KR20070011892A - Ｍｓｘ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를유효성분으로 포함하는 세포사멸유도제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 새로운 용도에 관한 것으로, 구체적으로 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제에 관한 것이다. 본원발명에 따른 Msx1을 포함하는 세포사멸 유도제는 p53과 상호작용하여 p53 단백질을 인산화시키고 핵으로의 이동을 증가시켜 p53 단백질의 세포사멸 효과를 유도할 수 있으며, 특히 내인성 야생형 p53 단백질을 포함하고 있지만, 이의 불활성화에 의한 종양 세포의 사멸에 효과적으로 사용될 수 있다.

Msx1, 호메오도메인, p53, 세포사멸, 종양억제

Description

Ｍｓｘ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 세포사멸유도제{A NOVEL AGENT COMPRISING MSX1 OR GENE ENCODING THE SAME AS AN ACTIVE INGREDIENT FOR INDUCING APOPTOSIS IN CANCER CELLS}

도 1은 Msx1 과발현 HeLa 세포(full Msx1 vector) 및 대조군 세포(control vector)에서 Msx1이 세포사멸에 미치는 영향을 관찰한 도면이며, 도 1A는 세포의 형태를 광학현미경으로 관찰한 사진이고, 도 1B는 세포 성장에 미치는 영향을 MTT 분석으로 나타낸 그래프이고, 도 1C는 핵에 미치는 영향을 DAPI 염색을 하여 형광현미경으로 관찰한 사진이고, 도 1D는 세포를 아넥신(Annexin) V-FITC 및 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide)로 이중 염색한 후 FACS로 분석한 그래프이다.

도 2는 Msx1 과발현 HeLa 세포(full Msx1 vector) 및 대조군 세포(control vector)에서 Msx1이 p53에 미치는 영향을 관찰한 도면이며, 도 2A는 Msx1 및 p53의 mRNA 및 단백질을 각각 노던 블롯 및 웨스턴 블롯으로 관찰한 사진이고, 도 2B는 지시된 시간 동안 세포에 사이클로헥시미드를 처리한 후, p53, 베타-액틴 및 HPV-E6 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯으로 관찰한 사진이고, 도 2C는 Msx1이 p53의 인산화에 미치는 영향을 세린아미노산에 특이적인 p53 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이고, 도 2D는 Msx1 과발현 HeLa 세포에서 핵(DAPI), p53 및 Msx1의 위치를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 3A는 Msx1과 p53과의 상호작용 부위를 밝히기 위해 Msx1의 일부가 결실된 4가지 종류의 Msx1 컨스트럭트를 나타낸 모식도이다.

도 3B는 도 3A의 4가지 종류의 Msx1 및 p53과의 상호작용을 이스트 투-하이브리드 분석으로 나타낸 사진(좌) 및 그래프(우)이다.

도 3C는 GST-p53 및 pCB6/Msx1-발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터 단독을 트랜스펙션한 HeLa 세포의 총 세포 용출액을 글루타치온-아가로즈 비드로 풀-다운한 후, p53과 Msx1과의 상호작용을 p53 항체 및 Msx1 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 관찰한 사진이다.

도 4A는 pEGFP, pEGFP/full Msx1 또는 pEGFP/Msx1(-HD)를 트랜스펙션한 HeLa 세포에서 EGFP 발현(상) 및 핵 검출을 위한 DAPI 염색(하)을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 4B는 pEGFP, pEGFP/full Msx1 또는 pEGFP/Msx1(-HD)을 트랜스펙션한 HeLa 세포의 콜로니 형성을 확인한 사진이다.

도 4C는 pEGFP, pEGFP/full Msx1 또는 pEGFP/Msx1(-HD)를 트랜스펙션한 HeLa 세포에서 p53, 베타-액틴 및 GFP의 발현을 웨스턴 블롯으로 관찰한 사진이다.

도 4D는 CMV-p53 및 pEGFP/full Msx1-발현 벡터 또는 CMV-p53 단독을 트랜스펙션한 H1299 세포에서 p53, Msx1 및 베타-액틴의 발현을 웨스턴 블롯으로 관찰한 사진이다.

도 4E는 정해진 양의 CMV-p53 및 증가하는 양의 전장 Msx1-발현 벡터를 H1299 세포에 공트랜스펙션하여 p53, Msx1 및 베타-액틴의 발현을 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.

도 5A는 HeLa 자궁경부암 암종 세포를 BALB/c 누드 마우스에 피내 주사하여, 종양 부피가 100 mm³에 달했을 때, 5x10⁸ pfu Ad-Msx1, Ad-p53 또는 Ad-Mock 아데노바이러스를 종양에 주입하여 종양의 부피를 측정한 그래프이다.

도 5B는 Ad-Msx1, Ad-p53 또는 Ad-Mock 아데노바이러스를 주입한 종양의 용출물에서 Caspase 3, Bax 및 베타-액틴의 발현을 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.

도 5C는 Ad-Msx1, Ad-p53 또는 Ad-Mock 아데노바이러스를 주입한 종양에서 핵을 관찰하기 위한 DAPI 염색 및 세포사멸 분석을 위한 TUNEL 분석 결과를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

본 발명은 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 새로운 용도에 관한 것으로, 구체적으로 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제에 관한 것이다.

세포사멸(apotosis)은 진핵세포에서 나타나는 세포의 파괴 또는 자살을 의미하는 것으로 (Kerr et al., British Journal of Cancer, 26: 239-257, 1972) 동물의 정상적인 발생조절 및 불필요하거나, 비정상적인 손상된 세포의 제거 등 개체의 항상성 유지를 위해 반드시 요구되는 생리학적으로 매우 중요한 현상이다. 이러한 세포사멸은 세포질의 파괴, 세포막의 기포형성(blebbing), 세포 수축 및 염색체의 응축 등으로 특징되며, 가장 특징적인 현상은 게놈 DNA가 엔도뉴클레아제에 의해 180-200bp의 뉴클레오솜 크기의 단편으로 절단되어 (Kerr et al., British Journal of Cancer, 26: 239-257, 1972) 아가로스 겔 전기영동 시 사다리 모양의 밴드로 나타나는 것이다.

세포사멸의 생체내 기능과 관련하여 특히 관심을 끄는 것은 세포사멸에 의한 개체 내 비정상적인 세포의 제거이다. 세포의 DNA 손상, 저산소증, 발암유전자의 활성에 의한 비정상세포에서의 신호전달체계의 불균형은 세포사멸을 촉진하는데, 이 경우 세포사멸의 억제는 암의 발생으로 이어질 수 있기 때문에 특히 암세포에서 세포사멸의 기전을 이해하려는 연구가 활발히 수행되어져 왔다.

이와 관련하여, 세포사멸억제에 의한 암발생에 있어 가장 중요한 기능을 하는 대표적 유전자로는 p53을 들 수 있으며, Myc과 같은 발암유전자에 의한 비정상적 세포성장을 나타내는 세포에서 p53이 세포사멸의 매개자로서 이러한 세포의 제거에 관여한다는 것이 밝혀졌다(Vogelstein et al., Nature 408: 307-310, 2000; Vousden et al., Nat. Rev. Cancer, 2:594-604, 2002). p53은 손상된 DNA의 수리, 세포주기 조절에 관여하는 대표적인 종양 억제 단백질로, 특정 유전자의 프로 모터 내 표적 서열에 대한 높은 친화성을 가진 전사조절인자로 작용하여 표적 유전자의 발현을 전사수준에서 조절하여 세포의 분열을 억제하거나 또는 손상된 DNA를 갖거나 비정상적인 분열을 하는 비정상적인 세포를 선택적으로 파괴하여 이들 세포의 암으로의 진행을 막는데 중요한 역할을 한다(Oda et al., Cell, 102:849-862, 2000).

