KR100509398B1 - 세포침투성 티에이티-박테리아 사이토신 디아미네이즈융합단백질 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리아 사이토신 디아미네이즈(bacteria cytosine deaminase, bCD)를 세포내로 운반하고 세포내에서 활성을 갖도록 하기 위하여 HIV-1 Tat 단백질과 결합시킨 융합단백질 Tat-bCD, 이 융합단백질 Tat-bCD를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이 융합단백질을 제조하는 벡터 및 Tat-bCD 융합단백질의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 박테리아 사이토신 디아미네이즈(bacteria cytosine deaminase; 이하 본 명세서에서 "CD" 또는 "bCD"와 혼용하였음, 동일한 의미임)와 HIV-1 Tat을 결합시킨 융합단백질, 이 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드, 이 융합단백질의 발현벡터 및 그 융합단백질의 용도에 관한 것으로서, 좀더 상세히는 재조합 벡터를 이용하여 사이토신 디아미네이즈의 N말단 측에 6개의 히스티딘 잔기와 9개의 HIV-1 Tat 단백질을 결합시킨 융합단백질을 제조, 정제함으로써 높은 효율로 세포내로 투과되어 세포내에서 특이적으로 암세포만을 파괴시키는 활성을 가지는 Tat-사이토신 디아미네이즈 융합단백질에 관한 것이다.
항암치료에 사용되는 많은 화학요법 (chemotherapy)은 암세포에 대한 선택적인 치료가 불가능하다. 따라서 최근의 암치료는 선택적으로 암세포에게만 독성물질(toxic compound)을 전달하여 암세포만의 사멸을 유도하는 방향으로 진행되고 있다. 선택적으로 암세포만을 치료할 수 있는 방법으로 무독성의 프로드럭(prodrug)을 이용하는 효소/프로드럭 시스템(enzyme/prodrug system)이 제시되고 있으며, 이 방법은 암세포의 특이적 효소를 이용하여 프로드럭을 드럭(drug)으로 바꾸어 결국 암세포만이 선택적으로 사멸하는 원리를 이용한 것이다.
효소/프로드럭 치료방법(Enzyme/prodrug therapy)이란 암세포 또는 비정상적인 상태의 세포의 사멸을 유도하는 치료방법을 말하며, 그 원리로는 효소 또는 프로드럭 자체는 목표세포에 아무런 영향을 미치지 않지만, 그들의 조합에 의해 프로드럭이 새로운 형태의 해로운 드럭으로 변화하여 결국 세포의 사멸을 유도한다는 것이다. 최근 몇 년간 진행된 효소/프로드럭 시스템은 암세포가 가지지 않는 특이적 효소를 이용하게 되었는데, 암세포에만 존재하는 전사인자(transcription factor)에 반응하는 프로모터(promoter)를 발현시키고자 하는 효소 유전자의 앞에 클로닝하고, 목표세포에 삽입하여 세포의 사멸을 유도하는 방법으로 발전하게 되었다. 이러한 방법을 유전자 유도 효소/프로드럭 치료법(gene directed enzyme/prodrug therapy; GDEPT)이라고 부르고 있으며 많은 형태의 GDEPT가 보고되고 있다(TA Connors 1995). GDEPT에 사용되는 효소들은 다음 몇 가지 기준에 적합해야만 사용할 수 있다. 첫째, GDEPT에 사용되는 효소들은 유전자를 삽입하고자 하는 목표세포가 가지고 있지 않는 것이어야 하며, 일반적으로 암세포가 가지고 있지 않은 효소를 사용하게 된다. 둘째, 이 효소는 국외자 효과(bystander effect)라고 알려진 특성을 가져야 하는데, 국외자 효과란 본래의 기질(substrate)을 제외한 다른 기질과 반응하여 새로운 유해한 생산물을 만들 수 있는 능력을 말한다(Ion Niculescu-Duvaz et al 1998).
사이토신 디아미네이즈(Cytosine deaminase; CD)는 암세포의 유전자가 아니며, 국외자 효과의 특성을 가지는 효소로서 많은 GDEPT에 사용되고 있다. CD는 사이토신의 탈아민화(deamination)에 관여하는 효소로서, 많은 미생물에서 발견되며 사이토신의 대사에 관여하며 국외자 효과(bystander effects)에 의해 무해한 프로드럭인 5-FC(fluorocytosine)를 유독성 드럭인 5-FU (fluorouracil)로 바꾼다고 알려져 있다(도 1, Richard Jund et al 1970, P. Erbs et al 2000). 사이토신은 다른 핵염기(nucleobases)와 다르게 세포질 효소(cellular enzyme)에 의해 암모니아로 직접 분해될 뿐만 아니라 샐비지 합성(Salvage synthesis)에도 사용되는데, 이때 CD에 의해 사이토신이 가수분해되어 우라실(uracil)로 전환될 수 있다(Kim, Tae Hyun et al 1998).
5-FU의 사멸은 현재 여러 형태의 기작에 의한 것이라고 밝혀지고 있다 (Philippe Erbs et al 2000). 5-FU는 다양한 유도체로 변화하여 단백질 합성과 DNA합성을 억제한다고 알려졌다. 대표적인 기작으로서 변환된 5-FU가 세포내의 효소에 의해 5-FUTP와 5-fluoro-dUTP(5-FdUTP)의 형태로 변화하여 세포의 사멸에 관여한다는 것이다. 5-FdUTP는 티미딜산 합성효소(thymidylate synthase)라는 효소를 억제하여 DNA 복제에 사용되는 dTTP의 결핍을 유도하여 DNA 복제를 억제한다. 반면 또 다른 유도체인 5-FUTP는 메신저 RNA의 합성에 직접 참여하여 정상적인 단백질의 합성을 억제한다고 알려져 있다(Jacob Kream et al 1952, Mark S. Khil et al 1996, Mullen C. A. et al 1992).
