FI120499B - Menetelmiä, jotka liittyvät Grb3-3-geeniin tai sen variantteihin - Google Patents

Description

Menetelmiä, jotka liittyvät Grb3-3-geeniin tai sen variantteihin

Esillä oleva keksintö liittyy uuteen geeniin, 5 jonka nimeksi on annettu Grb3-3, sen variantteihin ja niiden käyttöihin etenkin syöpävastaisessa geeniterapiassa .

Erilaiset geenit, joita kutsutaan onkogeeneiksi ja suppressorigeeneiksi, liittyvät solujakautumisen sääte-10 lyyn. Näistä ras-geenit ja niiden yleensä p21-proteiineik-si kutsutut tuotteet ovat keskeisessä osassa solulisäänty-misen säätelyssä kaikissa eukaryoottisissa organismeissa, joissa niitä on tutkittu. Etenkin on osoitettu, että näiden proteiinien tietyt spesifiset modifikaatiot saavat ne 15 menettämään niiden normaalin säätelyn ja johtavat niiden muuttumiseen onkogeenisiksi. Täten suuri lukumäärä ihmis-kasvaimia on yhdistetty modifioitujen ras-geenien läsnäoloon. Samoin näiden p21-proteiinien hyvin runsas ilmentyminen voi johtaa solulisääntymisen häiriintymiseen. Näiden 20 p21-proteiinien täsmällisen roolin soluissa, niiden toimintatavan ja niiden ominaisuuksien ymmärtäminen muodostaa siten tärkeän tehtävän syövän synnyn ymmärtämiseksi ja sen lähestymiseksi terapeuttisesti.

On identifioitu tiettyjä tekijöitä, jotka liitty-25 vät ras-riippuvaiseen signallisaatioreittiin. Näitä ovat geeni Grb2, joka koodittaa 23 - 25 kDa:n proteiinia, jonka rakenne on SH3-SH2-SH3 [Lowenstein et ai. , Cell 70 (1992) 431; Matuoka et ai., PNAS 89 (1992) 9015). Grb2-geenituote vaikuttaa olevan vuorovaikutuksessa fosforyloitujen tyro-30 siiniproteiinien kanssa alueensa SH2 välityksellä ja luokan SOS GDP-vaihtotekijän kanssa alueensa SH3 välityksellä [Egan et ai. , Nature 363 (1993) 45] . Se olisi täten yksi ras-geenituotteen transformoivan aktiivisuuden rakenneosista. Esillä oleva keksintö seuraa Grb2-geeni-isoformin, 35 joka nimettiin Grb3~3:ksi ja jolla on deleetio SH2-alueel- 2 la, osoittamisesta, kloonauksesta ja karakterisoinnista. Tämä geeni ilmentyy täysikasvuisten kudoksissa: vastaava mRNA esiintyy yksittäisenä 1,5 ke:n nauhana, ja siitä saadaan translaatiossa 19 kDa:n proteiini. Johtuen sen delee-5 tiosta SH2-alueella Grb3-3-geenituote ei enää kykene olemaan vuorovaikutuksessa fosforyloitujen tyrosiiniproteii-nien (fosforyloitu EGF-reseptori) kanssa, mutta sillä on tallella kyky olla vuorovaikutuksessa SOS-proteiinien runsaasti proliinia sisältävien alueiden kanssa. Deleetion-10 sa johdosta Grb3-3-geenituote kykenee täten vastustamaan Grb2-geenituotteen soluvaikutuksia. Tämän geenin, tai sen varianttien mukaan lukien antisens-sekvenssit, siirtäminen in vivo tekee siten mahdolliseksi solujen lisääntymis-, differentiaatio- ja/tai kuolinprosessiin puuttumisen.

15 Keksinnön ensimmäinen kohde liittyy siten nukleo- tidisekvenssiin, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain Grb3-3-geenin (sekvenssi tunnusnro 1).

Keksinnön toinen kohde liittyy nukleotidisekvens-siin, joka on saatu sekvenssistä tunnusnro 1 ja joka kyke-20 nee inhiboimaan vähintään osittain proteiinin Grb2 tai Grb3-3 ilmentymisen. Erityisesti keksintö liittyy anti-sens-sekvensseihin, jotka kohdesolussa ilmentämällä voivat kontrolloida solun mRNA-sekvenssien transkriptiota. Näiden sekvenssien transkriptiossa kohdesolussa voi esimerkiksi 25 syntyä RNA-sekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia Grb2-tai Grb3-3-solu-mRNA-sekvensseihin nähden, jolloin ne sal-paavat näiden translaation proteiiniksi, tekniikan mukaan, jota kuvataan EP-patenttijukaisussa 140 308. Tällaisia sekvenssejä voidaan muodostaa nukleiinisekvenssistä sek-30 venssi tunnusnro 1 kokonaisuudessaan tai osittain, jonka transkriptio suoritetaan käänteisessä suunnassa.

Kuten edellä mainittiin, Grb2 on vähintään bifunk-tionaalinen proteiini, joka ankkuroituu SH2-alueensa välityksellä erityisiin tyrosiinissa fosforyloituihin sek-35 vensseihin, ja SH3-alueidensa välityksellä ryhmän SOS

3 vaihtotekijoihin. Grb3-3, joka on menettänyt kykynsä liittyä tyrosiinissa fosforyloituihin proteiineihin, voi siten yksinomaan muodostaa kompleksin SOS-proteiinien kanssa. Grb3-3 voi siten vastustaa kompleksin Grb2-S0S 5 kerääntymistä autofosforyloituihin kasvutekijäreseptorei-hin tai liittymistä samoin tyrosiinissa fosforyloituihin liittyviin proteiineihin kuten SHC tai XRS1. Koska Grb3-3 kykenee salpaamaan tämän kerääntymisen tai liittymisen, se kykenee salpaamaan mitoosireittejä ja aiheuttamaan solun 10 kuoleman. Hakija on itse asiassa osoittanut, että Grb3-3-proteiini ilmentyi tiettyjen fysiologisten prosessien aikana, kuten esimerkiksi kateenkorvan kypsyminen rotalla. Hakija on samoin osoittanut, että Grb3-3 kykenee indusoimaan solukuoleman eri tyyppisten solujen apoptoosin vä-15 lityksellä. Nämä hyvin edulliset ominaisuudet on voitu osoittaa (i) ruiskuttamalla yhdistelmä-DNA-proteiinia fib-roblasteihin 3T3 ja (li) siirtämällä Grb3-3:ea koodittava sekvenssi 3T3-soluihin {esimerkki 4). Grb3-3 kykenee siten indusoimaan elinkelpoisten solujen, kuten immortalisoitu-20 jen solujen, syöpä- tai alkiosolujen, solukuoleman. Kuten esimerkeissä osoitetaan, Grb2 kykenee vastustamaan Grb3-3:n vaikutuksia.

