CZ288882B6 - Polynukleotid, antimediátorový polynukleotid, polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotidem, vektor obsahující uvedený polynukleotid, farmaceutická kompozice obsahující uvedený polynukleotid nebo antimediátorový polynukleotid nebo polypeptid nebo vektor a jejich použití pro přípravu farmaceutické kompozice - Google Patents

Abstract

eÜen je zalo eno na nalezen nov ho genu ozna en ho jako Grb3-3 a t²k se polynukleotidu, kter² obsahuje cel² gen Grb3-3 nebo jeho st, odpov daj c ho antimedi torov ho polynukleotidu, polypeptidu k dovan ho uveden²m polynukleotidem, vektoru obsahuj c ho uveden² polynukleotid, farmaceutick kompozice obsahuj c uveden² polynukleotid nebo uveden² antimedi torov² polynukleotid nebo uveden² polypeptid nebo uveden² vektor a jejich pou it pro p° pravu farmaceutick kompozice, ur en pro l en rakoviny a AIDS.\

Description

Oblast techniky

Vynález je založen na nalezení nového genu Grb3-3 a týká se takto polynukleotidu, který obsahuje celý gen Grb3-3 nebo jeho část, odpovídajícího antimediátorového polynukleotidu, polypeptidu kódovaného uvedeným polynukleotidem, vektoru obsahujícího uvedený polynukleotid, farmaceutické kompozice obsahující uvedený polynukleotid nebo uvedený antimediátorový polynukleotid nebo uvedený polypeptid nebo uvedený vektor, a jejich použití pro přípravu uvedené farmaceutické kompozice.

Dosavadní stav techniky

Při regulaci buněčného dělení se uplatňují různé geny, které se nazývají onkogeny a supresorové geny. Z těchto genů lze uvést geny ras a jejich produkty obecně označované jako proteiny p21, které hrají klíčovou roli při regulaci buněčné proliferace u všech eukaryotických organismů, ve kterých byly zkoumány. Zejména bylo prokázáno, že některé specifické modifikace těchto proteinů ztrácí normální regulační schopnost a stávají se onkogenními. Takto má velký počet lidských nádorů souvislost s výskytem modifikovaných genů ras. Stejně tak může nadměrná exprese těchto proteinů vést k poruchám v buněčné proliferaci. Pochopení přesné úlohy těchto proteinů p21 v buňkách, mechanismu jejich funkce a jejich charakteristik tedy představují základní kameny pro pochopení kancerogeneze a pro stanovení farmaceutického přístupu k léčení rakoviny.

V rámci ras-dependentní signální dráhy byly identifikovány různé vektory. Mezi těmito faktory figuruje gen Grb2, který kóduje protein s 23-25 kDa mající strukturu SH3-SH2-SH3 (Lowenstein a kol., Cell 70 (1992) 431; Matuoka a kol., PNAS 89 (1992) 9015). Zdá se, že produkt genu Grb2 vstupuje v interakci s tyrosin-fosorylovanými proteiny svou doménou SH2 a s výměnným faktorem GDP třídy SOS dvou doménou SH3 (Egan a kol., Nátuře 363 (1993)45). Tento produkt by byl takto jednou ze složek transformační aktivity produktu genu ras. Vynález je výsledkem prokázání, klonování a charakterizace izoformy genu Gsb2, označované jako Grb3-3 a mající deleci v doméně SH2. Tento gen je exprimován v dospělých tkáních: odpovídající RNAm je přítomna v jediném řetězci o délce 1,5 kb, a je translací konvertován na protein s 19 kDa. Vzhledem kjeho deleci v doméně SH2 není již produkt genu schopen interakce s tyrosin-fosforylovanými proteiny (fosforylovaný receptor EGF), i když si zachovává schopnost interakce s doménami bohatými na prolin proteinů SOS. Z důvodu uvedené delece je produkt genu Grb3-3 takto schopen opozice vůči buněčným účinkům produktu genu Grb2. Přenos tohoto genu in vivo nebo jeho variant, včetně antimediátorových sekvencí tudíž umožňuje interferenci s proliferačními nebo diferenciačními procesy nebo/a s procesy buněčné smrti.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je polynukleotid kódující polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ idč. 1.

Předmětem vynálezu je rovněž výše uvedený polynukleotid obsahující nukleotid 37 až 564 sekvence SEQ ID č. 1.

Předmětem vynálezu je rovněž antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého výše uvedeného polynukleotidu nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expresi Grb2.

Předmětem vynálezu je rovněž antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého výše uvedeného polynukleotidu nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expresi Grb3-3.

Předmětem vynálezu je rovněž polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 1.

Předmětem vynálezu je rovněž vektor obsahující výše uvedený polynukleotid.

Výhodně je uvedeným vektorem virový vektor. Výhodně se uvede virový vektor vektorem odvozeným od adenovirů, retrovirů, přidružených adenovirů, viru herpes, cytomegaloviru nebo viru kravských neštovic. Výhodně je uvedeným virem replikačně defektní vir.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá vtom, že obsahuje výše uvedený polynukleotid nebo výše uvedený vektor nebo výše uvedený antimediátorový polynukleotid nebo výše uvedený polypeptid.