사이토신 디아미네이즈는 많은 미생물에 존재하는데 특히 대장균과 효모의 사이토신 디아미네이즈가 많이 연구되고 있다. 효모 사이토신 디아미네이즈(yCD)는 박테리아 사이토신 디아미네이즈(bCD)보다 5-FC를 5-FU로 바꾸는 변환 능력이 뛰어나지만, 높은 온도(37℃)에서의 안정성은 박테리아 사이토신 디아미네이즈에 비해 매우 낮다고 알려져 있다(Katauragi et al 1989).
최근 CD 유전자를 이용한 GDEPT가 많이 연구되었다(Els Kievit et al 1999). CD를 이용한 GDEPT는 CD 유전자가 목표세포 내로 세포감염(transfection)되면, CD단백질은 발현되어 5-FC를 5-FU로 변환하게 된다. 5-FU는 세포가 가지는 효소에 의해 5-FUTP 또는 5FdUTP로 바뀌어 단백질의 발현과 DNA의 복제를 억제하게 되어 결국 세포의 사멸을 유도한다(Denis Evoy et al 1991). 그러나, GDEPT는 유전자의 삽입 효율이 매우 낮고, 지속적이고 영구적인 단백질 발현이 유도되며, 단백질의 발현수준을 조절할 수 없는 몇가지 단점을 가지고 있다.
따라서, 이러한 문제점을 극복하는 새로운 형태의 치료방법으로 DNA에 의한 세포도입이 아닌 정제된 효소를 직접 세포내로 침투시키는 방법이 개발되고 있다.
최근의 연구에서 세포침투 도메인(protein transduction domain, PTD)는 공유결합으로 연결된 거대분자를 뇌막(brain blood barrier) 안으로 이동시킬 수 있다는 사실이 밝혀진 바 있으며, 대표적인 PTD로서 HIV-1 Tat 단백질이 있다. HIV-1 Tat 단백질은 바이러스 단백질과 DNA의 복제를 증가시키는데 필수적인 역할을 하는 바이러스의 전사인자로써 세포질에서 발현된 후 자신의 RNA를 전사하기 위해 핵 안으로 이동하는 특성을 지니고 있다(Michael J. Orsini. et al, 1996, Arya et al., 1985; Morrow et al., 1994). Tat의 돌연변이 분석(mutational analysis)을 통해 Tat은 아미노 말단의 산성그룹(acidic group)과 7개의 시스테인을 가지는 사이토신이 풍부한 부위(cysteine-rich cluster) 그리고 아르기닌(arginine)과 라이신(lysine)이 많이 존재하는 양전하를 띤 염기성 부위(positively charged basic region)의 3개의 기능성 도메인(functional domain)을 가진다고 알려졌다(Rosen et al, 1992). 산성그룹은 Tat의 발현을 더욱 활성화시키는 역할을 하며(Rappaport et al., 1989). 시스테인이 풍부한 도메인(cysteine-rich domain)은 Tat의 유사금속 다이머(metal-liked dimer)를 형성하는 역할을 한다(Frankel et al., 1988). 염기성 도메인은 Tat 단백질의 핵으로의 이동과 RNA와의 결합에 관여한다(Hauber et al., 1989; Ruben et al., 1989).
Tat 단백질은 어떤 수용체(receptor)나 수송체(transporter)의 도움 없이 세포막과 핵막을 통과할 수 있는 능력을 가진다고 알려져 있다(Guyader. M. et al, 1997). 많은 연구에서 세포의 배양액에 Tat 단백질을 처리하였을 경우 세포의 핵 안까지 Tat 단백질이 이동하는 것을 증명하였고, Tat의 여러 도메인 중 염기성 도메인(49~57, with two lysines and six arginines in nine residues)이 단백질의 형질도입에 관여한다고 알려져 있다(Steven R Schwarze et al 2000). 비록 단백질의 형질도입에 대한 정확한 기작은 잘 알려지지 않았지만, Tat 염기성 도메인은 공유결합으로 연결된 융합단백질을 모든 세포 안으로 이동시킬 수 있다고 알려졌다.
Tat의 형질도입 능력은 시그널 분자(signal molecules)의 기작을 밝히는데 중요한 역할을 하고 있으며(Hikaru Nagahara et al 1998), 유전자 치료법의 문제점을 극복할 수 있는 대안책으로 제시되고 있다(Steven R Schwarze et al 2000).
그러나, 실제 모든 단백질이 Tat 단백질에 의해 운반되는 것은 아니다. 또한, Tat에 의해 세포 내로 운반된 모든 단백질이 생물학적 활성을 나타내는 지도 아직 확실히 밝혀지지 않은 상태이다.
이와 같이, 본 발명에서는 세포감염(transfection)에 의한 유전자 유도 효소/프로드럭 치료법(GDEPT)이 가지는 문제점을 극복하기 위하여 단백질 형질도입부위(protein transduction domain; 이하 "PTD"와 혼용함)인 HIV-1 Tat(49-57)와 박테리아 사이토신 디아미네이즈를 공유결합시킨 Tat-bCD 융합단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 Tat-bCD 융합단백질을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 Tat-bCD 융합단백질을 세포에 형질도입시킨 후 MTT 어세이 등을 통하여 항암효과를 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 단백질의 형질도입(transduction)에 관여한다고 알려져 있는 HIV-1 Tat 단백질의 염기성 도메인(49~57)을 이용하여 유전자 유도 효소/프로드럭 치료법의 단점을 극복하고, 암치료를 위한 효소/프로드럭 요법에 이용될 수 있는가를 연구하였다. 특히, 단백질의 형질도입에 관여한다고 알려져 있는 HIV-1 Tat 단백질의 염기성 도메인(49~57)과 박테리아의 사이토신 디아미네이즈를 결합시켜 정제된 Tat-bCD 융합단백질이 암치료를 위한 효소/프로드럭 치료법에 이용될 수 있는가를 연구하였다.
