JPH08131185A - マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH08131185A JPH08131185A JP6278825A JP27882594A JPH08131185A JP H08131185 A JPH08131185 A JP H08131185A JP 6278825 A JP6278825 A JP 6278825A JP 27882594 A JP27882594 A JP 27882594A JP H08131185 A JPH08131185 A JP H08131185A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 マウスの細胞表面分子であるＶＬＡ−１分子
に特異的に反応するモノクローナル抗体およびその活性
フラグメント、該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマおよび該モノクローナル抗体の製造方法が提供
される。 【効果】 本発明のＶＬＡ−１分子に対するモノクロー
ナル抗体およびその活性フラグメントは、ＶＬＡ−１発
現細胞とそのリガンドとの相互作用の解析を行う際に有
用であり、また、免疫治療や診断用としても有用であ
る。
に特異的に反応するモノクローナル抗体およびその活性
フラグメント、該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマおよび該モノクローナル抗体の製造方法が提供
される。 【効果】 本発明のＶＬＡ−１分子に対するモノクロー
ナル抗体およびその活性フラグメントは、ＶＬＡ−１発
現細胞とそのリガンドとの相互作用の解析を行う際に有
用であり、また、免疫治療や診断用としても有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マウスの細胞表面分子
であるＶＬＡ−１分子に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体およびその活性フラグメント、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ、および該モノクローナ
ル抗体の製造方法、ならびに免疫関連細胞の解析におけ
る該モノクローナル抗体およびその活性フラグメントの
使用に関するものである。ここで活性フラグメントと
は、抗原抗体反応活性を有する抗体フラグメントを指
し、具体的にはＦ(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆvおよび組換
えＦv体などである。
であるＶＬＡ−１分子に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体およびその活性フラグメント、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ、および該モノクローナ
ル抗体の製造方法、ならびに免疫関連細胞の解析におけ
る該モノクローナル抗体およびその活性フラグメントの
使用に関するものである。ここで活性フラグメントと
は、抗原抗体反応活性を有する抗体フラグメントを指
し、具体的にはＦ(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆvおよび組換
えＦv体などである。
【０００２】
【従来の技術】免疫の応答機構は、多種類の細胞および
調節因子が複雑に相互作用することにより機能してい
る。この機構を解明することにより、免疫関係疾患の発
症機構が明らかになり、その治療への応用が可能になる
ものと期待される。免疫応答の第１段階は、免疫系の細
胞が互いに結合することである。次いで、結合によるシ
グナル伝達によって互いの細胞が活性化され、種々の調
節因子の産生や新たな細胞表面分子の発現が惹起され
る。この第１段階における細胞間の結合に重要な役割を
担うのが、接着分子と称される細胞表面上の機能分子で
ある。また、これら細胞接着分子は、細胞の結合に寄与
することにより、細胞の発生、分化および増殖、炎症お
よび創傷の治癒、血液凝固、あるいは癌転移など、生体
内の種々の重要な現象に深く関与していることが明らか
にされている。これら細胞接着分子についての解説は、
FASEB Journal, vol.4, 1990やAnnual Review ofImmuno
logy, vol.8, 1990などの多くの文献に記載されてい
る。
調節因子が複雑に相互作用することにより機能してい
る。この機構を解明することにより、免疫関係疾患の発
症機構が明らかになり、その治療への応用が可能になる
ものと期待される。免疫応答の第１段階は、免疫系の細
胞が互いに結合することである。次いで、結合によるシ
グナル伝達によって互いの細胞が活性化され、種々の調
節因子の産生や新たな細胞表面分子の発現が惹起され
る。この第１段階における細胞間の結合に重要な役割を
担うのが、接着分子と称される細胞表面上の機能分子で
ある。また、これら細胞接着分子は、細胞の結合に寄与
することにより、細胞の発生、分化および増殖、炎症お
よび創傷の治癒、血液凝固、あるいは癌転移など、生体
内の種々の重要な現象に深く関与していることが明らか
にされている。これら細胞接着分子についての解説は、
FASEB Journal, vol.4, 1990やAnnual Review ofImmuno
logy, vol.8, 1990などの多くの文献に記載されてい
る。
【０００３】細胞接着分子には、細胞間の相互作用に関
与するものと、細胞と細胞外マトリックス(ＥＣＭ)の相
互作用に関与するものがある。細胞外マトリックスとは
細胞外の空間に存在する巨大分子の複雑な網目構造であ
り、周囲の細胞から分泌された多糖類とタンパク質で構
成される。その構成成分には、フィブロネクチン(Ｆ
Ｎ)、ラミニン(ＬＮ)、コラーゲン(ＣＬ)、フィブリノ
ーゲン(ＦＢ)、ビトロネクチン、テネイシンなどが含ま
れる。この内、接着には主としてＦＮと基底膜のＬＮが
関与している。
与するものと、細胞と細胞外マトリックス(ＥＣＭ)の相
互作用に関与するものがある。細胞外マトリックスとは
細胞外の空間に存在する巨大分子の複雑な網目構造であ
り、周囲の細胞から分泌された多糖類とタンパク質で構
成される。その構成成分には、フィブロネクチン(Ｆ
Ｎ)、ラミニン(ＬＮ)、コラーゲン(ＣＬ)、フィブリノ
ーゲン(ＦＢ)、ビトロネクチン、テネイシンなどが含ま
れる。この内、接着には主としてＦＮと基底膜のＬＮが
関与している。
【０００４】例えば、Ｔ細胞とＢ細胞の主要な免疫応答
はＴ−Ｂ細胞結合により行われ、この結合は、Ｔ細胞表
面のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)／ＣＤ３複合体とＢ細胞表面
の抗原／クラスII ＭＨＣ複合体の結合を介する。しか
し、この複合体を介する結合はＴ−Ｂ細胞間で機能的な
相互作用を起こさせる程には十分に強くないため、細胞
表面に発現される細胞接着分子が結合の強化あるいは安
定化に寄与していることが知られている。このような免
疫細胞相互の安定かつ機能的な結合には、細胞−細胞の
結合に関与する接着分子だけでなく細胞−ＥＣＭの結合
