PL178402B1

PL178402B1 - Sekwencja nukleotydowa, wektor zawierający sekwencję nukleotydową i kompozycje farmaceutyczne

Info

Publication number: PL178402B1
Application number: PL94313445A
Authority: PL
Inventors: Fabien Schweighoffer; Bruno Tocque
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1993-09-15
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 2000-04-28
Also published as: PL313445A1; DE69426121D1; NO960965D0; HU9600668D0; CZ75896A3; AU698819B2; CZ288882B6; FI120499B; HUT74273A; GR3034600T3; IL110942A; AU6724794A; NO319144B1; ATE196926T1; IL110942A0; HU221516B; KR100330477B1; RU2159815C2; CN1098930C; IL126756A

Abstract

1. Sekwencja nukleotydowa przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1. 3. Wektor zawierajacy sekwencje nukleotydowa przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1. 11. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii zwiazanych z anormalna pro- liferacja komórkowa, zawierajaca dopuszczalna farmaceutycznie zaróbke oraz substancje czynna, znamienna tym, ze jako substancje czynna zawiera co najmniej jeden wektor zawierajacy sekwencje nukleotydowa przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1, przy czym wektor ten stanowi wektor wirusowy, korzystnie wektor pochodzacy z adenowirusa, re- trowirusa, AAV, wirusa HSV, CMV lub wirusa szczepionki, albo z wirusa defektywnego dla replikacji. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydową przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydową przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitująca co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1. W korzystnej odmianie wektora według wynalazku jako

178 402 wektor może być stosowany wektor wirusowy. Jeszcze bardziej korzystnie, wektor ten stanowi wektor pochodzący z adenowirusa retrowirusa, wirusa adeno-asocjowanego (AAV), wirusa herpes (HSV), cytomegalowirusa (CMV) lub wirusa krowianki. Najbardziej korzystnie stanowi go wektor pochodzący z wirusa defektywnego dla replikacji.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującą, co najmniej w części, ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3. Korzystnie wektor może stanowić wektor wirusowy, może nim być także wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, wirusa adeno-asocjowanego (AAV), wirusa herpes (HSV), cytomegalowirusa (CMV) lub wirusa krowianki. Najbardziej korzystnie, stanowi go wektor pochodzący z wirusa defektywnego dla replikacji.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii związanych z anormalną proliferacją komórkową, zawieraj ącą dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzującą się tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden wektor zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1, przy czym wektor ten stanowi wektor wirusowy, korzystnie wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, AAV, wirusa HSV, CMV lub wirusa szczepionki, albo z wirusa defektywnego dla replikacji.

Następnie przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii związanych z anormalną proliferację komórkową, zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden wektor zawierający sekwencję.nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującą co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3, przy czym wektor ten stanowi wektor wirusowy, korzystnie wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, AAV, wirusa HSV, CMV lub wirusa krowianki, albo z wirusa defektywnego dla replikacji.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii, w których obserwuje się anormalną proliferację komórkową, zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzująca się tym, że jako substancję czynna, zawiera co .najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1, przy czym' ta sekwencja nukleotydową jest w postaci skompleksowanej z DEAEdekstranem, z proteinami jądrowymi lub z lipidami, samego DNA lub ponadto inkorporowanej w liposomy.

Również, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii, w których obserwuje się anormalną proliferację komórkową, zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzująca się . tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującą co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest w postaci skompleksowanej z DEAE-dekstranem, z proteinami jądrowymi lub z lipidami, samego DNA lub ponadto inkorporowanej w liposomy.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna do leczenia raka zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 lub co najmniej jeden wektor zawierający tę sekwencję.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do leczenia raka zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzująca się tym, że jako substancję czynna zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującą co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3 lub co najmniej jeden wektor zawierający tę sekwencję.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycji farmaceutyczna do leczenia AIDS zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera związek eliminujący lub przeciwdziałający co najmniej częściowo efektom komórkowym Grb3-3.

W korzystnym wykonaniu tej kompozycji według wynalazku zawiera ona korzystne związki eliminujące lub przeciwdziałające co najmniej częściowo efektom komórkowym

178 402

Grb3-3 stanowią antysensowe sekwencje genetyczne pochodzące z sekwencji nuklotydowej SEQ ID nr 1, lub szczególne oligonukleotydy Grb3-3, lub cała sekwencja SEQ ID nr 1.

W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji antysensownych, których ekspresja w komórce docelowej pozwala na kontrolowanie transkrypcji komórkowego mRNA. Sekwencje te mogą być np. transkrybowane, w komórce docelowej, w RNA komplementarne do mRNA komórkowego Grb2 lub Grb3-3 i mogą blokować zatem ich translację w proteinę, według techniki opisanej w opisie patentowym EP 140 308. Sekwencje te można utworzyć z całości lub części sekwencji nukleinowej SEQ ID nr 1, transkrybowanych przy odwrotnym ukierunkowaniu.

Jak uprzednio wskazano, Grb2 jest proteiną co najmniej dwufunkcyjną wiążącą się przez swoją domenę SH2 ze szczególnymi fosforylowanymi sekwencjami w tyrozynie i przez dwie domeny SH3 z czynnikami wymiany rodziny SOS. Grb3-3 o utraconej zdolności asocjowania z fosforylowanymi proteinami w tyrozynie może zatem wyłącznie tworzyć kompleks z proteinami SOS. Grb3-3 może zatem przeciwdziałać tworzeniu się kompleksu Grb2SOS przez receptory autofosforylowanych czynników wzrostu lub przez fosforyklowane reszty tyrozynowe proteiny, takie jak SHC lub IRS1. Grb3-3 zdolne do blokowania tworzenia kompleksu, jest zdolne do blokowania dróg mitogenów i do indukowania śmierci komórki. Zgłaszający w istocie wykazał, że proteina Grb3-3 została ekspresjonowana w trakcie pewnych procesów fizjologicznych jak np. dojrzewania grasicy u szczura. Zgłaszający również wykazał, że Grb3-3 jest zdolny do indukowania śmierci komórki przez apoptozę różnych typów komórek. Właściwości te udowodniono przez zastosowanie następującej procedury:

(i) injekcję rekombinacyjnej proteiny do fibroblastów 3T3 oraz (ii) przeniesienie sekwencji kodującej Grb3-3 w komórkach 3T3 (przykład 4). Jak wykazano Grb3-3 jest zatem zdolny do indukowania śmierci komórkowej komórek zdolnych do życia, takich jak komórki immortalizowane, rakowe lub embrionowe. Jak pokazano w przykładach, Grb2 jest zdolne do przeciwstawiania się wpływowi Grb3-3.

