HU219537B - Humanizált és kiméra monoklonális antitestek, azokat tartalmazó gyógyászati készítmények, az antitesteket kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós vektorok, valamint eljárás az antitestek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány olyan humanizált monoklonális antitestre vonatkozik, amelyhumán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését azilyen receptorokhoz, és amelynek könnyű- és nehézlánca nem humáneredetű specifikus antigénkötő régiót (CDR), humán eredetű variábiliskerettartományt (FR) és humán eredetű konstans régiót tartalmaz. Atalálmány vonatkozik továbbá expressziós vektorokra, az expressziósvektorral transzformált gazdasejtekre, valamint az említett antitestelőállítására a transzformált gazdasejtek tenyésztése útján, továbbáaz antitestet tartalmazó gyógyszerkészítményre. ŕ

Description

A találmány olyan humanizált monoklonális antitestre vonatkozik, amely humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz, és amelynek könnyű- és nehézlánca nem humán eredetű specifikus antigénkötő régiót (CDR), humán eredetű variábilis kerettartományt (FR) és humán eredetű konstans régiót tartalmaz.

A találmány vonatkozik továbbá expressziós vektorokra, az expressziós vektorral transzformált gazdasejtekre, valamint az említett antitest előállítására a transzformált gazdasejtek tenyésztése útján, továbbá az antitestet tartalmazó gyógyszerkészítményre.

A találmány szerinti új, humanizált monoklonális antitestek legalább a humán immunglobulinok nehézlánca variábilis tartománya FR-einek mesterségesen módosított konszenzusszekvenciáját tartalmazzák.

A találmány közelebbről olyan humanizált és kiméra monoklonális antitestekre is vonatkozik, amelyek kötődnek az epidermális növekedési faktorhoz. A találmány ismerteti az ezen receptor antigénkötő helyeiért felelős aminosavszekvenciát.

A találmány szerinti gyógyászati készítményekben lévő antitestek tumorok, így melanoma, glioma és karcinóma kezelését szolgálják. Ezek az antitestek diagnosztikai célokra is alkalmazhatók az említett tumorok in vitro vagy in vivő helymeghatározására és vizsgálatára.

A leírásban számos műszaki kifejezést használunk, amelyeket a következőkben definiálunk.

„Humanizált” antitestek olyan antitesteket jelentenek, amelyek a könnyű- és nehézláncában lévő aminosavak humán eredetű, variábilis régiók FR-eit és konstans tartományait tartalmazzák, míg a hipervariábilis tartományok nem humán eredetűek.

„Kiméra” antitestek olyan antitesteket jelentenek, amelyek nem humán eredetű variábilis és hipervariábilis tartományokat tartalmaznak, míg a konstans tartományok humán eredetűek.

„FR” egy antitest vázát alkotó kerettartományokat jelenti, amelyeket a variábilis tartományokon belül találunk. Ezekben a tartományokban előfordul az aminosavak bizonyos változása.

„CDR” jelenti az egy antitest komplementaritását meghatározó vagy „hipervariábilis” tartományait; ezek a variábilis tartományokon belül találhatók. Ezek a tartományok képviselik a sajátos antigénkötő helyeket; nagyarányú aminosavkicserélődés jellemző rájuk. Az antigén kapcsolódási affinitásáért elsődlegesen a CDR-ek felelősek.

„Konszenzusszekvencia” a könnyű- vagy nehézláncban elhelyezkedő tartományokként nem természetes előfordulású aminosavszekvenciát jelent, amelyet az eredetileg jelen lévő nem humán, nehéz- vagy könnyűláncban lévő variábilis tartományok helyettesítésére használunk. A konszenzusszekvenciák szintetikus természetűek, így a humán immunglobulinok nehéz- vagy könnyűláncai különböző osztályaihoz vagy alosztályaihoz vagy alcsoportjaihoz tartozó legszokásosabb aminosavak alkotta mesterséges szekvenciák.

Az „EGF” és, JEGF-receptor” rövidítések az epidermális növekedési faktort, illetve annak receptorát jelentik.

„V_L” tartományok könnyűláncban található variábilis tartományokat jelentenek.

„V_H” tartományok nehézláncban található variábilis tartományokat jelentenek.

A humán A431 karcinóma-sejtvonal ellen termelt, egérből származó 425-ös monoklonális antitestről (MAb 425) megállapították, hogy az a humán epidermális növekedési faktor receptora (EGF-receptor) külső doménjén levő polipeptidepitóphoz kötődik. A vizsgálatok szerint az epidermális növekedési faktor (EGF) kötődése mind csekély, mind nagy affinitású EGF-receptorokon gátlást szenved [Murthy és munkatársai (1987)]. Számos forrásból származó rosszindulatú szöveten EGF-receptorok fokozott kifejeződése volt tapasztalható, így ezáltal MAb 425 hatóanyagként számításba vehető a humán tumorok diagnosztizálására és terápiás kezelésére. Ténylegesen a MAb 425 in vitro kísérletekben korlátozta a tumor sejttoxicitását, in vitro kísérletekben pedig visszaszorította epidermoid és kolorektális karcinóma eredetű sejtvonalú tumorsejtek növekedését [Rodeck és munkatársai (1987)]. Kísérleti adatok azt is megmutatták, hogy egerekben radioaktív elemekkel jelzett MAb 425 kötődik a rosszindulatú humán gliomák xenograftjaihoz [Takahashi és munkatársai (1987)].

Az EGF olyan polipeptidhormon, amely epidermális sejtek és epitélsejtek osztódására serkentőleg hat. Az EGF érzékeny sejtekkel lép kölcsönhatásba, a membránreceptorokhoz kötődik; a receptor/EGF komplex képződmények nyalábokban rendeződnek el, majd sejten belüli vezikulumokban jutnak be a sejtbe. Ez felelős a „leszabályozás” jelenségéért. Az EGF kötődése a receptormolekula tirozin-kináz-aktivitását váltja ki, és. DNS-szintézist indukál.

Az EGF-receptor mintegy 170 000 D-os transzmembrán-glükoprotein [Cohen (1982)], amely a c-erb-B protoonkogén gén terméke [Downward és munkatársai (1984)]. A receptor kinetikai szempontból két alakban, az úgynevezett csekély, illetve nagy affinitású receptorként létezik.

Az A431 karcinóma-sejtvonal a sejtjei felületén bőségesen kifejez EGF-receptorokat, ezért számos vizsgálatsorozatban alkalmazták anti-EGF-receptor-antitestek létrehozására. Az A431 receptorai azonban a polipeptidhez kapcsolt szénhidrátoldalláncok tekintetében különböznek egyéb típusú sejtek receptoraitól. Ezért számos, az A431 membránok ellen kitermelt antitest olyan szénhidrátok ellen irányul, amelyek nem közösek a receptormolekula összes alakjában [Schreiber (1983)].

Más monoklonális antitestek az EGF-receptorok proteinoldalláncával reagálnak. Az EGF-receptorokhoz kötődve ezen antitestek különféle tulajdonságokat mutatnak, amelyek feltehetően az antitest receptormolekulához kötődésének sajátos mértékétől és az antitest izotípusától függenek. Némely antitest az EGF valamely hatásait utánozza (agonisták), mások a hatásokat gátolják (antagonisták).

Az EGF-receptorok kifejeződése kapcsolatban van a tumor növekedésének folyamatával. A receptorok génje a v-erb-B madárvírus onkogén celluláris analógjának bizonyult [Ulrich (1984)]. Ezenkívül asszociációt

HU 219 537 Β észleltek a melanomafejlődés késői szakaszai és a receptorgént hordozó kromoszóma extra kópiái között [Koprowska és munkatársai (1985)].

Minthogy az EGF-receptorok ellenálló tumorok számos változatán kifejeződnek, a tumor elleni terápia alkalmas célpontjai lehetnek. A technika állása szerint azonban igény mutatkozik alkalmas antireceptorantitest iránt. Az ismert antitestek számos változata olyan tulajdonságokat mutat amelyek tumorellenes szerként használva károsak lennének. így például az EGF hatását utánzó antitestek inkább a tumor fejlődését stimulálhatják, mint hogy megfékeznék. Egyéb, csak a nagy vagy csak a csekély affinitású receptorokhoz kötődő antitestek az optimálisnál kisebb hatásosságúak lehetnek, minthogy az EGF a le nem kötött receptorokon keresztül még mindig kifejtheti hatását. Ismét más antitestek a csekély affinitású receptorokat nagy affinitású receptorokká változtatják, amelyek a tumor növekedésének gátlása helyett inkább fokozhatják azt. Ezért igény mutatkozik olyan anti-EGF-receptor iránt, amely alkalmas tumor elleni terápiához.

Bár már használtak emberekben terápiás kezeléshez egér-MAb-okat, azok immunválaszt váltottak ki [Giorgi és munkatársai (1983), Jaffers és munkatársai (1986)]. Ezen nehézség leküzdésére több kutatócsoport megkísérelte „humanizálni” az egérantitesteket. Ez két megközelítés valamelyikével történhet. Az első változat szerint az egér eredetté konstans tartomány doménjeit mind a könnyű-, mind a nehézlánc esetén helyettesíthetjük humán konstans tartományokkal. Humán tumorokkal kapcsolatos antigénekkel szembeni számos egér eredetű antitestből sikeresen állítottak elő ilyen „kiméra”, egér-humán antitesteket [Sun és munkatársai (1987), Whittle és munkatársai (1987), Liu és munkatársai (1987), Gillies és Wesolowski (1990)]. Ezen megközelítésben az egérantitest antigénkötő helyei és ezért az antigénaffinitás teljesen megőrződnek, míg a humán izotípus és effektorfúnkciók átadódnak. A második megközelítésben az egér eredetű variábilis tartományokból csak a komplementaritást meghatározó tartományok (CDR-ek) kapcsolódnak össze a humán könnyűlánc és nehézlánc variábilis doménjeinek (V_L és V_H) kerettartományaival (FR-ek). Igazolták, hogy ez az eljárás az antigénkötő helyek kritikus és nagyobb hányadát átviszi a humán antitestbe [Jones és munkatársai (1986)].

CDR-átültetést számos rágcsáló eredetű monoklonális képződménnyel lefolytattak [Jones és munkatársai (1986), Reichmann és munkatársai (1988), Verhoeyen és munkatársai (1988), Yueen és munkatársai (1989), Co és munkatársai (1991), Gorman és munkatársai (1991), Maeda és munkatársai (1991), Temptest és munkatársai (1991)]. Bár az affinitás mértéke rendszerint csökkent, valamennyien megőrizték antigénmegkötési képességüket. A legtöbb esetben szükséges volt a humán kerettartományokban (FR-ek) bizonyos aminosavak megváltoztatása. A klinikai vizsgálatok terén mind a kiméra, mind az átültetett CDR-t tartalmazó antitestek jobbnak bizonyultak, mint az egér eredetű antitestek [Halé és munkatársai (1988), LoBuglio és munkatársai (1989), Mathieson és munkatársai (1990)]. Arra vonatkozó általános kitanítás, hogy mely aminosavakat kell megváltoztatni, nem ismeretes, és ennek teljes előrejelzése egyetlen esetben sem lehetséges.

A 088 994 számú európai szabadalmi leírás olyan rekombináns DNS-vektorok előállítását javasolja, amely egy előre meghatározott ligandumra specifikus immunglobulin könnyű- vagy nehézlánca variábilis doménjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. Ez a megoldás a variábilis dómén szekvenciájában nem irányoz elő változtatásokat.

A 102 634 számú európai szabadalmi leírás bakteriális gazdaszervezetekben humán IgG nehézlánca teljes polipeptidjét vagy annak egy részét kódoló gének klónozását és kifejezését ismerteti, de a polipeptid szekvenciájában nem tervez változtatásokat.

A 239 400 számú európai szabadalmi leírásban javasoltak szerint humanizált antitestekhez lehet jutni azáltal, hogy bármilyen humán antitest antigénkötő helyeit (hipervariábilis tartományait) géntechnológiai eljárások útján nem humán, így egér vagy patkány eredetű kötőhelyekkel helyettesítik.

Ennek a kitanításnak az alapján ezért előállíthatok olyan specifikus antigénkötő helyeket tartalmazó humán vagy humanizált antitestek, amelyek eddig humán eredetű antitestekben nem voltak elérhetők.

Kiméra antitesteket lehet kapni azáltal, hogy a könynyű- és nehézláncoknak nemcsak a CDR-eit, hanem a teljes variábilis tartományait helyettesítik. A kiméra antitestek azonban még immunogének maradnak. Diagnosztikai célokra és humanizált antitestek optimalizálásához azonban nagyon hasznosak a kiméra antitestek.

Igazolni lehetett, hogy az antigénkötő helyek affinitása befolyásolható azáltal, hogy a variábilis tartományon belül néhány olyan aminosavat cserélnek ki egyenként, amelyek nem tartoznak közvetlenül a CDR-ekhez [Reichmann és munkatársai (1988)].