に関与する接着分子も関与している。
はＴ−Ｂ細胞結合により行われ、この結合は、Ｔ細胞表
面のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)／ＣＤ３複合体とＢ細胞表面
の抗原／クラスII ＭＨＣ複合体の結合を介する。しか
し、この複合体を介する結合はＴ−Ｂ細胞間で機能的な
相互作用を起こさせる程には十分に強くないため、細胞
表面に発現される細胞接着分子が結合の強化あるいは安
定化に寄与していることが知られている。このような免
疫細胞相互の安定かつ機能的な結合には、細胞−細胞の
結合に関与する接着分子だけでなく細胞−ＥＣＭの結合
に関与する接着分子も関与している。
【０００５】また、癌の転移においては、原発巣から循
環系に移行した癌細胞が遠隔臓器に転移する過程におい
て、様々な細胞間および細胞−ＥＣＭ間の接着分子が関
与していることが示唆されている[Annual Review 免
疫：VII. 腫瘍免疫、160-169頁(1992)、中外医学社]。
特に、癌細胞による基底層(膜)や間質への侵潤には、癌
細胞とＥＣＭ(ＦＮやＬＮ)との結合が大きな役割を果た
しており、細胞表面のＥＣＭ受容体の機能の解明によっ
て癌転移の機構が明らかになることが期待されている。
環系に移行した癌細胞が遠隔臓器に転移する過程におい
て、様々な細胞間および細胞−ＥＣＭ間の接着分子が関
与していることが示唆されている[Annual Review 免
疫：VII. 腫瘍免疫、160-169頁(1992)、中外医学社]。
特に、癌細胞による基底層(膜)や間質への侵潤には、癌
細胞とＥＣＭ(ＦＮやＬＮ)との結合が大きな役割を果た
しており、細胞表面のＥＣＭ受容体の機能の解明によっ
て癌転移の機構が明らかになることが期待されている。
【０００６】細胞接着分子は、その類似した構造的特徴
から５種類のファミリーに分類されている。その中の１
つであるインテグリンファミリーはＥＣＭの受容体の１
つであり、ＥＣＭと細胞内部にある細胞骨格とを連結す
る膜貫通型の糖タンパク質である。このインテグリンフ
ァミリーはαおよびβポリペプチド鎖が非共有結合によ
って結合したヘテロダイマーであり、β鎖の相違に基づ
いてさらに３つのサブファミリー(β1、β2、β3)に大
別される。即ち、それぞれのサブファミリーの構成員
は、異なるα鎖と共通のβ鎖を有している。β1サブフ
ァミリーはＶＬＡ(very late activation antigen)とも
呼ばれ、互いにホモロジーを有するが異なっているα鎖
(α1〜α6)と共通のβ1鎖からなる(ＶＬＡ−１〜ＶＬＡ
−６)。一方、β2サブファミリーには白血球細胞間の接
着分子として知られるＬＦＡ−１が含まれ、β3サブフ
ァミリーにはＶＮ受容体および血小板表面のgpIIb／III
a複合体が含まれる。
から５種類のファミリーに分類されている。その中の１
つであるインテグリンファミリーはＥＣＭの受容体の１
つであり、ＥＣＭと細胞内部にある細胞骨格とを連結す
る膜貫通型の糖タンパク質である。このインテグリンフ
ァミリーはαおよびβポリペプチド鎖が非共有結合によ
って結合したヘテロダイマーであり、β鎖の相違に基づ
いてさらに３つのサブファミリー(β1、β2、β3)に大
別される。即ち、それぞれのサブファミリーの構成員
は、異なるα鎖と共通のβ鎖を有している。β1サブフ
ァミリーはＶＬＡ(very late activation antigen)とも
呼ばれ、互いにホモロジーを有するが異なっているα鎖
(α1〜α6)と共通のβ1鎖からなる(ＶＬＡ−１〜ＶＬＡ
−６)。一方、β2サブファミリーには白血球細胞間の接
着分子として知られるＬＦＡ−１が含まれ、β3サブフ
ァミリーにはＶＮ受容体および血小板表面のgpIIb／III
a複合体が含まれる。
【０００７】ＶＬＡ-１はα1鎖とβ1鎖からなるβ1サブ
ファミリーのインテグリンであり、ＥＣＭの構成成分で
あるコラーゲンおよびラミニンの受容体である。ＶＬＡ
−１はラミニンの十字架型構造の核の部分とそのＮ末端
部分を含むＥ１断片を認識する。ラミニンは神経組織で
神経突起の伸長を促すなど成長・分化に重要な役割を果
し、ＶＬＡ−１の神経組織における役割が注目を浴びて
いる。また、ＶＬＡ−１を発現する神経芽細胞腫細胞
を、ＲＧＤ合成ペプチド存在下で培養し、マトリックス
に接着する細胞を選択的に培養し続けると、ＶＬＡ−１
を正常の２０倍も発現し、神経突起を持ち、神経細胞の
形質を示す株が得られた。即ち、ＶＬＡ−１の発現増加
が形質変化に寄与している可能性がある。
ファミリーのインテグリンであり、ＥＣＭの構成成分で
あるコラーゲンおよびラミニンの受容体である。ＶＬＡ
−１はラミニンの十字架型構造の核の部分とそのＮ末端
部分を含むＥ１断片を認識する。ラミニンは神経組織で
神経突起の伸長を促すなど成長・分化に重要な役割を果
し、ＶＬＡ−１の神経組織における役割が注目を浴びて
いる。また、ＶＬＡ−１を発現する神経芽細胞腫細胞
を、ＲＧＤ合成ペプチド存在下で培養し、マトリックス
に接着する細胞を選択的に培養し続けると、ＶＬＡ−１
を正常の２０倍も発現し、神経突起を持ち、神経細胞の
形質を示す株が得られた。即ち、ＶＬＡ−１の発現増加
が形質変化に寄与している可能性がある。
【０００８】インテグリンファミリーのインビトロにお
ける機能解析は、各種モノクローナル抗体の開発の成功
により、ヒト細胞を用いて解析が進んできた。一方、イ
ンビボにおけるインテグリンファミリーの機能解析を行
うためには、マウスやラットなどの実験動物に反応する
モノクローナル抗体が必要になる。しかし、このような
抗体として、これまでＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５に対
する抗体が得られていたにすぎなかった(それぞれ、特
願平３−２６３５７８および特開平５−２４４９８
４)。これらの抗体を用いて各種癌細胞と細胞外マトリ
ックスとの相互作用などを調べていたところ、例えば、
マウスニューロブラストーマＣ１３００または大腸癌細
胞株Ｃolon２６と細胞外マトリックスとの相互作用は上
述の２抗体では解析が不可能であり、他のＶＬＡ分子を
介した相互作用が関与しているとの結論を得た。
ける機能解析は、各種モノクローナル抗体の開発の成功
により、ヒト細胞を用いて解析が進んできた。一方、イ
ンビボにおけるインテグリンファミリーの機能解析を行
うためには、マウスやラットなどの実験動物に反応する
モノクローナル抗体が必要になる。しかし、このような
抗体として、これまでＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５に対
する抗体が得られていたにすぎなかった(それぞれ、特
願平３−２６３５７８および特開平５−２４４９８
４)。これらの抗体を用いて各種癌細胞と細胞外マトリ
ックスとの相互作用などを調べていたところ、例えば、
マウスニューロブラストーマＣ１３００または大腸癌細
胞株Ｃolon２６と細胞外マトリックスとの相互作用は上
述の２抗体では解析が不可能であり、他のＶＬＡ分子を
介した相互作用が関与しているとの結論を得た。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】このような状況下、本
