SK281143B6 - Chimérická monoklonálna protilátka, expresné vektory a farmaceutický prostriedok - Google Patents

Abstract

Chimérická monoklonálna protilátka obsahujúca miesta viažuce antigén, CDR, nehumánneho pôvodu, úseky základnej štruktúry, FR, nehumánneho pôvodu a konštantné oblasti humánneho imunoglobulínu, ktorá má tieto znaky: i) viaže sa k humánnym receptorom epidermálneho rastového faktora (EGF) a inhibuje väzbu EGF k receptoru EGF, ii) konštantné oblasti jej ťažkého reťazca zahŕňajú sekvenciu aminokyselín humánneho reťazca gama-1 a konštantné oblasti ľahkého reťazca zahŕňajú sekvenciu aminokyselín humánneho reťazca kapa, iii) jej oblasti CDR reprezentujúce miesta viažuce antigén zahŕňajú špecifické sekvencie aminokyselín uvedené v opise, iv) jej úseky základnej štruktúry, FR, variabilnej oblasti, ktorá nemá vzťah k miestam viažucim antigén, zahŕňajú iné špecifické aminokyselinové sekvencie uvedené v opise. Expresívny vektor obsahujúci sekvenciu DNA kódujúcu variabilnú a konštantnú oblasť ľahkého reťazca tejto chimérickej monoklonálnej protilátky a farmaceutický prostriedok obsahujúci opísanú chimérickú monoklonálnu protilátku na terapeutické a diagnostické účely pri liečení nádorov.ŕ

Description

Vynález sa týka nových chimérických monoklonálnych protilátok, ktoré obsahujú umelú modifikovanú konvenčnú sekvenciu, prinajmenšom úsekov základnej štruktúry vo variabilnej oblasti ťažkého reťazca humánnych imunoglobulínov.

Vynález sa ďalej týka chimérických monoklonálnych protilátok, ktoré sa viažu k epitopom epidermálneho rastového faktora (EGF). Vynález zverejňuje sekvencie aminokyselín príslušného miesta viažuceho antigén pre tento receptor.

Ďalej sa vynález týka farmaceutických prípravkov, ktoré obsahujú tieto protilátky. Tieto farmaceutické prípravky sú vhodné na liečbu nádorov, ako sú melanómy, gliómy a karcinómy. Protilátky podľa vynálezu sa môžu používať aj pri diagnostických aplikáciách, pri ktorých sa zisťuje povaha a umiestnenie týchto nádorov in vitro alebo in vivo.

V opise sa používa niekoľko technických termínov, ktoré budú teraz vysvetlené:

Pod pojmom „humanizované“ protilátky sa rozumejú protilátky, ktoré obsahujú úseky základnej štruktúry variabilných oblastí a konštantných oblastí aminokyselín umiestnených v ľahkom ťažkom reťazci, ktoré pochádzajú z humánnych zdrojov. Naproti tomu ich hypervariabilné oblasti pochádzajú z nehumánnych zdrojov.

Pod pojmom „chimérické“ protilátky sa rozumejú protilátky obsahujúce variabilné a hypervariabilné oblasti, ktoré pochádzajú z nehumánnych zdrojov, zatiaľ čo ich konštantné oblasti sú humánneho pôvodu.

Úseky základnej štruktúry protilátky sú v ďalšom texte označované skratkou FRs (fŕamework regions). FRs sa nachádzajú vo variabilných oblastiach. V týchto oblastiach dochádza k určitej alterácii aminokyselín.

Skratkou CDRs (complementarity determining regions) sa označujú oblasti určujúce komplementárnu alebo „hypervariabilné oblasti protilátky. CDRs sa nachádzajú vo variabilných oblastiach. Tieto oblasti predstavujú špecifické miesta viažuce antigén a vykazujú nesmieme veľkú výmenu aminokyselín. CDRs sú predovšetkým zodpovedné za väzbovú afinitu antigénu.

Pod pojmom „konvenčná sekvencia“ sa rozumie sekvencia aminokyselín, ktorá sa nevyskytuje v prírode ako variabilné oblasti ľahkého alebo ťažkého reťazca. Konvenčná sekvencia sa používa ako náhrada za pôvodne prítomné variabilné oblasti nehumánneho ťažkého alebo ľahkého reťazca. Konvenčná sekvencia je syntetická, a jedná sa teda o umelú sekvenciu najbežnejších aminokyselín určitej triedy alebo podtriedy ťažkých alebo ľahkých reťazcov humánnych imunoglobulínov.

Skratkou „EGF“ sa označuje epidermálny rastový faktor a skratkou „EGFR“ sa označuje receptor epidermálneho rastového faktora.

Pod pojmom „V_L“ oblasti sa rozumejú variabilné oblasti ľahkého reťazca.

Pod pojmom „V_H“ oblastí sa rozumejú variabilné oblasti ťažkého reťazca.

Doterajší stav techniky

Monoklonálna protilátka z Muridae 425 (MAb 425) bola vypestovaná proti humánnej bunkovej línii karcinómu A431 a zistilo sa, že sa viaže k polypeptidovému epitopu na vonkajšej doméne receptora humánneho epidermálneho rastového faktora (EGFR). Táto protilátka inhibuje väzbu epidermálneho rastového faktora (EGF), na miestach

EGFR s nízkou aj s vysokou afinitou (Murthry a ďalší (1987), Árch. Biochem. Biophys. 252, 549). K zvýšenej expresii EGFR dochádza v malígnom tkanive rôzneho pôvodu, čo robí z MAb 425 možnú látku na. diagnostiku a liečbu humánnych nádorov. Skutočne sa zistilo, že MAb 425 vykazuje cytotoxicitu voči nádorom in vitro a potláča rast nádorových buniek z bunkových línií odvodených od epidermoidného a kolorektálneho karcinómu in vitro (Rodeck a ďalší (1987) Cancer Res. 47, 3692). Bolo tiež dokázané, že sa MAb 425, označená rádionuklidom, viaže ku xenoštepom humánnych malignych gliómov u myší (Takahashi a ďalší (1987), Cancer Res. 47, 3847).

EGF je polypeptidovým hormónom, ktorý je mitogénny pre epidermálne a epitelové bunky. Pri interakcii EGF, so senzitívnymi bunkami dochádza k jeho väzbe na membránové receptory; komplexy receptor-EGF sa zhlukujú a potom sú zahrnuté do endocytotických vačkov. Tým dochádza k úkazu označovanému termínom regulácia smerom nadol („down-regulation“). Väzba EGF indukuje tyrozínkinázovú aktivitu receptorovej molekuly a indukuje syntézu DNA.

Receptor EGF je transmembránovým glykoproteínom s veľkosťou približne 170 000 dalton (Cohen (1982), J. Biol. Chem. 258, 1523). Je génovým produktom c-erb-B protoonkogénu (Downward a ďalší, Náture, sv. 307, strana 521 až 527,1984). Tento receptor sa vyskytuje v dvoch kinetických formách, ktoré sú označované ako receptor s nízkou afinitou a receptor s vysokou afinitou.

Bunková línia karcinómu A431 exprimuje na povrchu svojich buniek veľké množstvo receptorov EGF, a preto sa použila pri mnohých štúdiách na tvorbu protilátok antiEGF-receptor. Receptory A431 sa však líšia od receptorov na iných typoch buniek v uhľovodíkových zvyškoch, ktoré sú pripojené k polypeptidu. Veľa protilátok vypestovaných proti membránam A431 je preto zameraných proti uhľovodíkom, ktoré nie sú spoločné pre všetky formy receptorových molekúl (pozri napríklad Schreiber (1983) J. Biol. Chem., 258, 846).

Iné monoklonálne protilátky sú reaktívne voči proteínovénu zvyšku receptorov EGF. Pri väzbe k receptorom EGF vykazujú tieto protilátky rôzne vlastnosti, o ktorých sa predpokladá, že sú závislé od konkrétnej časti viazanej receptorovej molekuly a od izotypu protilátky. Niektoré protilátky napodobňujú niektoré účinky EGF (agonisty) a niektoré tieto účinky inhibujú (antagonisty).

V priebehu rastu nádoru sa predpokladá expresia receptorov EGF. Zistilo sa, že gén pre tieto receptory je bunkovým analógom vtáčieho vírusového onkogénu v-erb-B (Ulrych a ďalší (1984), Náture, 309, 418). Okrem toho bolo nájdené spojenie medzi neskorými štádiami vývoja melanómu a navyše kópiami chromozómu nesúceho receptorový gén (Koprowski a ďalší, Somatic Celí and Molecular Genetics, zv. 11, str. 297 až 302; 1985).

Pretože receptory EGF sú exprimované v celom rade tuhých nádorov, poskytujú vhodný cieľ pre antinádorovú liečbu. Existuje však nutnosť nájsť vhodnú protireceptorovú protilátku. Veľa zo známych protilátok má vlastnosti, ktoré by pri ich použití ako protinádorové činidlá boli škodlivé. Tak napríklad protilátky, ktoré napodobňujú účinky EGF, by mohli stimulovať rast nádorov namiesto toho, aby ho zastavovali. Iné protilátky, ktoré sa viažu k receptorom s vysokou alebo nízkou afinitou, by mohli mať účinnosť nižšiu, ako je účinnosť optimálna, pretože EGF by ešte mohol prejavovať svoj účinok prostredníctvom neviazaných receptorov. Ešte ďalšie protilátky menia receptory s nízkou afinitou na receptory s vysokou afinitou, čo by mohlo mať za následok výrazné posilnenie rastu nádoru namiesto jeho inhibície. Existuje teda v tomto odbore potreba nájsť protilátku proti receptoru EGF, ktorá by bola vhodná na protinádorovú liečbu.

Protilátky MAb (z Muridae) sa síce používali na liečbu ľudí, vyvolávali však imunologickú odpoveď (Giorgi a ďalší, (1983) Tmasplant. Proc. 15, 639; Jaffers a ďalší, (1986), Transplantation 41, 572). Na prekonanie tohto problému sa niekoľko skupín snažilo „humanizovať“ protilátky z Muridae. Pritom je možné použiť dva prístupy. Jednak je možné domény z konštantnej oblasti v ľahkom aj v ťažkom reťazci Muridae nahradiť humánnymi konštantnými oblasťami. Také „chimérické“ Muridae humánne protilátky boli úspešne skonštruované z niekoľkých protilátok z Muridae zameraných proti antigénom, ktoré sú spojené s humánnymi nádormi (Sun a ďalší (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 214; Whittle a ďalší (1987), Proteín Eng., 1, 499; Liu a ďalší (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439; Gillies a Wesolowski (1990), Hum. Antibod. Hybridomas 1, 47). Pri tomto prístupe sa úplne zachová miesto viažuce antigén protilátky Muridae, a teda aj afinita pre antigén a súčasne sa dodajú humánne izotypové a efektorové funkcie. Pri druhom prístupe sa len očkujú oblasti určujúce komplementaritu (CDRs) z myších variabilných oblastí spoločne s humánnymi úsekmi základnej štruktúry (FRs) z variabilných domén z ľahkého aj ťažkého reťazca (V_L a V_H). Argumentuje sa, že pri tejto technike sa prevedie kritická a hlavná časť miesta viažuceho antigén do humánnej protilátky (Jones a ďalší (1986), Náture, 321,14).

Očkovanie CDR bolo uskutočnené u niekoľkých monoklonálnych protilátok pochádzajúcich z hlodavcov (Jones a ďalší (1986) Náture, 321,14; Reichmann a ďalší (1988), Náture 322,21; Verhoeyen a ďalší (1988), Science 239, 18; Queen a ďalší (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029; Co a ďalší (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869; Gorman a ďalší (1991),. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4181; Maeda a ďalší (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124; Tempest a ďalší (1991), Biol. Technology 9, 266). Všetky si zachovali svoju schopnosť viazať antigén napriek tomu, že ich afinita bola obvykle znížená. Vo väčšine prípadov bolo potrebné vymeniť určité aminokyseliny v humánnych úsekoch základnej štruktúry (FRs). Pri klinickom skúšaní sa chimérická aj očkovaná protilátka ukázala ako lepšia ako myšie protilátky (Hale a ďalší (1988), Lancet, ii, 1394; LoBuglio a ďalší (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4220; Mathieson a ďalší (1990) N. Eng. J. Med. 323, 250). V Žiadnom prípade však nie je známy všeobecný poznatok, ktoré aminokyseliny majú byť vymenené, a takú výmenu nie je možné ani úplne predvídať.