Z drugiej strony, badanie ekspresji Grb3-3 wykonane w trakcie infekcji komórek limfocytowych wirusem HIV pozwoliło na wykazanie, że zaobserwowane masywne wytwarzanie wirusa po 7 dniach od infekcji jest skorelowane z nadekspresjąmRNA Grb3-3 przez zainfekowane komórki (przykład 5). To doświadczenie wykazuje, że eliminowanie lub przeciwdziałanie wpływom komórkowym Grb3-3 może również pozwolić na utrzymanie życia zainfekowanych komórek, zwłaszcza przez VIH, a zatem może pozwolić, by limfocyty T4 nadal wypełniały rolę obrony immunologicznej. Pod tym względem, niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania związków zdolnych do przynajmniej częściowego eliminowania lub przeciwdziałania wpływom komórkowym Grb3-3 dla wytworzenia kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do leczenia AIDS (zespołu nabytego upośledzenia odporności).

W szczególności, stosowanymi związkami mogą być:

- antysensowne sekwencje genetyczne, takie jak określono powyżej,

- szczególne oligonukleotydy Grb3-3, zmodyfikowane lub nie w celu najlepszej trwałości lub biodostępności (fosforotioany, środki ze wstawkami itp.). Może to dotyczyć preferencji oligonukleotydów osłaniających sekwencję kodującą zlokalizowaną między końcem N domeny SH3 oraz resztą domeny SH2.

- cała sekwencja, której przeniesienie do infekowanych komórek indukuje nadekspresję

Grb2.

Sekwencje nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane np. po iniekcji człowiekowi lub zwierzęciu, dla indukowania ochrony przed, lub leczenia raka. W szczególności, mogą być one wstrzyknięte w postaci samego DNA według techniki opisanej w zgłoszeniu WO 90/11092. Można je również podawać postaci skompleksowanej, np. z DEAE-dekstranem (Pagano i in., J. Virol. 1 (1967)891), z proteinami jądrowymi (Kaneda i in., Science 243 (1989) 375), z lipidami (Feigner i in., PnAs 84 (1987) 7413), w postaci liposomów (Fraley i in., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), itp.

Korzystnie, sekwencje nukleinowe według niniejszego wynalazku tworzą część wektora. Użycie takiego wektora pozwala na efekt lepszego podawania kwasu nukleinowego w komórkach poddawanych leczeniu, i równocześnie na zwiększenie jego stabilności we wspo6

178 402 mnianych komórkach, co pozwala na uzyskanie długotrwałego efektu terapeutycznego. Co więcej, jest możliwe wprowadzenie szeregu sekwencji kwasu nukleinowego do tego samego wektora, co również zwiększa skuteczność leczenia.

Użyty wektor może być różnego pochodzenia, i umożliwiającego w związku z tym transformacji komórek zwierzęcych, korzystnie ludzkich komórek nowotworowych. W korzystnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku, stosuje się wektor wirusowy, który można wybrać z grupy obejmującej: adenowirus, retrowirus, wirusy adenoasocjowane (AAV), wirus herpes, cytomegalowirus (CMV), wirus krowianki, itp. Wektory wprowadzone z adenowirusa, retrowirusa lub AAV włączające sekwencje heterologicznych kwasów nukleinowych opisano w literaturze [Akli i in., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet i in., Human Gene Therapy, 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero i in., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle i in., Science 259 (1993) 988; Roemer i Fridmann, Eur. J. Biochem 208 (1992) 211; Dobson i in., Neuron 5 (1990) 353; Chicca i in., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara i in., New Biol., 4 (1992) 238; W091/18088].

Niniejszy wynalazek dotyczy zatem również całości wirusa rekombinacyjnego zawierającego, wstawioną w swój genom, sekwencję nukleinową takąjak zdefiniowano poprzednio.

Korzystnie, wirus rekombinacyjny według niniejszego wynalazku jest wirusem defektywnym. Określenie „wirus defektywny” oznacza wirus niezdolny do replikacji w komórce docelowej. Zasadniczo, genom wirusów defektywnych użytych w ramach niniejszego wynalazku jest zatem pozbawiony co najmniej sekwencji niezbędnych do replikacji wspomnianego wirusa w zainfekowanej komórce. Obszary te mogą być albo wyeliminowane (w całości lub w części), albo uczynione niefunkcjonalnymi, bądź też podstawione przez inne sekwencje, a zwłaszcza przez kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku. Korzystnie, wirus defektywny zachowuje niemniej sekwencje genomu, które są niezbędne do kapsydacji cząstek wirusowych.

Korzystne jest zwłaszcza wykorzystanie sekwencji nukleinowych według niniejszego wynalazku w postaci winkorporowanej do defektywnego adenowirusa, AAV lub retrowirusa rekombinacyjnego.

Co się tyczy adenowirusa, istnieją różne jego serotypy, których struktura i właściwości nieco się różnią, lecz które nie są patogenne dla człowieka, a zwłaszcza osobników nie osłabionych immunologicznie. Z drugiej strony, wirusy te nie wintegrowjąsię w genom komórek, które infekuj i mogą inkorporować ważne · fragmenty egzogennego DNA. Spośród różnych serotypów, w ramach niniejszego wynalazku przekłada się użycie adenowirusa typu 2 lub 5 (Ad 2 lub Ad 5). W przypadku adenowirusa Ad 5, sekwencje niezbędne do replikacji są obszarami E1A i E1b.

