CN101563105B - 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学、免疫学和肿瘤学领域。本发明涉及发现了在肿瘤抑制基因smad4(也称作dpc4)和整联蛋白αvβ6的表达水平与患者群体对αvβ6活性化合物和组合物(例如，结合αvβ6的抗体和其他配体)的应答之间的关系，尤其在来自这种患者群体的癌细胞，更尤其癌，如胰腺癌中的这种关系。本发明从而提供了通过检查肿瘤细胞的αvβ6和smadA的表达来确定肿瘤细胞(尤其来自胰腺肿瘤的细胞)对此类αvβ6活性化合物和组合物的应答性的方法，以及使用配体诊断和治疗/预防肿瘤进展的方法，所述配体包括抗体和小分子药物，其结合至肿瘤细胞表面上的整联蛋白αvβ6和/或阻断TGF-β途径(尤其smad4缺陷的肿瘤细胞中)的一种或多种组分。

Description

用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
发明背景 
发明领域
本发明属于细胞生物学、免疫学和肿瘤学领域。本发明涉及发现了在肿瘤抑制基因smad4(也称作dpc4)和整联蛋白αvβ6的表达水平与患者群体对αvβ6活性化合物和组合物(例如，结合αvβ6的抗体和其他配体)的应答之间的关系，尤其在来自这种患者群体的癌细胞，更尤其癌，如胰腺癌中的这种关系。本发明从而提供了通过检查肿瘤细胞的αvβ6和smad4的表达来确定肿瘤细胞(尤其来自胰腺肿瘤的细胞)对此类αvβ6活性化合物和组合物的应答性的方法，以及使用配体诊断和治疗/预防肿瘤进展的方法，所述配体包括抗体和小分子药物，其结合至肿瘤细胞表面上的整联蛋白αvβ6和/或阻断TGF-β途径(尤其smad4缺陷的肿瘤细胞中)的一种或多种组分。 
相关技术 
整联蛋白是细胞表面糖蛋白受体，其结合细胞外基质蛋白并介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用(通常被称作细胞粘附事件)(Ruoslahti，E.，J.Clin.Invest.87：1-5(1991)；Hynes，R.O.，Cell 69：11-25(1992))。这些受体由非共价结合的α和β链组成，α和β链组合而产生具有不同的细胞和粘附特异性的多种异二聚体蛋白质(Albeda，S.M.，Lab.Invest.68：4-14(1993))。最近的研究已经将某些整联蛋白与多种细胞过程的调节联系起来，所述细胞过程包括细胞粘附、迁移、侵入、分化、增殖、凋亡和基因表达(Albeda，S.M.，Lab.Invest.68：4-14(1993)；Juliano，R.，Cancer Met.Rev.13：25-30(1994)；Ruoslahti，E.和Reed，J.C.，Cell 77：477-478(1994)；和Ruoslahti，E.and Giancotti，F.G.，Cancer Cells 1：1 19-126(1989)；Plow，Haas等人2000；van der Flier andSonnenberg 2001)。 
αvβ6受体是作为细胞表面异二聚体蛋白质表达的整联蛋白家族的一个成员(Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267(9)：5790-5796(1992))。尽管αv亚基可以与多种β亚基(β1、β3、β5、β6和β8)形成异二聚体，β6亚基只能作为与αv亚基的异二聚体表达。已知αvβ6整联蛋白是纤连蛋白-潜伏相关肽(latency associated peptide，LAP)和生腱蛋白C结合细胞表面受体，通过其上的RGD三肽结合位点与细胞外基质相互作用(Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267：5790-5796(1992)；Weinacker，A.等人，J.Biol.Chem.269：6940-6948(1994)；Prieto，A.L.等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA 90：10154-10158(1993))。尽管在10多年前就已经首次鉴定了αvβ6整联蛋白并对其测序，但是αvβ6的生物学重要性(特别在疾病中)仍然处于研究中。αvβ6的表达局限于上皮细胞，在那里它在健康组织中以相对低水平表达并且在发育、创伤和伤口愈合期间被显著上调(Breuss，J.M.等人，J.Histochem.Cytochem.41：1521-1527(1993)；Breuss，J.M.等人，J.Cell Sci.108：2241-2251(1995)；Koivisto，L.等人，Cell Adhes.Communic.7：245-257(1999)；Zambruno，G.等人，J.Cell Biol.129(3)：853-865(1995)；Hakkinen，L.等人，J.Histochem.Cytochem.48(6)：985-998(2000))。不断增加的近期报导表明αvβ6在上皮来源的癌症中被上调，所述癌症包括结肠癌(Niu，J.等人Int.J.Cancer 92：40-48(2001)；Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115：339-347(2005))，卵巢癌(Ahmed，N.等人，J.Cell.Biochem.84：675-686(2002)；Ahmed，N.等人，J.Histochem.Cytochem.50：1371-1379(2002)；Ahmed，N.等人，Carcinogen.23：237-244(2002))，鳞状细胞癌(Koivisto，L.等人，Exp.Cell Res.255：10-17(2000)；Xue，H.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.288：610-618(2001)；Thomas，G.J.等人，J.Invest.Dermatol.117：67-73(2001)；Thomas，G.J.等人，Int.J.Cancer 92：641-650(2001)；Ramos，D.M.等人，Matrix Biol.21：297-307(2002)；(Agrez，M.等人，Br.J.Cancer 81：90-97(1999)；Hamidi，S.等人，Br.J.Cancer 82(8)：1433-1440(2000)；Kawashima，A.等人，Pathol Res.Pract.99(2)：57-64(2003))，和乳腺癌(Arihiro，K.等人，Breast Cancer 7：19-26(2000))。已经报导αv亚基可能涉及肿瘤转移，并且该亚基的阻断因此可以防止转移(综述见Imhof，B.A.等人，in：“Attempts to Understand MetastasisFormation 1，”U.Günthert和W.Birchmeier，eds.，Berlin：Springer-Verlag，pp.195-203(1996))。 
αvβ6整联蛋白在肿瘤细胞生物学中具有多种调节功能。最近的研究表明β6亚基的细胞外和细胞质结构域介导不同的细胞活性。已经表明细胞外和跨膜结构域介导TGF-β活化和粘附(Sheppard，D.，Cancer and Metastasis Rev.24：395-402(2005)；Munger，J.S.等人，Cell 96：319-328(1999))。β6亚基的细胞质结构域含有独特的11-氨基酸序列，其在介导αvβ6调节的细胞增殖、MMP产生、迁移和促存活中是重要的(Li，X.等人，J.Biol.Chem.278(43)：41646-41653(2003)；Thomas，G.J.等人，J.Invest.Derm.117(1)：67-73(2001)；Thomas，G.J.等人，Br.J.Cancer87(8)：859-867(2002)；Janes，S.M.和Watt，F.M.，J.Cell Biol166(3)：419-431(2004))。已经克隆、表达和纯化了β6亚基(Sheppard等人，美国专利号6,787,322B2，将其公开完整引入本文作为参考)，并且已经报导了选择性结合αvβ6整联蛋白的功能阻断抗体(Weinreb等人，J.Biol.Chem.279：17875-17877(2004)，将其公开完整引入本文作为参考)。也已经提出αvβ6的拮抗剂(包括某些单克隆抗体)作为某些形式的急性肺损伤和纤维化的可能的治疗(见美国专利号6,692,741B2和WO 99/07405，将其公开完整引入本文作为参考)。αvβ6可以通过与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)基序直接相互作用结合至几种配体，包括纤连蛋白、生腱蛋白和潜伏相关肽(latency associated peptide)-1和-3(LAP1和LAP3)、TGF-β1 的潜伏前体形式的N-末端278个氨基酸(Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267(9)：5790-5796(1992)；Yokosaki，Y.等人，J.Biol.Chem.271(39)：24144-24150(1996)；Huang，X.Z.等人，J.Cell.Sci.111：2189-2195(1998)；Munger，J.S.等人，Cell 96：319-328(1999))。TGF-β细胞因子作为潜伏的复合体合成，其具有与成熟的活性C-末端TGF-β细胞因子非共价结合的N-末端LAP。潜伏的TGF-β复合体不能结合至它的同源受体，并且从而在转化为活性形式前没有生物活性(Barcellos-Hoff，M.H.，J.Mamm.Gland Biol.1(4)：353-363(1996)；Gleizes，P.E.等人，Stem Cells 15(3)190-197(1997)；Munger，J.S.等人，Kid.Int.51：1376-1382(1997)；Khalil，N.，Microbes Infect.1(15)：1255-1263(1999))。αvβ6与LAP1或LAP3的结合导致TGF-β1和TGF-β3的潜伏前体形式的活化(Munger，J.S.等人，Cell 96：319-328(1999))，其被提出是由于潜伏复合体的构象改变而允许TGF-β结合其受体的结果。从而，α vβ6的上调的表达可以导致TGF-β的局部活化，其又可以活化下游事件的级联。 
TGF-β1细胞因子是多效性生长因子，其调节细胞增殖、分化和免疫应答(Wahl，S.M.，J.Exp.Med.180：1587-1590(1994)；Massague，J.，Annu.Rev.Biochem.67：753-791(1998)；Chen，W.和Wahl，S.M.，TGF-β：Receptors，Signaling Pathways andAutoimmunity，Basel：Karger，pp.62-91(2002)；Thomas，D.A.和Massague，J.，Cancer Cell 8：369-380(2005))。TGF-β1在癌症中的角色是两面的。认识到TGF-β是肿瘤抑制因子并具有生长抑制活性，然而，许多肿瘤演化出对TGF-β1的生长抑制活性的抗性(Yingling，J.M.等人，Nature Rev.Drug Discov.3(12)：1011-1022(2004)；Akhurst，R.J.等人，Trends Cell Biol.11(11)：S44-S51(2001)；Balmain，A.和Akhurst，R.J.，Nature 428(6980)：271-272(2004))。在已经建立的肿瘤中，TGF-β1表达和活性已经涉及促进肿瘤存活、发展和转移(Akhurst，R.J.等人，Trends Cell Biol. 11(11)：S44-S51(2001)；Muraoka，R.S.等人，J.Clin.Invest.109(12)：1551(2002)；Yang，Y.A.等人，J.Clin.Invest.109(12)：1607-1615(2002))。推测这由局部肿瘤-基质环境中的自分泌和旁分泌作用介导，其中包括TGF-β对免疫监视、血管发生和增加的肿瘤间隙压的作用。-些研究现在已经表明了抑制TGF-β1的抗肿瘤和抗增殖效应(Akhurst，R.J.，J.Clin.Invest.109(12)：1533-1536(2002)；Muraoka，R.S.等人，J.Clin.Invest.109(12)：1551(2002)；Yingling，J.M.等人，Nat.Rev.Drug Discov.3(12)：1011-1022(2004)；Yang，Y.A.等人，J.Clin.Invest.109(12)：1607-1615(2002)；Halder，S.K.等人，Neoplasia7(5)：509-521(2005)；Iyer，S.等人，Cancer Biol.Ther.4(3)：261-266(2005))。 
肿瘤上，尤其肿瘤-基质界面上αvβ6的增加的表达反映了TGF-β1的局部活化的独特机理和促进肿瘤存活、侵入和转移的能力。在人肿瘤转移中的高表达水平推断出αvβ6在建立的转移中的潜在功能，其与如下的以前报导相符合：即αvβ6可以介导上皮向间质转移、体外肿瘤细胞侵入，和与小鼠模型中转移相关的表达(Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115(2)：339-347(2005)；Thomas，G.J.等人，Br.J.Cancer 87(8)：859-867(2002)；Morgan，M.R.等人，J.Biol.Chem.279(25)：26533-26539(2004))。我们以前已经描述有效的、选择性抗αvβ6单克隆抗体(mAbs)的产生，所述单克隆抗体结合αvβ6的人和鼠形式并阻断αvβ6与其配体的结合和TGF-β1的αvβ6介导的活化(Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279(17)：17875-17887(2004))。 
以前已经描述了结合αvβ6的人和鼠形式并阻断αvβ6与其配体的结合和TGF-β1的αvβ6介导的活化的有效的、选择性抗αvβ6单克隆抗体(mAbs)的产生(Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279(17)：17875-17887(2004))；也见Violette等人的美国专利申请号11/483,190，标题“Anti-αvβ6 Antibodies and Uses Thereof，” 2006年7月10日申请，将其完整引入本文作为参考)。也如PCT公开WO 03/100033(将其完整引入本文作为参考)中所述，发现并表征了抗αvβ6的高亲和力抗体，包括此类抗体的互补决定区(CDR)中关键氨基酸残基的鉴定和分析。具体地，这些高亲和力抗体(a)特异结合至αvβ6；(b)以低于10D5(国际专利申请公开WO 99/07405)的IC50值的IC50值抑制αvβ6与其配体如LAP、纤连蛋白、玻连蛋白和生腱蛋白的结合；(c)阻断TGF-β的活化；(d)在CDR中含有某些氨基酸序列，其提供了对αvβ6的结合特异性；(e)特异结合至β6亚基；和/或(f)在免疫染色步骤，如石蜡包埋的组织的免疫染色中识别αvβ6。 
WO 03/100033也描述了如下发现：结合αvβ6的抗体可以被分成生物物理上不同的类别和亚类。一类抗体显示出阻断配体(如LAP)与αvβ6(阻断剂)的结合的能力。该类抗体可以被进一步分成阳离子依赖型阻断剂和阳离子独立型阻断剂亚类。一些阳离子独立型阻断剂含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而阳离子独立型阻断剂不含有RGD序列。另一类抗体显示出结合αvβ6的能力然而不阻断αvβ6与配体(非阻断剂)的结合。 
此外，WO 03/100033公开了包含重链和轻链的抗体，其互补决定区(CDR)1、2和3由提供对αvβ6的结合特异性的某些氨基酸序列组成。WO 03/100033也提供了特异结合αvβ6但是不抑制αvβ6与潜伏相关肽(LAP)的结合的抗体，以及结合相同表位的抗体。 
WO 03/100033还公开了杂交瘤6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2A1、6.2E 5、7.1G10、7.7G5和7.1C5的细胞，包含抗αvβ6抗体的编码序列的分离的核酸和包含抗αvβ6抗体的氨基酸序列的分离的多肽。具体地，WO 03/100033公开了包含重链和轻链多肽序列的抗αvβ6抗体，作为杂交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5产生的抗体。一些杂交瘤根据布达佩斯条约被保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。具体地，杂交瘤克隆6.3G9 和6.8G6在2001年8月16日被保藏，并且保藏号分别为ATCC PTA-3649和PTA-3645。杂交瘤6.3G9和6.8G6产生的鼠抗体在本申请中就它们作为人源化抗体的潜在开发被进一步研究。 
鼠单克隆抗体3G9是从用人可溶的αvβ6免疫的β6整联蛋白-/-小鼠(Huang等人，J.Cell Biol.133：921-928(1996))分离的鼠IgG1，κ抗体。3G9抗体特异识别在损伤、纤维化和癌症期间以上调的水平表达的αvβ6整联蛋白表位(见例如，Thomas等人，J.Invest.Dermatology 117：67-73(2001)；Brunton等人，Neoplasia 3：215-226(2001)；Agrez等人，Int.J.Cancer 81：90-97(1999)；Breuss，J.Cell Science 108：2241-2251(1995))。它不结合其他αv整联蛋白并且与人和鼠分子交叉反应。已经将鼠单克隆抗体3G9描述为阻断αvβ6与LAP的结合，如通过阻断与纯化的人可溶性αvβ6或表达β6的细胞的结合所测定，从而抑制TGF-β受体活化的促纤维化活性(见WO 03/100033)。也已经表明它以低于一种已知的αvβ6抗体10D5的IC50值抑制αvβ6介导的TGF-β的活化(Huang等人，J.Cell Biol.111：2189-2195(1998))。 