V EP 088 994 je navrhnutá konštrukcia vektorov rekombinantnej DNA, ktoré obsahujú sekvenciu DNA, kódujúcu variabilnú doménu ľahkého alebo ťažkého reťazca imunoglobulínu špecifického pre vopred určený ligand. V tejto citácii sa nepredpokladajú variácie v sekvencií variabilnej domény.

V EP 102 634 sa opisuje klonovanie a expresia génov jódujúcich celý polypeptid humánneho ťažkého reťazca IgG alebo jeho časť v bakteriálnych hostiteľských organizmoch. Ani tu sa nepredpokladajú variácie v sekvencií polypeptidu.

V EP 239 400 sa navrhuje, že humanizované protilátky sa dajú získať tak, že sa miesto viažuce antigén (hypervariabilnej oblasti) akejkoľvek humánnej protilátky nahradí miestom viažucim antigén nehumánnej, napríklad myšej alebo potkanej protilátky prostredníctvom metód génového inžinierstva.

Podľa tejto citácie je teda možné vyrábať humánne alebo humanizované protilátky obsahujúce špecifické miesta viažuce antigén, ktoré až doteraz neboli k dispozícii v protilátkach pochádzajúcich z ľudí.

Chimérické protilátky je možné získať tak, že sa nahradia nielen CDRs, ale celé variabilné oblasti ľahkého a ťažkého reťazca. Chimérické protilátky môžu však byť ešte imunogénne. Chimérické protilátky sú však veľmi užitočné na diagnostické účely a na optimalizáciu humanízovaných protilátok.

Bolo by možné ukázať, že afinitu miest viažucich antigén je možné ovplyvniť selektívnou výmenou niektorých jednotlivých aminokyselín vo variabilných oblastiach, ktoré nie sú priamo súčasťou CDRs (Reichmann a ďalší (1988), Náture, 322,21).

Ak sa postupuje podľa údajov uvedených v EP 239 400, môže v najhoršom prípade dôjsť k úplnej strate väzbovej afinity pre antigén. Túto skutočnosť sú schopní demonštrovať autori tohto vynálezu, ktorým sa nepodarilo skonštruovať príslušnú humanizovanú protilátku zameranú na epitopy receptora EGF.

Je preto treba vziať do úvahy, že úspešnosť takej humanizácie závisí od zloženia a konformácie použitých variabilných oblastí a ich interakcií s príslušným miestom viažucim antigén. Nedá sa teda úplne predvídať, či alebo ktoré modifikácie vo variabilných doménach protilátky je potrebné modifikovať, aby sa dosiahla väzba antigénu k protilátke, alebo aby sa táto väzba zlepšila.

Podstata vynálezu

Úlohou tohto vynálezu je teda vyvinúť humanizovanú monoklonálnu protilátku, ktorá je zameraná najmä na receptory EGF a ktorá obsahuje miesto viažuce antigén nehumánneho pôvodu a úseky základnej štruktúry (FRs) z variabilných oblastí a konštantných oblastí humánneho pôvodu, ktoré sú v prípade potreby modifikované takým spôsobom. aby špecifickosť väzbového miesta zostala zachovaná, alebo sa regenerovala.

Úlohou tohto vynálezu je predovšetkým charakterizovať hypervariabilné oblasti miesta viažuceho antigén protilátky proti receptoru EGF a zaviesť tieto CDRs do definovanej humanizovanej monoklonálnej protilátky.

Táto protilátka a jej chimérický variant môže hrať dôležitú úlohu ako terapeutické alebo diagnostické činidlo, slúžiace na potláčanie nádorov, ako sú melanómy, gliómy alebo karcinómy.

Zistilo sa, že účinné a špecifické humanizované monoklonálne protilátky jc možné ľahko získať použitím konvenčnej sekvencie prinajmenšom z variabilných oblastí ťažkého reťazca humánnych imunoglobulínov. Vhodné sú najmä všetky také konvenčné sekvencie, ktoré vykazujú dobrú identitu (aspoň 60 až 70 %, najmä 65 až 70 %) v porovnaní s variabilnými oblasťami pôvodných nehumánnych protilátok.

Ďalej sa zistilo, že tieto konvenčné sekvencie musia byť modifikované len v malom rozsahu, zatiaľ čo s použitím variabilných oblastí prírodných humánnych protilátok je treba niekedy uskutočňovať omnoho viac modifikácií. Často nie je nutné uskutočňovať žiadne modifikácie alebo je nutné uskutočňovať len málo modifikácií v sekvencií aminokyselín, aby sa podľa vynálezu dosiahla dobrá špecifická väzba antigénu. Je teda potrebné vymeniť len niekoľko aminokyselín na dosiahnutie perfektnej väzby receptora EGF k prednostnej humanizovanej protilátke podľa tohto vynálezu. Podľa poznatkov uvedených v EP 239 400 sa ne dá v tomto prípade dosiahnuť väzba. Stupeň modifikácie, ktorý je podľa vynálezu potrebný, je možné charakterizovať výmenou aminokyselín v rozsahu od 0 do 10 %, prednostne od 1 do 5 %.

Humanizovaná monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu má nasledujúce výhody: Konvenčnú sekvenciu, čo je sekvencia zodpovedajúca najčastejšiemu výskytu aminokyselín v určitej polohe reťazca humánneho imunoglobulinu z definovanej triedy, podtriedy alebo poskupiny, je možné bez problémov syntetizovať ako celok alebo časť. Nie je tu závislosť od podrobnej znalosti alebo dostupnosti určitých individuálnych protilátok alebo ich fragmentov. To znamená, že je možné pokryť široký rozsah individuálne a v prírode sa vyskytujúcich fragmentov protilátky prostredníctvom veľmi obmedzeného počtu konvenčných sekvencií, ktoré sa klonujú do príslušných expresných vektorov. Konvenčná sekvencia môže byť priaznivá, čo sa týka imunogenicity, v porovnaní s individuálnymi prírodnými sekvenciami, o ktorých je známe, že sa niekedy jedná o epitopy pre iné protilátky (napríklad antiidiotopické protilátky).

Aj keď bolo skutočne realizované len jedno prednostné uskutočnenie, poskytuje tento vynález všeobecné základné poznatky. Vzhľadom na veľký počet možných sekvencií a kombinácií sekvencií vo variabilnej a hypervariabilnej doméne nie je len náhodou, že sa na základe opísaných poznatkov vzťahujúcich sa na konvenčnú sekvenciu podarilo skonštruovať humanizovanú protilátku zameranú na receptory EGF.

Ďalej sa zistilo, že ťažké reťazce variabilných domén dodávajú väčší príspevok miestu viažucemu antigén v porovnaní s príslušnými ľahkými reťazcami. Nie je preto nutné modifikovať rovnakým spôsobom ľahký reťazec humanizovanej protilátky obsahujúci konvenčnú sekvenciu. Tento aspekt je zaujímavý, pretože je známe, že ľahké reťazce hrajú u niektorých známych prírodných protilátok dôležitejšiu úlohu ako príslušné ťažké reťazce (pozri Williams a ďalší (1990) Tibtech. 8, 256).

Podľa vynálezu je napokon možné uskutočniť pomocou génového inžinierstva charakterizáciu, klonovanie a amplifikáciu miesta viažuceho antigén protilátky z Muridae proti receptoru EGF (MAb 425). Tento aspekt vynálezu je najdôležitejší. Je možné syntetizovať príslušné oligonukleotidy kódujúce toto miesto viažuce antigén a celú variabilnú doménu humanizovanej a chimérickej monoklonálnej protilátky. Predmetom vynálezu sú ďalej príslušným spôsobom účinné expresívne vektory, ktoré je možné používať na transformáciu vhodných eukaryotických buniek.

Predmetom vynálezu je teda humanizovaná monoklonálna protilátka obsahujúca miesta viažuce antigén, CDR, nehumánneho pôvodu, úseky základnej štruktúry, FR, nehumánneho pôvodu a konštantné oblasti humánneho imunoglobulinu, ktorá má tieto znaky:

i) viaže sa k humánnym receptorom EGF a inhibuje väzbu EGF k receptoru EGF, ii) konštantné oblasti jej ťažkého reťazca zahŕňajú sekvenciu aminokyselín humánneho reťazca gama-1 a konštantné oblasti ľahkého reťazca zahŕňajú sekvenciu aminokyselín humánneho reťazca kapa, iii) jej oblasti CDR reprezentujúce miesta viažuce antigén zahŕňajú nasledovné sekvencie aminokyselín:

ľahký reťazec

CDR-l -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-Tyr~

CDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SexCOR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrťažký reťazec

COR-l -Sex-His-Trp-Met-HlsCDR-2 -Glu-phe-Asn-Rxo-Sex-Asn-Cly-Axg-Thr-Asn-Tyr-AsnGlu-Lys-Phe-Lys-SerCOR-3 -Axg-Asp-Tyx-Asp-Tyx-Asp-Gly-Axg-Tyr-Phe-Asp-Tyx— iv) jej úseky základnej štruktúry, FR, variabilnej oblasti, ktorá nemá vzťah k miestam viažucim antigén, zahŕňajú nasledovné aminokyselinevé sekvencie: ľahký reťazec

FR-1 -Gln-Ile-Val~Leu-Thr-Gl.n-Ser-Pro-Ala-Ile~Met-SerAla-Ser-Pro-Gly-Glu-Lys-Val-Thr-Met-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-LeuLeu-Ile-ryrFR-3 -Gly-ValPro-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-GlyThr-Ser-Tyr-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Arg-Met-Glu-Ala’· Glu-Asp-Ala-ALa-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -phe-Gly-Ser-Gly-Thr-Lys-LeU'-Glu-Ile-Lysťažký reťazec

FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Fxo-Gly-Ala-Glu-Leu-ValLys-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Leu-Ser-Cys-Lys-AtaSer-Gly-Tyr-Thr-Phe-ThrFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Axg-Ala-Gly-Cln-Gly-Leu-Glu-TrpIle-GlyFR-3 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thx-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Sex-ThxAla-Tyx-Met-Gln-Leu-Ser-Ser-Leu-Thr-Ser-Glu-ASpSex-Ala-vaL-Tyx-Tyx-Cys-Ala-SexFR-4 -Txp-Gly-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Thr-val-Sex-SerPredmetom vynálezu je ďalej expresívny vektor obsahujúci sekvenciu DNA kódujúcu variabilnú a konštantnú oblasť ľahkého reťazca uvedenej chimérickej monoklonálnej protilátky, ktorý nesie označenie pCVL425 a je uložený v zbierke DSM pod prírastkovým číslom DSM 6338.

Predmetom vynálezu je ďalej expresívny vektor obsahujúci sekvenciu DNA kódujúcu variabilnú a konštantnú oblasť ťažkého reťazca uvedenej chimérickej monoklonálnej protilátky, ktorý nesie označenie pCVH425 a je uložený v zbierke DSM pod prírastkovým číslom DSM 6337.

Napokon je predmetom vynálezu aj farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje uvedenú chimérickú monoklonálnu protilátku.

Všetky uvedené citácie patentov ďalej v tomto texte predstavujú náhradu za prenesenie ich celého obsahu do opisu tohto vynálezu.