Ennek következtében a 239 400 számú európai szabadalmi leírás kitanításának megfelelően eljárva a legrosszabb esetben az antigén kötési affinitása teljesen megszűnhet. Igazoltuk ezt a körülményt azáltal, hogy nem vezettek eredményre az EGF-receptor epitópjai elleni, megfelelően humanizált antitest előállítására végzett kísérletek.

Ezért figyelembe kell venni azt, hogy az ilyen humanizálás sikere az alkalmazott variábilis tartományok konstitúciójától és konformációjától, valamint a megfelelő antigénkötő helyek viszonylatában fennálló kölcsönhatásaitól függ. így nem határozható meg teljesen előre, hogy az antitest variábilis doménjein belül szükségesek-e és milyen módosítások szükségesek ahhoz, hogy az antigén az antitesthez kötődjön vagy hogy a kötődést javítsuk.

A találmány feladata ezért olyan humanizált monoklonális antitest biztosítása, amely - különösen az EGFreceptorokra irányuló - nem humán eredetű antigénkötő helyeket, valamint humán eredetű variábilis FR-eket és konstans tartományokat tartalmaz, amelyek - szükség esetén - úgy vannak módosítva, hogy a kötőhelyek specifikus jellege megőrződjék vagy helyreálljon.

HU 219 537 Β

A találmány feladata közelebbről meghatározva az EGF-receptorokkal szembeni antitest antigénkötő helye hipervariábilis tartományainak jellemzése és ezen CDR-ek biztosítása az előzőekben definiált humanizált monoklonális antitesten belül.

Ez az antitest és kiméra változata terápiás vagy diagnosztikai szerként fontos szerepet tölt be tumorok, így melanoma, glioma vagy karcinóma leküzdésében.

Megállapítottuk, hogy könnyen előállíthatunk hatásos és specifikus humanizált monoklonális antitesteket humán immunglobulinok variábilis tartományai legalább nehézláncának konszenzusszekvenciáját használva. Különösen azon konszenzusszekvenciák alkalmasak, amelyek az eredeti nem humán antitestek variábilis tartományához hasonlítva jó (legalább 60-70%-os, különösen 65-70%-os) egyezést mutatnak.

Megállapítottuk továbbá, hogy ezeket a konszenzusszekvenciákat csak csekély mértékben kell módosítani, míg természetes előfordulású humán antitestek variábilis tartományait használva olykor sokkal több módosítás szükséges. Jónak minősülő specifikus antigénkötés eléréséhez az aminosav szekvenciájában gyakran nincs vagy csak csekély mértékű módosításra van szükség a találmány értelmében. így csupán néhány aminosavat kell kicserélni ahhoz, hogy az EGF-receptorok tökéletesen kötődjenek a találmány szerinti előnyös humanizált antitesthez, míg a 239 400 számú európai szabadalmi leírásban adott kitanításnak megfelelően nem következik be kötődés. A találmány értelmében szükséges módosítások mértéke az aminosavak kicserélése tekintetében 0-10%, előnyösen 1-5% mértékkel jellemezhető.

A találmány szerinti humanizált monoklonális antitest a következő előnyt mutatja: egy meghatározott osztályhoz vagy alosztályhoz vagy alcsoporthoz tartozó humán immunglobulin láncának különböző helyzeteiben a legszokásosabban előforduló aminosavat tartalmazó szekvenciának megfelelő konszenzusszekvencia nehézségek nélkül szintetizálható akár egész szekvenciaként, akár annak részlete alakjában - függetlenül attól, hogy bizonyos egyedi antitestek vagy antitestfragmentumok, illetve azokra vonatkozó részleges ismeretek rendelkezésre állnak-e. Ez azt jelenti, hogy a természetben előforduló egyedi antitestfragmentumok széles tartománya fedhető le azáltal, ha nagyon korlátozott számban biztosítunk megfelelő expressziós vektorokba klónozott konszenzusszekvenciákat. Egy konszenzusszekvencia az immunogenitás tekintetében kedvezőbb lehet az egyedi természetes szekvenciákkal összehasonlítva, amelyek ismeretesen olykor egyéb antitestek (így antiidiotípusos antitestek) epitópjai.

Jóllehet csak egy előnyös megoldást valósítottunk meg, a találmány szellemében általános elvi kitanítást adunk. A variábilis és hipervariábilis doménekben lehetséges szekvenciák és szekvenciakombinációk nagy számának vonatkozásában nem merő véletlen, hogy a konszenzusszekvenciára vonatkozóan ismertetett kitanítás az EGF-receptorra irányuló humanizált antitest elkészítésében eredményes volt.

Azt is megállapítottuk, hogy a variábilis dómén nehézláncai nagyobb mértékben járulnak hozzá az antigénkötő helyekhez, mint a megfelelő könnyűláncok. Ezért nincs szükség arra, hogy egy konszenzusszekvenciát tartalmazó humanizált antitest könnyűláncát ugyanúgy módosítsuk. Ez érdekes szempont, minthogy a könnyűláncokról ismert, hogy bizonyos ismert természetes antitestekben fontosabb szerepet játszanak, mint a megfelelő nehézláncok [Williams és munkatársai (1990)].

A találmány végül és legfőképpen elsőként biztosítja a génsebészet eszközeivel EGF-receptorok elleni, egér eredetű antitest (MAb 425) antigénkötő helyének jellemzését, klónozását és megsokszorozását. Szintetikus úton elő tudtuk állítani azokat a megfelelő oligonukleotidokat, amelyek humanizált és kiméra monoklonális antitest antigénkötő helyét és teljes variábilis doménjét kódolják. A találmány ezenkívül megfelelő hatékonyságú expressziós vektorokat biztosít, amelyek alkalmas eukariótasejtek transzformálására használhatók.

A találmány tárgya tehát humanizált monoklonális antitest, amely humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz, és amelynek könnyű- és nehézlánca nem humán eredetű specifikus antigénkötő régiót (CDR), humán eredetű variábilis kerettartományt (FR) és humán eredetű konstans régiót tartalmaz. A találmány értelmében humanizált monoklonális antitestre jellemző, hogy (i) a könnyűlánc CDR-régiójának aminosavszekvenciája a következő :

CDR-1: Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-Tyr CDR-2: Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser CDR-3: Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thr, míg a nehézlánc CDR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

CDR-1: Ser-His-Trp-Met-His

CDR-2: Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-ThrAsn-Tyr-Asn-Glu-Lys- Phe-Lys-Ser CDR-3: Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-TyrPhe-Asp-Tyr, és (ii) legalább a nehézlánc FR-régiója tartalmazza a humán immunglobulinok FR-régiójának egy, a természetben elő nem forduló módosított konszenzusszekvenciáját.

A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási formájában a könnyűlánc konstans régiója egy humán immunglobulin kappa-láncának aminosavszekvenciáját, míg a nehézlánc konstans régiója egy humán immunglobulin gamma-1-láncának aminosavszekvenciáját tartalmazza.

A találmány szerinti megoldás egy másik előnyös megvalósítási formájában a konszenzusszekvencia az aminosavak legfeljebb 10%-ának megváltoztatásával van módosítva.

A találmány szerinti megoldás egy további előnyös megvalósítási formájában

- a könnyűlánc FR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

FR-1: Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-SerLeu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-ThrIle-Thr-Cys

FR-2: Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-ProLys-Leu-Leu-lle-T yr

HU 219 537 Β

FR-3: Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-GlySer-Gly-Thr-Asp-Xaaj-Thr-Phe-Thr-Ile-SerSer-Leu-Gln-Pro-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-TyrTyr-Cys

FR-4: Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-Lys, - a nehézlánc FR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

FR-1: Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-GluVal-Lys-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-ValSer-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe-Xaa₂

FR-2: Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Gln-Gly-LeuGlu-Trp-Xaa₃-Gly

FR-3: Xaa₄-Xaa₅-Thr-Met-Thr-Xaa₆-Asp-Thr-SerThr-Asn-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu-Leu-Ser-SerLeu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-TyrCys-Ala-Ser

FR-4: Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-ValSer-Ser, ahol

Xaa! jelentése Tyr vagy Phe,

Xaa₂ jelentése Thr vagy Ser,

Xaa₃ jelentése He vagy Val,

Xaa₄ jelentése Lys vagy Arg,

Xaa₅ jelentése Alá vagy Val,

Xaa₆ jelentése Val vagy Leu.

A találmány tárgya továbbá olyan expressziós vektor, amely egy fenti antitest nehézláncának és/vagy könnyűláncának variábilis és konstans régióját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási formája a pRVL425 jelű, DSM6340 számon letétbe helyezett expressziós vektor, amely egy olyan antitest könnyűláncának variábilis és konstans régióját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz.

A találmány szerinti megoldás egy másik előnyös megvalósítási formája a pRVH425 jelű, DSM6339 számon letétbe helyezett expressziós vektor, amely egy olyan antitest nehézláncának variábilis és konstans régióját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz.

A találmány tárgya továbbá olyan gazdasejt, amely egy fenti expressziós vektorral van transzformálva.

A találmány tárgya ezenkívül eljárás humán EGFreceptorokhoz kötődni és az EGF ilyen receptorokhoz való kötődését gátolni képes humanizált monoklonális antitest előállítására, amelynek során egy gazdasejtet egy fenti expressziós vektorral transzformálunk, a transzformáit gazdasejteket alkalmas tápközegen tenyésztjük, és az expresszált antitestfehéijéket izoláljuk.

A találmány tárgya továbbá gyógyszerkészítmények, amelyek valamely fenti antitestet tartalmaznak.

A találmány szerinti humanizált vagy kiméra antitestek tumorokba szánt hatóanyag előállítására alkalmazhatók.

Ezenkívül a találmány szerinti humanizált vagy kiméra antitestek tumor növekedésének diagnosztikai helymeghatározására és vizsgálatára is alkalmazhatók.

Összefoglalásképpen a találmány lényege olyan monoklonális antitest, amely humán immunglobulinok egyik osztálya vagy alcsoportja nehézláncának variábilis tartományai konszenzusszekvenciáját tartalmazza.

A leírásunk bármely helyén idézett közrebocsátási iratok, szabadalmi leírások és közlemények, valamint a 103 389 számú európai közrebocsátási irat teljes tartalmát beépítettük leírásunkba a hivatkozás útján.

A találmány megvalósítása során használt mikroorganizmusok és plazmidok:

(a) pRVL425 (=HCMV-RV_Lh425-k), amelyet 1991. február 1-jén a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) intézetnél a DMS 6340 deponálási számon helyeztünk letétbe a Budapesti Szerződésben foglaltak szerint. Az expressziós vektor az egér eredetű 425 antitest hipervariábilis tartományainak (CDR) és a humanizált antitest könnyűlánca konstans (kappa-) és variábilis tartománya FR-einek szekvenciáit tartalmazza. Az R jelölés jelentése : újraalakított.

(b) pRVH425 (= HCMV-RV_Hg425-y), amelyet 1991. február 1-jén a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) intézetnél a DMS 6339 deponálási számon helyeztünk letétbe a Budapesti Szerződésben foglaltak szerint. Az expressziós vektor az egér eredetű 425 antitest hipervariábilis tartományainak (CDR) és a humanizált antitest nehézlánca konstans (gamma-1-) és variábilis tartománya FR-einek szekvenciáit tartalmazza. Az R jelölés jelentése: újraalakított.

(c) pCVL425 (=HCMV-CV_L425-k), amelyet 1991. február 1-jén a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) intézetnél a DMS 6338 deponálási számon helyeztünk letétbe a Budapesti Szerződésben foglaltak szerint. Az expressziós vektor az egér eredetű 425 antitest könnyűlánca variábilis tartományának hipervariábilis tartományai (CDR) és FR-ei szekvenciáit, valamint a humán immunglobulin könnyűlánca konstans (kappa-) tartománya szekvenciáit tartalmazza. A C jelölés jelentése : kiméra.

(d) _PCVH425 (=HCMV-CVh425-i), amelyet 1991. február 1-jén a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) intézetnél a DMS 6338 deponálási számon helyeztünk letétbe a Budapesti Szerződésben foglaltak szerint. Az expressziós vektor az egér eredetű 425 antitest könnyűlánca variábilis tartományának hipervariábilis tartományai (CDR) és FR-ei szekvenciáit, valamint a humán gamma-l-immunglobulin könynyűlánca konstans tartománya szekvenciáit tartalmazza. A C jelölés jelentése: kiméra.

(e) 425 hibridóma-sejtvonal, amelyet 1988. január 26-án az American Type Culture Collection (ATCC) intézetnél HB 9629 deponálási számon helyeztünk letétbe a Budapesti Szerződésben foglaltak szerint. A sejtvonal termeli az EGF-receptorra irányuló egér eredetű 425 antitestet.