Předmětem vynálezu je konečně použití výše uvedeného polynukleotidu nebo výše uvedeného antimediátorového polynukleotidu nebo výše uvedeného vektoru nebo výše uvedeného polypeptidu pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakoviny a použití výše uvedeného antimediátorového polynukleotidu schopného inhibovat expresi Grb3-3 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení AIDS.

Polynukleotid odvozený od sekvence SEQ ID č. 1 je schopen inhibovat alespoň částečně expresi proteinu Grb2 nebo Grg3-3. Vynález se zejména týká antimediátorových sekvencí, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat přepis buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na komplementární RNA buněčných mRNA Grb2nebo Grb3-3 a blokovat takto jejich translaci na protein technikou popsanou v evropském patentu EP 140 308. Takové sekvence mohou být tvořeny celou nukleovou sekvencí SEQ ID č. 1, přepsanou v inverzní orientaci, nebo její částí.

Jak již bylo uvedeno výše, je Grb2 alespoň bifunkčním proteinem vázajícím se svou doménou SH2 ke specifickým sekvencím fosforylovaným na tyrosinu a svými dvěma doménami SH3 k výměnným faktorům skupiny SOS. Grb3-3, který ji ztratil svou schopnost vázat se na proteiny fosforylované na tyrosinu, může tedy výlučně tvořit komplex s proteiny SOS. Grb3-3 může tedy oponovat tvorbě komplexu Grb2-SOS receptory autofosforylovaných růstových faktorů nebo přidruženými proteiny rovněž fosforylovanými na tyrosinu, jakými jsou SHC nebo IRS1. Grb3-3, který je schopný blokovat tuto tvorbu, je způsobilý blokovat mitogenní cesty a způsobit buněčnou smrt. Přihlašovatel skutečně prokázal, že protein Grb3-3 je exprimován v průběhu některých fyziologických procesů, jakým je například maturace brzlíku u krysy. Přihlašovatel rovněž prokázal, že Grb3-3 je schopen přivodit buněčnou smrt apoptózou různých buněčných typů. Tyto naprosto výhodné vlastnosti mohly být prokázány i) injekcí rekombinantního proteinu do fibroblastů 3T3 a ii) přenosem sekvence kódující Grb3-3 v buňkách 3T3 (příklad 4). Grb3-3 je tedy schopen indukovat buněčnou smrt životných buněk, jakými jsou imortalizované, rakovinové nebo embryonální buňky. Jak je to prokázáno v příkladech, je Grb2 schopen opanovat účinkům Grb3-3.

Výzkum exprese Grb3 provedený v průběhu infekce lymfocytních buněk virem HIV umožnil prokázat, že masivní virální produkce pozorovaná 7 dní po infekci je korelovaná nadměrnou expresí RNAm Grb3-3 infikovanými buňkami (příklad 5). Tento experiment rovněž prokázal, že eliminace nebo opozice buněčných účinků Grb3-3 může rovněž umožnit zachování naživu infikovaných buněk, a to infikovaných zejména virem HIV, a takto umožnit lymfocytům T4

-2CZ 288882 B6 pokračovat v jejich úloze při imunitní ochraně. V tomto ohledu se vynález rovněž týká použití sloučenin schopných eliminovat nebo redukovat alespoň částečně buněčné účinky Grb3-3 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení AIDS. Zejména použitými sloučeninami mohou být:

- genetické antimediátorové sekvence, jaké jsou definovány výše,

- specifické oligonukleotidy Grb3-3, nemodifikované nebo modifikované za účelem lepší stability nebo biologické dostupnosti (fosforothioáty, interkalační činidla, atd.). Výhodně se může jednat o oligonukleotidy pokrývající kódující sekvenci lokalizovanou mezi N-terminální doménou SH3 a reziduální doménou SH2,

- libovolná sekvence, jejíž přenos do infikovaných buněk indukuje nadměrnou expresi Grb2.

Nukleové sekvence podle vynálezu mohou být použity jako takové, například pro injekci člověka nebo zvířeti za účelem indukování ochrany proti rakovině nebo za účelem léčení rakoviny. Tyto sekvence mohou být zejména injikovány ve formě samotné DNA technikou popsanou v přihlášce WO 90/11092. Tyto sekvence mohou být rovněž podány ve formě komplexu, například komplexu s DEAE-dextranem (Pagano a kol.. J. Virol. 1(1967) 891), s jádrovými proteiny (Kaneda a kol., Science 243 (1989) 375), s lipidy (Felgner a kol., PNAS 84 (1987)7413), ve formě liposomů (Fraley a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd.

Výhodně tvoří nukleové sekvence podle vynálezu součást vektoru. Použití takového vektoru ve skutečnosti umožňuje zlepšit podání nukleové kyseliny do buněk, které mají být léčeny, a rovněž zlepšit její stabilitu v uvedených buňkách, což umožňuj dosáhnout trvalého terapeutického účinku. Kromě toho je možné zavést do jednoho a téhož vektoru několik sekvencí nukleové kyseliny, což rovněž zvyšuje účinnost léčení.