Mikroorganizmy a plazmidy použité pri uskutočňovaní vynálezu

a) pRVL425 (=HCMV-RV]b425-k) uložený 1. februára 1991 v súlade s Budapeštianskou dohodou v Nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod prírastkovým číslom DSM 6340. Expresívny vektor obsahuje sekvencie hypervariabilných oblastí (CDRs) protilátky 425 z Muridae a FRs variabilnej oblasti a konštantnej (kapa) oblasti ľahkého reťazca humanizovanej protilátky. Symbol R znamená „pretvorený“ (reshaped).

b) pRVH425 (=HCMV-RV_Hg425-gama), uložený 1. februára 1991, v súlade s Budapeštianskou dohodou v Nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod prírastkovým číslom DSM 6339. Tento expresívny vektor obsahuje sek vencie hypervariabilných oblastí (CDRs) protilátky 425 Muridae a FRs variabilnej oblasti a konštantnej (gama-1) oblasti ťažkého reťazca humanizovanej protilátky. Symbol R znamená „pretvorený“ (reshaped).

c) pCVL425 (=HCMV-CV_L425-k), uložený 1. februára 1991, v súlade s Budapeštianskou dohodou v Nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod prírastkovým číslom DSM 6338. Tento expresívny vektor obsahuje sekvencie FRs a hypervariabilných oblasti (CDRs) variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky 425 z Muridae a konštantnej (kapa) oblasti ľahkého reťazca humánneho imunoglobulínu. Symbol C znamená „chimérický“.

d) pCVH425 (=HCMV-CVH425-gama), uložený 1. februára 1991 v súlade s Budapeštianskou dohodou v Nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod prírastkovým číslom DSM 6337. Tento expresívny vektor obsahuje sekvencie FRs a hypervariabilných oblastí (CDRs) variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky 425 Muridae a konštantnej oblasti ľahkého reťazca humánneho gama-1 imunoglobulínu. Symbol C znamená „chimérický“.

e) Hybridová bunková línia 425, uložená 26. februára 1988 v súlade s Budapeštianskou dohodou v americkej zbierke Američan Type Culture Collection (ATCC) pod prírastkovým číslom HB 9629. Táto bunková línia produkuje protilátku 425 Muridae, ktorá je zameraná na receptor EGF.

Iné biologické materiály

Iné mikroorganizmy, bunkové línie, plazmidy, promótory, markery rezistencie, počiatky replikácie alebo iné fragmenty vektorov, ktoré sú uvedené v tomto opise, sú obchodne alebo inak všeobecne dostupné. Ak nie je v tomto opise uvedené inak, používajú sa len ako príklady a ich konkrétna voľba nie je pri uskutočňovaní vynálezu dôležitá, takže je možné nahradiť ich inými vhodnými prostriedkami a biologickými materiálmi.

Na amplifikáciu príslušných sekvencií DNA sa prednostne používajú bakteriálni hostitelia. Ako príklad takých hostiteľov je možné uviesť E. coli alebo Bacillus.

Pri výrobe humanizovaných a chimérických protilátok podľa tohto vynálezu sa dáva prednosť eukaiyotickým bunkám, ako je COS (CV1 pôvod SV 40) alebo bunkám z vaječníkov čínskeho chrčka (CHO) alebo kvasinkám. Osobitná prednosť sa dáva bunkám COS a CHO.

Všeobecné postupy výroby

Technológie, ktoré sú podstatné na uskutočňovanie tohto vynálezu, sú podrobne uvedené v tomto opise.

Iné technológie, ktoré nie sú podrobne opísané, zodpovedajú známym štandardným technológiám, ktoré sú dobre známe odborníkom v tomto odbore alebo ktoré sú opísané podrobnejšie v uvedených literárnych odkazoch, patentových prihláškach a štandardnej odbornej literatúre.

Prehľad obrázkov na výkrese

Na obr. 1 sú schematicky znázornené vektory, používané na expresiu chimérických a pretvorených humánnych protilátok. Reštrikčné miesta, používané pri konštrukcii expresívnych plazmidov, sú označené. Sekvencie, kódujúce variabilnú oblasť, sú znázornené čiernymi úsekmi, konštantné oblasti sú znázornené bielymi úsekmi, promótor HCMV a zosilňovač transkripcie (enhacer) šrafovanými úsekmi a nukleotidový fragment z plazmidu pSVneo je zná zornený bodkovanými úsekmi. Smery transkripcie sú znázornené šípkami.

Na obr. 2 sú znázornené sekvencie nukleotidov a aminnky selín V_H425 (A) a V_L425 (B) cDNA klonovanej do pUC18. Aminokyseliny, prispievajúce k vedúcej sekvencii (leader), sú podčiarknuté a CDRs sú označené zátvorkami. Miesta zostrihu medzi variabilnými oblasťami a konštantnými oblasťami sú tiež znázornené. Sú tu znázornené aj predné a zadné PCR-prímery a ich miesta teplotnej hybridizácie (annealing sites), použité pri konštrukcii génov kódujúcich chimérické protilátky.

Na obr. 3 sú uvedené sekvencie nukleotidov a aminokyselín syntetizovaného génového fragmentu, kódujúceho pretvorenú humánnu V_na425. Vedúca sekvencia je podčiarknutá a rezíduá, prispievajúce k CDRs, sú v zátvorkách.

Na obr. 4 je uvedené porovnanie sekvencie aminokyselín myšej a pretvorenej humánnej variabilnej oblasti 425. Panel A ukazuje sekvenciu myšej V_L (V_L425) a pretvorenej humánnej V_LS (RV_La425 a RV_Lb425). Panel B ukazuje sekvencie myšej V_H (Vh425) a pretvorenej humánnej V_HS (RV„a425, RV_Hb425, RVhc425, RV_Hd425, RVHe425, RV„f425, RV_Hg425, RV_Hh425, RV„i425) a sú označené FRs a CDRs. Aminokyseliny sú očíslované podľa Kabat a ďalší (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices.

Na obr. 5 je znázornený molekulový model variabilných oblasti myšej MAb 425.

Na obr. 6 je znázornená detekcia väzby k EGFR pomocou metódy ELISA. Aktivita väzby antigénu sa stanovuje v zriedených supematantoch tetransfektovaných COS buniek a vynáša sa do grafu ako optická hustota pri 450 nm oproti koncentrácii IgG (zistené metódou ELISA, pozri časť opisu„Materiály a metódy“). Všetky verzie pretvorených humánnych V_H oblastí sa transfektujú s RV_La425 a sú reprezentované nasledujúcimi grafickými symbolmi:

RV_Ha425 A, RV„b425 O, RV_}Ic425 Δ, RVnd425 <8f; RV„e425 □, RV_Hf425 B, RF_Hg425 □, RV_Hh425 O, RV_Hi425 ®, RV_Hb425 kotransfektovaný ako RV_Lb425 je reprezentovaný symbolom ♦. Produkty kotransfekcie chimérického V_L425 a Vh425 sú reprezentované symbolom ·.

Na obr. 7 je znázornená konkurencia pri väzbe k antigénu. V okienku A je znázornená konkurencia medzi označenou myšou protilátkou 425 a (1) neoznačenou myšou protilátkou 425 (+) a (2) chimérickou protilátkou 425 (·), produkovanou bunkami COS po kotransfekcii s HCMV-CV_L425-kapa a HCMV-CV_H425-gama-l. V okienku B je znázornená konkurencia medzi označenou myšou protilátkou 425 a (1) neoznačenou myšou protilátkou (+) a (2) pretvorenými humánnymi protilátkami 425, produkovanými bunkami COS po kotransfekcii s HCMV-RVta425-kapa a HCMV-RV_Li425-gama-l (O) a s HCMV-RV_La425-kapa a HCMV-RV_Hg425-gama-l (□). Vo všetkých prípadoch sa na horizontálnu os vynáša koncentrácia inhibítora v ng/ml. Na vertikálnu os sa vynáša percento inhibície väzby.

Na obr. 8 sú znázornené účinky rôznych pretvorených humánnych oblastí V_L na väzbu antigénu. V okienku A je znázornená väzba antigénu pretvorenými humánnymi protilátkami, produkovanými v bunkách COS transfektovaných HCMV-CV_L425-kapa a HCMV-CV_H425-gama-l (·), HCMV-RV_La425-kapa a HCMV-RV_Hg425-gama-l (□), HCMV-RV_Lb425-kapa a HCMV-RV_Hg425-gama-1 (), HCMV-RV_La425-kapa a HCMV-RVHc425-gama-l (Δ) a HCMV-RV_Lb425-kapa a HCMV-RV_Hc425-gama-l (Á).

SK 281143 Β6

V okienku B je znázornená konkurencia o väzbu k antigénu medzi označenou myšou protilátkou 425 a (1) neoznačenou myšou protilátkou 425 (+) a (2) pretvorenými humánnymi protilátkami 425, produkovanými v bunkách COS kotransfektovaných HCMV-V_La425-kapa a IICMV-V_Hg425-gama-1 (□) a HCMV-V_Lb425-kapa a HCMV-V_Hg425-gama-1 (). V okienku A sa na vertikálnu os vynáša optická hustota pri 450 nm (OD450) a na horizontálnu os sa vynáša koncentrácia IgG v ng/ml. V okienku B sa na horizontálnu os vynáša koncentrácia inhibítora v ng/ml a na vertikálnu os percento inhibície väzby.

Na obr. 9 je v okienku A znázornená analýza pretvorených (dráhy 1 a 2), chimérickej (dráha 3) a Muridae (dráha 4) MAbs 425 metódou SDS-PAGE za neredukujúcich podmienok (a) a za redukujúcich podmienok (b). Dráhy 7 a 8 zodpovedajú pretvoreným, dráha a chimérickej a dráha 10 protilátke z Muridae. Dráhy 5, 6, 11 a 12 predstavujú markery molekulovej hmotnosti. V okienku B je znázornená purifikácia pretvorenej MAb 425 gélovou filtráciou na Superose 12. Pík 2 zodpovedá IgG.

Na obr. 10 je .znázornená konkurencia medzi MAb z Muridae, chimérickou a pretvorenými MAbs 425 o receptor EGF (EGFR). Na vertikálnu os sa vynáša pomer medzi viazanou (Mab) a celkovou (Mab) v percentách (% viazaná/celkom). Na horizontálnu os sa vynáša koncentrácia protilátky (mol/1 /log/. Používajú sa nasledujúce symboly:

V znamená MAb 425 z Muridae

O znamená MAb 425 chimérickú ·, ▼ znamená MAb 425 pretvorené.

Na obr. 11 je znázornená konkurencia medzi EGF a protilátkami o receptory EGF. Na vertikálnu os sa vynáša % viazaná/celkom /MAb/. Na horizontálnu os sa vynáša koncentrácia protilátky (mol/1 /log). Symbol O znamená MAb 425 z Muridae a symboly Δ, V, □ znamenajú MAb 425 pretvorené.

Nasleduje podrobný opis vynálezu.

Klonovanie a sekvenovanie génov variabilnej oblasti MAb 425

Zo syntézy cDNA a klonovania s použitím prímeru s kapa reťazcom sa na screening prednostne vezme 300 až 400 kolónii Zo syntézy cDNA a klonovania s použitím prlmeru gama-2a sa prednostne vezme na screening 200 až 300 kolónií. Po screeningu hybridizáciou s použitím dvoch zodpovedajúcich klonovacích prímerov poskytuje 20 až 30 kolónií s ľahkým reťazcom a 10 až 20 kolónii s ťažkým reťazcom silné signály. Z týchto kolónií sa izoluje plazmidová DNA a analyzuje obvyklým spôsobom štiepenia obchodne dostupnými reštrikčnými enzýmami, aby sa stanovila veľkosť inzertov cDNA. Ako kandidáti na sekvenovanie sa volia klony zrejme obsahujúce inzert 400 až 500 bp v prípade V_L klonovania a 500 až 600 bp v prípade V_H klonovania. Tri V_L klony a tri V_H klony sa sekvenujú na obidvoch vláknach s použitím univerzálnych a reverzných sekvenačných prímerov M13. Z troch možných V_L Idonov, ktoré boli sekvenované, jeden kóduje úplnú variabilnú oblasť a ostatné kódujú peptidy, ktoré k nej nemajú vzťah. Dva z V_H klonov kódujú identické V_H oblasti, zatiaľ čo ostatné kódujú Vh oblasť s intrónom medzi vedúcou sekvenciou a ešte prítomným FR-1. Vedľa intrónu tretí V_H kloň obsahuje kódujúcu sekvenciu, ktorá je identická so sekvenciami prvých dvoch klonov. Na overenie sekvencie V_L oblasti sa sekvenujú tri ďalšie cDNA klony, ktoré obsahujú inzerty vhodnej veľkosti. Dva z nich poskytujú sekvencie, ktoré sú v súlade s prvým V_L klonom. Tretí pred stavuje nepodobnú DNA sekvecniu. V sekvenovaných klonoch nie sú prítomné všetky pôvodné sekvencie prímeru. Rozsah delécii sa mení od klonu ku klonu. Tieto delécie, ku ktorým dochádza pravdepodobne v priebehu syntézy cDNA a klonovania, môžu znížiť účinnosť sreeningu kolónie.