Sitä paitsi tutkimus Grb3-3:n ilmentymisestä, joka suoritettiin imusolujen tartuttamisen HI-viruksella puit-25 teissä, teki mahdolliseksi osoittaa, että 7 päivää tartu-tuksesta havaittu runsas virustuotanto korreloi tartutettujen solujen hyvin runsaaseen Grb3-3-mRNA-ilmentymiseen (esimerkki 5) . Tämä koe osoittaa, että eliminoimalla tai vastustamalla Grb3-3:n soluvaikutuksia voi samoin olla 30 mahdollista ylläpitää hengissä tartutettuja, etenkin HIV-tartutettuja, soluja ja siten tehdä mahdolliseksi T4-lym-fosyyttien immuunipuolustusroolin täyttämisen jatkamisen. Tässä suhteessa keksintö koskee myös yhdisteiden käyttöä, jotka kykenevät eliminoimaan tai vastustamaan vähintään 35 osittain Grb3-3:n soluvaikutuksia, farmaseuttisen koostu- 4 muksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu aidsin hoitoon. Tarkemmin ottaen käytettyjä yhdisteitä voivat olla: edellä määritellyn mukaiset antisens-geenisekvens- sit; 5 spesifiset Grb3-3-oligonukleotidit, joita on modi fioitu tai ei ole modifioitu parempaa stabiilisuutta tai biosaatavuutta silmällä pitäen (fosforotioaatit, interka-loivat aineet jne.}. Kyseessä voivat edullisesti olla oli-gonukleotidit, jotka kattavat koodaussekvenssin, joka 10 sijaitsee N-pää-SH3-alueen ja SH2-jäämäalueen välissä; mitä tahansa sekvenssi, jonka siirtäminen tartunnan saaneisiin soluihin indusoi Grb2:n hyvin runsaan ilmentymisen .

Keksinnön mukaisia nukleiinihapposekvenssejä voi-15 daan käyttää sellaisenaan, esimerkiksi ruiskutuksen ihmiseen tai eläimeen jälkeen, suojan syöpiä vastaan indusoi-miseksi tai niiden hoitamiseksi. Erityisesti niitä voidaan ruiskuttaa paljaana DNA:na tekniikan mukaan, jota kuvataan WO-patenttihakemusjulkaisussa 90/11 092. Niitä voidaan 20 myös antaa kompleksoituina esimerkiksi DEAE-dekstraaniin Pagano et ai., J. Virol. 1 (1967) 891], tumaproteiineihin [Kaneda et ai., Science 243 (1989) 375], lipideihin [Feigner et ai., PNAS 84 (1987) 7413], liposomien muodossa [Fraley et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] jne.

25 Edullisesti keksinnön mukaiset nukleiinihapposek- venssit ovat osa vektoria. Tällaista vektoria käyttämällä voidaan itse asiassa parantaa nukleiinihapon antoa hoidettaviin soluihin, ja samoin lisätä sen stabiilisuutta mainituisssa soluissa, mikä mahdollistaa pitkäkestoisen 30 terapeuttisen vaikutuksen saamisen. Lisäksi on mahdollista viedä useampia nukleiinihapposekvenssejä samaan vektoriin, mikä samoin nostaa hoidon tehoa.

Käytetyn vektorin alkuperä voi vaihdella, sikäli kuin se kykenee transformoimaan eläinsoluja, edullisesti 35 ihmisen kasvainsoluja. Keksinnön edullisessa suoritusmuo- 5 dossa käytetään virusvektoria, joka voidaan valita adeno-viruksista, retroviruksista, adenoliitteisistä viruksista (AAV), herpes-viruksesta, sytomegaloviruksesta (CMV), lehmänrokkoviruksesta jne. Adenoviruksista, retroviruk-5 sista tai AAV:eistä saatuja vektoreita, jotka sisältävät heterologisia nukleiinihapposekvenssejä, on kuvattu kirjallisuudessa [Akli et ai., Nature Genetics 3 (1993} 224; Stratford-Perricaudet et ai., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573; Levrero et ai. , Gene 101 (1991) 195; Le 10 Gal la Salle et ai. , Science 259 (1993) 988; Roemer ja Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et ai. , Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et ai., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et ai. , New Biol. 4_ (1992) 238; WO 91/18 088].

15 Esillä oleva keksintö liittyy siten samoin mihin tahansa yhdistelmä-DNA-virukseen, joka käsittää genomiinsa insertoituna edellä määritellyn mukaisen nukleiinihappo-sekvenssin.

Edullisesti keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA-vi-20 rus on puutteellinen virus. Ilmaisulla "puutteellinen virus" tarkoitetaan virusta, joka ei kykene replikoitumaan kohdesolussa. Yleensä esillä olevan keksinnön puitteissa käytettyjen puutteellisten virusten genomi on siten vailla ainakin mainitun viruksen replikaatiolle tartutetussa so-25 lussa tarpeellisia sekvenssejä. Nämä alueet on joko voitu eliminoida (kokonaisuudessaan tai osittain), tai niistä on voitu tehdä epäfunktionaalisia, tai ne on voitu korvata muilla sekvensseillä ja etenkin keksinnön mukaisella nukleiinihapolla. Edullisesti puutteellisella viruksella on 30 kuitenkin tallella genominsa ne sekvenssit, jotka ovat välttämättömät viruspartikkelien kapsidaatiolle.

Keksinnön mukaisia nukleiinihapposekvenssejä käytetään erityisen edullisesti puutteelliseen yhdistelmä-DNA-adenovirukseen, -AAVthen tai -retrovirukseen sisälly-35 tetyssä muodossa.