Použitý vektor může být rozličného původu, pokud je schopen transformovat živočišné buňky, výhodně lidské nádorové buňky. V rámci výhodného provedení způsobu podle vynálezu se používá virový vektor, který může být zvolen z množiny zahrnující adenoviry, retroviry, přidružené adenoviry (AAV), vir herpes, cytomegalovir (CMV), vir kravských neštovic, atd. Vektory odvozené od adenovirů, retrovirů nebo přidružených adenovirů s inkorporovanými sekvencemi heterologních nukleových kyselin byly popsané v četné odborné literatuře /Akli a kol., Nátuře Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet a kol., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; Le Gal Ia Salle a kol., Science 259 (1993) 988; Roemer a Friedmann, Eur. J. Biochem 208 (1992) 211; Dobson a kol., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca a kol., New Biol. 2(1990) 739; Miyanohara a kol., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/1808/.

Vynález se rovněž týká libovolného rekombinantního viru, který obsahuje ve svém genomu vloženou výše definovanou nukleovou sekvenci.

Výhodně je rekombinantním virem podle vynálezu defektní vir. Výraz „defektní vir“ zde označuje vir, který je schopen replikace v cílové buňce. Obecně je genom defektního viru použitého v rámci vynálezu zbaven alespoň sekvencí, které jsou nezbytné pro replikaci uvedeného viru v cílové buňce. Tyto oblasti mohou být buď eliminovány (zcela nebo částečně), nebo mohou být učiněny nefunkčními, nebo mohou být nahrazeny jinými sekvencemi a zejména nukleovou kyselinou podle vynálezu. Výhodně si defektní vir nicméně zachovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Je obzvláště výhodné použít nukleové sekvence podle vynálezu ve formě přidružené k defektnímu adenovirů, přidruženému adenovirů (AAV) nebo rekombinantnímu retrovirů.

Pokud jde o adenoviry, existují různé sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, přičemž tyto sérotypy nejsou pro člověka patogenní a zejména nejsou patogenní pro subjekt s nedeprimovanou imunitní odezvou. Tyto viry se ostatně neintegrují do genomu

-3CZ 288882 B6 buněk, které infikují, a mohou inkorporovat důležité fragmenty exogenní DNA. Z těchto rozličných sérotypů se přednostně v rámci vynálezu používají adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5). V případě adenovirů Ad 5 jsou oblastmi nezbytnými pro replikaci oblasti El A aElB.

Defektní rekombinantní viry podle vynálezu mohou být připraveny homologní rekombinací mezi defektním virem a plazmidem nesoucím mimo jiné výše definovanou nukleotidovou sekvenci (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984)2917). Ktéto homologní rekombinací dojde po kotranfekci uvedených virů a plazmidů v příslušné buněčné řadě. Použitá buněčná řada výhodně musí být transformovatelná uvedenými prvky a musí obsahovat sekvence schopné komplementovat část genomu defektního viru, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo rizikům rekombinace. Jako příklad použitelné buněčné řady pro přípravu defektních rekombinantních adenovirů lze uvést buněčnou řadu 293 z ledviny lidského zárodku (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje integrované ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %). Jako příklad buněčné řady použitelné pro přípravu defektních rekombinantních retrovirů lze uvést buněčnou řadu CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).

Multiplikované viry se potom izolují a přečistí klasickými technikami molekulární biologie.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice obsahující alespoň jeden rekombinantní vir nebo nukleotidovou sekvenci, které byly definovány výše.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány do vhodné galenické formy pro topické, perorální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulámí a jiné podání.

Výhodně tyto farmaceutické kompozice obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče pro injikovatelnou formulaci, případě aplikovanou přímo do léčeného nádoru. Zejména se může jedna o solné roztoky (hydrogenfosforečnan sodný, dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý, atd. nebo směsi těchto solí) ve sterilním izotonickém stavu nebo o suché, zejména lyofylizované kompozice, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku umožňují vytvoření injikovatelných roztoků.

Dávky nukleových kyselin (sekvence nebo vektor) použité pro podání mohou být závislé na různých faktorech mezi které zejména patří způsob podání, léčený patologický stav, nukleová kyselina, která má být exprimována, nebo také požadovaná doba léčení. Obecně pokud jde o rekombinantní viry podle vynálezu, jsou tyto viry formulovány a podávány ve formě dávek obsahujících mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, výhodně mezi 10⁶ a 10¹⁰ pfu/ml. Výraz pfu („plaque forming unit“) odpovídá infekční potenci virového roztoku a je stanoven infekcí příslušné buněčné kultury a určením, obvykle po 48 hodinách, počtu kolonií infikovaných buněk. Technika stanovení hodnoty pfu daného virového roztoku je velmi dobře dokumentována v literatuře.

Uvedené kompozice mohou být použity v humánní medicíně pro léčení nebo/a prevence rakovin. Produkty podle vynálezu jsou zejména schopné modulovat aktivitu proteinů ras, umožňují intervenci do procesů rozvoje rakovin a zejména mohou inhibovat aktivitu onkogenů, jejíchž transformační aktivita je zprostředkována funkční interakcí p21-GAP. Ve skutečnosti bylo zjištěno, že četné rakoviny jsou v souvislosti s přítomností onkogenních proteinů ras. Z těchto rakovin zahrnujících nejčastěji mutantní geny ras lze zejména uvést adenokarcinomy pankreasu, z nichž 90 % má mutantní onkogen Ki-ras na dvanáctém kodonu (Almoguare a kol., Cell 53 (1988)549), adenokarcinomy tračníku a rakoviny štítné žlázy (50 %) nebo karcinomy plic a myeloidní leukomie (30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989)4682). Obecněji mohou být kompozice podle vynálezu použity pro léčení všech typů patologických stavů, u kterých je pozorována abnormální buněčná proliferace indukcí apoptózy, jakož i všech patologických stavů

-4CZ 288882 B6 charakterizovaných buněčných smrtí následkem apoptózy (AIS, Hustingotova chorea, Parkinsonova nemoc) pomocí sloučenin blokujících účinky Grb3-3 (zejména antimediátorové).

