ誘導性関節炎における抗αＩ ｍＡｂおよびα２ ｍＡｂの効果を示す。マウスに、０日目に抗コラーゲンｍＡｂをｉ．ｐ．注射し、その後、３日目にＬＰＳをｉ．ｐ．注射した。マウスに、０日目から開始して３日目ごとに、示されるｍＡｂをｉ．ｐ．注射した。臨床的関節炎が、ＬＰＳ注射の２〜３日後に明白であり、数週間継続した。各肢を、実施例６に示されるように３日目ごとに０〜４スケールに対して評価した。結果を、４肢すべての９日目と１５日目との間の平均関節炎スコア（±ＳＥＭ）として表す。これらのデータは、４つの実験の要約を示し、各実験は、１条件あたり３〜４匹のマウスのグループからなる。
【図７】図７は、コラーゲンｍＡｂ誘導性関節炎における抗α１ ｍＡｂおよび抗α２ ｍＡｂの効果を示す。Ａ．抗α１ ｍＡｂまたは抗α２ ｍＡｂのいずれかでマウスを予防処置すると、関節炎スコアを減少させる。マウスを、０日目に抗コラーゲンｍＡｂで処理し、そして３日目にＬＰＳで処理した。関節炎が、６日目までに明白であり、数週間継続した。マウスを、０日目に開始して３日目ごとに、示されたｍＡｂで処理した。各肢を評価して、３日目ごとに０〜４スケール上でスコア付けした。結果を、４肢すべての９日目と１５日目との間の平均関節炎スコア（±ＳＥＭ）として表す（最大スコア１６）。１条件あたり４匹のマウスのグループを使用した；平均１２回の実験を示す。Ｂ．α１欠損マウスは、抗α１ ｍＡｂで処理した野生型マウスと匹敵する、減少した関節炎スコアを有する。実験の詳細およびスコア付けは、上記に概略した通りである。１条件あたり４匹のマウスのグループを使用した。平均２回の実験を示す。
【図８】図８は、関節炎の発症が、リンパ球の非存在下で遅延され、そして抗α１ ｍＡｂによる関節炎の阻害が、リンパ球の非存在下で生じることを示す。野生型Ｂ６，１２９マウスまたはＲＡＧ−１欠損Ｂ６，１２９マウスを、０日目に抗コラーゲンｍＡｂで処理し、そして３日目にＬＰＳで処理した。関節炎が、６日目までに明白であり、数週間継続した。マウスを、０日目に開始して３日目ごとに、示されたｍＡｂで処理した。各肢を評価して、３日目ごとに０〜４スケール上でスコア付けした。結果を、１肢あたりの平均関節炎スコアとして表す（最大スコア４）。１条件あたり４匹のマウスのグループを使用した。
【図９】図９は、関節炎の抗α１ ｍＡｂ阻害の用量応答を示す。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目に抗コラーゲンｍＡｂで処理し、そして３日目にＬＰＳで処理した。関節炎が、６日目までに明白であり、数週間継続した。マウスを、０日目に開始して３日目ごとに、示された用量のＨａ４／８（アイソタイプコントロール）ｍＡｂまたはＨａ３１／８（抗α１）ｍＡｂのいずれかを用いてｉ．ｐ．処理した。各肢を評価して、３日目ごとに０〜４スケール上でスコア付けした。結果を、１肢あたりの平均関節炎スコアとして表す（最大スコア４）。１条件あたり４匹のマウスのグループを使用した。
【図１０】図１０は、抗α１ ｍＡｂでの治療処置が、関節炎スコアを減少し得ることを示す。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目に抗コラーゲンｍＡｂで処理し、そして３日目にＬＰＳで処理した。関節炎が、６日目までに明白であり、数週間継続した。マウスを、４日目に開始して３日目ごとに、ｍＡｂ（２５０μｇ）またはＩｇ融合タンパク質（２００μｇ）を用いてｉ．ｐ．処理した。マウスに、ｍＡｂ（Ｈａ４／８アイソタイプコントロールまたはＨａ３１／８抗α１）、Ｉｇ融合タンパク質（アイソタイプコントロールＩｇまたはＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ）、または両方（２５０μｇ Ｈａ３１／８および２００μｇ ＴＮＦ−Ｒ５５−Ｉｇ）の組み合わせのいずれかを与えた。各肢を評価して、３日目ごとに０〜４スケール上でスコア付けした。結果を、１肢あたりの平均関節炎スコアとして表す（最大スコア４）。１条件あたり４匹のマウスのグループを使用した。
【図１１】図１１は、抗α１ ＩドメインブロックｍＡｂについてのエピトープの位置を示す。Ａ．ラットα１−Ｉドメインのアミノ酸配列（上段；配列番号６３）およびヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列（下段；配列番号６４の残基９１〜９４）を示す。ＭＩＤＡＳ（金属イオン依存性接着部位）モチーフを含む残基が、太字で示される。対応するラット残基（ＲΔＨ）を置換したヒトアミノ酸が、ラット配列の下に四角で囲んだ領域中に示される。明確にするために、本文中での残基の番号付けは、（例えば、結晶番号付けとして）他のように示されない限り、この図を参照する。Ｂ．漸増濃度のｍＡｂ ＡＪＨ１０（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３５８０；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡに、２００１年８月２日付けで、ブダペスト条約の下で寄託された）を、３０μｇ／ｍｌのヒトα１−Ｉドメイン（円形）、ラットα１−Ｉドメイン（三角形）またはＲΔＨα１−Ｉドメイン（四角形）でコートしたプレートに結合させた。示されるデータは、３つの実験の代表である。
【図１２】図１２は、ヒトα１−Ｉドメインのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。