発明者らはＶＬＡ−４および５以外のＶＬＡに対するモ
ノクローナル抗体を作製すれば、これら細胞におけるＶ
ＬＡを介した細胞間相互作用について解析が進むのでは
ないかと考え、鋭意検討を重ねた。その結果、マウスの
ＶＬＡ−１に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体および該抗体を産生するハイブリドーマの取得に成功
し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明はマウス
のＶＬＡ−１に特異的に反応するモノクローナル抗体ま
たはその活性フラグメント、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ、および該モノクローナル抗体の
製造方法を提供するものである。
発明者らはＶＬＡ−４および５以外のＶＬＡに対するモ
ノクローナル抗体を作製すれば、これら細胞におけるＶ
ＬＡを介した細胞間相互作用について解析が進むのでは
ないかと考え、鋭意検討を重ねた。その結果、マウスの
ＶＬＡ−１に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体および該抗体を産生するハイブリドーマの取得に成功
し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明はマウス
のＶＬＡ−１に特異的に反応するモノクローナル抗体ま
たはその活性フラグメント、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ、および該モノクローナル抗体の
製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明のマウスＶＬＡ−
１に対するモノクローナル抗体および該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、以下のようにして製
造することができる。即ち、(1)ＶＬＡ−１を発現して
いると考えられるマウスニューロブラストーマ細胞株
(Ｃ１３００)を抗原として用いて齧歯類動物を免疫感作
し、(2)該免疫感作した動物の脾細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、(3)ＶＬ
Ａ−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択し、(4)該選択したハイブリドーマを適当
な条件下で培養してモノクローナル抗体を産生させ、こ
れを回収する。
１に対するモノクローナル抗体および該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、以下のようにして製
造することができる。即ち、(1)ＶＬＡ−１を発現して
いると考えられるマウスニューロブラストーマ細胞株
(Ｃ１３００)を抗原として用いて齧歯類動物を免疫感作
し、(2)該免疫感作した動物の脾細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、(3)ＶＬ
Ａ−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択し、(4)該選択したハイブリドーマを適当
な条件下で培養してモノクローナル抗体を産生させ、こ
れを回収する。
【００１１】さらに詳しくは、上記の製造方法は以下の
工程からなる： (i)齧歯類動物をマウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１
３００)で免疫感作し、(ii)該免疫感作した齧歯類動物
から脾臓を摘出して脾細胞の懸濁液を調製し、(iii)該脾
細胞の懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融合促進剤の
存在下で混合して両細胞を融合し、(iv)融合した細胞を
未融合ミエローマ細胞を支持しない媒質中で希釈して培
養し、(v)ハイブリドーマを含有する各培養ウエル中の
上清液について、マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ
１３００)との反応性を指標にして抗体の存在を確認
し、(vi)所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し
た後、限界希釈法により単一クローンにし、(vii)その
単一クローンのハイブリドーマの培養上清液から抗体を
回収する。
工程からなる： (i)齧歯類動物をマウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１
３００)で免疫感作し、(ii)該免疫感作した齧歯類動物
から脾臓を摘出して脾細胞の懸濁液を調製し、(iii)該脾
細胞の懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融合促進剤の
存在下で混合して両細胞を融合し、(iv)融合した細胞を
未融合ミエローマ細胞を支持しない媒質中で希釈して培
養し、(v)ハイブリドーマを含有する各培養ウエル中の
上清液について、マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ
１３００)との反応性を指標にして抗体の存在を確認
し、(vi)所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し
た後、限界希釈法により単一クローンにし、(vii)その
単一クローンのハイブリドーマの培養上清液から抗体を
回収する。
【００１２】上記の方法を実施する際の齧歯類動物とし
ては種々の動物を挙げることができるが、アルメニアン
ハムスターが好ましい。免疫感作の抗原として用いるマ
ウスニューロブラストーマ細胞株(Ｃ１３００)は、順天
堂大学医学部免疫学教室から入手することができる。マ
ウスのミエローマ細胞としては各種細胞を用いることが
できるが、マウス由来のα-アザグアニン耐性株である
Ｐ３Ｕ１が好ましい。脾細胞とミエローマ細胞を融合さ
せる方法としては種々の方法を用い得るが、融合促進剤
としてポリエチレングリコールを用いる方法が簡便であ
る。未融合ミエローマ細胞を支持しない媒質としては、
例えばＨＡＴ培地を用いることができる。
ては種々の動物を挙げることができるが、アルメニアン
ハムスターが好ましい。免疫感作の抗原として用いるマ
ウスニューロブラストーマ細胞株(Ｃ１３００)は、順天
堂大学医学部免疫学教室から入手することができる。マ
ウスのミエローマ細胞としては各種細胞を用いることが
できるが、マウス由来のα-アザグアニン耐性株である
Ｐ３Ｕ１が好ましい。脾細胞とミエローマ細胞を融合さ
せる方法としては種々の方法を用い得るが、融合促進剤
としてポリエチレングリコールを用いる方法が簡便であ
る。未融合ミエローマ細胞を支持しない媒質としては、
例えばＨＡＴ培地を用いることができる。
【００１３】所望の抗体を産生しているハイブリドーマ
の選択は、例えば次のようにして行うことができる。ま
ず、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がＶ
ＬＡ−１を発現しているマウスニューロブラストーマ細