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétnějších příkladů jeho provedení za použití odkazů na připojené výkresy.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje schematické zobrazení strukturních domén Grb2 a Grb3-3, obr. 2 znázorňuje studium vazby Grb3-3 k receptoru pro EGF (obr. 2a) a k peptidům bohatým na prolin (obr. 2b), obr. 3 znázorňuje účinek Grb3-3 na aktivitu typu trans za použití ras PRE odvozeného od enhanceru polyomaviru, obr. 4 znázorňuje demonstraci buněčné smrti indukované působením Grb3-3 na fibrolastech 3T3 a obr. 5 znázorňuje demonstraci exprese Grb3-3 v buňkách infikovaných virem HIV.

Obecné techniky molekulární biologie

Klasicky používané techniky molekulární biologie, jakými jsou preparativní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, srážení DNA v solném prostředí ethanolem nebo izopropanolem, transformace v Escherichia coli atd. jsou velmi dobře známé a hojně popsané v příslušné odborné literatuře /Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Colg Spring Harbor, N.Y. 1982; Ausubel F.M. a kol. (edit.), „Current Protocol in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987/.

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy řady M13 jsou komerčně dostupné (Bethesda Research Laboratories).

Za účelem ligací mohou být fragmenty DNA separovány podle velikosti elektroforézou na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, sráženy ethanolem a potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Naplnění proeminentních konců 5' může být provedeno Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podle pokynů dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5' se provádí šetrným působením nukleázy Sl.

Řízená mutageneze in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena metodou vyvinutou Taylorem a kol. /Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.

Enzymatická amplifikace fragmentů DNA technikou, nazvanou PCR /Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. a Fallona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350/, může být provedena za použity DNA-termálního cykleru („DNA thermal cycler“) (Perkin Elmer Cetus) podle pokynů výrobce.

-5CZ 288882 B6

Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sangerem a kol. /Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, které mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně definován formulací patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace genu Grb3-3

Gen Grb3-3 byl izolován tříděním lidské banky DNA pomocí sondy odvozené od sekvence genu Grb2.

Pomocí sondy odvozené od sekvence genu Grb2 bylo vytříděno 500 000 rekombinantních fágů Lambda gtl 1 nesoucích fragmenty DNA původem z banky lidské placenty (Clontech). Použitá sonda odpovídá osmi prvním aminokyselinám proteinu Grb2 a zahrnuje následující sekvenci:

ATGGAACCATCGCCAAATATGAC (SEQ ID č. 2).

Takto bylo identifikováno deset pozitivních klonů. Inzert těchto deseti klonů byl izolován ve formě fragmentů EcoRI, klonován vplazmidu M13mpl8 a sekvenován. Z těchto deseti klonů jich devět neslo inzerty identické se sekvencí Grb2. Pouze jediný z těchto klonů nesl inzert, jehož velikost byla menší než velikost genu Grb2 z důvodů delece v doméně SH2 (obr. 1). Analýza zbývající sekvence prokázala dokonalou identitu s odpovídajícími oblastmi Grb2, včetně nekódujících oblastí 5' a 3'. Fáze otevřené četby tohoto klonu kóduje protein se 177 aminokyselinami (SEQ Id č. 1), obsahující dvě domény SH3 ohraničující neúplnou doménu SH2 (obr. 1). Vypouštěné (delece) aminokyseliny v doméně SH2 (zbytky 60 až 100 proteinu Grb2) odpovídají zbytkům implikovaným ve vazbě Grb2 kpeptidům obsahujícím fosforylované tyrosiny.

Příklad 2

Aktivita vazby proteinu Grb3-3

Jak již bylo uvedeno výše, je Grb2 mediátor interakce mezi receptory fosforylovaných růstových faktorů a faktory SOS. Tento příklad demonstruje skutečnost, že protein Grb3-3 je neschopen interakce s fosforylovaným EGF (s fosforylovaným růstovým faktorem), ale že si i nadále zachovává svoji schopnost interakce s peptidem bohatým na prolin odvozeným ze sekvence lidského faktoru SOS1.

Kapacita vazby Grb3-3 byla studpvána za použití biotinylových fúzních proteinů k glutathionS-transferáze (GST). Tento typ fúze umožňuje rychlou a účinnou purifikaci rekombinantních produktů. Za tím účelem byly sekvence podle vynálezu exprimovány v kmeni Escherichia coli TG1 ve formě fúzních proteinů s GST podle techniky popsané Smithem a Jonoson-em /Gene 67(1988)31/. Stručně specifikováno, byly geny Gsb2 a Grb3-3 nejdříve modifikovány zavedením na obou stranách kodonů start a stop místa BamHI. Za tím účelem byly otevřené fáze četby těchto genů amplifíkovány technikou PCR za použití následujících oligonukleotidů:

-6CZ 288882 B6

Oligonukleotid I (5') (SEW ID č. 3):

GAATTCGGATTCATGGAAGCCATCGCCAAATATGACTTC oligonukleotid II (3') (SEQ ID č. 4):

Podtržená část uvedených oligeonukleotidů odpovídá vytvořenému místu BamHI následovanému nebo předcházenému kodony start a stop.