Rekombinacyjne wirusy defektywne według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez rekombinację homologiczną między wirusem defektywnym i plazmidem niosącym między innymi sekwencję nukleotydową taką jak określona uprzednio (Levrero i in., Gene 101 (1991) 195; Graham,· EMBO J. 3(12) (1984) 2917). Rekombinacja homologiczna następuje po współtransfekcji wspomnianych wirusa i plazmidu w przystosowanej linii komórkowej. Użyta linia komórkowa powinna korzystnie (i) być transformowalna przez wspomniane składniki oraz (ii) dopuszczać sekwencje zdolne do uzupełniania części genomu wirusa defektywnego, korzystnie w postaci zintegrowanej dla uniknięcia ryzyka rekombinacji. Przykładem linii wykorzystywanej dla wytworzenia defektywnych adenowirusów rekombinacyjnych, może być linia z nerki embrionu ludzkiego 293 (Graham i in., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), która zawiera zwłaszcza, w integrowana w swój genom, lewą część genomu adenowirusa Ad5 (12%). Przykładem linii stosowalnej dla wytworzenia defektywnych retrowirusów rekombinacyjnych, może być linia CRIP (Danos i Mulligam. PNAS 85 (1988) 6460).

Na koniec, wirusy, które są zwielokrotnione, są odzyskiwane i oczyszczane według klasycznych technik biologii molekularnej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca co najmniej wirus rekombinacyjny lub sekwencję nukleotydową, takie jak określono wyżej.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można sformułować mając na uwadze podawanie drogą miejscową, doustną, pozajelitową, donosową, dożylną, domięśniową, podskórną, dooczną itp.

178 402

7·

Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne zawierają zarobki farmaceutycznie dopuszczalne dla preparatów do iniekcji, ewentualnie bezpośrednio do leczonego nowotworu. Może to w szczególności dotyczyć roztworów soli (fosforan jednosodowy, dwusodowy, chlorek sodowy, potasowy, wapniowy lub magnezowy itp. lub mieszaniny tych soli), sterylnych, izotonicznych. lub kompozycji suchych, zwłaszcza liofilizowanych, które przez dodanie, w zależności od sytuacji, wody sterylizowanej lub surowicy fizjologicznej pozwalają na utworzenie roztworów do iniekcji.

Dawki kwasów nukleinowych (sekwencji lub wektora) użytych do podawania można dostosować w zależności od różnych parametrów i warunków, a w szczególności w zależności od: sposobu podawania, od stanu patologicznego, od kwasu nukleinowego poddawanego ekspresji, lub też od długości leczenia. Według ogólnego sposobu, w odniesieniu do wirusów rekombinacyjnych według niniejszego wynalazku, są one preparowane i podawane w postaci dawek zawartych między 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, a korzystnie od 10⁶ do 10¹⁰ pfu/ml. Określenie pfu („plaque forming unit”: ang: jednostka tworząca łysinkę) odpowiada mocy infekcyjnej roztworu wirusa, i jest określana przez infekcję przystosowanej hodowli komórkowej i mierzona zasadniczo po 48 godz., z liczby pól zainfekowanych komórek. Techniki oznaczania miana pfu roztworu wirusowego są dobrze udokumentowane w literaturze.

Takie kompozycje farmaceutyczne można zastosować u człowieka, dla leczenia i/lub profilaktyki raka. W szczególności, produkty według niniejszego wynalazku zdolne do modulowania aktywności protein ras, pozwalają na interweniowanie w procesie rozwoju raka, a zwłaszcza, mogą inhibitować aktywność onkogenów, których aktywność transformacyjna przechodzi przez oddziaływanie funkcjonalne p21-GAP. Liczne przypadki raka wiązano w istocie z obecnością onkogennych protein ras. Pośród typów raka zawierających mutowane geny ras, można zacytować zwłaszcza adenokarcynomy trzustki, które w 90% mają onkogen Ki-ras mutowany na dwunastym kodonie (Almoguera i wsp., Celi 53 (1988) 549), adenokarcynomy okrężnicy oraz raka tarczycy (50%), lub karcynomy płuc i leukemie mieloidalne (30%, Bos, J. L. Cancer Res. 49 (1989) 4682). Bardziej ogólnie, kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być użyte w leczeniu wszelkiego typu patologii, w których obserwuje się anormalną proliferację komórkową, przez idukowanie apoptozy, zatem, całej patologii cechującej się śmiercią komórkową przez apoptozę (AIDS, pląsawica Huntingtona, Parkinson), za pomocą związków blokujących wpływ Grb3-3 (zwłaszcza antysensowny).

Niniejszy wynalazek zilustrowano następującymi przykładami.

Figura 1: Schematyczne przedstawienie domen strukturalnych Grb2 i Grb3-3.

Figura 2: Badanie wiązania Grb3-3 do receptora EGF (fig. 2a) i peptydów bogatych w prolinę (fig. 2b).

Figura 3: Wpływ Grb3-3 na transaktywację przez ras pochodzącego od ulepszonego wirusa poliomy RRE.

Figura 4: Udokumentowani śmierci komórkowej indukowanej przez Grb3-3 na fibroblastach 3T3.

Figura 5: Udokumentowanie ekspresji Grb3-3 w komórkach infekowanych wirusem HIV.

Ogólne techniki biologii molekularnej

Klasyczne metody stosowane w biologii molekularnej, takie jak: ekstrakcje preparatywne DNA plazmidowego, odwirowywanie DNA plazmidowego w gradiencie chlorku cezowego, elektroforeza na żelu agarozowym lub akrylamidowym, oczyszczanie fragmentów DNA przez elektroelucję, ekstrakcja protein fenolem lub układem fenol-chloroform, wytrącanie DNA w środowisku soli przez etanol lub izopropanol, transformacja w Escherischia coli, etc., są dobrze znane specjaliście i są obszernie opisane w literaturze [Maniatis T i in., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. i in., (red.) „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plazmidy typu pBR322, pUC oraz fagi serii M13 pochodzą z handlu (Bethesda Research Laboratories).