胞株(Ｃ１３００)と反応するか否かをＦＡＣＳで調べ
る。さらに、このモノクローナル抗体がＶＬＡ−１を発
現している細胞のＶＬＡ−１分子と反応することを免疫
沈降の実験により特定し、最終的にＶＬＡ−１に対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択す
る。本発明のモノクローナル抗体は、上記で選択したハ
イブリドーマを適当な培地で培養した後、その培養上清
から、または、例えばマウス腹腔にハイブリドーマを注
射した後、その腹水液から回収することができる。回収
した抗体を、当分野の常法に従って精製することができ
る。
の選択は、例えば次のようにして行うことができる。ま
ず、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がＶ
ＬＡ−１を発現しているマウスニューロブラストーマ細
胞株(Ｃ１３００)と反応するか否かをＦＡＣＳで調べ
る。さらに、このモノクローナル抗体がＶＬＡ−１を発
現している細胞のＶＬＡ−１分子と反応することを免疫
沈降の実験により特定し、最終的にＶＬＡ−１に対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択す
る。本発明のモノクローナル抗体は、上記で選択したハ
イブリドーマを適当な培地で培養した後、その培養上清
から、または、例えばマウス腹腔にハイブリドーマを注
射した後、その腹水液から回収することができる。回収
した抗体を、当分野の常法に従って精製することができ
る。
【００１４】本発明は、マウスＶＬＡ−１分子に特異的
に反応するモノクローナル抗体だけでなく、その活性フ
ラグメントをも包含するものである。モノクローナル抗
体は特定の抗原物質を認識する均一な免疫グロブリンで
あり、その活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を
有するモノクローナル抗体のフラグメントを意味し、具
体的には、Ｆ(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆv、および組換え
Ｆv体などを挙げることができる。これらの活性フラグ
メントは、本発明のモノクローナル抗体から常法により
調製することができる。
に反応するモノクローナル抗体だけでなく、その活性フ
ラグメントをも包含するものである。モノクローナル抗
体は特定の抗原物質を認識する均一な免疫グロブリンで
あり、その活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を
有するモノクローナル抗体のフラグメントを意味し、具
体的には、Ｆ(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆv、および組換え
Ｆv体などを挙げることができる。これらの活性フラグ
メントは、本発明のモノクローナル抗体から常法により
調製することができる。
【００１５】Ｆ(ab')2フラグメントは、免疫グロブリン
ＩgＧをペプシンを用いて消化することにより得られる
フラグメントの１つである。ＩgＧをpＨ４.０付近でペ
プシン消化すると、Ｈ鎖のヒンジ部で切断されて、分子
量が約１０万のフラグメントを生成する。この切断は、
Ｈ鎖間のジスルフィド結合よりもＣ末端側で起こる。こ
のフラグメントは、抗原結合部位が２個あるので、抗原
に結合して、沈降反応や凝集反応を起こすことができ
る。
ＩgＧをペプシンを用いて消化することにより得られる
フラグメントの１つである。ＩgＧをpＨ４.０付近でペ
プシン消化すると、Ｈ鎖のヒンジ部で切断されて、分子
量が約１０万のフラグメントを生成する。この切断は、
Ｈ鎖間のジスルフィド結合よりもＣ末端側で起こる。こ
のフラグメントは、抗原結合部位が２個あるので、抗原
に結合して、沈降反応や凝集反応を起こすことができ
る。
【００１６】Ｆab'フラグメントは、Ｆ(ab')2フラグメ
ントを２−メルカプトエタノールなどの試薬で還元し
て、モノヨード酢酸でアルキル化すると、Ｈ鎖間のジス
ルフィド結合が切断されて生じる分子量が約５万のフラ
グメントである。
ントを２−メルカプトエタノールなどの試薬で還元し
て、モノヨード酢酸でアルキル化すると、Ｈ鎖間のジス
ルフィド結合が切断されて生じる分子量が約５万のフラ
グメントである。
【００１７】Ｆabフラグメント(抗原結合性フラグメン
ト)は、ＩgＧをパパイン消化することにより得られるフ
ラグメントの１つである。ＩgＧをシステインの存在下
にパパイン消化すると、ヒンジ部のＨ鎖間のジスルフィ
ド結合よりＮ末端側の位置でＨ鎖を切断し、２個のＦab
と１個のＦc(crystallizable fragment)を生成する。Ｆ
abフラグメントは、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分に相当する
Ｆdフラグメント(ＶHドメイン＋ＣH１ドメイン)とＬ鎖
とがジスルフィド結合した分子量が約４５,０００のフ
ラグメントである。Ｆabフラグメントは、抗原結合部位
を１個有している。
ト)は、ＩgＧをパパイン消化することにより得られるフ
ラグメントの１つである。ＩgＧをシステインの存在下
にパパイン消化すると、ヒンジ部のＨ鎖間のジスルフィ
ド結合よりＮ末端側の位置でＨ鎖を切断し、２個のＦab
と１個のＦc(crystallizable fragment)を生成する。Ｆ
abフラグメントは、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分に相当する
Ｆdフラグメント(ＶHドメイン＋ＣH１ドメイン)とＬ鎖
とがジスルフィド結合した分子量が約４５,０００のフ
ラグメントである。Ｆabフラグメントは、抗原結合部位
を１個有している。
【００１８】Ｆvフラグメントは、非共役結合で結合し
たＨ鎖可変部(ＶH)とＬ鎖可変部(ＶL)からなる抗原結合
可能なフラグメントである。
たＨ鎖可変部(ＶH)とＬ鎖可変部(ＶL)からなる抗原結合
可能なフラグメントである。
【００１９】組換えＦv体は、モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマからＤＮＡをシーケンスして、Ｖ
HとＬHをコードする各塩基配列を決定し、次いで、これ
らのＤＮＡ断片をベクターに組み込んで、ＶL−リンカ
ー−ＶHの構造を有する一価の抗体活性フラグメントを
産生させることにより得ることができる。ＩgＧ、Ｆab
またはＦ(ab')2では、ＶHとＬHはＳ−Ｓ結合により結合
しているが、組換えＦv体フラグメントでは、ＶHとＬH
との間にリンカーを挿入して、Ｓ−Ｓ結合している状態
と同様の立体構造がとれるようにしている。このフラグ
メントは、単にＦvと呼ばれることがあり、またＳＣＦv
(single chain Fv)とも呼ばれている。組換えＦv体は、
大腸菌等の微生物やバクテリオファージによって発現さ
せることもできる。
生するハイブリドーマからＤＮＡをシーケンスして、Ｖ
HとＬHをコードする各塩基配列を決定し、次いで、これ
らのＤＮＡ断片をベクターに組み込んで、ＶL−リンカ
ー−ＶHの構造を有する一価の抗体活性フラグメントを
産生させることにより得ることができる。ＩgＧ、Ｆab