【図１３】図１３は、α１−Ｉドメインに対するブロックｍＡｂの同定を示す。Ａ．漸増濃度のｍＡｂ ＡＥＦ３（三角形）またはｍＡｂ ＡＪＨ１０（円形）を、３０μｇ／ｍｌのα１−Ｉドメインでコートしたプレートに結合させた。Ｂ．このα１−Ｉドメインを、漸増濃度のｍＡｂ ＡＪＨ１０（菱形）またはｍＡｂ ＢＧＣ５（四角形）で処理し、コラーゲンＩＶ（２μｇ／ｍｌ）でコートしたプレートに結合させた。Ｃ．Ｋ５６２−α１細胞を、漸増濃度のｍＡｂ ＡＥＦ３（三角形）またはｍＡｂ ＡＪＨ１０（円形）で処理し、コラーゲンＩＶ（５μｇ／ｍｌ）でコートしたプレートに結合させた。各ウェルに添加した細胞の４５〜５０％が、コラーゲンＩＶに接着した。示されるデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図１４】図１４は、蛍光活性化細胞分離装置（ＦＡＣＳ）により分析したブロックｍＡｂの種交差反応性を示す。ウサギ血管平滑筋細胞を、ｍＡｂ ＡＪＨ１０（下図）またはマウスＩｇＧコントロール（上図）のいずれかとともにインキュベートし、そして蛍光活性化細胞分離装置（ＦＡＣＳ）により分析した。
【図１５】図１５は、α１−Ｉドメインがコラーゲンに結合することを示す。Ａ．漸増濃度のヒトα１−Ｉドメインを、１μｇ／ｍｌのコラーゲンＩ（四角形）またはコラーゲンＩＶ（円形）で以前にコートしたプレートに結合させた。示される値は、ＢＳＡへのバックグラウンド結合について補正してある。Ｂ．２μｇ／ｍｌのヒトα１−Ｉドメインを、漸増濃度の抗ヒトα１インテグリン抗体５Ｅ８Ｄ９（四角形）または抗ヒトα２インテグリン抗体Ａ２ＩＩＥ１０（円形）と混合し、その後、１μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶで以前にコートしたプレートに結合させた。Ｃ．プレートを、１μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶまたは３％ＢＳＡでコートした。その後、α１−Ｉドメイン（２μｇ／ｍｌ）を、１ｍＭ Ｍｎ２＋、１ｍＭ Ｍｇ２＋、または５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で、コートしたプレートに結合させた。示されるデータは、３つの独立した実験を代表する。
【図１６】図１６は、ヒト化ＡＱＣ２形態の特徴付けを示す。ｍＡＱＣ２（三角形）、ｃｈＡＱＣ２（円形）、ｈＡＱＣ２（逆三角形）およびｈＡＱＣ２’（四角形）を評価した。
【０２８１】
Ａ．ＩＶ型コラーゲンへのＶＬＡ−１結合の阻害。
【０２８２】
Ｂ．ＩＶ型コラーゲンへのα１−Ｉドメイン結合の阻害。
【０２８３】
Ｃ．固定したα１−Ｉドメインへの結合。
【０２８４】
Ｄ．固定したα１−Ｉドメインへの結合についてのビオチン化ｍＡＱＣ２との競合。
【図１７】図１７は、ＦＡＣＳによるヒト化ＡＱＣ２形態の特徴付けを示す。
【図１８】図１８は、ＦＡＣＳによるヒト化ＡＱＣ２形態の特徴付けを示す。
【図１９】図１９は、α１−Ｉドメイン／Ｆａｂ複合体についての原子構造座標を示し、これは、その複合体の結晶からのＸ線結晶学によってＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）形式で誘導される。非対称性単位での２つの複合体の座標が、以下のように列挙される。
【０２８５】
複合体１：分子Ａ＝インテグリンのＩドメイン
分子Ｈ＝ｈＡＱＣ２ Ｆａｂの重鎖
分子Ｌ＝ｈＡＱＣ２ Ｆａｂの軽鎖
分子Ｍ＝Ｍｎ２＋
複合体２：分子Ｂ＝インテグリンのＩドメイン
分子Ｘ＝ｈＡＱＣ２ Ｆａｂの重鎖
分子Ｙ＝ｈＡＱＣ２ Ｆａｂの軽鎖
分子Ｍ＝Ｍｎ２＋。
【図２０】図２０は、Ｉドメイン−Ｆａｂ複合体を示す。Ａ．Ｉドメイン−Ｆａｂ複合体のリボン・ダイヤグラム。Ｉドメイン、ならびに抗体重鎖および抗体軽鎖を、標識している。Ｍｎ２＋イオンは、白色の球である。Ｂ．Ａｓｐ１０１（結晶番号付け）による金属イオン（白色球）の配位を示すＭＩＤＡＳ（金属イオン依存性接着部位）部位のクローズアップ。タンパク質骨格がリボンとして示され、そして側鎖が、球棒表示で示される。円柱は、金属イオンとタンパク質原子との間の相互作用を示す。細い線は、Ｈ結合を示す。図２０は、ソフトウェアプログラムＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，１９９１，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２４：９５８−９６１）を用いて作成した。
【図２１】図２１は、図２２および図２３の記憶媒体によりコードされる指示を実行するために使用されるシステムのダイヤグラムを示す。
【図２２】図２２は、磁気記憶媒体の断面を示す。
【図２３】図２３は、光学式読み取り可能なデータ記憶媒体の断面を示す。

Claims (42)

  1. 抗ＶＬＡ−１抗体であって、該ＶＬＡ−１抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３３、４９〜５５および８８〜９６によって規定され、そして該ＶＬＡ−１抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５および９８〜１０７によって規定される、抗ＶＬＡ−１抗体。
  2. 請求項１に記載の抗体であって、該抗体は、配列番号１の軽鎖可変ドメイン配列および配列番号２の重鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
  3. 請求項１に記載の抗体であって、該抗体は、ハイブリドーマｍＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７３）によって産生される抗体と同一の重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、抗体。
  4. ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
  5. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体は、その軽鎖内の以下の残基：Ｑ１、Ｌ４、Ｐ４６、Ｗ４７およびＹ７１の少なくとも１つを含むか；またはその重鎖内の以下の残基：Ｄ１、Ｖ１２、Ｓ２８、Ｆ２９、Ａ４９、Ｔ９３、Ｒ９４（Ｋａｂａｔ番号付け規約）の少なくとも１つを含む、抗体。