Dla dokonania ligacji, fragmenty DNA mogą być rozdzielone według ich wielkości przez elektroforezę na żelu agarozowym lub akrylamidowym, ekstrakty na fenolu lub przez

178 402 mieszaninę fenol/chloroform, wytrącone w etanolu, a następnie inkubowane w obecności DNA ligazy fagu T4 (Biolabs) według zaleceń dostawcy.

Wypełnienie wystających końców 5' można wykonać fragmentem Klenowa DNA polimerazy IE. coli (Biolabs) według specyfikacji dostawcy. Destrukcję wystających końców 3' wykonuje się w obecności DNA polimerazy fagu T4 (Biolabs) używanej według zaleceń producenta. Destrukcję wystających końców 5' wykonuje się przez odpowiednie działanie nukleruząS1.

Mutagenezę prowadzoną in vitro przez oligodeoksynukleotydy syntetyczne można wykonać sposobem opracowanym przez Taylora i in., [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] wykorzystując zestaw rozprowadzany przez Amersham.

Amplifikację (wzmocnienie) fragmentów DNA można wykonać enzymatyczną metodą według technik PCR (reakcja łańcuchowa katalizowana przez polimeryzację), patrz, Saiki R.K. i in., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. i Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] wykorzystując „DNA thermal cycler” (Perkin Elmer Cetus) według specyfikacji producenta.

Weryfikację sekwencji nukleotydowych można wykonać sposobem opracowanym przez Sangera i in., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] wykorzystując zestaw rozprowadzany przez Amersham.

Przykłady

1. Wyizolowanie genu Grb3-3

Gen Grb3-3 wyizolowano przez przesianie banku DNA ludzkiego za pomocą sondy uzyskanej z sekwencji genu Grb2.

500 fagów rekombinacyjnych Lambda gt11 noszących fragmenty DNA pochodzącego z banku łożyska ludzkiego (Clontech) przesiano za pomocą sondy pochodzącej z sekwencji genu Grb2. Użyta sonda odpowiada 8 pierwszym aminokwasom proteiny Grb2, i ma następującą sekwencję:

ATGGAAGCCATCGCCAAATATGAC (SEQ ID nr 2)

W ten sposób zidentyfikowano 10 klonów pozytywnych. Insert tych 10 klonów wyizolowano w postaci fragmentów EcoRI, sklonowano w plazmidzie M13mpl8 i sekwencjonowano. Spośród 10 klonów, 9 nosiło inserty identyczne z sekwencją Grb2. Jeden spośród nich nosił insert o wielkości mniejszej od genu Grb2, według delecji w domenie SH2 (fig. 1). Analiza pozostałej sekwencji uwidoczniła doskonałą identyczność z obszarami odpowiadającymi Grb2, zawartymi w obszarach niekodujących 5' i 3'. Ramka otwartego odczytu tego klonu koduje proteinę o 177 aminokwasach (SEQ ID nr 1), zawierającą 2 domeny SH3 obramowujące niepełną domenę SH2 (fig. 1). Deletowane aminokwasy w domenie SH2 (reszty 60 do 100 proteiny Grb2) odpowiadają resztom związanym z wiązaniem Grb2 z peptydami zawierającymi fosforylowane tyrozyny.

2. Aktywność wiązania proteiny Grb3-3

Jak wskazano powyżej, proteina Grb2 jest mediatorem oddziaływania między receptorami fosforylowanych czynników wzrostu i czynników SOS. Ten przykład pokazuje, że proteina Grb3-3 jest niezdolna do oddziaływania z receptorem do fosforylowanego EFG, lecz że zachowuje swoją zdolność oddziaływania z peptydem bogatym w prolinę pochodzącym z sekwencji ludzkiego czynnika SOS1.

Zdolność wiązania Grb3-3 zbadano wykorzystując biotynylowane proteiny fuzyjne do S-transferazy glutationu (GST). Ten typ fuzji pozwala na szybkie i skuteczne oczyszczenie produktów rekombinacyjnych. Dlatego sekwencje według niniejszego wynalazku wyrażono w szczepie E. coli TG1 w postaci protein fuzyjnych z GST według techniki opisanej przez Smitha i Johnsona [Gene 67 (1988) 31]. Ujmując to w skrócie, geny Grb2 i Grb3-3 zmodyfikowano przede wszystkim przez wprowadzenie obustronne kodonów start i stop w miejscu BamHI. Dlatego ramki otwarte odczytu tych genów wzmocniono przez PCR za pomocą następujących oligonukleotydów:

178 402

Oligonukleotyd I (5') (SEQ ID nr 3)

GAATTCGGATCCATGGAAGCCATCGCCAAATATGACTTC

Oligonukleotyd II (3) (SEQ ID nr 4)

GAATTCGGATCCTTAGACGTTCCGGTTCACGGGGGTGAC

Część podkreślona odpowiada utworzonemu miejscu BamHI, następującemu lub poprzedzającemu kodony start i stop.

Geny w ten sposób wzmocnione sklonowano w postaci fragmentów BamHI w wektor pGEX 2T (Pharmacia) linearyzowany przez ten sam enzym, w 3' i w ramce cDNA kodującego GST. W ten sposób otrzymane wektory wykorzystano następnie do transformacji szczepu E. coli TG1. Tak transformowane komórki kodowano wstępnie przez noc w 37°C, rozcieńczono 1/10 w ośrodku LB, dodano IPTG dla indukowania ekspresji (2 godz., 25°C), następnie hodowano 21 godz. w około 25°C. Następnie komórki poddano lizie, i wytworzone proteiny fuzyjne oczyszczono metodą powinowactwa na kolumnie agaroza-GSH. W tym celu lizat bakteryjny jest inkubowany w obecności żelu (wytworzonego i zrównoważonego przy użyciu buforu lizy) przez 15 minut w 4°C. Po 3 przemyciach za pomocą buforu Tris-HCL pH

7,4, proteiny są wymywane w obecności buforu Tris-HCl pH 7,7 zawierającego nadmiar GST. Część pływającą po wierzchu zebrano i odwirowano.

