JPH10512145A - ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼ - Google Patents
ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼInfo
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- JPH10512145A JPH10512145A JP8521616A JP52161696A JPH10512145A JP H10512145 A JPH10512145 A JP H10512145A JP 8521616 A JP8521616 A JP 8521616A JP 52161696 A JP52161696 A JP 52161696A JP H10512145 A JPH10512145 A JP H10512145A
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Abstract
(57)【要約】
本出願は、酵素ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼに対するタンパク質配列およびそれをコードする対応するDNA配列を開示する。本出願はまた、この酵素に対して調製された抗体、この酵素を同定する方法、および薬物としてのこの酵素の使用を考察する。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼ
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に
関する。さらに詳細には、本発明のポリペプチドはヒトゲラニルゲラニルピロリ
ン酸シンセターゼ(本明細書中では以下「hGGPS」ともいう)である。本発明は
また、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
生物学的高分子の調節、機能的活性化、および細胞内標的化は、しばしば特定
部分の共有結合的な接着により媒介される。リン酸化、グリコシル化、アセチル
化、脂肪性のアシル化、およびメチル化による特定のタンパク質の翻訳後修飾は
、広範に研究されており、そして種々の重要な生物学的機能が特定の側鎖に帰す
る。これらのなじみ深いタイプの化学的修飾に対して、タンパク質プレニル化は
、脂肪親和性のイソプレノイドの群の付着による分子の共有結合的な修飾に帰す
る。イソプレノイドは反復5-炭素構造に基づく脂肪親和性分子の多種多様なフ
ァミリーである。15個の炭素分子ファルネシル二リン酸、および20個の炭素分子
ゲラニルゲラニル二リン酸は、タンパク質プレニル化に最も関連したイソプレノ
イド化合物である。
多くの特定のタンパク質がプレニル基で翻訳後修飾される。全てではないにし
ても、ほとんどのプレニル化タンパク質は、システイン残基へのチオエーテル結
合において15-炭素ファルネシルまたは20-炭素ゲラニルゲラニル基(Rilling,H.C
.ら、Science,247:318-320(1990))の付着により修飾される。総細胞タンパク質
におけるファルネシルシステインおよびゲラニルゲラニル化システインの相対比
は生物間および細胞型との間でいくらか変化するが、ほとんどの生物においてゲ
ラニルゲラニル化は、ファルネシル化より一般的な修飾である(Epstein,W.W.ら
、PNAS,USA,88:9668-7019(1991))。プレニル化タンパク質は種々の細胞区画中で
見い出され、それには核、サイトゾル、および膜結合オルガネラが含まれる(Ma
lt
ese,W.A.およびSheridan,K.M.,J.Cell.Pysiol.,133:471-81(1987))。
その正体が決定されたプレニル化タンパク質のほとんどは、以下の4つのタン
パク質ファミリーの一つに属する:低分子量GTP結合タンパク質、リポペプチド
フェロモン、核ラミン、および三量体Gタンパク質。ほとんどの既知のプレニル
化タンパク質は低分子量グアニンヌクレオチド結合タンパク質のRasスーパーフ
ァミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、以下の4つの低分子量タン
パク質ファミリーに分けられ得る:Ras、Rho、Rap、およびRab/Yptファミリー(
Chardin,P.,Biochimie,70:865-68(19889)。これらのタンパク質は種々の細胞機
能(細胞増殖および分化の制御、細胞***ならびに膜輸送を含む)に関与する。
すべての低分子量GTP結合タンパク質はカルボキシル末端またはその近傍にシス
テイン残基を含有し、これは翻訳後プレニル化の標的として働くようである。
Rasタンパク質は原形質膜局在分子であり、哺乳動物細胞および酵母細胞にお
いて細胞分化および増殖を調節する。Rasタンパク質は、システイン、それに続
いて2つの脂肪族の残基およびカルボキシル末端X残基(C,S,M,Q,またはAであり
得る)を有するCaaXモチーフと呼ばれるカルボキシル末端に配列を含有する(Tapa
rowsky,E.ら、Cell,34:581-56(1983))。タンパク質プレニル化の遺伝的または薬
学的阻害は、ヒトおよび酵母のRasタンパク質の両方の膜結合および生物学的活
性をブロックする(Hancock,J.F.ら、Cell,57:1167-77(1989)およびSchafer,W.R
.ら、Science,245:379-85(1989))。
低分子量GTP結合タンパク質の第2の群は、カルボキシル末端位に、ロイシン
残基を有するCaaLモチーフと呼ばれるCaaXボックスと類似のカルボキシル末端モ
チーフを含有する。この群は、RapおよびRhoタンパク質ファミリーのような細胞
質***に関する多くのタンパク質を含む。これらのタンパク質の多くはゲラニル
ゲラニル化されることが知られており、G25K、RhoA(Katayama,M.ら、J.Biol.Che m.
,266:12639-45(1991)、およびRap 1Aおよび1B(Buss,J.E.ら、Mol.Cell.Biol.
