CN1133064A

CN1133064A - Grb3-3基因、其变体及它们的应用

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Publication number: CN1133064A
Application number: CN94193814A
Authority: CN
Inventors: F·斯克维霍福尔; B·托考伊
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1993-09-15
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 1996-10-09
Anticipated expiration: 2014-05-09
Also published as: PL313445A1; DE69426121D1; NO960965D0; HU9600668D0; CZ75896A3; AU698819B2; CZ288882B6; FI120499B; PL178402B1; HUT74273A; GR3034600T3; IL110942A; AU6724794A; NO319144B1; ATE196926T1; IL110942A0; HU221516B; KR100330477B1; RU2159815C2; CN1098930C

Abstract

本发明涉及一种称为Grb3-3的新基因、其变体，和它们的应用，特别是用于抗癌的基因治疗中。

Description

GRB3-3基因、其变体及它们的应用

本发明涉及一种称为Grb3-3的新基因，其变体及它们的应用，特别是在抗癌基因治疗中的应用。

称为致癌基因和抑制基因的多种基因与细胞***的调控有关。其中，ras基因和它们的产物(一般称为p21蛋白)在所有已研究的真核生物中对细胞增殖起关键作用。特别是已证明对这些蛋白的某些特异性修饰使其丧失正常的调控而导致其致癌性。例如，已显示许多人肿瘤与改变的ras基因的存在相关。同样，这些p21蛋白的过量表达引起细胞增殖失调。因此，对这些p21蛋白在细胞中的确切作用、功能方式和其特征的理解对致癌作用的理解和治疗方法起重要作用。

已鉴定出ras依赖性信号途径中涉及的多种因子。其中代表性的有Grb2基因，它编码一种具有SH3-SH2-SH3结构的23-25kDa的蛋白(Lowenstein等，Cell 70(1992)431；Matuoka等，PNAS 89(1992)9015)。Grb2基因的产物似通过其SH2区与酪氨酸上被磷酸化的蛋白相作用，而通过其SH3区与SOS类GDP交换因子相作用(Egan等，Nature 363(1993)45)。因而它是ras基因产物中具有转化活性的成分之一。本发明来自于对Grb2基因一种异型的克隆和鉴定，这种异型称为Grb3-3，在SH2区中有缺失。该基因在成体组织中表达：相应的mRNA呈现1.5kb的单一带，并被翻译成19kKa的蛋白。由于SH2区中的这种缺失，Grb3-3基因产物不再能与酪氨酸上被磷酸化的蛋白(磷酸化EGF受体)相作用，但其保留了与SOS蛋白的富脯氨酸区相作用的能力。由于这种缺失，Grb3-3基因的产物能够对抗Grb2基因产物的细胞效应。因而含有反义序列的这种基因或其变体的体内转移可干预细胞增殖、分化和/或死亡。

本发明的第一个目的涉及包含Grb3-3基因(SEQ ID No.1)之全部或部分的核苷酸序列。

本发明的另一目的涉及一种衍生自SEQ ID No.1序列并能够至少部分抑制Grb2或Grb3-3蛋白表达的核苷酸序列。更具体讲，本发明涉及其在靶细胞中的表达能调控细胞mRNA转录的反义序列。例如这种序列可按专利EP140308中描述的技术在靶细胞中转录成Grb2或Grb3-3细胞mRNA的互补RNA从而阻断它们翻译成蛋白。这种序列可由以相反方向转录的SEQ ID No.1核苷酸序列的全部或部分组成。

如上所述，Grb2是一种至少双功能性蛋白，其SH2区与酪氨酸上被磷酸化的特殊序列有关，而其两个SH3区与SOS族交换因子有关。已失去与酪氨酸上磷酸化的蛋白相结合能力的Grb3-3只能与SOS蛋白形成复合物。因而Grb3-3可通过自磷酸化生长因子的受体或通过与酪氨酸上同样磷酸化的有关蛋白如SHC或IRS1对抗Grb2-SOS复合物的形成。Grb3-3能够阻断这种形成，所以它能够阻断有丝***途径并诱发细胞死亡。实际上，申请人已证明Grb3-3蛋白在某些生理过程如大鼠胸腺成熟中被表达。申请人还证明Grb3-3能够通过不同细胞类型的细胞程序死亡(apoptose)诱发细胞死亡。这些特别有利的特性已通过(i)在成纤细胞3T3中注入该重组蛋白和(ii)向3T3细胞中转移编码Grb3-3的序列得以证明(实施例4)。因此，Grb3-3能够诱导活细胞如无限增殖化细胞、癌细胞或胚胎细胞的细胞死亡。如实施例中所示，Grb2能够对抗Grb3-3的效应。