특히, 본 발명에서는 대장균의 사이토신 디아미네이즈(E. coli cytosine deaminase, 이하 "bCD"라 약칭함) 유전자를 HIV-1 Tat 단백질의 염기성 도메인과 융합시킨 후 E.coli 에서 발현, 정제하여 Tat-bCD 융합단백질을 제조하였다. 정제된 Tat-bCD 융합단백질은 Tat 염기성 도메인이 융합되지 않은 bCD 단백질과 달리 세포배양액에 처리되었을 때 세포내로 효과적으로 형질도입되는 것이 확인되었다. 또한 Tat-bCD 융합단백질이나 프로드럭인 5-FC 중 한 가지만을 세포배양액에 처리하였을 때 세포에 아무런 영향을 주지 못하는 반면, Tat-bCD와 5-FC가 함께 세포배양액에 처리되었을 때는 사멸이 유도되는 결과를 얻었다.
이러한 결과들은 Tat의 염기성 도메인을 이용하여 효소/프로드럭 요법(enzyme/ prodrug therapy)의 단점을 해결할 수 있는 새로운 방법이 될 수 있으며, Tat 염기성 도메인과 결합된 bCD가 유전자 치료법에 효과적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시해 준다. 따라서, 본 발명은 기존의 문제점을 극복하기 위한 새로운 형태의 치료방법으로서 DNA에 의한 세포감염(transfection)이 아닌 정제된 효소를 직접 세포내로 침투시키기 위한 실험을 수행하였다.
그러나, 본 발명의 Tat-bCD 융합단백질은 유전자 재조합 방법 외에도 일반적인 화학결합 방법으로 제조할 수 있다.
본 명세서에서는 사이토신 디아미네이즈 단백질을 세포내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과", "형질도입", "세포도입"한다는 표현들과 혼용하였다.
또한, 본 명세서에서는 "bCD", "Tat-bCD"를 "효소"와 "단백질"을 혼용하여 통칭하였다.
본 발명은 박테리아 사이토신 디아미네이즈의 아미노 말단에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57)가 공유결합된 세포침투성 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57)의 업스트림에 수개의 히스티딘 잔기가 결합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 박테리아 사이토신 디아미네이즈 cDNA의 5'측에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57) 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항 또는 제2항의 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 5 또는 코돈 축퇴성에 의한 그의 등가물 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.당업자들은 본 발명이 서열번호 6의 Tat 박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질 아미노산 서열 및 서열번호 5의 Tat 박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에만 한정되는 것이 아님을 분명히 알 수 있다. 예컨대, Sambrook 등(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1. pp.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))이 정의한 바와 같이, 본 발명이 Tat 박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션할 수 있는 그러한 DNA 또는 RNA 서열도 포함된다는 것을 분명히 이해하고 있을 것이다.따라서, 본 발명에 의해 해석되는 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 발명 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이제이션하는 서열 및 유전암호의 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 상기 개시한 방법에 의해 제조된 Tat 박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.본 발명은 Tat 박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질 아미노산 서열(서열번호 7)뿐만 아니라, silent change에 따라 서열내에서 다른 아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. silent change란 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있음을 말한다. 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다.즉, 유전자 서열의 "기능적 등가물"이란 동일한 아미노산 서열로 번역되는 유전자 서열들을 의미하며, 또한, 아미노산 서열의 "기능적 등가물"이란 예컨대, 서열 내의 아미노산들이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산들로 치환되어 동등한 기능을 수행할 수 있는 아미노산 서열들을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포침투성 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 도 1의 제한지도와 같이 구성되는 것을 특징으로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 상기 약제학적 조성물이 항암제로서 사용되는 것을 특징으로 한다.
Tat-bCD 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001~100㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명은 Tat-사이토신 디아미네이즈 융합단백질의 염기서열(서열번호 5)뿐만 아니라, silent change에 따라 서열내에서 다른 아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. silent change란 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있음을 말한다. 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다.
또한, 본 발명의 Tat-사이토신 디아미네이즈 융합단백질 또는 아미노산 서열간의 일정범위의 상동성, 예컨대 90-100% 범위내의 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편(fragments)이나 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. pTat-bCD 벡터 제조
pET-bCD, pTat-bCD 발현벡터는 pET15-b 벡터(Invitrogen, Carlsbad, U.S.A)를 사용하여 만들었다. pET15-b 벡터는 T7 프로모터, Lac 오퍼레이터, T7 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal)을 가지고 있다. pTat 발현벡터는 다음과 같은 방법으로 만들었다. HIV-1 Tat 염기성 도메인(basic domain)을 코딩하고 있는 두 DNA 올리고머(상위쇄, 5'-TAG GAA GAA GCG GAG ACA GCG ACG AAG AC-3'; 하위쇄, 5'-TCG AGT TCC CGT CGC TGT CTC CGC TTC TTC C-3')로 합성하였는데 DNA 염기서열은 양끝에 각각 NdeI과 XhoI의 제한효소 절단부위를 가지고 있다. 두 DNA 올리고머는 70℃에서 30분간 배양을 통해 이중사슬(double-strand)로 어닐링하였다. pET15-b을 NdeI과 XhoI의 제한효소로 자른 후 오픈리딩프레임(open reading frame)에 맞게 Tat 염기도메인을 삽입하여 pTat 벡터를 제작하였다. Tat 유전자의 삽입은 형광 자동 서열측정기(fluorescence-based automated sequencer; model 373A; Applied Biosystems, Inc)를 사용하여 확인하였다. 그리고 Tat 염기도메인의 뒤에 bCD (FCY1) 유전자를, 그리고 pET15-b 벡터에 bCD유전자를 각각 삽입하였다.
bCD 유전자를 박테리아 발현 플라드미드(bacterial expresion plasmid)에 삽입하기 위해 bCD 유전자는 PCR을 사용하여 증폭하였다. bCD의 증폭을 위해 주형(template)으로는 대장균(Eschrichia coli)의 유전자(genomic) DNA를 사용하였다. bCD 유전자의 증폭을 위한 개시체(primer)는 XhoI 절단부위를 가지는 5'-CTC GAG TCG AAT AAC GCT TTA CCA ACA ATT ATT AAC GCC-3'의 상위쇄와 종결코돈(stop codon)의 뒤에 XhoI 절단부위를 가지는 5'-GGA TCC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGC TTC TGG-3'의 하위쇄가 사용되었다.
