CZ303450B6 - Protilátky k VLA-1, kompozice je obsahující a nukleové kyseliny, které je kódují, zpusob stanovení hladiny VLA-1 a použití pri lécení imunologického onemocnení - Google Patents

Protilátky k VLA-1, kompozice je obsahující a nukleové kyseliny, které je kódují, zpusob stanovení hladiny VLA-1 a použití pri lécení imunologického onemocnení Download PDF

Info

Publication number
CZ303450B6
CZ303450B6 CZ20033039A CZ20033039A CZ303450B6 CZ 303450 B6 CZ303450 B6 CZ 303450B6 CZ 20033039 A CZ20033039 A CZ 20033039A CZ 20033039 A CZ20033039 A CZ 20033039A CZ 303450 B6 CZ303450 B6 CZ 303450B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
domain
seq
light chain
heavy chain
Prior art date
Application number
CZ20033039A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20033039A3 (cs
Inventor
D. Lyne@Paul
A. Garber@Ellen
W. Saldanha@Jose
Karpusas@Michael
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ20033039A3 publication Critical patent/CZ20033039A3/cs
Publication of CZ303450B6 publication Critical patent/CZ303450B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

Predmetem rešení je protilátka anti-VLA-1 nebo její antigen-vazebný fragment, jejíž úseky urcující komplementaritu lehkého retezce a težkého retezce jsou definovány specifickými úseky ze sekv. id. c. 1 a sekv. id. c. 2. Dále je predmetem rešení kompozice tuto protilátku nebo její antigen-vazebný fragment a farmaceuticky prijatelný nosic obsahující, izolovaná sekvence nukleové kyseliny obsahující DNA, kódující sekv. id. c. 1 a kódující sekv. id. c. 2 a použití kompozice pro prípravu léciva pro lécení imunologického onemocnení.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká protilátek k integrínu VLA-1, kompozic je obsahujících, nukleových kyselin, které kódují tyto protilátky a použití protilátek pro přípravu léčiva pro léčení imunologických onemocnění. Vynález se také týká způsobu stanovení hladiny VLA-1 in vitro a způsobu identifikace inhibitoru 1 domény integrinu.
Dosavadní stav techniky
Integriny tvoří superrodinu receptorů buněčného povrchu, které zprostředkovávají adhezi buňka-buňka a buňka-matrix. Tyto proteiny jsou známy tím, že poskytují ukotvení a také signály pro buněčný růst, migraci a diferenciaci během vývoje a regenerace tkání. Soudí se, že se také podílejí na imunitních a zánětlivých procesech. Integriny jsou heterodimerické proteiny složené ze dvou nekovalentně spojených polypeptidových řetězců, a a β. Aminokonec každého řetězce vytváří kulovitou „hlavu“, která přispívá k meziřetězcové vazbě a k vazbě ligandu. Tyto kulovité hlavy jsou připojeny k transmembránovým segmentům tzv. „stonky“. Cytoplazmatické „ocásky“ jsou obvykle dlouhé méně než 50 aminokyselinových zbytků. Integrinové subrodiny byly původně definovány na základě toho, že β podjednotka byla použita ke vzniku heterodimerů. Integriny obsahující βΐ jsou také nazývány VLA molekuly, což souvisí se vztahem k antigenům „velmi pozdní aktivace“ („very latě activation“). Označení VLA-1 až VLA-6 se týkají subrodiny obsahující al až a6 (tj. CD49a až CD49f), v daném pořadí. Pro obecný přehled viz např. Cellular and Molecular Immunology, eds. Abul K. Abbas et al„ W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000.
Kolagen (jak typ I tak typu IV) a lamin i n jsou známé ligand αϊβΐ integrinu (tj. VLA-1). Má se za to, že VLA-1 se podílí na buněčné adhezi a migraci na kolagenu (Keely et al., 1995, J. Cell Sci. 108: 595-607, Gotwals et al., 1996, J, Clin. Invest. 97: 469-2477), podporuje kontrakce a reorganizaci kolagenové matrice, je rozhodující komponentou při hojení ran (Gotwals et al„ výše a Chiro, 1991, Cell 67: 403-410), a účastní se řízení exprese genů zapojených do reorganizace extracelulámí matrix (Riikonen et ak, 1995, J. Biol. Chem. 270: 1-5, and Langholz et al„ 1995, J. Cell Biol. 131: 1903-1915). Takže nesprávná regulace VLA-1 může mít za následek určité patologické stavy, jako například fibrózu.
Navíc bylo také navrženo, že VLA-1 by mohl hrát úlohu v onemocněních, která jsou způsobena T lymfocyty/monocyty. anti-VLA-1 protilátky blokují expresi cytokinů závislou na T lymfocytech (Miyake et al„ 1993, J. Ep. Med. 177: 863-868). Exprese VLA-1 je zvýšena u perzistentně aktivovaných, 2 až 4 týdny starých, kultivovaných T lymfocytech (Hemler et al„ 1985, Eur. J. lmmunol. 1 5: 502-508). VLA-1 je také exprimován na vysokém procentu T lymfocytů izolovaných ze synovia pacientů s revmatoidní artritidou (Hemler et al., 1986, J. Clin. Invest. 78: 692702).
Několik krystalových struktur integrinové podjednotky a bylo určeno, včetně struktury domény a2-I z α2β1 (PDB přístupový kód laox, Emsley et ak, 1997, J. Biol. Chem. 272: 28512-28517), al-I domény z potkanního cxlβ 1 (PDB přístupový kód lck4, Nolte et ak, 1999, FEBS Lett. 452: 379-385, WO00/20459), al podjednotky humánního αϊβΐ (PDB přístupový kód lqc5, Rich et ak, 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906-24913), aL-I a aM-I domén a vWF-A3 (Lee et ak, 1995, Cell 80: 631-635, Lee et ak, 1995, Structure 3: 1333-1340, Qu et ak, 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:10277-10281, Qu et al., 1996, Structure 4:931-942). Struktura α2β1 byla odhalena
- 1 CZ 303450 B6 jako šroubovice (helix) (tj. G-helix), která tvoří zářez nebo rýhu na jedné straně proteinu ve vazebném místě pro ion kovu (Emsley et al.5 supra).
Krystalová struktura a2-I domény v komplexu s krátkým trojšroubovicovým peptidem na bázi kolagenu odhalila, že peptid na bázi kolagenu byl vázán k zářezu, kde aminokyseliny a2-I, které vytvářely intermolekulámí kontakty nebo kontakty s kovem, byly Aspl51, Asn 154, Tyr 157, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295 a Lys298 (PDB přístupový kód ldzi, Emsley et al., 2000, Cell 101: 47-56, WOO 1/73444). Bezprostředně výše uvedené číslování aminokyselin je založeno na sekvenci s PDB přístupový kódem 1 dzi, a v tomto textu se na ně dále odkazuje jako na „krystalové číslování“. Krystalové struktury al-I domén laboratorního potkana a člověka vykazovaly podobné zářezy.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje protilátky anti-VLA-1, a dále se týká použití těchto protilátek při léčení celé řady imunologických onemocnění.
Konkrétně se vynález týká protilátky, které se specificky váže kVLA-1 (např . humánnímu VLA-l). Tato protilátka obsahuje úseky určující komplementaritu („CDR“) lehkého řetězce definované aminokyselinovými zbytky 24 až 39, 49 až 55 a 88 až 96 ze sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako sekv. id. č. 1, a jejíž úseky určující komplementaritu těžkého řetězce jsou definované aminokyselinovými zbytky 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 ze sekvence uvedené zde v seznamu sekvencí jako sekv. id. č. 2.
Tyto úseky CDR mohou obsahovat mutace (např. delece, inzerce a/nebo substituce) v částech, které nejsou v kontaktu s antigenem, jak bylo určeno z krystalové struktury popsané v tomto textu, aniž by to ovlivnilo VLA-l-vazebnou aktivitu protilátky. Příklady takových mutací jsou S24N, G92S a D101A v CDR lehkého řetězce a G55S v CDR2 těžkého řetězce.
V jednom provedení vynálezu obsahuje uvedená protilátka ve svém těžkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: V12, F29, A49, T93 a R94 (číslování odpovídá konvenci podle Kabata) nebo obsahuje ve svém lehkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků Ql, L4 a Y71.
V jednom provedení protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle vynálezu obsahuje variabilní doménu lehkého řetězce mající sekvenci id. č. 1 a/nebo variabilní doménu těžkého řetězce mající sekvenci id. ě. 2.
V příbuzném provedení protilátka podle vynálezu obsahuje stejnou polypeptidovou sekvenci těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná hybridomem mAQC2, který byl uložen
18. dubna 2001 v Americké sbírce mikroorganizmů (American Type Culture Collection, „ATCC“, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) a má ATCC přístupové číslo PTA3273. (Všechna uložení v ATCC popsaná v tomto textu byla provedena ve smyslu Budapešťské smlouvy). Tato protilátka může být tedy produkována například hybridomem mAQC2 nebo buňkami, které obsahují sekvencí nukleové kyseliny izolovanou z uvedeného hybridomu, kterážto sekvence kóduje těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky mAQC2.
V jednom provedení je protilátka nebo její fragment humanizovanou protilátkou.
Humanizovaná protilátka nebo její antigen-vazebný fragment obsahuje (a) ve svém lehkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: Ql, L4, P46, W47 a Y71; nebo ve svém těžkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: Dl, V12, S28, F29, A49, T93, R94 podle číslování podle Kabata; nebo může obsahovat
-2CZ 303450 B6 (b) sekvenci variabilní domény lehkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 106 ze sekv. id. č. 3 a sekvenci variabilní domény těžkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 118 ze sekv. id. č. 4; nebo může obsahovat (c) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linii hAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3275; (vzorek uložen 18. dubna 2001) nebo může obsahovat io (d) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií hsAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3356; nebo může obsahovat (e) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií ha AQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3274.
V dalším provedení humanizovaná protilátka podle vynálezu může obsahovat mutaci (např. deleci, substituci nebo adici) v jedné nebo více (např. 2, 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8) určitých polohách těžkého řetězce, takže efektorová funkce protilátky (např. schopnost protilátky vázat se k Fc receptorů nebo faktoru komplementu) je změněna, aniž by byla ovlivněna schopnost protilátky vázat se k VLA-1 (U. S. Patent 5 548 260). Tyto polohy v těžkém řetězci zahrnují zbytky 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 (systém číslování EU).
Jedním provedením je humanizovaná protilátka obsahující mutace L234A (tj. leucin v poloze 234 nemodifikované protilátky je nahrazen alaninem) a L235A (systém číslování EU) v těžkém řetěz25 Cl.
V ještě dalším provedení humanizovaná protilátka podle vynálezu obsahuje mutaci (např. deleci nebo substituci) v aminokyselinovém zbytku, který je místem pro glykosylaci, takže glykosylační místo je odstraněno. Taková protilátka může být klinicky přínosná tím, že má redukovanou efektorovou funkci nebo další nežádoucí funkce, přičemž si udržuje svoji vazebnou afinitu pro VLA-1. Mutace glykosylačního místa mohou být také přínosné pro vývoj postupů zpracování (např. exprese proteinu a jeho purifikace). Konkrétně těžký řetězec protilátky může obsahovat mutaci N297Q (systém číslování EU), takže takový těžký řetězec nemůže být glykosylován v tomto místě.
V jednom dalším provedení vynálezu je antigen-vazebný fragment protilátky vybrán ze skupiny sestávající z Fab, F(ab')2 a jednoduchého řetězce Fv.
Vynález dále zahrnuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující (a) kódující sekvenci pro sekv.
id. č. 1, a izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro sekv. id. č. 2;
(b) izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro lehký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2;
(c) izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro lehký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hAQC2, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií gAQC2;
(d) izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií haAQC2;
(e) izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hsAQC2;
-3CZ 303450 B6 (f) izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro zbytky 1 až 106 ze sekv. id. Č. 3, izolovanou nukleovou kyselinu obsahující kódující sekvenci pro zbytky 1 až 118 ze sekv. id. č. 4, (g) kódující sekvence protilátky anti-VLA-1 nebo jejího antigen-vazebného fragmentu, jejíž úseky určující komplementaritu lehkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 24 až 33,49 až 55 a 88 až 96 ze sekv. id. č. 1, a jejíž úseky určující komplementaritu těžkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 ze sekv. id, č, 2.
ío Dále jsou předmětem vynálezu buňky buněčné linie hAQC2, buňky buněčné linie haAQC2 a buňky buněčné linie hsAQC2 nebo buňky hybridomu mAQC 2.
Vynález dále zahrnuje kompozici obsahující výše definovanou protilátku nebo její antigenvazebný fragment a farmaceuticky přijatelný nosič.
Předkládaný vynález se také týká použití této kompozice pro přípravu léčiva pro léčení pacienta s imunologickým onemocněním. Při léčení se podává pacientovi účinné množství protilátky podle vynálezu. Například se takové léčivo používá při léčení humánních pacientů ke zmírnění, zlepšení, stabilizování, re verzi, zabránění, zpomalení nebo zdržení průběhu onemocnění. Jinak kompozice obsahující výše definovanou protilátku nebo její antigen-vazebný fragment používá profylakticky při léčbě humánních pacientů, kteří jsou v nebezpečí, že se u nich rozvine imunologické onemocnění, a to buď pro prevenci nebo pro zpoždění nástupu onemocnění. „Účinné množství“ přípravku může být podáno v jedné nebo ve více dávkách.
K imunologickým onemocněním zprostředkovaným VLA-1 patří, aniž by však tento výčet byl omezující, chorobné stavy, při kterých je hladina VLA—1 aktivity z výšena v jedné nebo ve více tkáních ve srovnání s normálním zdravým jedincem. Příklady takových chorobných stavů jsou stavy příbuzné kožním nemocem (např. psoriáza, ekzém, popáleniny, dermatitida a abnormální proliferace buněk vlasových váčků), fibróza (např. ledvin nebo plicní flbróza), alergická rinitida, syndrom respiračního distessu, astma, bronchitida, tendinitida, bursitida, horečka, migrény, gastrointestínální onemocnění (např. zánětlivé onemocnění střev, Crohnova nemoc, gastritida, syndrom dráždivého tračníku, kol itida a kolorektální karcinom), vaskulámí onemocnění (např. ateroskleróza), periarteritida nodosa, thyroiditida, aplastická anémie, Hodgkinova nemoc, revmatická horečka, osteoartritida, auto imunní nemoci (např. diabetes typu 1, myasthenia gravis, revmatoidní artritida, systémový lupus erythematosus a sclerosis multiplex), sarkoidóza, nefrotický syndrom, renální selhání, Bechetův syndrom, polymyositida, gingivitida, přecitlivělost (např. opožděný typ hypersenzitivity nebo okamžitá hypersenzitivita), rejekce štěpu a transplantátu, onemocnění způsobené reakcí štěpu proti hostitelovi (GVHD), konjunktivitida, otoky nastávající po poranění, ischémie myokardu a syndrom endotoxinového šoku.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro určení in vitro hladiny VLA-1 v tkáni (např. vzorku tkáně a tělní tekutiny), který zahrnuje krok, kdy se tkáň přivede do kontaktu in vitro s protilátkou podle vynálezu a pak se detekuje vazba protilátky k tkáni, čímž se určí hladina VLA-1 v tkáni.
Jak se v tomto textu používá termín protilátka podle vynálezu, může to být například myší protilátka, humanizovaná protilátka nebo chimérická protilátka. Může to být celá protilátka (tj. se dvěma kompletními lehkými řetězci a dvěma kompletními těžkými řetězci) kteréhokoliv izotypu a podtypu (např. IgM, lgD, IgG, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA a IgA2, s lehkým řetězcem buďto typu kappa nebo lambda). Jinak se termín protilátka podle vynálezu také týká antigen-vazebného fragmentu (např. Fab, F (ab')2 a jednoduchého řetězce Fv) z celé protilátky.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob identifikace inhibitorů domény I integrinu, který zahrnuje kroky, kdy se
-4CZ 303450 B6 (a) použijí strukturní koordináty aminokyselin hAQC2 obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Arg31, H is56, Tyr58, Gly 100 a AsplOl podle obr. 19, nebo +/- hodnota střední kvadratické odchylky atomů hlavního řetězce uvedených aminokyselin hAQC2 nejvýše ±1,10 A, přičemž 1 Á je 1.10“l°m, pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, (b) použije trojrozměrná struktura k navržení nebo výběru potenciálního antagonisty, (c) syntetizuje potenciální antagonista a (d) uvede do kontaktu potenciální antagonista s hAQC2, aby se určila schopnost potenciálního antagonisty interagovat s hAQC2, přičemž schopnost potenciálního antagonisty interagovat s hAQC2 ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitorem I domény.
Další vlastnosti a výhody vynálezu budou zjevné z následujícího podrobného popisu, příkladů, obrázků a nároků.
Popis obrázků
Obrázek 1. Integriny αϊβΐ a α2β1 vázající kolagen na aktivovaných leukocytech. (A). Analýza exprese al a α2β! integrinů na IL-2 aktivovaných splenocytech (dlt) užitím průtokové cytometrie. Buňky byly značeny buďto anti-αΐ mAb (monoklonální protilátkou), anti-a2 mAb nebo nevázající se kontrolní mAb (šedé linie) a poté FITC-anti-křeččí imunoglobulin. (B) Účinek anti-α a anti-a2 mAb na adhezi leukocytů ke kolagenu. 105 IL-2 aktivovaných splenocytů bylo podrobeno působení uvedených mAb po dobu 15 minut před vysetím na destičky s jamkami potaženými kolagenem buďto typu IV nebo typu I na dobu 1 hodiny při 37 °C. Adheze byla vypočtena jak je znázorněno v příkladu 1 a vyjádřena jako % adheze vzhledem ke kontrolním buňkám ošetřeným mAb. Testy Adheze byly provedeny ve třech opakováních a byly provedeny přinejmenším tři nezávislé experimenty. Ukázán je jeden reprezentativní experiment.
Obrázek 2. Účinek anti-integrovaných mAb na efektorovou fázi hypersenzitivity opožděného typu. SRBC-senzitizované myši byly injikovány i, p, uvedenými mAb, a to 1 hodinu před SRBC výzvou („challenge“). Tloušťka polštářků tlapky (dále zkráceně jen tlapky) byla měřena 20 hodin po expozici antigenu a výsledky jsou ukázány jako % zvýšení tloušťky ± střední chyba průměru (SEM), jak je znázorněno v příkladu 2. Data představují souhrn z osmi experimentů s n = 79 (PBS), 68 (kontrolní Ig křečka), 68 (anti-al), 29 (anti-a2), 18 (anti-al ±anti-a2), 45 (anti-a4), 18 (anti-a5), 20 (anti-a6) a 10 (anti-βΐ). Byly použity mAb Ha4/8 (kontrolní křečci Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-αό) a HMPL-1 (anti-βΐ).
Obrázek 3. Účinek anti-integrovaných mAb na efektorovou fázi kontaktní hypersenzitivity. FITC-senzitizované myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny před FITC výzvou. Tloušťka ušního boltce byla změřena na počátku (výchozí hodnota) za 24 hodin, a výsledky byly uvedeny jako % zvýšení tloušťky ucha ± střední chyba průměru (SEM), jak je ilustrováno v příkladu 3. Tato data představují shrnutí devíti experimentů s n = 74 (PBS), 60 (kontrolní Ig křečka), 26 (anti-ICAM-1), 44 (anti-al), 44 (anti-a2), 38 (anti-al + anti-a2), 36 (anti-a4), 16(anti-a5). 26 (anti-a4 + anti-a5), 24 (anti-a6) a 22 (anti-βΐ). Byly použity křeěčí mAb: Ha4/8 (kontrolní křečci Ig skupiny 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/ (anti-a2), HMSS1-1 (anti-βΐ), 3E2 (anti-ICAM-1), a byly použity mAb laboratorního potkana; R35-95 a R35-38 (kontrolní IgG2a laboratorního potkana, a IgG2b laboratorního potkana, v daném pořadí), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-aS), GoH3 (anti-a6).
-5 CZ 303450 B6
Obrázek 4. Reakce kontaktní hypersenzitivity u α 1—deficitní myši ve srovnání s myší divokého typu. FITC-senzitizované myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb, a to 4 hodiny před FITC výzvou. Tloušťka ušního boltce byla změřena na počátku (výchozí hodnota) a za 24 hodin, a výsledky byly uvedeny jako % zvýšení tloušťky ucha ± střední chyba průměru (SEM), jak je ilustrováno v příkladu 4. Skupiny čtyř až pěti myší byly užity pro jednotlivé typy ošetření a všechny experimenty byly provedeny nejméně třikrát. Jeden reprezentativní experiment je ukázán.
Obrázek 5. Účinek anti-αΐ a anti-a2 mAb na nespecifický zánět indukovaný krotonovým olejem. Myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb 4 h před potřením uší krotonovým olejem. Tloušťka ucha byla změřena na počátku (bazální hodnota) a o 24 hodin později, a výsledky byly ukázány jako % zvýšení tloušťky ± střední chyba průměru, jak je znázorněno v příkladu 5. Skupiny čtyř až pěti myší byly užity pro jednotlivé typy ošetření a všechny experimenty byly provedeny nejméně třikrát. Jeden reprezentativní experiment je ukázán.
Obrázek 6. Účinek anti-αΐ a a2 mAb na artritidu indukovanou mAb proti kolagenu. Myši byly injikovány i. p. anti-kolagen mAb v den 0, poté následované LPS v den 3. Myši byly injikovány i. p. uvedenými mAb každý 3. den počínaje dnem 0. Klinická artritida byla patrná 2 až 3 dny po LPS injekci a trvala několik týdnů. Každá končetina byla ohodnocena podle škály 0 až 4 každý 3. den, jak je znázorněno v příkladu 6, a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dnem 9 a dnem 15 (±SEM) z údajů pro všechny čtyři končetiny. Data představují shrnutí ze čtyř experimentů, kdy každý experiment byl proveden na skupině tří až čtyři myší.
Obrázek 7. Účinek anti~al a a2 mAb na artritidu indukovanou mAb proti kolagenu.
A. Prevenční léčba myší buď anti-αΐ nebo anti-a2 mAb snížila artritické skóre. Myši byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, poté následoval LPS v den 3. Artritida byla patrná v den 6 a pokračovala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení uvedených mAb každý 3. den počínaje dnem 0. Každá končetina byla ohodnocena podle škály 0 až 4 každý 3. den, jak je znázorněno v příkladu 6, a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dnem 9 a dnem 15 (±SEM) pro všechny čtyři končetiny (maximální skóre 16). Skupina čtyř myší byla použita pro každý druh experimentálního ošetření, uvedená data jsou průměrem ze 12 experimentů.
B. al deficitní myši měly redukované artritické skóre srovnatelné se skupinou myší divokého typu ošetřených anti-αΐ mAb. Skupiny čtyř myší byly užity pro každý experiment, je uvedena průměrná hodnota ze dvou experimentů.
Obrázek 8. Rozvoj artritidy je opožděn za absence lymfocytů a inhibice artritidy anti-αΐ mAb nastává za absence lymfocytů. Myši divokého typu B6,129 nebo RAG-1 deficientní myši B6,129 myši byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, následoval LPS v den 3. Artritida byla patrná v den 6 a trvala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení uvedených mAb každý 3. Den počínaje dnem 0. Každá končetina byla hodnocena a byla vyhodnocena na skóre 0 až 4 každý 3. den. Výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre pro končetinu (maximální skóre 4), Pro každé ošetření byly použity skupiny 4 myší.
Obrázek 9. Reakce na dávku při anti-αΐ mAb inhibici artritidy. Myši divokého typu Balb/c byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, následoval LPS v den 3. Artritida byla patrná v den 6 a trvala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení i. p. uvedených dávek buďto Ha4/8 (izotypová kontrola) nebo Ha31/8 (anti—al) mAb každý 3. den počínaje dnem 0. Každá končetina byla hodnocena a byla skórována v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. den. Výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre na končetinu (maximální skóre 4). Pro každé ošetření byly použity skupiny 4. myší.
-6 CZ 303450 B6
Obrázek 10. Terapeutické ošetření santi-αΐ mAb může snížit artritické skóre, myši Balb/c divokého typu byly podrobeny působení anti-kolagen mAb v den 0, následoval LPS v den 3. Artritida byla patrna v den 6 a trvala několik týdnů. Myši byly podrobeny působení i. p. mAb (250 pg) nebo Ig fuzního proteinu (200 pg) každý 3. Den počínaje dnem 4. Myši dostaly buď mAb (Ha4/8 izotypová kontrola nebo Ha31/8 anti-αΐ), Ig fúzní protein (Ig izotypová kontrola nebo TNF R55-lg) nebo kombinaci obou (250 pg Ha31/8 a 200 pg TNF-R55-Ig). Každá končetina byla hodnocena a byla skórována v rozsahu škály 0 až 4 každý 3. den. Výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre na končetinu (maximální skóre 4). Pro každé ošetření byly použity skupiny 4 myší.
Obrázek 11. Lokalizace epitopu pro anti-αΐ mAb blokující doménu I.
A. Aminokyselinová sekvence al-I domény laboratorního potkana (nahoře, sekv. id. č. 63) a člověka (dole, sekv. id. č. 64). Zbytky zahrnující motiv MIDAS (adhezní místo závislé na kovovém iontu) jsou ukázány tučně. Humánní aminokyseliny, které nahradily odpovídající zbytky laboratorního potkana (RAH) jsou ukázána pod sekvencí laboratorního potkana v rámečku. Pro jasnost, číslování zbytků v textu se vztahuje právě k tomuto obrázku, není-li uvedeno jiné číslování, např. krystalové číslování.
B. Zvyšující se koncentrace mAb AJH10 (ATCC č. PTA-3580, uložena podle Budapešťské smlouvy ve sbírce ATC, Manassas, VA, USA, 2. srpna 2001) byla navázána na destičky potažené 30pg/ml humánní (kroužky), potkanní (trojúhelníky) nebo RAH (čtverečky) al-I domény. Uvedená data reprezentující tri experimenty.
Obrázek 12. Aminokyselinová sekvence humánní al-I domény (sekv. id. ě. 64).
Obrázek 13. Identifikace blokující mAb al-I domény
A. Zvyšující se koncentrace mAb AEF3 (trojúhelníky) nebo AJH10 (kruhy) byly navázány na destičky potažené 30 pg/ml al-1 domény.
B. al-I doména byla podrobena působení zvyšující se koncentrace mAb AJH10 (kosočtverce) nebo mAb BGC5 (čtverce) a navázána na destičky potažené kolagenem IV (2 pg/ml).
C. K562—al buňky byly podrobeny působení zvyšující se koncentrace mAb AEF3 (trojúhelníky) nebo AJH10 (kruhy) a navázány na destičky potažené kolagenem IV (5 pg/ml). 45 až 50 % buněk přidaných ke každé jamce adherovalo ke kolagenu IV. Uvedená data reprezentují tři nezávislé experimenty.
Obrázek 14. Druhově zkřížená reaktivita blokujících mAb analyzovaná FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk). Králičí buňky hladkého svalstva cév byly inkubovány buď s mAab AJH10 (dole) část nebo myší IgG kontrolou (nahoře) a analyzovány FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk).
Obrázek 15. al-1 doména váže kolagen.
A. Zvyšující se koncentrace humánní al-I domény byla navázána na destičky předtím potažené 1 pg/ml kolagenu I (čtverečky) nebo kolagenu IV (kroužky). Uvedené hodnoty byly korigovány na pozadí vazby k BSA.
B. 2 pg/ml humánní al-I domény bylo smícháno se zvyšující se koncentrací protilátky 5E8D9 proti humánnímu αΐ-integrinu (čtverečky) nebo protilátky A2IIE10 proti humánnímu a2-integrinu (kroužky) a pak navázáno na destičky předtím potažené 1 pg/ml kolagenu IV.
-7CZ 303450 B6
C. Destičky byly potaženy 1 gg/ml kolagenu IV nebo 3% BSA. al-I doména (2 pg/ml) byla následovně navázána na destičky potažené v přítomnosti 1 mM Mn2+, 1 mM Mg2+ nebo 5 mM EDTA. Uvedená data reprezentují tři nezávislé experimenty.
Obrázek 16. Charakterizace humanizovaných forem AQC2. Byly hodnoceny mAQC2 (trojúhelníky), chAQC2 (kruhy), hAQC2 (obrácené trojúhelníky) a hAQC2' (čtverce) byly.
A. Inhibice VLA-1 vazby ke kolagenu typu IV.
B. Inhibice vazby al-I domény ke kolagenu typu IV.
C. Vazba k imobilizované doméně al-L
D. Kompetice s biotinylovanou mAQC2 o vazbu k imobilizované doméně al-I.
Obrázek 17. Charakterizace humanizovaných forem AQC2 pomocí FACS.
Obrázek 18. Charakterizace humanizovaných forem AQC2 pomocí FACS.
Obrázek 19. Koordináty atomové struktury komplexu „al-I doména/Fab“, jak byly určeny rentgenovou krystalografií krystalů komplexu ve formátu proteinové databanky (PDB). Koordináty dvou komplexů v asymetrické jednotce jsou uvedeny následovně:
Komplex 1: molekula A = I doména integrinu molekula H = těžký řetězec hAQC2 Fab molekula L = lehký řetězec hAQC2 Fab molekula M = Mn +
Komplex 2: molekula Β = I doména integrinu molekula X = těžký řetězec hAQC2 Fab molekula Y - lehký řetězec hAQC2 Fab molekula M = Mn2+
Obrázek 20. Komplex „I doména/Fab“.
A. Pásový diagram komplexu doména I/Fab. Doména I a těžký a lehký řetězec protilátky jsou značeny. Mn2' ion je ukázán jako koule.
B. Zvětšení místa MIDAS (adhezní místo závislé na kovovém iontu) ukazující koordinaci kovového iontu (koule) zbytkem AsplOl (krystalové číslování). Proteinové hlavní řetězce jsou ukázány jako stuhy a postranní řetězce jsou znázorněny formou kuliček a tyčinek. Válce představují interakce mezi kovovým iontem a proteinovými atomy. Tenké čáry představují H-vazby. Obr. 20 byl vytvořen pomocí softwaru RIBBONS (Carson, 1991, J. Appl.Cryst. 24:958-961).
Obrázek 21. Diagram systému použitého k realizaci instrukce kódované paměťovým médiem na obr. 22 a 23.
Obrázek 22. Průřez magnetickým paměťovým médiem. Obrázek 23. Průřez opticky čitelným paměťovým médiem.
-8CZ 303450 B6
Podrobný popis vynálezu
Objevem, na kterém je založen předkládaný vynález, je to, že protilátka k integrinu (např. VLA-1) a jeho fragmentu, konkrétně podjednotce al-integrinu, může blokovat interakci prozánětlivých leukocytů se složkami extracelulámí matrix, včetně kolagenů, lamininu a fibronektinu, aniž by tento výčet složek byl omezující. Tento objev ukazuje důležitost adhezních molekul z rodiny integrinů, zejména αϊβΐ, v prostředí periferních tkání v průběhu stavů příbuzných zánětu.
To také rozšiřuje úlohu členů rodiny integrinů a jejich fragmentů při zánětu nad pouhé navázání leukocytů a extravasaci na hranici endotelu tím, že zdůrazňuje důležitost matrix-bohatého prostředí periferní tkáně pro imunitní reakce a odhaluje tak periferní tkáně jako nový cílový bod intervence při terapii založené na adhezi.
