JP3794697B2 - Grb3−3遺伝子、その変異体およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
癌遺伝子およびサプレッサー遺伝子と呼ばれる様々な遺伝子が、細胞***の制御に関与している。その中でも、ras遺伝子および一般的にp21タンパク質と呼ばれるその産物は、調査されたすべての真核生物中で細胞増殖の制御において鍵となる役割を果たす。特に、これらのタンパク質のある特別な修飾がそれらに正常な制御を失わせ、そしてそれらを発癌性にする。このように多くのヒトの腫瘍は修飾されたras遺伝子の存在と関連している。同様に、これらp21タンパク質の過剰発現は細胞増殖の調節解除を導く。したがって、細胞中でのこれらp21タンパク質の正確な役割、それらの操作様式および特徴を理解することは、発癌現象の解明および治療的研究の主柱を構成するだろう。
ras−依存性発信経路に関与する種々の因子が同定された。それらの中には、SH3−SH2−SH3構造を有する23−25kDaのタンパク質をコードするGrb−2遺伝子がある(Lowensteinら、Cell 70(1992) 431;マツオカら、PNAS 89(1992)9015)。Grb−2遺伝子産物はチロシン リン酸化タンパク質とそのSH2ドメインを介して相互反応し、そしてそのSH3ドメインを介してSOSクラスのGDPの交換因子と相互反応するようである(Eganら、Nature 363(1993) 45)。したがってこれはras遺伝子産物の形質転換活性成分の1つであろう。本発明はGrb3−3と命名された、SH2ドメインに欠失を持つGrb−2遺伝子のアイソフォームのクローニングおよび特徴決定の実証から得られたものである。この遺伝子は成人組織で発現し、対応するmRNAが1.5kbの単一バンド状態で存在し、そして19kDaタンパク質に翻訳される。そのSH2ドメイン中の欠失のために、Grb3−3遺伝子産物は、もはやチロシン リン酸化タンパク質(リン酸化EGFレセプター)とは相互反応することができないが、SOSタンパク質のプロリン−リッチドメインと相互反応する能力を保持している。従ってその欠失のために、Grb3−3遺伝子産物はGrb2遺伝子産物の細胞効果を防ぐことができる。それ故にインビボでのこの遺伝子またはその変異体(アンチセンス配列を含む)の移入は、増殖、分化および/または細胞死の過程を妨害することを可能にする。
従って本発明の第一の主題は、Grb3−3遺伝子(配列番号1の配列)の全部または一部を含んで成るヌクレオチド配列に関する。
本発明の別の主題は、配列番号1の配列に由来し、かつGrb2またはGrb3−3タンパク質の発現を少なくとも部分的に抑制することができるヌクレオチド配列に関する。特に本発明は、標的細胞中での発現により細胞性mRNAの転写を制御することができるアンチセンス配列に関する。そのような配列は、欧州特許出願公開第140 308号明細書に記載されている技術に従い、例えば標的細胞中で細胞性mRNA Grb2またはGrb3−3に相補的なRNAに転写され、そしてこれらがそれらのタンパク質への翻訳を遮断する。そのような配列は逆方向に転写された配列番号1の配列の全部または一部の核酸配列から成ることができる。
上記に示したように、Grb2は少なくとも二官能性のタンパク質であり、そしてそのSH2ドメインを介して、チロシンでリン酸化された特異的な配列と連結し、かつ2つのSH3ドメインを介してSOS族の交換因子と連結する。Grb3−3はチロシンでリン酸化されたタンパク質と結合する能力を失っているので、SOSタンパク質とのみ複合体を形成することができる。したがってGrb3−3は、自己リン酸化増殖因子のレセプターにより、あるいはSHCまたはIRS1のようなチロシンでリン酸化される関連タンパク質により、Grb2−SOS複合体の補充を防ぐことができる。Grb3−3はこの補充を遮断することができるので、***促進経路を遮断し、そして細胞死を誘導することができる。出願人はまさにGrb3−3タンパク質が、例えばラット胸腺の成熟のような特定の生理学的過程中に発現したことを示した。出願人は、Grb3−3が様々な種類の細胞のアポトーシスにより細胞死を誘導できることも示した。これらの完全に有利な特性は(i)組換えタンパク質を3T3繊維芽細胞に注入することにより、および(ii)Grb3−3をコードする配列を3T3細胞に移入させることにより検出することができた(実施例4)。したがってGrb3−3は不滅化された癌または胚細胞のような生存能力のある細胞の細胞死を誘導することができる。実施例に示すように、Grb2はGrb3−3の効果を妨害することができる。