鼠单克隆抗体8G 6是鼠IgG1κ抗体，其也识别αvβ6整联蛋白表位，如WO 03/100033中所述。鼠单克隆抗体8G6是αvβ6的阳离子依赖型的高亲和力阻断剂，显示出以低于10D5的IC50值抑制αvβ6介导的TGF-β活化(见WO 03/100033)。 
3G9和8G6鼠抗体在预防肾和肺的纤维化中都有效，如WO03/100033中所述。此外，鼠抗体3G9能够在人肿瘤异种移植模型中有效抑制肿瘤生长，提示αvβ6在癌症病理中的潜在作用和使用针对αvβ6的此类阻断的有效性。 
Smad4是Smad通路的组分，其涉及TGF-β通路中的信号传导(Levy，L.和Hill，C.S.，Molec.Cell.Biol.25：8108-8125(2005)；Fukuchi，M.等人，Cancer 95：737-743(2002))。该基因也称作dpc4(表示“在胰腺癌中降低”)似乎是肿瘤抑制基因，并且在多种原发性癌中观察到smad4表达的减少，所述癌包括胰腺癌(Luttges，J. 等人，Am.J.Pathol.155：1677-1683(2001)；Subramanian，G.等人，Cancer Res.64：5200-5211(2004))，食道癌(Fukuchi，M.等人，Cancer 95：737-743，(2002)，***(Maliekal，T.T.等人，Oncogene 22：4889-4897(2003)，和其他原发性人类癌症(Iacobuzio-Donahue，C.A.等人，Clin.Canc.Res.10：1597-1604(2004)，以及在包括胰腺癌(Lohr，M.等人，Cancer Res.61：550-555(2001)；Yasutome，M.等人，Clin.Exp.Metastasis 22：461-473(2005))，和结肠癌(Levy，L.，和Hill，C.S.，Molec.Cell.Biol.25：8108-8125(2005))的细胞系癌症模型中观察到smad4表达的减少。肿瘤中smad4的降低的表达与患者存活的不良预后有关，尤其在具有smad4缺陷的胰腺腺癌患者中(Liu，F.，Clin.Cancer Res.7：3853-3856(2001)；Tascilar，M.等人，Clin.Cancer Res.7：4115-4121(2001)；Toga，T.等人，Anticancer Res.24：1173-1178(2004))。smad4基因产物的肿瘤抑制活性的机理还不很了解，但是认为它可以作为“开关”调节TGF-β信号传导通路的某些组分的生长抑制和生长活化活性(综述见，Akhurst，A.J.，J.Clin.Invest.109：1533-1536(2002)；Bachman，K.E.，和Park，B.H.，Curr.Opin.Oncol.17：49-54(2004)；Bierie，B.，和Moses，H.L.，Nature Rev.Cancer 6：506-520(2006))。 
发明概述 
本发明涉及使用αvβ6结合配体，如αvβ6结合抗体进行癌症诊断、治疗和预防的方法。具体地，本发明涉及发现了肿瘤细胞中smad4降低的表达和整联蛋白αvβ6升高的表达的相关性，以及具有此类表达模式的肿瘤细胞更可能应答αvβ6活性化合物和应答TGF-β抑制性配体的倾向之间的相关性。 
从而，在一个实施方案中，本发明提供了表征肿瘤的方法，例如鉴定更可能发展为转移性或侵入性肿瘤的肿瘤，或鉴定用于使用预先选择的试剂如本文描述的抗αvβ6剂的治疗的肿瘤，所述方法包括： (a)从患者得到包含肿瘤或其部分的癌性组织样品，和任选地非癌性组织样品；(b)测定来自所述癌性组织样品和任选地来自所述非癌性组织样品的细胞中smad4的表达水平；(c)将来自所述一种或多种组织样品的细胞与结合整联蛋白αvβ6的一个或多个亚基的一种或多种配体接触；和(d)测定来自所述癌性组织样品的所述细胞和任选地来自所述非癌性组织样品的所述细胞中整联蛋白αvβ6的表达水平，并比较所述癌性组织样品与参考样品中的表达水平，例如，所述非癌性组织样品中的表达水平，从而表征肿瘤。癌性样品中达到或超过参考值的表达水平表明存在更可能发展为转移性或侵入性肿瘤的肿瘤。例如，相对于所述非癌性组织样品中smad4和整联蛋白αvβ6的表达水平，来自所述癌性组织样品的细胞中smad4表达的降低和整联蛋白αvβ6表达水平的同时增加表明在所述患者中存在更可能发展为转移性或侵入性肿瘤的肿瘤。在本发明的一些此类实施方案中，肿瘤细胞是癌，如腺癌。在更具体的实施方案中，癌是胰腺癌、结肠直肠癌、***、鳞状细胞癌(如食道癌)、头颈癌、肝癌、卵巢癌和肺癌。更具体地，所述癌是胰腺癌、结肠直肠癌、***或头颈癌。根据本发明该方面的合适的实施方案使用αvβ6整联蛋白结合配体，其是αvβ6结合抗体或其αvβ6表位结合片段。根据一些此类实施方案，所述抗体是单克隆抗体(其可以是嵌合的、灵长类化的、人或人源化的)，包括美国专利申请公布号US 2005/0255102 A1中公开的那些，将其公开完整引入本文作为参考。合适的此类抗体包括但不限于，被指示为1A8、3G9、8G6、2B1、2B10、2A1、2E5、1G10、7G5、1C5、10D5的α vβ6结合单克隆抗体(ATCC保藏号HB 12382)和CSβ6，以及其片段、嵌合体和杂合体。尤其适用于本发明的此类实施方案的是单克隆抗体3G9和8G6。也尤其适用于本发明的此类实施方案的是人源化单克隆抗体，如指示为hu3G9(BG00011)的人源化3G9抗体和指示为hu8G6的人源化8G6抗体。在本发明的一些此类方面，将所述配体用至少一种可检测标记缀合，所述标记如生色标记(例如，二氨基联苯胺或4-羟基偶氮-苯-2-羧酸)、酶标记(如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核 酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母-醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)、放射性同位素标记(例如， 3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、 90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc和109Pd)、非放射性同位素标记(例如，157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、56Fe、99mTc和112In)、荧光标记(例如， 152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二醛标记和荧光胺标记)、毒性标记(如白喉毒素标记、蓖麻毒蛋白标记和霍乱毒素标记)、化学发光标记(例如，氨基苯二酰肼标记、异氨基苯二酰肼标记、芳族吖啶鎓酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记)、和X放射照相标记(例如，钡或铯)、自旋标记(例如，氘)或核磁共振造影剂标记(例如，Gd、Mn和铁)。 
在相关实施方案中，本发明提供了从患者中清除肿瘤的方法，例如，其中所述肿瘤变成转移或侵入性的可能性增加。此类方法包括例如，如本文所述表征组织样品，例如：(a)根据用于鉴定上述的此类肿瘤的方法，在来自患者的组织样品中鉴定更可能发展为转移性或侵入性肿瘤的肿瘤；和(b)对患者(其中这种肿瘤已经被鉴定)施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体结合一种或多种αvβ6-阳性转移性肿瘤细胞上的整联蛋白αvβ6的一种或多种亚基，其中所述配体与整联蛋白的结合导致所述转移性肿瘤细胞的死亡、化学致敏或者侵入性降低。在优选实施方案中，将相同试剂，如相同的抗体用于表征肿瘤和治疗患者。在其他实施方案中，使用不同的试剂或抗体。例如，可以用具有第一种标记的抗体进行表征，并用具有第二种标记的抗体如治疗剂进行治疗。 
在相关实施方案中，本发明提供了减少或防止患者中转移前肿瘤发展为转移性肿瘤的方法，包括(a)表征如本文所述的组织样品，例 如根据用于鉴定上述的此类肿瘤的方法，在来自患者的组织样品中鉴定更可能发展为转移性或侵入性肿瘤的肿瘤；和(b)对患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体结合转移前或侵入前肿瘤中的一种或多种细胞上的整联蛋白αvβ6的一种或多种亚基，其中所述配体与整联蛋白的结合导致减少或防止转移前癌症细胞侵入到原发性肿瘤周围的组织区域。在根据本发明的该方面的治疗实施方案中，αvβ6-结合配体(例如，αvβ6-结合抗体)可以用一种或多种细胞毒性化合物或试剂缀合或结合，当αvβ6结合配体-毒性化合物缀合至细胞或组织上的一种或多种αvβ6整联蛋白时，导致或引起所述细胞或组织的死亡。在一些实施方案中，用于表征肿瘤的抗体将缺少细胞毒性化合物或试剂。在本发明的额外治疗实施方案中，将αvβ6结合配体(例如，αvβ6结合抗体)与一种或多种此类细胞毒性化合物或试剂一起施用于患者。根据本发明的这些方面可以适当使用的细胞毒性化合物或试剂包括但不限于，细胞毒性剂(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、苯丙氨酸氮芥、多柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、加利车霉素、美登素、trichothene、CC 1065、白喉A链、铜绿假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商路(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、阿霉素(也称作并可以与多柔比星互换使用)、吉西他滨、酚霉素、伊诺霉素、单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)、放射性同位素(如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、和Lu的放射性同位素)和前体药物活化酶(如碱性磷酸酶、芳基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、糖类切割酶、P-内酰胺酶和青霉素酰胺酶。细胞毒性剂也可以是募集特定细胞或者一般增加对肿瘤的免疫应答的物质。在一些实施方案中，以药物组合物的形式对患者施用一种或多种αvβδ整联蛋白结合配体，所述药物组合 物包含有效量的一种或多种αvβδ整联蛋白结合配体和一种或多种可药用载体或赋形剂。所述一种或多种αvβδ整联蛋白结合配体和/或包含一种或多种αvβδ整联蛋白结合配体的一种或多种药物组合物可以通过施用药物组合物的任何合适的方式施用于患者，所述方式包括但不限于，经口施用、肠胃外施用(包括例如，通过肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下途径的注射)、颅内施用、经皮施用、肺内施用和鼻内施用。 
在额外实施方案中，本发明提供了诊断或鉴定肿瘤如癌(例如腺癌)的方法，所述肿瘤更可能发展为侵入性癌和/或更可能应答用结合整联蛋白αvβδ的一种或多种亚基的配体的治疗。合适的此类方法可以包括例如(a)从患者得到包含肿瘤或其部分的癌性上皮组织样品，和非癌性上皮组织样品；(b)测定来自所述组织样品的细胞中smad4的表达水平；(c)将所述组织样品与结合整联蛋白αvβδ的一种或多种亚基的一种或多种配体接触；和(d)测定组织样品中整联蛋白α vβδ的表达水平，其中相对于非癌性组织样品中smad4和整联蛋白α vβδ的表达水平，癌性组织样品中smad4的表达水平的降低和整联蛋白αvβδ的表达水平的同时增加表明患者中存在这样的肿瘤：(a)从原位或非侵入性形式发展为侵入性、转移性形式的可能性增加；和/或(b)更可能应答使用一种或多种上述治疗方法的处理，所述治疗方法依赖于αvβ6结合配体、尤其是缀合到一种或多种细胞毒性化合物或试剂(如上述的那些)的αvβ6结合配体或与所述细胞毒性化合物或试剂一起施用的αvβ6结合配体的结合。此类方法适于诊断或鉴定多种肿瘤，包括但不限于涉及上述上皮组织的那些。在一些此类实施方案中，结合整联蛋白αvβ6的一种或多种亚基的配体是αvβ6整联蛋白结合抗体(其可以是单克隆抗体如上述单克隆抗体)或者其αvβ6表位结合片段。尤其适用于本发明的此类诊断方法的是被可检测地标记的αvβ6结合配体(例如抗体)，即包含或缀合到或结合至少一种可检测标记，如生色标记(例如，二氨基联苯胺或4-羟基偶氮-苯-2-羧酸)、酶标记(如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5 -类固醇异构酶、酵母-醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、葡糖淀粉酶或乙酰胆碱酯酶)、放射性同位素标记(例如，3H、111In、125I、 131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、 211At、212Pb、47Sc或109pd)、非放射性同位素标记(例如，157Gd、55Mn、 162Dy、52Tr、56Fe、99mTc或112In)、荧光标记(例如，152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二醛标记和荧光胺标记)、毒性标记(如白喉毒素标记、蓖麻毒蛋白标记和霍乱毒素标记)、化学发光标记(例如，氨基苯二酰肼标记、异氨基苯二酰肼标记、芳族吖啶鎓酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记)、X放射照相标记(例如，钡或铯)、自旋标记(例如，氘)或核磁共振造影剂标记(例如，Gd、Mn和铁)。 
一方面，本发明描述了抑制来自smad4缺陷肿瘤的细胞生长的方法。该方法包括例如，测定来自该肿瘤的细胞中ssmad4表达水平，用引起该肿瘤细胞生长抑制或死亡的一种或多种试剂处理smad4表达缺陷的肿瘤细胞。所述一种或多种试剂可以是例如，结合整联蛋白αvβ6的一种或多种亚基的配体，如抗αvβ6抗体，或其αvβ6表位结合片段。在另一实施方案中，所述一种或多种试剂抑制细胞中TGF-β信号传导通路。此类试剂包括例如，蛋白质激酶分子、小分子治疗性化合物，或可溶性TGF-β受体多肽。 
在另一方面，本发明描述了使smad4缺陷的肿瘤细胞对生长抑制化学治疗性化合物的治疗化学致敏的方法。该方法包括例如，测定来自该肿瘤的细胞中smad4表达水平，用一种或多种试剂处理smad4表达缺陷的肿瘤细胞，使得该处理导致对一种或多种生长抑制化学治疗性化合物的应答增加。所述一种或多种试剂可以似乎例如，结合整联蛋白αvβ6的一种或多种亚基的配体，或抑制TGF-β信号传导通路 的试剂。 
根据下面的附图和本发明的描述和权利要求，本发明的其他优选实施方案将是技术人员显而易见的。 
附图说明
图1是一组显微照片，描绘了在一些人类癌中αvβ6表达水平(暗区)，所述癌已经从指出的原发性肿瘤部位转移到***(图1A-1D)或肺(图1E-1F)。 
图2是一组显微照片，描绘了在一些人类癌中αvβ6表达水平(暗区)，所述癌已经从指出的原发性肿瘤部位转移到所指出的转移的肿瘤部位。 
图3是一组两张显微照片，描绘了原位导管癌(DCIS；BrCa 19)(图4A)和侵入性乳腺癌(BrCa 23)(图4B)的组织切片中观察到的αvβ6表达水平(暗区)。 
图4是一组显微照片，描绘了来自三名不同患者的原发性和转移性胰腺导管腺癌肿瘤的匹配样品中观察到的αvβ6表达水平(暗区)。图4A-4C：来自三名不同患者的原发性肿瘤样品中的表达。图4D-4F：来自这些相同的3名患者的匹配的***转移瘤中的表达。图4G-4H：来自这3名患者两名的正常胰腺组织中的表达。 
图5是一组显微照片，描绘了来自5名不同患者的原发性和转移性胰腺腺癌肿瘤的匹配样品中观察到的αvβ6表达水平(暗区)。图65-5E：来自5名不同患者的原发性肿瘤样品中的表达，三名具有以腺鳞癌为特征的肿瘤(图5A-5C)，两名具有以弱分化为特征的肿瘤(图5D-5E)。图5F-5J：来自这些相同的5名患者的匹配的***转移瘤中的表达。图5K-5L：来自这5名患者中2名的正常胰腺组织中的表达。 
图6图解了抗αvβ6单克隆抗体(3G9)抑制人胰腺癌的BxPC-3小鼠异种移植模型中的肿瘤生长的能力。图6A：用抗αvβ6单克隆抗体(3G9)通过免疫组织化学染色的异种移植肿瘤的切片的显微照片。图 6B：用αvβ6mAb 3G9(▲)、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白 ，或载体PBS(■)处理期间BxPC-3异种移植肿瘤生长曲线。图6C：研究结束时(第66天)个体肿瘤大小的散点图。 
图7是来自三名不同患者样品的胰腺组织/肿瘤切片的一系列显微照片，所述切片就整联蛋白αvβ6(顶部三个图)或smad4(底部三个图)的表达进行探测。 
图8是来自三名不同患者样品(不同于图7的那些)的胰腺组织/肿瘤切片的一系列显微照片，所述切片就整联蛋白αvβ6(顶部3个图)或smad4(底部3个图)的表达进行探测。 
图9是来自三名不同患者样品(不同于图7和8的那些)的胰腺组织/肿瘤切片的一系列显微照片，所述切片就整联蛋白αvβ6(顶部3个图)或smad4(底部3个图)的表达进行探测。 
图10是来自两名不同患者样品(不同于图7-9的那些)的胰腺组织/肿瘤切片的一系列显微照片，所述切片就整联蛋白αvβ6(顶部2个图)或smad4(底部2个图)的表达进行探测。 