I. Anti-integrinové protilátky
Způsoby podle předkládaného vynálezu uvažují s použitím protilátek k integrinům, kde integriny zahrnují molekuly, které obsahují řetězec β, včetně, ale bez omezení βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, nekovalentně vázaný k řetězci a, včetně, ale bez omezení, al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, a 10, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Příklady různých integrinů, přicházejících do úvahy pro použití podle vynálezu, zahrnují, ale bez omezení, následující integriny:
αϊβΐ, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, αόβΐ, α7β1, α8β1, α9β1, αΙΟβΙ, αΥβΙ, αΐ,βΐ, αΜβΙ, αΧβΙ,αϋβΙ,αΠΗβΙ,αΕβΙ;
ο1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, «6β2, «7β2, <χ8β2, α9β2, <χ10β2, αΥβ2. oLP2, «Μβ2, αΧβ2, αϋβ2, α!Β>β2, <χΕβ2;
«1β3, «2β3, α3β3, α4β3. α5β3, «6β3, «7β3, <χ8β3, α9β3, α10β3. aVp3, <Λβ3, αΜβ3, αΧβ3, αθβ3, αΙΠ)β3. αΕβ3;
α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, aLp4, αΜβ4, αΧβ4 αθβ4, αΐη>β4, αΕβ4;
ο1β5, Όί2β5, α3β5, α4β5, <χ5β5, α6β5, α7β5, α8β5, α9β5, α10β5, ανβ5, aLp5, «Μβ5, αΧβ5, αθβ5, αΙΠ>β5, αΕβ5;
α1β6, α2β6, α3β6, α4βό, α5β6, αόβδ, α7β6, α8βό, α9β6, αΙΟβό, ανβ6,«Ι.β6.αΜβ6, αΧβό, αΟβδ, αΙΙάβδ, αΕβδ;
α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, α5β7, αδβ7, «7β7, α8β7, «9β7, «10β7, αΥβ7, oLP7, αΜβ7, οΧβ7,αΟβ7,αΐη>β7,αΕβ7;
-9CZ 303450 B6 <%1β8, <χ2β8, α3β8, α4β8, α5β8, α6β8, α7β8, <χ8β8, α9β8, α10β8, <χνβ8, αΙβ8,αΜβ8, αΧβ8,αϋβ8,αΠάβ8, αΕβ8;
Způsoby podle předkládaného vynálezu také zahrnuj í použití protilátek k fragmentům integrínu včetně například protilátek proti samotnému řetězci β, včetně, ale bez omezení βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, stejně jako samotnému řetězci a, včetně, ale bez omezení, al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Navíc způsoby podle předkládaného vynálezu dále uvažují i použití protilátek k fragmentům integrínu včetně například protilátek k doméně I řetězce a, včetně, ale bez omezení, domény I z αϊβΐ (Briesewitz et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 2089), α2β1 (Takada and Hemler, 1989, I Cell Biol 109: 397), α!.β2 (Larson et al., io 1989, J. Cell Biol 108: 703), αΜβ2 (Corbi et al., 1988, J. Biol Cheer 263: 12403), αΧβ2 (Corbi et al,, 1987, EMBO J 6: 4023), αϋβ2 (Grayson et al., 1988, J Exp Med 188: 2187), αΕβ7 (Shaw et al., 1994, J. Biol Chetsz 269: 6016). V jednom provedení antigenní determinanta al-I domény zahrnuje aminokyselinovou sekvenci přinejmenším 6 po sobě jdoucích aminokyselin, přičemž tato souvislá sekvence se vyskytuje v sekvenci uvedené na obr. 12. V příbuzném provedení je tato souvislá sekvence Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (aminokyselinové zbytky 91 až 97 ze sekv. id. č. 64).
Způsoby produkce integrinů pro použití podle předkládaného vynálezu jsou odborníkům známy (viz např. Springer et al., 1990, Nátuře 346: 425-434).
Provedení předkládaného vynálezu dále zahrnuje anti-integrinové polyklonální a monoklonální protilátky. Provedení předkládaného vynálezu zahrnují monoklonální protilátky jako je např. anti-αΐ monoklonální protilátka. Protilátky pro léčení, konkrétně pro humánní léčbu, zahrnují humánní protilátky, humanizované protilátky, chimérické protilátky a antigen-vazebné fragmen25 ty celých protilátek, jako jsou například Fab, Fab', F(ab')2 a F(v) protilátkové fragmenty. Některé protilátky podle vynálezu mohou také zahrnovat proteiny obsahující jeden nebo více imunoglobulinových lehkých řetězců a/nebo těžkých řetězců, jako například monomery a homo- nebo heteromultimery a (např. dimery nebo trimeiy) těchto řetězců, kde jsou tyto řetězce případně vázány disulfidickou vazbou nebojsou zesítěny jiným způsobem. Protilátky jsou schopné vazby k jednomu nebo více antigenům (např. al, a2, a6 nebo podjednotkám integrínu obsahujícím a-I doménu).
Označení protilátka blokující funkci αϊβΐ, jak se v tomto textu používá, se týká protilátky, která se váže na al-I doménu, například zbytky 92 až 97 sekvence na obr. 12, a blokuje tím αϊβΐ funkci, která je testována např. například podle schopnosti inhibovat K562-O.1 závislou adhezi ke kolagenu IV (viz příklad 15).
V následující části jsou popsány různé způsoby přípravy protilátek podle předkládaného vynálezu. Způsoby, kteréjsou v oboru známy, ale nejsou specificky popisovány v tomto textu, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu. Například protilátky podle vynálezu mohou také být identifikovány s použitím fágové displejové protilátkové knihovny, jak je např. popsáno v Smith, 1985, Science 228: 1315-7, nebo v U.S. patentech 5 562 332, 5 733 743, 6 291 650 a 6 303 313. Další protilátky podle vy nálezu mohou být připraveny kondenzací těžkých řetězců identifikovaných podle vynálezu s nepříbuzným lehkým řetězcem, např. lehkým řetězcem, který byl identifi45 kován metodou displeje na fágu („phage display“).
II. Protilátky z hybridomů jiných než humánních
Monoklonální protilátky podle vynálezu mohou být tvořeny známou hybridomovou technologií.
Například zvířata βΐ—/— (např. myši, laboratorní potkani nebo králíci) mohou být imunizovány purifikovaným nebo surovým preparátem αϊβΐ, buňky mohou být transfekovány cDNA konstruktem kódujícím al, βΐ nebo obaantigeny, buňky mohou konstitutivně exprimovat a 1 β 1 apod.
- 10CZ 303450 B6 antigen může být podán jako purifikovaný protein, protein exprimovaný na buňkách, proteinový fragment nebo jeho peptid, jako holá DNA nebo virový vektor kódující protein, proteinový fragment nebo peptid. Séra imunizovaných zvířat jsou pak testována na přítomnost anti-αΐβΐ protilátky. B lymfocyty jsou izolovány ze zvířat, která jsou v testu pozitivní a s B lymfocyty jsou vyt5 vořeny hybridomy.
Protilátky sekretované hybridomy jsou podrobeny screeningu na jejich schopnost vázat se specificky kVLA-1 (např. vázat se na buňky transfekované al a nikoliv na parenterální netransfekované buňky) a na jakékoliv další požadované vlastnosti, např. zda mají požadované CDR kanonické sekvence, zda inhibují (nebo neinhibují, v případě hledání neblokujících agens) vazbu mezi kolagenem a VLA-1.
Hybridomové buňky, které jsou pozitivní v screeningovém testu, jsou kultivovány v živném médiu za podmínek, které dovolují buňkám sekretovat monoklonální protilátky do kultivačního média. Kondicionovaný supematant hybridomové kultury je pak odebrán a protilátky obsažené v supematant jsou purifikována. Jinak mohou být požadované protilátky vytvořeny tak, že se injikují hybridomové buňky do pobřišniční dutiny neimunizovaného zvířete (např. myši). Hybridomové buňky se pak množí v pobřišniční dutině, a sekretující protilátku, která se hromadí jako tekutý ascites. Protilátka pak může být sklizena tím, že se odebere ascitická tekutina z pobřišniční dutiny pomocí injekční stříkačky.
Monoklonální protilátky mohou také být připraveny tak, že se izoluje cDNA kódující protilátku z požadovaného hybridomu, tato cDNA se transfekují do savčích hostitelských buněk (např. buňky CHO nebo NSO), transfekované hostitelské buňky se kultivují a protilátka se získá z ku 1ti25 vačního média.
III. Chimérické protilátky
Monoklonální protilátky podle vynálezu mohou také být připraveny tak, že se připraví příbuzná protilátka z hybridomu (např. myši, laboratorního potkana nebo králíka). Například příbuzná protilátka může pak být změněna technikou rekombinantní DNA tak, že část nebo celá kloubová oblast a/nebo konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce jsou nahrazeny odpovídajícími složkami protilátky jiného biologického druhu (např. humánní protilátky).
Obecně, variabilní domény gen eticky připravené protilátky zůstanou totožné nebo v podstatě totožné s variabilními doménami příbuzné protilátky. Taková geneticky upravená protilátka se nazývá chimérická protilátka a je méně antigenní než příbuzná protilátka, když je podávána příjemci, který je biologickým druhem, ze kterého pocházejí celá kloubová oblast a/nebo konstantní úseky těžkého a/nebo lehkého řetězce (např. člověk). Způsoby přípravy chimérických protilátek jsou v oboru dobře známy. Humánní konstantní úseky zahrnují ty, které pocházejí z IgG 1 a IgG4.
IV. Plně humánní protilátky
Monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu také zahrnují plně humánní protilátky.
Ty mohou být připraveny užitím in vitro iniciovaných („primed“) humánních splenocytů, jak bylo popsáno v Boemer et al., 1991, J. Immunol. 147: 86-95, nebo s využitím fágové displejové knihovny protilátek, jak bylo popsáno např. v U. S. patentu 6 300 064.
Jinak plně humánní protilátky mohou také být připraveny pomocí tzv. repertoárového klonování, jak bylo popsáno v Persson et al., 1991, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 188: 24322436, and Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236. Kromě toho, U. S. patent 5 798 230 (25. srpen 1998) popisuje přípravu humánní monoklonální protilátky z humánních B lymfocytů, kde humánní B lymfocyty produkující protilátky jsou imortalizovány infekcí virem EpsteinBarrové nebo jeho derivátem, který exprimuje nukleární antigen 2 (EBNA2) viru Epstein- 11 CZ 303450 B6
Barrové, což je protein požadovaný pro imortalizaci. EBNA2 funkce je následně vyřazena, což pak vede ke zvýšení produkce protilátky.
Některé další metody produkce plně humánních protilátek zahrnují použití zvířat jiného než lidského původu, která mají deaktivovaná endogenní lg lokusy a jsou transgenní pro geny těžkého řetězce a lehkého řetězce humánních protilátek, které nejsou přeskupeny. Taková transgenní zvířata mohou být imunizována αϊβΐ a z jejich B lymfocytů se pak připraví hybridomy. Tyto metody jsou popsány např. v různých publikacích GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA) a patentech týkajících se transgenní myší obsahující humánní lg minilokusy (např. Lonberg, U. S. patent 5 789 650), různých publikacích/patentech firmy Abgenix (Fremont, CA) týkajících se XENOMICE (např. Kucherlapati, U. S. patenty 6 075 181, 6 150 584 a 6 162 963, Green et al., 1994, Nátuře Genetics 7: 13-21 a Mendez et al., 1997, Nátuře Genetics 15 (2): 146-56) a různých publikacích/patentech firmy Kirin (Japonsko) týkajících se „transomické“ myši (např. EP 843961 a Tomizuka et al., 1997, Nátuře Genetics 16: 133-1443).
V. Humanizované protilátky
Monoklonální protilátky podle vynálezu také zahrnují humanizované verze příbuzných antiαϊβΐ protilátek pocházejících z jiných biologických druhů. Humanizovaná protilátka je protilátka připravená metodami rekombinantní DNA, ve které jsou některé nebo všechny aminokyseliny humánního imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce, které nejsou vyžadované pro vazbu antigenu (např. konstantní úseky a rámcové úseky variabilních domén) použity k nahrazení odpovídajících aminokyselin lehkého nebo těžkého řetězce v příbuzné protilátce jiného než lidského původu. Tak například humanizovaná verze myší protilátky k určitému antigenu má jak v těžkém i v lehkém řetězci (1) konstantní úseky humánní protilátky, (2) rámcové úseky z variabilní domény humánní protilátky a (3) úseky CDR z myší protilátky. Když je to nutné, jeden nebo více zbytků v humánním rámcovém úseku může být změněno na zbytky odpovídající polohám v myší protilátce, aby se zachovala vazebná afinita humanizované protilátky k antigenu. Tato změna je někdy nazývána „zpětnou mutací“ („back mutation“). Humanizované protilátky obecně vyvolávají imunitní reakce u lidí s menší pravděpodobností ve srovnání s chimérickými humánními protilátkami, protože humanizované protilátky obsahují podstatně méně složek jiného než lidského původu.
Způsoby přípravy humanizovaných protilátek jsou známy a byly popsány např. ve Winter, EP 239 400, Jones et al., 1986, Nátuře 321: 522-525, Riechmann et al., 1988, Nátuře 332: 323-327, 1988, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536, Queen et al., 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86: 10029, U. S. patent 6,180,370, a Orlandi et al„ 1989, Proč. Nati, Acad. Sci. USA 86: 3833. Obecně, transplantace myších (nebo obecně jiného než lidského původu) úseků CDR na humánní protilátku se provádí následujícím způsobem.
Z hybridomů se izolují cDNA kódující variabilní domény těžkého a lehkého řetězce. DNA sekvence variabilních domén, zahrnující úseky CDR, jsou určeny sekvencováním. DNA kódující CDR jsou pak přeneseny do odpovídajících úseků sekvence kódující variabilní domény těžkého nebo lehkého řetězce humánní protilátky metodou místně cílené mutageneze. Pak jsou přidány genové segmenty humánních konstantních úseků požadovaného izotypu (např. γΐ pro CH a k pro CL). Geny humanizovaného těžkého a lehkého řetězce jsou pak koexprimovány (současně exprimovány) v savčích hostitelských buňkách (např. CHO nebo NSO), čímž je produkována rozpustná humanizovaná protilátka. Aby bylo možné produkovat protilátky v průmyslovém měřítku, je často potřeba produkovat takové humanizované protilátky v bioreaktorech obsahujících buňky exprímující protilátky nebo pomocí transgenních savců (jako jsou např. kozy, krávy nebo ovce), kteří exprimuji protilátku v mléce (viz např. U. S. patent 5 827 690).
Někdy přímý přenos úseků CDR do humánního rámce vede k ztrátě antigen—vazebné afinity pro antigen u takto vzniklé protilátky. To je tím, že některé v některých příbuzných protilátkách určité aminokyseliny v rámcovém úseku interagují s CDR a tak ovlivňují celkovou vazebnou
- 12CZ 303450 B6 afinitu protilátky k antigenu. V takovém případě by bylo rozhodující vnést „zpětné mutace“ (viz výše) do rámcového úseku akceptorové protilátky, aby se udržela antigen-vazebná aktivita příbuzné protilátky.
Obecný postup vnášení zpětných mutací je v oboru znám. Například Queen et al. (viz výše), Coet al., 1991, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873 a WO90/G7861 (Protein Design Labs lne.) popisují způsob, který zahrnuje dva klíčové kroky. V prvním kroku humánní úseky V rámce jsou vybrány pomocí počítačové analýzy podle optimální sekvenční proteinové homologie s V rámcovými úseky příbuzné myší protilátky. Pak je terciární struktura myšího V úseku modelovalo na počítačem, aby bylo možné vizualizovat aminokyselinové zbytky rámcového úseku, které by mohly pravděpodobně interagovat s myšími úseky CDR, a tyto myší aminokyselinové zbytky jsou pak superponovány na homologní humánní rámcový úsek.
Při tomto dvoufázovém postupu je několik kritérií pro navrhování humanizovaných protilátek.
Prvním kritériem je použití jakožto humánního akceptoru rámcového úseku z určitého humánního imunoglobulinu, který je obvykle homologní s donorovým imunoglobulinem jiného než lidského původu, a nebo použití kanonické sekvence rámce z mnoha humánních protilátek. Druhým kritériem je použití aminokyseliny donora spíše než akceptoru, jestliže humánní akceptorový zbytek je neobvyklý a aminokyselinový zbytek donora je typický pro humánní sekvence ve spe20 cifickém zbytku rámcového úseku. Třetím kritériem je použití aminokyselinového zbytku rámcového úseku donora spíše než akceptora v polohách bezprostředně sousedících s úseky CDR.
Může být ale použit také zcela jiný přístup, jak byl popsán např. v Tempest, 1991, Biotechnology 9: 266-271. Podle tohoto postupu úseky V rámců pocházející z těžkého a lehkého řetězce
NEWM a REI, v daném pořadí, byly použity pro CDR-roubování, aniž by byly vnášeny radikálně myší zbytky. Výhodou při použití tohoto přistupuje to, že trojrozměrné struktury variabilních úseků NEWM a REI jsou známy z rentgenové krystalografie, takže specifické interakce mezi CDR úseky a zbytky úseku V rámce mohou být snadno modelovány.
VI. Další skupiny
Monoklonální protilátky podle vynálezu mohou dále zahrnovat další skupiny pro vykonávání požadovaných funkcí. Například protilátky mohou obsahovat toxinovou skupinu (např. tetanový toxoid nebo ricin) nebo radionuklid (např. 'in nebo 90Y) pro usmrcení buněk cílených proti35 látkami (viz např. U. S. patent 6 307 026). Protilátky mohou obsahovat skupinu umožňující detekci nebo snadnou izolaci (např. biotin, fluorescenční skupiny, radioaktivní skupiny, histidinový „přívěšek“ - tag, nebo další peptidové tágy). Protilátky mohou také obsahovat skupiny, které mohou prodloužit jejich sérový poločas, například polyethylenglykolovou (PEG) skupinu, a člena superrodiny imunoglobulinu nebo jeho fragment (např. část konstantního úseku těžkého řetězce humánního IgGl, například pantový úsek, CH2 a CH3 úseky).
VII. Krystalizovatelné kompozice a krystaly
Předkládaný vynález také poskytuje krystalizovatelnou kompozici obsahující komplex: (1) pot45 kan-humánní chimérické al-I domény (např. mutanta RAH) nebo její část (např. polypeptid zahrnující aminokyseliny 135 až 336 z potkan-humánní chimérické al-I domény) a (2) Fab fragment zhAQC2 nebo jeho část (např. polypeptid zahrnující aminokyseliny 3 až 213 lehkého řetězce a/nebo polypeptid zahrnující aminokyseliny 3 až 219 těžkého řetězce). Příklad takového komplexu je ukázán na obr. 20. RAH al-l doména může obsahovat např. aminokyselinové zbyt50 ky 145 až 336 (krystalové číslování) (sekv. id. č. 59, viz výše) al podjednotky laboratorního potkana. hAQC2 Fab fragmenty mohou obsahovat aminokyselinové zbytky 1 až 106 (např. 1 až 213) lehkého řetězce, který má sekv. id. č. 3, a aminokyselinové zbytky 1 až 118 (např. 1 až 219) těžkého řetězce, který má sekv. id. č. 4. Fragmenty hAQC2 Fab mohou být získány papainovým štěpením celé protilátky nebo mohou být připraveny metodami rekombinantní DNA. Fab
13CZ 303450 B6 fragmenty obsahují alespoň antigen-vazebnou část variabilní domény lehkého řetězce a/nebo těžkého řetězce z hAQC2.
145 TQLDIV
151 XVLDGSNSIY PWESVXAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY ‘ 191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI
231 OTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKA LGERXF (Sekv. id. č. 59)
Některé krystalizovatelné kompozice a krystaly podle vynálezu mohou obsahovat molekulu nebo molekulární komplex, který je homologní k al-I doméně a/nebo hAQC2 Fab fragmentu podle aminokyselinové sekvence nebo trojrozměrné struktury. Příklady homologů zahrnují, avšak bez omezení: cx I -I doménu a/nebo hAQC2 Fab fragment s mutacemi, jako jsou například konzervativní substituce, adice, delece nebo jejich kombinace. Termín „konzervativní substituce“ označuje nahrazení zbytku jiným zbytkem, který je fyzicky podobný velikostí, tvarem, hydrofobicitou, nábojem a/nebo chemickými vlastnostmi odpovídajícímu referenčnímu zbytku. Způsoby identifikace „dpovídající“ aminokyseliny jsou v oboru známy a jsou založeny na sekvenčním porovnání, strukturním porovnání, funkční poloze nebo jejich kombinaci ve srovnání s krystalovou strukturou řešenou podle předkládaného vynálezu. Například odpovídající aminokyseliny mohou být identifikovány tím, že se superponují atomy aminokyselin hlavního řetězce komplexu al-I doména/hAQC2 a homologů al-I domény a/nebo hAQC2 s použitím odborníkovi dobře známých programů (softwarových aplikací), jako je například QUANTA (Molecular Simulation, lne., San Diego, CA, ©1998, 2000). Odpovídající aminokyseliny mohou také být identifikovány s použitím počítačových programů pro porovnávání sekvencí, jako je například program „Bestfit“ dostupný od Genetcs Computer Group, který používá algoritmus lokální homologie popsaný v publikaci Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981.
Krystal izovatel né kompozice podle vynálezu mohou dále obsahovat jednu nebo více součásti, které podporují krystalizaci a/nebo jsou kompatibilní s podmínkou krystal izace. K takovým složkám patří, ale bez omezení, pufr, soli, precipitační činidla a další činidla. Jedna složka může být 30 % (hmotnost/objem) polyethylenglykolu 1500 (PEG1500).
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby přípravy krystalů z krystalizovatelné kompozice obsahující komplex al-I domény a antigen-vazebné části hAQC2 (např. Fab, Fab' nebo jiného fragmentu, viz výše). Různé techniky krystalizace mohou být použity ve vynálezu, včetně difúze páry, dialýzy, mikrodávkové a dávkové difúze, a difúze kapalína-kapalina.
Metody difúze páry zahrnují, ale bez omezení, metody přisedlé kapky („sitting-drop“), zavěšené kapky („hanging-drop“) a sendvičové kapky („sandwich-drop“). Metody difúze páry mohou využívat postupy ke kontrole rychlosti krystalizace, jako je například přidání olejů na kapky nebo roztoku v zásobníku. Krystalizační metody mohou zahrnovat míchání roztoku v zásobníku obsahujícího srážedlo svodným roztokem komplexu al—1 domény a antigen-vazebné části hAQC2 za vzniku krystal izovatelné kompozice. Směs nebo krystalizovatelná kompozice mohou pak být krystalizovány s použitím různých výše zmíněných postupů. Krystalizovatelná kompozice podle tohoto vynálezu může být vodný roztok komplexu al-I domény a antigen-vazebné části hAQC2, který obsahuje komplex v koncentraci přibližně 1 až 50 mg na 1 ml, jako například koncentraci přibližně 5 až 15 mg na 1 ml (např. 11 mg na 1 ml).
- 14CZ 303450 B6
VIII. Krystalové struktury a strukturní koordináty
Předkládaný vynález dále poskytuje trojrozměrnou strukturu krystalu včetně komplexu mutanty RAH a hAQC2 Fab fragmentu při rozlišení 2,8 Á (viz příklad 24). Trojrozměrné struktury dalších příbuzných krystalů mohou také být určeny s použitím způsobů popsaných v tomto textu a postupů známých v oboru. Trojrozměrná struktura tohoto komplexu je definována souborem strukturních koordinát (souřadnic) uvedených na obr. 19. Tyto strukturní koordináty jsou kartézské koordináty atomů odvozené z matematických rovnic týkajících se vzorců získaných d i frakcí monochromatického paprsku rentgenového záření na atomech nebo rozptylových cenio třech krystalického komplexu al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu. Difrakční (rozptylová) data jsou nejdříve použita pro výpočet mapy elektronové hustoty (denzity) opakující se krystalové jednotky. Mapa elektronové hustoty je pak použita ke stanovení polohy jednotlivých atomů komplexu.
Předkládaný vynález poskytuje molekulu nebo molekulární komplex definovaný všemi nebo některými strukturními koordinátami všech aminokyselin u vedených na obr. 19, a také homologní molekulu nebo molekulární komplex, kde homolog má odmocninu průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce těchto aminokyselin mezi 0,00 Á a 0,65 Á, například mezí 0,00 Á a 0,60 A (např. mezi 0,00 Á a 0,50 A).
Termín „odmocnina průměrného čtverce odchylky“ nebo „r. m. s. odchylky“ znamená druhou odmocninu aritmetického průměru čtverců odchylek od průměru. To je způsob, jak vyjádřit odchylku nebo variaci od trendu nebo předmětu. Pro účely tohoto vynálezu, termíny „odmocnina průměrného čtverce odchylky“ nebo „r. m. s. poziční odchylky“ definují odchylku hlavního řetězce proteinu od relevantní části hlavního řetězce polypeptidu, jak byl definován strukturními koordinátami popsanými v tomto textu.
Molekula nebo molekulární komplex podle tohoto vynálezu mohou také zahrnovat vazebné místo definované strukturními koordinátami alespoň sedmi aminokyselin z hAQC2 Fab fragmentu vybraných ze skupiny obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 aTrp95 a zbytky těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování) podle obr. 19, nebo homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má odmocninu průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce jedné nebo více z těchto aminokyselin mezi 0,00 A a 1,10 Á, například mezi 0,00 A a 1,00 Á (např. mezi 0,00 A a 0,50 Á). Termín „vazebné místo“, jak se v tomto textu používá, se týká úseku molekuly nebo molekulárního komplexu, který se, v důsledku svého tvaru a náboje, příznivě asociuje s další chemickou entitou. Termín „místo“ zahrnuje, ale není tím omezen, prohloubeninu, rýhu, kanál nebo kapsu. Například vazebná místa na al doméně mohou zahrnovat vazebné místo pro kolagen (Emsley etal„ 1997, viz výše), vazebné místo pro antigen a alosterické (nebo MIDAS) vazebné místo (Huth et al., 2000, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 97: 5231-5236). Termín „chemická entita“ zahrnuje, ale není tím omezen, jakoukoliv molekulu, molekulární komplex, sloučeninu nebo její fragment. Termín „asociovat se“ se týká asociace nebo vazby v podmínkách blízkosti chemické entity nebo její části a vazebné kapsy nebo vazebného místa proteinu. Asociace může být nekovalentní - kde vzájemné postavení vedle sebe je energicky zvýhodněno vodíkovými vazbami nebo van der Waalsovými nebo elektrostatickými interakcemi - nebo může být kovalentní.
Molekula nebo molekulární komplex podle vynálezu může také obsahovat vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků al-I domény vybraných ze skupiny obsahující Asp 154, Serl56, Asn 157, Ser 158, TyrlóO, Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln232, Thr224, Asp257, H is261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homolog molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin al-I domény mezi 0,00 a 0,92 Á.
- 15CZ 303450 B6
Molekula nebo monoklonální komplex podle vynálezu může také obsahovat vazebné místo definované strukturními koordinátami aminokyselinových zbytků al-I domény vybraných ze skupiny obsahující Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homolog molekuly nebo komplexu, který obsahuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů hlavního řetězce aminokyselin al-I domény mezi 0,00 a 0,30 A.
Odborníci rozumějí, že soubor strukturních koordinát pro polypeptid je relativní soubor bodů, které definují tvar ve třech rozměrech (v prostoru). Takže je možné, že zcela odlišný soubor io koordinát, který definuje podobný nebo totožný tvar, může být vytvořen pomocí matematických úprav strukturních koordinát na obr. 19. Například strukturní koordináty by mohly být upravovány krystalografickými permutacemi strukturních koordinát, frakcionalizací strukturních koordinát, přičtením nebo odečtením celého čísla od souboru strukturních koordinát, inverzí strukturních koordinát nebo jakoukoliv jejich kombinací. Navíc malé změny v jednotlivých koordiná15 těch mají jen malý účinek na celkový tvar.
Jinak modifikace v krystalové struktuře způsobená mutací, jako je například adice, substituce, a/nebo delece aminokyseliny, nebo další změny ve kterékoliv složce polypeptidů (např. hAQC2 Fab fragmentu nebo al-I doméně), která tvoří krystal, může také odpovídat za změny struktur20 nich koordinát. Jestliže takové variace jsou v přijatelném rozsahu střední chyby ve srovnání s původními koordinátami, výsledný trojrozměrný tvar je považován za shodný s nemodifikovaným krystalem.
Je proto nutné určit, zda entita je dostatečně podobná celé nebo části struktuiy popsané v tomto textu, pokud jde o to, zda může být považována za stejnou.
Takové analýzy mohou provádět s použitím moderních softwarových aplikací, jako je například program QUANTA (Accelrys, lne. and Molecular Simulations, lne., San Diego, CA © 1998, 2000) a program O (Jones et al., 1991, ActaGast. A47; 110-119), víz příslušné uživatelské pří30 ručky. Aplikace Molecular Similarity z programu QUANTA a aplikace LSQ z programu O umožňují srovnání mezi různými strukturami, různými konformacemi stejné struktury a různými částmi stejné struktury. Obecný postup použitý v obou aplikacích je vložení struktur, které mají být srovnávány, definování ekvivalentních atomových poloh v těchto strukturách, provedení přiřazovacích operací a analyzování výsledků.
Po vložení každé struktury do aplikace její přiděleno jméno a struktura je identifikována jako fixovaná struktura nebo pohyblivá struktura. Atomová ekvivalence je obvykle definována ekvivalentními atomy jako například atomy proteinového řetězce (N, Ca, CaO) pro všechny konzervativní zbytky mezi dvěma strukturami, kteréjsou srovnávány. Pohyblivá struktura je translato40 vána a otáčena, aby se dosáhlo optimální shody nebo shody s nej menším čtvercem odchylek s fixovanou strukturou. Odmocnina průměrného čtverce odchylek pro všechny specifikované páry ekvivalentních atomů je uváděna oběma programy v ángstrómech (A).
Pro účel tohoto vynálezu, kterýkoliv molekulární komplex, který má odmocninu průměrného čtverce odchylek atomů hlavního řetězce konzervativních zbytků (N, Ca, C, O) mezi 0,00 A a 1,50 A, jako například mezi 0,00 a 1,00 A (např. mezi 0,00 a 0,50 A), když je superponován na relevantní atomy hlavního řetězce popsané strukturními koordinátami uvedenými na obr. 19, je považován za totožný.
IX. Určování dalších krystalových struktur
Strukturní koordináty uvedené na obr. 19 mohou také být použity jako pomůcka pro získání strukturních informací o jiných krystalizovaných molekulárních entitách, například jiné hAQC2 obsahující substituce aminokyselin v jednom z úseků CDR. Toho může být dosaženo kteroukoliv
- 16CZ 303450 B6 ze známých technik, zahrnujících molekulární substituci, což je obzvláště užitečný způsob pro určování struktury mutant a homo logů al-I domény/Fab.
Strukturní koordináty uvedené na obr. 19 mohou také být použity pro určení alespoň části troj5 rozměrné struktury molekulárních entit, které obsahují alespoň některé strukturní rysy podobné alespoň části al-I domény nebo hAQC2 Fab. Proto další provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob využití molekulární substituce pro získání strukturní informace o krystalizované molekule nebo molekulárním komplexu s neznámou strukturou zahrnující kroky; (a) vytvoření rentgenového dífrakční ho vzorce pro krystalizovanou molekulu nebo molekulární komplex a (b) aplikace ío alespoň části strukturních koordinát uvedených na obr. 19 na rentgenový dífrakční vzorec, aby se vytvořila trojrozměrná mapa elektronové denzity molekuly nebo molekulárního komplexu s neznámou strukturou.
Aplikací molekulární substituce mohou být všechny nebo část strukturních koordinát uvedených na obr. 19 použity k rychlejšímu a účinnějšímu určení neznámé struktury krystalizované molekuly, než kdyby se takové informace získávaly znovu od samého počátku (ab initio). Molekulární substituce poskytuje přesné určení fází pro neznámou strukturu. Fáze jsou faktory v rovnicích určených pro řešení krystalových struktur, který nemohou být určeny přímo. Získání přesných hodnot pro fáze, metodami jinými než je molekulární substituce, může být často časově velmi náročný postup, který zahrnuje iterační cykly aproximací a dalšího zpřesňování, a výrazně ztěžuje vyřešení krystalového struktury. Nicméně když je vyřešena krystalová struktura proteinu obsahujícího alespoň homologní část, fáze ze známé struktury mohou často poskytnout uspokojivý odhad fází pro neznámou strukturu.
Takže molekulární substituce zahrnuje vytvoření předběžného modelu molekuly nebo molekulárního komplexu, jehož strukturní koordináty jsou neznámé, tím, že se orientuje a polohuje relevantní část komplexu podle obr. 19 v rámci jednotkové buňky krystalu neznámé molekuly nebo molekulárního komplexu tak, aby nejlépe odpovídala pozorovanému vzorci rentgenové difrakce krystalu molekuly nebo molekulárního komplexu, jehož struktura je neznámá. Fáze mohou pak být vypočteny z tohoto modelu a v kombinaci s amplitudami pozorovaného vzorce rentgenové difrakce poskytnou mapu elektronové denzity struktury, jejíž koordináty jsou neznámé. Ta potom může být dále podrobena jakékoliv známé metodě výstavby modelu a upřesňování struktury, aby byla získána přesná struktura neznámé kiystalizované molekuly nebo molekulárního komplexu (Lattman, 1985, Meth. EnzymoL 115: 55-77, Rossmann, ed., „The Molecular
Replacement Method“, Int. Sci. Rev. Ser., No. 13, Gordon & Breach, New York, 1972). Struktura kteréhokoliv části kterékoliv krystalizované molekuly nebo molekulárního komplexu, které jsou dostatečně homologní s kteroukoliv částí al-I domény a/nebo hAQC2 Fab fragmentu (podle obr. 19), může být vyřešena tímto způsobem.