さらに、HIVウイルスのリンパ球細胞の感染中に起こるGrb3−3発現に関する研究で、感染細胞による感染7日後に観察される大規模なウイルス生産が、Grb3−3mRNAの過剰発現と相関することを示すことができた(実施例5)。この実験ではGrb3−3の細胞効果の排除または遮断で、特にHIVに感染した生存細胞を維持することを可能にし、そしてこれによりT4リンパ球が防御免疫の役割を果たし続けるようになることを示している。またこの点に関して、本発明はAIDS治療を目的とした医薬組成物の調製用にGrb3−3の細胞効果を少なくとも部分的に排除または遮断することができる化合物を使用することに関する。より詳細には、使用する化合物は:
−上記定義のような遺伝的アンチセンス配列、
−Grb3−3に特異的なオリゴヌクレオチドであり、修飾されているか、あるいはよりよい安定性またはバイオアベイラビリティー(ホスホロチオエート、挿入剤等)のものであってよい。それらは好ましくはN−末端SH3ドメインと残存SH2ドメインとの間に位置できるコーディング配列を網羅するオリゴヌクレオチドであることができ、
−感染した細胞への移入がGrb2の過剰発現を誘導する任意の配列であることができる。
本発明の核酸配列は、例えばヒトまたは動物に注射した後に、癌の予防または治療を誘導するように使用できる。特にそれらは国際公開第90/11092号明細書に記載された技術に従い、裸のDNA状態で注射することができる。それらはまた、例えばDEAE−デキストラン(Paganoら、J.Virol.1(1967)891)と、核タンパク質(カネダら、Science 243(1989) 375)と、脂質(Felgnerら、PNAS 84(1987) 7413)との複合体の状態で、リポソーム(Fraleyら、J.Biol.Chem.255(1980)10431)の状態等で投与されることもできる。
好ましくは本発明の核酸はベクターの部分を形成する。そのようなベクターの使用は、まさに処理すべき細胞中への核酸の投与を向上させることができ、そしてまた該細胞中での核酸の安定性を増大させることができ、これにより持続性の治療効果を得ることが可能になる。さらに、同じベクター中に数種の核酸配列を導入することもでき、これにより治療効力も増す。
使用するベクターは、動物細胞、好ましくはヒト腫瘍細胞を形質転換することができるかぎり、様々な起源であってよい。本発明の好適な態様では、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ−伴生ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ワクシニアウイルス等から選択できるウイルスベクターが使用される。ヘテテロガスな核酸配列を組込んだアデノウイルス、レトロウイルスまたはAAVに由来するベクターは、文献に記載されている[Akliら、Nature Genetics 3(1993) 224;Stratford-Perricaudetら、Human Gene Therapy 1(1990) 241;欧州特許出願公開第185 573号明細書、Levereoら、Gene 101(1991) 195;Le Gal la Salleら、Science 259(1993) 988;RoemerおよびFriedmann,Eur.J.Biochem.208(1992)211;Dobsonら、Neuron 5(1990)353;Chioccaら、New Biol.2(1990) 739;ミヤノハラら、New Biol.4(1992) 238;国際公開第91/18088号明細書]。
したがって本発明は、ゲノム中に挿入した上記定義の核酸配列を含んで成る任意の組換えウイルスにも関する。
有利には、本発明の組換えウイルスは欠陥ウイルスである。“欠陥ウイルス”という用語は、標的細胞中で複製できないウイルスを言う。したがって一般的に、本発明の範囲内で使用される欠陥ウイルスのゲノムは、感染細胞中で少なくとも該ウイルスの複製に必要な配列が欠けている。これらの領域は除去されるか(完全に、または部分的に)、あるいは非機能的にされるか、あるいは他の配列、特に本発明の核酸に置き換えられることができる。これにもかかわらず欠陥ウイルスは好ましくはそのゲノム中にウイルス粒子の夾膜化に必要な配列を保存している。
本発明の核酸配列をアデノウイルス、AAVまたは欠陥組換えレトロウイルスに組込んだ状態で使用することが特に有利である。
アデノウイルスに関して、構造および特性がかなり変化した様々な血清型が存在するが、これらはヒト、そして特に非免疫抑制個体に対して病原性ではない。さらに、これらのウイルスは感染した細胞のゲノムを組み込まず、そして外因DNAの巨大な断片を組み込むことができる。様々な血清型の中でも、2または5型アデノウイルス(Ad2またはAd5)が、本発明の枠内で好ましい。Ad5アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列はE1AおよびE1B領域である。