따라서 p53 기능의 불활성화는 암의 발생과 밀접한 연관을 가지고 있으며, 이러한 p53 기능 불활성화의 원인은 크게 p53의 돌연변이성과 비돌연변이성으로 나눌 수 있다. 전자는 p53 유전자의 결함(돌연변이)에 의한 p53 단백질 자체의 기능 결함을 의미하며, 후자는 p53 유전자의 결함을 수반하지 않는 것으로 야생형 p53 단백질을 발현하지만, 이의 기능이 다른 요인에 의해 불활성화된 것을 의미한다. 예컨대 인간에서 발견되는 암의 50%에서 p53 유전자에 점돌연변이를 포함한 결함이 발견되지만, p53이 정상인 경우에도 바이러스 유래의 발암단백질(oncoprotein)과의 상호작용에 의해 p53이 불활성화되어 암이 발생하기도 한다. 따라서, 후자의 경우에 있어서는 본래 정상인 p53의 기능을 재활성화하여 세포사멸을 유도함으로써 암을 효과적으로 치료할 수 있다.

이러한 p53의 세포내 기능은 여러 가지 요인에 의해 조절되는데, 예를 들면 번역 후 변형(modification), 안정화(분해조절), 다른 단백질과의 상호작용 및 세포내 위치 변동을 포함하는 몇 가지 기작에 의해 조절된다. 이 중 가장 효과적인 조절기작 중의 하나가 p53 단백질의 분해를 조절하는 것으로 많은 수의 발암단백질이 분해조절기작을 통하여 암을 유발하는 것으로 알려졌다.

정상세포에서, 발현된 p53 단백질은 일정 시간 경과 후 유비퀴틴(ubiquitin)-의존적인 단백질 가수분해(proteolysis)에 의해 분해되는데 이 과정에서 Mdm2 (Murine double minute 2)가 중요한 조절인자로서 작용하며 p53 단백질의 핵 밖으로의 이동(nuclear export) 및 안정성을 조절함으로서 p53의 분해에 영향을 미쳐 암을 일으킬 수 있다는 것이 보고되었다 (Ashcroft et al., Oncogene, 18: 7637-7643, 1999; Yang et al., 23: 2096-2106, 2004; Boyd et al., Nat. Cell Biol., 2: 563-568, 2000). Ras, RB 및 TSG101과 같은 발암단백질은 Mdm2에 의해 매개되는 p53의 분해를 조절함으로써 p53의 안정성에 영향을 준다는 최근 보고가 있다(Michael et al., Semin. Cancer Biol, 13: 49-58, 2003). 자궁경부암의 원인으로 지목받는 인간 파필로마바이러스 (papillomavirus, HPV) 유래의 E6 단백질(Hausen et al., J. Natl. Cancer Inst., 92: 690-698, 2000)의 경우도 p53 분해를 조절하여 HPV-양성 경부 암을 발생시킨다는 것이 보고되었다 (Hengstermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98: 1218-1223, 2001). 그러므로, 정상 p53 단백질의 불활성화에 의한 암의 경우 p53의 재활성화에 의한 세포사멸의 유도가 가장 효과적인 치료법이 될 수 있다.

종래에는 p53에 의한 세포사멸 과정에서 이와 상호작용하는 단백질을 발견하려는 많은 노력이 있었다. 예를 들면, US2004/0038243은 p53에 의해 유도되는 유전자를 스크리닝하는 방법을 통하여 새로운 세포사멸 관련 유전자, p53AIP1을 개시한다.

WO2004/035580은 종양 세포에서 야생형 p53의 세포사멸 유도 능력을 복구하 는 능력이 있는 저분자량 화합물을 개시한다.

US2004/253595는 Ser 64 인산화를 통하여 p53 기능을 조절함으로써 p53-의존적인 아포토시스를 유도하는 p53-유도된 핵단백질, p53-의존적인 손상 유발 핵 단백질1(p53-dependent Damage-Inducible Nuclear Protein 1, p53DINP1)을 개시한다.

그러나, 상기 문헌은 정상 p53에 의해서 유도되는 세포사멸 단계에서 작용하는 유전자/단백질만을 개시할 뿐, 불활성화된 정상 p53과 직접 상호작용하여 이를 재활성화시켜 세포사멸을 유도할 수 있는 보다 직접적이고 효과적인 방법 또는 물질은 개시하지 않는다.

이에, 본 발명자들은 p53과 상호작용하여 p53에 의한 세포사멸을 유도할 수 있는 유전자를 탐색하던 중, Msx1 단백질이 p53과 상호작용하여 세포사멸을 유도할 수 있음을 발견하였다.

Msx1은 32kDa의 전사조절인자로 종전에 이의 생화학적 특성 및 생리학적 기능, 즉 배발생에서의 역할 (Bendall et al., Gene, 247: 17-31, 2001) 및 모발, 치아의 성장 등, 재생성능과 관련되어 있음이 밝혀져 있었으나, p53과 상호작용 및 이에 의한 세포사멸의 유도에 관하여는 알려진바 없다.

본 발명자들은 Msx1 단백질이 호메오도메인을 통하여 p53과 상호작용하여 p53을 인산화하여 안정화시키고 이의 핵 내로 이동을 증가시켜 시험관 내 및 생체 내 조건에서 세포사멸을 유도하여 종양 성장을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 새로운 용도, 구체적으로 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제를 제공하는 것이다. 본 발명은 p53과 상호작용하여 이를 인산화시키고 핵 내 이동을 증가시켜 세포사멸을 유도할 수 있으며, 특히 정상적인 내인성 p53의 불활성화에 의한 종양의 억제에 효과적으로 사용될 수 있는 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제를 제공하는 것이다.

상기 목적 달성을 위해 본 발명은 Msx1 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 Msx1 단백질의 호메오도메인 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 유전자가 비 바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 세포사멸은 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용은 p53의 분해방지, p53의 인산화 및 p53의 핵내 이동을 초래하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 세포사멸이 종양세포에서 발생하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 종양세포가 불활성화된 야생형 p53 단백질 또는 이와 기능적 동등한 변이체를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 종양세포는 난소암, 자궁경부암 또는 폐암 유래인 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제를 제공한다.

본 발명은 또한 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 p53 단백질 조절제를 제공한다.

본 발명은 또한 Msx1 단백질의 호메오도메인, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 p53 단백질 조절제를 제공한다.

본 발명은 또한 p53 단백질 조절이 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 p53 단백질 조절제를 제공한다.

본 발명은 또한 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용은 p53의 분해방지, p53의 인산화 및 p53의 핵내위치화를 초래하는 것을 특징으로 하는 p53 단백질 조절제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Msx1 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제에 관한 것으로, 상기 Msx1 단백질은 이의 호메오도메인을 통하여 p53과 작용하여 세포사멸의 효과를 나타내므로 Msx1 단백질의 호메오도메인, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체 또한 효과적인 세포사멸 유도제로 사용될 수 있다.

Msx1 단백질은 약 32 kDa의 호메오도메인을 포함하는 호메오단백질로 다양한 종 유래의 진핵세포에 존재하며, 본원발명에 따른 세포사멸의 효과를 나타낼 수 있는 한 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 Msx1 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체가 본원발명의 범위에 포함되며, 예를 들면 사람 유래의 서열번호 1의 Msx1 단백질 및 서열번호 2의 Msx1 단백질을 코딩하는 유전자가 이에 포함된다.

Msx1 유래의 호메오도메인 또는 이를 코딩하는 유전자는 본원발명에 따른 세포사멸 효과를 나타낼 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니며, 다양한 포유류 유래의 Msx1 단백질의 호메오도메인, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체도 본원발명의 범위에 포함되며, 예를 들면 서열번호 1의 사람 유래의 Msx1 단백질의 아미노산 잔기 166-225 및 서열번호 2의 Msx1 유전자의 뉴클레오티드 496-675가 이에 포함된다.