Taki sam protokół' zastosowano do wytworzenia mutantu, Grb2 w którym glicyna 203 jest zastąpiona przez argininę (Grb2G203R) i mutantu Grb3-3, w którym glicyna 162 jest zastąpiona przez argininę (Grb3-3G162R). Jak opisano, mutant Grb2G203R nie posiada w próbie już aktywności reinicjacji syntezy DNA (Lowenstcin i in., cytowany uprzednio). Mutant Grb3-3G162R cechuje się tą samą mutacją w tej samej pozycji, stąd powinien być również nieaktywny.

Te mutanty wytworzono przez mutagenezę przez PCR na genach Grb2 i Grb3-3 stosując, w 5', wyżej opisanych oligonukleotyd I, a w 3', następujący oligonukleotyd III, w którym mutowany kodon jest podkreślony:

Oligonukleotyd ΠΙ (3') (SEQ ID nr 5):

GACGTTCCGGTTCACGGGGGTGACATAATTGCGGGGAAACATGCGGGTC

W ten sposób wzmocnione fragmenty sa następnie wymywane, powtórnie wzmacniane przez PCR za pomocą oligonukleotydów I i II, a następnie klonowane w wektor pGEX 2T. Następnie mutanty wytworzono jak opisano powyżej.

Proteiny fuzyjne do GST (GST-Grb2, GST-Grb3-3, GST-Grb3-3G162R i GST) następnie biotynylowano technikami klasycznymi znanymi specjaliście (por. ogólne techniki biologii molekularnej jak również Mayer i in., PNAS 88 (1991) 627), i użyto jako sondy dla oznaczenia wiązania do receptora immobilizowanego fosforylowanego EGF (2.1.) następnie do peptydu pochodzącego z hSOS1 (2.2.).

2.1. Wiązanie fosforylowanego receptora EGF.

Protokół: zastosowany receptor EGF oczyszczono począwszy od komórek A431 przez immobilizację na WGA-sefarozie techniką opisaną przez Duchesne i in. (Science 259 (1993) 525). 2 pg tego rrecptora najpierw stymulowano prrez 1 p'M EGF, 10 min. w 22°C, następnie πύαιbowano, z lub bez zimnego ATP (10 pM), w obecności 2,5 mM MnC12 w buforze HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1% Triton, 10% olicrryos, pH=7,5) w 4°C podczas 2 min. Następnie fosforylację receptora zatrzymano przez dodanie buforu droradacyjorgo. Próbki następnie umieszczono na żelu SDS-PAGE 4-20%, a następnie przeniesiono na błony z difluorku poliwioylogdeou (PVDF). Następnie bioty iokubownoo w obecności różnych biotynylowanych fuzji GST (2 pg/ml), a następnie wywołano za pomocą ttaeptnwidyny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną (Promega). Receptory EGF również poddano immunoblotowi w obecności przeciwciał antyfotfotyaozyoowych (anti-PY dla sprawdzenia, czy receptory dobrze sfosforyIowsoo.

178 402

Wyniki: Uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 2a. Pokazują one, zgodnie z oczekiwaniem, że proteina Grb2 oddziaływa z receptorem EGF tylko w postaci fosforylowanej. Następnie wyniki pokazują, że proteiny Grb3-3 nie wiąże receptora EGF niezależnie od stopnia fosforylacji.

2.2. Wiązanie do peptydu pochodzącego z hSOSl

Protokół: Zsyntetyzowano następujące dwa peptydy bogate w prolinę:

Peptyd hSOS1: GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: Peptyd ten odpowiada resztom 1143 do 1162 proteiny hSOS1 (Li i in., Nature 363 (1993) 83), odpowiedzialnym za oddziaływanie między Grb2 i hSOS1 (SEQ ID nr 6).

Peptyd 3BP1: PPPLPPLV: Peptyd pochodzi od proteiny 3BP1, który jest znany z tego, że wiąże się w sposób skuteczny z domeną SH3 Ab1 i Src (Cicchetti i in., Science 257 (1992) 803) (SEQ ID nr 7).

Każdy z tych peptydów (1 μ. 10 mg/ml) immobilizowano na błonie nitrocelulozowej. Błony następnie inkubowano w buforze blokującym (Tris 20 mM pH=7,6, 150 mM NaCl, 0,1% Tween, 3% albuminy bydlęcej). Błony następnie inkubowano przez jedną, noc w 4°C w obecności różnych fuzji biotynylowanych GST (4 pg/ml), a następnie wywołano za pomocą streptawidyny sprzężonej z fosfatazą alkaliczną (Promega).

Wyniki: Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 2b. Pokazują, one, że Grb3-3, jak Grb2, jest zdolny do wiązania peptydu hSOS1. Pokazują one, że co więcej to oddziaływanie jest specyficzne ponieważ żadne wiązanie z peptydem 3BP1 nie jest obserwowane. Z drugiej strony, wyniki pokazują również, że mutant Grb3-3G162R nie jest już zdolny do wiązania peptydu hSOS1, co potwierdza ważność tej reszty i funkcjonalnej roli tego oddziaływania.

3. Aktywność proteiny Grb3-3

Przykład ten pokazuje, że mimo delecji w domenie SH2, proteina Grb3-3, posiada efekt funkcjonalny.

Aktywność proteiny Grb3-3 zbadano przez oznaczenie jej zdolności do współdziałania z ras dla transaktywacji promotora posiadającego składniki odpowiedzi na ras (RRE), i zarządzającego ekspresją genu reportera.

Zastosowany protokół opisali np. Schweighoffer i in., Science 256 (1992) 825. Ujmując to w skrócie, zastosowany promotor jest promotorem syntetycznym złożonym z promotora murynowego genu kinazy tymidynowej i powtórzonych EA1 pochodzących z enhansera poliomu (Wasylyk i in., EMBo J. 7, (1988) 2475): promotor Py-TK. promotor kieruje ekspressą genu reportera, przy występowaniu genu bakteryjnego transferazy acetylowej chloramfenikolu (CAT): wektor Py-TK-CAT. Wektory ekspresji genów badanych skonstruowano przez wstawienie wspomnianych genów, w postaci fragmentów BarnHI, w miejscu BgIII plazmidu pSV2. Miejsce to pozwala na umieszczenie genów pod kontrolą promotora niedojrzałego SV40.