本発明の欠陥組換えウイルスは、欠陥ウイルスと、とりわけ上記定義のヌクレオチド配列を持つプラスミドとの間の相同組換えにより調製できる(Levreroら、Gene 101(1991) 195;Graham EMBO J.3(12)(1984) 2917)。相同組換えは、該ウイルスおよびプラスミドを適当な細胞系中に同時−トランスフェクションした後に生成される。使用する細胞系は組換えの危険性を回避するように、好ましくは組換え状態で(i)該要素により形質転換できるべきであり、そして(ii)欠陥ウイスルのゲノムの部分を相補できる配列を含むべきである。欠陥組換えアデノウイルスの調製に使用できる系の例として、特にそのゲノム中Ad5アデノウイルスのゲノムの左部を組み込んだ(12%)、ヒト胚腎臓系293(Grahamら、J.Gen.Virol.36(1977) 59)を挙げることができる。欠陥組換えレトロウイルスの調製に使用できる系の例として、CRIP系を挙げることができる(DanosおよびMulligan,PNAS 85(1988) 6460)。
次に操作したウイルスを従来の分子生物学的技術により回収し、そして精製する。
また本発明の主題は、少なくとも1つの上記定義の組換えウイルスまたはヌクレオチド配列を含む医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与等のために配合できる。
好ましくは医薬組成物は、場合によっては治療される腫瘍に直接注射することができる配合物として、医薬的に許容できる賦形剤を含む。これらは等張の滅菌された塩溶液(リン酸1ナトリウムまたは2ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等、あるいはそのような塩の混合物)、または乾燥、特に凍結乾燥した組成物であってよく、これらは場合に応じて滅菌水または生理塩溶液の添加時に、注射溶剤を構成することができる。
投与に使用される核酸(配列またはベクター)の投与量は、様々なパラメーターの関数として、そして特に使用する投与様式、関連する病因、発現する核酸に関連して、あるいは所望する治療期間に関連して調整することができる。一般的に本発明の組換えウイルスに関して、後者は104から1014pfu/ml、好ましくは106から1010pfu/mlの間の投与量の状態で配合され、そして投与される。pfuという用語は(“plaque forming unit:プラーク形成単位”)は、ウイルス溶液の感染力に相当し、そして適当な細胞カルチャーを感染させ、そして一般的に48時間後に感染細胞のプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定するための技術は文献に詳細に記載されている。
そのような医薬組成物は、特に癌の治療および/または予防のためにヒトに使用できる。特に、本発明の生成物はrasタンパク質の活性をモジュレートでき、それらは発癌過程に介入することが可能であり、そして特に形質転換体活性がp21−機能的GAP相互作用に依存する癌遺伝子の活性を抑制することができる。実に多くの癌が発癌性rasタンパク質と関係してきた。突然変異したras遺伝子を最もよく含む癌の中でも、特に膵臓の腺癌を挙げることができるが、この90%が第12番目のコドンが突然変異したKi−ras癌遺伝子を有し(Almoguera et coll 53(1988) 549)、結腸の腺癌および甲状腺癌(50%)、あるいは肺の癌腫および骨髄白血病(30%、Bos,J.L. Cancer Res.49(1989)4682)である。さらに一般的には本発明の組成物は、細胞の異常な増殖が観察される任意の種類の病因の治療にアポトーシスを誘導することにより、ならびにアポトーシスによる細胞死が特徴である任意の病因(AIDS、ハンチントン コレラ、パーキンソン)にGrb3−3の効果を遮断する化合物により(特にアンチセンス)使用できる。
本発明は以下の説明をするものであって制限するものではない実施例により、より完全に記載されている。
図の説明
図1:Grb2およびGrb3−3の構造ドメインの図解を表す。
図2:Grb3−3のEGFレセプター(図2a)およびプロリン−リッチペプチド(図2b)への結合実験。
図3:ポリオーマウイルスエンハンサー由来RREのrasによるトランス活性化に対する、Grb3−3の効果。
図4:3T3繊維芽細胞について、Grb3−3−誘導細胞死の実証。