またはＦ(ab')2では、ＶHとＬHはＳ−Ｓ結合により結合
しているが、組換えＦv体フラグメントでは、ＶHとＬH
との間にリンカーを挿入して、Ｓ−Ｓ結合している状態
と同様の立体構造がとれるようにしている。このフラグ
メントは、単にＦvと呼ばれることがあり、またＳＣＦv
(single chain Fv)とも呼ばれている。組換えＦv体は、
大腸菌等の微生物やバクテリオファージによって発現さ
せることもできる。
【００２０】
【発明の効果】本発明のＶＬＡ−１に対するモノクロー
ナル抗体およびその活性フラグメントは、マウスＶＬＡ
−１に反応することから、以下に述べるような種々の用
途が考えられる。即ち、ＶＬＡ−１を発現しているリン
パ球とそのリガンドであるコラーゲンまたはラミニンと
の相互作用の解析を行うことにより、動物胚発生におけ
る細胞の遊走、分化、増殖、さらには、創傷治癒、癌細
胞転移などにおけるＶＬＡ−１とコラーゲンまたはラミ
ニンのメカニズムを理解することができる。また、近年
慢性関節リューマチ患者の関節滑膜にもＥＣＭが存在し
ていることがわかっていることから、これら疾患におけ
るＥＣＭの機能解析において本発明に係るモノクローナ
ル抗体は有力な武器となり得る。さらに、本発明のモノ
クローナル抗体およびその活性フラグメントを、免疫化
学的な研究だけでなく、免疫治療や診断のために用いる
こともできる。このような用途は当業者には明らかであ
ろう。
ナル抗体およびその活性フラグメントは、マウスＶＬＡ
−１に反応することから、以下に述べるような種々の用
途が考えられる。即ち、ＶＬＡ−１を発現しているリン
パ球とそのリガンドであるコラーゲンまたはラミニンと
の相互作用の解析を行うことにより、動物胚発生におけ
る細胞の遊走、分化、増殖、さらには、創傷治癒、癌細
胞転移などにおけるＶＬＡ−１とコラーゲンまたはラミ
ニンのメカニズムを理解することができる。また、近年
慢性関節リューマチ患者の関節滑膜にもＥＣＭが存在し
ていることがわかっていることから、これら疾患におけ
るＥＣＭの機能解析において本発明に係るモノクローナ
ル抗体は有力な武器となり得る。さらに、本発明のモノ
クローナル抗体およびその活性フラグメントを、免疫化
学的な研究だけでなく、免疫治療や診断のために用いる
こともできる。このような用途は当業者には明らかであ
ろう。
【００２１】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく
説明する。実施例１ モノクローナル抗体の作成および特性化 Ａ．免疫感作 マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１３００)(順天堂
大学医学部免疫学教室より入手)をＰＢＳ(リン酸緩衝化
食塩水)に懸濁し、１×１０7個をpolyＡpolyＵアジュバ
ンド(ＳＩＧＭＡ製)と共にアルメニアンハムスター(極
東製薬、メス、８週齢)の腹腔内に注射した。次いで、
２週間後から週１回で合計６回、同一ハムスターにＣ１
３００細胞を注射することにより、免疫感作した。
説明する。実施例１ モノクローナル抗体の作成および特性化 Ａ．免疫感作 マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１３００)(順天堂
大学医学部免疫学教室より入手)をＰＢＳ(リン酸緩衝化
食塩水)に懸濁し、１×１０7個をpolyＡpolyＵアジュバ
ンド(ＳＩＧＭＡ製)と共にアルメニアンハムスター(極
東製薬、メス、８週齢)の腹腔内に注射した。次いで、
２週間後から週１回で合計６回、同一ハムスターにＣ１
３００細胞を注射することにより、免疫感作した。
【００２２】Ｂ．細胞融合 最終免疫の３日後に上記ハムスターから脾臓を取り出し
た。取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地[(株)日研生物医学研究所製]に浮遊さ
せ、脾細胞を１×１０8個得た。この脾細胞とマウス由
来のα−アザグアニン耐性株(ヒポキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株)Ｐ３Ｕ１(Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １５９７)２×１０7個を約５:１の割合
で混合し、遠心した(１５００rpm、５分)。得られた細
胞のペレットに、５０％ポリエチレングリコール４００
０(メルク製)／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の
温水中で撹拌しながら１分間を要して加えた。これにＲ
ＰＭＩ１６４０溶液１５mlを撹拌しながら６分間を要し
て加え、細胞融合を行った。融合後、大量(約４０ml)の
ＲＰＭＩ１６４０溶液を加え、遠心分離(１５００rpm、
５分)して上清を除去した。次いで、ヒポキサンチン(１
００μＭ)、アミノプテリン(０.４μＭ)、チミジン(１
０μＭ)を含む１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地
(ＨＡＴ培地)にて、脾細胞が１×１０6個／mlになるよ
うに調製した。
た。取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地[(株)日研生物医学研究所製]に浮遊さ
せ、脾細胞を１×１０8個得た。この脾細胞とマウス由
来のα−アザグアニン耐性株(ヒポキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株)Ｐ３Ｕ１(Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １５９７)２×１０7個を約５:１の割合
で混合し、遠心した(１５００rpm、５分)。得られた細
胞のペレットに、５０％ポリエチレングリコール４００
０(メルク製)／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の
温水中で撹拌しながら１分間を要して加えた。これにＲ
ＰＭＩ１６４０溶液１５mlを撹拌しながら６分間を要し
て加え、細胞融合を行った。融合後、大量(約４０ml)の
ＲＰＭＩ１６４０溶液を加え、遠心分離(１５００rpm、
５分)して上清を除去した。次いで、ヒポキサンチン(１
００μＭ)、アミノプテリン(０.４μＭ)、チミジン(１
０μＭ)を含む１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地
(ＨＡＴ培地)にて、脾細胞が１×１０6個／mlになるよ
うに調製した。
【００２３】Ｃ．ハイブリドーマの選択 上記Ｂで調製した細胞浮遊液を９６ウエルマイクロプレ
ート５枚に２００μl／ウエルで分注し、３７℃、５％
ＣＯ2下のＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。１週
間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成して、
増殖していることが確認できた。
ート５枚に２００μl／ウエルで分注し、３７℃、５％
ＣＯ2下のＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。１週