  6. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体は、配列番号３のアミノ酸残基１〜１０６によって規定される軽鎖可変ドメイン配列、および配列番号４のアミノ酸残基１〜１１８によって規定される重鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
  7. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体は、細胞株ｈＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７５）によって産生される抗体と同一の重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、抗体。
  8. 請求項４に記載の抗体であって、前記重鎖は、残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２（ＥＵ番号付け系）からなる群より選択されるアミノ酸残基の１つ以上で変異されており、これにより、エフェクター機能に変更を生じるが改変されていない抗体と比較してＶＬＡ−１に結合し続ける、抗体。
  9. 請求項８に記載の抗体であって、該抗体は、改変されていない抗体と比較してその重鎖内に変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け系）を含む、抗体。
  10. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体は、細胞株ｈｓＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３３５６）によって産生される抗体と同一の重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、抗体。
  11. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体は、グリコシル化部位であるアミノ酸残基で変異されており、これによりグリコシル化部位を排除する、抗体。
  12. 請求項１１に記載の抗体であって、該抗体は、その重鎖内に変異Ｎ２９７Ｑ（ＥＵ番号付け系）を含む、抗体。
  13. 請求項４に記載の抗体であって、該抗体は、細胞株ｈａＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７４）によって産生される抗体と同一の重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、抗体。
  14. 請求項４〜１３のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
  15. 配列番号１に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  16. 配列番号２に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  17. ハイブリドーマｍＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７３）によって産生される抗体の軽鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  18. ハイブリドーマｍＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７３）によって産生される抗体の重鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  19. 細胞株ｈＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７５）によって産生される抗体の軽鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  20. 細胞株ｈＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７５）によって産生される抗体の重鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  21. 細胞株ｈａＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７４）によって産生される抗体の重鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  22. 細胞株ｈｓＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３３５６）によって産生される抗体の重鎖に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  23. 配列番号３の残基１〜１０６に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  24. 配列番号４の残基１〜１１８に対するコード配列を含む、単離された核酸。
  25. ＶＬＡ−１によって媒介される免疫学的障害を有する被験体を処理する方法であって、請求項１４に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
  26. 組織中のＶＬＡ−１レベルを決定する方法であって、該組織を請求項１に記載の抗体と接触させる工程、および該抗体の該組織に対する結合を決定し、これにより該組織中のＶＬＡ−１レベルを決定する工程、を包含する、方法。
  27. ハイブリドーマｍＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７３）の細胞。