図5:HIVウイルスに感染した細胞中のGrb3−3発現の実証。
一般的な分子生物学技法
プラスミドDNAの調製的抽出、プラスミドDNAの塩化セシウム勾配遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるDNA断片の精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール−クロロホルム抽出、塩媒質中でのDNAのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌の形質転換等の分子生物学で従来使用されている方法は、当業者は周知であり、文献に豊富に記載されている[Maniatisら、“モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル:Molecular Cloning,a Laboratory Manual”コールドスプリングハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールドスプリングハーバー、N.Y.,1982;Ausubel F.M.ら、(編集)、“分子生物学の最新の方法:Current Protocols in Molecular Biology”、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク、1987]。
pBR322およびpUC型のプラスミドならびにM13シリーズのファージは、市販されているものである(ベセスダリサーチラボラトリーズ:Bethesda Research Laboratories)。
ライゲーションのために、DNA断片をその大きさに従いアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、フェノールまたはフェノール−クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてファージT4 DNAリガーゼ(バイオラボズ:Biolabs)の存在下で、供給元の推薦に従いインキュベーションすることができる。
5’突出末端のフィリングは、大腸菌DNAポリメラーゼI(バイオラボズ)のクレノー断片で、供給元の仕様に従い行うことができる。3’突出末端の破壊は、ファージT4 DNAポリメラーゼ(バイオラボズ)の存在下で、製造元の推薦に従い行う。5’突出末端の破壊は、S1ヌクレアーゼで制御された処理により行う。
合成オリゴデオキシヌクレオチドによるin vitro部位特異的突然変異誘発法は、Taylorらによる方法[Nucleic Acids Res.13(1985)8749-8764]に従い、アマシャム(Amersham)により販売されているキットを使用して行うことができる。
いわゆるPCR法[Polymerase-catalysed Chain Reaction:ポリメラーゼ−触媒連鎖反応、Saiki R.K.ら、Science 230(1985)1350-1354;Mullis K.B.et Faloona F.A., Meth.Enzym.155(1987)335-350]によるDNA断片の酵素的増幅法は、“DNAサーマルサイクラー”(パーキンエルマーシータス:Perkin Elmer Cetus)を使用して、製造元の仕様に従い行うことができる。
ヌクレオチド配列の確認はSangerらにより開発された方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74(1977)5463-5467]により、アマシャムが市販しているキットを使用して行うことができる。
実施例
1.Grb3−3遺伝子の単離
Grb3−3遺伝子はヒトDNAライブラリーを、Grb2遺伝子の配列に由来するプローブでスクリーニングすることにより単離した。
ヒト胎盤ライブラリー(クローンテック:Clontech)由来のDNA断片を有する500,000のラムダgt11組換えファージを、Grb2遺伝子の配列に由来するプローブでスクリーニングした。使用したプローブはGrb2タンパク質の初めの8アミノ酸に相当し、以下の配列を有する:ATGGAAGCCATCGCCAAATATGAC(配列番号2)