6

Mitä tulee adenoviruksiin, niitä esiintyy erilaisina serotyyppeinä, jotka rakenteeltaan ja ominaisuuksiltaan ovat jonkin verran erilaisia, mutta jotka eivät ole ihmiselle patogeenisiä, ja etenkään kohteille, joiden im-5 muunijärjestelmä on heikentynyt. Lisäksi nämä virukset eivät integroidu tartuttamiensa solujen genomiin, ja ne voivat sisältää merkittäviä eksogeenisiä DNA-fragmentteja. Eri serotyypeistä esillä olevan keksinnön puitteissa käytetään edullisesti adenoviruksia tyyppi 2 tai 5 (Ad2 tai 10 Ad5). Adenoviruksen Ad5 kohdalla replikaatiolle välttämättömät sekvenssit ovat alueet E1A ja E1B.

Keksinnön mukaiset puutteelliset yhdistelmä-DNA--virukset voidaan valmistaa homologisella DNA-yhdistymi-sellä puutteellisen viruksen ja plasmidin välillä, joka 15 viime mainittu käsittää muun muassa edellä määritellyn mukaisen nukleotidisekvenssin [Levrero et ai., Gene 101 (1991} 195; Graham, EMBO J. 3:12 (1984) 2917]. Homologinen DNA-yhdistyminen tapahtuu mainitun viruksen ja plasmidin ko-transfektion sopivaan solulinjaan jälkeen. Käytetyn 20 solulinjan tulee edullisesti (i) olla transformoitavissa mainituilla elementeillä, (ii) käsittää sekvenssit, jotka kykenevät täydentämään viruksen puutteellisen genomiosan, edullisesti integroidussa muodossa DNA-yhdistymisen vaarojen välttämiseksi. Esimerkkinä solulinjasta, joka on 25 käyttökelpoinen puutteellisten yhdistelmä-DNA-adenovirus-ten valmistamiseksi, voidaan mainita ihmisen alkion mu-nuaissolulinja 293 [Graham et ai. , J. Gen. Virol. 36 (1977) 59], joka sisältää etenkin genomiinsa integroituna adenoviruksen Ad5 genomin vasemmanpuoleisen osan (12 %) . 30 Esimerkkkinä solulinjasta, joka on käyttökelpoinen puutteellisten yhdistelmä-DNA-retrovirusten valmistamiseksi, voidaan mainita solulinja CHIP [Danos ja Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460].

7

Sitten monistuneet virukset otetaan talteen ja niitä puhdistetaan molekyylibiologian tavanomaisin tekniikoin .

Esillä oleva keksintö liittyy myös farmaseuttiseen 5 koostumukseen, joka käsittää vähintään yhden edellä määritellyn mukaisen yhdistelmä-DNA-viruksen tai nukleotidi- sekvenssin .

Keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset voidaan koostaa silmällä pitäen antoa paikallista, oraa-10 lista, ruoansulatuskanavan ulkopuolista, nenänsisäistä, laskimonsisäistä, lihaksensisäistä, ihonalaista, silmän-sisäistä jne. tietä.

Edullisesti farmaseuttiset koostumukset sisältävät nestemäisiä kantajia, jotka ovat farmaseuttisesti hyväk-15 syttäviä ruiskeena annettavaan koostumukseen mahdollisesti suoraan hoidettavaan kasvaimeen. Erityisesti voivat tulla kyseeseen suolaliuokset (mononatrium-, dinatriumfosfaatti, natrium-, kalium-, kalsium- tai magnesiumkloridi jne. tai tällaisten suolojen seokset), jotka ovat steriilejä ja 20 isotoonisia, tai kuivat, etenkin kylmäkuivatut, koostumukset, jotka tapauksesta riipuen steriloitua vettä tai fysiologista seerumia lisäten voidaan rekonstituoida ruiskeena annettaviksi liuoksiksi.

Annossa käytetyt nukleiinihappoannokset (sekvenssi 25 tai vektori) voidaan sovittaa eri parametrien funktiona, ja etenkin käytetyn antotien, kyseessä olevan patologian, ilmennettävän nukleiinihapon tai edelleen hoidon halutun keston funktiona. Yleensä ottaen mitä tulee keksinnön mukaisiin yhdistelmä-DNA-viruksiin, nämä koostetaan ja anne-30 taan annoksina, jotka ovat 104 - 1014 pmy/ml, ja edullisesti 106 - 1010 pmy/ml. Ilmaisu pmy ("plakin muodostava yksikkö") vastaa virusliuoksen tartutuskykyä, ja se määritetään tartuttamalla sopiva soluviljelmä ja mittaamalla yleensä 48 tunnin kuluttua tartutettujen solujen plakkien 8 lukumäärä. Tekniikat virusliuoksen pmy-tiitterin määrittämiseksi on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu.

Tällaisia farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää ihmisellä syöpien hoitamiseksi ja/tai estämiseksi.

5 Erityisesti koska keksinnön mukaiset tuotteet kykenevät moduloimaan ras-proteiinien aktiivisuutta, niillä on mahdollista puuttua syöpien kehittymisprosessiin, ja etenkin niillä voidaan inhiboida onkogeenien aktiivisuus, joiden transformoiva aktiivisuus kulkee funktionaalisen p21-GAP-10 vuorovaikutuksen kautta. Lukuisia syöpiä on itse asiassa yhdistetty onkogeenisten ras-proteiinien läsnäoloon. Syövistä, joihin useimmiten liittyy mutagenisoituneita ras-geenejä, voidaan mainita etenkin haiman adenosyövät, joista 90 %:lla on mutagenisoitunut Ki-ras-onkogeeni 12. kodo-15 nissa [Almoguera et ai., Cell 53 (1988) 549], paksusuolen adenosyövät ja kilpirauhassyövät (50 %}, tai keuhkosyövät ja myeloiset leukemiat [30 %, Bos, J.L., Cancer Res. 49 (1989) 4682]. Yleisemmin keksinnön mukaisia koostumuksia voidaan käyttää minkä tahansa patologiatyypin hoitamisek-20 si, jossa havaitaan epänormaalia solujen lisääntymistä apoptoosin indusoinnin välityksellä, sekä minkä tahansa patologian hoitamiseksi, jolle on karakteristista solukuo-lema apoptoosin välityksellä (aids, Huntingtonin tanssi-tauti, Parkinsonin tauti), yhdisteiden avulla, jotka sal-25 paavat Grb3-3:n vaikutukset (etenkin antisens).

Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havainnollistaviksi eikä rajoittaviksi.

Kuvioselitykset 30 Kuvio 1: Grb2:n ja Grb3-3:n rakennealueiden kaa viollinen esitys.

Kuvio 2: Tutkimus Grb3-3:n sitoutumisesta EGF-re- septoriin (kuvio 2a) ja proliinia runsaasti sisältäviin peptideihin (kuvio 2b).

9

Kuvio 3: Grb3-3:n vaikutus polyoomaviruksen tehos-timesta saadun RRE:n transaktivaatioon rasiilla.

Kuvio 4: Grb3-3:n indusoiman solukuoleman osoittaminen 3T3-fibroblasteissa.

5 Kuvio 5: Grb3-3:n ilmentymisen osoittaminen HIV-viruksen tartuttamissa soluissa.

Yleiset molekyylibiologiset tekniikat

Molekyylibiologiassa tavanomaisesti käytetyt tekniikat kuten plasmidi-DNA:n preparatiiviset uutot, plasmi-10 di-DNA:n sentrifugointi cesiumkloridigradienttia käyttäen, elektroforeesi agaroosi- tai akryyliamidigeeleissä, DNA-fragmenttien puhdistaminen elektroeluutiolla, proteiinien uuttaminen fenolilla tai fenoli-kloroformilla, DNA: n seostaminen suolaympäristössä etanolilla tai isopropano-15 lilla, transformointi Escherichia coliin jne. ovat alan ammattilaiselle tuttuja ja niitä kuvataan runsaasti kirjallisuudessa [Maniatis, T., et ai., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel, F.M., et al. (toim.): 20 "Current Protocols in Molecular Biology"; John Wiley & Sons, New York, 1987] .

Tyypin pBR322, pUC plasmidit ja sarjan M13 fagit ovat kaupallista alkuperää (Bethesda Research Laboratories) .

25 Ligatointeja varten DNA-fragmentit voidaan erottaa niiden koon perusteella elektroforeesilla agaroosi- tai akryyliamidigeeleissä, uuttaa fenolilla tai fenoli/kloro-formiseoksella, saostaa etanolilla ja inkuboida sitten fa-gin T4 DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa toimittajan 30 suosituksia noudattaen.

Esiin työntyvät 5'-päät voidaan täyttää EL_ colin DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmentilla (Biolabs) toimittajan spesifikaatioita noudattaen. Esiin työntyvät 3'-päät tuhotaan fagin T4 DNA-polymeraasin (Biolabs) läsnä olles-35 sa, jota käytetään toimittajan suosituksia noudattaen.

10

Esiin työntyvät 5'-päät tuhotaan käsittelemällä varovaisesti Sl-nukleaasilla.

Kohdennettu mutagenisointi in vitro synteettisillä oligonukleotideillä voidaan suorittaa menetelmän mukaan, 5 jonka ovat kehittäneet Taylor et ai. [Nucl. Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764] käyttäen Amershamin markkinoimaa pak kausta .

DNA-fragmenttien entsymaattinen monistaminen PCR:ksi [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki, R.K., 10 et ai. , Science 230 (1985) 1350 - 1354; Mullis, K.B., ja Faloona, F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350] kutsu tulla tekniikalla voidaan suorittaa käyttäen "DNA Thermal Cycler" -laitetta (Perkin Elmer Cetus) valmistajan spesifikaatioiden mukaan.

15 Nukleotidisekvenssien todentaminen voidaan suorit taa menetelmällä, jonka ovat kehittäneet Sanger et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467], käyt täen Amershamin markkinoimaa pakkausta.

Esimerkkejä 20 1. Geenin Grb3-3 eristäminen

Geeni Grb3-3 eristettiin seulomalla ihmis-DNA-pankki koettimen avulla, joka oli saatu Grb2-geenisek-venssistä.

500 000 yhdistelmä-DNA-fagia Lambda gtll, jotka 25 käsittivät ihmisen istukkapankista (Clontech) peräisin olevia DNA-fragmentteja, seulottiin koettimen avulla, joka oli saatu Grb2-geenisekvenssistä. Käytetty koetin vastaa Grb2-proteiinin kahdeksaa ensimmäistä aminohappoa ja sen sekvenssi on seuraava: 30

ATGGAAGCCATCGCCAAATATGAC

Sekvenssi tunnusnro 2 11 Näin identifioitiin kymmenen positiivista kloonia. Näiden kymmenen kloonin insertti eristettiin EcoRI-frag-menttien muodossa, se kloonattiin plasmidiin M13mpl8 ja sekventoitiin. Näistä kymmenestä kloonista yhdeksän käsit-5 ti Grb2-sekvenssiin nähden identtisiä inserttejä. Vain yksi ainoa niistä käsitti geeniin Grb2 nähden pienikokoisemman insertin, mikä johtui deleetiosta SH2-alueella (kuvio 1) . Jäljellä olevan sekvenssin analyysissä paljastui täydellinen identtisyys vastaaviin Grb2-alueisiin nähden, mu-10 kaan lukien ei-koodittavat 5'- ja 3'-alueet. Tämän kloonin avoin lukualue koodittaa 177 aminohapon proteiinia (sekvenssi tunnusnro 1) , joka käsittää 2 SH3-aluetta, jotka rajoittuvat epätäydelliseen SH2-alueeseen (kuvio 1) . Alueelta SH2 deletoidut aminohapot (Grb2-proteiinin täh-15 teet 60 - 100) vastaavat tähteitä, jotka osallistuvat

Grb2:n sitoutumiseen peptideihin, jotka sisältävät fosfo-ryloituja tyrosiineja.

2. Grb3-3-proteiinin sitoutumisaktiivisuus

Kuten edellä mainittiin, Grb2-proteiini on fosfo-20 ryloitujen kasvutekijäreseptoreiden ja SOS-tekijoiden välisen vuorovaikutuksen välittäjä. Tämä esimerkki osoittaa, että Grb3-3-proteiini ei kykene olemaan vuorovaikutuksessa fosforyloidun EGF-reseptorin kanssa, mutta että sillä on tallella kyky olla vuorovaikutuksessa ihmisen 25 SOSl-tekijäsekvenssistä saadun runsaasti proliinia sisältävän peptidin kanssa.