图11是来自两名不同患者样品(不同于图7-10的那些)的胰腺组织/肿瘤切片的一系列显微照片，所述切片就整联蛋白αvβ6(顶部2个图)或smad4(底部2个图)的表达进行探测，所述样品对于整联蛋白αvβ6的表达是异质性的(“+/-”)。 
图12是来自一名患者样品(不同于图11的那些)的胰腺组织/肿瘤切片的一系列显微照片，所述切片就整联蛋白αvβ6或smad4的表达进行探测，所述样品对于整联蛋白αvβ6的表达是异质性的(“+/-”)。 
图13是表格，总计了图7-12中描绘的结果。 
图14总结了在一组胰腺癌细胞系中αvβ6和smad4表达水平。 
图15是一组显微照片，描绘了如通过Folio阵列所测定的胰腺癌中αvβ6和smad4的表达的水平。 
图16是示意图，总结了23个不同的胰腺肿瘤组织样品中的αvβ6和smad4表达水平。 
图17是示意图，总结了在Biomax组织微阵列上测定的70个不同的胰腺导管腺癌(PDAC)中αvβ6和smad4表达水平。 
图18是示意图，总结了在Leiden阵列上测定的50个不同的PDAC样品中αvβ6和smad4表达水平。 
图19是示意图，总结了在Leiden阵列上测定的9个不同的PDAC转移瘤样品中αvβ6和smad4表达水平。 
图20A和B是条形图，总结了分别通过Biomax阵列和Leiden阵列测量的PDAC中αvβ6和smad4表达水平结果。 
图21是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的BxPC-3人胰腺腺癌对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和吉西他滨的应答。 
图22是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的BxPC-3人胰腺腺癌对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和吉西他滨的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图23是散点图，图解了在治疗方案的第45天时，皮下植入无胸腺裸鼠的BxPC-3人胰腺腺癌对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和吉西他滨的应答。 
图24是曲线图，图解了应答用mAb 3G9或吉西他滨的治疗，宿主动物体重的改变。 
图25是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的BxPC-3人胰腺腺癌细胞对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和多柔比星的应答。 
图26是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的BxPC-3人胰腺腺癌细胞对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和多柔比星的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图27是散点图，图解了在治疗方案的第45天时，皮下植入无胸腺裸鼠的BxPC-3人胰腺腺癌细胞对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和多柔比星的应答。 
图28是曲线图，图解了应答用mAb 3G9或多柔比星的治疗，宿主动物体重的改变。 
图29A是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Su86.86人胰腺 腺癌细胞对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和吉西他滨，以及对可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-β RII-Fc)的应答。图29B是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Su86.86人胰腺腺癌细胞对作为单一试剂或组合的mAb 3G9和吉西他滨，以及对TGF-β RII-Fc的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图30A是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Panc 04人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9和TGF-β RII-Fc以及对任一试剂与吉西他滨组合的应答。图30B是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Panc04人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9和TGF-β RII-Fc以及对任一试剂与吉西他滨组合的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图31A是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Capan-2人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9、TGF-β RII-Fc和吉西他滨，以及对mAb 3G9和TGF-β RII-Fc的每一种与吉西他滨组合的应答。图31B是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Capan-2人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9、TGF-β RII-Fc和吉西他滨，以及对mAb 3G9和TGF-β RII-Fc的每一种与吉西他滨组合的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图32A-32C是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的SW1990人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9和吉西他滨(每种单独或组合)的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图33A是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Capan-1人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9、TGF-β RII-Fc和吉西他滨，以及对mAb 3G9和TGF-β RII-Fc的每一种与吉西他滨组合的应答。图33B是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Capan-1人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9、TGF-β RII-Fc和吉西他滨，以及对mAb 3G9和TGF-β RII-Fc的每一种与吉西他滨组合的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图34是条形图，图解了原位植入无胸腺裸鼠的ASPC-1人胰腺腺癌细胞对mAb 3G9、TGF-β RII-Fc和吉西他滨，以及对mAb 3G9和 TGF-β RII-Fc的每一种与吉西他滨组合的应答。 
图35是表格，总结了图29-34中描绘的结果。 
图36A-36D是Kaplan-Meier曲线，表示来自莱顿大学医学中心(Leiden University Medical Center)的患有胰腺导管腺癌的26名患者的累计存活作为αvβ6的保持或αvβ6表达的缺陷，或者smad4的保持或smad4表达的缺陷，或者这些表型的组合的函数。分析了仅仅来自原发性肿瘤的数据。 
图37是Kaplan-Meier曲线，表示患有胰腺导管腺癌的患者的累计存活作为作为smad4的保持或smad4表达缺陷的函数。分析了仅仅来自原发性肿瘤的数据。Log Rank(Mantel-Cox)。 
图38是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的SW 1990人胰腺腺癌细胞(转移部位：脾脏)对mAb 3G9和可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-βRII-Fc)的应答。 
图39是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的SW1990人胰腺腺癌细胞(转移部位：脾脏)对mAb 3G9和可溶性TGF-βRII-Fc的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分数。 
图40是散点图，图解了在治疗方案的第42天时，皮下植入无胸腺裸鼠的SW 1990人胰腺腺癌细胞(转移部位：脾脏)对mAb 3G9和可溶性TGF-βRII-Fc的应答。 
图41是一组图，显示了：A：基于αvβ6表达分类的SW 1990细胞亚群中显示出smad4表达的Western印迹的放射自显影照片；B：在移植的SW 1990肿瘤中αvβ6表达的免疫组织化学；和C-E：通过smad4和αvβ6表达对SW 1990细胞群体的FACS介导的细胞分类。 
图42是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9和可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-βRII-Fc)的应答。 
图43是散点图，图解了在治疗方案第39天时，皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9、mAb 4B4和可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-βRII-Fc)的应答。 
图44是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9、mAb 4B4和可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-βRII-Fc)的应答。 
图45是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9、mAb 4B4、mAb 8G6和可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-βRII-Fc)的应答。 
图46是散点图，图解了在治疗方案第34天时，皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9、mAb 4B4、mAb 8G6和可溶性TGF-β受体II/Fc融合蛋白(TGF-βRII-Fc)的应答。 
图47是一对曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9(顶部)和对人源化的mAb 3G9(BG00011)(底部)的应答。 
图48是散点图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9(顶部)和对人源化的mAb 3G9(BG00011)(底部)的应答。 
图49是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对鼠mAb 3G9和对人源化的mAb 3G9(BG00011)的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体作为阴性对照；TGF-βRII-Fc作为阳性对照)结果的百分比。 
图50是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对野生型鼠mAb 3G9的应答。 
图51是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对糖基鼠mAb 3G9的应答。 
图52是散点图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对野生型鼠mAb 3G9和对糖基鼠mAb 3G9的应答。 
图53是曲线图，图解了皮下植入无胸腺裸鼠的Detroit 562人咽癌细胞对野生型鼠mAb 3G9和对糖基鼠mAb 3G9的应答，将测试动物的结果表示为对照(载体)结果的百分比。 
图54是表格，总结了图42-52的结果。 
发明详述 
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所述技术领域中技术人员通常理解的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明，但是在下文中描述优选的方法和材料。 
定义 
约：如本文所用，当指任何数值时，术语“约”指所述数值的±10％的数值(例如，“约50℃”包括从45℃到55℃的温度范围，包括端点；类似地，“约100mM”包括从90mM到110mM的浓度范围，包括端点)。 
拮抗剂：如本文所用，术语“拮抗剂”指减小、实质性减小或者完全抑制αvβ6整联蛋白在细胞、组织或生物中的生物学和/或生理学作用的化合物、分子、部分或复合体。拮抗剂(其可以是αvβ6的配体)可以以多种方式执行此类作用，所述方式包括但不限于与另一配体竞争结合细胞表面上的αvβ6；以减小、实质性减小或者抑制整联蛋白与其他配体结合的能力的方式与αvβ6相互作用；结合并诱导细胞表面αvβ6的构象改变使得整联蛋白采取其他配体不再能够结合(或者可以仅仅以减小或实质性减小的亲和力和/或效率结合)的结构；诱导细胞、组织或生物中的生理学改变(例如，细胞内信号复合体的增加；转录抑制剂的增加；细胞表面αvβ6表达的减少；等等)使得其他配体的结合或者结合至细胞上的αvβ6时此类配体诱导的生 理学信号被减小、实质性减小或者完全抑制；和普通技术人员熟悉的、拮抗剂可以借以发挥它们的活性的其他机理。如普通技术人员可以理解，拮抗剂可以具有与它拮抗的另一αvβ6结合部分(例如，αvβ6结合配体)相似的结构(例如，拮抗剂可以是突变蛋白、激动剂的变体、片段或衍生物)或者可以具有完全不相关的结构。 
结合：如本文所用，术语“结合”指结合或附着，其可以是共价的，例如通过化学偶联，或非共价的，例如，离子相互作用、疏水相互作用、氢键，等等。共价键可以是例如酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、氨基甲酸乙酯、酰胺、胺、肽、二酰亚胺、腙、酰肼、碳-硫键、碳-磷键、等等。术语“结合”比术语“偶联的”、“缀合的”和“附着的”更广并包括这些术语。 
缀合物/缀合：如本文所用，术语“缀合物”指部分如化学品或放射性同位素共价附着到结合αvβ6的配体，如αvβ6结合抗体或其片段上的产物。“缀合”指形成如前一句中定义的缀合物。将化学品或放射性同位素缀合到生物活性物质如蛋白质或多肽(包括抗体)领域技术人员通常使用的任一种方法可以用于本发明。 
疾病、病症、状况：如本文所用，术语“疾病”或“病症”指人或动物的任何不利的状况，包括肿瘤、癌症、***反应、成瘾、自身免疫、感染、中毒或者最佳精神或身体功能的受损。如本文所用的“状况”包括疾病和病症但是也指生理状态。例如，生育力是生理状态但不是疾病或病症。适于通过降低生育力防止怀孕的本发明的组合物将因此被描述为状况(生育力)的治疗，但不是病症或疾病的治疗。其他状况是本领域普通技术人员所理解的。 
有效量：如本文所用，术语“有效量”指必需或足够实现所希望的生理效果的给定化合物、缀合物或组合物的量。根据本发明方法的给定化合物、缀合物或组合物的有效量将是实现该所选结果的量，并且这种量可以由本领域技术人员使用本领域已知的和/或本文描述的测定法常规地确定，而不必需要过度实验。例如，治疗或预防癌症转移的有效量可以是防止肿瘤细胞在体内经基膜或内皮层迁移或侵入所 必需的量。该术语也与“足够量”同义。任何具体应用的有效量可以根据如下因素而变化，如被治疗的疾病、病症或状况、被施用的具体组合物、施用途径、受试者的大小，和/或疾病或状况的严重性。本领域技术人员可以依据经验根据本文提供的教导，不用过度实验就确定本发明的具体化合物、缀合物或组合物的有效量。 
一、一个或一种：当术语“一”、“一个”或“一种”用于本公开时，它们指“至少一个”或“一个或多个”，除非另有指明。同样，术语“一个”“一个或多个”和“至少一个”可在本文互换使用。 
肽、多肽、蛋白质：如本文所用，术语“多肽”意在包括单数“多肽”以及复数“多肽”，并且指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何一条或多条链，但是不指产物的特定长度。从而，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以用于替代这些术语的任一个或与其互换使用。术语“多肽”也意在指多肽的表达后修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶切割、或者通过非自然发生的氨基酸修饰。多肽可以来自天然生物来源或者通过重组技术产生，而不必需从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成产生。根据该定义，用于本发明的多肽可以为约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多、或者2000个或更多氨基酸大小。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不必需具有此类结构。具有确定的三维结构的多肽被称作折叠的，并且不具有确定的三维结构而是采取许多不同构象的多肽被称作未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白指偶联到至少一个糖部分的蛋白质，所述糖部分通过氨基酸残基(如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链附着到蛋白质。用于本发明的优选的多肽包括为细胞表面上αvβ6整联蛋白的配体或者与其 结合的多肽，包括但不限于识别并结合αvβ6上一个或多个表位的抗体(特别是单克隆抗体)。 