Takto amplifikované geny se potom klonují ve formě fragmentů BamHI ve vektoru pGEX 2T (Pharmacia) linearizovaném stejným enzymem v 3' a ve fázi cDNA kódující GST. Takto získané vektory se potom použijí pro transformaci kmene Escherichia coli TG1. Takto transformované buňky se potom předkultivují přes noc při teplotě 37 °C, zředí 1:10 v prostředí LB, smísí s IPTG pro indukci exprese (2 hodiny, 25 °C) a potom kultivují po dobu 21 hodin při teplotě 25 °C. Tyto buňky se potom podrobí lyži a produkované fúzní proteiny se přečistí na základě jejich afinity na sloupci produktu agarosa-GSH. Za tím účelem se bakteriální lyzát inkubuje v přítomnosti gelu (připraven a uveden do rovnovážného stavu s pufrem lyže) po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. Po 3 hodinách promývání tamponem Tris-HCl (pH 7,4) se proteiny eluují v přítomnosti pufru Tris-HCl (pH 7,7) obsahujícího přebytek GST. Supematant se oddělí a odstředí.

Stejná metodika se použije pro přípravu mutantu Grb2, ve kterém je glycin 203 nahrazen argininem (Grb2G203R), a mutantu Grb3-3, ve kterém je glycin 162 nahrazen argininem (Grb33T162R). Mutant Grb2G203R byl popsán jako mutant, který nevykazuje účinnost při testu reiniciace syntézy DNA (Lowenstein a kol.). Mutant Grg3-3G162R nese stejnou mutaci ve stejné poloze a měl by tedy být rovněž neúčinný.

Tyto mutanty byly připraveny mutagenezí technikou PCR na genech Grb2 a Grb3-3 za použití v 5' oligonukleotidu I popsaného výše a v 3' následujícího oligonukleotidu III, ve kterém je mutovaný kodon podtržen:

oligonukleotid III (3')(SEQ ID č. 5):

GACGTTCCGGTTCACGGGGGTGACATAATTGCGGGGAAACATGCGGGTC.

Takto amplifikované fragmenty se potom eluují, reamplifikují technikou PCR pomocí oligonukleotidů I a II a potom klonují ve vektoru pGEX 2T. Potom se výše uvedenými postupy připravují odpovídající mutanty.

Fúzní proteiny s GST (GST-Grb2, GST-Grb3-3, GST-Grb3-3G162R a GST) se potom biotinylují klasickými známými technikami (viz obecné techniky molekulární biologie a Mayer a kol., PNAS 88 (1991)627) a použijí jako sondy pro stanovení vazby kreceptoru pro imobilizovaný fosforylovaný EGF (2.1) a potom k peptidu odvozenému od hSOSl (2.2)..

1) Vazba k receptoru pro fosforylovaný EGF

Metodika:

Receptor pro EGF byl purifíkován z buněk A431 imobilizací na WGA-sepharose provedenou technikou popsanou Duchesnem a kol. (Science 259 (1993)525). 2 pg tohoto receptoru se nejdříve stimulují 1 μΜ EGF po dobu 10 minut při teplotě 22 °C a potom inkubují v přítomnosti nebo nepřítomnosti chladného ATP (10 μΜ), a v přítomnosti 2,5 mM chloridu manganatého v pufru HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton, 10% glycerol, pH=7,5) při teplotě 4 °C po dobu 2 minut. Fosforylace receptoru se potom ukončí přidáním degradačního pufru. Vzorky se potom nanesou na 4-20% gel SDS-PAGE a potom převedou na polyvinyl

-7CZ 288882 B6 idendifluoridové membrány (PVDF). Získané bloty se potom inkubují v přítomnosti různých biotinylovaných fúzí GST (2 pg/ml) a potom vyvolají pomocí streptavidinu kopulovitého s alkalickou fosfatázou (Promega). Receptory RGf byly rovněž podrobeny imunoglotu v přítomnosti anti-fosfotyrosinových protilátek (anti-PY) za účelem ověření toho, že receptory byly skutečně fosforylovány.

Výsledky:

Získané výsledky jsou zobrazeny na obr. 2. Tyto výsledky ukazují pode očekávání, že protein Grb2 vstupuje do interakce s receptorem EGF pouze v případě, kdy je tento receptor fosforylován. Tyto výsledky dále ukazují, že protein Grb3-3 se neváže k receptoru EGF a to bez ohledu na jeho stupeň fosforylace.

2) Vazba k peptidu odvozenému od hSOS 1

Metodika:

Byly syntetizovány následující dva peptidy bohaté na prolin:

- peptid hOSl: GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: tento peptid odpovídá zbytkům 1143 až 1162 proteinu hSOSl (li a kol., Nátuře 363 (1993)83), odpovědného za interakci mezi Grb2 ahSOSl (SEQ ID č. 6), peptid 3BP1: PPPLPPLV: tento peptid je odvozen od derivátu proteinu 3BP1, o kterém je známo, že váže účinně doménu SH3 Abl a Src (Cicchetti a kol., Science 257 (1992)803) (SEQ ID č. 7).