Gény V_L a V_H MAb 425 sú znázornené na obr. 2. Sekvencia aminokyselín V_L a V_H oblasti 425 sa porovnáva s ínými myšími variabilnými oblasťami v Kabátovej databáze (Kabat a ďalší, (1987) Sequence of Proteins Immunological Intercst, US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices). Oblasť V_L je možné zatriediť do podskupiny IV alebo VI myších variabilných oblastí s reťazcom kapa. V úsekoch základnej štruktúry (FRs) vykazuje oblasť 425 V_L približne 86 % identitu s konvenčnou sekvenciou myšej kapa podskupiny IV a približne 89 % identitu s podskupinou VI. Zdá sa, že oblasť 425 V_L používa segment JK4. Pri skúmaní V_H oblasti sa zistí približne 98 % identita s FRs konvenčnej sekvencie myšieho ťažkého reťazca z podskupiny II (B).

Správna voľba vhodnej triedy alebo podskupiny humánneho imunoglobulinu je závislá od stupňa identity s reťazcom, ktorý je v nehumánnej protilátke pôvodne prítomný. Identita dedukovanej konvenčnej sekvencie podľa tohto vynálezu by mala byť vyššia ako 65 až 70 %, pri porovnaní so sekvenciou pôvodného nehumánneho reťazca.

Dáva sa prednosť konvenčným sekvenciám ťažkých reťazcov, najmä však konvenčnej sekvencií humánneho ťažkého reťazca z podskupiny I. Pre iné protilátky sú však vhodné konvenčné sekvencie iných humánnych ťažkých reťazcov. Prednostné konvenčné sekvencie sú modifikované. Možná výmena aminokyselín je podľa vynálezu 0 až 10 %, prednostne 5 až 10 %.

Konštrukcia a expresia chimérickej protilátky 425

Skôr ako je možné použiť pri konštrukcii chimérickej protilátky 425 cDNA na kódovanie V_L a V_H oblastí, je potrebné zaviesť niekoľko modifikácií do 5'- a 3'-konca. Tieto modifikácie zahŕňajú zavedenie vhodných miest pre reštrikčné enzýmy tak, aby bolo možné sekvencie kódujúce variabilnú oblasť ľahko subklonovať do expresívnych vektorov HCMV. Je nutné znova vytvoriť donorové zostrihnuté miesta v 3’-lemujúcich oblastiach kvôli správnemu a účinnému zostrihu variabilných oblastí ku konštantným oblastiam.

Aj 5'-lemujúce oblasti sa modifikujú, aby obsahovali sekvenciu, ktorá by vytvorila účinné iniciačné miesta pre transláciu cukaryotickými ribozómami (Kozák a ďalší (1987), J. Mol. Bio., 196, 947). Tieto modifikácie sa zavádzajú použitím PCR prímerov. Použité prímery sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Oligonukleotidy použité na klonovanie cDNA, konštrukciu chimerík a mutagenézu. Podčiarknuté úseky označujú bázy, ktoré sa tepelne hybridizujú k humánnej štruktúre.

číslo sakvenele opis

1,	S' -GTAGGAŤCCTGGATGGTGGGAAGATG-3'	prímer lahkého reťazca na syntézu cDNA
2.	S’ -GTAGGATCCAGTGúATAGACCGATG-3'	príšer ťaZkého reťazca na syntézu cDNA
3.	5r -CTCCAAGCTTGACCICACCATGG-3'	predný príšer chlserlckej oblasti vH
		zadný príšer
4.	5' -TT<^rCCACTCACCTGAGGAGACTGTGA-3'	chieerickaj oblasti vH
5.	S' “AauiÄGcrTccAíXAT(^TTrreuu^G-3·'	predný príme r chinariekaj oblasti VL
5.	5' -GTAGATCTACŤCACGTTITATTTCCAAC-3'	zadný príšer ohiserickej ob1..U VL
1.		CDR-1 príšer pre tvorenej oblasti
	TAACTŤACKTGTATTGGTKCCfcfiCKG-3*
8.	S' -cTGCTGATCTACCACxcAtccAACCTGGc	CDR-2 príšer pretvorenej oblas-
	TTCTGGŤGTGCCAJlGC-3*	« ’l
9.	y -xcctaoactgccmťcagtggabtagtca-	CDR-3 príšer pretvorenej oblasti
	CATATTCÔ£SH£SS££iÄ-3'	v *L
10.	S' -AGCGGTACCGACTACACCTTCACCATC-3'	príšer na zavádza-

nie F71Y do

11.	5' -ATACCTTCACATCCCžCTG-3'	príšer ne zavádzanie S30T do RVh
12.	5' “OÍAGTCaATTOGCGAGT-3·	prítner n* zavádzanie V48T do RVh
13.	5' -nTAAGAGCAAGGCIACCATCACCGTGGAcacctct-i'	príšer na zavádzanie R66K, V67A a L71V do RVh
14.	S' -CATGACCGrCCKCACCTCT-3’	príšer ns zavádzanie L71V do PVH

Pre každú variabilnú oblasť cDNA sa prednostne vytvoria dva prímery. V predných prímeroch sa použije 15 báz na 3'-konci prímeru na hybridizáciu prímeru k templátovej DNA zatiaľ čo 5'-koniec prímeru obsahuje miesto HindlII a „Kozákovu sekvenciu“. Zadné prímery majú podobné zloženie. Posledných 15 báz pri 3'-konci sa použije na hybridizáciu prímeru k templátovej DNA a 5'-koniec prímeru obsahuje miesto BamHI donorové miesto pre zostrih. V prípade zadného prímeru ľahkého reťazca sa používa miesto BglII namiesto miesta BamHI, pretože cDNA kódujúca V_L obsahuje interné miesto BamHI (pozri obr. 2). Reakcia PCR sa prednostne uskutočňuje spôsobom opísaným v príkladoch.

DNA V_L oblasti modifikovaná PCR sa klonuje do miest HindlII a BamHI expresívneho vektora ľahkého reťazca HCMV, ako HindlIl-BglII fragment. Tento vektor už obsahuje humánnu genómovú konštantnú oblasť kapa s pohrebným akceptorovým miestom ; pre zostrih a miestami poly(A⁺). Celý PCR-modifikovaný V_L fragment sa sekvenuje s použitím dvoch prímerov, ktoré sa tepelne hybridizujú k miestam lemujúcim klonovacie miesto expresívneho vektora. Sekvenovanie potvrdzuje, že v priebehu stupňa PCR neboli zavedené žiadne chyby. PCR-modifikovaná V_H DNA sa klonuje do expresívneho vektora ťažkého reťazca HCMV, ako HindlII-BamHI fragment a tiež sa sekvenuje, aby sa potvrdilo, že počas PCR neboli zavedené žiadne chyby. Fragment BamHI obsahujúci humánnu genómovú konštantnú oblasť gama-1 sa vloží do vektora HCMV-CVH na 3'-strane oblasti V_H. Tento fragment obsahuje potrebné akceptorové miesto pre zostrih V-C, ktorý sa má uskutočniť in vivo, a prírodné miesto poly(A⁺).

Expresívne vektory obsahujúce chimérické oblasti 425 V_L a V_H sa kotransfektujú do vhodných eukaryotických buniek, prednostne do buniek COS. Po približne 72 hodinách prechodnej expresie sa médium bunkovej kultúry skúša metódou ELISA na prítomnosť produkovaného humánneho IgG a na väzbu k EGFR proteínu. Množstvo humánneho IgG detegovaného v médiu kolíše v rozmedzí od 100 do 400 ng/ml. Vyrobená chimérická protilátka sa dobre viaže na proteín EGFR pri štandardnej skúške väzby antigénu ELISA, čím sa potvrdí, že boli klonované a sekvenované správne myšie variabilné oblasti.

Počiatočné navrhnutie, konštrukcia a expresia pretvorených humánnych ľahkých a ťažkých reťazcov 425

Pri návrhu pretvorenej humánnej protilátky 425 sa najväčší doraz kladie na oblasť V_H, pretože táto doména je často pri väzbe antigénu najdôležitejšia (Amit a ďalší (1986), Science 233, 747; Verhoeyen a ďalší (1988) Science 239, 18). Pri voľbe humánnych FRs, na ktorých sa majú očkovať myšie CDRs, sa FRs myšej VH oblasti MAb 425 porovnávajú s FRs konvenčných sekvencií zo všetkých podskupín humánnych oblastí V_H (Kabat a ďalší, (1987) pozri uvedenú citáciu). Toto porovnanie ukazuje, že FRs oblastí V_H myšej protilátky MAb 425 sú najviac podobné FRs humánnych oblastí VH podskupiny I. Je tu 73 % identita medzi FRs a približne 65 % identita medzi celými oblasťami V_H.

Uskutoční sa ďalšie porovnávanie myšej oblasti V_H 425 s inými myšími oblasťami Vh z rovnakých Kabátových podskupín, aby sa identifikovali všetky zvyšky FR, ktoré sú charakteristické pre MAb 425, a mohli by sa teda podieľať na väzbe antigénu. Zvyšok v polohe 94 myšej oblasti V_H MAb 425 je serín, zatiaľ čo v iných oblastiach V_H myšej podskupiny II (B) a aj humánnej podskupiny I je zvyškom 94 arginín (Kabat a ďalší, (1987), pozri uvedenú citáciu). Táto substitúcia aminokyseliny je neobvyklá, a pretože poloha 94 prilieha k CDR-3, jedná sa o prekvapivo dôležitú polohu. Z týchto dôvodov sa pretvorená oblasť V_H humánnej 425 prednostne navrhuje tak, že je založená na CDRs myšej protilátky MAb 425 a FRs odvodených z konvenčnej sekvencie humánnych FRs z podskupiny I (podľa definície Kabata a ďalších (1987), pozri uvedenú citáciu). Polohy 94 vo FR-3 sa obsadia serínom, ako je to u myšej protilátky MAb 425. V polohách konvenčnej sekvencie FRs z humánnej podskupiny I, kde nie sú uvedené jednotlivé aminokyseliny sa zvoli aminokyselina, ktorá sa najčastejšie vyskytuje v tejto polohe. Ak sa v určitej polohe humánnej konvenčnej sekvencie nevyskytuje žiadna aminokyselina prednostne, volí sa ako aminokyselina tá aminokyselina, ktorá sa v tejto polohe sekvencie nachádza v oblasti V_H myšej MAb 425. Výsledná aminokyselinová sekvencia obsahuje prvú verziu (verziu „a“) pretvorenej humánnej oblasti V_H 425 (pozri obr. 3). Všetky nasledujúce verzie pretvorenej oblasti V_H humánnej 425 sú modifikáciami tejto prvej verzie.

Navrhne sa a syntetizuje (pozri príklady a obr. 3) 454bp fragment DNA, ktorý kóduje pretvorenú V_H oblasť humánnej 425, ako je to opísané. Okrem sekvencií DNA, kódujúcich aminokyseliny pretvorenej V_H oblasti humánnej 425, obsahuje tento fragment DNA aj sekvencie, kódujúce humánnu vedúcu sekvenciu. Humánna vedúca sekvencia sa môže vziať napríklad z protilátky HG3 CL (Rechavi a ďalší, (1983), Proc. Natl. Sci. USA 80, 855), čo je člen humánnej oblasti V_H z podskupiny I (Kabat a ďalší (1987), pozri uvedenú citáciu). Fragment syntetickej DNA tiež obsahuje eukaryotické translačné signály na 5'-konci (Kozák (1987), J. Mol. Bio. 196, 1947), donorové miesto pre zostrih na 3'-konci (Breathnach a ďalší (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4853), a miesto HindlII na 5'-konci a

SK 281143 Β6 miesto BamHI na 3'-konci, na subklonovanie do expresívneho vektora HCMV.