另外，对HIV病毒感染淋巴细胞过程中进行的Grb3-3表达的研究表明：感染7天后观察到的大量病毒产生与感染细胞中Grb3-3 mRNA的过量表达相关(实施例5)。该试验表明消除或抑制Grb3-3的细胞效应还可允许感染细胞(特别是HIV感染)保持存活，从而使T4淋巴细胞继续发挥免疫防卫的作用。关于这一点，本发明还涉及能够消除或抑制至少部分Grb3-3细胞效应的化合物在制备用于治疗爱滋病的药物组合物中的用途。更具体讲，所用化合物可为：

——如上所定义的反义基因序列，

——Grb3-3的特异寡核苷酸，为得到更好的稳定性或生物利用度进行过改造或没有改造(硫代磷酸酯，***剂等)。优选包括位于SH3区N-末端和残余SH2区之间的编码序列的寡核苷酸。

——转移到感染细胞能诱导Grb2过量表达的所有序列。

本发明的这些序列可如此应用，例如给人或动物注射诱导一种保护作用或治疗癌。具体讲，它们可以裸DNA的形式按专利申请WO 90/11092中所述技术注射。它们还可以与例如DEAE-葡聚糖(Pagano等，J.Virol.1(1967)891)、与核蛋白(Kaneda等，Sci-ence243(1989)375)、与脂质(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)的复合物形式，以脂质体的形式(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等投药。

本发明的序列优选构成载体的一部分。应用这种载体实际上有助于核酸向待处理细胞中投送。还可提高其在所述细胞中的稳定性，从而得到持久的治疗效果。另外，可能在同一载体中引入多个核酸序列，这也可以提高治疗效力。

所用载体可以是各种来源的，只要它能转化动物细胞，优选人肿瘤细胞。在本发明的一种优选方案中，使用病毒载体，这可选自腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。在文献已描述了***外源核酸序列的来自腺病毒、逆转录病毒或AAV的载体〔Akli等，Nature Genetics 3(1993)224；Stratford-Perricaudet等，Human Gene Therapy 1(1990)241；EP185573，Levrero等，Gene 101(1991)195；Le GalLa Salle等，Science 259(1993)988；Roemer et Friedmann，Eur.J.Biochem.208(1992)211；Dobson等，Neuron 5(1990)353；Chiocca等，New Biol.2(1990)739；Miyanohara等，New Biol.4(1992)238；WO 91/18088〕。

因此，本发明还涉及含有***在其基因组中的如上定义的核酸序列的所有重组病毒。

本发明的重组毒最好是缺陷病毒。术语“缺陷”病毒指在靶细胞中不能够复制的病毒。一般地讲，用于本发明范围的缺陷病毒基因组至少缺少在感染细胞中所述病毒复制所必须的序列。这些区域可以或被消除(全部或部分)，或使得无功能，或被其他序列取代，特别是被本发明的核酸取代。该缺陷病毒优选仍保留其基因组的病毒颗粒衣壳化必须的序列。

以***缺陷重组的腺病毒、AAV或逆转录病毒的形式使用，本发明的核酸序列特别有利。

腺病毒存在不同的血清型，其结构和特性稍有不同，但对人都不是病原性的，特别是对那些非免疫低下的对象。另外，这些病毒不会整合在其所感染细胞的基因组中。在不同的血清型中，本发明范围内优选使用2或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。对于Ad5腺病毒而言，复制所需序列是E1A和E1B区。