Egyéb biológiai anyagok

A leírásban említett egyéb mikroorganizmusok, sejtvonalak, plazmidok, promoterek, rezisztenciamarkerek, replikációs origók vagy vektorok egyéb fragmentumai kereskedelmi úton vagy egyéb módon általánosan hozzáférhetők. Feltéve, hogy a leírás egyéb utalásokat

HU 219 537 Β nem tartalmaz, ezeket csak szemléltetésül használtuk, a találmány szempontjából nem alapvető fontosságúak, és helyettesíthetők egyéb alkalmas eszközökkel, illetve biológiai anyagokkal.

A megfelelő DNS-szekvenciák amplifikálásához előnyösen bakteriális gazdaszervezeteket használunk. Ilyen gazdaszervezetekre példák az E. coli vagy a Bacillus.

A találmány szerinti humanizált vagy kiméra antitestek előállításához alkalmasak az eukariótasejtek, így COS (SV40 eredetű CV1)- vagy CHO (kínaihörcsögpetefészek)-sejtek vagy a gombák. Előnyösen COSvagy CHO-sejteket alkalmazunk.

Az eljárás során használt általános módszerek

A találmány szerinti eljárás szempontjából alapvető módszereket a leírásban részletesen ismertetjük.

A részletesen nem ismertetett egyéb módszerek a szakember számára ismert szokásos módszereknek felelnek meg vagy részletes ismertetésük megtalálható az idézett forrásokban, közrebocsátási iratokban és a szakterület kézikönyveiben.

A következőkben röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra sematikusan szemlélteti a kiméra és újraformált humán antitestek kifejezéséhez használt vektorokat. Az expressziós plazmidok elkészítése során használt restrikciós helyek be vannak jelölve. A variábilis tartományt kódoló szekvenciákat sötét terület, a konstans tartományokat világos terület, a HCMV promotert és az enhancert vonalkázott terület, a pSVneo plazmidból származó nukleotidffagmentumot pedig pontozott terület jelöli. Az átírás irányait nyilak jelzik.

A 2. ábra a pUC18 plazmidba klónozott V_H425 (A panel) és V_L425 (B panel) cDNS nukleotid- és aminosavszekvenciáját mutatja be. A szignálhoz hozzájáruló aminosavak aláhúzással vannak jelölve, a CDR-ek pedig zárójelben szerepelnek. A variábilis tartományokat és a konstans tartományokat összeillesztő helyek is fel vannak tüntetve. Az ábrán a kiméra antitesteket kódoló gének elkészítése során használt első és hátsó PCRprimerek és összeforrasztási helyeik is láthatók.

A 3. ábra az újraalakított humán V_Ha425-öt kódoló szintetizált gélfragmentum nukleotid- és aminosavszekvenciáját tünteti fel. A szignálffekvencia aláhúzással van jelölve, a CDR-ekhez hozzájáruló maradék pedig zárójelben van.

A 4-1. és 4-2. ábra az egér eredetű, illetve humán 425 antitest variábilis tartományai aminosavszekvenciáit hasonlítja össze. Az A panelen találhatók az egér eredetű V_L (V_L425) és az újraformált humán V_LS (RV_La425 és RV_Lb425) szekvenciái. A B panelen láthatók az egér eredetű V_H (V_fI425) és az újraformált humán V_HS (RV_Ha425, RV_Hb425, RV_Hc425, RV_Hd425, RV_He425, RV_Hf425, RV_Hg425, RV_Hh425 és RV_Hi425) szekvenciái. Az FR- és CDR-tartomány ok fel vannak tüntetve. Az aminosavakat irodalmi adatoknak megfelelően számoztuk [Kábát és munkatársai (1987)].

Az 5A. és 5B. ábrák az egér eredetű MAb 425 variábilis tartományainak molekulamodelljét mutatják be.

A 6. ábra az EGF-receptorhoz való kötődés detektálását szemlélteti ELISA útján. Az antigénkötési aktivitást transzfektált COS-sejtek hígított felülúszóiban vizsgáltuk, és 450 nm hullámhosszon mért optikai sűrűségként ábrázoltuk az IgG-koncentráció függvényében (amelyet ELISA útján határoztunk meg, lásd a leírás anyagokat és eljárásokat ismertető részét). Az újraformált humán V_H tartományok összes változatát RV_La425-tel koranszfektáltuk, és a következőkben megadott módon tüntetjük fel az ábrán: RV_Ha425 A RV_Hb425 O, RV_hc425 A RV_Hd425 ®, RV_He425 □, RV_Hf425 KI,RV_Hg425 □,RV_Hh425 O,RV_Hi425 O, az RV_Lb425 kotranszfektált RV_Hb425 jelölése ♦. A kiméra VL425 és VH425 kotranszfekcióját · jelöli.

A 7A. és 7B. ábra az antigénhez való kötődési versengést mutatja. A 7A. ábra jelzett, egér eredetű 425 antitest, valamint (1) nem jelzett, egér eredetű 425 antitest (+); és (2) HCMV-CV_L425-kappa és HCMV-C„425-gamma-1 bevonásával végzett kotranszfekció után COS-sejtekkel előállított kiméra 425 antitest (·) közötti versengést mutatja.

A 7B. ábra jelzett, egér eredetű 425 antitest, valamint (1) nem jelzett, egér eredetű 425 antitest (+); és (2) HCMV-RV_L425-kappa és HCMV-RV_Hi425-gamma-1 (O,) továbbá HCMV-RV_La425-kappa és HCMV-RV_Hg425-gamma-l (□) bevonásával végzett kotranszfekció után COS-sejtekkel előállított, újraformált humán 425 antitest közötti versengést mutatja.

A vízszintes tengelyen mindegyik esetben az inhibitor koncentrációja (ng/ml) van feltüntetve. A függőter ges tengely a kötődés gátlását mutatja %-ban.

A 8A. és 8B. ábra különböző újraformált humán V_L tartományoknak az antitestkötődésre gyakorolt hatásának vizsgálati eredményeit tünteti fel. A 8A. ábra olyan újraformált humán antitestek révén lejátszódó antigénkötődést mutat be, amelyeket HCMV-CV_L425-kappa és HCMV-CV_H425-gamma-l (», HCMV-RV_La425kappa és HCMV-RV_Hg425-gamma-l (□), HCMVRV_Lb425-kappa és HCMV-RV_Hg425-gamma-l (), HCMV-RV_La425-kappa és HCMV-RV_Hc425-gamma1 (A), valamint HCMV-RV_Lb425-kappa és HCMVRV_Hc425-gamma-l (A) bevonásával transzfektált COS-sejtekben állítottunk elő.

A 8B. ábra jelzett, egér eredetű 425 antitest, valamint (1) nem jelzett, egér eredetű 425 antitest (+); és (2) HCVM-V_La425-kappa és HCVM-V_Hg425gamma-1 (□), illetve HCMV-V_Lb425-kappa és HCMV-V_Hg425-gamma-l () bevonásával kotranszfektált COS-sejtekben előállított újraformált humán 425 antitestek közötti versengést mutatja.

A 8A. ábrán a függőleges tengely jelentése a 450 nm hullámhosszon mért optikai sűrűség (OD₄₅₀), míg a vízszintes tengelyen az IgG koncentrációja (pg/ml) van feltüntetve. A 8B. ábrán a vízszintes tengelyen az inhibitor koncentrációja (pg/ml), a függőleges tengelyen a kötődés %-ban kifejezett gátlása van feltüntetve.

HU 219 537 Β

A 9A. ábrán újraformált (1. és 2. sáv), kiméra (3. sáv) és egér eredetű (4. sáv) MAb 425 minták elemzése látható SDS-PAGE eljárással nem redukáló (a) körülmények között. Redukáló (b) körülmények között vizsgált minták közül is újraformált (7. és 8. sáv), kiméra (9. sáv) és egér eredetű (10. sáv) látható. Az 5., 6., 11. és 12. sáv molekulatömeg-marker.

A 9B. ábra újraformált MAb 425 Superose 12 használatával végrehajtott gélszűréses tisztítását mutatja be. A 2 csúcs az IgG-nek felel meg.

A 10. ábra egér eredetű, kiméra és újraformált MAB 425 minták EGF-receptorokhoz való kötődési versengését mutatja be. A függőleges tengelyen a kötött (MAb) és a teljes (MAb) aránya van feltüntetve %bán. A vízszintes tengelyen az antitest koncentrációja van felmérve [mol/1 (lóg)].

A használt jelölések:

V jelentése egér eredetű MAb 425

O jelentése kiméra MAb 425 ·, ▼ jelentése újraformált MAb 425.

A 11. ábrán EGF és antitestek EGF-receptorokhoz való kötődési versengése látható. A függőleges tengelyen a kötött/teljes (MAb) arány van feltüntetve %-ban. A vízszintes tengelyen az antitest koncentrációja van felmérve [mol/1 (lóg)].

A használt jelölések:

O jelentése egér eredetű MAb 425

Z\, V, □, jelentése újraformált MAb 425.

MAb 425 génjei variábilis tartományának klónozása és szekvenálása

A kappa-lánc primer használatával végzett cDNSszintézis és -klónozás után előnyösen 300-400 kolóniát választunk ki a válogatókísérletek számára. A gamma-2a prímért használó cDNS-szintézis és -klónozás után előnyösen 200-300 kolóniát választunk ki válogatókísérletekhez. A két megfelelő klónozóprimert használva a hibridizáció útján végzett válogatás után 20-30 könnyűlánc-kolónia és 10-20 nehézlánc-kolónia ad erős jelet. Ezekből a kolóniákból plazmid-DNS-t izolálunk, és a cDNS-betoldások méretének meghatározására szokásos és kereskedelemben kapható restrikciós enzimmel emésztve elemezzük. A V_L és V_H klónozásához 400-500 bp, illetve 500-600 bp betoldású kiónokat választunk ki a szekvenálás alanyaiként. Mindkét szálon három V_L és három V_H kiónt szekvenálunk, ehhez M13 univerzális és reverz szekvenálóprimereket használunk. A három lehetséges szekvenált V_L klónból az egyik a teljes variábilis tartományt kódolja, míg a többiek idegen peptideket kódolni látszanak. A V_H kiónok közül kettő azonos V_H tartományokat kódol, míg a többi olyan V_H tartományt kódolni látszik, amely a szignálszekvencia és FR-1 között még tartalmazza az intront. A harmadik V_H klón az introntól eltekintve olyan kódolószekvenciát tartalmaz, amely azonos az első két kiónéval. A V_L tartomány szekvenciájának igazolására további három cDNS-klónt szekvenálunk, amelyek megfelelő méretű betoldásokat tartalmaznak. Kettő ezek közül az első V_L kiónnal egyezésben lévő szekvenciákat ad. A harmadik idegen DNS-szekvencia. A szekvenált kiónokban nincs mindegyik eredeti primer szekvencia jelen. A kiiktatások mértéke klónról kiónra változik. Ezek a valószínűleg a cDNS-szintézis és -klónozás során bekövetkező kiiktatások csökkenthetik a kolóniaválogatás hatásosságát.

A MAb 425 V_L és V_H génjeit a 2. ábra mutatja. A 425 antitest V_L és V_H tartományai aminosavszekvenciáját összehasonlítottuk szakirodalmi adatbázisban közölt egyéb egér eredetű variábilis tartományokkal [Kábát és munkatársai (1987)]. A V_L tartomány az egér-kappa-lánc variábilis tartományának IV. vagy VI. alcsoportjába sorolható be. Az FR-eken belül a 425 V_L tartomány közelítőleg 86%-os egyezést mutat az egérkappa-lánc IV. alcsoportjával és közelítőleg 89%-os egyezést a VI. alcsoporttal. A 425 V_L tartomány láthatóan a JK4 szegmenst használja. A V_H tartomány vizsgálata közelítőleg 98%-os egyezést mutat az egémehézlánc II. (B) alcsoport konszenzusszekvenciájának FR-eivel.

Egy humán immunglobulin alkalmas osztálya vagy alcsoportja megfelelő megválasztása függ a nem humán antitestben eredetileg jelen lévő lánccal való egyezés mértékétől. A találmány értelmében levezetett konszenzusszekvenciának 65-70%-nál nagyobb mértékben meg kell egyeznie az eredeti nem humán lánc szekvenciájával.

A nehézláncok konszenzusszekvenciái előnyösen azonban a humán nehézlánc I. alcsoport konszenzusszekvenciái. Egyéb antitestek számára viszont megfelelnek egyéb humán nehézláncok konszenzusszekvenciái. Az előnyös konszenzusszekvenciák módosítottak. Az aminosavak lehetséges kicserélése a találmány értelmében 0-10% előnyösen 5-10% mértékű.