Podobný postup sa použije aj na zostrojenie pretvorenej oblasti V_L humánnej 425. Úseky FRs myšej V_L oblasti protilátky MAb 425 sa porovnajú s konvenčnými sekvenciami všetkých podskupín humánnych oblastí V_L (Kabat a ďalší (1987), pozri uvedenú citáciu). Pri FRs sa zistí približne % totožnosť medzi oblasťou V_L myšej 425 a humánnou oblasťou V_L kapa z podskupiny III a približne 70 % identita s humánnou oblasťou V_L kapa z podskupiny I. DNA kódujúca humánne FRs humánnej oblasti V_L kapa z podskupiny I je už dostupná z pretvorenej humánnej oblasti V_L D1.3 (EP 239 400, Winter) a pretvorenej humánnej Campath-1 (Reichmann a ďalší (1988), Náture 322, 21). Návrh pretvorených humánnych oblastí V_L v týchto dvoch humánnych protilátkach je založený na štruktúrne vyriešenom humánnom imunoglobulínovom protcíne REI (Epp a ďalší (1975), Biochemistry 14, 4943). Z týchto dôvodov sa používajú aj humánne FRs z oblasti V_L z pretvorenej humánnej protilátky D 1.3 a CAPMPATH-1H v pretvorenej humánnej oblasti V_L 425. Porovnanie FRs myšej oblasti V_L 425 a FRs iných myších protilátok z podobných podskupín neukazuje žiadne podstatné rozdiely vo zvyškoch aminokyselín vo funkčne dôležitých polohách. Z týchto dôvodov nie sú potrebné žiadne zmeny v humánnych FRs. Sekvencia aminokyselín pretvorenej humánnej oblasti V_L 425 verzie „a“ je na obr. 4.

Na konštrukciu pretvorenej humánnej V_L oblasti 425 sa zostroja tri oligonukleotidy, obsahujúce interné sekvencie DNA, kódujúce tri CDRs myšej V_L oblasti 425 a 12 báz na 5'- a 3'-koncoch, ktoré sú určené na hybridizáciu so sekvenciami DNA, ktoré kódujú humánne FRs v pretvorenej humánnej V_L oblasti protilátky D 1.3 (pozri oligonukleotidy 7 až 9 v tabuľke I). Štepenie CDR sa uskutočňuje spôsobom opísaným v príkladoch. Po sekvenovaní DNA pravdepodobných pozitívnych klonov zo sereeningu je celkový výťažok trojnásobného mutantu 5 až 15 prednostne 9 až 10 %. Pretvorená V_L oblasť humánnej 425, ktorá neobsahuje žiadne omyly PCR, sa klonuje ako fragment HindlII - BamHI do expresívneho vektora ľahkého reťazca za vzniku plazmidu HCMV-RV_La425-kapa (pozri obr. 1).

Dva expresívne vektory, nesúce pretvorené oblasti V_L 425 a V_H 425 sa teraz kotransfektujú do vhodných buniek (pozri vyššie), s cieľom hľadania prechodnej expresie funkčnej pretvorenej humánnej protilátky 425. Približne po hodinách sa bunkové supematanty pozberajú a metódou ELISA sa v nich stanovuje humánny IgG. Humánny IgG môže byť stanovený na úrovni v rozmedzí od 100 do 500 ng/ml, avšak pri skúške ELISA, zameranej na stanovenie väzby antigénu, nie je väzba na EGFR s prekvapením detegovateľná. Ak sa bunky kotransfektujú HCMV-RV_La425-kapaZHCMV-CV_H425-gama-l, vyrobí sa humánny IgG, ktorý sa viaže k EGFR. Ak sa však bunky kotransfektujú HCMV-CV_L425kapa/HCMV-RV_Ha425-gama1, vyrobí sa humánny IgG, ktorý sa však na detegovateľnej úrovni neviaže k EGFR. Z týchto neočakávateľných výsledkov je zrejmé, že sú potrebné ďalšie modifikácie s charakterom vynálezu vo FRs pretvorenej humánnej oblasti V_H 425, aby sa získalo funkčné miesto viažuce antigén.

Modifikácia FRs pretvorenej oblasti V_H humánnej 425

Na základe molekulového modelu domén myších variabilných oblastí 425 sa uskutočnia ďalšie zmeny vo FRs pretvorenej humánnej V_H oblasti 425. Preskúmajú sa slučky CDR pretvorenej humánnej oblasti V_H, aby sa zistilo, ako sa zhodujú s kánonickými štruktúrami, ktoré opísali

Chothia a ďalší (1989), Náture 342, 877. Na základe tejto analýzy sa uskutočnia vo FRs určité zmeny. Uskutočnia sa aj iné zmeny FRs, ktoré sú založené na funkčnej pretvorenej humánnej protilátke anti-Tac, ktorá bola taktiež zostrojená na základe humánnych FRs z podskupiny I (Queen a ďalší (1989)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10 029). S prekvapením bolo zistené, že oblasť V_H myšej protilátky anti-Tac je približne na 79 % identická s V_H oblasťou myšej protilátky 425. Teraz sa podľa vynálezu vytvorí molekulový model variabilných oblastí myšej protilátky 425 (obr. 5). Model je založený na štruktúre HYHEL-5, čo je protilátka s objasnenou štruktúrou, ktorej variabilné oblasti vykazujú vysoký stupeň homológie s oblasťami myšej protilátky 425. Na základe tejto analýzy sa zvyšky aminokyselín v polohách 30, 48, 67, 68 a 71 v pretvorenej humánnej oblasti V_H protilátky zmenia tak, aby boli identické zo zvyškami aminokyselín, ktoré sa vyskytujú v týchto polohách v myšej oblasti V_H protilátky 425. Na ozrejmenie individuálnych účinkov týchto zmien sa uskutočňované zmeny pri konštrukcii podľa vynálezu rôzne kombinujú a potom skúšajú.

Celkom sa skonštruuje 8 nových verzií pretvorenej oblasti V_H humánnej protilátky 425 (pozri obr. 4). Z verzií, ktoré sa vytvoria spôsobmi podrobne opísanými v príkladoch, sa ďalšie verzie vyrobia rekombináciou malých fragmentov DNA z predchádzajúcich verzií. Keď sú už všetky žiadané verzie zostavené, prednostne v pUC18, prenesú sa pretvorené V_H oblasti humánnej protilátky 425 vo forme fragmentov HindlII-BamHI do expresívneho vektora HCMV-Vh, za vzniku verzií „b“ až „i“ plazmidu HCMV-RV_h 425-gama-l (obr. 4).

Modifikácia v FRs pretvorenej oblasti V_L humánnej protilátky 425

Aj keď príslušné bunky kotransfektované vektormi exprimujúcimi pretvorený ľahký reťazec humánnej protilátky 425, verziou „a“ a chimérickým ťažkým reťazcom protilátky 425 skutočne produkujú protilátku, ktorá sa viaže k EGFR, protilátka s pretvoreným ľahkým reťazcom humánnej protilátky 425 sa neviaže tak dobre ako chimérická protilátka 425. Preskúmaním oblastí V_L myšej protilátky 425 a pretvorením humánnej verzie „a“ protilátky 425 sa ukazuje, žc zvyšok 71, ktorý je súčasťou kanonickej štruktúry CDR-1 (Ll) nie je zachovaný vo verzii „a“ (Chothia a ďalší (1989), Náture 342, 877). Na zavedenie zmeny Phe na Tyr v tejto polohe sa prednostne použije PCR-mutagenéza (Kamman a ďalší (1989), Nucleic Acids Res. 17, 5404). Fragment HindlII-BamHI, vzniknutý touto mutagenézou, sa zavedie do expresného vektora HCMV-Vl na vytvorenie HCMV-RV_Ľb425-kapa (pozri obr. 4).

Analýza nových verzií pretvorenej oblasti V_H humánnej protilátky 425

Expresívne vektory, obsahujúce pretvorené humánne verzie V_H „a“ až „i“, sa kotransfektujú do uvedených buniek s expresívnym vektorom, obsahujúcim pretvorenú humánnu V_L oblasť verzie „a“. Po asi 3 dňoch sa bunkové supematanty analyzujú metódou. ELISA na produkciu humánneho IgG. Úroveň produkcie kolíše v rozmedzí od 50 do 500 ng/ml. Potom sa vzorky analyzujú metódou ELISA na humánny IgG, ktorý je schopný viazať sa k EGFR. Rôzne verzie pretvorených humánnych oblastí V_H majú za následok mnoho rôznych úrovni väzby antigénu (pozri obr. 6). Pri tomto teste ELISA na väzbu antigénu sa môžu rázne pretvorené humánne protilátky 425 priamo porovnávať s

SK 281143 Β6 chimérickou protilátkou 425, ale nie s myšou protilátkou 425. Je to tak preto, že protilátkou použitou na detekciu väzby k antigénu je antihumánna protilátka IgG. Deväť verzií pretvorenej humánnej oblasti V_H je možné rozdeliť do skupín podľa ich schopnosti väzby k EGFR. Verzie „g“ a „i“ pretvorenej humánnej oblasti V_H poskytujú najvyššie úrovne väzby, potom nasledujú verzie „c“, „f“ a „h“, nato nasleduje verzia „b“. Pri niektorých pokusoch poskytuje verzia „e“ nízku, ale detegovateľnú úroveň väzby. Verzie „a“ a „d“ nikdy neposkytujú detegovateľnú úroveň väzby.

Na priame porovnanie pretvorených humánnych protilátok 425, obsahujúcich verzie „g“ a „i“ V_H, a chimérickej protilátky 425 s myšou protilátkou 425 sa použije konkurenčný väzbový test (pozri obr. 7). Pretože protilátky v bunkových supematantoch nie sú purifikované, a preto sú kvantifikované metódou ELISA, je potrebné považovať výsledky konkurenčného väzbového testu za hodnoty relatívnej úrovne väzby, skôr ako za presnú kvantifikáciu afinity. Konkurenčné väzbové testy so vzorkami zo 4 pokusov, napríklad v bunkách COS, poskytujú konzistentné výsledky, pokiaľ sa týka relatívnej úrovne väzby k antigénu. Chimérická protilátka 425 dobre súťaží s označenou myšou protilátkou 425 a poskytuje percentovú inhibíciu väzby, ktorá je práve o niečo nižšia ako je inhibícia pri konkurenčnom teste s použitím neoznačenej myšej protilátky 425, ktorá súťaží s označenou myšou protilátkou 425 (pozri obr. 7, okienko A). Pretvorená humánna protilátka s oblasťou V_La a V_Hg je lepšia ako protilátka s oblasťou V_La a V_Hi (pozri obr. 7, okienko B). Porovnanie bodov, ktoré prislúchajú „plató“ na krivkách väzby, ukazuje, že pretvorená humánna protilátka s oblasťou V_Hg súťaží s označenou myšou protilátkou 425 na 60 až 80 % tak dobre, ako to robí neoznačená myšia protilátka 425 pri rovnakom teste. Keď sa urobí priemer výsledkov s použitím vzoriek zo 4 nezávislých pokusov, napríklad s použitím buniek COS alebo CHO, dospeje sa k zisteniu, že pretvorená humánna protilátka, obsahujúca oblasť V_La a V_Hg, poskytuje väzbu, ktorá zodpovedá 60 až 80 % väzby myšej protilátky 425.

Na základe týchto výsledkov je možné komentovať relatívne príspevky jednotlivých zvyškov v FRs štruktúre k väzbe antigénu. Najsignifíkantnejšia jednotlivá zmena v tejto štúdii je zmena L71V. Bez tejto zmeny s prekvapením sa nedá detegovať žiadna väzba k antigénu (porovnaj verzie „a“ a „b“ V_H). Pre väzbu sú prekvapením dôležité aj zmeny R67K a V68A (porovnaj verzie „b“ a „c“ a verzie „i“ a „h“ V_H). Zatiaľ čo H zavedenie samotnej zmeny V48KI a zmien V48I a S3OT spoločne, nemá za následok signifikantnú väzbu antigénu, zmeny v týchto polohách skutočne zvyšujú väzbu antigénu. Zmena S3OT má s prekvapením vyšší účinok ako zmena V48I (porovnaj verzie „g“ a „i“ a verzie „f‘ a „i“ V_H).