可通过缺陷病毒和其中含有如上所定义的核苷酸序列的质粒间同源重组来制备本发明的缺陷重组病毒(Levrero等，Gene 101(1991)195；Graham，ENBO J.3(12)(1984)2917)。在所述病毒和质粒共转染到一种适当细胞系中后发生这种同源重组。所用细胞系优选应(i)可被所述元件转化，和(ii)含有能够补充该病毒基因组缺陷部分的序列，该序列优选是整合形式以避免重组的危险。作为可用于制备缺陷重组腺病毒的细胞系的例子，可举出人胚胎肾细胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1977)59)，在其基因组中整合有腺病毒Ad5基因组的左侧部分(12％)。作为可用于制备缺陷重组逆转录病毒的细胞系的例子，可举出CRIP细胞系(Danos et Mulli-gan，PNAS 85(1988)6460)。

然后，回收增殖后的病毒并按标准分子生物学技术纯比。

本发明的另一目的是至少含有一种如上所定义的重组病毒或核苷酸序列的药物组合物。

配制本发明的药物组合物，以通过表皮、口服、非胃肠道、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内等途径给药。

优选地，这些药物组合物含有用于可注射制剂的药用载体，可以是或不是直接注射在待治疗的肿瘤上。特别是无菌、等渗的盐水溶液(磷酸一钠、磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干组合物，特别是冻干品，可根据情况加入无菌水或生理血清将其制成注射溶液。

核酸(序列或载体)的给药剂量取决于不同的参数，特别是所用给药方法、有关的疾病、要表达的核酸、还有要求的治疗持续时间。一般地，本发明的重组病毒被配制成剂量为10⁴-10¹⁴pfu/ml，优选10⁶-10¹⁰pfu/ml的形式，并以此形式给药。术语“pfu”(空斑形成单位)相当于病毒溶液的感染能力，通过感染适当的细胞培养物、(一般48小时后)测量被感染细胞的空斑数目来测定。病毒溶液滴度pfu的测定技术在文献中有充分的说明。

这种药物组合物可用于人体以治疗和/或预防癌症。具体讲，能够调节ras蛋白活性的本发明产物可干预癌的发展过程，特别是它们可抑制如下致癌基因的活性，其中致癌基因的转化活性通过一种有效的p21-GAP作用而体现。实际上许多癌与致癌的ras蛋白的存在有关。这些癌通常含有突变的ras基因，例如胰腺癌、其90％含第十二密码子上突变的Ki-ras致癌基因(Almoguera et coll，Cell53(1988)549)，结肠腺癌和甲状腺癌(50％)，或肺癌和髓样白血病(30％，Bos，J.L.Cancer Res.49(1989)4682)。更广泛地讲，本发明组合物可通过诱导细胞程序死亡用于治疗所有其中观察到异常细胞增殖的疾病，以及通过阻断Grb3-3效应的化合物(特别是反义的)治疗所有以细胞程序死亡为特征的疾病(爱滋病、杭廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病)。

借助于以下实施例将更全面地描述本发明，这些实施例应视为说明性的而非限制性的。

附图说明图1：Grb2和Grb3-3的结构区域图示。

图2：Grb3-3与EGF受体的结合研究(图2a)和Grb3-3与富脯氨酸肽的结合研究(图2b)。

图3：Grb3-3对来自多瘤病毒增强子的RRE的ras反式激活的作用。

图4：显示Grb3-3诱导的成纤细胞3T3的细胞死亡。

图5：显示Grb3-3在HIV病毒感染的细胞中表达。

分子生物学的一般技术

用于分子生物学中的常规方法如质粒DNA的制备性提取、质粒DNA的氯化铯梯度离心、琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、电洗脱纯化DNA片段、苯酚或苯酚—氯仿提取蛋白质、在含盐介质中用乙醇或异丙醇沉淀DNA、在大肠杆菌中的转化等都是本领域技术人员所熟知的，并在文献中有充分的描述〔Maniatis T.等，“MolecularCloning，a Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spfring Harbor，N.Y.，1982；Ausubel F.M.等(eds)，“Cur-rent Protocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，NewYork，1987〕。

pBR322，pUC型质粒和M13系噬菌体是从市场上购得的(Bethesda Research Laborataries)。

为了连接，先将DNA片段用琼脂糖或丙烯酰胺电泳按其大小分离，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉淀，然后按照供应商的推荐方法在噬菌体T4的DNA连接酶(Biolabs)存在下孵育。