Grb3-3:n sitoutumiskapasiteettia tutkittiin käyttäen biotinyloituja fuusioproteiineja Glutathion-S-Trans-ferasen (GST) kanssa. Tämän tyyppinen fuusio mahdollistaa 30 yhdistelmä-DNA-tuotteiden nopean ja tehokkaan puhdistuksen. Tätä varten keksinnön mukaiset sekvenssit ilmennettiin coli -kannassa TG1 fuusioproteiineina GST:n kanssa tekniikan mukaan, jota kuvaavat Smith ja Johnson [Gene 67 (1988) 31). Lyhyesti, ensiksi geenejä Grb2 ja Grb3-3 modi-35 fioitiin liittämällä start- ja stop-kodonien kummallekin 12 puolelle BamHI-kohta. Tätä varten näiden geenien avoimia lukualueita monistettiin PCR:llä seuraavien oligonukleoti-dien avulla: oligonukleotidi I {5’) (sekvenssi tunnusnro 3): gaattcggatc.catogaagccatcgccaaatatgacttc oligonukleotidi II (3’) (skevenssi tunnusnro 4): 5 Alleviivattu osa vastaa luotua BamHI-kohtaa, jota seuraavat tai edeltävät start- ja stop-kodonit.

Sitten näin monistetut geenit kloonattiin BamHI-fragmentteina vektoriin pGEX2T (Pharmacia), josta oli tehty lineaarinen samalla entsyymillä, 3'-suuntaan ja 10 faasiin GST:tä koodittavan cDNA:n kanssa. Sitten näin saatuja vektoreita käytettiin kannan Eb coli TG1 trans-formoimiseksi. Näin transformoituja soluja esiviljeltiin yön yli 37 °C:ssa, ne laimennettiin suhteessa 1/10 LB-kas-vualustaan, lisättiin IPTG:tä ilmentymisen indusoimiseksi 15 (2 tuntia, 25 °C) ja viljeltiin sitten noin 21 tunnin ajan 25 °C:ssa. Sitten soluissa aikaansaatiin lyysi ja tuotettuja fuusioproteiineja puhdistettiin affiniteettikromato-grafisesti Agarose-GSH-kolonnissa. Tätä varten bakteerily-saattia inkuboitiin geelin (joka oli valmistettu ja tasa-20 painoitettu lyysipuskuria käyttäen) läsnä ollessa 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. 3 pesun Tris-HCl-puskurilla, pH 7,4, jälkeen proteiinit eluoidaan Tris-HCl-puskurin, pH 7,7, läsnä ollessa, joka sisältää ylimäärin GST:tä. Superna-tantti otetaan talteen ja sentrifugoidaan.

25 Samaa protokollaa käytettiin Grb2-mutantin, jossa glysiini 203 on korvattu arginiinilla (Grb2G203R), ja Grb3-3-mutantin, jossa glysiini 162 on korvattu arginiinilla (Grb3-3G162R), valmistamiseksi. On kuvattu, ettei mutantilla Grb2G203R enää olisi aktiivisuutta DNA-syntee-30 sin uudelleenkäynnistämisen testissä (Lowenstein et ai. , supra). Mutantti Grb3-3G162R käsittää saman mutaation sa- 13 massa asemassa, jolloin myös sen tulisi olla epäaktiivi-nen.

Nämä mutantit valmistettiin mutagenisoimalla PCRrllä geenejä Grb2 ja Grb3-3 käyttäen 5'-suunnassa edel-5 lä kuvattua oligonukleotidia I ja 3'-suunnassa seuraavaa oligonukleotidia III, jossa mutagenisoitu kodoni on alleviivattu :

oligonukleotidi III (3') (sekvenssi tunnusnro 5): CACGTTCCGGTTCACGGGGGTGACATAATTfiCaGGGAAACATGCGGOTC

10 Sitten näin monistetut fragmentit eluoitiin, ja sen jälkeen ne monistettiin PCR:llä oligonukleotidien I ja II avulla, minkä jälkeen ne kloonattiin sitten vektoriin pGEX2T. Mutantit tuotettiin sitten kuten edellä kuvattiin.

Sitten GST-fuusioproteiinit (GST-Grb2, GST-Grb3-3, 15 GST-Grb3-3G162R ja GST) biotinyloitiin sitten alan ammattilaiselle tutuilla tavanomaisilla tekniikoilla [vrt. yleiset molekyylibiologiset tekniikat sekä Mayer et ai., PNAS 88 (1991) 627], minkä jälkeen niitä käytettiin koet-timina sitoutumisen immobilisoituun fosforyloituun EGF-re-20 septoriin (2.1.) määrittämiseksi ja sitten hSOSlistä saatuun peptidiin (2.2.).

2.1. Sitoutuminen fosforyloituun EGF-reseptoriin

Protokolla: Käytetty EGF-reseptori puhdistettiin lähtien A431-soluista immobilisoimalla WGA-sefaroosiin 25 tekniikan mukaan, jota kuvaavat Duchesne et ai. [Science 259 (1993) 525]. 2 pg tätä reseptoria stimuloitiin ensiksi pitoisuudella 1 μΜ EGF 10 minuutin ajan 22 °C:ssa, minkä jälkeen inkuboitiin leimaamattoman ATP:n läsnä ollessa (10 μΜ) tai puuttuessa pitoisuuden 2,5 #1 MnCli läsnä ol-30 lessa HNTG-puskurissa (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton-valmistetta, 10 % glyserolia, pH =7,5} 4 °C:ssa 2 minuutin ajan. Sitten reseptorin fosforylaatio keskeytettiin lisäämällä hajotuspuskuria. Sitten näytteet sijoitettiin 4 - 20-%:iselle SDS-PAGE-geelille, minkä jälkeen 35 ne siirrettin polyvinyyligdeenidifluoridi- (PVDF-) memb- 14 raaneille. Siirtokopioita inkuboitiin sitten erilaisten biotinyloitujen GST-fuusioiden läsnä ollessa (2 μς/ml), minkä jälkeen ne osoitettiin alkaliseen fosfataasiin kytketyn streptavidiinin (Promega) avulla. EGF-reseptoreilla 5 suoritettiin myös immuuni-blot-määritys fosfotyrosiini-vastaisten (anti-PY-) vasta-aineiden läsnä ollessa sen varmistamiseksi, että reseptorit olivat todella fosfory-loituja.