10個の陽性クローンがこのようにして同定された。これらの10クローンの挿入物は、EcoRI断片の状態で単離され、プラスミドM13mp18にクローン化され、そして配列決定された。10個のクローンの中で、9個がGrb2配列と同一の挿入物を持っていた。その中の1つがSH2ドメイン中の欠失のためにGrb2遺伝子よりも小さいサイズの挿入物を持っていた(図1)。残りの配列の分析では、非コーディング5’および3’領域を含むGrb2の対応する領域と完全に同一であることが明らかとなった。このクローンのオープンリーディングフレームは177アミノ酸(配列番号1)のタンパク質をコードし、不完全なSH2ドメインを境界とするSH3ドメインを含む(図1)。SH2ドメイン中の欠失したアミノ酸(Grb2タンパク質の60から100残基)は、Grb2がリン酸化チロシンを含むペプチドに結合するのに関与する残基に対応する。
2.Grb3−3タンパク質の結合活性
上記に示したように、Grb2タンパク質はリン酸化増殖因子レセプターとSOS因子との間の相互反応のメディエーターである。この実施例では、Grb3−3タンパク質がリン酸化EGFレセプターとは相互反応できないが、ヒトSOS1因子の配列に由来するプロリン−リッチペプチドとは相互反応する能力を保持していることを実証する。
Grb3−3の結合能は、ビオチン化グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質を使用して研究した。この種の融合物は組換え生成物の迅速かつ効率的な精製を可能にする。そのために、本発明の配列は、SmithおよびJohnson[Gene 67(1988) 31]により記載された技法に従い、GSTとの融合タンパク質状態で大腸菌(E.coli)TG1株中で発現させた。簡単に述べると、Grb2およびGrb3−3遺伝子を、始めに開始および終止コドンの何れか側のBamHI部位に導入することにより修飾した。そのために、これら遺伝子のオープンリーディングフレームを以下のオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した:
下線部は、開始および終止コドンの後または前に作成されたBamHI部位に対応する。
このように増幅した遺伝子を、次に同じ酵素で直線化したベクターpGEX 2T(ファルマシア:Pharmacia)中にBamHI断片の状態で、GSTをコードするcDNAの3’および枠内にクローン化した。このようにして得たベクターを大腸菌TG1株を形質転換するために使用した。このように形質転換した細胞を37℃で一晩前培養し、1/10にLB培地で希釈し、発現を誘導するためにIPTGを補充し(2時間25℃)、そして約21時間、25℃で培養した。次に細胞を溶解し、そして生成した融合タンパク質をアガロース−GSHカラムでアフィニティー精製した。このために細菌溶解物をゲル(溶解緩衝液で準備および平衡化した)の存在下で15分間、4℃にてインキューベーションする。Tris-HCl緩衝液、pH7.4で3回洗浄した後、タンパク質を過剰量のGSTを含有するTris-HCl緩衝液、pH7.7の存在下で溶出する。上清を回収し、そして遠心する。
グリシン203がアルギニンに置換されたGrb2の突然変異体(Grb2G203R)、およびグリシンの162がアルギニンに置換されたGrb3−3の突然変異体(Grb3-3G162R)を調製するために、同じ手順を使用した。Grb2G203R突然変異体はもはやDNA合成の再開始の試験で活性を持たないと記載されている(Lowensteinら、同上)。Grb3-3G162R突然変異体は同じ位置に同じ突然変異を持ち、したがって不活性なはずである。
これらの突然変異体を、5’では上記のオリゴヌクレオチドIを、3’では以下のオリゴヌクレオチドIII(その突然変異コドンに下線を付した)を使用して、Grb2およびGrb3−3遺伝子についてPCRにより、突然変異誘発法で調製した:
このように増幅した断片を次に溶出し、オリゴヌクレオチドIおよびIIによりPCRで再増幅し、そしてベクターpGEX 2Tにクローン化した。次に突然変異体を上記のように作成した。
GST融合タンパク質(GST-Grb2、GST-Grb3-3、GST-Grb3-3G162RおよびGST)を、当業者に周知の従来法によりビオチン化し(一般的な分子生物学的手法ならびにMayerら、PNAS 88(1991)627に注意されたい)、そして固定化リン酸化EGFレセプター(2.1.)および次にhSOS1に由来するペプチド(2.2.)への結合を測定するプローブとして使用した。
2.1. リン酸化EGFレセプターへの結合