Analýza novej verzie pretvorenej oblasti V_L humánnej protilátky 425

Expresívny vektor obsahujúci RV_Lb425 sa kotransfektuje do vhodných, prednostne eukaryotických buniek s expresívnym vektorom obsahujúcim verzie „b“, „c“ alebo „g“ pretvorenej humánnej oblasti V_H. Pozberajú sa bunkové supematanty a skúšajú na produkciu IgG a potom na humánny IgG, ktorý je schopný viazať sa k EGFR (pozri obr. 8, okienko A). Tieto výsledky ukazujú, že verzia „b oblasti V_L pretvorenej humánnej protilátky 425 zvyšujú väzbu k antigénu. Potom sa uskutoční konkurenčný väzbový test s cieľom porovnať pretvorenie humánnych protilátok 425 s oblasťou V_La plus V_Lb plus V_Hg s myšou protilátkou 425. Pretvorená humánna protilátka MAb 425 s verziou „b“ ob lasti V_L má vyššiu afinitu pre antigén. Zmena F71Y v oblasti V_L teda zvyšuje väzbu antigénu. Pretvorená humánna protilátka MAb 425 s oblasťou V_Lb a V_Hg vykazuje afinitu pre antigén, ktorá je 60 až 80 % afinity protilátky myšovitých MAb 425.

Z iných experimentov použitím pretvorenej humánnej protilátky obsahujúcej kombináciu V_Lb plus V_Hg (pozri príklady 10 a 11) je zrejmé, že väzbová potencia k EGFR je podobná pre chimérickú, pretvorenú a protilátku z myšovitých.

Z vynálezu je zrejmé, že pomerne konzervatívne zmeny v FR zvyškoch môžu silno ovplyvniť väzbu antigénu.

Molekulový model variabilných oblastí myšej protilátky 425 jasno ukazuje, že tento zvyšok v polohe 30 V_H je na povrchu tejto molekuly v susedstve CDR-1. V skutočnosti Hl, podľa definície, ktorú uskutočnili Chothia a Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196, 901, zasahuje od zvyšku 26 do zvyšku 32, takže zahŕňa zvyšok v polohe 30. Keď sa zvyšok v polohe 30 v protilátke CAMPATH-1H zmení zo Ser na THR, nemá to žiadny vplyv na väzbu antigénu. Keď poloha 30 sa zmení zo Ser na Thr v pretvorenej humánnej oblasti V_h425, zlepší sa väzba k antigénu. Ukazuje sa, že aminokyselina v polohe 3C skutočne hrá určitú úlohu pri väzbe antigénu pri tejto konkrétnej interakcii protilátky s antigénom. Pretože zmena S3OT zlepšuje väzbu antigénu len nepatrne, a pretože táto zmena nie je pre väzbu antigénu podstatná, vykazuje Thr v polohe 30 len slabú interakciu s antigénom.

Zmena zvyšku v polohe 71 vo V_H silno ovplyvňuje väzbu antigénu. Táto skutočnosť je prekvapujúca, pretože obidva zvyšky, ktoré boli skúšané v tejto polohe, t. j. Val a Leu, sa líšia len jednou metylskupinou. H2 myšej protilátky 425 je členom H2, skupiny 2 kánonických štruktúr definovaných Chothiom a ďalšími (1989), Náture 342, 877. HyHEL-5 má H2 so sekvenciou aminokyselín podobnou tej, ktorá má H2 myšej protilátky 425. V HyHEL-5 Pro v polohe 52A v CDR-2 sa zbalí do dutiny vytvorenej malou aminokyselinou (Ala) v polohe 71 FRs. V modeli variabilnej oblasti myšej protilátky 425 existuje podobná interakcia medzi Pro-52A a Val-71. Vo V_H myšej protilátky 425 je síce Pro v polohe 52A schopný zbaliť sa do dutiny vytvorenej Val v polohe 71, nahradenie Val-71 Leu však spôsobuje molekulovú kolíziu, ktorá môže zmeniť konformáciu slučky CDR2. Z tohto dôvodu zmena V71L v prevtorenej V_H oblasti humánnej protilátky 425 znova vytvára interakciu CDR-2-FR, k akej dochádza v oblasti V_H myšej protilátky 425. To s prekvapením veľmi zlepšuje väzbové vlastnosti pre antigén pretvorených humánnych protilátok 425 (porovnaj pretvorené humánne protilátky s verziami „a“ a „b“ V_H na obr. 6).

Zmena v polohe 71 V_L pravdepodobne ovplyvňuje konformáciu CDR, pretože zvyšok 71 je členom navrhovanej kanonickej štruktúry pre L1 (CDR-1) (Chothia a ďalší (1989), pozri uvedenú citáciu). Zvyšok 29 v CDR-1 je „pochovaný zvyšok“ (buried residue) a má styk so zvyškom 71 v FRs. V myšej protilátke 425 je zvyškom 71 vo V_L Tyr. V humánnych FRs, používaných na konštrukciu pretvorených humánnych oblastí V_L, je zvyškom 71 Phe. Ukazuje sa, že hydroxyskupina, ktorá je prítomná v Tyr, ale nie vo Phe, má úlohu pri udržiavaní správnej konformácie CDR-1.

Z molekulového modelu variabilných oblastí myšej protilátky 425 je zrejmé, že Lys-66 vytvára soľný mostík s

Asp-86.

Zavedenie väčšieho zvyšku Arg do polohy 66 by túto štruktúru rozbilo. Ala-67 môže interagovať s CDR-2 a súčasná výmena zvyškov 66 a 67 na Arg a Val, ako vo

V_Ha425 by mohla mať nepriaznivý stérický účinok na

SK 281143 Β6

CDR-2. Zvyšok v polohe 48 je, ako je známe, zvyšok „pochovaný“ (Chothia a Lesk (187), pozri uvedenú citáciu) a model túto skutočnosť potvrdzuje. Zmena zvyšku 48 z íle, ktorý sa nachádza v myšej protilátke 425, na Val, ktorý sa nachádza v humánnych oblastiach V_H podskupiny I, by mohol ovplyvniť väzbu antigénu všeobecne tak, že by došlo k rozpadnutiu tejto štruktúry. Aj aminokyselina v polohe 48 je blízko CDR-2 a môže mať malý stérický účinok na slučku CDR-2.

Zo štúdií konkurenčnej väzby je zrejmé, že najlepšími pretvorenými humánnymi oblasťami V_L a V_H sú oblasti V_Lb a V_Hg. V_Hg obsahuje všetkých päť zmien FR, diskutovaných a zároveň zmenu v polohe 94, ktorá je zahrnutá v prvej verzii v oblasti V_H pretvorenej humánnej protilátky 425. FRs vo verzii „b“ oblasti V_L pretvorenej humánnej protilátky 425 sú na 70 p identické s FRs v oblasti V_L myšej protilátky 425. FRS vo verzii „g“ oblasti Vh pretvorenej humánnej protilátky 425 sú na 80 % identické s príslušnými oblasťami myšej protilátky.

Terapeutické a diagnostické použitie protilátok podľa vynálezu

Protilátky podľa vynálezu je možné podávať humánnym pacientom z terapeutických alebo diagnostických dôvodov v súlade s postupmi známymi z doterajšieho stavu techniky. Obvykle sa protilátka alebo jej fragmenty podávajú vo forme parenterálnych injekcií, prednostne intraperitoneálne. Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa však môžu podávať aj intravenózne.

Stanovenie vhodných titrov protilátky na podávanie je v rozsahu skúsenosti odborníkov v tomto odbore. Zvyčajne sa pri podávaní monoklonálnych protilátok podľa vynálezu používa také široké rozmedzie dávkovania, že sa nim dosiahol požadovaný účinok pri potláčaní nádorov. Dávkovanie by nemalo byť také vysoké, aby spôsobovalo nepriaznivé vedľajšie účinky, ako sú nežiaduce krížové reakcie, anafylaktické reakcie a pod. Dávkovanie sa bude obvykle líšiť v závislosti od veku, zdravotného stavu, pohlavia a rozvoja choroby u pacienta a je v rozsahu skúseností odborníkov v tomto odbore. Ošetrujúci lekár môže dávkovanie upraviť v prípade akýchkoľvek kontraindikácií, imunologickej tolerancie alebo podobných stavov. Dávkovanie môže kolísať v rozmedzí od 0,1 do 70 mg/kg, prednostne od 0,1 do 50 mg/kg, pričom táto dávka sa môže podávať raz alebo niekoľkokrát denne jeden alebo viac dní.

Prípravky na parenterálne podávanie zahŕňajú sterilné, vodné alebo nevodné roztoky, suspenzie a emulzie. Ako príklady nevodných rozpúšťadiel je možné uviesť propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje, ako olivový olej a organické estery, ktoré je možné podávať injekčným spôsobom, ako je etyloleát. Vodné nosiče zahŕňajú vodu, vodno-alkoholové roztoky, emulzie alebo suspenzie, vrátane fyziologického roztoku a tlmených médií. Parenterálne vehikulá zahŕňajú roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu a chlorid sodný, laktátové Ringerove prípravky alebo stabilné oleje. Intravenózne vehikulá zahŕňajú prípravky doplňujúce kvapalinu a živiny alebo elektrolyt, ako sú prípravky na báze Ringerovej dextrózy a pod. Môžu byť prítomné aj konzervačné látky a iné prísady ako napríklad antimikrobiálne látky, antioxidanty, chelatačné činidlá, inertné plyny a pod.

Protilátky môžu byť konjugované k toxínu, ako je ricínová podjednotka A, toxín diphteria, alebo k toxickému enzýmu. Alternatívne môžu byť označené rádioaktívnym nuklidom, v súlade so známymi metódami tohto odboru. Protilátka podľa tohto vynálezu však vykazuje vynikajúcu cytotoxicitu za neprítomnosti toxínu a za prítomnosti efektorových buniek, ako sú humánne monocyty.

Tuhé nádory, ktoré je možné detegovať a liečiť s použitím spôsobov podľa tohto vynálezu, zahŕňajú melanómy, gliómy a karcinómy. Rakovinové bunky, ktoré neexprimujú receptory EGFR vo veľkom rozsahu, je možné indukovať, aby tak robili, s použitím lymfokínových prípravkov. Lymfokinové prípravky môžu spôsobovať homogénnejšiu expresiu receptorov EGF v bunkách nádoru, čo vedie k účinnejšej liečbe.

Lynfokínové prípravky, ktoré sú vhodné v tejto súvislosti na podávanie, zahŕňajú interferón-gama, faktor nekrózy nádorov a ich kombinácie. Je možné ich podávať intravenózne. Vhodná dávka lymfokínu je 10 000 až 1 000 000 jednotiek na pacienta.

Na diagnostické účely je možné protilátku konjugovať k rádio-opakovému farbivu, alebo je možné ju označiť rádionuklidom. Prednostnou metódou označovania je jodogénová metóda (Fraker a ďalší (1978), Biochem. biophys. Res. Commun. 80, 849). Na diagnostické účely sa protilátka prednostne podáva vo forme fragmentov F(ab')₂. To zaisťuje dosiahnutie vynikajúcich výsledkov, takže nie je nutné odčítať pozadie. Fragmenty je možné pripravovať známymi postupmi (pozri napríklad Herlyn a ďalší (1983), Cancer. Res. 43, 2731). Obvykle sa uskutočňuje štiepenie pepsínom pri kyslom pH a fragnenty sa oddeľujú od nerozštiepeného IgG a fragmentov ťažkého reťazca chromatografiou na Protein A-Sepharose®*.