Kiméra 425 antitest készítése és kifejezése

Ahhoz, hogy a V_L és V_H tartományokat kódoló cDNS-eket alkalmazhassuk a kiméra 425 antitest elkészítése során, számos módosítás elvégzése szükséges az 5’- és a 3’-végen. Ezek magukban foglalják megfelelő restrikciósenzim-helyek beiktatását úgy, hogy a HCMV expressziós vektorokba kényelmesen szubklónozhatók legyenek a variábilis tartományt kódoló szekvenciák. A 3’-vég túlnyúló tartományaiban újra létesíteni kell donorillesztő helyeket úgy, hogy a variábilis tartományok korrekt módon és hatásosan illeszkedjenek a konstans tartományokhoz. Az 5’-vég túlnyúló tartományai is módosítottak abban az értelemben, hogy olyan szekvenciát tartalmaznak, amely az eukariótariboszómák útján végbemenő transzlációhoz hatásos kiindulási helyeket létesít [Kozák (1987)]. Ezeket a módosításokat PCR-primerek használata útján visszük be. A használt primereket az I. táblázat tünteti fel.

HU 219 537 Β

1, táblázat

A cDNS-klónozáshoz, kimérakészítéshez és mutagenezishez használt oligonukleotidok. Az aláhúzott részletek olyan bázisokat jelölnek, amelyek a humán kerettel olvadnak össze.

Sorszám	Szekvencia	Megnevezés
1.	5’-GTAGGATCCTGGATGGTGGGAAGATG-3’	cDNS-szintézishez könnyűláncprimer
2.	5 ’ -GTAGGATCCAGTGGATAGACCGATG-3’	cDNS-szintézishez nehézláncprimer
3.	5’-CTCCAAGCTTGACCTCACCATGG-3’	kiméra VH első primer
4.	5’-TTGGATCCACTCACCTGAGGAGACTGTGA-3’	kiméra VH hátsó primer
5.	5 ’ -AGAAAGCTTCCACCATGGATTTTCAAGTG-3’	kiméra VL első primer
6.	5 ’ -GTAGATCTACTCACGTTTTATTTCCAAC-3’	kiméra VL hátsó primer
7.	5’-ACCATCACCTGTAGTGCCAGCTCAAGTG TAACTTACATGTATTGGTACCAGCAG-3’	újraformált VL CDR-1 primer
8.	5’-CTGCTGATCTACGACACATCCAACCTGGC TTCTGGTGTGCCAAGC- 3’	újraformált VL CDR-2 primer
9.	5 ’ - ACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACATATTCACGTTCGGCCAA- 3 ’	újraformált VL CDR-3 primer
10.	* 5 ’ -AGCGGTACCGACTACACCTTCACCATC-3’	primer F71Y beviteléhez RVL-be
11.	* * 5’-ATACCTTCACATCCCACTG-3’	primer S30T beviteléhez RVH-ba
12.	♦ * 5 ’ -CGAGTGGATTGGCGAGT- 3 ’	primer V48I beviteléhez RVH-ba
13.	* * * 5’-TTTAAGAGCAAGGCTACCATGACCGTGGACACCTCT-3’	primer R66K, V67A, L71V beviteléhez RVH-ba
14.	♦ 5 ’ -CATGACCGTGGACACCTCT-3’	primer L71V beviteléhez RVH-ba

A cDNS mindegyik variábilis tartományához előnyösen két primer van konstruálva. Az első printerekben 15 bázist használunk a primer 3’-végénél ahhoz, hogy a prímért a templát DNS-hez hibridizáljuk, míg a primer 5’-vége egy HindlII helyet és a „Kozak”szekvenciát tartalmazza. A hátsó primerek hasonló módon vannak konstruálva; a 3’-végnél 15 bázissal a printernek a templát DNS-hez hibridizálásához, a primer 5’-vége pedig BamHI helyet és donorillesztő helyet tartalmaz. A könnyűlánc hátsó primer esetében a BamHI hely helyett BglII helyet használunk, minthogy a V_H-t kódoló cDNS belső BamHI helyet tartalmaz (2. ábra). A PCR-reakciót előnyösen a példákban leírt módon folytatjuk le.

A PCR-módosított V_L tartományt tartalmazó DNS-t HindlII-BglII fragmentumként klórozzuk a HCMV könnyűlánc-expressziós vektor HindlII-BamHI helyére. Ez a vektor már tartalmazza a szükséges felvevőillesztő hellyel és poli(A⁺) helyekkel ellátott humán genom kappa konstans tartományt. Az egész PCRmódosított V_L fragmentumot két primer használatával szekvenáljuk, amelyek az expressziós vektorban lévő klónozási helyen túlnyúló helyekkel kapcsolódnak össze. A szekvenálás igazolja, hogy a PCR-lépés során nem kerültek be hibák. A PCR-módosított V_H DNS-t HindlII-BamHI fragmentumként klórozzuk a HCMV nehézlánc-expressziós vektorba, és szintén szekvenálást végzünk annak igazolására, hogy PCR-hibákat nem tartalmaz. A humán genom gamma-1 konstans tartományát tartalmazó BamHI fragmentumot inzertáljuk a HCMV-CVH-vektorba a V_H tartomány 3’-oldalán. Ez a fragmentum tartalmazza az in vivő előforduló V-C illesztéshez a szükséges felvevő-illesztő helyet és a természetes előfordulású poli(A+) helyet.

A kiméra 425 V_L és V_H tartományokat tartalmazó expressziós vektorokat alkalmas eukariótasejtekbe, előnyösen COS-sejtekbe kotranszfektáljuk. Közelítőleg 72 óra időtartamú tranziens jellegű kifejezés után a sejtek tápközegét ELISA útján vizsgáljuk humán IgG termelése és EGF-receptor proteinhez kötődés szempontjából. A közegben kimutatott humán IgG mennyisége 100-400 ng/ml tartományban változik. Szokásos antigénkötő ELISA-vizsgálatban a termelt kiméra antitest jól kötődik az EGF-receptor-proteinhez, igazolva ezáltal azt, hogy a megfelelő egér eredetű variábilis tartományokat klónoztuk és szekvenáltuk.

Újraformált humán 425 könnyű- és nehézláncok kezdeti tervezése konstruálása és kifejezése

Az újraformált humán 425 antitest tervezése során a legnagyobb figyelmet a V_H tartománynak szenteltük, minthogy az antigénkötődésben gyakran ez a dómén a legfontosabb [Amit és munkatársai (1986), Verhoeyen

HU 219 537 Β és munkatársai (1988)]. Azon humán FR-ek kiválasztására, amelyekkel egér CDR-eket összeforrasztjuk, az egér MAb 425 V_H tartományának FR-eit a humán V_H tartományok mindegyik alcsoportjára nézve összehasonlítjuk a konszenzusszekvenciák FR-eivel [Kábát (1987)]. Ez azt mutatja, hogy az egér Mab 425 V_H FR-ei nagymértékben hasonlóak a humán V_H I. alcsoportja FR-eivel, ez megközelítőleg 73%-os egyezést jelent az FR-eken belül és megközelítőleg 65%-os egyezést a V_H tartományok egészére vonatkoztatva.

Az egér 425 V_H tartományt továbbá ugyanazon Kabat-alcsoportokból származó egyéb egér V_H tartományokkal hasonlítottuk össze olyan FR-csoportok azonosítására, amelyek jellemzőek a MAb 425-re, és ezért az antigén kötődésében szerepet játszhatnak. Az egér MAb 425 V_H tartomány 94-es pozíciójában lévő csoport szerin, míg az egér eredetű II. (B) alcsoport és a humán I. alcsoport egyéb V_H tartományaiban a 94-es pozícióban lévő csoport arginin [Kábát (1987)]. Ez az aminosavhelyettesítés szokatlan, és - minthogy a 94-es pozíció CDR-3-mal szomszédos - meglepően fontos pozícióban következik be. Ezen okoknál fogva az újraformált humán 425 V_H tartományt előnyösen egér MAb 425 CDR-eknek és humán I FR-ek konszenzusszekvenciájából származtatott FR-eknek alapján tervezzük meg a szakirodalomban ismertetett módon [Kábát és munkatársai (1987)]. FR-3-ban a 94-es pozíciók az egér MAb 425-ben megállapított módon szerint tartalmaznak. A humán I. alcsoport FR-ek konszenzusszekvenciájában azokban a pozíciókban, ahol nem egyetlen aminosav van felsorolva, az azon pozícióban legáltalánosabban előforduló aminosavat választjuk. Ha a humán konszenzusszekvencia meghatározott pozíciójában nincs kitüntetett aminosav, azt az aminosavat választjuk, amely az egér MAb 425 V_H szekvenciájának adott pozíciójában található. Az eredményül kapott aminosavszekvencia tartalmazza az újraformált humán 425 V_H első verzióját („a” verzió, 3. ábra). Az újraformált humán 425 V_H valamennyi ezt követő változata ezen első változat módosítása.

Az előzőekben leírt módon egy olyan 454 bp DNSffagmentumot terveztünk meg és szintetizáltunk, amely az újraformált humán 425 V_H tartományt kódolja (lásd a példákat és a 3. ábrát). Az újraformált humán 425 V_H tartomány aminosavjait kódoló DNS-szekvenciákon kívül ez a DNS-fragmentum humán szignálszekvenciát kódoló szekvenciákat is tartalmaz. A humán szignálszekvencia forrása lehet például a HG3 CL antitest [Rechavi és munkatársai (1983)], amely humán V_HI. alcsoportjának tagja [Kábát és munkatársai (1987)]. A szintetikus DNS-fragmentum az 5’-végnél eukarióta transzlációs szignálokat [Kozák (1987)], a 3’-végnél donorillesztő helyet [Breathnach és munkatársai (1978)] továbbá az 5’- és 3’-végnél HindlII, illetve BamHI helyeket is tartalmaz a HCMV expressziós vektorba történő szubklónozáshoz.

Hasonló eljárást folytatunk le az újraformált humán 425 V_L tartomány tervezése során. Az egér MAb 425 V_L tartomány FR-eit összehasonlítjuk a humán V_L tartományok összes alcsoportjának konszenzusszekvenciáival [Kábát és munkatársai (1987)]. Az FR-eken belül megközelítőleg 71%-os egyezést találunk az egér 425 V_L és a humán kappa V_L III. alcsoportja között, valamint megközelítőleg 70%-os egyezést a humán kappa V_L I. alcsoporttal. Humán kappa V_L I. alcsoport humán FR-eit kódoló DNS már hozzáférhető az újraformált humán Dl.3 V_L tartománya [239 400 számú európai szabadalmi leírás] és újraformált humán CAMPATH-1 [Reichmann és munkatársai (1988)] útján. E két humán antitestben lévő újraformált humán V_L tartomány tervezése a humán immunglobulin REI protein megoldott szerkezetén alapszik [Épp és munkatársai (1975)]. Ezen okoknál fogva az újraformált humán 425 V_L-ben az újraformált humán Dl.3 és CAMPATH-1H eredetű humán V_L FR-eit is használjuk. Az egér 425 V_L tartomány FR-einek összehasonlítása hasonló alcsoportokból származó egyéb egérantitestek FR-eivel funkcionálisan fontos pozíciókban lévő aminosavcsoportok terén nem mutatnak szignifikáns eltéréseket. A humán FR-ekben ezért nincs szükség változtatásokra. Az újraformált humán 425 V_L tartomány aminosavszekvenciájának „a” változatát a 4. ábra mutatja.

Az újraformált humán 425 V_L tartomány elkészítéséhez három olegonukleotidot tervezünk, amelyek az egér 425 V_L tartomány három CDR-ét kódoló belső DNS-szekvenciákat tartalmaznak, tartalmaznak továbbá 12 bázist az 5’- és 3’-végeken abból a célból, hogy az újraformált humán Dl.3 V_L tartományban lévő humán FR-eket kódoló DNS-szekvenciákhoz hibridizáljanak (lásd a 7-9. oligonukleotidot az 1. táblázatban)? A CDR-összeforrasztást a példákban leírt módon végezzük. A válogatókísérletekből származó vélt pozitív kiónok DNS-szekvenálása után a háromszoros mutáns, bruttó kitermelése 5-15%, előnyösen 9-10%. A HCMV-RV_La425-kappa plazmid előállítására PCRhibát nem tartalmazó, újraformált humán 425 V_L tartományt klónozunk HindlII-BamHI fragmentumként a könnyűlánc expressziós vektorába (1. ábra).