,11:1523-30(1991)Ral.Rac(kinsella,B>T.ら、J.Biol.Chem.,266:9786-94(1991
)、ならびにおよびKowata,M.ら、PNAS,USA,87:8960-64(1990))を含む。プレニ
ル化カルボキシル末端はRap 1Bの膜への結合に必要とされる。Rap 1Bカルボキシ
ル末端に対応するプレニル化、リン酸化されたペプチドは、GDSとの相互作用に
つい
てインタクトなRap 1Bと競合し得るので(どちらの修飾も欠失している他のペプ
チドは競合し得ないが)、プレニル化およびリン酸化は両方ともGDSとして知ら
れる因子とのRap 1Bの相互作用に必要とされる。GDSはGDP/GTP変換を刺激する(H
ata,Y.ら、J.Biol.Chem.,266:6571-77(1991))。
Rhoタンパク質はまた、ゴルジ体にも局在し(McCaffey,M.ら、J.Cell.Biol.,1
15:309-19(1991))、そしてさらに膜および変換因子との結合のためにゲラニルゲ
ラニル化を必要とするようである。
低分子量GTP結合タンパク質の第3の群は、カルボキシル末端配列C-C、C-X-C
、またはC-C-X-Xを含有する。これらのタンパク質はRab/YPTタンパク質のほとん
どを含み、これらは細胞内輸送の調節に関与し、そして両方とも細胞質に存在し
、そして個々の膜区分に結合する(Balch,W.E.,Trends Biochem.Sci.,15:469-72
(1990))。これらのタンパク質のゲラニルゲラニル化は、これらのタンパク質が
膜に結合するために必須であることが示されている。
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼは、代謝のコレステロール/ステロ
イド経路の分岐に関与し、そしてC20ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)を形成
するための、ジメチアリル二リン酸へのイソペンテニル二リン酸の3つの分子の
トランス-付加(trans-addition)を媒介する。上述のように、GGPPは、タンパク
質を修飾し、シグナル伝達および、これらのタンパク質の活性化ならびにこれら
のタンパク質の輸送を制御するプレニルタンパク質修飾基として用いられる。
本発明のポリペプチドは、ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼとし
て推定的に同定された。この同定は、アミノ酸配列相同性の結果としてなされた
。
本発明の1つの局面によれば、hGGPSである新規の成熟ポリペプチド、ならび
に生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログ
、および誘導体が提供される。
本発明の別の局面によれば、hGGPSをコードする単離された核酸分子が提供さ
れ、それには、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびに生物学的に活性で、かつ
診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体が含まれる
。
本発明のなおさらなる局面によれば、組換え技術によりこのようなポリペプチ
ドを産生するためのプロセスが提供される。組換え技術は、上記タンパク質の発
現およびその後の前記タンパク質の回収を促進する条件下で、hGGPS核酸配列を
含む組換え原核宿主細胞および/または真核宿主細胞を培養することを含む。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのよ
うなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的(例えば、細胞の
形態を制御するため、アポトーシスを抑制するため、ならびにアンタゴニストお
よび/またはアゴニストをスクリーニングするため)に利用するプロセスが提供
される。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が
提供される。
本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニ
ストが提供され、これは例えば、腫瘍(例えば、腫瘍およびガン細胞増殖)の処
置においてこのようなポリペプチドの作用を阻害するため、ならびにウイルス増
殖を妨げるために用いられ得る。
本発明の別の局面によれば、hGGPS配列に特異的にハイブリダイズするのに十
分な長さの核酸分子を含む核酸プローブがまた提供される。
本発明の別の局面によれば、疾患またはhGGPS核酸配列中の変異およびこのよ
うな核酸配列にコードされるタンパク質に関する疾患に対する感受性の診断方法
が提供される。
本発明のなお別の局面によれば、開示されたポリヌクレオチドおよび研究目的
のためのポリペプチドを使用するためのプロセスが提供される。
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ
るはずである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により取り
囲まれるような本発明の範囲を限定することを意味しない。
図1は、hGGPSポリペプチドのcDNA、および対応する推定アミノ酸配列を示す
。示したポリペプチドは、このポリペプチドの全長タンパク質配列である。アミ
ノ酸の標準1文字略語を使用する。配列決定を、373自動DNAシーケンサー(Appli
ed Biosystems,Inc.)を用いて行った。配列決定の精度は、97%の精度より大き
いことが予想される。
図2は、hGGPSポリペプチドとNeurospora crassa由来のゲラニルゲラニルピロ
リン酸シンセターゼとの間のアミノ酸配列の相同性を図示する。
図3は、Neurospora crassa由来のGGPSと本発明のhGGPSとの間のアミノ酸配列
相同性を示す。アミノ酸が同一である場合、そのアミノ酸の略語をコンセンサス
で標識した下の行に示す。
本発明の局面によれば、図1(配列番号2)の推定のアミノ酸配列を有する成
熟ポリペプチドまたは1994年9月28日にATCC受託番号第75900号として寄託され
たクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された
核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、骨巨細胞腫、8週齢
の胎児および微小血管内皮細胞から入手され得る。本発明のポリヌクレオチドは
、ヒト胎児心臓由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。これは、構造的に
ポリプレニルシンセターゼファミリーに関連する。これは、300アミノ酸残基の
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質
は、265アミノ酸にわたって54%の同一性および72%の類似性を有し、Neurospor
a crassa由来のGGPSと最も高い相同性を示す。hGGPSは、このタンパク質のファ
ミリーに顕著である保存されたアスパラギン酸モチーフである、LLIDDEIDNSKLRR G
およびLGLFFQIRDDYANの両方を含有する(図1を参照)。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA(このDNAはcDNA、ゲノムD
NA、および合成DNAを包む)の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり
得、そして一本鎖の場合にはコード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり
得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図1(配列番号1)に示す
コード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはその
コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図1(配列番号1)
のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配
列であり得る。
図1(配列番号2)の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る:成熟ポ
リペプチドのコード配列のみ;成熟ポリペプチドのコード配列(および随意のさ
らなるコード配列)ならびに非コード配列(例えば、イントロンあるいは成熟ポ
リペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列)。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列およ
び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
本発明はさらに、図1(配列番号2)の推定のアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチ
ドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に
存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体で
あり得る。
従って本発明は、図1(配列番号2)に示すものと同じ成熟ポリペプチド、ま
たは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する
。この改変体は、図1(配列番号2)のポリペプチドまたは寄託したクローンの
cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログを
コードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、およ
び付加または挿入改変体を含む。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図1(配列番号1)に
示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝
子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改
変体は、1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌク
レオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質
的に変化させない。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供
する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。ある
いは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が使用され
る場合は、血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝
集素タンパク質に由来するエピトープと一致する(Wilson,I.ら、Cell,37:767
(1984))。
本発明はさらに、配列間に少なくとも50%および好ましくは70%の同一性が存
在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられ
る用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが配列間に少な
くとも95%および好ましくは少なくとも97%の同一性が存在する場合のみに生じ
ることを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図1(配列番号1)のcDNAまたは
寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能
または活性を保持するポリペプチドをコードする。
本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、単に便宜上当業者に提
供されるのみであり、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされること
を認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそ
れによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として
援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている
。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。
本発明はさらに、図1(配列番号2)の推定のアミノ酸配列を有するか、また
は寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するhGGPSポリペプチド、
ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関す
る。
用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図1(配列番号2
)のポリペプチドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合は
、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポ
リペプチドを意味する。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により
活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合
成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図1(配列番号2)のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポ
リペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)そこで1つ以上のア
ミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミ
ノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コ
ードによりコードされるアミノ酸残基であるかもしれないし、またはそうではな
いかもしれないもの、あるいは(ii)そこで1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含
有するもの、あるいは(iii)そこで成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を
増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物に融
合されているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナロ
グは、本明細書中の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形熊
で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
用語「単離された」は、物質がその本来の環境(例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離
されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離さ
れている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。この
ようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして/またはこのような
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのよ
うなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないためなお単離され得
る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ
チドの産生に関する。
宿主細胞は、本発明のベクター(これは例えば、クローニングベクターまたは
発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作される(形質導入されるか、また
は形質転換されるか、またはトランスフェクトされる)。ベクターは例えば、プ
ラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはhGGPS遺伝
子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培
養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択される宿主細胞に以前使
用された条件であり、そして当業者には明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に用いられ得る。従って例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現する
ための種々の発現ベクターのいずれか1つに含まれ得る。このようなベクターは
、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を含む。このようなベ
クターは、例えば、SV40の誘導体;細菌性プラスミド;ファージDNA;バキュロウ
イルス;酵母プラスミド;プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来す
るベクター、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、および仮性狂犬病)である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可
能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配
列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され
る。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。
発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列(プロモーター)に作動可
能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例と
しては、以下が挙げられ得る:LTRまたはSV40プロモーター、E.coli. lacまたはtrp
、λファージPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはその
ウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発
現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネー
ターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得
る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型特性(例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性、あるいはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性)を提供する1つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また
は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る:細菌細胞(例えば、E.coli
、Streptomyces、Salmonella typhimurium);真菌細胞(例えば酵母);
昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9);動物細胞(例えば
、CHO、COSまたはBowes黒色腫);アデノウイルス;植物細胞など。適切な宿主
の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した1つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。この構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター)を含み、このベクターの中には本発明の配列が正方
向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築
物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを含
む)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり
、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性:pQE7
0、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK
、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A.pNH46A(Stratagene);pTRC99a、pKK223-3、p
KK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、
pSG(Stratagene);pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意の
プラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能
である限り、使用され得る。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。2つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特に
よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびt
rpを含む。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40お
よび後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIを含
む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲
内である。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核細胞(例え
ば、酵母細胞)であり得るか、あるいは宿主細胞は原核細胞(例えば、細菌細胞
)であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
シヨン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレ
ーションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in
Molecular Biology,(1986))。
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する
ために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは
、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物
に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得
る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発
現ベクターは、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版
,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)(この開示は、本明細書中に参考として援
用されている)に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの
シス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーター
に作用してその転写を増大させる。例として、複製起点(bp100〜270)の後期側の
SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複
製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー
が挙げられる。
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点お
よび選択マーカー(例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae
のTRP1遺伝子)、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素(例えば
、
3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸性ホスファターゼ、または
熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻
訳開始配列および翻訳終止配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異
種配列は、所望の特徴(例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化さ