PCR은 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하였고, bCD의 유전자를 증폭하기 위해 주형을 95℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃ 40초, 70℃ 5분, 55℃ 1분의 사이클을 30회 반복하였고 70℃에서 마지막으로 10분간 더 증폭하였고, 증폭된 DNA는 XhoI으로 자른 후 pTat 벡터에 삽입하여 pTat-bCD 벡터를 만들었고, 같은 방법으로 HIV-1 Tat 염기성 도메인을 가지지 않는 pET15-b를 사용하여 pET-bCD 발현벡터를 만들었다.
실시예 2. 융합 단백질의 발현과 정제
실시예 1에서 제조된 bCD와 Tat-bCD의 발현벡터는 BL21 E. coli(amersham pharmacia)에 세포도입(transformation)시켰다(도 3). 각각의 유전자를 발현하는 대장균은 50ml의 LB에서 OD(Optical Density)600의 값이 0.6~0.7이 될 때까지 37℃에서 3~4시간정도 배양시켰다. OD600의 값이 0.6~0.7이 되었을 때 1mM의 IPTG를 넣고 3~4시간동안 단백질의 발현을 유도했다(Park. jinseu et al 2000). 대장균을 원심분리하여 수거한 후 6M 우레아 완충액(urea buffer)을 넣어 1시간동안 얼음에서 변성시키고 14000rpm에서 원심분리시킨 후 상층액(supernatant)은 Ni2+-NTA 컬럼(Novagen Ins)에 로딩시켰다. 상기 컬럼은 25ml의 결합완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.9)으로 세척하였고 25ml의 세척완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)에 의해 세척한 후 4ml의 일루션 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.9)로 정제되었다. 그리고 이미다졸을 제거하기 위해 정제된 융합단백질은 PBS(phosphate saline buffer)를 사용하여 PD-10 컬럼에 로딩시켰다(Hikaru Nagahara et al 1998). 발현된 융합단백질은 Biorad 어세이 키트(Bradford protein assay kit)로 농도를 측정하였다.하였다.
도 4a에서 보이는 것처럼 정제된 단백질은 15%의 SDS-PAGE에 의해 분리된 후 쿠마시 블루(coomassie blue)에 의해 염색되었다. 정제된 단백질이 목표단백질이 맞는지 확인하기 위해서 이뮤노블랏(immunoblot)으로 분석하였다(도 4b). 도 4a에서와 동일하게 분리된 단백질은 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼고, 그 단백질은 ECL 측정킷트를 사용하여 측정하였다(도 4b). 상기 결과에 의하여 실험에 사용된 융합단백질은 순수하게 정제된 것임을 알 수 있었다.
실시예 3. 세포배양과 융합단백질의 세포도입
본 실시예에서 사용된 모든 HeLa 세포는 37℃, 7% CO2에서 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100U/㎖ 페니실린을 포함한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)에서 배양되었다.
Tat-bCD의 세포도입(transduction) 능력을 확인하기 위해 HeLa 세포는 6X105 cells/35mm로 플레이트에 깔았다. 약 70% 컨플루언트(confluent)가 되었을 때, 세포들을 2ml의 무혈청 DMEM으로 두 번 세척하고, 새로운 1ml의 DMEM으로 교체하였다.
시간에 따른 세포도입 효과를 확인하기 위해서 1uM의 정제된 Tat-bCD 융합단백질을 다양한 시간동안 37℃에서 처리하였다.
또한, 농도에 따른 세포도입을 확인하기 위해서 정제된 bCD 또는 Tat-bCD를 다양한 농도로 배지에 2시간동안 37℃에서 처리하였다.
또한, 세포내에서의 안정성을 확인하기 위해 1uM의 Tat-bCD 융합단백질을 2시간동안 처리한 후 무혈청로 두 번 세척한 후 새로운 배지로 교체해 준 후 시간별로 하비스트하여 세포내에서의 안정성을 측정하였다.
모든 세포도입(transduction)을 측정하기 위한 세포들은 단백질을 처리한 후 하비스트되기 전에 0.05% 트립신/EDTA(GIBCOBRL) 500ul로 10분동안 37℃에서 처리리하여 세포의 밖에 남아있는 융합단백질들을 제거하고, 차가운 PBS로 세척한 후 하비스트하였다. 하비스트된 세포들은 세포도입능을 확인하기 위하여 pET15-b에 태그(tagging)되어 있는 6개의 히스티딘(histidine)을 이용하여 이뮤노블랏을 수행하였다.
이뮤노블랏(Immunoblot)을 위해 세포들은 용출완충액(lysis buffer; 150nM NaCl, 0.02% 소듐 아자이드, 100㎍/㎖ PMSF, 1% 트리톤 X-100, 50nM Tris-HCl, pH 8.0.)에 녹인 후 4℃에서 30분동안 배양시켰다. Tat-bCD는 10%의 SDS-PAGE으로 분리하였고, 니트로셀룰로즈 멤브레인(S and S. Ins)으로 옮겼다. 멤브레인은 10% 탈지분유로 1시간 동안 블로킹시켰다. 이 멤브레인은 10ml의 TBST(20mM Tris, 500mM NaCl, 0.05% Tween-20)로 10분간 2번 세척한 다음 rabbit antibody directed against the tagged histidine (Santa Cruz)로 2시간 동안 배양하였다. 그 후 멤브레인은 10ml의 TBST로 10분간 2번 세척한 후 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합 고우트항-레빗 2차항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody, Sigma chemical)와 2시간 동안 배양하였다. 10ml의 TBST로 10분간 2번 세척한 멤브레인은 제조자 지침(manufacturer's instruction; ECL, Amersham)에 의해 탐지되었다.