Az újraformált humán 425 V_L és V_H tartományokat tartalmazó két expressziós vektort ekkor megfelelő sejtekbe kotranszfektáljuk (lásd az előzőekben), és vizsgáljuk a funkcionális, újraformált humán 425 antitest tranziens kifejezését. Megközelítőleg 72 óra időtartam után a sejtek felülúszóját összegyűjtjük, majd ELISA útján megvizsgáljuk humán IgG-tartalmára. Humán IgG a 100-500 ng/ml tartományban mutatható ki, az antigénkötődés meghatározására végzett ELISA-vizsgálatban azonban meglepő módon nem mutatható ki az EGFreceptorhoz kötődés. Ha a sejteket HCMV-RV_La425kappa/HCMV-CV_H425-gamma-l használata mellett kotranszfektáljuk, humán IgG termelődik, és az az EGFreceptorokhoz kötődik. Ha viszont a sejteket HCMVCV_L425-kappa/HCMV-RV_Ha425-gamma-l használata mellett kotranszfektáljuk, termelődik humán IgG, de kimutatható mértékben nem kötődik az EGF-receptorokhoz. Ezen váratlan eredmények alapján nyilvánvaló, hogy az újraformált humán 425 V_H FR-eiben további találmányi szintű módosítások szükségesek ahhoz, hogy funkcionális antigénkötő helyet kapjunk.

HU 219 537 Β

Módosítások az újraformált humán 425 V_H tartomány FR-eiben

Az egér 425 variábilis tartománya doménjeinek molekuláris modellje alapján további változtatásokat eszközlünk az újraformált humán 425 V_H tartomány FReiben. Az újraformált humán V_H tartomány CDR-hurkait megvizsgáljuk arra nézve, mennyire illeszkednek a szakirodalomban ismertetett kanonikus szerkezetekbe [Chotia és munkatársai (1989)]. Ezen vizsgálatok folyományaként bizonyos változtatásokat hajtunk végre az FR-ekben. Az FR-ekben egyéb változtatásokat funkcionális, újraformált humán anti-Tac antitest alapján végzünk, amelyeket az I. alcsoportból származó humán FR-ek alapján terveztünk meg [Queen és munkatársai (1989)]. Meglepő módon az egér anti-Tac antitest V_H tartománya közelítőleg 79%-os egyezést mutat az egér 425 antitest V_H tartományával. Ezt követően a találmány értelmében elkészítjük az egér 425 variábilis tartományainak egy molekuláris modelljét (5. ábra). A modell a HyHEL-5, egy strukturálisan megoldott antitest szerkezetén alapszik, amelynek variábilis tartományai nagyfokú homológiát mutatnak az egér eredetű 425 antitestével. Az előzőekben említett elemzés eredményeként az újraformált humán 425 V_H tartomány 30, 48, 67, 68 és 71-es pozícióiban lévő aminosavcsoportokat cseréljük ki, hogy azonosak legyenek az egér 425 V_H tartomány azon pozícióiban előforduló aminosavakkal. Ezen változtatások egyedi hatásainak megállapítására a szóban forgó változtatások kombinációinak számos változatát állítjuk elő és vizsgáljuk meg a találmány értelmében.

Összesen az újraformált humán 425 V_H tartomány 8 új változatát állítjuk elő (lásd a 4. ábrát). A példákban részletesen ismertetett eljárásokkal előállított változatokból további változatokat állítunk elő azáltal, hogy az előző változatok rövid DNS-ffagmentumait rekombináljuk. Amikor már valamennyi kívánt változat előnyösen pUC 18-ba van beépítve, az újraformált humán 425 V_H tartományokat HindlII-BamHI fragmentumokként visszük be a HCMV-V_h expressziós vektorba, és ezáltal a HCMV-RV_H425-gamma-l plazmid „b”-„i” változatait állítjuk elő (4. ábra).

Módosítások az újraformált humán 425 V_L tartományban

Bár az újraformált humán 425 könnyűlánc „a” változatát és a kiméra 425 nehézláncot kifejező vektorokkal kotranszfektált megfelelő sejtek az EGF-receptorhoz kötődő antitestet termelnek, az újraformált humán könnyűláncot tartalmazó antitest - úgy tűnik - nem kötődik olyan jól, mint a kiméra 425 antitest. Az egér eredetű 425 és az újraformált humán 425 „a” változat V_L tartományainak vizsgálata során megállapítást nyert, hogy a CDR-1 (Ll) kanonikus szerkezet részét képező, 71-es pozícióban lévő csoport nem maradt meg az „a” változatban [Chothia és munkatársai (1989)]. Ezen pozícióban a Phe —» Tyr kicserélésre előnyösen a PCR-mutageneziseljárás [Kamman és munkatársai (1989)] használatos. E mutagenezisből származó HindlII-BamHI fragmentumot visszük be a HCMV-VL expressziós vektorba HCMV-RV_Lb425-kappa előállítására (4. ábra).

Az újraformált humán 425 V_H tartomány új változatainak elemzése

Az újraformált humán V_H „a”-„i” változatait tartalmazó expressziós vektorokat az újraformált humán V_L tartomány „a” változatát tartalmazó expressziós vektorral együtt az előzőekben ismertetett sejtekbe kotranszfektáljuk. Mintegy 3 nap múlva a sejtek felülúszóit ELISA útján humán IgG-termelés tekintetében megvizsgáljuk. A termelés az 50-500 ng/ml tartományban változik. Ezután a mintákat EGF-receptorokhoz kötődni képes humán IgG vonatkozásában vizsgáljuk ELISA segítségével. Az újraformált humán V_H tartományok különböző változatai széles tartományban változó antigénkötődést eredményeznek (6. ábra). Az antigénkötődés ezen ELISA-vizsgálatában a különböző újraformált humán 425 antitestek közvetlenül összehasonlíthatók a kiméra 425 antitesttel, az egér 425 antitesttel azonban nem. Ennek az az oka, hogy az antigénhez való kötődés detektálására használt antitest anti-humán IgGantitest. Az újraformált humán V_H tartomány kilenc változatát csoportosíthatjuk EGF-receptorokhoz való kötődési képességük alapján. Az újraformált humán V_H tartomány „g” és „i” változatai adják a legnagyobb mértékű kötődést, ezt követik a „c”, „f ’ és ,4t” változatok, majd pedig a „b” változat következik. Néhány kísérletben az „e” változat csekély, de detektálható mértékű kötődést mutat. Az „a” és „d” változatok egyetlen esetben sem mutatnak kötődést.

A kötődési versengés vizsgálatát használtuk ahhoz, hogy V_H „g” és „i” változatait tartalmazó újraformált humán 425 antitesteket és a kiméra 425 antitestet összehasonlítsuk az egér 425 antitesttel (7. ábra). Minthogy a sejtek felülúszójában lévő antitestek nincsenek tisztítva; és ezért mennyiségűket ELISA útján határozzuk meg, a kötődési versengés vizsgálati eredményei inkább a kötődés viszonylagos mértékének tekinthetők, mint az affinitás pontos mennyiségi meghatározásának. Négy kísérletből származó mintákkal például COS-sejtekben végzett kötődési versengési vizsgálatok az antigénhez való kötődés viszonylagos mértékére vonatkozóan konzisztens eredményeket adnak. A kiméra 425 antitest számottevően verseng a jelzett egér 425 antitesttel, és a kötődés olyan %-os gátlását váltja ki, amely csekély mértékben kisebb, mint amelyet jelzett egér 425 antitesttel versengő nem jelzett egér 425 antitest esetén kapunk (7A. ábra). V_La és V_Hg tartományokat tartalmazó újraformált humán antitestek jobbak, mint a V_La és V_Hi tartományokat tartalmazók (7B. ábra). A kötődési görbék platótartománya pontjainak összehasonlítása azt mutatja, hogy a V_Hg-t tartalmazó újraformált humán antitest 60-80%-os mértékben vetekszik a jelzett egér 425 antitesttel az azonos vizsgálatban a nem jelzett egér 425 antitesttel kapott eredményekhez hasonlítva. Ha átlagoljuk azokat az eredményeket, amelyeket négy független kísérletből származó mintákat például COS- vagy CHO-sejtekben használva kaptunk, a V_La- és V_Hg-tartalmú újraformált humán antitestre az egér 425 antitest kötődése 60-80%-ának megfelelő értéket kapunk.

Ezen eredmények alapján értelmezhetővé válik az egyes csoportok viszonylagos hozzájárulása az antigén10

HU 219 537 Β kötődéshez. Ezen vizsgálatokban a legszignifíkánsabb egyedi csere az L71V csere. Enélkül meglepő módon nem figyelhető meg kötődés az antigénhez (vesd össze a V_H „a” és „b” változatait). Meglepő módon az R67K és V68A cserék is fontosak a kötődés szempontjából (vesd össze a V_H „b” és „c”, illetve „i” és „h” változatait). Míg az egyedüli V48K1 csere, továbbá az együttes V48I és S30T csere nem vezet szignifikáns antigénkötődéshez, az ezen pozíciók mindegyikében végrehajtott csere fokozza az antigénkötődést. Az S30T csere hatása váratlan módon meghaladja a V48I cseréét (vesd össze a V_H „g” és „i”, valamint „f” és „i” változatait).

Az újraformált humán 425 V_L tartomány új változatának vizsgálata

Az RV_Lb425-öt tartalmazó expressziós vektort az újraformált humán V_H tartomány „b”, „c” vagy „g” változatát tartalmazó expressziós vektorral együtt alkalmas, előnyösen eukariótasejtekbe kotranszfektáljuk. A sejtek felülúszóját összegyűjtjük, és humán IgG-termelés tekintetében, majd pedig EGF-receptorokhoz kötődni képes humán IgG vonatkozásában vizsgáljuk (8A. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az újraformált humán 425 V_L „b” változata fokozza az antigénhez való kötődést. Ezután a kötődési versengés vizsgálatát végezzük el V_La-t és V_Hg-t, illetve V_Lb-t és V_Hg-t együttesen tartalmazó újraformált humán 425 antitestek egér 425 antitesttel történő összehasonlítására. A V_L tartomány „b” változatát tartalmazó újraformált humán MAb 425 antigén iránti aviditása nagyobb. Ezért a V_L-ben végrehajtott F71Y csere növeli az antigénhez kötődést. A V_Lb és V_Hg tartományt tartalmazó újraformált humán MAb 425 antigén iránti aviditása az egér MAb 425 aviditásának 60-80%-át teszi ki.

V_Lb-t és V_Hg-t együttesen tartalmazó újraformált humán antitesttel végzett egyéb kísérletekből (10. és 11. példa) látható, hogy az EGF-receptorhoz való kötődési képesség a kiméra, újraformált és egérantitestek vonatkozásában hasonló.

A találmány szemlélteti, hogy az FR csoportjaiban végrehajtott viszonylagosan konzervatív cserék jelentős mértékben befolyásolhatják az antigénhez való kötődést.

Az egér 425 variábilis tartományainak molekuláris modellje a V_H 30-as pozíciójában lévő csoportot egyértelműen a molekula felületén, CDR-1 szomszédságában mutatja. Irodalmi adatok szerint Hl ténylegesen a 26-tól a 32-ig terjedő pozíciókban lévő csoportokra terjed ki [Chothia és Lesk (1987)], így magában foglalva a 30-as pozícióban lévő csoportot. Ha a CAMPATH-1H antitestben a 30-as pozícióban Ser -> Thr cserét hajtunk végre, ez nem befolyásolja az antigénhez kötődést. Ha újraformált humán V_H425 30-as pozíciójában végzünk Ser -» Thr cserét, az antigénhez való kötődés fokozódik. Úgy tűnik, hogy a 30-as pozícióban lévő aminosav ezen sajátos antitest-antigén kölcsönhatás terén szerepet játszik az antigénkötődésben. Minthogy az S30T csere csupán kis mértékben fokozza az antigénkötődést és ez a csere nem alapvető fontosságú az antigénkötődés szempontjából, a 30-as pozícióban lévő Thr csak gyenge kölcsönhatásban van az antigénnel.

A V_H 71-es pozíciójában lévő csoport cseréje erősen befolyásolja az antigénkötődést. Ez meglepő, minthogy az ezen pozícióban vizsgált két, a Val és Leu aminosavakból származó gyök csak egy metilcsoportban különbözik egymástól. Az egér 425 antitest H₂ a szakirodalomban ismertetett H₂ a 2. csoport kanonikus szerkezeteinek része [Chothia és munkatársai (1989)]. A HyHEL-5-ben lévő H₂ aminosavszekvenciája hasonló az egér 425 antitest H₂-ben lévőhöz. A HyHEL-5ben a CDR-2 52A pozíciójánál egy Pro egység tölti ki az FR-ek 71-es pozíciójánál lévő kisméretű aminosav (Alá) által létesített üreget. Az egér 425 variábilis tartományai modelljében hasonló kölcsönhatás van a Pro52A és a Val-71 között. Bár az egér 425 V_H esetében az 52A pozíciónál lévő Pro belefér a 71-es pozíciónál lévő üregbe, Val-71 helyettesítése Leu egységgel olyan molekuláris feszültséget kelthet, amely megváltoztathatja a CDR-2 hurok konformációját. Emiatt az újraformált humán V_H 425-ben a V71L csere helyreállítja a CDR-2FR kölcsönhatást, amint az az egér 425 V_H esetén fennáll. Ez meglepő módon jelentősen javítja az újraformált humán 425 antitest antigénkötődési tulajdonságait (vesd össze a 6. ábrán a V_H „a”, illetve „b” változatait tartalmazó újraformált humán antitesteket).