Každý z těchto peptidů byl imobilizován na nitrocelulózové membráně. Tyto membrány byly potom inkubovány v blokačním pufru (Tris 20 mM pH=7,6, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween, 3 % bovinní albumin). Membrány se potom inkubují přes noc při teplotě 4 °C v přítomnosti různých biotinylovaných fúzí GST (4 pg/ml) a potom vyvolají pomocí streptavidinu kopulovaného s alkalickou fosfatázou (Promega).

Výsledky:

Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Tyto výsledky ukazují, že Grb3-3 je stejně jako Grb2 schopen vázat peptid hSOSl. Tyto výsledky dále ukazují, že tato interakce je specifická, neboť nebyla pozorována žádná vazba speptidem 3BP1. Jinak výsledky rovněž ukazují, že mutant Grb3-3G162R již není schopen vázat peptid hSOSl, což potvrzuje důležitost tohoto zbytku a funkční úlohu uvedené interakce.

Příklad 3

Aktivita proteinu Grg3-3

Tento příklad demontruje, že vzdor deleci v doméně SH2 má protein Grb3-3 funkční účinek.

Aktivita proteinu Grb3-3 byla studována stanovením jeho schopnosti kooperovat s ras v rámci aktivity typu trans promotoru majícího prvky odezvy vůči ras (RRE) a řídícího expresi reportážního genu.

Použitá metodika byla popsána například Schweighoffem a kol., v Science 256 (1992) 825. Stručně specifikováno je použitým promotorem syntetický promotor tvořený murinním promotorem genu thymidin-kinázy a 4 repetitivních prvků PEAÍ odvozených od polyomního

-8CZ 288882 B6 enhanceru (Wasylyk a kol., EMBO J. 7(1988)2475): promotor Py-TK. Tento protomor řídí expresi reportážního genu, v případě bakteriálního genu chloramfenikolacetyltransferázy (CAT): vektor Py-TK-CAT. Testované vektory exprese genů byly konstruovány inzercí uvedených genů ve formě fragmentů BamHI do místa BglII plazmidu pSV2. Toto místo umožňuje vložit geny pod kontrolu raného promotoru SV40.

Buňky ER22 se 40% konfluencí byly transfekovány za použití 0,5 pg vektoru Py-TK-CAT samotného (Py) nebo v přítomnosti expresního vektoru nesoucího pod kontrolou raného promotoru SV40 gen: Grb2, 2 pg, Grb3-3, 2 pg, Grb2(G203R) 2 pg, Grb3-3(G162R) 2 pg nebo Grb3-3, 2 pg + Grb2, 2 pg. V každém případě je celkové množství DNA nastaveno na 5 pg expresním vektorem bez inzertu. Transfekce byla provedena v přítomnosti liposperminu (Transfectam, IBF-Sepracor). Buňky byly udržovány po dobu 48 hodin v prostředí DMEM suplementovaném 0,5 % fetálního telecího séra. Aktivita CAT (transaktivace RRE) byla potom stanovena způsobem popsaným Wasylykem a kol. (PNAS 85 (1988)7952).

Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Tyto výsledky jasně ukazují, že exprese proteinu Grb3-3 oponuje účinkům aktivace receptoru pro růstový faktor. Tyto výsledky rovněž ukazují, že Grb2 v přebytku oponuje účinkům Grb3-3 v odezvu na růstový faktor.

Příklad 4

Grb3-3 indukuje buněčnou apoptózu

Tento příklad demonstruje přímou implikaci Grb3-3 v buněčné apoptóze. Tato vlastnost nabízí obzvláště výhodná použití v rámci léčení patologických stavů vyplývajících z buněčné proliferace (rakoviny, restenóza, atd.).

Indukce buněčné apoptózy účinkem Grb3-3 byla demonstrována i) injekcí rekombinantního proteinu do fíbroblastů 3T3 a ii) přenosem sekvence kódující Grb3-3 do buněk 3T3.

i) Injekce rekombinantního proteinu

Rekombinantní protein Grb3-3 byl připraven ve formě fúzovaného proteinu s GST podle metodiky popsané v příkladu 2. Fúzovaný protein byl potom zpracován trombinem (0,25%, Sigma) za účelem oddělení části GST a potom purifikován iontoměničovou chromatografií na sloupci monoQ. Frakce obsahující rekombinantní protein se potom zahustí pomocí mikrokoncentrátoru Microsep (Filtron) ve 20 mM fosfátovém pufru (pH 7) obsahujícím 100 mM chloridu sodného. Takto získaný purifikovaný protein byl infikován (1 až 3 mg/ml) do kultury buněk 3TS pomocí automatického mikroinjektoru Eppendorf. Tyto buňky se potom inkubují při teplotě 34 °C a v pravidelných intervalech fotografují za účelem sledování morfologických transformací. Získané výsledky ukazují, že 5 hodin po injekci Grb3-3 je většina buněk mrtvých, zatímco injekce Grb2 nebo mutantu Grb3-3(G162R) není žádný účinek na životnost buněk.

ii) Přenos sekvence kódující rekombinantní protein

Byl konstruován plazmid obsahující sekvenci SEQ ID č. 1 kódující protein Grb3-3 pod kontrolou raného promotoru viru SV40.