X. Počítač a paměťové médium
Aby bylo možné použít strukturní koordináty podle tohoto vynálezu, např. koordináty uvedené na obr. 19, je obvykle nutné konvertovat tyto koordináty na trojrozměrnou (tj. prostorovou) reprezentaci nebo tvar. Komerčně dostupné grafické programy (software) včetně, ale bez omezení, programu O (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47: 110-119) a INSIGHTII (©Accelrys, lne. a Molecular Simulation, lne., San Diego, CA), jsou schopné ze souboru strukturních koordinát vytvořit trojrozměrnou reprezentaci molekuly nebo molekulárního komplexu nebo jejich částí.
Podle předkládaného vynálezu strukturní koordináty molekulárních entit podle vynálezu jsou ulo50 ženy na paměťovém médiu, které je čitelné strojově (např. počítačem). S použitím počítače a vhodného programového vybavení (softwaru) mohou být taková data použita pro celou řadu účelů, jako například objevování léčiv a rentgenokrystalografíckou analýzu krystalů dalších proteinů.
V souladu s tím, strojově čitelné médium pro uchování dat (paměťové médium) může zahrnovat datový materiál kódovaný do strojově čitelných dat zahrnující alespoň část strukturních koordinát
- 17CZ 303450 B6 uvedených na obr. 19. Počítač může dále zahrnovat instrukce pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekulárních komplexů al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu zpracováním strojově čitelných dat podle tohoto vynálezu. Počítač podle vynálezu může také zahrnovat displej, grafické rozhraní pro zobrazení nebo vstupní zařízení pro pohybování a manipulace s trojrozměrnou grafickou reprezentací strukturních koordinát.
Předkládaný vynález také poskytuje počítač pro určení alespoň části strukturních koordinát odpovídající datům rentgenové difrakce získaným pro molekulární komplex αϊβΐ integrinu a Fab fragmentu z hAQC2 protilátky, kde počítač zahrnuje strojově čitelné médium obsahující datový materiál kódovaný se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují alespoň část strukturních koordinát molekulárního komplexu z al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu podle obr. 19 nebo data rentgenové difrakce získaná z krystalického molekulárního komplexu. Počítač dále zahrnuje instrukce pro provádění Fourierovy transformace strojově čitelných koordináto vých dat a instrukce pro zpracování těchto strojově čitelných difrakčních dat do strukturních koordinát. Tento počítač může dále zahrnovat: pracovní paměť pro ukládání instrukcí pro zpracování strojově čitelných dat, centrální procesorovou jednotku spojenou s pracovní paměti a se strojově čitelnými daty, a volitelně grafické rozhraní nebo displej spojený s centrální procesorovou jednotkou pro zobrazení trojrozměrné grafické reprezentace strukturních koordinát molekuly nebo molekulárního komplexu.
Vynález dále poskytuje počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace: molekuly nebo molekulárního komplexu definovaného tím, že alespoň část nebo všechny strukturní koordináty všech aminokyselin al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu, uvedených na obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog má odmocninu čtverce průměrné odchylky od atomů aminokyselin hlavního řetězce mezi 0,00 A a 1,50 A, například mezi 0,00 a 1,00 A (např. mezi 0,00 a 0,50 A). Dále v tomto vynálezu počítač zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro uložení dat obsahující uložený datový materiál kódovaný se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují alespoň část nebo všechny strukturní koordináty všech aminokyselin al-I domény a Fab hAQC2 fragmentu, jak jsou uvedeny na obr. 19.
Počítač podle vynálezu může vytvořit trojrozměrnou reprezentaci molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebných míst. Vazebné místo může být definováno strukturními koordinátami alespoň sedmi aminokyselin z hAQC2 Fab fragmentu vybraných ze skupiny obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytky těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (kiystalové číslování) podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek atomů hlavního řetězce alespoň jedné aminokyseliny zhAQC2 Fab fragmentu mezi 0,00 A a 1,10 A, jako například mezi 0,00 Á a 1,00 A (např. mezi 0,00 A a 0,50 A). Dále počítač podle tohoto vynálezu zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro ukládaní dat včetně uloženého datového materiálu kódovaného se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují strukturní koordináty alespoň sedmi aminokyselin z hAQC2 Fab fragmentu vybraných ze skupiny obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 a Trp95 a zbytky těžkého řetězce Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO a AsplOl (krystalové číslování) podle obr. 19.
Vynález také poskytuje počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Aspl54, Serl56, Asnl57, Serl58, TyrlóO, Glul92, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylek atomů aminokyselin domény I mezi 0,00 A a 0,92 A. Dále v tomto vynálezu počítač zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro ukládání dat včetně uloženého datového materiálu kódovaného se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují strukturní koordináty aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Asp 154, Ser 156, Asn 157,
- 18CZ 303450 B6
Serl58, TyrlóO, Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalové číslováni) podle obr. 19.
Tento vynález také poskytuje počítač pro vytvoření trojrozměrné reprezentace molekuly nebo molekulárního komplexu včetně vazebného místa definovaného strukturními koordinátami aminokyselin domény 1 vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování), podle obr. 19, nebo homologu molekuly nebo molekulárního komplexu, kde homolog zahrnuje vazebné místo, které má hodnotu odmocniny průměrného čtverce odchylky od atomů aminokyselin hlavního řetězce domény mezi 0,00 Á a 0,30 Á. Dále ío v tomto vynálezu počítač zahrnuje: strojově čitelné paměťové médium pro ukládání dat včetně uloženého datového materiálu kódovaného se strojově čitelnými daty, kde data zahrnují strukturní koordináty aminokyselin domény I vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky Glu 192,
Gln218, Arg219, Gly220 a G ly221 (krystalové číslování), podle obr. 19.
Obr. 21 demonstruje jedno takové provedení. Systém 10 zahrnuje počítač 11 včetně centrální procesorové jednotky („CPU“) 20, pracovní paměť 22, která může být např. RAM (paměť typu „random-access“) nebo „feritová“ paměť, paměť 24 pro hromadné ukládání (jako například jedna nebo více jednotek - driverů - pro disk nebo pásku nebo CD-ROM nebo DVD-ROM), jeden nebo více obrazovkových (“CRT“) terminálů 26, jednu nebo více klávesnic 28, jedno nebo více vstupních vedení 30 a jedno nebo více výstupních vedení 40, každé z nich je propojeno obvyklou oboustrannou systémovou sběrnicí 50.
Vstupní hardware 36, spojený s počítačem JU vstupním vedením 30, může být realizován celou řadou cest. Strojově čitelná data podle tohoto vynálezu mohou být vkládána prostřednictvím modemu nebo modemů 32 připojených telefonní linkou nebo zvláštní linkou 34 pro přenos dat. Alternativně nebo i navíc, vstupní hardware 36 může zahrnovat CD-ROM nebo DVD-ROM jednotky nebo páskové nebo diskové jednotky 24. Ve spojení s displejovým terminálem 26 může být také klávesnice 28 použita jako vstupní zařízení.
Výstupní hardware 46, spojený s počítačem 11 výstupním vedením 40, může být podobně realizován obvyklými zařízeními. Například výstupní hardware 46 může zahrnovat obrazovkový CRT terminál 26 pro zobrazení grafické reprezentace vazebného místa podle tohoto vynálezu s použitím programu jako je například program QUANTA, jak bylo popsáno výše v tomto textu. Výstupní hardware by mohl také zahrnovat tiskárnu 42, takž by bylo možné vytvářet výstupní výtisky, nebo diskovou jednotku 24 pro uložení celého systémového výstupu pro pozdější použití.
Za provozu CPU 20 koordinuje použití různých vstupních a výstupních zařízení 36, 46, koordinuje zpřístupnění datového materiálu z hromadné paměti 24 a umožňuje vstup a výstup z pra40 covní paměti 22, a také určuje sled jednotlivých kroků zpracování dat.
Ke zpracování strojově čitelných dat podle tohoto vynálezu může být použita celá řada programů. Tyto programy jsou diskutovány ve vztahu k výpočetním metodám pro navrhování léčiv popsaným v tomto textu. Specifické odkazy na jednotlivé komponenty hardwarového systému 10 jsou zahrnuty tam, kde je to vhodné, v následujícím popisu média pro uchovávání dat.
Obr. 22 ukazuje průřez magnetickým paměťovým médiem 100, které může být kódováno strojově čitelnými daty, což může být provedeno systémem jako například systém W na obr. 21. Médium 100 může být obvyklá pružná disketa nebo pevný disk, mající vhodný substrát 101, a vhodnou obalovou vrstvu 102, která může obvykle obsahovat, na jedné nebo na obou stranách, magnetické domény (neviditelné), jejichž polarita nebo orientace mohou být změněny magneticky.
Médium 100 může také mít otvor (není ukázán) pro vsunutí hřídele diskové jednotky nebo jiného zařízení pro uchovávání dat 24.
- 19CZ 303450 B6
Magnetické domény ve vrstvě 102 na médiu 100 jsou polarizované nebo orientované tak, aby kódovaly způsobem, který je obvyklý, strojově čitelná data jako například data popsaná v tomto textu, pro zpracování systémem jako je například systém 10 na obr. 21.
Obr. 23 ukazuje průřez opticky-čitelným paměťovým médiem 110 pro uchovávání dat, která také mohou být kódována se strojově čitelnými daty nebo souborem instrukcí, který mohou být prováděny systémem, jako je například systém 10 na obr. 21.
Médium 110 může být obvyklý kompaktní disk nebo DVD disk typu ROM („Read Onyl Memory“), tj. CD-ROM nebo DVD-ROM, nebo přepisovatelné médium, jako například magnetooptický disk, který je opticky čitelný a magneto-opticky zapisovatelný. Médium 100 má vhodný substrát 111, který může být obvyklý, a vhodný povrch 112, který může být obvyklý, a to obvykle na jedné straně substrátu 111.
V případě CD-ROM, jak je dobře známo, povrchová vrstva 112 je reflexivní a je pokryta velkým množstvím jamek 113, které kódují strojově čitelná data. Uspořádání jamek je čteno laserovým světlem odraženým z povrchu vrstvy 112. Ochranná vrstva 114, která je v podstatě průhledná, je nanesena na povrchu vrstvy 112.
V případě magneto-optického disku, jak je dobře známo, vrstva 112 nemá žádné jamky 113, ale obsahuje velké množství magnetických domén, jejichž polarita nebo orientace mohou být změněny magneticky, když se zahřejí nad určitou teplotu, např. laserem (není uvedeno). Orientace domén je čtena měřením polarizace laserového světla odráženého od vrstvy 112. Uspořádání domén kódujících data je jak bylo popsáno výše.
XI. Racionální návrh léčiv
Předkládaný vynález dovoluje použít postupy návrhu léčiv založené na strukturních údajích a postupy tzv. racionálního navrhování léčiv („Rational Drug Design“) pro návrh, selekci, syntézu nebo izolaci chemických entit, jako jsou například inhibitory al-I domény, a také ke zlepšení známých inhibitorů této domény.
Tyto inhibitory mohou být schopné blokovat vazebné místo VLA-I pro kolagen. Tento vynález také dovoluje použít postupy založené na strukturních údajích a postupy tzv. racionálního navrhování léčiv pro návrhy variant, které mohou působit jako inhibitory vazby kolagenu.
Trojrozměrné reprezentace podle tohoto vynálezu mohou být použity experimentálně nebo v počítačové formě pro navrhování potenciálních inhibitorů, dalších chemických entit, variant Fab fragmentů nebo kombinace chemický entit, které se mohou vázat na biologickou funkci hAQC2 Fab fragmentu nebo chimérické al-I domény podle vynálezu a ovlivňovat ji.
Odborník může použít jednu nebo několik metod screeningu chemických entit na jejich schopnost asociovat se s komplexem hAQC2 Fab fragmentu nebo chimérické al-I domény podle předkládaného vynálezu a konkrétně s vazebným místem buďto domény I nebo Fab fragmentu. Tento postup může začít vizuálním vyhledáváním, například vazebného místa buďto pro doménu I nebo Fab fragment, na počítačové obrazovce, na základě koordinát komplexu uvedených na obr. 19.
Vybrané chemické entity se pak umístí v celé řadě orientací nebo se usadí v individuálních vazebných místech buďto domény I nebo Fab fragmentu. Toto usazování může být uskutečněno s použitím softwaru jako je například program QUANTA, po kterém následuje minimalizace energií a molekulární dynamika s využitím standardních silových polí molekulární mechaniky, jako jsou například programy CHARMM (Molecular Símulations, lne., Burlington, MA ©1994) a AMBER (P. A. Kollman, University ofCalifomiaat San Francisco, (©1994).
-20CZ 303450 B6
Specializované počítačové programy mohou také pomoci v postupu selekce chemický entit. Kromě dalších k takovým programům patří následující:
1. GRID (Goodford, P. J., 1985, J. Med. Cliem. 28: 849-857). Program GRID lze získat z Oxford University, Oxford, UK
2. MCSS (Miranker, AAA. and M. Karplus, 1991, Proteins. Structure, Function and Genetics 11: 29-34). MCSS je dostupný od Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and AAA. J. Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 195-202). AUTODOCK je dostupný ze Scripps Research Institute, La Jol la, CA.
4. DOCK (Kuntz, I. D. et al, 1982, J. Mol. Biol. 161:269-288). DOCK lze získat z University of Califomia, San Francisco, CA.
Jakmile byly vhodné chemické entity vybrány, mohou být sestaveny do jednotlivých sloučenin. Sestavování může pokračovat vizuální prohlídkou vztahu entit k sobě navzájem ve trojrozměrném zobrazení na počítačové obrazovce ve vztahu ke strukturním koordinátem komplexu hAQC2 Fab fragmentu a chimérické al-I domény. Poté následuje ruční sestavení modelu s použitím softwaru jako je například program „Qunta“ nebo „Sybyl“.
Výše popsané postupy vyhodnocování chemických entit mohou být prováděny podobným způsobem pro sloučeniny nebo pro varianty, který mohou vázat al-I doménu.
K užitečným programům, které odborníkovi pomohou ve spojování individuálních chemických entit patří např. následující:
1. CAVET (Bartlett, P. AAA. et al, „CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules“. In „Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems“, Spacial Pub„ 1989, Royal Chem. Soc„ 78: 182-196). CAVEAT lze získat z University of Califomia, Berkeley, CA.
2. 3D databázové systémy jako je například MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Tato oblast je v přehledu zhodnocena v publikaci Martin, Y. C„ 1992,
J. Med. Chem. 35: 2145-2154.
3. HOOK (dostupný od firmy Molecular Simulations, Burlington, MA).
Místo toho, aby pokračovalo sestavování inhibitoru nebo vazebné sloučeniny postupným způsobem vždy po jedné chemické entitě, jak bylo popsáno výše, vazebné sloučeniny mohou být také navrženy najednou v celku nebo „de novo“ s použitím buďto prázdného vazebného místa (jako je například vazebné místo al-I domény nebo hAQC2 Fab fragmentu) nebo volitelně zahrnující nějakou část nebo části známé vazebné sloučeniny al-I domény nebo hAQC2 Fab fragmentu. K takovým postupům patří např. následující:
1. LUDI (Bohm, H.-J„ 1992, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 61-78). LUDI je dostupný od firmy Biosym Technologies, San Diego, CA.
2. LEGEND (Nishibata, Y. and AAA. Itai, 1991, Tetrahedron 47: 8985). LEGEND je dostupný od Molecular Simulations, Burlington, MA.
3. LeapFrog (dostupný od Tripos Associates, St. Louis, MO).
V předkládaném vynálezu mohou být užity i další techniky molekulárního modelování, viz např. Cohen, N. C. et al„ 1990, J Med. Chem. 33:883-894. Viz také Navia, M. A. a M. A. Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 202-210.
Jakmile je jednou entita navržena nebo vybrána výše popsanými metodami, účinnost, se kterou se taková entita může vázat k al-I doméně nebo hAQC2 Fab fragmentu, může být testována
-21 CZ 303450 B6 a optimalizována pomocí vyhodnocování výpočtů. Například sloučenina, která byla navržena nebo vybrána, aby fungovala jako vazebná sloučenina al-I domény, se může rozprostírat v objemu, který se nepřekrývá s objemem, který zabírá vazebné místo, když je vázáno k chimérické al-I doméně. Účinná vazebná sloučenina al-I domény může vykazovat relativně malý rozdíl v energii mezi svým vázaným a volným stavem (tj. malá deformační energie) vazby). Takže nej účinnější vazebná sloučenina al-I domény by měla být navržena tak, aby deformační energie vazby nebyla větší než přibližně 41,868 kj/mol (10 kcal/mol), např. ne větší než 29,308 kj/mol (7 kcal/mol). Vazebné sloučeniny al-I domény mohou interagovat s al-I doménou ve více než jedné konformacích, které jsou podobné v celkové energii vazby. V takových případech, deformační energie vazby je rozdílem mezi energií volné sloučeniny a průměrnou energií konformace, kterou lze pozorovat, když se sloučenina váže na protein.
Sloučenina navržená nebo vybraná jako vazebná sloučenina al-I domény může být dále počítačově optimalizována tak, aby ve svém vázaném stavu postrádala odpudivé elektrostatické interakce s cílovým proteinem. Takové nekomplementámí (např. elektrostatické) interakce zahrnují odpudivé interakce typu náboj-náboj, dipól—dipól a náboj-dipól. Specificky, suma všech elektrostatických interakcí mezi sloučeninou a proteinem, když je sloučenina vázána k al-I doméně, by měla být neutrálním nebo prospěšným příspěvkem k entalpii vazby.
Pro výpočty deformační energie sloučenin a elektrostatických interakcí je odborníkům k dispozici specifický počítačový software. Příklady programů určených pro taková použití zahrnují: Gaussian 92, revize C (M. J. Frisch, Gaussian, lne., Pittsburgh, PA, ©1992), AMBER, verze 4,0 (P. A. Kollman, University of Califomia at San Francisco, (©1994), QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, lne., Burlington, MA, ©1994), a Insight II/Discover (Biosysm Technologies lne., San Diego, CA (©1994). Tyto programy mohou být implementovány například na počítačích (workstation) Silicon Graphics. Další hardwarové systémy a softwarové balíky jsou odborníkům také známy.
Jednou z dalších technik použitelnou pro navrhování léčiv, kterou umožňuje předkládaný vynálezce iterační navrhování léčiv. Iterační navrhování léčiv je způsob, jak optimalizovat vztahy mezi proteinem a sloučeninou (včetně sloučeniny, kterou je protilátka) tím, že se určují a vyhodnocují trojrozměrné struktury postupných souborů komplexů protein/sloučenina. Při iteračním navrhování léčiv jsou získány série proteinových krystalů v komplexu s entitami, které se vážou na protein, a pak se řeší trojrozměrné struktury každého molekulárního komplexu. Takový přístup poskytuje možnost nahlédnout do spojení mezi proteiny a dalšími entitami každého komplexu. To je uskutečněno tak, že se selektují chemické entity s inhibiční aktivitou, získají se krystaly nových komplexů, vyřeší se trojrozměrné struktuiy komplexů a srovnají se spojení (asociace) mezi novými komplexy a dříve řešenými komplex. Spojení v komplexu mohou být optimalizována tím, že se pozoruje, jak změny ve složkách komplexu ovlivňují spojení.
V některých případech iterativní návrh léčiv je prováděn tak, že se vytvoří postupné komplexy a pak se krystalizuje každý nový komplex. Alternativně jsou přeformované proteinové krystaly navlhčeny v přítomnosti další chemické entity, čímž se vytvoří komplex, a tak se odstraní nutnost krystalizovat každý individuální komplex.
XII. Farmaceutické přípravky
Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu obsahují jeden nebo více VLA-1 antagonistů podle předkládaného vynálezu (např. anti-VLA-1 protilátky a VLA-1 antagonisty typu malé molekuly, které byly identifikovány výše popsaným způsobem racionálního návrhu léčiv) nebo jejich farmaceuticky přijatelné deriváty. Přípravky mohou dále obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič, jako například adjuvans, vehikulum, pufr a stabilizátor.
-22CZ 303450 B6
Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být podávány perorální, topič kou, intravenózní, subkutánní, intraperitoneální, intramuskulámí, intramedulámí, intraarteriální, intraartikulární, intrasynoviální, intrastemální, intrathekální, intrahepatickou, intraspinální nebo intrakraniální cestou podle požadavků, nebo přímo lokálně do místa zánětu nebo růstu nádoru. Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou také být podávány inhalací, např. pomocí nebulizéru, inhalátoru pro suchý prášek nebo inhalátoru s odměmými dávkami, a nebo implantací infúzní pumpy nebo biologicky kompatibilního implantátu s prodlouženým uvolňováním přímo do těla pacienta.
Farmaceutické přípravky mohou být také ve formě sterilního přípravku pro injekci, například sterilní vodné nebo olejové suspenze pro injekci. Takové suspenze mohou být formulovány postupy, které jsou v oboru známy, s použitím vhodných dispergačních, smáčecích a suspendujících činidel. Jestliže je přípravek podáván perorálně, pak farmaceutická kompozice může být podávána ve formě tobolky, tablety, vodné suspenze nebo roztoku. Pro topické aplikace farmaceutické kompozice mohou být formulovány jako vhodné masti.
Dávka a dávkovači režim VLA1 antagonistů podle tohoto vynálezu, které jsou účinné pro dosažení požadovaného účinku, závisí na celé řadě faktorů, jako například povaha onemocnění, které se léčí, velikost pacienta, požadovaný cíl léčby, použitý specifický farmaceutický přípravek a názor ošetřujícího lékaře.
Použitelné jsou např. dávkové hladiny účinné složky mezi přibližně 0,001 a přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti za den, například mezi přibližně 0,1 a přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti za den. Například protilátka podle vynálezu bude podávána v dávkách v rozmezí od přibližně 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti za den a přibližně 20 mg/kg tělesné hmotnosti za den, např. v rozmezí od mezi přibližně 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti za den a přibližně 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den, a to v intervalech jedenkrát denně až jedenkrát za čtrnáct dnů.
V jiném provedení je protilátka podávána v dávce přibližně 0,3 až 1 mg/kg tělesné hmotnosti, pokud je podávána intraperitonálně. V ještě dalším provedení je protilátka podávána v dávce přibližně 5 až 12,5 mg/kg tělesné hmotnosti, když je podávána intravenózně. V dalším provedení je proti látkový přípravek podáván v množství, které je dostatečně účinné na to, aby poskytlo plazmatickou hladinu protilátky alespoň 1 mg/ml.
XIII. Nemoci a modely na zvířatech
VLA-1 antagonisté podle předkládaného vynálezu jsou užitečné při léčení, včetně prevence, a 1 βΐ-zprostředkovaných nemocí jako jsou například nemoci již vyjmenované výše. Léčení užitím přípravků podle tohoto vynálezu je účinné jak u lidí tak i u zvířat, postižených uvedenými nemocemi. Zvířata, u kterých je vynález použitelný, zahrnují jak domácí tak hospodářská zvířata, chovaná buďto jako domácí mazlíčci nebo pro komerční účely. Příkladem jsou psi, kočky, dobytek, koně, ovce, prasata a kozy.
Účinnost VLA-1 antagonistů podle vynálezu může být testována na různých zvířecích modelech. Například k užitečným modelům psoriázy a artritidy patří modely popsané ve WOOO/72881. K modelům fibrózy ledvin patří modely popsané ve WO 99/61040, model Alportova syndromu ledvin je popsán v Cosgrove et al., 2000, Am. J. Path. 157: 1649-1659 a model lupus nephritis na SNF1 myších je popsán v Kal led et al., 2001, Lupus 10: 9-22. Model vaskulární fibrózy pro restenózu zahrnuje model poškození karotidy balónkem u laboratorního potkana popsaný v Smith et al., 1999, Circ. Res. 84: 1212-1222. Model fibrózy plic modelující idiopatickou plicní fibrózu a plicní fibrózu asociovanou se sklerodermou zahrnuje model bleomycinem indukované plicní fibrózy popsaný ve Wang et al., 1999, Thorax 54: 805-812. Modely cirhózy jater pro hepatitidu C nebo pro alkoholem indukovanou cirhózu zahrnuje model s ligací žlučovodu popsaný v George et al., 1999, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96: 12719-12724 a model CCLA-indukované fibrózy jater popsaný v Shi et al., 1997, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 10663-10668.
-23CZ 303450 Β6
Účinnost léčení užitím přípravků podle tohoto vynálezu může být hodnocena řadou dostupných diagnostických prostředků, včetně fyzikálního vyšetření, krevních testů, měření proteinurie, hladiny kreatininu a clearance kreatininu, funkčního plícního testu, rentgenu hrudníku, bronchoskopie, brocnhoalveolámí laváže, biopsie plic, hladin dusíku v plazmě, krvi a moči (BUN), pozorování a skórování jizvení nebo fibrotíckých lézí, depozitu extracelulámí matrix, například kolagenu, akt inu hladkého svalstva a fibronektinu, funkčních testů ledvin, a vyšetření pomocí ultrazvuku, zobrazování pomocí magnetické resonance (MRI) a vyšetření počítačovou tomografií (CT),
XIV, Diagnostické postupy
Protilátky podle tohoto vynálezu mohou být použity pro diagnostické stanovení nemocí asociovaných se změnami expresní hladiny αϊβΐ. Tkáňový vzorek od pacienta, jako například tkáňová biopsie, vzorek tělesné tekutiny nebo laváž (např, alveolární laváž), může být testován v testu založeném na zachycení antigenu, ELISA testu, imunohistochemickému testu apod. s použitím protilátky. Tkáňový vzorek od normálního zdravého jedince je použit jako kontrola.
Při provedení předkládaného vynálezu se využije, pokud není specificky uvedeno jinak, obvyklých technik buněčné biologie, tkáňových kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy a patří k jejich rutinním dovednostem. Takové techniky jsou popsány v odborné literatuře, například Molecular Clonig: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989, Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, Ed.), 1984, U. S. Patent 4,683,195, Mullis et al., Nucleic Acid Hybridization, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984, Transcription and Translation, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984, Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Ed.), 1987, Immobilized cells and Enzymes, IRL Press, 1986, A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984, Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al,, Eds.), Academie Press, New York, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos, Eds.), 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds.), 1987, Handbook of Experiment Immunology, VolumesI-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), 1986, Manipulating the Mouše Embryo, 1986.
Není-li uvedeno jinak, všechny technické a vědecké termíny použité v tomto textu mají stejný význam, jak mu obvykle rozumí odborník v příslušném oboru techniky, do kterého spadá tento vynález. Příklady metod a materiálů jsou popsány níže, ačkoliv v praxi nebo testech podle předkládaného vynálezu mohou také být použity metody a materiály podobné nebo ekvivalentní s těmi, které jsou popsány v tomto textu. Všechny publikace a další odkazy, které jsou uvedeny v tomto textu, jsou formou odkazu celé zahrnuty v předkládané přihlášce. V případě konfliktu, je rozhodný předkládaný popis, včetně uvedených definic. Materiály a metody, a také uvedené příklady, jsou pouze ilustrativní a nijak předkládaný vynález neomezují.
V tomto popisu a nárocích, termín „obsahovat“ nebojeho tvary („obsahuje“ nebo „obsahující“) je třeba chápat tak, že znamená zahrnutí daného celého čísla nebo skupiny celých čísel, ale přitom nevylučuje jakákoliv další celá čísla nebo skupiny celých čísel.
Následující příklady, které jsou poskytnuty s cílem podrobněji objasnit předkládaný vynález, nijak neomezují rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Chemická činidla lsothiokyanát fluorescein (FITC) byl koupen od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Krotonový olejový byl koupen od ICN Biochemicals (Aurora, OH). Plná ovčí krev v Alseverově
-24CZ 303450 B6 roztoku byl získán od East Acres Biologicals (Southbridge, MA). Kolagen typu I z ocasu laboratorního potkana a myší kolagen typu IV byly koupeny od Collaborative Research lne. (Bedford, MA) a Gibco (Gaithersburg, MD), v daném poradí.
Samice myší Balb/c ve stáří 6 až 8 týdnů byly koupeny od firmy Taconic (Germantown, NY) a myši α 1 pil—deficitní s Balb/c základem byly získány jak bylo popsáno dříve (3).
Příklad 1 io
Monoklonální protilátky
Funkci-blokující monoklonální protilátky (mAb) proti myším antigenům byly připraveny ve formátu bez amidu a s nízkým endotoxinem: Ha31/8 (křeěčí anti-CD49a, integrin al) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72: 367-375), Ha 1/29 (křečci anti-CD49b, integrin α2) (βΐ) (Mendrick et al., 1995. Lab. Invest. 72: 367-375, Mendrick, D. L., and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690702), křečci kontrolní mAb H4/8 skupiny II (křeččí anti-KLH) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702 ) a PS/2 (potkaní anti-CD49d, řetězec integrin α4β!) (Miyake et al. 1991 J. Exp. Med. 173: 599-607). Kromě toho, následující funkci-blokující monoklonální protilátky proti myším antigenům byly zakoupeny jako preparáty bez azidu/s nízkým obsahem endotoxinu od firmy Pharmingen (San Diego, CA): ΗΜβΙ-1 (křeččí anti-CD29, řetězec integrin βΐ) (Noto et al. 1995 Int. Immunol. 7:835-842), Ha2/5 (křeček anti-CD29. řetězec integrin βΐ) (Mendrick, D. L. and D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702), 3E2 (Křeččí anti-CD54, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150: 655-663), 5H10-27 (potkaní anti-CD49e, integrin a5) (Kinashi, T., and T. A, Springer. 1994. Blood Cells. 20: 25—44), GoH3 (potkaní anti-CD49f, integrin a6) (Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262: 10376-10383) a potkaní izotypová kontrolní monoklonální protilátky R35-95 (potkaní IgG2a) a R35-38 (potkaní IgG2b).
Testy adheze
Splenocyty z Balb/c myší byly pěstovány s 20 ng/ml IL-2 po dobu 7 až 12 dnů. Adheze buněk ke kolagenu typu I a typu IV byla taková, jak bylo již dříve popsáno (Gotwals et al. 1996J. Clin. Invest. 97: 2469-2477). Stručně, 96 jamkové destičky Maxisorp (Nunc, Napierville, IL) byly potaženy buďto 10 pg/ml kolagenu typu IV nebo 5 μg/ml kolagenu typu I a nespecifická místa byla blokována 1% BSA. IL-2 aktivované splenocyty byly značeny s 2 μΜ BCECF [pentaacetoxymethylester 2',7-bis(karboxyethyl)-5(6)karboxyfluoresceinu] (Molecular Probes, Eugene, OR) a inkubován s 10 μg/ml uvedené protilátky po dobu 15 minut. 105 buněk v 0,25% BSA v RPMI bylo pak přidáno k potaženým jamkám a inkubován o po dobu 60 minut v 37 °C. Nenavázané buňky byly odstraněny promytím třikrát s 0,25% BSA v RPMI. Adheze byla kvantifikována s použitím čtecího zařízení Cytoflor 2350 pro fluorescenci na destičkách (Millipore, Bedford, MA).
Poměr navázaných buněk k celkovému počtu vstupujících buněk byl měřen a procento adheze vzhledem k buňkám ošetřeným kontrolní protilátkou (normalizován ke 100 %) bylo vypočteno.
Hodnoty pozadí způsobené buněčnou adhezí na jamky potažené samotným BSA byly odečteny. Expresní a funkční blokáda al βΐ a al β2 aktivovaných leukocytů
Vzhledem ke klíčové úloze leukocytů při zánětu, původci se rozhodli testovat, zda anti-αΐ a anti-a2 monoklonální protilátky byly schopny blokovat adhezi leukocytů ke kolagenu. Aby se získaly leukocyty exprimující vysoké hladiny jak al tak i a2, myší T lymfocyty byly stimulovány in vitro s IL-2 po dobu 7 až 12 dnů. Tyto buňky exprimovaly vysoké hladiny jak al tak i a2 (Obr. 1 A) a vázaly se dobře k oběma povrchům potaženým kolagenem typu IV a typu I (Obr.