A V_L 71-es pozíciójában végrehajtott csere valószínűleg befolyásolja a CDR-konformációt, minthogy a 71-es helyzetű csoport tagja az L1 (CDR-1) számára javasolt kanonikus szerkezetnek [Chothia és munkatársai (1989)]. A CDR-l-ben lévő 29-es pozíciójú csoport a molekulafelszín alatt helyezkedik el, és érintkezik az FR-ek 71-es pozíciójú csoportjával. Az egér 425 antitestben V_L-ben a 71-es csoport Tyr. Az újraformált humán V_L-ek előállításához használt humán FR-ekben ez a csoport Phe. Úgy tűnik, hogy a Tyr csoportban előforduló, a Phe csoportban viszont hiányzó hidroxilcsoport szerepet játszik CDR-1 helyes konformációjának fenntartásában.

Az egér 425 variábilis tartományainak molekuláris modelljéből úgy tűnik, hogy Lys-66 az Asp-86-tal sóhidat képez. A 66-os pozícióban a nagyobb méretű Arg bevitele szétfeszítené a szerkezetet. Ala-67 kölcsönhatásban lehet CDR-2-vel, a 66-os és 67-es pozíciójú csoportok egyidejű kicserélése Arg és Val csoportokra - mint V_H425 esetében - fordított szterikus hatást gyakorolhatna CDR-2-re. A 48-as pozícióban lévő csoportot a molekulafelszín alatt elhelyezkedőnek tartják [Chothia és Lesk (1987)], és a modell igazolja ezt. A 48-as pozícióban lévő He csoport - amint az az egér 425 antitestben található - az I. alcsoport humán V_H tartományaiban talált Val csoportra cserélése a szerkezet teljes szétfeszítése révén befolyásolhatná az antigénkötődést. A 48-as pozícióban lévő aminosav is közel van CDR-2-höz, és enyhe szterikus hatást fejthet ki a CDR-2 hurokra.

A kötődési versengésre vonatkozó vizsgálatok szerint a legjobb újraformált humán V_L és V_H tartomány a V_Lb és V_Hg. V_Hg az FR-nek az előzőekben tárgyalt mind az 5 cseréjét tartalmazza, ezenkívül a 94-es pozíciónál végrehajtott cserét, amely az újraformált humán 425 V_H tartomány első változatában van. Az újraformált humán 425 V_L tartomány „b” változatában lévő

HU 219 537 Β

FR-ek 70%-os egyezést mutatnak az egér 425 V_L tartományban lévőkkel. Az újraformált humán 425 V_H tartomány „g” változatában lévő FR-ek 80%-os egyezést mutatnak egérben találhatókkal.

Az antitestek terápiás és diagnosztikai alkalmazása

A találmány szerinti antitestek humán betegeknek terápiái vagy diagnosztikai célból ismert módon beadhatók. Jellemzően az antitestet vagy antitestfragmentumokat parenterálisan, előnyösen intraperitoneálisan lehet beadni. A találmány szerinti monoklonális antitestek azonban intravénásán is beadhatók.

Az antitest megfelelő beadandó titerjeinek meghatározása a technika állásából ismert. A találmány szerinti monoklonális antitestek beadásra szánt adagolási tartományai általában elegendően nagyok ahhoz, hogy a kívánt tumorgátló hatást kiváltsák. Az adagolás ne legyen annyira nagy, hogy káros mellékhatásokat, így nem kívánt keresztreakciókat, anafilaktikus reakciókat és hasonlókat okozzon. Az adagolás általában függ a beteg korától, állapotától, nemétől és a betegség súlyosságától; az adagolást szakember meg tudja határozni. Bármilyen ellenindikáció, immuntolerancia vagy hasonló állapotok esetén az adagolást a kezelőorvos határozhatja meg. Az adagolás 0,1 mg/kg és 70 mg/kg között, előnyösen 0,1 mg/kg és 500 mg/kg lehet dózisonként naponta egy vagy több adagban beadva egy vagy több napon keresztül.

Parenterális beadásra szánt készítmények vizes vagy nemvizes oldatokat, szuszpenziókat és emulziókat foglalnak magukban. Nemvizes oldószerekre példák a propilénglikol, polietilénglikol; növényi olajok, így olívaolaj és befecskendezhető szerves észterek, így etil-oleát. Vizes hordozók többek között a víz, alkoholos/vizes oldatok, emulziók vagy szuszpenziók, beleértve a sóoldatokat és pufferolt közegeket. Parenterális hordozók többek között a nátrium-klorid-oldat, a Ringer-féle dextróz, dextróz és nátrium-klorid, laktátozott Ringer-féle vagy fixált olajok. Intravénás hordozók folyadékot továbbá tápanyag-kiegészítőket, elektrolitkiegészítőket, így Ringer-féle dextróz alapján készített kiegészítőket és hasonlókat foglalnak magukban. Konzerválóhatású és egyéb adalékok is jelen lehetnek, így mikrobaölő anyagok, antioxidánsok, kelátképző szerek, inért gázok és hasonlók.

Az antitestek társíthatok toxinhoz, így ricinus A alegységhez, diftériatoxinhoz vagy toxikus enzimhez. A technika állásából ismert módszereknek megfelelően radioaktív jelzésük is lehetséges. A találmány szerinti antitest azonban kitűnő sejttoxicitást mutat toxin távollétében, effektorsejtek, így humán monocíták jelenlétében.

A találmány szerinti eljárásokkal kimutatható és kezelhető ellenálló tumorokhoz tartozik a melanoma, glioma és karcinóma. EGF-receptorokat nem nagy mértékben kifejező ráksejtek indukálhatok limfokinkészítmények alkalmazása útján. Limfokinkészítmények tumorsejtek között is előidézhetik EGF-receptorok homogénebb kifejezését, és ezáltal hatásosabb terápiához vezetnek.

Beadásra alkalmas limfokinkészítmények többek között az interferon-gamma, a tumomekrózis-faktor és azok kombinációi. Ezek a készítmények beadhatók intravénásán. A limfokin alkalmas dózisai a 10 000 és 1 000 000 egység/beteg közötti tartományban vannak.

Diagnosztikai célokra az antitestet kapcsolhatjuk radioopak színezékhez vagy jelölhetjük radioaktív izotóppal. Előnyösen használható jelölési módszer az Iodogen-módszer [Fraker és munkatársai (1978)]. Diagnosztikai célokra az antitestet előnyösen F(ab’)2 fragmentumok alakjában adjuk be. Ez kiváló eredményeket biztosít, így a háttérkorrekció szükségtelenné válik. Fragmentumokat előállíthatunk ismert eljárásokkal [Herlyn és munkatársai (1983)]. Általában pepszinemésztést végzünk savas pH mellett, és a fragmentumokat Protein ASepharose kromatográfiás eljárással választjuk el az emésztetlen IgG-től és a nehézlánc-ffagmentumoktól.

A találmány szerinti újraformált humán 425 antitestek kisebb valószínűséggel váltanak ki immunválaszt emberekben, mint akár egér- vagy kiméra 425 antitestek. Az újraformált humán 425 antitest legjobb változatának aviditása megegyezik az egér- vagy kiméra 425 antitestével a találmány legjobb kiviteli alakjaiban. Kötődési vizsgálatok azt mutatják, hogy optimális viszonyok között az EGF ellenében mutatott versengési képesség az EGF-receptorhoz kötődés tekintetében kiméra, újraformált és egérantitestekre azonos. Ezenkívül emberekben terápiás célra használva az újraformált humán 425 antitestek hatásosabbak, mint akár az egér-, akár a kiméra 425 antitestek. Az immunizálásban beálló nagy csökkenés következtében az újraformált humán 425 antitest felezési ideje emberekben hosszabb;, és a legkisebb a valószínűsége annak, hogy az emberi szervezetben bármilyen káros immunválaszt kivált.

A meghatározott MAb 425 eredményei azt mutatják, hogy mesterséges konszenzusszekvenciát tartalmazó humanizált monoklonális antitestek nem befolyásolják az észrevehető minimális választ. Az egyéb előnyös tulajdonságokat a leírás bevezető részében ismertettük.

A találmány szerinti új antitestek értéke terápiás és diagnosztikai célokra ezért rendkívül nagy.

A leírásban idézett hivatkozások:

Amit és munkatársai: Science 233, 747 (1986),

Aviv és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69,

1408 (1972),

Bemstein és munkatársai: J. Mól. Bio. 112, 525 (1977), Breathnach és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci

USA 75, 4853 (1978),

Brooks és munkatársai: J. Comp. Chem 4, 187 (1983), Brüggemann és munkatársai: J. Exp. Med. 166, 1351 (1987),

Carter és munkatársai: Oligonucleotide Sitedirected

Mutagenesis in M 13, antitest Experimental Approach Manual, Anglián Biotechnology Ltd., Colchester (1985),

Chirgwin és munkatársai: Biochemistry 18, 5294 (1979),

Chothia és munkatársai: J. Mól. Bioi. 196, 901 (1987), Chothia és munkatársai: Natúré 342, 877 (1989),

Co és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,

2869 (1991),

Cohen: J. Bioi. Chem. 258, 1523 (1982),

HU 219 537 Β

Downward és munkatársai: Natúré 307, 521-527 (1984),

Épp és munkatársai: Biochemistry 14, 4943 (1975), Épp és munkatársai: Eur. J. Biochem. 133, 51 (1983), Fraker és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 80, 849 (1978),

Gillis és munkatársai: Hűm. Antibod. Hybridomas 1, 47 (1990),

Giorgi és munkatársai: Transplant. Proc. 15, 639 (1983), Gorman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,

4181 (1991),

Gubler és munkatársai: Gene 25, 263 (1983),

Halé és munkatársai: Láncét, ii, 1394 (1988),

Herlyn és munkatársai: Cancer Rés. 43, 2731 (1983), Hoggenboom és munkatársai: J. Immunoi. 144, 3211 (1990),

Jaffers és munkatársai: Transplantation 41, 572 (1986), Jones és munkatársai: Natúré 321, 14 (1986),

Kaariten és munkatársai: J. Immunoi. 130, 937 (1983), Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of

Immunological Interest. US Dept. Health and Humán Services, US Government Printing Offices (1987),

Kammann és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 17, 5404 (1989),

Koprowski és munkatársai: Somatic Cell and Mól. Genetics 11, 297-302 (1985),

Kozák: J. Mól. Bio. 196, 947 (1987),

Laemmli és munkatársai

Levy és munkatársai: Gene 54, 167 (1987),

Liu és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,

3439 (1987),

LoBuglio és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4220 (1989),

Maeda és munkatársai: Hűm. Antibod. Hybridomas 2, 124 (1991),

Martin: D. Phil. thesis. Oxford University (1990), Martin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,

9268 (1989),

Mathieson és munkatársai: N. Eng. J. Med. 323, 250 (1990),

Murthy és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 252, 549 (1987),

Nakamaye és munkatársai: Nucleic Rex. 14, 9679 (1986),

Padlan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5938 (1989),

Panka és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3080 (1988),

Queen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10 029 (1989),

Rabbitts és munkatársai: Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 113, 166 (1984),

Rechavi és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 855 (1983),

Reichmann és munkatársai: Natúré 322, 21 (1988), Rodeck és munkatársai: Cancer Rex. 47, 3692 (1987), Sayers és munkatársai: Nucleic Acid Rés. 16, 791 (1988),

Schreiber: J. Bioi. Chem. 258, 846 (1983),

Sheriff és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8075 (1987),

Show és munkatársai: Proteins 1, 267 (1986),

Suh és munkatársai: Proteins 1, 74 (1986),

Sun és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,

214 (1987),

Sutcliffe: Ph. D. thesis, London University (1988), Takahashi és munkatársai: Cancer Rex. 47, 3847 (1987),

Takahashi és munkatársai: Cell 29, 671 (1982),

Taylor és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 13, 8749 (1985a),

Taylor és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 13, 8764 (1985b),

Tempest és munkatársai: Bioi. Technology 9, 266 (1991),

Ulrich és munkatársai: Natúré 309, 418 (1984), Verhoeyen és munkatársai: Science 239, 18 (1988), Verhoeyen és munkatársai: Epenetos, A. A. (szerk.),

Monoclonal Antibiodes: Applications in Clinical Oncology, Chapman and Hall, London, 37 (1991),

Ward és munkatársai: Natúré 341, 544 (1989),

Whittle és munkatársai: Protein Eng. 1, 499 (1987), Williams és munkatársai: Tibtech 8, 256 (1990).

A találmányt a következőkben példákkal szemléltetjük.