Tulokset: Saadut tulokset esitetään kuviossa 2a.

10 Niistä ilmenee odotuksia vastaavasti, että proteiini Grb2 on vuorovaikutuksessa vain fosforyloidussa muodossa olevan EGF-reseptorin kanssa. Ne osoittavat sitten, ettei proteiini Grb3-3 sitoudu EGF-reseptoriin riippumatta tämän fosforylaatioasteesta.

15 2.2. Sitoutuminen hSOSl-peräiseen peptidiin

Protokolla: Syntetisoitiin seuraavat kaksi run saasti proliinia sisältävää peptidiä: peptidi hSOSl: GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: tämä peptidi vastaa proteiinin hSOSl tähteitä 1143 - 1162 [Li et ai., 20 Nature 363 (1993) 83], jotka ovat vastuussa Grb2:n ja hSOSl:n (sekvenssi tunnusnro 6) välisestä vuorovaikutuksesta; peptidi 3BP1: PPPLPPLV: tämä peptidi saadaan pro teiinista 3BP1, joka tunnetusti sitoo tehokkaasti Abi:n ja 25 Src:n SH3-alueen [Cicchetti et ai., Science 257 (1992) 803] (sekvenssi tunusnro 7).

Kumpikin näistä peptideistä (1 μΐ, 10 mg/ml} immo-bilisoitiin nitroselluloosamembraanille. Sitten membraane-ja inkuboitiin salpauspuskurissa (20 mM Tris, pH = 7,6, 30 150 mM NaCl, 0,1 % Tween-valmistetta, 3 % nauta-albumii nia). Sitten membraaneja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa biotinyloitujen eri GST-fuusioiden läsnä ollessa (4 pg/ml), minkä jälkeen ne osoitettiin alkaliseen fosfataasiin kytketyn sterptavidiinin (Promega) avulla.

15

Tulokset: Saadut tulokset esitetään kuviossa 2b. Ne osoittavat, että Grb3-3, kuten Grb2, kykenee sitomaan peptidin hSOSl. Ne osoittavat lisäksi, että tämä vuorovaikutus on spesifistä, koska mitään sitoutumista ei 5 havaita peptidin 3BP1 kanssa. Lisäksi tulokset osoittavat samoin, ettei mutantti Grb3-3G162R enää kykene sitomaan peptidiä hSOSl, mikä vahvistaa tämän tähteen tärkeyden ja tämän vuorovaikutuksen funktionaalisen roolin.

3. Grb3“3“proteiinin aktiivisuus 10 Tämä esimerkki osoittaa, että huolimatta delee- tiostaan SH2-alueella Grb3-3-proteiinilla on funktionaalinen vaikutus.

Proteiinin Grb3-3 aktiivisuutta tutkittiin määrittämällä sen kyky olla yhteistoiminnassa ras:in kanssa pro-15 moottorin transaktivoimiseksi, jossa on ras-vaste-element-tejä (RRE), ja joka hallitsee reportterigeenin ilmentymistä .

Käytettyä protokollaa on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Schweighoffer et ai♦, Science 256 (1992) 825. Ly-20 hyesti, käytetty promoottori on synteettinen pomoottori, joka koostuu tymidiinikinaasigeenin kypsästä promoottorista ja polyoomatehostimesta saaduista neljästä toistuvasta PEAl-elementistä [Wasylyk et ai., EMBO J. 7 (1988) 2475]: promoottori Py-TK. Tämä promoottori ohjaa reportterigeenin 25 ilmentymistä, tässä tapauksessa kloramfenikoliasetyyli-transferaasin (CAT) bakteerigeeniä: vektori Py-TK-CAT.

Testattujen geenien ilmentämisvektorit rakennettiin inser-toimalla mainitut geenit BamHI-fragmentteina plasmidin pSV2 Bglll-kohtaan. Tämä kohta tekee mahdolliseksi geenien 30 sijoittamisen SV40-varhaispromoottorin kontrolliin.

ER22-soluja, joiden yhteenkasvamisaste oli 40 %, transfektoitiin 0,5 pg:lla vektoria Py-TK-CAT yksinään (Py) tai ilmentämisvektorin läsnä ollessa, joka käsittää SV40-varhaispromoottorin kontrollissa geenin: Grb2, 2 pg, 35 Grb3-3, 2 pg, Grb2 (G203R) 2 pg, Grb3-3 (G162R) 2 pg tai 16

Grb3-3, 2 yg + Grb2, 2 pg, Kussakin tapauksessa DNA:n kokonaismäärä säädettiin 5 pg:ksi vailla inserttiä olevalla ilmentämisvektorilla. Transfektointi suoritettiin lipo-spermiinin (Transfectam, IBF-Sepracor) läsnä ollessa. So-5 luja pidettiin 48 tunnin ajan viljelmässä DMEM-kasvualus-tassa, jota oli täydennetty 0,5 %:lla vasikansikiöseeru-mia. Sitten määritettiin CAT-aktiivisuus (RRE:n transak-tivaatio) kuten kuvaavat Wasylyk et ai. [PNAS 8J5 (1988) 7952].

10 Saadut tulokset esitetään kuviossa 3. Ne osoitta vat selvästi, että Grb3-3-proteiinin ilmentäminen vastustaa kasvutekijäreseptorin aktivaation vaikutuksia. Ne osoittavat samoin, että Grb2 ylimäärin läsnä ollessaan vastustaa Grb3-3:n vaikutuksia kasvutekijävasteeseen.

15 4. Grb3-3 indusoi soluapoptoosin Tämä esimerkki osoittaa Grb3-3:n suoran liittymisen soluapoptoosiin. Tämä ominaisuus tarjoaa erityisen edullisia käyttöjä solulisääntymisestä seuraavien patologioiden (syövät, uudelleen ahtautuminen jne.) hoitamisek-20 si.

Soluapoptoosin indusointi Grb3-3:lla osoitettiin (i) ruiskuttamalla yhdistelmä-DNA-proteiinia 3T3-fibro-blasteihin ja (ii) siirtämällä Grb3-3 koodittava sekvenssi 3T3-soluihin.