按照供应商的说明，用大肠杆菌的DNA聚合晦I的Klenow片段(Biolabs)对凸起的5’末端补平。按照制造商的推荐方法，在噬菌体T4的DNA聚合晦(Biolabs)存在下对凸起的3’末端进行破坏。凸起的5’末端经核酸酶S1仔细处理进行破坏。

利用合成的寡聚脱氧核苷酸的体外定向突变是用Amersham提供的试剂盒按Taylor等开发的方法〔Nucleic Acids Res.13(1985)8749-8764〕来进行的。

用所谓的PCR技术对DNA片段的酶法扩增〔Polymerase Cat-alyzed Chain Reaction，Saiki R.K.等，Science 230(1985)1350-1354；Mullis K.B和Faloona F.A，Meth.Enzym.155(1987)335-350〕可用“DNA thermal cycler”(Perkin Elmer Cetus)按制造商的说明进行。

用Amersham销售的检测试剂盒根据Sanger等研制的方法验证核苷酸序列。

实施例：

1.Grb3-3基因的分离

通过用Grb2基因衍化的探针筛选人DNA文库分离Grb3-3基因。

用Grb2基因序列衍化的探针筛选了500,000个带有来自人胎盘文库(Clontech)的DNA片段的重组噬菌体λgtll。所用探针相应于Grb2蛋白的头8个氨基酸，并具有以下序列：

ATGGAAGCCATCGCCAAATATGAC(SEQ ID n°2)

这样鉴定了10个阳性克隆。将这10个克隆的***序列以EcoRI片段的形式分离，克隆在质粒M13mp18中并测序。这10个克隆中，9个带有与Grb2序列相同的***序列。其中只有一个带有比Grb2基因短的***序列，因为在SH2区中有缺失(图1)。该残余序列的分析表明其与Grb2的相应区域完全相同，并含于5’和3’非编码区中。该克隆的开放读码框架编码177个氨基酸的蛋白(SEQID No.1)，包括2个与不完整的SH2区相邻的SH3区(图1)。在SH2区中缺失的氨基酸(Grb2蛋白的60-100残基)相当于Grb2与含磷酸化酪氨酸的肽结合的相关残基。

2.Grb3-3蛋白的结合活性

如上文所述，Grb2是磷酸化生长因子受体与SOS因子相互作用的介体。本实例证明Grb3-3蛋白不能与磷酸化EGF受体相作用，但它保留了与人SOS1因子序列衍化的富脯氨酸肽相作用的能力。

用生物素标记的与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的蛋白研究Grb3-3的结合能力。这种融合使得可以快速有效地纯化重组产物。为此，按照Smith和Johnson描述的技术〔Gene 67(1988)31〕在大肠杆菌菌株E.coli TG1中以与GST融合蛋白的形式表达本发明的序列。简单讲，首先双方都引入BamHI位点的起始和终止密码子对Grb2和Grb3-3基因进行修饰。为此，利用下述寡核苷酸通过PCR扩增了这些基因的开放读码框架：

寡核苷酸I(5′)(SEQ ID n°3)：

GAATTCGGATCCATGGAAGCCATCGCCAAATATGACTTC

寡核苷酸II(3′)(SEQ ID n°4)：

GAATTCGGATCCTTAGACGTTCCGGTTCACGGGGGTGAC

下划线部分相当于位于起始和终止密码子之后或之前的所造的BamHI位点。

将这样扩增后的基因以BamHI片段的形式克隆在用同一酶线性比的载体pGEX 2T(Pharmacia)中，位于3’和编码GST的cDNA区。这样得到的载体然后用于转化E.Coli TG1菌株。转化后的细胞在37℃预培养过夜，在LB介质中稀释至1/10，加入IPTG以诱导表达(2小时，25℃)，然后在25℃左右培养21小时。然后裂解细胞，并在Agarose-GSH柱上亲合层析纯化融合产物蛋白。为此，在凝胶(用溶菌缓冲液制备并平衡)存在下溶菌产物于4℃保温15分钟。用pH7.4的Tris-HCl缓冲液洗涤3次后，在含过量GST的pH7.7的Tris-HCl缓冲液存在下洗脱蛋白。收集上清液并离心。