1. példa

Molekuláris klónozás - szekvenálás

MAb 425-öt termelő W425-15 (ACCT HB 9629) sejtvonalból teljes RNS-t izoláltunk. Közelítőleg 9,6 xlO⁷ sejtet használtunk teljes RNS előállítására a guanidinium-CsCl módszert [Chirgwin és munkatársai (1979)] alkalmazva. A teljes RNS izolálására használt sejtek felülúszóját ELISA útján vizsgáltuk meg annak biztosítására, hogy a sejtek nagy mennyiségben termelték a helyes MAb-t. Poli(A+)-RNS-t állítottunk elő [Aviv és Leder (1972)]. Kétszálú cDNS-t szintetizáltunk lényegében az irodalomban ismertetett módszer szerint [Aviv és Leder (1972)] azzal az eltéréssel, hogy az egér kappa- és gamma-2a immunglobulin konstans tartományai 5’-végnél lévő részeivel homológ polimereket használtunk az első szál szintézisének elindításához [Levy és munkatársai (1987)]. A könnyűláncprimer tervezete 26 tagú volt (I. táblázat, 1. oligonukleotid), amelyet publikált adatok [Levy és munkatársai (1987), Kaariten és munkatársai (1983)] alapján terveztünk. A nehézláncprimer tervezete 25 tagú volt (I. táblázat, 2. oligonukleotid), amelyet publikált adatok [Kaariten és munkatársai (1983), Kábát és munkatársai (1987)] alapján terveztünk. A primereket Applied Biosystem 380B típusú DNS-szintetizáló berendezéssel terveztük és szintetizáltuk, majd karbamid-akrilamid gélen tisztítottuk. A második szál szintézise után a tompa végű cDNS-eket Smal-gyel emésztett (kereskedelmi forgalomban kapható) pUC18-ba klónoztuk, és kompetens E. coli sejtekbe, így (kereskedelmi forgalomban kapható) DH5-a sejtekbe transzformáltuk. Kolóniákat agarlemez rácsán osztottunk szét, és hibridizálás útján válogatókísérleteket végeztünk ³²P izotóppal jelzett első13

HU 219 537 Β szál-szintézispolimereket használva [Carter és munkatársai (1985)]. Kétszálú plazmid DNS-szekvenálását Sequenase (gyártó cég : United States Biochemical Corporation) alkalmazásával végeztük.

2. példa

Kiméra gének előállítása

Mindegyik variábilis tartományhoz egy első 5’ és hátsó 3’-polimeráz-láncreakció (PCR) prímért szintetizáltunk (3-6. oligonukleotidok, I. táblázat). PCR-reakciókat 1 ng, a klónozott cDNS-t tartalmazó pUC18 plazmid-DNS-t, egyaránt 1 pmol/l végső koncentrációjú első és hátsó PCR-primert, egyenként 200 pmol/l dNTP-t, 10 mmol/1 Tris-HCl-ot (pH 8,3), 50 nunol/1 KCl-ot, 1,5 mmol/1 MgCl₂-ot és 0,01 vegyes% zselatint használva folytattunk le. Mindegyik vizsgálatnál 2,5 egység Amplitaq DNS-polimerázt (gyártó cég: Perkin Elmer Cetus) adagoltunk az elegyhez. 94 °C hőmérsékleten 1,5 perc időtartamig végzett kezdeti olvasztás után 25 ciklus amplifikálást végeztünk 94 °C-on 1 perc, 45 °C-on 1 perc és 72 °C-on 3 perc időtartamokkal. Egy végső meghosszabbított kezelést 72 °C-on folytattunk le 10 perc időtartamig. A PCR-reakcióelegyeket Hind-III és BamHI útján végzett emésztés előtt fenol/kloroform eleggyel kétszer extraháltuk, majd etanollal kicsapatást végeztünk. A V_L vagy V_H tartományt kódoló PCR-ffagmentumot ezután expressziós vektorba klónoztuk. Ez a vektor a HCMV (humán cytomelo vírus) enhancert és promotert, a bakteriális neogént és az SV40 replikációs origót tartalmazza. A humán gamma-1 konstans tartományt kódoló genomiális DNS egy 2,0 kb BamHI fragmentumát [Takahashi és munkatársai (1982)] ínzertáltuk helyes orientációban, lefelé a V_H tartomány fragmentumába (lásd az 1. ábrán HCMVCV_H425-gamma-l-et). Később ezt a vektort alkalmaztuk a konstans tartomány fragmentuma 3’-végénél lévő BamHI eltávolítása útján, ami által lehetségessé válik a variábilis tartományok közvetlen inzertálása a nehézlánc-expressziós vektorba HindlII-BamHI fragmentumként [Maeda és munkatársai (1991)]. A V_L tartományt kódoló fragmentumot egy hasonló HCMV expressziós vektorba ínzertáltuk, amely ebben az esetben megközelítőleg 2,6 kb méretű, a humán kappa konstans tartományt kódoló, és illesztő akceptorhelyet és poli(A⁺)-t tartalmazó genomiális DNS BamHI fragmentumot tartalmaz [Rabbits és munkatársai (1984)] (lásd az

1. ábrán HCMV-CV_L-425-kappát).

3. példa

MAb 425 V_L és V_H molekuláris modellezése

Az egér MAb 425 variábilis tartományainak molekuláris modelljét a nagymértékben homológ antilizozinantitest, HyHEL-5 [Sheriff és munkatársai (1987)] megoldott szerkezetére alapozva építettük fel. Az MAb 425 és HyHEL-5 variábilis tartományainak homológiája körülbelül 90%-os.

A modellt UNIX programot futtató és „QUANTA” (Polygen Corp.) molekulamodellező programcsomagot használó Silicon Graphics Iris 4D munkahelyen hoztuk létre. A molekulavázban lévő azonos csoportokat megtartottuk; a nem azonos csoportokat a QUANTA proteinmodellező csomagba beépített maximális átfedés módszerét [Snow és Amzel (1986)] használva helyettesítettük. A nehézláncban lévő három N-terminális csoport fő lánckonformációját egy homológ antitest szerkezetből (HyHEL-10) [Padlan és munkatársai (1989)] helyettesítettük, minthogy hőmérsékleti faktoruk szokatlanul nagy volt (nagyobb, mint a váz hőmérsékleti faktoraiból származtatott átlagérték+a szórás háromszorosa) továbbá befolyásolták V_H CDR-3 (H3) elrendeződését [Martin (1990)]. Az MAb 425-ből származó V_L tartomány CDR-1 (Ll) és CDR-2 (L2) szekvenciái, valamint a V_H tartomány CDR-1 (Ll) és CDR-2 (L2) szekvenciái megfeleltek a szakirodalomban javasolt kanonikus formáknak [Chothia és munkatársai (1989)]. Ezen hurkokra vonatkozóan a főlánc torziós szögeit a HyHEL-5-nek megfelelő értékeken tartottuk. A MAb 425-ből származó V_L tartomány CDR-3 (L3) szekvenciája és a V_H tartomány CDR-3 (L3) szekvenciája nem felelt meg a kanonikus szerkezeteknek, ezért ezeket eltérő módon modelleztük. A Brookhaven-adatokból [Bemstein és munkatársai (1977)] ismert számítógépes programmal [Martin és munkatársai (1989)] választottunk ki hurkokat. Ezután a hurkokat szekvenciahasonlóság, energia és a szerkezetet meghatározó csoportok [Sutcliffe (1988)] alapján osztályoztuk. A lista elejére sorolt hurkokat grafikai megjelenítésben megszemléltük, és szemre kiválasztottuk a legjobbat. H3-at a 92-103. pozíciójú csoportok tartományában a szarvasmarha-glutation-peroxidáz alapján modelleztük [Épp és munkatársai (1983)]. L3-at a könnyűlánc 88-96 pozíciójú csoportjainak tartományában az egér-IgA (J539) Fab fragmentum [Suh és munkatársai (1986}} alapján modelleztük.

Az atomok közötti kedvezőtlen érintkezések kiiktatására továbbá a Van dér Waals-típusú és elektrosztatikus kölcsönhatások optimalizálására a QUANTA programcsomagba beépített CHARm potenciált [Brooks és munkatársai (1983)] használva a modellben a legnagyobb iránytangens és konjugált gradiensek alapján energiaminimalizálást hajtottunk végre.

4. példa

Humanizált antitestgének előállítása

Az újraformált humán 425 könnyűlánc első változatát a szakirodalomból ismert CDR-ojtás-megközelítés [Reichmann és munkatársai (1988); Verhoeyen és munkatársai (1988)] analógiájára eljárva készítettük. A humán antilizozim V_L tartományt kódoló HindlII-BamHI fragmentumot tartalmazó, kereskedelmi forgalomban kapható M13mpl8 vektorból egyszálú templát DNS-t készítettünk [239400 számú európai szabadalmi leírás]. Ezen könnyűlánc FR-ei a kristálytanilag oldott REI proteinből vannak származtatva. Három, azon DNS-szekvenciákból álló oligonukleotidot terveztünk, amelyek olyan DNS-szekvenciákból álltak, amelyek az egér Mab 425 könnyűlánc CDR-eket kódolják, ezeket mindkét végen 12 olyan DNS-bázis határolta, amelyek komplementerek a humán REI szomszédos FR-eit kódoló DNS-szekvenciákra (az I. táblázatban a 7-9. oligonukleotidok).

HU 219 537 Β

Az oligonukleotidokat az előzőekben ismertetett módszer szerint szintetizáltuk és tisztítottuk. Mindhárom oligonukleotidot foszforileztük és egyidejűleg használtuk Eckstein és munkatársai eljárásán alapuló, oligonukleotid-irányítású in vitro mutagenezis-rendszerben [Taylor és munkatársai (1985), Nakamaye és Ecksteim (1986), Sayers és munkatársai (1988)]. Az exonukleáz III-mal végzett emésztési műveletben a gyártó javaslatai szerint jártunk el. A reakcióelegyet ezután fenol/kloroform közeggel extraháltuk, etanollal kicsapatást, majd 100 pl TE-ben újraszuszpendáltatást végeztünk. A kapott elegy 10 μΐ térfogatú részét templát DNS-ként használtuk 100 μΐ térfogatban lefolytatott PCR-amplifikációs reakcióban, amelynek közege M13 univerzális prímért és reverz szekvenálóprimert tartalmazott egyaránt 0,2 pmol/l végső koncentrációban. A puffer és a termikus ciklus a 2. példában leírt volt azzal az eltéréssel, hogy az összeforrasztási hőmérséklet 55 °C volt. A PCR-reakció elegyét fenol/kloroform közeggel kétszer extraháltuk, etanollal kicsapatást végeztünk a HindlII és BamHI útján lefolytatott emésztés és pUC18ba való szubklónozás előtt. A vélt pozitív kiónokat ³²Pjelzett mutagén printerekhez hibridizálva azonosítottuk [Carter és munkatársai (1987)]. A kiónok szekvenálás révén pozitívnak bizonyultak. A HCMV-RV_La425-kappaplazmid előállítására egy mindhárom ojtott CDR-t tartalmazó V_L tartományt klónoztunk HindlII-BamHI fragmentumként a V_L expressziós vektorba.

Az újraformált V_L „b” változatát csekély mértékben módosított, ismert PCR-mutagenezis-eljárással [Kammann és munkatársai (1989)] állítottuk elő. A templát DNS pUC18-ba szubklónozott RV_La volt. Az első PCR-reakciót 50 μΐ össztérfogatban folytattuk le, a reakcióelegy 1 ng templátot, egyenként 1 pmol/l végső koncentrációban M13 reverz szekvenálóprimert és (I. táblázat szerinti) 10 prímért, 200 pmol/l dNTPs-t, 10 mmol/1 Tris-HCl-ot (pH 8,3), 50 mmol/1 KCl-ot, 1,5 mmol/1 MgCl₂-ot és 0,01 vegyes% zselatint tartalmazott. Mindegyik vizsgálati közeghez egy egység Amplitaq DNS-polimerázt adtunk. A reakciót három párhuzamos kísérletben folytattuk le. 94 °C hőmérsékleten 1,5 perc időtartamig végzett olvasztás után 40 ciklust végeztünk 94 °C-on 1 perc, 37 °C-on 1 perc és 72 °C-on 2 perc időtartamokkal, amit 72 °C-on 10 perc időtartamú meghosszabbított kezelés követett. A párhuzamos kísérletek reakcióelegyét egyesítettük, fenol/kloroform közeggel extraháltuk és etanollal kicsapatást végeztünk, mielőtt a TAE agarózgélből a PCR-terméket izoláltuk. Az első PCR-reakció elegyének 1/10 részét a második PCR-reakcióban az egyik primer gyanánt használtuk. A második reakciót az elsőhöz hasonlóan folytattuk le, azzal a különbséggel, hogy az első reakció termékét és Ml3 univerzális primer 20 pmol mennyiségét használtuk. A ciklikus kezelést ismert módon végeztük [Kamman és munkatársai (1989)]. A HindlII-BamHI fragmentumot pUC 18-ba klónoztuk, és szekvenálást hajtottunk végre. A HCMV-RV_Lb425-kappa-plazmid előállítására a kívánt módosításokat tartalmazó DNSfragmentumokat a V_L expressziós plazmidba szubklónoztuk.