1B). Adheze ke kolagenu typu IV byla částečně inhibována samotnou anti-αΐ mAb a samotnou
-25 CZ 303450 B6 anti-a2 mAb inhibována nebyla. Na rozdíl od toho adheze ke kolagenu typu I byl kompletně inhibována anti-a2 mAb a anti-αΐ mAb samotná projevovala pouze parciální inhibici. Jak antiβΐ mAb tak kombinace anti-αΐ a anti-a2 mAb úplně inhibovaly adhezi ke kolagenu typu I a IV. Poté, co bylo ukázáno, že integriny αϊβΐ a α1β21 jsou exprimovány na aktivovaných T lymfocytech a že anti-αΐ a a2 monoklonální protilátky jsou schopny funkčně blokovat adhezi leukocytů ke kolagenu, byly tyto monoklonální protilátky použity kin vivo zkoumání role uvedených integrinu ve zvířecích modelech zánětlivých onemocnění.
Příklad 2
Inhibice DTH reakce anti-integrinovými monoklonálními protilátkami
SRBC-ind ukovaná hypersenzitivní reakce opožděného typu (DTH) byla adaptována z již dříve publikovaného protokolu (Hurtrel et al, 1992, Cell. Imunnol. 142: 252-263). Krátce, myši byly imunizovány na hřbetě s.c. injekcí dávkou 2 x 107 SRBC v 100 μϊ PBS v den 0, myši byly podruhé s. c. inj i kovány (byla provedena tzv. antigenní výzva, „challenge“) v den 5 dávkou 1 x 108 SRBC v 25 μΐ PBS do pravého tlapky. Tloušťka tlapky byla měřena inženýrským posuvným měřítkem (kaliperem) firmy Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ, 20 hodin po expozici antigenu a byla vypočtena míra otoku tlapky. Výsledky jsou uvedeny jako průměrná hodnota procentního nárůstu tloušťky tlapky ± střední chyba průměru (SEM) a vypočteny jako % zvýšení = [1- (tloušťka pravé tlapky 20 hodin po expozici antigenu/tloušťka neinjikované levé tlapky 20 hodin po expozici antigenu)] x 100. Pro zablokování efektorové fáze SRBC-índukované DTH reakce byly terapeutické nebo kontrolní mAb (100 pg), které byly připraveny postupy popsanými v příkladu 1, podávány i, p. 1 hodinu před antigenní výzvou v den 5.
SRBC-indukovaná DTH je dobře charakterizovaný in vivo model zánětu, konkrétně psoriázy, který byl použit k demonstraci významu celé řady cytokinů a adhezních molekul při zánětu (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 2259-2264, Terashita et a., 1996, J. Immunol. 156: 4638 4643). SRBC-senzibilizované myši dostaly anti-integrinové mAb 1 hodinu před antigenní výzvou provedenou na chodidle a zánět byl vyhodnocen po 20 hodinách jako míra zvětšení tloušťky tlapky. Kontrolní myši ošetřené PBS a kontrolní myši ošetřené křeěčím Ig ukázaly 60 až 70% zvýšení tloušťky tlapky 20 hodin po antigenní výzvě (obr. 2). Ve srovnání s kontrolou ošetřenou křeěčím Ig, antí-αΐ, nebo anti-a2 mAb vedly k 68% a 60% inhibici v tloušťce tlapky, v daném pořadí. Kombinace zanti-αΐ a anti-a2 mAb vedla k 71% inhibici, což ukázalo velmi malý aditivní účinek proti samotným anti-αΐ nebo anti-a2 mAb. Ošetření dalšími anti-integrin mAb bylo také účinné v inhibici efektorové reakce DTH. Míra inhibice pozorovaná pro různé mAb byla 49 % (anti- a4), 23 % (anti-a5) a 57 % (anti-a6). A nakonec mAb blokáda obecné integrinové podjednotky βΐ (mAb HMBI-1) vedla k inhibici efektorové DTH reakce o 67%.
Příklad 3
Inhibice CHS efektorové reakce anti-integrinovými monoklonálními protilátkami
Kontaktní hypersenzitivita (CHS) na FITC byl testován jak bylo popsáno dříve (Gaspari et al., 1991, Current Protocols in Immunology. J, E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober, editors. John Wtley & Sons, New York. Sekce 4. 2: 1). Krátce, myši byly senzibilizovány nanesením 100 μϊ 0,5% FITC ve směsi 1:1 aceton/dibutylftalát na oholený hřbet v den 0, po 10 dnech byla provedena antigenní výzva („challenge“) nanesením 5 μΐ 0,5% FITC na obě strany každého ucha. Reakce otoku ucha byla hodnocena tloušťkou ucha měřenou inženýrským posuvným měřítkem (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) v době antigenní výzvy (den 10) a o 24 hodin později a výsledky byly uvedeny jako průměrné procentní z výšení bazální hodnoty tloušťky ušního boltce ± SEM (střední chyba průměru).
-26 CZ 303450 B6
Zvýšení tloušťky ucha bylo vypočteno jako % zvýšení = [1-(tloušťka ucha 24 h po antigenní výzvě/tloušťka ucha v okamžiku antigenní výzvy)] x 100. Pro zablokování efektorové fáze CHS reakce, terapeutické nebo kontrolní mAb (250 pg) byly podávány i. p. 4 hodiny před antigenní výzvou v den 10. Myši, které byly antigenně-senzibilizovány pouze vehikulum a také do ucha bylo injikováno samotné vehikulum (vehikulová kontrola) nebo myši, u kterých byla provedena antigenní výzva ucha bez předchozí senzibilizace (kontrola iritujícím činidlem), sloužily jako negativní kontroly (nikdy překročil 2 % zvýšení tloušťky ucha).
Vzhledem k tomu, že CHS je co do mechanizmu zřetelně odlišný od DTH a podílejí se na něm také odlišné efektorové buňky, původci zkoumali, jaké účinky mají anti-integrinové mAb na efektorovou fází CHS reakce. Myši byly haptenově-senzibilizovány s použitím FITC naneseným na vyholený hřbet, poté následovala o 10 dnů později FITC výzva aplikací na uší, která vedla k zánětlivé reakci následující den. FITC-senzibilizované myši vykazovaly 60 až 70% zvýšení tloušťky (ucha) 24 hodin po antigenní výzvě (obr. 3). V souladu s publikovanými výsledky (Scheyníus et al., J. Immunol. 150: 655—663), léčení podáváním anti-ICAM-1 mAb vedlo k 51% inhibici otoku ucha. Ve srovnání s kontrolní křeččí mAb, léčba myší podáváním anti-αΐ nebo anti-a2 mAb 4 hodiny před antigenní výzvou vedla k 37% a 57% inhibici otoku ucha, v daném pořadí (obr. 3). Kombinace zanti-αΐ a anti-a2 mAb vedlo k mírně vyšší inhibici otoku ucha (65%).
Léčení dalšími mAb proti βΐ integrinu odhalilo, že zatímco mAb anti-a4 a anti-a5 nevedly k žádné inhibici FITC-indukované CHS efektorové reakce ve srovnání s kontrolní mAb laboratorního potkana, léčení anti-a6 mAb vedlo k 86% inhibici efektorové reakce. A nakonec mAb blokáda společné βΐ integrinové podjednotky inhibovala CHS efektorovou reakci o 74 %. Podobné CHS výsledky byly získány s použitím různých kmenů myší (C57/BL6,129/Sv) a různých senzíbilizujících činidel (oxazolon) (data nejsou ukázána). Podobně jako výsledky pozorované u SRBC -indukovaného modelu DTH, histologické analýzy uší se zánětem odhalily, že jak vytváření edému tak infiltrace leukocytů byly inhibovány podáváním anti-αΐ a anti-a2 mAb.
V souladu se zjištěními, že al β 1 a α2β1 mohou být exprimovány na IL-2-aktivovaných splenocytech, analýza lymfatických uzlin z antigenem senzibilizovaných myši (FITC nebo oxazolon) ukázala, že αϊβΐ a α2β1 jsou exprimovány výlučně na CD44hl LFA-1ht aktivovaných CD4+ a CD8+ T lymfocytech (data nejsou ukázána). Léčení myší podáváním anti-αΐ a anti-a2 mAb nevedlo k odstranění těchto buněk, když množství aktivovaných T lymfocytů jak ve slezině tak lymfatických uzlinách zůstalo neovlivněno v reakci na senzibilizaci antigenem v CHS modelu. Kromě toho, efektorové buňky nebyly funkčně odstraněny, když dlouhodobé léčení antigenem senzibilizovaných myší anti-αί a antí-a2 mAb (den 10 až 16) neovlivnilo zánětlivé reakce myší, u kterých byla aplikována antigenní výzva v den 20 (data nejsou ukázána).
Příklad 4
CHS efektorové reakce jsou sníženy u αϊβΐ-deficitních myší
Aby byla vyloučena možnost, že inhibiční úloha αϊβΐ v efektorové reakci FITC-zprostředkované CHS byla zprostředkována monoklonální protilátkou, experimenty byly prováděny u myší divokého typu a myší defícíentních na αϊβΐ (obr. 4). Inhibice mAb efektorové fáze myší divokého typu byla shodná s předchozími výsledky, kdy 56% inhibice v tloušťce ucha byla pozorována santi-al, 56% santi-a2 a 62% s kombinací anti-αί a anti-a2. Efektorová fáze CHS byl významně redukován u neošetřených αΐβΐ-deficientních myší ve srovnání s neošetřenými myšmi divokého typu (30% vs. 71% zvýšení v tloušťce ucha, v daném poradí). Jak se dalo očekávat, míra otoku ucha u neošetřených αΐβΐ-deficientních myší byla ekvivalentní s mírou otoku ucha pozorovanou u myší divokého typu podrobených působení anti-αί mAb. A nakonec, mAb blo-27CZ 303450 B6
I káda α2β1 a al βΐ-deficientu ich myší vedla pouze k mírně zvýšené inhibici otoku ucha, což bylo v souhlasu s pozorováním u myší divokého typu podrobených působení kombinace anti—al a anti-a2 mAb.
Příklad 5
Aby byla dále vyloučena možnost, že inhibiční účinek anti-integr i nových mAb, pozorovaný jak u DTH, tak i CHS modelů zánětu, je způsoben obecným protizánětlivým účinkem zprostředkovaným anti-αΐ a anti-a2 mAb, byl zkoumán účinek mAb na dermatitidu vyvolanou dráždivým činidlem (iritantem).
Pro hodnocení dermatitidy vyvolané iritantem bylo myším naneseno 5 μΐ 0,8% krotonového oleje v acetonu na obou stranách každého ucha. Terapeutické nebo kontrolní protilátky byly podávány 4 hodiny před použitím iritantu. Otok ucha byl měřen o 24 hodin později, jak bylo popsáno výše, a byl srovnán s tloušťkou ucha před aplikací krotonového oleje. Výsledky jsou uváděny jako průměr procentního zvýšení bazální hodnoty tloušťky ucha ± SEM, jak bylo popsáno výše. Myši, u kteiých byl aplikován samotný aceton (kontrola vehikulum) sloužily jako negativní kontrola.
Za 24 hodin uši myší podrobené působení krotonového oleje vykazovaly významné zvýšení tloušťky ucha (48%) ve srovnání k myším dostávajícím samotné vehikulum (aceton). Toxické otoky ucha způsobené krotonovým olejem nebyly významně ovlivněny u myší předem ošetřených anti-αΐ nebo anti-a2 mAb ve srovnání s kontrolními zvířaty ošetřenými buďto PBS nebo kontrolní mAb (obr. 5). Histologické vyšetření uší ošetřených krotonovým olejem neodhalilo žádné rozdíly v počtu nebo typu infiltruj ících buněk nebo tvorbě edému u myší podrobených působení anti-αΐ nebo anti-a2 mAb ve srovnání s myšmi ošetřenými kontrolní mAb nebo PBS (data nejsou ukázána).
Příklad 6
Inhibice artritidy podáváním αϊβΐ aa^2
Jelikož αϊβΐ je dobře exprimován na infiltruj ících buňkách v synovi u pacientů s artritidou, původci se rozhodli zkoumat, zda anti-αΐ nebo anti-a2 mAb by působily jako inhibiční ve zrychleném modelu artritidy dříve popsaném (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148: 2103-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147).
Soupravy artrogen-CIA protilátek byly koupeny od Stratagene (La Jolla, CA) a artritida byla indukována s použitím zavedeného protokolu (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148: 2103—2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147). Krátce, artritida byla indukována podáváním ί. p. injekce koktejlu z 4 mAb anti-kolagen typu II (1 mg každé) v den 0, poté následovala i. p. injekce 50 μΐ LPS v den 3. V průběhu dalších 3 až 4 dnů se u myší vyvinuly otoky zápěstí, kotníků a prstů. Terapeutické nebo kontrolní mAb (250 μg) byly podávány i. p. 4 hodiny před injekcí a nt i-kolagenových mAb v den 0 a znovu 4 hodiny před podáním LPS v den 3 a pak podávání pokračovalo každý 3. Den po celou délku trvání experimentu. Počínaje dnem 3 myši byly vyhodnocovány na rozvoj artritidy. Závažnost artritidy v každé končetině byla zaznamenávána s použitím čtyřbodového systému: 0 = normální, 1 = mírné zčervenání, nepatrný otok kotníku nebo zápěstí, 2 - mírný otok kotníku nebo zápěstí, 3 = závažný otok včetně některých prstů, kotníku a tlapky, 4 = maximální zánět.
Závažná artritida se u Balb/c myší vyvinula za 72 hodin po LPS injekci a přetrvávala po více než týdny. Ani injekce anti-kolagenových mAb samotných ani LPS samotného neindukovala artritidu. Myši dostávající kontrolní mAb vykazovaly stejně závažnou artritidu jako byla pozorována
-28CZ 303450 B6 u myší, kterým byl podáván PBS (Obr. 6). Na rozdíl od toho, léčba anti-αΐ mAb samotnou vedla k výraznému potlačení (78%) artritidy, které trvalo po celou dobu experimentu. Léčba anti «2 mAb samotnou měla také příznivý účinek, vedla k 32% snížení artritického skóre ve srovnání s myšmi léčenými kontrolními mAb. Kombinace anti-αΐ a anti-a2 mAb vedla k podobné míře inhibice jaká byla pozorována pro anti-αΐ mAb samotnou.
Příklad 7
H i sto logická analýza účinku léčení anti-αΐ a anti-a2 mAb na zánětový buněčný infiltrát
Další histologické analýzy SRBC-ind ukované DTH reakce potvrdily schopnost anti-αΐ a antia2 mAb léčby modulovat vyvolanou zánětlivou reakci. Polštářky tlapky (dále zkráceně tlapky) bez aplikace antigenní výzvy u SRBC-senzibilizovaných myší skutečně nevykazovaly žádný zánětový buněčný infiltrát, ve srovnání s chodidly po SRBC-výzvě u stejných myší. Léčení SRBC-senzibilizovaných anti-αΐ a anti-a2 mAb buďto samotnými nebo v kombinaci vedlo k redukci počtu infiltrujících buněk zjištěných v tlapkách po SRBC-výzvě, ve srovnání s myšmi léčenými kontrolní mAb. Podrobnější vyšetření infiltruj ících buněk odhalilo, že většinu buněk představovaly neutrofily, s výskytem několika monocytů a lymfocytů, a potvrdilo tak, že léčba anti-αΐ a anti-a2 mAb vede k velkému snížení počtu těchto buněk.
Příklad 8
Imunohistochemická demonstrace buněk exprimujících αϊβί v zánětovém infiltrátu
Imunohistochemické vyšetření bylo provedeno podrobněji kvůli přesnějšímu určení povahy infiltruj ících buněk a ke zjištění toho, zda exprimují integriny vázající kolagen. Infiltruj ící buňky ze zanícených chodidel neošetřených myší byly vyšetřeny na exprese αϊβί integrinu a výskyt markérů buněčných linií. Exprese αϊβί integrinu byla zjištěna na mnoha infiltrujících leukocytech. Dvojí imunohistochemické značení bylo použito k rozpoznání povaha infiltrujících buněk a distribuci αϊβί exprese. S použitím markérů buněčných linií bylo zjištěno, že infiltrát je složen převážně z granulocytů/monocytů (Mac-1+), přičemž mnohé z těchto buněk jsou neutrofily (Grl+), spolu s menším počtem T lymfocytů (CD3+). Exprese αϊβί integrinu byla zjištěna u všechny třech podmnožin buněk, s al exprimovanou na podmnožině Mac-1+ granulocytů/monocytů, podmnožině Grl+ neutrofilů a na většině infiltrujících CD3+ T lymfocytů. Detailní imunohistochemická analýza odhalila, že ačkoli léčení anti-αΐ a anti~a2 mAb redukovalo množství infiltrujících buněk, nebyla pozorována žádná změna ve složení infiltrátu (data nejsou ukázána). Imunohistochemické vyšetření s barvením pomocí FITC anti-křeččí mAb potvrdilo schopnost anti-αί a anti-a2 mAb lokalizovat se do zanícené tlapky (data nejsou ukázána).
Příklad 9
Inhibice artritidy mAb proti αϊβί aa^2 u αϊβί—deficitních myší
Jelikož αϊβί je dobře exprimován na infiltrujících buňkách v synoviu pacientů s artritidou, původci se rozhodli zkoumat, zda anti-αί nebo anti-a2 mab by působily jako inhibiční ve zrychleném modelu artritidy dříve popsaném (Terato et al., 1992, J Immunol 148: 2103-2108, Terato etal., 1995, Autoimmunity 22: 137-147).
Tento model zahrnuje injekci koktejlu z 4 mAb anti-kolagen typu II (1 mg každé) v den 0 do myší, následovanou podáním LPS, což vede v průběhu dalších 3 až 7 dnů k vývoji artritidy.
-29CZ 303450 B6
Myši dostávaly mAb každý 3. den počínaje dnem 0 a byly vyhodnocovány na rozvoj artritidy také každý 3. den. Závažná artritida se vyvinula u všech myší za 72 hodin po LPS injekci a přetrvávala po více než 3 týdny. Ani injekce anti-kolagenových mAb samotných ani LPS samotného neindukovala artritidu. Myši dostávající kontrolní mAb vykazovaly stejně závažnou artritidu jako byla pozorována u myší, kterým byl podáván PBS (Obr. 7). Na rozdíl od toho, léčení samotnou anti-al mAb vedlo k výraznému potlačení (79% a vyšší) artritidy, které trvalo po celou dobu experimentu. Léčení samotnou anti-a2 mAb mělo také příznivý účinek, vedlo k 37% snížení artritického skóre ve srovnání s myšmi léčenými kontrolními mAb. Kombinace anti-αΐ a anti-a2 mAb vedla k podobné míře inhibice jaká byla pozorována pro anti—α 1 mAb samotnou.
Redukce artritického skóre podáváním anti-αΐ mAb byla pozorována u všech myší a porovnání vyznělo příznivě oproti jiným mAb pro léčení artritidy, jako je například fúzní protein rozpustného TNF receptoru a Ig (Moři et al., 1996, J. Immunol. 157: 31783182), anti-Mac-1 (Taylor et al., 1996, Immunology. 88: 315-321), anti-a4 (Seififge, 1996, J. Rheumatol. 23: 2086—2091) a anti-ICAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Cell Immunol. 142: 326-337). Ve shodě s údaji založenými na mAb ukazujícímu důležitou úlohu αϊβΐ při artritidě, neošetřené αΐ-deficientní myši vykazovaly významné snížení artritického skóre ve srovnání divokého typu myši.
Příklad 10
Účinky léčení anti-αΐ mAb na imunopatologii artritických kloubů
Klouby z divokého typu artritické myši (den 8) dostávajících buďto kontrolní mAb nebo anti-al mAb byly srovnávány vizuálně a histologicky s klouby z normálních neošetřených myší. Vizuálně klouby z kontrolní mAb-treated myši demonstrovaly zčervenání a otok celé nohy včetně prstů, zatímco myši léčené anti-al mAb vykazovaly malé, pokud vůbec, známky zánětu buďto v kloubech nebo prstech.
Histologické vyšetření ukázalo závažné změny na artritických kloubech po ošetřené kontrolní mAb, s rozsáhlou infiltrací subsynoviálních tkání buňkami zánětlivé reakce, adhezi buněk na povrch kloubu a značnou destrukcí chrupavky, což prokazuje ztráta proteoglykanů. V souladu s předchozími publikacemi (Terato et al., 1992, J. Immunol 148: 2103-2108, Terato et al., 1995, Autoimmunity 22: 137-147), byla většina infiltrujících buněk v tomto modelu neutrofily. Léčba anti-al mAb myší dramaticky redukovala množství zánětového infiltrátu a míru destrukce chrupavky.
Příklad 11
Rozvoj artritidy je zpožděn v přítomnosti lymfocytů a inhibice arthritidy anti—al mAb nastává při absenci lymfocytů
Pro určení toho, jaké buněčné typy by mohly být důležité v modelu kolagen mAb-indukované artritidy, původci porovnali schopnost myší B6-129 divokého typu a B6-129 RAG-l-deficientních myší rozvinout artritidu (obr. 8). Genetická delece genu RAG-1 (rekombinace aktivující gen 1) vedla k úplné ztrátě zralých T a B lymfocytů (Mombaerts et al., 1992, Cell 68:869-877). Jak u myší divokého typu tak u RAG-1-deficientních myší se vyvinula artritida, ačkoli kinetika indukce u RAG-1-deficientních myších byla významně pomalejší (obr. 8). Výsledky svědčí pro to, že zatímco lymfocyty jsou zapojeny do tohoto modelu artritidy, nejsou vyžadovány pro rozvoj a průběh onemocnění. Jiné publikace zkoumající účinek RAG-1 deficitních myší v dalších modelech artritidy také zjistily, že ztráta T a B lymfocytů zpožďuje nástup artritidy (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162:1018-1023).
-30CZ 303450 B6
Léčení jak myší divokého typu tak i RAG-1-deficientu ích myší anti-αΐ mAb kompletně inhiboválo artritidu (obr. 8). Výsledky demonstrují, že účinnost anti-αΐ mAb v tomto modelu není závislá na přítomnosti lymfocytů, a že účinnost anti-αΐ mAb v prevenci onemocnění může být prostřednictvím jejího působení na další al-exprimující buňky, jako například makrofágy a neutrofily, jak již bylo navrženo v předchozích experimentech (obr. 7).
Příklad 12 ío Reakce na dávku při inhibici artritidy podáváním anti-αΐ mAb
Vzhledem k překvapujícím účinkům podávání anti-αΐ mAb na prevenci artritidy původci vynálezu rozšířili tyto studie tak, aby byla zahrnuta i analýza reakce na dávku (viz obr. 9). Různé dávky mAb byly podávány i. p. každý 3. den počínaje v den 0. Ve shodě s dřívějšími daty,
250 μg dávka anti-αΐ mAb vedla k téměř kompletní prevenci artritidy. Nižší dávka 100 pg antial mAb byla částečně účinná v prevenci artritidy v tomto modelu, zatímco nižší dávky neměly žádný prokazatelný účinek na artritické skóre (obr. 9).
Příklad 13
Terapeutické podávání anti-αΐ mAb může snížit artritické skóre
Vzhledem k účinnosti anti-αΐ mAb pri prevenci artritidy se původci pokusili o léčení myší, které jsou na cestě k tomu, aby se u nich vyvinulo toto onemocnění. Artritida byla indukována u myší injekcí koktejlu mAb anti-kolagen typu II v den 0, následovanou podáním LPS v den 3. Myši byly pak podrobeny působení buďto anti-αΐ mAb nebo fúzního proteinu rozpustného TNF receptoru s Ig počínaje dnem 4. Progrese artritidy byla zcela zablokována u myší dostávajících anti-αΐ mAb počínaje dnem 4 ve srovnání k myšmi dostávajícími kontrolní křeččí mAb počínaje dnem 4 (obr. 10). Míra inhibice pozorovaná při terapeutickém podávání anti-αΐ mAb byla kompletní a byla stejná jako ta, která byla pozorována pri preventivním podávání anti-αΐ mAb (zahájeném v den 0) (obr. 10). Pro srovnání, léčba fúzním proteinem TNF receptoru s Ig ode dne 4 vedla pouze k 60 až 70% inhibici artritického skóre ve srovnání s kontrolním Ig fúzním proteinem (obr. 10). Kombinovaná léčba anti-αΐ mAb a fúzní TNF receptoru s Ig vedla k účinné kompletní inhibici artritického skóre, což není překvapující, vzhledem k plné účinnosti podávání samotné anti-αΐ mAb na potlačení artritidy. Lze tedy shrnout výsledky, které ukázaly, že terapeutické podávání anti-αΐ mAb je účinné v inhibici artritického skóre a lze ho příznivě srovnat s terapeutickým podáváním TNF antagonisty.
Příklad 14
Klonování a mutageneze al-I domény
Sekvence humánní a potkaní domény I integrinu αϊβΐ byly amplifikovány z kompletních cDNA (Kem, et al., 1994, J. Biol. Chefra. 269, 22811-22816, Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709-720) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) (užitím soupravy PCR CORE Kit, Boehringer Mannheim, GmbH, Německo), s využitím buďto specifických humánních primerů:
-31 CZ 303450 B6
5’’CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3’ [přímý] (sekv. id. č. 7) a
5’-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [reverzní] (sekv. id. Č. 8) nebo primerů specifických pro laboratorního potkana:
5'-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3’ [přímý] (sekv. id. č.: 9) a
5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [reverzní] (sekv. id. č: 10).
Výsledné PCR amplifikované produkty byly purifikovány, ligován do plazmidu pGEX4t-i (Pharmacia) a transformována do kompetentních buněk DH5a (Life Technologies). Ampicillinu odolné kolonie byly podrobeny screeningu na expresi fúzního proteinu „glutathion-S-transferáza 5 doména I“ velikosti přibližně 45 kDa. Sekvence z inzertů plazmidů DNA klonů, které byly selektovány pro další charakterizaci, byly potvrzeny sekvencováním DNA.
Chimérická humánní/potkaní doména al-I (RAH) byla připravena (souprava pro mutagenezi MORPH Mutagenesis kit, od firmy „5 prime-3 prime“), přičemž zbytky G92, R93, Q94 a L97 io laboratorního potkana (Obr. 11) nahradily odpovídající humánní zbytky V, Q, R a R, v uvedeném pořadí. Klony nesoucí RAH I doménu byly identifikovány podle toho, že ztratily diagnostické místo pro restrikění enzym Stu 1 a inzerty pak byly potvrzeny DNA sekvencováním. Aminokyselinová sekvence humánní al-I domény je ukázána na obr. 12.
Příklad 15
Příprava mAb specifických pro al-I doménu
Prokázalo se, že monoklonální protilátky jsou velmi užitečné jako sondy při zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí integrinových podjednotek. Například mAb byly využity velmi extenzivně při studiu úseků βΐ podjednotky spojené s aktivovanou konformací (Qu, A., and Leahy, D. J., 1996, Structure 4, 931-942). Takže pro identifikaci potenciální sondy vhodné pro konformační z měny al-I domény byl původci vytvořen panel mAb k humánní al-I doméně.
Příprava monoklonálních protilátek k al-I doméně („anti-al-I doména“ mAb)
Samice Robertsonových myší (Jackson Labs) byly imunizovány intraperitoneálně (i. p.) 25 μΐ purtfikovaného humánního αϊβΐ (Edwards et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 12635-12640,
Gotwals et ak, 1999, Biochemistry 38: 8280-8) emulgovaného s kompletním Freundovým adjuvans (LifeTechnologies), Byly třikrát stimulovány zesilovací dávkou („boost“) i. p. 25 pg αϊβΐ emulgovaného s neúplným Freundovým adjuvans (LifeTechnologies), Myš s nej vyšším titrem protilátky anti-al-I doména byla znovu stimulována i. p. 100 pg αϊβΐ tři dny před fúzí a pak intravenózně 50 pg αϊβΐ i.p. jeden den před fúzí. Buňky sleziny byly fúzovány buňkami myelomu FL653 v poměru 1:6a pak vysety v množství 100,000 a 33,000 na jamku do 96 jamkových destiček pro tkáňové kultivace.
Supematanty pak byly hodnoceny na vazbu αϊβΐ integrinu pomocí FACS sjednoduchým barvením. Před FACS analýzou byly supematanty inkubovány s netransfekovanými buňkami
K562, aby se vyloučil IgG, který se váže pouze βΐ podjednotce. Následně bylo 3 až 5 x 104 buněk K562 transfekovaných podjednotkou al integrinu (K562-al) suspendovaných ve FACS pufru (1% fetální telecí sérum (FCS) v PBS obsahující 0,5% NaN3) inkubováno se supematantem po dobu 45 minut ve 4 °C, promyty a inkubováno s anti-myším IgG konjugovaným s ťykoerytrinem. Po promytí dvakrát FACS pufrem byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem
Becton Dickinson.
-32CZ 303450 B6
Supematant ze vzniklých hybridomu byly podrobeny screeningu na vazbu k al-I doméně. Krátce, 50 μΐ fúze „humánní al-I doména - GST“ v PBS (30 pg/ml byl) byla užita k potažení jamek 96 jamkových destiček (Nunc) přes noc ve 4 °C. Destičky byly promyty PBS, blokovány 1% BSA v PBS a hybridomový supematant byl tnkubován s doménou I při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po důkladném pro mytí v PBS obsahujícím 0,03% Tween 20, byl přidán na další hodinu anti—myší IgG s navázanou alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch). Po konečném promytí bylo přidáno 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (pNPP) v 0,1 M glycinu, 1 mM ZnCl2 a 1 mM MgCl2 na dobu 30 minut při teplotě místnosti a destičky pak byly čteny při O. D. 405.
Vybrané supernatanty byly testovány na jejich schopnost inhibovat K562-al závislou adhezi ke kolagenu typu IV. Buňky K562-al byly značeny 2 mM pentaacetoxymethylesterem 2',7'(bis-2karboxyethyl-5 a 6)karboxyfluoresceinu (BCECF, Molecular Probes) v DM EM obsahujících 0,25% BSA ve 37 °C po dobu 30 minut.
Značené buňky byly promyty vazebným pufrem (10 mM Hepes, pH 7,4, 0,9% NaCI a 2% glukóza) a resuspendovány ve vazebném pufru s 5 mM MgCl2 na konečnou koncentraci x 106buněk/ml. 50 μΐ supematantu bylo inkubováno se stejným objemem 2 x 105 buněk K562-al v jamkách 96 jamkové destičky. Destička pak byla stočena a supernatanty byly odstraněny. Buňky byly resuspendovány ve vazebném pufru a přeneseny do jamek kolagenem potažené destičky a inkubovány po dobu 1 hodiny ve 37 °C. Po inkubaci byly odstraněny neadherující buňky promytím třikrát vazebným pufrem. Přisedlé buňky byly analyzovány na zařízení Cytofluor (Millipore).
Původci zpočátku identifikovali 19 hybridomu, jejichž supernatanty se vázaly k humánním leukémíckým buňkám K562 exprimujícím αϊβΐ integrin (K562-al) a k al-I doméně. Imunoglobuliny byly purifíkovány z každého z hybridomu a byly testovány na schopnost blokovat vazbu buď K562-al nebo al-I domény ke kolagenu IV. Mab spadaly do dvou kategorií: ty, které blokovaly, a ty, které neblokovaly αϊβΐ funkce. Například zatímco mAb produkované klony AEF3, BGC5, AQC2 a AJH10 vážou al-I doménu (viz obr. 13A, data nejsou ukázána pro BGC5), pouze mAb AJH10 a AQC2 inhibuj í adhezi ke kolagenu IV záviselo na al-I doméně (obr. 13B, obr. I6B) nebo K562-al (obr. 13C, obr. 16C).
Sekvencování úseků určujících komplementaritu (CDR)
Pro ustanovení klonálního původu tohoto panelu mAb, původci amplifikovali pomocí PCR a sekvencovali úseky CDR u 12 z 19 připravených protilátek (data nejsou ukázána).
pg mRNA, izolované 107 hybridomu (užitím soupravy pro izolaci mRNA FasTrackmRNA, Invitrogen), bylo reverzně transkribováno (užitím soupravy Ready-To-Go You Primer First Strand Kit, Pharmacia Biotech) s využitím 25 pM každého z následujících primerů: těžký řetězec VH1FOR-2 (Michishita et al,, 1993, Cell 72: 857-867), lehký řetězec, VK4FOR, který definuje čtyři samostatné olígonukleotidy (Kem et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 22811-22816). Pro každý hybridom, těžké a lehké řetězce byly amplifikovány ve čtyřech oddělených PCR reakcích s použitím různých kombinací následujících oligonukleotidů: 1 ) Těžký řetězec: VH1FR1K (Kamata et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 12531-12535), VH1BACK, VH1BACK (Baldwin et al., 1998, Structure 6, 923-935), VHfrla, VHfrlb, VHfrle, VHfrlf, V„frlg (Ignatius et al., 1990, J.Cell Biol. 111, 709-720), nebo VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., and Amaout, M. AAA., 1993, Cell 72, 857-867, a 2) Lehký řetězec: VK1BACK (Baldwin et al., 1998, Structure 6, 923-935), VK4FOR, VK2BACK olígonukleotidy (Kem et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22811-22816) nebo VKfrla, VKfrlc, VKfrle, VKfrlf, (Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709-720). Produkty byly amplifikovány (5 minut v 95 °C, 50 cyklů 1 minuta/94 °C, 2 minuty 55 °C, 2 minuty 72 °C, a nakonec cyklu 10 minut v 72 °C), purifíkovány z gelu (QIAQUICK,
-33CZ 303450 B6
Qiagen) a přímo sekvencovány s použitím různých výše uvedených oligonukleotidů užitím sekvenátoru ABI 377.