用相同方法制备了其中甘氨酸203用一精氨酸取代的Grb2突变体(Grb2G203R)和其中甘氨酸162被一精氨酸取代的Grb3-3突变体(Grb3-3G162R)。据报道Grb2G203R突变体在DNA合成的再起始试验中不再有活性(Lowenstein等，同上)。Grb3-3G162R突变体在相同位置带有相同的突变，因此也应是无活性的。

这些突变体是在Grb2和Grb3-3基因上通过PCR诱变制备的，在5’使用如上所述的寡核苷酸I，在3’使用下述寡核苷酸III，其中在突变密码子下划线：

寡核苷酸.II(3′)(SEQ ID n°5)：GACGTTCCGGTTCACGGGGGTGACATAATTGCGGGGAAACATGCGGGTC

如此扩增的片段随后经洗脱、用寡核苷酸I和II再扩增，然后克隆在载体pGEX 2T中。随后如上所述产生这些突变体。

随后按本领域技术人员公知的常规技术将这些与GST融合的蛋白(GST-Grb2，GST-Grb3-3，GST-Grb3-3G162R及GST)用生物素标记(参见诸如Mayer等，PNAS 88(1991)627的分子生物学通用技术)，并用作探测物以测定与固定化磷酸化EGF受体的结合(2.1.)，然后测定与hSOS1衍化肽的结合(2.2.)。

2.1.与磷酸化EGF受体的结合

方法：通过按Duchesne等描述的技术(Science 259(1993)525)在WGA-Sepharose上固定化，从A431细胞纯化了EGF变体。首先用1μM EGF在22℃刺激2μg该受体10分钟，然后在HNTG缓冲液(20mM Hepes，150mM NaCl，0.1％Tritox，10％甘油，pH＝7.5)中2.5mM MnCl₂存在下于4℃与冷ATP(10μM)或无冷ATP时保温2分钟。然后通过加入降解缓冲液终止受体的磷酸化。随后将这些样品上样于4-20％SDS-PAGE凝酸上，再转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后将这些印迹在不同的生物素标记融合GST(2μg/ml)存在下孵育，再用与碱性磷酸酶偶联的链霉抗生素蛋白显现。EGF变体还在抗磷酸酪氨酸的抗体(anti-PY)存在下进行了免疫印迹分析，以证实变体被很好地磷酸化。

结果：所得结果显示于图2a中。正如所料，结果显示Grb2蛋白只与磷酸化形式的EGF变体作用。结果还显示Grb3-3蛋白不与EGF变体结合，无论其磷酸化程度如何。

2.2.与hSOS1衍生的肽结合

方法：合成了下列两种富含脯氨酸的肽：

hSOS1肽：GTPEVPVPPPVPPRRRPESA：该肽相应于hSOS1蛋白(Li等，Nature 363(1993)83)的1143-1162残基，负责Grb2和hSOS1间的相互作用(SEG ID No.6)。

3BP1肽：PPPLPPLV：这是衍生自3PP1蛋白的肽，已知其与Ab1和Src的SH3区有效地结合(Cicchetti等，Science 257(1992)803)(SEQ ID No.7)。

将每种这些肽(1μl，10mg/ml)固定在硝基纤维素膜上。然后膜在封闭缓冲液(Tris20mM pH7.6，150mM NaCl，0.1％Tween，3％牛血清白蛋白)中孵育。然后在不同的生物素标记融合GST(4μg/ml)存在下于4℃将这些膜保温过夜，再用与碱性磷酸酶偶联的链霉抗生物素蛋白(Promega)显现。

结果：所得结果显示于图2b中。结果表明，像Grb2一样，Grb3-3能够与hSOS1肽结合。结果还显示这种相互作用是特异性的，因为没有观察到与3BP1肽的任何结合。另外，结果还显示Grb3-3G1 62R突变体不再能与hSOS1肽结合，这证实了该残基的重要性和这种相互作用的功能作用。3.Grb3-3蛋白的活性