Az újraformált humán 425 V_H tartomány első változatát kémiai úton szintetizáltuk. A DNS-szekvenciát úgy terveztük, hogy kódolja a kívánt aminosavszekvenciát és tartalmazza a szükséges túlnyúló DNS-szekvenciákat (lásd az előzőekben). A kodonok alkalmazását emlőssejtekre nézve optimalizáltuk, emellett az FR-eket kódoló DNS-szekvenciákba használható restrikciósenzimhelyeket építettünk be. Szintetizáltuk a 454 bp-t, és EcoRI-HindlII fragmentumként pUC18-ba szubklónoztuk. A HCMV-RV_Ha-425-gamma-l-plazmid előállítására egy az újraformált humanizált 425 nehézláncot kódoló HindlII-BamHI fragmentumot átvittünk a V_H expressziós vektorba.

Különféle módszerekkel az újraformált humanizált nehézláncok nyolc további változatát állítottuk elő. A nehézlánc „a” változatát kódoló HindlII-BamHI fragmentumot M13mpl8-ba vittük át, és egyszálú DNS-t készítettünk. A 11-13. oligonukleotidok (I. táblázat) használatával az előzőekben leírtak szerint PCR-re adaptált M13 mutagenezist alkalmaztunk ahhoz, hogy az újraformált humán 425 V_H tartományai „d”, „e”, „f” és „g” változatait kódoló DNS-t generáljuk pUC18-ban. A HCVM-RV_Hd425-gamma-l-, HCVM-RV_He425-gamma-1-, HCVM-RV_Hf425-gamma-l- és HCVM-RV_Hg425gamma-l-plazmidok előállítására ezen változatokat HindlII-BamHI fragmentumokként a nehézlánc-expressziós vektorba szubklónoztuk.

Újraformált humán 425 V_H tartományok „b” és „c” változatait generáltuk ismert PCR-mutagenezis-eljárást [Kamman és munkatársai (1989)] használva az előzőekben leírtak szerint. A templát DNS pUC 18-ba szubklónozott újraformált humán 524 V_H tartomány „a” változata volt, az első PCR-reakcióban használt mutagén primer vagy a (I. táblázat szerinti) 13 vagy 14 primer volt. Mutagenezis és szekvenálás után a kívánt módosításokat tartalmazó szekvenciákat a nehézlánc-expressziós plazmidba szubklónoztuk a HCMV-RV_Hb425gamma-1- és HCMV-RV_Hc425-gamma-l-plazmid előállítására.

Létező változatok pUC-alapú klónjaiból újraformált nehézlánc „h” és „i” változatait állítottuk elő. Az „e” változatból származó egyik 0,2 kb HindlII-Xhol fragmentumot egy „b” vagy „c” változatból eredő 2,8 kb XhoI-HindlII fragmentumhoz ligáitok új „h”, illetve „i” változatokat állítva elő ezáltal. Az ezen változatokat kódoló HindlII-BamHI fragmentumokat a nehézlánc-expressziós vektorba szubklónozva előállítottuk a HCMV-RV_Hh425-gamma-l- és HCMVRV_Hi425-gamma-l-plazmidokat.

5. példa

DNS transzfektálása COS-sejtekbe

COS-sejteket elektroporációnak vetettünk alá a nehéz-, illetve könnyűláncokat kódoló géneket tartalmazó expressziós vektorok mindegyikének 10 pg-ja jelenlétében. A vizsgálatot röviden a következő adatokkal jellemezhetjük: PBS-ben lévő COS-sejtek 1 x 10⁷ sejt/ml szuszpenziójának 0,8 ml térfogatú alikvot részeihez mindegyik plazmidból 10 pg-ot adtunk. Bio-Rad Gene Pulser típusú berendezéssel 1900 V-os

HU 219 537 Β feszültségimpulzusokat gerjesztettünk 25 pF kapacitás mellett. A sejteket 10 perc időtartamig szobahőmérsékleten pihentettük, mielőtt 10% borjúembrió-szérumot tartalmazó 8 ml DMEM-be helyeztük azokat. 72 órás inkubálás után a közeget összegyűjtöttük, a sejttöredékeket centrifugálással eltávolítottuk, majd az ELISAvizsgálat előtt rövid időtartam esetén 4 °C, hosszabb időtartam esetén -20 °C hőmérsékleten steril körülmények között tároltuk.

6. példa

Az 5. példában leírtak szerint CHO-sejtekbe DNS-t transzfektáltunk.

7. példa

IgG termelésének mennyiségi jellemzése és az antigénkötődés detektálása

A COS-sejtek felülúszójában jelen lévő humán IgG-t ELISA útján detektáltuk: a humán IgG-re irányuló ELISA-vizsgálatokban 96 rekeszes lemezeket (egész molekula) kecske-antihumán IgG használatával vontunk be, és a mintákban lévő azon humán IgG-t, amely a lemezekhez kötődött, alkáli-foszfatázzal konjugált (gamma-láncspeciftkus) kecske-antihumán IgG-t használva detektáltuk. Standardként kereskedelmi forgalomban kapható, tisztított humán IgG-t használtunk. Az MAb 425 által felismert antigénhez kötődést egy második ELISA-vizsgálattal határoztuk meg. EGF-receptorprotein-készítménnyel [Rodeck és munkatársai (1980)] vontuk be a lemezeket, és az EGF-receptorhoz kötődő antitesteket vagy (gamma-láncspecifikus) antihumán IgG peroxidáz konjugáttal (kiméra és újraformált humán antitesteknél) vagy (egész molekula) anti-egér IgG peroxidáz konjugáttal (egér MAb 425 antitestnél) detektáltuk (mindkét konjugát gyártó cége: Sigma). Standardként tisztított egér MAb 425-öt használtunk.

8. példa

Kötődési versengés vizsgálata

Kereskedelmi forgalomban kapható, megfelelő kit használatával egér MAb 425-öt biotineztünk. ELISAlemezeket optimális hígítású EGF-receptor-proteinnel vontunk be. A COS-sejtek hígított felülúszóinak 50 pl-ét 50 pl biotinezett egér MAb 425-tel kevertünk össze (amelynek koncentrációját ELISA útján 1,75 pg/ml értékben határoztuk meg). Mindegyik COS-sejt-felülúszót két párhuzamos kísérletben vizsgáltuk. A lemezeket egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A kötött biotinezett egér MAb 425-öt kereskedelmi forgalomban kapható streptavidin-torma-peroxidáz komplex hozzáadása révén detektáltuk. Versengő ágens nélkül lefolytatott ellenőrző kísérlet lehetővé tette az egyes COS-sejt-felülúszók %-os gátlási vagy blokkolási értékének kiszámítását a következő módon:

100-[(OD₄₅₀ {minta}/OD₄₅₀ {ellenőrző minta} χ 100],

9. példa

Egér, újraformált és kiméra MAb 425 különböző mintáit elemeztük SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) alkalmazásával ismert módon [Laemmli és munkatársai]. Mind nem redukáló, mind redukáló körülmények között valamennyi mintából 2,5 pg-ot használtunk. A proteint Coomassie-festékkel végzett színezéssel tettük láthatóvá. A 9A. ábra azt mutatja, hogy a minták tisztasága hasonló.

Az antitestek molekulatömeg-tartománya:

180 000-200 000.

10. példa

Újraformált MAb 425-öt tisztítottunk Superose 12 (gyártó cég: PharmaciaCorp., Svédország) alkalmazásával, szokásos módon lefolytatott gélrésszűrés útján. Az antitestet (0,1 mólos) PBS-közeggel (pH 7,4; 0,8 mól NaCl) eluáltuk. Egyetlen kapott csúcs figyelhető meg (5 percnél, 9B. ábra).

11. példa

Biotinnal jelzett MAb 425-öt használtunk nem jelzett MAb 425 vagy származékai EGF-receptorhoz való kötődésének tekintetében versengési vizsgálathoz. Biotinnal szokásos módon folytattuk le a jelzést. Az A431 membránokról szokásos eljárásokkal szolubilizáltuk az EGF-receptort. Az A431 sejteket a kereskedelemben szereztük be. POD-konjugált sztreptavidinnel és szubsztrátummal végzett inkubálást követően végeztük a detektálást. Ezen adatokból gátlási görbéket szerkesztettünk (10. ábra). A görbék azt mutatják, hogy a különböző antitestek kötődése összevethető.

12. példa

Tisztított egér, kiméra és újraformált MAb 425 különböző mintáit vizsgáltuk EGF-fel versengési képességükre EGF-receptorhoz való kötődésük tekintetében. A vizsgálatot ¹²⁵I jelzésű EGF (gyártó cég : Amersham Corp., Nagy-Britannia) és különféle antitestek versengése útján folytattuk le EGF-receptor-pozitív membránokhoz (A431) történő kötődésre vonatkozóan. A vizsgálati rendszer SPA-technológián (Amersham) alapult. Az egér és (3 mintával képviselt) újraformált antitestek versengési görbéi majdnem azonosak (11. ábra).

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Humanizált monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz, és amelynek könnyű- és nehézlánca nem humán eredetű specifikus antigénkötő régiót (CDR), humán eredetű variábilis kerettartományt (FR) és humán eredetű konstans régiót tartalmaz, és (i) a könnyűlánc CDR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

   CDR-1: Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-Tyr CDR-2: Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser CDR-3: Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thr, míg a nehézlánc CDR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

   CDR-1: Ser-His-Trp-Met-His

   HU 219 537 Β

   CDR-2: Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-ThrAsn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ser

   CDR-3: Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-TyrPhe-Asp-Tyr, és (ii) legalább a nehézlánc FR-régiója tartalmazza a humán immunglobulinok FR-régiójának egy a természetben elő nem forduló módosított konszenzusszekvenciáját.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti humanizált monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy a könnyűlánc konstans régiója egy humán immunglobulin kappa-láncának aminosavszekvenciáját, míg a nehézlánc konstans régiója egy humán immunglobulin gamma-1-láncának aminosavszekvenciáját tartalmazza.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humanizált monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy a konszenzusszekvencia az aminosavak legfeljebb 10%-ának megváltoztatásával van módosítva.
4. 4. A 3. igénypont szerinti humanizált monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy

   - a könnyűlánc FR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

   FR-1: Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-SerLeu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-ValThr-Ile-Thr-Cys

   FR-2: Trp-Tyr-Gln-Gln- Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-ProLys-Leu-Leu-Ile-Tyr

   FR-3: Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-GlySer-Gly-Thr-Asp-XaapThr-Phe-Thr-Ile-SerSer-Leu-Gln-Pro-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-TyrTyr-Cys

   FR-4: Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-Lys,

   - a nehézlánc FR-régiójának aminosavszekvenciája a következő:

   FR-1: Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-GluVal-Lys-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-ValSer-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe-Xaa₂

   FR-2: Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Gln-Gly-LeuGlu-Trp-Xaa₃-Gly

   FR-3: Xaa₄-Xaa₅-Thr-Met-Thr-Xaa₆-Asp-Thr-SerThr-Asn-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu-Leu-Ser-SerLeu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-TyrCys-Ala-Ser

   FR-4: Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-SerSer, ahol

   Xaaj jelentése Tyr vagy Phe,

   Xaa₂ jelentése Thr vagy Ser,

   Xaa₃ jelentése Ile vagy Val,

   Xaa₄ jelentése Lys vagy Arg,

   Xaa₅ jelentése Alá vagy Val,

   Xaa₆ jelentése Val vagy Leu.
5. 5. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy egy, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti antitest nehézláncának és/vagy könnyűláncának variábilis és konstans régióját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti, pRVL425 jelű, DSM6340 számon letétbe helyezett expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy egy olyan antitest könnyűláncának variábilis és konstans régióját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti, pRVH425 jelű, DSM6339 számon letétbe helyezett expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy egy olyan antitest nehézláncának variábilis és konstans régióját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely humán EGF-receptorokhoz képes kötődni, és gátolja az EGF kötődését az ilyen receptorokhoz.
8. 8. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy, az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
9. 9. Eljárás humán EGF-receptorokhoz kötődni és az EGF ilyen receptorokhoz való kötődését gátolni képes humanizált monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet egy, az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektorral transzformálunk, a transzformált gazdasejteket alkalmas tápközegen tenyésztjük, és az expresszált antitestfehéqéket izoláljuk.
10. 10. Gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy egy, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti antitestet tartalmaznak.