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其天然环境中的多肽。不需要具体的纯化水平。例如，可以将分离的多肽从其自然或天然环境除去。对于本发明，认为宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质是分离的，就像通过任何合适的技术分离、分级分离或者部分或基本纯化的天然或重组多肽一样。 
本发明多肽还包括前面多肽的片段、衍生物、类似物或变体，和其任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”当指抗αvβ6抗体或抗体多肽时，保留对应的天然抗体或多肽的至少一些抗原结合性质的任何多肽，即保留结合αvβ6整联蛋白上的一个或多个表位的能力的那些多肽。本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段，以及缺失片段，和本文别处讨论的特定抗体片段。用于本发明的抗αvβ6抗体和抗体多肽的变体包括如上述的片段，以及由于氨基酸替代、缺失或***而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或非天然存在。可以用本领域已知的诱变技术产非天然存在的变体生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸替代、缺失或添加。用于本发明的抗αvβ6抗体和抗体多肽的衍生物是被改变从而显示出在天然多肽上没有发现的额外特征的多肽。实例包括融合蛋白。变异多肽在本文中也可以被称作“多肽类似物”。如本文所用，抗αvβ6抗体或抗体多肽的“衍生物”指具有通过官能侧基反应化学衍生的一个或多个残基的对象多肽。作为“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可以替代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以替代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替代组氨酸；高丝氨酸可以替代丝氨酸；或鸟氨酸可以替代赖氨酸。 
smad4：如本文所用，肿瘤抑制基因smad4与本领域技术人员已知的该相同肿瘤抑制基因的其他名称同义，所述其他名称包括但不限于madh4和dpc4。与常规一样，该基因的表达产物在本文中被称作SMAD4，其与本领域技术人员已知的该基因表达产物的其他名称同义，所述其 他名称包括但不限于MADH4和DPC4。 
基本上，实质上：如本文所用，说蛋白质的缀合“基本上”不干扰蛋白质与其受体的结合的能力，是如果缀合的蛋白质与受体的结合率和/或量不小于没有被缀合的相应细胞因子、趋化因子、生长因子或多肽激素的结合率和/或量的约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％或以上。 
治疗：如本文所用，术语“治疗”或“处理”指预防和/或治疗，尤其其中的目的是防止或减缓(减轻)不希望的生理学改变或病症，如多发性硬化的进展。有益的或者所希望的临床结果包括但不限于，可检测到的或不可检测到的症状的减轻、疾病程度的减小、疾病的稳定化(即不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、和缓解(部分或全部的)。“治疗”也可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已经具有状况或病症的那些人以及易于具有所述状况或病症的那些人，或者待预防其所述状况或病症的那些人。“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指希望被诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类和其他灵长类、家养动物、农业动物、和动物园动物、运动动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、牛等等。 
概述 
本发明至少部分基于如下发现，即在某些肿瘤细胞中，肿瘤抑制基因smad4和整联蛋白αvβ6的表达水平之间存在反相关，并且这两种标记物的表达水平可以用于确定或预测此类肿瘤细胞对用抗整联蛋白配体并用拮抗TGF-β信号传导通路的试剂治疗的敏感性。具体地，已经发现显示出smad4表达水平降低的肿瘤细胞同时表达增加量的整联蛋白αvβ6；因此，与显示出smad4的更高表达水平(同时更低水平的表面整联蛋白αvβ6)的肿瘤细胞相比，smad4缺陷的肿瘤细胞更 倾向于应答结合整联蛋白αvβ6的配体。在相关实施方案中，本发明人已经发现与显示出smad4的更高表达水平的肿瘤细胞相比，smad4缺陷的肿瘤细胞更可能应答拮抗TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的配体。如本文所用，“应答”结合整联蛋白αvβ6的配体或者应答拮抗TGF-β通路的一种或多种组分的配体的肿瘤细胞指这样的肿瘤细胞，其中生长、***，和/或其他代谢通路受到不利影响使得细胞的生长或***受到抑制和/或经历凋亡或其他形式的细胞死亡。 
在其他实施方案中，本发明也提供了使用该差异表达的鉴定在确定肿瘤细胞的侵入性和/或转移性潜力和鉴定更可能快速发展并且应该在患者中被积极治疗的那些癌，如某些腺癌(包括胰腺癌)中的方法。本发明也提供了鉴定如下肿瘤的方法，在所述肿瘤中，组成肿瘤的细胞更可能应答用结合整联蛋白αvβ6的一种或多种配体进行的治疗。本发明也提供了诊断和治疗/预防肿瘤转移的方法。 
smad4和整联蛋白αvβ6的表达的测定 
在一个实施方案中，本发明涉及鉴定更可能应答结合整联蛋白α vβ6的配体和/或拮抗TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的配体的肿瘤和肿瘤细胞，尤其癌细胞，如胰腺癌细胞。此类方法包括例如，测定肿瘤细胞的肿瘤抑制基因smad4的表达水平，其中smad4的降低的表达表明该肿瘤细胞更可能应答结合整联蛋白αvβ6的配体和/或拮抗TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的配体。在一些此类实施方案中，在从患有这种肿瘤的患者得到的组织切片中测定肿瘤(如癌)的细胞中的smad4表达水平，其中相对于非肿瘤组织样品(理想地来自相同患者的相同器官)，肿瘤细胞中smad4表达的降低表明该肿瘤更可能应答结合整联蛋白αvβ6的配体和/或拮抗TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的配体。以这种方式，可以快速鉴定和实现用于治疗患者中此类肿瘤的合适的和积极方案，从而使得癌症患者的阳性治疗结果的可能性增加。 
在每种此类实施方案中，本发明依赖于鉴定或研究某些肿瘤细胞 中smad4的降低的表达，和αvβ6的同时升高的表达。使用本领域公知的用于测量基因表达的方法，可以容易地测定smad4的表达水平，所述方法包括例如，杂交或PCR/RT-PCR，其中使用已知的基因探针或者smad4基因的特异引物(见例如，Maliekal，T.T.等人，Oncogene22：4889-4897(2003)；lacobuzio-Donahue，C.A.等人，Clin.CancerRes.10：1597-1604(2004))；northern印迹(见例如，Yasutome，M.等人，Clin.Exper.Metast.22：461-473(2005))和用抗SMAD4抗体进行免疫组织化学分析(见例如，Lüttges，J.等人，Am.J.Pathol.158：1677-1683(2001)；Fukuchi，M.等人，Cancer 95737-743(2002)；Subramanian，G.等人，Cancer Res.64：5200-5211(2004)；Levy，L.和Hill，C.S.，Mo1.Cell.Bio1.25：8108-8125(2005)；Toga，T.等人，Anticancer Res.24：1173-1 178(2004))。适于检测给定细胞、组织、器官或生物样品中smad4基因表达水平的其他方法是本领域技术人员熟悉的。类似地，使用本领域公知的测量整联蛋白表达的方法可以容易地测定αvβ6的表达水平。在一些此类实施方案中，通过将组织、肿瘤或肿瘤细胞与结合所述组织、肿瘤或肿瘤细胞中整联蛋白αvβ6的一种或多种配体接触完成此类测定。 
在一些此类实施方案中，所述组织、肿瘤或肿瘤细胞是癌组织、肿瘤或肿瘤细胞，包括来自癌(如腺癌)的那些。在更具体的实施方案中，所述癌是胰腺癌、结肠直肠癌、***、鳞状细胞癌(如食道癌)、头颈癌、肝癌、卵巢癌和肺癌。更具体地，所述癌是胰腺癌、结肠直肠癌、***或头颈癌。 
在本发明的一些实施方案中，结合αvβ6的配体是αvβ6的拮抗剂。此类拮抗剂包括但不限于特异结合αvβ6的抗体；特异结合β6的抗体；特异结合αv的抗体；特异结合αvβ6的配体的抗体、αvβ6的配体；反义核酸；以及此类配体的肽、非肽和肽模拟类似物。 
在本发明的一些此类实施方案中，结合整联蛋白αvβ6的配体是结合整联蛋白αvβ6的抗体或其整联蛋白αvβ6结合片段、变体或衍生物。此类抗体可以结合至整联蛋白的一个亚基(例如，结合至位于 αv亚基上的表位或者结合至位于β6亚基上的表位的抗体)，或者结合至两个亚基(例如，结合至位于整联蛋白异二聚体区域中的抗体，所述区域桥接αv和β6亚基)。除非特别指示完整大小的抗体，如天然存在的抗体，术语“αvβ6抗体”包括完整大小的抗体以及此类抗体的αvβ6结合片段、变体、类似物或衍生物，例如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或者以类似于抗体分子的方式结合抗原工程化的抗体分子或片段。抗体可以是合成的、单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域公知的技术制备。对于治疗应用，具有人恒定区或可变区的“人”单克隆抗体通常是优选的，以便最小化患者对该抗体的免疫应答。通过免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因动物可以产生此类抗体(见例如，Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.764：525-535(1995))。关于合成的或半合成的抗体，此类术语意在涵盖但不限于抗体片段、同种型转换的抗体、人源化抗体(例如，小鼠-人、人-小鼠，等等)、杂种、具有多种特异性的抗体、完全合成的抗体样分子，等等。 
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链的可变区，并且通常至少包含重链和轻链的可变区。脊椎动物***中的基本免疫球蛋白结构是相对完全公知的。见例如，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，第二版，1988)。如普通技术人员理解的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括可以在生物化学上区分的多种广泛类别的多肽。本领域技术人员理解重链被分为γ，μ，α，δ或ε，还有某些亚类(例如，γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“类别”为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等等被良好表征并且已知赋予功能专一性。这些类别每一种和同种型的经修饰形式是技术人员参考本公开后容易分辨的并且因此在本发明的范围内。 
适用于本发明的结合αvβ6或其αvβ6结合片段、变体或衍生物的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗 体、人源化抗体、灵长类化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、通过Fab表达文库产生的片段、和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，针对本文公开的抗αvβ6抗体的抗Id抗体)。ScFv分子是本领域已知的并且例如在美国专利5,892,019中描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。 
抗体片段，包括单链抗体，可以包含单独的可变区或者与下面的整体或部分组合：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其也包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。用于本文公开的诊断和治疗方法的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、大鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、骆马、马、牛或鸡抗体。最优选地，抗体是人、人源化或灵长类化抗体，或者嵌合抗体，特别是单克隆抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并且包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体或从对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文和Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所述。如本文所用，术语“嵌合抗体”将指任何抗体，其中免疫反应区或部位得自或来自第一个物种而恒定区(其可以是完整的、部分的或根据本发明修饰)得自第二个物种。在优选实施方案中，目标结合区或部位来自非人来源(例如小鼠或灵长类)而恒定区来自人。 
尤其优选的用于本发明的抗体是抗αvβ6单克隆抗体，如Weinreb等人，J.Biol.Chem.279(17)：17875-17877(2004)(将其公开完整引入本文作为参考)中公开的那些，包括其中公开的单克隆抗体6.8G6(“8G6”)和6.3G9(“3G9”)。结合αvβ6并因此适用于本发明的额外抗体包括结合整联蛋白αvβ6的β6亚基的抗体(包括其片 段、变体或衍生物)(并且因此被认为是“抗β6抗体”)，如Weinacker等人，J.Cell Biol.269：1-9(1994)，将其公开完整引入本文作为参考；和美国专利号6,692,741 B2(将其公开完整引入本文作为参考)，尤其第2-3栏和7-8栏中公开的那些，包括被称作10D5的单克隆抗体(ATCC保藏号HB12382，1997年8月6日保藏，美国典型培养物保藏中心P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)(见美国专利号6,692,741，第3栏，7-13行，和7-8栏)和CSβ6(见美国专利号6,692,741，7-8栏)。根据本发明该方面的合适的实施方案使用为α vβ6-结合抗体或其αvβ6表位结合片段的αvβ6整联蛋白-结合配体。适用于本发明该方面的额外抗体包括，但不限于，美国专利申请公布号US 2005/0255102 A1中公开的αvβ6结合单克隆抗体(将其公开完整引入本文作为参考)，包括其中称作3G9、8G6、1A8、2B1、2B10、2A1、2E5、1G10、7G5、1C5的那些，以及其片段、嵌合体和杂种抗体。尤其适用于本发明的抗体是单克隆抗体2B1、3G9和8G6。 
在一些实施方案中，所述抗体包含与通过杂交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5产生的抗体相同的重链和轻链多肽序列。用于本发明尤其合适的抗体是单克隆抗体，其包含与杂交瘤6.2B1(ATCC保藏号PTA-3646，2001年8月16日保藏，美国典型培养物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)产生的2B1抗体、杂交瘤6.8G6(ATCC保藏号PTA-3645，2001年8月16日保藏，美国典型培养物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)产生的抗体8G6、和杂交瘤6.3G9(ATCC保藏号PTA-3649，2001年8月16日保藏，美国典型培养物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)产生的抗体3G9(见公布的美国申请号US2005/0255102 A1，将其公开完整引入本文作为参考，尤其第1页，0008段；第2页，0032和0036段；和6-14页实施例中)和被称作10D5的抗体(分泌该抗体的杂交瘤在1997年8月6日被保藏，ATCC保藏号HB 12382，美国典型培养物保藏中心，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108)(见美国专利号6,692,741，将其公开完整引入 本文作为参考，尤其第3栏7-13行，和第7-8栏)相同的重链和轻链多肽序列。 