本实例证明：尽管在SH2区中有缺失，Grb3-3蛋白仍具有功能效应。

通过测定其与ras协作反式激活带有ras反应性元件(RRE)的、操纵报道基因表达的启动子的能力研究Grb3-3蛋白的活性。

使用例如在Schweighoffer等Science 256(1992)825中描述的方法。简言之，所用启动子是由胸苷激酶基因的鼠启动子和4个衍生自多瘤病毒增强子的重复PEA1元件组成的合成启动子(Wasylyk等，EMBO J.7(1988)2475)：启动子Py-TK。该启动子操纵报道基因的表达，在氯霉素乙酰转移酶(CAT)的细菌基因的情形下为载体PY-TK-CAT。用于表达待测基因的载体通过在质粒pSV2BglII位点以BamHI片段的形式***所述基因构建而得。该位点使得可将这些基因置于SV40早熟启动子的调控之下。

40％汇合度的ER22细胞仅用Py-TK-CAT载体(py)或在含有SV40早熟启动子控制下的下列基因的表达载体存在下转染：Grb2，2μg；Grb3-3，2μg；Grb2(G302R)2μg；Grb3-3(G162R)2μg；或Grb3-3，2μg＋Grb2，2μg。每种情况下，用无***基因的表达载体将DNA总量调节到5μg。在脂质精胺(Transfectam，IBF-Sepracor)存在下进行转染。将细胞在补有0.5％胎牛血清的DMEM介质中持续培养48小时。然后按Wasylyk等(PNAS 85(1988)7952)所述测定CAT活性(RRE的反式激活)。

所得结果示于图3中。结果清楚表明Grb3-3蛋白的表达对抗生长因子受体的激活作用。结果还表明过量的Grb2对抗Grb3-3对生长因子应答的效应。4.Grb3-3诱导的细胞程序死亡

本实例证明细胞程序死亡中直接牵连到Grb3-3。这一特性为细胞增殖造成的疾病(癌、resténose等)的治疗提供了特别有利的应用。

Grb3-3对细胞程序死亡的诱导作用已通过(i)将重组蛋白注入成纤细胞3T3中及(ii)将编码Grb3-3的序列转移到3T3细胞中得到证明。

(i)注射重组蛋白

按照实施例2中描述的方法以与GST融合的蛋白形式制备了重组Grb3-3蛋白。然后用凝血酶(0.25％，Sigma)处理该融合蛋白以去掉GST部分，然后在monoQ柱上进行离子交换层析而纯化。再用Microsep(Filtron)微浓缩器在含100mM NaCl的20mM(pH7)磷酸缓冲液中浓缩含重组蛋白的部分。用Eppendorf原子微注射器将这样得到的纯化蛋白注射(1-3mg/ml)到培养中的3T3细胞中，然后于34℃培养细胞，并以规则间隔照像以跟踪其形态转变。所得结果表明注射Grb3-35小时后，大部分细胞死亡，而在相同条件下注射Grb2或Grb3-3(G162R)突变体对细胞的存活力没有任何影响。

(ii)转移编码重组蛋白的序列

构建了一种包含SEQ ID No.1序列的质粒，该序列编码Grb3-3蛋白，并处在SV40病毒的早熟启动子控制之下。

汇合度40％的成纤细胞3T3在脂质精胺(Transfectam，IBF-Sepracor)存在下用0.5或2μg这种表达质粒转染。转染48小时后，50％的细胞悬浮在介质中(其余细胞粘附在壁上)，并呈现很大的形态变化(图4)。另外通过琼脂糖凝胶电泳的分析证明：这些细胞呈现死亡细胞的特征性寡核小体DNA断裂图谱(图4)。相反，在相同条件下用Grb2，Grb3-3(G162R)或Grb2(G203R)的表达质粒转染的细胞保持正常形态，一直存活及不呈现任何DNA断裂。如图4所示，Grb2的共同表达可对抗Grb3-3的效果。