間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成して、
増殖していることが確認できた。
【００２４】Ｄ．Ｃ１３００ニューロブラストーマ細胞
と反応する抗体を産生するハイブリドーマの選択 上記Ｃで得たハイブリドーマが産生する抗体がＶＬＡ−
１分子を発現しているマウスニューロブラストーマ細胞
(Ｃ１３００)と反応するか否かを、Fluorescence Activ
ated Cell Sorter(ＦＡＣＳ)(フローサイトメトリー)に
よって調べた。Ｃ１３００ニューロブラストーマ細胞を
ＰＢＳで１ｘ１０7個／mlに調製し、フィッシャーチュ
ーブに１×１０6個ずつ入れた。このチューブに上記Ｃ
のハイブリドーマ培養液の培養上清２００μlを入れ、
氷上で２０分間反応させ、ＰＢＳで遠心洗浄した(３,０
００rpm、１分、３回)。次いで、ＦＩＴＣ−抗ハムスタ
ーＩg's(カルタゴ製)(１００倍希釈)を１００μl入れ、
氷上で２０分間反応させた。反応の後、ＰＢＳによる遠
心洗浄を２回行い、ＰＢＳ２００μlに懸濁し、ＦＡＣ
Ｓcanで測定した。このようにして、Ｃ１３００細胞と
反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
と反応する抗体を産生するハイブリドーマの選択 上記Ｃで得たハイブリドーマが産生する抗体がＶＬＡ−
１分子を発現しているマウスニューロブラストーマ細胞
(Ｃ１３００)と反応するか否かを、Fluorescence Activ
ated Cell Sorter(ＦＡＣＳ)(フローサイトメトリー)に
よって調べた。Ｃ１３００ニューロブラストーマ細胞を
ＰＢＳで１ｘ１０7個／mlに調製し、フィッシャーチュ
ーブに１×１０6個ずつ入れた。このチューブに上記Ｃ
のハイブリドーマ培養液の培養上清２００μlを入れ、
氷上で２０分間反応させ、ＰＢＳで遠心洗浄した(３,０
００rpm、１分、３回)。次いで、ＦＩＴＣ−抗ハムスタ
ーＩg's(カルタゴ製)(１００倍希釈)を１００μl入れ、
氷上で２０分間反応させた。反応の後、ＰＢＳによる遠
心洗浄を２回行い、ＰＢＳ２００μlに懸濁し、ＦＡＣ
Ｓcanで測定した。このようにして、Ｃ１３００細胞と
反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
【００２５】Ｅ．クローニング 上記Ｄで選択したウエルで増殖しているハイブリドーマ
を限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が
１個／ウエルとなるように１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６
４０培地で希釈し、９６ウエルのプレートに２００μl
ずつ分注し、３７℃の５％ＣＯ2下で培養した。約一週
間後にハイブリドーマの増殖が認められた。コロニーが
ある程度の大きさになってから、上記Ｄの方法で再度抗
体の検出を行った。この操作を２回繰り返し、安定にＣ
１３００細胞と反応する抗体を産生するハイブリドーマ
を得ることができた。このハイブリドーマが産生する抗
体をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、その分子量からＩgＧ型のハ
ムスター抗体であることを確認した。
を限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が
１個／ウエルとなるように１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６
４０培地で希釈し、９６ウエルのプレートに２００μl
ずつ分注し、３７℃の５％ＣＯ2下で培養した。約一週
間後にハイブリドーマの増殖が認められた。コロニーが
ある程度の大きさになってから、上記Ｄの方法で再度抗
体の検出を行った。この操作を２回繰り返し、安定にＣ
１３００細胞と反応する抗体を産生するハイブリドーマ
を得ることができた。このハイブリドーマが産生する抗
体をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、その分子量からＩgＧ型のハ
ムスター抗体であることを確認した。
【００２６】Ｆ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ラミニンをコートするため、９６ウェルプレートＩＭＭ
ＵＬＯＮ２（ダイナテック社製)に、１０μg/mlのラミ
ニン(ＧＩＢＣＯ社製)を５０μl/ウェルで分注し、３７
℃で２時間インキュベートした。次いで２００μl/ウェ
ルの１％ＢＳＡ/ＰＢＳで３７℃、２時間のインキュベ
ートによりブロッキングを行い、ＰＢＳで３回洗浄し
た。細胞(Ｃ１３００)を無血清培地ＡＩＭ−Ｖ(ＧＩＢ
ＣＯ社製)で懸濁して１×１０7細胞/mlとし、１０μmol
/ＬのＢＣＥＣＦ−ＡＭ[２',７'−ビス(２−カルボキシ
エチル)カルボキシフルオレセイン テトラアセトキシメ
チルエステル](和光純薬製)とともに３７℃で３０分間
インキュベートすることにより細胞内を蛍光ラベルした
後、ＰＢＳで３回洗浄した。蛍光ラベルしたＣ１３００
に上記Ｅで得たハイブリドーマの培養上清１００μlを
加え、３７℃で３０分間プレインキュベートした。ラミ
ニンをコートしたプレートにプレインキュベートした細
胞を１×１０5細胞/５０μl(ＡＩＭ−Ｖ)/ウェルで蒔
き、３７℃で３０分間インキュベートし、ラミニンにＣ
１３００を接着させた。接着しなかった細胞を取り除
き、１％ＮＰ４０/ＰＢＳを１００μl/ウェルで加え、
接着した細胞を溶解し、フルオロスキャンII(ラボシス
テムズ社製)で蛍光強度を測定した。培養上清を加えな
いときの蛍光強度を１００％として％対照とした。ま
た、コラーゲンについても同様にしてＡdhesion assay
を行った。その結果、得られたハイブリドーマが産生す
る抗体はＶＬＡ−１とラミニンとの結合、およびＶＬＡ
−１とコラーゲンとの結合を阻害することがわかった
(図１)。すなわち、この抗体がＶＬＡ−１に対する抗体
であることが示された。
ＵＬＯＮ２（ダイナテック社製)に、１０μg/mlのラミ
ニン(ＧＩＢＣＯ社製)を５０μl/ウェルで分注し、３７
℃で２時間インキュベートした。次いで２００μl/ウェ
ルの１％ＢＳＡ/ＰＢＳで３７℃、２時間のインキュベ
ートによりブロッキングを行い、ＰＢＳで３回洗浄し
た。細胞(Ｃ１３００)を無血清培地ＡＩＭ−Ｖ(ＧＩＢ
ＣＯ社製)で懸濁して１×１０7細胞/mlとし、１０μmol
/ＬのＢＣＥＣＦ−ＡＭ[２',７'−ビス(２−カルボキシ
エチル)カルボキシフルオレセイン テトラアセトキシメ
チルエステル](和光純薬製)とともに３７℃で３０分間
インキュベートすることにより細胞内を蛍光ラベルした
後、ＰＢＳで３回洗浄した。蛍光ラベルしたＣ１３００
に上記Ｅで得たハイブリドーマの培養上清１００μlを
加え、３７℃で３０分間プレインキュベートした。ラミ
ニンをコートしたプレートにプレインキュベートした細
胞を１×１０5細胞/５０μl(ＡＩＭ−Ｖ)/ウェルで蒔
き、３７℃で３０分間インキュベートし、ラミニンにＣ
１３００を接着させた。接着しなかった細胞を取り除
き、１％ＮＰ４０/ＰＢＳを１００μl/ウェルで加え、