れた精製)を与えるN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読
み取り相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグ
ナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは
、1つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望
により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために
適切な原核宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、な
らびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種
を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは
、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含む市
販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。
このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,U
ppsala,Sweden)およびGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)を含む。これ
らのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わされる。
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選
択されたプロモーターは適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)に
より誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman,Cell,23: 175(1981)に記載され
るサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細
胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)が含まれる。哺乳動
物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならび
に任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部
位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および5'フランキング
非転写配列もまた含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に
由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され
得る。
hGGPSポリペプチドは、以下を包含する方法により組換え細胞培養物から回収
され、そして精製され得る。硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン
または陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー
、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー
。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ(refolding)工程が、成熟タンパ
ク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラ
フィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主(例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞)から組換え技術により産生され得る
。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリ
コシル化されるかもしれないし、またはグリコシル化されないかもしれない。本
発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
hGGPSポリペプチドは、hGGPSの活性および生じるGGPPの形成をブロックするも
の(アンタゴニスト)を同定するための化合物をスクリーニングする方法におい
て使用され得る。このタイプのスクリーニングについて多数の方法(例えば、鋭
敏な特異性が異なるタンパク質基質の認識に存在し得る)が存在する。これはGG
PSのこれらのタンパク質またはペプチド基質に対する結合を評価するアッセイま
たは酵素の読み取りにおいて使用され得る。さらに、アッセイは基質アナログを
用いて形成され得る。
一例として、アゴニスト活性は、hGGPSおよびスクリーニングされるべき化合
物の存在下で過剰モルのイソペンテニルジホスファターゼ、ジメチルアリルジホ
スファターゼから合成されたGGPPの量を測定することにより決定され得る。この
反応は、反応混合物の存在下で、そしてGGPPの形成を促進する反応条件下で行わ
れる。上で列挙した基質は、例示の目的のためのみのものであり、多くの基質が
このアッセイにおいて使用され得る。hGGPSの特性を拮抗する、スクリーニング
されるべき化合物の能力を、合成されたGGPPの量を測定し、そしてその量と化合
物の非存在下で合成されたGGPPの量に相当する量と比較することにより決定する
。GGPSはHPLCにより精製され得、そしてLowryアッセイがこのタンパク質の量を
測定するために使用され得る。GGPPはまた、アミノ酸配列分析によって同定され
得る。
ヒトGGPSは細胞内において産生され、そして機能するので、いかなるアンタゴ
ニストも細胞内に存在せねばならない。hGGPSに対する潜在的なアンタゴニスト
は、細胞内で産生される抗体を含む。例えば、hGGPSを拮抗すると同定された抗
体は、当該業者に公知の手順(例えば、hGGPSの機能を妨害する単鎖抗体をコー
ドするDNAで適切な細胞を形質導入すること)により単鎖抗体として細胞内で産
生され得る。
別の潜在的なhGGPSアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製された
アンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、トリプルヘリックス形態ある
いはアンチセンスDNAまたはRNAによって遺伝子発現を調節するために使用され得
、これらの方法は両方とも、DNAまたはRNAにポリヌクレオチドが結合することに
基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
の5'コード部分は、長さにおいて約10から40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌ
クレオチドを設計するのに用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与
する遺伝子の領域に相補的になるように設計され(トリプルヘリックス、Leeら
、Nucl.Acids Res.、6:3073(1979);Cooneyら、Science、241:456(1988);およびD
ervanら、Science、251:1360(1991)を参照のこと)、それにより、hPFGSの転写
および産生が妨害される。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでそ
のmRNAとハイブリダイズし、そのmRNA分子のhGGPSポリペプチドへの翻訳をブロ
ックする(アンチセンス-Okano、J.Neurochem.、56:560(1991);遺伝子発現のア
ンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド、CRC Press,Boca Rato
n,FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、そのアンチセンスRNAまたは
アンチセンスDNAがhGGPSの産生を阻害するためにインビボで発現され得るように
、細胞に送達され得る。
潜在的なhGGPSアンタゴニストはまた、細胞膜を通過し、そしてポリペプチド
の触媒部位に結合し占拠し得、それによって正常な生物学的活性を妨げるように
、触媒部位を基質に接近させなくする低分子を含む。低分子の例として、小ペプ
チドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これに限定されない。
hGGPSポリペプチドおよびポリペプチドであるアンタゴニストはまた、インビ
ボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明に従って用いられ得、これは
しばしば、「遺伝子治療」といわれる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞
はポリペプチドで処置される患者に提供される。このような方法は当該分野で周
知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレト
ロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分
野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた
めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法による本発明のポリペブ
チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示により当業
者には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは
、レトロウイルス以外のもの(例えば、アデノウイルス)であり得る。これは、
適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用さ
れ得る。
ひとたびhGGPSポリペプチドが遺伝子治療を介して細胞内で発現されれば、そ
れは中枢のシグナル伝達タンパク質を修飾し、それにより、多くの疾患を処置す
るのに用いられ得る。例えば、hGGPSはGGPPの存在を増大し、そして細胞に適切
な形態学的表現型を回復させるのに用いられ得る。なぜならタンパク質プレニル
化の非存在下では、細胞は丸い屈折した形態に発達するからである。これは、微
小管の格子または中間のフィラメント構造における著しい変化を伴わないアクチ
ンケーブルの選択的な欠失のためである。このことはプレニル化されたタンパク
質が細胞内アクチンの状態および細胞の一般的な形態を調節することにおいて重
大な役割を果たすことを示す。これは高コレステロール状態のためにロバスタチ
ンのようなHMG-CoA還元酵素インヒビターの処置を受けている患者において重要
である。
hGGPSはまた、HMG-CoA還元酵素インヒビター処置の副作用である、横紋筋融解
(rhabdomyolysis)を処置するために使用され得、ここで筋細胞の形状は制御さ
れる。
hGGPSポリペプチドはまた、プログラムされた細胞死またはアポトーシスを抑
制するために使用され得る。メバロン酸合成のインヒビターであるロバスタチン
は、細胞に増殖および形態における変化を示させ、このようにして細胞はついに
はアポトーシスを介して死滅するように誘導される。メバロン酸はイソプレン脂
質の前駆体である。これは、細胞死を抑制する機構においてイソプレニル化タン
パク質が関与することを指摘する。
本発明のなおさらなる局面によれば、ヒトの疾患の処置用の治療学および診断
学を開発する目的のために、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの作製
に関するインビトロでの目的のための研究試薬として、このようなポリペプチド
、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法
が提供される。
hGGPSのアンタゴニストは、ガンに至る細胞の腫瘍性のトランスフォーメーシ
ョンを妨げるために使用され得る。これらのタンパク質のCaaボックスのシステ
イン残基に転移したプレニルピロリン酸由来のプレニル基を有さない所定のタン
パク質は、細胞の腫瘍性のトランスフォーメーションを妨げるように膜との相互
作用に影響し得ない。簡単には、所定のプロトオンコジーン産物はそれらのオン
コジーンの潜在力を発現するためにプレニル化を有さねばならない。
hGGPSアンタゴニストは、細胞内質細網状からゴルジ体への輸送に必要なrabタ
ンパク質のイソプレニル化をブロックすることにより、ウイルスエンベロープ前
駆体が、ゴルジ体区画に達することから防ぐ処置に使用され得る。
アンタゴニストは、アンタゴニストが細胞膜を通過し得る場合には、例えば本
明細書に後述するような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使