본 발명의 Msx1 단백질 또는 이의 호메오도메인을 암호화하는 유전자는 게놈 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA를 포함한다. 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

게놈 DNA는 예를 들어, Msx1 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA(예를 들어, 서열번호 2)를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA(예를 들어, 서열번호 2)에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 폴리머라제연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 행함으로써 제조할 수도 있다.

cDNA는 예를 들어, Msx1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.

용어 “기능적으로 동등한 변이체”란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 유전자 서열과 비교하여 변이가 있지만 p53과 상호작용하여 세포사멸을 유도할 수 있는 기능을 갖는 것을 말한다. 따라서, 예를 들면 본원발명의 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 사람 유래의 서열번호 1의 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 서열번호 2의 유전자와 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다.

이러한 유전자에는 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 을 암호화하는 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함한다.

아미노산 서열이 변화된 단백질을 암호화하는 DNA는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법(site-directed mutagenesis, Kr amer, W.& Fritz, H-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplux DNA. Methods in Enzymology, 154, 350-367, 1987) 등에 의해 제조될 수 있다. 또, 염기서열의 변이에 의해 암호화하는 단백질의 아미노산 서열 변이는 자연적으로도 발생된다. 이와 같이, 야생형 Msx1 단백질을 암호화하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자도 야생형 Msx1 단백질(서열번호 1)과 동등한 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 한, 본 발명의 유전자에 포함된다.

나아가, 예를 들어, 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중변이)도 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 유전자에 포함된다.

서열번호 1의 Msx1 단백질과 기능적으로 동일한 단백질을 암호화하는 유전자는 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 혼성화 기술(Southern, E.M., Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)이나 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 당업자라면 Msx1 유전자의 염기서열(서열번호 2)로부터 Msx1 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프라이머를 고안하여 Msx1 유전자와 높은 상동성을 가지는 다양한 포유류 유래의 Msx1 유전자를 분리할 수 있을 것이다. 이러한 혼성화 기술이나 PCR 기술에 의해 분리되는 Msx1 단백질과 동일한 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자도 또한 본 발명의 유전자에 포함된다.

이렇게 분리된 유전자는 아미노산 수준에 있어서, Msx1 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 높은 상동성을 가진다고 생각된다. 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다.

아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램(Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)을 사용하여 분석될 수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다(http://www,ncbi.nlm.nih.gov.).

본 발명의 p53을 표적으로 하는 세포사멸 유도제는 상기에 언급한 Msx1 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함할 수 있다.

유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 경우, Msx1 단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 DNA 기술 등 공지된 방법에 따라, 표적세포 예를 들면 포유류 유래의 종양세포에서 Msx1 유전자를 발현할 수 있는 한 이로 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 선형 DNA, 플라스미드 벡터 또는 그 외 DNA 전달용 벡터로 도입되어 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 바람직하게는 비바이러스성이며, 진핵세포에서 Msx1 유전자를 발현할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 pCB6+/Msx1(Zhang et al., Mol. Cell Biol., 17: 2920-29232, 1997) 또는 pEGFP/Msx1(1-297)(Park et al., Cancer Res., 65: 749-759, 2005)을 포함한다.

단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 경우, 예를 들면 상기 벡터를 공지된 방법에 따라 세포배양 시스템에서 적절한 세포에 트렌스펙션하여 발현시킨 후 Msx1 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 Msx1 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.

또한 본 발명의 Msx1 유전자는 유전자치료 시스템 등에 사용되는 발현벡터 예를 들면 바이러스벡터에 도입되어 공지된 방법에 따라 전달체로서 바이러스입자에 포함되어 사용될 수 있다. 상기의 바이러스 벡터는 본 발명의 Msx1 단백질을 관심있는 조직내로 도입할 수 있는 것이면 제한되지 않으며 바람직하게는 아데노바이러스 벡터이며, 상기 바이러스성 벡터는 진핵세포에서 이에 포함된 유전자를 발현할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니나, p△ACMVMsx1(Ad-Msx1)일 수 있다(Park et al., Cancer Res., 65: 749-759, 2005).

본 발명의 실시예에서는 예로서 비바이러스성 벡터를 사용하여 HeLa세포에 Msx1 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 유도하였다.

이러한 본 발명에 따른 세포사멸 유도제에 의한 세포사멸은 Msx1 단백질 또는 Msx1의 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용에 의해 달성되며, 이러한 상호작용은 p53의 분해방지, p53의 인산화 및 p53의 핵내 이동을 초래한다.

p53 단백질은 일반적으로 합성 후에 세린(serine) 잔기에서의 인산화에 의해 활성화되어 핵으로 이동하여 전사인자로서 특정 유전자의 발현에 관여하게 되며 (Liang et al., Eur. J. Biochem. 268, 2779-2783, 2001), 이러한 p53의 조절은 주로 단백질 수준에서 일어나게 된다. 일반적으로, 발현된 p53 단백질은 반감기를 가지며, 일정 기간 후 Mdm2 에 의해 유비퀴틴화되고 유비퀴틴-단백질 분해효소 복합체에 의해 분해되지만, 인산화된 p53은 Mdm2에 대한 결합력이 약해져 분해되지 않게 된다(Honda et al., EMBO, 18: 22-27, 1999; Haupt et al., Nature, 387: 296?299, 1997). 따라서 p53의 인산화 및 인산화된 p53 단백질의 핵내 이동 및 분해억제는 서로 밀접하게 연관되어 있다.

이를 뒷받침하는 것으로 본 발명의 한 실시예에서, Msx1이 과발현된 경우 p53 단백질 안정화, 이의 인산화 및 핵내 위치화의 증가가 확인되었다.

구체적으로 이러한 Msx1의 과발현은 내재하는 p53 mRNA 수준에는 영향이 없지만, p53 단백질의 반감기를 약 2배 증가시킴으로서(도 2B 참조) Msx1 단백질을 안정화시켜, 내재하는 p53 단백질 수준을 증가시켰다. 이러한 p53 단백질의 안정화는 p53의 인산화와 밀접한 관련이 있는 것으로 상기 Msx1-과발현 세포에서 p53 단백질의 15번째 세린잔기에서의 인산화가 유도 되었으며(도 2C 참조), p53의 명확한 핵 내 축적을 확인하였다(도 2D 참조).

상기 결과는 Msx1이 p53 단백질의 인산화, 이의 핵내 이동 및 안정성을 증가 시키는 새로운 기능을 가지고 있음을 제시하는 것이다.

본 발명에 따른 Msx1 단백질, 이의 호메오도메인 또는 이를 코딩하는 유전자 를 포함하는 세포사멸 유도제는 세포사멸이 요구되는 포유류 유래의 다양한 세포, 예를 들면, 종양세포의 사멸에 유효하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 상기 종양세포는 정상 (야생형) p53 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 함유하나 이러한 정상적인 p53 단백질이 바이러스 유래의 단백질에 의해 불활성화되어 그 기능을 하지 못하는 모든 세포를 포함한다. 예컨대 SV40 large T-항원, 아데노바이러스의 E1B 단백질, 파필로마바이러스 유래의 E6 단백질, 엡스타인바 바이러스의 EBNA-5등을 포함하는 단백질에 의해 p53이 불활성화된 종양세포를 들 수 있으며, 예를 들면 자궁경부암, 난소암세포를 들 수 있다.