Sekvence z klonů produkujících funkci blokující mAb byly téměř totožné ve všech úsecích určujících komplementaritu (CDRS) a vložené úseky rámcové sekvence naznačují, že hybridomy jsou klonálně příbuzné.
Příklad 16
Imunopřenos a FACS Analýza
Sekvence variabilních úseků neblokující protilátky byly významně odlišné od klonálně příbuzné rodiny sekvencí zjištěných pro blokující protilátky. Jelikož se zdá, že blokující protilátky pocházejí z jediného klonu, původci vybrali dvě protilátky (AJH10 a AQC2) po další charakterizaci. Imunopřenos („immunoblotting“)
Vrstva buněk hladkého svalstva odebraná z ovčí aorty a K562-al buňky byly extrahovány užitím 1% Triton X-100 v 50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM feny 1 methyl sul fonyl fluorid (PMSF), 20 pg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 10 mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA). Vzorky byly podrobeny SDS-PAGE na 4 až 200 gradientu a přeneseny elektroforeticky (blotovány) na nitrocelulózovou membránu Bloty byly blokovány 5% sušeným mlékem v TBS, promyty TBS obsahujícím 0,03% Tween-20 a inkubovány s protilátkami v blokačním pufru obsahujícím 0,05% NaN3 po dobu 2 hodin. Bloty byly pak promyty jako předtím, inkubovány s anti-myším IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou po dobu jedné hodiny, znovu promyty a pak podrobeny působení ECL činidla (Amersham). Bloty pak byly exponovány na film (Kodak) po dobu 30 až 60 sekund a vyvolány.
Imunoblot a FACS analýza (víz obr. 14) ukázaly, že AJH10 reaguje s humánním, králičím a ovčím αϊβΐ integrinem, ale nikoliv s potkaním αϊβΐ integrinem, což vede k názoru, že blokující mAb se vážou na evolučně konzervativní, lineární epitop. Neblokující mAb nebyly účinné ani v imunoblotu ani nereagovaly s jiným biologickým druhem než člověkem.
Příklad 17
Vazba al-I domény ke kolagenu je závislá na dvojmocném kationtu
A. Purifikace α 1 -I domén al-I domény byly exprimovány v E. co//jako fúzní proteiny s GST (glutathion-S-transferázou) obsahující místo pro štěpení trombinem ve spojení sekvencí. Vyčištěný supematant z buněk lyžovaných v PBS byl nanesen na kolonu glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia), která byla důkladně promyta PBS. Fúzní protein „al-I doména - GST“ byl eluován pufrem obsahujícím 50 mMTris-HCl, pH 8,0, 5 mM glutathion (redukovaný). Pro denaturační studie I doména byla odštěpena trombinem v pufru 50 mM Tris, pH 7,5 a purifíkována od GST fúzního partnera. Ke vzorku byl přidán 2 mM DTT a vzorek byl nanesen na kolonu glutathion Sepharose 4B. Proteklý pufr a promývací frakce byly sloučeny a naneseny na kolonu Q Sepharose FF (Pharmacia). al-I doména byla eluována pufrem obsahujícím 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM 2-merkaptoethanol, 75 mM NaCl. Puntíkovaná I doména vykazovala predikovanou hmotnost (Leea et al., 1995, Structure 3, 1333-1340: 871 Da) podle elektrosprejové ionizační hmotové spektrometrie (ESI-MS), na SDS-PAGE se pohybovala jako jednoduchý pás a protein se eluoval jako
-34CZ 303450 B6 jednoduchý vrchol odpovídající velikosti při vylučovací chromatografií na koloně Supe rose 6 FPLC (Pharmacia).
B. Funkční analýza jamkové destičky byly potaženy přes noc ve 4 °C 1 pg/ml kolagenu typu IV (Sigma) nebo kolagenu typu I (Collaborative Biomedical), promyty tritonovým pufrem (0,1% Triton X-l 00, 1 mM MnCl2, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) a blokovány užitím 3% bovinního sérového albuminu (BSA) v pufru obsahujícím 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (TBS).
Sériové ředění fúzního proteinu „al-I doména-GST“ v TBS obsahujícím 1 mM MnCl2 a 3% BSA bylo inkubováno na potažených destičkách při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a promyto tritonovým pufrem. Navázaná al-I doména byla detekována sériovým přidáním 10 pg/ml biotinylované anti-GST polyklonální protilátka (Pharmacia), ExtrAvidin-křenové peroxidázy (Sig15 ma) naředěné 1 : 3000 v TBS obsahujícím 1 mM MnCl2 a 3% BSA, a 1-Step ABTS (2,2-azíndi[3-ethylbenzthiazolinsulfonát], od firmy Pierce). Destičky byly vyhodnoceny na O. D. 405 na čtecím zařízení pro mikrotitrační destičky (Molecular Devices).
Výsledky al-I domény člověka a laboratorního potkana (95% identita s humánní sekvencí) byly exprimovány v E. coli jako GST-fúzní proteiny a puntíkovány přes glutathion-Sepharose. Oba proteiny byly vyšetřeny na vazbu ke kolagenu I a IV s použitím obměněného testu založeného na ELISA, který byl již drive popsán (Qu, A. a Leahy, D. J., 1995, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 1027725 10281). Humánní al-I doména váže kolagen IV s lepší účinností než kolagen I (viz obr. 15A).
Protilátka specifická k al-I doméně, ale nikoliv protilátka specifická k a2-I doméně (obr. 15B) ruší vazbu k oběma ligandům (data pro kolagen I nejsou ukázána). Jak Mn2+ tak Mg2+ stimuluje vazbu, EDTA redukuje vazbu na hladinu šumu (pozadí) (obr. 15C). Žádné měřitelné rozdíly ve vazbě ligandu nebyly detekovány mezi humánní a doménou al-I a stejnou doménou potkana, což vede k předpokladu, že sekvenční rozdíly mezi biologickými druhy nejsou funkčně relevantní (data nejsou ukázána). Takže al-I doména pro účinnou vazbu ligandu specificky vyžaduje přítomnost kationtu.
Příklad 18
Epitop závislý na kationtu je umístěn v blízkosti MIDAS motivu
Původci využili pozorování, že AJH10 rozpoznává humánní al-I doménové sekvence, ale niko40 liv potkaní, pro mapování epitopu pro αΐβΐ-funkci blokující mAb. Humánní sekvence a sekvence laboratorního potkana se liší pouze ve 12 aminokyselinách, z nichž 4 leží v úseku 6 aminokyseliny (aa 92-97. obr. 11 A) sousedícím s kritickým threoninem (obr. 11 A, aa 98) v motivu MIDAS. Pro testování hypotézy, že 6 aminokyselinových zbytků, Val-Gln-Arg-<jly-Gly-Arg, zahrnuje epitop pro blokující mAb, původci zkonstruovali chimérickou I doménu (RAH), kde zbytky G92, R93, Q94 a L97 laboratorního potkana byly vyměněny za odpovídající humánní zbytky V, O, R a R, v daném pořadí. AJH10, spolu se všemi funkci blokujícími mAb, rozpoznává chimérickou I doménu (RAH, obr. 11B). Pro orientaci těchto zbytků vzhledem k doméně MIDAS v terciární struktuře al-I domény, původci modelovali al-I doménu s použitím koordinát krystalové struktury α2 I domény.
Homologní model humánní al I domény byl postaven s použitím rentgenově zjištěné krystalové struktury humánní α2 I domény (Ward et al., 1989, Nátuře 341, 544-546). Model byl postaven s použitím modulu pro homologní modelování InsightlI (verze 2.3.5, Biosym Technologie).
Program CHARMM (Clackson et al., 1991, Nátuře 352, 624-628) byl použit se souborem všech
-35CZ 303450 B6 vodíkových parametrů 22 se vzdáleně závislou dielektrickou konstantou dvojnásobku vzdálenosti oddělující atomy. Nejprve bylo provedeno prvních 1000 kroků nejstrmější sestupné minimalizace s hmotnostně-váženou harmonickou polohovou zábranou 4,19 kJ/(mol Á2) (1 kcal/ (mol Á2)) na všech atomech al-I domény. Po této minimalizaci následovalo dalších 1000 kroků nejstrmějšího sestupu a 5000 kroků z Adopted-Basis Newton Raphson se zábranami 0,419 kJ/(mol A2) (0,1 kcal/ (mol Á2)) C-α atomech al-I domény, aby se zabránilo významným odchylkám od rentgenografické krystalové struktury <x2-I domény.
Sekvence integrinu αϊβΐ 3α1β2 projevují 51% identitu bez jakýchkoliv inzercí nebo delecí, což vede k předpokladu, že celková struktura obou I domén bude podobná. Koordinační místo kovu je podle predikce stejná v al-I doméně jako v a2-I doméně, a rezidua, která obsahují epitop pro blokující mAb leží na kličce mezi helixem a3 a helixem a4, který obsahuje threonin v MIDAS motivu, který je kritický pro vazbu kationtu. Model al-I domény predikuje, že amidový dusík zbytku Q92 (obr. 1IA) vytváří vodíkovou vazbu s karbonylovou skupinou zbytku 133, což je zbytek sousedící se zbytkem S32. Takže klička, která obsahuje epitop, může hrát funkční úlohu ve stabilizaci úseku MIDAS.
Příklad 19
Monoklonální protilátka AQC2 (tj. mAQC2, kde „m“ označuje, že se jedná o myší protilátku) (Příklad 15, viz výše) je protilátka typu IgG], kappa. Pro identifikaci nukleotidové sekvence kódující těžký a lehký řetězec této protilátky byla připravena celková buněčná RNA z myších hybridomových buněk AQC2 použitím soupravy QIAGEN RNEASY mídi kit podle instrukce výrobce. Pak byly cDNA kódující variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce klonovány metodou RT-PCR z celkové buněčné RNA s použitím soupravy „GIBCO BRL SUPERSCRIPT Preamplification System for the First Strand cDNA Synthesis“ podle protokolu doporučeného výrobcem. Náhodné hexamery byly použity jako reakční primery.
Variabilní doména těžkého řetězce mAQC2 byla amplifikována pomocí PCR z prvního vlákna cDNA s primery:
5’ TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C 3' (sekv. id. č. 11) a
5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3’ (S=C/G, M=A/C, R=A/G a W=A/T) (sekv. id. č. 12).
PCR byla provedena ve 30 cyklech s použitím Clon těch's Advantage Taq polymerázy: denaturace 30 vteřin v 94 °C, nasednutí 1 minuta v 50 °C a prodlužování 1,5 minuty v 68 °C. Lehký řetězec mAQC2 a jeho signální sekvence byly amplifi kovány pomocí PCR s použitím primerů:
5’ ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C 3’ (W=A/T) (sekv. id. č. 13) a
5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3' (sekv. id. č.: 14).
PCR byla provedena ve 30 cyklech s použitím klonované Pfu polymerázy Stratagene: denaturace minuta v 94 °C, nasednutí 1 minuta v 50 °C a prodlužování 2 minuty v 70 °C. PCR produkty pro těžký a lehký řetězec byly purifikovány z gelu s použitím soupravy QIAGEN QIAQUICK pro gelovou extrakci podle výrobcem doporučeného protokolu.
-36CZ 303450 B6
Purifikovaný produkt - těžký řetězec byl subklonován do vektoru pCR2.1-TOPO TA firmy Invitrogen s použitím klonovací soupravy TORO TA, Invitrogen. Purifikovaný lehký řetězec byl subklonován do vektoru pCRbluntlITOPO od Invitrogen s použitím klonovací soupravy Zero Blunt TOPO, Invitrogen, podle protokolu doporučeného výrobcem. Inzerty z mnoha nezávislých sub5 klonů byly sekvencovány. S výjimkou degenerovaných poloh v PCR primerech byly sekvence inzertů nezávislých subklonů totožné.
Polypeptidové sekvence mAQC2 byly dedukovány z jejich kódujících sekvencí. N koncová aminokyselinová sekvence pro zralý lehký řetězec predikovaná z cDNA sekvence PCR produktu amplifikovaného se signální sekvencí přesně odpovídala N-koncové sekvenci purifi kovaného lehkého řetězce mAQC2 získané Edmanovou degradaci (DVKVVESGG, sekv. id. č. 15). BLAST analýzy sekvencí variabilních domén potvrdily jejich imunoglobulinovou identitu.
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVW HMFWYQQKPK
SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE
DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106 (Sekv. id.č. 1)
CDR úseky jsou znázorněny tučně. CDR úseky jsou definovány podle Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, the United States Deparment of Health and Human Servies, the United States Government, Printing Office, 1991. S použitím systém číslování podle Kabata, sekv. id. č. 1 je reprezentována následovně, přičemž pomlčka označuje nepřítomnost aminokyseliny:
QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASS-SV NHMFWYQQKP
KSSPKPWIYL TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA
EDAATYYCQQ WSGNPWTFGG GTKLEIK 107
Polypeptidová sekvence variabilní domény těžkého řetězce mAQC2 je následující:
DVKWBSGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
QMSSLRSEDT AMYYCTRGFG DGGYFDVWGQ GTTVTVSS (Sekv. id. č. 2)
CDR úseky jsou znázorněny tučně. S použitím systém číslování podle Kabata, sekv. id. č. 1 je reprezentována následovně, přičemž Čísla poloh jsou po sobě následující čísla, pokud není uveden jinak:
1 DVKWESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI
41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL
81 QM
82a-c SSL
83 RSEDTAMY YCTRGFGDGG
lOOa-b YF
101 DVWGQGTTVT VSS 113
-37CZ 303450 B6
Jak se v tomto textu používá, čísla poloh aminokyselinových zbytků variabilních domén jsou ve shodě se systémem číslování podle Kabata, není-li uvedeno jinak.
Příklad 20
Tento příklad popisuje přípravu chimérické myší-humánní protilátky chAQC2.
CDNA kódující variabilní úseky těžkého a lehkého řetězce mAQC2 byly použity ke konstrukci expresních vektorů chAQC2, ve kterých variabilní úseky pAQC2 byly spojeny s humánním IgG] a konstantními úseky kappa.
Chiméra těžkého řetězce byla konstruována následujícím postupem: Fragment KbPstl-BstEII velikosti 0,33 kb z plazmidu pAND083 těžkého řetězce mAQC2 byl subklonován do fosfatázou ošetřeného Pstl-BstEII vektorového fragmentu velikosti 2,82 kb z plazmidu 5a8 těžkého řetězce pLCB7, aby byla přidána signál-kódující sekvence myšího těžkého řetězce a myší donorové sestřihové místo k cDNA variabilního úseku těžkého řetězce mAQC2. 5a8 je molekulárně klonovaná CD4-specifická mAb (viz, např., Boon et al., 2002, Toxicology 172: 191-203). Ve zralém těžkém řetězci kódovaném vzniklým plazmidem (pAND092) se N-konec liší v pěti aminokyselinových zbytkách od N-konce (DVKVVE, sekv. id. č. 16) příbuzného těžkého řetězce mAQC2.
Pro opravu N-konce těžkého řetězce byl pAND092 podroben mutagenezi eliminací jedinečných míst (USE) s použitím soupravy pro USE mutagenezi (Amersham Pharmacia Biotech) podle protokolu doporučeného výrobcem. Substituce Q1D, Q3K, L4V, Q5V a Q6E byly kódovány mutagenním primerem: 5' GCA CCA GGT GCC CAC TCC GAC GTC AAG GTG GTG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG 3' (sekv. id č. 17). Mutované plazmidové klony byly identifikovány podle jejich nových AatlI a Hinfl míst a ztráty Pstl místa. Kódující sekvence těžkého řetězce pak byla potvrzena DNA sekvencováním. Správně mutovaný plazmid byl nazván pAND094. Notl-HindlII fragment velikosti 0,43 kb z pAND094 a HindlII-Notl fragment velikosti 1,21 kb z plazmidu pEAG964 (obsahující kódující sekvence pro konstantní úsek humánního IgG]) byly subklonovány do Notl místa v pCH269, plazmidu pocházejícím z pCEP4 EBV expresního vektoru (Invitrogen). Výsledný plazmid byl nazván pAND099.
Chiméra lehkého řetězce byla připravena následujícím způsobem: EcoRI fragment velikosti 0,46 kb z plazmidu dpAND081 variabilní domény lehkého řetězce mAQC2 byl subklonován do fosfatázou ošetřeného fragmentu velikosti 2,7 kb z vektoru pNN09 odvozeného zklonovacího vektoru pUC, aby bylo přidáno 5' Notl místo. Vzniklý plazmid, pAND091, byl podroben mutagenezi s použitím soupravy pro USE mutagenezi (Amersham), viz výše)), aby se vneslo BglII místo na 3' konec kódující sekvence. Mutagenní primer měl sekvenci: 5'GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3' (sekv. id. ě. 18).
Správně mutovaný plazmid byl identifikován podle změn polohy míst BglII a BstYI. Sekvence kódující lehký řetězec ve výsledném plazmidu pAND093 byla potvrzena DNA sekvencováním. Pak byl Notl-BglII fragment variabilní doména lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pAND093 aBclI-Notl fragment z plazmidu pEAG963 velikosti 0,68 kb (obsahující kódující sekvenci konstantní doménu humánního lehkého řetězce kappa) subklonovány do Notl místa pCH269 (viz výše), čímž byl vytvořen plazmid pAND102. Pro vytvoření neblokovaného lehkého řetězce kappa (Q1E), pAND093 byl podroben USE mutagenezi s mutagenním primerem: 5'CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCT CAC CCA G 3' (sekv. id. č. 19), pro vnesení XmnI místa. Mutovaný plazmid byl identifikován screeningem na změnu polohy XmnI. Sekvence lehkého řetězce ve vzniklém plazmidu pAND097 byla potvrzena DNA sekvencováním. Fragment NotlBglII variabilní domény lehkého řetězce z pAND097 velikosti 0,44 b a BclI-Notl fragment
-38CZ 303450 B6 z plazmidu pEAG963 velikosti 0,68 kb (obsahující konstantní doménu humánního lehkého řetězce kappa) byly subklonovány do Notl místa pCH269, čímž byl vytvořen plazmid pAND098.
Pro tvorbu protilátky chAQC2 byly expresní vektory (vektor pAND099 pro těžký řetězec chAQC2 + vektor pAND102 pro lehký řetězec chAQC2 a vektor pAND099 pro těžký řetězec chAQC2 + vektor pAND098 pro neblokovaný lehký řetězec chAQC2) kotransfekovány do buněk 293-EBNA. Transfektanty byly testovány na sekreci protilátky a její specifitu. Kontrolu tvořily buňky transfekované odpovídající vektory bez inzertu nebo s DNA konstrukty kódujícími ch5c8 (molekulárně klonovaná CD154-specifická mAb popsaná např. v Elster et al., 2001, Transplantation 72:1473-1478) nebo chCBEl 1 (molekulárně klonovaná LTR-speciflcká mAb popsaná např. v Browning et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 2 4934-24938).
Pak byly transfektanty, které sekretovaly požadovanou protilátku, lyžovány a s lyzáty a kondiciovaným médiem byla provedena imunoprecipitace proteinem A. Western blot analýza precipitátů prováděná s protilátkami proti humánnímu těžkému a lehkému řetězci ukázala, že chAQC2transfekované buňky syntetizovaly a účinně sekretovaly těžký a lehký řetězec v hladině podobné ch5c8-transfekovaným a chCBEl 1-transfekovaným buňkám. Dále hu V LA-1-exprimující buňky K562al byly označeny (obarveny) pomocí kondicionovaného média z transfekovaných buněk a na takto označených buňkách byla provedena FACS analýza. Výsledky ukázaly, že protilátka chAQC2 vytvořila obarvené profily podobné profilům mAQC2, zatímco kondicionovaná média ze slepě transfekovaných a ch5c8-transfekovaných buněk neuspěly v obarvení buněk K562al. Chimérická AQC2 produkovaná po přechodné transfekci ve větším měřítku byla purifikována a pomocí FACS titrace bylo ukázáno, že se váže kVLA-1. Chimérická AQC2 buďto divokého typu nebo s geneticky odblokovaným lehkým řetězcem se váže k VLA-1. Viz také obrázky 16 A - D (diskutované dále).
Příklad 21
Tento příklad popisuje způsob humanizace monoklonální protilátky mAQC2.
Analýza variabilní domény mAQC2
Variabilní domény lehkého a těžkého řetězce mAQC2 byly srovnány s kanonickými sekvencemi pro myší a humánní podskupiny (Kabat et al., viz výše) s použitím počítačového programu FA STA. Bylo zjištěno, že variabilní doména lehkého řetězce je členem myší podskupiny IV s 89% identita v překrývajícím se úseku 109 aminokyselin. Tato doména také odpovídala humánní podskupině 1 se 72% identitou v překrývajícím se úseku 113 aminokyselin. A dále bylo zjištěno, že variabilní doména těžkého řetězce je členem myší podskupiny Illd s 86% identitou v překrývajícím se úseku 129 aminokyselin. Tato variabilní doména těžkého řetězce také odpovídala humánní podskupině III se 79% identitou v překrývajícím se úseku 130 aminokyselin.
CDR úseky byly kategorizovány roztříděny do kanonických tříd podle Chothia et al., Nátuře 342, pp. 877-883, 1989. Klíčové zbytky definující každou z kanonických tříd rozhodují do značné míry o strukturní konformace CDR klíčky, takže by měly být zachovány v reorganizované (přestavěné) protilátce. Ukázalo se, že LI klička mAQC2 spadá do kanonické třídy 1 (klička z 10 zbytků), L2 do třídy 1 (klička ze 7 zbytků) a L3 také do třídy 1 (klička z 9 zbytků). H1 klička spadá do třídy 1 (klička 5 zbytků) a H2 klička také do třída 1 (klička ze 16 zbytků). Zdá se, že H3 klička nepatří do žádné kanonické třídy. Kanonické zbytky důležité pro tyto třídy byly všechny zahrnuty v humanizovaných protilátkách.
Neobvyklé zbytky rámce mAQC2 byly určeny pomocí analýzy všech myších a humánních sekvencí variabilních řetězců podle 1999 verze databáze Kabata. Věřilo se, že mAQC2-specifické rozdíly by mohly ukazovat na somatické mutace, které zesilují vazebnou afinitu, jestliže se rozdíly vyskytují blízko vazebného místa. Neobvyklé mAQC2 zbytky ve větší vzdálenosti od vazeb-39CZ 30345« B6 ného místa a neobvyklé zbytky humánního rámce byly odstraněny v případě, že by vytvářely imunogenní epitopy v humanizované protilátce. Neobvyklé zbytky rámce zjištěné v mAQC2 byly 7 (F), 10 (L) a 41 (K) v lehkém řetězci a 4 (V), 21 (A) a 40 (I) v těžkém řetězci. Žádný z neobvyklých zbytků myšího rámce nebyl ponechán v humanizovaných protilátkách.
Modelování struktury variabilních úseků
Lehký a těžký řetězec mAQC2 byly porovnávány proti nonredundantní databázi pro stanovení toho, které strukturní rámce by měly být použity ke konstrukci trojrozměrných modelů lehkého io a těžkého řetězce mAQC2. S použitím programu FA STA bylo zjištěno, že lehký řetězec má 82% sekvenční identitu s myší monoklonální protilátkou ab57 (1CLOL), zatímco těžký řetězec má
76% sekvenční identitu s myším 6d9 Fab fragmentem (1HYY). S použitím programového balíku pro molekulární modelování SYBYL (Tripos lne.), byla sestavena přibližná trojrozměrná struktura lehkého a těžkého řetězce mAQC2 s využitím lehkého řetězce z ab57 a těžkého řetězce z 6d9, v daném pořadí. Strukturní integrita modelů byla vyhodnocena přímo u počítače a shledána jako rozumná.
Návrh reorganizovaných variabilních úseků
Byly použity dva přístupy pro výběr humánního akceptorového rámce, aby přijal CDR úseky z mAQC2c. První přístup byla metoda homologní shody (Lhomology matchíng) a druhým přístupem bylo využití kanonických humánních Ig sekvencí. Při homologické metodě byla databáze Kabata, nonredundantní databáze NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health) a databáze Incyte prohledávány použitím programů FA STA a BLAST. Volba humánního akceptorového byla učiněna na základě sekvenční identity mezi rámcem mAQC2 a humánním rámcem (s vyloučením rámců již dříve humanizovaných protilátek) a zdrojem protilátky.
Rámce z genů variabilních úseků imunoglobulinu mající přístupové číslo v GENBANK gi:587330 (humánní kappa podskupinal VK—lei47) byly nakonec zvoleny pro lehký řetězec humanizované protilátky (Welschof et al., J. Immunol. Meth. 179: 203-14, 1995). Rámce z Amulcll (Kabat ID 044469, humánní podskupina III) byly zvoleny pro těžký řetězec humanizované protilátky (Huang et al., J. Immunol. 151: 5290-300, 1993).
Zpětné mutace humánního rámce
Strategie pro určení toho, které zpětné mutace udělat, jsou dostupné webových stránkách Humanization by Design na url adresách http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan a http://www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s. Předchozí experimenty prokázaly, že je důležité zachovat kanonické zbytky, zbytky „sbalování rozhraní“ a neobvyklé myší zbytky, kteréjsou blízko vazebného místa. Kromě toho by měly být zváženy zbytky ve „Vemier zóně“, která tvoří platformu, na které spočívají úseky CDR (Foote et al., J. Mol. Biol. 224, p. 487, 1992), a zbytky v blízkosti CDR H3 by měl být považován.
Čtyři reorganizované verze byly navrženy pro každý variabilní lehký a těžký řetězec, jak je ukázáno v tabulce 1. Dvě ze čtyř verzí pro každý řetězec byly navrženy metodou shody podle homologie (označené huAQC2-hl a -h2) a další dvě verze metodou kanonické shody (huAQC2-cl a —c2). Je nutné poznamenat, že sekvence pro těžký řetězec huAQC-hl a těžký řetězec huAQC-cl jsou identické.
-40CZ 303450 B6
Tabulka 1
Sekvence mAQC2, huAQC2 a humánní rámce
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl raAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2~cl huAQC2-c2
TEZKY RETEZEC
FR1 CPR1
E-QL-------IQ-----R-S------TV- SNY-E-QL-------IQ-----R-S------T-- ------QL--------Q-----R-S..............
DVKWESGGGLVKPGGSLKLACAASGFSFS RYTMS
--QL--------Q '--R-S--------- ----E-QL--------Q-----R-S------T-- ----FR2 CDR5
----A-G-G----S V-YS--S---A.....
----a-g-g----- -------------------A-G-G----- ---------------WVRQIPSKRLEWVA TISGGGHTYYLDSVKQ ----A-G-G----- -------------------A-G-G----- ---------------AMU1C11 huAQC2-h2 huAQC2-hl mAQC2 huAQC2-cl huAQC2-c2
CPR3
--------S--------N a----V AS IRFLEWS--Y
--------3--------N a----V----- ---------........S........N---A----V.........-.....
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTR GFGDGGYFDV
-.......S--------N---A----V-..............
--------3--------N---A----V----- ----------
FR4 Změny rámce
AMU1C11 -----L----- 20
huAQC2-h2 -----L..... 16
huAQC2-hl -----L----- 13
mAQC2 WGQGTTVTVSS*** 0
huAQC2-cl -----L----- 13
huAQC2-c2 -----L----- 15
* pomlčky ukazuji na identitu s aminokyselinovou sekvenci AQC2. ** Část sekv. id. č. 1. ***Část sekv. id č, 2. Sekvence id. č. 67, 44, 42, 2, 42 a 68 v tom pořadí, jak jdou za sebou
-41 CZ 303450 B6
LEHKÝ ŘETĚZEC
FR1
Vk-lcl47 D--M--S-SSL---V-DR--I--* huAQC2 -h2 ------S -SSL“ — V-DR- -I - huAQC2-hl ......S-SSL---V-DR--I-mAQC2 QIVLTQFPALMSASPGEKVTMTC huAQC2-cl --Q---S-SSL--- V-DR--I -huAQC2-c2 --Q---S-SSL---V-DR--I —
CDR1 FR2
Vk-lcl47 R--Q-ISYLN GKA--LL-huAQC2 -h2 ---------- ------GKA--LL- huAQC2-hl ---------- ------GKA......
mAQC2 SASSSVNHMF WYQQKPKSSPKPWIY huAQC2-cl ---------- ------GKA-----huAQC2-c2 - GKA--LL-CDR2 FR3
Vk-lcl47 AA-S-Q- — S.........DFT-----LQP--F.....
huAQC2-h2 ........--S---------D-T-----LQP--F----huAQC2-hl -.....- ---S---------D-T-----LQP--F----mAQC2 LTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC huAQC2-Cl ....... ---fí.........D-T.....LQP--F.....
huAQC2-c2 ......- ---S---------D-T-----LQP--F.....
Změny
CDR3 FR4 rámce
Vk-lcl47 --SYST-L- ------V—_ 25
huAQC2-h2 -.....v--- 21
huAQC2-hl ......V—- 19
mAQC2 QQWSGNPWT FGGGTKLEIK** 0
huAQC2-cl --Q---V— 21
huAQC2-c2 23
Sekvence id. č. 65, 51, 49, 1, 66 a 54, v tom
pořadí, jak jdou za sebou
-42 CZ 303450 B6
Některé zpětné mutace jsou diskutovány ještě dále.
(1) Lehký řetězec:
1 D —► Q Tato mutace byla vytvořena ve všech verzích, protože předchozí reorganizaění experimenty (např. Kolbinger et al., Protein Eng. 6, p. 971, 1993) předpokládají její důležitost pro vazbu antigenu.
M —* L Toto je „vemier“ zbytek a byl zachován ve všech verzích, io
L —> P Tento zbytek je jak zbytek rozhraní tak i „vemier“ zbytek a byl zachován pouze v hl a cl.
L —► W Toto je „vemier“ zbytek a byl zachován pouze v hl a cl.
F —> Y Tento zbytek je v důležité kanonické poloze a byl zachován ve všech verzích.
(2) Těžký řetězec:
1 E —* D Tato zpětná mutace byla vytvořena v pouze h 1 (tj.cl).
I —> V Zbytek lje neobvyklý v humánní sekvenci a byl zachován pouze v h2.
T —► S Toto je „vemier“ zbytek a byl zachován pouze v h 1.
V —► F Toto je kanonický zbytek a byl zachován ve všech verzích.
S -+ A Toto je „vemier“ zbytek a byl zachován ve všech verzích.
93 A —► T Tento zbytek je jak zbytek rozhraní tak i „vemier“ zbytek a byl zachován ve všech verzích.
S —► R Toto je kanonický zbytek a byl zachován v obou verzích.
Variabilní úseky huAQC2 byly připraveny pomocí USE mutageneze, jak bylo popsáno výše, s využitím plazmidu variabilní domény chAQC2 jakožto výchozích templátů. cDNA sekvence humánního akceptorového rámce („FR“) byly Kabat # Z37334 pro lehký řetězec a Kabat #U00490 pro těžký řetězec. Pro snazší identifikaci mutovaných plazmídů byly vneseny umlčené mutace, aby se změnila restrikční místa. Mutované plazmidy byly identifikovány podle změny restrikčních míst. cDNA sekvence variabilních úseků ve výsledných plazmidech byla ověřena DNA sekvencováním.
Verze těžkých řetězců hl a cl (které byly totožné) byly vytvořeny s použitím plazmidu pAND094 jako templátů. Mutagenní primery byly následující:
FR1 primer 5' GGT GCC CAC TCC GAC GTC CAG CTG GTC GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC 3' (sekv. íd. č. 20), který vnesl místa Taql a Pvulí a eliminoval místo Ddel,
FR2 primer 5' ATG TCT TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG
GTC GCA ACC 3' (sekv. id. č. 21), který vnesl místo Ncil a eliminoval místa BspEl a Earl,
-43CZ 303450 B6
FR3 primer 5' TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA 3' (sekv. id. č. 22), který vnesl místa Pstl a Ddel, a
FR4 primer 5' TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GAG 3' (sekv. id. č.23), který vnesl místa KpnI a Eco0109I. Výsledný plazmid těžkého řetězce hl (tj. cl) byl nazván pANDl 04.