在一些实施方案中，所述抗体包含重链，其互补决定区(CDR)1、2和3基本上由(即，一些保守变异除外)下面表1中所示的序列组成。在一些此类实施方案中，所述抗体包含重链，其CDR1基本上由SEQ ID NOs：1-5的任一个组成；其CDR2基本上由SEQ ID NOs：6-11的任一个组成；其CDR3基本上由SEQ ID NOs：12-17的任一个组成；和/或轻链，其CDR1、2和3基本上分别由SEQ ID NOs：18-23、24-27和28-33的任一个序列组成。 
表1 
抗体          氨基酸序列           SEQ ID NO：
重链CDR1序列 
8G6           SYTFTDYAMH           1 
1A8           SYTFTDYTMH           2 
2B1           GFTFSRYVMS           3 
3G9           GFTFSRYVMS           3 
2A1           GYDFNNDLIE           4 
2G2           GYAFTNYLIE           5 
重链CDR2序列 
8G6           VISTYYGNTNYNQKFKG    6 
1A8           VIDTYYGKTNYNQKFEG    7 
2B1           SISSG-GSTYYPDSVKG    8 
3G9           SISSG-GRMYYPDTVKG    9 
2A1           VINPGSGRTNYNEKFKG    10 
2G2           VISPGSGIINYNEKFKG    11 
重链CDR3序列 
8G6           GGLRRGDRPSLRYAMDY    12 
1A8           GGFRRGDRPSLRYAMDS    13 
2B1           GAIYDG-----YYVFAY    14 
3G9           GSIYDG-----YYVFPY    15 
2A1           IYYGPH-----SYAMDY    16 
2G2           ID-YSG-----PYAVDD    17 
表1(续) 
抗体          氨基酸序列          SEQ ID N0：
轻链CDR1序列 
8G6           RASQSVSTSS-YSYMY    18 
1A8           RASQSVSIST-YSYIH    19 
2B1           SASSSVSSS----YLY    20 
3G9           SANSSVSSS----YLY    21 
2A1           KASLDVRTAVA         22 
2G2           KASQAVNTAVA         23 
轻链CDR2序列 
8G6           YASNLES             24 
1A8           YASNLES             24 
2B1           STSNLAS             25 
3G9           STSNLAS             25 
2A1           SASYRYT             26 
2G2           SASYQYT             27 
轻链CDR3序列 
8G6           QHNWEIPFT           28 
1A8           QHSWEIPYT           29 
2B1           HQWSSYPPT           30 
3G9           HQWSTYPPT           31 
2A1           QQHYGIPWT           32 
2G2           QHHYGVPWT           33 
在其他相关实施方案中，用于本发明的单克隆抗体是嵌合抗体，即其中通过重组DNA技术改变来自一个物种(例如，小鼠、大鼠或兔)的同源抗体使得重链和/或轻链的铰链区和/或恒定区的部分或全部被来自另一物种(例如人)的抗体的对应组分替换的那些单克隆抗体。通常，经改造的抗体的可变结构域保持与同源抗体的可变结构域相同或基本上相同。这种被改造的抗体被称作嵌合抗体，并且当施用于得 到铰链区和/或恒定区的来源物种(例如人)个体时的抗原性低于所述同源抗体。制备嵌合抗体的方法是本领域公知的。 
在其他相关实施方案中，用于本发明的单克隆抗体是完全人抗体。产生此类完全人单克隆抗体的方法是本领域公知的(见例如，US2005/0255102 A1，第4页，0069-0070段，将其引入本文作为参考)。 
在其他相关实施方案中，用于本发明的单克隆抗体是来自其他物种的同源抗αvβ6抗体的人源化形式。人源化抗体是通过重组DNA技术产生的抗体，其中不是抗原结合所需的人免疫球蛋白轻链或重链的一些或全部氨基酸(例如，恒定区和可变区的构架区)用于替代来自同源的非人抗体的轻链或重链的对应氨基酸。作为实例，针对给定抗原的鼠抗体的人源化形式在其重链和轻链上具有：(a)人抗体的恒定区；(b)来自人抗体的可变结构域的构架区；和(c)来自鼠抗体的CDR。当需要时，可以将人构架区中一个或多个残基改变成鼠抗体中对应位置的残基以便保留人源化抗体对抗原的结合亲和力。该改变有时被称作“回复突变”。与嵌合人抗体相比，人源化抗体通常不可能在人体中引起免疫应答，因为人源化抗体含有少得多的非人组分。产生此类人源化单克隆抗体的方法是本领域公知的(见例如，US2005/0255102 A1，4-5页，0072-0077，将其引入本文作为参考)。 
除了此类实施方案外，所述人源化抗体还在重链和/或轻链中包含一个或多个CDR，其来自不同抗体的重链和/或轻链中对应的CDR。此类抗体的一个合适的非限制性实例是人源化3G9抗体，其包含轻链CDR1，该轻链CDR1具有来自2B1抗体的轻链CDR1的序列(SEQ IDNO：20)，而不是来自保藏的3G9抗体的轻链CDR1的序列(SEQ IDNO：21)。此类具有SEQ ID NO：20所示的轻链CDR1序列的人源化3G9抗体在本文中被称作hu3G9(或BG00011)。此类抗体的另一合适的非限制性实例是包含轻链CDR1的人源化8G6抗体，所述轻链CDR1具有来自2B1抗体的轻链CDR1的序列(SEQ ID NO：20)，而不是来自保藏的8G6抗体的轻链CDR1的序列(SEQ ID NO：18)。此类具有SEQ ID NO：20所示的轻链CDR1序列的人源化8G6抗体在本文中被称作hu8G9。考虑 到表1中描述的序列和本文提供的教导，此类衍生抗体的额外实例(其中一个或多个重链和/或轻链CDR已经被来自另一抗体的一个或多个对应的重链和/或轻链CDR替代，并且适于根据本发明的使用)是本领域技术人员显而易见的。制备此类人源化抗体，包括此类衍生的人源化抗体的合适的方法是本领域技术人员熟悉的并且例如在美国公布的申请号2005/0255102 A1中所示，将其公开完整引入本文作为参考。 
在一些实施方案中，结合αvβ6的配体(如抗体)可以以非缀合形式使用。在此类实施方案中，将肿瘤细胞与结合αvβ6的配体在有利于该配体结合细胞表面上αvβ6的条件下接触。合适的此类条件是本领域公知的，并且在下面的实施例中详述。在一些此类实施方案中，配体的结合使该配体结合的肿瘤细胞对一种或多种毒性化合物的作用致敏，即，配体与肿瘤细胞表面上αvβ6的结合诱导肿瘤细胞变得对一种或多种毒素的生长抑制和/或死亡诱导作用更敏感。从而，在额外实施方案中，本发明提供了抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞的方法，包括(a)将肿瘤细胞与结合细胞表面上αvβ6的一种或多种配体(例如，一种或多种抗体或其片段)在有利于配体结合细胞表面上αvβ6的条件下接触；和然后(b)将肿瘤细胞与抑制肿瘤细胞生长和/或杀死肿瘤细胞的一种或多种毒性化合物接触。根据本发明该方面使用的合适的毒性化合物，以及其合适的剂量和施用方案是本领域已知的并且在本文别处详细描述。 
在相关实施方案中，本发明提供了通过用调节(例如，抑制或活化)TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的一种或多种试剂处理肿瘤细胞使得肿瘤细胞对一种或多种毒性化合物致敏的方法。合适的此类试剂包括例如，TGF-β或其片段、可溶性TGF-β受体或其片段，或包含可溶性TGF-β受体或其片段的融合蛋白(例如，TGF-βII型受体片段融合到抗体的Fc区，以产生可溶性“TGF-βRII-Fc”多肽)。在使用中，TGF-β调节剂的结合或内化使得结合或内化该调节剂的肿瘤细胞对一种或多种毒性化合物作用致敏，即诱导肿瘤细胞变得对一种或多种毒素的生长抑制和/或死亡诱导作用更敏感。从而，在额外实 施方案中，本发明提供了抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞的方法，包括(a)将肿瘤细胞与调节(例如，抑制或活化)TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的一种或多种试剂在有利于该试剂被肿瘤细胞结合或内化的条件下接触；然后(b)将肿瘤细胞与抑制肿瘤细胞生长和/或杀死肿瘤细胞的一种或多种毒性化合物接触。根据本发明该方面使用的合适的毒性化合物，以及其合适的剂量和施用方案是本领域已知的并且在本文别处详细描述。 
αvβ6结合配体的缀合物和其他修饰 
如上文指出的，在一些实施方案中，结合αvβ6的配体，如抗体可以以非缀合形式使用。在其他实施方案中，结合αvβ6的配体，如抗体可以缀合到例如可检测标记、药物、前体药物或同位素。 
在下文更详细描述的本发明的一些方法中，如检测细胞或组织中αvβ6表达以及检测smad4表达作为测量肿瘤细胞应答αvβ6结合配体和/或TGF-β阻断剂的应答的方法，将αvβ6结合配体(如抗体)缀合到一种或多种可检测标记。对应此类用途，αvβ6结合配体，如αvβ6结合抗体可以通过共价或非共价附着生色、酶的、放射性同位素的、同位素的、荧光的、毒性的、化学发光的、核磁共振造影剂标记或其他标记被检测地标记。 
合适的生色标记的实例包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。 
合适的酶标记的实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母-醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。 
合适的放射性同位素标记的实例包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、 14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、 47Sc和109Pd等等。111In是优选的同位素，其中使用体内成像，因为它 避免了肝脏对125I或131I标记的αvβ6结合配体的脱卤作用。此外，该放射性核素对于成像具有更有利的γ发射能量(Perkins等人，Eur.J.Nucl.Med.10：296-301(1985)；Carasquillo等人，J.Nucl.Med.28：281-287(1987))。例如，用1-(P-异硫氰酸根合苯甲基)-DPTA将111In偶联到单克隆抗体在非肿瘤组织，尤其在肝中显示出很少的摄入，因此增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人，J.Nucl.Med.28：861-870(1987))。 
合适的非放射性同位素标记的实例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和 56Fe。 
合适的荧光标记的实例包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二醛标记和荧光胺标记。 
合适的毒性标记的实例包括白喉毒素标记、蓖麻毒蛋白标记和霍乱毒素。 
化学发光标记的实例包括氨基苯二酰肼标记、异氨基苯二酰肼标记、芳族吖啶鎓酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记。 
核磁共振造影剂的实例包括重金属核，如Gd、Mn和铁。 
将上述标记结合至αvβ6结合剂，如αvβ6结合抗体的典型技术由Kennedy等人，Clin.Chim.Acta 70：1-31(1976)，和Schurs等人，Clin.Chim.Acta81：1-40(1977)提供。后者中提到的偶联技术是戊二醛方法、高碘酸盐方法、二马来酰亚胺方法、间-马来酰亚胺苯甲基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯方法，将所有这些方法引入本文作为参考。 
对于用于本发明的某些治疗方法，如肿瘤细胞的消融或肿瘤细胞生长、侵入或转移的防止，αvβ6结合配体可以被缀合到一种或多种药物、前体药物或同位素。优选的此类缀合物包含缀合到一种或多种细胞毒性剂的结合αvβ6的一种或多种配体，如一种或多种抗体或其片段、衍生物或变体；此类缀合物可用于本发明提供的治疗和预防治 疗转移的方法中。根据本发明的一些此类方法，将αvβ6结合配体，如抗体缀合到细胞毒性剂。可用于产生αvβ6结合配体-细胞毒性剂缀合物的细胞毒性剂，如化学治疗剂是本领域公知的并且包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、吉西他滨、阿霉素(多柔比星)、苯丙氨酸氮芥、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、加利车霉素、美登素、trichothene。根据本发明的该方面尤其合适的是紫杉醇、吉西他滨和阿霉素(多柔比星)。适用于根据本发明的该方面的其他化学治疗剂是公知的并且是普通技术人员熟悉的。 
从而，本文也包括使用一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体和一种或多小分子毒素，如紫杉醇、阿霉素(多柔比星)、吉西他滨、加利车霉素、美登素(美国专利号5,208,020)、trichothene和CC 1065的缀合物。在本发明的一个实施方案中，αvβ6结合配体缀合到一个或多个美登素分子(例如，每一个αvβ6结合配体约1到约10个美登素分子)。美登素可以例如被转化为May-SS-Me，其可以被还原为May-SH3并与修饰的αvβ6结合配体反应(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))以产生美登醇(maytansinoid)-αvβ6-结合配体缀合物。 
备选地，可以将αvβ6结合配体缀合到一个或多个加利车霉素分子。加利车霉素家族抗生素能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括，但不限于γ1 1、α2 1、α3 1、N-乙酰基-γ1 1、PSAG和φ1 1((Hinman等人Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode等人Cancer Research 58：2925-2928(1998))。 
可以用于产生与一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体的缀合物的酶促活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商旅蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦 瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。见例如，在1993年10月28日以英文公开的WO 93/21232，将其公开完整引入本文作为参考。也可以将Mytansinoids缀合到一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体。本发明还包括与具有溶核活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNase)缀合的αvβ6结合配体。 
多种放射性同位素也可以用于产生用于本发明治疗方法的放射性缀合的αvβ6结合配体。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、 153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。 
使用多种双功能蛋白质偶联剂可以制备αvβ6结合配体和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白质偶联剂为诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸酯、亚氨基硫醇(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、his-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-苯基二异氰酸酯)，和二活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。14C标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合到αvβ6结合配体的示例性螯合剂。见WO 94/11026。接头可以是“可切割的接头”，其方便细胞毒性药物在细胞中的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头，二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人Cancer Research 52：127-131(1992))。 