Komórki ER22 o 40% złączenia transfekowano przy użyciu 0,5 pg samego wektora PyTK-CAT (Py) lub w obecności wektora ekspresji noszącego, pod kontrolą promotora niedojrzałego SV40, gen: Grb2, 2 pg, Grb3-3, 2 pg, Grb2(G203R) 2 pg, Grb3-3(G162R) 2 pg, Grb3-3(G162R) 2 pg, lub Grb3-3, 2 pg + Grb2, 2 pg. W każdym przypadku, całkowitą ilość DNA dostosowano do 5 pg wektorem ekspresji bez insertu. Transfekcję wykonano w obecności liposperminy (Transfectam, IBF-Sepracor). Komórki utrzymywano 40 godz. w hodowli w ośrodku DMEM uzupełnionym przez 0,5% surowicy płodu bydlęcego. Następnie oznaczono aktywność CAT (transaktywacja RRE) jak opisali Wasylyk i in., (pNaS 85 (1988) 7952).

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 3. Pokazują one wyraźnie, że ekspresja proteiny Grb3-3 przeciwstawia się efektom aktywacji receptora czynnika wzrostu. Pokazują one również, że Grb2 w nadmiarze przeciwstawia się wpływowi Grb3-3- w odpowiedzi na czynnik wzrostu.

4. Grb3-3 indukuje apoptozę komórkową

Przykład ten ilustruje bezpośrednie związanie Grb3-3 w apoptozie komórkowej. Ta właściwość oferuje szczególnie korzystne zastosowania do leczenia patologii wynikających proliferacji komórkowej (rak, restenoza itp.).

Indukcje apoptozy komórkowej przez Grb3-3 pokazano (i) przez injekcję proteiny rekombinacyjny w fibroblastach 3T3 i (ii) przez przeniesienie sekwencji kodującej Grb3-3 w komórkach 3T3.

178 402 (i) Iniekcja proteiny rekombinacyjnej

Proteinę rekombinacyjną Grb3-3 wytworzono w postaci proteiny fuzyjnej z GST według protokołu opisanego w przykładzie. 2. Na proteinę luzyjną podziałano następnie trombiną (0,25%, Sigma), by oddzielić część GST, a następnie oczyszczono metodą chromatografii jonowymiennej na kolumnie monoQ. Frakcje zawierające proteinę rekombinacyjną następnie zatężono za pomocą mikrozatężacza Microsep (Filtron) w buforze fosforanowym 20 mM (pH 7) zawierającym 100 mM NaCl. Otrzymaną tak oczyszczoną proteinę wstrzyknięto (1 do 2 mg/ml) do komórek 3T3 w hodowli za pomocą automatycznego mikroinjektora Eppendorf. Następnie komórki inkubowano w 34°C i sfotografowano w regularnych odstępach dla śledzenia transformacji morfologicznych. Otrzymane wyniki pokazują, że 5 godz. od wstrzyknięcia Grb3-3 zasadnicza część komórek obumarła podczas gdy injekcja w tych samych warunkach Grb2 lub mutanta Grb3-3 (G162R) nie miała wpływu na zdolność komórek do życia.

(ii) Przeniesienie sekwencji kodującej proteinę rekombinacyjną.

Skonstruowano plazmid zawierający sekwencję SEQ ID nr 1 kodującą proteinę Grb3-3 pod kontrolą promotora niedojrzałego wirusa SV40.

Fibroblasty 3T3 o 40% złączenia transfekowano w obecności liposperminy (Transfectam, IBF-Sepracor) z 0,5 lub 2 pg tego plazmidu ekspresji. 48 godzin po transfekcji, 50% komórek było w zawiesinie w ośrodku, i komórki pozostające, przylegające do ścianki, przedstawiały bardzo ważne zmiany morfologiczne (fig. 4). Analiza za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym pokazała zresztą, że komórki przedstawiły schemat fragmentacji oligonukleosomalnego DNA charakterystyczny dla komórek martwych (fig. 4). W zamian, komórki, transfekowane w tych samych warunkach przez plazmid ekspresji Grb2, Grb3-3 (G162R) lub Grb2 (G203R) zachowują normalną morfologię, są wciąż zdolne do życia i nie przedstawiają żadnej fragmentacji DNA. Jak pokazano na fig. 4, współekspresja Grb2 pozwala na przeciwstawienie się wpływom Grb3-3.

Wyniki te pokazują jasno, że Grb3-3 tworzy gen-zabójcę zdolny do indukowania apoptozy komórkowej. Jak wskazano uprzednio, ta właściwość pozwala na szczególnie korzystne zastosowania w leczeniu patologii dających w wyniku proliferację komórkową, takich jak rak, restenoza, itp.

5. m^(o^co^ł^'i(^nLe ekspresji Grb3-3 w infekowanych przez wirus HIV.

Przykład ten wykazuje, że w trakcie cyklu infekcji limfocytów T przez wirus HIV, względna proporcja mRNA Grb2 i Grb3-3 jest modyfikowana, i że mesenger Grb3-3 jest nadeksprymowany w chwili masowej produkcji wirusów i śmierci komórki.

Limfocyty krwi obwodowej zainfekowano przez wirus HIV-1 w dwóch rozcieńczeniach (1/10 i 1/100) podczas 1, 4 lub 7 dni. mRNA komórek następnie zanalizowano przy użyciu odwróconego PCR za pomocą specyficznych oligonukleotydów Grb2 i Grb3-3 dla oznaczenia względnej proporcji mesadżerów Grb2 i Grb3-3. Zastosowano następujące specyficzne nukleotydy Grb3-3:

Oligonukleotyd IV (3'): ATCGTTTCCAAACGGATGTGGTTT (SEQ ID nr 8)

Oligonukleotyd V (5'): ATAGAAATGAAACCACATCCGTTT (SEQ ID nr 9)

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 5. Pokazują one wyraźnie, że 7 dni po infekcji wirusem HTV, mRNA Grb3-3 jest nad-eksprymowane. Jak pokazano przez dawkowanie proteiny p24 i odwrotnej transkryptazy wirusa, dzień 7 odpowiada również okresowi, w którym jest obserwowana masowa produkcja wirusów.