因此，所得结果清楚表明，Grb3-3构成一种能够诱导细胞程序死亡的杀伤基因。如上所述，这一特性为细胞增殖造成的疾病(例如特别是癌，resténose等)的治疗提供了特别有利的应用。

5.证明Grb3-3在HIV病毒感染的淋巴细胞中表达

本实例显示：在HIV病毒对T淋巴细胞的感染周期中Grb2和Grb3-3的mRNA的相对比例有变化，在大量病毒产生时和细胞死亡时Grb3-3的信使被过量表达。

外周血液淋巴细胞用两个稀释度(1/10和1/100)的HIV-1病毒感染1、4或7天。然后用Grb2和Grb3-3的特异寡核苷酸通过逆转录PCR分析了细胞的mRNA，以确定Grb2和Grb3-3信使的相对比例。所用的对Grb3-3特异的寡核苷酸如下：

寡核苷酸IV(3′)：ATCGTTTCCAAACGGATGTGGTTT(SEQ ID n°8)

寡核苷酸V(5′)：ATAGAAATGAAACCACATCCGTTT(SEQ ID n°9)

所得结果示于图5中，结果清楚表明HIV病毒感染7天后Grb3-3的mRNA过量表达。如p24蛋白和病毒的逆转录酶的定量所示，第7天也相应于观察到大量病毒产生的时期。

序列表(1)一般信息：(i)申请人

(A)名称：RHONE-POULENC S.A

(B)街道：20，avenue Raymond ARON

(C)城市：ANTONY

(E)国家：法国

(F)邮政编码：92165(ii)发明题目：Grb3-3基因、其变体及它们的应用(iii)序列数：9(iv)计算机可读形式：

(A)载体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release^#1.0，Version^#1.25(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：933个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：双链

(D)外形：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：非(iii)反义：非(vi)来源：

(A)生物体：Homo Sapiens(ix)其他特征：

(A)名称/关链词：CDS

(B)位置：37..567

(D)其他资料：/产物＝“Grb3-3”(xi)序列描述：SEQ ID No：1：GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54

Met Glu Ala Ile Ala Lys

1 5TAT GAC TTC AAA GCT ACT GCA GAC GAC GAC CTG AGC TTC AAA AGG GGG 102Tyr Asp Phe Lys Ala Thr Ala Asp Asp Asp Leu Ser Phe Lys Arg Gly

10 15 20GAC ATC CTC AAG GTT TTG AAC GAA GAA TGT GAT CAG AAC TGG TAC AAG 150Asp Ile Leu Lys Val Leu Asn Glu Glu Cys Asp Gln Asn Trp Tyr Lys

25 30 35GCA GAG CTT AAT GGA AAA GAC GGC TTC ATT CCC AAG AAC TAC ATA GAA 198Ala Glu Leu Asn Gly Lys Asp Gly Phe Ile Pro Lys Asn Tyr Ile Glu

40 45 50ATG AAA CCA CAT CCG TTT GGA AAC GAT GTG CAG CAC TTC AAG GTG CTC 246Met Lys Pro His Pro Phe Gly Asn Asp Val Gln His Phe Lys Val Leu55 60 65 70CGA GAT GGA GCC GGG AAG TAC TTC CTC TGG GTG GTG AAG TTC AAT TCT 294Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp Val Val Lys Phe Asn Ser

75 80 85TTG AAT GAG CTG GTG GAT TAT CAC AGA TCT ACA TCT GTC TCC AGA AAC 342Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser Thr Ser Val Ser Arg Asn

90 95 100CAG CAG ATA TTC CTG CGG GAC ATA GAA CAG GTG CCA CAG CAG CCG ACA 390Gln Gln Ile Phe Leu Arg Asp Ile Glu Gln Val Pro Gln Gln Pro Thr

105 110 115TAC GTC CAG GCC CTC TTT GAC TTT GAT CCC CAG GAG GAT GGA GAG CTG 438Tyr Val Gln Ala Leu Phe Asp Phe Asp Pro Gln Glu Asp Gly Glu Leu