备选地，例如，通过重组技术或肽合成可以制备包含αvβ6结合配体和细胞毒性剂的融合蛋白。 
在另一个实施方案中，可以将所述αvβ6结合配体缀合到“受体”(如链霉抗生物素蛋白)用于“预先靶定”，其中对患者施用αvβ6 结合配体-受体缀合物，接着用清除剂从循环***中除去未结合的缀合物，然后施用缀合到细胞毒性剂(如放射性核素)的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。 
也可以将本发明的αvβ6结合配体与前体药物活化酶缀合，该酶将前体药物(例如，肽基化学治疗剂，见WO 81/01145)转化为活性药物。见，例如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278。此类缀合物的酶组分包括能够以如下方式作用于前体药物的任何酶，所述方式将前体药物转化成其更有活性的细胞毒性形式。 
可用于本发明的方法的酶包括，但不限于，用于将含磷酸的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶，如沙雷菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草芽孢杆菌素、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，它们可以用于将含肽的前体药物转化为游离药物的；用于转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；糖类切割酶，如用于将糖基化前体药物转化为游离药物的O-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将用P-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的P-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于将分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在它们的胺氮处衍生的药物转化为游离药物。 
通过本领域公知的技术，如使用杂双功能交联试剂可以将酶共价结合至αvβ6结合配体。备选地，使用本领域公知的重组DNA技术可以构建融合蛋白，其包含连接到酶的至少一个功能活性部分的本发明αvβ6结合配体的抗原结合区(见例如，Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984))。 
疾病诊断和预后 
如上面指出的，现在已经发现来自与显示出更高水平smad4基因表达的细胞相比，显示出降低水平的smad4基因表达和显著提高水平的整联蛋白αvβ6的某些肿瘤的细胞更可能应答结合αvβ6的配体， 和阻断TGF-β信号传导通路的一种或多种组分的试剂。从而，一方面，本发明提供了可用于确定肿瘤细胞应答用抗αvβ6配体(如抗体)或用TGF-β阻断剂的治疗或被其化学致敏的可能性的方法，所述肿瘤包括来自癌如腺癌的肿瘤。在更具体的实施方案中，癌是胰腺癌、结肠直肠癌、***、鳞状细胞癌(如食道癌)、头颈癌、肝癌、卵巢癌和肺癌。更具体地，所述癌是胰腺癌、结肠直肠癌、***或头颈癌。 
根据本发明该方面的方法涉及测定肿瘤细胞或肿瘤组织样品中smad4的表达水平，并将这些表达水平与标准smad4表达水平(例如，正常细胞或组织中，优选得自相同动物，如人类患者)比较，其中肿瘤或其细胞中smad4表达的降低表明肿瘤更可能应答抗αvβ6配体(如抗体)或TGF-β阻断剂的生长抑制作用，或被与一种或多种化学治疗性化合物或组合物随后(或同时)的共治疗的此类配体或试剂化学致敏。如上指出，肿瘤中smad4的表达降低通常与差的患者预后相关，因此本发明的方法提供了用最可能提供特别定性的治疗方法的化合物和组合物快速诊断和积极治疗此类肿瘤的方法，从而为患者提供了更有利的临床结果。 
“测定smad4的表达水平”意指定性地或定量地直接(例如，通过测定或估计样品中αvβ6表达的绝对水平)或相对(例如，通过比较第一个生物样品与第二个生物样品中smad4的表达水平)测量或估计第一个生物样品(例如，肿瘤样品、组织活检或抽吸物等等)中smad4的水平。优选地，测量或估计第一个生物样品中smad4的水平，并与从来自没有癌症或癌变前损伤的个体的第二个生物样品得到的标准品中的smad4的水平比较。可以根据测量基因表达的领域已知的方法可以测量给定细胞、组织、器官或生物样品中smad4的水平，所述方法包括例如，用已知的基因探针或引物杂交或PCR/RT-PCR检测smad4基因(见例如，Maliekal，T.T.等人，Oncogene 22：4889-4897(2003)；Iacobuzio-Donahue，C.A.等人，Clin.Cancer Res.10：1597-1604(2004))，northern印迹(见例如，Yasutome，M.等人，Clin.Exper.Metast.22：461-473(2005))，和用抗SMAD4抗体进行免疫组织化学 分析(见例如， 
Figure G2007800260897D00401
J.等人，Am.J.Pathol.158：1677-1683(2001)；Fukuchi，M.等人，Cancer 95：737-743(2002)；Subramanian，G.等人，Cancer Res.64：5200-5211(2004)；Levy，L.和Hill，C.S.，Mol.Cell.Biol.25：8108-8125(2005))。如本领域普通技术人员理解的，一旦给定的非癌组织的标准smad4表达水平是已知的，那么它可以重复用作比较标准。 
类似地，“测定αvβ6的表达水平”意指定性地或定量地直接(例如，通过测定或估计样品中αvβ6的绝对水平)或相对(例如，通过比较第一个生物样品与第二个生物样品中αvβ6的表达水平)测量或估计第一个生物样品(例如，肿瘤样品、组织活检或抽吸物等等)中αvβ6的水平。优选地，测量或估计第一个生物样品中αvβ6的水平并与从来自没有癌症或癌变前损伤的个体的第二个生物样品得到的标准品中的αvβ6的水平比较。如本领域普通技术人员理解的，一旦给定的非癌组织的标准αvβ6表达水平是已知的，那么它可以重复用作比较标准。 
“生物样品”意指从个体(如患者)、细胞系、组织培养物或其他来源得到的任何生物样品，其可以含有细胞或细胞产物如细胞外基质。此类生物样品包括哺乳动物身体组织和细胞，包括可以表达αvβ6的白细胞、卵巢、***、心脏、胎盘、胰腺、肝脏、脾脏、肺、乳腺、头颈组织(例如，口、咽、舌和喉组织)、扁平细胞(例如，食管的)、子宫内膜、结肠(或结肠直肠)、子宫颈、胃和脐组织。从哺乳动物得到组织活检和体液的方法是本领域公知的。优选的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和人。尤其优选的是人。 
可以使用任何本领域已知的方法测定生物样品中的αvβ6表达水平。测定生物样品中的αvβ6表达水平优选使用免疫学技术。例如，可以用经典的免疫组织学方法研究组织中αvβ6表达。其中，通过结合αvβ6的一级配体，如抗体(多克隆或单克隆的)提供特异识别。可以例如用荧光、化学发光、发磷光的、酶的或放射性同位素标记物标记该一级配体。备选地，本发明的这些方法可以使用二级检测***， 其中如上述可检测地标记识别并结合至αvβ6结合配体的二级配体，例如，识别并结合至第一种αvβ6结合抗体的所谓“二级”抗体。结果，得到用于病理性检查的组织切片的免疫组织学染色。备选地，也可以例如用尿素或中性去污剂提取组织和细胞样品，以释放αvβ6蛋白用于Western印迹或点/狭线测定法(Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))，以相对于已知具有更低水平的αvβ6表达的标准组织或细胞样品进行直接定量。 
如上面指出的，本发明的方法可用于检测哺乳动物中的癌症，用于确定给定肿瘤细胞应答使用抗αvβ6配体和/或TGF-β的治疗和/或化学致敏的可能性，用于治疗多种类型的癌。具体地，本发明的方法用于检测和/或治疗上皮组织的癌症(即，癌)，包括胰腺癌、结肠/直肠癌、***、食管(和其他鳞状上皮组织)癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌和肺癌。尤其可通过本发明方法检测的是侵入性和/或转移性腺癌，包括但不限于胰腺癌、结肠直肠癌、***和头颈癌。此类癌的早期鉴定和治疗与患者的更好的长期预后有关。例如，已经报导如果不治疗，大部分非侵入性乳腺肿瘤将变成侵入性，并且可以导致具有差得多的预后的转移性癌症(见Sakorafas，G.H.，和Tsiotou，A.G.H.，Cancer Treatment Rev.26：103-125(2000))。此外，如上面指出的，原发性胰腺腺癌中smad4的表达降低与具有此类肿瘤的患者的差的预后有关(Liu，F.，Clin.Cancer Res.7：3853-3856(2001)；Tascilar，M.等人，Clin.Cancer Res.7：41 15-4121(2001)；Toga，T.等人，Anticancer Res.24：1173-1 178(2004))。从而，根据本文所述方法优选的早期诊断和开始治疗是患有smad4缺陷癌症的患者长期存活的关键。 
因此，本发明包括治疗或预防癌症的方法，包括鉴定患者中smad4缺陷的癌前期病变或癌，并治疗该患者以在它有机会演化为癌症的更晚期形式前消灭癌变前损伤。此类方法包括例如，(a)得到被怀疑含有癌或癌变前损伤的组织样品，和不含有癌或癌变前损伤的组织样品 (优选从与怀疑含有癌或癌变前损伤的组织样品相同的组织或器官)；和(b)测定肿瘤或组织样品或来自其的细胞中smad4的表达水平，其中相对于非癌性组织样品(或其细胞)中smad4表达水平，含有癌性或侵入前损伤的组织样品中smad4表达水平的降低是癌症或癌变前损伤更可能发展为更有侵入性或攻击形式癌症的标志。在其他相关实施方案中，本发明包括减慢或防止患者中癌变前损伤发展为肿瘤的方法，包括在患者中鉴定具有降低水平的smad4表达(优选使用上文所述的方法)的患者肿瘤(或其细胞)，并对患者施用治疗有效量的结合癌变前损伤中一种或多种细胞上整联蛋白αvβ6的一个和多个亚基的一种或多种配体，其中所述配体与整联蛋白的结合导致癌变前损伤的生长抑制或死亡，或者导致癌变前损伤对一种或多种化学治疗性化合物的死亡诱导或生长抑制作用的化学致敏。 
可以从中得到样品用于根据本发明的这些方法的合适组织和器官包括，但不限于本文别处描述的上皮组织。本发明本发明的此类方法可以有利地治疗或预防的癌症和肿瘤包括，但不必限于癌，尤其腺癌，包括本文别处详细描述的癌和腺癌。一旦根据本文的方法检测了此类癌，那么它可以通过本领域公知并且因此本领域技术人员熟悉的的手术、化学治疗、放射学或其他癌症治疗方法从患者清除。备选地，使用本发明的治疗方法，通过对患者或对患者的器官或组织施用一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体或其片段，可以清除这种癌。在此类实施方案的一些非限制性实例中，一种或多种αvβ6结合配体已经与如上文详述的一种或多种细胞毒性化合物或试剂缀合。在此类实施方案的额外的非限制性实例中，对受试者，如患者施用一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体或其片段以及如上文详述的一种或多种细胞毒性化合物或试剂。在其他相关实施方案中，本发明的此类方法包括施用一种或多种TGF-β阻断剂，如本文所述的那些，其抑制肿瘤细胞的生长和/或使得肿瘤细胞对一种或多种毒性化学肿瘤化合物的作用化学致敏。 
在相关实施方案中，本发明包括通过测量肿瘤或癌细胞的smad4 和αvβ6的表达水平测定肿瘤或癌细胞的转移潜力。在此类实施方案中，从如上述的患者得到肿瘤或细胞样品并根据本文所述的方法测定肿瘤或癌细胞的smad4和αvβ6表达水平。根据本发明的这些方法，肿瘤或癌细胞的smad4表达水平和肿瘤或癌细胞的αvβ6表达水平之间存在反相关，其提供了可用于确定肿瘤或癌细胞的转移潜力的有用的临床描绘。特别地，肿瘤或癌细胞的smad4表达的降低和肿瘤或癌细胞的αvβ6表达同时升高与在肿瘤或癌细胞的表达水平之间正相关表明肿瘤或癌细胞更可能从原发性肿瘤部位转移到第二个位置。所以，肿瘤或癌细胞的的smad4和αvβ6的表达水平可以用作肿瘤或癌细胞的转移潜力的预后指标，其可以帮助癌症患者和他们的医生基于对癌症的现有或预测的未来攻击性或侵入性做出合适的治疗决定。 
除了测定从个体的得到生物样品，如组织或肿瘤细胞样品中的smad4和αvβ6表达水平，也可以通过体内成像检测αvβ6的表达水平和模式。在本发明的此类方法中，将一种或多种SMAD4结合配体和αvβ6结合配体，例如，一种或多种SMAD4结合抗体和一种或多种αvβ6结合抗体用适于体内成像的一种或多种标记可检测地标记。用于体内成像的合适的标记或标记物包括通过X光线照相术、NMR或ESR可检测的那些。对于X光线照相术，合适的标记包括放射性同位素，如钡或铯，其发出可检测的放射但是对于受试者不是明显有害。NMR和ESR的合适标记包括具有可检测的特征性自旋的那些，如氘。 
向待检查癌症或癌的哺乳动物中原位引入(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)结合SMAD4或αvβ6的配体，例如，SMAD4-或αvβ6-结合抗体或抗体片段，其已经用合适的可检测成像部分如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)，放射性物质，或者可通过核磁共振检测的物质标记。本领域中理解受试者的大小和使用的成像***将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，注射的放射性的量将通常为约5到20毫居里99mTc。经标记的配体，如SMAD4-或αvβ6-结合抗体或抗体片段随后将优先在含有或表达SMAD4或αvβ6整联蛋白的细胞或组织部位积累。然后如S. W.Burchiel等人，″Immunopharmacokinetics of RadiolabelledAntibodies and Their Fragments″(Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer，中第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，编著，Masson Publishing Inc.(1982))所述的完成体内肿瘤成像。 
治疗方法 
在本发明的额外实施方案中，本发明的方法可以用于治疗方案中以治疗患某些疾病，特别是某些癌，如本文别处描述的那些癌的哺乳动物。本发明的此类方法可以用于治疗癌症和相关事件，包括肿瘤生长、转移和血管发生。尤其适于这种方法的是特征为在患有疾病的哺乳动物的组织或细胞中降低水平的smad4表达和同时升高水平的αvβ6表达的那些疾病或癌症，所述疾病或癌症应答靶定表达升高水平的αvβ6的组织或细胞并清除那些组织或细胞的治疗。根据本发明该方面的方法包括例如，(a)鉴定患者中具有降低的smad4表达的肿瘤或肿瘤细胞，和(b)用一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体或其片段，或用一种或多种TGF-β-阻断剂或其片段治疗患者。备选地，此类方法包括例如，(a)鉴定患者中具有降低的smad4表达的肿瘤或肿瘤细胞；(b)用一种或多种αvβ6结合配体，如一种或多种αvβ6结合抗体或其片段，或用一种或多种TGF-β-阻断剂或其片段治疗患者，其中αvβ6结合配体或TGF-β-阻断剂与肿瘤细胞的结合使得肿瘤细胞对一种或多种化学治疗性化合物的生长抑制和/或死亡诱导作用化学致敏；和(c)用抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞的一种或多种化学治疗性化合物治疗患者。 
通过这些方法尤其可治疗的疾病包括上皮组织的转移性癌症(如转移性癌和/或腺癌)，包括胰腺、结肠/直肠、宫颈、食道(和其他鳞状上皮组织和器官)、头和颈、肝、卵巢和肺的癌。本发明的这些方法尤其适于治疗的是胰腺、结肠/直肠、宫颈、头和颈和食道的癌。优选的用于治疗的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和 人。尤其优选人。 
在如上述的相关实施方案中，本发明提供了减少或防止患者中转移前肿瘤或转移肿瘤发展的方法，包括对患者施用治疗有效量一种或多种配体，所述配体结合转移前肿瘤中一种或多种细胞上整联蛋白α vβ6的一个或多个亚基，其中所述配体与整联蛋白的结合导致减少或防止转移前癌症细胞侵入到原发性肿瘤周围的组织区域。 
在实施本发明的这些治疗方法中，可以以治疗制剂的形式(其在本文中可互换并等同地称作药物组合物)对患者施用αvβ6结合配体，如αvβ6结合抗体或其片段，或者TGF-β-阻断剂或其片段。制备根据本发明使用的αvβ6结合配体或者TGF-β-阻断剂或其片段的治疗制剂用于保存，通过将具有希望的纯度的αvβ6结合配体或TGF-β-阻断剂或其片段与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合(例如以冻干制剂或水溶液的形式)进行所述制备。除了药学活性化合物如αvβ6结合配体或TGF-β-阻断剂或其片段外，用于本发明的治疗方法中的组合物可以含有一种或多种合适的可药用载体，其包含有助于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制备物的赋形剂和辅剂。以自身已知的方式生产本发明的药物制剂，如通过常规混合、制粒、制锭剂、溶解或冻干方法。从而，经口使用的药物制剂可以如下得到：将活性化合物与固体赋形剂混合，任选碾磨所得的混合并如果希望或需要，加入合适的辅剂后加工颗粒混合物，以得到片剂或锭剂核心。 