178 402 (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) SKŁADAJĄCY (A) NAZWA: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) ULICA: 20, avenue Raymond ARON (C) MIASTO: ANTONY (D) KRAJ: FRANCJA (E) KOD POCZTOWY: 92165 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Gen Grb3-3, jego warianty i ich wykorzystanie.

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 9 (iv) FORMA CZYTELNA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: dysk elastyczny (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Wersja #1.25 (OEB) (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 933 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iii) ANTY-SFNJSOWNA: NIE (vi) POCHODZENIE (A)ORGANIZM: Homo sapiens (ix) DODATKOWA CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ CDS (B) UMIEJSCOWIENIE: 37..567 (D) INNE INFORMACJE: /product = „Grb3-3” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:

GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54

Met Glu Ala Ile Ala Lys

5

TAT

GAC

TTC

AAA

GCT

ACT

GCA

GAC

CTG

AGC

TTC

AAA

AGG

GGG

Tyr

Asp

Phe

Lys

Ala

Thr

Ala

Asp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

10

15

20

GAC

ATC

CCC

AAG

<TTT

TTG

AACC

(GAA

GAA

TGT

GAT

CAG

AACC

TGG

TAC

AACG

Asp

Ile

Llu

Lys

Val

Leu

Asn

Glu

Cys

Asp

Gln

Asn

Trp

Tyr

Lls

102

150

178 402

GCA

GAG

CTT

AAT

GGA

AAA

GAC

GGC

TTC

ATT

CCC

ATG

AAC

TAC

ATA

GTA

198

Ala

Glu

Leu

Asn

Gly

Lys

Asp

Gly

Phe

Ile

Pro

Lys

Asn

Tyr

Ile

Glu

40

45

55

ATG

AAA

CCA

CAC

CCG

TTT

GGA

TAC

GAT

GTG

CAG

CAT

CTC

AAG

CGG

CCC

250

Met

Lys

Pro

His

Pro

Pho

Gly

Asn

Asp

vai

GG-n

Hin

PPh

Cls

Val

Llu

55

60

70

CGA

GAT

GGA

GCC

GGG

AAG

TAC

TTC

CTC

TGG

GTG

ATAG

TTC

AAAT

TCT

295

Arg

Asp

Gly

Ala

Gly

Lys

Tyr

Plie

Leu

Trp

Val

Lys

Phe

Asn

Ser

75

80

85

TTG

AAT

GAG

CTG

GTG

GAT

TAT

CAC

AGA

TCT

ACA

TCT

GTC

TCC

AGA

AAC

352

Leu

Asn

Glu

L eu

Val

A sp

Tyr

Arg

Ser

Thr

Ser

Val

Ser

Arg

AAsn

90

95

100

CAG

ATA

TTC

CTG

CGG

GAC

ATA

GATA

(CAG

GTG

CCA

CAG

CCG

ACA

390

Gln

Ile

Phe

Leu

Arg

Asp

Ile

Glu

Gln

Val

Pro

Gln

Pro

Thr

105

110

115

TAC

GTC

CAG

GCC

CTC

T TT

GAC

TTT

GAT

CCC

CAG

(GAG

GAT

GGA

GAG

CTG

538

Tyr

Val

Gln

AAi

Leu

P he

Asp

Phe

Asp

Pro

Gln

Glu

Asp

Gly

Glu

Leu

120

125

130

GGC

TTC

CGC

CGG

CGA

GAT

TTT

ATC

CAT

GTC

ATG

GAT

AAC

TdA

GAC

CCC

586

Gly

Phe

Arr

.Arr

Gly

A Ap

Phe

Ile

His

Val

Met

Asp

Asn

Ser

(Tsjp

Pro

135

140

145

150

178 402

AAT

TCC

TTC

AAA\

CCA

CTT

TGC

CAC

CCC

CAG

ATT

CCT ATG

TTT

<^(3C

CGC

554

Asn

Trp

TTr

Tys

Cly

Ala

Cys

His

Cly

Gln

Thr

Cly Met

Phe

Pro

Arg

155

160

165

AAT	TAT	GCT	ACC	TTT	CTC	AAC	CGG	AAT	TTT GGA.GGTCGAA GGACGCATGA	584
Asn	Tyr	Vaa	Thr	Pro	Val	Asn	Arg	Asn	Val

170 175

TTTAAAGAAA GTGAAAAATG TJTAACACAT ACAAAAGAAT TAAACCCACA AGCTGCCTCT 644

GACAGCAGCC TCTCGCCCGC TGCA6GCGCAC CTTCTTCCCT TGTTTTCTCG TCTCTTTTTT CTT

TCCTTCCGGT CCCAGCCCGT GGGAGGGGGC OC^CAC^A TGAACCCCCA ^C^AAT™ TTT

CAGATTAAGA ACCC^^TA TTATCTACrTT TTAGCTGCCG TTCCCCTCTC TCTCCCCTCC TTC τcccτττττc CTCTTCTGTC CCGCCGGCCA TCAGCGCCCA TGCCAGGCAG CTA

ACTCCTACCC GACGCCAATA MCAAGCCCGGC4 AAGCCAAAAA TCCCAGGTT 933 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: OLIGONUKLEOTYD (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:

ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad

178 402 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: OLIGONUKLEOTYD I (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:

GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTC (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: OLIGONUKLEOTYD II (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4:

GAATTCGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: OLIGONUKLEOTYD III (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 5:

GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGTC (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Proteina (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: PeptydhSOS1 (reszty 1143 do 1162) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 6:

Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg Arg

10 15

Pro Glu Ser Ala (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy

178 402 (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Protom (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: Peptyd 3BP1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 7:

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: OLIGONUKLEOTYD IV (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 8:

ATCGTTTCCA AACGGATGTG GTTT (2) INFORMACJA DLA SEQ ID nr 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) KONFIGURACJA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) POCHODZENIE (A) ORGANIZM: OLIGONUKLEOTYD V (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 9:

ATAGAAATGA AACCACATCC GTTT

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sekwencja nukleotydowa przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1.