25 (i) Yhdi s telinä-DNA-proteiinin ruiskuttaminen

Yhdistelmä-DNA-Grb3-3-proteiini valmistettiin fuu-sioproteiinina GST:n kanssa esimerkissä 2 kuvatun protokollan mukaan. Sitten fuusioproteiinia käsiteltiin trom-biinilla (0,25 I, Sigma) GST-osan erottamiseksi, minkä 30 jälkeen sitä puhdistettiin ioninvaihtokromatografisesti monoQ-kolonnissa. Yhdistelmä-DNA-proteiinia sisältävät fraktiot konsentroitiin sitten mikrokonsentroijien Micro-sep (Filtron) avulla 20 mM fosfaattipuskurissa (pH 7), joka sisälsi pitoisuuden 100 mM NaCl. Näin saatua puhdistet-35 tua proteiinia ruiskutettiin (1-3 mg/ml) 3T3-soluvil- 17 jelmään automaattisen eppendorf-mikroruiskun avulla. Sitten soluja inkuboitiin 34 °C:ssa ja niistä otettiin tasaisin väliajoin valokuva morfologisten muutosten seuraamiseksi. Saadut tulokset osoittavat, että 5 tunnin kuluttua 5 Grb3-3-ruiskeesta valtaosa soluista on kuollut, kun taas samoissa olosuhteissa Grb2:n tai mutantin Grb3-3(G162R) ruiskuttamisella ei ole mitään vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen.

(ii) Yhdistelmä-DNA-proteiinia koodattavan sekvens-10 sin siirtäminen

Rakennettiin plasmidi, joka käsittää sekvenssin tunnusnro 1, joka koodittaa Grb3-3-proteiinia SV40-viruk-sen varhaispromoottorin kontrollissa.

3T3-fibroblasteja, joiden yhteenkasvamisaste oli 15 40 %, transfektoitiin lipospermiinin (Transfectam, IBF-

Sepracor) läsnä ollessa 0,5 tai 2 pg:lla tätä ilmentämis-plasmidia. 48 tunnin kuluttua transfektiosta 50 % soluista oli suspensiona kasvualustassa, ja jäljellä olevat solut, jotka olivat kiinnittyneet seinämään, osoittivat hyvin 20 tärkeitä morfologisia muutoksia (kuvio 4}. Elektroforeet-tinen analyysi agaroosigeelissä osoitti lisäksi, että soluissa oli oligonukleosomaalinen DNA-frgamentaatiokuvio, joka on karakteristinen kuolleille soluille (kuvio 4). Sitä vastoin samoissa olosuhteissa ilmentämisplasmidilla 25 Grb2, Grb3-3(G162R) tai Grb2(G203R) transfektoidut solut ovat säilyttänet normaalin morfologian, ne ovat edelleen elinkelpoisia ja niissä ei esiinny lainkaan DNA-fragmen-taatiota. Kuten kuviosta 4 ilmenee, Grb2 koi Ilmentämällä voidaan vastustaa Grb3-3:n vaikutuksia.

30 Nämä tulokset osoittavat siten selvästi, että

Grb3-3 muodostaa tappajageenin, joka kykenee indusoimaan soluapoptoosin. Kuten edellä mainittiin, tämä ominaisuus tarjoaa erityisen edullisia käyttöjä patologioiden hoitamiseksi, jotka ovat seurausta solulisääntymisestä, kuten 35 etenkin syövät, uudelleen ahtautuminen jne.

18 5. Grb3-3:n ilmentymisen osoittaminen HIV-viruksel-la tartutetuissa lymfosyyteissä Tämä esimerkki osoittaa, että T-lymfosyyttien tar-tutussyklin HIV-viruksella aikana Grb2- ja Grb3-3-mRNA:n 5 suhteellinen määrä modifioituu, ja että Grb3-3-lähetti ilmentyy hyvin runsaasti runsaan virustuotannon ja solukuo-leman aikana.

Ääreisverilymfosyyttejä tartutettiin HIV-1-viruk-sella käyttäen kahta laimennosta (1/10 ja 1/100) 1, 4 tai 10 7 päivän ajan. Sitten solujen mRNA:t analysoitiin kään- teis-PCR:llä Grb2- ja Grb3-3-spesifisten oligonukleotidien avulla Grb2- ja Grb3~3”lähettien suhteellisen määrän määrittämiseksi.

Käytetyt Grb3-3-spesifiset oligonukleotidit ovat 15 seuraavat: oligonukleotidi IV (3'):

ATCGTTTCCAAACGGATGTGGTTT

Sekvenssi tunnusnro 8 20 oligonukleotidi V (51):

ATAGAAATGAAACCACATCCGTTT

Sekvenssi tunnusnro 9 25 Saadut tulokset esitetään kuviossa 5. Ne osoitta vat selvästi, että 7 päivän kuluttua HI-virustartutuksesta Grb3-3-mRNA ilmentyy hyvin runsaasti. Kuten osoittaa p24-proteiinin ja viruksen käänteiskopioijaentsyymin määritys, päivä 7 vastaa samoin aikaa, jona havaitaan hyvin runsasta 30 virustuotantoa.

19

Sekvenssiluettelo (1) INFORMATION GENERATE: (i) DEPOSANT: (Λ) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.

- (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON

ö (C) VILLE: ANTONY

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 92165 <ii) TITRE DE L·’ INVENTION: Gene Grb3-3, ses variants et leurs utilisations.