  28. 細胞株ｈＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７５）の細胞。
  29. 細胞株ｈａＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３２７４）の細胞。
  30. 細胞株ｈｓＡＱＣ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ３３５６）の細胞。
  31. （ａ）分子複合体であって、図１９に記載される、α１β１インテグリンＲΔＨのキメラＩドメインとヒト化抗体ｈＡＱＣ２との複合体の構造座標のセットによって規定される、分子複合体；または
    （ｂ）該分子複合体のホモログであって、該分子複合体の骨格原子から０．６５Å以下の根平均２乗偏差を有する、ホモログ、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載される、該複合体の構造座標の少なくとも一部を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  32. （ａ）ｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標によって規定される第１の結合部位であって、該結合部位は、図１９に記載される軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１の少なくとも７つを含む、結合部位；
    を含む、分子または分子複合体、または
    （ｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、該ホモログは、該ｈＡＱＣ２アミノ酸の骨格原子から１．１０Å以下の根平均２乗偏差を有する第２の結合部位を含む、ホモログ、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載される軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１の少なくとも７つを含む群より選択されるｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  33. （ａ）ｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標によって規定される第１の結合部位であって、該結合部位は、図１９に記載される軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１の少なくとも７つを含む、結合部位；または
    （ｂ）該ｈＡＱＣ２アミノ酸の骨格原子から１．１０Å以下の根平均２乗偏差を有する、ホモログの第２の結合部位、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載される軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１の少なくとも７つを含むｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  34. インテグリンＩドメインのインヒビターを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）図１９に記載される軽鎖残基Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４８、Ｔｒｐ９０、Ｓｅｒ９１、Ａｓｎ９３およびＴｒｐ９５、ならびに重鎖残基Ｓｅｒ３０、Ａｒｇ３１、Ｔｒｐ４７、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５３、Ｈｉｓ５６、Ｔｙｒ５８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００およびＡｓｐ１０１の少なくとも７つを含むｈＡＱＣ２アミノ酸の構造座標、または、該ｈＡＱＣ２アミノ酸の骨格原子から±１．１０Å以下の根平均２乗偏差、を使用して、結合部位の３次元構造を作成する、工程；
    （ｂ）潜在的アンタゴニストを設計または選択するために該３次元構造を使用する、工程；
    （ｃ）該潜在的アンタゴニストを合成する、工程；そして
    （ｄ）該潜在的アンタゴニストがｈＡＱＣ２と相互作用する能力を決定するために、該潜在的アンタゴニストをｈＡＱＣ２と接触させる工程であって、該潜在的アンタゴニストがｈＡＱＣ２と相互作用する能力は、該潜在的アンタゴニストが該Ｉドメインのインヒビターであることを示す、工程
    を包含する、方法。
  35. 請求項３４に記載の方法によって同定された、インテグリンＩドメインのインヒビター。
  36. （ａ）図１９に記載されるＩドメインアミノ酸残基Ａｓｎ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１およびＬｅｕ２９４の構造座標によって規定される、第１の結合部位を含む、分子または分子複合体、または
    （ｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、該ホモログは、該Ｉドメインアミノ酸の骨格原子から０．９２Å以下の根平均２乗偏差を有する第２の結合部位を含む、ホモログ、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載されるＩドメインアミノ酸残基Ａｓｎ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１およびＬｅｕ２９４の構造座標を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  37. （ａ）図１９に記載されるＩドメインアミノ酸残基Ａｓｎ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１およびＬｅｕ２９４の構造座標によって規定される第１の結合部位；または