接着した細胞を溶解し、フルオロスキャンII(ラボシス
テムズ社製)で蛍光強度を測定した。培養上清を加えな
いときの蛍光強度を１００％として％対照とした。ま
た、コラーゲンについても同様にしてＡdhesion assay
を行った。その結果、得られたハイブリドーマが産生す
る抗体はＶＬＡ−１とラミニンとの結合、およびＶＬＡ
−１とコラーゲンとの結合を阻害することがわかった
(図１)。すなわち、この抗体がＶＬＡ−１に対する抗体
であることが示された。
【００２７】Ｇ．Ｉmmunoprecipitation 得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
が、マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１３００)のＶ
ＬＡ−１分子に対する抗体であることを免疫沈降により
チェックした。
が、マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１３００)のＶ
ＬＡ−１分子に対する抗体であることを免疫沈降により
チェックした。
【００２８】(1)細胞のビオチン化 マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１３００)を７５cm
2培養フラスコ中、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培
地にて２×１０7個培養した。１,５００rpmで５分間の
遠心分離によりＣ１３００細胞を回収した後、ＰＢＳに
て１回遠心洗浄した。その後、ＨＢＳＳ(ハンクス緩衝
液)で３回遠心洗浄した。上清液を吸引した後、細胞ペ
レットを０.１ＭのＨepes(ヘペス；Ｎ-２-ヒドロキシエ
チルピペラジン-Ｎ'-２-エタンスルホン酸)緩衝液(pＨ
８.０)２mlに懸濁した。その後、１０mg／mlのＮＨＳ−
ビオチンを２０μl入れ、４０分間室温でローテーター
を用いて反応させた。次いで、４℃に冷したＲＰＭＩ１
６４０溶液にて３回遠心洗浄した。
2培養フラスコ中、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培
地にて２×１０7個培養した。１,５００rpmで５分間の
遠心分離によりＣ１３００細胞を回収した後、ＰＢＳに
て１回遠心洗浄した。その後、ＨＢＳＳ(ハンクス緩衝
液)で３回遠心洗浄した。上清液を吸引した後、細胞ペ
レットを０.１ＭのＨepes(ヘペス；Ｎ-２-ヒドロキシエ
チルピペラジン-Ｎ'-２-エタンスルホン酸)緩衝液(pＨ
８.０)２mlに懸濁した。その後、１０mg／mlのＮＨＳ−
ビオチンを２０μl入れ、４０分間室温でローテーター
を用いて反応させた。次いで、４℃に冷したＲＰＭＩ１
６４０溶液にて３回遠心洗浄した。
【００２９】(2)細胞の溶解 上記(1)で得たビオチン化細胞のペレットに４００μlの
溶菌緩衝液[５０mＭＴris-ＨＣl、１５０mＭ ＮaＣl、
１％ トリトンＸ-１００、５０mＭ ヨードアセトアミ
ド、２mＭ ＭgＣl2、２mＭ ＣaＣl2、０.１％ アジ化ナ
トリウム、１０μg／ml 大豆トリプシンインヒビター、
１μg／ml アプロチニン、１mＭ ＰＭＳＦ(フェニルメ
チルスルホニルフロライド)、１μg／ml ロイペプチン]
を加え、十分に撹拌した後、氷上にて３０分間放置し
た。その後１５,０００rpmで１０分間遠心し、上清液を
回収した。これを２００μlずつ２本に分けた。
溶菌緩衝液[５０mＭＴris-ＨＣl、１５０mＭ ＮaＣl、
１％ トリトンＸ-１００、５０mＭ ヨードアセトアミ
ド、２mＭ ＭgＣl2、２mＭ ＣaＣl2、０.１％ アジ化ナ
トリウム、１０μg／ml 大豆トリプシンインヒビター、
１μg／ml アプロチニン、１mＭ ＰＭＳＦ(フェニルメ
チルスルホニルフロライド)、１μg／ml ロイペプチン]
を加え、十分に撹拌した後、氷上にて３０分間放置し
た。その後１５,０００rpmで１０分間遠心し、上清液を
回収した。これを２００μlずつ２本に分けた。
【００３０】(3)プレクリアー(preclear) 上記(2)のように回収した上清液２００μlに、正常ハム
スターＩgＧをＣＮＢr活性化セファロースに結合させた
ビーズ１００μlを入れ、４℃で一晩反応させ、非特異
的結合タンパク質を除去した。その後、１２,０００rpm
で１分間の遠心によってビーズを沈降させ、上清を回収
した。
スターＩgＧをＣＮＢr活性化セファロースに結合させた
ビーズ１００μlを入れ、４℃で一晩反応させ、非特異
的結合タンパク質を除去した。その後、１２,０００rpm
で１分間の遠心によってビーズを沈降させ、上清を回収
した。
【００３１】(4)免疫沈降 上記(3)で回収した上清の１本目には、正常ハムスター
の血清を結合させたセファロースゲル１００μlを入
れ、他の１本には、今回樹立したハイブリドーマが産生
する抗体をＣＮＢr活性化セファロースに結合させたビ
ーズ１００μlを入れ、室温で２時間反応させた。洗浄
液[５０mＭ Ｔris-ＨＣl(pＨ８.３)、０.６Ｍ 塩化ナト
リウム、０.５％ ＮＰ-４０、０.１％ アジ化ナトリウ
ム]で３回遠心洗浄した後、ゲルに２％ ＳＤＳ(ドデシ
ル硫酸ナトリウム)を含むサンプル緩衝液[１０％ グリ
セロール、５％ ２-メルカプトエタノール、２.３％ Ｓ
ＤＳ、０.６２５Ｍ Ｔris-ＨＣl(pＨ６.８)、１mg／１
００ml ＢＰＢ(ブロモ・フェノール・ブルー)]を２０μ
l入れ、５分間煮沸した。その後、４〜２０％のＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル(第一化学製)を用いて非還元条件(ＮＲ)
および還元条件(Ｒ)で電気泳動した。電気泳動の後、ト
ランスブロットシステム(バイオラッド製)を用いてニト
ロセルロース膜(Sartorius製)に転写した。
の血清を結合させたセファロースゲル１００μlを入
れ、他の１本には、今回樹立したハイブリドーマが産生
する抗体をＣＮＢr活性化セファロースに結合させたビ
ーズ１００μlを入れ、室温で２時間反応させた。洗浄
液[５０mＭ Ｔris-ＨＣl(pＨ８.３)、０.６Ｍ 塩化ナト
リウム、０.５％ ＮＰ-４０、０.１％ アジ化ナトリウ
ム]で３回遠心洗浄した後、ゲルに２％ ＳＤＳ(ドデシ
ル硫酸ナトリウム)を含むサンプル緩衝液[１０％ グリ
セロール、５％ ２-メルカプトエタノール、２.３％ Ｓ
ＤＳ、０.６２５Ｍ Ｔris-ＨＣl(pＨ６.８)、１mg／１
００ml ＢＰＢ(ブロモ・フェノール・ブルー)]を２０μ
l入れ、５分間煮沸した。その後、４〜２０％のＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲル(第一化学製)を用いて非還元条件(ＮＲ)
および還元条件(Ｒ)で電気泳動した。電気泳動の後、ト
ランスブロットシステム(バイオラッド製)を用いてニト
ロセルロース膜(Sartorius製)に転写した。
【００３２】(5)発色反応 上記(4)で得たニトロセルロース膜を１％ ＢＳＡ(牛血
清アルブミン)-ＰＢＳに浸し、１時間放置し、ブロッキ
ングした。その後、ＡＢＣ溶液(アビジン−ビオチン化
ペルオキシダーゼ混合液)(ベクター製)に浸し、３０分