우선, 시간에 따른 세포도입능의 측정 결과는 도 6a에서 보는 것처럼 Tat-bCD는 융합단백질을 배양배지에 처리한 후 15분부터 감지되었고 90분이 넘어서면서 거의 모든 단백질이 세포 안으로 이동하는 것을 볼 수 있었다. 이 결과로서 단백질의 처리시간이 길어질수록 Tat-PTD의 세포도입능이 증가하는 것을 알 수 있다.
농도에 따른 세포도입효율은 도 6b에서 보는 것처럼 처리되는 융합단백질의 양이 증가할수록 세포 안으로 이동하는 단백질의 양도 함께 증가하는 것을 볼 수 있다. 이 결과로 세포도입 효율은 융합단백질의 농도의 증가에 따라 세포도입되는 단백질의 양도 증가한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 Tat을 가지지 않은 bCD 융합 단백질들도 동일한 조건으로 처리되었지만 세포 안으로 이동하지 못했고 어떠한 band도 확인할 수 없었다.
PTD-DEPT를 이용한 효과적인 단백질 암치료(protein cancer therapy)를 위해서는 세포 안으로 들어간 융합 단백질이 세포 안에서 오랜 시간동안 안정적으로 남아 있어야 하며, 세포내의 섀퍼롱(chaperone)에 의해 정확한 재폴딩(refolding)을 하여 활성을 얻어야 한다. 도 6c에서 보듯이 세포도입된 융합단백질이 세포 내에서 36시간까지 안정적으로 남아있는 것을 확인할 수 있었다. Tat-bCD는 12시간까지는 매우 안정적으로 남아있다가 점차 분해되었음을 알 수 있다.
실시예 4. 효소의 활성 측정
정제된 효소(enzyme)의 활성을 측정하기 위해서 융합단백질(fusion enzyme)은 우레아(urea)가 없는 상태로 정제하였다. 정제된 단백질(enzyme) 1㎍에 1709㎕ PBS (pH 7.4), 30㎕ 5-FC(30mM) 용액을 넣은 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후에 50㎕ 반응액에 1ml의 0.1N HCl을 첨가하였다. 사이토신 디아미네이즈 효소(CD enzyme)의 활성은 UV 분광기(Uvikon 930, Kontron, Ins.)를 사용하여 290nm와 255nm에서 측정하여 하기 수학식 1과 2로 계산하여 얻은 값을 도5에 도시하였다.
세포도입(transduction; "형질도입"과 혼용함)된 Tat-bCD의 활성은 기존의 논문에서 제시한 방법을 조금 변형해서 측정하였다(Shigeki Kuriyma et al 1999). 형질도입된 효소의 활성을 측정하기 위하여 이뮤노블랏을 확인하기 위한 형질도입과 동일한 방법으로 농도와 시간에 따라 세포에 단백질을 처리하고 하비스트하였다. 세포를 100㎕ 용균완충액(lysis buffer)에 녹인 후 170㎕ PBS(pH 7.4), 30㎕ 5-FC (30mM, Sigma chemical.) 용액을 넣은 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후에 50㎕ 반응액에 1㎖의 0.1N HCl을 첨가하였다. 활성은 UV 흡광기(Uvikon 930, Kontron, Ins.)를 사용하여 290nm와 255nm에서 각각 측정하고 측정된 값들을 아래의 식으로 각각 계산하여 얻었다(도 7a, b, c).
5-FC의 소실은 290nm에서 측정되었고 5-FU의 생성은 255nm에서 각각 측정된다. 효소 활성의 결과에서 융합단백질이 거의 모든 5-FC를 5-FU로 변환시키는 것을 알 수 있었다(도 5).
세포 안으로 단백질이 이동한다면, 변성(denaturation)된 단백질들은 세포내의 세포 섀퍼롱(cellular chaperone)에 의해 올바른 컨퍼메이션 구조(conformational structure)를 가지게 될 것이며 활성도 가지게 될 것이다. 도 7a에서 보는 것처럼 융합 단백질이 처리되지 않은 세포는 5-FC를 5-FU로 변환할 수 없었으며, Tat을 가지지 않은 단백질을 처리한 세포에서도 마찬가지로 어떠한 변화도 확인할 수 없었다. 그렇지만 Tat-bCD 융합단백질이 세포도입된 세포들은 5-FC를 5-FU로 변환하는 것을 알 수 있다. 또한 세포에 처리되어진 단백질의 농도에 비례하여 활성이 증가하는 것도 확인하였다.
세포 안으로 이동한 융합 단백질이 효소 활성을 가지는 시간에 대한 실험에서는 Tat-bCD의 활성은 세포도입 결과와 일치하여 약 90분에 최대의 효소활성를 가지는 것을 볼 수 있었다(도 7c).
도 7c에서 보듯이 더 이상의 단백질 공급이 없이도 Tat-bCD 활성은 24시간까지 지속된다. 이 결과 역시 세포도입을 이뮤노블랏(immunoblot)으로 확인한 결과와 동일한 것을 볼 수 있었다. 위의 결과들을 종합해 볼 때, Tat-bCD 융합단백질을 이용한 PTD-DEPT가 가능하다는 것을 확인 할 수 있다.
실시예 5. 세포파괴 어세이(cytotoxic assay)
본 실시예에서는 세포도입된 Tat-bCD 단백질에 의해 프로드럭이 드럭으로 변화하여 생기는 세포파괴 효과(cytotoxic effects)를 측정하기 위하여 MTT(3-[4,5-dimethlthiazol-2-yl]-2,5-diphenol-tetrazoline bromide, Sigma chemical.) 어세이를 수행하였다. 세포파괴정도(Cytotoxicity)를 측정하기 위해서 세포를 24웰 플레이트에 각각 1X104 로 세포를 깔았다. 다음날 무혈청 배지로 세척해 준 다음 완전배지 0.5㎖을 넣어 주었다. 각각의 조건에 맞게 0.5ml 배지에 정제된 bCD와 Tat-bCD 또는 5-FC가 처리되었다. 24시간마다 배지를 제거하고 새로운 배지에 단백질과 5-FC를 처리하였다. 세포의 생존력(viability)은 96시간 후에 MTT가 포함된 DMEM 1ml을 첨가한 후 37℃에서 3시간동안 배양하고, MTT를 제거한 후 1ml의 이소프로판올(iso-propanol)을 첨가하여 1분동안 가볍게 흔들어 준 후 100㎕의 시료를 ELISA 리더(reader)로 570nm에서 OD를 측정하였다.