용어 ‘불활성’이란 정상적 기능을 하는 단백질이 유전자의 변이를 수반함이 없이 제3의 단백질과의 상호작용 등에 의해 활성을 잃어 본래의 기능을 발휘하지 못하는 것으로, p53 단백질의 경우, 인산화의 방해, 분해촉진 등에 의한 기능의 상실을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에서 상기 종양세포는 내인성 p53이 결손된 모든 종양세포를 포함한다. 이 경우 Msx1 단백질과 함께 외인성 p53 단백질을 세포내로 도입하여 세포사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서 Msx1 단백질의 발현은 내인성 p53을 함유하나, 이의 기능이 HPV-E6 단백질에 의해 불활성화된 자궁경부암종 세포인 HeLa 세포 및 내인성 p53이 결손되었으나, 외인성 p53 단백질을 발현하는 인간폐암세포주인 H1299 세포에서 효과적으로 세포사멸을 유도하였다.

따라서, 본원발명의 세포사멸 유도제는 p53의 기능이 결여된 모든 종양세포. 예를 들면 폐암유래의 종양세포사멸유도에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원발명의 Msx1과 상호작용하는 p53 단백질은 외인성 또는 내인성일 수 있으며, 인간유래의 것이 바람직하며, 이와 기능적으로 동등한 변이체란 야생형 단백질 서열과 비교하여 변이가 있지만 Msx1과 상호작용하여 세포사멸을 유도할 수 있는 기능을 유지하는 것을 말한다. 이러한 단백질은 예를 들어, 인간유래의 야생형 p53 단백질을 구성하는 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체, 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체(homologues)를 포함한다.

본 발명의 한 실시예에서 야생형 p53 단백질을 포함하는 자궁경부암 유래의 암종 세포인 HeLa세포에서 Msx1의 일시적인 과발현은 대조군세포와 비교하여 세포성장의 극적인 감소를 유발하였을 뿐만 아니라(도 1A 및 B 참조), 세포사멸의 전형적인 특징인 분절된 핵을 나타내어 세포성장의 억제가 세포사멸에 의한 것임을 확인하였다(도 1C).

이러한 Msx1 단백질에 의한 세포사멸의 유도는 구체적으로 Msx1의 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용을 통하여 달성될 수 있는 것으로, 앞서 언급한 대로 전장 Msx1 단백질 뿐만 아니라, 이의 호메오도메인, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체 또한 세포사멸 유도제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

호메오도메인(homeodomain)은 진화적으로 보존된 60 개의 아미노산으로 이루 어진 DNA에 결합하는 도메인을 일컫는 것이다. 호메오도메인을 포함하는 호메오박스 유전자들은 다양한 종의 발생과정에서 필수적인 전사 조절인자로, 예를 들면 배발생에서의 패턴 형성, 세포 성장, 증식, 분화, 세포간 커뮤니케이션 및 세포사멸 경로를 조절하는 중요한 조절인자이다(McGinnis et al., Cell, 68: 283-302, 1992; Bendall et al., Gene, 247: 17-31, 2000). 따라서 이의 부적절한 발현조절은 인간의 종양발생과 관련이 있다고 최근 보고되고 있다(Chillo et al., Exp. Cell Res., 188: 161-169; Chill et al., J. Cell Physiol., 188:161-169, 2001; Ford et al. Cell biol. Int., 22: 397-400; Abate-Shen et al., Nat. Rev. Cancer 2: 777-785, 2002).

이러한 특성의 호메오도메인을 갖는 Msx1은 호메오도메인을 통하여 p53과 직접 상호작용을 통해 세포사멸 효과의 기능을 갖는다는 것이 본 발명을 통하여 밝혀졌다. 우선, 이스트 투-하이브리드 분석을 포함한 단백질간의 상호작용을 관찰할 수 있는 실험방법을 통하여 Msx1 호메오도메인 (아미노산 잔기 166-225)이 p53과 직접 상호작용함을 밝혔다(도 3 참조). 다음으로, 종양세포의 콜로니 형성에의 영향을 분석하여 Msx1은 호메오도메인이 세포사멸 유도에 필수적이고 충분한 것임을 밝혔으며 이는 단백질-단백질 상호작용 모티브로써의 Msx1 호메오도메인의 새로운 기능을 제시하는 것이다(도 4 참조).

종양세포에서 호메오도메인이 결여된 Msx1을 발현하는 세포는 현저한 콜로니 형성을 보였지만(도 4B 참조) 전장 Msx1의 발현은 극적으로 콜로니 형성을 억제하였다. 이는 세포내 p53 단백질의 수준과도 일치하는 것으로 전장 Msx1 발현 세포 에서는 p53 단백질의 양이 증가하였으나, 호메오도메인이 없는 Msx1이 발현된 세포에서는 p53 단백질의 양이 상대적으로 적었다(도 4C 참조). 이는 Msx1 호메오도메인이 종양세포에서 p53을 안정화하여 이에 의한 세포사멸을 유도하는데 반드시 필요함을 보여주는 결과이다.

본 발명의 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포사멸 유도제는 또한 종양억제제로도 유효하게 사용될 수 있다. 특히 야생형 p53 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 종양의 경우 p53의 기능을 활성화하여 세포사멸을 유도하면 효과적으로 암을 치료할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서 종양이 유도된 누드마우스에 Msx1을 처리한 결과 종양의 크기가 현저하게 줄어드는 것을 확인하였으며(도 5참조) 이는 세포사멸과 관련된 유전자 즉, 카스파제 3 및 Bax 단백질의 발현이 Msx1 처리 종양에서 극적으로 증가함을 확인하여 종양의 억제가 세포사멸에 기인한 것임을 알 수 있었다.

상기 결과는 Msx1 과발현이 생체 내 조건에서 세포사멸을 유도함으로써 종양 성장을 억제할 수 있음을 나타내는 것으로, 본 발명의 세포사멸 유도제는 야생형 p53 단백질을 포함하나 p53의 기능이 불활성화된 특징을 갖는 모든 종양의 치료, 예를 들면, 난소암, 자궁경부암, 폐암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

상기 언급한 대로 본 발명에 따른 세포사멸 유도제는 p53과의 상호작용을 통하여 이의 기능을 활성화시켜 그 효과를 달성하는바, 다른 측면에서 본 발명은 또한 Msx1 단백질 또는 이의 호메오도메인, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 p53 단백질 조절제를 제공한다. 여 기에서 p53 단백질 조절은 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용에 의해 달성되며 이러한 상호작용은 p53의 분해방지, p53의 인산화 및 p53의 핵내위치화를 초래한다. 본원발명의 p53 조절제와 상호작용하는 p53 단백질은 상기 언급한대로 불활성화된 야생형 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 세포사멸 유도제 또는 p53 조절제는, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 세포사멸유도제 또는 p53 조절제는 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 세포사멸 유도제 또는 p53 조절제는, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또 는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 세포사멸 유도제 또는 p53 조절제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 세포사멸유도제 또는 p53 조절제를 마우스에 정맥 내 주사에 의하여 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 세포사멸 유도제 또는 p53 조절제는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> Msx1 에 의한 세포사멸 유도

< 실시예 1-1> 일반적인 세포배양

인간 자궁경부암 유래의 HeLa (American Type Culture Collection, USA) 세포 및 인간페암종세포인 H1299 세포 (American Type Culture Collection, USA) 는 열로 불활성화된 10%의 소태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신(100unit/ml) 으로 보충된 DMEM 및 RPMI 배지(Life Technologies, USA)에서 5% CO₂의 37℃에서 배양하였다.