用され得る。
全長hGGPS遺伝子のフラグメントは、全長遺伝子を単離するためおよびこの遺
伝子に高い配列類似性を有する他の遺伝子または類似した生物学的活性を有する
他の遺伝子を単離するためのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプロー
ブとして使用され得る。このタイプのプローブは、一般的に少なくとも20塩基を
有する。しかし、好ましくは、このプローブは、少なくとも30塩基を有し、一般
的には50塩基を超えないが、より多数の塩基も有し得る。このプローブは、全長
転写物と一致するcDNAクローン、および調節領域およびプロモーター領域、エキ
ソン、ならびにイントロンを含む完全hGGPS遺伝子を含むゲノムクローンまたは
クローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの実施例は、オリゴヌ
クレオチドプローブを合成するための公知のDNA配列を使用することによるhGGPS
遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列と相補的な配
列を有する標識化オリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAの
ライブラリーをスクリーニングするのに用いられ、プローブがライブラリーのど
のメンバーにハイブリダイズするかが決定される。
本発明はまた、変異したhGGPS核酸配列の存在に関連する疾患または疾患に対
する感受性を検出するための診断アッセイの一部としてhGGPS遺伝子を使用する
ことに関する。このような疾患は、異常な細胞形態、細胞死、およびヒト先天性
脈絡欠如に関連し、X-結合形態の網膜変性が、ゲラニルゲラニルトランスフェ
ラーゼ遺伝子における変異により生じる。
hGGPS遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出
され得る。診断のための核酸は、患者の細胞(例えば、血液、組織生検、および
剖検物質)より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、
または分析前にPCRを用いることにより酵素的に増幅され得る(Saikiら、Nature
、324:163-166(1986))。RNAあるいはcDNAもまた同じ目的のために使用され得る
。一例として、hGGPSをコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、hGGPS変異
を同定および分析するのに使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺
伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により同定され得る。点
変異は、放射性標識されたhGGPS RNAまたは、あるいは、放射性標識されたhGGPS
アンチセンスDNA配列に、増幅させたDNAをハイブリダイズさせることにより検出
され得る。完全に対合した配列は、RNaseA消化または融解温度の差により、ミス
マッチした二重らせんと区別され得る。
DNA配列の相違に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル
におけるDNAフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成さ
れ得る。小さな配列の欠損または挿入は、高分離能ゲル電気泳動により視覚化さ
れ得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミドグラジエントゲル
上で区別され得る。このゲル中で、異なるDNAフラグメントの移動度は、それら
の特異的な融解温度または部分的融解温度に従い、異なる位置に、ゲル中で、遅
滞される(例えば、Myersら、Science、230:1242(1985))。
特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ(例えば、RNas
e保護およびS1保護または化学的切断法(例えば、cottonら、PNAS、USA、85:439
7-4401(1985)))により示され得る。
従って、特定のDNA配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、RNase保
護、化学的切断、直接的なDNA配列決定または制限酵素の使用(例えば、制限フ
ラグメント長多型(RFLP))、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような
方法により達成され得る。
より慣習的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサ
イチュ分析により検出され得る。
本発明はまた、種々の組織におけるhGGPSタンパク質のレベルの変化を検出す
るための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サンプルと比
較したこのタンパク質の過剰発現は、オンコジーン/シグナル伝達タンパク質の
膜局在における増大を示し、これは次にガンに関与する細胞の増大した増殖を示
し得るからである。宿主に由来するサンプル中のhGGPSタンパク質のレベルを検
出するために使用されるアッセイは、当業者には周知であり、そしてラジオイム
ノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイ、
および「サンドイッチ」アッセイを含む。
ELISAアッセイ(Coliganら、Current Protocols in Immunology,1(2),第6章、
(1991))は、最初にhGGPS抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
調製することを含む。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調
製される。このレポーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍
光、またはこの実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を結合させ
る。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する
固体支持体(例えば、ポリスチレンディッシュ)上でインキュベートされる。次
いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位は、BSAのような非特
異的タンパク質を用いてインキュベートすることにより覆われる。次に、モノク
ローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、モノクロー
ナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合された任意のhGGPSタンパク質と結
合する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液を用いて洗い出される。西
洋ワサビペルオキシダーゼと結合したレポーター抗体はここで、ディッシュ中に
置かれ、hGGPSと結合した任意のモノクローナル抗体に対するレポーター抗体の
結合を生じる。次いで、非付着レポーター抗体は、洗い出される。次いで、ペル
オキシダーゼ基質が、ディッシュに加えられ、そして所定の時間内の発色量は、
標準曲線と比較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在するhGGPSタンパ
ク質量の測定値である。
競合アッセイが、使用され得る。ここで、hGGPSに特異的な抗体は、固体支持
体に付着し、そして標識hGGPSおよび宿主由来のサンプルは、固体支持体上を通
過され、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出さ
れた標識の量は、サンプル中のhGGPS量と相関し得る。
「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」
アッセイにおいて、hGGPSは固体支持体上を通過され、そして固体支持体に付着
した抗体と結合する。次いで、第2の抗体をhGGPSと結合させる。次いで、標識
され、かつ第2の抗体に特異的な第3の抗体は、固体支持体上を通過され、そし
て第2の抗体に結合し、次いで、量が定量され得る。
本発明のhGGPSポリペプチドおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリア
と組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的に有効な量のポリペ
プチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキ
ャリアとして、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定さ
れない。処方は、投与様式に合わせるべきである。
本発明はまた、1つ以上の本発明の薬学的組成物の成分で満たされた1つ以上
の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤ま
たは生物製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形
式の注意を伴い得、この注意はヒトへの投与についての製造、使用、または販売
の政府機関による認可を反映する。さらに、薬学的組成物は、他の治療的化合物
と結びつけて用いられ得る。
この薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、皮
内経路のような便利な様式で投与され得る。この薬学的組成物は、特定の適応の
処置および/または予防に有効な量で投与される。一般的に、それらは、少なく
とも約10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、1日あたり約8mg
/kg体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、投与量は、投与経路、症
状などを考慮して、1日あたり約10μg/kg体重〜約1mg/kg体重である。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染
色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る
。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色***
置の標識に利用可能な実際の配列データ(反復多型)に基づいた染色体標識試薬
はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と
疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第1段階である。
簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を
調製することにより染色体にマップされ得る。3’非翻訳領域のコンピューター
解析が、ゲノムDNA内で1より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセ
スを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これ
らのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリー
ニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみ
が増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て
るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明
を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大き
なゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性の決定(sublocalization)が達
成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(flow-sorted
)染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築
するためのハイブリダイゼーションによる前選択を含む。
cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼー
ション(FISH)は、1工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。こ
の技術は、500または600塩基という短いcDNAで使用され得る;しかし、2,000bp
よりも長いクローンの方が、簡便な検出のために充分なシグナル強度でユニーク