Verze c2 těžkého řetězce byla vytvořena s použitím pAND104 jako templátu s následujícími ío mutagenními primery:
FR1 primer 5' TCC TGT GCA GCC TCT GAA TTC ACC TTC AGT AGG TAT ACT ATG TCT TGG GTT 3' (sekv. id. č. 24), který zavedl AccI místo, a
FR1 primer 5' GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC CAG CTG GTC GAG TCA 3' (sekv. id. č. 25), který zavedl FspI místo a eliminoval AatlI místo. Výsledný plazmid těžkého řetězce c2 byl nazván pANDl 15.
Verze h2 těžkého řetězce byla vytvořena s použitím pAND115 jako templátu s následujícím příměrem:
FR1 primer 5' GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC CTG 3' (sekv. id. č. 26), který eliminoval Ddel místo. Výsledný plazmid těžkého řetězce h2 byl nazván pANDl 13.
Pro vytvoření expresních vektorů pro těžký řetězec huAQC2, Notl-HindlII fragment variabilní domény těžkého řetězce velikosti 0,43 kb zpAND104, pAND115 nebo pANDl 13 a HindlIINotl fragment velikosti 1,21 kb zpEAG964 (viz výše) byly subklonovány do Notl místa v pCH269 (viz výše). Vzniklé exprese plazmidy pro těžké řetězce byly nazvány pANDl 14 (hl), pAND121 (c2) a pAND124 (h2), v daném pořadí.
Verze hl lehkého řetězce byla vytvořena s použitím plazmidu pAND093 jakožto templátu. Mutagenní primery byly následující:
FR1 primer 5' CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3' (sekv. id. ě. 7), který odstranil stEII a Pstl místa,
FR2 primer 5' TTC TGG TAT CAG CAG AAG CCC GGG A GCC CC A CCC TGG ATT 3' (sekv. id. č. 28), který zavedl Ncil místo,
FR3 primer 5' GCT TCT GGA GTC CCT TCA CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 3' (sekv. id. ě. 29), který zavedl Ddel místo a odstranil Eco0109I a Aval místa, a
FR4 primer 5' GGT GGA GGC ACT AAG GTG ATC TAA CGG GCT 3' (sekv. id. č. 30), který zavedl Ddel a Styl místa. Vzniklý plazmid lehkého řetězce hl byl nazván pANDl03.
Verze h2 lehkého řetězce byla vytvořena s použitím pANDl03 jakožto templátu s následujícími primery:
-44CZ 303450 B6
FR2 primer 5' CCC GGG A GCG CCC A CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3' (sekv. id. č. 31), který vnesl Hhal a Haell místa. Vzniklý plazmid lehkého řetězce h2 byl nazván pANDl 16.
Pro verzi cl lehkého řetězce byl použit plazmid pAND103 jako templát s následujícími primery:
FR1 primer 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (sekv. id č. 32), který vnesl místa Smál, Nci 1 a Pípali,
FR4 primer 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (sekv. id č. 33), který vnesl Bspl286I místo. Výsledný plazmid lehkého řetězce byl nazván pANDl 18.
Verze c2 lehkého řetězce byla vytvořena s použitím plazmídu pAND 116 jako templátu s násle15 dujícími primery:
FR1 primer 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TC T CCA TCC 3' (sekv. id. č. 34), který zavedl místa Smál, Ncil a Hpaíí,
FR4 primer 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (sekv. id č. 35), který zavedl Bspl286I místo. Výsledný plazmid lehkého řetězce c2 byl nazván pANDl 19.
Pro vytvoření expresních vektorů pro lehké řetězce huAQC2, Notl-BgíII fragmenty variabilní domény lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pANDl03, pANDl 16, pANDl 18 nebo pANDl 19 a BclI-Notl fragment velikosti 0,68 kb z pEAG963 (viz výše) byly subklonovány do Notl místa v pCH269 (viz výše). Výsledné expresní vektory lehkého řetězce byly nazvány pANDl 17 (hl), pANDl20 (h2), pANDl22 (cl) a pANDl23 (c2), v daném pořadí.
Expresní vektory byly kotransfekovány do buněk 293-EBNA a transfekované buňky pak byly testovány na sekreci protilátky ajejí specifitu. Buňky transfekované prázdným vektorem sloužily jako negativní kontrola. Lyzáty z celých buněk a kondicionovaná média byly imunoprecipitovány s proteinem A. Western blot analýza precipitátů (vyvolaná s protilátkami proti humánnímu těžkému a lehkému řetězci) ukázala, že huAQC2-transfekované buňky syntetizovaly a účinně sekreto35 vály těžký a lehký řetězec protilátky v hladinách podobných chAQC2-transfekovaným buňkám.
FACS analýza VLA-1 exprimujících buněk K562a obarvených kondicionovaným médiem z kultivace transfekovaných buněk pak byla provedena. Pro tento účel buňky K562a byly inkubovány s kondicionovaným médiem na ledu po dobu 120 minut. Buňky pak byly promyty třikrát FACS pufrem (PBS s 5% FBS a 0,05% azidem sodným). Promyté buňky byly resuspendovány v pufru a inkubovány s PE-konjugovaným anti-humánním IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, lne.) na ledu po dobu 30 minut. Po inkubaci byly buňky promyty třikrát FACS pufrem a resuspendovány ve FACS pufru pro analýzu. Data jsou ukázána v tabulce 2, kde HuAQC2-hl označuje mAb, sestávající z hl verze těžkého řetězce (HC) huAQC2 a hl verze lehkého řetězce (LC) z huaQAC2 (viz Tabulka 1), Podobně, huAQC2-h2 je mAb, kterou tvoří h2 verze těžkého a lehkého řetězce, u huAQC2-cl je to cl verze a u uAQC2-c2 je to c2 verze. V tabulce se MF1 týká průměrné MF1 normalizované k hodnotě, která byla pozorována pro blokovanou chAQ C2. Uvedená data reprezentují průměr ze dvou nezávislých transfekcí. Tato data ukazují, že huAQC2 h2 a-c2 mAb se vázaly hůře než huAQC2-hl a-cl vzhledem k chAQC2.
-45CZ 303450 B6
Tabulka 2
FAC S barvení buněk K562a užitím chAQC2 a huAQC2
Lehký řetězec Těžký řetězec Relativní MFI
chAQC2 PAND102 pANDO99 1,00
huAQC2-til pANDH7 pAND114 1,50
huAQC2-h2 pAND120 PAND124 0, 64
huAQC2-cl pANDl22 pAND114 1,50
huAQC2-c2 PAND123 pAND121 0,68
huAQC2 LC cl/HC c2 PAND122 PAND121 2,21
huAQC2 LC C2/HC cl PAND123 PAND114 0,76
huAQC2 LC neblokovaný cl/HC c2 pANDISO* PAND121 0,75
huAQC2 LC L46P c2/HC c2 PAND133** pAND121 1,50
huAQC2 LC L47W c2/HC c2 pAND132*** PAND121 1,00
* kóduje huAQC2 LC cl 3 neblokovaným N-koncem Q1D. ** kóduje huAQC2 LC c2 s L4 6P.
*** kóduje huAQC2 LC c2 s L47W.
Kotransfekce buněk 293-EBNA schAQC2 a huAQC2-hl, -h2, -cl a -c2 byly provedeny ve větším měřítku. Protilátky z kondicionovaného média byly purifikovány na Sepharose s proteinem A. Purifíkované mAb byly testovány na aktivitu pomocí FACS. Protokol byl následující:
ίο 1. Spočítej buňky z baňky, která byla rozdělena 1 : 4 den před testem.
2. Peletuj buňky a resuspenduj je na 2,5 x 105 buněk/ml ve FACS pufru (5% FBS v PBS s 0,02% azidem sodným).
3. Pipetuj po 100 μΐ buněk do jamek 96jamkové destičky se dnem typu V.
4. Připrav sériové ředění 1:3 z AQC2 ve FACS pufru počínaje koncentrací 3pg/ml.
5. Peletuj buňky po dobu 5 minut při 800 g a odstraň pufr z destičky vytřepnutím.
6. Resuspenduj buňky ve 100 μΐ naředěné protílátkové série.
7. Inkubuj po dobu 2 hodin na ledu.
8. Opláchni destičku. Pelet buňky po dobu 3 minuty v 800 g a odstraň pufr z destičky vytřepnutím.
9. Resuspenduj buňky ve 100 μΐ sekundární protilátky (naředěné 1:100 ve FACS pufru).
3o 10. Inkubuj po dobu 30 minut na ledu.
11. Opláchni destičku (viz výše).
-46CZ 303450 B6
12. Resuspenduj buňky ve 25 μΐ FACS pufru.
13. Centrifuguj krátce FACS zkumavky, aby bylo jisté, že objem 50 μΙ je na dně zkumavky.
14, Protřep důkladně na vortexu každou zkumavku a odeber 5000 případů.
Data jsou ukázána na obr. 17. Tato data potvrdila, že huAQC2-h2 a -c2 se váží hůře než huAQC2'hl a-cl vzhledem k chAQC2.
io Kanonické verze h uAQC2 byly zkoumány dále, protože byly méně imunogenní, když byly použity k léčení pacientů s chronickými indikacemi.
Kotransfekce tzv. typu „mix-and-match“ byly provedeny s cílem určit, zda jediný řetězec je zodpovědný za zjevné zhoršení vazby pozorované u huAQC2-c2. Kotransfekce vedly k názoru, is že zhoršení vazby lze přisoudit lehkému řetězci c2 (kódovanému pANDl 23), který se liší od lehkého řetězce c2 (kódovanému pAND123), který se liší od lehkého řetězce cl (kódovaného pAND122) pouze ve dva zbytkách FR2 úseku: P46L a W47L.
Aby se určily individuální příspěvky každé z těchto dvou záměn, byly zkonstruovány nové expresní vektory lehkého řetězce c2. Plazmid pAND125, L47W varianta lehkého řetězce c2, byl vytvořen s použitím pANDl 19 jako templátu s následujícím mutagenním primerem:
FR2 primer 5' GGG A GCA CCC A CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC 3' (sekv. id č.36), který vnesl Hhal a Haell místa. Plazmid pAND126, L46P varianta lehkého řetězce c2, byl vytvořen s použitím pANDl 19 jako templátu s následujícím mutagenním primerem:
FR2 primer 5' AAG CCC GGG AAG GCG CCC A CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCC AAC 3' (sekv. id. č. 37), který vnesl místa BsaHI, Bani a Narl. Expresní vektory pro nové lehké řetězce huAQC2 byly vytvořeny subklonováním Notl-BglII fragmentu variabilní domény lehkého řetězce velikosti 0,44 kb zpANDl25 nebo pAND126 a BcII-Notl fragmentu velikosti 0,68 kb z pEAG963 (viz výše) do Notl místa pCH269 (viz výše). Takto vzniklé plazmidy byly nazvána pANDl32 (c2 s L47W) a pANDl33 (c2 s L46P), v daném pořadí.
Byla provedena kotransfekce plazmidů s novým lehkým řetězcem s každým z plazmidů těžkého řetězce huAQC2. VLA-1 vazba byla pak vyšetřována užitím FACS. data ukazují, že zpětná mutace L47W nedokázala zlepšit vazbu. L46P mutace zlepšila vrchol vazebné křivky, ale hodnota EC50 byla posunuta ještě více doprava vzhledem k chování huAQC2 verze 1 (Tabulka 2, viz výše). Tyto výsledky vedou k názoru, že obě zpětné mutace byly potřebné pro plnou vazebnou aktivitu.
Geneticky neblokovaný lehký řetězec cl byl také vytvořen, protože Q1D varianta by byla ojeden zbytek více ..humanizovaná. Q1D mutanta, označená pANDl48, byla vytvořena stemplátem pANDl 18 s následujícím mutagenním primerem:
FR1 primer 5' GTC ATA ATG TCC CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3' (sekv. id č. 38), který zavedl nový EcoRI místo a odstranil Apol místo. Expresní vektor pro tuto poslední variantu lehkého řetězce huAQC2 byl vytvořen subklonováním Notl-BglII fragmentu variabilní domény lehkého řetězce velikosti 0,44 kb z pANDl48 a BcII-Notl fragmentu velikosti 0,68 kb z pEAG963 do Notl místa v pCH269, čímž byl připraven expresní vektor lehkého řetězce pANDl50 (cl s neblokovaným N-koncem Q1D). Koexprese geneticky neblokovaného lehkého řetězce s těžkým řetězcem c2 (tj. „huAQC2 LC cl neblokovaný/HC c2“, označený huAQC2-c4) byl ekvivalentní s „huAQC2 LC cl/HC c2“ (označeným huAQC2-c3). VLA-1 vazba byla potvrzena pomocí FACS na VLAl-exprimujících buňkách K562al (tabulka 2).
-47CZ 303450 B6
Kotransfekce buněk 293-EBNA chAQC2 a huAQC2-hl, -h2, -cl, -c2, -c3 a -c4. Protilátky v kondicionovaném médiu byly purifikovaný na protein-A-sepharose a purifikované mAb byly testovány na aktivitu (obr. 17 a 18). HuAQC-c2 byla vybrána jako kandidátní léčivo, protože její vlastnosti byly podobnější chAQC2. Pak byly navrženy vektory pro stabilní expresi huAQC2—c3 vCHO buňkách. Vektory obsahovaly cDNA pro huAQC2 cl LC nebo c2 HC, s deletovanými úseky 5' a 3' UTR vyloučený a geneticky deletovaným C-koncovým lysinem těžkého řetězce, aby byla zajištěna homogenita produktu. Výsledné vektory byly pAND162 (lehký řetězec) a pAND160 (těžký řetězec). Jak se v tomto textu užívá, huAQC2-c3 je také nazývána hAQC2.
ío Úplná polypeptidová sekvence hAQC2 je následující:
Lehký řetězec (Plasmid: pAND162)
QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMFWYQQKPG KAPKPWIYLT
SNLASGVPSR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW SGNPWTFGQG
101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAÍCVQWKVD
151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV
YACEVTHQGL
201 SSPVTKSFNR GEC (Sekv. id. č. 3)
Těžký řetězec (Plazmid: pANDlóO)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA
PGKGLEWVAT
IEGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT
AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYWST
301 YRWSVLTVL HQDWLWGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGOPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (Sekv. id. č. 4)
-48CZ 303450 B6
Další poíypeptidy těžkého a lehkého řetězce a nukleotidové sekvence jsou ukázány dále.
A. Těžký řetězec chAQC2 (Pand099) (sekv. id. č. 39 a 40. První číslo označuje nukleotidovou 5 sekvenci a druhé číslo polypeptidovou sekvenci. Stejné pořadí je použito i v následujícím číslování).
GACGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTC
DVKVVESGGGLVKPGGSL K L
GCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
ATT
ACAASGFSPSRYTMSWVR
Q I
121
CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA pekrlewvati SGGGHTY
Y I»
181 gacagtgtgaagggccgattcaccatctcgagagacaatgccaagaacaccctqtac
CTG
DSVKGRFTI SRDNAKNTL
Y L
241 caaatgagcagtctgaggtctgaggacacagccatgtattactgtacaagaggtttt
GGA
QMS SLRSEDTAMYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTTVTVSS
-49CZ 303450 B6
B. chAQC2HChI a cl (Pand 114) (sekv. id. č. 41 a 42)
GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC dvqlvesggglvqpggsl R h
TCCTGTCCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGATATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
SCAASGFSFSRYTMSWVR G A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATISGGGHTY
Y L
181 gacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccctgtac
CTG
DSVKGRFTISRDNSKMTL
Y I»
241 cagatgaacagtctgagggccgaggacacagccgtgtattactgtacaagaggtttt
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGrCACCGTCTCCTCA
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
-50CZ 303450 B6
C. chAQC2 těžký řetězec h2 (pAND124) (sekv. id. č. 43 a 44)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGLIQPGGSL
R L €1
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTftlACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
SCAASGFTFSRYTMSWVR
Q A
121
CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTCACACCTACTAT
CTA
PGKGLEWVATISGGGHTY
Y L
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTAC
CTG
DSVKGRFTISRDNSKNTL
Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG
F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGG
DGGYFDVWGQGTLVTVSS
-51 CZ 303450 B6
D. chAQC2 těžký řetězec c2 (pANDl 21) (sekv. id. č. 45 a 69)
GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGA
CTC
EVQLVESGGGLVQPGGSL R L
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGGTATACTATGTCTTGGGTTCGCCAG
GCT
SCAASGFTFSRYTMSWVR Q A
121 ccggggaaggggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggtggtcacacctactat
OTA
PGKGLEWVATI SGGGHTY y l
181
GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTCTAC
CTG
DSVKGRFTI SRDNSKNTL Y L
241
CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAAGAGGTTTT
GGA
QMNSLRAEDTAVYYCTRG F G
301
GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAC3G
PGGYFDVWGQGTLVTVSS
-52CZ 303450 B6
E. chAQC2 blokovaný lehký řetězec (Pand 102) (sekv. id. č. 46 a 47) x caaattgttctcacccagtttccagcactcatgtctgcgtctccaggggagaaggtcacc QIVLTQFPALMSASPGEK
V T
ATGACCTGCACSTGCCAQCTCAAGTGTAAATCACAlXTrTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
MTCSASSS V NHMFWYQQK P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
S SPKPWIYLTSNLASGVP A R
181 ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggct
GAA
F sgsgsgtsyslti ssme
A E
241 gatgctgccacttattactgccagcagtggagtggtaacccgtggacgttcggtgga
GGC
DAATYYCQQWSGNPWTFG G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA T K L E I K
- 53 CZ 303450 B6
F. hAQC2 lehký řetězec hl (pANDl 17) (sekv. id. č. 48 a 49)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGOGTCTG3AGGGGACAGAGTCACC QIVLTQSPSSLSASVGDR v T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTItAATCAGATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSSVNHMF-WYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCIXSGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP S R
181 ttcagtggcagtgggtctgggacagattacactctcacaatcagcagcctgcaacct
GAA
FSGSGSGTDYTLTI SSLQ
P E
241
GATITTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGřTGGACGTTCGGTGGA t5GC
DFATYYCQQWSGNPWTFG
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Τ K V Ε I K
-54CZ 303450 B6
G. hAQC2 lehký řetězec h2 (pAND120) (sekv. id. č. 50 a 51)
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC qivltqspsslsasvgdr
V T atcacatgcagtgccagctcaagtgtaaatcacatgttctggtatcagcagaagccc
GGG
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCrGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGC dfatyycqqwsgnpwtfg
G G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Τ Κ V Ε I K
-55CZ 303450 B6
H. hAQC2 lehký řetězec cl (pAND122) (sekv. id. č.: 52 a 70)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIQLTQSPSSLSAfiVGDR
V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GCG
ITCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
A&AGCCCCCAAACCCTQGATTTATCTCACATCC&ACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKFWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
PSG SGSGTDYTLTI SSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCÍGGTCAG
GGC dfatyycqqwsgnpwtfg Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Γ K V E I K
-56CZ 303450 B6
I. hAQC2 lehký řetězec c2 (pAND123) (sekv. č. 53 a 54)
CAAATTCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
QIQLTQSPS SLSASVGDR
V T atcacatgcagtgccagctcaagtgtaaatcacatgttctggtatcagcagaagccc
GGG
X TCSASSSVNHMFWYQQK
P G
121
AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKLLIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTDYTLTISSLQ
P E
241
GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQWSGNPWTFG
Q G
301 ACTAAGGTGGAGATCAAA Τ K V E X K
-57CZ 303450 B6
J. chAQC2 neblokovaný lehký řetězec (pAND098) (sekv. id. č. 55 a 56)
GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGGGAGAAGGTC
ACC
BXVLTQFPALMSASPGEK V T
AJGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCA
AAA
MTCSASSSVNHMFWYQQK P K
121
TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATC^AACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCT
CGC
SSPKPWIY TfíWLASGVP
A R
181
TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCT
GAA
FSGSGSGTSYSLTISSME
A E
241 gatgctgccacttattactgccagcagtggagtggtaacccgtggacgttcggtgga
GGC
DAATYYCQQWSGNFWTFG G G
301 ACCAAGCTGGAGATCAAA Τ K L Ε I K
-58CZ 303450 B6
K. huAQC2 neblokovaný lehký řetězec cl (pANDl50) (sekv. id. č. 57 a 58)
GATATCCAGCTCACCCA-GTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGGGGACAGAGTC
ACC
DIQLTQSPS SLSASVGDR V T
ATCACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATCACATGTTCTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGG
ITCSASSSVKHMFWYQQK
P G
121
AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCA
CGC
KAPKPWIYLTSNLASGVP
S R
181
TTCAGTGGCAGTC^GTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAACCT
GAA
FSGSGSGTD YTLTISSLQ
P E
241
GATrTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGACGTTCGGTCAG
GGC
DFATYYCQQWSGNPHTFG Q G
301 actaaggtggagatcaaa
T K V Ε I K
-59 CZ 303450 B6
Příklad 22
Tento příklad popisuje charakterizaci různých AQC2 protilátek podle vynálezu.
Test vazby α 1 I domény na pevné fázi μΐ fúzního proteinu „al I domény - GST” o koncentraci 10 pg/ml bylo naneseno na polystyrénové 96jamkové destičky CORNING COSTAR EASY WASH (Gotwalds et al., Biochemistry, 38, 8280-8, 1999). Po inkubaci 16 hodin ve 4 °C byly destičky promyty čtyřikrát 350 μΐ ío 0,1 % Tween-20 v PBS v promývačce destiček. Destička byla blokována nanesením 180 μΐ 3%
BSA v TBS a inkubací 60 minut v 25 °C, a pak promyta jako výše. Ředění protilátek (50 μΙ/jamka) v TBS obsahujícím l mg/ml BSA (testový pufr) byla připravena na 96jamkových destičkách s kulatým dnem, přenesena na destičku potaženou al I doménou a inkubována po dobu 60 minut ve 25 °C. Po posledním promytí bylo přidáno 100 μΙ/jamka TMB činidla (Pierce),
Po 10 minutách bylo přidáno 100 μΐ 1 M kyseliny sírové a absorbance ve 450 nm byla odečtena na UV-VIS spektrofotometru pro 96jamkové destičky.
Elektrochemiluminescenční testy na vazbu αϊβΐ integrinu nebo al I domény ke kolagenu.
Tosyl-aktivované perličky DYNABEADS M-280 (Dynal, INC.) byly potaženy kolagenem typu
IV (Sigma) v koncentraci 100pg/l podle instrukce výrobce. Buněčné lyzáty z αl-100μg/ml podle instrukce výrobce. Buněční lyzáty z αΐ-transfekovaných buněk K562 byly připraveny následujícím způsobem: Buňky byly sklizeny centrifugací, re suspendovány na koncentraci ' 108 buněk/ml v lyzačním pufru obsahujícím 25 mM Tris, pH 7,4, 1 % NP-40, 1 mM CaCI2,
1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 2% BSA a 1 mM PMSF, a byly inkubovány ve 4 °C po dobu minut. Buněčné zbytky (debris) byly odstraněny centrifugací v 12,00 rpm po dobu 30 minut a vzniklý supematant byl použit v následujícím experimentu. Anti-βΐ aktivující protilátky TS2/16 a polyklonální anti-GST protilátka (Pharmacia) byly značeny TAG-NHS esterem (IGEN International Inc., Gaithersburg, MD) podle instrukce výrobce. Značené protilátky byly purifiko30 vány gelovou filtrační chromatografií na SEPHADEC G25M (Pharmacia).
Pro uskutečnění vazebného testu byly perličky potažené kolagenem (1 mg/ml) byly blokovány po dobu 5 minut 8% plazmou laboratorního potkana kmene Lewis v testovém pufru obsahujícím 50 mM HEPES, PH 7,5, 150mM NaCI a 0,1% Triton X-100. Pro vazebný test αϊβΐ bylo sériové ředění protilátek inkubováno s 10μg perliček, buněčným lyzátem připraveným z 105 αΐ-transfekovaných buněk K562 (viz výše) a 0,1 g/ml TAG-TS2/16 v testovém pufru obsahujícím 1 mMMnCl2. Pro vazebný test al I domény byly protilátky inkubovány s 10 μg perliček, 0,1 g/ml fúzního proteinu al domény-GST a 1 μg/ml TAG-anti-GST v testovém pufru obsahujícím 1 mM MnCl2. Po jedné až dvou hodinách třepání při teplotě místnosti, bylo přidáno 200 μΐ testového pufru a vzorky byly čteny na detektoru elektrochemiluminiscence ORIGEN1.5 (IGEN). Grafy výsledků jsou prezentovány s uvedením arbitrárních jednotek elektrochemiluminescence (ECL) na ose x.
Kom pěti ční test s b i ot i nýtovaným mAQC2
96jamková destička byla potažena 50 μΐ fúzního proteinu al I doména-GST a blokován s 3% BSA v TBS, jak již bylo popsáno výše. Ředění protilátek (60 μΙ/jamka) v testovém pufru bylo připraveno na 96jamkových destičkách s kulatým dnem a 60 μΐ biotinylované myší AQC2 ředěné na 0,1 μ/rní v testovém pufru bylo přidáno. 50 μΐ z každé jamky bylo přeneseno na potaženou destičku a inkubováno po dobu 3 hodin ve 25 °C. Destička pak byla promyta, jak bylo uvedeno výše, a bylo přidáno 50 μΐ EXTRAVIDINU konjugovaného s peroxidázou (Sigma) v koncentraci g/ml a destička byla inkubována další 2 hodiny ve 25 °C. Po posledním promytí bylo přidáno
-60CZ 303450 B6
TMB činidlo (Pierce) 100 μΙ/jamka. Po 10 minutách bylo přidáno 100 μΐ 1 M kyseliny sírové a absorbance ve 450 nm byla odečtena na UVVÍs spektrofotometru pro 96 jamkové destičky.
Experimentální výsledky
Experimentální výsledky jsou ukázány na obr. 16A D a v tabulce 3. Byla určena schopnost mAQC2, chAQC2, hAQC2 a hAQCS4 (tj. huAQC2-c4, lišící se od hAQC2 pouze v tom, že zbytek 1 lehkého řetězce hAQC2‘ (je D místo Q) (1) vázat se K562 buňky transfekované humánní al (pomocí FACS), (2) vázat se na mobilizovanou al-I doménu (pomocí ELISA), (3) io soutěžit s mAQC2 o vazbu k al-I doméně (pomocí ELISA), (4) blokovat vazbu a-I domény ke kolagenu (pomocí elektrochemiluminesceněního testu) nebo (5) blokovat vazbu integrinu αϊβΐ ke kolagenu (pomocí elektrochemiluminesceněního testu). Výsledky jsou ukázány na obr. 16A-D a vypočtené hodnoty IC50 (pro inhibici) nebo EC50 (pro vazbu) jsou uvedeny v tabulce 3.
V každém, test každá z forem humanizované AQC2 projevila podobnou schopnost vázat buďto 15 VLA1 (nebo al doménu) nebo blokovat vazbu ke kolagenu (je třeba upozornit, že na panelu C pozorované rozdíly v intenzitě mezi mAQC2 a humanizovanými formami pocházející z toho, že byla použita sekundární protilátka anti-myší-IgG namísto anti-humánní-IgG).
Tabulka 3
Shrnutí výsledků testů (všechny hodnoty uvedené v mM)
Protilátka FACS (EC50) VLA1 Inhibice (IC50) all Inhibice (IC50) ELISA (EC50) Kompetice s biotinAQC2 (IC50)
mAQC2 neurčeno 0,0726 (±0,014) 0,029 (±0,011) 0,061 (±0,015) 38 (±8,7)
Chiméra 0,25 0,071 (±0,002) 0,027 (±0,007) 0,176 (+0,058) 30 (±6,9)
hAQC2 0,29 0,129 (±0,005) 0,035 (±0,005) 0,190 (±0,010) 65 (±2,2)
hAQC2' 0,43 0,125 (±0,013) 0,037 (±0,001) 0,313 (±0,072) 69 (±25,7)
Jako další původci testovali, zda změny určitých konzervativních zbytků v úsecích CDR mohou zachovávat VLA-1 vazebnou aktivitu hAQC2. DNA konstrukty kódující varianty hAQC2 s následujícími mutacemi byly vytvořeny místně cílenou mutagenezí: (1) G55S v CDR2 těžkého řetězce, (2) S24N v CDR1 lehkého řetězce (vnesení obsazeného místa N-vázané glykosylace), (3) G92S v CDR3 lehkého řetězce (4) kombinace (1) a (2), a (5) kombinace (1) a (3). DNA konstrukty kódující jak těžký tak lehký řetězec pak byly kotransfekovány do buněk 293-EBNA a kondicionovaná média z transfektant byla testována na expresi protilátku užitím analýzy Western blot a ELISA. Výsledky ukázaly, že hAQC2 varianty byly exprimovány stejně účinně jako příbuzný hAQC2. FAC analýza s použitím VLA-1- exprimuj ících buněk K562 dále ukázala, že VLA-1- vazebné aktivity těchto variant byly podobné samotné hAQC2. Lze tedy shrnout, že substituce aminokyselin nezměnila VLA-1 vazebnou aktivitu hQAC2. A opravdu, rentgenostruktumí analýzy krystalů RAH/HAQC2 Fab komplexu (viz výše) ukázala, že S24 aG92 lehkého řetězce a G55 těžkého řetězce nejsou lokalizovány ve vazebné kapse, která je v kontaktu s a 1-1 doménou.
-61 CZ 303450 B6
Příklad 23
Efektorové funkce imunoglobulin spojují imunoglobulinovou antigen-vazebnou aktivitu se zánětlivou, cytotoxickou a stimulační větví imunitního systému. Efektorové funkce mohou narušit bezpečnost a účinnost imunoglobulinového terapeutického produktu. Aby byly omezeny potenciální efektorové funkce hAQC2, byly vytvořeny mutace L234A a L235A na těžkém řetězci této protilátky, čímž byla připravena hsAQC2. Ze stejného důvodu byla vytvořena jednoduchá mutace N297Q v těžkém řetězci hAQC2, čímž byla připravena neglykosylovaná forma hAQC2, nazvaná haAQC2.
o
Mohou být provedeny studie srovnávající jejich účinnost, reziduální efektorové fiinkce, stabilitu a imunogenicitu vzhledem k hAQC2. Pokud není uvedeno jinak, poziční čísla aminokyselinových zbytků v konstantních úsecích použitá v tomto textu jsou v souladu s EU konvencí číslování.
Polypeptidová sekvence těžkého řetězce haAQC2 je následující (plazmid: pANDlól):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA
PGKGLEWVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT
AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYQST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGREY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (sekv. id. č. 5)
-62 CZ 303450 B6
Polypeptidová sekvence těžkého řetězce hsAQC2 je následující (plazmid: pAND171):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWRQA PGKGL5WVAT
ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCTRGFG
101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT
AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSW SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSWTVP
SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSOT KVDKKVEPKS CDKOTTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVXFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA
KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (sekv. id. č. 6)
Příklad 24
Tento příklad popisuje způsob určení krystalové struktury komplexu chimérické „potkaní/humánní“ al-I domény al integrinu a Fab fragmentu hAQC2.
io
Příprava proteinového komplexu
Fab fragment hAQC2 byl připraven z protilátky hAQC2s použitím obměněného postupu podle soupravy IMUNOPURE(R) Fáb Preparation Kit (katalog, ě. 44885, Pierce, Rockford, IL).
Intaktní hAQC2 protilátka byla koncentrována na 12 mg/ml v pufru obsahujícím 20 mM fosfát, lOmM EDTA a 25 mM cystein (pH 7,0). ímobilizovaný papain byl přidán v poměru enzym k substrátu 1:50 a štěpení bylo ponecháno probíhat přes noc ve 37 °C, ímobilizovaný papain byl odstraněn a surový naštěpen materiál byl dialyzován proti pufru 20 mM octanu sodného (pH 4,5).
Fab fragment byl separován od reziduální intaktní protilátky, dimemího Fab fragmentu a FC fragmentu kotiontovou výměnnou chromatografií s použitím S-kolony (Poros HS/M, PERSEPTIVE Biosystems, katalog, č, PO42M26) s pozvolným solným gradientem. Fab fragment pak byl dialyzován do 0,1 M Hepes pufru (pH 8,0).