< 실시예 1-2> Msx1 발현벡터 제조

인간 Msx1 유전자를 포함하는 벡터, pCB6/Msx1, Msx1-GST 융합백터 pGEX-2T-Msx1(1-297), pGEX2T-Msx1(1-165)는 종전에 기술되었다(Zhang et al., Mol. Cell Biol., 17: 2920-2932, 1997). 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein, EGFP)과 융합된 발현 벡터로 전장 Msx1 [pEGFP/Msx1(1-297)], 호메오도메인 결여 [pEGFP/Msx1(1-165)], 호메오도메인 포함[pEGFP/Msx1(1-225)], 및 호메오도메인을 단독 [pEGFP/Msx1 (166-225)]으로 포함하는 각각의 벡터는 종전에 기술된 대로 제작하였다: 요약하면 pGEX2T-Msx1(1-297)의 BamH I-Hind III 단편 및 pGEX2T-Msx1(1-165)의 BamHI-EcoRI 단편을 각각 pEGFPC1(Clonetech, USA)의 Bgl II 및 Hind III 위치[pEGFP/Msx1 (1-297)] 또는 Bgl II 및 EcoR I 위치[pEGFP/Msx1 (1-165)]로 삽입하였다. pEGFP(1-297)를 주형으로 올리고뉴클레오티드(5'attgtcgacaaccggcaagcccaggacgcct-3' 및 5'attggatcctcactgcatctcttggddtt-3')를 이용하여 Msx1의 호메오도메인(165-225)을 공지된 방법에 따라 PCR로 증폭하여 pEGFP의 Sal I 및 BamH I 위치로 삽입하여 pEGFP/Msx1(166-225)을 제작하였다. Msx1 및 이의 단편을 포함하는 상기 각 플라스미드는 제조자의 권고대로 DNA 염기서열 분석(Applied Biosystems, USA)을 수행하여 확인하였다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)-p53 및 pCMV-p53 발현벡터는 종전에 기재되었다(Park et al., Journal of Virology 74: 11977-11982, 2000).

< 실시예 1-3> Msx1 의 인간 종양 세포에서 세포사멸 유도

Msx1의 과발현에 의한 세포사멸유도는 종전에 기재된 대로 수행되었다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005). 요약하면, HeLa 세포를 5x10⁴ 세포/웰의 농도로 챔버슬라이드에 분주(seeding)하고, 실시예 1-2의 pEGFP/Msx1(1-297) (full Msx1 vector) 또는 Msx1을 포함하지 않는 음성 대조군벡터(Control vector)를 Effectene (Qiagen, Germany)을 제조자의 권고대로 사용하여 HeLa 세포에 트렌스펙션하였다. 이어서, 트렌스펙션된 HeLa 세포의 형태 및 세포성장을 종전에 기술된 대로 각각 광학현미경(Zeiss, Germany) 및 MTT 분석(Sigma, USA)으로 측정하였다 (Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005; Park J et al., Biochem Biophys Res Commun 281:1234-1240, 2001).

결과는 도 1에 있으며, HeLa 세포에서의 Msx1의 과발현은 대조군과 비교하여 세포 형태의 변화를 유발하고(도 1A) 세포성장의 현저한 감소(도 1B)를 유발하였다.

이어서, 이러한 세포성장의 억제가 세포사멸에 기인하는 것인지 여부를 조사하기 위하여 종전에 기술된 대로 핵의 형태 및 FACS 분석을 하였다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005). 요약하면, 핵의 형태는 핵을 특정적으로 염색하는 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(Sigma USA)를 사용하였다, DAPI 염색을 위하여 세포를 먼저 메탄올로 고정시키고 15분 동안 DAPI 로 염색하고, 인산완충용액으로 세번 세척한 후, VectaShield(Vector Lab., USA)를 처리하여 형광현미경으로 관찰하였다.

FACS 분석은 상기 각각의 벡터로 트렌스펙션된 HeLa 세포를 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표지된 아넥신 V 및 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, Boehringer Mannheim, Germany)로 15분 동안 이중 염색 후 세포사멸을 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)(Becton Dickinson, USA)로 분석하였다(도 1D).

각각의 결과는 도 1C 및 D에 있으며 전장 Msx1-과발현 세포에서는 세포사멸의 전형적인 특징인 분절된 핵의 모양을 나타내는 반면, Msx1을 과발현하지 않는 대조군 세포는 정상 타원형의 핵을 가지고 있었다 (도 1C).

나아가, FACS 분석에 있어서도, 전장 Msx1-과발현 세포는 음성 대조군(control vector)과 비교하여 사멸된 세포의 특징인 아넥신 V 포지티브 및 프로피 디움 요오드화물에 의한 염색이 네거티브인 즉, 낮은 전방향 산란(forward scatter, FCS) 및 높은 측방향 산란(side scatter, SSC) 양상을 보이는 세포를 다량 포함하고 있었다(도 1D 우측).

상기 결과는 HPV-E6 단백질을 발현하며, 불활성화된 p53 단백질을 가지고 있는 HeLa 세포에서 전장 Msx1 단백질의 과발현이 세포사멸을 효과적으로 유도할 수 있음을 나타내는 것이다.

< 실시예 2> Msx1 의 과발현으로 인한 p53 단백질의 안정화 및 핵내위치화

Msx1 의 과발현으로 인한 p53 단백질의 수준증가

Msx1에 의한 세포사멸 유도의 기본 기작을 조사하기 위하여, HeLa 세포를 Msx 1 단백질을 포함하는 발현 벡터로 트렌스펙션한 후 p53 mRNA 및 단백질의 수준을 종전에 기술된 대로 조사하였다(Park et al., Cancer Res 65: 749-757, 2005). 요약하면, 실시예 1-3에 기술된 대로 전장 Msx1 발현벡터 또는 Msx1 유전자를 포함하지 않는 대조군 벡터로 트렌스펙션된 HeLa 세포를 Trizol 시약(Life Technologies, USA)을 이용하여 제조자의 권고대로 총 RNA 분리하고, 15㎍의 총 RNA를 1.2% 아가로즈-포름알데히드 겔에 걸고 나일론 막으로 전달하여 블롯을 만들고, p53 및 Msx1 특이적 프로브를 ³²P로 표지한 후 상기 블롯과 잡종화하여 노던 블롯 분석을 실시하였다.

단백질 분석은 웨스턴블롯으로 수행하였으며 Msx1 과발현된 세포를 융해(lysis) 완충액[50 mmol/L, Tris-HCl(pH8.0), 150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 10 mmol/L sodium deoxylate]으로 융해하였다. 20 ㎍의 총 세포 용출액을 SDS-10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하여 나일론 막에 전달하고 항-Msx1 항체(Babco, USA) 또는 항-p53 항체(Snata Cruz, USA)와 배양한 후 ECL Chemiluminescent Kit(Amersham, UK)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 화학발광으로 시각화하였다.

결과는 도 2에 있으며, Msx1의 과발현은 내재하는 p53 mRNA 수준을 변화시키지는 않지만, 내재하는 p53 단백질 수준은 증가시켰다 (도 2A). 이러한 결과는 Msx1 단백질이 p53의 전사 증가가 아닌 p53 단백질의 안정화를 증가시킴으로써 세포내 존재하는 p53 단백질의 수준을 증가시킴을 제시하는 것이다.

p53 단백질의 수준증가와 p53 단백질 분해억제와의 관계

이러한 p53 단백질 수준의 증가가 p53 단백질의 안정화에 기인하는 것인지를 확인하기 위하여, Msx1의 과발현이 p53 단백질 분해를 조절하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 조사하였다.

전장 Msx1 발현벡터 또는 Msx1 유전자를 포함하지 않는 대조군 벡터를 HeLa 세포에 실시예 1-3에 기술된 대로 트랜스펙션하고, 24시간 후 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX)를 처리하고 상기 기술한 방법대로 항-p53 항체(Snata Cruz, USA) 또는 HPV-E6(Ab-1, Oncogene, USA) 항체를 사용하였으며 전체 단백질의 양을 정량하기 위한 목적으로 베타-액틴 항체(Snata Cruz, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 이어서, 농도계측적 스캐닝(Densitometric scanning) 방법으로 웨스턴 블롯에서 검출된 p53 단백질을 나타내는 밴드를 정량하여 반감기를 계산하였 다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

결과는 도 2B에 있으며, Msx1을 포함하지 않는 대조군 벡터로 트랜스펙트된 세포의 p53 단백질의 반감기는 30분 미만인 것에 반해, Msx1을 과발현하는 세포는 반감기가 2배 이상(60 분) 높았다. 이는 Msx1의 과발현된 세포에서 상기 p53 단백질 수준 증가는 반감기의 증가, 즉 p53의 안정화에 기인한 것임을 나타낸다.