な染色***置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要と
し、そしてこのクローンはより長いことが好ましい。例えば、2,000bpが良好で
あり、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、良好な結果に
時間の合理的な割合を得るためにおそらく必要でない。この技術の総説としては
、Vermaら,Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques,Pergamon Pre
ss,New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色***置にマップされると、配列の染色体上での物理的な
位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、
V.McKusick,Mendelian Inheritance in Manに見出される(Johns Hopkins Univ
ersity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同
一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析(物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝)により同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する
必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体
には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子でありそうである。
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患
に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原
因遺伝子の1つであり得る。(これは、1メガベースのマッピング解像度で、そ
して20kbあたり1遺伝子と仮定する。)
このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらの
アナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗
体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗
体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの
産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグ
メントの産生のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ
得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた
抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ
メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体
を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle
rおよびMilstein,1975,Nature,256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞
ハイブリドーマ技術(Kozborら,1983,Immunology Today4: 72)、およびヒトモ
ノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら,1985,Mono
clonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げら
れる。
単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発
明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る
。
また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対
するヒト化抗体の発現に使用され得る。
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する;しかし、本発明はこのよ
うな実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は
、他に明記しない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い所定の方法および
/または用語が記載される。
「プラスミド」は、先行する小文字のpおよび/またはそれに続く大文字およ
び/または数字により命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり
、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能な
プラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミ
ドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触
媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市
販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者
に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には1μgのプラスミドまた
はDNAフラグメントには、約2単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。
プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には5〜5
0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限
酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にて
の約1時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者
の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接
電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら,Nucleic Acids Res.,8: 4
057(1980)により記載された8%ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
「オリゴヌクレオチド」は、1本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに
連結する。
「連結」は、2つの2本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなけれ
ば、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきDNAフラ
グメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を用いて達成さ
れ得る。
記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb,A.,Virology,52:
456-457(1973)の方法に記載のように行った。
実施例1 hGGPS の細菌発現および精製
hGGPSをコードするDNA配列(ATCC受託番号第75900号)を、プロセスされたhGG
PS核酸配列の5'および3'末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて最初に増幅する。hGGPSに対応するさらなるヌクレオチドを、5'およ
び3'配列にそれぞれ添加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'A
GAGGATCCGCCATGGAGAAGACTCAAGAA3'(配列番号3)を有し、BamHI制限酵素部位
(下線)、それに続いてプロセスされたタンパク質の推定上の末端アミノ酸から
始まるhGGPSコード配列の18ヌクレオチドを含む。3'配列5’CGTTGGCTAGCCTTAT
TCATTTTCTTCTTTGGA3'(配列番号4)は、NheI部位(下線)に相補的な配列、そ
れに続いてhGGPSの18ヌクレオチドを含む。これらの制限酵素部位は、細菌発現
ベクターpQE-9(Qiagen、Inc.、Chatsworth、CA)上の制限酵素部位に対応する
。pQE-9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調節可能プロ
モーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Hisタグ、およ
び制限酵素部位をコードする。次いで、およびpQE-9をBamHIおよびXbaIで消化す
る。増幅された配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコード
する配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、M15/rep4の
商標でQiagenから入手可能なE .coliM15株をSambrook,J.ら、Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,(1989)に記載の手
順により形質転換する。M15/rep4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマ
イシン耐性(Kanr)を付与するプラスミドpREP4のマルチコピーを含有する。形
質転換体をLBプレート上で増殖する能力により同定し、そしてアンピシリン/カ
ナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離して、制限酵素分析
により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp(100μg/ml)および
Kan(25μg/ml)の両方を補充したLB培地における液体培養で一晩(O/N)増殖さ
せる。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を
、600の光学密度(O.D.600)が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、
IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を加えて1mMの最終濃
度にする。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化し、P/Oリーディングを解放する
ことによって遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに3〜4時間増殖させる
。次いで、細胞を遠心分離により収集する。この細胞ペレットをカオトロピック
薬剤6MグアニジンHCl中で可溶化する。明澄化の後、6-HIsタグを含有するタンパ
ク質による緊密な結合を可能にする条件下でのニッケル−キレートカラムにおけ
るクロマトグラフィーによって、この溶液から可溶化hGGPSを精製する(Hochuli,
Eら、J.Chromatography 471:177-184(1984))。hGGPS(90%純粋)を6MグアニジンH
Cl pH5.0でカラムから溶出し、そして再生のために3MグアニジンHCl、100mMリ
ン酸ナトリウム、10mMグルタチオン(還元型)、および2Mグルタチオン(酸化
型)に調整する。この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タンパク質
を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。
実施例2 バキュロウイルス発現系を用いるhGGPSのクローニングおよび発現
全長のhGGPSタンパク質をコードするDNA配列(ATCC受託番号第75900号)を、
この遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて増幅する。
5'プライマーは、配列5’GCCAGAGGATCCGCCACCATGGAGAAGACTCAAGAAACA 3'(
配列番号5)を有し、BamHI制限酵素部位(太字)、それに続いて真核細胞にお
ける翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する6ヌクレオチド(Kozak,M.,J.