Chimérická al-I doména, která byla použita v předkládaném vynálezu, je konstrukt chimérické potkan/humánní I domény (mutanta RAH) obsahující zbytky Thr145 až Phe336 z řetězce al integrinu laboratorní potkan, kde zbytky Gly217, Arg218, Gln219 a Leu222 (krystalové číslování) byly nahrazeny odpovídajícími humánními zbytky Val, Gin, Arg a Arg, v uvedeném
-63CZ 303450 B6 pořadí, aby se obnovila vazby protilátky, aminokyselinové sekvence chimérické RAH, al-I domény laboratorního potkana a humánní al-I domény jsou uvedeny níže sekv. id. č. 59, 60 a 61 vdaném pořadí. Rekombinantní al-I doména byla exprimována v E.coli jako GST-fuzní protein. RAH a 1-1 doména byla štěpena trombinem a purifikována z klonu Pichia pastoris, jak bylo popsáno dříve (Gotwals et al., 1999, Biochemístry 38: 8280-8288).
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKtVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (Sekv. id. č. 59)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY 191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIGRQG GLQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (Sekv. id. č. 60)
145 TQLDIV
151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY
191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTALGI
231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI
271 QDCEDENIQR FSIAILGSYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP
311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF (Sekv. id. č. 61)
Fab fragment hAQC2 byl smíchán s nadbytkem chimérické al-I domény a inkubován ve 37 °C 15 po dobu 15 minut. Saturované al/FAB komplexy byly odděleny od al-I domény nezahrnuté v komplexech vylučování chromatografií s použitím kolony S200 Sephakryl (Pharmacia, Gibco). komplex byl dále koncentrován na 11 mg/ml v pufru obsahujícím 20 mM Tris (pH 7,4),
150 NaCl, 1 mM MnCl2, 5 mM β-merkaptoethanol.
Příprava krystalů
Krystalizační podmínky byly zjištěny s použitím soupravy CRYSTAL SCREEN™ KITs od firmy
Hampton Reseach (Laguna Niguel, CA). Krystaly komplexu popsaného výše byly pěstovány ve
20° metodou difúze par s použitím stejného množství roztoku proteinového komplexu a 20 až
30% roztoku PEG 1500.
-64CZ 303450 B6
Typicky 2 μΐ proteinového komplexu bylo přidáno k 2 μΐ jamkového roztoku, čímž se získaly kapky o objemu 4 μΐ. Krystaly rostly dva až sedm dnů jako šestiúhelníkové pruty s rozměry 0,8 x 0,05 x 0,05 mm3. Přítomnost z al-I domény a hAQC2 Fab fragmentu byly potvrzeny SDS-PAGE analýzou rozpuštěných krystalů. Aby se zredukovalo nevyhnutelné poškození zářením v průběhu sběru dat, data difrakce rentgenového záření byla měřena přibližně při 100 K. Pro přípravu krystalů pro sběr dat v takové nízké teplotě, krystaly byly postupně ekvilibrovány s kryoprotektivním roztokem, obsahujícím 25 % PEG 400 A 30 % peg 1500 a velmi rychle ochlazeny v kapalném dusíku.
ío Určení struktury
Nativní data rentgenové difrakce pri rozlišení 2,8 A byla získána z jediného krystalu přibližně ve 100 K pomocí nabitého spřaženého detektoru A DSC Quantum 4 v paprskové dráze Χ4Α synchrotronu v National Synchrotron Light Source (NSLS) Brookhaven National Laboratory (BLN). Data byla zpracována s použitím počítačových programů DENZO a SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997, Methods in Enzymol. 276: 307-326). Krystaly patřily do prostorové skupiny P6j nebo jejího enantiomeru P65, s rozměry jednotkové buňky a = b = 255,09 A, c=38,64 Á. Soubor dat byl z 96,6 % kompletní a měl hodnotu „R-merge“ 8,3%. Matthewsův koeficient (Matthews, 1968, J. Mol. Biol. 33: 491—497) byl 2,59 A3 Da 1 s obsahem rozpouštědla
52,1 %, což ukazovalo, že se jedná o dva komplexy v asymetrické jednotce. Tyto dva komplexy v asymetrické jednotce byly ve vztahu nekrystalografické dvojité symetrie. Statistika datové je ukázána v tabulce 4.
Vyhledávání molekulárních náhrad bylo prováděno s programem AMoRe (Navaza, 1994, Acta
Cyst. A50: 157-163) z programového balíku CCP4 (Collaborative Computational Project No. 4. The CCP4 Suitě: Programs for protein Crystalography. 1994, Acta Cryst. D50: 760-763) a molekulární grafické manipulace byly prováděny pomocí programu QUANTA. Jediná al-I doména ze struktury al-I domény z αϊβΐ integrinu laboratorního potkana (Protein Data bank (PDB) přístupové číslo lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379-385) byla použita jako model nebo sonda pro rotační a trans lační vyhledávání. Vyhledávání trans lační funkcí ukázalo, že
1. a 9. nejvyšší vrcholy rotační funkce odpovídaly správném řešení pro dvě al-I domény, v asymetrické jednotce (korelační koeficient (cc) = 21,1%, R = 53,1 %), a že prostorová skupina byla P65. Následně bylo proveden vyhledávání pro hAQC2 Fab fragmenty, přičemž bylo zachováno řešení pro I doménu a byl použit model Fv domény z hAQC2 Fab jako vyhledávací sonda. Jasné řešení bylo nalezeno pro jednu ze dvou Fv domén (cc = 22,1%, R = 52,6 %), ale druhá Fv nemohla být lokalizována. Poloha druhé Fv byla určena pomocí nekrystalografické dvojité symetrie. Upřesnění tuhých těles dvou I domén a dvou Fv domén redukovalo R-faktor na
43.6 % (R-free = 42,7 %). Mapa elektronové hustoty 2Fo-Fc ukázala jasnou elektronovou hustotu pro konstantní doménu (Fconst) prvního Fab fragmentu, ale žádnou hustotu pro Fconst doménu druhého Fah fragmentu. Model Fconst domény prvního Fab byl ručně „napasován“ na pozorovanou elektronovou hustotu. Po zpřesnění tuhého tělesa pomocí programu programem CNX (Accelrys lne., San Diego, CAt) 2000, Brunger, 1998, Acta Cryst. D54: 905-921), s použitím dat v rozlišení 500-2,8 A optimalizace poloha všech domén snížila R-faktor na
39.7 % (R-free = 38,9%).
Všechny následné zpresňovací kroky byly prováděny programem CNX. Pro redukci nejistot modelu byly užity parciální modely pro výpočty 2Fo-Fc mapy a zpřesňování modelu. Výchozí parciální model byl podroben simulovanému nasednutí a seskupenému B-faktorovému zpřesnění s omezením nekrystalografické symetrie. Faktory „R-working“ a „R-free“ se snížily na 28,3 % a 32,9 %, v daném pořadí. Následovalo několik cyklů sestávajících z iterační výstavby modelu, pozičního upřesnění s maximální pravděpodobností a upřesnění B-faktoru. Pouze upřesnění modelu, která vedla k poklesu faktoru R-free byla přijata. Po vybudování kompletního modelu byla použita oprava na rozpouštědlo. Faktory R-working a R-free konečného modelu jsou
21,3 % a 27,2 %, v daném pořadí pro data (F > 2σ) při rozlišení 500-2,8 A.
-65 CZ 303450 B6
Výsledná mapa elektronové hustoty 2Fo-Fc je dobré kvality pro většinu komplexu s výjimkou aminokyselinových zbytků 288 až 295 zjednoho fragmentu I doména (molekula A na obr. 19), které jsou spojeny se slabou elektronovou hustotou a nebyly zahrnuty v modelu. Kromě toho, celá konstantní doména jednoho Fab fragmentu nemá žádnou viditelnou elektronovou hustotu, což ukazuje, že jde o poruchu. To je zřejmě důsledek nepřítomnosti krystalových kontaktů pro konstantní doménu Fab fragmentu způsobené její polohou ve velkém kanálu rozpouštědlovém kanálu. Tato doména také nebyla zahrnuta v konečném modelu, který se skládá z 1030 aminokyselina zbytků, vytvářejících 6 polypeptidových řetězců, a 2 manganových iontů. Hodnota r. m. io s. odchylky poloh mezi rovnocennými zbytky v komplexů v asymetrické jednotce je malá (0,37 Á pro 1660 ekvivalentních atomů hlavního řetězce).
Stereochemické statistické hodnoty byly vypočteny programy PROCHECK (Laskowski et al., 1993, J. Appl. Cryst. 26: 283-291, Morris et al„ 1992, Proteins 12: 435-364) a CNX. Vodíkové is vazby (< 3,6 Á) byly zjištěny programem CONTACT (Tadeusz Skarzynski, Imperiál College,
London, 1.12.88, Collaborative Computational Project 4. CCP4 Suitě: Programs for Protein
Crystalography. 1994, Acta Cryst. D50, 760-763)- Všechny zbytky jiné než glycin (kromě zbytku Thr50 v L řetězci, kteiý bude ještě diskutován dále) jsou v povoleném úseku Ramachandranova diagramu a 86 % zbytků leží v nej výhodnějších úsecích. Průměrný B-faktor atomů hlavního řetězce je 38,5 Á2. Data z krystalografické analýzy jsou uvedena v tabulce 4.
Tabulka 4
Shrnutí statistických údajů a krystalografické analýzy
Sběr dat
Rozměry buňky, a, b, c (Á) Prostorová skupina Rozlišení (Á)
Unikátní odrazy Úplnost (%)
Průměr I/s R-merge* (%)
Model
Počet atomů jiných než H Počet protein, zbytků Obsah asymetrické jednotky Průměrný B-faktor (Á2)
Zpřesňování
Použitý rozsah rozlišení(F R-faktor (R-working) (%) R-free++ (%)
255,09, 255,09, 38,64
P65
500 - 2,8 <2,9-2,8)+
35275
96,6 (87,7)+
11,92 (2,29) +
8,3 (30,9)*
7950
1030 domény I, 1 fragment Fab, doména Fv
38,5
2o) 500-2,8
21,3 27,2
-66CZ 303450 B6
Stechiometrie
RMS odchylky délky vazeb (A) 0,007
Úhly (Q) 1,43
Rmerge - ΣηΣ± |Ihi-Ih | /Shi Ihi * Hodnoty pro obal při nejvyšším rozlišení jsou uvedeny v závorce.
++ 8 % dat bylo přiděleno pro výpočet faktoru R-free.
Příklad 25
Tento příklad popisuje krystalovou strukturu komplexu chimérické potkaní/humánní al-I domény alpl integrinu a Fab fragmentu hAQC2.
io
Architektura krystalu
Krystalová struktura komplexu chimérické potkan í/humánní al-I domény αϊβΐ integrinu a Fab fragmentu hAQC2 má protáhlý tvar (viz obr. 20). Rozměry komplexu jsou 100 A x 50 A x 35 A.
Fab fragment projevuje svinutí molekuly typické pro imunoglobuliny. Lehký řetězec a těžký řetězec Fab fragmentu vytvářejí dva široké listy antiparalelních β řetězců, které jsou vzájemně těsně sbaleny a vytvářejí tak kostru pro kličky úseků určujících komplementaritu (CDR), které vyčnívají se sbalených listů. Jak lehký tak i těžký řetězec obsahují tři CDR kličky, přičemž kličky lehkého řetězce jsou označeny LI, L2 a L3, zatímco kličky těžkého řetězce jsou označeny Hl, H2 a H3. Kličky úseků určujících komplementaritu (CDR) odpovídají kanonické struktuře 1 pro kličky LI, L2 a L3 lehkého řetězce a pro kličky Hl a H2 těžkého řetězce (Chothia et al., 1989, Nátuře 342: 877-883). Klička H3 těžkého řetězce má kompaktní konformaci β-vlásenky, která je stabilizovaná vnitřními vodíkovými vazbami, a také dvěma aromatickými zbytky (Tyr 104 a Phe 105), které jsou umístěny proti lehkému řetězci. Zbytek Thr50 z L2 zaujímá úhly dvojstěnu hlavního řetězce, které spadají do zakázaných úseků Ramachadranova diagramu, stejné pozorování pro odpovídající zbytky bylo učiněno i u jiných protilátek (Muller et al., 1998, Stratagene 6, pp. 1153-11567), což ukazuje, že se jedná o přirozenou vlastnost L2 smyčky.
al-I doména podle předkládaného vynálezu má strukturu velmi podobnou al-I doméně nevázané v komplexu (PDB přístupové číslo Ick4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452: 379-385, PDB přístupové číslo lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906-24913). Struktura I domény má „dinukleotid-vázající“ nebo „Rossmanův“ záhyb (Rao & Rossman, 1973, J. Mol. Biol. 76: 241-256), ve kterém jsou centrální list pěti paralelních β řetězců a jeden malý antipara35 lelní řetězec obklopeny na obou stranách celkem sedmi α-šroubovicemi. Šest β-řetězců struktury podle předkládaného vynálezu je označováno βΑ, βΒ, β^ βϋ, βΕ a βΡ a sedm ,α-šroubovic je označováno al, a2, a3, a4, a5, a6 a a7.
V I doméně existují tři charakteristické strukturní znaky. Prvním charakteristickým znakem je přítomnost vložené malé šroubovce v βΕ—a6-kličce. nazývané C šroubovice. Většina kličky C spirály molekuly A (viz obr. 19) podle předkládaného vynálezu je spojena se slabou elektronovou hustotou, která svědčí o poruše. Zdá se, že je to důsledek nepřítomnosti krystalových kontaktů nebo kontaktů s Fab, které by jinak kličku stabilizovaly. Nicméně, stejná klička v molekule B (viz obr. 19) podle předkládaného vynálezu má jasně definovanou elektronovou hustotu a byla zahrnuta v modelu. Druhým charakteristickým znakem al-I domény je MIDAS neboli adhezní místo závislé na iontu kovu (Metal Ion Dependent-Adhesion-Site), kde kovové ionty a ligandy jsou zapojeny do vazby I doméně. Pět klíčových zbytků, které vytvářejí část MIDAS, je
-67 CZ 303450 B6 označováno jako motiv „DxSxS-T-D“. Tyto zbytky, které jsou naprosto konzervativní mezi I doménami, koordinují kovový iont (Gotwaís et al., 1999, Biochemistry 38: 8280-8288). Krystaly podle předkládaného vynálezu byly pěstovány v přítomnosti manganu a MIDAS místo I domény v této struktuře obsahuje, jak bylo pozorováno, kovový ion Mn+2 . Ion je přímo koordinován postranními řetězci zbytků Serl56, Ser 158 aThr224. Mapa 2Fo-Fc elektronové hustoty neukazuje, žádný důkaz toho, že MIDAS zbytky Asp 154 a Asp257 vytvářejí vodou zprostředkovanou nepřímou koordinaci kovového iontu (obr. 20). Nicméně, zjevná nepřítomnost molekuly vody by mohla být důsledkem omezeného rozlišení (2,8 Á) mapy elektronové hustoty. Třetím znakem I domény je to, že všechny určené struktury I domény patří k jedné ze dvou konformací nazvaných io „otevřená“ a „uzavřená“. Rozdíly mezi otevřenou a uzavřenou konformací zahrnují odlišný způsob koordinace kovového iontu a významný (přibližně 10 A) polohový posun C-koncové šroubovice I domény. I doména v komplexu podle předkládaného vynálezu je v uzavřené konformací.
Ve struktuře komplexu podle předkládaného vynálezu se Fab fragment váže se ke svému epitopu na předním horní povrchu I domény se „stopou“ 35 A x 30 A. Celkový obsazená plocha rozhraní protilátka-antigen je 1534 A2, což je typické i pro ostatní komplexy protilátka-antigen (Davies et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7-12, Jones & Thomton, 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 13-20). Povrch má z 25 % hydrofobní a ze 75 % hydrofilní charakter. Těžký řetězec přispívá 65 % k ploše obsazeného povrchu v komplexu, zatímco zbývajícími 35 % přispívá lehký řetězec. Protilátkový epitop sestává ze zbytků lokalizovaných ve čtyřech kličkách I domény (Emsley et al., 2000, Cell 101: 47-56). Tři z těchto kliček vytvářejí MIDAS místo: klička 1 (βΑ-α.1), která obsahuje konzervativní DXSXS sekvenci, klička 2 (α3-α4), která obsahuje MIDAS Thr224, a klička 3 (βϋ-α5), která obsahuje MIDAS zbytek Asp257. Čtvrtá klička je C-šroubovicová klička a je zapojena pouze do minoritních kontaktů.
Ústředním znakem interakce antigen-protilátka je koordinace kovového iontu v MIDAS místě AsplOl z CDR H3 protilátky (obr. 20). Vzdálenost mezi iontem a z AsplOl je 2,4 Á. Kromě toho atom 062 z AsplOl interaguje sHis261 zl domény. Je zajímavé, že CDR H3 obsahuje několik glycinových zbytků v sousedství AsplOl (sekvence GFGDGGY) (sekv. id. č. 62), pravděpodobně proto, aby byla umožněna dostatečná flexibilita CDR kličky a tak byla možná správná koordinace kovového iontu. CDR H3 sekvence je v podstatě neměnná v monoklonálních protilátkách, které byly připraveny proti stejnému antigenu a bylo o nich zjištěno, že patří do stejné třídy. Většina proti látkových zbytků, které se účastní kontaktu protilátka-antigen, je lokalizováno v kličkách L3, Hl, H2 a H3 CDR. Zdá se, že několik zbjlků z kličky LI (Asn30) a L2 (Tyr48) vytváří méně významné van der Waalsovy vazby. L3 primárně přispívá ke kontaktům prostřednictvím dvou velkých hydrofobních zbytků, Trp90 a Trp95. Kromě toho Asn93 z kličky L3 tvoří vodíkové vazby s Gln223 z I domény. Postranní řetězce His56 a Tyr58 z kličky H2 tvoří vodíkové vazby s atomy hlavního řetězce kličky 2 z I domény. Arg31 z kličky Hl je v kontaktu s Arg291 kličky 4 z I domény. Arg222 kličky 2 z I domény je vmezeřen mezi několik protilátko40 vých zbytků včetně Tyr58, Trp95 a Asn93. To je jediný zbytek ze čtyř mutovaných v RAH I doméně, který je zapojen do kontaktů s Fab. Je to proto pravděpodobně jediný zbytek zodpovědný za obnovení vazby protilátky po mutagenezi.
Srovnání krystalové soustavy komplexu chimérické potkan í/humán ní al-I domény a hAQC2
Fab fragmentu s jinými strukturami l domény
Chimérická al-I doména RAH má čtyři sekvenční v al-I doméně laboratorního potkana (zbytky ze sekvence laboratorní potkana: 217G, 218R, 219Q a 222L), osm sekvenčních rozdílů v humánní al-I doméně (zbytky z humánní sekvence: 163D, 166T, 214K, 264H, 268K, 288S, 3221 a
380T) a deset sekvenčních rozdílů v klonu použitém v krystalové struktuře použité ke studiu humánní al-I domény (zbytky ze sekvence klonu: 163D, 166T, 174E, 214K, 2301, 264H, 268K,
288S, 3221 a 380T). V krystalové struktuře al-I domény αϊβΐ laboratorního potkana bez navázaného ligandu (PDB přístupový kód lck4, Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), al-I doména neobsahuje žádné navázané kovové ionty a zaujímá „uzavřenou“ konformací.
-68CZ 303450 B6
V krystalové struktuře humánní al-l domény bez navázaného ligandu (přístupový kód lqc5, Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 24906-24913), al-I doména obsahuje vázaný Mg 2 a podobně zaujímá uzavřenou konformaci. Superimpozice těchto dvou struktur s komplexem chimérické al-I domény ukazuje, že jsou zde pouze málo významné konformační změny při vazbě protilátky hAQC2. Hodnota r. m. s. polohové odchylky mezi chimérickou al-l doménou a al-I doménou laboratorního potkana je 1,04 Á pro všech 768 atomů hlavního řetězce. Hodnota r. m. s. polohové odchylky mezi humánní a chimérickou al-I doménou je 0,69 A pro všech 764 atomů hlavního řetězce. Největší rozdíly (pár humánní a chimérické al-I domény) byl pozorován v kličce 1 (r. m. s. odchylky 1,24 A pro atomy hlavního řetězce zbytků 154 až 161) io a kličce 4 (C šroubovicová klička) al-I domény (r. m. s, odchylky 1,55 A pro atomy hlavního řetězce zbytků 288 až 296). Nicméně tyto rozdíly mohou být přesněji popsány jako posuny celých elementů sekundární struktury spíše než komplexní konformační změny. Zdá se, že jsou v běžném rozsahu konformační flexibility proteinů. Hodnota r. m. s. polohové odchylky mezi humánní a chimérickou al-I doménou pro atomy hlavní řetězec aminokyselinových zbytků
Glul92, Gln218, Arg219, Gly220 a Gly221 (krystalové číslování) je 0,33 Á. Hodnota r. m. s. polohové odchylka mezi potkaní a chimérickou al-I doménou pro atomy hlavního řetězce aminokyselinových zbytků Asp 154, Serl56, Asn 157, Ser 158, Tyr 160, Glu 192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 a Leu294 (krystalová číslování) je 0,97 Á.
I doména zachovává konformaci „zavřené“ I domény, která byla pozorována pouze pro I domény bez ligandu krystalizované bez přítomnosti ligandu nebo pseudoligandů vázaných k místu MIDAS. Hodnota r. m. s. polohové odchylka C-koncové šroubovice humánní a chimérické I domény (vypočtená pro atomy hlavního řetězce zbytků 321 až 335) je 0,64 A. Simulovaná mapa zanedbávající nasednutí vypočtená pro konečný zpřesněný model jednoznačně potvrdila, že poloha C-koncové šroubovice a přilehlého strukturního elementu je v souladu s uzavřenou konformaci.
Aby bylo možné zkoumat účinky vazby ligandu na způsob koordinace kovového iontu, struktura podle předkládaného vynálezu byla superponována se strukturou a2-I domény bez navázaného ligandu (PDB přístupový kód laox, Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517) a a2-I domény v komplexu s kolagenovým peptidem (PDB přístup. Kód ldzi, Emsley et al., 2000, Cell 101: 47-56). Koordinace kovového iontu AsplOl zprotilátky je pozoruhodně podobná koordinaci kovového iontu a2-I domény glutamovou kyselinou z kolagenového peptid.
Dalším znakem, který je konzervativní, je současná interakce kyselé skupiny sHis261 (His258 v a2-I doméně). Všechny MIDAS zbytky z komplexu I doména-Fab, kromě Serl56 a Serl58, zaujímají konformaci velmi podobnou té, která je pozorovna u I domény bez navázaného ligandu. Na rozdíl od toho postranní řetězce Serl56 a Serl58, a také kov, zaujímají konformaci podobnou konformaci I domény s ligandem. Je tedy jasné, že koordinace kovového iontu AsplOl neumožňuje iontu zachovat polohu a koordinační vzdálenosti, který jsou pozorovány ve stavu bez ligandu. Takže kovový ion není přímo koordinován Asp257, což je fakt, který dovoluje, že si ion zachovává vysokou elektrofilnost.
Biologické důsledky
Podle předkládaného vynálezu neexistuje žádná přímá koordinace kovu Asp257, která by mohla umožňovat vysokou afinitu vazby tím, že by snížila energetickou bariéru mezi zavřeno (ligand není vázán) a otevřenou (ligand je navázán) konformaci. Nicméně, koordinace kovu asparagovou kyselinou protilátky není dostatečná ktomu, aby indukovala otevřenou konformaci I domény podle předkládaného vynálezu. Struktura komplexu „I doména-Fab“ ukazuje, že je možné mít silnou vazbu k I doméně, která zaujímá uzavřenou konformaci, a že koordinace kovového iontu kyselým zbytkem z ligandu je nutná, nikoliv však postačující pro indukci změny konformace na otevřený stav. Očekává se, že navázání protilátky stabilizuje nízkoafinitní stav integrinu a brání tak signalizaci z vnějšku, která by doprovázela vazbu integrinu ke kolagenu.
-69CZ 303450 B6
Ačkoli byl předkládaný vynález popsán velmi podrobně formou příkladů výhodných provedení a ilustrativních příkladů pro účely jasnosti popisu, odborníkovi je zřejmé, že mohou být provedeny určité změny a modifikace, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky. Proto ani popis ani příklady by neměly být vyloženy tak, aby omezovaly rozsah vynálezu.