나아가, 도 2B에서 보듯이, E6 단백질은 대조군 벡터로 트랜스펙션된 HeLa 세포에서는 사이클로헥시미드 처리 30분 후 감지된 것에 반해, Msx1-과발현 세포에서는 120 분 경과 후에도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Msx1 단백질에 의한 p53 단백질의 안정성 증가가 세포내 E6 단백질에 의해 매개된 p53 단백질분해억제로 기인한 것임을 제시하는 것이다.

Msx1 의 과발현에 의한 p53 단백질의 활성화

p53 단백질의 인산화(phosphorylation)는 p53 단백질의 중요한 조절기작 중의 하나로 상기와 같은 p53 단백질의 안정성은 인산화와 밀접한 관련이 있기 때문에, 대조군 벡터 및 Msx1 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포 간의 p53 단백질의 인산화 상태를 비교하였다(도 2C). 5'-NH₂-말단에 존재하는 인산에 특이적인 p53 항체(Cell signaling, USA)를 이용하여 상기 기술한 대로 웨스턴 블롯을 실시하였다.

도 2C에서 보듯이, Msx1-과발현 세포에서 p53의 Ser15에서의 인산화가 상당히 유도됨을 확인하였다. 대조적으로 다른 잔기의 인산화 위치에서는 유의성 있는 변화를 보이지 않았다.

나아가, 인산화에 의해 활성화된 p53 단백질의 기능은 이의 핵으로의 이동과 밀접한 관계가 있으므로 전장 Msx1 발현세포에서 p53 단백질의 세포내 위치를 조사하기 위하여, 간접 면역형광법(indirect immunofluorescence)을 종전에 기술된 대로 수행하였다 (Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

요약하면, pEGFP/full Msx1 또는 pEGFP 벡터를 HeLa 세포에 트랜스펙션 후, 세포를 인상완충용액으로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.2% 트리톤 X-100으로 투과시키고, 1% 소혈청(bovine serum)으로 블로킹하였다. 이어 핵의 위치는 DAPI로 염색하였으며, Msx1은 내재된 GFP 녹색형광으로 관찰하였으며, p53 단백질은 세포를 항-p53 항체(Santa Cruz, USA)와 배양하고 로다민-접합 고트 항-마우스 IgG(Jackson Immunoresearch Lab., USA)로 배양한 후, 공촛점 현미경(confocal microscope, Bio-Rad, UK)을 이용하여 간접면역형광법으로 관찰하였다.

도 2D에서 보듯이, 대조군 벡터를 발현하는 세포(도 2D, DAPI: 파란색)의 핵에는 p53 단백질이 존재하지 않았지만, Msx1-트랜스펙션된 HeLa 세포(도 2D, p53, 빨간색)에서는 p53의 명확한 핵 내 축적을 확인할 수 있었으며, 이는 Msx1의 발현(도 2D, Msx1: 녹색)과 일치하는 것이었다.

상기 결과는 Msx1이 p53의 분해를 억제하여 이를 안정화함과 동시에 이의 활성화 및 p53 단백질을 핵으로 이동시키는 새로운 기능을 가지고 있음을 제시한다.

< 실시예 3> Msx1 단백질과 p53 단백질의 상호작용

< 실시예 3-1> 이스트 투- 하이브리드 (yeast two-hybrid) 분석

상기 Msx1 단백질의 과발현이 p53 단백질에 미치는 영향이 양 단백질간의 직 접적인 상호작용에 기인하는 것인지를 조사하기 위하여, 실시예 1-2에서 기술한 4가지 종류의 Msx1 컨스트럭트(도 3A)를 제작하여 Gyuris등에 의해 개발된 이스트 투-하이브리드 분석을 종전에 기술된 대로 수행하였다(Gyuris et al, Cell, 75: 791-803, 1993; Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

요약하면, HeLa 세포 유래의 cDNA 라이브러리(Clontech, USA)에서 PCR 방법으로 p53 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 pJG4-5(Clontech, USA)의 EcoRI 및 XhoI 위치로 클로닝하고, Msx1 단편은 LexA와의 융합 단백질로의 발현을 위해 pGilda 벡터(Clontech, USA)의 BamH I 및 Xho I 위치에 클로닝하였다. 각각의 pGilda 및 pJG4-5 융합 컨스트럭트를 실험 이스트 균주인 EGY 48(Clontech, USA)에 도입하고, 2% 갈락토스를 포함하는 류신-결핍 배지에서 세포가 자라는 능력 및 X-gal, 2% 갈락토스 및 2% 라피노스를 포함하는 합성 배지에서 파란색 콜로니 형성 여부를 통해 융합된 단백질 사이의 상호작용을 결정하였다.

결과는 도 3에 있으며, 전장 Msx1(1-297), 호메오도메인(1-225)을 포함하는 절단된 형태의 Msx1(truncated form) 및 호메오도메인 단독(166-225)을 포함하는 Mxs1 단백질은 전장 Msx1과 대등한 수준으로 p53과 상호작용을 하였으나(도 3B), 호메오도메인(1-165)이 결여된 Msx1은 p53과 전혀 상호작용을 하지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 Msx1의 p53과의 상호작용에서 호메오도메인의 중요성 및 호메오도메인이 p53과의 상호작용에 필수충분조건임을 또한 나타내며, 아울러, 종전의 DNA 결합모티브로써의 호메오도메인이 아닌 단백질-단백질 상호작용 모티브로써의 Msx1 호메오도메인의 새로운 기능을 제시한다.

< 실시예 3-2> 글루타치온 -S- 트랜스퍼라제 풀-다운 분석( Glutathione S-transferase(GST) Pull-down assay)

인간세포에서의 p53 및 Msx1의 상호작용을 조사하기 위하여, 종전에 기술된 대로 HeLa 세포에서의 GST 풀 다운(pull-down) 분석을 실시하였다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

요약하면, 실시예 1에 기술된 대로 HeLa 세포에 GST-p53 및 pCB6/Msx1-발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터 단독을 공동트랜스펙션한 후, 총 세포 용출액을 준비하고 글루타치온-아가로즈 비드로 풀-다운한 후, 항-p53 항체 및 항-Msx1 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

결과는 도 3C에 있으며, p53 및 Msx1을 발현하는 벡터로 공트랜스펙션된 세포(도 3C, GST-p53+pCB6/Msx1)에서만 Msx1 및 p53이 관찰되었으며 이는 진핵세포(HeLa 세포)에서 Msx1과 p53 단백질이 직접적인 상호작용함을 제시한다.

< 실시예 4> Msx1 의 호메오도메인에 의한 세포사멸 유도 및 p53 안정화

실시예 3에 기재된 대로 Msx1의 p53과의 직접적인 상호작용이 세포사멸에 중요하며, Msx1 단백질 중, 특히 호메오도메인이 이러한 효과발생에 필수적인 것으로 판단되므로, Msx1의 호메오도메인에 의한 p53 단백질의 안정화 및 세포사멸 유도 여부를 조사하였다.