方法:使用するEGFレセプターを、Duchesneら(Science 259(1993)525)に記載された方法に従い、A431細胞からWGA-Sepharoseの固定化により精製した。このレセプター2μgを始めに1μMのEGFで10分間、22℃で刺激し、そして次に冷ATP(10μM)の有無で、2.5mM MnC12の存在下でHNTG緩衝液(20mM Hepes、150mM NaCl、0.1% Triton、10%グリセロール、pH=7.5)中で4℃にて2分間インキュベーションした。このレセプターのリン酸化を次に分解緩衝液を加えて停止させる。試料を4-20% SDS-PAGEゲルで処理し、そして次にポリビニリデン ジフルオリド膜(PVDF)に移す。次にブロットを様々なビオチン化GST融合物(2μg/ml)の存在下でインキューベーションし、そして次にアルカリ−ホスファターゼ結合ストレプトアビジン(プロメガ:Promega)により視覚化した。EGFレセプターもレセプターが確実にリン酸化されたことを確認するために、抗−ホスホチロシン抗体(抗−PY)の存在下でイムノブロッティングに供した。
結果:得られた結果を図2aに示す。それらは予想通り、Grb2タンパク質がEGFレセプターとリン酸化状態でのみ相互反応することを示している。それらはGrb3−3タンパク質がリン酸化の程度にかかわらずEGFレセプターに結合しないことも示している。
2.2. hSOS1に由来するペプチドへの結合
方法:以下の2つのプロリン−リッチペプチドを合成した:
hSOS1 ペプチド:GTPEVPVPPPVPPRRRPESA:このペプチドはhSOS1タンパク質の1143から1162残基に対応し(Liら、Nature 363(1993) 83)、Grb2とhSOS1の間の相互作用の原因である(配列番号6)。
3BP1ペプチド:PPPLPPLV:このペプチドは3BP1タンパク質に由来し、Ab1およびSrcのSH3ドメインに効率的に結合すると知られている(Cicchettiら、Science 257(1992) 803)(配列番号7)。
これら各々のペプチド(1μl、10mg/ml)をニトロセルロース膜に固定化した。この膜を次にブロッキング緩衝液中(20mM Tris、pH=7.6、150mM NaCl、0.1% Tween、3%ウシ血清アルブミン)でインキューベーションした。膜を次に4℃で一晩、様々なビオチン化GST融合物(4μg/ml)が存在する中でインキューベーションし、そして次にアルカリ−ホスファターゼ−結合ストレプトアビジン(プロメガ)で視覚化した。結果:得られた結果を図2bに示す。それらはGrb3−3がGrb2と同様に、hSOS1ペプチドに結合できることを示している。これらは、この結合が3BP1ペプチドでは観察されないので、この相互作用が特異的であることも示す。さらに、この結果はGrb3-3G162R突然変異体がもはやhSOS1ペプチドに結合できないことを示しており、このことはこの残基およびこの相互作用の機能的役割の重要性を確認するものである。
3.Grb3−3タンパク質の活性
この実施例では、SH2ドメイン中の欠失にもかかわらず、Grb3−3タンパク質が機能的効果を有することを実証する。
Grb3−3タンパク質の活性は、ras反応要素(RRE)を有し、かつレポーター遺伝子の発現を支配するプロモーターのトランス活性化のために、rasと協同する能力を測定することにより調査した。
使用した手法は、例えばSchweighofferら、Science 256(1992) 825に記載されている。簡単に述べると、使用したプロモーターはチミジンキナーゼ遺伝子のネズミプロモーターおよびポリオーマエンハンサー由来の4つの反復PEA1要素から成る合成プロモーター(Wasylykら、EMBO J.7(1988) 2475):Py−TKプロモーターである。このプロモーターは細菌遺伝子の場合にはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のレポーター遺伝子の発現を支配する:Py−TK−CATベクター。試験遺伝子の発現用のベクターを、該遺伝子をBamHI断片の状態でプラスミドpSV2のBga1II部位に挿入することにより構築した。この部位は遺伝子を初期SV40プロモーターの制御下に位置させることが可能である。
40%の集密度のER22細胞を、0.5μgのベクターPy-TK-CAT単独(Py)、あるいは初期SV40プロモーターの制御下に遺伝子(Grb2、2μg、GRb3、2μg、Grb2(G203R)、2μg、Grb3-3(G162R)、2μgまたはGrb3、2μg+Grb2、2μg)を有する発現ベクターの存在下でトランスフェクトした。各々の場合に、DNAの全量は、挿入物無しの発現ベクターと一緒に5μgに調整した。トランスフェクションはリポスペルミン(トランスフェクタム:Transfectam、IBF-Sepractor)の存在下で行った。細胞を48時間、0.5%のウシ胎児血清を補充したDMEM培地中の培養物で維持した。次にCAT活性(RREのトランス活性化)は、Wasylykら、(PNAS 85 (1988) 7952)により記載されているように測定した。