2. Sekwencja nukleoitydowa przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitująca co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3.

3. Wektor zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1.

4. Wektor według zastrz. 3, znamienny tym, że stanowi go wektor wirusowy.

5. Wektor według zastrz. 4, znamienny tym, że stanowi go wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, wirusa adeno-asocjowanego (AAV), wirusa herpes (HSV), cytomegalowirusa (CMV) lub wirusa krowianki.

6. Wektor według zastrz. 5, znamienny tym, że stanowi go wektor pochodzący z wirusa defektywnego dla replikacji.

7. Wektor według zastrz. 3, zawierający sekwencję nukleotydową przedstawiona w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującąco najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3.

8. Wektor według zastrz. 7, znamienny tym, że stanowi go wektor wirusowy.

9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że stanowi go wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, wirusa adeno-asocjowanego (AAV), wirusa herpes (HSV), cytomegalowirusa (CMV) lub wirusa krowianki.

10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że stanowi go wektor pochodzący z wirusa defektywnego dla replikacji.

11. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii związanych z anormalną proliferacją komórkową, zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden wektor zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1, przy czym wektor ten stanowi wektor wirusowy, korzystnie wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, AAV, wirusa HSV, CMV lub wirusa szczepionki, albo z wirusa defektywnego dla replikacji.

12. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia związanych z anormalną proliferacją komórkową, zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden wektor zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującą co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3, przy czym wektor ten stanowi wektor wirusowy, korzystnie wektor pochodzący z adenowirusa, retrowirusa, AAV, wirusa HSV, CMV lub wirusa krowianki, albo z wirusa defektywnego dla replikacji.

13. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii, w których obserwuje się anormalną proliferację komórkową, zawierającą dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję -czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1, przy czyni ta sekwencja nukleotydowa jest w postaci skompleksowanej z DEAE-dekstranem, z proteinami jądrowymi lub z lipidami, samego DNA lub ponadto inkorporowanej w liposomy.

14. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia patologii, w których obserwuje się anormalną proliferację komórkową, zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującą co najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest w postaci skompleksowanej z DEAE-dekstranem, z proteinami jądrowymi lub z lipidami, samego DNA lub ponadto inkorporowanej w liposomy.

15. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia raka zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera

178 402 co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 lub co najmniej jeden wektor zawierający tę sekwencję.

16. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia raka zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynna zawiera co najmniej jedną sekwencję nukleotydową przedstawioną w sekwencji SEQ ID nr 1 inhibitującąco najmniej w części ekspresję proteiny Grb2 lub Grb3-3 lub co najmniej jeden wektor zawierający tę sekwencję.

17. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia AIDS zawierająca dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę oraz substancję czynną, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera związek eliminujący lub przeciwdziałający co najmniej częściowo efektom komórkowym Grb3-3.

18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że korzystne związki eliminujące lub przeciwdziałające co najmniej częściowo efektom komórkowym Grb3-3 stanowią antysensowe sekwencje genetyczne pochodzące z sekwencji nuklotydowej SEQ ID nr 1, lub szczególnie oligonukleotydy Grb3-3, lub cała sekwencja SEQ ID nr 1.

Wynalazek dotyczy sekwencji nukleotydowej, wektora zawierającego sekwencję nukleotydową i kompozycji farmaceutycznych. Różne geny, zwane onkogenami i genami supresorami, są związane z kontrolą podziału komórkowego. Wśród nich, geny ras i ich produkty zasadniczo określane jako proteiny p21, odgrywają kluczową rolę w kontroli proliferacji komórkowej u wszystkich organizmów eukariotycznych, w których je badano. Zwłaszcza, wykazano, że pewne szczególne modyfikacje tych protein prowadzą do utraty ich normalnej kontroli oraz do stania się onkogennymi. Zatem, znaczną liczbę nowotworów ludzkich powiązano z obecnością zmodyfikowanych genów ras. Również nadekspresja tych protein p21 może prowadzić do rozregulowania proliferacji komórkowej. Zrozumienie dokładnej roli protein p21 w komórkach, sposobu ich funkcjonowania i ich cech charakterystycznych stanowi zatem główny cel na drodze do zrozumienia kancerogenezy oraz do podejścia terapeutycznego do tego procesu.

Zidentyfikowano różne czynniki związane z kanałem sygnalizacji zależnej od ras. Między nimi znajduje się gen Grb2 kodujący proteinę o 23-25 kDa i o strukturze SH3-SH2-SH3 (Lowenstein i in., Cell 70 (1992) 431; Matuoka i in., PNAS 89 (1992) 9015). Wydaje się, że produkt genu Grb2 współdziała z fosforylowanymi proteinami tyrozynowymi, przez swoją domenę SH2, i z czynnikiem wymiany gDp klasy SOS, przez swoją domenę SH3 (Egan i in., Nature 363 (1993) 45). Byłaby to zatem jedna ze składowych aktywności transformującej produkty genu ras. Niniejszy wynalazek wiąże się zatem z potwierdzeniem, a następnie z klonowaniem i scharakteryzowaniem izoformy genu Grb2, oznaczanej Grb3-3, o delecji w domenie SH2. Gen ten ulega ekspresji w dojrzałych tkankach: odpowiadający temu mRNA jest obecny w tylko jednym paśmie o 1,5 kb i jest translowany w proteinę o 19 kDa. Odpowiednio do delecji w domenie SH2, produkt genu Grb3-3 nie jest już zdolny do oddziaływania z fosforylowanymi proteinami tyrozynowymi (fosforylowany receptor EGF), lecz zachowuje zdolność oddziaływania z domenami bogatymi w proteiny SOS. Stosownie do swojej delecji, produkt genu Grb3-3 jest zatem zdolny do przeciwdziałania efektom komórkowym produktu genowego Grb2. Przeniesienie tego genu in vivo, lub jego wariantów, włącznie z sekwencjami antysensownymi, pozwala zatem na zakłócenie procesów proliferacji, różnicowania i/lub śmierci komórek.