Fibroblasty 3T3 se 40% konfluencí byly transfekovány v přítomnosti liposperminu (Transfectam, IBF-Sepracor) pomocí 0,5 nebo 2 pg tohoto expresního plazmidu. 48 hodin po transfekci bylo 50 % buněk suspendováno v prostředí, zatímco zbývající buňky lnoucí ke stěně měly velmi významné morfologické změny (obr. 4). Analýza provedená elektroforézou na agarosovém gelu ukázala, že tyto buňky měly charakteristickou oligo-nukleosomální strukturu fragmentace DNA mrtvých buněk (obr. 4). Naopak buňky transfekované za stejných podmínek expresním

-9CZ 288882 B6 plasmidem Grb2, Grb3-3 (G162R) nebo Grb2 (G203R) si zachovaly normální morfologii, jsou stále živé a nemají žádnou fragmentaci DNA. Jak je to patrné z obr. 4, umožňuje ko-exprese Grb2 opozici vůči účinkům Grb3-3.

Tyto výsledky ukazují tedy jednoznačně, že Grb3-3 je smrtícím genem schopným indukovat buněčnou apoptózu. Jak již to bylo uvedeno výše, nabízí tato vlastnost obzvláště výhodné aplikace v rámci léčení patologických stavů rezultujících z buněčné proliferace, jakými jsou zejména rakoviny, restenóza, atd..

Příklad 5

Demonstrování exprese Grb3-3 v lymfocytech infikovaných virem HIV

Tento příklad ukazuje, že v průběhu infekčního cyklu lymfocytů T virem HIV je podíl RNAm Grb2 a Grb3-3 modifikován a že v okamžiku masivní virové tvorby a buněčné smrti je nadměrně exprimován mediátor Grb3-3.

Lymfocyty periferní krve byly infikovány virem HIV-1 ve dvou zředěních (1/10 a 1/100) po dobu 1, 4 nebo 7 dnů. RNAm buněk byly potom analyzovány reverzní technikou PCR pomocí specifických oligonukleotidů Grb2 a Grb3-3 za účelem stanovení relativního podílu mediátorů Grg2 a Grb3-3. Použitými specifickými oligonukleotidy Grb3-3 jsou následující oligonukleotidy:

oligonukleotid IV (3'):

ATCGTTTCCAAACGGATGTGGTTT (SEQ ID č. 8) oligonukleotid V (5'):

ATAGAAATGAAACCACATCCGTTT (SEQ ID č. 9).

Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Tyto výsledky ukazují jednoznačně, že 7 dní po infekci virem HIV dochází k nadměrné expresi mRNA Grb3-3. Jak je to patrné ze stanovení proteinu p24 a inverzní transkriptázy viru, odpovídá 7 dnů rovněž periodě, ve které je pozorována masivní virová produkce.

-10CZ 288882 B6

Seznam sekvencí

SEQ ID č. 1:

i) charakteristiky sekvence:

A) délka: 933 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) počet řetězců: dvojitý io D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetický: ne iii) antimediátorový: ne vi) původ:

A) organismus: Homo sapiens ix) Dodatečné charakteristiky:

A) jméno/klíč: CDS

B) umístění: 37..567

C) další informace: produkce = „Grg3-3“ ix) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:

-11CZ 288882 B6

GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54

Met 1

Glu

Ala

Ile

Ala 5

Lys

TAT

GAC

TTC

AAA

GCT

ACT

GCA

GAC GAC

GAC

CTG

AGC

TTC

AAA

AGG

GGG

102

Tyr

Asp

Phe

Lys

Ala

Thr

Ala

Asp Asp Asp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

10

15

20

GAC

ATC

CTC

AAG

GTT

TTG

AAC

GAA

GAA

TGT

GAT

CAG

AAC

TGG

TAC

AAG

150

Asp

Ile

Leu

Lys

Val

Leu

Asn

Glu

Glu

Cys

Asp

Gin

Asn

Trp

Tyr

Lys

25

30

35

GCA

GAG

CTT

AAT

GGA

AAA

GAC

GGC

TTC

ATT

CCC

AAG

AAC

TAC

ATA

GAA

198

Ala

Glu

Leu

Asn

Gly

Lys

Asp

Gly

Phe

Ile

Pro

Lys

Asn

Tyr

Ile

Glu

40

45

50

ATG

AAA

CCA

CAT

CCG

TTT

GGA

AAC

GAT

GTG

CAG

CAC

TTC

AAG

GTG

CTC

246

Met

Lys

Pro

His

Pro

Phe

Gly

Asn

Asp

Val

Gin

His

Phe

Lys

Val

Leu

55

60

65

70

CGA

GAT

GGA

GCC

GGG

AAG

TAC

TTC

CTC

TGG

GTG

GTG

AAG

TTC

AAT

TCT

294

Arg

Asp

Gly

Ala

Gly Lys

Tyr

Phe

Leu

Trp

Val

Val

Lys

Phe

Asn

Ser

75

80

85

TTG

AAT

GAG

CTG

GTG

GAT

TAT

CAC

AGA

TCT

ACA

TCT

GTC

TCC

AGA

AAC

342

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Asp

Tyr

His

Arg

Ser

Thr

Ser

Val

Ser

Arg

Asn

90

95

100

CAG

CAG

ATA

TTC

CTG

CGG

GAC

ATA

GAA

CAG

GTG

CCA

CAG

CAG

CCG

ACA

390

Gin

Gin

Ile

Phe

Leu

Arg

Asp

Ile

Glu

Gin

Val

Pro

Gin

Gin

Pro

Thr

105

110

115

TAC

GTC

CAG

GCC

CTC

TTT

GAC

TTT

GAT

CCC

CAG

GAG

GAT

GGA

GAG

CTG

438

Tyr

Val

Gin

Ala

Leu

Phe

Asp

Phe

Asp

Pro

Gin

Glu

Asp Gly

G1U

Leu

120

125

130

GGC

TTC

CGC

CGG

GGA

GAT

TTT

ATC

CAT

GTC

ATG

GAT

AAC

TCA

GAC

CCC

486

Gly

Phe

Arg

Arg Gly Asp

Phe

Ile

His

Val

Met

Asp

Asn

Ser

Asp

Pro

135

140

145

150

AAC

TGG

TGG

AAA

GGA

GCT

TGC

CAC

GGG

CAG

ACC

GGC

ATG

TTT

CCC

CGC

534

Asn

Trp

Trp

Lys

Gly

Ala

Cys

His

Gly

Gin

Thr

Gly

Met

Phe

Pro

Arg

155

160

165

AAT

TAT

GTC

ACC

CCC

GTG

AAC

CGG

AAC

GTC

TAAGAGTCAA GAAGCAATTA

584

Asn

Tyr

Val

Thr

Pro

Val

Asn

Arg

Asn

Val

170

175

TTTAAAGAAA

GTGAAAAATG

TAAAACACAT

ACAAAAGAAT

TAAACCCACA

AGCTGCCTCT

644

GACAGCAGCC

TGTGAGGGAG

TGCAGAACAC

CTGCCGGGTC

ACCCTGTGAC

CCTCTCACTT

704

TGGTTGGAAC

TTTAGGGGGT

GGGAGGGGGC

GTTGGATTTA

AAAATGCCAA

AACTTACCTA

764

TAAATTAAGA

AGAGTTTTTA

TTACAAATTT

TCACTGCTGC

TCCTCTTTCC

CCTCCTTTGT

824

CTTTTTTTTC TTCCTTTTTT

CTCTTCTGTC CATCAGTGCA TGACGTTTAA GGCCACGTAT

884

AGTCCTAGCT GACGCCAATA AAAAACAAGA AACCAAAAAA CCCGAATTC

933

-12CZ 288882 Β6

SEQ ID č. 2:

i) Charakteristiky sekvence

A) délka: 24 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) počet řetězců: jednoduchý

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:

A) organismus: oligonukleotid xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:

ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC 24

SEQ ID č. 3:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 39 párů bází

B) typ: kyselina nukleová

C) počet řetězců: jednoduchý

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:

A) organismus: oligonukleotid I xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTG 39

SEQ ID č. 4:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 39 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) počet řetězců: jednoduchý

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:

A) organismus: oligonukleotid II xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:

GAATTCGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC 39

-13CZ 288882 B6

SEQ ID č. 5:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 49 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) počet řetězců: jednoduchý

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:

A) organismus: oligonukleotid III xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:

GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGTC 49

SEQ ID č. 6:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 20 aminokyseliny

B) aminokyselina

C) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: protein vi) Původ:

A) organismus: peptid hSOSl (zbytky 1142 až 1162) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 6:

Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg Arg Pro Glu Ser Ala 1 5 10 15 20

SEQ ID č. 7:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 8 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: protein vi) původ:

A) organismus: peptid 3BP1 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 7:

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val

5

-14CZ 288882 B6

SEQ ID č. 8:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 24 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) počet řetězců: jednoduchý

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:

A) organismus: oligonukleotid IV xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 8:

ATCGTTTCCA AATGGATGTG GTTT

SEQ ID č. 9:

i) Charakteristiky sekvence:

A) délka: 24 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) počet řetězců: jednoduchý

D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:

A) organismus: oligonukleotid V xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 9:

Claims (12)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Polynukleotid kódující polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 1.
2. 2. Polynuikleotid podle nároku 1 obsahující nukleotid 37-564 sekvence SEQ ID č. 1.
3. 3. Antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého polynukleotidu podle nároku 1 nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expesi Grb2.
4. 4. Antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého polynukleotidu podle nároku 1 nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expresi Grb3-3.
5. 5. Polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEG ID č. 1.

   -15CZ 288882 B6
6. 6. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 1 nebo 2.
7. 7. Vektor podle nároku 6, který je virovým vektorem.
8. 8. Vektor podle nároku 7, který je vektorem odvozen od adenovirů, retrovirů, přidružených adenovirů, viru herpes, cytomegaloviru nebo viru kravských neštovic.
9. 9. Vektor podle nároku 7 nebo 8, který je replikačně defektním virem.
10. 10. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 1 nebo 2 nebo vektor podle nároků 6 až 9 nebo antimediátorový polynukleotid podle nároku 3 nebo polypeptid podle nároku 5.
11. 11. Použití polynukleotidu podle nároku 1 nebo 2 nebo vektoru podle nároků 6 až 9 nebo antimediátorového polynukleotidu podle nároku 3 nebo polypeptidů podle nároku 5 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakoviny.
12. 12. Použití antimediátorového polynukleotidu podle nároku 4 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení AIDS.