合适的赋形剂具体为填充剂，如糖类，如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇、纤维素制备物和/或磷酸钙，例如，磷酸三钙或磷酸氢钙，以及黏合剂，如淀粉糊剂，使用例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可以加入崩解剂，如上述淀粉以及羧甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如藻酸钠。辅剂为上面的全部、流动调节剂和润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其盐，如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚 乙二醇。对锭剂核心提供合适的包衣，其如果需要，是抗胃液的。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选含有***树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇，和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生抗胃液的包衣，使用合适的纤维素制备物，如邻苯二甲酸乙酰纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素的溶液。可以向片剂或锭剂包衣中加入染料原料或色素，例如用于鉴定或以便表征活性化合物剂量的组合。 
可以经口使用的其他药物制备物包括由明胶制备的推入配合式胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制备的软的封闭胶囊。推入配合式胶囊可含有粒剂形式的活性化合物，所述粒剂可以与填充剂(如乳糖)、黏合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)和任选地稳定剂混合。在软胶囊中，优选将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体(如脂肪油或液体石蜡)中。此外，可以加入稳定剂。 
用于肠胃外施用的合适的制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如，水溶性盐和碱性溶液。碱性溶液可以包括例如用Tris、氢氧化胆碱、bis-Tris丙烷、N-甲基葡萄糖胺或精氨酸制备的铵盐。此外，可以施用活性化合物的混悬剂，如合适的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如，油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400(所述化合物在PEG-400中可溶)。水性注射混悬剂可含有增加所述混悬剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，混悬剂也可含有稳定剂。 
本发明的化合物可以被施用于动物和人的眼，以滴剂，或者在软膏剂、凝胶剂、脂质体或生物相容的聚合物片、小丸内或者在隐形眼睛内携带。眼内组合物也可以含有生理学上相容的眼科载体，这些载体如本领域技术人员可以用常规表标准进行选择。所述载体可以选择已知的眼科载体，其包括但不限于水、聚醚(如聚乙二醇400)、乙烯类聚合物(如聚乙烯醇、聚维酮)、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)、石油衍生物(如矿物油和白矿脂)、动物脂肪(如羊毛脂)，植物脂肪(如花生油)、丙烯酸聚 合物(如羧基聚亚甲基凝胶)，多糖(如葡聚糖和葡糖氨基聚糖类)，如氯化钠和氯化钾、氯化锌和缓冲液(如碳酸氢钠或乳酸钠)。也可以使用高分子量分子。不失活所述组合物中本发明的化合物的生理学上相容的防腐剂包括醇，如氯代丁醇、苯扎氯铵和EDTA，或本领域技术人员已知的任何其他合适的防腐剂。 
适于皮下施用的抗体的冻干制剂在美国专利号6,267,958中公开，将其公开完整引入本文作为参考。可以用合适的稀释剂重构此类冻干的制剂至高蛋白质浓度，并可以对本文中待治疗的患者皮下施用重构的制剂。 
也可以将αvβ6结合配体捕获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如分别羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲基)微胶囊中，或者捕获在胶体给药***(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或大乳剂中。此类技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中。 
可以制备αvβ6结合配体的持续释放制备物。持续释放制备物的合适的实例包括含有αvβ6结合配体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为球形物品，如膜剂或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。 
将用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以通过经无菌滤膜的过滤容易地完成。 
可以通过任何合适的方式对受试者或患者施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段，所述方式包括肠胃外、肺内、颅内、经皮和鼻内。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，可以通过例如用下降剂量的αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或 其片段脉冲灌输合适地施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段。优选地，通过注射，最优选通过静脉内或皮下注射给予所述剂量，这部分地取决于施用是否是快速或长期的。 
在本发明的一些示例性实施方案中，以约1mg/m2到约500mg/m2的剂量对患者(例如，静脉内)施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段。例如，可以以约1mg/m2、2mg/m2、3mg/m2、4mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2、35mg/m2、40mg/m2、45mg/m2、50mg/m2、55mg/m2、60mg/m2、65mg/m2、70mg/m2、75mg/m2、80mg/m2、85mg/m2、90mg/m2、95mg/m2、100mg/m2、105mg/m2、110mg/m2、115mg/m2、120mg/m2、125mg/m2、130mg/m2、135mg/m2、140mg/m2、145mg/m2、150mg/m2、155mg/m2、160mg/m2、165mg/m2、170mg/m2、175mg/m2、180mg/m2、185mg/m2、190mg/m2、195mg/m2、200mg/m2、205mg/m2、210mg/m2、215mg/m2、220mg/m2、225mg/m2、230mg/m2、235mg/m2、240mg/m2、245mg/m2、250mg/m2、255mg/m2、260mg/m2、265mg/m2、270mg/m2、275mg/m2、280mg/m2、285mg/m2、290mg/m2、295mg/m2、300mg/m2、305mg/m2、310mg/m2、315mg/m2、320mg/m2、325mg/m2、330mg/m2、335mg/m2、340mg/m2、345mg/m2、350mg/m2、355mg/m、360mg/m2、365mg/m2、370mg/m2、375mg/m2、380mg/m2、385mg/m2、390mg/m2、395mg/m2或400mg/m2的剂量施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段。 
可以根据多种给药方案施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段。例如，αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段可以以预定的时间量(例如，4到8周，或更长)每天施用一次，或以预定的时间量(例如，4到8周，或更长)根据每周方案施用(例如，每周一天、每周二天、每周三天、每周四天、每周五天、每周六天或每周七天)。“每周一次”给药方案的特定实例是在治疗期间的第1、8、15和22天施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段。在备选实施方案中，可以在几个月的时间内间隔地施用αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段。例如，可以一年两次在三个连续的周内每周施用αvβ6结合 配体或TGF-β阻断剂或其片段(即，每六个月重复每周给药方案)。应当理解此类施用方案可以长期持续(数年)以保持最初治疗所提供的有益的治疗效果。在另一个实施方案中，可以按照设计的急性给药方案实现此类维持治疗，用以减轻癌性、转移性或原位癌状况的即时症状。 
在治疗期间内每次施用的αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段的量可以是相同的；备选地，治疗期间每次施用的量可以改变(例如，在给定时间施用的量可以多于或少于以前施用的量)。例如，维持治疗期间给予的剂量可以低于急性治疗期施用的剂量。取决于特定环境的合适的给药方案将是本领域普通技术人员显而易见的。 
在本发明的一些实施方案中，将多种类型或种类的αvβ6结合配体相互组合并施用于患者以治疗一种或多种癌性、转移性或原位癌状况。例如，本发明包括对患者施用两种或多种不同的αvβ6结合抗体和/或TGF-β阻断剂或其片段，如本文公开的那些。当对患者施用多种αvβ6结合配体和/或TGF-β阻断剂或其片段时，不同的αvβ6结合配体和/或TGF-β阻断剂或其片段可以在单个药物组合物中一起施用，或更优选地，可以在单独的剂量中顺序施用。此类其他试剂的有效量取决于制剂中存在的αvβ6结合配体和/或TGF-β阻断剂或其片段、疾病或病症或治疗的类型，和其他因素。 
本发明还包括治疗癌性或转移性状况的方法，包括对患者施用第一种试剂联合第二种试剂，其中第一种试剂是αvβ6结合配体并且第二种试剂是用于治疗一种或多种癌性、转移性或原位癌状况的试剂但不必需是αvβ6结合配体。在其他方面，本发明提供了治疗癌性或转移性状况的方法，其包括对患者施用第一种试剂联合第二种试剂，其中第一种试剂是TGF-β阻断剂或其片段并且第二种试剂是用于治疗一种或多种癌性、转移性或原位癌状况的试剂但不必需是TGF-β阻断剂。施用第一种试剂“联合”第二种试剂是指可以在将第二种试剂施用于患者之前、同时或之后对患者施用第一种试剂，使得在治疗方案期间对患者施用两种试剂。例如，根据本发明的一些此类实施方案， 对患者施用αvβ6结合配体联合(即之前、同时或之后)对患者施用一种或多种其他整联蛋白受体(例如，α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ5、α5β1等等)的拮抗剂，包括对一种或多种其他整联蛋白受体(例如，α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ5、α5β1等等)特异的抗体、多肽拮抗剂和/或小分子拮抗剂，其是本领域公知的。 
在本发明的该方面的一些实施方案中，与αvβ6结合配体或TGF-β阻断剂或其片段联合施用的第二种试剂是例如类固醇、细胞毒性化合物(包括本文别处描述的那些，尤其紫杉醇、吉西他滨或阿霉素(多柔比星)、放射性同位素(包括本文别处描述的那些)，前体药物活化酶(包括本文别处描述的那些)、秋水仙素、氧、抗氧化剂(例如，N-乙酰半胱氨酸)、金属螯合剂(例如，四硫代钼酸盐)、IFN-β、IFN-γ、α-抗胰蛋白酶等等。根据本发明该方面的治疗目的，可以与一种或多种第一种试剂(例如一种或多种αvβ6结合配体)联合施用于患者的额外的第二种试剂或化合物是本领域技术人员熟悉的；因此，认为此类额外的第二种试剂或化合物的用途被本发明包括。 
诊断试剂盒 
在额外实施方案中，本发明提供了试剂盒，尤其可用于诊断和/或预后疾病或病症(如癌症)的试剂盒。根据本发明的该方面的试剂盒可以包含至少一个容器，其含有结合或识别整联蛋白αvβ6的一种或多种上述配体，如抗体。本发明的这些试剂盒可以任选地还包括至少一个额外的容器，其可以含有例如用于将配体(如抗体)递送至来自患者的试样(如器官、组织或细胞样品)的试剂(例如缓冲盐溶液)；至少一个额外的容器，其含有例如适于测定生物样品中smad4表达的试剂(包括但不限于上述核酸试剂)；TGF-β；一种或多种去污剂、裂解剂，或者适于制备用于测试的生物样品的其他溶液；等等。本发明的此类试剂盒的其他合适的额外组分是本领域技术人员熟悉的。 
相关领域技术人员显而易见的是对本文描述的方法和应用的其他合适的修饰和改变是显而易见的，并且可以在不背离本发明或其任何实施方案的范围的情况下做出。现在已经详细描述了本发明；参考下 面的实施例将更清楚地理解本发明，在这里包括所述实施例仅用于说明的目的并且不意在限定本发明。 
实施例 
实施例1：相对于原发性肿瘤，在转移瘤中高水平表达αvβ6
在本实验中，我们开始研究αvβ6在上皮来源的多种癌症和转移病灶中的表达并确定功能阻断αvβ6mAB是否能够抑制体内表达αvβ6的肿瘤的生长。我们评估了人咽癌Detroit62上我们的抗人αvβ6mAbs的体外和体内抗肿瘤活性，并将其与TGFβRII：Fc的体内抗肿瘤活性比较。我们的数据支持αvβ6在人类癌症中的作用和用功能阻断αvβ6mAb进行治疗干预的潜力。 
A.材料和方法 
对于免疫组织化学，将组织切片在二甲苯和乙醇中脱蜡，在蒸馏水中再水化，然后浸入含有0.45％H2O的甲醇中。将组织用胃蛋白酶(00-3009，Zymed，San Francisco，CA)温育并用抗生物素蛋白和生物素(SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA)封闭。用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释一级抗体并将组织在4℃过夜温育。对于免疫染色小鼠异种移植组织上的β6，将切片与人/小鼠嵌合形式的抗αvβ6mAb，2A1(Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279(17)：17875-17887(2004))，和抗人生物素化的二级抗体(PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育。对于免疫染色人组织上的β6，将切片与小鼠2A1和抗小鼠生物素化的二级抗体(PK-6102，Vector Laboratories)温育。将抗生物素蛋白-生物素复合体-辣根过氧化物酶(Vector Kit，PK-6102)加到切片上，在室温温育30分钟，并如教导的制备3，3′-二氨基联苯胺(DAB)底物(SK-4100，Vector Laboratories)并在室温应用至切片中5分钟。用Mayer的苏木精染色组织切片1分钟并用水和PBS冲洗。 
B.结果 
1.转移瘤中αvβ6表达 
评估多种肿瘤转移瘤上αvβ6免疫染色。78％的转移瘤(43/55)阳性染色，在多数转移瘤中显示出强烈染色(图1A-F；图2A-I)。发现该结果在阳性免疫染色百分比中增加，因为发现仅仅头和颈、子宫颈和胰腺肿瘤具有相等的表达水平(表2)： 
表2：人肿瘤中的αvβ6表达(免疫组织化学) 
Figure G2007800260897D00521
2.人胰腺肿瘤样品、患者匹配的转移瘤和侵入性胰腺肿瘤的小鼠异种移植模型中的αvβ6表达 
如表2中指出的，αvβ6免疫染色在所检查的80％胰腺肿瘤中是阳性的。当通过免疫组织化学检查来自8名不同患者的原发胰腺肿瘤的样品时，染色在高等级肿瘤的侵入区中是突出的(图4A-4C；5A-5E)。原发性肿瘤样品也具有匹配的***转移(图4D-4F；5F-5J)，其也表明强烈的αvβ6染色，支持αvβ6阳性细胞已经从原发性肿瘤部位散布的观点。在正常胰腺(图4G-4H；5K-5L)中，染色局限于表面层上偶发的细胞。 
为了进一步检查αvβ6表达对肿瘤细胞侵入的影响，我们使用BxPC-3小鼠肿瘤异种移植物作为侵入性人胰腺腺癌的模型。使用0.1 ml/小鼠的注射，动物在腹部皮下植入(第0天)悬浮在无菌盐水中的5×106个细胞/小鼠。在第30天，对于所有研究，将具有建立的肿瘤(～60-100mm3)的小鼠与三个治疗组的每个配对(PBS；mAb 3G9；可溶性TGF-β受体II-Ig融合蛋白(solTGFβRII-Fc))。以每周三次的治疗方案，腹膜内对小鼠施用试剂。对小鼠注射10mg/kg 3G9，2mg/kgsolTGFβRII-Fc或PBS(阴性对照)。每周测量肿瘤生长两次并根据公式：[(宽度)2×长度]/2估计肿瘤体积。切除来自治疗组的肿瘤，用10％低聚甲醛固定，石蜡包埋并切片用于用非阻断性v6嵌合mAb6.2A1进行免疫组织化学分析。 
用抗αvβ6mAb 3G9治疗对治疗生长具有直接作用(图6B，6C)，在用所述抗体治疗约48天后观察到显著降低的肿瘤生长。用solTGFβRII-Fc中，观察到的生长抑制水平略低于3G9观察到的水平。这些结果表明抗αvβ6mAb 3G9在人胰腺癌的异种移植模型中抑制肿瘤生长，并且提示此类封闭抗体可以用于抑制肿瘤生长，并且通过延长肿瘤侵入，用于原发性人胰腺腺癌中。 
实施例2：原发性人胰腺肿瘤中smad4表达和整联蛋白表达之间的反相关 
为了检查原发性肿瘤中smad4表达和αvβ6表达之间的关系，得到原发性人胰腺肿瘤的切片并通过免疫组织化学对SMAD4蛋白和αvβ6染色。检查了来自不同患者的14个肿瘤样品。结果在图7-13中显示。 