Seznam sekvencí
10 <160> <170> 70 Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 106
15 <212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
20 <400> 1
Gin Ile Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
1 5 10
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2 <211> 118 <212> PRT <213 > U mělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 2
Asp Val 1 Lys Val Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Lys Leu 20 Ala Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ser Phe Ser 30 Arg Tyr
-70CZ 303450 B6
Thr Met Ser Trp 35 Val Arg Gin Ile 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 213
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
<400> 3
Gin Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val· Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160
-71 CZ 303450 B6
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Ser
Ala
Phe
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 447
<212> PRT
5 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
io <400> 4
Glu 1 Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15
5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Léu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
-72CZ 303450 B6
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 190 Ser Ser
180 185
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
445
435 440
<210> 5
<211> 447
<212> PRT
5 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
io <400> 5
-73 CZ 303450 B6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val S^r His Glu Asp Pro 260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
-74CZ 303450 B6
Lys Thr 290 Lys Pro Arg Glu Glu 295 Gin Tyr Gin Ser Thr 300 Tyr Arg Val Val
Ser 305 Val Leu Thr Val Leu 310 His Gin Asp Trp Leu 315 Asn Gly Lys Glu Tyr 320
Lys Cys Lys Val Ser 325 Asn Lys Ala Leu Pro 330 Ala Pro Ile Glu Lys 335 Thr
Ile Ser Lys Ala 340 Lys Gly Gin Pro Arg 345 Glu Pro Gin Val Tyr 350 Thr Leu
Pro Pro Ser 355 Arg Asp Glu Leu Thr 360 Lys Asn Gin Val Ser 365 Leu Thr Cys
Leu Val 370 Lys Gly Phe Tyr Pro 375 Ser Asp Ile Ala Val 380 Glu Trp Glu Ser
Asn 385 Gly Gin Pro Glu Asn 390 Asn Tyr Lys Thr Thr 395 Pro Pro Val Leu Asp 400
Ser Asp Gly Ser Phe 405 Phe Leu Tyr Ser Lys 410 Leu Thr Val Asp Lys 415 Ser
Arg Trp Gin Gin 420 Gly Asn Val Phe Ser 425 Cys Ser Val Met His 430 Glu Ala
Leu His Asn 435 His Tyr Thr Gin Lys 440 Ser Leu Ser Leu Ser 445 Pro Gly
<210> 6 <211> 447 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 6
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr 50 Ile Ser Gly Gly Gly 55 His Thr Tyr Tyr Leu 60 Asp Ser Val Lys
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
90 95
-75CZ 303450 B6
Arg Gly Phe Gly 100 Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val 105 Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Giy Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lle Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lle Glu Lys Thr
325 330 335
Tle Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lle Ala ν^ι Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
-76CZ 303450 B6
Ser Asp Gly Ser Phe 405 Phe
Arg Trp Gin Gin Gly Asn
420
Leu Tyr Ser Lys 410
Val Phe Ser Cys 425
Leu Thr Val Asp Lys Ser 415
Ser Val Met His Glu Ala 430
Leu
Leu His
Asn His
Tyr Thr
Gin Lys Ser
435 440
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
caggatccgt cagccccaca tttcaa
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
tcctcgaggg cttgcagggc aaatat
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 9
caggatccgt cagtcctaca tttcaa
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 10
tcctcgagcg cttccaaagc gaatat
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 11
Ser Leu Ser Pro Gly 445 tgaggagacg gtgaccgtgg cccttggccc c
-77CZ 303450 B6
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 12
aggtsmarct gcagsagtcw gg
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 13
actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 14
actggatggt gggaagatgg a
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický peptid
<400> 15
Asp Val Lys Val Val Glu. Ser Gly Gly
1 5
<21O> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
-78CZ 303450 B6 <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický peptid <400> 16
Asp Val Lys Val Val Glu 5 1 5
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 17
gcaccaggtg cccactccga cgtcaaggtg gtggagtcag ggggaggctt agtg 54
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 18
ggaggcacca agctggagat ctaacgggct gatgctgc 38 <21O> 19 <211> 34 <212> DNA <213> U mělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 19 cataatgtcc aggggagaaa ttgttctcac ccag 34 <210> 20 <211> 93 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 20 ggtgcccact ccgacgtcca gctggtcgag tcagggggag gcttagtcca gcctggaggg 60 tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttc 93
-79CZ 303450 B6 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> U měl á sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 21 atgtcttggg ttcgccaggc tccggggaag gggctggagt gggtcgcaac c 51 <210> 22 <211> 93 <212> DNA <213> U měla sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 22 ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac accctgtacc tgcagatgaa cagtctgagg 60 M gccgaggaca cagccgtgta ttactgtaca aga 93 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 23 3θ tggggccaag gtaccctggt caccgtctcc tcaggtgag 39 <210> 24 <211> 51 <2I2> DNA <213> Uměla sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 24 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aggtatacta tgtcttgggt t 51 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
-80CZ 303450 B6 <400 25 gcaccaggtg cgcactccga ggtccagctg gtcgagtca <210 <211>
<212>
<213>
DNA
Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 26 gagtcagggg gaggct.taat ccagcctgga gggtccctg <210> 27 <211> 81 <212> DNA <213> Uměla sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer <400> 27 ctgtagggga cagagtcacc 60 81 caaattgttc tcacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt atcacatgca gtgccagctc a
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 28
ttctggtatc agcagaagcc cgggaaagcc cccaaaccct ggatt
<210> 29
<211> 105
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 29
gcttctggag tcccttcacg cttcagtggc agtgggtctg atcagcagcc tgcaacctga agattttgcc acttattact ggacagatta cactctcaca 60 gccag 105 <210> 30 <211> 33
-81 CZ 303450 B6
<212> <213> DNA Umělá sekvence
<220> 5 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 30
ggtggaggca ctaaggtgga gatctaacgg gct 33
<210> 31
io <211> <212> <213> 39 DNA Umělá sekvence
<220> 15 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 31
cccgggaaag cgcccaaact cctgatttat ctcacatcc 39
<21O> 32
20 <211> <212> <213> 51 DNA Umělá sekvence
<220> 25 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 32
gcctcagtca taatgtcccg gggacaaatt cagctcaccc agtctccatc c 51
<210> 33
30 <211> <212> <213> 51 DNA Umělá sekvence
<220> 35 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 33 ggtaacccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga tctaacgggc t 51
<210> 40 <211> <212> <213> 34 51 DNA Umělá sekvence
<220> 45 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
<400> 34
-82CZ 303450 B6 gcctcagtca taatgtcccg gggacaaatt cagctcaccc agtctccatc c
<210> 35
<211> 51
<212> DNA
5 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
10 <400> 35
ggtaacccgt ggacgttcgg tcagggcact aaggtggaga
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
15 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
20 <400> 36
gggaaagcac ccaaactctg gatctatctc acatccaac
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
25 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
30 <400> 37
aagcccggga aggcgcccaa acccctgatt tatctcacat
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
35 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický primer
40 <400> 38
gtcataatgt cccggggaga tatccagctc acccagtct
-83CZ 303450 B6 <210> 39 <21 ]> 354 <212> DNA <213 > U mě 1 á sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) io <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 39
gac gtc aag gtg Val gtg Val 5 gag tca ggg gga ggc tta gtg aag Lys cct Pro gga Gly 15 ggg Gly 48
Asp Val 1 Lys Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val
tcc ctg aaa ctc gcc tgt gca gcc tet gga ttc agt ttc agt aga tat 96
Ser Leu Lys Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag att ccg gag aag agg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ile Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr Tle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
caa atg age agt ctg agg tet gag gac aca gcc atg tat tac tgt aca 288
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt tt t gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
acg gtc acc gtc tcc tca 354
Thr Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 40
-84CZ 303450 B6
Asp 1 Val Lys Val Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Lys Leu 20 Ala Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ser Phe Ser 30 Arg Tyr
Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ile 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Val
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 41
<211> 354
5 <212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> CDS
10 <222> (1)-(354)
<220>
<223> Popis umělé sekv
15 <400> 41
-85CZ 303450 B6
gac Asp 1 gtc Val cag Gin ctg Leu gtc gag tea ggg gga ggc tta gtc cag cct gga Gly 15 ggg Gly
Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc agt ttc agt aga tat
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac a ca gcc gtg tat tac tgt aca
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tea
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
144
192
240
288
336
354
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
<400> 42
-86CZ 303450 B6
Asp Val Gin Leu 1 Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Tle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 356
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid
<400> 43
gag gtc cag ctg gtc gag tca ggg gga ggc tta atc cag cct gga ggg 4 8
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gin Pro Gly Gly
10 15
-87CZ 303450 B6
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca Ala gcc Ala tet Ser 25 gga Gly ttc acc ttc agt agg tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser 20 Cys Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr lle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 288
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
aga ggt ttt gga gac ggg ggg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt acc 336
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
ctg gtc acc gtc tcc tea gg 356
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
5 <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
ío <400> 44
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lle Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr lle Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
-88CZ 303450 B6 <210> 45 <211> 356 <212> DNA <213> Uměla sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) ío <220 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400 45
gag gtc cag ctg gtc Val 5 gag tea ggg gga ggc tta gtc cag cct gga ggg 48
Glu 1 Val Gin Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gin Pro Gly 15 Gly
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt agg tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
act atg tet tgg gtt ege cag get ccg ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gca acc att agt ggt ggt ggt cac acc tac tat cta gac agt gtg aag 192
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acc ctg tac ctg 240
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
cag atg aac agt ctg agg gcc gag gac aca gcc gtg tat tac tgt aca 288
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
90 95
aga Arg ggt Gly ttt Phe gga gac ggg ggg tac ttc gat Asp gtc tgg ggc caa ggt acc Gin Gly Thr 110 336
Gly Asp 100 Gly Gly Tyr Phe 105 Val Trp Gly
ctg gtc acc gtc tcc tea gg 356
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
15 <210> 46
<211> 318
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
20 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<220>
25 <223> Popis umělé sekv
<400> 46
-89CZ 303450 B6
caa att gtt ctc acc cag ttt cca gca ctc atg tet gcg tet Ala Ser cca ggg Pro Gly 15 48
Gin 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Phe Pro Ala Leu 10 Met Ser
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tea agt gta aat cac atg 96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cca aaa tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg acc tet tac tet ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 '7 5 80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 47 <211> 106 <212> PRT <213 > U mělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 47
Gin 1 Ile Val Leu Thr Gin 5 Phe Pro Ala Leu 10 Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
-90CZ 303450 B6 <210> 48 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(318) io <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 48
caa att gtt ctc acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gcg tet gta ggg
Gin 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc agc tea agt gta aat cac atg
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser Val Asn 30 His Met
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat
Phe Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Pro 45 Trp Ile Tyr
ctc aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct tea cgc ttc agt ggc agt
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc agc agc ctg caa cct gaa
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
70 75 80
144
240
192 gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
90 95 ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa
288
318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
15 <210> 49
<211> 106
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
20 <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
<400> 49
-91 CZ 303450 B6
Gin Ile 1 Val Leu Thr Gin 5 Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> , 50
<211> 318
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 50
caa Gin 1 att Ile gtt Val ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val 15 ggg Gly 48
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
-92CZ 303450 B6
ttc tgg tat Phe Trp Tyr cag cag aag ccc ggg aaa Lys gcg ccc aaa Ala Pro Lys ctc ctg att tat 144
Gin Gin Lys Pro Gly 40 Leu 45 Leu Ile Tyr
35
ctc a ca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct tea cgc ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc agc agc ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 106
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
<400> 51
Gin 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 52 <211> 318
-93 CZ 303450 B6 <212> DNA <213> Uměla sekvence <220>
<221> CDS <222> (1).-(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 52
caa Gin 1 att Ile cag Gin ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val 15 ggg Gly 48
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr I le Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cec ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg get tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
15 <210> <211> <212> <213> 53 318 DNA Umělá sekvence
<220> <221> CDS
20 <222> (1)-(318)
<220> <223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid
25 <400> 53
-94CZ 303450 B6
caa Gin 1 att Ile cag Gin ctc Leu acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val 15 ggg Gly 48
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tea agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcg ccc aaa ctc ctg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct tea ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> U mělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 54
Gin Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met 20 25 30
Phe Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Gly 65 Ser Gly Thr Asp Tyr 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Glu 80
Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gin Gin Trp 90 Ser Gly Asn Pro Trp 95 Thr
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 100
Glu Ile Lys 105
-95CZ 303450 B6 <210> 55 <211> 318 <212> DNA <213> U mělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(318) io <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 55
gaa att Glu Ile 1 gtt ctc acc cag ttt cca gca ctc atg tet gcg tet cca ggg Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 48
Val Leu Thr 5 Gin Phe Pro Ala
10 15
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag cca aaa tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc a ca tcc aac ctg get tet gga gtc cct get ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg acc tet tac tet ctc a ca atc age age atg gag get gaa 240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
gat get gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
ttc ggt gga ggc acc aag ctg gag atc aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 56 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 56
-96CZ 303450 B6
Glu Ile Val Leu Thr Gin Phe Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile I,ys
100 105 <210> 57 <211> 318 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(318) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický oligonukleotid <400> 57
gat Asp 1 atc Ile cag Gin ctc acc cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tcc Ser 10 ctg Leu tet Ser gcg Ala tet Ser gta Val 15 ggg Gly 48
Leu Thr 5
gac aga gtc acc atc aca tgc agt gcc age tca agt gta aat cac atg 96
Asp Arg Val· Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
ttc tgg tat cag cag aag ccc ggg aaa gcc ccc aaa ccc tgg att tat 144
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
ctc aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct tca ege ttc agt ggc agt 192
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
ggg tet ggg aca gat tac act ctc aca atc age age ctg caa cct gaa 240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
-97CZ 303450 B6 gat ttt gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt ggt aac ccg tgg acg 288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
90 95 ttc ggt cag ggc act aag gtg gag atc aaa 318
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 58 <211> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 58
Asp 1 Ile Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 192
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: konstrukt chimérické domény I typu „potkan/člověk“
<400> 59
Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser Ile
1 5 10 15
Pro Trp Glu Ser Val Ile Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys Arg
25 30
-98 CZ 303450 B6
Asp Ile Gly 35 Pro Lys Gin Thr Gin 40 Val Gly Ile Val Gin 45 Tyr Gly Glu
Asn Val 50 Thr His Glu Phe Asn 55 Leu Asn Lys Tyr Ser 60 Ser Thr Glu Glu
Val 65 Leu Val Ala Ala Asn 70 Lys Ile Val Gin Arg 75 Gly Gly Arg Gin Thr 80
Met Thr Ala Leu Gly 85 Ile Asp Thr Ala Arg 90 Lys Glu Ala Phe Thr 95 Glu
Ala Arg Gly Ala 100 Arg Arg Gly Val Lys 105 Lys Val Met Val Ile 110 Val Thr
Asp Gly Glu 115 Ser His Asp Asn Tyr 120 Arg Leu Lys Gin Val 125 Ile Gin Asp
Cys Glu 130 Asp Glu Asn Ile Gin 135 Arg Phe Ser Ile Ala 140 Ile Leu Gly His
Tyr 145 Asn Arg Gly Asn Leu 150 Ser Thr Glu Lys Phe 155 Val Glu Glu Ile Lys 160
Ser Ile Ala Ser Glu 165 Pro Thr Glu Lys His 170 Phe Phe Asn Val Ser 175 Asp
Glu Leu Ala Leu val Thr Ile Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg Ile Phe
180 185 190
<210> 60
<211> 192
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 60
Thr 1 Gin Leu Asp Ile 5 Val Ile Val Leu Asp 10 Gly Ser Asn Ser Ile 15 Tyr
Pro Trp Glu Ser 20 Val Ile Ala Phe Leu 25 Asn Asp Leu Leu Lys 30 Arg Met
Asp Ile Gly 35 Pro Lys Gin Thr Gin 40 Val Gly Ile Val Gin 45 Tyr Gly Glu
Asn Val 50 Thr His Glu Phe Asn 55 Leu Asn Lys Tyr Ser 60 Ser Thr Glu Glu
Val 65 Leu Val Ala Ala Asn 70 Lys Ile Gly Arg Gin 75 Gly Gly Leu Gin Thr 80
Met Thr Ala Leu Gly 85 Ile Asp Thr Ala Arg 90 Lys Glu Ala Phe Thr 95 Glu
-99CZ 303450 B6
Ala Arg Gly Ala 100 Arg Arg Gly Val Lys 105 Lys Val Met Val Ile 110 Val Thr
Asp Gly Glu 115 Ser His Asp Asn Tyr 120 Arg Leu Lys Gin Val 125 Ile Gin Asp
Cys Glu 130 Asp Glu Asn Ile Gin 135 Arg Phe Ser Ile Ala 140 Ile Leu Gly His
Tyr 145 Asn Arg Gly Asn Leu 150 Ser Thr Glu Lys Phe 155 Val Glu Glu Ile Lys 160
Ser Ile Ala Ser Glu 165 Pro Thr Glu Lys His 170 Phe Phe Asn Val Ser 175 Asp
Glu Leu Ala Leu 180 Val Thr Ile Val Lys 185 Ala Leu Gly Glu Arg 190 Ile Phe
<210> 61
<211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Thr 1 Gin Leu Asp Ile 5 Val Ile Val Leu Asp 10 Gly Ser Asn Ser Ile 15 Tyr
Pro Trp Asp Ser 20 Val Thr Al.a Phe Leu 25 Asn Asp Leu Leu Lys 30 Arg Met
Asp Ile Gly 35 Pro Lys Gin Thr Gin 40 Val Gly Ile Val Gin 45 Tyr Gly Glu
Asn Val 50 Thr His Glu Phe Asn 55 Leu Asn Lys Tyr Ser 60 Ser Thr Glu Glu
Val 65 Leu Val Ala Ala Lys 70 Lys Ile Val Gin Arg 75 Gly Gly Arg Gin Thr 80
Met Thr Ma Leu Gly 85 Ile Asp Thr Ala Arg 90 Lys Glu Ala Phe Thr 95 Glu
Ala Arg Gly Ala 100 Arg Arg Gly Val Lys 105 Lys Val Met Val Ile 110 Val Thr
Asp Gly Glu 115 Ser His Asp Asn His 120 Arg Leu LyS Lys Val 125 Ile Gin Asp
Cys Glu 130 Asp Glu Asn Ile Gin 135 Arg Phe Ser Ile A±a 140 Ile Leu Gly Ser
Tyr 145 Asn. Arg Gly Asn Leu 150 Ser Thr Glu Lys Phe 155 Val Glu Glu Ile Lys 160
Ser Ile Ala Ser Glu 165 Pro Thr Glu Lys His 170 Phe Phe Asn Val Ser 175 Asp
Glu Ile Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg Ile Phe
180 185 190
- 100CZ 303450 B6 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213 > U mělá sekvence <220 <223> Popis umělé sekvence: Syntetický peptid <400> 62
Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Rattus sp.
<400> 63
Val 1 Ser Pro Thr Phe 5 Gin Val Val Asn Ser 10 Phe Ala Pro Val Gin 15 Glu
Cys Ser Thr Gin 20 Leu Asp lle Val lle 25 Val Leu Asp Gly Ser 30 Asn Ser
lle Tyr Pro 35 Trp Glu Ser Val lle 40 Ala Phe Leu Asn Asp 45 Leu Leu Lys
Arg Met 50 Asp lle Gly Pro Lys 55 Gin Thr Gin Val Gly 60 lle Val Gin Tyr
Gly 65 Glu Asn Val Thr His 70 Glu Phe Asn Leu Asn 75 Lys Tyr Ser Ser Thr 80
Glu Glu Val Leu Val 85 Ala Ala Lys Lys lle 90 Gly Arg Gin Gly Gly 95 Leu
Gin Thr Met Thr 100 Ala Leu Gly lle Asp 105 Thr Ala Arg Lys Glu 110 Ala Phe
Thr Glu Ala 115 Arg Gly Ala Arg Arg 120 Gly Val Lys Lys Val 125 Met Val lle
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val lle
130 135 140 ‘ 101 CZ 303450 B6
Gin Asp Cys Glu Asp Glu Asn Ile
145 150
Gly His Tyr Asn Arg 165 Gly Asn Leu
Ile Lys Ser Ile Ala Ser Glu Pro
180
Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Thr
'195 200
Ile Phe Ala Leu Glu 210 Ala
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Gin Arg Phe 155 Ser Ile Ala Ile Leu 160
Ser Thr 170 Glu Lys Phe Val Glu 175 Glu
Thr 185 Glu Lys His Phe Phe 190 Asn Val
Ile Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg
205
Val 1 Ser Pro Thr Phe 5 Gin Val Val Asn Ser 10 Ile Ala Pro Val Gin 15 Glu
Cys Ser Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser
20 25 30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Arg Met Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys Ile Val Gin Arg Gly Gly Arg
85 90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Thr Glu Ala Arg Gly Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Ile
115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val Ile
130 135 140
Gin Asp Cys Glu Asp Glu Asn Ile Gin Arg Phe Ser Ile Ala Ile Leu
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu
165 170 175
Ile Lys Ser Ile Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val
180 185 190
Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg
195 200 205
Leu Glu Ala
Ile Phe Ala 210
102 <210> 65 <211> 106 <212> PRT <213> Umělý sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 65
Asp 1 Ile Val Met Thr Gin 5 Ser Pro Ser Ser Leu 10 Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Tle Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<21O> 66 <21l> 106 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid
66
Gin Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
-103CZ 303450 B6 <210> 67 <211> Π8 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 67
Glu Val 1 Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Léu Ile Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu. .Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Arg Phe Leu Glu Trp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
<2I0> 68 <211> 118 <212> PRT <213> U mělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid <400> 68
- 104CZ 303450 B6
Glu Val 1 Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> <211> <212> <213> 69 118 PRT Umělá sekvence
<220> <223> <400> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptid 69
Glu 1 Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95
Arg Gly Phe Gly Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 106
-105
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polypeptíd
<400> 70
Gin Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Protilátka anti-VLA-1 nebo její antigen-vazebný fragment, jejíž úseky určující komplementaritu lehkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 ze sekv. id ě. 1, a jejíž úseky určující komplementaritu těžkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 ze sekv. id č, 2,
  2. 2. Protilátka podle nároku 1, která obsahuje ve svém těžkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: V12, F29, A49, T93 a R94.
  3. 3. Protilátka podle nároku l, která obsahuje ve svém lehkém řetězci alespoň jeden z následují25 cích zbytků: Ql, L4 a Y71.
  4. 4. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 1, která obsahuje:
    (a) variabilní doménu lehkého řetězce mající sekvenci uvedenou jako sekv. id. ě. 1, a variabilní 30 doménu těžkého řetězce mající sekvenci uvedenou jako sekv. id. č. 2; nebo (b) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná hybridomem mAQC2, jehož ATTC přístupové číslo je PTA3273.
  5. 5. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 1, kde protilátka nebo fragment je humanizovaná protilátka.
    - 106CZ 303450 B6
  6. 6. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 5, která obsahuje:
    (a) ve svém lehkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: Ql, L4, P46, W47 a Y71; nebo ve svém těžkém řetězci alespoň jeden z následujících zbytků: Dl, V12, S28, F29, A49, T93,
    R94 podle číslování podle Kabata; nebo (b) sekvenci variabilní domény lehkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 106 ze sekv. id. č. 3 a sekvenci variabilní domény těžkého řetězce definovanou aminokyselinovými zbytky 1 až 118 ze sekv. id. č. 4; nebo (c) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linii hAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3275; nebo (d) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií hsAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3356; nebo (e) stejné polypeptidové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako protilátka produkovaná buněčnou linií haAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3274.
  7. 7. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 5, kde těžký řetězec je mutován v jednom nebo ve více aminokyselinových zbytcích vybraných ze skupiny, kterou tvoří zbytky 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 a 322 podle systému číslování EU, čímž je způsobena změna efektorové funkce, zatímco je zachována vazba k VLA-1, ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou.
  8. 8. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 7, která obsahuje mutace L234A a L235A, podle systému Číslování EU, ve svém těžkém řetězci, ve srovnání s nemodifikovanou protilátkou.
  9. 9. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 5, která je mutovaná v aminokyselinovém zbytku, kterýje glykosylačním místem, čímž je glykosylační místo eliminováno.
  10. 10. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment podle nároku 9, která obsahuje mutaci N297Q ve svém těžkém řetězci podle systému číslování EU.
  11. 11. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku nebo její antigen-vazebný fragment podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  12. 12. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny obsahující DNA, která je vybrána ze skupiny sestáva40 jící z:
    (a) kódující sekvence pro sekv. id. č. 1. a kódující sekvence pro sekv. id. č. 2;
    (b) kódující sekvence pro lehký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3273 a kódující sekvence pro těžký řetězec protilátky produkované hybridomem mAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3273;
    (c) kódující sekvence pro lehký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hAQC2, jehož
    ATCC přístupové číslo je PTA3275 a kódující sekvenci pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3275;
    (d) kódující sekvence pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií haAQC2, jehož ATCC přístupové číslo je PTA3274;
    (e) kódující sekvence pro těžký řetězec protilátky produkované buněčnou linií hsAQC2, jehož
    ATCC přístupové číslo je PTA3356;
    (f) kódující sekvence pro zbytky 1 až 106 ze sekv. id. č. 3 a kódující sekvenci pro zbytky 1 až 118 ze sekv. id. č. 4; a
    - 107CZ 303450 B6 (g) kódující sekvence protilátky anti-VLA-1 nebo jejího antigen-vazebného fragmentu, jejíž úseky určující komplementaritu lehkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 24 až 33, 49 až 55 a 88 až 96 ze sekv. id. č. 1, a jejíž úseky určující komplementaritu těžkého řetězce jsou definovány aminokyselinovými zbytky 31 až 35, 50 až 65 a 98 až 107 ze sekv. id. č. 2.
  13. 13. Použití kompozice podle nároku 11 pro přípravu léčiva pro léčení imunologického onemocnění.
  14. 14. Způsob in vitro stanovení hladiny VLA-1 ve tkáni, vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení tkáně do kontaktu s protilátkou podle nároku 1 a detekci vazby protilátky ke tkáni, čímž se stanoví hladina VLA-1 ve tkáni.
  15. 15. Použití kompozice podle nároku 11 pro stanovení hladiny VLA-1 ve tkáni in vitro pro použití při diagnóze imunologického onemocnění.
  16. 16. Buňka buněčné linie hAQC2, jejíž ATCC přístupové číslo je PTA3275, haAQC2, jejíž ATCC přístupové číslo je PTA3274, hsAQC2, jejíž ATCC přístupové číslo je PTA3356 nebo hybridomu mAQC2 jehož ATCC přístupové číslo je PTA3273.
  17. 17. Způsob identifikace inhibitoru I domény integrinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se (a) použijí strukturní koordináty aminokyselin hAQC2 obsahující zbytky lehkého řetězce Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 a Trp95 a zbytků těžkého řetězce Arg31, His56, Tyr58, Gly 100 a AsplOl podle obr. 19, nebo +/- hodnota střední kvadratické odchylky atomů hlavního řetězce uvedených aminokyselin hAQC2 nejvýše ±1,10 Á, přičemž 1 Á je 1.10~10m, pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebného místa, (b) použije trojrozměrná struktura k navržení nebo výběru potenciálního antagonisty, (c) syntetizuje potenciální antagonista a (d) uvede do kontaktu potenciální antagonista s hAQC2, aby se určila schopnost potenciálního antagonisty ínteragovat s hAQC2, přičemž schopnost potenciálního antagonisty ínteragovat s hAQC2 ukazuje, že potenciální antagonista je inhibitorem I domény.
  18. 18. Použití podle nároků 13 až 15, kde imunologické onemocnění je vybráno ze skupiny, jež tvoří gastrointestinální o nemocnění, auto imunní onemocnění, fibróza, kožní onemocnění, vaskulámí onemocnění, alergická rinitida, syndrom respiračního distresu, astma, bronchitida, tendinitida, bursitida, migrénová bolest hlavy, periarteritida nodosa, thyroiditida, aplastická anémie, Hodgkinova nemoc, revmatická horečka, osteoartritida, sarkoidóza, nefrotický syndrom, renální selhání, Bechetův syndrom, polymyositida, gingivitida, přecitlivělost, rejekce štěpu nebo transplantátu, onemocnění způsobené reakcí štěpu proti hostiteli, konjunktivitida, otoky nastávající po poranění, ischémie myokardu a syndrom endotoxinového šoku, revmatoidní artritida, systémový lupus erythematosus, zánětlivé onemocnění střev, C roh nova nemoc, kol i ti da, gastritida, syndrom dráždivého tračníku, psoriáza a kolorektální karcinom.
  19. 19. Protilátka nebo její antigen-vazebný fragment, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde antigen-vazebný fragment je vybrán ze skupiny sestávající z Fab, F(ab')2 a z jednoduchého řetězce Fv.
    131 výkresů
    - 108CZ 303450 B6 al
    BUNĚK
    T-r
    10° 10’ IQ2 10®
    INTENZITA FLUORESCENCE
    Obr.IA
    - 109CZ 303450 B6 £
    § s
    *<
    TYF IV
    B KONTROLNÍ mAB O ANTI-al QANTFa2 S ΑΝΤΙ-αΊ+<χ2 @ ANTI-Pl
    TYP I
    Obr.1B
    -110CZ 303450 B6
    ZVÝŠENI TLOUŠŤKY CHODIDLA {%)
    -112
    113 CZ 303450 B6 co m
    o.
    in
    Obr
    -114CZ 303450 B6
    3ho>is ažiOiiimav re t
    t
    CM
    C _J CD
    O CČ o f—Ό ω
    O >0č iď
    V) to
    CL o
    cc
    Q_
    O i
    O
    O
    UJ >QÍ
    UJ »co
    -115CZ 303450 B6
    OŠETŘENÍ PROTILÁTKOU
    - 116CZ 303450 B6
    ARTRITICKÉ SKŮRE (MAX. = 4)
    -117CZ 303450 B6
    Obr. 9
    -118CZ 303450 B6
    ARTRITICKÉ SKÓRE (MAX. = 4)
    DEN
CZ20033039A 2001-04-13 2002-04-12 Protilátky k VLA-1, kompozice je obsahující a nukleové kyseliny, které je kódují, zpusob stanovení hladiny VLA-1 a použití pri lécení imunologického onemocnení CZ303450B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28379401P 2001-04-13 2001-04-13
US30368901P 2001-07-06 2001-07-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20033039A3 CZ20033039A3 (cs) 2004-03-17
CZ303450B6 true CZ303450B6 (cs) 2012-09-19

Family

ID=26962254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033039A CZ303450B6 (cs) 2001-04-13 2002-04-12 Protilátky k VLA-1, kompozice je obsahující a nukleové kyseliny, které je kódují, zpusob stanovení hladiny VLA-1 a použití pri lécení imunologického onemocnení

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7358054B2 (cs)
EP (1) EP1423431B1 (cs)
JP (2) JP4303475B2 (cs)
KR (1) KR100927670B1 (cs)
CN (1) CN1561345B (cs)
AR (1) AR036330A1 (cs)
AT (1) ATE471344T1 (cs)
AU (1) AU2002258778C1 (cs)
BG (1) BG66334B1 (cs)
BR (1) BRPI0209792B8 (cs)
CA (1) CA2443903C (cs)
CZ (1) CZ303450B6 (cs)
DE (1) DE60236735D1 (cs)
EA (1) EA006705B1 (cs)
EE (1) EE200300509A (cs)
ES (1) ES2347532T3 (cs)
GE (1) GEP20074252B (cs)
HU (1) HUP0402250A3 (cs)
IL (3) IL158376A0 (cs)
IS (1) IS6982A (cs)
MX (1) MXPA03009390A (cs)
MY (1) MY138286A (cs)
NO (1) NO20034554L (cs)
NZ (1) NZ529494A (cs)
PL (1) PL367324A1 (cs)
SK (1) SK288124B6 (cs)
UA (1) UA83791C2 (cs)
WO (1) WO2002083854A2 (cs)
YU (1) YU80903A (cs)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2557768T3 (es) 1999-06-01 2016-01-28 Biogen Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
IL158376A0 (en) 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
IL164021A0 (en) 2002-03-13 2005-12-18 Univ California Antibodies and anti-pharmaceutical compositions containing the same
JPWO2005073385A1 (ja) * 2004-01-29 2008-01-10 独立行政法人産業技術総合研究所 遺伝子導入効率を上昇させるための組成物および方法
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
ES2568436T3 (es) * 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
US9670269B2 (en) * 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
PL2034830T3 (pl) * 2006-05-25 2015-04-30 Biogen Ma Inc Przeciwciało anty-VLA-1 do leczenia udaru
AU2013204572B2 (en) * 2006-05-25 2015-06-18 Biogen Ma Inc. Methods of Treating Stroke
CN101563105B (zh) 2006-07-10 2013-01-23 拜奥根Idec马萨诸塞公司 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
SG10201605394SA (en) * 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
RU2531521C2 (ru) 2007-12-05 2014-10-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JP5789192B2 (ja) * 2008-11-13 2015-10-07 フェムタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＦｅｍｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． ヒト化抗ｉｌ−６抗体
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
KR101834890B1 (ko) * 2009-10-23 2018-04-20 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 항­ｇｃｃ 항체 분자와 관련 조성물 및 방법
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
MY166429A (en) 2010-11-17 2018-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
US20140017261A1 (en) * 2011-02-03 2014-01-16 Mark Totoritis Selection and treatment of subjects
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
US10316095B2 (en) * 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations
LT2841575T (lt) 2012-04-27 2019-10-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antikūno molekulės, nukreiptos prieš gcc, ir jų panaudojimas nustatant jautrumą į gcc nukreiptai terapijai
JP6154900B2 (ja) 2012-07-13 2017-06-28 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｖｅｇｆ／抗ａｎｇ−２抗体及び眼血管疾患の処置におけるそれらの使用
PT2970512T (pt) * 2013-03-12 2019-01-17 Biocon Ltd Proteínas de fusão imunomoduladoras e métodos para produção das mesmas
WO2014144466A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
US10035860B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
SG11201607165YA (en) 2014-12-19 2016-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
TW202248212A (zh) 2015-02-05 2022-12-16 日商中外製藥股份有限公司 包含離子濃度依賴之抗原結合域的抗體、Fc區變體、IL-8結合抗體與其用途
TW202339800A (zh) 2015-02-27 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
AU2016381992B2 (en) 2015-12-28 2024-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
AU2017233658B2 (en) 2016-03-14 2023-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US11312775B2 (en) * 2017-07-20 2022-04-26 University Of Virginia Patent Foundation Methods for treatment or prevention of a neurological immunity disorder
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
WO2020150214A1 (en) * 2019-01-14 2020-07-23 University Of Virginia Patent Foundation Use of integrin inhibitors for treatment or prevention of a neurological immunity disorder and/or nervous system injury

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08131185A (ja) * 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
US5788966A (en) * 1990-08-31 1998-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DK0626861T4 (da) 1992-01-13 2004-08-16 Biogen Inc Behandling af astma.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
SG44845A1 (en) 1993-01-12 1997-12-19 Biogen Inc Recombitant anti-vla4 antibody molecules
ES2114183T5 (es) 1993-02-09 2006-06-16 Biogen Idec Ma, Inc. Anticuerpo para el tratamiento de la diabetes dependiente de la insulina.
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
ES2270425T3 (es) 1994-01-25 2007-04-01 Elan Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanizados contra la molecula de adhesion leucocitaria vla-4.
ES2151054T3 (es) 1994-04-26 2000-12-16 Kanebo Ltd Farmaco para el tratamiento de la artritis reumatoide.
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
DK0843961T3 (da) 1995-08-29 2007-05-21 Kirin Brewery Kimærisk mus og fremgangsmåde til at producere samme
DE19534177A1 (de) 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
PL345946A1 (en) 1998-05-22 2002-01-14 Boys Town Nat Res Hospital Use of α1β1 integrin receptor inhibitors and tgf-β1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
CA2340333A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Biogen, Inc. Crystals of the alpha 1 beta 1 integrin i-domain and their use
IL145898A0 (en) * 1999-04-22 2002-07-25 Biogen Inc Method for the treatment of fibrosis using an antagonist of the integrin alpha-4 subunit
ES2557768T3 (es) 1999-06-01 2016-01-28 Biogen Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
WO2000078221A1 (de) 1999-06-17 2000-12-28 Kai Desinger Chirurgische sonde zur minimal invasiven gewebeentnahme
WO2001073444A2 (en) 2000-03-28 2001-10-04 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
IL158376A0 (en) 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
AU2003215298A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
CA2494310A1 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005016883A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Icos Corporation Acrylamide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
PL2034830T3 (pl) 2006-05-25 2015-04-30 Biogen Ma Inc Przeciwciało anty-VLA-1 do leczenia udaru
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
CA2754528A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Genetech, Inc. Antibody formulation
CN107095846A (zh) 2009-12-21 2017-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗体配制剂
US20140017261A1 (en) 2011-02-03 2014-01-16 Mark Totoritis Selection and treatment of subjects
CN103380495B (zh) 2012-01-11 2016-05-18 松下知识产权经营株式会社 压接型半导体装置及其制造方法
US10316095B2 (en) 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5788966A (en) * 1990-08-31 1998-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof
JPH08131185A (ja) * 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
De Fougerolles A.R. et al.: "Regulation of inflammation by collagen-binding integrins a1a1 and a2a1 in models of hypersensitivity and arthritis", J Clin. Invest., 105(6),721û729, 2000 *
Fabbri M. et al.: "A functional monoclonal antibody recognizing the human alpha 1-integrin I-domainö, Tissue antigens, vol. 48 (1), 47-51, 1996 *
Mendrick D.L. et al.: "Glomerular epithelial and mesangial cells differentially modulate the binding specificities of VLA-1 and VLA-2", Lab. Invest. Vol. 72 (3), 367-375, 1995 *
Shimaoka M. et al.: "Computational design of an integrin I domain stabilized in the open high affinity conformation", Nature Structural Biology, vol. 7(8), 674û678, 2000 *

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA03009390A (es) 2004-01-29
DE60236735D1 (de) 2010-07-29
YU80903A (sh) 2006-05-25
BG66334B1 (bg) 2013-06-28
NZ529494A (en) 2005-08-26
JP4303475B2 (ja) 2009-07-29
CA2443903A1 (en) 2002-10-24
US20110189177A1 (en) 2011-08-04
GEP20074252B (en) 2007-12-10
UA83791C2 (ru) 2008-08-26
US10336826B2 (en) 2019-07-02
MY138286A (en) 2009-05-29
HUP0402250A3 (en) 2007-06-28
US20170335000A1 (en) 2017-11-23
US7358054B2 (en) 2008-04-15
IL213564A0 (en) 2011-07-31
US20100272716A1 (en) 2010-10-28
US9644030B2 (en) 2017-05-09
JP2004536580A (ja) 2004-12-09
KR20040062879A (ko) 2004-07-09
BG108340A (bg) 2004-10-29
WO2002083854A2 (en) 2002-10-24
US20150299323A1 (en) 2015-10-22
WO2002083854A3 (en) 2004-04-08
BR0209792A (pt) 2005-04-26
EP1423431A2 (en) 2004-06-02
CN1561345B (zh) 2011-09-14
SK13742003A3 (sk) 2004-07-07
WO2002083854A9 (en) 2003-11-06
SK288124B6 (sk) 2013-09-03
AU2002258778C1 (en) 2008-12-04
ATE471344T1 (de) 2010-07-15
IL213564B (en) 2018-06-28
AU2002258778A2 (en) 2002-10-28
CZ20033039A3 (cs) 2004-03-17
NO20034554L (no) 2003-12-15
AU2002258778B2 (en) 2008-01-17
IS6982A (is) 2003-10-08
BRPI0209792B1 (pt) 2017-03-28
EP1423431B1 (en) 2010-06-16
US7723073B2 (en) 2010-05-25
US20090010930A1 (en) 2009-01-08
AR036330A1 (es) 2004-09-01
NO20034554D0 (no) 2003-10-10
BRPI0209792B8 (pt) 2021-05-25
US8084028B2 (en) 2011-12-27
EP1423431A4 (en) 2005-04-27
ES2347532T3 (es) 2010-11-02
US20120177638A1 (en) 2012-07-12
CA2443903C (en) 2018-03-20
US20040081651A1 (en) 2004-04-29
EA006705B1 (ru) 2006-02-24
EA200301117A1 (ru) 2004-08-26
JP2009079047A (ja) 2009-04-16
CN1561345A (zh) 2005-01-05
IL158376A (en) 2011-07-31
US7910099B2 (en) 2011-03-22
EE200300509A (et) 2004-08-16
KR100927670B1 (ko) 2009-11-20
IL158376A0 (en) 2004-05-12
HUP0402250A2 (hu) 2005-01-28
PL367324A1 (en) 2005-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10336826B2 (en) Antibodies to VLA-1
AU2002258778A1 (en) Antibodies to VLA-1
AU2006201540A1 (en) A Blocking Monoclonal Antibody to VLA-1 and Its Use for the Treatment of Inflammatory Disorders
ZA200308568B (en) Antibodies to VLA-1.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20210412