間反応させた。０.０５％ ツィーン２０／ＰＢＳにて３
回洗浄した(１０分間インキュベート×３)。アマーシャ
ムのＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムの発
色キットを用いて反応させた後、Ｘ線フィルムで露光
し、ハイブリドーマが産生する抗体と反応するタンパク
質を検出した(図２)。図２において、非還元および還元
とも、レーン１は正常ハムスター血清で、レーン２は今
回樹立した抗体で免疫沈降させた結果を示す。
清アルブミン)-ＰＢＳに浸し、１時間放置し、ブロッキ
ングした。その後、ＡＢＣ溶液(アビジン−ビオチン化
ペルオキシダーゼ混合液)(ベクター製)に浸し、３０分
間反応させた。０.０５％ ツィーン２０／ＰＢＳにて３
回洗浄した(１０分間インキュベート×３)。アマーシャ
ムのＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムの発
色キットを用いて反応させた後、Ｘ線フィルムで露光
し、ハイブリドーマが産生する抗体と反応するタンパク
質を検出した(図２)。図２において、非還元および還元
とも、レーン１は正常ハムスター血清で、レーン２は今
回樹立した抗体で免疫沈降させた結果を示す。
【００３３】また、今回樹立した抗体で沈降させたタン
パク質を、さらにラビットα１抗血清、β１抗血清等で
沈降させて検出した結果(図３)からも、今回樹立したハ
イブリドーマが産生する抗体はＶＬＡ−１のαβヘテロ
ダイマーを免疫沈降することができ、この抗体がＶＬＡ
−１に対する抗体であることを確認した。図３におい
て、レーン１は正常ハムスター血清、レーン２は今回樹
立した抗体、レーン３は正常ラビット血清、レーン４は
抗α１ラビット血清、レーン５は抗β１ラビット血清を
用いて免疫沈降させた結果を示す。
パク質を、さらにラビットα１抗血清、β１抗血清等で
沈降させて検出した結果(図３)からも、今回樹立したハ
イブリドーマが産生する抗体はＶＬＡ−１のαβヘテロ
ダイマーを免疫沈降することができ、この抗体がＶＬＡ
−１に対する抗体であることを確認した。図３におい
て、レーン１は正常ハムスター血清、レーン２は今回樹
立した抗体、レーン３は正常ラビット血清、レーン４は
抗α１ラビット血清、レーン５は抗β１ラビット血清を
用いて免疫沈降させた結果を示す。
【００３４】ＶＬＡ−１に対するモノクローナル抗体を
産生する株であるハイブリドーマＨＭα１は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１４５４６で寄託されている(受託日：１９９４年９月
２１日)。
産生する株であるハイブリドーマＨＭα１は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１４５４６で寄託されている(受託日：１９９４年９月
２１日)。
【図１】 本発明のハイブリドーマが産生する抗体によ
るＶＬＡ１とラミニンおよびコラーゲンとの結合の阻害
を調べた結果を示すグラフである。
るＶＬＡ１とラミニンおよびコラーゲンとの結合の阻害
を調べた結果を示すグラフである。
【図２】 本発明のハイブリドーマが産生する抗体と反
応するタンパク質をウエスタンブロットにより検出した
結果を示す模式図である。
応するタンパク質をウエスタンブロットにより検出した
結果を示す模式図である。
【図３】 本発明のハイブリドーマが産生する抗体で沈
降させたタンパク質を、さらにラビット血清を用いてウ
エスタンブロットにより検出した結果を示す模式図であ
る。
降させたタンパク質を、さらにラビット血清を用いてウ
エスタンブロットにより検出した結果を示す模式図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 奥村 康 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部内 (72)発明者 宮部 由紀 大阪府大阪市此花区島屋一丁目１番３号 住友電気工業株式会社大阪製作所内
Claims (6)
- 【請求項１】 マウスの細胞表面分子であるＶＬＡ−１
分子に特異的に反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ＩgＧ型のハムスター抗体である請求項
１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体のＦ
(ab')2、Ｆab'、Ｆab、Ｆv、および組換えＦv体から選
ばれる活性フラグメント。 - 【請求項４】 (i)齧歯類動物をマウスニューロブラス
トーマ細胞(Ｃ１３００)で免疫感作し、 (ii)該免疫感作した齧歯類動物から脾臓を摘出して脾細
胞の懸濁液を調製し、 (iii)該脾細胞の懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融
合促進剤の存在下で混合して両細胞を融合し、 (iv)融合した細胞を未融合ミエローマ細胞を支持しない
媒質中で希釈して培養し、 (v)ハイブリドーマを含有する各培養ウエル中の上清液
について、マウスニューロブラストーマ細胞(Ｃ１３０
０)との反応性を指標にして抗体の存在を確認し、 (vi)所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択した
後、限界希釈法により単一クローンにし、 (vii)その単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
から抗体を回収する、ことを特徴とする、マウスの細胞
表面分子であるＶＬＡ−１分子に特異的に反応するモノ
クローナル抗体の製造方法。 - 【請求項５】 齧歯類動物がアルメニアンハムスターに
属し、ミエローマ細胞がＰ３Ｕ１である請求項５記載の
方法。 - 【請求項６】 マウスの細胞表面に存在するＶＬＡ−１
分子に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6278825A JPH08131185A (ja) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6278825A JPH08131185A (ja) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08131185A true JPH08131185A (ja) | 1996-05-28 |
Family
ID=17602686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6278825A Pending JPH08131185A (ja) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08131185A (ja) |
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-
1994
- 1994-11-14 JP JP6278825A patent/JPH08131185A/ja active Pending
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