Pretvorené humánne protilátky 425 podľa tohto vynálezu spôsobujú u ľudí imunologickú odpoveď s nižšou pravdepodobnosťou ako myšie alebo chimérické protilátky 425. Afinita najlepšej verzie pretvorenej humánnej protilátky 425, ktorá tvorí najlepšie uskutočnenie tohto vynálezu, je rovnaká ako afinita myšej alebo chimérickej protilátky 425. Väzbové štúdie ukazujú, že schopnosť súťažiť s EGF o väzbu k EGFR za optimálnych podmienok je u chimérickej, pretvorenej i protilátky z myšovitých rovnaká. Okrem toho, pretvorené humánne protilátky 425 sú pri terapeutickom použití u ľudí účinnejšie ako myšia alebo chimérická protilátka 425. Vďaka veľkému zníženiu imunogenicity vykazuje pretvorená humánna protilátka 425 v ľudskom tele dlhší polčas životnosti a pravdepodobnosť, že u humánneho pacienta spôsobí nežiaducu odpoveď, je znížená na najnižšiu mieru.

Výsledky dosiahnuté s definovanou protilátkou MAb 425 ukazujú, že humanizované monoklonálne protilátky, obsahujúce umelú konvenčnú sekvenciu, nespôsobujú pozoruhodnú minimálnu odpoveď. Ďalšie výhody vynálezu sú opísané.

Na základe uvedeného opisu je možné konštatovať, že hodnota nových protilátok podľa vynálezu na terapeutické a diagnostické účely je mimoriadne vysoká.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Molekulové klonovanie a sekvenovanie

Z bunkovej línie W 425-15 (ACCT HB 9629), ktorá produkuje protilátku MAb 425, sa izoluje celé množstvo

RNA. Na produkciu celkovej RNA sa použije približne

SK 281143 Β6

9,6 x 10⁷ buniek, s použitím metódy s guanidíniom-CsCl (Chirgwin a ďalší) (1979), Biochemistry 18, 5294). Supernatanty z buniek, ktoré boli použité na izoláciu celého množstva RNA, sa skúšajú metódou ELISA, aby sa zistilo, že bunky produkujú vo vysokých množstvách správnu protilátku MAb. Pripraví sa poly(A⁺)RNA (pozri Aviv a Leder (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 1 408).

Dvojvláknová cDNA sa syntetizuje v podstate spôsobmi opísanými v publikácii Gubler a Hoffman (1983), Gene 25, 263, len s rozdielom, že sa na začatie syntézy prvého vlákna použijú prímery, ktoré sú homologické s 5'-oblasťami myších kapa a gama-2a' imunoglobulínových konštantných oblastí (pozri Levy a ďalší (1987), Gene 54, 167). Prímer ľahkého reťazca je 26-mér (oligonukleotid 1, tabuľka I), ktorý bol zostrojený na základe publikovaných údajov (Levy a ďalší (1987), Gene 54, 167; Kaariten a ďalší (1983), J. Immunol. 130,937). Prímer ťažkého reťazca je 25-mér (oligonukleotid 2, tabuľka I), ktorý bol zostrojený na základe publikovaných údajov (Kaariten a ďalší) (1983), J. Immunol. 130, 937; Kabat a ďalší (1987) Sequeces of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US Govemment Printing Offices). Prímery boli navrhnuté a syntetizované pomocou zariadenia Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer a prečistené na močovinovo-akrylamidových géloch. Po syntéze druhého vlákna sa tupo zakončené cDNA klonujú do Smal-štiepeného pUC18 (obchodne dostupný produkt) a transformujú do kompetentných buniek E. coli, napríklad DH5-alfa (obchodne dostupný produkt). Kolónie sa pomocou mriežky prenesú na agarové misky a uskutoční sa screening hybridizácií s použitím ³²P-označených prímerov na syntézu prvého vlákna (Carter a ďalší (1985), Oligonucleotide Sitedirected Mutagenesis in M 13, an Experimental Approach Manual, Anglian Biotechnology Ltd. Colchester). Sekvenovanie dvojvláknovej plazmidovej DNA sa uskutočňuje s použitím Sequenase (United States Biochemical Corporation).

Príklad 2

Konštrukcia chimerických génov

Pre každú variabilnú oblasť sa syntetizuje predný 5' a zadný 3' prímer na PCR reakciu (reťazová reakcia pomocou polymerázy) (oligonukleotidy 3 až 6, pozri tabuľku I). Reakcia PCR sa uskutočňuje s použitím 1 ng DNA z plazmidu pUC18, obsahujúcej klonovanú cDNA predného a zadného primeru PCR, z ktorých každý je prítomný v konečnej koncentrácii 1 μΜ, vždy 200 μΜ DNTP, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,1 g/1 želatíny. Na každé stanovenie sa pridá 2,5 jednotky polymerázy DNA Amplitaq (Perkin Elmer Cetus). Po počiatočnom 1,5-minútovom tavení pri 94 °C sa uskutoční 25 cyklov amplifikácie pri 94 °C počas 1 minúty, 45 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 3 minút. Záverečný predlžovací stupeň pri 72 °C sa uskutočňuje 10 minút. PCR reakčné zmesi sa dvakrát extrahujú zmesou fenolu a chloroformu, uskutoční sa zrážanie etanolom a potom štiepenie produktu HindlII a BamHI. Fragment PCR kódujúci oblasť V_L alebo V_H sa potom klonuje do expresívneho vektora. Tento vektor obsahuje enhacer a promótor z HCMV (humánny cytomelovírus), bakteriálny neogén a počiatok replikácie SV40. Vloží sa 2,0 Kb BamHI fragment genómovej DNA kódujúci humánnu gama-1 konštantnú oblasť (Takahashi a ďalší (1982), Celí 29, 671) v správnej orientácii zo smeru za V_H oblasťou fragmentu (pozri HCMV-CV_H425-gama-I na obr. 1). Tento vektor sa neskôr prispôsobí odstránením miesta BamHI pri

3-konci fragmentu konštantnej oblasti, čím sa umožní, aby boli variabilné oblasti priamo vložené do expresívneho vektora ťažkého reťazca, ako HindlII-BamHI fragmenty (Macda a ďalší (1991), Hum, Antibod. Hybridomas 2, 124). Fragment kódujúci oblasť V_L sa vloží do podobného HCMV expresívneho vektora, ktorý v tomto prípade obsahuje BamHI fragment genómovej DNA, približne s veľkosťou 2,6 Kb, ktorý kóduje humánnu kapa konštantnú oblasť a obsahuje akceptorové miesto pre zostrih a poly( A⁺) (Rabbitts a ďalší (1984), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113, 166) (pozri HCMV-CV_L-425-kapa na obr. 1).

Príklad 3

Molekulové modelovanie V_L a V_H MAb 425

Molekulový model variabilných oblastí protilátky 425 z Muridae bol vytvorený na základe vyriešenej štruktúry vysoko homologickej antilyzozýmovej protilátky HyHEL-5 (Sheriff a ďalší (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8075). Variabilné oblasti protilátok MAb 425 a HyHEL-5 vykazujú približne 95 % homológiu.

Model bol vytvorený na zariadení Silicon Graphics Iris 4D workstation running UNIX s použitím programovacieho balíka na modelovanie molekúl „QUANTA“ (Polygen Corp). Identické zvyšky v štruktúre boli zachované a neidentické zvyšky boli nahradené použitím maximálneho prekrývania maximum overlap“, Snow a Amzel (1986)), ktoré bolo zavedené do zariadenia na modelovanie proteínov „QUANTA“. Konformácie hlavného reťazca troch N-terminálnych zvyškov v ťažkom reťazci boli nahradené z homologickej protilátkovej štruktúry (HyHEL-10, Padlan a ďalší (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5938), pretože ich teplotné faktory boli abnormálne vysoké (vyššie ako stred plus tri smerodajné odchýlky, merané od teplotných faktorov hlavného reťazca/, a pretože ovplyvňovali zbaľovanie VHCDR-3 (H3) (Martin (1990), dizertačná práca-na doktorát filozofie na Oxfordskej univerzite). Sekvencie CDR-1 (Ll) a CDR-2 (L2) oblasti V_L a sekvencie CDR-1 (Hl) a CDR-2 (H2) oblasti VH z protilátky MAb 425 zodpovedajú kanonickým formám, ktoré postulovali Chothia a ďalší (1989), Náture 342,877). Hlavné uhly torzie reťazcov týchto slučiek boli udržiavané tak ako v HyHEL-5. Sekvencie CDR-3 (L3) oblasti V_L a sekvencie CDR-3 (H3) oblasti V_H z protilátky MAb 425 nezodpovedajú kanonickým štruktúram, a preto boli modelované odlišným spôsobom. Bol použitý počítačový program Martina a ďalších (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9268) na extrakciu slučiek z Brookhavenovej databanky (Bemstein a ďalší, (1977), J. Mol. Bio. 112, 525). Slučky sa potom vytriedili na základe podobnosti sekvencie, energie a zvyškov určujúcich štruktúru (Sutcliffe (1988), dizertačná práca na doktorát filozofie na Londýnskej univerzite). Kvalitné slučky boli kontrolované na grafike a najlepšie z nich boli vybraté na základe vizuálneho pozorovania. H3 bol modelovaný na hovädzej glutationperoxidáze (Epp a ďalší (1983), Eur. J. Biochem. 133, 51) v oblasti zvyškov 92 až 103. L3 bol modelovaný na IgG z Muridae (J539) Fab fragmentu (Suh a ďalší, (1986), Proteins 1, 74) v oblasti zvyškov 88 a 96 ľahkého reťazca.

Model bol podrobený minimalizácii energie najstrmejšími poklesmi a konjugátovými gradientami s použitím potenciálu CHARm (Brooks a ďalší (1983), J. Comp.

Chem. 4,187) zakomponovaným do QUANTA, aby sa odstránili nežiaduce kontakty atómov a aby sa optimalizovali van der Waalsove a elektrostatické interakcie.

SK 281143 Β6

Príklad 4

Konštrukcia génov humanizovancj protilátky

Konštrukcia prvej verzie ľahkého reťazca pretvorenej humánnej protilátky 425 bola uskutočňovaná s použitím CDR-očkovacieho postupu, ktorý sa podobá postupu opísanému v Reichmann a ďalší (1988), Náture 322, 21; Verhoeyen a ďalší (1988), Science 239, 18). Jednovláknová templátová DNA bola pripravená z vektora M13mpl8 (ktorý je obchodne dostupný), obsahujúceho fragment HindlIIBamHI kódujúci humánnu antilyzozýmovú oblasť V_L (EP 239 400, G. Winter). FRs tohto ľahkého reťazca sú odvodené z kryštalograíicky vyriešeného proteínu REI. Boli navrhnuté tri oligonukleotidy, ktoré pozostávali zo sekvencii DNA, kódujúcich každú CDR ľahkého reťazca myšej protilátky MAb 425, lemovaných na každom konci 12 bázami DNA komplementárnej k sekvenciám DNA kódujúcim susednú FRs humánneho REI (oligonukleotidy 7 až 9 v tabuľke I). Oligonukleotidy boli syntetizované a purifikované uvedeným spôsobom. Všetky tri oligonukleotidy boli fosforylované a súčasné použité v systéme pre mutagenézu in vitro zameranú na oligonukleotidy. Použitý systém je založený na metódach, ktoré vypracovali Eckstein a jeho spolupracovníci (Taylor a ďalší (1985), Nucleic Acid Res, 13, strana 8749 až 8764; Nakamaye a Eckstein (1986) Nucleic Res. 14, 9679; Sayers a ďalší (1988), Nucleic Acids Res. 16, 791). Až do exonukleázového III štiepiaceho stupňa sa postupovalo podľa inštrukcii výrobcu. Potom sa reakčná zmes extrahovala zmesou fenolu a chloroformu, produkt sa vyzrážal etanolom a resuspendoval v 100 μΐ TE. Objem 10 μΐ sa použil ako templátová DNA pri 100 μΐ PCR amplifikačnej reakcii s použitím univerzálneho primeru Ml3 a reverzného sekvenačného primeru až do konečnej koncentrácie každej z týchto látok 0,2 μΜ. Pufrovacie a termocyklové podmienky boli rovnaké ako v príklade 2 s tou výnimkou, že sa použila hybridizačná teplota 55 °C. Reakčná zmes bola dvakrát extrahovaná zmesou fenolu a chloroformu, produkt sa vyzrážal etanolom a potom štiepil HindlII a BamHI a subklonoval do pUC18. Predpokladané pozitívne klony sa identifikovali hybridizáciou k ³²P-označeným mutagénnym prímerom (Carter a ďalší (1987), pozri uvedenú citáciu). Klony boli potvrdené ako pozitívne sekvenovaním. Oblasť V_L obsahujúca všetky tri očkované CDR sa klonovala ako fragment HindlII-BamHI do expresívneho vektora V_L za vzniku plazmidu HCMV-RV_La425-kapa.