도 8a는 100uM 5-FC의 존재 하에서 세포에 다양한 농도의 단백질을 처리한 결과이다. 세포에 0.05㎍/㎖의 Tat-bCD를 처리했을 때 처음으로 반응을 보였고, 2㎍/㎖을 처리할 때까지 단백질의 처리양과 반비례의 생존률(viability)를 보인다. 그리고 2㎍/㎖ 이상에서는 거의 같은 반응을 보인다.
또한, 도 8b는 형질도입된 세포가 얼마나 5-FC에 대해 민감성을 보이는지를 확인한 그래프로써, 세포에 5㎍/㎖ Tat-bCD를 처리하고, 다양한 농도로 5-FC를 처리하연 얻은 결과이다. Tat-bCD를 처리한 세포는 약 0.1uM 이상의 5-FC 농도에서부터 반응을 보였다. 그리고 5-FC의 농도가 2uM을 넘어서면 더 이상의 효과를 나타내지 못했다. 모든 실험에서 대조군(control)으로서 Tat 도메인이 없는 bCD 융합단백질을 함께 처리하였고, 5-FC만을 처리하였는데, 그들은 세포의 성장이나 사멸에 영향도 미치지 못했다.
실시예 6. 국외자 세포파괴 효과(bystander cytotoxic effect) 어세이
활성화된 드럭(5-FU)에 의해 세포가 사멸하는 기작에 대한 연구를 수행하였다. 5-FU의 생화학적 기능을 측정하기 위해 세포를 동일한 조건(1X104 cells/plate)으로 2개의 24웰 플레이트에 깔았다. 그 중 하나의 플레이트는 세포파괴 효과를 측정하기 위해 처리한 것과 동일한 방법으로 단백질과 5-FC를 처리하였다. 나머지 하나의 플레이트에는 어떠한 단백질이나 화학물질도 처리하지 않았다.
처리되지 않은 플레이트는 국외자 세포파괴 효과(bystander cytotoxic effects)를 측정하기 위해 다음과 같은 방법을 사용하였다. 세포파괴 효과를 측정하기 위해 24시간마다 배양액을 바꾸어 주어야 하는데 이때 생기는 배양액을 원심 분리한 후 새로운 플레이트에 넣고 배양하였다. 이 절차를 24시간마다 반복하였고 96시간 후에 세포의 생존능력을 MTT 어세이를 통하여 ELISA 리더를 이용하여 570nm에서 측정하였다.
도 9에서 보면 일단 활성화된 드럭은 형질도입되지 않은 세포에 거의 비슷한 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 그러나 활성화된 드럭에 의한 세포의 사멸은 직접 형질도입한 세포의 사멸 기작(cytotoxic effects)처럼 강력해 보이지는 않았다. 국외자 세포사멸 기작(Bystander cytotoxic effects)의 결과를 보면 세포가 사멸하는 기작의 농도는 세포파괴 효과와 비슷하지만 최대의 효과를 나타내지는 못하는 것 같다.
따라서, 본 발명은 기존에 사용되었던 유전자 치료법에서 난점들을 단백질 형질도입 도메인인 Tat을 이용하여 효소/프로드럭 시스템에서 중요한 기작을 나타내는 bCD를 Tat-bCD 융합단백질의 형태로 보다 효율적으로 세포도입이 가능하도록하였다.
또한, 본 발명의 Tat-bCD 융합단백질은 약학적 조성물로 제공할 수 있다.
또한, Tat을 이용한 단백질 치료 기술은 생체내 기능조절에 관련된 모든 치료법에 응용될 수 있으며 이 기법은 향후 유전자 치료법과 함께 새로운 질환치료법 또는 투약법으로 활용될 것이다.
도 1은 세포파괴(cytotoxic) 효과를 발휘하는 사이토신 디아미네이즈의 생화학적 경로를 도시한 것이다.
도 2는 HIV-1 Tat 단백질 영역과 형질도입을 수행하는 Tat 염기성 도메인의 서열을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 플라즈미드 벡터들의 개략적 구조이다.
상기 벡터는 pET15-b를 기초하고, N-말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지며, Tat-bCD 융합단백질은 Tat의 단백질 형질도입부가 이어져 있다. pTat-bCD와 pbCD 발현벡터는 bCD 코딩서열 구조에서 융합되어 생성된다.
도 4는 E. coli에서 bCD와 Tat-bCD의 발현과 정제의 결과이다.
E. coli에서 발현된 bCD와 Tat-bCD는 각각 Ni-NTA 컬럼으로 변성된 형태로 정제했다.
도 4a는 정제된 bCD와 Tat-bCD의 쿠마시염색젤(coomassie staining gel)로 확인한 결과이다..
도 4b는 도 2a에서 나타난 젤을 웨스턴 블랏한 결과이다.
도 5는 자연상태로 정제된 bCD와 Tat-bCD의 활성을 측정한 그래프이다.
효소(1㎍) 100㎕를 170㎕ PBS와 30mM 5-FC용액 30㎕에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 그리고 이 용액 50㎕를 0.1N HCl 1㎖를 가지고 정지시킨 후 290nm와 255nm에서 UV 흡광기로 활성을 측정하였다.
도 6은 변성된 Tat-bCD 융합단백질의 형질도입 키네틱스(kinetics)를 측정한 결과이다.
융합단백질은 다양한 조건에서 HeLa 세포의 배양 배지에 첨가했다. 세포 용균액을 레빗 항히스티딘 항체로 이뮤노블랏을 한 후, 다양한 조건에서 세포를 수득하기 전에 무혈청 배지로 그 세포를 두 번 세척했다.