120 125 130GGC TTC CGC CGG GGA GAT TTT ATC CAT GTC ATG GAT AAC TCA GAC CCC 486Gly Phe Arg Arg Gly Asp Phe Ile His Val Met Asp Asn Ser Asp Pro135 140 145 150AAC TGG TGG AAA GGA GCT TGC CAC GGG CAG ACC GGC ATG TTT CCC CGC 534Asn Trp Trp Lys Gly Ala Cys His Gly Gln Thr Gly Met Phe Pro Arg

155 160 165AAT TAT GTC ACC CCC GTG AAC CGGAAC GTC TAAGAGTCAAGAAGCAATTA 584Asn Tyr Val Thr Pro Val Asn Arg Asn Val

170 175TTTAAAGAAA GTGAAAAATG TAAAACACAT ACAAAAGAAT TAAACCCACA AGCTGCCTCT 644GACAGCAGCC TGTGAGGGAG TGCAGAACAC CTGCCGGGTC ACCCTGTGAC CCTCTCACTT 704TGGTTGGAAC TTTAGGGGGT GGGAGGGGGC GTTGGATTTA AAAATGCCAA AACTTACCTA 764TAAATTAAGA AGAGTTTTTA TTACAAATTT TCACTGCTGC TCCTCTTTCC CCTCCTTTGT 824CTTTTTTTTC TTCCTTTTTT CTCTTCTGTC CATCAGTGCA TGACGTTTAA GGCCACGTAT 884AGTCCTAGCT GACGCCAATA AAAAACAAGA AACCAAAAAA CCCGAATTC 933

(2)SEQ ID No：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)外形：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源

(A)生物体：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID No：2：

ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC(2)SED ID No：3的信息： (i)序列特征：

(A)长度：39个碱在对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)外形：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源

(A)生物体：寡核苷酸I(xi)序列描述：SEQ ID No：3：GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTC(2)SEQ ID No：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)外形：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源

(A)生物体：寡核苷酸II(xi)序列描述：SEQ ID No：4：

GAATTCGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC(2)SEQ ID No：5的信息： (i)序列特征：

(A)长度：49个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)外形：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源

(A)生物体：寡核苷酸Ⅲ(xi)序列描述：SEQ ID No：5：GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGTC(2)SEQ ID No：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)外形：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)来源：

(A)生物体：hSOS1肽(1143-1162残基)(xi)序列描述：SEQ ID No：6：Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15Pro Glu Ser Ala

20 (2)SEQ ID No：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)外形：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：3BP1肽

(xi)序列描述：SEQ ID No：7：

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val

1 5(2)SEQ ID No：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)外形：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)来源

(A)生物体：寡核苷酸IV

(xi)序列描述：SEQ ID No：8：

ATCGTTTCCA AACGGATGTG GTTT(2)SEQ ID No：9的信息：(i)序列特征：(A)长度：24个碱基对(B)类型：核酸(C)链数：单链(D)外形：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源

(A)生物体：寡核苷酸V(xi)序列描述：SEQ ID No：9：

ATAGAAATGA AACCACATCC GTTT

Claims

1.包含SEQ ID No.1序列之全部或部分的核苷酸序列。

2.衍生自SEQ ID No.1序列并能够至少部分抑制Grb2或Grb3-3蛋白表达的核苷酸序列。

3.含有一种权利要求1或2的核苷酸序列的载体。

4.根据权利要求3的载体，其特征在于它是一种病毒载体。

5.根据权利要求4的载体，其特征在于它是一种衍生自腺病毒、逆转录病毒、AAV、HSV病毒、CMV或痘苗病毒的载体。

6.根据权利要求4或5的载体，其特征在于它是一种复制缺陷的病毒。

7.含有权利要求3-6之一的一种或多种载体的药物组合物。

8.含有权利要求1或2的一种或多种核苷酸序列的药物组合物，该核苷酸序列呈现与DEAE-葡聚糖、与核蛋白或与脂质的复合物形式，未加工形式与脂质体结合的形式。

9.权利要求1或2的一种序列或含有所述序列的一种载体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。

10.能够至少部分消除或抑制Grb3-3细胞效应的化合物在制备用于治疗爱滋病的药物组合物中的用途。