得られた結果を図3に示す。それらはGrb3−3タンパク質の発現が、増殖因子レセプターの活性化効果を防ぐことを明らかに示している。それらは過剰なGRb2が、Grb3−3の増殖因子への反応に対する効果を防ぐことも示す。
4.Grb3−3は細胞枯死を誘導する
この実施例は細胞アポトーシスにおけるGrb3−3の直接的関与を実証する。この特性は、細胞増殖(癌、再狭窄等)が原因の病気を治療するために特に有利な応用を提供する。
Grb3−3による細胞アポトーシスの誘導は、(i)組換えタンパク質を3T3繊維芽細胞に注入することにより、そして(ii)Grb3−3コーディング配列を3T3細胞に移入することにより示される。
(i)組換えタンパク質の注入
組換えGrb3−3タンパク質はGSTとの融合タンパク質状態で、実施例2に記載された方法に従い調製した。次にGST部分を分離するために、この融合タンパク質をトロンビン(0.25%、シグマ:Sigma)で処理し、そして次にmonoQカラムでイオン−交換クロマトグラフィーにより精製した。組換えタンパク質を含有する画分を次に100mMのNaClを含有する20mMリン酸緩衝液(pH7)中でMicrosep微量濃縮器(フィルトロン:Filtron)により濃縮した。このようにして得た精製タンパク質を培養した3T3細胞に自動エッペンドルフ(Eppendorf)マイクロインジェクターにより注入した(1から3mg/ml)。細胞を次に34℃でインキューベーションし、そして形態的形質転換を追うために定期的間隔で写真を取った。得られた結果は、Grb3−3の注入5時間後に、ほとんどの細胞が死んだが、同条件下のGrb2またはGrb3−3突然変異体(G162R)の注入は、細胞の生存能力に影響を及ぼさないことを示している。
(ii)組換えタンパク質をコードする配列の移入
SV40ウイルスの初期プロモーターの制御下に、Grb3−3タンパク質をコードする配列番号1の配列を含んで成るプラスミドを構築した。
40%の集密度の3T3繊維芽細胞を、リポスペルミン(トランスフェクタム、IBF-Sepractor)の存在下で、0.5または2μgのこの発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、50%のこの細胞が培地に懸濁しており、ならびに壁に付いている残りの細胞が大変実質的な形態的変化を表した(図4)。アガロースゲル電気泳動による分析ではさらに、死細胞に特徴的なオリゴ−ヌクレオソーム性DNA断片化を示した(図4)。これとは対照的に、同条件下でGrb2、Grb3−3(G162R)またはGrb2(G203R)発現プラスミドでトランスフェクトした細胞は、正常な形態を維持し、常に生存しており、そしてDNAの断片化を示していない。図4に示すように、Grb2の同時発現(co-expression)で、Grb3−3の影響を防止することが可能となる。
したがってこれらの結果は、Grb3−3が細胞アポトーシスを誘導できるキラー遺伝子を構成していることを明らかに示している。上記に示したように、これらの特性は特に癌、再狭窄のような細胞増殖が原因の病気を治療するために、特に有利な応用を提供する。
5.HIVウイルスに感染したリンパ球中でのGrb3−3発現の実証
この実施例は、HIVウイルスにTリンパ球が感染する周期中に、Grb2およびGrb3−3 mRNAの相対的比率が変化し、そしてGrb3−3メッセンジャーが、大量のウイルス生産および細胞死亡時に過剰発現することを示している。
末梢血リンパ球をHIV−1ウイルスで2種の希釈度(1/10および1/100)で、1、4または7日間感染させた。Grb2およびGrb3−3メッセンジャーの相対的比率を測定するために、Grb2およびGrb3−3に特異的なオリゴヌクレオチドで、逆−PCRにより細胞由来のmRNAを分析した。使用したGrb3−3特異的オリゴヌクレオチドは次のとおりである:
得られた結果を図5に示す。それらはHIVウイルスによる感染7日後に、Grb3−3 mRNAが過剰に発現していることを明らかに示している。p24タンパク質およびウイルス逆転写酵素をアッセイすることにより示すように、7日も大量のウイルス生産が観察される期間中に相当する。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:
(A)名前:ローヌ−プーラン ローラー エス.エー.
(B)通り:20、レイモンド アーロン通り
(C)市:アントニー
(E)国:仏国
(F)郵便番号:92165
(ii)発明の名称:Grb3−3遺伝子、その変異体およびそれらの使用
(iii)配列の数:9
(iv)コンピューター読み取り先:
(A)媒体の種類:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換型
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#1.0、バージョン#1.25(EPO)
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:933塩基対
(B)種類:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直線
(ii)分子型:cDNA
(iii)仮定:無し
(iii)アンチ−センス:無し
(iv)起源:
(A)生物:ホモサピエンス
(ix)特徴
(A)名前/キー:CDS
(B)位置:37...567
(D)他の情報:/生成物=“Grb3−3”
(xi)配列の記載:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
(B)種類:核酸
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(iv)起源:
(A)生物:オリゴヌクレオチド
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(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:39塩基対
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(i)配列の特徴:
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(xi)配列の記載:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:49塩基対
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(A)生物:オリゴヌクレオチドIII
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(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:20アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
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(ii)分子型:タンパク質
(iv)起源:
(A)生物:hSOS1ペプチド(1143−1162残基)
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(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:8アミノ酸
(B)種類:アミノ酸
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(ii)分子型:タンパク質
(iv)起源:
(A)生物:ペプチド3BP1
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(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:24塩基対
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(A)生物:オリゴヌクレオチドIV
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(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特徴:
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(A)生物:オリゴヌクレオチドV
(xi)配列の記載:配列番号9:
Claims (5)
- 配列番号1の配列に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含んで成るベクター。
- ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項2に記載のベクター。
- アデノウイルス、レトロウイルス、AAV、HSVウイルス、CMVまたはワクシニアウイルスに由来するベクターであることを特徴とする請求項3に記載のベクター。
- 複製しないウイルスであることを特徴とする請求項4に記載のベクター。
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