Msx1 의 호메오도메인에 의한 세포사멸 유도 및 세포성장 억제

우선, 실시예 1-2에 기술된 EGFP(Enhanced Green Fluorescence Protein)와 융합되어 발현되는 Msx1 발현 벡터(pEGFP/full Msx1) 또는 호메오도메인이 결여된 Msx1 발현 컨스트럭트(pEGFP/Msx1(-HD))를 제조하여 종전에 기술된 대로 HeLa 세포에 트랜스펙션하여, HeLa 세포에서 발현시키고, 세포사멸의 유도 및 콜로니형성 여부를 조사하였다(Park et al., Cancer Res 65: 749-757, 2005).

세포사멸 유도는 실시예 2에 기재된 대로 트랜스펙션된 HeLa 세포의 핵을 DAPI로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였으며, 콜로니 형성은 G418(500㎍/ml ~1mg/ml)(Life Technologies)를 포함하는 배지에서 상기 트랜스펙션된 세포를 2 주동안 배양한 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 확인하였다.

도 4A에서 보듯이, 모든 세포에서 EGPF 단백질이 발현됨을 알 수 있으며(도 4A, 윗패널, EGFP: 녹색), 대조군으로서 pEGFP 벡터 또는 호메오도메인이 결여된 Msx1 발현 벡터인 pEGFP/Msx1(-HD)로 트렌스펙션된 세포에서는 완전한 형태의 타원형의 핵이 관찰되어 세포사멸이 유도되지 않은 반면, 전장 Msx1를 포함하는 벡터인 pEGFP/full Msx1으로 트렌스펙션된 세포에서는 분절된 핵이 관찰되어 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(도 4A, 아래패널, DAPI: 파란색). 나아가, 도 4B에서 보듯이, EGFP 벡터 또는 호메오도메인이 결여된 Msx1 발현 벡터로 트랜스펙션된 HeLa 세포는 콜로니가 형성된 반면 전장 Msx1이 발현된 세포에서는 콜로니 형성이 현저하게 억제되었다. 상기의 결과는 Msx1에 의한 세포사멸의 유도 및 세포성장 억제의 효과가 호메오도메인에 기인한 것임을 나타낸다.

Msx1 의 호메오도메인에 의한 p53 단백질의 수준 증가

이어서, Msx1의 호메오도메인이 내인성 및 외인성 p53 단백질의 안정성에 미 치는 영향을 조사하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

우선, 상기 Msx1 전장 또는 호메오도메인이 결여된 벡터를 종전에 기술된 대로 HeLa 세포에 트렌스펙션 하였다. H1299세포는 내인성 p53 단백질이 결여된 세포로, p53 발현벡터(CMV-p53)를 상기 전장 Msx1 발현벡터와 함께 공트렌스펙션하였다. 각 세포에서의 p53, Msx1 및 대조군으로서 베타엑틴 단백질의 수준을 실시예 2에서 기술한 대로 항-p53 항체(Santa Cruz, USA), 항-β-액틴 항체(Sigma, USA), 항-GFP 항체(Snata Cruz, USA)를 이용하여 웨스턴블롯으로 조사하였다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

도 4C에서 보듯이, 전장 Msx1 발현벡터로 트랜스펙션된 HeLa 세포에서는 p53 단백질의 수준이 증가되었지만, EGFP 벡터 또는 호메오도메인이 결여된 Msx1 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포에서는 EGFP 벡터로 트랜스펙션된 것과 마찬가지로 p53 단백질의 수준이 매우 낮았다.

나아가, 도 4D에서 보듯이, 전장 Msx1 단백질은 내인성 p53 단백질만이 아니라, 내인성 p53 단백질이 결여된 H1299세포에 외부에서 도입된 외인성 p53 단백질의 수준을 증가시켰으며, Msx1을 발현하지 않는 세포에서 p53 단백질의 발현수준은 매우 낮았다. 이러한 결과는 Msx1 단백질이 내인성 p53 단백질 뿐만 아니라, 외인성 p53과도 상호작용하여 p53이 결여된 종양세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있음을 제시하는 것이다.

< 실시예 5 > p53 단백질의 Msx1 단백질-농도 의존적 수준증가

Msx1 단백질에 의한 p53 단백질 수준 증가가 Msx1 단백질 양에 비례하는지 조사하기 위하여, 정해진 양의 야생형 p53 발현벡터(pCMV-p53) 및 증가하는 양의 전장 Msx1 발현 벡터를 H1299 세포에 공트랜스펙션한 후, 실시예 2에서 기술한 대로 항-p53 항체(Santa Cruz, USA), 항-Msx1 항체(Babco, USA) 또는 항-β-액틴 항체(Sigma, USA)를 이용하여 웨스턴블롯을 실시하였다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

도 4E에서 보듯이, 세포내 p53 단백질의 수준은 Msx1 단백질의 양에 비례함을 알 수 있다. 이러한 결과는 Msx1의 과발현이 p53-결손(null) 인간 종양 세포에서 농도에 의존적인 방법으로 외인성 p53 단백질을 안정화시켜 세포사멸을 유도할 수 있음을 제시하는 것이다.

< 실시예 6> Msx1 에 의한 종양 성장의 억제

< 실시예 6-1> Msx1 아데노바이러스 제조

Msx1 유전자를 포함하는 아데노바이러스는 종전에 기술된 대로 제조되었다 (Park et al., Cancer Res 65:749-757, 2005).

요약하면 인간유래 Msx1의 0.9kb 단편을 p△ACMVp(A)의 멀티 클로닝 부위의 BamH I 위치로 클로닝하여 p△ACMVMsx1(Ad-Msx1)을 제작하였다. p53을 포함하는 Ad-p53 컨스트럭트는 종래에 기술되었다(Hwang et al., Int. J. Gynecol. Cancer, 8: 27-36, 1998). 아데노바이러스의 제조를 위해 상기 아데노바이러스 컨스트럭트 및 아데노바이러스 게놈 DNA를 포함하는 플라스미드 pJM17(F. Graham, McMaster University, Ontario, Canada)를 293 세포주에 공트랜스펙션하였다. 이어서, 상기 세포로부터 아데노바이러스를 CsCl-농도 구배 원심분리 후 10% 글리세롤 및 1 mmol/L MgCl₂를 포함하는 PBS로 투석하여 정제하였다. 상기 바이러스의 역가는 293 세포에서 플라크 어세이로 결정하며 단위는 pfu(plaque forming unit)로 표시된다.

< 실시예 6-2> Msx1 에 의한 종양 성장의 억제

종양억제에서의 Msx1의 역할을 확인하기 위하여, 기하급수적으로 성장하는 HeLa 세포를 그룹당 12-15마리의 면역-결핍 BALB/c 누드 마우스(Charles River Lab. Japan)에 피하로 주사하여 Msx1의 발현이 종양의 성장에 미치는 영향을 종전에 기술된 대로 조사하였다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

요약하면, 종양세포 주사 후 종양 부피가 100 mm³에 달했을 때, 5x10⁸ pfu의 전장 Msx1, β-gal 또는 p53을 발현하는 아데노바이러스를 종양에 주입하여 종양의 부피를 조사하였다

도 5A에서 보듯이, 아데노바이러스 처리 후 초기 4일 동안에는 그룹간 종양 성장에서 차이는 없었다. 그러나, 7일 후 Ad-Msx1-처리 그룹은 종양 성장이 억제되기 시작했으나, 아데노바이러스 벡터만을 포함하는 Ad-mock 처리 그룹은 종양 부피가 계속적으로 증가하였다. 마우스를 희생시킨 시점에서 대조군 Ad-mock 처리 그룹과 비교하여 Ad-Msx1 처리 그룹에서 종양 크기가 약 2배 감소를 확인할 수 있었다. 외관상 Ad-mock 처리 종양은 크고 둥글고 높은 혈관생성을 보인 반면, Ad-Msx1 처리 종양은 작고, 붕괴되었으며 혈관생성이 저해되어 거의 백색을 나타내었다(도 5A). 상기 결과와 일치하게 양성대조군으로서 Ad-p53 처리는 효과적으로 종양의 성장을 억제하였다(Kim et al., Cancer Gene Ther., 6: 172-178, 1999).