在14个肿瘤样品中，发现7(50％)个具有明显的αvβ6+肿瘤区域，而这些样品中的3个显示出表达的异质性(即一些肿瘤切片为αvβ6+，相同肿瘤的其他切片为αvβ6-；图8-9)。发现14个肿瘤中的7个为αvβ6阴性的。 
在11个肿瘤(排除αvβ6表达异质性的3个)中，在图7-10、13中观察到下面的结果： 
(C)四个为αvβ6+，其中三个为smad4-，一个为smad4+； 
(D)七个为αvβ6-，并且所有这七个为smad4+。 
在其中αvβ6表达为异质性的三个肿瘤中，观察到下面的结果(图11-13)： 
(C)为αvβ6+的肿瘤的那些区域为smad4-；和 
(D)为αvβ6-的肿瘤的那些区域为smad4+。 
这些结果支持如下结论：在原发性胰腺肿瘤细胞的smad4和整联蛋白αvβ6表达之间存在反相关。 
实施例3：胰腺癌细胞系上αvβ6和smad4的表达 
为一组胰腺细胞系测定αvβ6和smad4的表达。结果在图15中概述。 
在原代胰腺导管腺癌(PDAC)上αvβ6和smad4表达的初步分析中，检查了三个样品组。在第一组中，通过BioCat阵列测试10个PDAC样品，并发现所有10个(100％)都表达αvβ6。在第二组中，通过Cytomix测定法测试了14个胰腺腺癌样品，其中7(50％)的是αvβ6阳性的。在第三组中，通过Folio测定法测试了11个PDAC样品(图16)，其中10(91％)为αvβ6阳性的。 
对于第二和第三个样品组，也测定了smad4表达。发现15个细胞系为αvβ6阳性的，11个细胞系为smad4阳性的。12个细胞系为αvβ6+/smad4-的；8个细胞系为αvβ6-/smad4+的；三个细胞系为αvβ6+/smad4+的。两个细胞系是异质性的并且具有染色为αvβ 6+/smad4-和αvβ6-/smad4+的区域(图17)。 
在Biomax组织微阵列上，通过免疫组织化学检查70个PDAC(图18)。这些样品中的89％被测定为αvβ6阳性的，97％为smad4下调的。总共86％具有αvβ6+/smad4-表型。 
在通过Leiden University Medical Center(LUMC)制备的组织阵列(下文中称作“Leiden阵列”)上，通过免疫组织化学检查的50个PDAC的单独研究中，确定88％的为αvβ6阳性的，59％的为smad4下调的(图19)。总共有52％具有αvβ6+/smad4-表型。 
在使用Leiden阵列检查的9个PDAC转移瘤的研究中，发现所有都是αvβ6阳性的(多数为强阳性)，并且78％具有αvβ6+/smad4-表型(图19)。 
上面的结果表明αvβ6+/smad4-表型在原发性人胰腺癌中为显性表型。 
如在Leiden和Biomax阵列中打分的对PDAC的αvβ6和smad4表达分析的结果的图示显示在图20中。在两种不同方法之间观察到的结果差异可以是由于使用Biomax阵列观察到的smad4表达的更低强度的原因。 
实施例4：皮下植入的BxPC-3、人胰腺腺癌对作为单一试剂和组合使用的avβ6mAb 3G9和化学治疗剂阿霉素(多柔比星)和吉西他滨的应答 
作为人类肿瘤治疗模型，在人胰腺肿瘤的BxPC-3异种小鼠模型中进行单一或组合化学疗法。已知由于这些细胞中smad4基因的明显同源缺失，BxPC-3是smad4缺陷的(Subramanian，G.等人，Cancer Res.64：5200-5211(2004)；Yasutome，M.等人，Clin.Exp.Metastasis22：461-473(2005)。 
材料和方法 
1.动物.来自Harlan Sprague Dawley(Madisonn，WI.)的220只无胸腺雌性裸鼠Harlan Sprague Dawley(Madison，WI.)，Rec.03/13/2006，DOB 01/30/2006。小鼠在6-7周龄时开始研究。在植入肿瘤前让动物适应实验室至少5天。将动物分别用BioMedic可植入的ID芯片标记。用Onco Pharmacology Informatics(OPI)进行数据收集。 
2.肿瘤.BXPC-3：最初得自University of Arizona(Tucson，AZ)的细胞系。该细胞系是人胰腺腺癌。在被植入用于该研究前，将供者细胞系在无胸腺雌性裸鼠中传代5次。通过套管针将3mm3组织碎片 皮下植入动物的右侧腹区域。用具有最小100毫克和三次连续生长的已建立的肿瘤开始治疗。 
Figure G2007800260897D00561
3.测试方案 
第-1天：在左侧腹皮下植入ID发射应答器。 
第0天：如上述植入肿瘤。在植入小鼠的肿瘤上进行细节培养。记录动物的初始体重。 
第2天：开始记录肿瘤大小和体重测量并每隔一天继续直到分期日。 
分期日(治疗第1天)(植入后约11-13天)：选择用游标卡尺测定的具有100毫克的最小尺寸肿瘤的小鼠。将小鼠随机分成对照组和治疗组并记录体重。以上面列出的方案腹膜内施用剂量。剂量在每个给药方案内是盲法的。 
每周两次继续记录小鼠的肿瘤大小和体重。每天监测研究并标记对动物的任何不寻常的观察。直到研究结束前，研究将是盲法的。 
中点取血：(植入后第34/35天)：在该周3G9的第一次剂量前，从所有组中，从5只动物/组收集血清。给药后24小时，从所有组剩余的5只动物/组收集血清。使用24小时前没有用于波谷血清收集的5只剩余动物/组。 
给药的最后一周(植入后第44/45天)：在3G9的最后剂量前，从所有组中，从5只动物/组收集血清。给药后24小时，从所有组剩余的5只动物/组收集血清。使用24小时前没有用于波谷血清收集的5只剩余动物/组。 
终点： 
(a)最初动物体重 
(b)每周两次测量肿瘤大小和体重 
(c)给药中点和最后一周时血清3G9水平 
处死时： 
从下面组的每一组收获7个肿瘤；将每个肿瘤的1/2保存在10％NBF中，其他的1/2冷冻在OCT中： 
组1：载体；组2：3G9；组4：吉西他滨(Gem)140mg/kg；组6：多柔比星(Dox)6mg/kg；组8：3G9加Dox6mg/kg；和组10：3G9加Gem140mg/kg。 
结果 
这些实验的结果在图22-29中描绘。这些结果表明3G9与吉西他滨组合导致显著增加的生长抑制，其似乎是协同的。当3G9与多柔比星(阿霉素)组合时，组合效应甚至更大：约60％的生长抑制。选择该组合化学治疗是因为通过肿瘤药理学用该异种移植物模型较早得到的数据(未显示)表明BxPC-3抗吉西他滨。这些结果一起表明smad4缺陷的细胞系BxPC-3(a)应答抗αvβ6mAb作为单一试剂的治疗(测量为生长抑制)；和(b)通过抗αvβ6mAb的治疗使得其对用小分子治疗剂(如吉西他滨和多柔比星)的随后(或同时)治疗化学致敏。 
当用3G9和吉西他滨(140mg/kg)的组合治疗时，在用胰腺癌细胞系Su86.6(图30)、Panc04(图31)和Capan-2(图32)移植的小鼠中观察到类似的协同作用。然而，当用相同的组合疗法治疗用胰腺细胞系SW1990移植的小鼠时，与单独用吉西他滨治疗相比，治疗效果没有显著不同(见图33C)。当将吉西他滨浓度降低到100mg/kg时， 单独用吉西他滨治疗明显比用该组合疗法好(图32B)。当吉西他滨浓度进一步降低到80mg/kg时，用该组合疗法治疗显著好于单独用吉西他滨或3G9治疗(图32A)，如用其他细胞系在较高的吉西他滨浓度(140mg/kg)时所观察的。在Capan-1异种移植物模型中，抗体3G9和吉西他滨的组合疗法仅仅与单独的吉西他滨以及TGF-βRII-Fc与吉西他滨的组合疗法一样有效(图33)。 
使用来自细胞系ASPC-1的细胞，吉西他滨和3G9显著降低了胰腺癌的原位模型中的肿瘤体积。单独用吉西他滨或单独用3G9治疗对肿瘤体积没有显著影响(图34)。 
用BxPC-3、Panc04和Capan-2的治疗的异种移植肿瘤进行信号传递研究。在用3G9和吉西他滨处理后不同的时间点收获肿瘤用于下面的研究： 
表3.信号传导研究概述 
    读出  Western   IHC
  肿瘤间质液压   纤连蛋白   X  
    胶原I     X
    Sma I     X
    CD31     X
  凋亡   胱天蛋白酶     X
    TUNEL     X
  存活   p-AKT   X  
  增殖   p-ERK   X  
    Ki67     X
  通路   p-smad-2   X  
    FAK   X  
上面研究的结果在图35中概述。 
实施例5：Leiden University Medical Center的一组26名患者的存活表型 
诊断为胰腺患者的存活数据显示在图36和37中。图36和图37中的四个小图按照avb6和smad4表达表示数据。 
通常，具有表达smad4的肿瘤的患者比具有不表达smad4的肿瘤 的患者存活更长时间。此外，具有αvβ6+/smad4-表型的患者具有显著减少的存活时间。 
实施例6：通过抗avβ6配体逆转smad4+/avβ6+肿瘤细胞的生长抑制 
在与实施例4中所述相同的异种小鼠***中，测试人类胰腺细胞系SW1990。结果在图38-41中描绘。 
SW1990细胞系显示出αvβ6表达的异质性。将细胞系分类并富集αvβ6阳性和αvβ6阴性细胞(图41C-E)。所得变体的Western印迹分析表明αvβ6阳性群体为smad4+，而avβ6阴性群体为smad4-(图41A)。从而，αvβ6阳性SW1990细胞系不符合BxPC-3系的图谱，其中我们看到阻断αvβ6的mAb 3G9，特别是与化学治疗组合时对肿瘤生长的抑制(实施例4)。因为SW1990异种移植物的组织切片显示出α vβ6表达(图41B)，所以预期这些细胞在体内实际上是smad4+的。 
然后如实施例4中所述，在体内用鼠mAb 3G9或者可溶性TGF-βRII-Fc处理用SW1990移植的小鼠，并评估随着时间肿瘤的生长。结果在图38-40中显示，其表明与胰腺肿瘤系BxPC-3相比，SW1990肿瘤的生长没有受到抗αvβ6 3G9 mAb治疗的抑制，而是显示出细胞生长的轻微增加。用3G9或sol TGF-βRII治疗对SW1990生长的反作用可以通过如下推理解释：在smad4存在下，TGF-β可以诱导生长抑制信号，当TGF-β(活化)被可溶性TGF-β RII和/或3G9阻断时，所述信号被消除。 
这些结果提示为了应答αvβ6配体，肿瘤细胞必须在smad4表达中是缺陷的，因为smad4+细胞系SW1990不受到抗αvβ6mAb的生长抑制，而smad4-细胞系BxPC-3却受到其生长抑制。这些结果从而与αvβ6/smad4假说相一致，并且支持所选的一组胰腺癌患者(smad4-/αvβ6+)中的应答性，表明用于预测肿瘤细胞、尤其胰腺肿瘤细胞对αvβ6活性配体或其化学致敏的敏感性或应答性的有用的临床标记物决定那些肿瘤细胞中smad4的表达水平。 
实施例7：αvβ6mAb对Detroit 562人咽癌细胞的生长抑制 
在异种研究中，根据实施例4中描述的方案将Detroit 562人咽癌细胞皮下植入小鼠中。然后如前面实施例所述的随时间评估肿瘤生长。结果在图42-54中显示。 
这些结果表明在Detroit 562模型中，小鼠和人源化的3G9抗αvβ6mAb能够显著抑制肿瘤生长，而其他抗αvβ6mAb(特别是鼠4B4)的有效性更低。 
实施例8：胰腺癌中αvβ6阻断的相关性 
Smad4在约55％的胰腺腺癌中被失活(Tasci1ar等人，Clin.Cancer Res.4：4115-4121，2001)。 
Figure DEST_PATH_G50620939150131000D000151
等人(Cancer Res.61：550-555，2001)报导了TGFβ在胰腺癌中赋予促结缔织增生潜力，其导致纤维质生成。然而，该促结缔织增生潜力与smad4表达相关。我们观察到为无smad4的人胰腺细胞系(AsPC-2、BxPC-3、Capan-1和Capan-2)当被植入到小鼠时诱导粘连形成，而携带野生型smad4的细胞系(PaCa-2、PaCa-3、PaCa-44和PANC-1)不诱导粘连形成(见 
Figure DEST_PATH_G50620939150131000D000152
等人的表1)。 
结果总结：我们已经发现αvβ6在胰腺癌中受到高度上调。我们用αvβ6mAb(3G9)在体内也得到了功效数据，在咽癌模型和两个胰腺癌模型中确定单一试剂功效。我们也观察到用3G9和吉西他滨组合治疗在7个胰腺异种移植模型中的5个模型中相对于单独吉西他滨表现出增强的功效(图35)。 
现在已经为了清楚理解而通过示例说明和实施例，完整地详细描述了本发明，本领域普通技术人员显而易见通过在条件、制剂和其他参数的宽的、等同范围内通过修饰或改变本发明可以也可以实施本发明而不影响本发明或其任何特定实施方案的范围，并且此类修饰或改变意在被包括在所附权利要求的范围内。 
本申请中提及的所有出版物、专利和专利申请都表明本发明所属 领域技术人员的水平并且被相同程度地引入本文作为参考，就好像特别和单独指出每个单独的出版物、专利或专利申请被引入作为参考一样。 
Figure IYZ000007061535400011
Figure IYZ000007061535400021
Figure IYZ000007061535400031
Figure IYZ000007061535400041
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Figure IYZ000007061535400071
Figure IYZ000007061535400081
Figure IYZ000007061535400091
Figure IYZ000007061535400101
Figure IYZ000007061535400111

Claims (12)

1.选择性结合smad4缺陷肿瘤细胞中整联蛋白αvβ6的αvβ6抗体在制备用于诱导smad4缺陷肿瘤细胞的生长抑制或死亡的药物中的用途，其中所述抗体是来自如下杂交瘤产生的抗体：2A1(以ATCC保藏号ATCC PTA-3896保藏)，2E5(以ATCC保藏号ATCC PTA-3897保藏)，1A8(以ATCC保藏号ATCC PTA-3647保藏)，2B10(以ATCC保藏号ATCC PTA-3648保藏)，2B1(以ATCC保藏号ATCC PTA-3646保藏)，1G10(以ATCC保藏号ATCC PTA-3898保藏)，7G5(以ATCC保藏号ATCC PTA-3899保藏)，8G6(以ATCC保藏号ATCC PTA-3645保藏)，3G9(以ATCC保藏号ATCC PTA-3649保藏)，或其人源化形式。
2.权利要求1的用途，其中所述αvβ6抗体增加肿瘤细胞对生长抑制化学治疗性化合物的应答性。
3.权利要求1的用途，其中所述肿瘤细胞来自腺癌或选自胰腺癌、结肠直肠癌、***、鳞状细胞癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌和肺癌的癌。
4.权利要求1的用途，其中所述抗体是3G9、8G6、1A8或2E5。
5.权利要求1的用途，其中所述抗体是人源化的抗体。
6.权利要求5的用途，其中所述人源化的抗体是人源化的3G9(BG 00011)、人源化的8G6、人源化的1A8或人源化的2E5。
7.权利要求1或2的用途，其中所述抗体与可检测标记缀合。
8.权利要求7的用途，其中所述可检测标记选自生色标记、酶标记、放射性同位素标记、非放射性同位素标记、荧光标记、毒性标记、化学发光标记、X放射照相标记、自旋标记和核磁共振造影剂标记。
9.权利要求2的用途，其中所述生长抑制化学治疗性化合物选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、吉西他滨、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、加利车霉素、美登素、trichothene、CC 1065、白喉A链、铜绿假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商路蛋白、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、单端孢霉烯族化合物、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。
10.权利要求8的用途，其中：
a)其中所述生色标记选自二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸；
b)其中所述酶标记选自苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母-醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶；
c)其中所述放射性同位素标记选自3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc和109Pd；
d)其中所述非放射性同位素标记选自157Gd、55Mn、552Dy、52Tr、56Fe、99mTc和112In；
e)其中所述荧光标记选自152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二醛标记和荧光胺标记；
f)其中所述毒性标记选自白喉毒素标记、蓖麻毒蛋白标记和霍乱毒素标记；
g)其中所述化学发光标记选自氨基苯二酰肼标记、异氨基苯二酰肼标记、芳族吖啶鎓酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记；
h)其中所述X放射照相标记是钡或铯；
i)其中所述自旋标记是氘；以及
j)其中所述核磁共振造影剂标记选自Gd、Mn和铁。
11.权利要求1或2的用途，其中所述抗体与细胞毒性试剂缀合。
12.权利要求1或2的用途，进一步包括抑制smad4缺陷肿瘤细胞中TGF-β信号传导通路的试剂，其中所述试剂是可溶性TGF-β受体肽或其片段，或者包含可溶性TGF-β受体肽或其片段的如何蛋白质。
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