    （ｂ）該Ｉドメインアミノ酸の骨格原子から０．９２Å以下の根平均２乗偏差を有する、ホモログの第２の結合部位、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載されるＩドメインアミノ酸残基Ａｓｎ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１およびＬｅｕ２９４の構造座標を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  38. （ａ）図１９に記載されるＧｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０およびＧｌｙ２２１の少なくとも３つの残基を含むＩドメインアミノ酸の構造座標によって規定される、第１の結合部位を含む、分子または分子複合体、または
    （ｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、該ホモログは、該Ｉドメインアミノ酸の骨格原子から０．３０Å以下の根平均２乗偏差を有する第２の結合部位を含む、ホモログ、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載されるＧｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０およびＧｌｙ２２１の少なくとも３つの残基を含むＩドメインアミノ酸の構造座標を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  39. （ａ）図１９に記載されるＧｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０およびＧｌｙ２２１の少なくとも３つの残基を含むＩドメインアミノ酸の構造座標によって規定される第１の結合部位；または
    （ｂ）該Ｉドメインアミノ酸の骨格原子から０．３０Å以下の根平均２乗偏差を有する、ホモログの第２の結合部位、
    の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、
    ここで、該コンピュータは、以下：
    （ｉ）コード化された機械読み取り可能なデータを有するデータ格納材料を含む、機械読み取り可能なデータ格納媒体であって、該データは、図１９に記載されるＧｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０およびＧｌｙ２２１の少なくとも３つの残基を含むＩドメインアミノ酸の構造座標を含む、媒体；
    （ｉｉ）該機械読み取り可能なデータを処理するための命令を格納するための、ワーキングメモリ；
    （ｉｉｉ）該３次元表示に該機械読み取り可能なデータを処理するために該機械読み取り可能なデータ格納媒体を処理するための、該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能なデータ格納媒体に連結した、中央処理装置；ならびに
    （ｉｖ）該３次元表示を表示するための、該中央処理装置に連結した、ディスプレイ、
    を備える、コンピュータ。
  40. インテグリンＩドメインのインヒビターを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）図１９に記載されるＩドメインアミノ酸残基Ａｓｐ１５４、Ｓｅｒ１５６、Ａｓｎ１５７、Ｓｅｒ１５８、Ｔｙｒ１６０、Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０、Ｇｌｙ２２１、Ａｒｇ２２２、Ｇｌｎ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２６１、Ａｓｎ２６３、Ａｒｇ２９１およびＬｅｕ２９４の構造座標を使用して、結合部位の３次元構造を作成する、工程；
    （ｂ）潜在的アンタゴニストを設計または選択するために該３次元構造を使用する、工程；
    （ｃ）該潜在的アンタゴニストを合成する、工程；そして
    （ｄ）該潜在的アンタゴニストがＩドメインと相互作用する能力を決定するために、該潜在的アンタゴニストをＩドメインと接触させる工程であって、該潜在的アンタゴニストがＩドメインと相互作用する能力は、該潜在的アンタゴニストが該Ｉドメインのインヒビターであることを示す、工程
    を包含する、方法。
  41. インテグリンＩドメインのインヒビターを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）図１９に記載される残基Ｇｌｕ１９２、Ｇｌｎ２１８、Ａｒｇ２１９、Ｇｌｙ２２０およびＧｌｙ２２１を含む少なくとも３つのＩドメインアミノ酸の構造座標、または、該Ｉドメインアミノ酸の骨格原子から±０．３０Å以下の根平均２乗偏差、を使用して、結合部位の３次元構造を作成する、工程；
    （ｂ）潜在的アンタゴニストを設計または選択するために該３次元構造を使用する、工程；
    （ｃ）該潜在的アンタゴニストを合成する、工程；そして
    （ｄ）該潜在的アンタゴニストがＩドメインと相互作用する能力を決定するために、該潜在的アンタゴニストをＩドメインと接触させる工程であって、該潜在的アンタゴニストがＩドメインと相互作用する能力は、該潜在的アンタゴニストが該Ｉドメインのインヒビターであることを示す、工程
    を包含する、方法。
  42. 請求項４０または４１に記載の方法によって同定された、インテグリンＩドメインのインヒビター。
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