C: 형질도입시키지 않은 세포 용균액(non-transducted cell lysate)이다.
도 6a는 시간에 따른 형질도입 결과이다. 각 배양시간동안 세포에 1uM의 Tat-bCD 융합단백질을 형질도입시켰다.
도 6b 단백질의 농도에 따른 형질도입 결과이다. 표준조건 하에서 세포에 2시간동안 각 농도의 Tat-bCD와 bCD로 처리하였다.
도 6c 형질도입된 Tat-bCD의 안정성 측정한 결과이다. 세포들을 2시간동안 1uM의 Tat-bCD 융합단백질을 가지고 배양시킨 후, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 새로운 배지를 첨가했다. 그리고 나서 처리된 세포를 각 시간에서 수득하였다.
도 7은 HeLa 세포로 형질도입된 단백질의 활성을 측정한 결과이다.
세포에 bCD 또는 Tat-bCD를 형질도입시키고, 도 5와 동일한 조건에서 세포를 하비스트하였다. 290nm와 255nm에서 UV 흡광기로 활성을 측정하였다.
도 7a는 농도에 따라 형질도입된 bCD, Tat-bCD의 활성을 측정한 그래프이다. 세포들은 표준조건에서 2시간동안 각 농도(㎍/㎖)의 단백질로 형질도입되었다.
도 7b는 시간에 따른 형질도입된 Tat-bCD의 활성을 측정한 그래프이다.
도 7c는 형질도입된 Tat-bCD 활성의 안정성을 측정한 그래프이다.
도 8은 5-FC 존재 하에서 형질도입된 bCD, Tat-bCD의 생물학적 활성을 확인하기 위한 MTT 어세이 결과이다.
여러 종류의 드럭(drug)에 대한 세포들의 민감성은 MTT dye reduction 어세이를 사용하여 결정하였다. 세포들을 24공 플레이트에서 1 ×104 세포/웰에 깔았다. 다음날 배지를 제거했고 세포들은 0.5㎖ 배지에서 bCD, Tat-bCD 또는 5-FC로 매일 처리되었다. 살아있는 세포는 96시간 후에 570nm와 550nm에서 ELISA 리더를 사용하여 측정하였다.
도 8a는 각각의 단백질을 HeLa 세포에 형질도입시키고, 100uM 5-FC 존재 하에서 배양시켜 측정한 그래프이다.
도 8b는 HeLa 세포에 5㎍/㎖ bCD, Tat-bCD를 형질도입시키고, 다양한 농도의 5-FC하에서 세포를 배양시켜 측정한 그래프이다.
도 9는 Tat-bCD의 형질도입에 의하여 활성화된 드럭인 5-FU의 국외자 세포파괴 효과를 확인하기 위한 MTT 어세이 결과이다.
생물학적 활성의 확인에 따라서 세포들은 다양한 융합 단백질과 프로드럭, 5-FC로 24시간 동안 처리되었다. 또 다른 세포들은 플레이팅 룰(plating rule)에 따라 복제하였다. 그 세포는 어떤 단백질이나 화학물질로도 처리하지 않았다. 처리하지 않은 세포들의 배지는 24시간 동안 bCD, Tat-bCD 또는 5-FC를 가지고 배양한 배지와 교환하였다. 그리고 나서 72시간 후에 570nm와 550nm에서 ELISA 리더를 사용하여 세포의 생존율을 측정하였다.
도 9a는 bCD, Tat-bCD를 HeLa 세포에 형질도입시킨 후, 100uM 5-FC의 존재 하에서 세포를 배양시켜 측정한 그래프이다.
도 9b는 HeLa 세포에 5㎍/㎖ bCD, Tat-bCD를 형질도입시키고, 다양한 농도의 5-FC하에서 세포를 배양시켜 측정한 그래프이다.
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agg aag aag cgg aga cag cga cga aga ctc gag tcg aat aac gct tta 48
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Ser Asn Asn Ala Leu
1 5 10 15
caa aca att att aac gcc cgg tta cca ggc gaa gag ggg ctg tgg cag 96
Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Trp Gln
20 25 30
att cat ctg cag gac gga aaa atc agc gcc att gat gcg caa tcc ggc 144
Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala Ile Asp Ala Gln Ser Gly
35 40 45
gtg atg ccc ata act gaa aac agc ctg gat gcc gaa caa ggt tta gtt 192
Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp Ala Glu Gln Gly Leu Val
50 55 60
ata ccg ccg ttt gtg gag cca cat att cac ctg gac acc acg caa acc 240
Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His Leu Asp Thr Thr Gln Thr
65 70 75 80
gcc gga caa ccg aac tgg aat cag tcc ggc acg ctg ttt gaa ggc att 288
Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly Thr Leu Phe Glu Gly Ile
85 90 95
gaa cgc tgg gcc gag cgc aaa gcg tta tta acc cat gac gat gtg aaa 336
Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu Thr His Asp Asp Val Lys
100 105 110
caa cgc gca tgg caa acg ctg aaa tgg cag att gcc aac ggc att cag 384
Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln Ile Ala Asn Gly Ile Gln
115 120 125
cat gtg cgt acc cat gtc gat gtt tcg gat gca acg cta act gcg ctg 432
His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp Ala Thr Leu Thr Ala Leu
130 135 140
aaa gca atg ctg gaa gtg aag cag gaa gtc gcg ccg tgg att gat ctg 480
Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val Ala Pro Trp Ile Asp Leu
145 150 155 160
caa atc gtc gcc ttc cct cag gaa ggg att ttg tcg tat ccc aac ggt 528
Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile Leu Ser Tyr Pro Asn Gly
165 170 175
gaa gcg ttg ctg gaa gag gcg tta cgc tta ggg gca gat gta gtg ggg 576
Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu Gly Ala Asp Val Val Gly
180 185 190
gcg att ccg cat ttt gaa ttt acc cgt gaa tac ggc gtg gag tcg ctg 624
Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu Tyr Gly Val Glu Ser Leu
195 200 205
cat aaa acc ttc gcc ctg gcg caa aaa tac gac cgt ctc atc gac gtt 672
His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr Asp Arg Leu Ile Asp Val
210 215 220
cac tgt gat gag atc gat gac gag cag tcg cgc ttt gtc gaa acc gtt 720
His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser Arg Phe Val Glu Thr Val
225 230 235 240
gct gcc ctg gcg cac cat gaa ggc atg ggc gcg cga gtc acc gcc agc 768
Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly Ala Arg Val Thr Ala Ser
245 250 255
cac acc acg gca atg cac tcc tat aac ggg gcg tat acc tca cgc ctg 816
His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Leu
260 265 270
ttc cgc ttg ctg aaa atg tcc ggt att aac ttt gtc gcc aac ccg ctg 864
Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn Phe Val Ala Asn Pro Leu
275 280 285
gtc aat att cat ctg caa gga cgt ttc gat acg tat cca aaa cgt cgc 912
Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp Thr Tyr Pro Lys Arg Arg
290 295 300
ggc atc acg cgc gtt aaa gag atg ctg gag tcc ggc att aac gtc tgc 960
Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu Ser Gly Ile Asn Val Cys
305 310 315 320
ttt ggt cac gat gat gtc ttc gat ccg tgg tat ccg ctg gga acg gcg 1008
Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp Tyr Pro Leu Gly Thr Ala
325 330 335
aat atg ctg caa gtg ctg cat atg ggg ctg cat gtt tgc cag ttg atg 1056
Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu His Val Cys Gln Leu Met
340 345 350
ggc tac ggg cag att aac gat ggc ctg aat tta atc acc cac cac agc 1104
Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn Leu Ile Thr His His Ser
355 360 365
gca agg acg ttg aat ttg cag gat tac ggc att gcc gcc gga aac agc 1152
Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Asn Ser
370 375 380
gcc aac ctg att atc ctg ccg gct gaa aat ggg ttt gat gcg ctg cgc 1200
Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn Gly Phe Asp Ala Leu Arg
385 390 395 400
cgt cag gtt ccg gta cgt tat tcg gta cgt ggc ggc aag gtg att gcc 1248
Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg Gly Gly Lys Val Ile Ala
405 410 415
agc aca caa ccg gca caa acc acc gta tat ctg gag cag cca gaa gcc 1296
Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr Leu Glu Gln Pro Glu Ala
420 425 430
atc gat tac aaa cgt tga 1314
Ile Asp Tyr Lys Arg
435
<210> 6
<211> 437
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Ser Asn Asn Ala Leu
1 5 10 15
Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Trp Gln
20 25 30
Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala Ile Asp Ala Gln Ser Gly
35 40 45
Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp Ala Glu Gln Gly Leu Val
50 55 60
Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His Leu Asp Thr Thr Gln Thr
65 70 75 80
Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly Thr Leu Phe Glu Gly Ile
85 90 95
Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu Thr His Asp Asp Val Lys
100 105 110
Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln Ile Ala Asn Gly Ile Gln
115 120 125
His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp Ala Thr Leu Thr Ala Leu
130 135 140
Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val Ala Pro Trp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile Leu Ser Tyr Pro Asn Gly
165 170 175
Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu Gly Ala Asp Val Val Gly
180 185 190
Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu Tyr Gly Val Glu Ser Leu
195 200 205
His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr Asp Arg Leu Ile Asp Val
210 215 220
His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser Arg Phe Val Glu Thr Val
225 230 235 240
Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly Ala Arg Val Thr Ala Ser
245 250 255
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275 280 285
Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp Thr Tyr Pro Lys Arg Arg
290 295 300
Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu Ser Gly Ile Asn Val Cys
305 310 315 320
Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp Tyr Pro Leu Gly Thr Ala
325 330 335
Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu His Val Cys Gln Leu Met
340 345 350
Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn Leu Ile Thr His His Ser
355 360 365
Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Asn Ser
370 375 380
Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn Gly Phe Asp Ala Leu Arg
385 390 395 400
Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg Gly Gly Lys Val Ile Ala
405 410 415
Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr Leu Glu Gln Pro Glu Ala
420 425 430
Ile Asp Tyr Lys Arg
435
Claims (6)
- 박테리아 사이토신 디아미네이즈의 아미노 말단에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57)가 공유결합된 서열번호 6의 세포침투성 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질.
- 제1항에 있어서, HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57)의 업스트림에 수개의 히스티딘 잔기가 결합된 것을 특징으로 하는 세포침투성 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질.
- 사이토신 디아미네이즈 cDNA의 5'측에 HIV-1 Tat 형질도입부위 49~57 잔기(Tat 49-57) 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항 또는 제2항의 Tat-사이토신 디아미네이즈 융합단백질을 코딩하는 서열번호 5 또는 코돈 축퇴성에 의한 그의 등가물 재조합 폴리뉴클레오타이드.
- 상기 제1항 또는 제2항의 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 제3항의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포침투성 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질을 발현시키는 벡터.
- 삭제
- 항암제로서 사용되는 것을 특징으로 하며, 제1항 또는 제2항의 Tat-박테리아 사이토신 디아미네이즈 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
KR10-2003-0066620A KR100509398B1 (ko) | 2003-09-25 | 2003-09-25 | 세포침투성 티에이티-박테리아 사이토신 디아미네이즈융합단백질 및 그 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2003-0066620A KR100509398B1 (ko) | 2003-09-25 | 2003-09-25 | 세포침투성 티에이티-박테리아 사이토신 디아미네이즈융합단백질 및 그 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20050030682A KR20050030682A (ko) | 2005-03-31 |
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Family
ID=37386877
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR10-2003-0066620A KR100509398B1 (ko) | 2003-09-25 | 2003-09-25 | 세포침투성 티에이티-박테리아 사이토신 디아미네이즈융합단백질 및 그 용도 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR100509398B1 (ko) |
-
2003
- 2003-09-25 KR KR10-2003-0066620A patent/KR100509398B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20050030682A (ko) | 2005-03-31 |
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