Verzia „b“ pretvorenej oblasti V_L sa skonštruovala s použitím metódy PCR mutagenézy (Kamman a ďalší (1989), Nucleic Acids Res. 17, 5404) s menšími modifikáciami. Templátovou DNA bola RVLa subklonovaná do pUC18. Prvá PCR reakcia sa uskutočňovala v celkovom objeme 50 μΐ a reakčná zmes obsahovala jeden pg templátu, M13 reverzný sekvenačný prímer a prímer 10 (tabuľka I) s konečnou koncentráciou 1 μΜ, 200 μΜ každej dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,1 g/1 želatíny. Ku každému stanoveniu sa pridala jedna jednotka DNA polymerázy Amplitaq. Reakcia sa uskutočňovala s tromi replikáciami. Po 1,5-minútovom tavení pri 94 °C nasledovalo 40 reakčných cyklov; 1 minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 37 °C a 2 minúty pri 72 °C. Nakoniec sa uskutočnilo predlžovanie v priebehu 10 minút pri 72 °C. Reakčné produkty boli spojené a extrahované zmesou fenolu a chloroformu. Pred izoláciou PCR produktu z TAE agar-agarového gélu sa produkt vyzrážal etanolom. Jedna desatina prvého PCR reakčného produktu sa potom použila ako jeden z prímerov pri druhej PCR reakcii. Druhá reakcia bola rovnaká ako prvá s výnimkou použitia prvého reakč ného produktu a 20 pmol univerzálneho primeru M13. Cyklovanie sa uskutočnilo spôsobom opísaným v publikácii (Kamman a ďalší (1989) Nucleic Acids Res. 17, 5404), Fragment HindlII-BamHI sa klonoval do p-UC18 a sekvenoval. Fragment DNA nesúci požadovanú zmenu sa subklonoval do V_L expresívneho plazmidu za vzniku plazmidu HCMV-RV_Lb425-kapa.

Prvá verzia pretvorenej humánnej oblasti V_H protilátky 425 bola syntetizovaná chemicky. Zostrojila sa DNA sekvencia kódujúca požadovanú sekvenciu aminkyselín a obsahujúca potrebné lemovacie sekvencie DNA (pozri vyššie). Použitie kodónu bolo optimalizované pre cicavčie bunky zabudovaním užitočných miest pre reštrikčné enzýmy do sekvencii DNA kódujúcich FRs. Syntetizoval sa úsek s veľkosťou 454 bp a subklonoval do pUC18 ako EcoRI-HindlII fragment. Potom sa HindlII-BamHI fragment kódujúci ťažký reťazce pretvorenej humanizovanej protilátky 425, preniesol do V_H expresívneho vektora za vzniku plazmidu HCMV-RV_Ha-425-gama-l.

Rôznymi spôsobmi sa skonštruovali ďalšie verzie (celkom 8) pretvorených humanizovaných ťažkých reťazcov. Fragment HindlII-BamHI, kódujúci verziu „a“ ťažkého reťazca, sa preniesol do M13mpl8 a pripravila sa jednovláknová DNA. S použitím oligonukleotidov 11 až 13 (pozri tabuľku I) bola opísanou PCR-prispôsobenou M13 mutagenézou opísanou, pripravená DNA kódujúca verzie „d“, „e“, „f“ a „g“ oblastí VH pretvorenej humánnej protilátky 425 v pUC18. Tieto verzie boli subklonované do expresívneho vektora ťažkého reťazca ako fragmenty HindlII-BamHI za vzniku plazmidov HCMV-RV_Hd425-gama-l, HCMV-RV_He425-gama-l, HCMV-RV_Hf425-gama-l a HCMV-RV_Hg425gama-l.

Verzie „b“ a „c“ oblastí V_H pretvorenej humánnej protilátky 425 boli vytvorené s použitím PCR mutagenézy, ktorú opísali Kamman a ďalší (1989), pozri uvedenú citáciu. Ako templátová DNA sa použila verzia „a“ oblasti V_H humánnej protilátky 425, subklonovaná do pUC18 a ako mutagénny prímer sa použil pri prvej PCR reakcii buď prímer 13 alebo 14 (pozri tabuľku I). Po mutagenéze a sekvenovaní boli sekvencie nesúce požadované zmeny subklonované do expresívneho plazmidu ťažkého reťazca za vzniku plazmidov HCMV-RV_Hb425-gama-l a HCMV-RV_Hc425-gama-1.

Pretvorené verzie „h“ a „i“ ťažkého reťazca boli skonštruované z klonov existujúcich verzií na báze pUC. 0,2 Kb fragment HindlII-Xhol z verzie „e“ sa ligoval k 2,8 Kb fragmentu Xhol-HindlII buď z verzie „b“ alebo „c“ za vzniku nových verzií „h“ a „i“. Fragmenty HindlII-BamHI, kódujúce tieto verzie, boli subklonované do expresívneho faktora ťažkého reťazca za vzniku HCMV-RV_Hh425-gama-1 aHCMV-RV_Hi425gama-l.

Príklad 5

Transfckcia DNA do buniek COS

Bunky COS boli elektroporované vždy 10 pg expresívneho vektora nesúceho gén kódujúci ťažký reťazec a aj gén kódujúci ľahký reťazec. Skrátka, 10 pg každého plazmidu sa pridalo k 0,8 ml alikvótneho dielu suspenzie buniek COS v PBS s koncentráciou 1 x 10⁷ buniek na ml. Použilo sa riadenie BioRad^(R) Gene Pulser na dodanie pulzu 1900 V s kapacitou 25 pF. Bunky sa nechali zotaviť počas 10 minút pri teplote miestnosti a potom sa naniesli na misky do 8 ml DMEM s obsahom 10 % fetálneho teľacieho séra. Po 72 hodinách inkubácie sa média zhromaždili, zbavili úlomkov buniek odstredením a pred uskutočnením analýzy metódou

ELISA sa uložili za sterilných podmienok na krátky čas pri 4 °C alebo dlhší čas pri -20 °C.

Príklad 6

Transfekcia DNA do buniek CHO bola uskutočňovaná spôsobom opísaným v príklade 5.

Príklad 7

Kvantifikácia produkcie IgG a detekcia väzby antigénu

Humánny IgG, prítomný v supematantoch z buniek COS, bol detegovaný metódou ELISA. Pri stanovení humánneho IgG testom ELISA boli platne s 96 jamkami potiahnuté kozím antihumánnym IgG (celé molekuly) a humánny IgG vo vzorkách, ktorý sa naviazal na platne, bol detegovaný s použitím kozieho antihumánneho IgG konjugovaného alkalickou fosfatázou, (špecifického voči gamereťazcom). Ako štandard bol použitý zakúpený predčistený humánny IgG. Väzba antigénu, rozpoznaná protilátkou MAb 425, bola stanovená druhým testom ELISA. Platne sa potiahli EGFR proteínovým prípravkom, (ktorý sa dá získať napríklad spôsobom opísaným v publikácii Rodeck a ďalší (1987) Cancer Res. 47, 3692) a protilátky viažuce sa k EGFR boli detegované s použitím antihumánero IgG (špecifického voči gama-reťazcom) peroxidázového konjugátu (v prípade chimérických a pretvorených humánnych protilátok) alebo s použitím antimyšej IgG (celá molekula) peroxidázového konjugátu (v prípade myšej protilátky MAb 425). Obidva konjugáty boli dodané firmou Sigma. Purifikovaná protilátka 425 z Muridae bola použitá ako štandard.

Príklad 8

Konkurenčná väzbová skúška

Protilátka MAb 425 z Muridae bola biotinylovaná použitím príslušnej súpravy, ktorá je dostupná na trhu. Platne pre test ELISA boli potiahnuté EGFR proteínom v optimálnom zriedení. Zriedené supematanty buniek COS s objemom 50 μΐ boli zmiešané s 50 μΐ biotinylovanej protilátky MAb 425 z Muridae (s koncentráciou podľa testu ELISA 1,75 pg/ml). Každý supematant z buniek COS bol skúšaný dvakrát. Platne sa inkubovali cez noc pri teplote miestnosti. Viazaná biotinylovaná protilátka MAb 425 z Muridae sa detegovala prídavkom komplexu streptavidín-peroxidáza z reďkvi; tento komplex je dostupný na trhu. Kontrolný pokus, pri ktorom nie je prítomná žiadna konkurenčná látka, viedol k hodnote percenta inhibície alebo blokovania, ktorú je možné vypočítať pre každý supematant buniek COS podľa nasledujúceho vzorca:

100 - [(OD450 vzorky/OD₄₅₀ kontrolnej vzorky) x 100]

Príklad 9

Rôzne skúšky protilátky z Muridae, pretvorenej a chimérickej protilátky MAb 425 boli analyzované metódou SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidc-Gelspaceelectrophorcsis) metódou, ktorú opísali Laemmli a ďalší. Do každej jamky sa nanieslo 2,5 pg každej vzorky za neredukujúcich aj za redukujúcich podmienok. Proteín bol vizualizovaný farbením Coomassie. Obr. 9 (A) ukazuje, že vzorky mali podobnú čistotu. Rozmedzie molekulovej hmotnosti protilátok bolo 180 000 až 200 000.

Príklad 10

Pretvorená protilátka MAb 425 sapurifikovala gélovou priestorovou filtráciou na Superose 12^ (Pharmacia Corp., Švédsko) s použitím štandardných metód. Protilátka sa eluovala pomocou PBS (pH 7,4, 0,8 M NaCl) (0,1 M). Je možné získať jediný pík (pri 5 minútach) (obr. 9 (B)).

Príkladll

Biotínom označená protilátka MAb 425 sa použila ako konkurent neoznačenej protilátky MAb 425 alebo jej derivátov pri väzbe k EGFR. Označenie biotínom sa uskutočnilo štandardnými metódami. EGFR sa previedol do roztoku z membrán A431 štandardnými metódami. Bunky A431 boli zakúpené na trhu. Detekcia sa uskutočňovala po inkubácii s POD-konjugovaným streptavidínom a substrátom. Z týchto údajov sa zostrojili inhibičné krivky (obr. 10). Krivky ukazujú, že väzba rôznych protilátok je porovnateľná.

Príklad 12

Rôzne skúšky purifikovanej chimérickej, pretvorenej MAb 425 a MAb 425 z Muridae sa skúšali na svoju schopnosť súťažiť s EGF o väzbu k EGFR. Skúška sa uskutočňovala s použitím EGF označeného ¹²⁵I (Amersham Corp., Veľká Británia) a rôznych protilátok pozitívnej membrány (A431). Skúšobný systém je založený na technológii SP A. Konkurenčné krivky pretvorených protilátok a protilátky z Muridae (3 próby) sú takmer identické (obr. 11).

Claims (1)

1. L Chimérická monoklonálna protilátka obsahujúca miesta viažuce antigén, CDR, nehumánneho pôvodu, úseky základnej štruktúry, FR, nehumánneho pôvodu a konštánt·· né oblasti humánneho imunoglobulínu, ktorá má tieto znaky:

   i) viaže sa k humánnym receptorom EGF a inhibuje väzbu EGF k receptoru EGF, ii) konštantné oblasti jej ťažkého reťazca zahŕňajú sekvenciu aminokyselín humánneho reťazca gama-1 a konštantné oblasti ľahkého reťazca zahŕňajú sekvenciu aminokyselín humánneho reťazca kapa, iii) jej oblasti CDR reprezentujúce miesta viažuce antigén, zahŕňajú nasledovné sekvencie aminokyselín:

   ľahký reťazec