(ill) NOMBRE DE SEQUENCES: 9 10 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGXCIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: 15 (i.) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 933 paires de bases (B) TYPE: acide nucl6igue (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc 2Q (ill) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:

(A) NOM/CLE: CDS

0f- (B) EMPLACEMENT: 37..567 (D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product» ”Grb3-3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54

Met Glu Ala lie Ala Lys 1 5 30 TAT GAC TTC AAA GCT ACT GCA GAC GAC GAC CTG AGC TTC AAA AGG GGG 102

Tyr Asp Phe Lys Ala Thr Ala Asp Asp Asp Leu Ser Phe Lys Arg Gly 10 15 20 GAC ATC CTC AAG GTT TTG AAC GAA GAA TGT GAT CAG AAC TGG TAC AAG 150

Asp lie Leu Lys Val Leu Asn Glu Glu Cys Asp Gin Asn Trp Tyr Lys 25 30 35 GCA GAG CTT ΛΛΤ GGA ΛΛΛ GAC GGC TTC ATT CCC AAG AAC TAC ΛΤΑ GAA 198 35 Ala Glu Leu Asn Gly Lys Asp Gly Phe lie Pro Lys Asn Tyr lie Glu 20 40 45 50 ATG ΛΛΛ CCA CAT CCG TTT GGA AAC GAT GTG CAG CAC TTC AAG GTG CTC 246

Met Lys Pro His Pro Phe Gly Asn Asp Val Gin His Phe Lys Val Leu 55 60 65 70 CGA GAT GGA GCC GGG AAG TAC TTC CTC TGG GTG GTG AAG TTC ΛΑΤ TCT 294 5 Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp Val Val Lys Phe Asn Ser 75 80 85 TTG ΛΛΤ GAG CTG GTG GAT TAT CAC AGA TCT ACA TCT GTC TCC AGA AAC 342

Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser Thr Ser Val Ser Arg Asn 90 95 100 CAG CAG ΛΤΛ TTC CTG CGG GAC ΛΤΑ GAA CAG GTG CCA CAG CAG CCG ACA 390

Gin Gin lie Phe Leu Arg Asp lie Glu Gin Val Pro Gin Gin Pro Thr 10 105 110 115 TAC GTC CAG GCC CTC TTT GAC TTT GAT CCC CAG GAG GAT GGA GAG CTG 438

Tyr Val Gin Ala Leu Phe Asp Phe Asp Pro Gin Glu Asp Gly Glu Leu 120 125 130 GGC TTC CGC CGG GGA GAT TTT ATC CAT GTC ATG GAT AAC TCA GAC CCC 486

Gly Phe Arg Arg Gly Asp Phe lie His Val Met Asp Asn Ser Asp Pro 135 ' 140 145 150 15 AAC TGG TGG AAA GGA GCT TGC CAC GGG CAG ACC GGC ATG TTT CCC CGC 534

Asn Trp Trp Lys Gly Ala Cys His Gly Gin Thr Gly Met Phe Pro Arg 155 160 165 ΛΛΤ TAT GTC ACC CCC GTG AAC CGG AAC GTC TAAGAGTCAA GAAGCAATTA 584

Asn Tyr Val Thr Pro Val Asn Arg Asn Val 170 175 20 TTTAAAGAAA GTGAAAAATG TAAAACACAT ACAAAAGAAT TAAACCCACA AGCTGCCTCT 644 GACAGCAGCC TGTGAGGGAG TGCAGAACAC CTGCCGGGTC ACCCTGTGAC CCTCTCACTT 704 TGGTTGGAAC TTTAGGGGGT GGGAGGGGGC GTTGGATTTA AAAATGCCAA AACTTACCTA 764 TAAATTAAGA AGAGTTTTTA TTACAAATTT TCACTGCTGC TCCTCTTTCC CCTCCTTTGT 824 CTTTTTTTTC TTCCTTTTTT CTCTTCTGTC CATCAGTGCA TGACGTTTAA GGCCACGTAT 884 25 AGTCCTAGCT GACGCCAATA AAAAACAAGA AACCAAAAAA CCCGAATTC 933 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases on (B) TYPE: acide nucleigue (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin^aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC 24 35 21 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nuclMque (C) NOMBRE DE BRINS: simple 5 (D) CONFIGURATION: lineaire <ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE I

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTC 39 10 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nucl^ique ις (C) NOMBRE DE BRINS: simple

Xt> (D) CONFIGURATION: lineaire (id) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE II

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: 20 GAATTCGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC 39 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 49 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire 25 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE III

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGTC 49 30 (2) INFORMATION POUR LA .SEP ID. NQJ 6:.

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) JjONGUEUR: 20 acides amines (B) TYPE: acide amine (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Prot§ine 35 (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Peptide hSOS1 (residus 1143 ä 1162) 22 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg Arg 15 10 15 5 Pro Glu Ser Ala 20 .(2) INFORMATION POUR LA .SEP ID NQ: 7;.

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 8 acides amines .j f. (B) TYPE: acide aminS

(D) CONFIGURATION: lin£aire (il) TYPE DE MOLECULE: Prot6ine (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Peptide 3BP1 (Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: 15

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val 1 5 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: 20 (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucl^ique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE IV 25 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: ATCGTTTCCA AACGGATGTG GTTT 24 A2A_Ϊ.NEQiiMΔllQtLEQ.UβJL·Δ_^CL·IβJtiίlL_2i.

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: 30 (A) LONGUEUR: 24 paires de bases <B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOTIDE V

35 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: ATAGAAATGA AACCACATCC GTTT 24

Claims (8)

1. Menetelmä vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sopivaan vektoriin lisätään nukleotidisekvens- 5 si, jota edustaa sekvenssi tunnusnumero 1.

2. Menetelmä vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sopivaan vektoriin lisätään nukleotidisekvenssi, jota edustaa sekvenssi tunnusnumero 1 ja joka kykenee inhiboimaan ainakin osittain proteiinin Grb2 tai Grb3-3 il- 10 mentyrnisen.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on virusvektori.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on saatu adenoviruksista, ret- 15 roviruksista, AAVreistä, HSV-viruksesta, CMV:stä tai leh- mänrokkoviruksesta.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on replikaatioon puutteellinen virus.

6. Menetelmä nukleotidisekvenssin valmistamiseksi, jota edustaa sekvenssi tunnusnumero 1, tunnettu siitä, että seulotaan sopiva lähtömateriaali koettimella, jota edustaa sekvenssi tunnusnumero 2, ja eristetään haluttu nukleotidisekvenssi.

7. Menetelmä nukleotidisekvenssin valmistamiseksi, jota edustaa sekvenssi tunnusnumero 1 ja joka kykenee inhiboimaan ainakin osittain proteiinin Grb2 tai Grb3-3 ilmentymisen, tunnettu siitä, että seulotaan sopiva lähtömateriaali sopivalla koettimella ja eristetään haluttu nuk- 30 leotidisekvenssi.

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu nukleotidisekvenssi lisäksi kompleksoidaan DEAE-dekstraaniin, tumaproteiineihin tai li-pideihin, sellaisenaan tai edelleen liposomeihin sisälly- 35 tettynä.