Ad-Msx1 처리 그룹에서 종양 성장의 억제가 세포사멸과 관련이 있는지를 조사하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

종전에 기술된 대로 상기 종양 조직에서 총 단백질을 추출하여 세포사멸과 관련된 단백질에 대한 항체인 항-카스파제3(Santa Cruz, USA)항체 또는 항-Bax(Santa Cruz, USA) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하고, 상기 각 종양조직으로부터 8 ㎛의 동결섹션을 준비하여 Apoptosis Detection System (Promega, USA)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 TUNEL 분석(Promega, USA)을 수행하여 세포사멸을 확인하였다 (Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005).

결과는 도 5B 및 5C에 있으며, 카스파제 3 및 Bax와 같은 세포사멸과 밀접한 관련이 있는 단백질의 발현이 Ad-Msx1 처리 종양에서 또한 현저하게 증가하였고(도 5C, TUNEL: 녹색, DAPI: 파란색), Ad-mock 처리 종양에 비교하여 Ad-p53 및 Ad-Msx1 처리 종양에서 두드러진 세포사멸을 확인할 수 있었다(도 5D).

상기 결과는 Msx1 과발현은 생체내 조건에서 세포사멸을 유도함으로써 종양 성장을 억제할 수 있음을 나타내는 것으로 본원발명에 따른 세포사멸 유도제가 종양억제에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하는 조성물은 p53 단백질의 조절자로서 p53 단백질과 상호작용하여, p53 단백질의 안정화, 인산화 및 핵내위치화를 통하여 시험관 내 및 생체 내 조건에서 세포사멸을 유 도하여 종양세포성장 억제에 유효하게 사용될 수 있다. 또한 HPV 양성 자궁경부암처럼 야생형 p53 단백질의 기능이 불활성화된 종양세포에서도 Msx1은 p53 단백질의 세포사멸기능을 회복시켜주므로 종양세포성장 억제 기능을 가져올 수 있다.

<110> PARK, KS <120> A NOVEL AGENT COMPRISING MSX1 OR GENE ENCODING THE SAME AS AN ACTIVE INGREDIENT FOR INDUCING APOPTOSIS IN CANCER CELLS <130> 5p-04-50 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ser Leu Pro Leu Gly Val Lys Val Glu Asp Ser Ala Phe Gly 1 5 10 15 Lys Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gln Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala Asp Glu Glu Gly Ala Lys Pro Lys Val 35 40 45 Ser Pro Ser Leu Leu Pro Phe Ser Val Glu Ala Leu Met Ala Asp His 50 55 60 Arg Lys Pro Gly Ala Lys Glu Ser Ala Leu Ala Pro Ser Glu Gly Val 65 70 75 80 Gln Ala Ala Gly Gly Ser Ala Gln Pro Leu Gly Val Pro Pro Gly Ser 85 90 95 Leu Gly Ala Pro Asp Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Leu Gly His Phe 100 105 110 Ser Val Gly Gly Leu Leu Lys Leu Pro Glu Asp Ala Leu Val Lys Ala 115 120 125 Glu Ser Pro Glu Lys Pro Glu Arg Thr Pro Trp Met Gln Ser Pro Arg 130 135 140 Phe Ser Pro Pro Pro Ala Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Cys Thr Leu 145 150 155 160 Arg Lys His Lys Thr Asn Arg Lys Pro Arg Thr Pro Phe Thr Thr Ala 165 170 175 Gln Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Phe Arg Gln Lys Gln Tyr Leu Ser 180 185 190 Ile Ala Glu Arg Ala Glu Phe Ser Ser Ser Leu Ser Leu Thr Glu Thr 195 200 205 Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala Lys Ala Lys Arg Leu 210 215 220 Gln Glu Ala Glu Leu Glu Lys Leu Lys Met Ala Ala Lys Pro Met Leu 225 230 235 240 Pro Pro Ala Ala Phe Gly Leu Ser Phe Pro Leu Gly Gly Pro Ala Ala 245 250 255 Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ser Leu Tyr Gly Ala Ser Gly Pro Phe 260 265 270 Gln Arg Ala Ala Leu Pro Val Ala Pro Val Gly Leu Tyr Thr Ala His 275 280 285 Val Gly Tyr Ser Met Tyr His Leu Thr 290 295 <210> 2 <211> 894 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgacttctt tgccactcgg tgtcaaagtg gaggactccg ccttcggcaa gccggcgggg 60 ggaggcgcgg gccaggcccc cagcgccgcc gcggccacgg cagccgccat gggcgcggac 120 gaggaggggg ccaagcccaa agtgtcccct tcgctcctgc ccttcagcgt ggaggcgctc 180 atggccgacc acaggaagcc gggggccaag gagagcgccc tggcgccctc cgagggcgtg 240 caggcggcgg gtggctcggc gcagccactg ggcgtcccgc cggggtcgct gggagccccg 300 gacgcgccct cttcgccgcg gccgctcggc catttctcgg tggggggact cctcaagctg 360 ccagaagatg cgctcgtcaa agccgagagc cccgagaagc ccgagaggac cccgtggatg 420 cagagccccc gcttctcccc gccgccggcc aggcggctga gccccccagc ctgcaccctc 480 cgcaaacaca agacgaaccg taagccgcgg acgcccttca ccaccgcgca gctgctggcg 540 ctggagcgca agttccgcca gaagcagtac ctgtccatcg ccgagcgcgc ggagttctcc 600 agctcgctca gcctcactga gacgcaggtg aagatatggt tccagaaccg ccgcgccaag 660 gcaaagagac tacaagaggc agagctggag aagctgaaga tggccgccaa gcccatgctg 720 ccaccggctg ccttcggcct ctccttccct ctcggcggcc ccgcagctgt agcggccgcg 780 gcgggtgcct cgctctacgg tgcctctggc cccttccagc gcgccgcgct gcctgtggcg 840 cccgtgggac tctacacggc ccatgtgggc tacagcatgt accacctgac atag 894

Claims (16)

1. Msx1 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제.
2. Msx1 단백질의 호메오도메인 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 유도제.
3. 제 1항에 있어서, 상기 Msx1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1 및 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
4. 제 2항에 있어서, Msx1 단백질의 호메오도메인 또는 이를 코딩하는 유전자각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 166-225 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 496-675로 기재되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
5. 제 1항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 비 바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포사멸은 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 세포사멸유도제.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용은 p53의 분해방지, p53의 인산화 및 p53의 핵내위치화를 초래하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
8. 제 7 항에 있어서, p53 단백질은 외인성 또는 내인성인 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
9. 제 8 항에 있어서, 종양세포의 세포사멸인 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
10. 제 9 항에 있어서, 종양세포는 불활성화된 p53 단백질을 함유하거나 또는 p53이 결손된 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
11. 제 10 항에 있어서, 종양세포는 난소암, 자궁경부암 또는 폐암유래인 것을 특징으로 하는 세포사멸 유도제.
12. Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 p53 단백질 조절제.
13. Msx1 단백질의 호메오도메인, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 p53 단백질 조절제.
14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, p53 단백질 조절은 Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 p53 단백질 조절제.
15. 제 14 항에 있어서, Msx1 단백질 또는 Msx1 호메오도메인과 p53 단백질과의 상호작용은 p53의 분해방지, p53의 인산화 및 p53의 핵내위치화를 초래하는 것을 특징으로 하는 p53 단백질 조절제.
16. 제 15 항에 있어서, p53 단백질은 외인성 또는 내인성인 것을 특징으로 하는 p53 단백질 조절제.

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