Mol.Biol.,196,947-950,(1987))を含み、それはhGGPS遺伝子の最初の21ヌク
レオチドの直ぐ後にある(翻訳開始コドン「ATG」に下線を付す)。
3'プライマーは、配列5’CGTTGGCTAGCCTTATTCATTTTCTTCTTTGGA 3'(配列番
号6)を有し、制限エンドヌクレアーゼNheIの切断部位およびhGGPS遺伝子の3'
非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット
(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて、1%アガロースゲル
より単離する。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびNhe
Iで消化し、次いで1%アガロースゲルで再度精製する。このフラグメントを、F
2と称する。
ベクターpA2(pVL941ベクターの改変体、下記)をバキュロウイルス発現系を用
いるhGGPSタンパク質の発現のために用いる(総説について、Summers,M.D.およ
びSmith,G.E.1987,A manual of methods for baculovirus vectors and inse
ct cell culture procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bull
etin No.1555を参照のこと)。この発現ベクターは、Autographa californica
核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続い
て制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミアンウイル
ス(SV)40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。
組換えウイルスを容易に選択するために、E.coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺
伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルの前に、ポリヘドリンプ
ロモーターと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、コトランスフェクトされ
た野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列と両端で隣
接する。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る
。例えば、pAc373、pVL941,およびpAcIM1である(Luckow,V.A.およびSummers
,M.D.、Virology,170:31-39)。
プラスミドを制限酵素BamHIおよびXbaIで消化する。次いで、このDNAを、市販
のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて1%アガロースゲ
ルから単離する。このベクターDNAをV2と称する。
フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連
結する。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびPstI
を用いて、hGGPS遺伝子を有するプラスミド(pBac hGGPS)を含有する細菌を同
定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。
5μgのプラスミドpBac-hGGPSを、リポフェクション法(Felgnerら Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販の線状化し
たバキュロウイルス(「BaculoGoldTM baculovirus DNA」,Pharmingen,San Di
ego,CA.)とともにコトランスフェクトする。
1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラスミドpBachGGPSを、50μl
の無血清Grace培地(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)を含むマイ
クロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlリポフェクチ
ンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベ
ートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清Grace培地1ml
を有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に
滴下する。このプレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振
盪する。次いでプレートを、27℃で5時間インキュベートする。5時間後、トラ
ンスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10%ウシ胎児血清を補充し
た1mlのGrace昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そし
て27℃で4日間培養を続ける。
4日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith(前出)による記載と同様
にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単
離を可能にする、「Blue Gal」(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)を有
するアガロースゲルを用いる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li
fe Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュ
ロウイルス学の使用者ガイド(9〜10頁)においても見い出され得る)。
ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた4日後、青く染色されたプラークをエッ
ペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、20
0μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、簡単な
遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディ
ッシュに播種されたSf9細胞を感染させるために用いる。4日後、これらの培養
ディッシュの上清を回収し、次いで4℃で保存する。
Sf9細胞を、10%熱失活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させる。細胞を、
感染多重度(MOI)2で組換えバキュロウイルスV-hGGPSで感染させる。6時間後
、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないSF900 II培
地(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)に置き換える。42時間後、5μCi
の35S-メチオニンおよび5μCiの35Sシステイン(Amersham)を添加する。細
胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そし
てSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視化
する。
実施例3 COS 細胞における組換えhGGPSの発現
プラスミドhGGPS HAの発現は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)
に由来する:1)SV40複製起点、2)アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複
製起点、4)ポリリンカー領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化部位が
続くCMVプロモーター。hGGPS前駆体全体およびその3'末端にインフレームで融
合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域
にクローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下で
支配される。HAタグは、以前に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タ
ンパク質由来のエピトープに対応する(I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A
Cherenson,M.Connolly、およびR.Lerner、1984,Cell 37,767)。本発明者
らの標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体での
組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する:
hGGPSをコードするDNA配列(ATCC受託番号第75900号)を、以下の2つのプラ
イマーを用いてPCRにより構築した:5'プライマー5’GCCAGAGGATCCATGGAGAAGA
CTCAAGAAACA 3'(配列番号7)は、BamHI部位とそれに続いて開始コドンから始
まる21ヌクレオチドのhGGPSコード配列を含む;3'配列5’CGGCTGCTAGCCTCAAGC
GTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTCATTTTCTTCTTTGGA 3'(配列番号8)は、NheI部位
、翻訳停止コドン、HAタグ、およびhGGPSコード配列の最後の18ヌクレオチド(
停止コドンは含まない)に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、BamHI部
位、
インフレームで融合されたHAタグが続くhGGPSコード配列、HAタグに隣接する翻
訳終了停止コドン、およびNheI部位を含む。PCRで増幅されたDNAフラグメントお
よびベクターpcDNAI/Ampを、BamHIおよびNheI制限酵素により消化し、そして連
結する。連結混合物を、E .coliSURE株(Stratagene Cloning Systems,La Jolla
,CA)に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種
し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、
そして正しいフラグメントの存在について制限分析により試験する。組換えhGGP
Sの発現のために、COS細胞を、DEAE-DEXTRAN法(J.Sambrook,E.Fritsch.T.
Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory
Press,(1989))により発現ベクターでトランスフェクトする。hGGPS HAタンパ
ク質の発現を、放射標識および免疫沈降法(E.Harlow,D.Lane,Antibodies:
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988))により
検出する。細胞を、トランスフェクションの2日後、35S-システインで8時間標
識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(RIPA緩衝液(150mM
NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、1% NP-40、0.5% DOC、50mM Tris(pH7.5))(W
ilson,I.ら、同上 37:767(1984))で溶解する。細胞溶解物および培養培地の両
方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させる。沈降したタンパク質を
15% SDS-PAGEゲルで分析する。
実施例4 ヒト組織におけるhGGPSの発現パターン
ヒト組織におけるhGGPSの発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析を
行う。総細胞RNAサンプルを、RNAzolTMB システム(Biotecx Laboratories,Inc.
Houston,TX)を用いて単離する。指定したそれぞれのヒト組織から単離した約10
μgの総RNAを1%アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロ
ットする(Sambrook,FritschおよびManiatis,Molecular Cloning,Cold Spring
Harbor Press,(1989))。標識反応を、Stratagene Prime-Itキットによって50ng
のDNAフラグメントを用いて行う。標識されたDNAを、Select-G-50カラムを用い
て精製する。(5 Prime-3 Prime,Inc.Boulder,CO 80303)。次いで、フィルタ
ーを0.5M NaPO4(pH7.4)および7% SDS中で65℃にて一晩、1,000,000cpm/mlで
放射標識された完全長hGGPS遺伝子とハイブリダイズする。次いでフィルターを
、0.5×SSC、0.1% SDSを用いて室温で二回、および60℃で二回洗浄した後、フ
ィルターを増強スクリーンを用いて-70℃で一晩露出する。
本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考慮すれば可能であり、したが
って、特に記載された以外にも、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され
得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 48/00 ADU C07K 16/40
C07K 16/40 G01N 33/15 Z
G01N 33/15 A61K 37/02 ADY
(72)発明者 ローゼン,クレイグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル,ローリング ヒル ロー
ド 22400
(72)発明者 カークネス,エウェン エフ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20832,
オルニー,リトル ビスタ テラス 2519
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド; (a)配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、および該ポリペプ チドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド; (b)ATCC寄託番号第75900号中に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列 を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま たは誘導体をコードするポリヌクレオチド。 2.前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 3.前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 4.前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオ チド。 5.前記ポリヌクレオチドが配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ ドをコードする、請求項2に記載のポリヌクレオチド。 6.前記ポリヌクレオチドがATCC寄託番号第75900号のcDNAによってコードされ るポリペプチドをコードする、請求項2に記載のポリヌクレオチド。 7.配列番号1に示されるコード配列を有する、請求項1に記載のポリヌクレオ チド。 8.請求項2に記載のDNAを含むベクター。 9.請求項8に記載のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。 10.ポリペプチドを産生させるプロセスであって、請求項9に記載の宿主細胞 から前記DNAによってコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、 プロセス。 11.ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するプロセスであって、請求項8に 記載のベクターで細胞を形質転換する工程を包含する、プロセス。 12.請求項2に記載のDNAとハイブリダイズし得、かつhGGPS活性を有するポリ ペプチドをコードする単離されたDNA。 13.以下からなる群から選択されるポリペプチド:(i)配列番号2の推定アミ ノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および 誘導体;および(ii)ATCC寄託番号第75900号のcDNAによりコードされるポリペプ チド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体。 14.前記ポリペプチドが配列番号2の推定アミノ酸配列を有する、請求項13 に記載のポリペプチド。 15.請求項14に記載のポリペプチドに対する抗体。 16.請求項14に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。 17.hGGPSの必要性を有する患者の処置のための方法であって: 請求項14に記載のポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与する工程を包含 し、ここで該投与は、該ポリペプチドをコードするDNAを該患者に提供し、そし て該ポリペプチドをインビボで発現させることによって行われる、方法。 18.hGGPSを阻害する必要性を有する患者の処置のための方法であって: 請求項16に記載のアンタゴニストの治療的有効量を該患者に投与する工程を包 含する、方法。 19.前記投与が、前記アンタゴニストをコードするDNAを前記患者に提供し、 そして該アンタゴニストをインビボで発現させることによって行われる、請求項 18に記載の方法。 20.以下の工程を包含するhGGPSに対するアンタゴニストとして活性な化合物 を同定するためのプロセス: hGGPS、スクリーニングされるべき化合物、およびhGGPSと相互作用し、GGPPを産 生し得る基質を含有する混合物を組み合わせる工程;および 形成されたGGPPの量を測定することによりhGGPSの該基質への結合を妨害する該 化合物の能力を決定する工程。 21.宿主におけるhGGPS核酸配列中の変異に関する疾患または疾患に対する感 受性を診断するためのプロセスであって: 宿主由来のサンプル中のhGGPS核酸配列における変異を決定する工程を包含する 、プロセス。 22.宿主由来のサンプル中の請求項13に記載のポリペプチドの存在について 分析する工程を包含する、診断プロセス。
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